アフリカツメガエル成体の造血生理に関与する 蛋白質群の生物学的特性に関する研究

Studies on biological properties of proteins involved in the physiology of hematopoiesis in adult Xenopus laevis

2015 年 7 月

永澤 和道

Kazumichi NAGASAWA

アフリカツメガエル成体の造血生理に関与する 蛋白質群の生物学的特性に関する研究

Studies on biological properties of proteins involved in the physiology of hematopoiesis in adult Xenopus laevis

2015 年 7 月

早稲田大学大学院 先進理工学研究科 生命理工学専攻 分子生理学研究

永澤 和道

Kazumichi NAGASAWA

目次

目 次

略語一覧 ······························································································· v

図表一覧 ······························································································ vii

第 1 章 緒論 ························································································· 1

1-1. 本研究の背景 ································································································ 1 1-1-1. 哺乳類における造血機構 1-1-2. エリスロポエチン（EPO） （1）EPO の発見と研究の歴史 （2）EPO の検出法 （3）EPO の分子構造と機能（ヒト・マウス） （4）EPO における糖鎖の機能（ヒト） （5）脊椎動物の EPO 1-1-3. 環境応答における造血生理 （1）低酸素環境応答 （2）低温環境応答 1-1-4. ゲノム解読が生命科学研究に及ぼした影響 1-2. 本研究の目的と概要 ······················································································ 24 1-2-1. 目的 1-2-2. 概要（取り組んだ課題） （1）EPO の分子性状と構造活性相関 （2）造血の低温環境応答

第 2 章 アフリカツメガエルのエリスロポエチン検出系の構築 ····················· 27

2-1. 背景 ·········································································································· 27 2-2. 材料および方法 ··························································································· 27 2-2-1. ウサギ抗 xlEPO ペプチドポリクローナル抗体の作製 2-2-2. ウサギ抗 xlEPO ポリクローナル抗体の作製 2-2-3. マウス抗 xlEPO モノクローナル抗体の作製 2-2-4. 細胞増殖試験による中和活性の評価 2-2-5. xlEPO 定量サンドイッチ ELISA

i 目次

2-3. 結果 ·········································································································· 32 2-3-1. ウサギ抗 xlEPO ペプチドポリクローナル抗体 2-3-2. ウサギ抗 xlEPO ポリクローナル抗体 2-3-3. マウス抗 xlEPO モノクローナル抗体 2-3-4. 作出した抗体を使用した xlEPO 定量系の構築 2-4. 考察 ·········································································································· 40 2-4-1. 作製した抗 xlEPO 抗体の性質とその用途 2-4-2. 抗体を利用した展開例 1：xlEPO の糖鎖修飾の解析 2-4-3. 抗体を利用した展開例 2：ツメガエル血清中の xlEPO 活性の解析

第 3 章 アフリカツメガエルのエリスロポエチンの分子性状と構造活性相関 ··· 44

3-1. 背景 ·········································································································· 44 3-2. 材料および方法 ··························································································· 45 3-2-1. 糖鎖付加 xlEPO 発現ベクターの構築 3-2-2. 糖鎖付加 xlEPO の発現 3-2-3. xlEPO の物理化学的性状の解析 3-2-4. 糖鎖付加 xlEPO の脱糖鎖 3-2-5. 細胞増殖試験 3-3. 結果 ·········································································································· 49 3-3-1. 糖鎖付加 xlEPO の設計と発現 3-3-2. 糖鎖付加 xlEPO の分泌 3-3-3. 糖鎖付加 xlEPO の物理化学的性質 3-3-4. 糖鎖付加 xlEPO の in vitro 生物活性 3-4. 考察 ·········································································································· 56 3-4-1. xlEPO の分子性状 3-4-2. xlEPO の構造活性相関

第 4 章 アフリカツメガエルとネッタイツメガエルの血漿蛋白質の質量分析 ··· 62

4-1. 背景 ·········································································································· 62 4-2. 材料および方法 ··························································································· 62 4-2-1. 動物 4-2-2. 採血と血漿の採取 4-2-3. 質量分析用試料の調製

ii 目次

4-2-4. 質量分析（LC–MS/MS） 4-2-5. データ処理 4-2-6. アノテーション 4-3. 結果と考察 ································································································· 66

第 5 章 低温環境下のアフリカツメガエルにおけるプロテオーム変動 ············ 70

5-1. 背景 ·········································································································· 70 5-2. 材料および方法 ··························································································· 70 5-2-1. アフリカツメガエルの低温曝露 5-2-2. 採血，血算および血漿の採取 5-2-3. 肝臓組織の採取 5-2-4. 肝臓蛋白質の抽出 5-2-5. 蛋白質のトリプシン消化物の調製 5-2-6. 質量分析（LC–MS/MS） 5-2-7. データ処理 5-2-8. 量比解析 5-2-9. GO 解析およびパスウェイ解析 5-2-10. 遊離アミノ酸の定量 5-2-11. 肝臓中グリコーゲンの定量 5-2-12. グルコース，グリセロール，NADPH，NADP の定量 5-3. 結果 ·········································································································· 76 5-3-1. 低温曝露による環境温度（水温）の変化と汎血球減少の誘導 5-3-2. アフリカツメガエルの血漿・肝臓プロテオーム 5-3-2. 低温曝露による血漿・肝臓プロテオームの変動 5-3-3. 肝臓における代謝物の変動 5-4. 考察 ········································································································· 101 5-4-1. 低温曝露による血球減少の分子機序 5-4-2. 低温曝露により肝臓内で誘導される初期応答 5-4-3. プロテオミクスにおける分析方法の改善

第 6 章 総括と展望 ············································································· 106

6-1. 本研究の総括 ····························································································· 106 6-1-1. EPO の分子性状と構造活性相関

iii 目次

6-1-2. 造血の低温環境応答 6-2. 今後の課題と展望························································································ 109 6-2-1. EPO の分子性状 6-2-2. EPO の構造活性相関 6-2-3. 造血の低温環境応答 6-2-4. ツメガエルにおけるプロテオミクス 6-3. 結語 ········································································································· 115

謝辞 ·································································································· 116

参考文献 ···························································································· 117

研究業績 ···························································································· 132

iv 略語一覧

略語一覧

ARNT aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator BFU-E burst-forming unit erythroid（前期赤芽球系前駆細胞） BLVRA biliverdin reductase（ビリベルジン還元酵素） CFU-E colony-forming unit erythroid（後期赤芽球系前駆細胞） Con A concanavalin A（タチナタ豆レクチン） Dcytb duodenal cytochrome b DHAP dihydroxyacetone phosphate（ジヒドロキシアセトンリン酸） DIC disseminated intravascular coagulation syndrome（播種性血管内血液凝固症候群） DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium（ダルベッコ改変イーグル培地） DMT1 divalent metal transporter 1（二価金属トランスポーター1） DPBS Dulbecco’s phosphate buffered saline（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水） EC50 half maximal (50%) effective concentration（50%効果濃度） EGFP enhanced green fluorescent protein（高感度緑色蛍光タンパク質） ELISA enzyme-linked immunosorbent assay（酵素免疫化学的測定法） Emax maximal effect（最大効果） EPO erythropoietin（エリスロポエチン） EPOR erythropoietin receptor（EPO receptor）（ EPO 受容体） G1P glucose 1-phosphate（グルコース 1–リン酸） G3P glycerol 3-phosphate（グリセロール–3–リン酸） G3Pase glycerol-3-phosphatase（グリセロール–3–ホスファターゼ） G6P glucose 6-phosphate（グルコース 6–リン酸） GBE 1,4-alpha-glucan branching enzyme（1,4α–グルカン分岐酵素） G-CSF granurocyte-colony stimulating factor（顆粒球コロニー刺激因子） GO:BP Gene Ontology Biological Process GPDH glycerol-3-phosphate dehydrogenase（グリセロール–3–リン酸デヒドロゲナーゼ） HIF hypoxia-inducible factor（低酸素誘導性因子） HOMX1 hem oxygenase 1（ヘムオキシゲナーゼ） HRE hypoxia responsive element（低酸素応答配列） HSC hematopoietic stem cell（造血幹細胞） huEPO human EPO（ヒト EPO） huEPOR human EPOR（ヒト EPO 受容体） IBA Information Based Acquisition

v 略語一覧

IL interleukin（インターロイキン） IMDM Iscove’s modified Dulbecco’s media（イスコフ改変ダルベッコ培地） IRES internal ribosomal entry site（配列内リボソーム進入部位） KEGG Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes MAPK mitogen-activated protein kinase（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ） Nrf2 nuclear factor E2 (NfE2)-related factor 2 ODD oxygen dependent degradation domain（酸素依存性分解ドメイン） PBS phosphate-buffered saline（リン酸緩衝食塩水） PGM phosphoglucomutase（ホスホグルコムターゼ） PHD prolyl hydroxylase（プロリン水酸化酵素） PI3K phosphoinositide 3-kinase（イノシトールリン脂質 3 キナーゼ） PK pyruvate kinase（ピルビン酸キナーゼ） PNGase F peptide-N-glycosidase F（ペプチド N-グリコシザーゼ F） pVHL von Hippel-Lindau protein（von Hippel-Lindau 蛋白質） PYGL glycogen phosphorylase（グリコーゲンホスホリラーゼ） rhuEPO recombinant human EPO（遺伝子組換え型ヒト EPO） RIA radioimmunoassay（放射性免疫測定法） STAT signal transducer and activator of transcription（シグナル伝達性転写因子） TBS Tris-buffered saline（EDTA 含有トリス緩衝生理食塩水） TMBZ 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine（テトラメチルベンジジン） TPO thrombopoitein（トロンボポエチン） UGPase UDP-glucose pyrophosphorylase（ウリジン二リン酸グルコースピロホスホリラーゼ） VCAM-1 vascular adhesion molecule-1（血管細胞接着分子 1） VLA-4 very late activation antigen 4 WGA wheat germ agglutinin（小麦胚芽レクチン） xlEPO Xenopus laevis EPO（アフリカツメガエル EPO） xlEPOR Xenopus laevis EPOR（アフリカツメガエル EPO 受容体） α-MSH α-melanocyte stimulating hormone（α-メラトニン細胞刺激ホルモン）

vi 図表一覧

図表一覧

第 1 章

図 1-1． 血球分化系譜と造血因子 図 1-2． 造血生理に関与する要素 図 1-3． EPO の結合による EPOR の活性化 図 1-4． EPO 成熟蛋白質のアミノ酸配列相同性 図 1-5． EPO 成熟蛋白質の構造の模式図と EPO 発現臓器・赤血球前駆細胞の分布 図 1-6． HIF による EPO 発現の低酸素誘導 図 1-7． HIF による赤血球造血の制御 図 1-8． 体温調節における低温環境応答 図 1-9． 低温曝露ツメガエルにおける赤血球造血応答の模式図 図 1-10． オミクス 図 1-11． プロテオミクスに関する論文の報告数の推移 図 1-12． アフリカツメガエル成体の赤血球産生 表 1-1． ヒト EPO に対する抗体の報告 表 1-2． 脊椎動物における EPO 遺伝子配列の報告 表 1-3． 造血の季節・環境温度応答に関する報告 表 1-4． ゲノム情報が利用可能な脊椎動物

第 2 章

図 2-1． マウス抗 xlEPO モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング 図 2-2． xlEPO 抗原ペプチドの選定 図 2-3． huEPO 立体構造における xlEPO ペプチド抗原の相同部位 図 2-4． ウサギ抗 xlEPO ペプチド抗体の抗原認識 図 2-5． 抗原特異的抗 xlEPO ペプチド抗体の認識性 図 2-6． 抗 xlEPO ペプチド抗体による xlEPO 活性の中和 図 2-7． ウェスタンブロット法における各抗体による xlEPO の検出 図 2-8． xlEPO 定量サンドイッチ ELISA の検量線 表 2-1． xlEPO 抗原ペプチド 表 2-2． サンドイッチ ELISA におけるシグナルの xlEPO 濃度依存性 表 2-3． 作製した各抗 xlEPO 抗体の性質

vii 図表一覧

第 3 章

図 3-1． 糖鎖付加 xlEPO のデザイン 図 3-2． 本研究で用いた同時に複数の部位特異的変異を導入する方法の概念図 図 3-3． 糖鎖付加 xlEPO の発現と N 結合型糖鎖糖鎖修飾の確認 図 3-4． xlEPO の分泌に与える N 結合型糖鎖の影響 図 3-5． 糖鎖付加 xlEPO の物理化学的性質 図 3-6． 糖鎖付加 xlEPO の in vitro 生物活性 図 3-7． 糖鎖修飾の数と in vitro 生物活性の関係 表 3-1． 部位特異的変異導入に用いたプライマー 表 3-2． 糖鎖付加 xlEPO の in vitro 生物活性（相対値） 表 3-3． ヒト EPO-EPOR の結合部位 1 と結合部位 2 における互いに接触するアミノ酸残基， および対応する xlEPO，xlEPOR のアミノ酸残基

第 4 章

図 4-1． 質量分析用試料の調製（フローチャート） 図 4-2． プロテオミクスの分析法の選択 図 4-3． 同定された蛋白質の機能情報 表 4-1． MS/MS イオン検索の設定条件 表 4-2． データベースにおける塩基およびアミノ酸配列の登録数 表 4-3． 質量分析における蛋白質同定数

第 5 章

図 5-1． 試料調製とデータ処理の概念図 図 5-2． 5°C への曝露時間と水温 図 5-3． 血漿・肝臓蛋白質の構成 図 5-4． MS/MS イオン検索の概要（血漿） 図 5-5． 血漿蛋白質の GO およびパスウェイ解析 図 5-6． MS/MS イオン検索の概要（肝臓） 図 5-7． 肝臓蛋白質の GO およびパスウェイ解析 図 5-8． 血漿蛋白質の量比分布 図 5-9． 肝臓蛋白質の量比分布 図 5-10． 肝遊離アミノ酸量 図 5-11． 低温曝露 24 時間後の肝臓における糖代謝経路の蛋白質量の変化

viii 図表一覧

図 5-12． 肝グリコーゲン量 図 5-13． 肝臓におけるグリコーゲンの利用 図 5-14． 肝臓および血漿中のグルコース量 図 5-15． 肝臓および血漿中のグリセロール量 図 5-16． 肝臓中の NADP および NADPH 量 図 5-17． 血漿蛋白質の変動からみる血球減少機序 図 5-18． アフリカツメガエル肝臓における低温曝露に対する初期応答の概念モデル 表 5-1． 血算値および体重，肝臓湿重 表 5-2． 検出された血漿蛋白質群に関連する GO:BP 表 5-3． 検出された肝臓蛋白質群に関連する GO:BP および KEGG パスウェイ 表 5-4． 検出された肝臓蛋白質群に関連する GO:BP 表 5-5． 検出された肝臓蛋白質群に関連する KEGG パスウェイ 表 5-6． 低温曝露で発現量が高い蛋白質（血漿）：グループ 1 表 5-7． 低温曝露でのみ検出された蛋白質（血漿）：グループ 2 表 5-8． 低温曝露で発現量が低い蛋白質（血漿）：グループ 3 表 5-9． 低温曝露でのみ検出されなかった蛋白質（血漿）：グループ 4 表 5-10． 低温曝露で発現量が高い蛋白質（肝臓）：グループ 1 表 5-11． 低温曝露でのみ検出された蛋白質（肝臓）：グループ 2 表 5-12． 低温曝露で発現量が低い蛋白質（肝臓）：グループ 3 表 5-13． 低温曝露でのみ検出されなかった蛋白質（肝臓）：グループ 4

ix 第 1 章

第 1 章 緒 論

1-1. 本研究の背景

1-1-1. 哺乳類における造血機構 生物の身体の中を流れる血液は，生命の維持に必須である．ヒトでは，体重に対

する血液の量は 7～8%といわれており，そのうち 1/3～1/2 の血液を失うと死に至 る．血液中には赤血球，白血球，栓球（栓球のうち哺乳類のもつ脱核したものを血 小板という）が存在し，それぞれ，体組織への酸素供給，生体防御，止血血栓形成 を担う．血球の寿命には限りがあるため，末梢血球数の恒常性を保つには，血球が 絶えず補給されなければならない．したがって，血球産生（造血）は生物にとって 必須の生命機構である．造血は，自己複製能と多分化能を併せもつ造血幹細胞

（hematopoietic stem cell：HSC）が様々な血球系前駆細胞へと増殖・分化して進む （図 1-1）．その過程において，血球前駆細胞の増殖・分化は，造血微小環境（ニッ チ）とよばれる造血支持細胞との相互作用（総説 Morrison and Scadden, 2014）や， 特定の分化段階で各血球系譜特異的に作用する造血因子（サイトカイン）の作用（総

説 Kaushansky, 2006）を受けることで制御される（図 1-2）．例えば，ヒトやマウス の成体型造血において，HSC は骨髄中の骨芽細胞を含む間葉系細胞群や血管内皮 細胞，神経系のシュワン細胞に近接している．この HSC の維持に重要な骨髄ニッ チでは，HSC 側受容体/ ニッチ構成細胞側リガンドとして， Tie-2/Ang-1 ， CXCR4/CXCL12，c-kit/SCF，c-mpl/TPO などのシグナルがはたらいている．そして， 造血因子としては，赤血球の産生にはエリスロポエチン（erythropoietin：EPO），血 小板の産生にはトロンボポエチン（thrombopoitein：TPO），白血球のうち 6～7 割を 占める好中球の産生には顆粒球コロニー刺激因子（granurocyte-colony stimulating factor：G-CSF）が中心的な役割を果たす．EPO は主に腎臓で産生され，貧血や低 酸素環境への曝露により産生量が増加することで赤血球産生が促進され，酸素供給

の恒常性が維持される．TPO は主に肝臓において血小板数に左右されず常に一定 量産生され，血小板やその前駆細胞である巨核球上の TPO 受容体（c-mpl）に結合

1 第 1 章

IL-2 pro NK NK細胞 T/NK pro IL-2,6,7 pro T pre T T細胞 CLP

IL-4,5,6 pro B pre B B細胞

SCF CFU- 肥満細胞 Mast 白血球 IL-6 CFU- IL-3 HSC MPP TPO 好塩基球 Flt3リガンド Baso GMP IL-3, 5, GM-CSF CFU- 好酸基球 Eo

G-CSF CFU- 好中球 SCF G G-CSF CFU- IL-3 IL-3 GM GM-CSF GM-CSF M-CSF CMP CFU- 単球 M IL-3, G-CSF, TPO, EPO, SCF TPO, SCF, IL-3, GM-CSF CFU- 血小板 Meg EPO MEP SCF IL-3 GM-CSF EPO BFU CFU 赤血球 -E -E

図 1-1．血球分化系譜と造血因子 造血幹細胞（hematopoietic stem cell：HSC）は自己複製能をもたず多分化能のみをもつ多能性前 駆細胞（multipotential progenitor：MPP）に分化し，MPP は骨髄球系共通前駆細胞（common myeloid progenitor：CMP）とリンパ球系共通前駆細胞（common lymphoid progenitor：CLP）を産生する． CMP は巨核球/赤芽球系前駆細胞（megakaryocyte-erythroid progenitor：MEP）と顆粒球/マクロフ ァージ系前駆細胞（granulocyte-macrophage progenitor：GMP）に分化し，前者は赤血球と血小板， 後者は白血球のうち単球・マクロファージと顆粒球（好中球，好酸球，好塩基球）を産生する．CLP は，B 細胞，T 細胞，ナチュラルキラー細胞（NK 細胞）を産生する．赤血球の産生にはエリスロ ポエチン（erythropoietin：EPO），血小板の産生にはトロンボポエチン（thrombopoitein：TPO）， 白血球のうち好中球を中心とした顆粒球系細胞と単球・マクロファージの産生には顆粒球-マクロ ファージコロニー刺激因子（granurocyte-macrophage colony-stimulating factor：GM-CSF），顆粒 球コロニー刺激因子（granurocyte-colony stimulating factor：G-CSF），マクロファージコロニー刺 激因子（macrophage-colony stimulating factor：M-CSF），リンパ球の産生にはインターロイキン （interleukin：IL）が中心的な役割を果たす．図中の略語は以下である．SCF：幹細胞因子（stem cell factor），CFU：コロニー形成単位（colony-forming unit），BFU：バースト形成単位（burst-forming unit），pro/pre：前駆細胞（progenitor/precurcor）．カラーテキスト血液病学 2 版（木崎昌弘 編著， 2013）より引用・改変．

2 第 1 章

し取り込まれた後に分解される．この結果，血小板の消費により血小板数が減少す

ると，血中 TPO 濃度が高くなり血小板産生の恒常性が維持されている．G-CSF は， 感染等により活性化した単球が産生するインターロイキン（interleukin：IL）-1，IL-6， 腫瘍壊死因子 α といった炎症性メディエーターにより，繊維芽細胞，マクロファー ジ，内皮細胞での産生量が増加する．G-CSF 受容体は好中球前駆細胞から成熟好中 球にまで発現している．そのため，G-CSF は，その作用により好中球が増加すると， G-CSF 受容体を介した取り込みと分解により循環から除去される．このように，哺 乳類では，曝される外部環境や感染等に応答して造血が制御され，血球数や生体内 環境の恒常性が維持される（造血生理）．そして，造血微小環境や造血因子による

外的制御の他にも，内的制御として，血球系細胞は転写因子（総説 Zhu and Emerson, 2002），エピジェネティクス（総説 Sashida and Iwama, 2012）， 非翻訳 RNA である microRNA（総説 Montagner et al., 2014）などの制御を受ける．このように，造血生 理は多数の生体分子からなる非常に複雑なネットワークにより調節されている．

低酸素環境 / 血小板消費 / 病原体感染

転写因子 microRNA 成熟血球 造血因子 エピジェネティクス サイトカイン

受容体

可溶性蛋白質 血球前駆細胞 細胞外基質

接着分子

栄養素 造血支持細胞 アミノ酸，ミネラル， ビタミンなど

図 ．造血生理に関与する要素 1-2

3 第 1 章

1-1-2. エリスロポエチン（EPO） 赤血球はほとんどの脊椎動物がもち，赤血球をもたない生物はウナギの幼生と南

極のコオリウオだけとされる（Schmidt-Nielsen, 1997）．したがって，赤血球産生は 脊椎動物に共通した生命機構である．ここでは，赤血球産生を担う造血因子である

EPO について概説する．

(1) EPO の発見と研究の歴史 赤血球産生に関する研究は，1674 年に Leeuwenhoek が自らの赤血球の観察につ いて報告したことに端を発する（Leeuwenhoek, 1974; 総説 Becker, 2010）．その約 200 年後からさらに約一世紀かけて，EPO の存在が実証された（総説 Fried, 2009; 総 説 Fisher, 2010）． 1863 年には，Jourdanet が高地居住者は血液が濃くその粘性が高い ことを記載し，1882 年に Bert が高地で生活すると赤血球数が増加することを報告 した．そして，1891 年に Viault が高山への旅行で赤血球数が増加することを報告 し，赤血球産生と低酸素状態の関連が明らかとなった．1906 年に Carnot と Deflandre は，瀉血貧血家兎の血清を正常家兎に投与すると赤血球産生が亢進することを報告

し，貧血血清中には液性因子が存在すると考え‘hemopoietine’と名付けた．この 仮説は多くの人によって追試がなされ，1936 年に熊本大学（旧制熊本医科大学） の小宮悦造により（小宮，1936），また 1948 年にフィンランドの Bonsdorff と Jalavisto によって，赤血球産生を亢進する液性因子は‘erythropoietin’と命名された．そし て，1950 年に Reissmann が，2 匹のラットを並体接合（parabiosis）し，一方を低酸 素環境下，もう一方を正常酸素環境下におくと，正常酸素環境下のラットでも赤血

球産生が亢進することを示した（Reissmann, 1950）． さらに 1953 年に Erslev は，瀉 血貧血家兎の血漿を正常家兎に繰り返し投与すると赤血球産生が亢進することを

示した（Erslev, 1953）．この二つの実験により，低酸素状態，貧血状態で起きる赤 血球産生の亢進は血液中の液性因子を介していることが示され，EPO の存在が実 証された．その後，熊本大学の宮家らにより 2.5 t の再生不良性貧血患者の尿から 約 10 mg の天然型ヒト EPO 蛋白質が精製・純化され，1977 年に報告された（Miyake et al., 1977）． さらに，宮家らが精製した尿由来 EPO の部分ペプチドのアミノ酸配 列が気相シークエンサーを用いたアミノ酸配列分析により明らかとなり，この配列

もとにヒト EPO 遺伝子が cDNA ライブラリー（Jacobs et al., 1985）とゲノムライブ

4 第 1 章

ラリー（Lin et al., 1985）からそれぞれ単離され，1985 年に報告された．遺伝子が 単離されると，遺伝子工学的手法により遺伝子組換え型ヒト EPO（recombinant human EPO：rhuEPO）が作製されるようになった．そして現在では，チャイニーズ ハムスター卵巣細胞で発現された糖鎖構造をもつ rhuEPO が，慢性腎不全（Winearls et al., 1986; Eschbach et al., 1987）やがん（Miller et al., 1992），ヒト免疫不全ウイル ス感染（Henry et al., 1992），術前自己血貯血（Price et al., 1996）にともなう貧血や 未熟児貧血（Halpérin, 1991）の治療薬として臨床で使用されている．

(2) EPO の検出法 天然型ヒト EPO の完全純化が成功するに至る過程には，それより以前に，血中 や組織に含まれる EPO の性状や活性を調べるために数多くの生物学的測定法（バ イオアッセイ）が確立されてきたことが貢献している．1950 年代後半には in vivo バイオアッセイが確立された．本法は，体内の内因性の EPO 産生を抑制させたラ ットやマウスを用い，循環赤血球中のヘムへの放射性鉄の取り込み率を指標にして

投与した試料の EPO 活性を測定するもので，飢餓ラット法（Garcia and Van Dyke, 1959）と多血マウス法（輸血による多血：Jacobson et al., 1957; 低酸素飼育による 多血：Cotes and Bangham, 1961）が広く用いられた．しかし，in vivo バイオアッセ イには，数多くの動物を使い測定誤差が大きい，試料を多量に必要とする，結果を

得るまでに時間がかかる，測定感度が低い，といった欠点があった．そこで，1970 年代に in vitro バイオアッセイが確立され，広く用いられるようになった．その方 法には，ラットやマウスの骨髄細胞を液体培養して放射性鉄のヘムへの取り込みを

測定する方法（Goldwasser et al., 1975; Krystal et al., 1981）と，マウスの胎仔肝細胞 や骨髄細胞を半固形培地で培養して形成されるコロニーを顕微鏡下で識別し赤芽

球コロニーを計数する方法（コロニー形成法，コロニーアッセイ）（Stephenson et al., 1971; Gregory et al., 1973; Iscove et al., 1974; Johnson and Metcalf, 1977）がある．in vivo 法に比べ，測定感度が高く短時間で結果が得られる，という利点がある．宮家らは，

精製過程における EPO 活性の測定に飢餓ラット法，多血マウス法，ラット骨髄細 胞の液体培養を使用している（Miyake et al., 1977）． コロニーアッセイの確立により，EPO の標的細胞である赤血球系前駆細胞とそ の分化様式も調べられるようになった．本法では，半固形培地として血漿凝塊

5 第 1 章

（plasma clot）（Stephenson et al., 1971; Gregory et al., 1973），メチルセルロース （Iscove et al., 1974），軟寒天（Johnson and Metcalf, 1977）を含む培地を用いる．コ ロニーアッセイでは，形成された一細胞に由来するコロニーの構成細胞の種類や数 を調べることで，試料中の活性を標的細胞への特異性と共に調べると同時に，血球 前駆細胞の増殖・分化を調べることができる．つまり，血球系前駆細胞の増殖・分

化過程を in vitro でレトロスペクティブ（遡及的）に解析することができる．後に， 赤芽球コロニーを形成する細胞は後期赤芽球系前駆細胞（colony-forming unit erythroid：CFU-E）と定義された．そして，さらに長時間の培養により赤芽球コロ ニーの集団（赤芽球バースト）を形成する細胞（Iscove and Sieber, 1975）は，より 未分化な赤血球系の前駆細胞であり，前期赤芽球系前駆細胞（Burst-forming unit erythroid：BFU-E）と定義された．このようにして，BFU-E→CFU-E→赤芽球（前 赤芽球→好塩基性赤芽球→多染性赤芽球→正染性赤芽球）→網赤血球→赤血球とい

う赤血球系細胞の分化様式が理解された．このうち，EPO 感受性を有するのは BFU-E から赤芽球であり，CFU-E が最も EPO 応答性が高い． EPO の純化が進むと，多くの抗体が作出された（表 1-1）．そして，抗体を利用 した免疫学的測定法（イムノアッセイ） である放射性免疫測定法

（radioimmunoassay：RIA）（Sherwood and Goldwasser, 1979; Matsubara et al., 1989） や酵素免疫化学的測定法（enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA）（ Barosi and Costa, 1987; Kientsch-Engel et al., 1989; Wognum et al., 1989; Kientsch-Engel et al., 1990; Pauly et al., 1991; Noé et al., 1992; Noé et al., 1999; Yanagihara et al., 2008）が確 立され，EPO 活性ではなく EPO 分子（EPO 蛋白質）そのものの量を測定できるよ うになった．現在では，ELISA が広く一般的に用いられている．これらの手法の確 立に伴い，血中濃度 pg/mL オーダーとごく微量に存在する EPO までも検出するこ とが可能となり，EPO 活性や血中濃度の測定感度は in vivo でのバイオアッセイ法 と比べて数百倍にまで向上した．

(3) EPO の分子構造と機能（ヒト・マウス） ヒト EPO（human EPO：huEPO）の成熟蛋白質は，遺伝子産物の 193 アミノ酸残 基から 27 残基のシグナルペプチドが切断され，さらに C 末端のアルギニン残基が

6 第 1 章

表 1-1．ヒト EPO に対する抗体の報告 a b c 報告 作出抗体 使用抗原 実験手法 Weiss et al., 1982 ラット MoAb 部分精製 huEPO RIA，中和試験 Sue and Sytkowski, 1983 ウサギ PoAb 合成ペプチド ELISA，IP Yanagawa et al., 1984a マウス MoAb 部分精製 huEPO WB，IAC Sytkowski and Fisher, 1985 マウス MoAb 合成ペプチド RIA，IP，中和試験 Sytkowski and Donahue, 1987 マウス MoAb 合成ペプチド RIA，IP，中和試験 Wojchowski et al., 1987 ウサギ PoAb 合成ペプチド ELISA，IAC Miyazaki et al., 1988 マウス MoAb 精製 rhuEPO（CHO 細胞） ELISA，IAC Wognum et al., 1988 マウス MoAb 精製 huEPO，合成ペプチド RIA，ELISA，中和試験 Goto et al., 1989 マウス MoAb 精製 rhuEPO（BHK 細胞） RIA，ELISA，IP，中和試験， 受容体結合阻害試験 D'Andrea et al., 1990 マウス MoAb 精製 rhuEPO RIA，ELISA，IP，中和試験， 受容体結合阻害試験 Fledman et al., 1992 マウス MoAb huEPO WB，中和試験 Fibi et al., 1993 マウス MoAb 精製 rhuEPO，合成ペプチド EIA，受容体結合阻害試験 Ben Ghanem et al., 1993 マウス MoAb 精製 rhuEPO WB，IAC，中和試験 Elliot et al., 1996a マウス MoAb 合成ペプチド RIA，ELISA Elliot et al., 1996b ウサギ PoAb 精製 rhuEPO（CHO 細胞） RIA，ELISA，中和試験 マウス MoAb Yan et al., 2004 マウス MoAb 精製 rhuEPO ELISA，WB Giménez et al., 2007 マウス MoAb 合成ペプチド ELISA，WB，IAC Mi et al., 2007 マウス MoAb 精製 rhuEPO ELISA，WB

a MoAb：モノクローナル抗体，PoAb：ポリクローナル抗体． b huEPO：ヒト EPO，rhuEPO：組換えヒト EPO，（ ）： rhuEPO の発現宿主． c 抗体の性状解析に使用した実験手法または作出した抗体を使用した実験手法を列挙した． RIA：放射性免疫測定法，ELISA：酵素免疫化学的測定法，WB：ウェスタンブロット法，IAC： 免疫アフィニティークロマトグラフィー，IP：免疫沈降法．

除去された 165 アミノ酸残基からなる（Lai et al., 1986; Recny et al., 1987）．そして， 7 位と 161 位，29 位と 33 位のシステイン残基で形成される 2 本の分子内ジスルフ ィド結合（Lai et al., 1986）と，3 本の N 結合型糖鎖（Asn24，Asn38，Asn83）， 1 本の O 結合型糖鎖（Ser126）をもつ（Sasaki et al., 1987; Takeuchi et al., 1988; Imai, Kawamura et al., 1990）． I 型サイトカインに分類され，4 本の α-へリックス（ヘリッ クス A–D）がループにより up-up-down-down 配置で接続された立体構造をもつ （Cheetham et al., 1998）． EPO は，低酸素に応答して腎臓で産生され，赤血球前駆細胞表面に発現する EPO 受容体（EPO receptor：EPOR）に結合することで，その細胞の生存，増殖，分化を 促進し，赤血球産生を支持する．EPO 分子内には親和性の異なる 2 か所の EPOR 結合部位が存在し，1 分子の EPOが 2 分子の huEPOR と結合する（Syde et al., 1998）． 高親和性結合部位を site 1（結合部位 1），低親和性結合部位を site 2（結合部位 2）

7 第 1 章

と呼ぶ．結合部位 1 は Lys45，Asn147，Arg150，Gly151 が重要でありへリックス B 手前の短いへリックス構造とへリックス D に位置している．結合部位 2 は Arg14， Tyr15，Lys97，Ser100，Arg103，Ser104，Leu108 が重要であり，へリックス A とヘ リックス D に位置している（Syde et al., 1998）． EPOR 遺伝子は，1989 年にマウス（D'Andrea et al., 1989a）， 1990 年にヒト（Jones et al., 1990; Winkelmann et al., 1990）において cDNA の単離が報告された．EPOR は N 末端が細胞外に，C 末端が細胞内に存在する一回膜貫通型受容体で，I 型サイト カイン受容体ファミリーに分類される（D'Andrea et al., 1989b）． EPOR はもともと ホモ二量体を形成しており，その細胞内領域には細胞質型（非受容体型）チロシン

キナーゼであるヤヌスキナーゼ 2（Janus kinase 2：JAK2）が恒常的に会合している （Livnah et al., 1999）． EPO が結合すると，EPOR の細胞内領域の構造・立体配置に 変化が生じることで JAK2 同士が近接し互いにリン酸化する．リン酸化された活性 化 JAK2 は EPOR をリン酸化し，下流の STAT（signal transducer and activator of transcription）， PI3K（phosphoinositide 3-kinase）， MAPK（mitogen-activated protein kinase）を介する各シグナル伝達経路を活性化する（総説 Zhang et al., 2014）（図 1-3）． そして，最終的に前駆細胞のアポトーシスを抑制し，増殖と分化を促進する．EPOR 下流のシグナル伝達経路の活性化にはリガンド結合時の 2 分子の EPOR の立体配置

EPO EPO EPO EPO

EPOR

JAK2 JAK2 P JAK2 JAK2 P P JAK2 JAK2 P P JAK2 JAK2 P

P P P P

P P P P

EPORの立体配置の変化により 活性化したJak2は JAK2同士が近接し， EPORをリン酸化する． シグナル伝達経路の活性化 互いにリン酸化する． （STAT, PI3K, MAPK）

P リン酸化 増殖 生存 分化

図 1-3．EPO の結合による EPOR の活性化 総説 Zhang et al., 2014 より引用・改変．

8 第 1 章

が重要であることがわかっている（総説 Jiang and Hunter, 1999; 総説 Boger and Goldberg, 2001）． EPO の生体内での機能は，遺伝子改変マウスの解析でも調べられている．huEPO トランスジェニックマウスは多血症を呈する（Semenza et al., 1989）．一方，EPO ま たは EPOR のノックアウトマウスは，赤血球産生不全による著明な貧血で胎生致死 となるものの，他の血球系には異常を認めない（Wu et al., 1995）．以上より EPO と EPOR は赤血球産生に特異的かつ必須な因子である．また，これらのノックアウト マウスには BFU-E と CFU-E が存在し，CFU-E は減少していたことから，EPO は BFU-E の増殖や CFU-E への分化には必須でなく，CFU-E の生存と増殖・分化に必 須であることが示されている（Wu et al., 1995）．さらに，内在性の EPO と同調して 緑色蛍光蛋白質を発現するトランスジェニックマウスが作製され，EPO 産生細胞 が腎臓の尿細管間質細胞であること，生体内の EPO 産生量は個々の細胞における EPO 遺伝子発現量の変動ではなく EPO 産生細胞の数により調節されていることが 示されている（Obara et al., 2008）．

(4) EPO における糖鎖の機能（ヒト） huEPO の分子量 30,400 Da のうち約 39%を糖鎖が占める（Davis et al., 1987）．ま た，SDS-PAGE では，huEPO は約 37 kDa 付近に検出されるが，糖鎖を除去すると アミノ酸配列から計算されるポリペプチド鎖の分子量に等しい約 18 kDa 付近に検 出される（Tsuda et al., 1990）． EPO が糖蛋白質であること，シアル酸を除去すると in vivo アッセイでは生物活性を示さないが in vitro アッセイでは低濃度において生 物活性は 3 倍にまで上昇することが，huEPO 純化以前より示されていた（Goldwasser and Kung, 1974）．そのため，huEPO の純化と遺伝子が単離されると，尿由来天然型 huEPO や遺伝子組換え体を用いて糖鎖の生物活性に対する影響が精力的に研究さ れた． 糖鎖末端に位置するシアル酸を除去すると，huEPO の受容体親和性の上昇にと もない in vitro における生物活性が増加する（Takeuchi et al., 1990; Tsuda et al., 1990）． 一方で，in vivo においては，肝アシアロ糖蛋白質受容体により捕捉され，血液循環 から除去されるために，ほとんど生物活性を示さない（Fukuda et al., 1989; Spivak and Hogans, 1989）． huEPO のシアル酸含量と血中半減期，in vivo 生物活性には正の

9 第 1 章

相関関係を認めるが，受容体親和性および in vitro 生物活性とは負の相関関係にあ る（Imai, Higuchi et al., 1990; 総説 Egrie and Browne, 2001）． N 結合型糖鎖と O 結合 型糖鎖は，それぞれ 4 つと 2 つのシアル酸残基をもつ．そのため，huEPO の N 結 合型糖鎖の数は in vivo 生物活性には正の相関関係にあるが，受容体親和性および in vitro 生物活性とは負の相関関係にある（Higuchi et al., 1992; 総説 Egrie and Browne, 2001; Elliott et al., 2004a）．部位特異的変異導入により N 結合型糖鎖を欠失 させると，in vitro および in vivo 生物活性が影響を受ける（Dubé et al., 1988; Yamaguchi et al., 1991; Delorme et al., 1992; Fibi et al., 1995）．一方，O 結合型糖鎖の 酵素的除去や欠失は in vitro および in vivo 生物活性に影響を与えない（Takeuchi et al., 1990; Wasley et al., 1991; Delorme et al., 1992; Higuchi et al., 1992）．また，大腸菌で発 現させた糖鎖修飾をもたない rhuEPO は，動物細胞で発現させた糖鎖修飾をもつ rhuEPO に比して，血中安定性に乏しく半減期も短いため，in vivo 生物活性を示さ ない（Wang et al., 2010）．臨床においては，huEPO のアミノ酸配列の一部を改変し， 新たに 2 本の N 結合型糖鎖を付加したダルベポエチン α が腎性貧血の治療薬とし て使用されている（総説 Nissenson, 2001）． 以上のほか，糖鎖は huEPO の分子安定 性（Narhi et al., 1991; Endo et al., 1992; Uchida et al., 1997; Nishiyama et al., 2000; Toyoda et al., 2000; Toyoda et al., 2002）や，生合成，分泌（Dubé et al., 1988; Yamaguchi et al., 1991; Delorme et al., 1992）にも寄与する．

(5) 脊椎動物の EPO EPO 遺伝子は現在までに様々な脊椎動物で同定されている．哺乳類では少なく とも 13 種，哺乳類以外では無尾両生類のアフリカツメガエル（Xenopus laevis）と 硬骨魚類のトラフグ（Takifugu rubripes），ゼブラフィッシュ（Danio rerio），キンギ ョ（ Carassius auratus L.）で報告されている（表 1-2）．また，データベース上に EPO として登録されている遺伝子配列も含めれば，約 80 種に上る． 蛋白質の一次構造の相同性は，哺乳類間では 70%以上と高いが，哺乳類と両生類， 魚類間では 40%未満と低い（図 1-4）．huEPO のジスルフィド結合を形成するシス テイン残基の位置（Cys7–Cys161，Cys29–Cys33）は，齧歯類を除き保存されてい る．また，huEPO の 3 か所の N 結合型糖鎖付加部位（Asn24, Asn38, Asn83）と

10 第 1 章

表 1-2．脊椎動物における EPO 遺伝子配列の報告 分類 種名（学名） 文献 哺乳類 霊長目 ヒト（Homo sapiens） Jacobs et al., 1985; Lin et al., 1985 カニクイザル（Macaca fascicularis） Lin et al., 1986 アカゲザル（Macaca mullata） Wen et al., 1993 偶蹄目 ウシ（Bos indicus） Suliman et al., 1996 ヒツジ（Ovis aries） Fu et al., 1993 ブタ（Sus scrofa） David et al., 2001 奇蹄目 ウマ（Equus cabalhs） Sato et al., 2004 ネコ目 イヌ（Canis familiaris） Wen et al., 1993 ネコ（Felis catus） Wen et al., 1993 齧歯目 マウス（Mus musculus） McDonald et al., 1986; Shoemaker and Mitsock, 1986 ラット（Rattus norvegicus） Nagao et al., 1992 モグラネズミ（Myospalax baileyi） Wang et al., 2012 重歯目 ウサギ（Oryctolagus cuniculust） Vilalta et al., 2001 両生類 アフリカツメガエル（Xenopus laevis） Nogawa-Kosaka et al., 2010 魚類 トラフグ（Takifugu rubripes） Chou et al., 2004 ゼブラフィッシュ（Danino rerio） Chu et al., 2007;

Paffett-Lugassy et al., 2007 キンギョ（Carassius auratus） Katakura et al., 2013

アミノ酸配列相同性 0% 100%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1. ヒト 90.4 91.6 83.2 82.0 82.1 84.9 81.3 83.7 80.1 82.5 81.3 81.4 38.4 35.4 37.3 35.5 2. アカゲザル 90.4 98.8 90.8 79.6 81.0 82.5 80.1 82.5 79.5 81.9 79.5 79.6 37.9 33.9 38.2 36.4 3. カニクイザル 91.6 98.8 82.0 80.8 82.1 83.7 81.3 83.7 80.7 83.1 80.7 80.2 37.3 37.5 39.4 37.6 4. ウシ 83.2 90.8 82.0 97.0 88.1 88.0 87.4 88.6 79.0 79.0 82.6 79.6 39.9 35.3 37.7 36.5 5. ヒツジ 82.0 79.6 80.8 97.0 89.3 87.4 87.4 88.6 79.0 79.0 82.6 77.8 39.9 37.7 38.3 35.9 6. ブタ 82.1 81.0 82.1 88.1 89.3 87.5 84.5 86.9 79.8 79.8 82.1 79.2 37.8 35.9 38.3 37.1 7. ウマ 84.9 82.5 83.7 88.0 87.4 87.5 89.2 91.6 82.5 83.1 85.5 84.4 37.7 36.7 38.0 36.7 8. イヌ 81.3 80.1 81.3 87.4 87.4 84.5 89.2 94.6 80.7 79.5 82.5 80.8 40.1 34.3 36.7 36.1 9. ネコ 83.7 82.5 83.7 88.6 88.6 86.9 91.6 94.6 81.3 82.5 84.3 83.2 38.3 36.7 37.3 36.7 10. マウス 80.1 79.5 80.7 79.0 79.0 79.8 82.5 80.7 81.3 94.0 89.6 77.2 37.0 34.9 41.0 37.3 11. ラット 82.5 81.9 83.1 79.0 79.0 79.8 83.1 79.5 82.5 94.0 88.6 79.0 35.8 35.5 39.2 37.4 12. モグラネズミ 81.3 79.5 80.7 82.6 82.6 82.1 85.5 82.5 84.3 89.6 88.6 77.8 36.4 34.3 38.6 38.0 13. ウサギ 81.4 79.6 80.2 79.6 77.8 79.2 84.4 80.8 83.2 77.2 79.0 77.8 36.8 37.1 35.3 35.3 14. アフリカツメガエル 38.4 37.9 37.3 39.9 39.9 37.8 37.7 40.1 38.3 37.0 35.8 36.4 36.8 33.3 33.5 31.0 15. トラフグ 35.4 33.9 37.5 35.3 37.7 35.9 36.7 34.3 36.7 34.9 35.5 34.3 37.1 33.3 55.6 56.3 16. ゼブラフィッシュ 37.3 38.2 39.4 37.7 38.3 38.3 38.0 36.7 37.3 41.0 39.2 38.6 35.3 33.5 55.6 87.5 17. キンギョ 35.5 36.4 37.6 36.5 35.9 37.1 36.7 36.1 36.7 37.3 37.4 38.0 35.3 31.0 56.3 87.5

図 1-4．EPO 成熟蛋白質のアミノ酸配列相同性 遺伝情報処理ソフトウェア GENETYX Ver.6.1.1（株式会社ゼネティックス）を使用して，アミノ酸 配列相同性（%）を算出した．各動物の EPO 配列は，UniProt（http://www.uniprot.org/）より取得 した．UniProt のアクセッション番号は以下である：1．P01588，2．Q28513，3．P07865，4． P48617，5．P33709，6．P49157，7．Q867B1，8．P33707，9．P33708，10．P07321，11． P29676，13．Q9GKA2，14．D4AFJ9，15．Q6JV22，16．Q2XNF5，17．M4QK09．

11 第 1 章

1 か所の O 結合型糖鎖付加部位（Ser126）は，O 結合型糖鎖修飾部位を欠く齧歯類 以外の哺乳類で保存されている．一方，哺乳類以外では，アフリカツメガエルとト

ラフグの EPO には N 結合型糖鎖付加部位はないが，ゼブラフィッシュとキンギョ では 2 か所の N 結合型糖鎖付加部位（Asn38, Asn83）で保存されており，O 結合型 糖鎖付加部位はこれらの 4 種で保存されている．さらに，EPO の種間交差活性に 着目すると，哺乳類間では EPO の活性が交差することが，ヒト，マウス，ヒツジ， ネコ，イヌ間で示されている（Ganser et al., 1988; Barrio, 1997; Cowgill et al., 1998; MacLeod et al., 1998; Randolph et al., 2004）．これは，一次構造の相同性が高いこと からも予測できる．一方，哺乳類以外では，ヒトとアフリカツメガエル間で交差す

ることが示されている（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．この事実は，一次構造の相同 性は低くても，立体構造に類似性がある可能性を示している．しかし，EPO 蛋白 質の立体構造と受容体結合部位はヒトでのみ明らかとなっているに過ぎない． EPO の糖鎖修飾だけでなく，その発現部位や赤血球前駆細胞が存在する赤血球 造血巣は種により様々である（図 1-5）． EPO 遺伝子の主要な発現部位は，哺乳類 は腎臓と肝臓であるのに対し，アフリカツメガエルでは肺と肝臓，トラフグ，ゼブ ラフィッシュ，キンギョでは，心臓で高発現する．また，哺乳類の赤血球造血巣が 骨髄（齧歯類は骨髄と脾臓）であるのに対し，アフリカツメガエルでは肝臓

（Nogawa-Kosaka et al., 2011），ゼブラフィッシュ（Stachura et al., 2011）とキンギョ （Katakura et al., 2013）では腎臓であることがコロニーアッセイにより示されてい る． EPO の検出系としては，ヒト，マウス，ラットをはじめサル，ウシ，ヒツジ， ブタ，ウマ，イヌ，ネコ，ウサギなどの EPO ELISA キットが市販されている．一 方，哺乳類以外の EPO については市販されておらず，報告もない．バイオアッセ イとして，アフリカツメガエルではコロニーアッセイ（Nogawa-Kosaka et al., 2011） とアフリカツメガエル EPOR を強制発現させたマウス顆粒球系細胞株を用いた細 胞増殖試験（Nogawa-Kosaka et al., 2010），ゼブラフィッシュとキンギョとキンギョ ではコロニーアッセイ（Stachura et al., 2011; Katakura et al., 2013）が利用できるに 留まっている．

12 第 1 章

N結合型糖鎖 アミノ酸 EPO 赤血球前駆細胞 種 EPO分子の模式図 O結合型糖鎖 残基数 発現臓器 の分布 C システイン残基 ジスルフィド結合 ヒト 165 腎臓>肝臓 骨髄 Homo sapiens

マウス 166 腎臓>肝臓 骨髄・脾臓 Mus musculus

アフリカツメガエル 158 肺>肝臓 肝臓 Xenopus laevis

ゼブラフィッシュ ? 160 心臓>腎臓 腎臓 Danio rerio

キンギョ ? 160 心臓>脳 腎臓 Carassius auratus

フグ ? 160 心臓>肝臓 ? Takifugu rubripes

図 1-5．EPO 成熟蛋白質の構造の模式図と EPO 発現臓器・赤血球前駆細胞の分布

1-1-3. 環境応答における造血生理 生物が生存するためには，変動する外部環境に対して適応応答を起こし，内部環 境の恒常性を維持する必要がある（環境応答）．脊椎動物が常に曝される外部環境 の一つは大気（魚類では水）であり，その酸素濃度や温度は様々に変化する．血液 は内部環境の構成要素であるから，血液・造血系はこれらの外部環境に応答して調 節されなければならない．ここでは，低酸素環境と低温環境における血液・造血系

の応答について概説する．

(1) 低酸素環境応答 酸素は脊椎動物にとってエネルギー源として必要不可欠である．そのため，低酸 素環境下では，赤血球産生を亢進して血液中の循環赤血球数を増加させることで酸 素供給能を向上させ，少ない酸素を効率良く利用することで適応する．哺乳類にお

いては，赤血球産生の亢進には主に腎臓と肝臓における EPO 産生量の増加が中心 的な役割を果たす（1-1-2）．これは EPO 遺伝子の転写が低酸素刺激により顕著に誘 導されることによる．そして，赤血球数が増加し生体の低酸素状態が解除されると，

EPO 遺伝子の発現はもとに戻る．このような EPO 遺伝子発現の低酸素応答は，主 に低酸素誘導性因子（hypoxia-inducible factor：HIF）により制御されている（総説

13 第 1 章

通常 低酸素状態

P P P P HIF-α HIF-α

プロリン残基 PHD 安定化 の水酸化

OH OH P P P P HIF-α HIF-α HIF-β 核移行 pVHLの結合 二量体形成 ポリユビキチン化 遺伝子発現 pVHL P P OH OH 転写共役因子 HIF-α HIF-β P P HRE HIF-α Ub Ub Ub プロテアソーム系 腎臓EPO発現細胞 肝細胞 による分解 P P HIF-α HIF-β HIF-α HIF-β HIF-α

5′上流 EPO遺伝子 3′下流

図 1-6．HIF による EPO 発現の低酸素誘導 総説 Haase, 2013 より引用・改変．

Semenza, 2010; 総説 Haase, 2013）（図 1-6）．HIF は低酸素環境下で誘導される蛋白 質であり，転写因子として機能する．α 鎖と β 鎖から構成されるヘテロ二量体であ り，α 鎖は HIF-1α，HIF-2α，HIF-3α の 3 種類が同定されている．一方，β 鎖（ HIF-β） は共通であり別名 ARNT（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator）とも称す． HIF の低酸素応答性は，HIF-β 蛋白質が恒常的に存在するのに対し，HIF-α 蛋白質 は酸素濃度依存的に分解されることによる．通常酸素濃度下では，HIF-α の酸素依 存性分解ドメイン（oxygen dependent degradation domain：ODD）内のプロリン残基 がプロリン水酸化酵素（prolyl hydroxylase：PHD）により水酸化される．このプロ リン水酸化 HIF-α には，ユビキチンリガーゼ複合体を構成する von Hippel-Lindau 蛋白質（von Hippel-Lindau protein：pVHL）が結合する．そして，HIF-α はユビキチ ン化されたのち，プロテアソーム系で分解される．一方，低酸素環境下では，基質

である酸素が不足するために PHD の酵素活性が低下し，HIF-α の分解が進行しな い．その結果，HIF-α 蛋白質は蓄積し，核内に移行後 HIF-β と結合して二量体を形 成し，転写因子として機能する．EPO 遺伝子の発現は主に HIF-2α により調節され

14 第 1 章

る．EPO 遺伝子の 5′上流と 3′エンハンサー領域には低酸素応答配列（hypoxia responsive element：HRE）が存在する．低酸素環境下では，HIF-2α が腎臓の尿細管 間質細胞では 5′上流の HRE，肝細胞では 3′エンハンサー領域の HRE に転写共役因 子とともに結合し，EPO 遺伝子の転写を活性化する． HIF-1α と HIF-2α は，EPO 遺伝子以外にも多くの低酸素応答性遺伝子の発現を制 御することで，赤血球産生を促進する（総説 Semenza, 2010; 総説 Haase, 2013）．赤 芽球におけるヘモグロビンの合成には鉄が不可欠であり，赤血球産生の亢進には大 量の鉄が必要となる．食物として摂取された三価の鉄は，十二指腸の絨毛上皮細胞

の還元酵素である Dcytb（duodenal cytochrome b）により二価に還元され，金属トラ ンスポーターである DMT1（divalent metal transporter 1）により細胞内に取り込まれ る．HIF-2α は，Dcytb と DMT1 の発現を誘導することで，食物からの鉄の吸収を 促進する．細胞から血液中への鉄の放出はフェロポルチンが担っており，肝臓で産 生される鉄調節ホルモンであるヘプシジンが標的細胞におけるフェロポルチンの

発現を抑制することで鉄の移動を抑制し，鉄利用を制御する．HIF-1α は肝臓にお けるヘプシジンの発現を抑制することで，フェロポルチンを増加させる．その結果， 十二指腸の絨毛上皮細胞における吸収鉄や網内系マクロファージが保有する老廃 赤血球の処理で生じたモグロビン由来の鉄，肝細胞が保有する貯蔵鉄の血液中への 放出を亢進させ，鉄利用を促進する．血中の鉄はトランフェリンに結合して運搬さ れ，赤芽球のトランスフェリン受容体を介して細胞内に取り込まれ，ヘムの合成に

利用される．HIF-1α はトランフェリンとトランスフェリン受容体の発現を誘導す ることで，鉄の輸送と取り込みを促進する．赤芽球の成熟には，骨髄微小環境にお

ける赤芽球と内皮細胞の相互作用が必要であり，赤芽球前駆細胞は α4β1 インテグ リンである VLA-4（very late activation antigen 4）を発現し，内皮細胞が発現する接 着 分 子 で あ る VCAM-1 （ vascular adhesion molecule-1 ） に 結合し て い る （Papayannopoulou et al., 1992; Yanai et al., 1994; Hamamura et al., 1996）． HIF-2α は内 皮細胞における VCAM-1 の発現を促進することで，赤芽球の成熟を促進する （Yamashita et al., 2008）． また，骨芽細胞においては，HIF-1α と HIF-2α が安定化さ れると EPO 産生が促進され，骨髄内の局所的な EPO の増加により赤血球産生が亢 進する（Rankin et al., 2012）．

15 第 1 章

PHD pVHL

HIF-1α HIF-2α

DMT1 ヘプシジン トランスフェリン トランスフェリン EPO VCAM-1 Dcytb 受容体

フェロポルチン

腸における鉄の取り込み 鉄の運搬と取り込み 赤血球造血 貯蔵鉄の血液中への放出

図 1-7．HIF による赤血球造血の制御 総説 Semenza, 2010 より引用・改変．

哺乳類以外では，魚類のトラフグとゼブラフィッシュにおいて EPO 遺伝子の発 現量が調べられているに留まっている．トラフグ EPO は主に心臓で発現しており， 魚類肝細胞株を使用したフグ EPO プロモーターのレポーターアッセイでは低酸素 により誘導されない（Chou et al., 2004）． また，ゼブラフィッシュ EPO も主に心臓 で発現しており，個体を低酸素水に曝露すると mRNA 発現量は平常時の 2 倍程度 に増加する（Paffett-Lugassy et al., 2007）．マウスでは低酸素曝露により腎 EPO mRNA 発現量は 1000 倍以上に増加することを考えると，魚類の赤血球産生は低酸 素応答性に乏しく，EPO 以外の因子が赤血球産生の調節に中心的な役割を担う可 能性がある． このように，哺乳類における造血の低酸素環境応答では，HIF を介して EPO 産 生，鉄代謝系，骨髄微小環境が調節されることで赤血球産生が亢進し，生体内の酸

素恒常性が維持される（図 1-7）．一方，哺乳類以外の動物に関する知見は乏しく， 研究が待たれる．

(2) 低温環境応答 低温環境に対する応答は，体温を一定の範囲内に保つ内温動物（恒温動物）であ る哺乳類・鳥類と，体温が環境温度に依存して低下する外温動物である爬虫類・両

16 第 1 章

生類・魚類では異なる（図 1-8）．内温動物は，低温環境下で体温を維持するために， 骨格筋の収縮と弛緩の繰り返しによるふるえ熱産生や非褐色脂肪組織や内臓器官 での代謝の活性化による非ふるえ熱産生を行い，酸素消費量が増大する（総説

Florez-Duquet and McDonald, 1998）．一方，外温動物では，体温の低下に伴い代謝， 活動性が抑制され，その結果酸素消費量も減少する（総説 Salt, 1974）．このような 生体内調節に連鎖し，血液・造血系も低温環境応答を示すと考えられる．実際に， 季節変動や低温環境への曝露，冬眠時における末梢血球数や造血の変動が報告され

ている（表 1-3）．しかし，これらの多くは，現象の観察にとどまっており，その機 序や連鎖する生体反応は不明な点が多い．

内温動物 外温動物 哺乳類・鳥類 爬虫類・両生類・魚類

環境温度によらず体温を一定に保持 熱源は環境温度に依存

低温環境 低温環境

視床下部 温度受容器 皮膚 視索前野

神経系・内分泌系

熱放散抑制 ふるえ熱産生 非ふるえ熱産生 体温低下

皮膚血管 肝臓・筋肉 活動性 収縮 骨格筋 ふるえ 代謝促進 立毛筋 褐色脂肪細胞 代謝 酸素消費量 酸素消費量

図 1-8．体温調節における低温環境応答 内温動物は，低温環境下で体温を維持するために，神経系や内分泌系が作動し，熱放散抑制と熱産 生により体温を維持する．このとき，熱産生に伴い酸素消費量が増大する．一方，外温動物では， 熱源が環境温度に依存する外温動物では，体温が低下する．これに伴い代謝，活動性が抑制され， その結果酸素消費量も減少する．

17 第 1 章

表 1-3．造血の季節・環境温度応答に関する報告 解析 動物（学名） 末梢血所見 血液・造血系の解析所見 文献 （温度・季節） 内温動物 ココノオビアルマジロ Weiss and Wislocki, 季節変動・冬期 － 皮骨内の血球細胞数減少 （Dasypus novemcinctus） 1956 バンドウイルカ 季節変動・冬期 RBC, HGB, HCT 低下 － Hall et al., 2007 （Tursiops truncatus） マウス ・腎臓で EPO 発現量増加 低温曝露・ 5°C RBC, HGB, HCT 上昇 Maekawa et al., 2013 （Mus musculus） ・骨髄・脾臓で赤血球産生亢進 ラット 低温曝露・ 5°C RBC, HGB, HCT 上昇 赤血球寿命の延長 Deveci et al., 2001 （Rattus norvegicus） ニワトリ 低温曝露・10°C HGB, HCT 上昇 － Blahova et al., 2007 （Gallus domesticus） ラット 尾部を － 尾部造血が移植部で維持 Tavassoli et al., 1979 （Rattus norvegicus） 腹腔内へ移植 外温動物 ヨーロッパトノサマガエル 季節変動・冬期 RBC, HGB 低下 － Sinha, 1983 （Rana esculenta） ヨーロッパバイソン 季節変動・夏期 赤血球径の増大 － Gill, 1989 （Bison bonasus） ヨーロッパヤマカガシ 季節変動・冬期 RBC, HGB, HCT 低下 － Wojtaszek, 1992 （Natrix natrix） ニシキガメ Musacchia and Sievers, 低温曝露・ 2°C HCT 低下 － （Chrysemys picta） 1956 カニンガムイワトカゲ 低温曝露・ 8°C HCT, HGB 低下 － Maclean et al., 1975 （Egernia cunninghami） ヨコバイガラガラヘビ Macmahon and Hamer, 低温曝露・20°C RBC, HGB, HCT 上昇 － （Crotalus cerastes） 1975 ヒョウガエル ・赤血球寿命の延長 Cline and Waldmann, 低温曝露・ 5°C HCT 低下 （Rana pipiens） ・末梢赤血球 Fe59 取込量低下 1962 ウシガエル Wang and Herman, 低温曝露・ 5°C RBC, WBC, TBC 低下 － （Rana catesbeiana） 1996 アフリカツメガエル ・肝臓で赤血球破壊亢進 低温曝露・ 5°C RBC, WBC, TBC 低下 Maekawa et al., 2012 （Xenopus laevis） ・肝臓で新生赤血球の貯留 インデアンレッドキャット RBC, HGB, HCT, 低温曝露・18°C － Pandey, 1977 （Heteropneustes fossilis） WBC 低下 ゼブラフィッシュ 赤血球造血関連因子遺伝子の 低温曝露・17°C － Kulkeaw et al., 2010 （Danio rerio） 発現量低下 冬眠哺乳類 ヨーロッパハムスター 冬眠 WBC,TBC 低下 － Reznik et al., 1975 （Cricetus cricetus） ゴールデンハムスター 冬眠 TBC 低下 － Deveci et al., 2001 （Mesocricetus auratus） RBC：赤血球数，HGB：ヘモグロビン濃度，HCT：ヘマトクリット値，WBC：白血球数，TBC： 栓球数または血小板数．前川峻 博士論文（2012）より引用・改変．

前川らは，内温動物にマウス（Maekawa et al., 2013），外温動物にアフリカツメ ガエル（Maekawa et al., 2012）を用い，低温環境下における赤血球数の変動に至る 機序を解析した．マウスを 5°C へ曝露すると，7 日目には網状赤血球数が有意に増 加し，14 日目より末梢血中の成熟赤血球数が徐々に増加し，その後 56 日目まで高 値を維持する．低温曝露後に腎臓の EPO mRNA の発現量が増加し，その後，骨髄 と脾臓において赤血球前駆細胞（CFU-E と前赤芽球数）が増加する．以上より， 低温環境下のマウスでは，腎臓で EPO 発現が上昇して赤血球造血が亢進し，末梢 赤血球数が増加すると結論している．

18 第 1 章

一方，アフリカツメガエルを 5°C へ曝露すると，1 日目には末梢血中の赤血球， 白血球，栓球の数が減少し，汎血球減少を呈す．そして，低温曝露の間は末梢血球

数の低値は維持され，22°C へ復温すると正常値にまで回復する．低温曝露後には 血球代謝器官である肝臓でヘモグロビン代謝酵素群の mRNA 発現量が増加し，ヘ ム分解産物と考えられる組織鉄の増加を認める．そして，低温曝露後 1 日で減少す る赤血球数（全赤血球の約 30%）は，アフリカツメガエルの赤血球寿命（約 220 日）から推定される 1 日の破壊数（約 0.5%）よりも多い．以上より，低温曝露直 後の末梢赤血球数の減少は，肝臓における赤血球破壊の亢進が一因であると結論し

ている（図 1-9）．しかし，赤血球破壊の亢進に至る分子機序および白血球，栓球の 減少機序に関しては不明のままである． このように，血液・造血系の低温環境応答は，多数の動物においてその存在は認

めるものの，低酸素応答に比べると分子機序の解明がほとんど進んでいない．

図 1-9．低温環境下におけるアフリカツメガエルの血球減少 アフリカツメガエルを 5°C へ曝露すると，1 日目には末梢血中の赤血球，白血球，栓球の数が減少 し，汎血球減少を呈す．低温曝露後には血球代謝器官である肝臓でヘモグロビン代謝酵素（Hmox1， Blvra）の mRNA 発現量が増加し，ヘム分解産物と考えられる組織鉄の増加を認めることから，赤 血球減少は肝臓における赤血球破壊の亢進が一因である． （ ， ）より引用・改変． Maekawa et al., 2012 Fig. 1D–F Fig. 6A

19 第 1 章

1-1-4. ゲノム解読が生命科学研究に及ぼした影響 1996 年に酵母で真核生物初（Goffeau et al., 1996）， 1998 年に線虫で多細胞生物初 （C. elegans Sequencing Consortium, 1998）の全ゲノム解読が達成されると，2003 年 にはヒト全ゲノム解読の完了が報告された（International Human Genome Sequencing Consortium, 2004）． 2009 年には，脊椎動物 10,000 種についてゲノムを決定しよう というプロジェクトが発表された（Genome 10K Community of Scientists, 2009）．現 在では，Ensembl Genome Brouser や UCSC Genome Browser などの公共のデータベ ースにおいて，ほ乳類を中心として約 70 種の脊椎動物のゲノム情報が利用できる （表 1-4）．

表 1-4．ゲノム情報が利用可能な脊椎動物 分類 種名 学名 分類 種名 学名

哺乳類 哺乳類（つづき）

有胎盤類 その他 ナマケモノ Choloepus hoffmanni

霊長目 アカゲザル Macaca mulatta ネコ Felis catus

アヌビスヒヒ Papio anubis イワダヌキ Procavia capensis

オランウータン Pongo abelii ハリネヅミ Erinaceus europaeus

カニクイザル Macaca fascicularis パンダ Ailuropoda melanoleuca

キツネザル Otolemur garnettii ヒツジ Ovis aries

コモンマーモセット Callithrix jacchus ヒメハリテンレック Echinops telfairi

ゴリラ Gorilla gorilla gorilla フェレット Mustela putorius furo

チンパンジー Pan troglodytes ブタ Sus scrofa

テナガザル Nomascus leucogenys 有袋類 オポッサム Monodelphis domestica

ネズミキツネザル Microcebus murinus タスマニアデビル Sarcophilus harrisii

ヒト Homo sapiens ワラビー Macropus eugenii

ボリビアリスザル Saimiri boliviensis 単孔目 カモノハシ Ornithorhynchus anatinus

ミドリザル Chlorocebus sabaeus 鳥類 ガラパゴスフィンチ Geospiza fortis

メガネザル Tarsius syrichta シチメンチョウ Meleagris gallopavo

カンガルーネズミ Dipodomys ordii セキセイインコ Melopsittacus undulatus

齧歯目 チャイニーズハムスター Cricetulus griseus ゼブラフィンチ Taeniopygia guttata

ハダカデバネズミ Heterocephalus glaber ニワトリ Gallus gallus

ハタネズミ Microtus ochrogaster ヒタキ Ficedula albicollis

マウス Mus musculus マガモ Anas platyrhynchos

モルモット Cavia porcellus 爬虫類 アメリカアリゲーター Alligator Mississippiensis

ラット Rattus norvegicus スッポン Pelodiscus sinensis

リス Ictidomys tridecemlineatus ニシキガメ Chrysemys picta bellii

翼手目 オオコウモリ Pteropus vampyrus ミドリアノール Anolis carolinensis

ココウモリ Myotis lucifugus 両生類 アフリカツメガエル Xenopus laevis

海牛目 マナティー Trichechus manatus latirostris ネッタイツメガエル Xenopus tropicalis

クジラ目 イルカ Tursiops truncatus 魚類 アマゾンモーリー Poecilia formosa

マッコウクジラ Physter macrocephalus イトヨ Gasterosteus aculeatus

ミンククジラ Balaenoptera acutorostrata scammoni サザンプラティフィッシュ Xiphophorus maculatus

その他 アフリカゾウ Loxodonta africana シーラカンス Latimeria chalumnae

アルパカ Vicugna pacos スポッテッドガー Lepisosteus oculatus

アルマジロ Dasypus novemcinctus ゼブラッフィシュ Danio rerio

イヌ Canis lupus familiaris ゾウギンザメ Callorhinchus milii

ウサギ Oryctolagus cuniculus タイセイヨウダラ Gadus morhua

ウシ Bos taurus ドウクツギョ Astyanax mexicanus

ウマ Equus caballus トラフグ Takifugu rubripes

シロサイ Ceratotherium simum simum ナイルティラピア Oreochromis niloticus

ツチブタ Orycteropus afer afer ミドリフグ Tetraodon nigroviridis

ツパイ Tupaia belangeri メダカ Oryzias latipes

トガリネヅミ Sorex araneus ヤツメウナギ Petromyzon marinus

ナキウサギ Ochotona princeps

以下の公共データベースを参照し，ゲノム情報を利用可能な脊椎動物を一覧にまとめた（2015 年 6 月時点）．Ensembl Genome Brouser（http://asia.ensembl.org/index.html），UCSC Genome Browser （ ）， （ ） http://genome.ucsc.edu Xenbase http://www.xenbase.org/entry/

20 第 1 章

利用可能なゲノム情報の蓄積は，生命科学研究にパラダイムシフトをもたらした． すなわち，生命現象からそれを担う遺伝子を解析する帰納的アプローチから，個々 の遺伝子の機能を調べ構成することで生命現象を理解する演繹的アプローチへの 転換である．そして，シークエンシング技術やマイクロアレイ解析技術，質量分析 技術の進歩により生体内分子の大規模解析が可能となると，生命科学研究に生体内

分子群の「総体（ome）」を包括的に研究する学問分野であるオミクス（omics）が 誕生した（図 1-10）．すなわち，全遺伝情報（ゲノム：genome）を対象としたゲノ ミクス（genomics），ゲノムの転写産物である全 RNA（トランスクリプトーム： transcriptome）を対象としたトランスクリプトミクス（transcriptomics），翻訳産物

図 1-10．オミクス 生体中（細胞や組織内）に存在する分子全体を網羅的に解析する研究・学問をオミクス （omics）という（バイオキーワード集-実験医学，羊土社；https://www.yodosha.co.jp /jikkenigaku/keyword/index.html，2015 年 6 月時点）．解析対象が遺伝子（gene）であ ればゲノミクス（genomics），転写物（transcript）であればトランスクリプトミクス （transcriptomics），蛋白質（protein）であればプロテオミクス（proteomics），代謝物 （metabolite）であればメタボロミクス（metabolomics）と呼び，研究・学問だけでな く解析技術・方法論もさす．ncRNA：非翻訳 RNA（non-coding RNA）．

21 第 1 章

であり生体反応の実行分子である全蛋白質（プロテオーム：proteome）を対象とし たプロテオミクス（proteomics），そして生体反応における最終産物である全代謝物 （metabolome）を対象としたメタボロミクス（metabolomics）である．さらに，数 理的解析を適用し，生命現象を多数の生体分子が相互に作用するネットワークから

なるシステムとして理解しようとするシステム生物学が普及しつつある． 生命現象は，蛋白質同士あるいは蛋白質と他の生体分子との相互作用に基づき生

じている．また，細胞や組織における mRNA 発現量と蛋白質量が比較されており， 議論の余地はあるものの，両者の相関は乏しいといわれている（Anderson and Seilhamer, 1997; Ideker et al., 2001; Chen et al., 2002; Griffin et al., 2002; Mehra et al., 2003; de Sousa et al., 2009; Maier et al., 2009; Schwanhausser et al., 2011; Ghazalpour et al., 2011）．したがって，mRNA の発現量ではなく蛋白質量を直接捉えることが重 要であり，ポストゲノムとしてのプロテオミクスは重要である．これは，プロテオ ームあるいはプロテオミクスに関する学術論文の報告数が，線虫で多細胞生物初の

論文数 6000 proteome Mouse MeSH term: or and proteomics Human 5000

4000

ヒト 3000 完全版 ▼

2000 マウス ヒト ▼ 概要版 ▼ 1000 線虫 ▼ 0

発行年

図 1-11．プロテオミクスに関する論文の報告数の推移 PubMed（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）で MeSH Term をプロテオーム （proteome）またはプロテオミクス（proteomics）に指定して検索した際の論部数の 推移である．

22 第 1 章

ゲノムが解読された 1998 年以降，徐々に増え始め，ヒトゲノムの解読以降，2011 年まで増え続けていることからもわかる（図 1-11）． 上述の通り，プロテオミクスは，生体内の細胞や組織における蛋白質の構造・機 能を総合的に研究する学問分野であるが，狭義には蛋白質の分離と同定技術である プロテオーム解析を指す（デジタル大辞泉，小学館）．本論文では，以降，プロテ

オミクスという用語を狭義の意味（蛋白質の網羅的同定）において使用する． ゲノム解読の影響は造血研究にも波及した．ヒトの EPO 遺伝子は，赤血球産生 の刺激という生物活性を指標に純化された EPO 蛋白質から取得したアミノ酸配列 情報を基に単離されたことは上述した（1-1-2）．一方，トラフグの EPO 遺伝子は， フグのゲノムデータベースからシンテニー（染色体上の遺伝子の並び順が種を超え

て保存されているれている現象）を利用して同定された（Chou et al., 2004）．また， アフリカツメガエルでは，公開されているネッタイツメガエルのゲノム情報を参考

にして遺伝子が単離された（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．1994 年に 4 グループか ら同時に報告されたヒト TPO（c-mpl リガンド）遺伝子は，3 グループにおいて， 血小板減少症動物の血漿より精製・純化した TPO 蛋白質から取得したアミノ酸配 列情報を基に単離された（放射線照射ラット：Sohma et al., 1994; Kato et al., 1995， 放射線照射イヌ：Bartley et al., 1994，放射線照射ブタ：de Sauvage et al., 1994）． 一 方，2010 年には全ゲノム関連解析（genome-wide association study：GWAS）により， 日本人集団における血液学的形質に関連する遺伝子座の同定が報告され，血小板数

に関連する遺伝子として TPO が抽出されている（Kamatani et al., 2010）．また，ゼ ブラフィッシュではゲノムデータベース上に登録されている配列を基に遺伝子が

単離され，造血幹細胞から栓球への分化に機能することが示された（Svoboda et al., 2014）． このように，ゲノムデータベースを利用した造血関連遺伝子の同定・単離 が行われるようになった．また，プロテオミクスに関しては，ヒト全ゲノムの解読

の完了が報告された翌年の 2004 年には，blood 誌に血液学へのプロテオミクス技術 の応用に関する総説が掲載され（総説 Cristea et al., 2004），同誌で「Proteomics knocks on hematology’s door」と題した記事で紹介されている（Seshi, 2004）．実際に血液学・ 造血研究の領域においてプロテオミクスによる解析は数多く実施され，血球の表現 型解析，血液疾患の病態の理解やバイオマーカーの探索などに用いらてきた．さら

23 第 1 章

に，2010 年には造血および造血疾患におけるシステム生物学的アプローチに関す る総説が掲載されており（Whichard et al., 2010），ゲノム解読後の研究の推移が窺 える．

1-2 本研究の目的と概要

1-2-1. 目的 血液・造血系は脊椎動物に共通した生命維持機構であり，様々な種においてその 制御機構（造血生理）を比較し普遍性と多様性を考察することで，理解を深耕する

ことができる．しかし，1-1 の各項で述べたとおり，造血生理に関する知見は，ヒ トとマウスを中心に得られた哺乳類における知見を除くと，乏しいのが現状である． そこで，造血研究の対象として解析が進みつつあるアフリカツメガエルに着目した． アフリカツメガエルの成体は，物質代謝を担う肝臓で赤血球の産生と破壊を行って

おり，血液・造血系と代謝系が共存する（Aizawa et al., 2005; Kosaka-Nogawa et al., 2010; Kosaka-Nogawa et al., 2011; Okui et al., 2013）（図 1-12）．また，低温環境に応 答し汎血球減少を呈する（Maekawa et al., 2012）． 本研究では，このようなアフリ

肺 脾臓 EPO 赤血球系 前駆細胞 EPO

内分泌? 成熟赤血球 EPO

血液循環 内分泌? 肝臓

赤血球系 赤血球産生 前駆細胞 肝実質細胞 貪食細胞

EPO 傍分泌 赤血球破壊

図 1-12．アフリカツメガエル成体の赤血球産生

24 第 1 章

カツメガエルにおける造血生理を解析することで，脊椎動物における造血生理の普

遍性と多様性の一端を明らかにすることを大目的とした．

1-2-2. 概要（取り組んだ課題） 造血生理において造血因子の作用が重要であることは述べた（1-1-1）．したがっ て，脊椎動物における造血因子の構造や機能を比較することは重要である．また， 造血生理は，造血因子とその受容体だでけなく，内的制御として転写因子，エピジ

ェネティクス，microRNA，外的制御として造血微小環境との相互作用など，多数 の生体分子からなる非常に複雑なネットワークにより調節されている（1-1-1）．し たがって，このような調節系を比較することも重要である．そこで，本研究では， アフリカツメガエルの造血生理に関与する蛋白質群の生物学的特性として，まず造

血因子 EPO の分子性状と構造を調べ，次に EPO を含めた蛋白質群の調節系として 血液・造血系の低温環境応答を調べた．そして，既往の知見と比較することで，そ

の普遍性と多様性を考察した．

(1) EPO の分子性状と構造活性相関 赤血球はほとんどの脊椎動物がもつ血球であり，その産生（赤血球産生）は脊椎

動物に共通した生命機構である．赤血球産生を担う造血因子である EPO に関する 研究は，ヒト，マウスを中心に発展してきており，その分子構造や機能が明らかと

なっている．脊椎動物全般に目を向けると，EPO の遺伝子配列は，哺乳類を中心 に，両生類，魚類で単離されてきた．また，データベース上に EPO として登録さ れている遺伝子配列も含めれば，約 80 種類の脊椎動物で EPO の遺伝子・アミノ酸 配列が明らかとなっている．しかしながら，EPO の分子構造や機能に関する理解 は依然として進んではいない．そこで，本研究では，アフリカツメガエルの EPO （X. laevis EPO：xlEPO）の分子性状と構造活性相関を調べ，ヒト EPO との比較を 通し，その普遍性と多様性を考察した．まず，第 2 章において，xlEPO や赤血球産 生制御機構の解析において有用な研究ツールとなる抗体を作出し，免疫学的手法に

よる xlEPO の検出を可能とした．そして，第 3 章では，xlEPO には N 結合型糖鎖 付加部位がないという特徴に着目し，その分子性状と活性領域を調べた．

25 第 1 章

(2) 造血の低温環境応答 生物が常に曝される外部環境の一つは温度である．生物は，環境温度の変化や高 温・低温環境といった外部ストレス応答し，内部環境である体内の恒常性を維持す る必要がある．様々な生物において，季節性にあるいは低温環境下で末梢血球数が 変動することが報告されており，血液・造血系も環境応答することで恒常性の維持 に機能していると考えられる．しかし，末梢血球数の変動に至る機序やこれと連鎖

する生体内反応はほとんど理解されていない．先行研究では，5°C の低温環境下に おいてアフリカツメガエルは汎血球減少を呈し，赤血球減少は肝臓における赤血球

破壊の亢進が一因であることが示されている（Maekawa et al., 2012）．しかし，栓 球・白血球減少機序やこのときの肝臓で生じる応答は，依然として不明である．そ こで，本研究では，低温環境下における血球減少の分子機序および血球減少に連鎖 して誘導される造血巣の初期応答に関して，仮説生成に至る知見を得た．研究手法

には，2010 年に近縁種のネッタイメツガエルで全ゲノム解読が達成されたことを 背景にツメガエルにおけるプロテオミクスの重要性が高まっている状況を鑑み，プ

ロテオミクスを採用した．まず，第 4 章において，アフリカツメガエルにおけるプ ロテオミクスの有効性を検証した．そして，第 5 章において，低温環境下での造血 生理について解析を実施し，低温環境で生じる血球減少の分子機序と造血巣におけ

る初期応答について考察した．

26 第 2 章

第 2 章 アフリカツメガエルのエリスロポエチンの 検出系の構築

2-1. 背景

抗体は，様々な生命科学研究のツールとして利用されている．ヒトやマウスでは， 多くの造血因子に対する抗体が市販品として利用可能である．し かし，アフリカツ メガエルの造血因子に対する抗体はない．そこで，本章では，赤血球産生制御に関

する研究のツールとしてアフリカツメガエルのエリスロポエチン（xlEPO）に対す る抗体を作出し，xlEPO の検出・定量ならびに分子性状や活性の解析を可能とする ことを目的とした．研究着手当初は，免疫の抗原として使用可能な遺伝子組換え xlEPO がなかったため，xlEPO の部分ペプチドを抗原としてウサギポリクローナル 抗体を作製した．そして，大腸菌で発現させた遺伝子組換え xlEPO 精製品が得られ た後は，これを抗原としてウサギポリクローナル抗体とマウスモノクローナル抗体

を作製した．

2-2. 材料および方法

2-2-1. ウサギ抗 xlEPO ペプチドポリクローナル抗体の作製 表 2-1 に示す 3 種類のペプチド（xlEPO-P1，xlEPO-P2，xlEPO-P3）をインビトロ ジェン株式会社で合成した．各ペプチドは，末端のシステイン残基を介してマレイ

ミド法にてスカシガイへモシアニン（Imject® Maleimide Activated mcKLH，サーモ フィッシャーサイエンティフィック株式会社）に架橋後，ダルベッコリン酸緩衝生

理食塩水（Dulbecco’s phosphate buffered saline：DPBS）に溶媒交換した．

表 2-1．xlEPO 抗原ペプチド 抗原ペプチド名 部位 アミノ配列 a

xlEPO-P1 xlEPO7–23 CDKTVLDMFIKEARE xlEPO-P2 xlEPO44–57 TKLNVGEWNKLQTSC xlEPO-P3 xlEPO109–122 LQDEAQTSQTEGKTC a マレイミド法でスカシガイヘモシアニンへと架橋するために導入 したシステイン残基を下線で示す．誌上未発表． 27 第 2 章

各架橋抗原ペプチド 100 μg（計 300 μg）を 450 μL の DPBS に溶解し，500 μL の アジュバントと混合乳化して，抗原溶液とした．なお，初回の免疫には完全フロイ ントアジュバントを，その後の免疫には不完全フロイントアジュバントを使用した．

ニュージーランドホワイト種ウサギ（メス）の背部に計 7 回（初回免疫［0 日目］， 14 日目，21 日目，28 日目，36 日目，42 日目，50 日目）皮下免疫した．この間， 免疫前血清および一次から五次抗血清を各抗原ぺプチドを固相化した ELISA に供 し，抗体価が上昇していることを確認した．そして，初回免疫から 55 日目の採血 で得た七次抗血清から Protein G アフィニティー精製で抗体画分を得た．さらに， 各ペプチド固定化カラムを使用し，抗原特異的抗体を精製した（抗 xlEPO-P1 抗体， 抗 xlEPO-P2 抗体，抗 xlEPO-P3 抗体）．また，後に目黒により N 末端にヒスチジン タグ（His10，His6）を付加した大腸菌発現 His10-xlEPO，His6-xlEPO が調製された． そ こ で， His10-xlEPO 固 定 化カ ラム で も xlEPO 特異的抗体を精製した（抗 xlEPO-P1+2+3 抗体）．

2-2-2. ウサギ抗 xlEPO ポリクローナル抗体の作製 DPBS に溶解した大腸菌発現 His6-xlEPO とアジュバント（TiterMax Gold，TiterMax USA, Inc.）を 1：1 で混合乳化して，抗原溶液とした．ニュージーランドホワイト 種ウサギ（メス）に，His6-xlEPO（50–100 μg）を含む抗原溶液 100 µL を計 8 回（初 回免疫［0 日目］，7 日目，21 日目，28 日目，35 日目，42 日目，49 日目，77 日目） 皮下免疫した．この間，免疫前血清および一次，三次，五次抗血清を His6-xlEPO 固化 ELISA に供し，抗体価が上昇していることを確認した．そして，初回免疫か ら 93 日目に全採血し，八次抗血清を採取した．抗血清から Protein G アフィニティ ー精製で抗体画分を得て，さらに His10-xlEPO 固定化カラムで抗 His6-xlEPO 抗体 を得た．

2-2-3. マウス抗 xlEPO モノクローナル抗体の作製 マウス（BALB/c 系統，オス）に，30 μg の大腸菌発現 His6-xlEPO を 3 回皮下免 疫した．なお，抗原溶液は，DPBS に溶解した His6-xlEPO 溶液とアジュバント （TiterMax Gold）を 1：1 で混合乳化して調製した．三次免疫から 12 日後に，30 μg

28 第 2 章

の His6-xlEPO と 5 µg のヒト IL-6 を 50 µL の DPBS に溶解し，腹腔内投与した（最 終免疫）．最終免疫から 3 日後に脾細胞を採取し，ポリエチレングリコール 1500（ロ シュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用してミエローマ細胞

P3-X63-Ag8653（理研セルバンク）と 5：1 で細胞融合させた（脾細胞 7.6×107 個， ミエローマ 1.52×107 個）．融合細胞を，ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジ ン（HAT）を含む半固形培地 ClonaCell®-HY Medium D（STEMCELL Technologies.

Inc.）にて，37°C，5% CO2 下で培養した（10 cm ディッシュ 9 枚）．培養 10–12 日 目にコロニーを 96 ウェル丸底細胞培養プレートに移し，10% ウシ胎仔血清（fetal calf serum：FCS）， 100 μM ヒポキサンチン，16 μM チミジンを添加したダルベッ コ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s medium：DMEM）にて，37°C，

5% CO2 下で培養した（670 クローン）．このうち培養上清が His6-xlEPO を固相化し た ELISA において抗 xlEPO 抗体陽性であった 116 クローンを 24 ウェルプレートに 移し，10% FCS，0.5 ng/mL ヒト IL-6 含有 DMEM 培地にて培養した．細胞増殖を 認めた 70 クローンの培養上清について，His6-xlEPO のヒスチジンタグを切断した ものを固相化した ELISA とマウス IgG 定量 ELISA を行い，xlEPO を認識する IgG を産生するハイブリドーマ 22 クローンを得た．さらに，ウェスタンブロット法に おいて xlEPO 恒常発現 HEK293F 細胞の培養上清中の xlEPO を認識する 3 クローン （1B7，3H7，4B3）を選抜し，それぞれが産生する抗体を 1B7 抗体，3H7 抗体， 4B3 抗体と命名した．これらの 3 クローンは，限界希釈により再度単一クローン化 した後に無血清馴化し，無血清培地 CHO-S-SFM II（ライフテクノロジーズジャパ

○ ン株式会社）で 37 C，8% CO2 下でフラスコ振盪培養した（135 rpm）．この培養上 清より Protein G アフィニティー精製により各モノクローナル抗体を得た．各抗体 のサブクラスと軽鎖の判定には IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit（ロ シュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用した．さらに，ハイブリドーマを

腹水化した．BALB/c マウスにプリスタン（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン） 0.5 mL を腹腔内投与し，その 7-10 日後に各ハイブリドーマを 107 細胞以上腹腔内 投与した．腹部が膨張した細胞投与後 2 週間程度に腹水を採取し，Protein G アフィ ニティー精製により各モノクローナル抗体を得た．

29 第 2 章

マウス（BALB/c系統，オス，1匹）

0日目 初回免疫 （His6-xlEPO 30 µg，50% アジュバント，皮下投与） 15日目 二次免疫 （初回と同じ） 21日目 初回免疫 （初回と同じ） 33日目 最終免疫 （His6-xlEPO 30 µg，ヒトIL-6 5 µg，腹腔内投与）

36日目 脾細胞 7.6×107個

細胞融合（脾細胞：ミエローマ＝5 : 1）

37–47日目 10日間 半固形培地でHAT選択 （10 cmディッシュ 9枚）

47–49日目 ハイブリドーマのシングルコロニーを96ウェルプレートにピックアップ

670クローン 96ウェルプレート

6–10日間培養

53–58日目 His6-xlEPO固相化ELISAで抗体陽性

116クローン 24ウェルプレート

5–20日間培養で増殖を確認

70クローン

63–64日目 マウス抗体定量ELISAで抗体産生確認 2回 78日目 xlEPO固相化ELISAで抗体陽性

22クローン ハイブリドーマおよび培養上清を凍結保存

動物細胞発現xlEPOをウェスタンブロット法で認識

3クローン クローン 1B7，3H7，4B3

図 2-1．マウス抗 xlEPO モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング 実験方法の 2-2-3.を図式化したもの．

2-2-4. 細胞増殖試験による中和活性の評価 小坂らの報告（Nogawa-Kosaka et al., 2010）を一部改変して実施した．IL-3 依存 性マウス細胞株 FDC/P2 に xlEPOR を強制発現させた xlEPOR-FDC/P2 細胞を 1 ng/mL のマウス IL-3 を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove’s modified Dulbecco’s media：IMDM）で培養した．細胞を対数増殖期に回収し，カルシウム・ マグネシウム不含の DPBS で 3 回洗浄後，サイトカイン不含の培地で 8 時間培養し， スタベーションを行った．96 ウェル平底細胞培養プレート（コーニングジャパン

30 第 2 章

株式会社）に 1 ウェルあたり 1×104 個の細胞を 50 μL で播種し，xlEPO を一過性に 強制発現させた COS-1 細胞の培養上清またはマウス IL-3 と各抗体を予め反応させ た試料を 50 μL ずつ加えた．37°C で 3 日間培養後，MTS 試験を行った．5 mM の WST-1（株式会社同仁化学研究所）を含む 20 mM HEPES 緩衝液（pH7.4）（株式会 社同仁化学研究所）と 4 mM 1-Methoxy PMS（株式会社同仁化学研究所）を 20：1 で混合し，1 ウェルあたり 20 μL を添加し，37°C で 4 時間培養後に 450 nm におけ る吸光度をマルチプレートリーダー（パワースキャン HT，DS ファーマバイオメデ ィカル株式会社）で測定した．

2-2-5. xlEPO 定量サンドイッチ ELISA 50 mM 炭酸緩衝液 pH9.4 で希釈した捕捉抗体を 50 または 100 μL ずつ 96 ウェル ポリスチレン製マイクロプレート（コーニングジャパン株式会社）の各ウェルに加

え，4℃で一晩静置して固相化した．次に，各ウェルに 1 % w/v ブロックエース（BA） （DS ファーマバイオメディカル株式会社）を含むリン酸緩衝食塩水（10 mM リン 酸緩衝液［pH7.4］， 150 mM 塩化ナトリウム：PBS）を 200 μL ずつ加え，室温で 1 時間静置してブロッキングした．ウェルを 0.05% v/v Tween 20 含有 PBS（PBST） で 1 回洗浄後，標準試料として 0.4% BA 含有 PBST で希釈した xlEPO を 50 μL 添 加し，室温で 1 時間反応させた．PBST で 3 回洗浄後，0.4% BA 含有 PBST で希釈 した検出抗体を添加し，室温で 1 時間反応させた．PBST で 3 回洗浄後，50 または 100 μL の 0.4% BA 含有 PBST で希釈したペルオキシダーゼ（HRP）標識アビジン または HRP 標識抗マウスイムノグロブリン抗体または HRP 標識抗ウサギイムノグ ロブリン抗体を 50 または 100 μL 添加し，室温で 1 時間反応させた．プレートを PBST で 2 回，PBS で 1 回洗浄したのち，50 または 100 μL のテトラメチルベンジ ジン（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine：TMBZ）発色液を加え，室温で 5–30 分間反応 させた．その後，50 または 100 μL の硫酸を加えて反応を停止後，450 nm と 650 nm の吸光度をマルチプレートリーダー（パワースキャン HT，DS ファーマバイオメデ ィカル株式会社）で測定した．なお，xlEPO は大腸菌発現 His6-xlEPO のヒスチジ ンタグを切断後，イオン交換クロマトグラフィーで精製したものを使用した．

31 第 2 章

2-3. 結果

2-3-1. ウサギ抗 xlEPO ペプチドポリクローナル抗体 huEPO と xlEPO の成熟蛋白質はそれぞれ 166 残基と 158 残基のアミノ酸からな り，ジスルフィド結合を形成する Cys 残基の位置は保存されている（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．また，両者のアミノ酸配列相同性は約 38%と低いが，Kyte と Doolittle の親水性プロット（Kyte and Doolittle, 1982）は重なりあうことから，EPO 分子の立 体構造が保存されている可能性が示唆されている（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．

αヘリックス C システイン残基 A huEPO βシート N結合型糖鎖 Ｏ結合型糖鎖

二次構造 C C C C アミノ酸配列 APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAA--SAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTG--DR

EPOR結合部位1 (a) ** *** * * * * ** * EPOR結合部位2 * * * ** * * ** **

20―40 40―59 60―80 80―99 99―118 131―150 ペプチド抗原部位 (b)（Sytkowski and 111―129 147―166 Donahue, 1987）

ペプチド抗原部位 7―23 52―63 84―95 110―123 152―166 (c) （Fibi et al., 1993）

B xlEPO C C C C アミノ酸配列 APYKPVCDKTVLDMFIKEARELETAMDSCNIICQFPEDIMVPETKLNVGEWNKLQTSQQAAEVWNGLVLFTKAVPRITD-----FISDASLKFQVEKIHSDIRSVVHLFKSLNLQDEA--QT--S--Q-TEGKTLPVRTFKKLFSVYTNFLRGKLRLLVMAVCREASLPT

親水性 (e) （Kyte-Doolittle法）

7―23 44―57 109―122 (d) ペプチド抗原部位 P1 P2 P3

図 2-2．xlEPO 抗原ペプチドの選定 （A）ヒト EPO のアミノ酸配列とペプチド抗原部位．アミノ酸配列の上部に，システイン残基の 位置と糖鎖付加部位（▼：N 結合型糖鎖，▲：O 結合型糖鎖），二次構造（α へリックス，β シート） を図示した．下部には，受容体結合部位（Syed et al., 1998）を＊（a），抗ペプチド抗体を作出し た報告における抗原ペプチド部位を矢印（b, c）で図示した．破線は抗体が産生されなかったこと， 実線は抗体が産生されたこと，赤色は抗体が中和活性を示したことを表す．（B）ツメガエル EPO のアミノ酸配列とペプチド抗原部位．アミノ酸配列の上部にシステイン残基の位置を図示した．下 部には，Kite-Doolittle の親水性プロット（e），決定したペプチド抗原部位（d）を図示した．親水 性プロットにおける青色の網掛けは，親水性の領域であることを表している．誌上未発表．

32 第 2 章

抗原部位の選定には，抗ペプチド抗体作製法（田中ら，1994）を参考にし，さら に次の各点を参照した．まず，huEPO に対する抗ペプチド抗体の作出報告 （Sytkowski and Donahue, 1987; Fibi et al., 1993）を参照した（図 2-1A）．次に，xlEPO における Kyte と Doolittle の親水性プロットを参照し，分子表面に位置する領域を 推定した（図 2-1B）．さらに，核磁気共鳴法で決定された huEPO の立体構造 （Cheetham et al., 1998）を参照し，抗原部位は分子表面に露出し，各抗原部位を認 識する抗体で EPO 分子を挟めるように設計した（図 2-2）．また，中和活性を有す る可能性を考慮し，ヒト EPO/EPOR 複合体の結晶構造解析（Syed et al., 1998）によ り判明した huEPO の受容体結合部位が含まれるかを確認した（図 2-1A）．以上よ り，huEPO を認識する抗体が得られた部位に相当し EPOR 結合部位 1，2 の両方を

含む xlEPO-P1（xlEPO7–23）， huEPO を認識する抗体が得られた部位に相当し EPOR

結合部位 2 を含む xlEPO-P2（xlEPO44–57）， huEPO の中和活性を有する抗体が得ら

れた部位を含み親水性に富む xlEPO-P3（xlEPO109–122）を抗原部位とした（表 2-1）． 選定した 3 種類の抗原ペプチドをウサギに混合免疫して得た抗血清より Protein G カラムで精製した抗体（抗 xlEPO ペプチド抗体画分）は，ELISA において各ペ プチドを認識した（図 2-3A）．また，ウェスタンブロット法において，大腸菌発現 His10-xlEPO を 1 ng から検出し，COS-1 細胞で発現した培養上清中の xlEPO を認識

A ジスルフィド結合 B βシート αヘリックス

P1 P1

P3 P3

N末端 P2 C末端 P2

図 2-3．huEPO 立体構造における xlEPO ペプチド抗原の相同部位 紫色で示した huEPO 立体構造中（Protein Data Bank アクセス番号：1BUY）の xlEPO ペプチド抗原に相同な部位を黄色で示している．Cn3D（Wang et al., 2000）を使用し， 二次構造が表示される初期設定（A）と空間充填表現（B）で表示した．誌上未発表．

33 第 2 章

した（図 2-3B, C）．さらに各ペプチド固定化カラムを使用して精製した抗体は， ELISA において各抗原ペプチドをそれぞれ特異的に認識した（図 2-4 A）．また， ELISA とウェスタンブロット法において，大腸菌発現 His10-xlEPO を認識した（図 2-4B, C）．以上より，各抗 xlEPO ペプチド抗体は部位特異的に xlEPO を認識した． 造血因子に対する抗ペプチド抗体は，造血因子の検出だけでなく，活性の中和に

よる活性領域の解析にも使用される（Sue and Sytkowski, 1983; Sytkowski and Donahue, 1987; Fibi et al., 1993; Greenfield et al., 1993; Tahara et al., 1998）．そこで，中 和活性を調べた．抗 xlEPO-P2 抗体と抗 xlEPO-1 抗体は，xlEPO 刺激による xlEPOR-FDC/P2 細胞の増殖を特異的に阻害し，xlEPO の中和活性をした（図 2-5）． Protein Gカラムにより精製した抗体画分より大腸菌発現 His10-xlEPO固定化カラ ムで精製した抗 xlEPO 特異抗体（抗 xlEPO-P1+2+3 抗体）は，抗原固相化 ELISA に おいて xlEPO を認識し，免疫沈降法にも使用可能であった（データ未掲載）．ウェ スタンブロット法においては大腸菌発現 xlEPO を 7 pg から検出可能であった（図 2-6）．また，xlEPO の中和活性を有した（データ未掲載）．

2-3-2. ウサギ抗 xlEPO ポリクローナル抗体 Protein Gカラムにより精製した抗体画分より大腸菌発現 His10-xlEPO固定化カラ ムで精製した抗 His6-xlEPO 抗体は，抗原固相化 ELISA において xlEPO を認識し， 免疫沈降法にも使用可能であった（データ未掲載）．ウェスタンブロット法におい

ては大腸菌発現 xlEPO を 30 pg から検出可能であった（図 2-6）．また，xlEPO の中 和活性を有した（データ未掲載）．

2-3-3. マウス抗 xlEPO モノクローナル抗体

1B7，3H7，4B3 抗体のサブクラスおよび軽鎖型はすべて IgG1，κ であった．ハ イブリドーマの無血清培養上清から精製した各抗体は，抗原固相化 ELISA，ウェス タンブロット法において xlEPO を認識し，免疫沈降法にも使用可能であった（デー タ未掲載）．一方，xlEPO の中和活性は有さなかった（データ未掲載）．腹水から精 製した 1B7，3H7，4B3 抗体は，ウェスタンブロット法において大腸菌発現 xlEPO をそれぞれ 15，60，125 pg から検出可能であった（図 2-6）．

34 第 2 章

図 2-4．ウサギ抗 xlEPO ペプチド抗体の抗原認識 （A）ペプチド固相化 ELISA．1 ウェルあたり 1 μg/mL の抗原ペプチド溶液 50 μL で固相化したプ レートで実施した．ブロッキング剤に 0.2% w/v ブロックエースを含むトリス緩衝食塩水（20 mM トリス塩酸［pH 7.5］， 500 mM 塩化ナトリウム：TBS）， 1 次抗体に希釈した抗体画分，2 次抗体 にビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG 抗体，発色系に HRP 標識ストレプタクチン，TMBZ を使用した． （B, C）大腸菌発現 His10-xlEPO（B）および動物細胞発現 xlEPO（C）のウェスタンブロット法 による検出．SDS-PAGE は 14%分離ゲル，還元条件下で実施し，転写膜には PVDF 膜を使用した． ブロッキング剤に 0.4%ブロックエースを含む 0.1% v/v Tween 20 含有 TBS（TBST）， 1 次抗体に 5 μg/mL の抗体画分，2 次抗体にビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG 抗体，発色系に AP 標識ストレプタク チン，NBT/BCIP を使用した．分子量は His10-xlEPO 約 22 kDa，xlEPO 約 18 kDa である．M は ビオチン化マーカー蛋白質を示す．（B）各レーン上に表記した量の His10-xlEPO を泳動した．（C） xlEPO 発現ベクター（xlEPO）または空ベクター（Mock）を導入した COS-1 細胞の培養上清を， 総蛋白質 1 μg 分泳動した．誌上未発表．

35 第 2 章

図 2-5．抗原特異的抗 xlEPO ペプチド抗体の認識性 （A）ペプチド固相化 ELISA．1 ウェルあたり 1 μg/mL の抗原ペプチド溶液 50 μL で固相化したプ レートで実施した．ブロッキング剤に 0.2% w/v ブロックエース含有 TBS（0.2% BA-TBS）， 1 次 抗体に希釈した各抗体，2 次抗体にビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG 抗体，発色系に HRP 標識ストレ プタクチン，TMBZ を使用した．（B）His10-xlEPO 固相化 ELISA．1 ウェルあたり 0.5 μg/mL の His10-xlEPO 溶液 50 μL で固相化したプレートで実施した．ブロッキング剤に 0.2% BA-TBS，1 次抗体に希釈した各抗体，2 次抗体に HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG 抗体，発色系に TMBZ を使用し た．（C）His10-xlEPO のウェスタンブロット法による検出．SDS-PAGE は 14%分離ゲル，還元条 件下で実施し，転写膜には PVDF 膜を使用した．ブロッキング剤に 0.4%ブロックエースを含む TBST（0.4% BA-TBST）， 1 次抗体に 2 μg/mL の各精製抗体，2 次抗体にビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG 抗体，発色系に AP 標識ストレプタクチン，NBT/BCIP を使用した．左側のレーンにビオチン 化マーカー蛋白質，右側のレーンに His10-xlEPO を泳動した．His10-xlEPO の分子量は約 22 kDa である．誌上未発表．

36 第 2 章

140

120

100

） ウサギ抗体 % 80 * 抗xlEPO-P1抗体 60 抗xlEPO-P2抗体

細胞増殖（ 抗xlEPO-P3抗体 40

20 * 0 xlEPO mIL-3

図 2-6．抗 xlEPO ペプチド抗体による xlEPO 活性の中和 xlEPO を発現させた COS-1 培養上清（xlEPO）またはマウス IL-3（mIL-3）を各抗体と反応させた 後，スタベーションした xlEPOR-FDC/P2 細胞懸濁液に添加し，3 日間培養後に MTS 試験を実施 した．細胞懸濁液に添加後の終濃度は，COS-1 培養上清 2%，mIL-3 0.1 ng/mL，抗体 50 μg/mL である．細胞増殖（%）は，抗体非添加を 100%としたときの相対値で示した．棒グラフは 3 点測 定の平均値±標準偏差を示し，*P<0.01 は Tukey-Kramer の多重比較検定による．誌上未発表．

大腸菌発現xlEPO

ng

1 0

0.5

0.25 2 2 0.06 0.03

0.007 0.125 0.015 0.003

抗xlEPO-P1+2+3抗体

抗His6-xlEPO抗体

1B7抗体

次抗体 1

3H7抗体

4B3抗体

図 2-7．ウェスタンブロット法における各抗体による xlEPO の検出 SDS-PAGE は 15%分離ゲル，還元条件下で実施し，転写膜には PVDF 膜を使用した．ブロッキン グ剤に 5% w/v スキムミルクを含む PBST（10 mM リン酸緩衝液［ pH7.4］，150 mM NaCl，0.05% Tween 20），1 次抗体に 1 μg/mL の各精製抗体，2 次抗体に HRP 標識ヤギ抗ウサギ Ig 抗体（抗 xlEPO-P1+2+3 抗体と抗 His6-xlEPO 抗体）または HRP 標識ヤギ抗マウス Ig 抗体（1B7，3H7，4B3 抗体），発色基質に化学発光基質 ECL plus（GE Healthcare）を使用した．露光時間はそれぞれの ブロットごとに調整した．誌上未発表．

37 第 2 章

2-3-4. 作出した抗体を使用した xlEPO 定量系の構築 まず，先に得られた抗ペプチド抗体を使用したサンドイッチ ELISA の構築を試 みた（表 2-2A）．その結果，捕捉抗体に抗 xlEPO-P1 抗体，検出抗体にビオチン化 抗 xlEPO-P2 抗体を使用したとき，シグナル（吸光度）に xlEPO 濃度依存性を認め， 検出限界は 25 ng/mL であった（図 2-7A, B）． さらに，後に得られた各抗体を使用してサンドイッチ ELISA の構築を試みた（表 2-2B）．その結果，捕捉抗体に抗 His6-xlEPO 抗体（Protein G カラムで精製した抗体 画分），検出抗体にビオチン化同抗 His6-xlEPO 抗体，ビオチン化抗 xlEPO-P1+P2+P3 抗体，各マウスモノクローナル抗体（1B7，3H7，4B3）を使用したときに，シグナ ルに xlEPO 濃度依存性を認め，検出限界は 5–100 ng/mL であった（図 2-7A, C–G）．

表 2-2．サンドイッチ ELISA におけるシグナルの xlEPO 濃度依存性

検出 αP1 αP2 αP3 A 捕捉 αP1 - ○ ×

αP2 × - ×

αP3 × × -

検出 αP1+2+3 αH6-xlEPO 1B7 3H7 4B3 B 捕捉 αP1+2+3 - - - - -

αH6-xlEPO ○ ○ ○ ○ ○

1B7 - × - - -

3H7 - × - - -

4B3 - × - - -

サンドイッチ ELISA の検出抗体と捕捉抗体に各抗体を使用した時に得られるシグナル （吸光度）の xlEPO 濃度依存性を示した．xlEPO 濃度依存性が認められた組合せを○， 認められなかった組合せを×，未実施の組合せを – で示した． 各抗体の表記は以下である：αP1，抗 xlEPO-P1 抗体；αP2，抗 xlEPO-P2 抗体；αP3，

抗 xlEPO-P3 抗体；αP1+2+3，抗 xlEPO-P1+P2+P3 抗体；αH6-xlEPO，抗 His6-xlEPO 抗体（ カラム精製）．誌上未発表． Protein G

38 第 2 章

図 2-8．xlEPO 定量サンドイッチ ELISA の検量線 サンドイッチ ELISA においてシグナル（吸光度）が xlEPO 濃度依存性を示した検出抗体と捕捉抗 体の組合せについて，実験条件（A）と検量線（B–G）を示した．（A）捕捉抗体，検出抗体，標識 の条件を示す．これ以外の条件・方法は 2-2-5 に記している．検出限界は，3 点測定の吸光度の平 均値を Avg，標準偏差を SD と表記するとき，各測定濃度のうち Avg－2SD がブランクの Avg＋2SD と重ならない最少濃度とした．抗体等の表記は以下である：αP1，抗 xlEPO-P1 抗体；αP2，抗 xlEPO-P2 抗体；αP3，抗 xlEPO-P3 抗体；αP1+2+3，抗 xlEPO-P1+2+3 抗体；αH6-xlEPO，抗 His6-xlEPO 抗体（Protein G カラム精製）；AV-HRP，HRP 標識アビジン；αmIg-HRP，HRP 標識 抗マウスイムノグロブリン抗体．なお，抗体に付した-B はビオチン化標識を施していることを示 す．（B–G）A の各条件における検量線を示す．プロットは 3 点測定の Avg±SD を示す． 誌上未発表．

39 第 2 章

2-4. 考察 標的分子（抗原）に対して特異的な結合能力をもつ抗体は，様々な生命科学研究 のツールとして利用されている．抗体は，免疫学的検出方法（ウェスタンブロット

法，免疫沈降法，ELISA 法）による目的分子の発現や量，分子量などの確認に必須 であるほか，その特異的な結合能力を利用して目的分子を分離精製できる．また，

抗体がもつ目的分子の機能阻害活性を利用して，in vitro や in vivo において目的分 子の機能を調べることができる．本章では，xlEPO に対するウサギポリクローナル 抗体ならびにマウスモノクローナル抗体を作出し，使用可能な実験用途を示した

（表 2-3）．また，サンドイッチ ELISA 法による xlEPO 定量系の構築を試みた（図 2-7）．

表 2-3．作製した各抗 xlEPO 抗体の性質 ウェスタンブ 抗 体 免疫抗原 精製方法 免疫沈降法 b 中和活性 c ロット法 a ウサギポリクローナル抗体

抗 xlEPO-P1 抗体 3 種ペプチド xlEPO-P1 固定化カラム ○ - ○ 抗 xlEPO-P2 抗体 3 種ペプチド xlEPO-P2 固定化カラム ○ - ○ 抗 xlEPO-P3 抗体 3 種ペプチド xlEPO-P3 固定化カラム ○ - × 抗 xlEPO-P1+2+3 抗体 3 種ペプチド His10-xlEPO 固定化カラム ○（7 pg） ○ ○ 抗 His6-xlEPO 抗体 His6-xlEPO His10-xlEPO 固定化カラム ○（30 pg） ○ ○ マウスモノクローナル抗体

1B7 抗体（IgG1, κ） His6-xlEPO Protein G カラム ○（30 pg） ○ × 3H7 抗体（IgG1, κ） His6-xlEPO Protein G カラム ○（60 pg） ○ × 4B3 抗体（IgG1, κ） His6-xlEPO Protein G カラム ○（125 pg） ○ × a ウェスタンブロット法に使用可能な抗体を○で示し，検出限界を（ ）内に記した． b 免疫沈降法に使用可能な抗体を○，調べていない抗体を – で示した． c 中和活性を有する抗体を○，有さない抗体を×，調べていない抗体を – で示した． 誌上未発表．

2-4-1. 作製した抗 xlEPO 抗体の性質とその用途 各抗体はウェスタンブロット法に使用可能であったことから，xlEPO の検出を分 子量情報の取得とともに行えるようになった．検出感度が高いものでは 7 pg の xlEPO を検出した．これは，電気泳動に供する試料量（サンプルバッファーを除く） が 10 μL のとき，700 pg/mL 以上で検出可能であることを意味する．ウェスタンブ ロット法による分子量情報の取得は，huEPO の糖鎖構造の解析（糖鎖消化後の分 子量の変化）や変異体の解析（糖鎖導入後の分子量の変化）など多くの場面で利用

40 第 2 章

されている（Takeuchi et al., 1990; Yamaguchi et al., 1991; Delorme et al., 1992; Elliott et al., 1994; Fibi et al., 1995; Skibeli et al., 2001; Elliott et al., 2003; Elliott et al., 2004a; Elliott et al., 2004b）．本章で得た抗体により，xlEPO においても同様の展開が可能と なった．展開例として，xlEPO の糖鎖修飾について調べた例を 2-4-3 に記す．また， 第 3 章では，抗 xlEPO-P2 抗体を使用して xlEPO 糖鎖付加変異体の解析を行ってい る． 免疫沈降法に使用可能な抗体が得られたことから，xlEPO の分離・精製や xlEPO と相互作用する分子の解析が可能となった．huEPO については，抗 huEPO 抗体を 使用した免疫アフィニティークロマトグラフィーによる精製とその有効性が多数

報告されている（Yanagawa et al., 1984b; Miyazaki et al., 1988; Wojchowski et al., 1987; Goto et al., 1988; Sakata et al., 1992; Gokana et al., 1997; Mi et al., 2006; Dehnes et al., 2010）．同様に，ここで得た抗体を担体に結合したカラムを作製することにより， 免疫アフィニティークロマトグラフィーで xlEPO を精製することができると考え られる．精製 xlEPO を用いた分子性状解析や生体内投与による機能解析等の展開が 可能になったといえる． 中和活性を有する抗体が得られたことから，in vitro と in vivo の両方において， 抗体を用いた xlEPO の中和による xlEPO の生物活性や機能の解析，赤血球産生刺 激活性の解析が可能となった．中和抗体を利用した展開例として，貧血アフリカツ

メガエル血清中の赤血球産生刺激活性を解析した例を 2-4-2 に記す．また，EPO の 部分ペプチドに対する抗体が中和活性を有する場合，ペプチドの領域が EPO の活 性すなわち受容体への結合に重要な領域であるといえる（Sytkowski and Donahue, 1987; Fibi et al., 1993）．本章では抗 xlEPO-P1 抗体と抗 xlEPO-P2 抗体に中和活性を 認めたことから，これらの抗原ペプチド部位（xlEPO-P1：7–23，xlEPO-P2：44–57） は xlEPO の受容体結合部位を含む可能性がある．また，xlEPO-P1 と xlEPO-P2 は huEPO の受容体結合部位に相同な領域を含むことから，EPO の受容体結合部位は アフリカツメガエルとヒトで保存されている可能性が示唆された．これについては，

第 3 章において別の角度から検証を行っている． 得られた抗体を使用してサンドイッチ ELISA 法による xlEPO 定量系の構築を試 みた．EPO の定量系は，赤血球造血研究において重要なツールとなる．これは，

41 第 2 章

ヒト・マウス EPO のサンドイッチ ELISA による定量系が構築されてきたこと （Kientsch-Engel 1990; Noé et al., 1992; Sakata et al., 1995; Noé et al., 1999; Yanagihara et al., 2008），また現在では，ヒト，マウスおよびラットの EPO 定量 ELISA キット が複数のメーカーから市販されていることからも明らかである．ヒトにおける通常

時の血中 EPO 濃度は 5 pM 前後（170 pg/mL 前後）であり，重度の低酸素環境下で は約 1,000 倍にまで上昇する（総説 Choi et al., 1996; 総説 Elliot et al., 2008）．市販 品の huEPO 定量 ELISA キットは，感度が良いものは検出限界 2 pg/mL，定量下限 20 pg/mL 程度であり，様々な生理状態における血中 EPO 濃度を定量可能である． 本章で示したサンドイッチ ELISA の xlEPO 検出限界は 5–100 ng/mL であるが，血 清や血漿，臓器抽出物などの生体試料に適用するための測定条件の最適化を実施し

ていない．また，アフリカツメガエルにおける血中 EPO 濃度がヒトと同程度であ ると仮定すると，検出感度の向上が必要である．ELISA で使用した抗 His6-xlEPO 抗体は，抗血清より Protein G カラムで精製した抗体画分であり，His6 タグを認識 する抗体やその他の抗体も混在している．タグを切断した xlEPO を固定化したカラ ムで xlEPO 特異抗体を精製し使用することで特異性および感度の向上が期待でき る．また，抗体は Fab’化することで特異性の向上を期待できる．さらに，洗浄液や 抗体・試料希釈液，ブロッキング剤の種類，酵素標識法（検出抗体への直接標識，

アビジン-ビオチン系の利用，酵素標識二次抗体の利用）や基質・発色剤の選択， 各抗体の使用濃度等を詳細に検討することで，特異性・感度を向上させることがで

きる．以上を通し，生体試料中の xlEPO が定量できるようになれば，アフリカツメ ガエルにおける赤血球産生制御の解析が可能になる．

2-4-2. 抗体を利用した展開例 1：xlEPO の糖鎖修飾の解析 huEPO は 3 本の N 結合型糖鎖と 1 本の O 結合型糖鎖を有する糖蛋白質である． N 結合型糖鎖は蛋白質中のコンセンサス配列（Asn-X-Ser/Thr：X は Pro を除くアミ ノ酸）中の Asn の側鎖に付加され，O 結合型糖鎖は Ser または Thr の側鎖に付加さ れるが明確なコンセンサス配列はない．xlEPO には N 結合型糖鎖修飾のコンセンサ ス配列がないため，N 結合型修飾を受けないことは明白である．これは，xlEPO を 強制発現させた COS-1 細胞の培養上清を，N 結合型糖鎖と結合するタチナタ豆レ

42 第 2 章

クチン（concanavalin A：Con A）または小麦胚芽レクチン（wheat germ agglutinin： WGA）を利用したレクチンアフィニティークロマトグラフィーで分画すると， xlEPO の活性が非吸着画分に回収されることにより示された（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．一方，O 結合型糖鎖に関しては，huEPO の O 結合型糖鎖付加部位（Ser126） と相同な部位に Ser 残基（Ser116）を有し，O 結合型糖鎖修飾を受けている可能性 があった．そこで，xlEPO を含む培養上清をシアリダーゼと O-グリコシダーゼに よる O 結合型糖鎖の消化に供した後，抗 xlEPO ペプチド抗体画分を使用したタン ブロッティング法により xlEPO を検出し，その分子量の変化を調べた．その結果， 分子量は変化しておらず，xlEPO は O 結合型糖鎖修飾も受けていないと結論付けた．

2-4-3. 抗体を利用した展開例 2：ツメガエル血清中の xlEPO 活性の解析 ヒトや齧歯類では，貧血や失血，低酸素環境への曝露等により低酸素状態に陥る

と，主に腎臓における EPO の発現と分泌が亢進し，次いで血中 EPO 濃度が上昇す る．その結果，骨髄や脾臓における赤血球産生が亢進し，赤血球数が増加する．た

とえば，酸素濃度 7%の低酸素環境に曝露したマウスでは，腎臓における EPO の mRNA 発現量は約 30 倍に上昇し，血清 EPO 濃度も数十倍にまで上昇する（Chikuma et al., 2000）．一方，アフリカツメガエルに溶血性貧血を誘導すると，血中の赤芽球 コロニー形成刺激活性が約 6 倍に上昇するが主要発現臓器である肺と肝臓では EPO mRNA 発現量は変化せず，活性の本体が EPO であるかは不明であった （Nogawa-Kosaka et al., 2010）．そこで，貧血時の血清をレクチンアフィニティーク ロマトグラフィーで分画し，さらに抗 xlEPO-P2 抗体で EPO 活性を中和して，赤芽 球コロニー刺激活性を調べた．その結果，Con A と WGA の両方に結合しない画分 の活性は抗 xlEPO-P2 抗体で中和され，EPO に由来することがわかった．一方，Con A と WGA の両方に結合する画分の活性は抗 xlEPO-P2 抗体で中和されず，EPO 以 外の因子に由来することがわかった．以上より，貧血時に上昇する血中の赤芽球コ

ロニー刺激活性は，EPO およびレクチン結合性を有する EPO 以外の因子に由来す ると結論付け，報告した（Nogawa-Kosaka et al., 2011）．

43 第 3 章

第 3 章 アフリカツメガエルのエリスロポエチンの 分子性状と構造活性相関

3-1. 背景

huEPO は，3 本の N 結合型糖鎖と 1 本の O 結合型糖鎖を有する糖蛋白質である． 蛋白質分子に陰性電荷や親水性を付与する糖鎖は，huEPO の血中半減期や分子安 定性に重要である．しかしながら，xlEPO には N 結合型糖鎖修飾部位がない．また， xlEPO は，huEPO とのアミノ酸配列相同性が約 38%と低いにも関わらず，huEPO 受容体発現細胞を刺激する（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．さらに，第 2 章において， huEPO の受容体結合部位に相同な xlEPO の領域は生物活性に重要であることが示 唆された．したがって，xlEPO と huEPO は，分子性状は異なるものの受容体への 結合に重要な活性領域は保存されていると推察される．そこで，次の知見に着目し

た：（1）huEPO の 3 本の N 結合型糖鎖（Asn24，Asn38，Asn83）は受容体結合部 位の遠位に位置している（Elliot et al., 2003），（2）哺乳類の EPO は交差活性を示し （Ganser et al., 1988; Barrio, 1997; Cowgill et al., 1998; MacLeod et al., 1998; Randolph et al., 2004）， 3 本の N 結合型糖鎖の付加部位は保存されている（Wen et al., 1993）， （3）新たに N 結合型糖鎖付加部位を導入した huEPO 改変体では，付加部位の位置 が in vitro 生物活性の保持に影響を与える（Elliot et al., 2003; Elliot et al., 2004a），（4） N 結合型糖鎖付加部位の導入により，蛋白質の機能部位を調べることができる （Sanchez-Gallego et al., 2012）． 以上の知見と xlEPO が N 結合型糖鎖を有さない特 徴を利用し，「xlEPO と huEPO で活性領域が保存されていれば，N 結合型糖鎖を xlEPO の huEPO 相同部位に導入しても，in vitro 生物活性は保持される」と作業仮 説を立てた．本章では，この作業仮説に基づき，導入した N 結合型糖鎖が xlEPO の分子性状と in vitro 活性に与える影響を調べた．

44 第 3 章

3-2. 材料および方法

3-2-1. 糖鎖付加 xlEPO 発現ベクターの構築 糖鎖付加 xlEPO は，N 結合型糖鎖付加のコンセンサス配列（Asn-X-Ser/Thr：X は Pro を除くアミノ酸）を huEPO の N 結合型糖鎖付加部位（Asn24，Asn38，Asn83） に対応する位置（Thr24，Asp38，Asp83）に導入することで作製した（図 3-1）．

A Asn24 Asn38 Asn83 野生型 xlEPO ELETAMDSC FPEDIMYPE FISDASLKF 変異型 xlEPO ELENATDSC FPENITYPE FISNASLKF ヒトEPO EAENITTGC LNENITYPD LLVNSSQPW マウス EPO EAENVTMGC SENNITYPD LLANSSQPP

B N結合型糖鎖 O結合型糖鎖 huEPO Asn24 Asn83 Ser126 Asn38 xlEPO xlEPO-1 xlEPO-2 xlEPO-3 xlEPO-12 xlEPO-13 xlEPO-23 xlEPO-123

図 3-1．糖鎖付加 xlEPO のデザイン （A）糖鎖付加 xlEPO の糖鎖導入部位のアミノ酸配列．対応する野生型 xlEPO，ヒト EPO，マウス EPO の配列も示している．N 結合型糖鎖修飾のコンセンサス配列 （Asn-Xxx-Ser/Thr）を下線で示し，アミノ酸置換箇所を太字で示す．（B）xlEPO の概 念図．糖鎖付加 xlEPO の名称 xlEPO-XXX の「 X」は，糖鎖導入部位を表す（1：Asn24， 2：Asn38；3：Asn83）． Nagasawa et al., 2015 より引用・改変．

pGEM-T Easy ベクター（プロメガ株式会社）にクローニングした xlEPO 翻訳領 域 cDNA 全長（Nogawa-Kosaka et al., 2010）を鋳型とし，Seyfang と Jin の報告（Seyfang and Jin, 2004）を改変した部位特異的変異導入法により，糖鎖付加 xlEPO の cDNA を作製した（図 3-2）．用いたプライマーを表 3-1 に示す．変異プライマーと 3′-ア ンカープライマーはアニーリング前にリン酸化した．変異プライマーと 17 塩基の

45 第 3 章

固有なテイル部分をもつ 2 つのアンカープライマーを同時に鋳型 DNA にアニーリ ングした後，T4 DNA ポリメラーゼと T4 DNA リガーゼにより伸長，連結して変異 鎖を合成した．次いで，Ex Taq DNA ポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）と Pfu DNA ポリメラーゼ（Fermentas Inc.）を使用した高正確性 PCR において，アンカー プライマーのテイル部分に特異的な PCR プライマーを使用し，完全長の変異鎖を 増幅した．アガロースゲル電気泳動の後，584 塩基の増幅 DNA 断片を QIAEX II Gel Extraction Kit（キアゲン株式会社）を使用して抽出・精製し，pGEM-T Easy ベクタ ーにクローニングした．作製した変異体の塩基配列はダイターミネーター法により

ABI3100 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）で確認 した．目的の変異をもつプラスミドを，制限酵素 NheI と EcoRI で処理し，生じた DNA 断片を pIRES2-EGFP 発現ベクター（Clontech Laboratories, Inc.）のマルチクロ ーニングサイトに挿入した．DH5α 大腸菌に形質転換し，50 µg/mL のカナマイシン を含む Miller の LB 培地で培養した．集菌後，プラスミドをアルカリ SDS 法で調製 した．本発現ベクターは挿入遺伝子の上流にヒトサイトメガロウイルス最初期プロ

モーター，下流に配列内リボソーム進入部位（internal ribosomal entry site：IRES）， 高感度緑色蛍光タンパク質（enhanced green fluorescent protein：EGFP）翻訳領域， SV40 ウイルス初期ポリアデニル化シグナル配列を有する．このため，挿入した変 異 xlEPO と EGFP が同一 mRNA から翻訳される．

表 3-1．部位特異的変異導入に用いたプライマー プライマー 塩基配列（5′–3′） 変異プライマーa,c Thr24Asn/Met26Thr AGAGAATTGGAAAACGCCACGGACTCCTGCAAC Asp38Asn/Met40Thr CAATTTCCTGAGAATATCACGGTCCCTGAAAC Asp83Asn ATTTCATCTCCAATGCCAGCCTC アンカープライマーb 5′-アンカープライマー ACTTGCGGATCCATGGCGCTAGCCACCATGGGTGT 3′-アンカープライマーc GCTAGTCTACCAACGTGACGGTCGTTAACAGCTCT PCR プライマー PCR Fw プライマー ACTTGCGGATCCATGGC PCR Re プライマー AGAGCTGTTAACGACCG a アミノ酸置換に該当するコドンを下線で示し，点変異を太字で示した． b 開始コドンと終始コドンを下線で示し，変異鎖特異的なテイル部分を斜体で示した. c 5′末端をリン酸化して使用した． 略語：Fw，フォワード；Re，リバース. より引用・改変． Nagasawa et al., 2015 46 第 3 章

5′ 3′ 変異プライマーとアンカープライマーの × × × 3′ 5′ 鋳型DNA鎖へのアニーリング

T4 DNAポリメラーゼ T4 DNAリガーゼ 5′ 3′ プライマーの伸長と連結による × × × 変異鎖の合成 3′ 5′

Ex Taq DNAポリメラーゼ Pfu DNAポリメラーゼ

5′ × × × 3′ アンカープライマーのテイル部分（赤） Re に特異的なプライマーを用いた 高正確性PCRによる変異鎖の増幅 5′ × × × 3′ 3′ × × × 5′

5′ × × × 3′ 5′ — 3′ Fw Re × 変異プライマー 3′ × × × 5′ 3′-アンカープライマー 5′-アンカープライマー PCR-Fwプライマー 5′ × × × 3′ 3′ × × × 5′ PCR-Reプライマー

5′ × × × 3′ リン酸化 3′ × × × 5′

図 3-2．本研究で用いた同時に複数の部位特異的変異を導入する方法の概念図 リン酸化した変異プライマーとテイル部分をもつアンカープライマーを，アルカリ変性によ り一本鎖化した鋳型 DNA にアニーリングする．次に，T4 DNA ポリメラーゼとリガーゼに よりプライマーの伸長と連結を一工程で行い，変異鎖を合成する．そして，アンカープライ マーのテイル部分に特異的なプライマーを使用した高正確性 PCR により，変異鎖を特異的 に増幅する．Seyfang and Jin, 2004 より引用・改変．

3-2-2. 糖鎖付加 xlEPO の発現 発現プラスミドベクターをサル腎臓由来 COS-1 細胞（理研セルバンク）に導入 し，発現させた．COS-1 細胞は，10% FCS，100 U/mL ペニシリン，100 µg/mL スト

レプトマイシンを添加した DMEM 中，5% CO2，37°C で培養した．24 ウェル細胞 培養プレート（コーニングジャパン株式会社）に 1 ウェルあたり 8×104 個の細胞を 播種し，90%コンフルエントに達したら，1 ウェルあたり 0.8 µg の発現プラスミド DNA と 1.5 µL の Lipofectamine LTX（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社） を溶解した 100 µL の Opti-MEM（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）を 添加して 4 時間培養した．その後，抗生物質を含まない 10% FCS 含有 DMEM に培

47 第 3 章

地を置換して 24 時間培養し，さらに血清および抗生物質不含の DMEM に置換し 48 時間培養した．EGFP の蛍光強度を測定し（励起波長 485 nm，蛍光波長 528 nm）， 培養上清を回収した．回収した培養上清は分画分子量 5000 の遠心式限外ろ過フィ ルター（Amicon Ultra-4, 5000 NMWL；メルク株式会社）を用いて濃縮し，−80°C に保存した．残った細胞は，トリス塩酸緩衝食塩水（20 mM トリス塩［pH7.5］， 500 mM 塩化ナトリウム：TBS）で 1 回洗浄後，細胞可溶化液（250 mM トリス塩 酸［pH6.8］， 20 mM ジチオスレイトール，6% w/v SDS，20% v/v グリセロール，2 mM EDTA，0.1% w/v ブロモフェノールブルー）で溶解した．この細胞可溶化液を 5–10 分間煮沸して還元し，電気泳動用試料とした．

3-2-3. xlEPO の物理化学的性状の解析 培養上清に含まれる野生型と糖鎖付加 xlEPO を混合し，陽イオン交換クロマトグ ラフィーと逆相クロマトフラフィーで分析した．陽イオン交換クロマトグラフィー

では，酢酸で pH2 に調整した試料を 200 μL の SP Sepharose FF（GE ヘルスケア・ ジャパン株式会社）を充填したオープンカラムに添加し，pH2 から 9 のクエン酸/ リン酸緩衝液（50 mM クエン酸，100 mM リン酸）で溶出した．逆相クロマトフ ラフィーでは，YMC-Pack Protein-RP カラム（4.5 × 150 mm，株式会社ワイエムシ ィ）を使用した．0.1% トリフルオロ酸を含む水/アセトニトリル系で，流速 0.4 mL/ 分，30 分間でアセトニトリル比率 20%から 60%のリニアグラジエントで展開し，3 分間（1.2 mL）ごとに計 10 画分を回収した．各画分は，ウェスタンブロット法で 解析した．

3-2-4. 糖鎖付加 xlEPO の脱糖鎖 10 mM EDTA-2Na を含む 20 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH8.6）中で 0.8 U の ペプチド N-グリコシダーゼ F（PNGase F，ロシュ・ダイアグノスティックス株式 会社）で 37°C，24 時間反応させることにより，N 結合型糖鎖を除去した．

3-2-5. 細胞増殖試験 小坂らの報告（Nogawa-Kosaka et al., 2010）にしたがい実施した．IL-3 依存性マ ウス細胞株 FDC/P2 に xlEPOR を強制発現させた xlEPOR-FDC/P2 または EPO 依存

48 第 3 章

性ヒト細胞株 UT-7/EPO（Komatsu et al., 1993）を使用した．xlEPOR-FDC/P2 細胞お よび UT-7/EPO 細胞は，それぞれ 1 ng/mL のマウス IL-3 または 1 U/mL の huEPO を 含む 10% FCS を含む IMDM で培養した．細胞を対数増殖期に回収し，カルシウム・ マグネシウム不含の DPBS で 3 回洗浄後，それぞれ 8 時間または 20 時間サイトカ イン不含の培地で培養し，スタベーションを行った．96 ウェル平底細胞培養プレ ートに 1 ウェルあたり 1×104 個の細胞を 50 μL で播種し，段階希釈した試料（COS-1 培養上清など）を 50 μL ずつ加えた．37°C で 3 日間培養後，MTS 試験を行った（2-2-4 参照）． さらに各糖鎖付加 xlEPO の活性を比較するために，得られた培養上清添加濃度と 細胞増殖の濃度–反応曲線を 4 パラメータロジスティック曲線

に回帰し，各培養上清の細胞増殖に対する最大効果（Emax）と 50%効果濃度（EC50）

を得た．ここで，x は培養上清添加濃度，y は細胞増殖，a は y の最大値（Emax）， b

は勾配，c は EC50，d は y の最小値をそれぞれ表す．EC50 は培養上清添加濃度（%） を培養上清中の野生型および糖鎖付加 xlEPO の相対量で補正することで，xlEPO の

EC50 相対値を算出した．

3-3. 結果

3-3-1. 糖鎖付加 xlEPO の設計と発現 xlEPO の huEPO の N 結合型糖鎖付加部位と相同な箇所に部位特異的変異導入に より N 結合型糖鎖付加配列を導入した（図 3-1A）．変異は 3 か所に個々に導入し， その組み合わせで 1 本から 3 本の N 結合型糖鎖をもつ計 7 種類の糖鎖付加 xlEPO を設計した（図 3-1B）．野生型 xlEPO および糖鎖付加 xlEPO を COS-1 細胞で発現 させたところ，すべての糖鎖付加 xlEPO は発現し，上清に分泌された．抗 xlEPO-P2 抗体を使用したウェスタンブロット法では，野生型 xlEPO は約 18 kDa を示し，ペ プチド鎖と同じ分子量であった．糖鎖付加 xlEPO は，付加した N 結合型糖鎖数に 応じて約 22，26，30 kDa を示した（図 3-3A）． PNGase F 処理により，すべての糖 鎖付加 xlEPO は約 18 kDa に収束し，分子量の増大は付加した N 結合型糖鎖に起因

49 第 3 章

することを確認した（図 3-3A）． xlEPO-3，xlEPO-13，xlEPO-23，xlEPO-123 では， 一部に Asn83 に糖鎖修飾を欠いており，Asn24 と Asn38 は糖鎖修飾を効率的に受け るが，Asn83 は受けにくいことを示している．糖鎖付加 xlEPO の主要なバンドの下 には，分子量が小さいバンドが存在する．これら 2 つのバンドは，PNGase F 処理 では 1 本に収束することから，N 結合型糖鎖構造の不均一性に由来すると考えられ る．分泌されず細胞内に残っている糖鎖付加 xlEPO も検出した（図 3-3B）．

3-3-2. 糖鎖付加 xlEPO の分泌 ウェスタンブロットのデンシトメトリー解析により COS-1 細胞培養上清中の糖 鎖付加 xlEPO の相対量を算出した．huEPO の糖鎖修飾を増やすとウェスタンブロ ット法において抗ペプチド抗体の認識が減弱する事例が報告されている（Gimenez et al., 2007）．そこで，xlEPO に付加した N 結合型糖鎖は抗 xlEPO-P2 抗体の認識を 弱める可能性があるため，PNGase F 処理により糖鎖を除去した試料のウェスタン ブロット（図 3-3A）を用いた．バンド強度より算出した培養上清中の相対量（分 泌量）は，N 結合型糖鎖を 1 本導入した xlEPO-1，xlEPO-2，xlEPO-3 が野生型の約 半分，N 結合型糖鎖を 2 本または 3 本導入した xlEPO-12，xlEPO-23，xlEPO-123 が 野生型の約 4 分の 1 であった（図 3-4）．使用した発現ベクターは IRES を含んでお り，xlEPO と EGFP は同一 mRNA からバイシストロニックに共発現するため，EGFP の蛍光強度は xlEPO の mRNA レベルでの発現量を反映する．そこで，培養上清中 の xlEPO 相対量（相対分泌量）を EGFP 蛍光強度より得た相対発現量で除すること で分泌効率を算出した（図 3-4）．その結果，分泌効率は N 結合型糖鎖の数が増え るにしたがって低下することが分かり，糖鎖修飾が xlEPO の分泌に負の影響を与え ている可能性が示唆された．

50 第 3 章

A COS-1培養上清

(kDa) (kDa) N-CHO

31.0 30 3 26 2 22 1 PNGase F 21.5 (–) 18 0 14.4

31.0 PNGase F (+) 21.5 18 14.4

B 細胞可溶化液

(kDa) (kDa) N-CHO

31.0 30 3 26 2 22 1 xlEPO 21.5 18 0

14.4

EGFP 31.0 26

図 3-3．糖鎖付加 xlEPO の発現と N 結合型糖鎖糖鎖修飾の確認 （A）COS-1 細胞から分泌された糖鎖付加 xlEPO のウェスタンブロット．野生型および糖鎖付加 xlEPO 発現ベクターまたは空ベクター（Mock）を導入した COS-1 細胞の培養上清を 10 倍濃縮し た試料（上），さらに PNGase F 処理により糖鎖を除去した試料（下）を SDS-PAGE に供し，ウェ スタンブロット法で xlEPO を検出した．（B）COS-1 細胞内に残っている糖鎖付加 xlEPO のウェス タンブロット．細胞可溶化液を SDS-PAGE に供し，ウェスタンブロット法で xlEPO（上）および EGFP（下）を検出した．ウェスタンブロット法の条件は以下である：SDS-PAGE は 14%分離ゲ ル，還元条件で実施し，転写膜には PVDF 膜を使用した．ブロッキング剤に 0.4% BA-TBST，1 次 抗体に 2 μg/mL の抗 xlEPO-P2 抗体または 5,000 倍希釈した抗 GFP 抗体（Anti-GFP (Green Fluorescent Protein) pAb；株式会社医学生物学研究所），2 次抗体にビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG 抗体，発色系に AP 標識ストレプタクチンと発光基質 CDP-Star Detection Reagent（GE ヘルスケ ア・ジャパン株式会社）を使用し，化学発光をルミノ・イメージアナライザーLAS-3000（富士写 真フィルム株式会社）で検出した．最左のレーンにはビオチン化マーカー蛋白質を泳動した．泳動 に供する試料体積は，培養清上では統一し（A），細胞可溶化液では xlEPO と共発現する EGFP の バンド強度で標準化した（ ）． より引用・改変． B Nagasawa et al., 2015

51 第 3 章

1 2

*

1 **

** ** 相対発現量

分泌効率（相対値） 培養上清中の相対量

0 0

図 3-4．xlEPO の分泌に与える N 結合型糖鎖の影響 COS-1 細胞培養上清中の糖鎖付加 xlEPO 蛋白質量（分泌量）の相対値をウェスタンブロッ トのデンシトメトリー解析によりバンド強度から算出した（■）． xlEPO と EGFP は同一 mRNA から翻訳され，EGFP の発現量は xlEPO の発現量と相関することから，xlEPO 発現 量の相対値を EGFP の蛍光強度から算出した（□）．さらに，xlEPO 分泌量を発現量で補正 し，分泌効率の相対値を得た（○）．相対値は野生型 xlEPO を 1 とした．培養上清中の相対 量は平均値±標準偏差（n=3）を示し，*P<0.05，**P<0.01（野生型 xlEPO と比較）は の多重比較検定による． より引用・改変． Tukey-Kramer Nagasawa et al., 2015

3-3-3. 糖鎖付加 xlEPO の物理化学的性質 蛋白質の物理化学的性質のうち，電荷や親水性・疎水性はリガンド－受容体の親

和性や蛋白質の血中安定性に関与する（Darling et al., 2002; 総説 Pisal et al., 2010）． 野生型および糖鎖付加 xlEPO の電気的性質を調べるために，陽イオン交換クロマト グラフィーを実施した（図 3-5A）．野生型 xlEPO は pH8–9 の条件で溶出し，N 結合 型糖鎖を 1 本もつ糖鎖付加 xlEPO は pH7–8 で溶出し，2 本もつ糖鎖付加 xlEPO は 主に pH7 で溶出した．次に，疎水性を比較するため逆相クロマトグラフィーを実 施した（図 3-5B）． huEPO はアセトニトリル比率 40–46%（画分［Fr.］7，データ未 掲載）で溶出したのに対し，野生型 xlEPO は 46–58%（Fr. 8–9）で溶出した．N 結 合型糖鎖を 1 本もつ糖鎖付加 xlEPO は主にアセトニトリル比率 46–52%（Fr. 8）で 溶出し，2 本鎖付加 xlEPO は 40–52%（Fr. 7–8）で溶出した．以上より，糖鎖付加 xlEPO は野生型に比して等電点は低く，親水性が高いことがわかった．

52 第 3 章

A CIEC pI: 溶出液のpH: 2 3 4 5 6 7 8 9 N-CHO

3 2 1 0

B RP-HPLC 親水性: 画分番号: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N-CHO

3 2 1 0

図 3-5．糖鎖付加 xlEPO の物理化学的性質 （A）等電点に基づく分画．（B）疎水性に基づく分画．COS-1 細胞培養上清中に含まれる 野生型および糖鎖付加 xlEPO を陽イオン交換クロマトグラフィー（CIEC）（ A）と逆相高速 液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）（ B）で分画後，回収した各画分をウェスタンブロッ ト法に供し，xlEPO を検出した．Nagasawa et al., 2015 より引用・改変．

3-3-4. 糖鎖付加 xlEPO の in vitro 生物活性 導入した N 結合型糖鎖が xlEPO の in vitro 生物活性に与える影響を，xlEPOR を 発現する xlEPOR-FDC/P2 細胞（図 3-6A）と huEPOR を発現する UT-7/EPO 細胞（図 3-6B）の増殖試験により調べた．その結果，すべての糖鎖付加 xlEPO について， COS-1 細胞培養上清は両細胞の増殖を濃度依存的に刺激した．リガンドの活性は用 量効力（potency：ポテンシー）と最大効力（efficacy：エフィカシー）の 2 つの要 素で規定される．これらの要素は，それぞれリガンドの受容体に対する結合親和性

と受容体を活性化できる能力を表し，濃度–反応曲線におけるリガンドの EC50 と

Emax に反映される．そこで，両細胞の増殖に対する糖鎖付加 xlEPO の EC50（相対

値）と Emax からポテンシーとエフィカシーの相対値をそれぞれ算出した（表 3-2， 図 3-7）．糖鎖付加 xlEPO のポテンシーは，両細胞において，N 結合型糖鎖の数が増

53 第 3 章

加すると減少する傾向にあった（図 3-7A, B）．一方，エフィカシーは細胞ごとに異 なる傾向を示した（図 3-7C, D）． xlEPOR-FDC/P2 細胞に対する糖鎖付加 xlEPO の エフィカシーは，N 結合型糖鎖の数が増加すると減少する傾向にあった（図 3-7C）． 詳細には，xlEPO-12 と xlEPO-23 は野生型 xlEPO に比して有意に低く，xlEPO-1 と xlEPO-3 は野生型 xlEPO よりもわずかに低かった（表 3-2）．これとは対照的に， UT-7/EPO 細胞に対する糖鎖付加 xlEPO のエフィカシーは N 結合型糖鎖の付加によ

り変化しなかった（図 3-7D）．また，野生型および糖鎖付加 xlEPO の Emax は huEPO と同等であった（図 3-6B）． 糖鎖付加 xlEPO の in vitro 生物活性（エフィカシーとポテンシー）の減少が N 結 合型糖鎖の付加に起因するかを調べるために，PNGase F 処理した COS-1 細胞培養 上清を xlEPOR-FDC/P2 細胞の増殖試験に供した．その結果，COS-1 細胞培養上清 を終濃度 6%で添加したとき，PNGase F による N 結合型糖鎖の除去により，xlEPO-3 以外の糖鎖付加 xlEPO の比活性は上昇した（図 3-6C）．これより，付加した N 結合 型糖鎖が xlEPO の in vitro 生物活性を減少させていることが示された．

表 3-2．糖鎖付加 xlEPO の in vitro 生物活性（相対値） a b c 糖鎖付加 相対 EC50 （相対ポテンシー，% ） 相対エフィカシー，% xlEPO xlEPOR-FDC/P2 UT-7/EPO xlEPOR-FDC/P2 UT-7/EPO xlEPO-1 3.84 ± 0.54（26） 1.34 ± 0.27（74） 84 ± 15 106 ± 9 xlEPO-2 1.35 ± 0.79（74） 5.17 ± 4.07（19） 101 ± 5 108 ± 27 xlEPO-3 3.54 ± 1.50（28） 2.37 ± 0.48（42） 94 ± 6 100 ± 14 xlEPO-12 8.65 ± 1.58**（12） 3.24 ± 2.88（31） 54 ± 16** 96 ± 8 xlEPO-13 4.47 ± 2.97（22） 1.05 ± 0.43（95） 89 ± 8 97 ± 20 xlEPO-23 3.25 ± 1.41（31） 6.64（15） 74 ± 14* 91 xlEPO-123 N.D. 187（0.54） N.D. 103 a 細胞増殖に対する糖鎖付加 xlEPO の 50%効果濃度の相対値（相対 EC50）．野生型 xlEPO の EC50 を 1 とした．値は独立した 2～4 回の実験値の平均±標準偏差を示す． b 相対 EC50 から算出した相対ポテンシー．野生型 xlEPO を 100%とした． c 細胞増殖に対する糖鎖付加 xlEPO の最大効果（エフィカシー）の相対値．野生型 xlEPO を 100%

として Emax より算出した．値は独立した 2～4 回の実験値の平均±標準偏差を示す．*P<0.05 と **P<0.01 は野生型 xlEPO との比較による． 略語：N.D.は濃度-反応曲線の 4 パラメータロジスティック曲線への回帰において解が得られなか ったことを示す． より引用・改変． Nagasawa et al., 2015

54 第 3 章

図 3-6．糖鎖付加 xlEPO の in vitro 生物活性 （A，B）野生型および糖鎖付加 xlEPO 刺激よる xlEPOR-FDC/P2 細胞（A）と UT-7/EPO 細胞（B） の増殖の用量反応曲線．4 回の細胞増殖試験のうち 1 回の結果を，3 点測定の平均値±標準偏差で 示した．（C）N 結合型糖鎖の除去による用量反応曲線の変化．COS-1 培養上清を PNGase F で処 理し，xlEPOR-FDC/P2 細胞の細胞増殖試験に供した．また，PNGase F 非添加で同様に処理した 試料でも実施した（実線）．3 回の細胞増殖試験のうち 1 回の結果を，3 点測定の平均値±標準偏差 で示した．**P<0.01 は Student の t 検定による．Nagasawa et al., 2015 より引用・改変．

55 第 3 章

図 3-7．糖鎖修飾の数と in vitro 生物活性の関係 野生型および糖鎖付加 xlEPO を含む COS-1 細胞培養上清を xlEPOR-FDC/P2 細胞（A，C）

または UT-7/EPO 細胞（B，D）の細胞増殖試験に供した．EC50 から得た相対ポテンシー（A，

B）および Emax から得た相対エフィカシー（C，D）（表 3-2）を N 結合型糖鎖修飾部位の導 入数に対してプロットした．なお，相対値は野生型 xlEPO を 100%として算出した．各プ ロットは野生型 xlEPO および異なる糖鎖付加 xlEPO を示す．Nagasawa et al., 2015 より引 用・改変．

3-4. 考察

本章では，N 結合型糖鎖を導入した計 7 種類の糖鎖付加 xlEPO 変異体を作製し， （1）分泌，（2）物理化学的性質，（3）in vitro 生物活性について比較した．ここで は得られた結果をもとに，xlEPO の分子性状と構造活性相関について考察する．

3-4-1. xlEPO の分子性状 すべての糖鎖付加 xlEPO は COS-1 細胞で発現し，培養上清中に分泌された．そ して，付加した N 結合型糖鎖の数に応じた分子量の増大を認めたが，huEPO の

56 第 3 章

Asn83 に相同な部位は糖鎖修飾を受けにくいことがわかった（図 3-3A）． N 結合型 糖鎖は糖転移酵素がコンセンサス配列を認識することで付加され，コンセンサス配 列周辺のペプチドの立体構造により修飾の受けやすさが変化することがわかって

いる．これを利用して，Elliot らは，ヒトの EPO と TPO の立体構造について次の ように考察している：EPO と相同性を有する TPO の活性領域に N 結合型糖鎖付加 部位を導入したところ，糖鎖修飾に成功している部位は EPO の糖鎖修飾と相同な 部位であったことから，これらの部位において TPO と EPO の立体構造は類似して いると示唆される（Elliot et al., 2003）．この考察は，後に X 線結晶構造解析により 明らかとなった TPO 活性領域の立体構造（Feese et al., 2004）を EPO と比較した結 果からも支持される．以上を踏まえると，huEPO と xlEPO の立体構造は，問題な く糖鎖修飾を受けた 24 位，38 位周辺は類似しているが，83 位周辺では異なると考 えられる． 糖鎖付加 xlEPO の分泌効率は，付加した N 結合型糖鎖の数に応じて低下した（図 3-3C）．糖鎖は，翻訳過程において部分的に折りたたまれたポリペプチド鎖に付加 される（総説 Moremen et al., 2012）．そのため，蛋白質の合成および折りたたみと 糖鎖修飾は競合関係にある（Elliott et al., 2004b）．xlEPO では人為的に付加した N 結合型糖鎖の修飾が起きるために蛋白質の折りたたみ速度が低下し，分泌効率が減

少した可能性がある． 野生型 xlEPO は pH7 において陽イオン交換体に保持され，主に pH8 から溶出し ていることから，等電点は 7～8 の間だと考えられる．これは，野生型 xlEPO の成 熟蛋白質のアミノ酸配列から予測される等電点 7.86（Compute pI/Mw tool，SIB Swiss Institute of Bioinformatics により予測）と矛盾ない．X. laevis の血漿の pH はヒトと 同様に約 7.4 である（Wilson et al., 2011）．以上から，huEPO は等電点 4.4–5.1 であ り血中では負電荷を帯びているのに対し（Lasne and de Ceaurriz, 2000），野生型 xlEPO は帯びている負電荷が弱いか正電荷を帯びていると考えられる．huEPO の知 見では，受容体の負電荷と huEPO の糖鎖末端のシアル酸残基の負電荷の反発のた め，huEPO のシアル酸残基を除去すると受容体への結合速度が上昇する（Darling et al., 2002）．これより，野生型 xlEPO の受容体への結合速度は huEPO に比して速い と考えられる．したがって，肝細胞から分泌された xlEPO は，循環血中に移行する

57 第 3 章

というよりは，肝臓類洞壁に存在する赤血球前駆細胞（Okui et al., 2013）に傍分泌 性に作用すると考えられる．一方，糖鎖付加 xlEPO は野生型に比して負電荷および 親水性が高い（図 3-3D）．特に 2 本の N 結合型糖鎖を付加した xlEPO は，pH7 で陽 イオン交換体から溶出するため，血中では負電荷を帯びていると考えられる．糖鎖 末端のシアル酸は細胞表面や糖蛋白質の負電荷に寄与し，これらの負電荷により細 胞と糖蛋白質は電気的に反撥する．これにより，血中を流れる糖蛋白質は血管内皮 細胞への非特異的な吸着が抑制される．また，糖鎖は，親水性を付与し，糖蛋白質

の溶解性や血中安定性に重要である（Toyoda et al., 2002; 総説 Sinclair and Elliott, 2005）．大腸菌で発現させた糖鎖修飾をもたない rhuEPO は，動物細胞で発現させ た糖鎖修飾をもつ rhuEPO に比して，血中安定性に乏しく半減期も短いため，in vivo で生物活性を示さない（Wang et al., 2010）．一方，huEPO に新たな 2 本の N 結合型 糖鎖を付加したダルベポエチン α は，1 分子あたりのシアル酸含量が増えるために 等電点が約 3.3 と huEPO に比して低く，血中半減期が長いために in vivo における 生物活性は huEPO よりも高い（総説 Egrie and Browne, 2001; Egrie et al., 2003）．以 上より，野生型 xlEPO は血液循環を介さない肝臓内の傍分泌に適しているのに対し， 糖鎖付加 xlEPO は血中安定性の向上により内分泌に適している可能性がある．

3-4-2. xlEPO の構造活性相関 すべての糖鎖付加 xlEPO は in vitro 活性を保持しており，濃度依存的に xlEPOR-FDC/P2 細胞と UT-7/EPO細胞の増殖を刺激した（図 3-6）．したがって，xlEPO の huEPO の N 結合型糖鎖修飾と相同な部位に N 結合型糖鎖を付加しても，xlEPO の in vitro 生物活性すなわち EPOR への結合は完全には消失しなかった．これより， huEPO の N 結合型糖鎖が受容体結合部位とは遠位に位置するのと同様に，xlEPO の受容体結合領域は付加した N 結合型糖鎖修飾部位とは別の領域に位置すること が示唆された．さらに，リガンドの活性を規定するポテンシーとエフィカシーを各

糖鎖付加 xlEPO と野生型 xlEPO で比較することで，xlEPO の活性性状を調べた． ポテンシーは受容体に対する結合親和性の指標となる．糖鎖付加 xlEPO のポテン シーは N 結合型糖鎖付加数の増加に従い低下した（図 3-7A, B）．さらに，PNGase F 処理による N 結合型糖鎖の除去により，糖鎖付加 xlEPO の比活性が上昇すること

58 第 3 章

を確認し（図 3-6C），ポテンシーの低下が N 結合型糖鎖に起因することがわかった． huEPO の N 結合型糖鎖は，その末端シアル酸およびコア構造自体が EPO と EPOR の静電相互作用に影響し，受容体への結合速度定数を低下させると理解されている

（Darling et al., 2002）．そして，huEPO の N 結合型糖鎖を PNGase F で除去すると 受容体への結合親和性の上昇にともない in vitro 活性が上昇することが分かってお り（Higuchi et al., 1992），本結果と一致する．さらに，糖鎖数を増やしたダルベポ エチン α では，受容体への結合親和性と in vitro 活性が huEPO に比して低い（総説 Egrie and Browne, 2001; Egrie et al., 2003）．同様に，糖鎖付加 xlEPO の受容体への結 合親和性は野生型 xlEPO に比して低く，そのために in vitro 活性が低下していると 考えられる． エフィカシーはリガンドが受容体を活性化できる能力の指標となり，受容体の天

然リガンドと同等のエフィカシー（濃度–反応曲線においては Emax）をもつリガン ドを完全アゴニスト，天然リガンドよりも低いエフィカシーをもつリガンドを部分

アゴニストという．ヒトの EPO–EPOR の場合，1 分子の EPO が 2 分子の EPOR に 結合することで EPOR の立体配置が変化し，細胞内領域が近接するとシグナル伝達 が惹起され，EPO の活性が発現する（Syed et al., 1998; Livnah et al., 1999; Remy et al., 1999）． そして，リガンド結合時の EPOR の立体配置が活性の強さに影響する（総 説 Jiang and Hunter, 1999; 総説 Boger and Goldberg; 2001）． したがって，エフィカシ ーはリガンド結合後の EPOR の立体配置を反映し，完全アゴニストは EPOR 結合時 に EPO と同様の立体配置を形成するのに対し，部分アゴニストは EPO とは異なっ た立体配置を形成する． xlEPOR-FDC/P2 細胞の増殖に対する糖鎖付加 xlEPO のエフィカシーは，野生型 xlEPO に比して低い傾向にあった（図 3-7C）．これは，糖鎖付加 xlEPO が xlEPOR の部分アゴニストであり，シグナル伝達に十分な xlEPOR の立体配置が形成されな いことを示唆している．一方，UT-7/EPO 細胞の増殖に対する xlEPO のエフィカシ ーは，付加した N 結合型糖鎖の数によらず一定であり（図 3-7D），野生型および糖

鎖付加 xlEPO の Emax は huEPO と同等であった（図 3-7B）．これより野生型および 糖鎖付加 xlEPO は huEPOR の完全アゴニストであり，huEPO と同様に huEPOR の 立体配置を形成させると考えられる．なお，huEPO の N 結合型糖鎖は，huEPOR

59 第 3 章

との結合に干渉しない部位に付加している（Elliott et al., 2003）．以上をふまえると， xlEPOR と huEPOR に対する xlEPO のエフィカシーに与える N 結合型糖鎖の影響の 違いは以下のために生じたと考えられる：xlEPO が huEPOR に結合する際の立体配 置は huEPO の場合と相同であり，xlEPO に付加した N 結合型糖鎖は huEPOR との

結合に干渉しなかった．一方，アフリカツメガエルとヒトでは EPO-(EPOR)2 複合 体中の各分子の立体配置が異なるために xlEPO に付加した N 結合型糖鎖は xlEPOR との結合には干渉した． これは表 3-3 に示す huEPO と xlEPO のアミノ酸配列の比較からも推察される． huEPO の生物活性および受容体への結合に重要なアミノ酸残基は，huEPO への変 異導入（Grodberg et al., 1993; Wen et al., 1994; Matthews et al., 1996; Elliott et al.,

1997）やヒト EPO-(EPOR)2 複合体の結晶構造解析（Syed et al., 1998）により，同定 されている．huEPO と xlEPO の成熟蛋白質におけるアミノ酸配列一致率は約 38% しかない（Nogawa-Kosaka et al., 2010）にも関わらず，huEPO の生物活性および受 容体への結合に重要なアミノ酸残基（アミノ酸置換により in vitro 活性が減少し， かつ，huEPOR と相互作用を形成するアミノ酸残基）は 18 個中 12 個の約 67%が xlEPO にも保存されている（結合部位 1 では 10 個中 6 個，結合部位 2 では 8 個中 6 個）（表 3-3）．一方で，huEPOR と xlEPOR の細胞外領域のアミノ酸配列一致率は 26%であり（Aizawa et al., 2005），huEPO と相互作用を形成する huEPOR の 13 個の アミノ酸残基のうち 7 個（約 54%）が xlEPOR に保存されている（結合部位 1 では 8 個中 6 個，結合部位 2 では 8 個中 2 個）（表 3-3）．ヒトとアフリカツメガエルに おいて，結合部位 2 の EPOR のアミノ酸残基は 2 個しか保存されていないことを考

えると，アフリカツメガエルの EPO-(EPOR)2 がとる立体配置はヒトと異なる可能 性がある．一方で，EPO のアミノ酸残基は結合部位 1 と 2 において高度に保存さ れており，xlEPO が huEPOR に結合する際には，これらのアミノ酸残基を介してヒ

ト EPO-(EPOR)2 と同様な立体配置を形成している可能性がある．

60 第 3 章

表 3-3．ヒト EPO-EPOR の結合部位 1 と結合部位 2 における互いに接触するアミノ酸残基， および対応する xlEPO，xlEPOR のアミノ酸残基

結合部位 1 結合部位 2 近接する huEPOR の 近接する huEPOR の xlEPOa huEPOb,d xlEPORe xlEPOa huEPOb,d xlEPORe アミノ酸残基 c, d アミノ酸残基 c, d K9 S9 H153 P5 L5 F93, S204 F85, S195 T10 R10 H153, E176 D8 D8 H153 D13 E13 P203 T10 R10 M150, S152, H153 I16 L16 P203, S204 S195 V11 V11 F93, M150, H153, S204 F85, S195 K17 L17 P203 M14 R14 L33, E34, P149, M150 L31 R20 K20 E202, P203 F15 Y15 S92, F93 F85 T44 T44 S92, F93, V94 F85 T78 Q78 A88 K45 K45 E62, S91, S92, F93, V94 F85 E91 D96 T87, A88 L46 V46 T90, S91, S92, F93 F85 K92 K97 E34 N47 N47 T87, A88, D89, T90, S91 D81 H94 V99 A88 V48 F48 L33, E34, S92, F93, F205 F85 S95 S100 T87, A88, T90, S91 G49 Y49 E34, T87 R98 R103 L59, E62, A88, D89, D81 N52 K52 E34 S91, V94 K121 R131 E60, D61, E62 E52, D53 S99 S104 S91, S92, F93 F85 L123 I133 D61 D53 H102 T107 F93, V94 F85 K130 K140 E60, D61 E52, D53 L103 L108 F93 F85 S133 R143 E60, P95 E52 K105 R110 E60, D61 E52, D53 N137 N147 F93, V94, P95, H114 F85 R140 R150 F93, H114, N116, F85, N107, E117, P203, S204 E108, S195 G141 G151 F93 F85 R144 K154 H153, S204 S195 L145 L155 F93 F85 a 右列の huEPO アミノ酸残基に対応する xlEPO のアミノ酸残基（Nogawa-Kosaka et al., 2010）． 太字は huEPO と同一であることを示す． b 結合部位 1 と 2 の接触面において，huEPOR に埋もれている huEPO のアミノ酸残基（接触面 積 > 5.0 Å2）（Syed et al., 1998）．既報における huEPO への変異導入による in vitro 生物活性 の損失度に応じてアミノ酸残基に印を付けた（Elliott et al., 1997; Grodberg et al., 1993; Matthews et al., 1996; Wen et al., 1994）．太字・下線は 50 分の 1 未満に減少，太字は 5 分の 1 未満に減少，下線は 2~5 分の 1 に減少，無印は影響なしを示す． c ヒト EPO-(EPOR)2 結晶構造（Protein Data Bank アクセス番号：1EER）において，huEPO と の距離が 4.5 Å 以内の huEPOR アミノ酸残基（Syed et al., 1998）．太字は xlEPOR に保存され ているアミノ酸残基を示す（Aizawa et al., 2005）. d 灰色の網掛けは，水素結合・疎水結合といった相互作用を形成し合う huEPO と huEPOR のア ミノ酸残基を示す（Syed et al., 1998）． e 右列の huEPOR アミノ酸残基に対応する xlEPOR のアミノ酸残基のうち保存されているものを示 した． より引用・改変． Nagasawa et al., 2015

61 第 4 章

第 4 章 アフリカツメガエルとネッタイツメガエルの 血漿蛋白質の質量分析

4-1. 背景

質量分析により蛋白質を同定する際は，蛋白質のアミノ酸配列情報が必要となる． したがって，プロテオミクスを行うには全蛋白質（プロテオーム）を網羅したアミ ノ酸配列データベースを利用する必要があり，そのためにはゲノム情報が必須であ

る．2010 年，ネッタイツメガエル（Xenopus tropicalis）において，両生類で初めて の全ゲノム解読が発表された（Hellsten et al., 2010）．これにより，ツメガエル研究 においてもポストゲノムとしてプロテオミクスの重要性が増したことは論を待た

ない．しかし，本研究で対象としたアフリカツメガエル（Xenopus laevis）は，ゲノ ム量が多く異質 4 倍体の染色体をもつことからゲノム解読の着手が遅れており，ゲ ノム情報を利用できなかった．したがって，プロテオミクスを適用するにはアフリ カツメガエルよりもネッタイツメガエルの方が適していると考えられた．一方で，

アフリカツメガエルは 50 年以上の長い間モデル動物として利用されたことによる 研究蓄積が豊富であり，アフリカツメガエルでプロテオミクスが適用できた場合の メリットは大きい．そこで，本章では，ゲノム解読完了に先立ちアフリカツメガエ ルにおいてもプロテオミクスが適用できる可能性があるかを，実際に両カエルの血

漿蛋白質を分析・同定することで検証した．

4-2. 材料および方法

4-2-1. 動物 アフリカツメガエルは，野生型の成体（オス，体重 30–40 g）を大内一夫氏（埼 玉県三郷市）より購入した．水温 22°C，12 時間周期の明暗条件下で飼育し，餌と して成体ウナギ用餌を与えた． ネッタイツメガエルは，安田系統の成体（オス）の提供を文部科学省ナショナル

バイオリソースプロジェクト（代表機関：広島大学大学院理学研究科附属 両生類

62 第 4 章

研究施設）より受けた．水温 23°C，12 時間周期の明暗条件下で飼育し，餌として 成体ウナギ用餌を与えた．

4-2-2. 採血と血漿の採取 アフリカツメガエルとネッタイツメガエル 1 匹ずつより，次に記す方法で採血し， 血漿を得た．0.5 M EDTA-2Na 水溶液で通液したヘマトクリット毛細管（Drummond Scientific Company）に 27G 注射針（テルモ株式会社）を接続した自作の採血器具 を使用し，心穿刺により血液を約 20–50 μL 採取した．採取した血液には 0.5 M EDTA-2Na 溶液を終濃度約 3–5 mM となるように添加し，混和することで凝固を防 いだ．血液を 4°C，1,000×g で 5 分間遠心して血球を除き，血漿を採取した．血漿 は，さらに 4°C，15,000×g で 5 分間遠心して不溶物を除き，－80°C で保存した． 血漿中の蛋白質濃度は，ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin Standard Ampules, 2 mg/ml；サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を標準蛋 白質とし，Coomassie Plus Protein Assay Reagent（サーモフィッシャーサイエンティ フィック株式会社）を用いて Bradford 法により定量した．

4-2-3. 質量分析用試料の調製 フローチャートを図 4-1 に示す．蛋白質 50 μg を含む血漿（約 2 μL 弱）を変性緩 衝液（8 M 尿素および 2.5 mM EDTA-2Na を含む 500 mM トリス塩酸 pH 8.5）で希 釈し，15 μL とした．40 mM ジチオスレイトールを終濃度 10 mM となるように添 加した後に，37°C で 1.5 時間静置して蛋白質を変性および還元処理した．250 mM ヨ ードアセトアミドを終濃度 50 mM となるように添加し，室温・遮光条件下で 30 分 間静置して蛋白質をアルキル化した．尿素濃度が 1 M となるように 50 mM 重炭酸 アンモニウム溶液で希釈した後，総蛋白質の 50 分の 1 量のトリプシン（Sequencing Grade Modified Trypsin，プロメガ株式会社）を添加して 37°C で終夜消化した．ギ 酸を終濃度 0.1%となるように添加して反応を停止後，ペプチドを MonoTip C18（ジ ーエルサイエンス株式会社）で脱塩・濃縮し，減圧乾燥した．0.02%ギ酸を含む 2% アセトニトリル水溶液 50 μL でペプチドを溶解し，質量分析用試料とした．

63 第 4 章

蛋白質 50 μg

変性・還元処理

+ 変性緩衝液 （8 M尿素，2.5 mM EDTA-2Na，500 mM Tris-HCl，pH 8.5） （15 μLに希釈） + 40 mM ジチオスレイトール 5 µL （終濃度10 mM） 37°C，1.5時間

アルキル化

+ 250 mM ヨードアセトアミド 5 µL （終濃度 50 mM） 室温・遮光，30分間

トリプシン消化

+ 50 mM 重炭酸アンモニウム 175 µL （尿素を1 M以下に希釈） + トリプシン 1 µg （蛋白質全重量の50分の1量） 37°C，終夜

反応停止

+ 10% ギ酸 2 µL（終濃度0.1%）

ペプチド精製

MonoTip C18で脱塩・濃縮 減圧下 遠心乾燥

試料調製

+ 0.02% ギ酸-20%アセトニトリル 5 μL 撹拌・溶解 + 0.02% ギ酸 45 μL （アセトニトリル濃度を2%に希釈）

質量分析用試料 （総液量 50 μL）

図 4-1．質量分析用試料の調製（フローチャート） 「材料および方法」の 4-2-3 をフローチャート化したものである．総説 永澤ら，2014 より引用・改変．

4-2-4. 質量分析（LC–MS/MS） プロテオミクスにおける主要な分析法である液体クロマトグラフィー−多段階質 量分析（LC–MS/MS）を採用した（図 4-2）．機器には日立液体クロマトグラフ質量 分析計 NanoFrontier eLD（株式会社日立ハイテクノロジーズ），試料分離カラムに はスプレーニードル一体型キャピラリーカラム（ NANO HPLC CAPILLARY COLUMN NTCC-360/75-3-105，内径 0.075 mm × 105 mm；日京テクノス株式会社）， トラップカラムにはシリカモノリスキャピラリーカラム（Monolith Trap C18-50-150， 内径 0.050 mm ×150 mm；株式会社日立ハイテクノロジーズ）を使用した．移動相

64 第 4 章

図 4-2．プロテオミクスの分析法の選択 プロテオミクスでは，試料を 2 次元電気泳動で分画・可視化後，注目する蛋白質を含むゲル片をプ ロテアーゼ消化し質量分析に進める方法（上）と，試料をそのままプロテアーゼ消化し，液体クロ マトグラフィー（LC）と多段階質量分析（MS/MS）を組み合わせた LC-MS/MS により網羅的に同 定する方法（下）がある．本研究では，工程が少なく全分析時間が短く，検出感度と一度に同定で きる蛋白質数で優れている LC-MS/MS を選択した．どちらもペプチド断片の質量値を元の蛋白質 配列へ照合して同定するために，ゲノムデータベースを使う．総説 永澤ら，2014 より引用・改変．

に A 液は 0.1%ギ酸を含む 2%アセトニトリル水溶液，B 液は 0.1% ギ酸を含む 98% アセトニトリル水溶液を使用し，流量 200 nL/分，150 分間で B 比率を 2%から 35% へ上昇させるリニアグラジエントで展開した．質量分析は，エレクトロスプレーイ

オン化（ESI）によるポジティブイオンモードで行い，Information Based Acquisition （IBA）機能を使用した（Yokosuka et al., 2006）．血漿のように存在量の異なる様々 な蛋白質を含む試料を分析する場合，主要蛋白質に由来し高濃度に存在するペプチ ドが優先的に検出されるため，微量蛋白質に由来するペプチドの検出が困難となる．

IBA では，同一試料を繰り返し分析する際に，直前の分析と重複するペプチドの MS/MS 測定を回避し，異なるペプチドを測定する．これにより，分析回数を増や

65 第 4 章

すことで，検出ペプチド数が増加し，蛋白質同定数を増やすことができる．本分析

では，試料の注入量を 1.5，1.5，1.5，2.0，2.0 µg と変えて，計 5 回分析した．

4-2-5. データ処理 質量分析計から出力される RAW データに対するピークリストの作成から蛋白質 の同定までは，Xome（三井情報開発株式会社）で実施した（Honmyo, 2007）．蛋白 質の同定は，MASCOT Server version 2.1（マトリックスサイエンス株式会社）の MS/MS イオン検索で行った．検索条件は以下である（表 4-1）．

表 4-1．MS/MS イオン検索の設定条件 項目 設定 Data base NCBInr database Taxonomy アフリカツメガエルのとき Xenopus laevis (African clawed frog) ネッタイツメガエルのとき Other lobe-finned fish and tetrapod clade Enzyme Trypsin Maximum missed cleavages 1 Fixed modifications carbamidomethyl (C) Variable modifications oxidation (M) Peptide mass tolerance ±0.3 Da MS/MS ion mass tolerance ±0.3 Da Charge states +1, +2, and +3 Mass values Monoisotopic Instrument type ESI-TRAP Significance threshold P<0.05

4-2-6. アノテーション 同定された蛋白質の GI アクセッション番号に付与されている遺伝子オントロジ ー（ Gene Ontology：GO）を UniProt（Universal Protein Resource; http://www.uniprot.org/） で参照した．

4-3. 結果と考察

まず，質量分析における MS/MS イオン検索による蛋白質同定に使用するデータ ベースについて，分子の登録数をアフリカツメガエルとネッタイツメガエルで比較

した（表 4-2）． NCBI データベースの登録数は，核酸（nucleotide）はゲノム解読が 完了しているネッタイツメガエルの方が 2 倍以上多いが，蛋白質（protein）はどち

66 第 4 章

らも 3000 程度と大差はなかった．一方，蛋白質総合データベースの UniProtKB で は，蛋白質の登録数はネッタイツメガエルの方が多いものの，詳細な情報が付加さ

れている蛋白質数はアフリカツメガエルの方が多かった．

表 4-2．データベースにおける塩基およびアミノ酸配列の登録数 登録数（2011 年 9 月時点） データベース アフリカツメガエル ネッタイツメガエル NCBI a

Nucleotide 32,628 84,657 Protein 34,229 38,710 UniProtKB b 15,961 30,420 UniProtKB/Swiss-Prot c 3,327 1,619 a National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/） b Universal Protein Resource Knowledgebase（http://www.uniprot.org/） c UniProtKB 登録蛋白質のうち，研究者によりレビューされ手作業でアノテーション（付 加情報）が付与されているもの． 誌上未発表．

次に，実際に LC-MS/MS 分析で同定された血漿蛋白質の数を比較した．4 回の IBA， すなわち計 5 回の測定により，アフリカツメガエルでは計 94，ネッタイツメガエ ルでは計 73 の蛋白質が同定され，その数に大差はなかった（表 4-3）．全ゲノム情 報が解析途上にあるアフリカツメガエルの場合，発現配列タグ（expression sequence tag：EST）データベースの登録が蓄積されている．質量分析では，存在量の多い蛋 白質から優先的に検出・同定されるため，発現量の高い蛋白質から同定されるとも

いえる．発現量が高い蛋白質は EST で登録されている確率が高く，そのためにゲ ノム情報に基づく配列情報が登録されていなくても蛋白質が同定されたと考えら

れる．

表 4-3．質量分析における蛋白質同定数 積算同定数 分析回数 注入量（μg） アフリカツメガエル ネッタイツメガエル 1 1.5 累積 46 34 2（IBA 1 回目） 1.5 （3.0） 59 40 3（IBA 2 回目） 1.5 （4.5） 64 46 4（IBA 3 回目） 2.0 （6.5） 77 64 5（IBA 4 回目） 2.0 （8.5） 94 73 誌上未発表．

67 第 4 章

検出された蛋白質群や発現量が変動した蛋白質群をもとに生物学的な解釈を行 う場合，蛋白質群に関連しているアノテーション（分子機能注釈）を参照する．つ まり，蛋白質にアノテーションが付与されていることが必要である．そこで，アノ

テーション解析に頻用される GO について，同定された蛋白質にアノテーションで ある GO Term が付与されているかを調べた（図 4-3）．その結果，同定された蛋白 質のうち GO Term が付与されている蛋白質が占める割合は，Biological Process（生 物学的プロセス：その蛋白質が貢献する細胞的事象），Cellular Component（細胞内

アフリカツメガエル ネッタイツメガエル

biological regulation cell adhesion A cellular component organization or biogenesis cellular process immune system process localization metabolic process 62% multicellular organismal process response to stimulus 79% signal transduction developmental process establishment of localization transport GO term not found

B

cell 43% extracellular 71% GO term not found

C binding 25% catalytic activity enzyme regulator activity oxygen transporter activity scavenger receptor activity sequence-specific DNA binding transcription factor activity 62% hydrolase activity GO term not found

図 4-3．同定された蛋白質の機能情報 同定された蛋白質について，Gene Ontology の GO term を参照し，その構成を円グラフで示した． （A）Biological Process（生物学的プロセス：その蛋白質が貢献する細胞的事象）．（B）Cellular Component（細胞内構成要素：その蛋白質の局在）．（C）Molecular Function（分子機能：その蛋白 質の生化学的な機能）．左側にアフリカツメガエル，右側にネッタイツメガエルの円グラフを示す． 同定された蛋白質のうち GO term が付与されていない蛋白質を灰色（GO term not found）で示し た．GO term が付与されている蛋白質については，1 つの蛋白質に複数の GO term が付与されてい る場合があるため，GO term の割合を反映させて色分けした．誌上未発表．

68 第 4 章

構成要素：その蛋白質の局在），Molecular Function（分子機能：その蛋白質の生化 学的な機能）のいずれにおいても，ネッタイツメガエルの方が高かった．したがっ て，プロテオーム解析で得られた結果をもとに生物学的解釈を行う場合は，アフリ

カツメガエルが適していると考えられる． 以上より，ゲノムデータベースがないアフリカツメガエルでもゲノム情報を利用 できるネッタイツメガエルと同等に蛋白質の同定が可能であり，蛋白質に付与され ているアノテーションも多いことが判明した．したがって，アフリカツメガエルに おいてもプロテオミクスを適用し，生命現象を理解することが可能であると考えら

れる．

69 第 5 章

第 5 章 低温環境下のアフリカツメガエルにおける プロテオーム変動

5-1. 背景

アフリカツメガエルは低温環境下で汎血球減少を呈する（Maekawa et al., 2012）． 赤血球減少が肝臓における赤血球破壊の亢進が一因であることが示されているが， これに関与する分子，および栓球，白血球の減少機序は明らかとなっていない．ま た，アフリカツメガエルでは，血球産生，血球破壊，物質代謝を主に肝臓が担って おり，これらが共存する．したがって，低温環境下の肝臓は造血系と代謝系が連鎖 する場であるが，その詳細は不明である．本章では，低温曝露による血球減少の機 序および低温曝露により造血系と連鎖して誘導される肝臓での初期応答について， 仮説生成の糸口を得ることを目的とした．低温曝露による蛋白質の構成や量の変動 は仮説生成の材料となる．そして，前章では，アフリカツメガエルにおいてもプロ

テオミクスを利用した研究展開であることが示唆された．そこで，LC-MS/MS 分析 を使用したショットガンプロテオミクスにより，構成蛋白質の変動が生理状態を反 映する血漿と造血・代謝器官である肝臓について，低温曝露下でのプロテオーム変

動を解析した．

5-2. 材料および方法

5-2-1. アフリカツメガエルの低温曝露 成体の野生型アフリカツメガエル（オス，体重 30–40 g）を使用した．水 1 L が 入った水槽でカエル 1 匹を飼育し，水温 22℃を対照条件とした．低温曝露では，5°C に設定した個別動物飼育装置（バイオマルチインキュベータ，株式会社日本医化器

械製作所）内に水槽ごと移動し，24 時間放置した．

5-2-2. 採血，血算および血漿の採取 採血と血漿の採取は 4-2-2 と同様に行った．

70 第 5 章

血算は，血液を Shaw の希釈液で適宜希釈し（Hadji-Azimi, 1987），血球計算盤（ア ズワン株式会社）を用いて赤血球，白血球，栓球数を計数して実施した．ヘモグロ

ビン量は動物用全自動血球計数機（Celltac α MEK-6450，日本光電株式会社）を用 いて測定した．ヘマトクリット値は，血液を充填したヘマトクリット毛細管を 15 mL 遠心チューブに入れて 2400×g で 5 分間遠心した後，血球部分と血漿部分の長 さから計算した．

5-2-3. 肝臓組織の採取 対照群と 5°C で 24 時間飼育した低温曝露群より肝臓を摘出し，湿重を測定した （各群 3 個体）．肝臓左葉を EDTA 含有トリス緩衝生理食塩水（TBS-E：20 mM ト リス塩酸 pH 7.5，100 mM 塩化ナトリウム，1 mM EDTA-2Na）中で洗った後に半 分に切り，TBS-E を注入して組織内の血液を除去したのち，さらに約 5 mm 角の小 片に切った．組織小片は液体窒素で急速に凍結したのち，－80°C で凍結保存した． （早稲田大学 生物実験安全管理規程施行細則（動物実験）に従い実施）

5-2-4. 肝臓蛋白質の抽出 肝臓小片はビーズ破砕機（ビーズクラッシャーμT-12，タイテック株式会社）を 用いて破砕した．2.0 mL スクリューキャップチューブ（ワトソン株式会社）に， 重量を測定した凍結肝臓小片と冷却した直径 5 mm のジルコニアビーズ 1 個（ジル コニアボール YTZ-5，株式会社ニッカトー），肝臓片 100 mg あたり 0.5 mL の冷 TBS-E を加えて，3200 r/min，10 秒 3 回の破砕を行った．回収した肝臓破砕液を 4°C， 1,500×g で 5 分間遠心して組織破片を除き，上清をさらに 4°C，15,000×g で 5 分間 遠心して，不溶物を除いた．可溶性蛋白質を含む上清を回収し，–80°C で保存した． 肝臓抽出液の蛋白質濃度はウシ γ グロブリン（Bovine Gamma Globulin Standard Ampules, 2 mg/ml；サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を標準蛋 白質とし，Coomassie Plus Protein Assay Reagent（サーモフィッシャーサイエンティ フィック株式会社）を用いて Bradford 法により定量した．

5-2-5. 蛋白質のトリプシン消化物の調製

71 第 5 章

血漿および肝臓抽出液は，3 個体分を蛋白質あたり等量混合し（図 5-1），蛋白質 50 μg 分（血漿 2 μL 程度，肝臓抽出液 5 μL 程度）を変性緩衝液（8 M 尿素および 2.5 mM EDTA を含む 500 mM トリス塩酸 pH 8.5）で希釈し，15 μL とした．以降は 4-2-3 と同様にして，質量分析用試料を調製した．

5-2-6. 質量分析（LC–MS/MS） 使用した機器および分析条件は 4-2-4 と同じである．IBA 機能を使用せず，トリ プシン消化物 2 μL（蛋白質 2 μg に相当）を 3 回分析した（図 5-1）．

5-2-7. データ処理 質量分析計から蛋白質の同定までは，4-2-5 と同様に Xome で行った．MASCOT MS/MS イオン検索の条件も同様に行った（設定条件は表 4-1 を参照）．分析 3 回か ら得たデータを個別に処理し，すべての MASCOT 検索において偽陽性率（false discovery rate：FDR）は 5%未満であり，P<0.05 が適切であることを確認した（図 5-4A，図 5-6A）． そして，分析 3 回のうち 2 回以上で同定された蛋白質を信頼でき る蛋白質として以降の解析に使用した（図 5-4B，図 5-6B）． 同定したアフリカツメガエルの蛋白質は NCBI HomoloGene データベース （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene/）あるいは KEGG Orthology データベース （http://www.genome.jp/kegg/ko.html）を使用し，ヒトホモログ分子に変換した．血 漿で同定された 114 個の蛋白質うち 64 個，肝臓で同定された 145 個のうち 113 個 がこれに該当した．データベースに登録されていない分子については，NCBI Reference Sequence （ RefSeq ） データベースに対する配列相同性検索 blastp （protein-protein BLAST：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）により，ヒトホモロ グ候補分子を対応させた．

5-2-8. 量比解析 低温曝露により発現量が変動する蛋白質を見出すため，対照と低温曝露間におけ

る蛋白質の量比（低温曝露/対照）を Mass Navigator v1.2（三井情報開発株式会社） のノンラベル定量機能を使用して算出した．ノンラベル定量機能では次のような処

理を自動で行う：（1）同定したペプチドは m/z と保持時間により分析試料間で同一

72 第 5 章

ペプチドを対応させる．（2）MS クロマトグラムのペプチドピークをシンプレック ス法によりガウス波形に近似し，ピーク面積を計算する．（3）計算したピーク面積 からペプチド量比を計算する．（4）同一蛋白質から生じるペプチドの量比のうち， 外れ値を Thompson の棄却検定で除外する．（5）ペプチド量比の平均値を蛋白質の 量比として算出する． 対照と低温曝露のすべての組合せ（それぞれ 3 回分析で計 9 通り）について，蛋 白質の量比（低温曝露/対照）を算出した．ほとんどの蛋白質の発現量は異なる条 件下でも変化しないため，疑似内部標準蛋白質として用いることができる（Tabata et al., 2007）．そこで，個々の蛋白質の量比の最頻値を用いて標準化した．すなわち， 各蛋白質の量比を最頻値で除し，最頻値が 1 となるように補正した．標準化後，9 個の値を平均して，最終的な蛋白質の量比とした．手順の概念図を図 5-1 に示した．

5-2-9. GO 解析およびパスウェイ解析 アメリカ国立アレルギー・感染症研究所が提供する無償ウェブツールである Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) v6.7 （http://david.abcc.ncifcrf.gov/）（Huang et al., 2009a; Huang et al., 2009b）を使用した． GO 解析は Biological Process（GO:BP），パスウェイ解析は Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイデータベース（http://www.genome.jp/ kegg/pathway.html）を対象に実施し，抽出した蛋白質群と統計学的に有意に関連が ある生物学的概念およびパスウェイを探索した．解析条件は以下である． 対照および低温曝露各群において同定された蛋白質群を入力データに用いる場 合はバックグラウンドに初期設定を使用し，発現量が変化した蛋白質群を入力デー

タに用いる場合は同定された全蛋白質をバックグラウンドとした．Fisher の正確確 率検定の EASE スコア（Hosack et al., 2003）を Benjamini と Hochberg の方法 （Benjamini and Hochberg, 1995）で多重検定補正した P 値が 0.01 未満であり，2 個 以上の蛋白質に関連がある GO:BP およびパスウェイを有意に関連するものとした． さらに，GO の階層構造を QuickGO（http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）で参照し，最 も下位に位置する GO:BP を選択した.

73 第 5 章

図 5-1．試料調製とデータ処理の概念図 各群カエル 3 個体ずつから調製した試料を混合してトリプシン消化し，LC–MS/MS 分析を 3 回繰 り返した．自動ピーク抽出と MASCOT MS/MS イオン検索は Xome を使用して行った．3 回分析の データは個々に処理し，蛋白質を同定した．同定結果を用い，Mass Navigator のノンラベル定量機 能により，すべての組合せ（対照 3 回と低温曝露 3 回の組合せで 9 通り）で蛋白質の量比を算出し た．最頻値により標準化した後，9 個の値を平均し，最終的な蛋白質量比とした．詳細は，「材料 と方法」を参照． より引用・改変． Nagasawa et al., 2013 74 第 5 章

5-2-10. 遊離アミノ酸の定量 GC/FID 遊離（生体）アミノ酸分析キット EZ：faast（株式会社島津ジーエルシー） を使用し，ガスクロマトグラフィーで測定した．説明書にしたがって肝臓抽出液（蛋

白質 0.5 mg 分）の前処理（試料に含有される遊離アミノ酸の誘導体化）を行い， 分析試料とした．ガスクロマトグラフは水素炎イオン化型検出器（flame ionization detector：FID）付きガスクロマトグラフ（GC-2014; 株式会社島津製作所），カラム はキット付属の ZB-AAA 10 m × 0.25 mm I.D.を使用した．注入温度を 280°C，検出 器温度を 320°C に設定し，キャリアガスにはヘリウムを流量 50 cm/sec で使用した． 分析試料 2.0 μL をスプリット比 1：20 で注入し，カラム温度を昇温速度 20°C/min で 80°C から 320°C まで上昇させて分析した．キット付属の標準試料を用いて各ア ミノ酸の検量線を作成し，肝臓抽出液（蛋白質 0.5 mg 分）に含有されるアミノ酸 を定量した．

5-2-11. 肝臓中グリコーゲンの定量 肝グリコーゲンは Graff と Allen の方法にしたがい単離した（Graff and Allen, 1963）．すなわち，肝臓を氷冷 5% トリクロロ酢酸中で破砕し，抽出物から氷冷 70% エタノールでグリコーゲンを沈殿させた．上清を捨てて風乾後，沈殿物を精製水に

溶解して肝グリコーゲン溶液とした．グリコーゲンは Sahyun の方法にしたがいグ ルコースまで加水分解した（Sahyun, 1931）．すなわち，肝グリコーゲン溶液に硫酸 を 2 N となるように加え，100°C で 2 時間反応させた後，2 N 水酸化ナトリウムで 中和し，測定試料とした．試料中のグルコース濃度は，グルコース CII－テストワ コー（和光純薬工業株式会社）を使用して測定した．吸光度 505 nm はマルチプレ ートリーダー（パワースキャン HT，DS ファーマバイオメディカル株式会社）で測 定した．得られたグルコース量の値に 0.927 をかけて無水グリコーゲン量へ変換し た（Sahyun, 1931）．

5-2-12. グルコース，グリセロール，NADPH，NADP の定量 血漿および肝臓抽出物中のグルコース濃度は，グルコース CII－テストワコー（和 光純薬工業株式会社）を使用して測定した．

75 第 5 章

血漿および肝臓抽出物中のグリセロール濃度は，Glycerol Colorimetric Assay Kit （Cayman Chemical Company）を使用して測定した．肝臓抽出物は Driedzic らの報 告にしたがい調製した（Driedzic et al., 2006）．すなわち，凍結肝臓片を 9 倍容の 10% 過塩素酸中で破砕後，15,000×g で遠心した．上清を水酸化カルシウムで中和し，測 定試料とした． 肝臓中の NADP および NADPH は，SensoLyte NADP/NADPH Assay Kit（AnaSpec, Inc.）を使用して説明書に従い測定した． 吸光度および蛍光の測定にはパワースキャン HT を使用した．

5-3. 結果

5-3-1. 低温曝露による環境温度（水温）の変化と汎血球減少の誘導 6 時間の 5°C への曝露で水温はほぼ 5°C まで低下した（図 5-2）．低温曝露 24 時 間後のアフリカツメガエルは，末梢血中の赤血球数，栓球数，白血球数がいずれも 対照群に比して低く，汎血球減少を呈した．また，血中ヘモグロビン量およびヘマ

トクリット値も低かった（表 5-1）．したがって，先行研究（Maekawa et al., 2012） の再現を得た．体重および肝臓湿重には対照群と低温曝露群の間に有意な差を認め

なかった（表 5-1）．

25

20 ）

C 15

° （

10 水温

5

0 0 6 12 18 24 曝露時間（時間）

図 5-2．5°C への曝露時間と水温 22°C の飼育水 1 L を入れた水槽を 5°C の飼育装置に移して放置し，継時的に水温を測 定した． より引用・改変． Nagasawa et al., 2013

76 第 5 章

表 5-1．血算値および体重，肝臓湿重

項目 対照 低温曝露 血算値 赤血球数（1012/L） 01.1 ± 0.18 00.72 ± 0.02* 栓球数（109/L） 10.9 ± 0.58 02.92 ± 1.01* 白血球数（109/L） 22.1 ± 1.51 07.83 ± 6.02** ヘモグロビン量（g/dL） 17.6 ± 2.26 13.1 ± 1.79* ヘマトクリット値（%） 50.5 43.7 体重（g） 28.0 ± 0.58 27.7 ± 1.33 肝臓湿重（g/kg 体重） 右葉 16.8 ± 0.44 19.3 ± 2.41 左葉 19.1 ± 2.11 20.0 ± 0.73 肝臓全体 35.9 ± 2.27 39.5 ± 3.10 アフリカツメガエル 3 個体における測定値の平均値±標準誤差を示す．ただし，ヘマ トクリット値（n =2）を除く．*対照と比較して P<0.05，**対照と比較して P<0.01 （ の 検定）をそれぞれ示す． より引用・改変． Student t Nagasawa et al., 2013

5-3-2. アフリカツメガエルの血漿・肝臓プロテオーム 対照群および低温暴露群の血漿および肝臓のプロテオームを調べるために，

LC–MS/MS 分析を実施した．血漿および肝臓抽出物の SDS-PAGE 像は対照群と低 温曝露群で大差はなかったが（図 5-3）， LC–MS/MS 分析では構成蛋白質の違いを 検出することができた．さらに，同定した蛋白質群に関連する生物学的事象を GO 解析とパスウェイ解析により探索した． 血漿では，91 個の蛋白質（対照 79 個，低温曝露 73 個）を同定し，61 個が両群 で共通していた（図 5-4C）． GO 解析では，5 個の GO:BP が有意に対照と低温曝露 の肝臓蛋白質群に関連しており，対照あるいは低温曝露特異的な GO:BP は検出さ れなかった．また，パスウェイ解析では有意に関連するパスウェイは検出されなか

った．対照と低温曝露で関連する GO:BP に差異がなく，また関連する KEGG が検 出されないのは，GO や KEGG パスウェイに関連付けられているアフリカツメガエ ルの蛋白質数が少ないためである可能性がある．そこで，同定蛋白質をヒトホモロ

グ分子に変換し，解析を行った（図 5-5A）．その結果，対照と低温曝露それぞれ 11 個の GO:BP が有意に同定蛋白質群に関連しており，7 個が共通，4 個がそれぞれに 特異的であった（図 5-5B，表 5-2）． また，1 つのパスウェイ‘補体および血液凝固 カスケード（Complement and coagulation cascades：hsa04610）’が両群の蛋白質群に

77 第 5 章

関連していた（対照：14 個，P=1.16×10–16；低温曝露：13 個，P=4.44×10–15）（図 5-5C）． 肝臓では，145 個の蛋白質（対照 126 個，低温曝露 100 個）を同定し，81 個が共 通していた（図 5-6C）． GO 解析では，対照で 5 個，低温曝露で 7 個の GO:BP が有 意に肝臓蛋白質群に関連していた．これらのうち 4 つは共通しており，1 つが対照 特異的，3 つが低温曝露特異的であった（表 5-3）．パスウェイ解析では，2 つのパ スウェイが対照と低温曝露に共通して関連しており，3 つのパスウェイが低温曝露 特異的であった（表 5-3）． さらに，同定蛋白質をヒトホモログ分子に変換して解析 を行った（図 5-7A）．その結果，対照 14 個，低温曝露 19 個の GO:BP が有意に同 定蛋白質群に関連しており，12 個が共通，2 個が対照特異的，7 個が低温曝露特異 的であった（図 5-7B，表 5-4）．また 5 個のパスウェイが対照と低温曝露に共通し て関連していた（図 5-7C，表 5-5）．

78 第 5 章

A 血漿 非還元条件 還元条件 対照 低温曝露 対照 低温曝露 kDa * kDa * 200 200 116 116 96 96 66 66

45 45

31 31

<21 <21

B 肝臓 非還元条件 還元条件 対照 低温曝露 対照 低温曝露 kDa kDa 200 200 116 116 96 96 66 66

45 45

31 31

<21 <21

図 5-3．血漿・肝臓蛋白質の構成 アフリカツメガエルの血漿（A），肝臓（B）蛋白質の SDS-PAGE 像を示す．対照群， 低温曝露群それぞれ 3 個体から得た血漿，肝臓蛋白質 10 μg を 12%の SDS ポリアクリ ルアミドゲルで分離した（*このレーンのみ 31 μg を泳動した）．蛋白質は Coomassie brilliant blue R-250 で染色し，可視化した．左側は非還元条件，右側は還元条件を示す． （A）誌上未発表，（B）Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

79 第 5 章

A 対照 低温曝露 分析1 分析 2 分析3 分析1 分析2 分析3

同定ペプチド数 3152 2953 3017 3060 3004 2997

帰属ペプチド数a NCBInrデータベース 388 388 345 455 427 413 Decoyデータベース 9 9 7 7 9 8 偽陽性率（%）b 2.32 2.32 2.03 1.54 2.11 1.93

B 対照 低温曝露 分析 1 分析 2 分析 1 分析 2 100 95 88 84

16 15 27 24 20 18 49 46 8 6 7 5 計79 計73 30 22

93 80 分析 3 分析 3

C

対照 低温曝露 79 18 61 12 73

計91

図 5-4．MS/MS イオン検索の概要（血漿） （A）各検索におけるペプチド同定結果．a イオンスコアが同定閾値（P<0.05）を越えるペプチド を示した．b 偽陽性率は，Decoy データベースへの帰属数/NCBInr データベースへの帰属数で算出 した．（B）各検索で同定した蛋白質の構成．3 回分析のうち 2 回以上で同定した蛋白質を灰色で示 した．（C）同定蛋白質の対照と低温曝露においける比較．2 回以上同定された蛋白質を対照と低温 曝露で比較した．誌上未発表．

80 第 5 章

A 蛋白質の変換 対照 低温曝露

蛋白質 アフリカツメガエル 蛋白質 79個 GIアクセッション番号 73個

HomoloGene / KEGG Orthology / BLASTp

ID ヒト相同分子 ID 57個 RefSeq protein ID 52個

GO・パスウェイ解析

GO:BP: 11 GO:BP GO:BP: 11 パスウェイ: 1 KEGGパスウェイ パスウェイ: 1 比較

B GO:BP

対照 低温曝露 11 4 7 4 11

mitotic cell cycle regulation of response to external stimulus complement activation, alternative pathway response to chemical stimulus cell cycle phase regulation of hydrolase activity negative regulation of regulation of response to stress cellular component organization

C KEGGパスウェイ 対照 Complement and coagulation cascades 低温曝露 1

図 5-5．血漿蛋白質の GO およびパスウェイ解析 （A）データ処理の概念図．アフリカツメガエルの GI アクセッション番号を NCBI HomoloGene， KEGG Orthology，BLASTp を用いてヒトの RefSeq protein IDs に変換した．そして，DAVID を使 用し GO およびパスウェイ解析を実施し，蛋白質群に有意に関連のある GO:BP および KEGG パス ウェイを検出した（詳細は「材料と方法」に示す）．（B，C）対照および低温曝露の蛋白質群に関 連する （ ）と パスウェイ（ ）の比較．誌上未発表． GO:BP B KEGG C

81 第 5 章

表 5-2．検出された血漿蛋白質群に関連する GO:BP ヒトホモログ分子を用いて GO 解析を DAVID で行った．Fisher の正確確率検定で算出した EASE スコアを Benjamini と Hochberg の方法で多重検定補正した P 値（FDR 補正後 P 値）が 0.01 未満 であり，GO 階層構造の最下層に位置する GO を選択した．対照または低温曝露に特異的な GO:BP を示す．

蛋白質 FDR補正後 GO ID GO:BP 蛋白質（ヒトRefSeq ID）b 数a P値 対照特異的 GO:0006957 complement activation, alternative 5 NP_001138724, NP_001701, NP_000055, 0.02×10–3 pathway NP_001728, NP_000177 GO:0022403 cell cycle phase 9 NP_001804, NP_004349, NP_006222, 4.71×10–3 NP_001213, NP_060533, NP_001008938, NP_001002800, NP_059523, NP_002302 GO:0051129 negative regulation of cellular 6 NP_001804, NP_002119, NP_001634, 5.61×10–3 component organization NP_001636, NP_000030, NP_059523 GO:0000278 mitotic cell cycle 8 NP_001804, NP_004349, NP_006222, 9.64×10–3 NP_001213, NP_060533, NP_001008938, NP_001002800, NP_059523 低温曝露特異的 GO:0042221 response to chemical stimulus 15 NP_000375, NP_001613, NP_001634, 2.89×10–3 NP_001054, NP_000046, NP_000500, NP_068657, NP_005132, NP_006779, NP_000499, NP_001701, NP_000286, NP_000005, NP_000479, NP_001121179, NP_000176, NP_001630 GO:0051336 regulation of hydrolase activity 8 NP_001634, NP_002462, NP_001636, 4.90×10–3 NP_653271, NP_001728, NP_000497, NP_000030, NP_006779 GO:0032101 regulation of response to external 6 NP_000403, NP_001613, NP_000055, 6.38×10–3 stimulus NP_000005, NP_000479, NP_000497 GO:0080134 regulation of response to stress 7 NP_000403, NP_001613, NP_000055, 8.26×10–3 NP_000005, NP_000479, NP_001624, NP_000497 a 入力した蛋白質群（対照 69 個，低温曝露 65 個）から，それぞれの GO:BP に分類された蛋白質 数を示す．b 対照または低温曝露特異的な蛋白質を太字で示している． 誌上未発表．

82 第 5 章

A 対照 低温曝露 分析1 分析 2 分析3 分析1 分析2 分析3

同定ペプチド数 2856 2809 2760 2807 2815 2946

帰属ペプチド数a NCBInrデータベース 263 268 253 237 238 242 Decoyデータベース 6 3 10 2 7 3 偽陽性率（%）b 2.28 1.12 3.95 0.84 2.94 1.24

B 対照 低温曝露 分析 1 分析 2 分析 1 分析 2 146 133 116 124

10 10 40 26 35 33 77 62 19 20 9 19 計126 計100 41 22

159 112 分析 3 分析 3

C

対照 低温曝露 45 81 19 126 100

計145

図 5-6．MS/MS イオン検索の概要（肝臓） （A）各検索におけるペプチド同定結果．a イオンスコアが同定閾値（P<0.05）を越えるペプチド を示した．b 偽陽性率は，Decoy データベースへの帰属数/NCBInr データベースへの帰属数で算出 した．（B）各検索で同定した蛋白質の構成．3 回分析のうち 2 回以上で同定した蛋白質を灰色で示 した．（C）同定蛋白質の対照と低温曝露においける比較．2 回以上同定された蛋白質を対照と低温 曝露で比較した． より引用・改変． Nagasawa et al., 2013

83 第 5 章

表 5-3．検出された肝臓蛋白質群に関連する GO:BP および KEGG パスウェイ アフリカツメガエルの蛋白質を用いて GO およびパスウェイ解析を DAVID で行った．Fisher の正 確確率検定で算出した EASE スコアを Benjamini と Hochberg の方法で多重検定補正したP 値（ FDR 補正後 P 値）が 0.01 未満である GO:BP および KEGG パスウェイを選択した．なお，GO は階層 構造の最下層に位置するものを選択した．対照または低温曝露に特異的な GO:BP および KEGG パ スウェイを示す．

蛋白質 FDR補正後 GO/パスウェイ ID GO:BP/KEGGパスウェイ 蛋白質（GIアクセッション番号）b 数a P値 対照特異的 GO:0006800 oxygen and reactive oxygen species 4 157426935, 55824753, 64647, 2.87×10–3 metabolic process 118136396, 148223641 低温曝露特異的 GO:0006520 cellular amino acid metabolic process 9 148234619, 147907284, 147900590, 0.67×10–3 148230238, 148223115, 148230659, 148232264, 147902599, 148233713 GO:0006732 coenzyme metabolic process 6 148237590, 148236351, 147905276, 5.88×10–3 147899037, 147907224, 148223868 GO:0043603 cellular amide metabolic process 4 147900590, 148236351, 147905276, 7.17×10–3 147907224 xla00350 Tyrosine metabolism 6 160420189, 148237546, 148230238, 1.27×10–3 148223115, 147902599, 147905626 xla00620 Pyruvate metabolism 6 33585701, 148237590, 148224415, 9.86×10–3 148227690, 147898618, 148223868 xla00330 Arginine and proline metabolism 6 148234619, 147900590, 148230659, 9.48×10–3 148232264, 118384, 148233713 a 入力した蛋白質リスト（対照 126 個，低温曝露 100 個）から，それぞれの GO:BP に分類された 蛋白質数を示す．b 対照または低温曝露特異的な蛋白質を太字で示している． Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

84 第 5 章

A 蛋白質の変換 対照 低温曝露

蛋白質 アフリカツメガエル 蛋白質 126個 GIアクセッション番号 100個

HomoloGene / KEGG Orthology / BLASTp

ID ヒト相同分子 ID 109個 RefSeq protein ID 90個

GO・パスウェイ解析

GO:BP: 14 GO:BP GO:BP: 19 パスウェイ: 5 KEGGパスウェイ パスウェイ: 5 比較

B GO:BP

対照 低温曝露 14 2 12 7 19

response to glucocorticoid stimulus NADH metabolic process cellular response to oxidative stress gluconeogenesis pentose biosynthetic process tyrosine catabolic process cellular amino acid derivative metabolic process L-phenylalanine catabolic process glyoxylate metabolic process C KEGGパスウェイ

Glycolysis / Gluconeogenesis Pentose phosphate pathway 対照 5 Alanine, aspartate and glutamate metabolism 低温曝露 Arginine and proline metabolism Pyruvate metabolism

図 5-7．肝臓蛋白質の GO およびパスウェイ解析 （A）データ処理の概念図．アフリカツメガエルの GI アクセッション番号を NCBI HomoloGene， KEGG Orthology，BLASTp を用いてヒトの RefSeq protein IDs に変換した．そして，DAVID を使 用し GO およびパスウェイ解析を実施し，蛋白質群に有意に関連のある GO:BP および KEGG パス ウェイを検出した（詳細は「材料と方法」に示す）．（B，C）対照および低温曝露の蛋白質群に関 連する （ ）と パスウェイ（ ）の比較． より引用・改変． GO:BP B KEGG C Nagasawa et al., 2013 85 第 5 章

表 5-4．検出された肝臓蛋白質群に関連する GO:BP ヒトホモログ分子を用いて GO 解析を DAVID で行った．Fisher の正確確率検定で算出した EASE スコアを Benjamini と Hochberg の方法で多重検定補正した P 値（FDR 補正後 P 値）が 0.01 未満 であり，GO 階層構造の最下層に位置する GO を選択した．対照または低温曝露に特異的な GO:BP を示す．

蛋白質 FDR補正後 GO ID GO:BP 蛋白質（ヒトRefSeq ID）b 数a P値 対照特異的 GO:0051384 response to glucocorticoid stimulus 6 NP_001116105, NP_002070, NP_000026, 5.39×10–3 NP_002558, NP_000021, NP_000039 GO:0034599 cellular response to oxidative stress 5 NP_000393, NP_004896, NP_001743, 5.61×10–3 NP_036226, NP_000445 低温曝露特異的 GO:0006734 NADH metabolic process 4 NP_000026, NP_005267, NP_005909, 0.31×10–3 NP_005908 GO:0006094 Gluconeogenesis 5 NP_000026, NP_005267, NP_001152759, 0.34×10–3 NP_001121100, NP_000166 GO:0019322 pentose biosynthetic process 3 NP_000393, NP_002854, NP_002622 2.36×10–3 GO:0006572 tyrosine catabolic process 3 NP_000178, NP_000128, NP_002141 7.10×10–3 GO:0006575 cellular amino acid derivative 7 NP_001116105, NP_000393, NP_005887, 7.57×10–3 metabolic process NP_001076440, NP_002530, NP_000445, NP_000687 GO:0006559 L-phenylalanine catabolic process 3 NP_000178, NP_000128, NP_002141 9.95×10–3 GO:0046487 glyoxylate metabolic process 3 NP_005887, NP_036335, NP_000021 9.95×10–3 a 入力した蛋白質リスト（対照 109 個，低温曝露 90 個）から，それぞれの GO:BP に分類された蛋 白質数を示す．b 対照または低温曝露特異的な蛋白質を太字で示している． Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

表 5-5．検出された肝臓蛋白質群に関連する KEGG パスウェイ ヒトホモログ分子を用いてパスウェイ解析を DAVID で行った．Fisher の正確確率検定で算出した EASE スコアを Benjamini と Hochberg の方法で多重検定補正した P 値（ FDR 補正後 P 値）が 0.01 未満である KEGG パスウェイを示す．

パスウェイ KEGG 蛋白質数a 蛋白質（ヒトRefSeq ID）b FDR補正後P値 ID パスウェイ CNT CE 対照 低温曝露 対照 低温曝露 hsa00010 Glycolysis / Gluconeogenesis 12 9 NP_002037, NP_001121100, NP_002037, NP_000026, 1.58×10–8 1.06×10–5 NP_697021, NP_000660, NP_001158886, NP_001152759, NP_001158886, NP_000026, NP_001121100, NP_001967, NP_001419, NP_001152759, NP_000166, NP_005557, NP_001967, NP_000166, NP_000687, NP_000660 NP_002645, NP_005557, NP_000687 hsa00030 Pentose phosphate pathway 8 8 NP_006746, NP_000393, NP_006746, NP_000393, 8.10×10–7 5.30×10–7 NP_000026, NP_001121100, NP_000026, NP_001121100, NP_000166, NP_002622, NP_000166, NP_002622, NP_001128527, NP_115512 NP_001128527, NP_115512 hsa00250 Alanine, aspartate and glutamate 7 6 NP_001116105, NP_002070, NP_001116105, NP_000041, 6.30×10–5 5.25×10–4 metabolism NP_000041, NP_000021, NP_000021, NP_005262, NP_005262, NP_004332, NP_004332, NP_000039 NP_000039 hsa00330 Arginine and proline metabolism 8 7 NP_001116105, NP_002070, NP_001116105, NP_000041, 9.66×10–5 4.67×10–4 NP_000041, NP_002530, NP_002530, NP_000036, NP_000036, NP_005262, NP_005262, NP_000687, NP_000687, NP_000039 NP_000039 hsa00620 Pyruvate metabolism 7 6 NP_001158886, NP_036335, NP_001158886, NP_036335, 1.79×10–4 1.12×10–3 NP_005882, NP_005557, NP_005882, NP_005557, NP_002645, NP_005909, NP_005909, NP_005908, NP_005908, NP_000687 NP_000687 a 入力した蛋白質リスト（対照 109 個，低温曝露 90 個）から，それぞれの GO:BP に分類された蛋 白質数を示す．略語：CNT，対照；CE，低温曝露．b 対照または低温曝露特異的な蛋白質を太字 で示している． より引用・改変． Nagasawa et al., 2013

86 第 5 章

5-3-3. 低温曝露による血漿・肝臓プロテオームの変動 対照群と低温曝露群で発現量の異なる蛋白質を調べるため，ノンラベル法による

相対定量解析を実施し，検出された蛋白質の量比（低温曝露/対照）を算出した（図 5-8，図 5-9）．そして，対照群あるいは低温曝露群のみで検出された蛋白質と合わ せて，以下に示す 4 つに分類した．

グループ 1：低温曝露群で発現量の高い蛋白質（量比 1.25 より大） グループ 2：低温曝露群でのみ検出された蛋白質 グループ 3：低温曝露群で発現量の低い蛋白質（量比 0.8 未満） グループ 4：低温曝露群でのみ検出されなかった蛋白質

概して，グループ 1 と 2 を合わせて低温曝露により発現量が増加した蛋白質，グル ープ 3 と 4 を合わせて低温曝露により発現量が減少した蛋白質と考えることができ る．したがって，血漿では，16 個（グループ 1：13 個，グループ 2：3 個）蛋白質 が低温曝露により増加し，13 個（グループ 3：5 個，グループ 4：8 個）の蛋白質 が減少したと考えることができる（表 5-6 から表 5-9）．また，肝臓では，27 個（グ ループ 1：14 個，グループ 2：13 個）蛋白質が低温曝露により増加し，31 個（グ ループ 3：9 個，グループ 4：22 個）の蛋白質が減少したと考えることができる（表 5-10 から表 5-13）．さらに，これらの発現量が変動した蛋白質群に関連する生物学 的事象を見出すため GO 解析およびパスウェイ解析を実施したが，有意に関連する GO:BP およびパスウェイは見いだされなかった．また，ヒトホモログ分子に変換 して解析しても同様であった．

87 第 5 章

hemoglobin subunit alpha-1 gi|122285 serum albumin B gi|113571 serum albumin B gi|148236611 serum albumin A gi|148237263 LOC734667 protein gi|148226128 hemoglobin subunit beta-1 gi|147906883 similar to apolipoprotein A-I gi|148227056 hemoglobin, gamma G gi|291290905 LOC100189571 protein gi|205360872 serine (or cysteine) proteinase inhibitor gi|147903527 LOC100189571 protein gi|213623858 fibrinogen gamma chain gi|147902501 LOC446919 protein gi|51593670 serotransferrin-A gi|147905534 Golgi coiled-coil protein 1 gi|148228949 LOC100137710 protein gi|165905293 LOC100137667 protein gi|168693521 cytoskeleton associated protein 5 gi|147905967 LOC100189571 protein gi|213626879 calcium/calmodulin-dependent protein kinase II gamma J subunit gi|10443734 similar to fetuin B gi|28628318 pentraxin fusion protein gi|148227396 ficolin-1 gi|54038324 myosin, heavy chain 10, non-muscle gi|148223878 ATP-dependent RNA helicase ddx6 gi|288558810 complement C3 gi|1352104 IQ motif containing GTPase activating protein 1 gi|148234245 complement factor B gi|148237705 増加（グループ1，量比 > 1.25） complement component 9 gi|148233806 pentraxin fusion protein gi|213627704 変化なし serotransferrin-B gi|28175306 00 serotransferrin-A gi|158931156 LOC379735 protein gi|148231684 減少（グループ3，量比 < 0.8） alpha-2-macroglobulin-like 1 gi|205360886

蛋白質 alpha-1 antitrypsin gi|147900107 centromere protein E gi|147900710 LOC100158443 protein gi|183985915 alpha-1-antiproteinase gi|148224758 complement component C3 gi|758425 LOC397792 protein gi|213625350 complement component 4A gi|148225412 complement C3 gi|147903901 cytoskeleton associated protein 5 gi|148227498 alpha-1 antitrypsin gi|147906435 apolipoprotein CI gi|290745684 LOC443652 protein gi|49115728 phospholipase C, beta 3 (phosphatidylinositol-specific) gi|147900969 apolipoprotein A-I gi|148227435 LOC100036907 protein gi|120537898 alpha-2-macroglobulin a gi|285026443 LOC398654 protein, partial gi|32450035 LOC100189580 protein gi|124481722 serpin peptidase inhibitor gi|147906390 complement factor I gi|147899071 LOC398654 protein gi|49119429 Ig mu chain C region gi|85805 fibrinogen beta chain gi|147900556 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 量比（低温曝露/対照）

図 5-8．血漿蛋白質の量比分布 対照と低温曝露で同定された血漿蛋白質について，相対定量解析を実施し，蛋白質量における対照 に対する低温曝露の量比を算出した．誌上未発表．

88 第 5 章

表 5-6．低温曝露で発現量が高い蛋白質（血漿）：グループ 1

対照a 低温曝露a ヒトホモログ分子 アクセッション 蛋白質名 同定 ペプチド 同定 ペプチド 量比b 番号 RefSeq IDc 蛋白質 機能 スコア 数 スコア 数 gi|122285 hemoglobin subunit alpha-1 223 16 266 29 31.10 NP_000508† hemoglobin subunit alpha 酸素運搬 gi|113571 serum albumin B 1296 179 1343 162 22.40 NP_000468† serum albumin 物質輸送 gi|148236611 serum albumin B 1296 179 1343 162 07.40 NP_000468 serum albumin 物質輸送 gi|148237263 serum albumin A 970 104 938 103 05.78 NP_000468 serum albumin 物質輸送 gi|148226128 LOC734667 protein 128 8 116 8 02.28 NP_001613 alpha-2-HS-glycoprotein プロテアーゼ阻害 gi|147906883 hemoglobin subunit beta-1 439 27 494 41 02.04 NP_000550 hemoglobin subunit 酸素運搬 gamma-1 gi|148227056 similar to apolipoprotein A-I 324 16 359 18 01.93 NP_000030 apolipoprotein A-I 脂質・脂肪酸輸送 gi|291290905 hemoglobin, gamma G 199 15 222 17 01.72 NP_000175 hemoglobin subunit 酸素運搬 gamma-2 gi|205360872 LOC100189571 protein 1121 118 1255 122 01.38 NP_000468 serum albumin 物質輸送 gi|147903527 serine (or cysteine) 541 29 544 28 01.37 NP_000286 alpha-1-antitrypsin プロテアーゼ阻害 proteinase inhibitor gi|213623858 LOC100189571 protein 1198 126 1289 127 01.36 NP_000468† serum albumin 物質輸送 gi|147902501 fibrinogen gamma chain 479 27 475 22 01.32 NP_000500 fibrinogen gamma chain 血液凝固 isoform gamma-A † gi|51593670 LOC446919 protein 417 36 455 50 01.27 NP_055190 fetuin-B プロテアーゼ阻害 a MASCOT MS/MS イオン検索における蛋白質同定スコアとペプチド数は，3 回測定のうち最大値 を示す．b 量比（低温曝露/対照）は，値が 1.25 以上または 0.8 未満，変動係数が 30%未満のもの を有意な変化とみなし，太字で表記した．c ヒトホモログがデータベース（NCBI HomoloGene， KEGG Orthology）に登録されていないものは，ヒトの NCBI Reference Sequence（RefSeq）デー タベースに対する相同性検索（BLASTp）で候補分子を選出し，†で示した． 誌上未発表．

表 5-7．低温曝露でのみ検出された蛋白質（血漿）：グループ 2

アクセッション 同定 ペプチド ヒトホモログ分子 蛋白質名 番号 スコアa 数a RefSeq IDb 蛋白質名 機能 hydrogen/potassium-exchanging 34 6 potassium-transporting ATPase alpha gi|148222593 NP_001172014 ATP生合成，イオン膜輸送 ATPase 12A chain 2 isoform 1 gi|148223505 flightless 1 homolog 34 4 NP_001243193 protein flightless-1 homolog isoform 2 転写制御 gi|6692092 Ral interacting protein 29 2 NP_006779† ralA-binding protein 1 GTPアーゼ活性化 a MASCOT MS/MS イオン検索における蛋白質同定スコアとペプチド数は，3 回測定のうち最大値 を示す．b ヒトホモログがデータベース（NCBI HomoloGene，KEGG Orthology）に登録されてい ないものは，ヒトの NCBI Reference Sequence（RefSeq）データベースに対する相同性検索 （BLASTp）で候補分子を選出し，†で示した． 誌上未発表．

89 第 5 章

表 5-8．低温曝露で発現量が低い蛋白質（血漿）：グループ 3

対照 低温曝露 ヒトホモログ分子 アクセッション 蛋白質名 同定 ペプチド 同定 ペプチド 量比 番号 RefSeq ID 蛋白質 機能 スコア 数 スコア 数 gi|147900556 fibrinogen beta chain 541 21 537 21 0.408 NP_005132 fibrinogen beta chain 血液凝固 isoform 1 gi|85805 Ig mu chain C region 72 5 177 9 0.739 NP_001243225† immunoglobulin lambda- 不明 like polypeptide 5 isoform 2 gi|49119429 LOC398654 protein 421 17 370 13 0.740 NP_000499† fibrinogen alpha chain 血液凝固 isoform alpha-E gi|147899071 complement factor I 62 1 55 2 0.753 NP_000195 complement factor I 補体第二経路 gi|147906390 serpin peptidase inhibitor 110 8 107 5 0.764 NP_000479 antithrombin-III プロテアーゼ阻害 表 5-6 を参照． 誌上未発表．

表 5-9．低温曝露でのみ検出されなかった蛋白質（血漿）：グループ 4

アクセッション 蛋白質名 同定 ペプチド ヒトホモログ分子 番号 スコア 数 RefSeq ID 蛋白質名 機能 gi|147906272 MGC82112 protein 137 9 NP_000005 alpha-2-macroglobulin プロテアーゼ阻害 gi|148886732 vesicle-fusing ATPase 47 4 NP_006169 vesicle-fusing ATPase 細胞内輸送，シナプス伝達 gi|146218406 LOC100049737 protein 41 6 NP_001003795† general transcription factor II-I mRNA転写 repeat domain-containing protein 2B gi|148236049 vesicle-fusing ATPase 39 4 NP_006169 vesicle-fusing ATPase 細胞内輸送，シナプス伝達 gi|147903159 GDNF-inducible zinc finger protein 1 37 6 NP_071927 GDNF-inducible zinc finger 転写リプレッサー protein 1 gi|148235651 structural maintenance of 37 7 NP_001002800 structural maintenance of 染色体分離，クロマチン収 chromosomes protein 4 chromosomes protein 4 納・再構成 gi|148226998 glyoxylate reductase/hydroxypyruvate 31 3 NP_036335 glyoxylate reductase/ アミノ酸生合成 reductase hydroxypyruvate reductase gi|148231837 cytochrome P450 30 5 NP_001189784 cytochrome P450 3A4 isoform 2 電子伝達，酸化反応 表 5-7 を参照． 誌上未発表．

90 第 5 章

hemoglobin subunit beta-1 gi|147906883 LOC495053 protein gi|54037970 hemoglobin subunit alpha-2 gi|147902603 hemoglobin subunit alpha-1 gi|122285 fumarylacetoacetase gi|148223115 LOC733209 protein gi|62740095 hemoglobin, gamma G gi|291290905 KCNB2 gi|118384 ornithine decarboxylase 1 gi|147906522 purine nucleoside phosphorylase gi|147898869 similar to carbonic anhydrase II gi|148222055 malate dehydrogenase 2, NAD (mitochondrial) gi|147899037 enolase 3 gi|147904511 family with sequence similarity 64, member A gi|11385422 serine/threonine-protein kinase atr gi|77748240 triosephosphate isomerase gi|148236351 argininosuccinate synthase gi|147900590 MGC82659 protein gi|308153262 aldehyde dehydrogenase 1A gi|148232240 glucose-6-phosphate dehydrogenase gi|4586546 nucleoside diphosphate kinase A1 gi|6225751 14-3-3-like protein gi|148224415 isocitrate dehydrogenase 1 gi|148229659 uncharacterized protein LOC379555 gi|148229471 L-lactate dehydrogenase A chain gi|148226821 L-lactate dehydrogenase B chain gi|148235865 aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1 gi|147898618 fructose-1,6-bisphosphatase 1 gi|112688 cold-inducible RNA-binding protein B gi|148236091 malate dehydrogenase, cytoplasmic gi|148228255 cofilin-1-B gi|148223868 regucalcin (senescence marker protein-30) gi|7416136 alanine-glyoxylate aminotransferase gi|148234619 aldo-keto reductase family 1, member C1 gi|147902535 homogentisate 1,2-dioxygenase gi|32450739 carbamoyl-phosphate synthase 1, mitochondrial gi|148230238 増加（グループ1，量比 > 1.25） selenium-binding protein 1-B gi|147906867 epoxide hydrolase 2, cytoplasmic gi|148230659 変化なし MGC83388 protein gi|11035016 00 eukaryotic translation elongation factor 2, gene 1 gi|148236059 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating gi|147907224 減少（グループ3，量比 < 0.8）

蛋白質 glucose-6-phosphate isomerase gi|148232692 glutamate dehydrogenase 1 gi|148234425 SMARCA5 gi|147900682 MGC83376 protein gi|148229158 transaldolase 1 gi|147905276 transketolase-like 2 gi|148237546 LOC495840 protein gi|10197483 MGC80314 protein gi|21952442 aldolase B, fructose-bisphosphate gi|147904364 glutathione S-transferase mu gi|55824753 betaine--homocysteine S-methyltransferase 1 gi|147907284 uncharacterized protein LOC398893 gi|147899575 prostaglandin D2 synthase, hematopoietic a gi|9910617 allantoicase gi|147902599 UDP-glucose pyrophosphorylase 2 gi|148234947 transketolase gi|148223641 catalase, gene 2 gi|147898737 arginase 1 gi|118136396 catalase, gene 2 gi|33416812 argininosuccinate lyase gi|148232264 mg:bb02e05 gi|1703127 lymphocyte cytosolic protein 1 (L-plastin) gi|148223127 actin, cytoplasmic type 8 gi|64647 serum albumin B gi|148227690 GTP cyclohydrolase 1 feedback regulatory protein gi|148232311 aldehyde dehydrogenase 9 family, member A1 gi|1065161 lactate dehydrogenase A gi|32450751 Cu-Zn superoxide dismutase C-terminal fragment gi|148233713 LOC398623 protein gi|148230001 nucleolar and spindle-associated protein 1-A gi|148231271 superoxide dismutase [Cu-Zn] B gi|120577551 glyoxylate reductase/hydroxypyruvate reductase-like protein gi|148222492 glutathione S-transferase gi|16332351 uncharacterized protein LOC495316 gi|148237649 annexin A13 gi|113571 elongation factor 1-alpha, somatic form gi|148226440 MGC82879 protein gi|148233183 sorbitol dehydrogenase gi|147902842 prosaposin precursor gi|148236249 MGC69098 protein gi|33585701 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 量比（低温曝露/対照）

図 5-9．肝臓蛋白質の量比分布 対照と低温曝露で同定された肝臓蛋白質について，相対定量解析を実施し，蛋白質量に おける対照に対する低温曝露の量比を算出した．略語：KCNB2，potassium voltage-gated channel, Shab-related subfamily, member 2；SMARCA5，SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily a, member 5．Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

91 第 5 章

表 5-10．低温曝露で発現量が高い蛋白質（肝臓）：グループ 1

対照a 低温曝露a ヒトホモログ分子 アクセッション 蛋白質名 同定 ペプチド 同定 ペプチド 量比b 番号 RefSeq IDc 蛋白質 機能 スコア 数 スコア 数 gi|147906883 hemoglobin subunit beta-1 421 40 491 62 16.80 NP_000509† hemoglobin subunit beta 酸素運搬 gi|54037970 LOC495053 protein 041 08 052 13 09.79 NP_002696 periplakin 細胞骨格 gi|147902603 hemoglobin subunit alpha-2 252 45 322 58 07.47 NP_000508† hemoglobin subunit 酸素運搬 alpha gi|122285 hemoglobin subunit alpha-1 338 48 403 65 07.13 NP_000508† hemoglobin subunit 酸素運搬 alpha gi|148223115 fumarylacetoacetase 101 07 121 08 07.01 NP_000128 fumarylacetoacetase アミノ酸分解 gi|62740095 LOC733209 protein 035 08 033 07 03.09 NP_004478† Golgin subfamily B ゴルジ体構成 member 1 isoform 2 gi|291290905 hemoglobin, gamma G 211 16 263 24 02.81 NP_000175† hemoglobin subunit 酸素運搬 gamma-2 gi|118384 ornithine decarboxylase 1 039 08 038 12 02.67 NP_004761 potassium voltage-gated 陽イオン輸送 channel subfamily B member 2 gi|147906522 potassium voltage-gated 031 03 038 04 02.64 NP_002530 ornithine decarboxylase ポリアミン生合成 channel, Shab-related subfamily, member 2 gi|147898869 purine nucleoside 090 07 084 05 01.72 NP_000261 purine nucleoside プリン代謝 phosphorylase phosphorylase gi|148222055 similar to carbonic 054 02 057 01 01.48 NP_940986 carbonic anhydrase 13 炭素代謝 anhydrase II gi|147899037 malate dehydrogenase 2, 055 05 096 05 01.37 NP_005909 malate dehydrogenase, トリカルボン酸経路 NAD (mitochondrial) mitochondrial gi|147904511 enolase 3 066 08 072 07 01.37 NP_001967 beta-enolase isoform 1 解糖 gi|11385422 serine/threonine-protein 057 07 057 05 01.29 NP_001175 serine/threonine-protein DNA修復，リン酸化， kinase atr kinase ATR 細胞周期制御 a MASCOT MS/MS ion search における蛋白質同定スコアとペプチド数は，3 回測定のうち最大値 を示す．b 量比（低温曝露/対照）は，値が 1.25 以上または 0.8 未満，変動係数が 30%未満のもの を有意な変化とみなし，太字で表記した．c ヒトホモログがデータベース（NCBI HomoloGene， KEGG Orthology）に登録されていないものは，ヒトの NCBI Reference Sequence（RefSeq）デー タベースに対する相同性検索（BLASTp）で候補分子を選出し，†で示した． Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

表 5-11．低温曝露でのみ検出された蛋白質（肝臓）：グループ 2

アクセッション 同定 ペプチド ヒトホモログ分子 蛋白質名 番号 スコアa 数a RefSeq IDb 蛋白質名 機能 gi|147905834 lysosomal thioesterase PPT2-B 58 11 NP_005146† lysosomal thioesterase PPT2 蛋白質の脂質修飾 isoform a gi|160420189 dopa decarboxylase 32 06 NP_001076440 aromatic-L-amino-acid アミノ酸代謝 (aromatic L-amino acid decarboxylase) decarboxylase isoform 1 gi|147898691 DNA-dependent protein kinase catalytic 33 06 NP_008835† DNA-dependent protein kinase DNA修復，リン酸化， subunit catalytic subunit isoform 1 細胞周期制御 gi|125858908 Unknown (protein for IMAGE:8550378) 30 05 NP_005073† E3 ubiquitin/ISG15 ligase 蛋白質分解 TRIM25 gi|147902854 zinc finger protein 507 31 05 NP_055725† zinc finger protein 507 転写制御 gi|147901600 liver glycogen phosphorylase 35 04 NP_002854 glycogen phosphorylase, liver グリコーゲン代謝 form isoform 1 gi|68534041 LOC733291 protein 55 04 NP_006301 puromycin-sensitive 蛋白質分解 aminopeptidase gi|147907415 ropporin-1-like protein 28 03 NP_001188395† ropporin-1-like protein 未知 gi|148225833 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 54 03 NP_005267 glycerol-3-phosphate リン脂質代謝 (soluble) dehydrogenase [NAD+], cytoplasmic isoform 1 gi|3745759 histone H4 75 03 NP_778224† histone H4 クロマチン収納・再構成 gi|147905626 alcohol dehydrogenase 1C (class I), 35 02 NP_000660 alcohol dehydrogenase 1C 糖代謝 gamma polypeptide gi|37791449 protein tyrosine phosphatase 37 02 NP_002826† tyrosine-protein phosphatase 蛋白質リン酸化， PTP-PEST non-receptor type 12 isoform 1 シグナル伝達，細胞接着， 細胞運動など gi|49115587 LOC443650 protein 32 02 NP_055807 disheveled-associated activator 細胞運動 of morphogenesis 1 a MASCOT MS/MS ion search における蛋白質同定スコアとペプチド数は，3 回測定のうち最大値 を示す．b ヒトホモログがデータベース（NCBI HomoloGene，KEGG Orthology）に登録されてい ないものは，ヒトの NCBI Reference Sequence（RefSeq）データベースに対する相同性検索 （BLASTp）で候補分子を選出し，†で示した． より引用・改変． Nagasawa et al., 2013

92 第 5 章

表 5-12．低温曝露で発現量が低い蛋白質（肝臓）：グループ 3

対照 低温曝露 ヒトホモログ分子 アクセッション 蛋白質名 同定 ペプチド 同定 ペプチド 量比 番号 RefSeq ID 蛋白質 機能 スコア 数 スコア 数 gi|33585701 MGC69098 protein 049 03 043 02 0.631 NP_005882 acetyl-CoA 蛋白質アセチル化 acetyltransferase, cytosolic gi|148236249 prosaposin 074 06 056 03 0.677 NP_002769† proactivator polypeptide 脂質・脂肪酸輸送 isoform a gi|147902842 annexin A13 075 04 075 03 0.693 NP_001003954 annexin A13 isoform b 細胞分化 gi|148233183 elongation factor 1- 159 08 127 07 0.728 NP_001393† elongation factor 1-alpha 1 翻訳制御 alpha, somatic form gi|148226440 MGC82879 protein 547 29 445 24 0.730 NP_001144 annexin A4 脂質・脂肪酸・ ステロイド代謝 gi|113571 serum albumin B 094 06 103 05 0.750 NP_000468† serum albumin 物質輸送 gi|148237649 sorbitol dehydrogenase 076 08 041 04 0.750 NP_003095 sorbitol dehydrogenase 糖代謝 gi|16332351 glutathione S-transferase 466 21 360 16 0.750 NP_000839 glutathione S-transferase 解毒 mu 2 Mu 2 isoform 1 gi|148222492 uncharacterized protein 203 11 096 08 0.761 NP_001087 ATP-citrate synthase 脂質生合成 LOC495316 isoform 1 表 5-10 を参照． Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

表 5-13．低温曝露でのみ検出されなかった蛋白質（肝臓）：グループ 4

アクセッション 同定 ペプチド ヒトホモログ分子 蛋白質名 番号 スコア 数 RefSeq ID 蛋白質名 機能 gi|148232992 enolase 1 a 105 09 NP_001419 alpha-enolase isoform 1 解糖 gi|148235435 uncharacterized protein 099 06 NP_006750 UTP-glucose-1-phosphate 多糖代謝 LOC398814 uridylyltransferase isoform a gi|148237900 adenosylhomocysteinase B 082 03 NP_000678 adenosylhomocysteinase isoform 1 プリン代謝 gi|50415517 heat shock 70 kDa protein 078 03 NP_006588 heat shock cognate 71 kDa protein 蛋白質折り畳み， isoform 1 ストレス応答 gi|50417653 LOC397850 protein 075 03 NP_005338 78 kDa glucose-regulated protein 蛋白質折り畳み， ストレス応答 gi|288557262 heat shock cognate 70.II protein 071 04 NP_068814† heat shock-related 70 kDa protein 2 蛋白質折り畳み， ストレス応答 gi|159155766 LOC780759 protein 069 05 NP_001128527 transketolase ペントース・リン酸経路， ビタミン代謝 gi|147899332 glucan (1,4-alpha-), branching 063 06 NP_000149 1,4-alpha-glucan-branching enzyme グリコーゲン代謝 enzyme 1 gi|11493740 DNA polymerase epsilon 050 05 NP_006222† DNA polymerase epsilon catalytic DNA修復，細胞周期 subunit A gi|18202614 pterin-4-alpha-carbinolamine 048 02 NP_000272† pterin-4-alpha-carbinolamine mRNA転写， dehydratase dehydratase プテリン代謝 gi|64659 elongation factor 1-alpha 047 03 NP_001393 elongation factor 1-alpha 1 翻訳制御 gi|148233056 pyruvate kinase, liver and RBC 046 02 NP_002645 pyruvate kinase isozymes M1/M2 解糖 isoform a gi|147902366 cathepsin C precursor 039 04 NP_001107645† dipeptidyl peptidase 1 isoform c 蛋白質分解 gi|147905009 pericentriolar material 1 protein 038 09 NP_006188† pericentriolar material 1 protein 中心体会合 gi|71051388 matrix metalloproteinase-18 038 03 NP_002412† interstitial collagenase isoform 1 蛋白質分解 gi|147902026 peroxiredoxin 6 038 03 NP_004896 peroxiredoxin-6 生体防御，抗酸化， 遊離ラジカル除去 gi|147906799 lethal giant larvae homolog 1 036 05 NP_004131 lethal(2) giant larvae protein エクソサイトーシス， homolog 1 ニューロン新生， 外胚葉形成 gi|148222987 glucoside xylosyltransferase 2 035 01 NP_001073862† glucoside xylosyltransferase 2 O-結合型糖鎖 プロセッシング gi|147906817 tumor necrosis factor, alpha- 033 04 NP_006281† tumor necrosis factor alpha-induced 抗アポトーシス，炎症反応， induced protein 3 protein 3 ユビキチン結合経路 gi|148229521 protein CIP2A homolog 032 03 NP_065941 protein CIP2A 未知 gi|147904142 topoisomerase (DNA) II binding 031 15 NP_008958 DNA topoisomerase 2-binding DNA複製，細胞周期， protein 1 protein 1 クロマチン収納・再構成 gi|51703567 MGC84331 protein 031 07 NP_078857 protein FAM184A isoform 1 未知 表 5-11 を参照． より引用・改変． Nagasawa et al., 2013

93 第 5 章

5-3-4. 肝臓における代謝物の変動 肝臓のプロテオーム解析および GO 解析，パスウェイ解析の結果より推定される 代謝物の量的変化を検証した． 低温曝露では，チロシンとフェニルアラニンの代謝に必須なフマリルアセトアセ

ターゼ（fumarylacetoacetase）が増加傾向にあり（図 5-9，表 5-10）， GO 解析におい て‘チロシン異化作用（tyrosine catabolic process）’と‘L—フェニルアラニン異化作 用（L-phenylalanine catabolic process）’が低温曝露群の蛋白質群に有意に関連して いた（図 5-7，表 5-4）．肝臓は芳香族アミノ酸のうち，チロシンとフェニルアラニ ンは分解するが，トリプトファンは分解しない（総説 Dejong et al., 2007）．そこで， 肝臓中の遊離アミノ酸量を比較したところ，低温曝露群のチロシンとフェニルアラ ニンは対照群に比して有意に低くかったのに対し，トリプトファンには差を認めな

かった（図 5-10）．

10 9 * 対照 8 低温曝露 7 *

6 蛋白質） 5

/mg 4

nmol 3 肝遊離アミノ酸量 （ 2 1 0 フェニルアラニン トリプトファン チロシン

図 5-10．肝遊離アミノ酸量 肝遊離アミノ酸量を対照と低温曝露で比較した（各 n=3）． 棒グラフは平均値±標準誤 差を示す．*P<0.05（Student の t 検定）を示す．Nagasawa et al., 2013 より引用・改 変．

GO 解析およびパスウェイ解析において両群に共通して抽出された糖代謝系に着 目し，検出した蛋白質のリストを糖代謝経路へ照合することで，関連する酵素量の

変化を可視化した（図 5-11）．

94 第 5 章

解糖 / 糖新生 グリコーゲン合成 グルコース GYS UDPG GCK G6Pase UGPase GBE

6PGDH 6PG G6PDH G6P PGM G1P グリコーゲン

Ru5P GPI PYGL ペントース GDE Ro5P Xu5P −リン酸経路 F6P グリコーゲン分解 PFK FBPase TKET1 GK FBP グリセロール 3-P グリセロール S7P GAP TKET2 G3Pase FBA GPDH TALD F6P E4P GAP TPI DHAP ALDB F1P FK フルクトース

GAPDH GAK グリセルアルデヒド 1,3BPG

PGK 増加 （グループ1，2） 3PGA 変化なし PGM 減少 （グループ 3，4） 未検出 2PGA

ENO3 ENO1A

PEP PEPCK オキサロ酢酸 アセチル-CoA

PK MDH ACS リンゴ酸 乳酸 LDH ピルビン酸 酵素 リンゴ酸 ACL 酢酸

ピルビン酸 ALDH 代謝 GRHPR アセトアルデヒド TMABADH ACAT ピルビン酸 リンゴ酸 ADH エタノール クエン酸 クエン酸 イソクエン酸 アセチル-CoA

IDH クエン酸 mMDH 回路 α-ケトグルタル酸 ミトコンドリア

図 5-11．低温曝露 24 時間後の肝臓における糖代謝経路の蛋白質量の変化

95 第 5 章

図 5-11（つづき） 図 5-9 および表 5-10 から表 5-13 で示した蛋白質のリストを，KEGG パスウェイの‘Glycolysis / Gluconeogenesis’（ map00010）と‘Pentose phosphate pathway’（ map00030）へ照合し，関連 する酵素量の変化を可視化した．この結果は酵素量の変化であり，基質量の変化を捉えていない． そこで，このパスウェイマップより推定された酵素基質の量的変化を，実際に基質を定量し対照群 と低温曝露群で比較することで検証した（図 5-12 から図 5-16）．基質および酵素の略語は以下であ る：（解糖/糖新生）G6P，グルコース 6-リン酸；F6P，フルクトース 6-リン酸；FBP，フルクトー ス 1,6-ビスリン酸；GAP，グリセルアルデヒド 3-リン酸；DHAP，ジヒドロキシアセトンリン酸； 1,3BPG，1,3-ビスホスホグリセリン酸；3PGA，3-ホスホグリセリン酸；2PGA，2-ホスホグリセ リン酸；PEP，ホスホエノールピルビン酸；GCK，グルコキナーゼ；G6Pase，グルコース-6-ホス ファターゼ；PGI，グルコース-6-リン酸イソメラーゼ；PFK，ホスホフルクトキナーゼ；FBPase， フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ；FBA，フルクトース-1,6-ビスリン酸アルドラーゼ；TPI， トリオースリン酸イソメラーゼ；GAPDH，グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ；PGK， ホスホグリセリン酸キナーゼ；PGM，ホスホグリセリン酸ムターゼ；ENO，エノラーゼ；PEPCK， ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；PK，ピルビン酸キナーゼ；MDH，リンゴ酸デヒ ドロゲナーゼ；LDH，乳酸デヒドロゲナーゼ；ACL，ATP-クエン酸シンターゼ；ACS，アセチル-CoA シンターゼ；ALDH，アセデヒドデヒドロゲナーゼ；ADH，アルコールデヒドロゲナーゼ；（ペント ースリン酸経路）6PG，6-ホスホグルコネート；Ro5P，リボース 5-リン酸；Ru5P，リブロース 5-リン酸；Xu5P，キシルロース 5-リン酸；S7P，セドヘプツロース 7-リン酸；E4P，エリトロー ス 4-リン酸；G6PDH，グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ；6PGDH，6-ホスホグルコネートデ ヒドロゲナーゼ；TKET，トランスケトラーゼ；TALD，トランスアルドラーゼ；（グリコーゲン代 謝）G1P，グルコース 1-リン酸；UDPG，ウリジン二リン酸グルコース；PGM，ホスホグルコムタ ーゼ；UGPase，グルコース ピロホスホリラーゼ；GYS，グリコーゲンシンターゼ；PYGL，グリ コーゲンホスホリラーゼ；GBE，グリコーゲン分枝酵素；GDE，グリコーゲン脱分枝酵素；（その 他）Glycerol-3-P，glycerol-3-リン酸；F-1-P，フルクトース-1-リン酸；GK，グリセロールキナー ゼ；G3Pase，グリセロール-3-リン酸；GPDH，グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ；FK，フ ルクトキナーゼ；ALDB，フルクトース-bis リン酸アルドラーゼ B；GAK，グリセルアルデヒドキ ナーゼ；GRHPR，グリオキシル酸還元酵素/ヒドロキシピルビン酸還元酵素；TMABADH，4-トリ メチルアンモニオブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ；ACAT，アセチル-CoA アセチルトランスフ ェラーゼ；mMDH，ミトコンドリア MDH；IDH，イソクエン酸デヒドロゲナーゼ． Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

96 第 5 章

グリコーゲン合成・分解経路において，グリコーゲン合成系酵素である 1,4α—グ ルカン分岐酵素（1,4-alpha-glucan branching enzyme：GBE）とウリジン二リン酸グ ルコースピロホスホリラーゼ（UDP-glucose pyrophosphorylase：UGPase）は低温曝 露により減少し，グリコーゲン分解の律速酵素であるグリコーゲンホスホリラーゼ

（glycogen phosphorylase：PYGL）は増加した．したがって，低温曝露時にはグリ コーゲン合成は抑制され，グリコーゲンの分解が促進されると考えられた．そこで， 対照群と低温曝露群で肝グリコーゲン量を比較すると，低温曝露群では対照群の約

70%と低値傾向にあった（図 5-12）．

140 P=0.058 120

） 100

80

組織湿重 60

mg/g 40

肝グリコーゲン量 （ 20

0 対照 低温曝露 図 5-12．肝グリコーゲン量 肝グリコーゲン量を対照と低温曝露で比較した（各 n=4）． 棒グラ フは平均値±標準誤差を示す．P 値は Student の t 検定による． Nagasawa et al., 2013 より引用・改変．

97 第 5 章

グリコーゲンは PYGL によってグルコース 1—リン酸（glucose 1-phosphate：G1P） に分解された後，ホスホグルコムターゼ（phosphoglucomutase：PGM）によりグル コース 6—リン酸（glucose 6-phosphate：G6P）に変換され，最終的に以下に挙げる 代謝経路に利用される（図 5-13）．

（1）解糖：ATP，NADP 産生のための燃料として利用される． （2）グルコース産生：グルコースに変換され，エネルギー源として全身の組織に 供給される． （3）他の物質の生合成：炭素源として利用される． （4）ペントース–リン酸経路：酸化的経路の出発基質として利用される．

(2) グルコース産生 グルコース

合成 (4) ペントース グリコーゲン −リン酸経路 G6P

分解 解糖

(3) その他の物質 糖新生 の生合成 ピルビン酸

(1) 解糖： エネルギー源

図 ．肝臓におけるグルコースの利用 5-13

これらの各経路について，蛋白質量の変化および GO，パスウェイ解析を参照し， さらに一部は代謝物を測定することで検証した．

（1）解糖：解糖系の律速酵素であるピルビン酸キナーゼ（pyruvate kinase：PK） が低温曝露で減少していた（図 5-11，表 5-13）．

98 第 5 章

（2）グルコース産生：PYGL が低温曝露で増加していた（図 5-11，表 5-11）．耐 凍性を有するアメリカアカガエル（Rana sylvatica）は ，冬季に肝臓で PYGL の発現 が上昇し，耐凍性物質としてグルコースをグリコーゲンから産生する（Kiss et al., 2011）．肝細胞で産生されたグルコースは，細胞膜上のグルコーストランスポータ ーを介した促進拡散により血中に移動するため，肝臓でグルコース産生が亢進する

と，肝臓と血中の両方でグルコース量が増加する（総説 Nordlie et al., 1999）．そこ で，肝臓中と血漿中のグルコース量を測定した（図 5-14）．低温曝露群の肝臓中グ ルコース量は対照群の約半分と有意に低かった．一方，低温曝露群の血漿グルコー

ス濃度は対照群の約 3.5 倍と有意に高かった．

140 12 A * B *

120 10 ） 100 8

80 ） 蛋白質 6

60 mM （

40 4

nmol/mg

肝グルコース量 （ 20 血漿グルコース濃度 2

0 0 対照 低温曝露 対照 低温曝露 図 5-14．肝臓および血漿中のグルコース量 肝臓（各 n=3）（ A）および血漿中（各 n=5）（ B）のグルコース量．棒グラフは平均値 ±標準誤差を示す．*P<0.05（Student の t 検定）を示す．Nagasawa et al., 2013 より 引用・改変．

（3）物質の生合成：G6P から合成される物質にグリセロールがある．凍結回避能 をもつキュウリウオ（Osmerus mordax）では，低温によりグリセロール産生が誘導 され血漿中に蓄積する（Driedzic et al., 2006）．また，耐凍性をもつ陸棲ガエルのハ イイロアマガエル（Hyla versicolor や Hyla chrysoscelis）は，大量のグリセロールを 耐凍性物質として産生する（Schmid, 1982; Irwin and Lee, 2003）．これらの種は，肝 グリコーゲンをグリセロール合成の炭素源として用いている．この合成経路では，

ジヒドロキシアセトンリン酸（dihydroxyacetone phosphate：DHAP）がグリセロー

99 第 5 章

ル–3–リン酸デヒドロゲナーゼ（glycerol-3-phosphate dehydrogenase：GPDH）により グリセロール–3–リン酸（glycerol 3-phosphate：G3P）へと変換され，次いでグリセ ロール–3–ホスファターゼ（glycerol-3-phosphatase：G3Pase）によりグリセロールへ と変換される．この経路に着目すると，質量分析では低温曝露により GPDH が増 加していた（図 5-11，表 5-11）．これより，低温曝露群ではグリコーゲンはグリセ ロールの産生に利用されている可能性が示唆された．そこで，肝臓と血漿中のグリ

セロール量を対照群と低温曝露群で比較したところ，差を認めなかった（図 5-15）．

A 1.6 B 160

） 1.2 120 ）

0.8 80

組織湿重

μM （

0.4 40

μmol/g

肝グリセロール量

（ 血漿グリセロール濃度 0.0 0 対照 低温曝露 対照 低温曝露

図 5-15．肝臓および血漿中のグリセロール量 肝臓（A）（各 n=4）および血漿中（B）（各 n=4）のグリセロール量．棒グラフは平均 値±標準誤差を示す．*P<0.05（Student の t 検定）を示す．Nagasawa et al., 2013 よ り引用・改変．

（4）ペントース–リン酸経路：パスウェイ解析では‘ペントース–リン酸経路 （pentose phosphate pathway）’が対照群と低温曝露群の肝臓蛋白質群に共通して関 連しており，GO 解析ではペントース–リン酸経路が担う‘ペントース生合成 （pentose biosynthetic process）’が低温曝露の蛋白質群特異的に有意に関連していた （図 5-7，表 5-4，表 5-5）． これより，低温曝露群ではペントース–リン酸経路が亢 進している可能性が考えられた．ペントース–リン酸経路の酸化的経路では NADP から NADPH が生成される（総説 Wamelink et al., 2008）．そこで，肝 NADP，NADPH 量を対照群と低温曝露群で比較したところ差を認めず，肝 NADPH/NADP 比にも差 を認めなかった（図 5-16）．

100 第 5 章

A 12 B 8 ）

9 ） 6

量 量

6 4

組織湿重

組織湿重

NADP

NADPH 肝

3 肝 2

nmol/g

nmol/g

（ （ 0 0 対照 低温曝露 対照 低温曝露 図 5-16．肝臓中の NADP および NADPH 量 肝臓中 NADP（A）および NADPH 量（B）（各 n=4）． 棒グラフは平均値±標準誤差を 示す． （ の 検定）を示す． より引用・改変． *P<0.05 Student t Nagasawa et al., 2013

5-4. 考察

5-4-1. 低温曝露による血球減少の分子機序 低温曝露により肝臓でヘモグロビンサブユニット鎖の増加を認めた．試料調製の 際には脱血により肝臓片から赤血球を除去していることから，検出されたグロビン は肝臓中の赤血球由来ではない．哺乳類の知見では，赤血球が貪食細胞により貪 食・破壊されると，赤血球中のヘモグロビンはグロビンとヘムに分解され，ヘムは

さらにヘムオキシゲナーゼ（hem oxygenase 1：HOMX1）とビリベルジン還元酵素 （biliverdin reductase：BLVRA）の作用により鉄とビリルビンに分解される．鉄は 貪食細胞内や肝細胞内でフェリチン鉄やヘモシデリン鉄として貯蔵される．5℃曝 露 1 日目の肝臓では，HOMX1 と BLVRA の mRNA 発現量の有意な上昇とフェリチ ン鉄の増加を認めることから，赤血球破壊に伴うヘモグロビンの分解が亢進してい

る（Maekawa et al., 2012）．以上から，本結果は破壊赤血球由来のヘモグロビンお よびその分解産物であるグロビンの増加を検出したものであり，赤血球破壊の亢進 を支持する．また，血漿蛋白質では，低温曝露によりヘモグロビンサブユニット鎖 が増加しており，赤血球が血管内で溶血している可能性が示唆される．また，イム

ノグロブリン M と補体 I 因子が減少傾向にあった．赤血球の肝臓における貪食や 血管内溶血に抗体や補体が関与している可能性がある．

101 第 5 章

血漿蛋白質では，低温曝露により α2-マクログロブリン，フィブリノーゲン α 鎖 の減少を認めた．また，フィブリノーゲンの β 鎖およびアンチロトンビン III が減 少傾向にあった．これらの症状は，播種性血管内血液凝固症候群（disseminated intravascular coagulation syndrome：DIC）に見られる検査項目の傾向と一致する（「最 新 臨床検査項目辞典」監修：櫻林郁之介・熊坂一成）．DIC は血管内で広範に血 液凝固がおこる症候群である．低温曝露による急速な栓球数減少の一因は，血管内

血液凝固による栓球の消費である可能性がある．

赤血球減少 栓球減少

表現型解析 ・遺伝子 赤血球破壊 ↑ 未実施 ・組織像 肝貯蔵鉄量 ↑ （Maekawa et al., 2012）

プロテオミクス ヘモグロビン ↑ α2-マクログロブリン ↓ ・血漿蛋白質 抗体 ↓ アンチトロンビン ↓ 補体 ↓ フィブリノーゲン ↓

該当するヒト疾患 血球貪食症候群 播種性血管内凝固症候群 自己免疫性溶血性貧血

血球減少機序に関する • 血管内溶血も一因？ • 末梢での血液凝固による 仮説 • 抗体・補体が貪食・溶血に関与？ 消費の亢進が一因？

図 5-17．血漿蛋白質の変動からみる血球減少機序 ↑：亢進・増加，↓：減少を示す．

5-4-2. 低温曝露により肝臓内で誘導される初期応答 パスウェイ解析において肝臓蛋白質群に有意に関連している糖代謝系に着目す

ると，低温曝露群の肝臓では，グリコーゲン分解酵素（PYGL）の増加とグリコー ゲン合成系酵素（GBE）の減少を認め，実際に肝グリコーゲン量は減少していた． グリコーゲンは主に（1）解糖または（2）グルコース産生に利用されるほか，（3） グリセロールなどの生合成，（4）ペントース–リン酸経路に利用される．質量分析 では，解糖系律速酵である PK が減少しており，解糖は抑制されていると考えられ る．しかし，他の解糖系律速酵素であるグルコキナーゼとホスホフルクトキナーゼ

は今回検出されていないため（それぞれ図 5-11 中の GCK と PFK），これらの発現 量や活性，また解糖の代謝産物であるピルビン酸や乳酸を測定し，結論付ける必要

102 第 5 章

がある．通常，肝グリコーゲンから産生されるグルコースは，エネルギー源として

全身の組織に供給されるほか，耐凍性を有するアメリカアカガエル（Rana sylvatica） やウシガエル（Rana catesbeiana）では耐凍物質として利用される（Storey and Storey, 1984; Steiner et al., 2000）．凍結回避能を有するキュウリウオ（Osmerus mordax）や 耐凍性を有するハイイロアマガエル（Hyla versicolor，Hyla chrysoscelis）は，冬季 に肝グリコーゲンからグリセロールを産生し，それぞれ凍結防止物質や耐凍物質と

して利用する（Driedzic et al., 2006; Schmid, 1982; Irwin and Lee, 2003）．低温曝露し たアフリカツメガエルでは，肝グルコース量は減少し，肝グリセロール量と血漿グ リセロール濃度には差を認めなかったことから，グリコーゲンはグルコースおよび グリセロールの産生には利用されていないと考えられる．この結果は，アフリカツ メガエルが耐凍性や凍結回避能を有さないことから合理的である．一方，血漿中の グルコース濃度は低温曝露で上昇していた．これは，低体温化による末梢組織の基 礎代謝量の減少と循環赤血球の減少により，末梢組織および血中でのグルコース消

費量が減少したためと考えられる．ペントース–リン酸経路の酸化的経路では NADP から NADPH が生成される（Wamelink et al., 2008）．ところが，肝 NADP， NADPH 量，NADPH/NADP 比には差を認めなかった．5°C 曝露 1 日目の肝臓では， 赤血球の破壊が亢進し，鉄染色においてフェリチン鉄を認める（Maekawa et al., 2012）．正常状態では，フェリチン鉄の貯蔵密度は染色感度より低く，鉄染色でフ ェリチン鉄を認められない．したがって，低温曝露時の肝臓は鉄過剰状態である．

鉄過剰状態は活性酸素の産生に寄与し，酸化ストレスを上昇させる（総説 Bacon and Britton, 1990）．細胞内 NADPH は酸化ストレス耐性および酸化還元状態の恒常性の 維持に重要である．以上を踏まえると，低温環境に曝されたアフリカツメガエルの 肝臓では，赤血球破壊の亢進に起因する鉄過剰状態が招く酸化ストレスに対応して

抗酸化物質を供給するために，グリコーゲン分解を亢進し，NADPH 産生を維持し ていると考えられる（図 5-18）．なお，ラットの培養肝細胞や肝内皮細胞では低温 下で活性酸素種を介してアポトーシスが誘導される（Rauen et al., 1999）．酸化スト レスに対応した NADPH 産生の維持は，低温そのものに対する肝細胞の応答を含む 可能性がある．

103 第 5 章

赤血球破壊

鉄の集積

酸化ストレス ? 抗酸化物質 グルコース

バランス を維持 NADPH NADP 合成 供給 UGPase ペントース リン酸 ? GBE − G6P グリコーゲン ? 経路 PYGL 分解 ENO1A

解糖 PK 糖新生

ピルビン酸

図 5-18．アフリカツメガエル肝臓における低温曝露に対する初期応答の概念モデル アフリカツメガエルでは，低温曝露により末梢血中の循環赤血球は急速に肝臓に移行し破壊され る．そのため，肝臓では破壊赤血球のヘモグロビンに由来する鉄が過剰に集積し，酸化ストレスを 生じている可能性がある．糖代謝系に着目すると，肝グリコーゲンが分解され，その経路は解糖や 糖新生，グリセロール生合成ではなく，NADPH を供給するペントース–リン酸経路であると考えら れる．低温曝露で誘導されるこのパスウェイは，鉄過剰による酸化ストレスの抑制にはたらいてい る可能性がある．基質と酵素の略語は図 5-12 と同一である．Nagasawa et al., 2013 より引用・改 変．

5-4-3. プロテオミクスにおける分析方法の改善 本章では，血漿と肝臓抽出物の可溶性画分をそれぞれ 91 個と 145 個の蛋白質を 同定した．そして，血漿では 29 個，肝臓では 58 個の蛋白質の存在量の変動を検出 した．しかしながら，蛋白質数が少ないために，変動した蛋白質群特異的に有意に

濃縮される GO:BP およびパスウェイを見出せなかった．GO 解析およびパスウェ イ解析をより有効にするには，蛋白質の同定数を向上させる必要がある．本研究に おける質量分析用試料の調製では，トリプシン消化の前後に予め蛋白質やペプチド

を分画せずに LC–MS/MS 分析を行った．また，IBA 機能（第 4 章参照）を使用し

104 第 5 章

ていない．質量分析計における IBA 機能の使用や次のような処理の実施により， 蛋白質の同定数の向上が期待できる． 血漿や血清ではアルブミンやグロブリンを含む主要 22 蛋白質が全蛋白質の約 99%を占め，蛋白質濃度のダイナミックレンジは 10 桁以上である（Tirumalai et al., 2003）．そのため，主要蛋白質が優先的に検出されてしまう．このような場合，主 要な血液蛋白質に対する抗体を固定化したアフィニティーカラムによって主要蛋 白質を除くことで，蛋白質同定数が向上する．ヒト，マウス，ラットの主要血液蛋 白質を除去するためのカラムが市販されている．また，トリプシン消化前の分析試 料中の蛋白質を，一次元電気泳動や液体クロマトグラフィーの単独または組合せで 事前に分画することも有効である．たとえば，マウス肝臓では，これらの方法で

7,000 以上の蛋白質の同定に成功している（Shi et al., 2007; Lai et al., 2008）． 血漿蛋白質については，抗アフリカツメガエル血漿蛋白質カラムの使用を検討し

た（総説 永澤ら，2014）．筆者の所属研究室において，前田らは，全血漿をウサギ に免疫すれば存在量の多い蛋白質から優先的に抗体が産生されると仮定し，抗アフ リカツメガエル全血漿ウサギ抗体を自製した．次いで，この抗体を固相化したカラ

ム（第 1 カラム）に素通りするカエル血漿成分を別のウサギに免疫して新たな抗体 カラムを作製し（第 2 カラム），さらに，第 1・第 2 カラム両方に素通りした画分 を新しいウサギに免疫して第 3 カラムを作製した．筆者は，これら 3 種類のカラム にアフリカツメガエルの血漿を順次処理し，吸着画分と素通り画分を LC-MS/MS 分析に供した．その結果，アルブミン，イムノグロブリン，トランフェリンなどを

含む約 98%の蛋白質が吸着画分に回収され，除去できることがわかった．さらに， カラム処理により，蛋白質同定数は約 1.5 倍に向上した．この方法は，細胞や組織 試料中の血液蛋白質を夾雑物としてみなして除去する必要がある場合も利用可能

である．

105 第 6 章

第 6 章 総括と展望

6-1. 本研究の総括 造血生理は脊椎動物に共通した生命維持機構である．したがって，様々な種にお いて造血生理を比較し普遍性と多様性を解明することで，その理解を深耕すること ができる．しかし，造血生理に関する多くの知見は，臨床との繋がりから哺乳類で あるヒト，マウスに限られてきた．そこで本研究では，両生類であるアフリカツメ ガエルの造血生理に関与する蛋白質群の生物学的特性を解析した．すなわち，まず

造血因子 EPO の分子性状と構造について解析し，さらに EPO を含めた蛋白質群の 調節系に対象を広げ，血液・造血系の低温環境応答における蛋白質群の量的変動を

解析した．

6-1-1. EPO の分子性状と構造活性相関 EPO の遺伝子配列は，約 80 種もの生物で明らかとなっているが．哺乳類以外で EPO が赤血球産生にはたらくことが示されているのは，アフリカツメガエル，ゼ ブラフィッシュ，キンギョのみである．また，EPO の分子性状や構造活性相関に ついてはヒトで明らかとなっているのみであり，哺乳類以外の EPO では不明であ った．そこで，アフリカツメガエルの EPO の分子性状と構造活性相関を明らかに することを目的とした． 研究を進めるにあたり，xlEPO の検出系が不可欠であった．そこで，xlEPO に対 する抗体を複数作製し，免疫学的手法による xlEPO の検出を可能とした（第 2 章）． そして，得られた抗体のうち，huEPO の受容体結合部位に相同な領域を含む抗原 ペプチドに対する抗体は中和活性を有し，この部位は xlEPO においても活性に重要 な領域であることが示唆された．xlEPO と huEPO は一次構造の相同性が約 38%と 低いにも関わらず交差活性を示す（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．一方で，xlEPO に は哺乳類に共通する 3 か所の N 結合型糖鎖付加部位がない（Nogawa-Kosaka et al., 2010）．そこで，この性質に着目して，huEPO との相同部位（Asn24，Asn38，Asn83）

106 第 6 章

に導入した N 結合型糖鎖が xlEPO の物理化学的性質と in vitro 生物活性に与える影 響を調べ，分子性状と構造活性相関について考察した（第 3 章）．野生型および糖 鎖付加 xlEPO を COS-1 細胞で発現させたところ，Asn24，Asn38 には問題なく糖鎖 が付加されたが，Asn83 には付加されない分子を認めた．これより，huEPO と xlEPO の立体構造は，24 位，38 位周辺は保存されているが，83 位周辺は異なると考えら れた．陽イオン交換または疎水性クロマトグラフィーでの分画により，野生型 xlEPO は huEPO よりも塩基性および疎水性が高いこと，糖鎖付加により塩基性は 低下し親水性が上昇することがわかり，野生型 xlEPO は内分泌よりも傍分泌に適し ていると考えられた．糖鎖付加により xlEPO の in vito 生物活性は消失しないこと から，xlEPO の活性領域は huEPO と同様に 24，38 位周辺以外に位置すると考えら れた．また，糖鎖付加は xlEPOR に対する xlEPO のエフィカシーを減少させるが huEPOR に対するエフィカシーには影響を与えないことから，導入した糖鎖は xlEPO-xlEPOR の立体配置には干渉するが，xlEPO-huEPOR の立体配置には干渉し ないことが示唆された． 以上を通し，EPO の分子性状と構造活性相関に関して，アフリカツメガエルと ヒトでは，物理化学的性質は異なるものの立体構造と活性領域が保存されている可

能性，シグナル伝達に最適な EPO-EPOR の立体配置は異なる可能性を示した．

6-1-2. 造血の低温環境応答 温度は生物が常に曝される外部環境の一つであり，生物は環境温度の変化や高 温・低温環境といった外部ストレスに対して応答し，内部環境である体内の恒常性 を維持する必要がある（温度環境応答）．血液・造血系も例外ではなく，様々な生 物において，季節性にあるいは低温環境下で末梢血球数が変動することが報告され ている．しかし，末梢血球数の変動に至る機序や末梢血球数の変動に連鎖する生体

内反応はほとんど理解されていない．アフリカツメガエルは 5°C の低温環境下にお いて汎血球減少を呈し，赤血球減少は肝臓における赤血球破壊の亢進が一因である

ことが示されている（Maekawa et al., 2012）．そこで，本研究では，低温環境下に おける血球減少の分子機序および血球減少に連鎖して誘導される造血巣の初期応

答に関する仮説生成の糸口を得ることを目的とした．そして，2010 年にネッタイ

107 第 6 章

メツガエルで全ゲノム解読が達成され，ツメガエルにおけるプロテオミクスの重要

性が高まっていたことから，仮説生成の手段としてプロテオミクスを採用した． 研究を開始するにあたり，アフリカツメガエルはゲノム解読の途上にあり，プロ テオミクスが有効である確証がなかった．そこで，まず，アフリカツメガエルとネ ッタイツメガエルの血漿蛋白質を分析し，比較することでその有効性を検証した

（第 4 章）．その結果，蛋白質同定数に大差はなく，遺伝子オントロジーの注釈が 付与されている蛋白質が占める割合はアフリカツメガエルの方が高かった．以上よ り，プロテオミクスで同定した蛋白質群から生物学的解釈を通して仮説生成に至る にはアフリカツメガエルの方が適していると考え，低温環境下のプロテオーム変動

の解析へ進んだ（第 5 章）．造血・代謝器官である肝臓と構成蛋白質の変動が生理 状態を反映する血漿を対象に，LC–MS/MS 分析による蛋白質の網羅的同定と量比 解析，遺伝子オントロジー解析とパスウェイ解析を実施し，対照（22°C 飼育）と 低温曝露（5°C，24 時間飼育）で比較した． 低温曝露の血漿では，ヘモグロビンサブユニット鎖の増加を認め，イムノグロブ リンと補体が減少傾向にあったことから，赤血球減少は破壊亢進のほか溶血にも起

因し，抗体や補体が関与する可能性があると考えられた．また，α2–マクログロブ リンとフィブリノーゲンの減少を認め，アンチトロンビンは減少傾向にあった．ヒ

トにおいては，このような血漿蛋白質の変動を伴う血小板減少が DIC で認められ る．これより，栓球減少は血管内凝固による栓球の消費が一因である可能性がある

と考えられた． 肝臓で誘導される応答に関しては，同定された蛋白質群のパスウェイ解析におい て対照と低温曝露に共通して抽出された糖代謝系に着目した．まず，低温曝露では 解糖系律速酵素とグリコーゲン合成系酵素の減少，グリコーゲン分解律速酵素の増 加を認めたことから，解糖は抑制され，グリコーゲン分解が亢進していると考えた． そして，肝臓中グリコーゲン量を比較し，低温曝露では低値傾向にあることを確認 した．そこで，次に，グリコーゲンの用途について調べた．グリコーゲンは分解後

に G6P となり，主に解糖とグルコース産生に利用される．肝臓中グルコース量を 比較すると低温曝露で有意に低く，解糖とグルコース産生には利用されないと考え

られた．他には，ペントース–リン酸経路における NADPH 産生への利用が挙げら

108 第 6 章

れる．しかし，肝臓中 NADPH 量には対照と低温曝露で差を認めなかった．酸化ス トレスが生じるとき，NADPH は抗酸化物質の供給に消費される．そして，肝臓の 組織所見では，低温曝露において鉄の集積を認めることから酸化ストレスが生じて いると考えられる．これらをふまえると，低温環境に曝されたアフリカツメガエル の肝臓では，破壊赤血球に由来する鉄の集積で生じる酸化ストレスに対応して抗酸

化物質を供給するために，グリコーゲンの分解を亢進させ NADPH 産生を維持して いる，と考えると合理的である． 以上を通し，血液・造血系の低温環境応答として，アフリカツメガエルにおける 低温環境下での血球減少機序と肝臓における赤血球破壊亢進に連鎖する生体反応

ついて仮説生成につながる知見を得た．マウスでは，5°C の低温環境下で末梢赤血 球数が増加する（Maekawa et al., 2013）． これは酸素消費量の増大に伴う低酸素状 態により腎臓での EPO 発現が増加し，骨髄と脾臓における赤血球産生が亢進する ことによる．したがって，血液・造血系は低温環境に応答して生物ごとに固有な調

節を受ける．本血球ではその一旦を示した．

6-2. 今後の課題と展望

6-2-1 EPO の分子性状 野生型 xlEPO と糖鎖付加 xlEPO は，それぞれ臓器内拡散による傍分泌と血液循 環を介した内分泌に適した分子性状を有していることが明らかとなった．野生型 xlEPO と糖鎖付加 xlEPO の in vivo での生物活性や動態を実際に調べることで，作 用様式の理解を深めることができる． 脊椎動物間で EPO の糖鎖修飾の有無や発現分布，赤血球産生部位を比較すると， 種によって様々である．EPO の糖鎖修飾は，生息環境を反映した種ごとの赤血球 産生体系によって異なるのかもしれない．ヒト・マウス成体の主要な赤血球産生部

位は赤色骨髄であるが，胎仔期には肝臓内で EPO の分泌と赤血球産生が同時に行 われている．その後，赤血球産生部位は脾臓，骨髄と移行し，出生後には骨髄が中 心となる．また，大量出血時などには成体においても肝臓や脾臓などの骨髄以外で 造血が生じる（髄外造血）．したがって，造血器は柔軟に変化すると推察される． 一方で，アフリカツメガエルの主要な赤血球産生部位は肝臓であり，骨髄は黄色脂

109 第 6 章

肪髄を呈し，成熟赤血球と白血球がわずかに観察されるのみである（Hadji-Azimi et al., 1987; Okui et al., 2013）． ホルモンなどの液性因子の過剰発現は，その生物個体 に劇的な変化を与える．例えば，成長ホルモンを過剰発現するアフリカツメガエル

は対照個体に比して躰が大きく（Huang and Brown, 2000a），プロラクチンを過剰発 現するアフリカツメガエルは，オタマジャクシから成体に変態後も尾ひれをもち続

けるという驚くべき表現型を示す（Huang and Brown, 2000b）． これらをふまえると， 糖鎖付加 xlEPO をもつトランスジェニックカエルを作出した場合に赤血球産生体 系がダイナミックに変化するかを調べることは興味深い．また，同じ両生類でも半

陸棲のウシガエル（Lithobates catesbeianus）は赤色骨髄を有し，骨髄が赤血球産生 部位とされる（de Abreu Manso et al., 2009）．このウシガエルの EPO 遺伝子は同定 されておらず，糖鎖修飾を含めた EPO 分子の一次構造は未知である．様々な脊椎 動物について，EPO の分子構造と作用様式を調べることで，生物の進化において EPO の分子構造と赤血球産生体系がどのように変化してきたかを知る手掛かりと なるのではないだろうか．

6-2-2. EPO の構造活性相関 N 結合型糖鎖付加 xlEPO の分子性状と in vitro 生物活性の解析を通して，アフリ カツメガエルとヒトで EPO の立体構造と活性領域が保存されている可能性，シグ ナル伝達に最適な EPO-EPOR の立体配置は異なる可能性が示された．xlEPO の活 性領域を明らかにするためには，受容体結合部位と予測されるアミノ酸に変異を導

入し，受容体結合試験で調べる必要がある．また，糖鎖付加の in vitro 生物活性の 影響をより詳しく調べるには，野生型と糖鎖付加 xlEPO で活性化されるシグナル伝 達経路に差異が生じるか調べる必要がある．実際に，TPO 受容体作動薬は，巨核 球の増殖・分化促進という TPO と同一の生物活性を示すが，TPO で活性化される シグナル伝達経路の一部しか活性化しないことが知られている（総説 Imbach and Crowther, 2011）． 最も直接的な方法としては，xlEPO-xlEPOR 複合体，xlEPO-huEPOR 複合体の結晶構造解析により立体構造と結合様式を解明し，huEPO-huEPOR 複合体 と比較することで，結論付けることができる．さらに，このようなアプローチを哺 乳類，鳥類，爬虫類，両生類，魚類と種を跨いで展開することにより，脊椎動物に

110 第 6 章

普遍的な EPO-EPOR の構造活性相関を見出せる可能性がある．rhuEPO は貧血の治 療薬として利用されているが，投与後に抗 huEPO 抗体が発生することで赤血球系 造血前駆細胞の分化・増殖が阻害され，赤芽球癆（選択的に赤血球系のみが減少し，

重症の貧血を呈する造血器疾患）を発症する場合がある（Casadevall et al., 2002; Bennett et al., 2005）．そのために，EPO のアミノ酸配列と相同性を有さない EPOR 作動薬が期待されている．種間での比較を通して，EPO が EPOR を活性化させる のに重要な構造的特徴をアミノ酸配列に依存せずに抽出することができれば，医薬

品の開発に役立出ることができるのではないだろうか．

6-2-3. 造血の低温環境応答 血漿プロテオーム変動の解析により，低温環境下での赤血球減少は破壊亢進のほ か溶血にも起因し，抗体や補体が関与する可能性，栓球減少は血管内凝固による栓 球の消費が一因である可能性を見出した．また，肝臓プロテオームおよび代謝物の 解析から，血球産生（造血），血球破壊，物質代謝が共存する肝臓では，赤血球破 壊亢進に伴う鉄過剰に起因する酸化ストレスに応答し，糖代謝を変動させる可能性 を見出した．しかし，これらは仮説生成の糸口を得たに過ぎず，今後のさらなる検

証が必要である． 血球減少機序に関しては，ヒト臨床における知見を活用することができる．肝臓 における赤血球破壊亢進や抗体・補体が関与する溶血に起因する赤血球減少症は血 球貪食症候群や冷式自己免疫性溶血性貧血に該当し，栓球減少は播種性血管内凝固 症候群に該当する．そこで，まず，低温曝露アフリカツメガエルにこれらの疾患・ 症候群の検査診断方法を適用し，病態との異同を調べていく．そして，同じであれ ば，医学領域の知見を低温曝露アフリカツメガエルに，またその逆に，と双方向に 知見を応用し解析を進めていくことで，病態モデル構築や治療法開発の端緒となる 可能性がある．一方で，異なれば，アフリカツメガエルに固有の制御系と位置づけ て解析を進めていくことで，新たな造血制御機構の発掘につながる可能性がある． このほか，栓球減少に関しては，ヒトおよびマウスの低温保存血小板の知見も参考

になる．4°C の低温で保存した血小板は，細胞膜糖鎖の構造および分布が変化する ために肝マクロファージや肝細胞に補足され，速やかに血液循環から除去されるた

111 第 6 章

めに寿命が短い（総説 Rumjantseva and Hoffmeister, 2010）．5°C に曝露したアフリカ ツメガエルは体内の血液も 5°C になると考えられ，この時の栓球が低温保存血小板 と同様の変化を呈するかを調べることも必要である． 肝臓における反応に関しては，実際に酸化ストレス状態を呈しているか調べる必 要がある．そして，蛋白質量および代謝物量の変動に至る経路を明らかにする必要

がある．アフリカツメガエルでは，8°C 以下の環境温度により下垂体中葉からの α- メラトニン細胞刺激ホルモン（α-melanocyte stimulating hormone：α-MSH）の分泌が 刺激され，5°C で最大となる（Tonosaki et al., 2004）．そして，ヒトでは血漿 α-MSH レベルとインスリン抵抗性の関連がされ（Katsuki et al., 2000），マウスにおいて α-MSH がインスリン抵抗性に寄与することが示されている（Costa et al., 2006）． イ ンスリンは肝臓においてグリコーゲン合成と解糖を促進するため，グリコーゲン合

成の抑制と PK の減少による解糖の抑制は，α-MSH の制御による可能性がある．一 方，酸化ストレス応答を担う転写因子には Nrf2（NF-E2-related factor 2）がある． ヒト，マウスの Nrf2 は酸化ストレスにより活性化し，グルタチオン合成酵素や HMOX1 などの抗酸化ストレス酵素群を誘導するほか，ペントース–リン酸経路の 酸化的経路と非酸化的経路を触媒する酵素群を制御し，NADPH の産生を促進する （Wu et al., 2011; 総説 Hayes and McMahon, 2009; 総説 Motohashi, 2014）． Nrf2 はア フリカツメガエルにおいても酸化ストレス応答にはたらいていることが示されて

いる（Malik and Storey, 2009）．以上より，低温環境下の肝臓における HMOX1 の発 現亢進（Maekawa et al., 2012）や本研究の結果から考えられるペントース–リン酸 経路による NADPH 産生の亢進を Nrf2 が制御している可能性があり，今後の解析 が待たれる． 本研究では血液・造血系に着目して解析を進め，当初はみえなかった血液・造血 系と鉄・糖代謝系が環境変動へ応答するために複雑に連鎖することが示された．そ して，これらは個体レベル（内分泌系など），組織レベル（造血器など），細胞レベ ル（血球や肝細胞など）といった複数の階層における調節・制御系がはたらいた結

果であると考えられ，今後，in vivo と in vitro での解析が必要になる．また，本研 究で得られた蛋白質の変動に関する知見は，なぜ外温動物は体温が 5°C まで低下し ても生存できるのか，という課題にも貢献する可能性がある．このような視点では，

112 第 6 章

多様な動物における低体温時の肝臓におけるプロテオーム変動を比較することが 肝要となる．低体温時の肝臓プロテオームの変動は，低温曝露したヨーロッパヘダ

イ（Sparus aurata）（ Ibarz et al., 2010），冬眠移行時の冬眠哺乳動物（Epperson et al., 2004; Shao et al., 2010; Epperson et al., 2010; Rose et al., 2011），低体温誘導ラット （Oda et al., 2012），冬期の耐凍性アメリカアカガエル（Kiss et al., 2011）などで報 告されている．現時点では，共通して同定されている蛋白質や動物の種類の少なさ により，解釈は得られないが，今後分析法の改善と実施例の増加により可能となる だろう．さらに，内温動物における体温を維持するための低温環境応答と低体温時 の病態，冬眠動物における低体温耐性，外温動物における低温環境応答について個

体，組織，細胞レベルでその機序を明らかにし，比較していくことも重要である．

6-2-4. ツメガエルにおけるプロテオミクス 全ゲノム情報が解析途上にあるアフリカツメガエルにおいて，ゲノムデータベー

スを直接利用せずとも，200 種類以上の蛋白質を同定することができた．そして， 蛋白質量の変動から予想される代謝物量の変化を検証し，生理学的解釈に結び付け ることができた．アフリカツメガエルの生理応答に関するプロテオミクスは，神経

分泌細胞の生合成・分泌過程（van Herp et al., 2008），白色/黒色背景適応（Devreese et al., 2010），化学物質曝露に対する応答（Gillardin et al., 2009; Serrano et al., 2010)， 視細胞外節の集合（Wang et al., 2009），四肢再生（King et al., 2009）等で実施され てきたが，いずれも蛋白質の発現量および構成の変動から解釈を行っているに過ぎ ない．本研究は，肝臓における蛋白質量の変動の解釈に基づき代謝物量を実測する ことで，その一部を実証した．この点において，これまでの研究から進歩したもの であると考えている．しかし，プロテオミクスで得た結果をより有効に活用し，検 証するためには，メタボロミクスを実施し蛋白質量の変動に伴う代謝産物量の変動 も網羅的に調べることが必要である．また，今回はヒト血液疾患で明らかとなって いる血漿蛋白質の変動と肝臓の糖代謝系に絞って解釈したため，蛋白質の量的変動 や構成の変化を検出できていても，解釈に結び付けられていないが多々残されてい る．今回着目しなかった蛋白質について，その変動の意味を個々に検討していくこ

とも必要である．

113 第 6 章

現在では，アフリカツメガエルにおいてもゲノム解読に成功しており，ゲノム情

報が利用可能となっている（総説 Karpinka et al., 2015）．今後，アフリカツメガエ ルやネッタイツメガエルにおいてプロテオミクスを利用した生命現象の理解は 益々発展すると考えられる．本研究により，これを実現するための課題が見えてき

た．5-4-3 では分析方法による蛋白質同定数の少なさについて議論した．より重要 な課題として，両ツメガエル蛋白質におけるアノテーション情報の少なさがある． 本研究では，アフリカツメガエルの同定蛋白質をヒト相同分子に変換し，そのアノ テーション情報を用いて解釈を行った．本来は，ツメガエルの蛋白質付与されたア ノテーションを直接利用できることが望ましく，そのようなシステムを構築するこ とが必要である．このようなゲノムデータベースの質の向上の必要性は，世界的な

ツメガエル研究会が 2014 年に発行した Xenopus Community White Paper 2014 （Xenbase ［http://www.xenbase.org/entry/］より参照可能）にも記されている．なお， アノテーションにはヒトに加えモデル生物として研究蓄積が豊富なマウス，ゼブラ フィッシュ，ショウジョウバエ，線虫などの相同分子・同祖分子の機能と既にツメ ガエルで明らかとなっている機能が利用できるが，同じ蛋白質が生物種間で同一の

機能を有さない場合もあるため，両者を区別することが肝要となる． 現在では，非モデル生物や希少生物のように研究蓄積がない生物であっても，次

世代高速シークエンサーにより全 RNA 配列を得ることで蛋白質同定用に独自デー タベースを構築すればプロテオミクスが可能である．したがって，本研究で用いた 解析手段は多様な生物に適用可能である．今後，こうした解析手段を広範な生物を 対象に波及させることができれば，生物がもつ仕組みの多様性と普遍性についてさ

らなる理解の深耕を期待できるのではないだろうか．

114 第 6 章

6-3. 結語 本研究では，アフリカツメガエル成体の造血生理に関与する蛋白質の生物学的特

性を調べた．まず，アフリカツメガエル EPO の分子性状と構造活性相関について 調べ，分子性状はヒト EPO と異なるものの，その立体構造と活性領域は保存され ている可能性を示した．さらに，EPO をはじめとして様々な蛋白質が調節される と考えられる血液・造血系の低温環境応答に関して，蛋白質群の量的変動を調べた． そして，低温環境下における血球減少の機序とこれに連鎖して肝臓で生じるストレ ス応答についての仮説生成に至り，マウスとは異なる低温環境応答の仕組みを解明 する糸口を得た．これらは，未解明として残る脊椎動物の造血生理における普遍性

と多様性について，僅少ではあるがその一部を明らかにしたものと考えている．

115 謝辞

謝 辞

本論文は，早稲田大学 大学院先進理工学研究科 生命理工学専攻において加藤尚志教授の ご指導のもとに取り組んだ研究をまとめたものです．本研究を遂行し学位論文をまとめるに当 たり，指導教員として終始厳しくも温かい激励とご指導，ご鞭撻を賜りました同教授に心より 感謝申し上げます．また，研究に限らず様々な視点で多くのこと学ばせていただきました．

学位論文審査において，貴重なご教示，ご指導を賜りました早稲田大学 大学院先進理工学 研究科 筒井和義教授，同 中村正久教授，同 客員教授・国立がん研究センター研究所 分 子細胞治療研究分野 落谷孝広主任分野長に深く感謝いたします．

UT-7/EPO 細胞株をご提供いただきました順天堂大学 医学部附属順天堂医院 血液内科 小松則夫主任教授に御礼申し上げます．

液体クロマトグラフ質量分析計の使用に関してご指導，ご協力を頂きました早稲田大学 総 合研究機構 イノベーションデザイン研究所 上田しのぶ客員講師（当時），同 渡会敦子研

究員，早稲田大学 先端生命医科学センター 三好賢太郎博士（当時）に御礼申し上げます．

早稲田大学 分子生理学研究室の皆様には多くのご支援，ご協力をいただきました．小坂展 慶博士，小坂菜美博士には，分子生物学的実験，細胞培養，アフリカツメガエルの採血，血球 鑑別をはじめとした実験手技，研究に対する考え方や姿勢等，様々なことをご指導いただき， また本研究に関して多くの議論とご助言をいただきました．會沢洋一博士，山本雄介博士には， 研究を進めるにあたりご助言をいただきました．上原信明氏にはウサギへの免疫と採血，免疫 学的実験についてご指導いただきました．目黒瑞枝氏には xlEPO の大腸菌発現組換え体を調製 していただきました．須貝龍久氏，別府実穂氏には抗 xlEPO 抗体の性状解析でご協力いただき ました．奥井武仁氏，谷崎祐太氏，佐藤圭氏には実験にご協力いただき，また熱心な議論をい ただきました．同研究室の同期の皆様，特に，共に博士課程に進学した吉岡祐亮氏，奥井武仁 氏には，研究室生活を通して苦楽を共にし，大変お世話になりました．深く感謝いたします．

また，研究を進めるにあたり，ご支援，ご協力を頂きながら，ここにお名前を記すことがで きなかった多くの方々に心より感謝申しあげます．

最後に，これまで常に温かく見守り，辛抱強く支援してくださった両親に心より感謝いたし ます．

116 参考文献

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131 研究業績

研究業績

博士論文の中核を担う主業績には〇印を付して示している。

【論文】 （筆頭） ○ 1. Nagasawa K, Meguro M, Sato K, Tanizaki Y, Nogawa-Kosaka N, Kato T. The influence of artificially introduced N-glycosylation sites on the in vitro activity of Xenopus laevis erythropoietin. PLoS One. 2015 Apr 21;10(4):e0124676.

○ 2. Nagasawa K, Tanizaki Y, Okui T, Watarai A, Ueda S, Kato T. Significant modulation of the hepatic proteome induced by exposure to low temperature in Xenopus laevis. Biol Open. 2013 Aug 23;2(10):1057-1069.

（共著） 3. Hirose S, Takayama N, Nakamura S, Nagasawa K, Ochi K, Hirata S, Yamazaki S, Yamaguchi T, Otsu M, Sano S, Takahashi N, Sawaguchi A, Ito M, Kato T, Nakauchi H, Eto K. Immortalization of erythroblasts by c-MYC and BCL-XL enables large-scale erythrocyte production from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2013 Dec 5;1(6):499-508.

4. Okui T, Yamamoto Y, Maekawa S, Nagasawa K, Yonezuka Y, Aizawa Y, Kato T. Quantification and localization of erythropoietin-receptor-expressing cells in the liver of Xenopus laevis. Cell Tissue Res. 2013 Jul;353(1):153-164.

5. Okamoto M, Kobayashi S, Ikeuchi H, Yamada S, Yamanouchi K, Nagasawa K, Maekawa S, Kato T, Shimizu I. Synthesis and bioassay of a boron-dipyrromethene derivative of estradiol for fluorescence imaging in vivo. Steroids. 2012 Jul;77(8-9):845-849.

6. Nogawa-Kosaka N, Sugai T, Nagasawa K, Tanizaki Y, Meguro M, Aizawa, Maekawa S, Adachi M, Kuroki R, Kato T. Identification of erythroid progenitors induced by erythropoietic activity in Xenopus laevis. J Exp Biol. 2011 Mar;214(Pt 6):921-927.

7. Nogawa-Kosaka N, Hirose T, Kosaka N, Aizawa Y, Nagasawa K, Uehara N, Miyazaki H, Komatsu N, Kato T. Structural and biological properties of erythropoietin in Xenopus laevis. Exp Hematol. 2010 May;38(5):363-372.

【総説】 1. 永澤和道，渡会敦子，谷合正，竹島功将，加藤尚志．プロテオーム解析による比較生物学 的ミッシングリンク探索の実際．比較内分泌学，第 40 巻，No. 153，134-139 頁，2014 年 9 月．

【講演】 （筆頭・口演発表） ○ 1. 永澤和道，谷崎祐太，前川峻，加藤尚志．ツメガエルにおけるプロテオミクスの試行と展 望．第 5 回日本ツメガエル研究集会．熱海，2011 年 10 月．

（筆頭・ポスター発表） ○ 2. 永澤和道，前川峻，谷崎祐太，加藤尚志．低温環境に暴露したアフリカツメガエルの血漿 プロテオミクス（Plasma proteomics of Xenopus laevis exposed to low temperature）．日本動物学 会第 82 回旭川大会．旭川，2011 年 9 月．

132 研究業績

○ 3. 永澤和道，奥井武仁，渡會敦子，上田しのぶ，加藤尚志．アフリカツメガエルの臓器蛋白 質変動の網羅的解析．第 36 回日本比較内分泌学会大会及びシンポジウム．都道府県会館， 2011 年 11 月．

○ 4. Nagasawa K, Beppu M, Miyazaki H, Komatsu N, Kato T. Biological properties of N-glycosylated Xenopus laevis erythropoietin in comparison with the native form. ISEH – Society for Hematology and Stem Cells 39th Annual Scientific Meeting. Melbourne, Australia, Sep, 2010.

○ 5. 永澤和道，須貝龍久，谷崎祐太，前川峻，別府実穂，小坂（野川）菜美，加藤尚志．ツメ ガエルの血中に存在する赤血球産生活性の抗エリスロポエチン抗体による中和．第 35 回日 本比較内分泌学会大会及びシンポジウム．静岡，2010 年 11 月．

○ 6. 永澤和道，小坂（野川）菜美，上原信明，會沢洋一，加藤尚志．N 結合型糖鎖を導入した アフリカツメガエルのエリスロポエチンの生物活性．第 70 回日本血液学会総会．京都，2008 年 10 月．

○ 7. 永澤和道，小坂（野川）菜美，上原信明，會沢洋一，目黒瑞枝，妹尾勇弥，加藤尚志．ア フリカツメガエルのエリスロポエチンを認識する抗ペプチド抗体の作製．日本動物学会関 東支部第 60 回大会．駒場，2008 年 3 月．

（共著・口演発表） 8. 柏瀬奈央，谷崎祐太，永澤和道，前川峻，加藤尚志．低温曝露によるアフリカツメガエル 末梢栓球数減少における栓球膜糖鎖の関与（Analysis of thrombocytopenia at low temperature in Xenopus laevis: Role of cell surface glycans）．日本動物学会第 83 回大会．大阪，2012 年 9 月．

9. Hirose S, Takayama N, Nakamura S, Kato T, Nagasawa K, Sameshima T, Nakauchi H, Eto K. Potential application of an immortalized erythrocyte-producing cell line derived from human pluripotent stem cells. ISSCR (International Society for Stem Cell Research) 10th Annual Meeting. Yokohama, Japan. June, 2012.

10. 廣瀬正一，高山直也，中村壮，加藤尚志，永澤和道，鮫島正，中内啓光，江藤浩之．ヒト 多能性幹細胞由来不死化赤芽球株の樹立．第 11 回日本再生医療学会総会．横浜，2012 年 6 月．

11. 目黒瑞枝，永澤和道，小坂（野川）菜美，安達基泰，岡崎伸生，玉田太郎，黒木良太，加 藤尚志．赤血球造血因子エリスロポエチンの結晶構造から見える受容体結合部位の種間保 存．第 36 回日本比較内分泌学会大会及びシンポジウム．都道府県会館，2011 年 11 月．

12. 谷崎祐太，吉岡祐亮，永澤和道，小坂展慶，落谷孝広，小松則夫，加藤尚志．ヒト白血病 細胞株における網羅的遺伝子発現プロファイリング（Global gene expression profiling of human leukemia cell lines）．第 73 回日本血液学会学術集会．名古屋，2011 年 10 月．

13. 目黒瑞枝，別府実穂，永澤和道，安達基泰，岡崎伸生，玉田太郎，黒木良太，加藤尚志． ツメガエルエリスロポエチンの性状解析と分子構造の進化的保存性（ Molecular characterization of Xenopus erythropoietin and evolutionary conservation of its structure）．第 73 回 日本血液学会学術集会．名古屋，2011 年 10 月．

14. Iwai K, Nagasawa K, Kato T, Minamisawa S. Nov is a novel protein secreted by prostaglandin E2 stimulation from the rat ductus arteriosus. The 7th Japan-China-Korea Pediatric Heart Forum. Fukuoka, Japan. July, 2011.

133 研究業績

15. 前川峻，家村仁美，永澤和道，神保杏林，加藤尚志．ツメガエルにおける赤血球産生の低 温応答．第 35 回日本比較内分泌学会大会及びシンポジウム．静岡，2010 年 11 月．

16. 谷崎祐太，田原彩香，目黒瑞枝，永澤和道，山内志毅，木下紗也香，前川峻，岩田（石田） 貴子，小渕（下地）美也子，加藤尚志．トロンボポエチン様分子の刺激に応答するアフリ カツメガエル栓球前駆細胞の性質（Cellular features of thrombocytic progenitors responding to thrombopoietin-like molecule in Xenopus laevis）．第 72 回日本血液学会学術集会．横浜，2010 年 9 月．

17. 須貝龍久，前川峻，永澤和道，小坂（野川）菜美，前田康隆，山崎俊介，會沢洋一，加藤 尚志．アフリカツメガエル血清中に含まれる赤血球造血刺激因子の性質．日本動物学会第 79 回大会．福岡，2008 年 9 月．

（共著・ポスター発表） 18. 平田昭人，米塚友香，武藤洋史，藤山真吾，永澤和道，谷崎祐太，加藤尚志．アフリカツ メガエルエリスロポエチン受容体を認識するモノクローナル抗体による血球細胞のフロー サイトメトリー解析．第 66 回日本動物学会関東支部大会，東京，2015 年 3 月．

19. 佐藤圭，細沢咲湖，永澤和道，谷崎祐太，加藤尚志．アフリカツメガエルエリスロポエチ ンの酵素免疫学的測定法の構築．第 66 回日本動物学会関東支部大会，東京，2015 年 3 月．

20. 谷合正光，藤山真吾，竹島功将，永澤和道，前川峻，加藤尚志．低温曝露アフリカツメガ エルにおける赤血球破壊と肝臓組織鉄の変動．第 66 回日本動物学会関東支部大会．柏，2014 年 3 月．

21. 入江達也，武藤洋史，永澤和道，奥井武仁，加藤尚志．アフリカツメガエル未熟赤血球を 認識するモノクローナル抗体の作出．第 86 回日本生化学会大会．横浜，2013 年 9 月．

22. 竹島功将，永澤和道，谷崎祐太，渡会敦子，加藤尚志．アフリカツメガエルの赤血球膜蛋 白質群の同定．第 86 回日本生化学会大会．横浜，2013 年 9 月．

23. 竹島功将，永澤和道，渡会敦子，加藤尚志．超遠心法により分画したアフリカツメガエル 赤血球膜蛋白質群の検索．日本動物学会第 65 回関東支部大会．東京，2013 年 3 月．

24. 野村一騎，永澤和道，安川賢，一杉芽美，谷崎祐太，加藤尚志，多ヶ谷卓爾．ツメガエル トロンボポエチンのポリクローナル抗体の作出および免疫に伴うニュージーランドシロウ サギの血小板数変動の解析．日本動物学会第 65 回関東支部大会．東京，2013 年 3 月．

25. Meguro M, Adachi M, Nagasawa K, Beppu M, Okazaki N, Nogawa-Kosaka N, Tamada T, Kuroki R, Kato T. Implication of Molecular Diversity and Functional Conservation of Erythropoietin Based on a Comparison of Tertiary Structures of Humans and Frogs. The 53rd Annual Meeting of the American Society of Hematology. San Diego, California, USA. Dec, 2011.

26. 武藤洋史，廣瀬崇行，神保杏林，栗城遥，永澤和道，谷崎祐太，加藤尚志．アフリカツメ ガエル肺におけるエリスロポエチンの発現と作用（Expression and function of erythropoietin in the lung of Xenopus laevis）．第 73 回日本血液学会学術集会．名古屋，2011 年 10 月．

27. 奥井武仁，神保杏林，永澤和道，米塚友香，加藤尚志．赤血球造血を支持するアフリカツ メガエル肝臓の組織微小環境における接着分子の発現．日本動物学会第 82 回大会．旭川， 2011 年 8 月．

134 研究業績

28. 目黒瑞枝，安達基泰，黒木良太，谷崎祐太，田原彩香，別府実穂，永澤和道，加藤尚志． 大腸菌組換えタンパク質発現における C 末端配列への変異導入の効果（Effect of the C-terminal mutaion on cytokine expression levels in Escherichia coli）．第 11 回日本蛋白質科学会 年回．大阪，2011 月 6 月．

29. 一杉芽美，永澤和道，田原彩香，池田磨希，栗城遥，渡会浩志，加藤尚志．ツメガエル栓 球産生因子受容体 c-Mpl の発現系の構築．日本動物学会関東支部第 63 回大会．2011 年 3 月．

30. 遠藤信康，別府実穂，永澤和道，横田直樹，加藤尚志．ラウリル硫酸ナトリウムヘモグロ ビン法による有核赤血球中のヘモグロビン定量法の検討．日本動物学会関東支部第 63 回大 会．2011 年 3 月．

31. 清瀬大貴，永澤和道，田原彩香，谷崎祐太，栗城遥，渡会浩志，加藤尚志．動物細胞で発 現したツメガエルの組換えトロンボポエチンの生物活性．日本動物学会関東支部第 63 回大 会．2011 年 3 月．

32. 間舘一憲，上田しのぶ，永澤和道，加藤尚志，小林哲也．成長遅延症マウスにおける顎下 腺の機能解析．日本動物学会関東支部第 63 回大会．2011 年 3 月．

33. Tanizaki Y, Tahara A, Kinoshita S, Yamauchi M, Meguro M, Maekawa S, Nagasawa K, Ishida-Iwata T, Obuchi-Shimoji M, Nogawa-Kosaka N, Kato T. Proliferation and differentiation of thrombocyte progenitors in the liver and the spleen in Xenopus laevis under the stimulation of thrombopoietin. 52nd Annual Meeting of the American Society of Hematology. Orlando, Florida, USA, Dec, 2010.

34. 別府実穂，永澤和道，目黒瑞枝，前川峻，遠藤信康，小坂（野川）菜美，加藤尚志．アフ リカツメガエル赤血球産生におけるエリスロポエチンの作用動態．第 35 回日本比較内分泌 学会大会及びシンポジウム．静岡，2010 年 11 月．

35. 神保杏林，栗城遥，永澤和道，前川峻，渡会浩志，加藤尚志．抗エリスロポエチン受容体 抗体が認識するツメガエル赤血球前駆細胞の性質．第 35 回日本比較内分泌学会大会及びシ ンポジウム．静岡，2010 年 11 月．

36. Onda N, Onodera H, Kato T, Ishida T, Mano Y, Nagasawa K, Akatsuka R, Maeno M, Kato T. Lipopolysaccharide administration in adult African clawed frog as an animal model for leukocytosis. ISEH – Society for Hematology and Stem Cells 39th Annual Scientific Meeting. Melbourne, Australia, Sep, 2010.

37. 廣瀬崇行，永澤和道，奥井武仁，加藤友啓，須貝龍久，小坂（野川）菜美，加藤尚志．ア フリカツメガエルエリスロポエチン遺伝子の定量的発現解析法の最適化．日本動物学会関 東支部第 62 回大会．筑波，2010 年 3 月．

38. 目黒瑞枝，永澤和道，小坂（野川）菜美，会沢洋一，小松則夫，安達基泰，黒木良太，加 藤尚志．アスパラギン結合型糖鎖を欠失するアフリカツメガエルエリスロポエチンの熱安 定性の解析（Preparation and characterization of Xenopus erythropoietin）．第 82 回日本生化学会 大会．神戸，2009 年 10 月．

39. Tanizaki Y, Nogawa-Kosaka N, Nagasawa K, Tahara A, Maekawa S, Okui T, Kato T. Thrombocyte-erythrocyte progenitors identified in African clawed frog Xenopus laevis. ISEH – Society for Hematology and Stem Cells 38th Annual Scientific Meeting. Athens, Greece, Sep, 2009.

40. 田原彩香，永澤和道，目黒瑞枝，石田貴子，下地美也子，黒木良太，加藤尚志．抗体を用 いたアフリカツメガエルトロンボポエチン候補分子の生物活性の解析．日本動物学会関東

135 研究業績

支部第 61 回大会．埼玉，2009 年 3 月．

41. 上原信明，小坂（野川）菜美，會沢洋一，永澤和道，加藤尚志．動物細胞で発現したアフ リカツメガルエリスロポエチンの性状解析（Characterization of Xenopus erythropoietin expressed in mammalian cells）．第 30 回日本分子生物学会年会・第 80 回日本生化学会大会合 同大会．横浜，2007 年 12 月．

【講演（招聘）】 1. Kato T, Nagasawa K, Okui T, Tanizaki Y, Maekawa S. Environmental responses of hematopoiesis in Xenopus laevis. The 8th International Symposium on Amphibian and Reptilian Endocrinology and Neurobiology (ISAREN 2014). Okazaki, Japan, Nov, 2014.

2. 小坂（野川）菜美，前川峻，永澤和道，家村仁美，奥井武仁，加藤尚志．両生類造血に学 ぶ～アフリカツメガエル血球産生のダイナミクス～．日本比較免疫学会第 21 回学術集会， シンポジウム「リンパ球の起源と分化」．神奈川，2009 年 8 月．

【その他】 1. 永澤和道，谷崎祐太，奥井武仁，渡會敦子，上田しのぶ，加藤尚志．低温環境で変動する アフリカツメガエル肝臓のパスウェイ．私立大学戦略的研究基盤形成支援事業，第一回成 果報告会「ストレス応答制御に基づく次世代型健康寿命科学の研究拠点形成」．東京女子医 科大学・早稲田大学連携先端生命医科学研究教育施設（TWIns）． 2013 年 3 月．（ポスター 発表）

2. 永澤和道．モデル生物/非モデル生物の環境応答性蛋白質の追跡．TWINs オミクスコロキウ ム．東京女子医科大学・早稲田大学連携先端生命医科学研究教育施設（TWIns）． 2012 年 7 月．（口演発表）

3. 永澤和道，前川峻，奥井武仁，谷崎祐太，渡會敦子，加藤 尚志．アフリカツメガエルにお けるプロテオミクスの適用：血漿・肝臓蛋白質の網羅的な発現量変動解析．文部科学省私 立大学学術研究高度化推進事業（ハイテク・リサーチ・センター整備事業），第 5 回早稲田 大学・東京女子医科大学 TWIns ジョイントシンポジウム「TWIns を拠点とした医理工融合 の成果と展望」．東京女子医科大学・早稲田大学連携先端生命医科学研究教育施設（TWIns）． 2011 年 12 月．（ポスター発表）

4. 永澤和道，神保杏林，木下紗也香，谷崎祐太，田原彩香，恩田信洋，栗城遥，清瀬大貴， 前川峻，渡会浩志，永井豊，加藤尚志．フローサイトメトリー法による血球解析：抗体の 作出と蛍光核酸染色の応用．文部科学省私立大学学術研究高度化推進事業（ハイテク・リ サーチ・センター整備事業），第 4 回早稲田大学・東京女子医科大学 TWIns ジョイントシン ポジウム「医理工融合研究の新展開」．東京女子医科大学・早稲田大学連携先端生命医科学 研究教育施設（TWIns）． 2011 年 3 月．（ポスター発表）

5. 奥井武仁，永澤和道，目黒瑞枝，吉岡祐亮，前川峻，小坂（野川）菜美，上田しのぶ，加 藤尚志．造血の分子制御機構：アフリカツメガエル肝臓における血球産生．文部科学省私 立大学学術研究高度化推進事業（ハイテク・リサーチ・センター整備事業），第 1 回成果報 告シンポジウム「早稲田大学が目指す新しい医・理・工学融合研究の展開」．（東京女子医 科大学・早稲田大学連携先端生命医科学研究教育施設（TWIns）． 2009 年 8 月．（ポスター 発表）

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