PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Halančík furzerův jako nový modelový organismus v molekulární biologii

Bakalářská práce

ADRIÁNA ZBONČÁKOVÁ

Vedoucí práce: RNDr. Kamila Součková, Ph.D.

Ústav experimentální biologie obor Molekulární biologie a genetika

Brno 2020

HALANČÍK FURZERŮV JAKO NOVÝ MODELOVÝ ORGANISMUS V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Bibliografický záznam

Autor: Adriána Zbončáková Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Halančík furzerův jako nový modelový organismus v molekulární biologii Studijní program: Experimentálni biologie Studijní obor: Molekulární biologie a genetika Vedoucí práce: RNDr. Kamila Součková, Ph.D. Rok: 2020 Počet stran: 46 Klíčová slova: ; Halančík furzerův; Modelový organismus; Stárnutí; Anuální životní cyklus; Diapauza

2

HALANČÍK FURZERŮV JAKO NOVÝ MODELOVÝ ORGANISMUS V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Bibliografický záznam Autor: Adriána Zbončáková Prírodovedecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentálnej biológie Názov práce: Kaprozúbka furzerova ako nový modelový organizmus v molekulárnej biológii Študijný program: Experimentálna biológia Študijný obor: Molekulárna biológia a genetika Vedúci práce: RNDr. Kamila Součková, Ph.D. Rok: 2020 Počet strán: 46 Kľúčové slová: Nothobranchiidae; Kaprozúbka furzerova; Modelový organizmus; Starnutie; Anuálny životný cyklus; Diapauza

HALANČÍK FURZERŮV JAKO NOVÝ MODELOVÝ ORGANISMUS V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Bibliographic record

Author: Adriána Zbončáková Faculty of Science Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: furzeri as novel model organism in molecular biology Degree Programme: Experimental Biology Field of Study: Molecular Biology and Genetics Supervisor: RNDr. Kamila Součková, Ph.D. Year: 2020 Number of Pages: 46 Keywords: Nothobranchiidae; Nothobranchius furzeri; Model organism; Aging; Annual life cycle; Diapause

4

HALANČÍK FURZERŮV JAKO NOVÝ MODELOVÝ ORGANISMUS V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Abstrakt

V této Bakalářské práci se věnuji anuální rybě halančíku furzerovu (Nothobranchius furzeri), jež se stal novým modelovým organismem stárnutí. N. furzeri je obratlovec s dosud nejkratší průměrnou délkou života, který se dá chovat v laboratorních podmínkách. Jeho rychlý růst, pohlavní dospívání, brzké stárnutí a dlouhá diapauza z něj dělají atraktivní model pro výzkum stárnutí na fyziologické a molekulární úrovni. Uplatnění našel i v jiných bio- medicínských výzkumech. Známá sekvence genomu a vývoj nástrojů na úpravu genů, jakým je systém CRISPR/Cas9, umožňují studium vztahu mezi genetikou a prostředím během procesu stárnutí obratlovců.

Abstrakt

V tejto Bakalárskej práci sa venujem anuálnej rybe kaprozúbke furzerovej (Nothobranchius furzeri), ktorá sa stala novým modelovým organizmom star- nutia. N. furzeri je doposiaľ najkratšie žijúci stavovec, ktorý sa dá chovať v la- boratórnych podmienkach. Jej rýchly rast, pohlavné dospievanie, skoré star- nutie a dlho trvajúca diapauza z nej robia atraktívny model na výskum star- nutia na fyziologickej a molekulárnej úrovni. Uplatnenie našla aj v iných bio- medicínskych výskumoch. Známa sekvencia genómu a vývoj nástrojov na úpravu génov, ako je systém CRISPR/Cas9 umožňujú štúdium vzťahu medzi genetikou a prostredím behom procesu starnutia u stavovcov.

6

HALANČÍK FURZERŮV JAKO NOVÝ MODELOVÝ ORGANISMUS V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Abstract

In this thesis I study killifish Nothobranchius furzeri as a new model organism for research of aging. N. furzeri is the shortest-lived vertebrate that can be bred in the laboratory so far. Its rapid growth, early sexual maturation, fast aging and long term diapause make it an attractive model for researching of vertebrate aging at both physiological and molecular level as well as and in other biomedical research. Known genome sequence and the emergence of cutting-edge genome-editing technologies such as CRISPR/Cas9 allow studing of the interplay between genetics and environment during vertebrate aging.

HALANČÍK FURZERŮV JAKO NOVÝ MODELOVÝ ORGANISMUS V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Čestné prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vede- ním vedoucího práce s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci cito- vány.

V Brně 15. června 2020 ...... Adriána Zbončáková

HALANČÍK FURZERŮV JAKO NOVÝ MODELOVÝ ORGANISMUS V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII

Poděkování

Na tomto mieste by som veľmi rada poďakovala mojej školiteľke RNDr. Ka- mile Součkovej, Ph.D. za veľké množstvo zaujímavých článkov, cenných rád a trpezlivosti pri spracovaní tejto bakalárskej práce.

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita

OBSAH

Obsah

1 Úvod 17

2 Nothobranchiidae 18 2.1 Životný cyklus Nothobranchiidae ...... 20

3 Nothobranchius furzeri 22 3.1 Genetika N. furzeri ...... 26 3.2 Nothobrachius furzeri ako experimentálny model ...... 28

4 Výskumy 30 4.1 Výskum starnutia ...... 30 4.2 Vplyv črevnej mikroflóry na dĺžku života ...... 34 4.3 Regenerácia plutvy u Nothobranchius furzeri ...... 35

Záver 38

Použité zdroje 39

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita

ÚVOD

1 Úvod

Kaprozúbky (alebo čeľaď Nothobranchiidae) sú drobné veľmi krátko žijúce rybky. V Česku sú zatiaľ používané len v obmedzenom množstve výskumov. Potenciál ich prínosu vo výskume je ale obrovský. Sú to doposiaľ najkratšie žijúce stavovce, ktoré sa dajú chovať v kontrolovaných laboratórnych podmienkach, preto sa začali využívať na výskum starnutia. Dajú sa však využiť aj v iných oblastiach výskumu, ktoré podrobnejšie predstavím v samostatnej kapitole tejto práce. Sú nováčikmi medzi osvedčenými experimentálnymi modelovými organizmami ako sú Ca- enorhabditis elegans, Drosophila melanogaster či Mus musculus. V laboratóriach ich však už teraz nazývajú „vertebrate fruit fly“, čo by sa dalo preložiť ako Drosophila so stavcami. Tieto ryby boli objavené v roku 1968 v Národnom parku v Zimbabwe, v Afrike. Odvtedy boli odobrané rôzne populácie v rámci viacerých expedícií. Dlhé roky sa používali len ako ak- váriové ryby, atraktívne svojím sfarbením a nenáročným chovom. Do vedeckých laboratórií ich dostal fyziológ Alessandro Cellerino z Scuola Normale Superiore v Pise, v Taliansku. Slovenské označenie tejto čeľade, kaprozúbky, sa takmer nepoužíva, a preto budem v práci používať najmä ich latinské pomenovanie Nothobranchiidae.

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 17 NOTHOBRANCHIIDAE

2 Nothobranchiidae

Na začiatok uvádzam pre lepšiu orientáciu vedeckú klasifikáciu tejto skupiny: Ríša: Animalia (Živočíchy) Kmeň: Chordata Podkmeň: Vertebrata (Stavovce) Nadtrieda: Osteichthyes (Ryby) Trieda: (Lúčoplutvovce) Rad: Čeľaď: Nothobranchiidae Latinský názov radu Cyprinodontiformes vznikol podľa gréckeho „kyprinos“, čiže kap- rovitý a „odont“, znamenajúci zub. Do tohto radu patria takzvané kaprovité zubaté ryby, čomu zodpovedajú aj ich mená v rôznych jazykoch. Cyprinodontiformes sú malé, nelovné ryby, obývajúce všetky tropické a subtropické kontinenty okrem Austrálie. Mierne pásmo obývajú len v malom počte druhov. Sú často vy- hľadávané akvaristami pre ich atraktívne sfarbenie, ktoré je výsledkom prispôsobenia sa pro- strediu, v ktorom žijú. Veľa druhov žije v temných alebo kalných vodách, kde je pestré sfarbe- nie jedinou možnosťou na rozpoznanie jedincov vlastného druhu (Taylor et al., 2008). Životný cyklus väčšiny Cyprinodontiformes zodpovedá štandardnému životnému cyklu kostnatých rýb. Mladé rybky sa vyliahnu z ikier, rastú, dospievajú a dospelí jedinci sa, až na výnimky, trú a ikry kladú do rastlinného porastu, kde sa mladé rybky vyvíjajú. Túto skupinu nazývame neanuálne Cyprinodontiformes. Obývajú permanentné vody mierneho, subtropic- kého a tropického pásma. Sú to rody Kryptolebias, Rivulus, Aphyosemion a Fundulopanchax (Gilliam a Fraser, 2001). Asi štvrtina Cyprinodontiformes patrí medzi anuálne a obývajú oblasti vysychavých vôd, čiže sa ich životný cyklus líši. Obývajú dočasné vodné stanovišťa, ktoré sú často nehos- tinné pre iné druhy kostnatých rýb, pretože v období sucha úplne vyschnú. Objavujú sa pravi- delne počas období dažďa v rôznych malých vodných telesách od kaluží, močiarov alebo po- maly tečúcich potôčikov. Vo veľkých vodných plochách ako sú rieky, jazerá či moria sa vy- skytujú len zriedkavo. Obývajú teda rôzne sladké, brakické až slané vody, s rôznou 18

NOTHOBRANCHIIDAE náročnosťou na kvalitu vody. Do tejto skupiny patria rody Austrofundulus a Nothobranchius (Reichard et al., 2009). Zástupcovia čeľade Nothobrachiidae sú veľmi drobné ryby. Veľkosťou sa pohybujú okolo 3 až 15 centimetroch, zvyčajne však majú menej ako 7 centimetrov. Majú výrazný di- morfizmus a dichromatizmus (vyskytujú sa vo viacerých farebných variantoch). V prirodze- nom prostredí sa dožívajú maximálne 12 mesiacov, závisí to od lokality, v ktorej sa nachádzajú. V lokalite, kde sa voda drží kratší čas sa úmerne predĺži aj ich životný cyklus. V zajatí sa doží- vajú 3 až 18 mesiacov (Lucas-Sanchez et al., 2011). Nothobranchiidae žijú v malých od seba separovaných vodných telesách mimo aktív- nych riek alebo zaplavených pláni v oblasti východnej a južnej Afriky. Toto územie je pokryté prevažne savanou. Stanovištia často slúžia ako napájadla pre dobytok a bývajú veľmi znečis- tené výkalmi a močom. Voda na prirodzených stanovištiach je mäkká, s nízkym obsahom mi- nerálnych látok, no vysokým obsahom rastlinných výluhov. Často obsahuje prebytok dusíka- tých látok. Teploty vody v lokalitách dosahujú 15 – 35°C, s častým kolísaním (Reichard et al., 2009). Rozlišujeme tri vetvy čeľade Nothobranchiidae. O-vetva obsahuje len jeden široko roz- šírený druh Nothobrachius orthonotus (Vrtilek a Reichard, 2016), F-vetva má dva morfolo- gicky dobre rozlíšiteľné druhy N. furzeri a N. kadleci (Reichard, 2010) a R-vetva zahŕňa N.pie- naari, N. krysanovi a N. rachovii (Shidlovskiy et al., 2010). Reichard a kolektív (2017) uverejnili článok, v ktorom veľmi podrobne študovali evo- lučnú a biogeografickú históriu, enviromentálnu charakteristiku a zastúpenie jednotlivých dru- hov kaprozúbok na území ich výskytu. Boli zhromaždené údaje z rozsiahlych dlhodobých štú- dií. Medzi rokmi 2008 a 2015 boli odobrené vzorky populácií zo 168 vodných telies obsahujú- cich kaprozúbky. V južnej oblasti Mozambiku bol N. furzeri dominantný druh, čo sa týka roz- šírenia aj celkového počtu. Vytváral spoločenstvá s ďalšími dvoma druhmi a to N. orthonotus a N. pienaari. Všetky tieto tri druhy môžu spolunažívať v jednom vodnom telese bez vzájom- ného si konkurovania. V centrálnej časti Mozambiku sa najčastejšie vyskytoval N. orthonotus, N. kadleci a N. pienaari (v severnej časti sa namiesto N. kadleci vyskytoval N. rachovii). Druhy boli v zastúpené v rovnakom pomere. Všetky tri druhy sa často vyskytovali spolu v rámci jed- ného spoločenstva. V spoločenstvách s len jedným ďalším druhom (N. pienaari alebo N.

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 19 NOTHOBRANCHIIDAE rachovii) bol N. orthonotus výrazne menej dominujúci. Vďaka ich nenáročnému chovu a rôz- nofarebnosti sú Nothobranchiidae rozšírené aj medzi chovateľmi rýb a v zajatí sa dá chovať už 75 druhov. Touto cestou sa do laboratórií dostala aj Kaprozúbka furzerova (Nothobranchius furzeri).

2.1 Životný cyklus Nothobranchiidae

Nothobranchiidae sú na pravidelne vysychajúce prostredie adaptované životným cyklom. Rybky sa vyliahnu počas obdobia dažďa, keď sa jazero naplní vodou. Rýchlo rastú a po pár týždňoch pohlavne dospievajú. Po dosiahnutí pohlavnej dospelosti sa denne rozmnožujú a kladú sucho-vzdorné ikry v štádiu diapauzy do bahnitého substrátu na dne jazera (Obrázok 1). Populácia ikier prežije počas obdobia sucha, a keď sa jazero opäť naplní vodou, tak sa celý cyklus opakuje (Blazek et al., 2013). Obdobie sucha zvyčajne trvá šesť až osem mesiacov, no môže sa predĺžiť až na rok (Reichard et al., 2009). Diapauza (zastavenie vývinu embrya sprevádzané so spomalením jeho metabolizmu) u anuálnych kaprozúbok má tri odlišné časti – prvú, druhú a tretiu diapauzu (Wourms, 1972a). Prvá diapauza je prvé obdobie, kedy je embryo schopné prerušiť vývin. Odohráva sa ešte pred vytvorením embryonálnej osi tela. Embryá vstupujú do tejto fázy po vystavení nízkym teplo- tám, hypoxií a chemickým látkam produkovanými dospelými jedincami (Wourms, 1972b). Druhá diapauza je uprostred embryonálneho vývinu, nastáva po vzniku embryonálnej osi tela, v embryu majúcom presne 38 párov somitov (primitívnych segmentov, párových oblastí mezo- dermu). Embryá do nej prejdú pod vplyvom veľkého množstva vonkajších podmienok. Embryá v tejto fáze vydržia aj niekoľko mesiacov a sú najodolnejšie voči extrémnym teplotám, vysuše- niu a nedostatku kyslíka. Počas tretej diapauzy sú embryá už plne vyvinuté, ale neliahnu sa. Majú pomalý metabolizmus a vykazujú len slabé životné funkcie (Podrabsky a Hand, 1999). Anuálne kaprozúbky dokážu produkovať aj embryá, ktoré majú odlišný vývin. Nevstu- pujú do prvých dvoch diapáuz a vyvíjajú sa priamo (prejdú rovno do tretej diapauzy a liahnu sa). Ide o rovnaký vývin ako majú neanuálne kaprozúbky (Wourms, 1972b). To, či embryo vstúpi do diapauzy alebo sa bude rovno vyvíjať, závisí od veku matky a od množstva už nakla- daných vajíčok (Podrabsky et al., 2010a). 20

NOTHOBRANCHIIDAE

Keďže kaprozúbky obývajú prostredie s periodicky sa meniacimi podmienkami, ako je dĺžka dňa, množstvo kyslíka, teplota a prítomnosť ďalších rýb, predpokladá sa, že práve tieto faktory ovplyvňujú načasovanie jednotlivých diapáuz (Podrabsky et al., 2010b).

Obrázok 1: Životný cyklus anuálnych kaprozúbok. (A) Kmene často používané v labora- tóriach: krátko žijúci kmeň naľavo (GRZ, samček so žltým chvostom), dlho žijúci kmeň (MZM- 0403, samček s červeným chvostom). (B) Ukážka životného cyklu krátko žijúceho kmeňa. Em- bryo sa môže vyvíjať normálne alebo sa môže vývoj pozastaviť v stave zvanom diapauza, ktorá môže trvať niekoľko týždňov až mesiacov počas obdobia sucha. Počas obdobia dažďa je dia- pauza vynechaná a vývin embrya trvá 3 – 4 týždne. U dospelých jedincov pozorujeme pohlavný dimorfizmus, kedy je samček väčší, má farebnejšie plutvy aj telo. Vplyvom starnutia ryba stráca farbu, plutvy strácajú štruktúru a chrbtica sa ohýba (upravené z Kim et al., 2016).

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 21 NOTHOBRANCHIUS FURZERI

3 Nothobranchius furzeri

N. furzeri je najkratšie žijúci stavovec, ktorý sa dá chovať v zajatí. Patrí medzi anuálne žijúcich zástupcov Nothobranchiidae. Obýva dočasné vodné stanovištia vznikajúce počas období dažďa v oblasti medzi riekou Save a pohorím Lebombo v juhovýchodnej Afrike. Na daný biotop sa adaptoval veľmi krátkym životným cyklom trvajúcim 3 až 7 mesiacov, vďaka čomu sa stal vhodným modelom na výskum starnutia (Valdesalici a Cellerino, 2003). Vedecký potenciál N. furzeri objavil fyziológ Alessandro Cellerino z Scuola Normale Superiore v Pise, v Taliansku. Jeho priateľ Stefano Valdesalici choval veľmi krátko žijúce akváriové rybičky, ktoré ho zaujali. Experimentálne odpozoroval, že dospievajú vo veku 4 týžd- ňov a od 6 týždňa života začali hromadne umierať. Posledné jedince uhynuli vo veku 10 týžd- ňov (Valdesalici a Cellerino, 2003). Vývojom a zlepšovaním podmienok chovu sa podarilo mierne predĺžiť dĺžku ich života (Cellerino et al., 2016). Keďže N. furzeri obýva veľmi nepredvídateľné prostredie, vyvinuli sa uňho flexibilné odpovede na vonkajšie výkyvy. Napríklad pohlavná dospelosť môže byť za optimálnych pod- mienok dosiahnutá už v 18. deň života (Blazek et al., 2013). Ale v prípade, že podmienky nie sú vhodné, pohlavná dospelosť môže nastať až v piatom týždni (Graf et al., 2010). Denná pro- dukcia vajíčok v prirodzenom prostredí môže byť 0 – 200, veľkosť závisí od samičky aj ďalších podmienok a môžu dosahovať priemer 1,1 – 1,3 mm (Vrtilek a Reichard, 2015). Významné populácie N. furzeri majú svoje charakteristické kódy prislúchajúce zbier- kam. Na výskumy sa najčastejšie využíva prvý objavený kmeň GRZ pomenovaný podľa Ná- rodného parku v Zimbabwe (Gona Re Zhou), odkiaľ boli jedince tohto druhu prvýkrát odobrané v roku 1968 (Jubb, 1971). Medzi rokmi 1968 a 2016 boli v Zimbabwe a Mozambiku v rámci viacerých expedícií nazbierané vzorky ďalších populácií s rôznymi dĺžkami života a rôznymi stupňami inbrídingu. Podarilo sa vyšľachtiť rôzne inbrédne kmene, vrátane jedného úplne ho- mozygotného, ale plne životaschopného kmeňa GRZ (Cellerino et al., 2016). Najkratšie žijúci kmeň je GRZ s priemernou dĺžkou života 3 – 4 mesiace. Najdlhšie žijúce kmene, napríklad MZM-0410, majú priemernú dĺžku života 7 – 9 mesiacov. Molekulárna podstata tohto rozdielu ešte stále nebola úplne objasnená. Štúdia, ktorá sa zaoberá sekvenovaním mikroRNA v mozgu,

22

NOTHOBRANCHIUS FURZERI ale odhalila, že tieto dva kmene majú rôzne komplexné vzorce expresie niektorých miRNA (Baumgart et al., 2012). Pozorovania správania, vrátane sexuálneho chovania, sú ľahko uskutočniteľné, lebo N. furzeri je prirodzene smelý a rozmnožuje sa na dennej báze. Pár začne s trením už pár minút (niekedy sekúnd) po stretnutí. Pre tento druh je charakteristická vysoká plodnosť a pri správnom stravovaní dokáže v zajatí jediná samica vyprodukovať 30 – 50 vajíčok denne. Embryonálny vývin trvá 17 dní až tri roky, táto variabilita je dôsledok troch čiastočných embryonálnych dia- páuz (Furness et al., 2015). Druhy Nothobranchius, vrátane N. furzeri, sa primárne živia vodnými a pôdnymi bez- stavovcami. Ich strava závisí však na dostupnosti koristi. Štúdia uskutočnená na štyroch divo- kých populáciách N. furzeri uvádza, že preferujú malé kôrovce a nepreferujú tvrdý hmyz, má- loštetinavce a polokrídlovce. Iné druhy kaprozúbok, napríklad N. orthonotus zas preferujú larvy vodného hmyzu aj stavovcov (Polacik a Reichard, 2010). Na kŕmenie v laboratóriu sa od- porúčajú široko dostupné vajíčka žiabronôžky pre mladé ryby a mrazené alebo živé larvy pako- mára pre dospelé ryby (Polacik et al., 2016). Samci N. furzeri sú agresívni a často vytvárajú teritoriálne spoločenstvá. Samci sú fareb- nejší a robustnejší, zatiaľ čo samice sú sfarbené nenápadne (Obrázok 2). Výrazné sfarbenie u samcov je sexuálne selektované a druhovo špecifické (Wildekamp, 2004). Samci viacerých druhov, vrátane N.furzeri, sa vyskytujú v dvoch alebo viacerých farebných formách, ktoré môže byť sympatrické alebo allopatrické. U jedincov N. furzeri môžeme pozorovať červený a žltý variant sfarbenia primárne na chvostovej plutve. Žltý variant má vždy aj čierny pruh v distálnej časti plutvy. U červeného variantu tiež môžeme sledovať formu s čiernym pruhom v distálnej časti, ale taktiež má druhú formu, pri ktorej je chvost homogénne červený. Vo väčšine populácií sa vyskytujú obidve formy sfarbenia (Reichard et al., 2009). Sfarbenie sa počas života mení, jedince vplyvom veku strácajú farbu. Najvýraznejšie zmeny môžeme pozorovať na chvostovej plutve. V koži dochádza k neustálym zmenám na úrovni buniek a pigmentu. Sú spôsobené zmenami v expresií génov spojených so starnutím. Sekvenovanie RNA odhalilo súvislosť génovej expresie a dvoch farebných vzorov. Žlté pig- mentové bunky typicky vykazujú expresiu s melanocytárnymi génmi, zatiaľ čo červené pig- mentové bunky sú asociované s génmi spojenými s myozínom (Ng’oma et al., 2014).

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 23 NOTHOBRANCHIUS FURZERI

V laboratórnych podmienkach je pomer pohlaví u N. furzeri aj ďalších zástupcov rodu Nothobrachiidae vyrovnaný. U divokých populácií N. furzeri však samice zvyknú dominovať (Reichard et al., 2009). Pomer pohlaví sa mení krátko po dosiahnutí dospelosti, kedy na jedného samca pripadá 2,7 samice a na konci obdobia dažďa až 4,7 samice. Vznik nepomeru v divokom prostredí vysvetľujú dve teórie. Po prvé, samci sú výrazne pestrejšie sfarbení, čo ich robí vidi- teľnejšími pre predátorov, ako sú napríklad vtáky, ale aj pre veľký vodný hmyz z čeľade Belos- tomatidae a pre bežných predátorov dočasne sa vyskytujúcich vo vodných nádržiach. Po druhé, samci spolu často agresívne súperia o prístup ku samiciam, čo môže tiež zvyšovať ich mortalitu (Reichard et al., 2014). Reprodukčný systém je posledný systém, ktorý sa vyvíja u N. furzeri. Zaujímavosťou je, že pohlavie sa môže počas vývinu zmeniť. K určovaniu pohlavia dochádza vo veľmi ranných štádiách vývinu vplyvom génu gdf6, kódujúcom diferenciačný rastový faktor 6 (z rodiny TGF- β). Gén gdf6Y na chromozóme Y sa od génu gdf6 na chromozóme X líši v 22 SNVs a v delécií o dĺžke 9-bp. Na chromozóme Y dochádza k strate troch aminokyselín a zmenám v ďalších 15 aminokyselinách (Reichwald et al., 2015).

24

NOTHOBRANCHIUS FURZERI

Obrázok 2: Nothobranchius furzeri. (A) Dospelý samec s červeným chvostom (B) Dospelý samec so žltým chvostom (C) Samička (Cellerino et al., 2016).

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 25 NOTHOBRANCHIUS FURZERI

3.1 Genetika N. furzeri

Čo sa týka genetiky N. furzeri, jedinci odobratí z rovnakého izolovaného prostredia tvoria ge- neticky silne homogénnu populáciu. Už aj populácie z neďalekých oblastí sú geneticky vý- znamne rozdielne. Vo vnútri populácie ale funguje panmixia a neboli objavené žiadne segregá- cie spôsobené napríklad sfarbením samcov. Na základe analýzy mitochondriálnej DNA (kon- krétne CYTB-cytochróm B), 13 mikrosatelitných markerov a distribúcie haplotypov sa zistilo, že existujú dve hlavné vetvy N. furzeri – severná a južná vetva. Vetvy boli historicky oddelené, čo spôsobilo zastavenie génového toku. Južná vetva vykazuje kratší životný cyklus. Južná vetva je ďalej rozdelená riekou Limpopo, ktorá tvorí prirodzenú bariéru rozdeľujúcu populáciu. Tento poznatok dáva priestor na ďalšie genetické štúdie medzi vetvami (Bartáková et al., 2013). Stále sa znižujúca cena sekvenovania genómu a vývoj technológií na úpravu genómu, ako napríklad CRISPR/Cas9, umožnili použitie prakticky každého organizmu ako výskumného modelu (Sánchez Alvarado, 2018). Genóm N. furzeri bol osekvenovaný a zverejnený dvoma nezávislými skupinami v roku 2015. Prvá skupina je laboratórium Anne Brunet na Univerzite Stanford, vytvorili aj prehliadač s viacerými kmeňmi N. furzeri a aj ďalšími druhmi kapro- zúbok: http://africanturquoisekillifishbrowser.org/. Po osekvenovaní jedincov z rôznych populácií bolo identifikovaných 28 494 génov kódujúcich proteíny, väčšina z nich sa nachádza aj u ďalších stavovcov, 5 859 lncRNA (long non-coding RNA=úseky RNA o dĺžke minimálne 200 nukleotidov, ktoré nie sú prekladané do proteínov), miRNA a ďalšie druhy nekódujúcej RNA. Po korekcií viacerých hypotéz bolo identifikovaných 497 génov pod pozitívnou selek- ciou zodpovedajúcich za prenos signálov, metabolizmus, vývin, proteostázu a imunitu (Valen- zano et al., 2015). Druhá skupina je laboratórium Mattiasa Plaztera v mesta Jena v Nemecku, ktorí vy- tvorili prehliadač len pre N. furzeri, vrátane analýzy pohlavných chromozómov, katalóg miRNA a ncRNA: https://nfingb.leibniz-fli.de/ (Reichwald et al., 2015). Databáza NCBI v roku 2016 zverejnila referovaný genóm online (NCBI Genome ID: 2642, URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/2642). Výskumná skupina M. Platzera tento refe- rovaný genóm znova anotovala, zostavila a pridala ďalšie informácie z ďalších vedných disci- plín (Hu a Brunet, 2018).

26

NOTHOBRANCHIUS FURZERI

V súvislosti s imunitou bol porovnaný najnovší genóm N. furzeri s ďalšími modelovými organizmami. Sústredili sa na lokus ťažkého reťazca imunoglobulínu, ktorý je pozoruhodný vďaka svojej komplexite a veľkosti. Zároveň hrá významnú rolu v evolúcií adaptívnej imunite a teda aj prežití. U kaprozúbok vykazuje tento lokus rozdielnu organizáciu a rôzny počet opa- kovaní podjednotiek, čo z nich robí vhodný model aj na štúdium evolúcie imunity (Bradshaw a Valenzano, 2019). Baumgart et al. (2017) vytvorili ďalší obsiahly miRNA katalóg pre N. furzeri. MiRNA sú nekódujúce úseky RNA, dlhé 18 – 24 nukleotidov. Vznikajú pri množstve biosyntetických reakcií a hrajú kľúčovú úlohu pri posttranskripčnej regulácií génovej expresie. Na katalóg osek- venovali vzorky z mozgu, pečene a kože z jedincov N. furzeri rôzneho veku z kmeňov GRZ a MZM-0410. Celkovo bolo uskutočnených 2,2 miliardy čítaní pomocou prístroja Illumina a dáta boli využité na ďalšie analýzy. Identifikovali viac ako 750 ncRNA (non-coding RNA=RNA neprekladaná do proteínu) génov N. furzeri, napríklad viacero génov pre rRNA, tRNA, niekoľko hlavných RNA spliceozómov, SRP (signal recognition particle=častice na roz- poznávanie signálov) a jednu sadu vedľajších RNA spliceozómov. Po charakterizácií miRNA a detailnej anotácií publikovaného genómu sa zistilo, že katalóg RNA pre N. furzeri obsahuje zhruba rovnaké miRNA ako u Danio rerio. Pre N. furzeri bolo vyvinuté aj veľké množstvo nástrojov na jeho genetickú a genomickú úpravu (Harel et al., 2015; Platzer a Englert, 2016). Laboratórium Anne Brunet na Stanforde vyvinulo pre N. furzeri vysoko efektný postup na CRISPR/Cas9 upravovania genómu. CRI- SPR/Cas9 systém (clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein- 9 nuclease) umožňuje umlčať alely nehomologickým spájaním koncov (nonhomologous end joining NHEJ) alebo obnoviť funkciu génov opravou zameranou na homológiu (homology- directed repair HDR). Na presné zameranie cieľovej sekvencie je potrebná navádzacia gRNA (guide RNA) (Harel et al., 2016). Gény sa vnášajú mikroinjekčne cez systém Tol2-transpozón, pôvodne izolovaný z Oryzias latipes. Pri vnesení génu do jednobunkového embrya je gén za- členený do zárodočných buniek a prenášaný do ďalších generácií. Manipulácia s embryami N. furzeri je pomerne jednoduchá, pretože embryá majú dlhú diapauzu a poskytujú tak dostatok času v priebehu pokusov (Valenzano et al., 2011). Valenzano et al. (2015) uskutočnili analýzu genetických väzieb. Po skrížení krátko ži-

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 27 NOTHOBRANCHIUS FURZERI júceho GRZ a dlho žijúceho MZM-0703 mali potomkovia dlhší život ako GRZ, bez ohľadu na to, či z GRZ pochádzala samica alebo samec. Medzi potomstvom bol ale rozdiel v dĺžke života medzi pohlaviami. Samci sa dožívali dlhšieho veku ako samice, čo naznačuje možný súvis medzi dĺžkou života a pohlavím.

3.2 Nothobrachius furzeri ako experimentálny model

Vo výskumoch sa často používajú tradičnejšie druhy rýb ako je Danio rerio, Poecilia reticulata a Oryzias latipes. Žijú okolo štyri až šesť rokov, takže majú, žiaľ, pridlhý životný cyklus pre väčšinu biologických disciplín (Schartl, 2014). Väčšina zástupcov kaprozúbok ale dokončuje životný cyklus do jedného roka. Dĺžka ich života je vrodená, nie je spôsobená prostredím, v kto- rom sa prirodzene nachádzajú. Podobne dlhý čas žijú aj laboratórnych podmienkach. Podrobujú sa rovnakým funkčným zmenám spájaným so starnutím ako typické stavovce. N. furzeri teda ako experimentálny model kombinuje výhody nenáročného chovu, rýchleho množenia, no stavby a fyziológie stavovcov (Di Cicco et al., 2011). Okrem rýchlejšieho životného cyklu sa kaprozúbky odlišujú od ostatných experimentálnych rýb aj väčším prídelom jedla, stravou bo- hatšou na živiny a potrebou častejšej výmeny vody kvôli odstraňovaniu odpadových produktov metabolizmu. Ich embryonálny vývoj je často asynchrónny a ovplyvňovaný inkubačnými pod- mienkami, čo vedie k značnej variabilite v skutočnej miere liahnutia (Polacik et al., 2016). Zvyčajným postupom vo výskume starnutia je zbieranie dát v určitých momentoch ži- vota a rekonštruovanie procesu starnutia z týchto záznamov. Táto schéma je úspešná najmä pri krátko žijúcich bezstavovcoch, u ktorých stačí niekoľko bodov života na zabezpečenie dosta- točných informácií o kontinuite celého života (Golden, 2007; Rogers, 1991). Avšak u tradič- ných modelových stavovcov, ako sú myš alebo D. rerio, je tento proces náročný, nakoľko ich životný cyklus je moc dlhý. Vďaka krátkemu životnému cyklu N. furzeri sa tieto dáta ľahšie zbierajú a navyše stačí menší počet záznamov na zachytenie procesu starnutia (Baumgart et al., 2014). Navyše u kaprozúbok môžeme pozorovať viacero druhov komplexného správania ako učenie, ktoré môžeme monitorovať a vyhodnocovať (Valenzano et al., 2006). Kombináciou krátkeho životného cyklu a komplexného správania môžeme sledovať kognitívny útlm počas starnutia (Hu a Brunet, 2018).

28

NOTHOBRANCHIUS FURZERI

To, že kaprozúbky sú vhodný model na štúdium starnutia, dokazuje napríklad aj pozo- rovanie skracovania telomér, čo je sprievodný jav starnutia svalov a kože. Po analýze týchto tkanív u jedincov N. furzeri vo veku 5 – 21 týždňov sa zistilo, že dĺžka telomér N. furzeri je 5 – 7 kb. Ľudské teloméry majú 5 – 10 kb a napríklad myšacie 50 – 150 kb. Táto skutočnosť robí N. furzeri vhodnejším modelovým organizmom na štúdium skracovania telomér v priebehu starnutia u ľudí než myš (Hartmann et al., 2009). N. furzeri je prvý stavovec, u ktorého sa podarilo pomocou prírodného antioxidantu re- sveratrolu zvýšiť dĺžku života a spomaliť expresiu markerov súvisiacich so starnutím (Valen- zano et al., 2006). Ďalšie štúdie demonštrovali vplyv nižšej teploty prostredia (Valenzano et al., 2006) a nedostatku výživy na rýchlosť starnutia (Terzibasi et al., 2009). Prvá vedecká štúdia skúmajúca Nothobranchiidae bola publikovaná v roku 1976. Ri- chard Haas sa v nej zaoberal štúdiom sexuálnej selekcie u N. guentheri. Študoval úlohu jasného sfarbenia u samcov a prirodzenú selekciu (Haas, 1976). N. guentheri bol použitý aj v sérii výskumov študujúcich toxikológiu, správanie, emby- rogenézu, diapauzu a starnutie. Bol popísaný vznik na veku závislých histopatologických lézií vo viacerých orgánoch N. guentheri (Markofsky a Matias, 1977). U juhoamerického anuálneho druhu Austrolebias bellottii boli popísané rovnaké histopatologické zmeny. Autori tiež popísali efekt teploty vody na rast a starnutie u týchto druhov (Liu et al., 1975). Záujem o výskumy s kaprozúbkami sa obnovil po uverejnení štúdie preukazujúcej ex- trémne krátky životný cyklus u N. furzeri v roku 2003. Zlepšovanie metód laboratórneho vý- skumu N. furzeri viedlo napríklad k vzniku anotovaného altasu mozgu (D’Angelo, 2013) a po- pisu histopatologií, vrátane hojného výskytu nádorov (Di Cicco et al., 2011). Podarila sa ús- pešná transgenéza (Allard et al., 2013). Vznikol katalógu anotovaných transkriptov (Petzold et al., 2013) a so starnutím spojené miRNA profily expresie (Baumgart et al., 2012) . Bol taktiež zostavený plný genóm (Valenzano et al., 2015). V súčastnosti je úspešná predovšetkým apli- kácia súboru nástrojov na úpravu genómu pomocou technológie CRISPR/Cas9 (Harel et al., 2015). Tento druh disponuje širokým spektrom fenotypov spojených so starnutím vrátane neu- rodegeneratívneho a behaviorálneho úpadku (Harel et al., 2015). N. furzeri je pre svoje jedi- nečné vlastnosti vhodný model aj na štúdie ohľadom evolúcie či ekológie (Cellerino et al., 2016).

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 29 VÝSKUMY

4 Výskumy

4.1 Výskum starnutia

Starnutie je časovo závislý postupný úpadok funkcií, postihujúci väčšinu živých organizmov. V roku 1983 odštartovala éra výskumov starnutia vďaka izolácií dlho žijúcich bunkových línií z Caenorhabditis elegans. Proces starnutia je objektom vedeckej zvedavosti aj vďaka neustále sa rozširujúcim poznatkom o molekulárnych a bunkových základoch životných funkcií a vzniku a vývoja chorôb vrátane rakoviny (Lopez-Otin et al., 2013). Očakávaná dĺžka života rôznych druhov je regulovaná zložitou kombináciou genetic- kých a negenetických faktorov. López-Otin (2013) definoval deväť hlavných bunkových a mo- lekulárnych charakteristických znakov starnutia, ktoré sú zodpovedné za celkový proces star- nutia (Obrázok 3). Sú to genomická nestabilita, skracovanie telomér, epigenetické zmeny, strata proteostázy, nepravidelné prijímanie živín, dysfunkcia mitochondrií, bunkové opotrebovanie, vyčerpanie kmeňových buniek a alternatívna bunková komunikácia. Tieto znaky môžeme ešte rozdeliť do troch kategórií: primárne, antagonistické a integračné. Primárne sú jednoznačne ne- gatívne. Sú dôvodom poškodenia DNA, vrátane chromozomálnych aneuploidií, mutácie mito- chondriálnej DNA, skracovanie telomér, epigenetické zmeny a chyby v proteostáze. Naopak antagonistické znaky majú rôzne účinky na základe ich intenzity. V malých množstvách môžu byť prospešné, no vo vysokých sú škodlivé. Príkladom je bunkové opotrebovanie, ktoré spôso- buje celkové starnutie organizmu, ale zároveň ho ochraňuje pred vznikom rakoviny. Treťou kategóriou sú integračné znaky, medzi ktoré patrí vyčerpanie kmeňových buniek a alternatívna bunková komunikácia. Priamo ovplyvňujú homeostázu a funkcie tkanív. Počas starnutia do- chádza k spolupôsobeniu všetkých týchto znakov, navyše sú všetky silne prepojené a je ťažké identifikovať veľkosť ich príspevku do celkového starnutia. Jedným z hlavných menovateľov starnutia je akumulácia genetických poškodení počas života (Moskalev et al., 2013). Integrita a stabilita DNA je pod neustálym tlakom vonkajších činiteľov, a to fyzikálnych, chemických aj biologických. Zároveň je DNA vystavená endo- génnym vplyvom, ktoré zahŕňajú chyby pri replikácií DNA, spontánne hydrolytické reakcie a reaktívne kyslíkové formy (Hoeijmakers, 2009). Medzi poškodenia DNA patria bodové

30

VÝSKUMY mutácie, translokácie, straty a zisky chromozómov, skracovanie telomér, umlčanie génov spôsobené integráciou vírusov alebo transpozómov (Lord a Ashworth, 2012). Najrýchlejší systém na štúdium skracovania telomér u stavovcov je prerušenie expresie génu TERT (telomerase reverse transcriptase). Výskum tohto génu by mohol pomôcť objasniť vplyv skracovania telomér na starnutie aj u ľudí. U jedincov N. furzeri (kmeň GRZ) s nefunkč- ným génom TERT došlo k poruchám typickým pre starnutie v rýchlo sa deliacich tkanivách už vo veku dvoch mesiacov (Boonekamp et al., 2013; Harel et al., 2015).

Obrázok 3: Schéma zobrazujúca znaky starnutia: genomická nestabilita, skracovanie telo- mér, epigenetické zmeny, strata proteostázy, nepravidelné prijímanie živín, dysfunkcia mito- chondrií, bunkové opotrebovanie, vyčerpanie kmeňových buniek a alternatívna bunková ko- munikácia (upravené z Lopez-Otin et al., 2013).

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 31 VÝSKUMY

Bunky a tkanivá sú počas života ovplyvňované veľkým množstvom epigenetických zmien, napríklad zmeny v metylácií DNA, posttranslačná modifikácia histónov a remodelácia chromatínu (Fraga a Esteller, 2007). So starnutím spojené choroby a starnutie sú spojené s narušením proteínovej ho- meostázy alebo proteostázy (Powers et al., 2009). Proteostáza zahŕňa mechanizmy stabilizácie správneho skladania proteínov, mechanizmy degradácie proteínov použitím proteáz alebo ly- zozómov a proteíny tepelného šoku (Hartl et al., 2011). Tieto systémy opravujú nesprávne zlo- žené polypeptidy alebo ich odstránia a kompletne degradujú. Takto sa organizmus snaží pred- chádzať akumulácií poškodených komponentov a zaistiť nepretržitú obnovu vnútrobunkových proteínov. Viaceré štúdie preukázali vzťah proteostázy so starnutím. Dlhodobá tvorba nezlože- ných alebo chybne zložených proteínov a ich následná agregácia spôsobuje rozvoj porúch spo- jených s vekom, ako je Alzheimerova alebo Parkinsonova choroba (Powers et al., 2009). Regulovaný rast tela u cicavcov je zaistený rastovým hormónom a jeho druhým poslom IGF-1 (insulin-like growth factor 1), produkovaným najmä v hepatocytoch. Vnútrobunková signálna cesta pre IGF-1 je rovnaká ako pre inzulín, ktorý sa tvorí v prítomnosti glukózy. Táto signálna cesta je evolučne najviac konzervovaná cesta ovplyvňujúca starnutie, a preto je naj- častejším terčom pre transkripčné faktory z rodiny FOXO (forkhead box transkripčné faktory). Genetické polymorfizmy alebo mutácie redukujúce funkcie rastového faktoru, IGF-1 receptoru, inzulínového receptoru alebo nadväzujúcich vnútrobunečných efektorov sú spájané s dlho- vekosťou u ľudí aj u modelových organizmov (Barzilai et al., 2012). Pri starnutí buniek a organizmu sa účinnosť dýchacieho reťazca znižuje v dôsledku zvý- šenia úniku elektrónov a zníženia tvorby ATP (Green et al., 2011). Dlho sa tušilo, že je súvis medzi poruchami mitochondrií a starnutím, na vysvetlení presných podrobnosti procesu sa však stále pracuje. Zaujímavým faktorom starnutia je bunkové opotrebovanie, ktoré je spájané s pravidel- nými zmenami vo fenotype a v pokročilých fázach vedie až k úplnému zastaveniu bunečného cyklu. Bunečné opotrebovanie je spôsobené hlavne skracovaním telomér, ale aj ďalšími nezá- vislými mechanizmami, ako je poškodenie netelomerickej DNA alebo lokusu INK4/ARF (Collado et al., 2007). Bunečné opotrebovanie je prospešná kompenzačná reakcia, ktorá prispieva k zbaveniu poškodených a potenciálne onkogénnych buniek z tkanív tak, že 32

VÝSKUMY zabraňuje množeniu poškodených buniek a vyvoláva ich zánik pomocou imunitného systému. Odstraňovanie opotrebovaných buniek, mobilizácia kmeňových buniek a udržiavanie stabil- ného počtu buniek vyžaduje efektívny systém. Navyše sa niektoré druhy tkanív opotrebovávajú rýchlejšie ako iné. V staršom organizme sa tento systém stáva menej efektívny alebo môže dôjsť k vyčerpaniu kmeňových buniek, čo môže viesť k nahromadeniu opotrebovaných buniek a zvyšovať rýchlosť starnutia (Lopez-Otin et al., 2013). Ďalšou známkou starnutia je vznik alternatívnej medzibunkovej komunikácie, ktorá môže byť endokrinná, neuroendokrinná a nervová. Neurohormonálna signalizácia je počas star- nutia často deregulovaná vplyvom narastajúcich zápalových reakcií. Účinnosť imunitných re- akcií proti patogénom a rakovinotvorným bunkám klesá a mení sa zloženie v pericelulárnom a extracelulárnom priestore (Lopez-Otin et al., 2013). Doterajšie výskumy preukazujú, že kap- rozúbky nezomierajú len na jednu chorobu, ale na kombináciu všetkých týchto faktorov vyplý- vajúcich zo starnutia, čo dokazuje, že dĺžka ich života je skutočne prirodzená. Kolagén COL1A2 a cyklín B1 (CCNB1) sú markery remodelovania extracelulárnej matrix a zníženia neurogenézy, závislé od veku. Pri porovnaní N. furzeri s jeho dlhšie žijúcim príbuzným N. korthausae sa zistilo, že u N. korthause dochádza k oddialeniu zníženia expresie kolegénu COL1A2 v koži a k neskoršiemu nástupu neoplázie pečene viazanej na vek. Kolagén COL1A2 teda môžeme používať za marker starnutia. Na druhú stranu expresia cyklínu B1 v mozgu bola regulovaná rovnako u oboch druhov, takže nevykazuje druhovú špecificitu. Čo na- značuje, že tento gén je skôr marker na sledovanie chronologického priebehu starnutia a k po- škodeniu nedochádza vplyvom jeho akumulácie (Baumgart et al., 2015). Odlišnosti počas starnutia môžeme sledovať aj medzi jednotlivými kmeňmi. Populácie N. furzeri žijúce v suchších regiónoch (v tomto výskume použitá populácia NF222) vykazujú vyššiu celkovú mieru oxidatívneho stresu v tkanivách, než populácie z menej suchých oblastí (NF121). Nárast oxidativného stresu zároveň vykazuje prudší nárast s vekom v tkanivách srdca a pečene. Tento rozdiel bol najmenej výrazný v mozgu. Histopatologické zmeny súvisiace so vznikom nádorov v pečeni a obličkách boli opäť výraznejšie u kmeňov zo suchšieho prostredia (Blažek et al., 2017).

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 33 VÝSKUMY

4.2 Vplyv črevnej mikroflóry na dĺžku života

Komplexné mikrobiálne spoločenstvá pokrývajú slizničné povrchy na prechode medzi vonkaj- ším prostredím a organizmom. Mikroorganizmy sú súčasťou veľkého množstva kľúčových bio- logických procesov, vrátane prijímania živín, vývinu, metabolizmu, rozvoja imunity, obrany proti patogénom a chorobám. Napríklad v málo rozmanitej črevnej mikroflóre sa často množia druhy mikroorganizmov spájané s rôznymi chorobami (Claesson et al., 2012). Divoko žijúce kaprozúbky majú podobne rozmanité a komplexné zloženie črevnej mi- kroflóry ako jedince chované v zajatí. Štyri najhojnejšie zastúpené kmene baktérií u kapro- zúbok aj ľudí sú Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria a Bacteroidetes, avšak v odlišných pomeroch (Zoetendal et al., 2006). Ich taxonomická rozmanitosť je rovnaká ako u cicavcov, vrátane človeka, čo z nich robí ideálny model na štúdium vplyvu črevnej mikroflóry na starnutie stavovcov (Stephens et al., 2016). Črevné baktérie ovplyvňujú prežívanie a starnutie organizmu. Kvôli malému množstvu vhodných experimentálnych druhov stavovcov nie je zatiaľ jasné, či zmeny črevnej mikroflóry ovplyvňujú priamo procesy starnutia alebo nepriamo zlepšujú celkové zdravie organizmu, a tak prirodzene predlžujú život (Smith et al., 2017). Zmeny v zložení črevných mikrobiálnych spoločenstiev počas starnutia u N. furzeri boli uskutočnené pomocou porovnania hypervariabilných úsekov 16S rRNA (16S rRNA sekveno- vanie) črevnej mikrobioty rýb starých šesť a šestnásť týždňov. Medzi šiestym a šestnástym týždňom života dochádza k dramatickým zmenám v zložení druhov baktérií v črevnej mikrof- lóre, celkový nameraný počet baktérií ale zostal rovnaký. U mladých rýb sa vyskytujú druhy z kmeňov Bacteroidetes, Firmicutes a Actinobacteria spájaných s glykolýzou a metabolizmom polysacharidov. U starších rýb prevažujú druhy z kmeňa Proteobacteria, čiže baktérie chu- dobné na metabolizmus aminokyselín, nukleotidov a karbohydrátov, ale zato spájané s patoge- nézou, transportom a katabolizmom (Smith et al., 2017). Súčasťou práce Smith et al., (2017) je tiež experiment, ktorý po prvýkrát na rybom mo- deli bližšie objasňuje vplyv zloženia črevnej mikroflóry na dĺžku života. Ryby staré 9,5 týždňa boli cez noc liečené zmesou antibiotík (VMNA-vancomycin, metronidazol, neomycin, ampi- cillin). Antibiotiká významne znížili množstvo črevných mikroorganizmov oproti stavu pred

34

VÝSKUMY podaním antibiotík. Potom boli jedince rozdelené do troch skupín. Prvej skupine boli podané črevné mikroorganizmy získané zo šesť týždňov starých jedincov, druhej skupine z jedincov starých 9,5 týždňa a tretej skupine neboli podané žiadne črevné mikroorganizmy. Kontrolná (štvrtá) skupina bola bez liečby. Ryby boli kŕmené zvyčajnou stravou a bolo vyhodnotené ich prežívanie. Jedincom z prvej skupiny (šesť týždňov starí darci) sa najvýraznejšie predĺžil život, ná- rast o 41 % oproti druhej skupine (9,5 týždňa starí darci), o 21 % oproti tretej skupine (len antibiotiká). Oproti kontrolnej skupine (bez liečby) mali jedince priemerne o 37 % dlhší život. Ryby v strednom veku mali po kolonizácií čriev baktériami získanými z čriev mladých rýb aj lepší celkový zdravotný stav a navyše boli viac aktívne. Ďalšie analýzy taktiež odhalili, že pri nezdravej mikroflóre dochádza aj k častejším vznikom zápalov a redukcií bunečného delenia (Smith et al., 2017).

4.3 Regenerácia plutvy u Nothobranchius furzeri

Regeneráciu môžeme definovať ako nahrádzanie častí tela stratených poranením. Bunky rege- nerujúceho tkaniva môžu byť produkované dvoma mechanizmami. Buď zahŕňa kmeňové bunky, alebo progenitorové bunky, druhá možnosť dediferenciáciou a následnou transdiferená- cáciou už existujúcich buniek (Poss, 2010). Oba mechanizmy boli zaznamenané vo všetkých stupňoch regenerácie od uzavretia rany až po úplnú regeneráciu. Schopnosť regenerácie je veľmi odlišná u jednotlivých druhov a orgánových systé- moch. Navyše sa u väčšiny organizmov znižuje s vekom. Bezstavovce majú schopnosť regene- rovať celé telo len z malej časti tela, naopak u stavovcov je táto schopnosť výrazne obmedzená. Obojživelníky a ryby sú schopné regenerácie podstatnej časti srdca, miechy, končatín a plutiev (Iovine, 2007). Populárna modelová časť tela na štúdium regenerácie stavovcov je plutva kostnatých rýb, ktorá má schopnosť znovu narásť po amputácií. Na tieto štúdie sa využíva N. furzeri (kmeň MZM-0703), u ktorého sledujeme vplyv veku na schopnosť regenerácie. U mladých rýb (8 týždňov) dochádza k takmer úplnej (98 %) regenerácií chvostovej plutvy v priebehu štyroch týždňov. Ryby v strednom veku (20 týždňov) dosiahli 78 % regeneráciu, staré ryby vo veku 36 týždňov 57 % a veľmi starých ryb (priemerne 54 týždňov) došlo len k 46 % regenerácií plutvy.

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 35 VÝSKUMY

U veľmi starých rýb dokonca individuálne špecificky niektoré časti plutvy chýbali úplne (Wen- dler et al., 2015). Rozdiel rastu buniek u mladých a starých rýb bol viditeľný už v priebehu prvých troch dní po amputácií a časom sa ešte zvyšoval (Obrázok 4). U dvoch skupín mladších rýb bola maximálna miera rastu sedem dní po amputácií. U dvoch skupín starších rýb bola maximálna miera rastu rovnaká sedem aj deväť dní po amputácií. Na sledovanie proliferácie buniek v re- generujúcom sa tkanive bolo intraperitoneálne injekčne vnesené 10 mM (5-ethynyl-20-deoxy- uridine EdU), ktoré sa začleňuje do DNA behom S-fázy. EdU pozitívne bunky boli kvantita- tívne analyzované. Najviac EdU pozitívnych buniek u mladších skupín bolo pozorovaných dva dni po amputácií, u starších skupín tri dni po amputácií. Celkovo sa najviac EdU pozitívnych buniek nachádzalo u osem týždňov starých rýb (Wendler et al., 2015). Wendler a kolektív (2015) tak preukázali, že u mladších rýb dochádza k iniciácií rege- nerácie skôr než u starých rýb. Z toho vyplýva, že počiatočné procesy regenerácie sú rozhodu- júce pre schopnosť celkovej regenerácie. Autori merali aj na veku závislé zmeny génovej ex- presie v regenerujúcom sa tkanive. Vybrali osem spoločných génov, ktoré boli zapojené do regenerácie plutvy pri podobnom výskume uskutočnenom na Danio rerio z radu Cypriniformes (vybrané gény: wnt10a, axin2a, fgf20a, fgf1, msxb, raldh2, shh a lef1). Expresia všetkých týchto génov u N. furzeri bola oproti kontrole (pred amputáciou) významne vyššia u všetkých skupín na druhý až štvrtý deň po amputácií. Celkovo najviac zvýšené boli shh, wnt10a, msxb a fgf20a a to na tretí deň u osem týždňov starých rýb. U 36 týždňov starých rýb bolo maximum týchto génov dosiahnuté o deň neskôr. Ďalšie gény (raldh2, lef1 a msxb) dosiahli maximum u mladých rýb na druhý deň po amputácií, u starých rýb opäť o deň neskôr.

36

VÝSKUMY

Obrázok 4: Regenerácia chvostovej plutvy. Ukážka plutvy pred amputáciou (biela čiara zná- zorňuje miesto amputácie), v tretí, jedenásty a dvadsiaty siedmy deň po amputácií u 8‐, 20‐, 36‐ 54‐týždňov starých rýb (upravené z Wendler et al., 2015).

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 37 ZÁVER

Záver

V tejto bakalárskej práci som sa venovala čeľadi Nothobanchiidae a jej vo výskumoch najpou- žívanejšiemu druhu Nothobranchius furzeri, ktorý sa stal významným modelovým organiz- mom, v súčasnej dobe predovšetkým v oblasti starnutia a vplyvu epigenentických zmien na starnutie. Taktiež sa v súvislosti s ním skúma priebeh diapauzy a jej ovplyvňovanie, vznik anu- álneho životného cyklu a jeho genetická podstata. Do mojej bakalárskej práce som zahrnula aj zaujímavé výskumy v oblasti regenerácie a vplyvu črevnej mikroflóry na rýchlosť starnutia a celkový zdravotný stav. Zhrnula som princípy bunečnej a molekulárnej podstaty starnutia a výskumy s nimi spo- jené. Oblasť výskumu starnutia je ale žiaľ tak obsiahla, že som túto kapitolu musela poňať pomerne stručne. Doterajšie výskumy preukazujú, že kaprozúbky zomierajú na kombináciu viacerých faktorov vyplývajúcich zo starnutia. V budúcnosti treba presnejšie preskúmať me- chanizmy starnutia a možnosti ich presného ovplyvňovania. Keďže N. furzeri je stavovec, vý- sledky výskumu v oblasti starnutia sa budú môcť aplikovať aj na iných stavovcov vrátane člo- veka. V súčasnosti je už osekvenovaný genóm N. furzeri, je známy transkriptom, sú identifi- kované sekvencie kódujúce proteíny, ale aj nekódujúca RNA. U kandidátnych génov pravde- podobne zapojených do procesu starnutia momentálne prebieha výskum ich vplyvu a funkcie. Génové manipulácie sa uskutočňujú pomocou systému CRISPR/Cas9. Väčšina prelomového výskumu sa podľa mňa udiala pred pár rokmi spolu s osekveno- vaním genómu. To ale neznamená, že už nie je čo objavovať, naopak výskum sa posunul do špecializovanejších oblastí a k podrobnostiam. Ľahká manipulácia, možnosť chovu v labora- tórnych podmienkach a rýchle množenie robia z N. furzeri atraktívny modelový organizmus, takže verím, že sa v budúcnosti s nimi stretnem vo veľkom množstve zaujímavých výskumov.

38

POUŽITÉ ZDROJE

Použité zdroje

Allard, J.B., Kamei, H., Duan, C., 2013. Inducible transgenic expression in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. J. Fish Biol. 82, 1733–1738. https://doi.org/10.1111/jfb.12099

Bartáková, V., Reichard, M., Janko, K., Polačik, M., Blažek, R., Reichwald, K., Cellerino, A., Bryja, J., 2013. Strong population genetic structuring in an annual fish, Nothobranchius furzeri, suggests multiple savannah refugia in southern Mozambique. BMC Evol Biol 13, 196. https://doi.org/10.1186/1471-2148-13-196

Barzilai, N., Huffman, D.M., Muzumdar, R.H., Bartke, A., 2012. The Critical Role of Metabo- lic Pathways in Aging. Diabetes 61, 1315–1322. https://doi.org/10.2337/db11-1300

Baumgart, M., Groth, M., Priebe, S., Appelt, J., Guthke, R., Platzer, M., Cellerino, A., 2012. Age-dependent regulation of tumor-related microRNAs in the brain of the annual fish No- thobranchius furzeri. Mech. Ageing Dev. 133, 226–233. https://doi.org/10.1016/j.mad.2012.03.015

Baumgart, M., Di Cicco, E., Rossi, G., Cellerino, A., Tozzini, E.T., 2015. Comparison of cap- tive lifespan, age-associated liver neoplasias and age-dependent gene expression between two annual fish : Nothobranchius furzeri and Nothobranchius korthause. Biogeron- tology 16, 63–69. https://doi.org/10.1007/s10522-014-9535-y

Baumgart, M., Barth, E., Savino, A., Groth, M., Koch, P., Petzold, A., Arisi, I., Platzer, M., Marz, M., Cellerino, A., 2017. A miRNA catalogue and ncRNA annotation of the short- living fish Nothobranchius furzeri. BMC Genomics 18, 693. https://doi.org/10.1186/s12864-017-3951-8

Blažek, R., Polačik, M., Reichard, M., 2013. Rapid growth, early maturation and short genera- tion time in African annual fishes. EvoDevo 4, 24. https://doi.org/10.1186/2041-9139-4-24

Blažek, R., Polačik, M., Kačer, P., Cellerino, A., Řežucha, R., Methling, C., Tomášek, O., Sys- lová, K., Terzibasi Tozzini, E., Albrecht, T., Vrtílek, M., Reichard, M., 2017. Repeated intraspecific divergence in life span and aging of African annual fishes along an aridity gradient. Evolution 71, 386–402. https://doi.org/10.1111/evo.13127

Boonekamp, J.J., Simons, M.J.P., Hemerik, L., Verhulst, S., 2013. Telomere length behaves as biomarker of somatic redundancy rather than biological age. Aging Cell 12, 330–332. https://doi.org/10.1111/acel.12050

Bradshaw, W.J., Valenzano, D.R., 2019. Extreme genomic volatility characterises the evolu- tion of the immunoglobulin heavy chain locus in teleost fishes. bioRxiv 752063. https://doi.org/10.1101/752063

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 39 POUŽITÉ ZDROJE

Cellerino, A., Valenzano, D.R., Reichard, M., 2016. From the bush to the bench: the annual Nothobranchius fishes as a new model system in biology. Biol. Rev. 91, 511–533. https://doi.org/10.1111/brv.12183

Claesson, M.J., Jeffery, I.B., Conde, S., Power, S.E., O’Connor, E.M., Cusack, S., Harris, H.M.B., Coakley, M., Lakshminarayanan, B., O’Sullivan, O., Fitzgerald, G.F., Deane, J., O’Connor, M., Harnedy, N., O’Connor, K., O’Mahony, D., van Sinderen, D., Wallace, M., Brennan, L., Stanton, C., Marchesi, J.R., Fitzgerald, A.P., Shanahan, F., Hill, C., Ross, R.P., O’Toole, P.W., 2012. Gut microbiota composition correlates with diet and health in the elderly. Nature 488, 178-+. https://doi.org/10.1038/nature11319

Collado, M., Blasco, M.A., Serrano, M., 2007. Cellular senescence in cancer and aging. Cell 130, 223–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.07.003

D’Angelo, L., 2013. Brain Atlas of an Emerging Teleostean Model: Nothobranchius furzeri. Anat. Rec. 296, 681–691. https://doi.org/10.1002/ar.22668

Di Cicco, E., Tozzini, E.T., Rossi, G., Cellerino, A., 2011. The short-lived annual fish Notho- branchius furzeri shows a typical teleost aging process reinforced by high incidence of age- dependent neoplasias. Exp. Gerontol. 46, 249–256. https://doi.org/10.1016/j.exger.2010.10.011

Fraga, M.F., Esteller, M., 2007. Epigenetics and aging: the targets and the marks. Trends Genet. 23, 413–418. https://doi.org/10.1016/j.tig.2007.05.008

Furness, A.I., Lee, K., Reznick, D.N., 2015. Adaptation in a variable environment: Phenotypic plasticity and bet-hedging during egg diapause and hatching in an annual killifish. Evolu- tion 69, 1461–1475. https://doi.org/10.1111/evo.12669

Gilliam, J.F., Fraser, D.F., 2001. Movement in corridors: Enhancement by predation threat, disturbance, and habitat structure. Ecology 82, 258–273. https://doi.org/10.1890/0012- 9658(2001)082[0258:MICEBP]2.0.CO;2

Graf, M., Cellerino, A., Englert, C., 2010. Gender Separation Increases Somatic Growth in Females but Does Not Affect Lifespan in Nothobranchius furzeri. PLoS One 5, e11958. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011958

Green, D.R., Galluzzi, L., Kroemer, G., 2011. Mitochondria and the Autophagy-Inflammation- Cell Death Axis in Organismal Aging. Science 333, 1109–1112. https://doi.org/10.1126/science.1201940

Haas, R., 1976. Behavioral Biology of Annual Killifish, Nothobranchius-Guentheri. Copeia 80–91.

Harel, I., Benayoun, B.A., Machado, B., Singh, P.P., Hu, C.-K., Pech, M.F., Valenzano, D.R., Zhang, E., Sharp, S.C., Artandi, S.E., Brunet, A., 2015. A Platform for Rapid Exploration 40

POUŽITÉ ZDROJE

of Aging and Diseases in a Naturally Short-Lived Vertebrate. Cell 160, 1013–1026. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.01.038

Harel, I., Valenzano, D.R., Brunet, A., 2016. Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish. Nature Protocols 11, 2010–2028. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.103

Hartl, F.U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M., 2011. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature 475, 324–332. https://doi.org/10.1038/nature10317

Hartmann, N., Reichwald, K., Lechel, A., Graf, M., Kirschner, J., Dorn, A., Terzibasi, E., Wellner, J., Platzer, M., Rudolph, K.L., Cellerino, A., Englert, C., 2009. Telomeres shorten while Tert expression increases during ageing of the short-lived fish Nothobranchius fur- zeri. Mech. Ageing Dev. 130, 290–296. https://doi.org/10.1016/j.mad.2009.01.003

Hu, C.-K., Brunet, A., 2018. The African turquoise killifish: A research organism to study ver- tebrate aging and diapause. Aging Cell 17, e12757. https://doi.org/10.1111/acel.12757

Iovine, M.K., 2007. Conserved mechanisms regulate outgrowth in zebrafish fins. Nat. Chem. Biol. 3, 613–618. https://doi.org/10.1038/nchembio.2007.36

Jubb RA. 1971. A new Nothobranchius (Pisces, Cyprinodontidae) from Southeastern Rhodesia. Journal of American Killifish Association 8:12–19.

Kim, Y., Nam, H.G., Valenzano, D.R., 2016. The short-lived African turquoise killifish: an emerging experimental model for ageing. Disease Models & Mechanisms 9, 115–129. https://doi.org/10.1242/dmm.023226

Liu, R., Leung, B., Walford, R., 1975. Effect of Temperature-Transfer on Growth of Laboratory Populations of a South-American Annual Fish Cynolebias-Bellottii. Growth 39, 337–343.

Lopez-Otin, C., Blasco, M.A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G., 2013. The Hallmarks of Aging. Cell 153, 1194–1217. https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.05.039

Lucas-Sanchez, A., Almaida-Pagan, P.F., Madrid, J.A., de Costa, J., Mendiola, P., 2011. Age- related changes in fatty acid profile and locomotor activity rhythms in Nothobranchius korthausae. Exp. Gerontol. 46, 970–978. https://doi.org/10.1016/j.exger.2011.08.009

Markofsky, J., Matias, J., 1977. Effects of Temperature and Season of Collection on Onset and Duration of Diapause in Embryos of Annual Fish Nothobranchius-Guentheri. J. Exp. Zool. 202, 49–56. https://doi.org/10.1002/jez.1402020107

Ng’oma, E., Groth, M., Ripa, R., Platzer, M., Cellerino, A., 2014. Transcriptome profiling of natural dichromatism in the annual fishes Nothobranchius furzeri and Nothobranchius ka- dleci. BMC Genomics 15, 754. https://doi.org/10.1186/1471-2164-15-754

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 41 POUŽITÉ ZDROJE

Petzold, A., Reichwald, K., Groth, M., Taudien, S., Hartmann, N., Priebe, S., Shagin, D., En- glert, C., Platzer, M., 2013. The transcript catalogue of the short-lived fish Nothobranchius furzeri provides insights into age-dependent changes of mRNA levels. BMC Genomics 14, 185. https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-185

Platzer, M., Englert, C., 2016. Nothobranchius furzeri: A Model for Aging Research and More. Trends in Genetics 32, 543–552. https://doi.org/10.1016/j.tig.2016.06.006

Podrabsky, J.E., Hand, S.C., 1999. The bioenergetics of embryonic diapause in an annual killi- fish, Austrofundulus limnaeus. J. Exp. Biol. 202, 2567–2580.

Podrabsky, J.E., Garrett, I.D.F., Kohl, Z.F., 2010a. Alternative developmental pathways asso- ciated with diapause regulated by temperature and maternal influences in embryos of the annual killifish Austrofundulus limnaeus. J. Exp. Biol. 213, 3280–3288. https://doi.org/10.1242/jeb.045906

Podrabsky, J.E., Tingaud-Sequeira, A., Cerda, J., 2010b. Metabolic Dormancy and Responses to Environmental Desiccation in Fish Embryos, in: Lubzens, E., Cerda, J., Clark, M. (Eds.), Dormancy and Resistance in Harsh Environments. Springer-Verlag Berlin, Berlin, pp. 203– 226.

Polacik, M., Reichard, M., 2010. Diet overlap among three sympatric African annual killifish species Nothobranchius spp. from Mozambique. J. Fish Biol. 77, 754–768. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.2010.02717.x

Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M., 2016. Laboratory breeding of the short-lived annual ki- llifish Nothobranchius furzeri. Nat. Protoc. 11, 1396–1413. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.080

Poss, K.D., 2010. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in . Nat. Rev. Genet. 11, 710–722. https://doi.org/10.1038/nrg2879

Powers, E.T., Morimoto, R.I., Dillin, A., Kelly, J.W., Balch, W.E., 2009. Biological and Che- mical Approaches to Diseases of Proteostasis Deficiency, in: Annual Review of Bioche- mistry. Annual Reviews, Palo Alto, pp. 959–991.

Reichard, M., Polacik, M., Sedlacek, O., 2009. Distribution, colour polymorphism and habitat use of the African killifish Nothobranchius furzeri, the vertebrate with the shortest life span. J. Fish Biol. 74, 198–212. https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.2008.02129.x

Reichard, M., 2010. Nothobranchius kadleci (Cyprinodontiformes: Nothobranchiidae), a new species of annual killifish from central Mozambique. Zootaxa 49–60.

Reichard, M., Polacik, M., Blazek, R., Vrtilek, M., 2014. Female bias in the adult sex ratio of African annual fishes: interspecific differences, seasonal trends and environmental pre- dictors. Evol. Ecol. 28, 1105–1120. https://doi.org/10.1007/s10682-014-9732-9 42

POUŽITÉ ZDROJE

Reichard, M., Janac, M., Polacik, M., Blazek, R., Vrtilek, M., 2017. Community assembly in Nothobranchius annual fishes: Nested patterns, environmental niche and biogeographic history. Ecol. Evol. 7, 2294–2306. https://doi.org/10.1002/ece3.2851

Reichwald, K., Petzold, A., Koch, P., Downie, B.R., Hartmann, N., Pietsch, S., Baumgart, M., Chalopin, D., Felder, M., Bens, M., Sahm, A., Szafranski, K., Taudien, S., Groth, M., Arisi, I., Weise, A., Bhatt, S.S., Sharma, V., Kraus, J.M., Schmid, F., Priebe, S., Liehr, T., Gör- lach, M., Than, M.E., Hiller, M., Kestler, H.A., Volff, J.-N., Schartl, M., Cellerino, A., Englert, C., Platzer, M., 2015. Insights into Sex Chromosome Evolution and Aging from the Genome of a Short-Lived Fish. Cell 163, 1527–1538. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.10.071

Sánchez Alvarado, A., 2018. To solve old problems, study new research organisms. Develop- mental Biology, Regeneration: from cells to tissues to organisms 433, 111–114. https://doi.org/10.1016/j.ydbio.2017.09.018

Schartl, M., 2014. Beyond the zebrafish: diverse fish species for modeling human disease. Dis. Model. Mech. 7, 181–192. https://doi.org/10.1242/dmm.012245

Shidlovskiy, K.M., Watters, B.R., Wildekamp, R.H., 2010. Notes on the annual killifish species Nothobranchius rachovii (Cyprinodontiformes; Nothobranchiidae) with the description of two new species. Zootaxa 37–57.

Smith, P., Willemsen, D., Popkes, M., Metge, F., Gandiwa, E., Reichard, M., Valenzano, D.R., 2017. Regulation of life span by the gut microbiota in the short-lived African turquoise killifish. eLife 6, e27014. https://doi.org/10.7554/eLife.27014

Stephens, W.Z., Burns, A.R., Stagaman, K., Wong, S., Rawls, J.F., Guillemin, K., Bohannan, B.J.M., 2016. The composition of the zebrafish intestinal microbial community varies across development. ISME J. 10, 644–654. https://doi.org/10.1038/ismej.2015.140

Taylor, D.S., Turner, B.J., Davis, W.P., Chapman, B.B., 2008. Natural history note - A novel terrestrial fish habitat inside emergent logs. Am. Nat. 171, 263–266. https://doi.org/10.1086/524960

Terzibasi, E., Lefrancois, C., Domenici, P., Hartmann, N., Graf, M., Cellerino, A., 2009. Effects of dietary restriction on mortality and age-related phenotypes in the short-lived fish Notho- branchius furzeri. Aging Cell 8, 88–99. https://doi.org/10.1111/j.1474-9726.2009.00455.x

Valdesalicil, S., Cellerino, A., 2003. Extremely short lifespan in the annual fish Nothobranchius furzeri. Proc. R. Soc. B-Biol. Sci. 270, S189–S191. https://doi.org/10.1098/rsbl.2003.0048

Valenzano, D.R., Benayoun, B.A., Singh, P.P., Zhang, E., Etter, P.D., Hu, C.-K., Clement-Ziza, M., Willemsen, D., Cui, R., Harel, I., Machado, B.E., Yee, M.-C., Sharp, S.C., Bustamante, C.D., Beyer, A., Johnson, E.A., Brunet, A., 2015. The African Turquoise Killifish Genome Provides Insights into Evolution and Genetic Architecture of Lifespan. Cell 163, 1539– 1554. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.11.008

Šablona DP 3.0.7-SCI (2020-04-14) © 2014, 2016, 2018, 2019 Masarykova univerzita 43 POUŽITÉ ZDROJE

Valenzano, D.R., Sharp, S., Brunet, A., 2011. Transposon-Mediated Transgenesis in the Short- Lived African Killifish Nothobranchius furzeri , a Vertebrate Model for Aging. G3 1, 531– 538. https://doi.org/10.1534/g3.111.001271

Valenzano, D.R., Terzibasi, E., Genade, T., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A., 2006. Resveratrol prolongs lifespan and retards the onset of age-related markers in a short-lived vertebrate. Curr. Biol. 16, 296–300. https://doi.org/10.1016/j.cub.2005.12.038

Vrtilek, M., Reichard, M., 2016. Patterns of morphological variation among populations of the widespread annual killifish Nothobranchius orthonotus are independent of genetic diver- gence and biogeography. J. Zool. Syst. Evol. Res. 54, 289–298. https://doi.org/10.1111/jzs.12134

Vrtilek, M., Reichard, M., 2015. Highly plastic resource allocation to growth and reproduction in females of an African annual fish. Ecol. Freshw. Fish 24, 616–628. https://doi.org/10.1111/eff.12175

Wendler, S., Hartmann, N., Hoppe, B., Englert, C., 2015. Age-dependent decline in fin regene- rative capacity in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell 14, 857–866. https://doi.org/10.1111/acel.12367

Wildekamp, R.H., 2004. A world of killies: atlas of the oviparous cyprinodontiform fishes of the world. Volume IV. The genera Garmanella, Gnatholebias, Hubbsichthys, Hylopan- chax, Hypsopanchax, Jordanella, Laciris, Lamprichthys, Leptolebias, Leptolucania, Lu- cania, Maratecoara, Megalebias, Megupsilon, Micromoema, Millerichthys, Moema, Neo- fundulus, Nothobranchius, Orestias, Oxyzygonectes, Pachypanchax, Pantanodon, Papili- olebias, Pituna, Plataplochilus, Platypanchax and Plesiolebias. American Killifish Asso- ciation, Inc.

Wourms, J., 1972a. Developmental Biology of Annual Fishes .1. Stages in Normal Develop- ment of Austrofundulus-Myersi Dahl. J. Exp. Zool. 182, 143-. https://doi.org/10.1002/jez.1401820202

Wourms, J., 1972b. Developmental Biology of Annual Fishes .3. Pre-Embryonic and Embryo- nic Diapause of Variable Duration in Eggs of Annual Fishes. J. Exp. Zool. 182, 389-+. https://doi.org/10.1002/jez.1401820310

Zoetendal, E.G., Vaughan, E.E., de Vos, W.M., 2006. A microbial world within us. Mol. Micro- biol. 59, 1639–1650. https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2006.05056.x

44