Borges Yépez Rebeca Auxiliadora Análisis de los compuestos terpénicos C10-C20 de las especies Lepechinia Conferta (BENTH) Epling y Lepechinia Salviaefolia (KUNTH) Epling Universidad de Los Andes-Facultad de Farmacia y Bioanálisis-Postgrado en Química de Medicamentos. 2001. p. 183 Venezuela Disponible en: http://bdigital.ula.ve/RediCiencia/busquedas/DocumentoRedi.jsp?file=33907&type=ArchivoDocumento &view=pdf&docu=27077&col=5

¿Cómo citar? UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE FARMACIA POSTGRADO EN QUIMICA DE MEDICAMENTOS MÉRIDA-VENEZUELA

TESIS

ANALISIS DE LOS COMPUESTOS TERPENICOS C10 - C2o DE LAS ESPECIES LEPECHINIA CONFERTA (BENTH) EPLING Y LEPECHINIA SAL VIAEFOLIA (KUNTH) EPLING

SERBIULA Tulio Febres Cordero

POR: FARM. REBECA A. BÓRGES Y. MAY02001 DIGITALIZADO http://tesis. u la. ve '------"-' Este trabajo de Investigación fue realizado en el Laboratorio de Productos Naturales del Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Los Andes con financiamiento del Centro de Desarrollo Científico Humanístico y Tecnológico (CDCHT) bajo el Proyecto N° FA-228- 99-08-E. DEDICADO A:

EDGARDO, por estar a mi lado apoyándome, por ser manantial inagotable de estímulo y amor. Lo hemos logrado juntos. Mis hijos CARLOS JAIRO Y EDGARDO ANDRES, todos mis esfuerzos de superación están dedicados a ustedes. MI F'Aftf/LIA por su apoyo y estímulo. AGRADECIMIENTO

GRACIAS SEÑOR, por haberme dotado de una férrea voluntad para lograr esta meta. Fueron muchos los momentos de flaqueza, de desilusion y de sacrificios, pero tu luz siempre estuvo en mi camino y tu voz en mi ofdo ... "Sigue adelante que tu puedes lograrlo, me decías"... Aquí esta tu obra mi Dios, eternamente gracias. Pero también entre todas esas cosas buenas que me haz brindado están las persona que siempre mostraron su solidaridad y estimulo hacia mi, por eso quiero agradecerles a cada una de ellas al ver culminado este trabajo: Al Profesor Luis rojas, por haber aceptado la tutoría de este trabajo. Al Dr. Usubillaga, por su disposición de transmitir sus consejos y conocimientos. A Nancy, Gina y Alba, por su amistad y colaboración. Al personal que labora en el Instituto de Investigaciones de la Facultad de Farmacia, por su incondicional colaboración. A mis amigas (os): Rosa, Marisabel, Daisys, Yolita, Marianelay Angel, por haber estado siempre presentes con una palabra de aliento, un abrazo de apoyo y su amistad sincera.

GRACIAS. RESUMEN

Lepechinia conferta (Benth) Epling y Lepechinia salviaefolia (Kunth) Eplin, (Lamiaceae), son plantas que crecen sobre 2000 metros en Mérida, Táchira y Trujillo, estados andinos al oeste de Venezuela. El presente trabajo describe el análisis de los aceites esenciales de hojas y flores obtenidos por hidrodestilación usando la trampa de Clevenger. Los aceites fueron analizados por cromatografia de gases usando una llama de ionización y detector de masas. La identificación de los componentes del aceite se logró por comparación de los espectros de masas de los mismos con los existentes en la base de datos Wiley MS e índices de Kováts. En el aceite esencial de hojas de Lepechinia conferta se identificaron 44 componentes siendo los mayoritarios: Ledol (24.3%), o- 3- careno (11%), P-telandreno (9.7%) y aromadandreno (4.5%); en el aceite esencial de flores se identificaron 47 componentes, de los cuales los cuatro mayoritarios fueron Ledol (28.8%), p -

felandreno (11.7%), <5 -3 - careno (10.4%), aromadandreno (3.6%). En el aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefolia los cuatro componentes mayoritarios de los 19 identificados fueron Ledene (28.2%), p - felandreno (25.8%), espatulenol (8.9%), P- selineno (7.6%) y en el aceite esencial de flores fueron identificados 30

componentes con Ledol (27.4%), p - felandreno (12.2%), <5 - 3 -careno (10.9%) y aromadandreno (3.5%) como compuestos mayoritarios. Las hojas secas y molidas de L. salviaefolía fueron extraídas en un sohxlet con hexano, al enfriar fue obtenido un sólido el cual fue identificado como taxoquinona.

Posteriormente la extracción con ChCL3 dio como resultado una mezcla de ácidos triterpénicos los cuales fueron metilados y tentativamente identificados como: 2a,3 P,23 -trihidroxio lean-12-en-28 ácido metil ester; 3-oxo-olean-12-en-28-ácido metil ester; 3P-hidroxiolean-12-en-28-ácido metil ester; 2a,3P-dihidroxiolean-12 -en- 28-ácido metil ester. ABSTRACT

Lepechinia conferta (Benth) Epling and Lepechinia salviefolia (Kunth) Epling (lamiacea) are plants which grow above 2000 m, in Mérida, Táchira and Trujillo states 1'-'' ated in Western Venezuela. The essential oils from leaves and flowers were obtained by hydrodistillation using a Clevenger trap. The oils were analyzed by gaschromatography using flame ionization and mass detectors. Identification of the oil components was achieved by computer comparison of the mass spectra of the constituents with the spectra of the Wiley Mass Spectral Library by Kováts indices. The oil of L. conferta showed 44 components; the main constituents found werc Ledo! (24.3%), 6-3-carene ( 11.0%), ~­ phclandrene (9.7%), and aromadendrene (4.5%). The tlowers of the L.con.ferta showed 47 components, and the main constituents were ledo! (28.8%), ~-phelandrene (!l. 7%), 8-3- caren~ ( 10.4%),and aromadendrene (3.6%). On the other hand the oil from the leaves of L. sah·iaefó!ia showed 19 components, the major ones ledo! (28.2%), ~-phelandrene (25.8%),

SHd.ilenol (8.9%), and ~-selenene (7.6%). The oil from the flowers of the L. salviaefolia showed 30 components and the most abundant constituents were ledo! (27.4%), ~­ phelandrene (12.2%), 8-3-carene (10.9%), and aromadendrene (3.5%). The dry and ground leaves of Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling were extracted in a soxhelt with n­ hcxane, upon cooling a solid was obtained which was identified as taxoquinone. Further extraction with CHCb yielded a mixture of triterpene acids wich upon methylation were tcntatively identified as: 2a,3~,23-trihidroxyolean-12-en-28 acid methyl ester; 3-oxo-olean-

12-cn-28-acid methyl ester; 3~-hidroxyolean-12-en-28-acid methyl ester; 2a,3~­ dihidn:-xyolean-12-en-28-acid methyl ester. TESIS DE GRADO

CONTENIDO

Pag. INTRODUCCION 1 HIPOTESIS 5 OBJETIVOS 6 PRIMERA PARTE

CAPITULO 1: COMPUESTOS TERPENICOS (C 10 - C20 ) 7 l.l Formación de los compuestos terpenicos (C 10 - C20) 7

1.2 Localización y composición de los compuestos terpenicos c10 - c15 (aceites esenciales) 20 1.3 Función de los compuestos terpenicos en la planta 21 1.4 Utilidad de los compuestos terpenicos para el hombre 22 CAPITULO 2: ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS SOBRE COMPUESTOS

TREPNICOS C10 - C20 EN EL GENERO LEPECHINIA Y SUS USOS MEDICINALES 26 2.1 Monoterpenos y Sesquiterpenos en el género Lepechinia 26 2.3 Usos medicinales del género Lepechinia 35 SEGUNDA PARTE CAPITULO 3: ESTUDIOS PRELIMINARES SOBRE LAS DOS ESPECIES DE LEPECHINIAS 36 3.1 Selección e identificación del material vegetal 36 3.1.1 Descripción del genero Lepechinia 36 3.1.2 Lepechinia conferta (Benth) Epling 36 3.1.3 Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling 37 3.2 Recolección del material vegetal 38 CAPITULO 4: AISLAMIENTO DE LOS COMPUESTOS TERPENICOS

(Cto- C1s) Y DITERPENICOS (Clo) 41 4.1 Extracción de los aceites esenciales 41 4.2 Identificación de los componentes de los aceites 43 4.3 Determinación del numero de componentes por cromatografia de gases 43 TESIS DE GRADO

4.4 Cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas (CG/ EM) 44 4.5 Determinación de los índices de Kovats 45 4.6 Determinación de constantes tísicas 45 4.6.1 Indice de refracción 45 4.6.2 Densidad 45 4.6.3 Punto de fusión 45 4. 7 Porcentaje de los componentes de los aceites 45 4.8 Fraccionamiento del aceite por cromatografía preparativa en capa gruesa y 46 análisis por cromatografia de gases acoplada a espectromctria de masas 4.9 Extracción de los compuestos diterpenicos 46 4.9.1 Extracción con solventes orgánicos en caliente 46 4.10 Separación de los compuestos diterpenicos 46 4.10.1 Cromatografia en columna abierta 46 4.10.2 Cromatografía en capa fina 47 4.10.3 Cromatografía preparativa en capa gruesa 47 4.11 Metilación 47 4.12 Identificación de los compuestos 47 TERCERA PARTE CAPITULO 5: RESULTADOS Y DISCUSION 48

5.1 Extracción de los compuestos terpenicos C 111 - C15 (aceites esenciales) 48 5.2 Constantes fisicas 49 5.3 Determinación del numero de componentes de los aceites esenciales por cromatografía de gases 50 5.4 Identificación de los componentes de los aceites 50 5.5 Fraccionamiento del aceite por cromatografía preparativa en capa gruesa y análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometria de masas 60 5.6 Extracción de los compuestos diterpenicos 62 5.6.1 Extracción con solventes orgánicos en caliente: Hexano 62 5.6.2 Extracción con cloroformo 65 5.7 Identificación de los compuestos diterpenicos (Taxoquinona) 69 5. 7.1 Espectro ultravioleta 69

¡¡ TESIS DE GRADO

5. 7.2 Espectro de infrarrojo 69 5. 7.3 Patrón de fragmentación de la taxoquinona en cromatografia de gases acoplada a espectrometria de masas 70

13 5.7.4 Interpretación de espectros de RMN)H, RMN-C , COSY, HMQC 72 CONCLUSIONES 78 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 80 ANEXOS 86

------~------iii TESIS DE GRADO ------·------

INDICE DE FOTOGRAFIAS Pag.

FOTOGRAFIA 1. Lepechinia conferta (Benth) Epling 39 FOTOGRAFIA 2. Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling 40 FOTOGRAFIA 3. Equipo de hidrodestilación con trampa de Clevenger 42

INDICE DE ESQUEMAS Pag

ESQUEMA l. Obtención de los aceites esenciales 41 ESQUEMA 2. Separación de los componentes de los aceites 44 ESQUEMA 3. Extracción en caliente con bexano 64 ESQUEMA 4. Metilación de los ácidos triterpenicos 67 ESQUEMA 5. Extracción en caliente con cloroformo 68 ESQUEMA 6. Patrón de fraccionamiento de la taxoquinona 71 ESQUEMA 7. Patrón de fraccionamiento de la taxoquinona

iv TESIS DE GRADO

IN DICE DE TABLAS Pag

TABLA l. Principales géneros de la familia Lamiaceae 3 TABLA 2. Representantes de la familia Lamiaceae que contienen esencias 4 TABLA 3. Agrupaciones de átomos de carbono en los terpenoides vegetales 8 TABLA 4. Propiedades terapéuticas de los terpenos 24 TABLA 5. Rendimiento de extracción de aceite esencial en las hojas y las flores de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling 48 TABLA 6. Rendimiento de extracción de aceite esencial en las flores y hojas de Lepechinia conferta (Benth) Epling 49 TABLA 7. Determinación del numero de compuestos de los aceites esenciales por cromatografía de gases 50 TABLA 8. Identificación de los componentes del aceite esencial de hojas de Lepechinia conferta (Benth) Epling 51 TABLA 9. Identificación de los componentes del aceite esencial de flores de Lepechinia conferta (Benth) Epling 53 TABLA 10. Comparación de la composición porcentual de los aceites esenciales de hojas y llores de Lepechinia conferta (Benth) Epling 55 TABLA 11. Identificación de los componentes del aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling 56 TABLA 12. Identificación de los componentes del aceite esencial de flores de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling 57 TABLA 13. Comparación de la composición porcentual de los aceites esenciales de hojas y flores de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling 59 TABLA 14. Compuestos mayoritarios de las fracciones del aceite esencial de hojas de Lepechinia conferta (Benth) Epling 60

V ll·.SIS 1>1·: UI\ADU

TABLA 15. Compuestos mayoritarios de las fracciones del aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling 61 TABLA 16. Bandas de absorción en el espectro de infrarrojo de la taxoquinona 69 TABLA 17. Fragmentos (m/z) más notables en el espectro de masas de la taxoquinona 70 TABLA 18. Resultados de RMN-H1 76 TABLA 19. Resultados de RMN-C 13 77

vi TESIS IJE URADO

INDICE OE FIGURAS Pag.

FIGURA l. Estructura tipo ent-kaureno de compuestos aislados de la familia Lamiaceae 1 FIGURA 2. Compuesto con estructura tipo neoclerodano aislado de los generos Ajuga, Salvia y Teucrium 2 FIGURA 3. Primera etapa de la biogénesis de los monoterpenos 9 FIGURA 4. Segunda etapa de la biogénesis de monoterpenos 11 FIGURA 5. Tercera etapa de la biogénesis de monotcrpenos 13 FIGURA 6. Cuarta y quinta etapa de la biogénesis de monoterpenos 14 FIGURA 7. Estructuras de monoterpenos aciclicos 15 FlGlJRA 8. Estructuras de monoterpenos biciclos 16 FIGURA 9. Estructuras de monoterpenos irregulares 17 FIGURA 10. Estructuras de sesquiterpenos 18 FIGURA 11. Estructuras de diterpenos 19 FIGURA 12. Compuestos aislados de la Lepechinia calycina. Epling 26 FIGURA 13. Compuestos aislados de la Lepechiniajloribunda (Benth) Epling 27 FIGURA 14. Sesquiterpenos de la serie guaiano aislados de la Lepechinia urbaniana (Brig) Epling 28 FIGURA 15. Compuestos aislados de la Lepechinia schiedeana (Schlecht) Vatke 29 FIGURA 16. Compuestos aislados de la Lepechinia chamaedryoides (Balbis) Briq 30 FIGlmA 17. Diterpenos aislados de la Lepechinia bullata (Kunth) Epling 31 FIGURA 18. Diterpenos aislados de la Lepechinia meyeni (Walp) Epling 32 FIGURA 19. Diterpeno aislado de la Lepechinia caulescens (Ort) Epling 33 FIGURA 20. Diterpeno aislado de la Lepechinia hastata (A.Gray) Epling 33 FIGURA 21. Diterpenos de la serie abietano aislados de la Lepechinia urhaniana (Brig) Epling 34 FIGURA 22. Espectro de infrarrojo del precipitado obtenido 66 FIGURA 23. Espectro de infrarrojo de la taxoquinona 69 FIGURA 24. Estructura de la taxoquinona 75

------~¡ TESIS DE GRADO

INDICE DE ANEXOS Pag.

ANEXO l. Cromatograma del aceite esencial de hojas Lepechinia conferta (Benth)

~~~ ~ ANEXO 2. Cromatograma del aceite esencial de flores de Lepechinia conferla (Benth) Epling. 88 ANEXO 3. Cromatograma del aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling. 89 ANEXO 4. Cromatograma del aceite esencial de flores de Lepechinia salviaefolia (Kuntb) Epling. 90 ANEXO 5. Espectro de masas del fraccionamiento del aceite esencial de hojas de Lepechinia conferta (Benth( Epling 91 ANEXO 6. Espectro de masas del fraccionamiento del aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefolia (Kuoth) Epling 92 ANEXO 7. Espectro de masas del a.-pioeno 93 ANEXO 8. Espectro de masas del J3-pineno 94 ANEXO 9. Espectro de masas del J3-mirceno 95 ANEXO 10. Espectro de masas del sabineno 96 ANEXO 11. Espectro de masas delo-3-careno 97 ANEXO 12. Espectro de masas del a.-terpineno 98 ANEXO 13. Espectro de masas del p-cimeno 99 ANEXO 14. Espectro de masas del J3-felandreno 100 ANEXO 15. Espectro de masas del y-terpineno 101 ANEXO 16. Espectro de masas del Oxido de linalol 102 ANEXO 17. Espectro de masas del terpinoleno 103 ANEXO 17. Espectro de masas dellinalol 104 ANEXO 18. Espectro de masas de la isopioocanfona 105 ANEXO 19. Espectro de masas del a.-copaeno 106

·------viii TESIS DE GRADO

ANEXO 20. Espectro de masas del a.-copaeno 107 ANEXO 21. Espectro de masas del a.-gurjuneno 108

ANEXO 22. Espectro de masas del ~-cariofileno 109 ANEXO 23. Espectro de masas del aromadandreno 110 ANEXO 24. Espectro de masas del a.-humuleno 111 ANEXO 25. Espectro de masas del aloaromadandreno 112 ANEXO 26. Espectro de masas del a-farneseno 113 ANEXO 27. Espectro de masas del a-cadineno 114 ANEXO 28. Espectro de masas delledol 115 ANEXO 29. Espectro de masas del espatulenol 116 ANEXO 30. Espectro de masas del viridiflorol 117 ANEXO 31. Espectro de masas del guaiol 118 ANEXO 32. Espectro de masas del y-eudesmol 119

ANEXO 33. Espectro de masas del ~-eudesmol 120 ANEXO 34. Espectro de masas del a-eudesmol 121 ANEXO 35. Espectro de masas del oxido de manoil 122 ANEXO 36. Espectro de masas del mirceno 123 ANEXO 37. Espectro de masas del ~-selineno 124 ANEXO 38. Espectro de masas del eremofileno 125 ANEXO 39. Espectro de masas del valenceno 126 ANEXO 40. Espectro de masas del biciclogermacreno 127 ANEXO 41. Espectro de masas delledano 128 ANEXO 42. Espectro de masas del oxido de cariofileno 129 ANEXO 43. Espectro de masas del a-guaiano 130 ANEXO 44. Espectro de masas del a-tujeno 131 ANEXO 45. Espectro de masas del a-felandreno 132 ANEXO 46. Espectro de masas del cis-bidrato de sabineno 133 ANEXO 47. Espectro de masas del p-ment-2-en-1-ol 134 ANEXO 48. Espectro de masas de la pinocanfona 135 ANEXO 49. Espectro de masas del 4-terpineol 136

ix TESIS DE GRADO

ANEXO 50. Espectro de masas del p-cimen-8-ol 137 ANEXO 51. Espectro de masas del a-terpineol 138 ANEXO 52. Espectro de masas del cis-piperitol 139 ANEXO 53. Espectro de masas del a-cubeneno 140 ANEXO 54. Espectro de masas del isoledano 141 ANEXO 55. Espectro de masas del a-selineno 142 ANEXO 56. Espectro de masas del calareno 143 ANEXO 57. Espectro de masas del y-cadineno 144 ANEXO 58. Espectro de masas del globulol 145 ANEXO 59. Espectro de masas del bulnesol 146 ANEXO 60. Espectro de masas del Kaureno 147 ANEXO 61. Espectro de masas del a-muroleno 148 ANEXO 62. Espectro de masas del a-cadineno 149 ANEXO 63. Espectro de masas del a- calacoreno 150 ANEXO 64. Espectro de masas dell,2,3,4-tetrametilbenceno 151 ANEXO 65. Espectro de masas trans-piperitol 152 ANEXO 66. Espectro de masas del a-fencheno 153 ANEXO 67. Espectro de masas del canfeno 154 ANEXO 68. Espectro de masas del verbeneo o 155 ANEXO 69. Espectro de masas del3-octanol 156 ANEXO 70. Espectro de masas de la fraccion metilada 157 ANEXO 71. Espectro de masas del metil-2 a, 3(3-dihidroxiolean-12-oato 158 ANEXO 72. Espectro de masas del metil-3 (3-hidroxiolean-12-en-28-oato 159 ANEXO 73. Espectro de masas del metil, 2 a,3 (3,23-trihidroxiurs-12-en-28-oato 160 ANEXO 74. Espectro de masas del olean-12-en-28-oic acido, 3 oxo-metil ester 161 ANEXO 75. Espectro de masa del metil, 3 (3-hidroxiolean-12-en-28-oato 162 ANEXO 76. Espectro de RMN-H1 de la taxoquinona 163 ANEXO 77. Espectro de RMN-C 13 de la taxoquinona 164

X TESIS DE GRADO

ANEXO 78. Espectro de HMQC de la taxoquinona 165 ANEXO 79. Espectro de COSY de la taxoquinona 166 ANEXO 80. Espectro de ultravioleta de la taxoquinona 167

XI TESIS DE GRADO

INTRODUCCION

Algunas especies de la familia Lamiaceae han sido objeto de estudios fitoquímicos y farmacológicos por parte de numerosos investigadores a escala mundial, los cuales han demostrado las propiedades medicinales que se les atribuyen (Ferhout, 1999).

La clasificación más reciente de esta familia para nuestro país es la realizada por Velázquez en 1.997, donde se presenta una clave para los géneros, junto con sus descripciones. Se reportan 21 géneros y 80 especies ubicadas entre 20 y 3.600 msnm. Los géneros de más amplia distribución por toda la geografia nacional son Hyptis, Leonotis, Leonunis y Salvia, los demás están restringidos a la Cordillera de la Costa, a la Cordillera de los Andes y otros a las regiones de los Llanos y Guayana, como se muestra en la tabla 1

La fumilia Lamiaceae al igual que la Myrtaceae, Umbellífera, Pinaceae, Rutaceae y Compositae, es particularmente rica en aceites esenciales, algunas de sus especies son mostradas en la tabla 2 (Marcano,1991). El estudio fitoquímico de plantas de la familia Lamiaceae, ha permitido aislar diterpenoides biológicamente activos, por ejemplo, de diferentes especies del género Rhabdosia (Plantas endémicas de China y Japón), se han aislado diterpenos con esqueleto de ent-Kaureno como el mostrado en la figura 1, y de los géneros Ajuga, Salvia, Teucrium abundantes en la cuenca mediterránea se han aislado diterpenos con esqueleto de neoclerodano (figura 2) que presentan propiedades antitumorales, bactericidas e inhibidores del desarrollo de los insectos (Hanson,l985).

Figura l. Estructura tipo ent-kaureno de compuestos aislados de la familia Lamiaceae ~------TESIS DE GRADO

Figura 2. Compuesto con estructura tipo neoclerodano aislado de los géneros Ajuga, Salvia y Teucrium R------11

Clerodin (II).

Las especies Lepechinia conferta (Benth) Epling y Lepechinia salviaefo/ia (Kunth) Epling, pertenecientes al género Lepechinia de la familia Lamiaceae, son plantas que se encuentran distribuidas en nuestro país en los estados Táchira, Mérida y Trujillo, por encima de los 2.000 metros de altura sobre el nivel del mar. Por medio de este trabajo de investigación se logró obtener los aceites esenciales de hojas y flores de ambas especies, por el método de hidrodestilación empleando la Trampa de Clevenger. Estos aceites fueron analizados por cromatografla de gases, cromatografla de gases acoplada a espectrometría de masas, índices de Kovats y se midieron sus propiedades fisicas. Se realizó una extracción con diferentes solventes en caliente de hojas de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling, obteniendo como resultado la separación de compuestos de interés, identificados como Taxoquinona y algunos ácidos triterpénicos. En esta fuse se recurrió a técnica<> de separación como son: cromatografia en columna, cromatografia en capa fina y cromatografia preparativa en capa gruesa, con la finalidad de purificar lo mejor posible cada_ compuesto y facilitar su identificación.

2 TESIS DE ORADO

TABLA 1

PRINCIPALES GENEROS DE LA FAMILIA LAMIACEAE

GENERO NUMERO DE ESPECIES Ajuga 40 Teucrium 300 Scutellaria 200 Marrubium 40

,v~· Nepeta 150 Prunella 7 Stachys 200 Salvia 500 Monarda 12 Origanum 15 a20 Thymus 300 a 400 Mentha 25 Rosmarlnus 3 Coleus 200 Hyptis 400

. Ocimun 150 Lavandula 28 Molucella '4' Glechoma 10 a 12 Lepechinia 4

Tomado y modificado de Velázquez (1995)

3 TESIS DE GRADO

HIPO TESIS:

1. En vista de que la mayoría de las plantas pertenecientes a la familia Lamiaceae poseen tcrpcnoídes (CIO,Cts) y que existen reportes de que el género Lepechinia contiene sustancias aromáticas, cabe suponer que estas dos especies a estudiar presenten componentes volátiles que puedan ser aislados por hidrodestilación.

2. Tomando en cuenta que las especies del género Lepechinia estudiadas anteriormente, reportan la presencia de diterpenos de las series abietanos y guaianos así como triterpenos de la serie ursano, es posible que en las especies Lepechinia salviaefolia (KWith). Epling y L. Conferta (Benth). Epling existan componentes semejantes. De esta manera cabe esperar que los resultados que obtengamos ayuden a establecer, en estudios posteriores, un perfil quimiotaxonómico de este género.

5 TESIS DE ORADO ._

OBJETIVOS:

l. Extraer los aceites esenciales de hojas y flores de las dos especies.

2. Determinar el rendimiento de los aceites esenciales obtenidos de las hojas y flores de cada una de las especies y compararlos.

3. S~pm-at e i~ntificar cada uno de los componentes de los aceites esenciales obtenidos de las hojas y flores de las dos especies y compararlos.

4. Extraer, purificar e identificar algunos diterpenos que estén presentes en ambas especies de Lepechinias para aportar información sobre la fitoquimica del género para su posterior ubicación taxonómica.

6 TESIS DE GRADO

PRIMERA PARTE:

Capítulo 1: Compuestos Terpénicos (CwC1o)

1.1. Formación de Compuestos Terpénicos (C10-C10).

Los monoterpenos y sesquiterpenos tradicionalmente han sido considerados como productos metabólicos de desechos. Investigaciones realizadas a través de k>s años han indicado que estos compuestos pueden jugar un variado e importante papel como

mediadores de las interacciones de las plantas con su entorno (Crotea~l991).

Los monoterpenos (Cto), sesquiterpenos (Cts) y diterpenos (C2o) son grupos ~ compuestos isoprenoides. Las bases para la elucidación,·de la estructura quúnica de los terpenos fueron establecidas hipotéticamente por Wallach en 1887 y postulada por · , Ruzick.a en 1953, cuando propuso la JJamada "regla del isopreno", según la cual los terpenos son considerados como productos de la fusión de dos o más unidades de

isoprenos. La fórmula general de los terpenos es (Cslls)0 ; cuando n=2 los hidrocarburos son conocidos como monoterpenos, cuando n=3 son Jlamados sesquiterpenos· y cuando n=4 son diterpenos, existen también n=5 llamados sesterpenoides y n=6 que son los triterpenoides (Reineccius,l994). En la tabla 3 se presentan ejemplos de cada uno de estos compuestos.

7 TESIS DE GRADO

Tabla 3 AGRUPACIONES DE ATOMOS DE CARBONO EN LOS TERPENOIDES VEGETALES

~ de Unidades ~ de Carbonos Clase o tipo Estructura de isoprcno (n)

1 c5 Isopreno

2 Cto Monoterpenos (Mirceno)

3 Ct5 Sesquiterpenos (Cadineno)

4 Czo Diterpenos (Fitano)

Tomado y modificado de Albornoz 1980

8 TESIS DE ORADO

El proceso biogenético de formación de un terpeno puede ser dividido en cinco etapas fundamentales:

La primera etapa (figura 3) se puede defmir como de formación del precursor común, el ácido mevalónico.

La ruta es iniciada con la combinación de dos moles de acetilcoenzima A para producir acetoacetil coenzima A. Condensaciones enzimáticas del acetoacetil coenzima A

con otro mol de acetil coenzima A fom1an ~- hidroxi-J3-metilglutaril coenzima A; con liberación de coenzima A. Una posterior reducción enzimática, realizada por la enzima hidroxi-metilglutaril coenzima A reductasa y catalizada por NADPH, del grupo tioester del J3- hidroxi-(3-metilglutaril coenzima A produce ácido mevalónico (Erman, 1985).

Figura 3. Primera etapa de la biogénesis de monotcrpenos ·------;¡

CH COSCoA 0 0:H ~ H~O, enz 2CH COSCoA --.-.- .& ______. HOOC ..& 3 acetil coenzima A O SCoA -CoASI-l O SCoA Aceto acetil P-hidroxi- J3-metil- coenzimaA glutaril coenzima A

OH enz HOOCQ -SCoA HO Acido mevaJónico

9 TESIS DE GRADO

En la segunda etapa de la ruta, representada en la figura 4, se lleva a cabo la formación de las unidades isoprénicas: isopentenil piro fosfato y dimetilalil piro fosfato. Una serie de fosforilaciones y descarboxilaciones junto con la eliminación de la función oxígeno en el C3 (como fosfato) produce isopentenil pirofosfato, la unidad isoprenoide básica condensada, que contiene 5 átomos de carbono (Croteau,l991).

En el primer paso de la conversión de ácido rnevalónico en pirofosfato, el grupo 5-hidroxil del ácido mevalónico es fosforilado en un proceso controlado enzimáticamente requiriendo adenosín trifosfato (ATP) e ión magnesio. El intermediario ácido S-fosfato mevalónico, experimenta una segunda fosforilación ATP dependiente para producir ácido 5-pirofosfato

mevalónico. El último compuesto es enzi.máticamente transf~Emado con ATP en isopentenil pirofosfato, con eliminación de fosfato inorgánico y dióxido de carbono. Esto ocurre en dos . etapas, en la primera, el grupo 3-hidroxil es fosforilado con ATP, y en la segunda, el derivado resultante experimenta eliminación conjunta de dióxido de carbono y fosfato (Ennan, 1985).

Posteriormente el isopentenil pirofosfato es isomerizado a dimetilalil pirofosfato, el pr~er piro fosfato alílico (prenil) de la ruta (Croteau, 1991 ).

10 TESIS DE GRADO

Figura 4. Segunda etapa de la biogénesis de monoterpenos.

XH ATP,. XOPP ATP .. Mg+ Mg+ A_ l ~OOHl HO O OPP OH Q OPP acido acido-5- fosfuto acido-5-pirofusfuto rnevalonico rrevalonico rrevalonico ATP -HOPO l -C02

~OPP

Isopentenilpirofosfuto

1l

~OPP

Dirnetilalilpiro fosfato

11 TESIS DE GRAOO

La tercera etapa de esta ruta biosintética la cual se muestra en la figura 5, es la conversión de isopentenil piro fosfato en geranil piro fosfato (Erman, 1985).

El dirnetilalil pirofosfato, actúa corno co-substrato con el isopentenil pirofosfato en la condensación para formar el intermediario geranil piro fosfato, que contiene 1O átomos de carbono (Dewick,l999), progenitor de los monoterpenos (Crote~u, 1991).

La mayoría de los monoterpenoides son formados por la fusión "cabeza-cola" de unidades de isopreno (Croteau,1991). En menor número los terpenos son formados por acoplamientos anómalos del isopentenil y el dimetilalilpirofosfato (Errnan,1991). Otro ciclo de extensiones cíclicas envuelve la adición de isopentenil pirofosfato para fonilar el intermediario farnesil pirofosfato que contiene 15 átomos de carbono; el trans-trahS farnesil pirofosfato es considerado corno el progenitor de los sesquiterpenos. La ciclación en la serie sesquiterpenos es iniciada por ionización de el pirofosfato alflico e incluye ataques electrofilicos de los dobles enlaces centrales o distales de el precursor sobre el centro catiónico (Croteau,1991). De esta manera continúa el proceso para producir una serie de homólogos prenil pirofosfatos que se diferencian en el número de unidades isoprenoides. Los pasos de alargamiento de la cadena son catalizados por la prenil transferasa (Dewick, 1991 ).

La cuarta y quinta etapa de la ruta, resumidas en la figura 6, enwelven la conversión de geranilpirofosfato y nerilpirofosfato en los diferente monóterpenos: acíclicos (Figura 7), bicíclicos (Figura 8), irregulares (Figura 9), sesquiterpenos (Figura 1O) y diterpenos (Figura 11) (Errnan, 1985).

Todos los terpenos sintetizados por esta ruta, pueden presentar funciones oxigenadas como cetonas, aldehídos, ácidos y alcoholes (Croteau,l991).

12 TESIS DE ORADO

Figura 5. Tercera etapa de la biogénesis de monoterpenos. ------~------·-·--·-- -· ·- --· -·------·------11 ~~P+~OPP ~~OPP DMAPF IPPF l H OPP OPP N erilpirofosfuto Geranilpirofos:Jato ~OPP IJ>PF 1

e is-trans famesilpirofusfato Trans-trans famesil pirofusfato

13 TESIS DE GRADO

Figura 6. Cuarta y quinta etapa de la biogénesis de monoterpenos.

OPP

Geranylpirofusfuto N erilpirofusfato l l Progenitor xronoterpenos Progenitor monoterpenos aci::licos ci::licos

14 TESIS DE GRADO

Figura 7. Estructuras de monoterpenos acíclicos.

OH

Ocil:reno Mirceoo Geranio!

OH

Nerol

H

Limlol Geranial N eral

15 TESIS DE GRADO

Figura 8. Estructura de monoterpenos bicíclicos. e}; a- pineno J3- pineno Careno

rfro ~OH

Alcanfor Borneo! Canfeoo

16 TESIS DE GRADO

Figura 9. Estructuras de monoterpenos irregulares. AÁCOOH Isoarternisia cetona Acido crisantemico (arternisilo) ( crisantemilo)

Rose:furano Lavandubl (lavandulilo)

17 TESIS DE ORADO

Figura 10. Estructuras de sesquiterpenos.

Cadireno 13-bumuleno Trans-cariofik:no

,.....

Ge11l"IlCrem-A p-eJe manos

Nerolidol Bisabo1em Zingibereoo

18 TESIS DE GRADO

Figura 11. Estructuras de diterpenos~

·¡··A.. ,~ .. ,,,

FITOL

OH

Manool Acido Ab~tico

OH Acido Labdamlico Acido Podocarpk:o

19 TESIS DE GRADO

1.2 Localización y composición de los terpenos C111-C15 (aceites esenciales).

Se considera que la síntesis de los compuestos tél'pénicos se realiza en los tejidos de las plantas como productos de degradación de los materiales de reserva, de naturaleza quimica compleja (Casamada, 1977). La acwnulación de estos aceites se realiza en estructuras histológicas especializadas, bajo la forma de gotas muy pequetlas que se ponen de manifiesto en las plantas por su olor fuerte y agradable, localizándose ·en determinados tejidos, frecuentemente situadas sobre o en la proximidad de la suj>erficie de la planta, según la familia de plantas de que se trate; así tenemos:

- Células con esencias: Lauráceas, Zingiberáceas

- Pelos secretores estipitados o sésiles y con cabeza pluricelular: Lamiaceae

- Bolsas o cavidades secretoras esquizógenas (Mirtáceas) o esquizolisígenas (Rutáceas, Burseráceas).

-Canales secretores: Umbellíferas, Compuestas. (Bruneton,1991; Casamada ,1977)

En general, los compuestos terpénicos pueden loé3lizarse en flores, hojas, frutos y son menos comunes en raíces (Domínguez,l975). También se les puede encontrar en rizomas, leños, cortezas y semillas (Bruneton, 1991) .

Los compuestos terpénicos C10. C1s (esencias) son generalmente mezclas. de

hidrocarburos y compuestos oxigenados derivados de ellos. Se exceptúan los d~rivados de heterósidos (almendras amargas y mostaza). Estos compuestos oxigenados le imprimen olor y sabor, al mismo tiempo los hacen solubles en agua, pero más en alcohol (Evans,l991), también son solubles en éter y la mayoría de los disolventes orgánicos (Tyler, 1988).

Los aceites esenciales pueden contener hidrocarburos alicíclicos y aromáticos, así como sus derivados oxigenados (ácidos libres, aldehidos, cetonas), sustancias azufradas ( allicina del ajo) y nitrogenadas. Los compuestos más frecuentes derivan biogenéticamente del ácido mevalónico (timol y carvacrol), los menos frecuentes Se originan de la ruta del ácido shiquímico ( eugenol) y d;'ta degradación de ácidos grasos, (butanaldehído) (Domínguez,l975; Marcano, 1991). Solamente unos pocos poseen un solo componente en porcentaje elevado, por ejemplo, la mostaza contiene no menos del 93% de isotiocianato de alilo, la esencia de clavo no menos de 85% de sustancias

20 TESIS DE GRADO

fenó licas, específicamente eugenol (Tyler, 1965). Algunos aceites esenciales se encuentran en la planta en forma de precursores no volátiles, frecuentemente glicósidos (M arcano, 1991 ).

Los aceites fijos y los aceites esenciales se diferencian en forma general, por ser los últimos, volátiles a temperatura ordinaria, pueden ser separados por arrastre de vapor, no dejan mancha grasosa permanentemente en el papel, no contienen glicéridos y por lo tanto no pueden ser saponificados con álcalis (Albornoz, 1980).

La composición de un aceite esencial está en función de la especie productora; en plantas con aceites esenciales son muy frecuentes las razas químicas; los diferentes constituyentes pueden variar proporcionalmente de manera importante durante el desarrollo del ciclo biológico de una especie dada, razón por la cual debe elegirse razonadamente la fecha de recolección. En la producción de aceite inciden directamente las condiciones climáticas, la naturaleza del suelo, prácticas de cultivo, densidad de plantación, intensidad y modalidad de ríego y la utilización de abono (Bruneton, 1991; Domínguez, 1975).

A los aceite esenciales se les pueden determinar algunas constantes fisicas y propiedades químicas, debido a la diversidad de estructuras, puesto que el grupo engloba sustancias muy heterogéneas (Tyler, 1965). Son líquidos a temperatura ambiente, muy raramente tienen color y en general su densidad es inferior a la del agua, pero se disuelven en ella lo suficiente como para comunicarle su olor. Son solubles en alcoholes y en diso !ventes orgánicos habituales; son arrastrables por el vapor de agua (Bruneton, 1991; Tyler, 1965). En su mayoría son ópticamente activos con índices de refracción muy elevados y sus rotaciones específicas suelen ser un valioso dato para identificarlos (Tyler, 1965).

1.3 Función de los compuestos terpénicos (C 10- C 20) en la .planta.

Los compuestos terpénicos constituyen los elementos de la comunicación química en las plantas debido a su marcado olor y volatilidad. Se les atribuye un importante papel en la polinización, donde intervienen como hormonas, y como intermediarios en la dispersión de las diasporas (Marcano, 1991 ).

21 TESIS DE GRADO

Debido a la localización periférica de los elementos secretores, estos compuestos (aceites esenciales) proveen a la planta de un medio de defensa frente a depredadores (microorganismos, hongos, insectos, herbívoros) y anteriormente se les cons~d~ra,pa' )("­ productos de desecho metabólico (Bruneton,l991). Son productos de reserva, protegen los tejidos de la planta contra la acción de agentes atmosféricos; evitan el recalentamiento de

la planta mediante el mecanismo de ahorro del agua, ya que el calor absorbido sirve p~~- la evaporación 4.el aceite esencial y prevenir la evaporación excesiva del agua deJas células.\Son donadores de protones en reacciones de óxido-reducción, cicatrizan heridas, son fuente de energía durante un estado deficiente causado por interrupción de la

asimilación normal de C02, pueden actuar corno horrnónas inhibitorias (ác.absicico) del crecimiento (Albornoz. 1980).

Por su parte, los diterpenos, los cuales se encuentran frecuentemente en las hojas, tallos y capítulos de las plantas; ocupan un lugar fundamental en la biología vegetal. en forma de giberilinas, que actúan como hormonas de crecimiento de las plantas; así mismo, les confieren propiedades tóxicas, irritantes de la piel y cancerígenas (Banthorpe, 1980; Bruneton, 1991 ).

1.4 Utilidad de los compuestos terpénicos (C 10- C20) para el hombre

Anualmente a nivel mundial se producen grandes cantidades de diversos tipos de esencias (Evans,1991). Las principales industrias consumidoras de aceites esenciales son la perfumería, la industria agroalimentaria y la industria del medicamento': Muchas plantas con aceites esenciales no se utilizan únicamente para extraer los principios volátiles que contienen, sino que también se emplean al natural como .. especies y aromas, así como por sus propiedades medicinales (Bruneton, 1991 ).

El uso de esencias en la conservación de alimentos y cosméticos es debido a que los componentes de muchas esencias interfieren en la respiración y el transporte de electrones de diversas bacterias, confiriéndole su carácter de conservadores (Evans,l991).

Muy importante es la aplicación de las esencias en la preparación de medicamentos, como agentes saborizantes y aromáticos especialmente para jarabes, elíxires, suspensiones y en la preparación de Fórmulas Magistrales como tópicos gingivales analgésicos y antisépticos, como es el caso del aceite de clavo. (De Filipis, 1989). También debe mencionarse su uso en la· síntesis industrial de la vitamina A,

22 TESIS DE GRADO en la cual se usa el aceite de citronela (Albornoz, 1980); las esencias de limón, rosas y trementina han sido muy usadas en perfumería como aromatizantes (Morris, 1984).

Debido al creciente interés en el uso de estas sustancias en la industria farmacéutica, las investigaciones sistemáticas con aceites esenciales obtenidos de plantas han tenido un papel muy importante, para establecer propiedades terapéuticas de los aceites esenci~les (Baratta, 1998).

Las propiedades antisépticas y desinfectante de los aceites esenciales se han , aprovechado a través del tiempo (Marcano,l991). El uso de estos compuestos como antimicrobianos naturales es importante no sólo en la preservación de alimentos sino también en el control de enfermedades humanas de origen microbiano. Las infecciones bacterianas y fiíngicas representan una gran amenaza para la salud, especialmente en sujetos inmunocomprometidos (enfermos de SIDA), de aquí la necesidad de encontrar agentes antimicrobianos efectivos y económicos (Baratta, 1998).

El poder antiséptico (y no antibiótico) de los aceites esenciales es evidente frente a varias bacterias patógenas, cepas resistentes a antibióticos, hongos inferiores responsables de micosis y levaduras como la Candida albicans (Bruneton, 1991 ). Hoy en día estos han sido sustituidos por las sulfonamidas y antibióticos, sin embargo, la carvona, mentona, citronelal, mentol, linalool, citral, geranio! y timol poseen propiedades antisépticas mayores que el fenol (Marcano,1991) y el aceite de cedro de varias especies de Juniperus ha mostrado actividad antibacteriana comparable a la estreptomiciria , (Meccia, 1998).

Muchas fragancias tiene la propiedad de estimular o deprimir la corteza cerebral y son usadas en aromaterapia para facilitar el sue:fio, calmar tensiones nerviosas y serenar la actitud del individuo (Bucbauer et al,l993). Ejemplo de ellas son la valerialm, asafétida, toronjil y lavanda(Marcano,l991)

Un moderno uso de los compuestos aromáticos es en el control, regulación o supresión del apetito en personas obesas. Olores desagradables reducen el placer de comer y el apetito. Otra aplicación de estos compuestos es en el alivio de los síntomas de cacosmia, una forma especial de parosmia, aflicción del sistema olfativo que sólo permite olfatear olores fétidos. También en el tratamiento de enfermedades como arterioesclerosis

23 . TESIS DE GRAOO

y cáncer (Baratta et al, 1998). Otras propiedades terapéuticas de los terpenos son mostradas en la Tabla 4.

TABLA4

PROPIEDADES TERAPEUTICAS DE LOS TERPENOS

MONOTERPENO usos FUENTE BOTANICA

13- felandreno Expectorante Pinus sp.

1,8-cineol Expectorante, antiséptico Euca/yptus g/obulus Labill.

Alcanfor Contrairritante, anestésico, Achillea millefolium L. antiséptico,estimulante circulatorio

Ascaridol Antihelmíntico Chenopodium ambrosioides L

Bomeol Perfumería Rosmarinus officina/is L.

Carvona Carminativo, antiséptico, Mentha spicata L. perfumes, saborizante

Citral Saborizante, síntesis de vit. A, Cymbopogon citratus perfumería Stapf.

Fenchona Contrairritante, perfumes Foeniculum vulgare Mili.

Limoneno Expectorante, saborizante, Citrus sp. alimentos, brebajes Menthasp.

Mentol Antiprurítico, contrairritante, Mentha piperita Ehr. analgésico. Var.citrata.

Tomado y modificado de Bruneton,1991

24 TESIS IJE GRADO

En cuanto a los datos sobre la toxicidad de las esencias~ estos son muy fragmentarios, sus posibles efectos secundarios no han sido estudiados ni se ha demostrado la ausencia de efectos cancerígenos o teratogénicos. Entre las toxicidades conocidas están la de las esencias con tuyona, ajenjo, ciertas variedades de salvia y esencias con (-)-pinocanfona, son psicoanalépticos que ingeridos a elevadas dosis producen crisis epileptiformes y tetaniformes, trastornos psíquicos y sensoriales. También la esencia de hisopo causa crisis epileptiformes. El cis-anetol causa convulsiones; la esencia de sabina, hemorragias uterinas; la esencia de enebro, hematurias. Dos gramos de mentol pueden ser mortales para un adulto y usado como gotas nasales en nifios, pueden producir espasmos en la glotis con el riesgo de asfixia refleja (Bruneton, 1991).

25 TESIS DE GRADO

Capítulo 2: Antecedentes bibliográficos sobre compuestos terpenicos (C10-C20) en el género Lepechinia y sus usos medicinales.

Diversos estudios fitoquímicos sobre aceites y otros compuestos de este género han sido realizados y se han determinado actividades farmacológicas en algunas especies. A continuación se presentan algunos:

2.1. Monoterpenos y sesquiterpenos en el género Lepechinia.

En la Lepechinia calycina Epling., Lamiaceae nativa de América del Norte. se identificaron corno principales componentes el 1,8- cineol (19.7%), alcanfqr (17.5%), 8-3- careno, canfeno, pineno y cariofileno, cuyas estructuras son mostradas en la figura 12 (Lawrence, 1979).

Figura 12. Compuestos aislados de la Lepechinía calycina Epling.

Alcanfor Canfeno

1,8- cineol

Cario fileno Pire no Careno

El aceite hidrodestilado de la planta con flores de Lepechinia jloribunda (Benth) Epling, colectada en Provincia de Córdoba, Argentina; fue estudiado por medio CG y CG/EM. Fueron identificados 36 componentes de los cuales el mayoritario fue el borne~l

26 TESIS DE GRADO

(21.44%), obteniéndose también P- cariofileno, aromadandreno y acetato de ledilo, mostrados en la figura 13 (Velasco, 1994).

Figura 13. Compuestos aislados de la Lepechiniajloribunda (Benth) Epling. trH Bomeol

P-cariofileno Arormdandreno

27 TESIS DE GRADO

De la Lepechinia urbaniana (Brig) Epling, se reporta el aislamiento y elucidación de la estructura de dos sesquiterpenos de la serie guaianos, mostrados en la figura 14, los primeros obtenidos a partir del género Lepechinia (Ahmed, 1996).

Figura 14. Sesquiterpenos de la serie guaiano aislados de la Lepechinia urbaniana (Brig) Epling.

HO

Los principales componentes aislados del aceite esencial de la Lepechinia schiedeana (Schlecht) Vatke, de Colombia y Venezuela son los mostrados en la figura 15: mirceno, 0-3- careno, a-terpineno, ocimeno, farneseno, cadineno y ledol entre otros (Stashenko,1997; Rojas,1999).

28 TESIS DE GRADO

Figura 15. Compuestos aislados de la Lepechinia schiedeana (Schlecht) Vatke.

Mirceno 3- careoo a-terpineno

Ocitreno Farneseno Cadineno

.. - >tS;;...... Ledo!

Cerca del 90% de los compuestos (65 componentes) del aceite esencial de la Lepechinia chamaedryoides (Balbis) Briq, fueron identificados, siendo la mayoría sesquiterpenos, también se obtuvieron a-felandreno, P-cariofileno, t-cadinol, espatulenol, limoneno y 8-cardineno, cuyas estructuras pueden verse en la figura 16 (Valenzuela,l992). La planta colectada en distintas estaciones del año, verano y

29 TESIS DE GRADO

primavera, mostró diferentes componentes: ácido betulínico y ácido urs6lico (triterpenos) respectivamente (Silva, 1968).

Figura 16. Compuestos aislados de la Lepechinia chamaedryoides (Balbis) Briq.

H~ ~ ~ H /'--.... a - felandreno Cario fileno T-cadinol

Espatulenol Limoneno 8- cadineno

2.2. Diterpenos en el género Lepechinia.

A partir del extracto en metano} de Lepechinia bullata (Kunth) Epling fueron aislados tres quinonas diterpenicas citototóxicas: 6,7-dihidroroyleanona, horminona y 7-0- metilhormonona; siendo estos compuestos, mostrados en la figura 17, los primeros reportados para esta especie (Jonathan, 1989).

30 TESIS DE GRADO

Figura 17. Diterpenos aislados de la Lepechinia bu/lata (Kunth) Epling. 11------·------tll

7-0-rretil honninona Honninona

6, 7 -dihidroroyleanona

De las hojas de la Lepechinia meyeni (Walp.) Epling, natural de Perú fueron aislados cuatro diterpenos del grupo abietano previamente reconocido (pisiferol, rosmanol, ácido carnosico y salvicanol) juntos con dos diterpenos que fueron identificados como isosalvicanol y un derivado 12- formil abietano. De las hojas de Lepechinia hastata (A.Gray) Epling sólo se ha aislado el ácido camosico (Bruno,l991). Figura 18

31 TESIS DE GRADO

Figura 18. Diterpenos aislados de la Lepechinia meyeni (Walp) Epling.

Salvicanol Isosalvicanol

Un nuevo diterpeno, ácido 7~- hidroxi- abieta- 8 (14)- en- 18- oic- 9 a, 13 a, endoperoxido (figura 19), junto con ácidos ursólico y oleanóico, así como flavonoides conocidos como salvigenin y cirsimaritin, fueron aislados de las hojas de Lepechinia caulescens (Ort.) Epling (Delgado, 1992). A partir de la Lepechinia hastata (A.Gray) Epling se obtuvo carnosol (figura 20) en forma pura (Dimayuga,l991).

32 TESIS DE GRADO

Figura 19. Diterpeno aislado de la Lepechinia caulescens (Ort) Epling.

7- ~ -hilioxi-abieta-8(14)-en- 18-oic-9 a, 13 a-endoperox:ido

Figura 20. Diterpeno aislado de la Lepechinia hastata (A.Gray) Epling.

OH

... ··. Carnoso}

Para la Lepechinia urbaniana (Brig) Epling se reporta el aislamiento de seis diterpenos de la serie abietano, mostrados en la figura 21, identificados como carnoso!, 20- deoxocarnosol, 6-hidroxicarnosol, rosmanol, 7-metoxirosrnanol, 7-etoxirosmanol (Ahmed, 1995).

33 TESIS DE GRADO

Figura 21. Diterpenos de la serie abietano aislados de la Lepechinia urbaniana (Brig) Epling.

OH OH

carnosol 20-deoxocarnosol

OH OH

6-~oxicarnosol rosmaool

OH OH

7-rretoxirosmmol 7-eto>drosnlaOOl

34· TESIS DE GRADO

2.3. Usos medicinales del género Lepechinia.

En algunos países son aprovechadas las propiedades medicinales de algunas

especies de este género: La Lepechinia hastata (A.Gray) Epling conocida localment~ como chicura de la sierra, en Baja california sur (Méxipo ), es reportada para la cura de infecciones uterinas al ingerir la decocción de sus raíces e investigaciones posteriores del · extracto de material seco mostraron actividad antimicrobiana contra miroorganismo seleccionados S. aureus, S.fecalis, B. subtilis (Dimayuga,l991).

La Lepechinia caulescens (Ort.) Epling fue usada en un estudio de efeCto antihiperglicemiante de 28 plantas medicinales usadas en el tratamiento de diabetes mellitus. Los resultados mostrados por 8 de estas plantas, entre las que se encontraba esta especie, fue el decrecimiento significativo del pico hiperglicémico y/o el área bajo la curva de tolerancia a la glucosa (Alarcon,1998).

En el desarrollo de un método para monitoreo de la degradación oxidativa en lípidos y evaluación de la actividad antioxidante de productos naturales, se escogió como modelo la Lepechinia schideana (Schlecht) Vatke, la cual mostró una capacidad de bloqueo de lipoxidación 4 veces superior a la de la vitamina E, demostrando también un notorio sinergismo con este antioxidante natural (Stashenko, 1997).

La Lepechinia chamaedryoides (Balbis) Briq, comunmente conocida como "salvia"es una planta endémica de Chile; los vapores de la cocción de las hojas son usados en medicina popular como un emenagogo (Valenzuela,1992).

35 TESIS DE GRADO

SEGUNDA PARTE:

Capítulo 3: Estudios preliminares sobre las dos especies de Lepechinia a estudiar.

3.1 Selección e identificación del material vegetal. El material vegetal fue seleccionado para ser estudiado, en vista de que en la revisión bibliográfica realizada sobre el género Lepechinia no se encontraron datos sobre las especies L. conferta (Benth).Epling y L. salviaefolia (Kunth). Epling. Sin embargo existe abundante información sobre este género, pudiéndose destacar la referente a sus propiedades farmacológicas y terapéuticas, las cuales esperamos encontrar en las dos especies estudiadas y al mismo tiempo aportar información quimiotaxonómica.

3.1.1. Descripción del genero Lepechinia.

"Sufritices, arbustos o arboles de hasta 5 metros, muy aromáticos. Hojas rugosas, ásperas. Flores sésiles o subsesiles, en verticilastro dispuestos en racimos o panículas. Caliz casi regular, con 5 dientes deltoides, agudos. Corola blanca o azul, ligeramente bilabiada, los labios planos. Estilo apenas bífido, con ramas subiguales, subuladas o aplanadas (Velazquez, 1997).

En Venezuela el género Lepechinia se asocia a pisos altitudinales entre los 1.500 y 3.500 msnm (Cegarra,l996). Representados por las especies: Lepechinia bu/lata (Kunth) Epling, Lepechinia conferta (Benth). Epling, Lepechinia salviaefolia (Kunth). Epling y Lepechinia schiedeana (Schlecht) Vatke; las cuales se distribuyen en los estados Anzoátegui, Lara, Mérida, Miranda, Sucre, Táchira, Trujillo, y el Distrito Federal; en Jugares alterados, sabana, bosque de galería, bosque nublado, subpáramo y páramo; entre 1.900 y 3.400 msnm (Velazquez,l997).

3.1.2. Lepechinia conferta (Benth) Epling:

Sinonimia: Sphacele co'!ferta.

Arbusto, medio arbusto o pequeños árboles con hojas ampliadas, elípticas lanceo ladas hasta codiforme y truncadas en la base, flores pequefias, verticiladas, los verticilos multitudinarios y en panicula; cáliz dentado mayormente deltoide, obtuso, estambres mayormente incluidos. Inflorecencia espigada, glomerada, paniculadas, las ramas verticiladas y sésiles, estambres incluidos o levemente excertos. Flores usualmente

36 TESIS DE ORADO

3 o más en las axilas de las brácteas, más frecuentemente en multitudes y glomeradas, los , glomérulos frecuentemente espigados (Cegarra, 1996).

3.1.3. Lepechinia salviaefolia (Kunth). Epling

Sinonimia : Sideritis salviifolia

Arbusto aromático de hasta 4 m, ramas teretes puberulas, hojas oblongo lanceo ladas, subagudas en el ápic~, redondeado truncadas a redondeado angostados en la base; con frecuencia estrechas en los pecíolos, láminas foliares de 6-12cm de largo y de 2- 5cm de ancho con borde aserrado, haz glabro-puberulo-verdoso bullado rugoso, envés reticulado- venuloso, diminuto y densamente tormentosa (Cegarra, 1996).

37 TESIS DE GRADO

3.2 RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL:

La primera recolección del material vegetal de ambas especies fue realizada en el Páramo de La Negra, vía Pregonero a orillas de la carretera, en las cercanías de la población de Bailadores (aproximadamente a 25 Km) durante el mes de Octubre de 1998. Durante la misma se hizo el reconocimiento de las especies en su hábitat natural, poniendo especial atención en el tamaiio de la planta, altura del terreno a la cual crece, forma de la hoja y del tallo, etc. Se prepararon especúnenes voucher de ambas especies para el herbario :MnRF identificados como: Lepechínia salviaefolia (Kunth) Epling,. (Rojas- Usubillaga 021) y Lepechinia conferta (Benth) Epling, (Rojas- Usubillaga 013). En esta primera recolección se obtuvo 2.606 gramos de hojas de Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling y 850 gramos de hojas de Lepechinia conferta (Benth) Eplin.g. De flores se recogieron 41 O gramos y 260 gramos respectivamente. En el mes de junio de 1999 se realizó una segunda recolección de Lepechinia conferta (Benth) Epling sin flores, de aproximadamente 725 gramos de hojas, en el mismo lugar. En el mes de enero del 2000 se hizo la tercera recolección de Lepechinia conferta (Benth) Epling sin flores con un peso total de 2.360 gramos. Toda la identificación de este material vegetal, mostrado en las fotografias 1 y 2, fue hecha por los Ingenieros Jesús Alexander Cegarra y Juan Carmona en el herbario MERF de la Facultad de Farmacia.

38 TESIS DE GRADO

Fotografía l. Lepechinia conferta (Kunth) Epling en su hábitat natural y detalles de la inflorescencia. ur------~n

Tomada de Cegarra, 1996.

39 TESIS DE GRADO

Fotografía 2. Lepechinia salviaefolia (Benth) Epling en su hábitat natural y detalles de su inflorescencia.

Tomada de Cegarra, 1996.

40 TESIS DE GRADO

CAPITULO 4: AISLAMIENTO DE LOS COMPUESTOS TERPENICOS (C 10 - C 1 ~) Y

DITERPENICOS (C2o)·

4.1 EXTRACCION DE LOS ACEITES ESENCIALES.

La extracción de los aceites esenciales a partir del material vegetal fresco (hojas y · flores) de ambas especies, se realizó por medio de un equipo de hidrodestilación, empleando la trampa de Clevenger, como se muestra en la fotografia N° 3 (Cañigueral. 1990). Las hojas y flores fueron cortadas con la finalidad de romper las células que contienen los aceites aromáticos y aumentar así el rendimiento de la extracción, según el procedimiento descrito por Croteau ( 1991 ); luego fueron colocadas en un balón de destilación de 12 litros de capacidad, cubiertas con suficiente agua y sometidas a ebullición a una temperatura de 100 °C durante 4 a 6 horas aproximadamente. Los aceites obtenidos fueron tomados de la trampa de Clevenger, se les adicionó sulfato de sodio anhidro para eliminar las trazas de agua y fueron guardados protegidos de la luz y refrigerados a 4°C (Domínguez, 1975).

E uema 1. Obtención de los aceites esenciales:

Aceite 1 A

Aceite 1 B

Aceite 2 A

Aceite 2 B

41 TESIS DE GRADO

Fotografía 3. Equipo de Hidrodestilación con trampa de Clevenger

42 TESIS DE GRADO

4.2. IDENTIFICACION DE LOS COMPONENTES DE LOS ACEITES. /1 1 ') La identificación de los componentes volátiles se realizó por medio de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (CG/EM) y determinación de los índices de· Kováts (Skoog,l994). 4.3. DETERMINACION DEL NUMERO DE COMPONENTES POR CROMATOGRAFIA DE GASES. La cromatografia de gases fue empleada para separar y estimar el número de componentes de los aceites esenciales (Wijesekera, 1991 ). Se utilizó un cromatógrafo de gases marca Perkin Elmer, modelo Autosystem, equipada con tres columnas diferentes: HP-1 (metilsilicona) de 60 metros de largo y 0.25 mm de diámetro, AT-5 (metil5% fenil silicona) y HP-Wax-20 M (carbowax)

El programa de temperatura utilizado fue el siguiente: 60°C isotérmico durante 4 minutos, con un incremento de 4°C por minuto hasta alcanzar 200°C durante 1 minuto, luego se aumentó a 280°C y se mantuvo durante 20 minutos. El inyector se mantuvo a 200°C y el detector a 280°C. El volumen de muestra inyectada fue de 0.2 Jll de aceite puro (Rojas, 1999).

43 TESIS DE GRADO

Esquema 2. Se oración de los com onentes de los aceites esenciales.

Aceite 1 A ono erpenos y sesquiterpenos Aceite l.A.

Aceite 1 B Monoterpenos y sesquiterpenos Aceite l.B. Separación de los componentes Volátiles por Cromatografía De gases (HP-1, AT-5, HP-Wax) Aceite 2 A Monoterpenos sesqu i ter penos Aceite 2 A.

Aceite 2 B Monoterpenos y sesquiterpenos Aceite 2 B.

4.4 CROMATOGRAFIA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASAS (CG/EM). Las esencias obtenidas se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas utilizando un cromatógrafo de gases marca Hewlet-Packard modelo 6898, con columna capilar HP-5 de 30 metros de largo y equipado con un detector de masa marca Hewlet-Packard modelo 5973. Los espectros de masas obtenidos mostraron información sobre el patrón de fragmentación del compuesto, su masa molecular y porcentaje de similitud con los

44 TESIS DE GRADO

compuestos contenidos en la sexta edición de la base de datos Wiley Ms

(Mclafferty, 1969; Alleman, 1989). Para el análisis se preparó una solución de 20 ~l de aceite en 1 mL de heptano.

4.5 DETERMINACION DE LOS INDICES DE KOV Á TS: El cálculo de los índices de Kováts de los aceites esenciales de las hojas y las t1ores de ambas especies se realizó en un cromatógrafo de gases marca Perkin Elmer modelo Autosystem equipado con un programa Turbochrom y el programa Kováts 40, sobre una columna AT-5. Se inyectó 0.5 ~1 de cada aceite puro, bajo el mismo programa de temperatura empleado para los aceites, se compararon los tiempos de retención de los componentes con una serie de n-parafmas (C7 - C22) y los valores obtenidos fueron. confrontados con los valores publicados en la literatura, logrando así la identificación de cada uno de los componentes.

4. 6 DETERMINACION DE CONSTANTES FISICAS. A los aceites obtenidos en suficiente cantidad se les determinaron las siguientes propiedades fisicas: índice de refracción, densidad. También se tomó el punto de fusión para los compuestos sólidos. 4.6.1 lndice de refracción: Fue medido en un refractómetro marca Bausch and Lomb,

con temperatura constante de 21 o C. 4.6.2 Densidad: Esta propiedad se determinó en los aceites esenciales, utilizando un picnómetro aforado de 2 mi diseñado para tal fm y temperatura controlada a 23° C. 4.6.3 Punto de Fusión: Para compuestos sólidos se utilizó el aparato de Fisher-Jhons.

4.7. PORCENTAJE DE LOS COMPONENTES DE LOS ACEITES. Para realizar éste cálculo se utilizó el mismo cromatógrafo empleado para la determinación de los índices de Kováts. Estos porcentajes obtenidos sobre las columnas de metil fenil silicona (AT-5, ALL TECH) y de carbowax (ALL TECH), fueron determinados según el área de cada pico; utilizando en el cromatógrafo de gases el programa Turbocrom y en el crornatógrafo de gases acoplado al espectrómetro de masas el programa HP Chem.

45 TESIS DE GRADO

4.8. FRACCIONAMIENTO DEL ACEITE POR CROMATOGRAFIA PREPARATIVA EN CAPA GRUESA Y ANÁLISIS POR CROMATOGRAFIA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASAS. Se hizo una cromatografla preparativa en capa gruesa de cada uno de los aceites esenciales de hojas de ambas especies. Las placas se desarrollaron en dos recorridos con una mezcla de diclorometano (100 ml) y 12 gotas de ácido fórmico; una vez secas se visualizaron con luz ultravioleta, pudiéndose demarcar las bandas de interés en cada una de las placas. Estas bandas fueron barridas con una espátula y colocadas en un beaker con el mismo solvente, posteriormente fueron filtradas al vacío para separar los compuestos existentes en las bandas. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por CG!EM al igual que una muestra de aceite puro. Una vez obtenido el espectro del aceite y de cada una de las fracciones, se compararon los picos y tiempos de retención que aparecieron en cada fracción con el cromatograma del aceite, lográndose identificar mejor el pico del compuesto mayoritario presente en cada fracción.

4.9. EXTRACCION DE LOS COMPUESTOS DITERPENICOS. 4.9.1. EXTRACCION CON SOLVENTES ORGANICOS EN CALIENTE. Se tomaron 378g de hojas de L. Sa/viaefolia (Kunth) Epling y se desecaron en estufa a 40° e, posteriormente fueron molidas para ser sometidas a extracción con hexano (esquema 1) y cloroformo (esquema 2) en caliente. El procedimiento se realizó en un equipo de extracción Soxhlet. La extracción se realizó durante 2 días con cada solvente, utilizando 2000 ml de cada uno y temperatura controlada a 60° e aproximadamente. Las fracciones obtenidas fueron unidas y concentradas a 100 ml cada una.

4.10. SEPARACION DE LOS COMPUESTOS DITERPENICOS 4.10.1. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA ABIERTA. Los extractos crudos obtenidos de las plantas fueron prefraccionados por medio de cromatografia al vacío, para lo cual se empleó una colunma rellena de sílica gel 60 (Merck tamafio 0.040 -0.063 mm), con un dispositivo de vacío en la parte inferior, usando

46 TESIS DE GRADO como sistema de solvente una mezcla de hexano -- acetato de etilo en orden creciente de polaridad en intervalos de 5% hasta alcanzar el 100% de acetato de etilo. De las fracciones obtenidas, se escogieron las que contenían menos impurezas y fueron sometidas a un nuevo fraccionamiento en columna abierta con silica gel 60, con la finalidad de purificar los compuestos presentes en el extracto de las plantas (Edwards, 1975; Wijesekera, 1991).

4.1 0.2. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Esta técnica fue empleada como un método de orientación sobre el posible número de compuestos presentes en los extractos (Galagovsky, 1995).

4.10.3. CROMATOGRAFIAPREPARATIVA EN CAPA GRUESA. Para esta técnica se empleó el aparato de Ritter-Meyer para la aplicación de la muestra y las placas fueron corridas usando como solvente una mezcla de 40 mL de cloroformo, 1.5 rnL de metano} y 1.5 mL de ácido fórmico. Los compuestos fueron visualizados por medio de luz ultravioleta. Al conocer la posición de la banda de interés se retiró la placa, barriendo la zona de la sustancia con una espátula, extrayendo luego la sustancia con un disolvente (Domínguez, 1975).

4.11. METILACION. Para esto se preparó una solución, colocando 1O gramos de nitrosometilurea previamente preparada en un balón de 250 mL de capacidad y cubiertos con 150 m.L de éter, enfriándola con un baño de hielo, se le adicionó una solución de 15 gramos de KOH en agua 50% p/v. Al balón con la mezcla se le ajustó un refrigerante y la misma fue calentada con agua tibia, al destilar la mezcla diazometano - éter, se recogió en un balón con éter, enfriándose en baño de hielo; por último fue agregada a la muestra estudiada disuelta en éter (Haitman,1957). Este procedimiento es mostrado en el esquema 4.

4.12. IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPUESTOS Los compuestos aislados fueron identificados por medio de espectrofotometría de infrarrojo, cromatografia de gases acoplada a espectrometría de masas y resonancia

47 TESIS DE GRADO

magnética nuclear de protones y carbono 13, HMQC, COSY y HMBC. Las técnicas espectroscópicas uní y bidimensionales se realizaron el Laboratorio de Espectroscopía de la Facultad de Ciencias de la ULA con un equipo marca Bruker de 400 MHz.

TERCERA PARTE

CAPITULO 5: RESULTADOS Y DISCUSION

5.1 F.XTRACCION DE COMPUESTOS TERPENICOS C 10-C 15 (aceites esenciales)

De la Lepechinia salviaefolia (Kunth). Epling fueron empleados 2.228 gramos de hojas, obteniéndose un rendimiento de 1.8 ml (0,08%) de aceite esencial de color amarillo, apariencia turbia y olor característico. De las inflorescencias fueron extraídos 41 O gramos con un rendimiento de 0.4 mi (0.09%) de aceite de color amarillo muy claro v olor característico. Estos rendimientos son resumidos en la tabla 5.

TABLA 5 RENDIMIENTO DE EXTRACCIÓN DE ACEITE ESENCIAL EN LAS HOJAS Y LAS FLORES DE LEPECHINJA SALVJAEFOLIA (KUNTH). EPLING

VOL. FECHA PESO OBTENIDO % -+---- HOJAS 06-10-98 2.228g 1.8 mL 0.08 --1------

-- ~----~--~------¡--- FLORES 06-10-98 410g 0.4 mL 0.09

Se realizaron tres extracciones de aceite de hojas de Lepechinia cor¡ferta (Benth) Epling y una de inflorescencias, obteniéndose un aceite incoloro, turbio y de

olor característico de las hojas. Los rendimientos de e~tas extracciones son mostrados en la tahla 6, en los cuales se aprecia la variación de los rendimientos de obtención de aceite según la época del año en que se hizo la recolección.

48 TESJS DE GRADO ------

TABLA 6 RF.NDlMIENTO DE EXTRACCIÓN DE ACEITE EN LAS FLORI~S Y LAS HOJAS DE LEPECHINIA CONJi'ERTA (BENTH).EPLINC

r-,..i ..~~ -- ~~,.,._~;.&."'~-""T-"'"=~ ..~.,.""· ""-"" ---- 7rm ...., ~- ..~-~ ...... ,... l VOL.

FECHA PESO 1 OBTENIDO % FLORES 06~10-98 ______:260 gr-· ···t i,~ffi}i_-;---·- .. ------0,53 ... --. ------.______. ¡ .----··-- -

! ------r· .... ------í HOJAS 06-10-98 1 850 gr ,4 mL 0,16 --- ·-· ------~-- 1 . - -- 26~06-99 ! 725 gr l 1,5 mL 0,20 ------+--2-7--0-1--0-0-- --620 g-~---·r 2 mL 0,32 l~~~~~~~~~~~~-~~~~~~~~~~~

De estos resultados se puede inferir que la variación de volumen obtenido en cada

~'xtracción es debida a la época en que se hizo la recolección, ya que durante los meses de liuvias (Junio y Octubre) en que se recolectó se obtuvo menor cantidad de aceite, esto se

puede deber a que la planta contiene mayor cantidad de agua, mientra~ que en meses de sequía (Enero) durante los cuales se recolectó y se ohtuvo mayor cantidad de aceite en la extracción, la planta presenta menos contenido de agua y el aceite esencial puede estar en mayo¡ cantidad.

:".2 CONSTANTES FÍSICAS: Fute medido d índice de refracción para los aceites de hojas y flores de amba'3 especies y la densidad para el aceite de hojas de Lepechinia coriferta (Benth) Epling. 1o dice de refraccion: Hojas de Lepechinia conferta: 1.488 Flores de Lepechinia conferta: 1.489'i Hojas de Lepechinia salviaefolia: 1.4955 Flores de Lepechinia salviaefolia: 1.663 La densidad del aceite de hojas de Lepechinia salviaefolia dio como resultado:

O.R l g/mL. El punto de fusión fue tomado en la Taxoquinona dando como resultados !J,J'" C.

49 I'I·:S!S DE CIRADU

5.3 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COMPONENTES DE LOS i\CEITES ESENCIALES POR CROMATOGRAFIA DE GASES. En el análisis realizado por cromatografia de ga''>es sobre una columna AT -5 (metil

5% fcnil silicona) de los aceites esenciales de hojas y flores de ambas especies, se estimó el número de compuestos según se muestra en la tabla 7.

TABLA 7 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE COMPUESTOS DE LOS ACEITES ESENCIALES POR CROMATOGRAFÍA DE GASES

N°DE COMPONENTES ACEITE --- Hojas de L. Salviaefolia 19 ' --~ -- ~-··--·- . ·- ·- ----30 ------Flores de L. Salviaefolia --- -·--·-

-~------··- Hojas de L. Conferta 47 ------Flores de L. Conferta 47

5.4 IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES DE LOS ACEITES. En el aceite esencial de las hojas de Lepechinia co11ferta se lograron identificar 44 compuestos, que representan un 87.9% (tabla 8}, de los cuales un 32.1% fueron monoterpenos hidrocarbonados, 1.7 % monoterpenos oxigenados, 17.9% sesquiterpenos hidrocarbonados, 35.6% sesquitcrpenos oxigenados y 0.5% diterpcnos oxigenados, siendo

los cuatro componentes mayoritarios: Ledo! (24.3%), <5-3-careno ( ll %), ~)-felandreno (9.7%), Arornadandreno (4.5%).

50 TESIS DE GRADO

TABLA 8 IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS HOJAS DEL CONFERTA (BENTH) EPLING

M-

SEÑAL TR (mio) AREA(%) COMPUESTO IKr IKc e------1 4.95 0.12 a-tujeno 931 927 -----·· ------2 5.12 1.13 a-pineno 939 941

1------~------1--- - 3 5.43 - a-fencheno 951 946 ------4 5.46 - Canfeno 953 956 5 5.59 0.17 Verbenene 967 963 6 6.35 0.38 Sabineno 976 976 7 6.14 3.56 13-pineno 980 984 1--- 8 6.46 0.75 13-mirceno 991 1001 1---- 9 6.57 - 3-octano1 993 1010 ,______- 10 6.85 2.22 a-felandreno 1005 1001 t------1---- 11' 7.03 11.07 8-3-careno 1011 1017 -1--- 12 1.41 0.98 p-cimeno 1026 1020 13' 7.58 9.72 ¡3-felandreno 1031 1030 ------14 7.96 0.30 1,2,3,4- - - tctramet i !benceno ------+------15 8.45 0.37 y-terpineno t-----¡()62 1062 ~-- - -- 16 8.79 0.25 Linalol oxido 1074 1071 1--- - 17 9.29 1.28 Terpinoleno 1088 1088 18 9.61 0.39 Linalool 1098 1099 19 10.30 0.29 p-menth-2-en-1-ol 1140 1139 20 12.01 0.53 Isopinocanfona 1173 1174

~- 21 12.11 0.31 Terpineol-4 1177 1176 ---- 22 12.34 -- p-cimen-8-01 1183 1184 1--- 23 12.54 - a-terpineol 1189 1190 24 13.09 - Trans-piperitol 1205 1201 25 17.71 - a-cubeneno 1351 1352 26 18.45 0.33 Iso1edano 1373 1371 1------r------27 18.57 1.69 a-copaeno 1376 \375-- 28 19.63 1.94 a-gurjuneno 1409 1410

~- 29 19.91 1.50 ¡3- cariotileno 1418 1418 ------30 20.29 0.67 Calaren o - - 31' 20.53 4.53 Aromadandreno 1439 1441

51 TESIS DE GRADO

Continuación tabla 8

32 20.66 0.67 13-selineno 1485 1485 33 22.28 3.41 Ledano 1481 1474 34 22.38 0.76 a.-muroleno 1499 1499 35 23.07 2.40 0-cadineno 1524 1524 36 23.47 - a.-cadineno 1538 1535 37 23.66 - a.-calacoreno 1542 1541 381' 24.37 24.23 Ledol 1565 1557 39 24.62 4.17 Spathulenol 1576 1582 40 24.84 3.79 Viridiflorol 1590 1589 41 25.26 2.59 Guaiol 1595 1595 42 26.78 0.48 a.-eudesmol 1652 1653 43 27.14 0.35 Bulnesol 1666 1668 44 35.39 0.50 Manoyl oxido 1989 1988

TR: Tiempo de retención de los componentes %: Porcentaje de área IKT: Indice de Kováts tomado de tablas bibliográficas (Adams, 1995) IKc: Indice de Kováts calculado con temperatura programada en columna HP-5

Del aceite esencial de las flores de Lepechinia conferta (tabla 9) se identificaron 47 componentes que representan el 92.8%, de los cuales un 31.7% son monoterpenos' hidrocarbonados, 1.8% monoterpenos oxigenados, 21.4% sesquiterpenos hidrocarbonados, 36.1% sesquiterpenos oxigenados y 1.7% diterpenos; los cuatro compuestos mayoritarios

fueron: Ledol (28.8%),f3-felandreno (11.7%), ~-3-careno (10.4%), Aromadandreno (3.6%).

52 TESIS DE GRADO

TABLA 9 IDENTIFICACION DE LOS COMPONENTES DEL ACEITE ESENCIAL DE FLORES DE L. CONFERTA (BENTH) EPLING

Señal TR (mio) Area (%) COMPUESTO IKT IKc 1 4.96 - a-tujeno 931 934 2 5.10 0.65 a-pineno 939 940 3 6.05 - Sabineno 976 978 4 6.14 2.75 f3-pineno 980 988 5 6.47 0.80 [3-mirceno 991 993 6 6.86 1.79 a-fe1andreno 1005 1004 7 7.02 10.48 &-3-careno 1011 1007 8 7.16 0.53 a-terpineno 1018 1015 9 7.30 0.59 p-cimeno 1026 1023 10 7.55 11.77 [3-felandreno 1031 1032 11 8.36 1.98 y-terpineno 1062 1063 12 8.63 T Cis-sabineno hidrato 1068 1067 13 8.79 T Cis-oxido linalool 1074 1074 14 9.21 0.49 Terpinoleno 1088 1088 15 9.28 1.33 Linalool 1098 1097 16 10.31 T p-ment-2-en-1-ol 1140 1142 17 11.59 T Pinocanfona 1173 1174 18 12.09 0.53 Terpineo1-4 1177 1177 19 12.36 T p-cimen-8-ol 1183 1184 20 12.55 T a-terpineol 1189 1191 21 12.69 T cis-piperito1 1193 1196 22 17.71 T a-cubeneno 1351 1351 23 18.42 T Isoledano 1373 1373 24 18.55 1.87 a-copaeno 1376 1379 25 19.62 2.42 a-gurjuneno 1409 1410 26 19.92 3.14 Trans-[3-cariofileno 1417 1417 27 20.16 0.47 a-selineno 1494 1494 28 20.29 0.70 Calareno -- 29 20.50 3.62 Aromadandreno 1439 1437 30 20.94 0.71 a-humuleno 1454 1454 31 21.16 T Aloaromadandreno 1461 1458

53 TESIS DE GRADO

Continuación tabla 9

- - ··------32 21.94 T fl-sel incno 1485 1488

------~------~------f------33 22.24 3.59 Leda no 1482 1481

f-- --~---~------34 22.46 0.50 Valenceno 1491 1497 ------35 22.61 T u-farncseno 1508 1509

------~------·-- -- 36 22.80 0.69 y-cadineno 1513 1515 37 23.08 3.61 8-cadineno 1524 1526 38 24.46 28.87 Ledol 1565 1568 39 24.62 0.63 Spathulenol 1576 1574 r--- 40 24.82 0.60 Globulol 1583 1580 ---- 41 25.05 0.40 Viriditlorol 1590 1594 42 25.24 2.01 Guaíol 1595 1596 43 26.18 0.60 y-eudesmol 1630 1631

44 26.69 0.85 ~-eudesmol 1649 1650 45 26.77 1.75 a-eudesmol 1652 1655 46 27.17 0.43 Bulnesol 1666 1667 1--- 47 35.42 1.73 Ka ureno 2034 2036

TR: Tiempo de retención de los componentes %: Porcentaje de área IKT: Indice de Kováts tomado de tablas bibliográficas (Adams, 1995) IKc: Indice de Kováts calculado con temperatura programada en columna HP-5

Haciendo un análisis comparativo de ambos aceites se puede evidenciar que los compuestos mayoritarios son los mismos pero con variación de sus porcentajes y que se diferencian por la presencia de diterpenos oxigenados en el aceite de hojas y diterpenos no oxigenados en el aceite de flores, tal como se muestra en la tabla 10.

54 TESIS DE GRADO

TABLA 10 COMPARACIÓN DE LA COMPOSICIÓN PORCENTUAL DE LOS ACEITES ESENCIALES DE HOJAS Y FLORES DE LEPECHINIA CONFERTA (BENTH) EPLING

COMPOSICIÓN HOJAS FLORES % IDENTIFICADO 87.9% 92.8%

MONOTERPENOS HIDROCARBONADOS 32.1% 31.7% MONOTERPENOS OXIGENADOS 1.7% 1.8% SESQUITERPENOS HIDROCARBONADOS 17.9% 21.4% ¡----~-----~--- -- SESQUITERP. OXIGENADOS 35.6% 36.1% - DITERPENOS " 1.7% DITERPENOS OXIGENADOS 0.5% -

Del aceite esencial de las hojas de Lepec:hinia salviaefolia se lograron identificar 19 componentes, que forman un 95.8% (tabla 11) con 30.1% de monoterpenos hidrocarbonados, 0.6% de monoterpenos oxigenados, 52.9% de sesquiterpenos hidrocarbonados y 12.0% de sesquiterpenos oxigenados. Como compuestos mayoritarios se identificaron: Ledene (28.2%), P-felandreno (25.8%), Espatulenol (8.9%), ¡3-selineno (7.6%).

55 TESIS DE GRADO

TABLA 11 IDENTIFICACIÓN DE LOS COMPONENTES DEL ACEITE ESENCIAL DE LAS HOJAS DE LEPECHINIA SALVIAEFOLIA (KUNTH) EPLING

SEÑAL TR(min) Area(%) COMPUESTO IKT IKc 1 5.11 0.43 a-pineno 939 940 2 6.04 0.20 Sabineno 976 969 3 6.13 0.20 ¡3-pineno 980 972 4 6.81 2.61 Mirceno 991 983 5 6.99 0.29 o-3-careno 1011 1003 6 7.39 0.56 p-cimeno 1026 1009 7 7.55 25.88 1>-felandreno 1031 1030 8 9.61 0.69 Linalool 1098 1098 9 19.92 4.70 ¡3-cariofileno 1418 1419 10 20.89 7.68 1>-selineno 1485 1452 11 20.98 1.23 12 22.11 3.98 Eremofileno - - 13 22.19 2.09 Yalencene 1491 1491 - - 14 22.29 1.80 Biciclogermacreno

15 22.55 28.24 Ledene 1482 1516

16 24.37 3.21 Ledol 1565 1571

17 24.68 8.93 Espatulenol 1576 1585

\8 24.83 2.64 Cariofileno oxido 1581 1594

19 25.39 0.45 a-guaiano 1439 1439

TR: Tiempo de retención de los componentes %: Porcentaje de área IKr: lndice de Kováts tomado de tablas bibliográficas (Adams, 1995) IKc: Indice de Kováts calculado con temperatura programada en columna HP-5

56 11\1 :, 1> 1 1 l 1{ ;\ 1H !

En el aceite esencial de las tlores de esta cspec1e, fueron identificados 30 componentes, que representan d 9 1. 9°1<, (tabla 12 ). de los cuales 32.1% fueron monoterpenos hidrocarbonados, 2.8% monoterpenos oxigenados, 46.2% scsquiterpenos hidrocarbonados, 9.4% sesquiterpenos oxigenados y 1.4% diterpenos oxigenados. Los cuatro compuestos con mayor porcentaje fueron: Ledo! (27.4%), ~-felandreno (12.2%), 8-3- c;m::nn (10.9°/Ó), Arornadandrcno (~.5~\.J

TABLA12 IDENTIFJCACION DE LOS COMPONENTES DEL ACEITE ESENCIAL DE FLORES DE L. S'ALV!AEFOLIA (Kunth) Rpling

tif"''"~ -TI ~....,"'i'>:'=ic'l!-.+.-."t"!th:at..~~,.,.:;,¿_==:,-_~~-~"-i""--;_¿-u.._

il: SEÑAL 1 TR (min) :l :\rca ("In) 1 COMPliFS 10 11< 1 K< l . l ' ¡,¡ ¡l -t-----5~ i\- ----~~- ·ü:67 1 o-pin~rhl <)jl) 926 ~ 1 ' .. 6. 1.4 . . , 2.8 7 11 11-píneo 980 982 ~ ~~ _\ ---j------6.46-----f-- O.RS _1l_ í~-mirc~no 9lJI 99lJ ~:.l:l lt: . : ~ 1 tll .¡ 1 6.RJ 1 : ,¡{) i Sabin~nu )76 lJ()-/ l : l ~·~~- -11(~:~1 ! ,::t~~·;~~·:.~. -~~~ -:::~~~ ·-~1

l.inalol oxidn \085 :~ 1 \ ~- cf:is·----t I.JS 1 !'t:rpinokJHl ! - i OX8 1ni/5- ~~~

:1: 1~ i Ll.6\ -- 0.12 , Linalu,ll \ 109X 1 \U" ~

\li 13 i2.lln 0.59 i hopinocanfnna 1 173 + 1 1911 ¡1:

ilf 14 18.56 \.¡{5 - 137t; - 1381 l1 1 ' -1409 j-_ 1407 1 1 :~ ~ ¡-~~-- ~ ~~~- _-)~::~~:"~ ... :::~ 1- ~::: - '1 L~~- ~tlo~~:j_~~~J~ -~-h~c~~:==- -~~-~-~-.-±~~4~2 ~:.

57 TESIS DE GRADO

Continuación tabla 12 =------r 19 21.19 0.44 01 nadandreno 1461 1461 1 ~- Alr;~, ------· ------1 20 22.24 3.4ú (J.- rneseno 1508 151 o

--- -~----. ------21 23.09 3.41 1 (') -ea· dineno 1524 1526

1 -- --~--··-- ---~---- 1 - 1------22 24.46 27.42 L edol 1565 1568 11 --~------~--· 23 24.65 0.59 S pa thulenol 1576 1572

. ---~--- --~------ll 2--l 0.38 V ir idi floro! 1590 1585 1 - -~ 25.06 - .. ------·:-· 25 25.24 1.87 ( !uaiol 1595 1603 ----- 26 25.40 3.44 - - 27 26.18 0.54 y -e u des mol 1630 1637

--- f------~------28 26.69 0.77 ~) -e u des mol 1649 1649

- ----·------" ---- - .. ------~_------t------29 26.78 1.58 o. -e u des mol 1652 ------30 35.41 1.41 M·an oyl oxido -= - 2020 ------:::~------

TR: Tiempo de retención de los componentes (Y.,: Porcent~je de área IK 1: lndicc de Kováts tomado de tublus bihliogrúticas (/\dums,I'J95) 1K e: lndice de Kováts calculado con temperatura programada en columna HP-5

5!\ TESIS DE GRADO

La composición de los aceites esenciales de las hojas y las flores de Lepechinia salviaefolia difieren en cuanto a los componentes mayoritarios y en la presencia de diterpenos oxigenados en el aceite de flores. Ambos aceites carecen de diterpenos no oxigenados, tal como se muestra en la tabla 13.

TABLA 13 COMPARACION DE LA COMPOSICION PORCENTUAL DE LOS ACEITES ESENCIALES DE HOJAS Y FLORES DE LEPECHINIA SALVIAEFOLIA (Kunth) Epling

COMPOSICION HOJAS FLORES

~----- % IDENTIFICADO 95.8% 91.9% ------·

-----~- MONOTERPENOS HIDROCARBONADOS 30.1% 32.1% MONOTERPRNOS OXIGENADOS 0.6% 2.8% SESQUITERPENOS 52.95 46.2% HIDROCARBONADOS SESQUITERPENOS OXIGENADOS 12.0% 9.4% DITERPENOS - - DITERPENOS OXIGENADOS - 1.4%

Todos los espectros de masas de los compuestos identificados son mostrados en los anexos.

59 TESIS DE GRAOO

5.5 FRACCIONAMIENTO DEL ACEITE POR CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA EN CAPA GRUESA Y ANÁLISIS PORCG/EM. En el fraccionamiento por cromatografía preparativa en capa gruesa se lograron separar e identificar los compuestos presentes en cada una .. de las bandas de la placa Del aceite esencial de hojas de Lepechinia conferta se obtuvieron siete fracciones, en , las cuales el componente mayoritario presente en la fracción 1 fue aromadandreno, en las fracciones 2, 3 y 4 ledol, fracciones 5 y 6 oxido de linalol y fracción 7 el 3-octanol; lo cual se muestra en la tabla 14.

TABLA 14 COMPUESTOS MAYORITARIOS DE LAS FRACCIONES DEL ACEITE ESENCIAL DE HOJAS DE LEPECHINIA CONFERTA (BENTH) EPLING.

TIEMPO FRACCION DE RETENCION COMPUESTO 1 19.78 ·Aromadandreno 2 23.84 Ledol 3 23.66 Ledol 4 24.66 Ledol 5 8.31 Oxido de linalo l 6 8.77 Trans-oxido de linalol 7 5.79 3- octanol

60 TESIS DE GRADO

En el fraccionamiento del aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefo/ia se obtuvieron seis fracciones, el compuesto mayoritario de las fracciones 2,3,4 y 6 fue el ledene, en la fracción 5 se logró identificar el espatulenol, estos resultados se muestran en la tabla 15.

TABLA15

COMPUESTOS MAYORITARIOS DE LAS FRA~CIONES DEL ACEITE ESENCIAL DE HOJAS DE LEPECHINIA SALVIAEFOLIA (KUNTH) EPLING TIEMPO FRACCION DE RETENCIÓN COMPUESTO 1 - - 2 23.96 Ledene 3 23.94 Ledene ,. 4 23.97 Ledene 5 24.11 Espatuleno 1 6 23.70 Ledene

61 TESIS DE GRADO

5.6 EXTRACCIÓN DE LOS COMPUESTOS DITERPÉNICOS. 5.6.1 EXTRACCIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS EN CALIENTE: HEXANO Al someter 378 gr de hojas secas y molidas de Lepechinia salviaefolia a extracción en caliente usando como solvente 2000 MI de hexano, se obtuvo un extracto de 44,8 gr, en el cual se formó un precipitado de cristales de color amarillo. El extracto fue filtrado usando hexano frío para lavar los cristales, logrando así separarlos, obteniéndose 190 mg. Se les realizó una cromatogra:fia en capa fina usando como sistema de elución hexano-acetato de etilo en proporción 50: 50 , logrando evidenciar que estaba presente en forma pura, por lo que se disolvió en cloroformo deuterado para analizarlo por medio de espectrofotometría 1 13 de infrarrojo, RMN-H , RMN-C , COSY, HMQC y HMBC. El resto del extracto fue preparado para cromatografia en columna abierta con sílica gel 60 (marca Merck tamaño 0.040-0.063mm) y eluído con una mezcla de hexano-acetato de etilo, aumentando la polaridad hasta alcanzar el 100% de acetato de etilo. Fueron recogidas 11 fracciones de 50Ml cada una, se les realizó cromatografla en capa fina con hexano acetato de etilo al 50% como eluente y se unieron las fracciones con igual perfil cromatográfico. En las fracciones número 8 y 6 al 10% de acetato de etilo, se formaron cristales (520 y 680 mg respectivamente), los cuales fueron separados y lavados con la mezcla hexano -acetato de etilo para compararlos por cromatografia en capa fina con la sustancia separada del extracto. Los cristales de la fracción número 8 resultaron ser iguales, por lo que se prepararon para ser identificados con las técnicas espectroscópicas mencionadas anteriormente. Los cristales de la fracción 6 (680 mg) fueron preparados en una columna abierta al vacío con sílica gel 60 (marca Merck tamafto 0.040 - 0.063111IIi), eluída con mezcla de hexano - acetato de etilo con aumento de polaridad hasta alcanzar el 100% de acetato de etilo. Se recogieron 12 fracciones de 50 MI cada una, fueron comparadas por cromatografia en capa fina y unidas las fracciones de igual perfil cromatográfico. De esta columna no se logró separar ningún compuesto; se estima que fue debido a la poca cantidad de muestra empleada. Este procedimiento se presenta en forma resumida en el esquema 3. Por medio del análisis, interpretación y coordinación de la información obtenida de 1 13 los espectros de infrarrojo (figura 2), RMN-H , RMN-C , espectrometria de masas y

62 TESIS DE GRADO

RMN bidimensionales: HMQC, H1 -H1 COSY de los cristales obtenidos a partir del extracto puro y en la fracción 8 de 10% de hexano- acetato de etilo, estos fueron identificados como taxoquinona. Esta sustancia no ha sido reportada para el genero ni para las especies de Lepechinias estudiadas anteriormente. Estos resultados se presentan en forma detallada en el punto 5.7 de este capitulo.

63 TESIS DE GRADO

ESQUEMA 3 EXTRACCIÓN EN CAIJIENTE CON HEXANO LEPECHINIA SALVIAEFOLIA (Kuntb) Epling 378 gr de hojas secas molidas

soJxlet (2000 mi de bexano) ~ 44,8 gr de extracto ---j){Cristales amarillos \190 mg)

Cromatografía+ en columna abierta al vacío (H exano- Al¡etato d e E·¡ho )

1 1 1 1 1 1 1

A

1 1 1 A3Fs A3F6 cristales Cristales amarillos 680mg 520mg

1 Cromatografia en columna abierta (Hex:AcOEt)

Cromatografia en capa fina

NO HUBO SEPARACIÓN

64 TESIS DE GI~ADO

5.6.2 EXTRACCION CON CLOROFORMO: En la extracción en caliente con cloroformo (esquema 5) se obtuvieron 12 gramos de extracto, los cuales fueron prefraccionados por cromatografia en columna abierta preparada con 130 gramos de silica gel 60 (marca Merck tamaño 0.040-0.063mm) y usando como eluente una mezcla de hexano - acetato de etilo en orden creciente de polaridad hasta alcanzar el 100% de acetato de etilo. Se recogieron 1O fracciones (A) de 75 mL cada una.

En la fracción número 3 al 10% de acetato de etilo (F3) se pudo observar la formación de cristales, estos fueron filtrados, lavados con hexano y recogidos; posteriormente se hizo una cromatografla preparativa en capa gruesa, usando hexano -acetato de etilo al 50% como eluentc. De esta cromatografia se obtuvieron 14 fracciones (B), de las cuales la número 6 (B6) presentó un color rojo intenso, por lo que se tomó para preparar una columna abierta con sfiica gel 60 y una mezcla de hexano - acetato de etilo como eluente. Se recogieron 1O fracciones de 50 mL (C), se compararon por cromatografla en capa fina y se unieron las de igual perfil cromatográ:fico. En las fracciones del 25 al 100% de acetato de etilo (Cs- C), se observó la formación de un precipitado blanco, el cual fue recogido obteniéndose 220 mg, cuyo comportamiento en cromatografia en capa fina con hexano- acetato de etilo al 50% como sistema de elución revelo la presencia de un compuesto con una coloración rojiza. Este precipitado fue analizado por espectrofotometria de infrarrojo, lográndose evidenciar la presencia de bandas de grupos ácidos (figura 22), por lo que se procedió a realizar una metilación con 130 mg. de precipitado, como se detalla en el esquema 4. Al compuesto metilado se le hizo cromatografia preparativa en capa gruesa, usando como solvente 40 mL de cloroformo, 1.5 mL de matanol y 1.5 mL de ácido fórmico, logrando separar 7 fracciones. De estas, la fracción 7 presento mejor separación, por lo que fue recogida para ser analizada por cromatografía de gases acoplada a espectrometria de masas, obteniéndose como resultado una mezcla de ácidos triterpenicos metilados cuyos núcleos fueron

tentativamente identificados como: 2a,3~,23-trihidroxi-12-en28 ácido metil ester; 3-oxo

olean-12-en-28 ácido metil ester; 3~-hidroxiolean-12-en-28- acido metil ester; 2a,3~­

dihidroxiolean-12-en-28 ácido metil ester; 2a,3~-dihidroxiolean-12-en-28 ácido metil ester.

65 TESIS DE GRADO

FIGURA 22 ESPECTRO DE INFRARROJO PRECIPITADO OBTENIDO

00.0 .. J

.,T

100.0

10.0

1 o.o-+~~~~~~~~~~~~~~~~+-~~~~~~~A~~~~~~+-~~~~~ 2000.0 1000.0•

66 TESIS DE GRADO ·

ESQUEMA4 METILACIÓN DE LOS ÁCIDOS TRITERPÉNICOS

1O gr de Nitroso- metil - urea se cubren con 150 mL de Et2 O

~ se enfría con bafio de hielo Se le afiade solución de KOH en HzO (50% p/v)

Mezcla (se calienta con agua tibia)

Al destilar la mezcla de diazometano-EhO se recoge en un balón sobre Et20

~ se enfría en baño de hielo

La mezcla diazometano-EtzO se agrega a la sustancia a metilar disuelta en EtzO

67 TESIS DE GRADO

ESQUEMAS EXTRACCIÓN EN CALIENTE CON CLOROFORMO Lepechinia Salviaefolia (Kunth) Epling 378 gr d+.hojas secas molidas soXhlet (200 mL de CHCh) 12 gr de extracto

Cromatografía+ en columna (Hexano -- 1}cetato de etilo)

1 1 1 1 1 1 1 ~!O) A¡ A2 AJ As A H~x11no 5% 10% 15% 1 2~/o 1 25% 100% 1 FJ cristales

~ Cromatografia Preparativa

1 l L 1 1 1 11 B¡ ~~~~~~ Bs 1111 B6 11 11 8¡4 11

Cromatografia en columna (Hexano -Acetato de Etilo)

1 1 1 1 1 1 C¡ CJ Cs c6 1He;ano 1 5% 10% ~o 20% 25% 1!0~/o 1 1 Precipitado IR ~ blanco

Cromatografia Preparativa ,.._,[ Metilación• 7 fracciones

•F1 --+ Esteres CG/EM Metila dos

68 TESIS DE GRADO

5.7 IDENTIFICACION DE LOS COMPUESTOS DITERPENICOS (TAXOQUINONA) 5.7.1 ESPECTRO ULTRA VIOLETA: en este espectro, realizado con metari.ol como solvente se observa la banda de absorcin en 275.0 nm y la absorbancia m1xima en/ 0.168. Estos valores coinciden con los reportados por Kupchan ( 1968). 5.7.2 ESPECTRO DE INFRARROJO: en el espectro de infrarrojo se pueden observar bandas características de tensión 0-H a 3.500 cm·I, se presentan dos bandas de tensión C=O desdobladas, características de grupos carbonilos a,~ insaturados entre 1.620 1 1 y 1.654 cm· , de igual forma se observan bandas en 2.920 cm" correspondientes a la te)~ón) \ c. c.Jl /e, 3 1 C-H de enlaces sp • Figura 23. . ·..-. ,. 0, 't' '--"-'. \

TABLA 16 BANDAS DE ABSORCIÓN DE LA TAXOQUINONA EN INFRARROJO

1 Vmáx (cm" ) 3.340-3.571 1.620 - 1.654 2.920 Asignación 0-H C=O C-H

FIGURA23 ESPECTRO DE INFRARROJO DE LA T AXOQUINONA ... - r rf{ V! V - ~ 1 "' - ( K r~ ·1'1 (1\¡ nf ,.. 1~,...... \ r~v ... ~ -- - ~ ..... -- ...... lnl --...... ~ ~ ... ,.. ~~' ------·"

69 TESIS DE GRADO

5.7.3 PATRON DE FRAGMENTACION DE LA TAXOQUINONA EN CROMATOGRAFIA DE GASES ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASAS El fragmento más importante es el fragmento miz 195 (1 00%) que se forma por rompimiento de la molécula como se indica en el esquema 6, figura 6.a. El fragmento miz 290 (10.1%) se origina por la pérdida del grupo isopropilo ubicado en el carbono 13, lo cual origina una carga positiva en la molécula (figura 6.b). Al experimentar la molécula la pérdida de los grupos carbonilos ubicados en las posiciones 11 y 14 y el grupo metilo de la posición 18 se forma el fragmento miz 261 (36. 7% ), el cual por pérdida del grupo OH y el protón de la posición 7 forma el fragmento miz 243 ( 10.1%) como se indica en la figura 6.c. En el esquema 7, figura 7.a se indica la formación del fragmento rnlz 314 (10.1%) debido a la pérdida del grupo OH y el protón del carbono 7, el cual da origen al fragmento miz 299 (20.2%) por la pérdida de un grupo metilo (figura 7.b), este fragmento al experimentar la pérdida de un grupo carbonilo forma el fragmento m/z 271 (7.5%) mostrado en la figura 7.e, la subsiguiente pérdida de otro grupo carbonilo origina el fragmento miz 243 (10.1 %) como se indica en la figura 7.d.

TABLA 17 FRAGMENTOS (m/z) MÁS NOTABLES EN EL ESPECTRO DE MASA DE LA TAXOQUINONA

m/z 332 (M+) 314 299 290 271 261 243 195 Abundancia relativa 100% 10.1% 20.2% 10.1% 7.5% 36.7% 10.1% 100%

70 TESIS DE GRADO

ESQUEMA6 PATRON DE FRAGMENTACION DE LA TAXOQUINONA (1)

OH

o "<:::

miz 195 (100%)

OH +

miz 290

OH +

miz 261 miz 243

71 TESIS DE GRADO

ESQUEMA 7 PATRON DE FRAGMENTACION DE LA TAXOQUINONA (11)

+

7.a m/z 314 !~eH, + OH

7.b m/z299 1<;~H + o

7.d m/z243 7.c m/z271

------72 TESIS DE GRADO

5.7.4. INTERPRETACION DE LOS ESPECTROS RMN.lH, RMN-13C, COSY ,HMQC,HMBC. En el espectro de protones (Anexo 76) se observan dos singuletes que integran para tres protones cada uno asignados a los metilos 18 y 19 (figura 24) con desplazamientos a o: 0.92 y 8:0.93 respectivamente; a 8:1.1 O se aprecia un doblete (J=13.0Hz) correspondiente al protón H -5; con desplazamientos o: 1.19 y 8: 1.20 se observan dos señales de dobletes (1=7.0 Hz cada una) asignadas a los metilos 16 y 17 del grupo isopropilo; los protones del metilo H-20 se observan como un singulete a campo alto (o: 1.35) debido a su ubicación en la zona diamagnética creada por el enlace C=O del C-11, seguidamente con desplazamiento a o: 1.50 se puede apreciar una señal de multiplete originada por los protones H-1, H-2 (ec), y H-6 (ec); el protón H-2 en posición axial acoplado con los protones H-1 y H-3 se observa como un cuarteto de tripletes a 8: l. 70; se puede observar también un doblete de doblete (J=13.0 Hz) a 8:2.35 asignado al protón H-6 en posición axial; el doblete ancho con desplazamiento a o:2.65 es debido al protón H-1; a campo mas alto con desplazamiento a o:3.15 se aprecia un septeto originado por el acoplamiento del protón H-

15 con los protones de los metilos H-16 y H-17. El protón H-7 en posición pseudo axial en la molécula y ubicado sobre un carbono oxigenado origina una sefial de doblete de doblete (J=lO.O Hz y J=7.0 Hz) a 8:4.78 por su acoplamiento con los protones H-6 (esta sefial aparece a campo bajo debido a que la zona alílica esta activada por el grupo C=O de la posición C-11 ); las ultimas señales observadas son las de los protones hidroxilicos H-7 a o: 3.81 como un singulete ancho y el protón H-12 a 8: 7.31 como una sefial fina. El espectro de COSY (Anexo 79) permitió confirmar las asignaciones hechas al espectro de RMN- 1H, por ejemplo, los dos metilos H-16 y H-17 del grupo isopropilo muestran claramente su acoplamiento con el protón H-15, se puede ver también el acoplamiento del protón H-7 pseudo axial a o: 4.78 con los protones H-6 (ec) a o: 1.50 y el protón H-6 {ax) a 8: 2.35. En el espectro de RMN- 13 C (Anexo 77) se presentan veinte carbonos de los cuales cuatro son oxigenados, tres son aromáticos, cuatro son CH2 alifáticos, dos CH alifáticos, cinco CH3 alifáticos y dos cuaternarios. Haciendo una correlación a un enlace C-H por

73 TESIS DE GRADO medio del DEPT-135 y el espectro RMN- 1H en el HMQC (Anexo78) se observan claramente cada una de estas correlaciones. Luego de asignar y coordinar cada una de las señales y sus correlaciones, por medio de espectro HMBC (Anexo 80) se verifico cada tma de ellas, logrando evidenciar la correlación del protón H-7 con los carbonos C>8 y C-9 a dos y tres enlaces respectivamente, igualmente se demuestra la correlación Con el carbono C-6 a dos enlaces y atres enlaces con el carbono C-5. Este espectro permitió también asignar inequívocamente los desplazamientos de los grupos carbonilos y los carbonos sp2 del anillo; así, el protón hidroxilico sobre el carbono C-12 esta correlacionado a dos enlaces con el carbono C-12 y a tres enlaces con el carbono C-11 y el carbono C-13 y a cuatro enlaces con el carbono C-14 (señal débil por ser una interacción lejana); por otra parte, el protón H-15 esta correlacionado a dos enlaces con el carbono C-13 y atres enlaces con el carbono C-12 y el carbono C-14 que es el segundo carbonilo de la molécula, además esta correlacionado con los dos metilos del grupo isopropilo; en cuanto a los protones de los metilos H-18 y H- 19 estos muestran correlación con los carbonos C-3 y C-5, y los protones del metilo H-20 están correlacionados con el carbono C-1 O y el carbono C-5.

74 TESIS DE GRADO

Sobre la base de los resultados anteriormente expuestos se propone que la estructura del compuesto en estudio pertenece a la 7~- hidroxyroyleanona (taxoquinona), la cual es un diterpeno de la serie del abietano con formula molecular C20 H28 04, que corresponde a un compuesto con siete insaturaciones y peso molecular de 332 gr/mol; lo cual fue deducido al estimar su masa molecular por espectrometria de masa (ion mas abundante miz 195), al determinar su número de carbonos por RMN-C 13 y al establecer la naturaleza de los mismos en base a sus desplazamientos químicos y orientación de los mismos en el espectro DEPT 13. La presencia de este compuesto no ha sido reportada en especies de Lepechinias estudiadas anteriormente, existen reportes de su aislamiento a partir de especies del genero Plectranthus de la familia Lamiaceae (Hensch et al, 1975) y del Taxodium disticum Rich de la familia Taxodiaceae, mostrando una significativa actividad inhibitoria in vivo sobre el carcinoma intramuscular de Walker en ratas, así como in vitro sobre células humanas de carcinoma de naso faringe (Kupchan et al, 1968).

FIGURA 24 ESTRUCTURA DE LA TAXOQUINONA

16 OH

17

75 TESIS DE GRADO

TABLA 18 RESULTADOS DE RMN-H1

-~=-~

PROTÓN SEÑAL DESPLAZAMIENTO (8)

18 S 0.92

19 S 0.93 5 d (J=l3.0 Hz) 1.10 e---"""_"___ , ____ ~ ----- 16 d (J= 7.0 Hz) 1.19 17 d (J=7.0 Hz) 1.20

20 S 1.35 1,2(ec),6(ec) m 1.50 2(ax) qt 1.70 6(ax) dd (J=l3.0 Hz) 2.35 1 d 2.65 15 sept (J=7.0 Hz) 3.15

7 (OH) S 3.81 dd 7(ax) (J=lO.OHz yJ=7.0Hz) 4.78 --- r--- 12 (OH) S 7.31

17

76 TESIS DE GRADO

TABLA 19 RESULTADOS DE RMN-e13

CARBONO TIPO DESPLAZAMIENTO (ppm) 1 CH2 36.0 ppm 2 eH2 18.6 ppm 3 CH2 40.8 ppm ------4 e 33.0 ppm 5 eH 48.8 ppm 6 CH2 26.1 ppm 7 CH 67.9 ppm --1--- 8 e 144.2ppm --r-:-- -- 9 e 147.8 ppm ------10 e 39.3 ppm 11 e 183.7 ppm 12 e 150.9 ppm 13 e 124.2 ppm 14 e 189.6 ppm 15 CH 23.8 ppm

16 CH3 19.73ppm

17 CH3 19.73 ppm

18 CH3 33.2 ppm

19 CH3 21.5 ppm

20 CH3 19.73 ppm

17

77 TESIS DE GRADO

CONCLUSIONES l. Se lograron aislar los aceites esenciales de las hojas y las flores a partir de las especies Lepechinia conferta y Lepechinia salviaefolia, siendo el rendimiento obtenido para las hojas de Lepechinia salviaefolia 1.8 mL (0.08%) y para las flores 0.4 mL (0.09%). El rendimiento para las flores de Lepechinia conferta fue de 1.4 mL (0.53%) y para cada una de las tres extracciones de aceite de hojas fue de 1.4 mL (0.16), 1.5 mL (0.20%), 2 mL (0.32%) respectivamente. 2. A los aceites obtenidos se les determino el índice de refracción dando como resultado en las hojas de Lepechinia conjerta 1.488, en las flores de Lepechinia conferta 1.4895, en las hojas de Lepechinia salviaefolia 1.4955 y en las flores de Lepechinia salviaefolia 1.663. La densidad fue determinada en el aceite de hojas de Lepechinia salviaefolia resultando 0.81 g/mL. El punto de fusión se tomo en la taxoquinona dando como

resultado 214 o C. 3. Por medio de cromatografía de gases acoplada a espectrometria de masas y el calculo de los índices de Kovats se lograron identíficar 19 componentes en el aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefolia, 30 componentes en el aceite de flores de Lepechinia salviaefolia.En el aceite de hojas de Lepechinia conferta se identificaron 47 componentes y en el aceite de flores 4 7 componentes. 4. Como componentes mayoritarips en el aceite esencial de hojas de Lepechinia conferta se identificaron ledol (24.3%), <5-3-careno (11%), P-felandreno (9.7%) y aromadandreno (4.5%). En el aceite esencial de flores de esta especie los componentes mayoritarios fueron Iedol (28.8%), P-felandreno (11.7%), o-3-careno (10.4%), aromadandreno (3.6%). 5. En el aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaefolia los componentes mayoritarios fueron ledene (28.2%), P-felandreno (25.8%), espatulenol (8.9%), P-selineno (7.6%). Para el aceite de flores los componentes mayoritarios fueron ledol (27.4%), P­ felandreno (12.2%), <5-3-careno (10.9%) y aromadandreno (3.5%).

6. En el fraccionamiento por cromatografia preparativa en capa gruesa y análisis por CG/EM de cada una de las fracciones del aceite esencial de hojas de Lepechinia conferta se lograron identificar como compuestos mayoritarios aromadandreno, ledol,

78 TESIS DE GRADO

oxido de linalol, 3-octanol. En el aceite de hojas de Lepechinia salviaefolia ledene y • espatuleno l. 7. De las hojas de Lepechinia salviaefolia se logro aislar por medio de extracción en caliente con hexano taxoquinona, un diterpeno de la serie abietano el cual fue 1 identificado por medio de espectrofotometria de inferrojo, ultravioleta , RMN-H , 13 RMN-C , COSY, HMQC Y HMBC. 8. En la extracción en caliente con cloroformo delas hojas de Lepechinia salviaefolia se aislaron un grupo de ácidos triterpenicos los cuales fueron metila.dos y sus núcleos tentativamente identificados como: 2a,3(3,23-trihidroxy-12-en-28 ácido metil ester; 3- oxo olean-12-en-28 ácido metil ester; 3(3-hidroxiolean-12-en-28 ácido metil ester; 2a,3(3-dihidroxiolean-12- en -28 ácido metil ester; 2a,3(3-dihidroxiolean-12-en-28 acido metil ester.

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85 TI'SIS DI

86 Tt:::SIS DE GRADO

Anexo l. Cromatograma del aceite esencial de hojas de lepechinia conferta (Benth) Epling

1 10

1

1

!

50

------87 TESIS DE GRADO

Anexo 2. Cromatograma del aceite esencial de flores de lepechinia conferta (Benth) Epling

1¡ ti\' 6 1! ·¡,

1\

1 ti

1

-¡ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 35 40 45 50 55 60 65 70 Time [min)

88 TESIS DE GRADO

Anexo 3. Cromatograma del aceite esencial de hojas Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling.

00 " 1 3 so8 -== =- 70~= = --=- 60~

-:j3 =1 }01)-~~ "~ 30J :j ;ool -1 .~lll.l: ,,,, , .. ~ ~~ ,,J~~G~r-c- :J~~

\1 1 1 1 j 11 1 t ji 1 1 ljll 11 ji lit ji t 1 1 j 1 11 1 ji 1 ¡j¡ ji 1 1 1 j ITTTfTI 1 1; 1 1 1 ljl 1 1 t j 1 1 1 1 ji 1 1: o 5 , o 15 20 2s 30 35 40 45 se ss so 65 70 Time [min]

89 TESIS DE GRADO

Anexo 4. Cromatograma del aceite esencial de flores Lepechinia salviaefolia (Kunth) Epling.

Ir r r r ] r r : r .1. r r r r _1 r r r rr-n r 1 r r r r ¡ r r r r 1 r r TlfTir-l!TlTllT: r 1 1 1 IITTí . .- .. ·. .:\: 1*.) :e .5: : ·. : :: <·· ~·'J ce 11···" [rr·i"J

<)() TESIS DE GRADO

~r-=- Anexo 5. Espectro de masa del fraccionamiento del aceite esencial de hojas de Lepechinia con erta ]-~---­ ~ ~ ::l

ACEITE F1 Aromadandreno :._¡ ____ ------!·- '- :~

·-1 . ...,

F3 Ledol

1'-i H-, J

1 '""'\

' 1 ....1 •• ...,i

i,, Fs Oxido de linalol F1 3- octano) !IL~-o:c~.,.,__iC!:-;..?~ .. ~ _ ---~---

91 Segundo seminario

Anexo 6. Espectro de masa del fraccionamiento del aceite esencial de hojas de Lepechinia salviaejolia. ~~~=~~~~~~~~--~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~\ TIClFI'ECHIO - ·~ 1 "'""'"'WXQ)O: ~!

, ....1 i

-~ 1 """""" ~ 1 1 ACEITE """""" ""'""' 1

1

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42 TESIS DE GRADO

Anexo 7: Espectro de masas del a- pineno

------~s~~~n~1~3~~PE~.~------~

77 121 105

77

¡__ _b------

93 TL~SIS Dl.~ GRADO

Anexo 8: Espectro de masa del (3-pineno.

AI>U""'ñdiiii=;;-;ce:;;------,s«>c.""n""2rr(G.127 min): Lci-'I::S2.D

8000

7000

6000

5000

4000

3000 69 41 711 2000

1000

-> 0 ~20~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~r.c~~~~~~~~~

9000

8000

7000

6000

5000

4000 69 3000 41 79 2000

->

<)4 TESIS DE GRADO

Anexo 9: Espectro de masas del f3-mirceno.

¡:r.ncA 7000 611 6000

5000 41

3000

2000 711 1000

-> o~2ro~~~~~~~~~~~~~~~~~~T.C~~~~:~~~~~T.C~~77.~~1 anal

8000 69 7000 41

6000

5000

4000

3000

2000 711 1000 1~

95 TESIS DE GRADO

Anexo 10: Espectro de masas del Sabineno

ruñdance Sean 26r{s:o3Tiñlñj:[EPES .

9000

8000

7000

8000

5000

4000 77 3000 136 2000 41 1000

ance

QOOO

8000

7000

6000

5000 77

;¡! 4000

¡!li 3000 41 ill·~ jj, 2000 :¡¡ 136 1000 1

96 TESIS DE GRADO

Anexo 11: Espectro de masas del 8- 3- careno.

il1 l\1. llj

:¡1 '¡f r:8000 :¡1 7000 ! 8000 5000

4000

3000 121 136 2000 105 1000 o 30 ce

9000

8000

7000

8000

5000

4000 121 136 11! 3000 il\ 105 2000 39 1000 o 1 nlz-> 30 ~! ¡11 ¡l' i[l

:il,,,, ¡li •'1

r 1! iil ill 11! if ¡¡i

111 li' Hl ,1¡¡

11! lL~

97 TESlS DE GRADO

Anexo 12: Espectro de masas del a- terpineno.

A.Oundance <>can 411 (7. 158 min): LE:.I-'

8000 93 7000

600 o 136 ,il 5000 i 4000 ~:. 1 ~1 1 \1¡ 3000 ¡ij 77 1 200o

1000 41 5 65 129 191 207 261 1 o \ii, 1~1 ~e ]~ .1 lniz-> 30 40 50 60 70 BO 90 160 tj_o 1 o 130 14o 15o 160 110 1so 100 200 210 2~ ªo ~o 25o 26o 210 2éo AEüiiQ¡¡ nce 1125315: .alí)lía.-lerplpene Sr.AIJ>RA-:;TERPINENt: · 93 1 1

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000

6000

50 00 136 4000 77 3000

2000 105

¡¡; 111 \li L1~ ___ _

98 TESIS DE GRADO

Anexo 13: Espectro de masas del p-cimeno.

~~~r-a~n~~------~ S~~~~E~.~------, 1 11

9000

8000

7000

6000

5000

3000 Q1

2000

99 TESIS DE GRADO

r¡r~-~=!.1.lif,""'--O::;;:'f2="--:ES'-~

11

1 Anexo 14: Espectro de masas del P-felandreno.

l>;büñdance ll Sean 456\7A93mmY[EPECRr.

1¡: 9000 ¡,1 11 1¡1 8000

1 7000 1.¡11 1'1 6000

11 5000 1¡ i 4000 ~1 68 !!¡ 3000 136 ~1 77 2000 ii 121 1000 107 111 o -> 20 30 ance 111 111 9000

8000

7000

1 6000 [¡1 5000 1'' ,[1 4000 \!1, 68

1 11 3000 77 '" 41 1!1 2000 136 1¡ 53 1 1000

z->

lOO TESIS DE GRADO

Anexo 15: Espectro de masas de y- terpineno.

Abundan ce

9000

8000

7000

6000 136 5000

4000 121 3000 77

2000

1000 o z-> 30 u ance

9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000 77 43 121 136 2000

1000

1 o 1 z-> 30

11 l¡l 1~ i¡l !¡l

11

______¡

101 TESIS DE GRADO

r''""~"~"~3B'""''""-~~,.,,,"""'"""'~"""'""""""""'"""'"""'"'""'"""''"""""""'""""""""'"""''''":-~!.lii;i;!~~~~~ -= --T!f.'i¡;"~m:;!S~?GJi!-

Anexo 16: Espectro de masas Oxido de linalol

fl'buíldince==;::------scano21r(S:78a mlnJ:-lEPEs-rz.,.,..o------

0000 i

8000 94 7000

8000 111 5000 43 4000

3000 81

2000

0000

8000

7000 43

8000

5000

4000

3000 94 111 2000 81 1000

-> 20

OH

102 TESIS DE GRADO

Anexo 17: Espectro de masas del Terpinoleno.

1 ~

¡~ ~ - Sean 354 (6.132 mm): LEPES~. u !,1 93 1 1 ~~ 9000 ;¡¡ 1 il 8000 1! 136 7000

6000

5000

4000 79

3000 44 105

.1 2107 lill LL 281

136

105 39 2000 1 ~ J ~~ ], Jt ul mn-> 30 40 5o 60 io 60 90 1119 110 1 o 130 140 1$0 160 110 íéo 100 2ÓO 210 22o 230 240 2$0 260 270 280

------·---

103 TESiS DE GRADO

Anexo 18: Espectro de masas del Linalool.

'-;:..;-;,'<;i-~-i:t=~- i

11\

Abundan ce ¡¡can ~~~ (~.blU mm¡: Lcr't;.;;.l.U ¡1 g()()() 93

8000

7000

8000

5000 55 41 4000 80 121 3000

2000

1000 o 20

9000 41 111 8000 93 !11 !\ 7000

1'1 8000 55 1· 11 !1 5000 1[1 \~ 4000 3000 80

2000 28 1 1000

1 o -> 20 il! 1¡\l

:!¡ i\i 111 ,1, 1'' ,1¡

11! OH 1

104 TESIS DE (IJV\DO ·------·------

Anexo 19: Espectro de masas de la lsopinocanfona

~ Sean 1057 (ii.lla7 mm): LEPEszo---- 69 9000 55 8000

7000

8000

5000 95 41 4000

3000 152 2000 110

1000 o 10 ce :1 11 1 7000 41

6QQI;) 1 1 1

5000

4000 95

3000

152 2000 27

1000 15 T'o/z-> 10 20

li l~~-""C'SS~~~-~--~~~~~~""""'--"·~~· -==s-- ~~~~~~~~.,..,.J

105 TESIS DE GRADO

Anexo 20: Espectro de masas del a-copaeno.

1 11 L.,... ~~~-=eo-~-~-~~""""""""~~~~~~~~~~~~~~

106 TESIS DE GRADO

Anexo 21: Espectro de masas del a-gurjuneno

.,"""1 "vn1 \lw,o,¿o ITilnJ: Lt:.r-c:,:,.L.v 2

j 8000 161 189

7000

8000 105

5000 119

4000 91 133 147 3000

2000

11000 161

8000 189

7000 105 41 8000 119 5000 91

4000 133 55 147 3000 81 29 2000 69

------

107 TESIS DL liH/\IJU ------......

Anexo 22: Espectro de masas del fj-cariofileno

AbüñdañC8===------~sca"""n2""'1""16rT('fll"11"1ñlílf"[EPES2:o·------1 3 ¡ 0000 93

8000

7000 69 6000 79 105

5000 120 161 41 4000 147 189 3000 55 1 2000

1000 1r 281 o 111.1 J111 .1 JI¡ 1 lu 1.1. 111 Ll 111. IIL T Tllz-> 30 40 50 60 o 80 00 íóo 1 o 1 o ~~? B_o @_ li?_ 110 180 100 260 2lo :z2o 23o 2.\o 2So 26o 210 2/i) iilíUñdance #896sr::B~VOPfMIEI'lE 41 9000 79 133 8000

7000 69 105 6000

5000 120 4000 1 53 3000 147 161 2000 189 1000 175 \, 11 . 2r o 11 .11 11 l. h 11 11 11 11 ..1111. rt'Jz-> 30 40 50 60 o 80 00 íóo 1 o 1 o .130 1-40 1so 1 o 1to 1áo 100 200 21o 22o 23o :i4ó 250' 260 :itó :i&i ~

------108 TJ·:SIS DF (JHt\D< >

Anexo 23: Espectro de masas del Aromadandreno.

n~~-.~~~~,------~s~~~n~2~8~1~):LEPES'l~:..n-u------~

8000 7000 91 105 6000 133 119 204 5000 189 79 4000 147 41 69 3000 2000 55 1000 175 11,¡ 1 \, 111 1, d 111 ,¡ 1, 11 281 miz-> o 20 30 40 50 60 o so so 1óo 1 o 1 o 13o 1.\o 15o 1E no H~o 100 :ióo :ilo '22o 2:1o 246 250· 260 :ito 280 l!lllJ'It : ¡+)-Atomaaenarene $'1~-~ycloprop(e¡azulene;-óocany A!>Unaan~ 41 0000

8000 93 7000 107

6000 79 204 121 133 5000 55

189 147 3000 29 2000

miz->

1

109 TESIS DE GRADO

Anexo 24: Espectro de masas del a.- humuleno.

Abüí'idince Sean 226r(2o:QS6 rilrnTl:EPES:Z:

9000

8000

7000

8000

5000

4000 121 :1000 60 147

2000 107

1000 o -> 30

9000

8000

1 7000 t,¡ !¡ 6000 ill 5000 (\; ll 4000 1 60

:1000 121

2000 41 147

1000 o -> 30

li ¡¡: ¡,l lil il! ill '1'1: '------ili t1'

110 TESIS DE GRADO

Anexo 25: Espectro de masas del Aloaromadandreno

m SCiíi :Z:Z/6 12l·Df' riíiñ)! FES26WII.O -----" GOOO

8000 &1 105 7000 133 .u 8000 7& 11& 204 8000 147

<4000 87 3000 65 18ll 2000

1000 175. o 1 ), lt J Jhl lh. ".llh. 1 211 a13 miz~ 2030406ll eo o eo w 100 ,A 131 140, 501 170 180 1 ~:!t: 210 220 230 2 o 319 ., 1 r ·~·-1 GOOO - &1 8000 105 6& 7000 1 7& 133 8000 204 65 11& 6000 147

<4000 18ll 3000 28 : 2000 ' 1000 ,, o .lilli ~1, .n.l1 ,, T miz-> 2030406ll 60 o 60 go 100 , o, 013< 140 150, 170 160 1 002Ó( 210 220 230 240 2SO ~_210 260 200 300 310 ~ -~

1

-·-··--'• - ..

111 TESIS DE GRADO ------

Anexo 26: Espectro de masas del a-farneseno.

¡unaance Sean"2~2ó{22:2.1Trñlñ):l:EPES . 119 11¡ 9000 ¡l: lli lii,, 8000 ''1 11• 7000 107

11 6000 161

5000 1 l, 79 '1 4000 1 41 69 189 204 3000 55 133

2000 147 175 1 1000 o _,. 30 ance

9000

8000

7000 69 ,, 6000 55

111 5000 79 107 ~~ 4000 :1¡ 119 3000

1 2000

1000 o _,. 30

112 TESIS DE GRADO

Anexo 27: Espectro de masas del o- cadineno

&:añ JSIU (30.3W$ ñílñ): JUL2IOOAOO 11 QOOO

8000

7000

105 4000 207 3000 2000 .,

cw 5 o

8000

7000

105

3000 41 81 2000

4 o o

113 TESIS DE GRADO

Anexo 28: Espectro de masas del Ledol.

\QiUñdince Sean 2710 !24.341 m~n): LEPECRr.o--- 1 1

QOOO 122 ~ 8000 1[¡ 7000

¡'\ 6000

5000 161 4000 95 81 147 204 3000 55 41 69 2000

1000

z-> anca

9000 41

8000 122 7000 55 6000 81 5000 95 69 4000 161 3000 29 147 2000 204

1000 .... o

114 TESIS DE GRADO

Anexo 29: Espectro de masas del Espatulenol

N>undance

9000

8000 119 7000 91

6000 43 105 159 5000 147

79 4000 133 187

3000 69 177 2000 55

1 1 220 00: 1.11.1!. 1 1~.1 111. 11. 111. r 281 ~2 miZ-> 20 30 40 & 60 o 80 90 1 1 01 ~~~ 01401501 110 180 1é02C: o 21 o 220 230 240 2:>0 2&hfo 2&i 200 300 31 o 32o 33o ' Abundance oo.o: 1+ 1 spalllu\enol

9000

8000

7000

6000

5000 91 4000 79 69 119 3000 205 55 105 159 2000 187 1000 1 lh. l 11., 1,1 ,¡ 1. ·¡;_ 220 o l I Tli miz-> 20 30 40 so 60 O 80 90 1001101 01 01401501

OH _Á

1/ l______

115 TESIS DE GRADO

Anexo 30: Espectro de masas del Viridiflorol

Abundan ce ::ican ;¿¡¡u:, (:ló.Ul>:l mm¡: L~l-'t:.::i:l.U 109 1 1 ¡¡()()()

8000

7000

6000 43 189 69 93 5000 122 81 204 4000 133 147 3000 55

2000

1000 o 30 ce 1 9 9000 43 8000 161 7000 69 6000 81 93 5000 121 55 4000 133 189 3000 147 2000

1000 o -> 30

OH

116 TESIS DE GRADO

Anexo 31: Espectro de masas del Guaiol.

~ce :;can ~~o 125.2011 mm): LéPél:i~.LJ 1 1 9000

8000

7000

8000

5000

4000 107 3000 59 li1 119 189 2000 204

1000

-> 10 u ance

0000

8000 59 7000

6000

5000 107

4000 93 81 41 3000 204 189 119 133 2000 69 149 1000 18 o 10 20

HO

117 TESIS DE GRAOO

Anexo 32: Espectro de masas del y- eudesmol.

Séañ295812noomrnn:EPES2.0 1 a 9000 161 6000 204 7000

6000

5000

4000 105 133 3000 91 147 2000 59

1000 nlz-> 20 30

9000

6000

7000 204 161 6000 5000 59 133 4000 105 3000 41 81 93

nlz->

OH

118 TESIS DE GRADO

Anexo 33: Espectro de masas del J3- eudesmol.

5ij 1 9 QOO()

8000

7000

6000

5000 164

4000 109 3000 122 81 93

2000 87 135 189 1000 o -> 10

9000

8000

7000

6000

5000

4000 149 3000 108 164 2000 41

1000 o 222 2 2\ o 2:Ío 23o úo 2&í 21íil 2to 2&í

HO

'

119 TESIS DE GRADO

Anexo 34: Espectro de masas del a- eudesrnol.

anca ------,s~~~n~~~1mn):LEPES~.n------~ ! 1 11 9000 204 161 189 8000

7000 59 6000

! 5000 4000 109 i~¡ 93 3000 81 122 133 2000 43

11¡1

~~h 9000 1' 8000

1 7000

6000

5000

4000

3000 43 81 93 107 189 204 2000

1000 o -> 30

OH

120 TESIS LJE URALJO

Anexo 35: Espectro de masas del Oxido de manoil.

------lt ,A.bunáance Sean HS8\35:389-min): LEPES2.D 257 2 5 !1\ QOOO

1\1 8000

7000 1 8000 11 192 5000 177 ~1 4000 81 137 95 11\ 123 3000 43 55 69 109 ·~ 1 2000 149 1000 o 10 nce

QOOO

8000 257 7000

8000 81 192 5000 55 137 4000 95 177 43 67' 3000 109 123 2000 149

¡

1 ¡11~

!11

1

1 1

121 TESIS DE GRADO

Anexo 36: Espectro de masas del Mirceno.

'lbUñdiñCi Sc:an 315 (6.440 íñln): LEPECH.

9000

8000

7000 69 6000 5000 .,

~

3000

2000

9000

8000 69

7000

6000

5000 •ooo 3000

2000

1000 o ->

122 TESIS DE GRADO rr--

'1 Anexo 37: Espectro de masas del f3- selineno. t-~~~~-~~~""""...... """"'""""""""--""""-""""'""""' ...... "'"""""""""""""""'""""'""""""""'"""" ...... """"""""""""""""'" ...... -l\1 !¡

1 ;:,oao "->01 \.O:l.WO:!I mm¡: L.t;.t"'t;.S2.D - ~~ 105 161

8000 204 7000 711 133

6000 121 147 189 5000 67 « 4000

3000 55 175

9000 79 8000

7000 67 204

6000 121 133 161 55 147 189 5000

3000 175

2000

1000

0 1111 1111 1 d 1 1111 tm-> 30 40 5c 60 o 80 00 100 1 o 1 o 130 140 160 1 170 1áo 100 20C 210 220 2~ 240 260 260 270 2áo

123 TESIS DE GRADO

Anexo 38: Espectro de masas del Eremoflleno.

1\liiiñdance 1

g()()()

6000 107 7000 11g 93 133 6000 79 189 5000 204 147 4000

3000 41 2000

1000 o 1 .I .~1: ~lll.u. .1,111 T 241 miz-> 10 20 30 40 5060 o 80 90 100 1 o 1 o 1) 1-40 150 1 170 100 190 2()( 210 ~o ~ ~40 2~ ~ao 210 ~~ l\llunóancQ IRI!hltll, l;t8mopnll8fle w Naplll/lal800, 1,;.:,;¡,:>,0,( ,tl,tla-OCWI 79 D3 1 7 161 g()()() 41 119 8000

7000

8000 133 SS 204 5000 147 189 4000 67

3000 29 2000

1000 1S miz-> 10 20

124 TESIS DE GRADO

Anexo 39: Espectro de masas del Valenceno.

o.bundllnce ------,s~~-.n~n~«nc~~o~.~~Qm~~n¡r.:n=cePE~~------105 1 1 IX)()()

8000

7000 91 119 6000 204 5000 1J3 4000 711

3000 147 41 67 175 2000

IX)()()

8000

7000

6000 105 204 93 5000 79 119 133 4000 41 189 3000 55 67 147 2000 175

1000 o -> 30

------·------

125 TESIS DE GRADO

Anexo 40: Espectro de masas del Biciclogermacreno. ll_~~.;;:=s-¡,e;._.¿:...=.;¿;,..-""""'""""""""""""""""'_...... """" ...... ""'"""""" ...... """""""""""'""""...-""""'""""""""'""""'""""""""'-""""""""""""'"""" ____ ...... ji\

~

8000

7000

6000 41

$()()()

4000

3000

2000 161 204 1000 ~·~-~-o~~Jt~~~~~~t.;~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

126 TESIS DE GRADO

Anexo 41: Espectro de masas del Ledano.

u~~~~------~s~~n~~p~·~.rr------1 1 QOOO

8000 105 7000

6000 81 91 119 189 5000 204

4000 133 147

3000 41 2000 55 67 1 1000 1

1,11 ,11, 111 ,1, 281 o 11 ~.l. .1 Jl~t 1111 .1, I 1. 11. miz-> 20 30 40 50 60 10 80 90 1ÓO 1 o 1 o 1 o ~o 1 ~1 rto 100 1 ~ 260 210 22o 2:io 24o 25o 26o 2to 200 """"oí: ~ l,_.,YCIClpfC>p 8¡al:U ene, a :, .. ,:>, , , a, 41 r- QOOO

8000 93

7000 28 6000 119 79 5000 161

4000 55 135 3000 67 189 147 2000 204

1000

o 1 rl\lz-> 20 30 40 5C 60 o 80 90 100 110 1 o 130 140 1So 1 o 170 1Bo 19o 200 21 o 220 23o 240 2So 26o 270 200

- 1

--

127 TESIS DE GRADO

Anexo 42: Espectro de masas del Oxido de cariofileno.

~------.,ca=-"n 778\2T.a4W íñlñ): LEPECR. 9 &000

8000

7000 1011 43 6000 121 5000 6 4000 SS

3000 135 1411161

2000 177

1000 0,~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ -> 40 60 80

8000 79

7000 93 6000

5000

4000 S56 109

3000 121

2000

128 TESIS DE GRADO

Anexo 43: Espectro de masas del a-guaiano.

~ ~2856~ECRID ' llOOO 95 8000 81 109 122 1 7000 161

6000 67

5000 133 147 55 4000 207 189 3000

2000 222

1000 2f ¡1· o ~L ~ 111111 IIJ 1111 1\ i. fnlz-> 20 40 60 1ÓC ~10 1 1 o 21 2 o 24o 260 2M 300 32o 34o · 38ó J Azlllene, 1 ,2,3,4,5,5,T,II-Oclahyel ~ce 1~~'"":

9000 147 8000 ll3

7000 41 711 8000 133 5000 55 204 121 169 4000 67

3000 161 2000 29

1000 o 15 111 1,11.11 l1i, .n.lll1 T miz-> 20 40 60 60 1ÓC 1 o 140 1 ó 1M 2Ó< 22o 24o 200 2M 3óó 32o 34o 38ó d

1

129 TESIS DE GRADO

Anexo 44: Espectro de masas del a-tujeno.

1'1

11

1'1 A.l>undanc:e can lT'(4.~37mlñ):CEPECRr.D 1~ •., 111 9000 ...

6000 ¡' lil 7000 6000

~¡[1 5000 !1i 4000

3000 77

2000 136

9000

6000

7000

6000

5000 77 4000

3000

2000 41 1000 o -> 30 1\¡ l¡¡

t_¡·t '1 11¡ .,, !ti it ,¡1

111

1

1

--··--··------.. ------130 TESIS DE GRADO

Anexo 45: Espectro de masas del a.- felandreno.

0000

8000

7000

8000

5000

4000 77 3000

2000 136 1000 o -> 30

0000

8000

7000

6000

5000

4000 77

3000

2000 136

131 TESIS DE GRADO

Anexo 46: Espectro de masas del cis - hidrato de sabineno.

~ scal\ 1166 (\:Z:SOJ lllill¡: JOL2100B.O

9000

8000 1 1 1 7000 71 6000 43 121 $000

1 4000 13g

3000 2000 ~ 1000 1g1210 262281 350 383 412 628 o ~ h \~7 ~~ 20 40 60 801 1 o 1 o 1&o 1ao 200 2:20 24o 26o 28o 300 32o 34o 36o 3áo 400 .do «o 460 480 56o 52o Mo 56o 580 600 620 640

4 gJ sooo

8000 71

7000

6000

$000 1 ! 4000 l 121

1 3000

1 2000

132 TESIS DE GRADO

Anexo 47: Espectro de masas del p-ment-2-en-1-ol.

133 TESIS DE GRADO

Anexo 48: Espectro de masas de la Pinocanfona.

i'M.WilCfl Sean 1002 (11.57~PES .

¡¡()O()

8000 1 7000 ,,:: 1, 'l' 6000 55 69 i¡l ti 1 5000 ~ 4000

¡1 3000 41 95 2000 152 1000 1 o ¡, -> ¡l ~~ ¡¡()O()

8000

7000 55 ! 69 6000 1' 5000 41 4000

3000

2000 95 1000 o 15 ->

134 TESIS DE GRADO

Anexo 49: Espectro de masas del 4-terpineol.

¡l;bundance Sean 10/5 (12.121 íñlñ): LEP

gooo 1

1 8000 111 7000

6000

5000

4000 154 3000 43 86

2000 55 136

1000 o 20 30

9000

8000

7000

6000

5000 111 93 4000

3000 43 86 2000 55

1000

-> 20

135 TESIS DE GRADO

Anexo 50: Espectro de masas del p-cimen-8-ol.

A!iüñdaílCi SGaíí 1101 r2.360 íñiñ): OCI29980.0

10000

8000

7000

6000 43 5000

4000

3000

2000 150 1000 o ->

10000

8000

7000

6000

5000 135 4000

3000

2000 91 1000 27 35 ->

136 TESIS L>b URAL>O

,~~~-~-~~~~------A_n_e_x_o_s_t_:_E__ sp_e_c_tr_o __ d_e_m_a_s_a_s_d_e_l_a_-_t_er~p-i_n_eo_I_.~----~------~

~~~ tu;.c=aru:e=------.,"""""'~,..,r=;;;-r.r-rpes2.D

!li 93 121 :¡¡ 8000 :¡! 7000 136 1· 8000 81 5000

4000

3000 43 67

2000

1000 o -> 30

9000

8000 93 7000 121

8000 136

5000 43 81 4000

3000 67

2000

OH

137 TESIS DE GRADO

Anexo 52: Espectro de masas del cis-piperitol .

.undanc:a

9000

8000

7000

6000 139 5000

4000

3000

2000

1000

->

9000

6000

7000

6000

5000

4000

3000 43 139 2000 55

1000

->

138 TESIS DE GRADO

Anexo 53: Espectro de masas del a-cubeneno.

~ Sciíñ 1824 (17.720 mln): LEPES2.D 1 1 11000 1111 8000 105

7000

6000

5000

4000

3000 111 204

2000 81

1000 o -> 20 30

11000

8000

7000

6000

5000

4000 41 81 111 3000 55 2000 204 69 :11 1000 i'' 1' z-> ll

1

1

139 TESIS DE GRADO ------·------

Anexo 54: Espectro de masas de [soledano.

¡::

'1¡ ~1 111 jll Abundance :.can l~W (18.4301ñfill:CEPES2.0------·------, :¡¡ 1 1 ji, ,l. 0000

¡11 8000 105 1 7000

1 6000 119 1

5000

4000 91 3000 133 1lli 2000 189 i'l 1000

nn-> ~~o~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 1\büñdance 1 5 0000

8000 161

7000

6000 91 119 5000

4000

3000 133 55 2000 81 lz_:~3~0~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~·~~~~~~~~~~~~~~

140 TESIS DE GRADO

Anexo 55: Espectro de masas del a- selineno.

1 1 1 9 0000

8000 109 1 7000 133 91 204 6000

5000 ill 4000 lli ,, 3000 41 ~ 2000 67 :¡¡ 1000 11 o ~ J ,l 232 281 ' 548 IX-i:7:~:=:--.:::40:...... ::60::.-=60:.....!:1tnlz-> o:.::.....:1~o:...1.:.::1-«;::....:., =-1=- so~2:::...:22::::10:...2=::24,..10 200 2so 3oo 32o 34o Jso 3so 400 42o «o 4éo 4ao sóo 52 o 54 o ~nce R"95wr: .alpna.·aeunene 1 9 0000

8000

7000 204 6000 93 133

5000 161 4000 55

3000 7 2000

1000 o nlz-> 40 60 80 10 1 o 14o 1 o 1éó 2ÓO 220 240 2éo 2éo 3ÓO 32o 340 3SO 3SO 4ÓO 420 440 460 480 500 520 540

d li !~

:¡1

!1¡¡

111 •¡i l-~~~~------~--~~~~~~~--~--~--~

141 TESIS DE GRADO

Anexo 56: Espectro de masas del Calareno.

!J)\Jiidanca Sean 2171!20.313 mm): LEPESZ:O 1 1 9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000 105 11g 189 2000 91

1000 o -> 30 ance 1 1 9000

8000

7000

6000

5000

4000

3000 105 11g 41 g1 189 2000 204

1000 o z-> 30

142 TESIS DE GRADO

Anexo 57: Espectro de masas del y- cadineno.

:sean ¡¡:.w ¡U.t/1 m&O): U\,; 1:l~l!t!O.D 1 1

8000

7000 6000 .. = H /"-.... 3000 105 119 204 91

9000

8000 41

7000

8000 91 105

5000 79

4000 119 3000 55 133 204 2000

1000 176 189 1 O' 11' 1 1' b-> 3b 4'o 16\\ 170 180 1'90 200 210 220

143 TESIS DE GRADO

Anexo 58: Espectro de masas del Globulol.

ce

0000 109 8000 Q3 7000 81 43 121 189 69 6000 204 5000 135 147

0000

8000

!¡¡ 7000 11 6000 ~1 109 5000 69 81 161 \1 4000 95 122 3000 55 204 1 189 135 2000 147

1000 o 36 mil.-> 30

144 TESIS DE GRADO

Anexo 59: Espectro de masas del Bulnesol.

can 3086 (27 .152 min)ó LEPE$2.0 1 107

161

7000 93 6000 59 5000 189

119 204 3000 79 147 2000 41

1000

anc:e

9000

6000

7000 107 6000 93 5000 161

4000 81 3000 11Q 204 2000

1000

o~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ -> 20

HO

145 TESIS DE GRADO

Anexo 60: Espectro de masas del Kaureno.

ii,., ¡¡¡

:1: ljl ili'¡ il gga . 1 2 7 ¡, g()()() 8000 ¡1 ·~ 7000 1,¡1 6000 1,! ''1 5000 ~1 4000

! ~~ 3000 272 1\ 11 2000

1000 91 1-49

1

gooo -41 69 8000 1 91 r¡¡ 7000 81 105 55 125 1 6000 147 229 5000 272

4000

3000 161 175 187 2000 201 1000 o -> 30 40 50 60 o 80 90 1

'

lj\ lil•cFE:~~""'·c·o-~~...... ~~~~~~~~~-~~....,.;¡j

146 TF-:SIS DE GRADO

Anexo 61: :Espectro de masas del a- muroleno.

~~~=------1 5 9000

8000

7000 161 6000

5000 204

4000 93 11Q 3000

2000 81 189

1000

9000

8000

7000

6000

5000 161 93 4000

3000 79 204 119 2000

1000

'!1 o JO 40 50 60 ji,

1\1 !il iil 1)!

1

il, •

___ , ..... __ , ___ --·------·------,------147 TESIS DI·: CiR!\D<)

Anexo 62: Espectro del a- cadineno.

rund: 5

161 8000

7000

6000

5000

40001 204 36oo: 44 91 119 20001

10001

-> ance

1 0000: aooo:

7000

6000

5000

4000

3000 161

2000

1000 o f,-;z-=-~---

------·- --·. ------l-1-X TESIS DE GRADO

r~ ~1 Anexo 63: Espectro de masas del a-calacoreno.

~ Sean 26l"S\2~P 1 7

9000

8000

7000

8000

11 5000 '1' ¡¡: 4000 :¡; 142 3000 '1'11 i'i 2000 200 1:1 « 1000 111 o -> 20 nce 1 7 1 9000 11 8000 11. :li 7000 ¡,,'11 11! '!! 6000 ri1 142 5000 ¡: '·1 4000

11 3000 28 2000

1000

149 TESIS DE GRADO

Anexo 64: Espectro de masas del1,2,3,4- tetrametilbenceno.

~ ~~998C.D 1 9 ! ¡¡()()()

8000

7000

6000

5000

4000 91 3000

2000

1000

1 9

¡¡()()()

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000 91

1000

->

150 TESIS DE GRADO

Anexo 65: Espectro de masas del trans- piperitol.

~ce~------~s~~~1~2~~PE~------~

9000

8000

7000

6000 139 5000

4000 93 3000

2000

1000 o -> 20

QOOO

8000

7000

6000

5000

4000

3000 41 93 139 2000 55

1000 o -> 20

151 TESIS DE GRADO

Anexo 66: Espectro de masas del a.- fencheno.

Abuñdañce ::;c;¡n 1 tlO (5.431 min): OCT2998C.D

9000

8000 #

7000

8000 79 121

5000

4000

3000 107 138

2000 41

1000

miz-> 10 AJiíJñdañCi

9000

8000 79 7000

6000

5000 41 4000 121

3000 27 107 2000 53 136

1000 15 o miz-> 10 20

152 TESIS DE GRADO

Anexo 67: Espectro del Canfeno.

unoance Sean 183l5:454rlilnJ'TEPES2.

9000 121 8000

7000

6000

5000

4000 107 79 3000 67 136 2000

1000 o miz-> 30 .1\líüñdanc:e

9000

8000 121 7000

6000 41

5000 79

4000 67 107 3000

2000 53

1000 o -> 30

153 TESIS IJc URAJJO

Anexo 68: Espectro del Verbeneno.

Abundance sc:añ 202 (505115 i'ñlíij: oc 1w.o

8000

8000

7000

8000

5000

-'000

3000 1 1111

\11 2000 105

Ir~ 1! 8000

8000

7000

8000

5000

-'000

3000 1111 2000 -41

154 TESIS DE GRADO

Anexo 69: Espectro de masas del 3-octanol.

1\bunaance------.S"'ca"'n"'33U1S:55:tmlñYl.l::PECHr.Dr----

0000

8000 83

7000

6000

5000

4000 101

3000

2000 41

0000

8000

7000

8000

5000 83

4000

3000

2000 101

1000 o z-> 30

155 TESIS DE GRADO

Anexo 70: Espectro de masas de la fracción metilada.

¡t>J>unóance 11~11.0

9000000

8500000 21.01

8000000

7500000

7000000

6500000 iii 111 ~~ 6000000

~1 5500000 ¡1

1 6000000

1' 4500000

4000000

3500000

3000000

2500000 27.73

2000000

1500000 1 28.30

1000000

25.48 500000 23.46 26.1 os /\ 24.02 J1A "(....)....L1. 24-:SD A. -. .. j' . ----- 2~.52 tnme-> 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00 30.00. 31.00 32.00

156 TESIS DE GRADO

Anexo 71: Espectro de masas del2 a, 3J3- dihidroxiolean-12-en-28 ácido metil ester.

Abundance Sean 299'1\2H6añiiñj:t#\Yf000 . 2 7 0000

8000

7000 426 8000 44 262 5000 281 4000 189 3000 133

2000 95

1000 o T\lz-> 20 i>J)uñd;once

9000

8000 262 7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000 o 20 40

1 lli 1¡ '1' 111

111 '!'

1

1 ti

157 TESIS DE GRADO

Anexo 72: Espectro de masas del3 {3-hidroxiolean-12- en-28- ácido metil ester

1\büñdance 2 3 9000

8000

7000 262 6000

5000

4000

3000

2000 133 1000 o 553 603 626 -> 20 6 o ance

9000 262

8000

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000 470 o z-> 20

158 TESIS DE GRADO

Anexo 73: Espectro de masas del metil, 2 a.,3f3,23-trihidroxiolean-12- en-28-acido metil ester. -- ---~E-~~~~~aa~==~=aSE~Ea~~~=a~~~~~==~==~aa$5====~a=s=~~~ea~~~==~~~

'\Dunoance i:ican <598 (22.508 min): MAY1000H.o-- ---~------2 2 0000

6000 203 7000

6000

4000 133

3000

2000

1000 175 233 1 o !1 li r:u ~1 7 203 1 000 1,'ll 1 6000

11 5000

4000

3000

2000 11~ ~. 1000 '1' o -> 20 6 o lii'¡'

1 l 1

159 TJ·:SIS J>J·: GRADO

Anexo 74: Espectro de masas del 3 oxo-olean- 12-en-28 ácido metil ester.

'Aliüooanceo------.S"'ca"'n""2456 (21.446 mín):MAYfOOORJJ 2 7

9000

8000

7000 44 6000 262

5000 281 133 4000

3000

2000 189

1000 o miz-> 20 ce

9000

8000

7000

6000

5000 262 4000

3000

2000 133

1000 o -> 20

160 TESIS DE GRADO

Anexo 75: Espectro de masas del3f3-hidroxiolean-12-en-28- acido metil ester.

iJlííñdance i:>Cé:IO "-Oltlll \~ ... ~ nunJ; MA Y 1 UUOH.U 2 2 9000

8000 203 7000

8000

5000

4000 133

3000

2000

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9000 262 .

8000

7000

8000

5000

4000

3000

2000

1000 470 o 20

161 TESIS DE GRADO

Anexo 76: Espectro de RMN-1H de la Taxoquinona.

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162 TESIS DE GRADO

Anexo 77: Espectro de RMN- 13C de la Taxoquinona.

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163 TESIS DE GRADO

Anexo 78: Espectro de HMQC de la Taxoquinona

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164 TESIS DE GRADO

Anexo 79: Espectro de COSY de la Taxoquinona.

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165 TESIS DE GRADO

Anexo 80. Espectro de HMBC de la Taxoquinona.

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166 TESIS DE GRADO

Anexo 80. Espectro ultravioleta de la Taxoquinona.

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166