GABRYELE SILVA RAMOS
CAPACIDADE DE DISPERSÃO E PARÂMETROS BIOLÓGICOS INERENTES À CRIAÇÃO MASSAL DE Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) PARA O CONTROLE DE PENTATOMÍDEOS-PRAGA EM SOJA
Botucatu 2020
GABRYELE SILVA RAMOS
CAPACIDADE DE DISPERSÃO E PARÂMETROS BIOLÓGICOS INERENTES À CRIAÇÃO MASSAL DE Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) PARA O CONTROLE DE PENTATOMÍDEOS-PRAGA EM SOJA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Agronomia: Proteção de Plantas.
Orientadora: Profª. Drª. Regiane Cristina Oliveira de Freitas Bueno
Botucatu
Ramos, Gabryele Silva R175c Capacidade de dispersão e parâmetros biológicos inerentes à criação massal de Telenomus podisi ashmead (hymenoptera: platygastridae) para o controle de pentatomídeos-praga em soja / Gabryele Silva Ramos. -- Botucatu, 2020 122 p. : il., tabs., fotos
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu Orientadora: Regiane Cristina Oliveira de Freitas Bueno
1. Entomologia agrícola. 2. Manejo integrado de pragas. 3. Controle biológico. 4. Parasitoide de ovos. 5. Controle de qualidade. I. Título.
Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agronômicas, Botucatu. Dados fornecidos pelo autor(a).
Essa ficha não pode ser modificada.
Aos meus amados pais, Júnia e Jorge, dedico
AGRADECIMENTOS
A Deus.
Aos meus amados avós, Nilza e Perpedigno, aos meus pais, Júnia e Jorge, e irmão Gabryel pelo amor e apoio incondicionais.
À Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Campus de Botucatu.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro, concedido por meio de bolsa de mestrado (Processo nº 180017).
À Profª. Drª. Regiane Bueno, pela orientação, ensinamentos, paciência e inspiração profissional.
Aos amigos do Grupo de Pesquisa em Manejo Integrado de Pragas na Agricultura (AGRIMIP), em especial, João Pedro, Nadja, Carol, Fábio e Pedro por todo o apoio, auxílio na execução dos experimentos e principalmente, pela amizade construída.
Aos motoristas durante a bateria de ensaios a campo, Daniel, Thaís e Simone, e demais colegas que auxiliaram em toda a coleta de dados, pela colaboração e companheirismo.
Aos professores do Departamento de Proteção Vegetal – FCA/UNESP pelos valiosos ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Carlos Frederico Wilcken e colegas do LCBPF pelo suporte e disponibilização do laboratório para a execução das análises morfométricas.
Ao Prof. Dr. Luis Gustavo Frediani Lessa, Dr. Donizete e Amanda, pela disposição em ajudar e disponibilização do Laboratório de Geoprocessamento para a realização das análises geoestatísticas.
À Vanessa Carvalho pelos importantes ensinamentos durante a nossa convivência e por toda a ajuda nas análises moleculares presentes neste trabalho e à Profª Drª Sílvia Renata pela concessão de uso do Laboratório de Biologia Molecular.
Ao time da Agroterenas S/A (Unidade de Santa Cruz do Rio Pardo, SP), em especial ao Leonardo e Joselito, aos profissionais da Fazenda Santa Fé, João e Beatriz Burckas, e à BioPartner por toda a colaboração, auxílio, disponibilização de insumos e concessão de áreas necessárias à condução dos experimentos de campo.
Aos amigos que fiz durante o Mestrado e aos que me acompanharam e apoiaram, mesmo que distantes, durante essa trajetória...
Muito obrigada!
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez”.
George Bernard Shaw
RESUMO
O sucesso de programas de controle biológico de insetos-praga é dependente do entendimento detalhado de parâmetros biológicos, comportamentais e da capacidade de dispersão dos agentes de controle nos agroecossistemas. Após a saída da especificação de referência para registro e comercialização, é esperada a otimização de pacotes tecnológicos para garantir a eficiência e eficácia de um agente macrobiológico. É o caso do parasitoide de ovos de pentatomídeos-praga, Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae). Com as limitações do uso recorrente de inseticidas no controle de percevejos fitófagos em grandes culturas de elevada importância econômica como a soja, a liberação de T. podisi em áreas extensas vem sendo vista como uma estratégia de controle promissora e pertinente. Neste contexto, parâmetros biológicos inerentes ao desenvolvimento de um controle de qualidade para a criação massal e liberação a campo de T. podisi foram explorados no presente estudo. Bioensaios de preferência por ovos de Euschistus heros (Fabricius) (Hemiptera: Pentatomidae) frescos ou criopreservados, estudo morfométrico e identificação de endossimbiontes foram conduzidos em laboratório, bem como a determinação da proporção ideal de fêmeas de T.podisi/ovo hospedeiro a fim de se diminuir a competição intraespecífica a aumentar as taxas de parasitismo em condições laboratoriais de multiplicação do parasitoide. Além disso, foi realizado o estudo da capacidade de dispersão de T. podisi a partir de matrizes de pontos equidistantes demarcadas e liberação central do número recomendado de fêmeas, segundo a especificação de referência de uso, em plantações de soja. As bactérias endossimbiontes Wolbachia pipientis e Serratia grimesii foram detectadas em T. podisi. Parasitoides multiplicados em ovos frescos de E. heros têm seu período de desenvolvimento ovo-adulto prolongado e tíbias mais compridas. A quantidade de fêmeas/ovo que permite uma maior taxa de parasitismo e de 8,87 fêmeas e a partir 9,28 ovos/fêmea há um estímulo de parasitismo de T. podisi. O emprego da proporção ideal de fêmeas de T. podisi/ovo hospedeiro e do número mínimo de ovos hospedeiros/fêmea em criações massais a fim de se diminuir a competição intraespecífica pode levar ao aumento das taxas de parasitismo em condições laboratoriais de multiplicação do parasitoide. A distância máxima de forrageamento atingida por T. podisi foi de 39 metros durante o estágio fenológico da soja Vn-R1 e de 30,90 metros no estágio R5-R6. Fêmeas oriundas de ovos de P. guildinii possuem asas mais estreitas e menor comprimento de corpo. Entre todas as espécies comparadas, os machos de T. podisi possuem asas mais largas que fêmeas. A presença de endossimbiontes foi bastante variável entre os ovos hospedeiros e os parasitoides oriundos destes ovos. Wolbachia pipientis foi detectada apenas em T. podisi oriundo de ovos de T. perditor. A espécie de bactéria endossimbionte Serratia grimesii também foi detectada entre as amostras. Os resultados obtidos fornecem informações que auxiliam o entendimento sobre a dinâmica ecológica de parasitismo a campo e adaptação hospedeira de T. podisi e norteiam a elaboração de programas de controle de qualidade da produção em massa e posterior liberação de T. podisi para o manejo de pentatomídeos-praga na cultura da soja.
Palavras-chave: Controle biológico. Pentatomidae. Parasitoide de ovos. Dispersão.
ABSTRACT The success of biological control programs for insect pests is dependent on a detailed understanding of biological, behavioral parameters and the dispersion capacity of control agents in agroecosystems. After the reference specification approval for registration and commercialization, the optimization of technological packages is expected to guarantee the efficiency and suitability of a macrobiological agent. This is the case of the pentatomid egg parasitoid, Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae). With the limitations of the recurrent use of insecticides in the control of phytophagous stink bugs in large crops of high economic importance such as soy, the release of T. podisi in large areas has been seen as a promising and relevant control strategy. In this context, biological parameters inherent to the development of quality control for mass farming and field release of T. podisi were explored in the present study. Bioassays of preference for fresh or eggs cryopreserved Euschistus heros (Fabricius) (Hemiptera: Pentatomidae), morphometric study and identification of endosymbionts were carried out in the laboratory, as well as the determination of the ideal proportion of T. podisi females/ host egg in order to decrease the intraspecific competition to increase parasitism rates in laboratory conditions of parasitoid multiplication. In addition, the study of the dispersion capacity of T. podisi was carried out from matrices of demarcated equidistant points and central release of the recommended number of females, according to the reference specification of use, in soybean plantations. The endosymbiont bacteria Wolbachia pipientis and Serratia grimesii were detected in T. podisi. Parasitoids multiplied in fresh E. heros eggs have a prolonged egg-adult development period and longer tibiae. The number of females/ egg that allows a higher rate of parasitism and 8.87 females and from 9.28 eggs/ female there is a parasitism stimulus of T. podisi. The use of the ideal proportion of T. podisi females/ host egg and the minimum number of host eggs/ female in mass rearing in order to decrease intraspecific competition may lead to increased rates of parasitism in laboratory conditions of parasitoid multiplication. The maximum foraging distance reached by T. podisi was 39 meters during the phenological stage of soybean Vn-R1 and 30.90 meters in stage R5-R6. Females from P. guildinii eggs have narrower wings and shorter body length. Among all the species compared, males of T. podisi have wider wings than females. The presence of endosymbionts was quite variable between host eggs and parasitoids from these eggs. Wolbachia pipientis was detected only in T. podisi from eggs of T. perditor. The species of endosymbiont bacteria Serratia grimesii was also detected among the samples. The results obtained provide information that helps to understand the ecological dynamics of parasitism in the field and host adaptation of T. podisi and guide the development of quality assessment programs for mass rearing and later release of T. podisi for the management of pentatomids pest in soybean crops.
Keywords: Biological control. Pentatomidae. Egg parasitoid. Dispersion.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL...... 17 CAPÍTULO 1 - MANEJO DE Euschistus heros (HEMIPTERA: PENTATOMIDAE) VIA LIBERAÇÃO INUNDATIVA DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE)...... 21 1.1 A cultura da soja...... 22 1.2 Manejo Integrado de Pragas da soja...... 22 1.3 Aspectos bioecológicos de Euschistus heros...... 24 1.4 Inimigos naturais de E. heros...... 25 1.5 Aspectos bioecológicos de Telenomus podisi...... 26 1.6 Criação massal e controle de qualidade de T. podisi.... 28 1.7 Identificação de endossimbiontes associados a parasitoides de ovos...... 29 1.8 Dispersão de T. podisi...... 31 1.9 Considerações finais...... 32 1.10 REFERÊNCIAS...... 32 CAPÍTULO 2 - CONTROLE DE QUALIDADE E PREFERÊNCIA HOSPEDEIRA DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE) EM OVOS FRESCOS E CRIOPRESERVADOS DE Euschistus heros (HEMIPTERA: PENTATOMIDAE)...... 43 2.1 INTRODUÇÃO...... 45 2.2 MATERIAL E MÉTODOS...... 46 2.2.1 Obtenção dos insetos...... 46 2.2.1.1 Multiplicação de E. heros...... 46 2.2.1.2 Multiplicação de T. podisi...... 47 2.2.2 Bioensaios de preferência de T. podisi em ovos de E. heros...... 48 2.2.3 Morfometria de T. podisi...... 49 2.2.4 Bioensaios de testes de voo de T. podisi...... 50 2.2.5 Identificação de endossimbiontes associados a T. podisi...... 51 2.2.6 Análises estatísticas...... 54 2.3 RESULTADOS...... 55 2.3.1 Bioensaios de preferência de T. podisi em ovos de E. heros...... 55 2.3.2 Morfometria de T. podisi...... 57 2.3.3 Bioensaios de testes de voo de T. podisi...... 58 2.3.4 Identificação de endossimbiontes associados a T. podisi...... 59 2.4 DISCUSSÃO...... 61 2.5 REFERÊNCIAS...... 63 CAPÍTULO 3 - PARÂMETROS BIOLÓGICOS E PROPORÇÃO IDEAL DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE) PARA CRIAÇÃO MASSAL EM OVOS DE Euschistus heros (HEMIPTERA: PENTATOMIDAE)...... 69 3.1 INTRODUÇÃO...... 70 3.2 MATERIAL E MÉTODOS...... 72 3.2.1 Obtenção dos insetos...... 72 3.2.2 Biologia reprodutiva de T. podisi em ovos de E. heros...... 72
3.2.3 Proporção ideal de T. podisi em ovos de E. heros...... 73 3.2.4 Análises estatísticas...... 73 3.3 RESULTADOS...... 74 3.3.1 Biologia e proporção ideal de T. podisi em ovos de E. heros...... 74 3.4 DISCUSSÃO...... 77 3.5 REFERÊNCIAS...... 79 CAPÍTULO 4 - DISPERSÃO E DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE) PARA O MANEJO DE Euschistus heros (HEMIPTERA: PENTATOMIDAE) EM SOJA...... 83 4.1 INTRODUÇÃO...... 84 4.2 MATERIAL E MÉTODOS...... 85 4.2.1 Obtenção dos insetos...... 86 4.2.2 Avaliação da dispersão a campo...... 86 4.2.3 Análises estatísticas...... 87 4.3 RESULTADOS...... 88 4.4 DISCUSSÃO...... 91 4.5 REFERÊNCIAS...... 94 CAPÍTULO 5 - IDENTIFICAÇÃO DE ENDOSSIMBIONTES E PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE) EM OVOS DE DIFERENTES ESPÉCIES DE PENTATOMÍDEOS-PRAGA DA SOJA...... 98 5.1 INTRODUÇÃO...... 99 5.2 MATERIAL E MÉTODOS...... 102 5.2.1 Estudo morfométrico e identificação de endossimbiontes em T. podisi oriundos de diferentes ovos hospedeiros...... 102 5.2.2 Análises estatísticas...... 104 5.3 RESULTADOS...... 105 5.3.1 Estudo morfométrico e identificação de endossimbiontes em T. podisi oriundos de diferentes ovos hospedeiro...... 105 5.4 DISCUSSÃO...... 109 5.5 REFERÊNCIAS...... 112 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 117 REFERÊNCIAS...... 119
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INTRODUÇÃO GERAL
A cultura da soja, Glycine max L., é a principal commoditie agrícola de exportação no Brasil (RAUCCI et al., 2015). A produção no Brasil, atrás apenas dos EUA, foi de mais de 114 milhões de toneladas colhidas em 35,822 milhões de hectares (CONAB, 2019). O estado do Mato Grosso foi o maior produtor de soja no país, com 32,455 milhões de toneladas em mais de nove milhões de hectares na safra de 2019/2020. A importância da sojicultura brasileira é diretamente relacionada ao alto consumo interno e da exportação da produção sob a forma de grãos, farelo e óleo que impulsiona o agronegócio e a economia. No entanto, milhões de toneladas produzidas são perdidas em todas as safras devido a condições climáticas adversas, doenças e, danos causados por pragas. A redução na produtividade da soja, não relacionada à área plantada, é afetada por fatores ambientais e adversidades climáticas, problemas de logística de produção e transporte, competição de plantas daninhas, incidência de doenças e de pragas (CONAB, 2019) sendo os percevejos, pragas-chave pois atacam diretamente as vagens e as sementes (PANIZZI et al., 2015). A estratégia de Manejo Integrado de Pragas da Soja foi implantada no Brasil, na década de 1970, e tem sido aperfeiçoada constantemente. Assim, o monitoramento da lavoura, a identificação correta das pragas e dos inimigos naturais, o conhecimento do estádio de desenvolvimento da planta e dos níveis de ação são importantes componentes que têm sido difundidos aos poucos entre sojicultores (SIMONATO et al., 2014). Dentre os insetos-praga que atacam a cultura, um complexo de percevejos fitófagos é responsável por grande parte das injúrias que limitam a produtividade. Atualmente, destaca-se o percevejo-marrom-da-soja, Euschistus heros (Fabricius) (Hemiptera: Pentatomidae), considerado uma das principais pragas desde as regiões mais quentes do norte do Paraná até o Centro-Oeste brasileiro (CORRÊA-FERREIRA et al., 2002; ÁVILA & GRIGOLLI, 2014; TIMBÓ et al., 2014). O controle dos percevejos da soja é realizado principalmente com o uso de inseticidas. Atualmente, no Brasil, entre os produtos registrados, além do uso difundido de organofosforados, outros grupos químicos de inseticidas como piretroides e neonicotinoides ainda são utilizados (ANVISA, 2019). No entanto, alguns desses produtos tiveram a sua utilização proibida ou estão em vias
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de reavaliação toxicológica, como o acefato (SOSA-GÓMEZ & OMOTO, 2012). Portanto, há restrita disponibilidade de princípios ativos com modos de ação distintos, desfavorecendo a rotação do uso e o adequado manejo da resistência (BUENO et al., 2011; BELO et al., 2012). Como alternativa a essa limitação, o uso de outras táticas como o controle biológico dentro de um manejo integrado de pragas, apresenta-se bastante promissor. O controle biológico aplicado com o uso de parasitoides de ovos é relatado como eficiente no controle de diversas pragas, principalmente lagartas desfolhadoras e o complexo de pentatomídeos que atacam a soja. O uso de parasitoide de ovos no manejo de pentatomídeos da soja provou ser eficaz tanto dentro de estratégias de controle biológico clássico (EHLER, 2002), quanto inoculativo (CORRÊA-FERREIRA, 2002). Liberações inundativas desses agentes de controle biológico reduzem a população de pragas para um nível inferior ao nível de dano econômico, de modo análogo ao uso dos produtos fitossanitários (BUENO et al., 2011). O parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead, 1893 (Hymenoptera: Platygastridae) é relatado como um dos principais inimigos naturais de pentatomídeos fitófagos que atacam a cultura da soja (MICHEREFF et al., 2015), demonstrando preferência por E. heros com alto nível de parasitismo, e mais de 80% em ocorrência natural (PACHECO & CORRÊA-FERREIRA, 2000; MICHEREFF et al., 2016). Ao se tratar de áreas extensas de monocultura e da necessidade de repetidas liberações inoculativas de T. podisi ao longo do ciclo da soja, o uso da biotecnologia é dependente da produção de ovos dos hospedeiros em larga escala. Com o aumento da população de E. heros em plantações de soja (CORRÊA-FERREIRA, 2002) e desenvolvimento de pesquisas voltadas à multiplicação massal desta espécie em laboratório, com dietas naturais e artificiais bem estabelecidas, o percevejo- marrom-da-soja tem sido considerado um bom hospedeiro para o estabelecimento de criação massal de T. podisi. Apesar de em condições de laboratório, T. podisi demonstrar preferência por ovos do percevejo-barriga-verde, Dichelops melacanthus (Dallas, 1851) (Hemiptera: Pentatomidae (QUEIROZ et al., 2018), criações de E. heros fornecem quantidades satisfatórias de ovos e técnicas de otimização dessa produção para a multiplicação massal de parasitoides de ovos já foram desenvolvidas (SILVA et al., 2008). Outra técnica que confere vantagem para o
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desenvolvimento e manutenção de criações massais de T. podisi é a criopreservação dos ovos do hospedeiro, permitindo maior controle na oferta de ovos a cada geração em biofábricas, sincronizando com a presença de surtos populacionais da praga ou chegada de percevejos colonizadores (FOERSTER & DOETZER, 2006). Entretanto, os efeitos da criopreservação de ovos hospedeiros em baixas temperaturas (geralmente em nitrogênio líquido, a -196 ºC) devem ser devidamente explorados ao longo de gerações a fim de constatar que não há perda da qualidade do produto macrobiológico (CINGOLANI et al., 2018). Além disso, a eficiência de linhagens de T. podisi mantidas em laboratório em ovos hospedeiros criopreservados ao longo do tempo necessita de comprovações esporádicas a campo. Pensando em um contexto de estabelecimento de criações massais de parasitoides de ovos, e constatação da manutenção do fitness do produto macrobiológico ao longo do tempo, ainda se faz necessário o estudo de um conjunto de técnicas apropriadas ao controle de qualidade de T. podisi. Testes de voo, o conhecimento dos endossimbiontes de populações silvestres e seus efeitos sobre a biologia dos parasitoides de ovos são assuntos a serem elucidados. A eficiência dos inimigos naturais é crucial ao sucesso de programas de controle biológico e resultados insatisfatórios devido à queda de qualidade destes agentes macrobiológicos podem levar à má fama do produto e do controle biológico (PREZOTTI & PARRA, 2002; NARANJO-GUEVARA et al., 2020). Assim, o controle de qualidade esporádico pode evitar o estabelecimento de características indesejáveis (alterações comportamentais que comprometem o forrageamento do ovo hospedeiro a campo, endogamia, perda de endossimbiontes importantes à aclimatação e resistência do inseto a condições adversas e contaminações por patógenos) em linhagens de parasitoides de ovos (VACARI et al., 2012; NARANJO-GUEVARA et al., 2020). O controle de qualidade das linhagens de T. podisi em biofábricas que já iniciaram a comercialização após a recente liberação da especificação de referência deste parasitoide de ovos pelo MAPA (2019) deve ser implementado inicialmente. Embora a eficácia do uso de agentes de controle biológico, como os parasitoides, seja uma realidade, ainda são necessários estudos detalhados da biologia de T. podisi em E. heros e a capacidade real de dispersão do parasitoide multiplicado em
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laboratório a campo, que influi no número ideal de insetos necessários na liberação para o sucesso do controle de determinada praga. Diante o exposto, o avanço em estudos que elucidam o entendimento de parâmetros biológicos inerentes à criação massal, controle de qualidade e da dinâmica de ação de T. podisi a campo, poderá contribuir na elaboração de técnicas de liberação mais assertivas que permitam a concretização do uso eficiente de agentes de controle biológico de pentatomídeos na soja. O presente trabalho teve por objetivo o estudo de parâmetros biológicos inerentes ao desenvolvimento de um controle de qualidade para a criação massal, bem como a determinação da capacidade de dispersão e distribuição espacial de Telenomus podisi Ashmead, 1893 (Hymenoptera: Platygastridae) a campo.
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CAPÍTULO 1
MANEJO DE Euschistus heros (HEMIPTERA: PENTATOMIDAE) VIA LIBERAÇÃO INUNDATIVA DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE)
RESUMO O manejo do percevejo-marrom Euschistus heros Fabricius (Hemiptera: Pentatomidae) a partir de programas de controle biológico aplicado é dependente do entendimento detalhado de parâmetros biológicos, comportamentais e da capacidade de dispersão dos agentes de controle nos agroecossistemas. Após a saída da especificação de referência para registro e comercialização, é esperada a otimização de pacotes tecnológicos para garantir a eficiência e idoneidade de um agente macrobiológico. É o caso do parasitoide de ovos de pentatomídeos-praga, Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae). Com o uso indiscriminado de inseticidas no controle de percevejos fitófagos em grandes culturas de elevada importância econômica como a soja, a liberação de T. podisi em áreas extensas vem sendo vista como uma estratégia de controle promissora e pertinente. Neste contexto, conceitos e estudos sobre aspectos bioecológicos; parâmetros inerentes ao desenvolvimento de um controle de qualidade para a criação massal; dispersão e liberações em massa de T. podisi dentro de programas de manejo integrado de pragas da soja foram explorados. O conhecimento contido na literatura especificamente sobre o uso de T. podisi a campo ainda é relativamente pequeno, entretanto fornece bases sólidas para o desenvolvimento de pesquisas mais assertivas num futuro próximo e evidencia lacunas que carecem de atenção e esclarecimento na otimização de liberações inundativas de parasitoides de ovos em extensas áreas de cultivo. Palavras-chave: Controle biológico. Pentatomidae. Parasitoide de ovos. MIP.
ABSTRACT The brown stink bug Euschistus heros Fabricius (Hemiptera: Pentatomidae) management from applied biological control programs is dependent on a detailed understanding of biological, behavioral parameters and the dispersion capacity of control agents in agroecosystems. After the reference specification approval for registration and commercialization, the optimization of technological packages is expected to guarantee the efficiency and suitability of a macrobiological agent. This is the case of the pentatomid egg parasitoid pentatomid, Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae). As a consequence of the indiscriminate insecticide use to control phytophagous stink bugs in large crops of high economic importance such as soybean, the T. podisi mass release in large areas has been seen as a promising and relevant management strategy. In this context, concepts and studies on bioecological aspects; parameters inherent to the development of a quality control for mass rearing; dispersion and mass release of T. podisi inside integrated soybean pest management programs were explored. The knowledge contained in the literature specifically on the use of T. podisi in the field is still relatively small, however it provides solid bases for the development of more assertive research in the near future and highlights gaps that need attention and clarification in the optimization of mass releases of egg parasitoids in wide cultivate crops.
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Keywords: Mass rearing. Pentatomidae. Egg parasitoid. IPM.
1.1 A cultura da soja A soja, Glycine max L., é uma planta da família Fabaceae, originária da China. É uma planta anual, herbácea, ereta e autógama. Pode atingir cerca de 0,2 a 1,5 metros até o desenvolvimento completo que chega até 75 dias, para cultivares precoces, e 200 dias para as tardias, conforme as condições de cultivo (PROBST & JUDD, 1973). A produtividade no Brasil, atrás apenas dos EUA, foi de mais de 114 milhões de toneladas colhidas em 35,822 milhões de hectares na safra de 2019 (3.206 kg/ha) (CONAB, 2019). O estado do Mato Grosso foi o maior produtor de soja no país, com 32,455 milhões de toneladas em 9,7 milhões de hectares. A produção brasileira de soja na temporada 2019/2020 foi estimada em 121,09 milhões de toneladas de acordo com o levantamento realizado pela Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2019). A importância da sojicultura brasileira está relacionada ao alto consumo interno e da exportação sob a forma de grãos, farelo e óleo que impulsionam o agronegócio e a economia. O processamento industrial dos grãos da soja e seus derivados proporcionam inúmeras utilizações, tais como: alimentação humana, adubação verde, nutrição animal (silagem e farelo), produção de tintas, fibras, adesivos, tecidos e cosméticos, além da fabricação de energia renovável, na forma de biodiesel. A oleaginosa é a cultura agrícola que mais cresceu no Brasil nas últimas três décadas, chegando a 49% da área plantada com grãos no país (CONAB, 2019). A redução na produtividade da soja, não relacionada à área plantada, é afetada por fatores ambientais e adversidades climáticas, problemas de logística de produção e transporte, competição de plantas daninhas, incidência de doenças e de pragas (CONAB, 2019) sendo os percevejos, pragas-chave pois atacam diretamente as vagens e as sementes (PANIZZI et al., 2015).
1.2 Manejo Integrado de Pragas da soja O Manejo Integrado de Pragas da soja é considerado um dos exemplos mais expressivos no mundo em relação ao impacto socioeconômico e ambiental, servindo de modelo para outros programas no Brasil e em outros países da América Latina
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(SIMONATO et al., 2014). Com a adoção do MIP na cultura da soja, grande parte de inseticidas deixaram de ser aplicados no agroecossistema e, as aplicações passaram a ter critérios técnicos, baseados em níveis de ação e de não-ação (referente ao número de inimigos naturais na área), estimados através do monitoramento das pragas (CONTE et al., 2014). A implantação de programas de manejo integrado de pragas inicialmente favoreceu a cultura da soja, voltando-se, principalmente, para o controle biológico da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Noctuidae), e alguns dos percevejos fitófagos recorrentes na cultura em várias regiões do país (RAMIRO et al., 1986; PESSOA et al., 2014). Na última década, têm-se avançado nos estudos de agentes bióticos controladores de pragas agrícolas, possibilitando implantar programas de controle biológico em áreas extensas de monocultura (VOLPE et al., 2014).
O Manejo Integrado de Pragas da Soja foi implantado no Brasil, na década de 1970, e tem sido aperfeiçoado constantemente. Assim, o monitoramento da lavoura, a identificação correta das pragas e dos inimigos naturais, o conhecimento do estádio de desenvolvimento da planta e dos níveis de ação são importantes componentes que têm sido difundidos aos poucos entre sojicultores (SIMONATO et al., 2014). A cultura da soja está sujeita ao ataque de insetos desde a germinação à colheita. Logo após a emergência das plântulas, a partir do início do estádio vegetativo, vários insetos como o bicudo-da-soja Sternechus subsignatus Boheman, 1836 (Coleoptera: Curculionidae), a lagarta-elasmo Elasmopalpus lignosellus Zeller, 1848 (Lepidoptera: Pyralidae), os corós (Scarabaeidae) e os percevejos-castanhos-da- raiz Scaptocoris castanea Perty, 1830 e Atarsocoris brachiariae Becker, 1996 (Hemiptera: Cydnidae) danificam a cultura. Com o avançar do ciclo da cultura, a lagarta-da-soja Anticarsia gemmatalis Hubner, 1818, a lagarta falsa-medideira Chrysodeixis includens Walker, 1858, Helicoverpa armigera Hubner e o complexo Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae) atacam as plantas, ocorrendo em maior número durante as fases vegetativa e de floração. Com o início da fase reprodutiva, surgem os pentatomídeos sugadores de vagens e sementes (Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Thyanta perditor, Edessa meditabunda, Euschistus heros, dentre outras espécies), dentre outras espécies, que causam danos desde a formação das vagens até o final do enchimento dos grãos (CORRÊA-FERREIRA et al., 2002; PANIZZI et al., 2015; CONTE et al., 2014).
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Os insetos-praga têm suas populações controladas naturalmente por predadores, parasitóides e fungos entomopatogênicos, conhecidos como inimigos naturais. Com a chegada do fungo Phakopsora pachyrhizi Sidow, causador da ferrugem asiática, uma das principais doenças da soja, capaz de reduzir a produtividade das lavouras em 80%, devido sua alta capacidade de disseminação, e ocorrer nos principais estados produtores (TSCHURTSCHENTHALER et al., 2012; FREITAS et al., 2016), deu-se início a intensa aplicação de fungicidas na cultura. Em decorrência disso, o agroecossistema entrou em desequilíbrio, ocasionando maior incidência de lagartas desfolhadoras, principalmente Chrysodeixis includens, anteriormente controladas pelo fungo entomopatogênico Nomuraea rileyi (SONG et al., 2014; COSTA et al., 2015). A chegada de H. armigera ao Brasil na safra de 2012/2013 também desencadeou intenso desequilíbrio pelo desenfreado uso de inseticidas nas lavouras de soja em todo o país (KRITICOS et al., 2015). As mudanças climáticas e o aumento da temperatura em até 2º C nos trópicos também levou à explosão populacional de E. heros na cultura, explorando nichos deixados pelo uso do evento de soja Bt (WEILER et al., 2016; CARVALHO, 2014). Assim, as alterações dinâmicas da ocorrência de pragas na soja alertam pelo uso de um manejo integrado consolidado, necessitando-se aplicar conhecimento de seletividade de pesticidas aos inimigos naturais, pesquisa em fontes genéticas de resistência de plantas e conhecimentos de aspectos inerentes à produção massal de inimigos naturais aliados ao controle biológico conservativo.
1.3 Aspectos bioecológicos de Euschistus heros O percevejo Euschistus heros (Fabricius, 1794) (Hemiptera: Pentatomidae) é nativo da América Tropical, estando bem adaptado aos climas mais quentes e possuindo maior abundância no Centro-Oeste do Brasil (DEGRANDE & VIVAN, 2002). Além da soja, podem se alimentar de amendoim-bravo, Euphorbia heterophylla L., carrapicho-de-carneiro Acanthospermum hispidum DC, girassol Helianthus annuus L., feijão guandu Cajanus cajan (L.) Millsp., dentre outras plantas consideradas daninhas em que consegue manter-se até o período migratório para a nova safra de soja (PANIZZI et al., 2015).
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Os adultos de E. heros medem cerca de 1 cm de comprimento, possuindo coloração marrom em todo o corpo. No protórax, possuem dois espinhos laterais e há de uma mancha branca em formato de meia-lua no final do escutelo, acima da parte membranosa das asas (MOREIRA et al., 2012). As fêmeas ovipositam massas contendo entre 5 a 7 ovos de coloração amarelada na parte abaxial das folhas e nas vagens das plantas. As ninfas recém-eclodidas são de coloração avermelhada e permanecem sobre os ovos, em instinto gregário, até o segundo ínstar, iniciando a alimentação. Na planta, a partir do terceiro instar, se inicia a dispersão, tornando-se mais ativas e passando a sugar os grãos. Os adultos apresentam longevidade média de 116 dias, podendo viver por mais de até 300 dias (PACHECO & CORREA- FERREIRA, 2000; PANIZZI et al., 2015). Durante a safra podem ocorrer até três gerações, e, após a colheita dos grãos, migram para cultivos mais tardios e/ou para outras plantas hospedeiras. O ciclo de vida médio é de 36 dias, sendo de cinco a sete dias até a eclosão das ninfas, 29 dias em fase ninfal e 78 dias de adulto (DEGRANDE & VIVAN, 2002). As injúrias resultantes do ataque de E. heros ocasionam o enrugamento ou chochamento dos grãos, provocado pela sucção da seiva das vagens durante o enchimento; retenção foliar conhecida por “soja louca”, em que há a permanência de folhas verdes nas plantas quando as vagens estão em ponto de colheita e; o favorecimento da incidência de fitopatógenos sobre os grãos e as sementes, intensificando os danos antes e depois da colheita (MOREIRA et al., 2012).
1.4 Inimigos naturais de E. heros Os parasitoides são considerados eficientes controladores de pentatomídeos, impedindo que o hospedeiro cause danos à cultura, pela interrupção do ciclo biológico da praga e crescimento populacional (PAZ-NETO et al., 2015). Os percevejos estão sujeitos ao ataque de parasitoides desde a fase de ovo até a fase adulta. Dentre as 20 espécies de parasitoides de ovos de percevejos já constatadas na cultura da soja, encontram-se os microhimenópteros platigastrídeos Trissolcus basalis e Telenomus podisi, que vêm sendo produzidos massalmente em laboratórios para liberação no campo e controle de percevejos. T. basalis e T. podisi são pequenas vespas que medem até 1,3 mm de comprimento e que desenvolvem-
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se, de ovo a adulto, dentro de ovos de percevejos (COLAZZA, 2016; TOGNON et al., 2014). Além de ovos de E. heros, parasitam outras espécies do complexo de pentatomídeos que ocorrem na soja (MARUYAMA et al., 2002). Os ovos parasitados apresentam-se inicialmente acinzentados, passando a castanhos e a totalmente pretos, quando próximos à emergência dos adultos do parasitoide. O potencial reprodutivo é alto, cada fêmea de T. basalis é capaz de parasitar, em média, 240 ovos de percevejos; enquanto T. podisi é relatado em 80% de ocorrência natural de parasitismo de E. heros. Após a oviposição no interior do ovo hospedeiro, a fêmea faz a marcação do ovo parasitado, discriminando-o. O parasitóide de ovos T. podisi vem sendo produzido para liberação e controle de E. heros, pelo qual demonstra preferência a campo (MICHEREFF et al., 2015). O parasitismo em adultos de percevejos está representado principalmente por Trichopoda nitens (Diptera: Tachinidae), espécie importante na regulação das populações de N. viridula e E. heros, chegando a atingir níveis de até 95% de parasitismo (DIOS, 2014; AGOSTINETTO et al., 2018), no período de entressafra, e por Hexacladia smithii (Hymenoptera: Encyrtidae) em populações de E. heros (TURCHEN et al., 2015). No interior desse percevejo, os parasitoides se desenvolvem em número de dois a 39/hospedeiro, em aproximadamente 35 dias, afetando o potencial reprodutivo do percevejo marrom. A maior contribuição de H. smithii tem sido observada nos meses de dezembro e janeiro (TURCHEN et al., 2015). O percevejo-marrom-da-soja, E. heros e demais pentatomídeos fitófagos são controlados também por fungos entomopatogênicos como Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Paecilomyces fumosoroseus (PIKE, 2014; SOSA-GOMEZ, 2017). Contudo, a incidência desses fungos é muito baixa, geralmente não atingindo 1% de incidência em populações naturais de percevejos (SOSA-GOMEZ, 2014).
1.5 Aspectos bioecológicos de Telenomus podisi O parasitoide de ovos Telenomus podisi é um microhimenóptero pertencente à família Platygastridae de vida livre que se alimenta de néctar ou mel. Possui aproximadamente 1 mm de comprimento, de coloração preta (PACHECO & CORRÊA- FERREIRA, 2000; BUENO et al., 2012). O dimorfismo sexual da espécie é realizado através das antenas, em que as fêmeas apresentam antenas clavadas e os machos
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filiformes (JOHNSON, 1984). Desenvolve-se dentro do ovo de diferentes hospedeiros da família Pentatomidae, Scutelleridae e Coreidae (MARGARÍA et al., 2009), estando adaptados a diversos hospedeiros e condições climáticas. A distribuição geográfica vai desde o Centro-Oeste até o sul do Brasil (MOREIRA & BECKER 1986, SILVA, 2017). O ciclo biológico desse parasitoide dura em torno de 10 a 14 dias quando estão submetidos a temperaturas entre 25 a 32°C (TORRES et al., 2006), estando até a emergência de adultos no interior do ovo hospedeiro (BUENO et al. 2012). Ao encontrar massa de ovos, as fêmeas aproximam a antena ao ovo hospedeiro, examinam e inserem o seu ovipositor na base do ovo. Em seguida, fazem uma marcação, passando o ovipositor sobre o córion, para evitar o superparasitismo. O desenvolvimento torna-se perceptível pela mudança de coloração dos ovos do hospedeiro, como nos ovos de E. heros (coloração amarela), que quando são parasitados mudam para marrom-acinzentado e depois para preto que é a mesma cor dos parasitoides adultos (BUENO et al., 2012). Os machos emergem um a dois dias antes das fêmeas e são atraídos para a cópula, assim que elas começam a mastigar o córion para a emergência (JOHNSON, 1984; BUENO et al., 2012). As fêmeas de T. podisi apresentam fecundidade média de 104 ovos, nos primeiros três dias de oviposição, em ovos de E. heros à 25°C (SILVA, 2017). Conforme a idade da fêmea aumenta, a proporção de ovos que originam machos adultos aumenta (BUENO et al., 2012). Em condições de laboratório, adultos de T. podisi vivem de 3 a 54 dias dependendo de fatores abióticos, alimentares e da exposição aos ovos hospedeiros. É um parasitoide solitário que se desenvolve em ovos de hospedeiros hemípteros com comportamento gregário no campo, incluindo espécies herbívoras e predadoras (como o percevejo asopíneo Podisus nigrispinus, Dallas 1851) (TORRES et al., 2006). No entanto, a preferência por determinados hospedeiros pode ser devido à predominância de uma determinada espécie hospedeira em maior abundância, por exemplo, em cultivos de soja, T. podisi apresenta preferência por E. heros (PACHECO & CORRÊA- FERREIRA, 2000). A incidência e manutenção de populações naturais desses parasitoides na sojicultura brasileira estão diretamente relacionadas às práticas de manejo adotadas na cultura, uma vez que são insetos sensíveis ao uso de pesticidas não seletivos (BUENO et al., 2012).
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1.6 Criação massal e controle de qualidade de T. podisi O uso de parasitoide de ovos no manejo de pentatomídeos da soja provou ser eficaz tanto dentro de estratégias de controle biológico clássico (EHLER, 2002), quanto inoculativo (CORRÊA-FERREIRA, 2002). Entretanto, ao se tratar de áreas extensas de monocultura e da necessidade de repetidas liberações inoculativas de T. podisi ao longo do ciclo da soja, o uso da biotecnologia é dependente da produção de ovos hospedeiros em larga escala. Com o aumento da população de E. heros em plantações de soja (CORRÊA-FERREIRA, 2002) e desenvolvimento de pesquisas voltadas à multiplicação massal desta espécie em laboratório, com dietas naturais e artificiais bem estabelecidas, o percevejo-marrom-da-soja tem sido considerado um bom hospedeiro para o estabelecimento de criação massal de T. podisi e, alternativamente Nezara viridula, para a multiplicação de Trissolcus basalis (PERES & CORRÊA-FERREIRA, 2001). Apesar de, em condições de laboratório, T. podisi demonstrar preferência por ovos do percevejo-barriga-verde, Dichelops melacanthus (QUEIROZ et al., 2018), criações de E. heros fornecem quantidades satisfatórias de ovos e técnicas de otimização dessa produção para a multiplicação massal de parasitoides de ovos já foram desenvolvidas (SILVA et al., 2008). Outra técnica que confere vantagem para o desenvolvimento e manutenção de criações massais de T. podisi é a criopreservação do ovo hospedeiro, permitindo maior controle na oferta de ovos a cada geração em biofábricas antes da liberação a campo, sincronizando com a presença de surtos populacionais da praga ou chegada de percevejos colonizadores (FOERSTER & DOETZER, 2006). Entretanto, os efeitos da criopreservação de ovos hospedeiros em baixas temperaturas (geralmente em nitrogênio líquido, a -196 ºC) devem ser devidamente explorados ao longo de gerações a fim de constatar que não há perda da qualidade do produto macrobiológico. Alguns estudos já comprovam que não há perda nos percentuais de parasitismo e emergência (CINGOLANI et al., 2018). Contudo, a eficiência de linhagens de T. podisi mantidas em laboratório em ovos hospedeiros criopreservados ao longo do tempo necessita de comprovações esporádicas a campo. Considerando um contexto de estabelecimento de criações massais de parasitoides de ovos, e constatação da manutenção do fitness do agente macrobiológico ao longo do tempo, ainda se faz necessário o estudo de um conjunto de técnicas apropriadas ao controle
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de qualidade de T. podisi. Testes de voo, o levantamento dos endossimbiontes de populações silvestres e seus efeitos sobre a biologia dos parasitoides de ovos são assuntos a serem elucidados.
A eficiência dos inimigos naturais é crucial ao sucesso de programas de controle biológico e resultados insatisfatórios devido à queda de qualidade destes agentes macrobiológicos podem levar à insatisfação em relação ao produto e ao controle biológico (PREZOTTI & PARRA, 2002). Assim, o controle de qualidade sistemático pode evitar o estabelecimento de características indesejáveis (alterações comportamentais que comprometem o forrageamento do ovo hospedeiro a campo, deterioração genética, perda de endossimbiontes importantes à aclimatação e resistência do inseto a condições adversas e contaminações por patógenos) em linhagens de parasitoides de ovos (VACARI et al., 2012). Portanto, o controle de qualidade das linhagens de T. podisi em biofábricas que já iniciaram a comercialização após a recente liberação da especificação de referência deste parasitoide de ovos pelo MAPA (2019) deve ser implementado. Como exemplo, temos a preocupação com a qualidade de linhagens liberadas de Cotesia flavipes Cameron (Hymenoptera: Braconidae) nos últimos anos (HIVIZI et al., 2009), enfatizando que um controle de qualidade acentuado garante o acréscimo e a manutenção da eficiência do produto macrobiológico comercializado ao longo do tempo.
1.7 Identificação de endossimbiontes associados a parasitoides de ovos A interação entre insetos e bactérias (entre outras classes de microrganismos) evoluiu ao longo de milhões de anos, na maioria das vezes, culminando em associações simbióticas que variam do mutualismo ao parasitismo (PRADANA et al., 2019). Os endossimbiontes fornecem uma função facultativa, ou até mesmo obrigatória em alguns casos. Endossimbiontes obrigatórios herdados maternalmente geralmente estão associados ao fornecimento de benefícios nutricionais, disponibilizando nutrientes essenciais em órgãos hospedeiros específicos, como o mesêntero de insetos e, quando ausentes podem ocasionar redução no peso corporal e conteúdo nutricional destes indivíduos (BAUMANN, 2005). No caso de endossimbiontes facultativos que vivem na hemolinfa de artrópodes, a transmissão se dá horizontalmente entre os hospedeiros, como por exemplo, ao realizarem a trofalaxia (muito comum em insetos sociais) (ISHII et al., 2013). O grupo de
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endossimbiontes bacterianos compreendidos por Wolbachia (Rickettsiales: Anasplamataceae) é um exemplo bastante conhecido de endossimbiontes facultativos. São relatadas em cerca de 70% das espécies de insetos existentes (WERREN et al., 1995). Em artrópodes é encontrada principalmente no citoplasma das células hospedeiras dos órgãos reprodutivos e em hemócitos e sistema nervoso (LOUIS & NIGRO, 1989). Em insetos e nematoides, Wolbachia é passada à prole via transmissão transovariana (WERREN, 1997) e geralmente condiciona mudanças significativas na razão sexual a partir da promoção da partenogênese (STOUTHAMER et al., 1999). Os endossimbiontes são capazes de manipular seus hospedeiros suprimindo entomopatógenos e afetando a resistência de insetos a fatores adversos. Muitos parasitoides economicamente importantes, como os dos gêneros Trichogramma sp. e Cotesia sp., requerem a presença de Wolbachia para a manutenção de funções reprodutivas (DEDEINE et al., 2005). Endossimbiontes do gênero Rickettsia podem proporcionar melhora no fitness de insetos hospedeiros em condições de campo e laboratório e também estão associados ao aumento de fêmeas numa população (CASS et al., 2015). A proteção contra fatores ambientais causadores de estresse como toxinas, presença de predadores/parasitoides e aumento de temperatura também constitui uma vantagem gerada pela endossimbiose. A presença de Wolbachia e Rickettsia também pode estar relacionada à diminuição da resistência do hospedeiro a inseticidas. Endossimbiontes pertencentes à família Enterobacteriaceae, como os gêneros de bactérias Serratia sp., Hamiltonella sp., Regiella sp., e Arsenophonus sp.; também são relatados como mediadores nas relações de susceptibilidade versus resistência do hospedeiro a inseticidas (CASS et al., 2015). Outros gêneros de endossimbiontes que comumente estão presentes em parasitoides de ovos e hospedeiros são Sodalis sp., relacionado às adaptações metabólicas às condições ambientais; Spiroplasma sp., relatado como facilitadores da resistência do hospedeiro à entomopatógenos e; Cardinium sp., relatado como sendo um manipulador reprodutivo em insetos (STOUTHAMER et al., 2019). Há muito para ser esclarecido nas relações e mecanismos de ação de endossimbiontes sobre insetos. Entretanto, é inegável que alterações na frequência destes microrganismos ao longo das gerações de parasitoides de ovos podem gerar alterações biológicas e
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comportamentais significativas, sendo de fundamental importância a elucidação dos tipos de endossimbiontes presentes em populações silvestres e laboratoriais de parasitoides. Microsporídios e parasitas intracelulares são outros tipos de endossimbiontes que, quando presentes em populações de inimigos naturais, podem se tornar um problema de contaminação para os programas de controle biológico (SIMÕES et al., 2012), ocasionando alterações em características biológicas importantes como o aumento do tempo de desenvolvimento e redução de longevidade e da capacidade reprodutiva. As infecções ainda podem interferir na capacidade de forrageamento do agente macrobiológico a campo, sendo de fundamental importância o diagnóstico esporádico da presença de contaminantes dentro de um controle de qualidade (KERMANI et al., 2014).
1.8 Dispersão de T. podisi O estudo da atividade de dispersão e forrageamento de parasitoides permite a geração de conhecimentos aplicáveis ao controle biológico de insetos-praga e visão ecológica nas interações entre parasitoides e hospedeiros (DINARDO-MIRANDA et al., 2014; UMBANHOWAR et al., 2003). Algumas características biológicas são consideradas essenciais na avaliação da eficiência de um inimigo natural, sobretudo para o desenvolvimento de estratégias de controle e metodologias de liberação a campo. Dentre as mais importantes destacam-se: taxa de desenvolvimento, longevidade, capacidade de forrageamento, fecundidade, capacidade de dispersão e razão sexual (DOETZER & FOERSTER, 2013). Dentre esses aspectos comportamentais, o estudo da capacidade de dispersão e distribuição espacial do parasitoide de ovos T. podisi ainda é incipiente, sendo muitas vezes subestimada a campo pela falta de desenvolvimento de técnicas mais assertivas na avaliação e coleta de dados.
Pesquisas anteriores indicam baixo parasitismo e dispersão de T. podisi: aproximadamente 39 metros a partir do ponto de liberação (BUENO et al., 2013). Dessa forma, conclui-se que a dispersão de T. podisi em campo deve ser reavaliada para a verificar o real deslocamento do parasitoide em campo através de métodos de marcação concisos (como a de origem isotópica) e que certifiquem a dinâmica
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Desses indivíduos na área após a liberação, excluindo-se a ocorrência natural para fins de constatação científica da distribuição espacial de T. podisi (BUENO et al., 2013; GOLIN, 2014).
1.9 Considerações finais Diante o exposto, conclui-se que os efeitos da criopreservação de ovos; o estudo da capacidade de dispersão; a proporção ideal de fêmeas/ovo hospedeiro; parâmetros biológicos em outros potenciais hospedeiros, dentre outros aspectos, ainda devem ser devidamente explorados dentro de um contexto de multiplicação em massa de T. podisi para o uso em programas de CBA voltados ao manejo de E. heros e demais pentatomídeos-praga da soja.
1.10 REFERÊNCIAS AGOSTINETTO, A.; PANIZZI, A. R.; LUCINI, T. Monthly parasitism rate by tachinid flies and egg allocation on the body of Dichelops furcatus. Florida Entomologist, v. 101, n. 1, p. 91-96, 2018. DOI: https://doi.org/10.1653/024.101.0116. Disponível em:
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Disponível em: 43 CAPÍTULO 2 CONTROLE DE QUALIDADE E PREFERÊNCIA HOSPEDEIRA DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE) EM OVOS FRESCOS E CRIOPRESERVADOS DE Euschistus heros (HEMIPTERA: PENTATOMIDAE) RESUMO O controle alternativo de pentatomídeos-praga na cultura da soja tem se apresentado cada vez mais promissor a partir de liberações inundativas do parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae). Após a saída da especificação de referência para registro e comercialização de T. podisi, é esperada a otimização de pacotes tecnológicos para garantir a eficiência e idoneidade do produto macrobiológico. Contudo, informações que permeiam o crescimento exponencial assertivo de criações massais de T. podisi ainda carecem de atenção. Portanto, o presente estudo teve como objetivo a avaliação da preferência hospedeira de T. podisi entre ovos frescos e criopreservados do hospedeiro Euschistus heros Fabricius (Hemiptera: Pentatomidae) e a condução de experimentos relacionados à elaboração de um programa de controle de qualidade para este importante agente de controle biológico. Os bioensaios de preferência de T. podisi por ovos frescos ou criopreservados (em nitrogênio líquido, -196 ºC) de E. heros foram realizados em arenas confeccionadas utilizando tubos do tipo Falcon de 50 mL com quatro tubos de Durhan de acrílico acoplados na parte basal, formando uma cruz. Dessa forma, 20 arenas foram dispostas de forma inteiramente casualizada e cada uma recebeu quatro cartelas de papel couché de 4x1 cm com 40 ovos de E. heros (duas contendo ovos que foram criopreservados por 30 dias a -196 ºC e duas contendo ovos frescos de 24 h, devidamente identificadas), uma em cada tubo de Durhan. Fêmeas de T. podisi oriundas de ovos frescos e fêmeas oriundas de ovos criopreservados de E. heros foram liberadas, separadamente, por um orifício central superior e puderam escolher entre os dois tipos de ovos para parasitismo. Após 24 h, as cartelas foram retiradas das arenas e posteriormente parâmetros como a razão sexual, tempo de desenvolvimento ovo-adulto e os percentuais de emergência e parasitismo foram avaliados. Amostras de machos e fêmeas oriundos de cada tratamento (FF. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos frescos; FC. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos criopreservados; CF. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos frescos e; CC. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos criopreservados) foram coletadas para análise de caracteres morfométricos e identificação de endossimbiontes. As populações dos diferentes tratamentos também foram submetidas a testes de voo. O parasitismo de T. podisi foi significativamente maior em ovos frescos, entretanto o ciclo do parasitoide é encurtado em ovos criopreservados. Os comprimentos de tíbia e de corpo são maiores em fêmeas de T. podisi oriundas de ovos frescos a porcentagem de insetos voadores é maior que 60 em populações oriundas de ovos hospedeiros criopreservados. Além disso, a bactéria endossimbionte Wolbachia pipientis é presente nas populações de T. podisi dos diferentes tratamentos enquanto que Serratia grimesii apenas quando os parasitoides foram oriundos ou parasitados por matriz oriunda de ovos frescos. Os resultados obtidos norteiam a elaboração de programas de controle de qualidade da produção em massa de T. podisi para o manejo de pentatomídeos-praga na cultura da soja. 44 Palavras-chave: Criação massal. Pentatomidae. Parasitoide de ovos. Controle de qualidade. ABSTRACT Alternative control of pentatomids in soybean crops has shown itself to be increasingly promising from the egg parasitoid Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) mass release. After the sanction of the reference specification for the registration and commercialization of T. podisi, optimization of technological packages is expected to guarantee the macrobiological product efficiency and suitability. However, information that permeates the assertive exponential growth of mass rearing of T. podisi still needs attention. Therefore, this study aimed to evaluate the host preference of T. podisi among fresh and cryopreserved eggs of the host Euschistus heros Fabricius (Hemiptera: Pentatomidae) and to conduct experiments related to the elaboration of a quality assessment program for this important biological control agent. T. podisi preference bioassays for fresh or cryopreserved eggs (in liquid nitrogen, -196 ºC) of E. heros were carried out in arenas made using 50 mL Falcon tubes with four acrylic Durhan tubes coupled in the basal part forming a cross. Thus, 20 arenas were arranged in a completely randomized manner and each received four 4x1 cm paper cards with 40 E. heros eggs (two containing eggs that were cryopreserved for 30 days at -196 ºC and two containing 24h fresh eggs, properly identified), one in each tube of Durhan. Females of T. podisi from fresh eggs and females from cryopreserved eggs from E. heros were released separately through an upper central hole and were able to choose between the two types of eggs for parasitism. After 24 h, the cards were removed from the arenas and subsequently parameters such as sex ratio, egg-adult development time and percentages of emergence and parasitism were evaluated. Samples of males and females from each treatment (FF. Matrix from fresh eggs parasiting fresh eggs; FC. Matrix from fresh eggs parasiting cryopreserved eggs; CF. matrix from cryopreserved eggs parasiting fresh eggs and; CC. Matrix from eggs cryopreserved parasitizing cryopreserved eggs) were collected for analysis of morphometric characters and identification of endosymbionts. The populations of the different treatments were also subjected to flight tests. T. podisi parasitism was significantly higher in fresh eggs, however the parasitoid cycle is shortened in cryopreserved eggs. The tibia and body lengths are higher in T. podisi females from fresh eggs, the percentage of flying insects is greater than 60 in populations from cryopreserved host eggs. In addition, the endosymbiont bacteria Wolbachia pipientis is present in the populations of T. podisi of the different treatments, whereas Serratia grimesii only when the parasitoids were originated or parasitized by a matrix originating from fresh eggs. The results obtained guide the elaboration of quality assessment programs for mass rearing of T. podisi for the management of pest pentatomids in soybean. Keywords: Mass rearing. Pentatomidae. Egg parasitoid. Quality assessment. 45 2.1 INTRODUÇÃO O complexo de pentatomídeos-praga é um dos grupos mais importantes de insetos que atacam a soja na América do Sul, afetando seriamente o rendimento de grãos e qualidade de sementes. Dentre o complexo de espécies, o percevejo-marrom- da-soja Euschistus heros Fabricius, 1798 (Hemiptera: Pentatomidae), é destaque por ser o responsável por grandes perdas em várias regiões produtoras de soja do Brasil e do mundo (CORRÊA-FERREIRA et al., 2002; ÁVILA & GRIGOLLI, 2014; TIMBÓ et al., 2014). O manejo do complexo de percevejos fitófagos na cultura da soja é realizado expressivamente pelo uso de inseticidas, aplicados de forma indiscriminada e na maioria das vezes de forma “calendarizada” em adição a caldas compostas por fungicidas e/ou herbicidas para a aproveitar a entrada de pulverizadores na área (PANIZZI, 2015). Além disso, a disponibilidade de ingredientes ativos com diferentes mecanismos de ação e ainda eficazes no controle de pentatomídeos é baixa e limitada, favorecendo a seleção de populações resistentes, surtos populacionais de pragas e o desequilíbrio ambiental (BUENO et al., 2011; BELO et al., 2012). Portanto, como alternativa a tais limitações do controle químico, outras estratégias como o uso do controle biológico dentro de um manejo integrado de pragas são promissoras. Programas de controle biológico aplicado voltados a liberações inundativas de parasitoides de ovos em soja é relatado como eficiente no manejo e E. heros e outros percevejos do complexo (VAN LENTEREN et al., 2018). Tais agentes de controle biológico podem reduzir a população de pragas para níveis abaixo do nível de danos econômico, de forma similar aos inseticidas sintéticos (BUENO et al., 2011). O parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead, 1893 (Hymenoptera: Platygastridae) é destaque dentre os inimigos naturais de percevejos fitófagos (MICHEREFF et al., 2015), apresentando altas taxas de parasitismo em ovos de E. heros a campo (PACHECO & CORRÊA-FERREIRA, 2000; MICHEREFF et al., 2016). Embora T. podisi seja multiplicado em larga escala em biofábricas em ovos de E. heros após a recente saída de especificação de referência para comercialização como produto macrobiológico no Brasil, ainda há muito para ser elucidado e otimizado num contexto de produção massal do parasitoide, influenciando diretamente no sucesso de programas de controle biológico aplicado (VAN LENTEREN et al., 2018; 46 MAPA, 2019). Neste contexto, o uso da criopreservação de ovos em baixas temperaturas (geralmente em Nitrogênio líquido, a -196 ºC) foi também incorporada na logística de criações massais de parasitoides de ovos de pentatomídeos por permitir a sincronicidade das liberações inundativas com os surtos de percevejos a campo sem comprometer de maneira drástica as características físicas e químicas dos ovos hospedeiros (NAKAMA & FOERSTER, 2001). Estudos iniciais sobre o armazenamento de ovos de E. heros demonstraram resultados promissores e impactos mínimos sobre o desenvolvimento e biologia de T podisi (SILVA et al., 2018). Em contrapartida, fatores como preferência hospedeira de T. podisi por ovos frescos ou criopreservados de E. heros, impactos do uso da técnica de criopreservação sobre a capacidade de voo e sobre a presença dos principais gêneros de microrganismos endossimbiontes carecem de estudos. Portanto, o presente trabalho avaliou a preferência de T. podisi por ovos frescos ou criopreservados de E. heros a partir de parâmetros biológicos e morfométricos de populações oriundas dos dois tipos de ovo hospedeiro, bem como foi realizado o estudo da capacidade de voo e identificação de 10 principais grupos de endossimbiontes, comumente presentes em parasitoides, a fim de fornecer informações para a condução de um controle de qualidade da produção em massa de T. podisi. 2.2 MATERIAL E MÉTODOS Os bioensaios de preferência e de controle de qualidade foram conduzidos nos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Manejo Integrado de Pragas na Agricultura – AGRIMIP e as análises moleculares no laboratório de Biologia Molecular, localizados no Departamento de Proteção Vegetal da Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista, FCA/UNESP, Campus de Botucatu, SP (latitude 22º 53' 09"S longitude 48º 26' 42" W). 2.2.1 Obtenção dos insetos 2.2.1.1 Multiplicação de E. heros A criação de E. heros foi mantida em condições controladas de luz (14 h de fotofase), umidade (70±5%) e temperatura (25±2 °C) no Laboratório de Manejo Integrado de 47 Pragas – AGRIMIP, FCA/UNESP e seguiram procedimentos semelhantes aos descritos em Borges et al. (2006) e Silva et al. (2008). Adultos e ninfas a partir do terceiro ínstar de E. heros eram mantidos em gaiolas transparentes (potes plásticos com um volume de 4,5 L). Para permitir a ventilação da gaiola, as tampas dos potes possuíam uma abertura coberta com tecido organza. Os fundos das gaiolas eram recobertos por papel filtro. Os insetos foram alimentados com dieta natural, consistindo de sementes de amendoim cru (Arachis hypogaea, Linnaeus), vagens de feijão (Phaseulus vulgaris, Linnaeus) e o fornecimento sazonal de frutos de ligustro (Ligustrum lucidum, Linnaeus). Oito a dez vagens de feijão eram distribuídas nas extremidades de cada gaiola e placas plásticas de Petri (Ø 90 mm) contendo grãos de amendoim eram fornecidas aos insetos. Em cada gaiola, foi colocada uma placa plástica (Ø 60 mm) contendo algodão embebido em água destilada para assegurar o fornecimento de umidade. Para os adultos de E. heros, quatro recortes de tecido de algodão cru de 10 x 05 cm foram pendurados, apoiados nas paredes das gaiolas, como substrato para cópula, oviposição e caminhamento. A densidade de adultos no interior da gaiola foi de aproximadamente 100 casais e as posturas coletadas a cada dois dias. As posturas retiradas eram acondicionadas em cápsulas plásticas de (Ø 60 mm) com um fragmento de 5 cm de vagens verdes de feijão até a eclosão das ninfas. Quando atingiam o segundo instar, os insetos eram transferidos para potes retangulares de 4,5 L e o alimento fornecido era composto, também, por vagens verdes de feijão e grãos de amendoim. 2.2.1.2 Multiplicação de T. podisi A multiplicação de T. podisi foi realizada em ovos de E. heros, uma vez que é o hospedeiro preferencial para a criação desses parasitoides (TOGNON et al., 2016; MICHEREFF et al., 2015). A criação era mantida em condições controladas de 25 ± 1°C, 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 14 horas. Os ovos de E. heros recolhidos da criação em laboratório e colados em cartelas de papel (8 x 10 cm), de acordo com a quantidade necessária para atender as liberações a campo, eram fornecidos aos adultos de T. podisi em potes plásticos de três litros vedados com filme plástico e liga elástica, contendo filetes de mel puro ad libitum nas laterais para a alimentação dos parasitoides. Para a manutenção do número de parasitoides e 48 execução dos bioensaios de preferência e controle de qualidade, duas vezes por semana eram ofertados para parasitismo aproximadamente 2000 ovos de E. heros. 2.2.2 Bioensaios de preferência de T. podisi em ovos de E. heros Os bioensaios de preferência de T. podisi por ovos frescos ou criopreservados (em nitrogênio líquido, -196 ºC) de E. heros foram realizados em arenas, segundo a metodologia adaptada de Thuler et al (2007). As arenas foram confeccionadas utilizando tubos do tipo Falcon de 50 mL com quatro tubos de Durhan de acrílico acoplados na parte basal, formando uma cruz. Dessa forma, 20 arenas foram dispostas de forma inteiramente casualizada e cada uma recebeu quatro cartelas de papel couché de 4x1 cm com 40 ovos de E. heros (duas contendo ovos que foram criopreservados por 30 dias a -196 ºC e duas contendo ovos frescos de 24 h, devidamente identificadas), uma em cada tubo de Durhan. Para o descongelamento dos ovos criopreservados embalados em papel alumínio, era realizado o procedimento de imersão em água a 35 ºC por cinco a sete segundos e esperada a secagem para posteriormente serem colados nas cartelas de papel. Quatro fêmeas de T. podisi oriundas de ovos frescos de E. heros (sexadas a partir do dimorfismo sexual presente nas antenas, em que fêmeas apresentam antenas clavadas e machos, filiformes) foram liberadas por um orifício central superior (proporção de uma fêmea para 40 ovos) e puderam escolher entre os dois tipos de ovos para parasitismo. Após 24 h, as cartelas foram retiradas das arenas e acondicionadas em BOD a 25 ºC, 70% de URA e 14 h de fotofase. Passados 10 dias de desenvolvimento, a emergência diária dos parasitoides foi acompanhada e posteriormente parâmetros como a razão sexual, tempo de desenvolvimento ovo-adulto e os percentuais de emergência e parasitismo foram avaliados. A longevidade das fêmeas de cada tratamento também foi avaliada. Outra bateria deste bioensaio foi conduzida concomitantemente, mas com quatro fêmeas oriundas de ovos criopreservados em Nitrogênio líquido em cada arena. Assim, configuram-se os quatro tratamentos: FF. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos frescos; FC. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos criopreservados; CF. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos frescos e; CC. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos criopreservados. Amostras de 50 indíviduos de cada tratamento e de 50 ovos frescos 49 e criopreservados de E. heros também foram armazenadas no fixador Chelex para a identificação de endossimbiontes (Figura 2.1). Figura 2.1 - Arenas experimentais para os ensaios de preferência de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em ovos frescos e criopreservados de E. heros. Disposição das arenas durante o experimento (A); vista superior de cada arena (B). Bioensaios sem chance de escolha também foram realizados. Neste contexto, em cada um dos tubos de vidro de fundo chato (Ø 20 mm x 80 mm de altura) contendo cartelas de 40 ovos de E. heros (20 repetições contendo ovos frescos e 20 contendo ovos criopreservados por 30 dias) foi colocada uma fêmea de T. podisi oriunda de ovos frescos. Outros 40 tubos (20 de cada tratamento) receberam fêmeas oriundas de ovos criopreservados. Passadas 24 h, as fêmeas foram retiradas e as cartelas acondicionadas individualmente nas mesmas condições e para as mesmas análises do bioensaio com chance de escolha descrito anteriormente. 2.2.3 Morfometria de T. podisi Amostras de 15 fêmeas e 15 machos oriundos de cada um dos quatro tratamentos (FF. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos frescos; FC. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos criopreservados; CF. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos frescos e; CC. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos criopreservados) foram armazenadas em álcool 70% para o estudo de caracteres morfométricos no lado direito do corpo (largura e comprimento de asas, tamanho de tíbia e comprimento do corpo) usando um estereomicroscópio (Leica Application Suite-Version 1.6.0) (Figura 2.2). 50 Figura 2.2 - Vista da lateral direita de um macho de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) exemplificando como o estudo morfométrico foi realizado, mensurando a largura e comprimento de asas e o tamanho de tíbia e de corpo (em vermelho) a partir de fotos tiradas via estereomicroscópio. 2.2.4 Bioensaios de testes de voo de T. podisi Os testes de voo de T. podisi foram conduzidos em gaiolas de PVC segundo modelo da IOBC e adaptação de Prezotti (2002). A parte interna do tubo de PVC foi revestida por cartolina preta e o fundo vedado por discos de isopor revestidos por papel preto e filme plástico. Para a constatação da presença de parasitoides caminhadores, a 3,5 cm da base da gaiola era fixada uma fita de acetato de 0,5 cm de largura coberta por cola entomológica. A parte superior do tubo foi tampada por uma placa de Petri (Ø 150 mm) impregnada por cola entomológica para captura dos parasitoides voadores. Foram realizados testes para cada tratamento, são eles: FF. ovos frescos de E. heros parasitados por fêmeas oriundas de ovos frescos; FC. ovos criopreservados de E. heros parasitados por fêmeas oriundas de ovos frescos; CF. ovos frescos de E. heros parasitados por fêmeas oriundas de ovos criopreservados; CC. ovos frescos de E. heros parasitados por fêmeas oriundas de ovos criopreservados. Círculos de papel couché (Ø 20 mm) contendo ovos parasitados de E. heros de acordo com cada tratamento foram acondicionados em tubos de vidro de fundo chato (Ø 20 mm x 80 mm de altura) e fixados no centro de cada gaiola. As gaiolas então eram colocadas em bancada com iluminação direta e constante. Após cinco dias, foram avaliadas as porcentagens de parasitoides emergentes voadores (colados na placa de Petri), caminhantes (presos no anel de acetato) e não caminhantes (presentes no fundo do tubo de vidro) (Figura 2.3). 51 Figura 2.3 - Desenho esquemático do modelo de gaiola de voo preconizado pela IOBC e adaptado por Prezotti (2002). Placa de Petri impregnada por cola entomológica para a captura de insetos voadores (A); tubo de vidro de fundo chato contendo a cartela de ovos de onde emergiram os adultos de T. podisi e onde foram observados insetos não caminhantes (B); anel de acetato posicionado a 3,5 cm da base e impregnado por cola entomológica para coleta de insetos caminhantes (C). 2.2.5 Identificação de endossimbiontes associados a T. podisi Os procedimentos de extração de DNA foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular (Nematologia) da Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista (FCA/UNESP) campus de Botucatu/SP. Foram coletados 50 adultos de Telenomus podisi oriundos dos bioensaios de preferência e dos seguintes tratamentos: 1. adultos ourindos de ovos frescos parasitados por matriz oriunda de ovos frescos; 2. adultos ourindos de ovos criopreservados parasitados por matriz oriunda de ovos frescos; 3. adultos ourindos de ovos frescos parasitados por matriz oriunda de ovos criopreservados e; 4. adultos ourindos de ovos criopreservados parasitados por matriz oriunda de ovos criopreservados; 5. ovos frescos de E. heros; 6. ovos de E. heros criopreservados a -196 ºC por 30 dias. De cada “pool” de 50 indivíduos ou 50 ovos foi realizada a extração de DNA, macerando os indivíduos em tubo de polipropileno (eppendorf) em adição de solução de 50 ml de Chelex 100® a 10% e 5 ml de protease K (COOMBS; GOUGH; PRIMROSE, 1999). A seguir, a mistura foi incubada por 20 segundos a 95 ºC para o rompimento da membrana e dos tecidos celulares. Posteriormente, as soluções foram utilizadas na detecção molecular de 52 endossimbiontes a partir da reação em cadeia da polimerase (PCR), conforme indicado na tabela 2.1. Tabela 2.1 - Lista de primers para a detecção de endossimbiontes em T. podisi e em ovos de E. heros Gene Endossimbionte Sequência do Primer 5’>3’ (pb) Referência Alvo 23S F-CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA (Thao & Arsenophonus 600 rRNA R-GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC Baumann, 2004) 16S F-TACTGTAAGAATAAGCACCGGC (Zchori-Fein & Cardinium 900 rRNA R-GTGGATCACTTAACGCTTTCG Pearlman, 2004) 16S F-TGAGTAAAGTCTGGAATCTGG (Zchori-Fein & Hamiltonella 700 rRNA R-AGTTCAAGACCGCAACCTC Brown, 2002) 16S R-TTATGATCCTGCTAATGGTTC (Vossbrinck et Nosema 222 rRNA F- CACCAGGTTGATTCTGCC al., 1993) 16S F-GCTCAGAACGAACGCTATC (Gottlieb et al., Rickettsia 900 rRNA R-GAAGGAAAGCATCTCTGC 2006) 16S F- CGCAGGCGGTTTGTTAAGTC (Zhu, Sun, Dang; Serratia 268 rRNA R- CTTCAAGGGCACAACCTCCA 2008) F-ACCGCATAACGTCGCAAGACC (Nováková & 16S Sodalis R- 1000 Hypša, 2007) rRNA CTTAACCCAACATTTCTCAACACGAG F-GCTTAACTCCAGTTCGCC (Montenegro et 16S Spiroplasma 800 al., 2005) rRNA R-CCTGTCTCAATGTTAACCTC 16S F-CGGGGGAAAAATTTATTGCT (Heddi et al., Wolbachia 700 rRNA R-AGCTGTAATACAGAAAGTAAA 1999) As reações de PCR para cada um dos gêneros de endossimbiontes testados foram executadas de acordo com as seguintes condições (Tabela 2.2): 53 Tabela 2.2 - Lista de endossimbiontes testados e metodologia utilizada para os ensaios de PCR. Ciclo Endossimbiontes Temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 95ºC a 30 Arsenophonus e Hamiltonella segundos, 58ºC a 30 segundos, 72ºC a 1 minuto e extensão final a 72ºC por 5 minutos, em um total de 1 hora e 24 minutos. Temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 92ºC a 30 Cardinium e Carsonella segundos, 57ºC a 30 segundos, 72ºC a 30 segundos e extensão final de 72ºC por 5 minutos. Temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 4 minutos, seguido de 45 ciclos de 95ºC a minuto, 48ºC Nosema a 1 minuto, 72ºC por 1 minuto e extensão final de 72ºC por 4 minutos. Temperatura de desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC a 1 minuto, Regiella e Spiroplasma 52ºC a 1 minuto, 72ºC a 2 minutos e extensão final de 72ºC por 5 minutos. Temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 92ºC a 30 Rickettsia segundos, 58ºC a 30 segundos, 72ºC a 30 segundos e extensão final de 72ºC por 5 minutos. Temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguido de 35 ciclos de 95ºC a 1 minuto, Serratia 62ºC a 1 minuto, 72ºC a 1 minuto e extensão final de 72ºC por 1 minuto. Temperatura de desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido de 30 ciclos de 94ºC a 1 minuto, Sodalis 62ºC a 1 minuto, 72ºC a 2 minutos e extensão final de 72ºC por 5 minutos. Temperatura de desnaturação inicial a 95ºC por 3 minutos, seguido de 30 ciclos de 95ºC a 30 Wolbachia segundos, 55ºC a 30 segundos, 72ºC a 30 segundos e extensão final de 72ºC por 5 minutos, totalizando um ciclo de 1 hora e 12 minutos. As amostras de PCR obtidas para cada tratamento em que houve a presença de banda positiva para os endossimbiontes testados foram purificadas e quantificadas segundo o procedimento tecnológico de purificação a partir de Beads magnéticas em placa imantada. O procedimento consistiu na adição homogênea de 40 µL de extrator BEAD a 20 µL da solução de PCR, logo em seguida a solução era colocada sobre 54 placa imantada por três minutos para que o DNA da amostra se separasse da solução. Em seguida, foram realizadas lavagens com álcool 70% e o DNA foi eluido em água nuclease-free. A concentração de DNA da amostra foi mensurada a partir do equipamento Espectrofotômetro NanoDrop® 2000 Thermo Scientific. Quando a concentração de DNA em nanogramas/ µL era suficiente para cada endossimbionte (Tabela 2.3) tais amostras foram encaminhadas para o sequenciamento automático de DNA Sanger (Modelo ABI 3500 – Applied Biosystems) do Instituto de Biotecnologia da UNESP Campus de Rubião (IBTEC). Tabela 2.3 - Quantidades recomendadas para o sequenciamento automático de DNA Sanger (Modelo ABI 3500 – Applied Biosystems) de acordo com a quantidade estimada de pares de bases do DNA amostral. 2.2.6 Análises estatísticas Os resultados dos parâmetros biológicos avaliados em cada bioensaio de preferência com e sem chance de escolha (razão sexual, tempo de desenvolvimento ovo-adulto, percentuais de parasitismo e emergência), bem como os dados de morfometria foram submetidos à análise de variância e, quando as premissas de normalidade dos resíduos e/ou homogeneidade de variância eram satisfeitas (Shapiro & Wilk, 1965), as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. Quando os dados seguiram distribuição não paramétrica, estes foram submetidos à análise de Kruskal-Wallis. Os dados de longevidade foram avaliados a partir do método estatístico de Kaplan-Meier e comparadas a partir do teste de Log-rank. Todas as análises e confecção de gráficos foram realizadas via software SigmaPlot versão 12.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). 55 2.3 RESULTADOS 2.3.1 Bioensaios de preferência de T. podisi em ovos de E. heros Foram observadas diferenças no parasitismo e emergência de T. podisi no bioensaio de preferência com chance de escolha. As maiores porcentagens de parasitismo obtidas foram observadas em fêmeas oriundas de ovos frescos parasitando ovos frescos e de fêmeas oriundas de ovos criopreservados parasitando ovos frescos; 69,32% e 68,06%, respectivamente (H = 9,56; p = 0,023) (Figura 2.4a). A emergência de T. podisi foi significativamente menor quando fêmeas oriundas de ovos criopreservados parasitaram ovos frescos, emergindo 68,93% de adultos dos ovos parasitados (H = 6,35; p = 0,012). Em relação aos resultados do bioensaio sem chance de escolha, fêmeas oriundas de ovos frescos parasitando ovos frescos ou criopreservados obtiveram as maiores porcentagens de parasitismo, respectivamente; 73,78% e 72,82% (H = 14,85; p = 0,002). Entretanto, as taxas de emergência de T. podisi não diferiram significativamente entre tratamentos (Figura 2.4b). O tempo de desenvolvimento ovo-adulto no bioensaio com chance de escolha foi significativamente mais curto quando fêmeas oriundas de ovos criopreservados eram a matriz de parasitismo; levando um tempo médio de 14,64 dias para a emergência de T. podisi (H = 78,27; p < 0,0001). Quando não houve chance de escolha, em ovos frescos parasitados, independente da fêmea, os parasitoides levaram um tempo significativamente menor para a emergência; 14,65 dias (H = 21,27; p = 0,0001). A razão sexual não diferiu entre nenhum dos tratamentos ou tipo de matriz, com ou sem chance de escolha (Figura 2.4c). Analisando especificamente a preferência das fêmeas oriundas de ovos frescos ou criopreservados, temos: na ausência de oportunidade de escolha, adultos de T. podisi oriundos de ovos criopreservados parasitados por fêmeas oriundas de ovos frescos tiveram o tempo médio de desenvolvimento ovo-adulto prolongado; 16,63 dias (F = 15,88; p = 0,0003). Em contrapartida, na possibilidade de escolha, fêmeas oriundas de ovos frescos preferiram parasitar ovos frescos (F = 5,77; p = 0,019) e o de desenvolvimento de T. podisi foi significativamente maior quando parasitaram ovos criopreservados (F = 13,24; p = 0,0005). 56 Figura 2.4 - Parâmetros biológicos de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em diferentes tratamentos para testes com (lado esquerdo) e sem chance de escolha (lado direito): FF. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos frescos; FC. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos criopreservados; CF. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos frescos e; CC. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos criopreservados. Porcentagens de parasitismo (A) e emergência (B), tempo de desenvolvimento ovo-adulto em dias (C) e razão sexual (D). Barras (médias ± erro padrão) acompanhadas por mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. Histograma acima da letra indica média significativamente diferente entre a preferência hospedeira dentro de cada tipo de matriz (fresca ou criopreservada). A longevidade das fêmeas não diferiu entre os tratamentos, variando de 16,88 ± 1,30 a 21,45 ± 1,98 dias após a emergência (análise de LogRank = 6,32; p = 0,097) (Figura 2.5). Figura 2.5 - Longevidade de fêmeas de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae): FF. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos frescos; FC. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos criopreservados; CF. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos frescos e; CC. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos criopreservados. Curvas acompanhadas por mesma letra não diferem entre si pelo método de Holm-Sidak a 5% de significância (análise de Kaplan-Meier: LogRank). 57 2.3.2 Morfometria de T. podisi Dentre os parâmetros morfométricos mensurados, a largura de asas foi significativamente menor em machos oriundos de ovos criopreservados parasitados por matriz também de origem criopreservada (F = 3,08; p = 0,035). Em contrapartida, este parâmetro não diferiu entre fêmeas dos diferentes tratamentos. O tamanho de tíbia e o comprimento do corpo é significativamente maior em fêmeas oriundas de ovos frescos parasitados por matriz também de origem fresca (F = 6,70; p = 0,0006). A partir da análise comparativa dos parâmetros morfométricos entre machos e fêmeas oriundos de um mesmo tratamento, é possível observar que, com exceção do tratamento CC que não diferiu entre os sexos, machos possuem asas mais largas que fêmeas (F = 16,06; p = 0,0004). Dentro do tratamento CF, os machos também possuem asas mais compridas e tíbias maiores (F = 2,15; p = 0,153). Entretanto, o comprimento do corpo de fêmeas é maior do que o de machos quando os ovos são parasitados por fêmeas oriundas de ovos frescos, tratamentos FF e FC, respectivamente (F = 7,42; p = 0,011) (Figura 2.6). 58 Figura 2.6 - Parâmetros morfométricos de fêmeas e machos de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae): FF. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos frescos; FC. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos criopreservados; CF. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos frescos e; CC. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos criopreservados. Largura (A) e comprimento da asa direita (B), comprimento da tíbia direita (C) e do corpo (D) em milímetros. Barras (médias ± erro padrão) acompanhadas pela mesma letra em maiúsculo (comparação entre fêmeas) e minúsculo (comparação entre machos) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. Histograma abaixo da letra indica média significativamente diferente entre machos e fêmeas dentro do mesmo tratamento. 2.3.3 Bioensaios de testes de voo de T. podisi Os bioensaios de testes de voo de T. podisi demonstram um menor número de parasitoides voadores para o tratamento CF, em que os adultos eram oriundos de ovos frescos parasitados por fêmeas oriundas de ovos criopreservados. A porcentagem de insetos voadores dentre os tratamentos variou de 46,59% a 72,82% (F = 6,38; p = 0,0006). A menor porcentagem de adultos caminhantes foi a de adultos oriundos de ovos criopreservados parasitados por matriz criopreservada (F = 9,47; p 59 = 0,0001), enquanto fêmeas oriundas de ovos frescos parasitando ovos criopreservados originaram uma população de adultos de T. podisi com a menor porcentagem de insetos não caminhantes (H = 8,62; p = 0,035). Avaliando-se diferenças entre as classes de voo de T. podisi dentro de cada tratamento, temos: matriz criopreservada parasitando ovos frescos originou população de insetos com porcentagens de indivíduos voadores e caminhantes maiores que 45% (F = 42,45; p < 0,0001) e parasitando ovos também criopreservados originou população de insetos com porcentagens de indivíduos caminhantes e não caminhantes estatisticamente iguais (H = 39,71; p < 0,0001) (Figura 2.7). Figura 2.7 - Insetos voadores (A), caminhantes (B) e não caminhantes (C) (%) em populações de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) dos tratamentos: FF. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos frescos; FC. matriz oriunda de ovos frescos parasitando ovos criopreservados; CF. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos frescos e; CC. matriz oriunda de ovos criopreservados parasitando ovos criopreservados. Gráfico de caixas acompanhados pela mesma letra em minúsculo (comparação entre tratamentos) e maiúsculo (comparação entre classes: voadores, caminhantes e não caminhantes) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. Valores discrepantes (outliers) representados por círculos são superiores em 1,5 vezes o comprimento da borda superior e inferior da caixa e o segundo quartil das caixas representa a mediana. (A) Parasitoides presos na parte superior da gaiola-teste. (B) Parasitoides presos no anel de acetato a 3,5 cm da base da gaiola-teste. (C) Parasitoides que permaneceram na parte basal da gaiola-teste. 2.3.4 Identificação de endossimbiontes associados a T. podisi Os gêneros de endossimbiontes presentes em adultos de T. podisi dos diferentes tratamentos testados e em ovos de E. heros frescos e criopreservados constam na tabela abaixo (Tabela 2.4). 60 Tabela 2.4 - Gêneros de endossimbiontes presentes (+) em Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) nos tratamentos FF. adultos oriundos de ovos frescos parasitados por matriz fresca; FC. adultos oriundos de ovos criopreservados parasitado por matriz fresca; CF. adultos oriundos de ovos frescos parasitado por matriz criopreservada; CC. adultos oriundos de ovos criopreservados parasitado por matriz criopreservada e presentes em OF. ovos frescos e OC. criopreservados de E. heros. Gêneros testados: Ars.: Arsenophonus sp.; Card.: Cardinium sp.; Ham.: Hamiltonella sp.; Reg.: Regiella sp.; Ric.: Rickettsia sp.; Ser.: Serratia sp., Sod.: Sodalis sp.; Spi.: Spiroplasma sp.; Wol.: Wolbachia sp.; Nos.: Nosema sp. e; Cars.: Carsonella sp. Gêneros de endossimbiontes testados Ars. Card. Ham. Reg. Ric. Ser. Sod. Spi. Wol. Nos. Cars. FF - - - - - + - - + - - FC - - - - - + - - + - - CF - - - - - + - - + - - CC ------+ - - OF ------OC ------ O sequenciamento pelo método de Sanger realizado a partir de cada amostra de reação de PCR positiva para o gênero de endossimbionte testado indica a presença de Wolbachia pipientis (Rickettsiaceae) em T. podisi e de Serratia grimesii (Enterobacteriaceae) apenas nos tratamentos em que T. podisi era oriundo de matriz fresca ou parasitou ovos frescos de E. heros. 2.4 DISCUSSÃO No geral, fêmeas de T. podisi optaram por parasitar ovos frescos de E. heros em vez de ovos criopreservados, o que pode ser devido às alterações ínfimas nas características físico-nutricionais decorrentes da criopreservação, porém detectáveis pelo parasitoide. A teoria do forrageamento ideal dita que organismos supostamente encontrem, avaliem e explorem recursos de maior conteúdo energético a fim de maximizar sua vida e fitness (STEPHENS & KREBS, 1986; BORGES & ALDRICH, 1994; QUEIROZ et al., 2018). Numerosos estudos confirmam a teoria a partir de demonstrações de que, quando há abundância de recursos para o forrageamento, há também a tendência de evitar fontes que produzam um retorno menor de energia em detrimento de fontes de alimento mais compensáveis (STEPHENS & KREBS, 1986). 61 A menor emergência e maior tempo de desenvolvimento de T. podisi em ovos frescos de E. heros quando foram parasitados por fêmeas oriundas de ovos criopreservados pode estar associada à adequação hospedeira inicial, afetando a capacidade dos parasitoides perfurarem o córion do ovo hospedeiro para a saída de uma geração para a outra. É mais provável que T. podisi parasite e tenha melhor performance no mesmo tipo de ovo no qual se desenvolveu (TOGNON et al., 2014). A complexidade do relacionamento entre parasitoide e ovo hospedeiro vai além do teor nutricional do recurso, até mesmo secreções excretadas pela espécie hospedeira no momento da adesão dos ovos pode influenciar a escolha de oviposição de fêmeas de parasitoides (BIN et al., 1993). Assim, as diferenças apontadas nos resultados podem remeter às diferentes comparações hospedeiras e a emissão diferencial de voláteis em ovos que passaram pelo processo de criopreservação, afetando a escolha e, consequentemente, os parâmetros biológicos. A qualidade do ovo hospedeiro pode influenciar não somente parâmetros biológicos como também morfométricos de vespas parasitoides. A avaliação de caracteres morfológicos é um indicador da aptidão do parasitoide em tipos de ovos diferentes, uma vez que o tamanho do indíviduo pode estar intrinsicamente atrelado à capacidade de dispersão e forrageamento a campo (SEQUEIRA & MACKAUER, 1992). Machos de T. podisi apresentaram menor largura de asas quando oriundos de ovos criopreservados, e a porcentagem de insetos voadores também foi menor quando os insetos eram oriundos de ovos frescos, indicando a existência de correlação da largura de asas com a capacidade de voo de T. podisi. O maior comprimento do corpo e de tíbias de fêmeas oriundas de ovos frescos e, consequentemente, maior porcentagem de insetos voadores em uma população oriunda de ovos frescos sugere que a performance de T. podisi a campo poderia ser incrementada ao ser multiplicado em ovos frescos de E. heros na geração antecedente à liberação das pupas do parasitoide a campo (LUNDGREN & HEIMPEL, 2003). No geral a criação de T. podisi mantida em laboratório apresentou uma porcentagem de insetos voadores variando de 46 a mais de 70%, sugerindo potencial eficiência no manejo de E. heros em soja. A menor porcentagem de insetos não caminhantes (não foi detectada nenhuma deformação, entretanto os insetos 62 permaneceram no fundo da gaiola-teste) foi encontrada quando T. podisi oriundo de ovos frescos parasitou ovos criopreservados, indicando melhor fitness e maior disponibilidade energética na geração F1 de fêmeas oriundas de ovos frescos. Similarmente, estudos demonstram maior porcentagem de insetos voadores quando o parasitoide é multiplicado em ovos do hospedeiro preferencial (PREZOTTI et al., 2002). Entretanto, a avaliação e controle de qualidade de criações em massa de parasitoides mantidos em ovos hospedeiros criopreservados ainda é incipiente, demonstrando ineditismo no presente estudo. Assim, apesar de a linhagem mantida deter de um percentual de insetos caminhantes acima de 17% em todos os tratamentos, ainda são necessários estudos correlacionando a capacidade e eficiência no forrageamento de ovos de pentatomídeos a campo a fim de se constatar se a pressão de endogamia em laboratório e o uso da criopreservação de ovos pode acarretar a diminuição da eficiência de T. podisi a campo (PREZOTTI et al., 2002; QUEIROZ et al., 2018). A presença da bactéria endossimbionte Wolbachia pipientis comumente presente em Parasitica indica influência sobre a biologia reprodutiva de T. podisi (mais de 80% de fêmeas em todas as populações amostrais avaliadas). O processo de criopreservação não afetou a presença e passagem transovariana de Wolbachia pipientis (Rickettsiaceae) em nenhum dos tratamentos observados. A α- proteobactéria W. pipientis é um simbionte citoplasmático frequentemente presente em insetos, manipulando-os a partir da indução partenogenética (aumento da razão sexual e, até mesmo, morte de machos antes da emergência). Além disso, este endossimbionte é capaz de gerar incompatibilidade de cruzamento entre fêmeas não infectadas (STOUTHAMER; BREEUWER; HURST, 1999). A presença de W. pipientis é tida como desejável, uma vez que influencia diretamente no aumento de fêmeas de T. podisi desejáveis num contexto de uso de parasitoide de ovos em programas de controle biológico aplicado (RUSSEL et al., 2018). Em contrapartida, a presença detectável da bactéria Serratia grimesii (Enterobacteriaceae) foi condicionada à passagem de T. podisi por ovos frescos, seja a geração parental ou a geração F1. A virulência e fisiologia de Serratia sp. é expressivamente afetada em condições extremas de temperatura, principalmente em faixas de temperatura onde ocorre congelamento (SONAWANE et al., 2018). Portanto, 63 a criopreservação, de certo modo, altera características no ovo hospedeiro podendo interferir na transmissão de Serratia sp., um importante endossimbionte capaz de mediar e evitar infecções por entomopatógenos, entre gerações de T. podisi. Diante o exposto, conclui-se que os efeitos da criopreservação de ovos devem ser detalhadamente explorados dentro de um contexto de multiplicação em massa de T. podisi para o uso em programas de CBA. Além disso, os resultados registrados indicam que, mesmo entre uma geração de insetos, a técnica de criopreservação interfere em importantes parâmetros biológicos e morfométricos de T. podisi e seu uso deve ser considerado ao se elaborar um conjunto de procedimentos inerentes ao controle de qualidade de parasitoides de ovos de pentatomídeos. 2.5 REFERÊNCIAS ÁVILA, C.J., GRIGOLLI, J.F.J. Pragas da Soja e Seu Controle. In: Lourenção, A.L.F., Grigolli, J.F.J., Melotto, A.M., Pitol, C., Gitti, D.C., Roscoe, R. 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Neste contexto, foram individualizadas 30 fêmeas virgens e 30 fêmeas copuladas por 24 h em tubos de vidro de tubo chato (Ø 20 mm x 80 mm de altura) e para cada uma das fêmeas foram ofertadas cartelas de 30 ovos frescos de E. heros por 24 h ao longo de cinco dias. Foram analisados os percentuais de parasitismo, emergência e a razão sexual. As fêmeas foram alimentadas com fios de mel puro ad libitum e foram acompanhadas diariamente para a análise de longevidade. Além disso, as longevidades de fêmeas virgens e copuladas sem parasitar ovos, de machos virgens e copulados foram avaliadas e comparadas. A proporção ideal de ovos de T. podisi/ovo hospedeiro foi avaliada a partir da variação do número de fêmeas de T. podisi para um número fixo (cinco) de ovos criopreservados de E. heros. Foi conduzido também um bioensaio em arenas fixando o número de fêmeas (cinco) e variando o número de ovos de criopreservados de E. heros. Após 24 h de parasitismo, os ovos ofertados em cada repetição foram acondicionados em 25 ºC, 70% de URA e 14 h de fotofase. O parasitismo de fêmeas virgens e copuladas foi maior no primeiro dia de oferta de ovos. A razão sexual foi nula em populações parasitadas por fêmeas virgens e o superior a 0,7 quando parasitadas por fêmeas copuladas. Fêmeas virgens ausente de atividade de parasitismo e machos possuem maior longevidade. A quantidade de fêmeas/ovo que permite uma maior taxa de parasitismo e de 8,87 fêmeas e a partir 9,28 ovos/fêmea há um estímulo de parasitismo de T. podisi. O emprego da proporção ideal de fêmeas de T.podisi/ovo hospedeiro e do número mínimo de ovos hospedeiros/fêmea em criações massais a fim de se diminuir a competição intraespecífica pode levar ao aumento das taxas de parasitismo em condições laboratoriais de multiplicação do parasitoide. Além disso, o conhecimento da biologia reprodutiva de T. podisi permite o entendimento e otimização das criações massais. Palavras-chave: Criação massal. Parasitoide de ovos. Percevejo-marrom-da-soja. ABSTRACT The study of the egg parasitoid Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Pentatomidae) reproductive biology is significantly important for the understanding of population dynamics and the use of this information in the optimization of large-scale rearing for the management of phytophagous stink bugs in monoculture extensive áreas. The present study evaluated biological parameters and the ideal proportion of 70 T. podisi in Euschistus heros (Hemiptera: Pentatomidae) eggs. Accordingly, 30 virgin females and 30 females copulated for 24 h were mantained in flat tube glass tubes (Ø 20 mm x 80 mm height) and for each of the females, 30 fresh E. heros eggs were offered for each 24 h over five days. Percentages of parasitism, emergence and sex ratio were analyzed. The females were fed with strands of pure honey ad libitum and were monitored daily for longevity analysis. In addition, the longevities of virgin and copulated females without parasitizing eggs, of virgin and copulated males were evaluated and compared. The ideal proportion of T. podisi eggs/ host egg was evaluated by varying the number of T. podisi females to a fixed number (five) of E. heros cryopreserved eggs. A bioassay was also carried out in arenas fixing the number of females (five) and varying the number of E. heros cryopreserved eggs. After 24 h of parasitism, the eggs offered in each repetition were stored at 25 ºC, 70% of URA and 14 h of photophase. The parasitism of virgin and copulated females was higher on the first day of egg supply. The sex ratio was nil in populations parasitized by virgin females and higher than 0.7 when parasitized by copulated females. Virgin females absent of parasitism activity and males have greater longevity. The number of females/ egg that allows a higher rate of parasitism is 8.87 females and from 9.28 eggs/ female there is a parasitism stimulus of T. podisi. The use of the ideal proportion of T. podisi females/ host egg and the minimum number of host eggs/ female in mass rearing in order to reduce intraspecific competition can lead to increased rates of parasitism in laboratory conditions of parasitoid multiplication. Furthermore, the knowledge of the reproductive biology of T. podisi allows the understanding and optimization of mass rearings. Keywords: Mass rearing. Egg parasitoid. Brown stink bug. 3.1 INTRODUÇÃO O percevejo-marrom-da-soja, Euschistus heros (Fabricius, 1798) (Hemiptera: Pentatomidae) destaca-se dentre o complexo de pentatomídeos fitófagos que ocasionam danos durante todo o ciclo da soja, levando a consideráveis perdas na qualidade de sementes e rendimento de grãos da cultura em diversas regiões da América do Sul e do mundo (ÁVILA & GRIGOLLI, 2014; TIMBÓ et al., 2014). O manejo de E. heros e demais percevejos-praga da soja é realizado majoritariamente com o uso de inseticidas sintéticos, principalmente os amplamente difundidos organofosforados e outros grupos químicos como neonicotinoides e piretroides, por vezes em mistura (SOSA-GÓMEZ & OMOTO, 2012). Portanto, o uso de inseticidas com amplo espectro de ação e a restrita disponibilidade de ingredientes ativos com modos de ação distintos desfavorecem a rotação de uso e adequado manejo de resistência de populações de insetos-praga (BUENO et al., 2011; BELO et al., 2012). Neste contexto, o uso do controle biológico se faz bastante promissor e 71 surge como alternativa viável ao uso indiscriminado do controle químico (BUENO et al., 2011). O parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead, 1893 (Hymenoptera: Platygastridae), dentre os platigastrídeos estudados para o uso potencial em programas de controle biológico aplicado, é um dos principais inimigos naturais de pentatomídeos fitófagos que atacam a cultura da soja (MICHEREFF et al., 2015), e têm sido produzido massalmente para o uso em programas de controle biológico aplicado em extensas áreas de soja após a recente saída da especificação de referência para comercialização deste agente (MAPA, 2019). Embora a eficácia de liberações inundativas de T. podisi sejam apontadas como eficientes no manejo de E. heros (VAN LENTEREN et al., 2018), ainda são necessários estudos detalhados da biologia de T. podisi em ovos E. heros em laboratório, o que influi diretamente no sucesso da produção em massa em biofábricas. O estudo da biologia reprodutiva de parasitoides de ovos é de significativa importância para o entendimento da dinâmica populacional e emprego dessas informações na otimização da produção em larga escala. Parasitoides da família Trichogrammatidae, amplamente distribuídos e utilizados mundialmente em programas de controle biológico, já possuem características de cópula e reprodução bem elucidadas, ocorrendo na maioria das vezes arrenotoquia. Entretanto, houve a constatação de partenogênese telítoca em população de Trichogramma pretiosum Riley, 1879 (HOHMANN; LUCK; STOUHAMER, 2001; PRATISSOLI et al., 2009; PRATISSOLI et al., 2014). Portanto, estudos acerca das características reprodutivas das populações de T. podisi mantidas em laboratórios e/ou biofábricas são de importância considerável e podem ser esporadicamente realizados. Embora estudos anteriores constatem a existência de partenogênese arrenótoca na ausência de cópula em populações de T. podisi, informações em relação à frequência de oferta de ovos hospedeiros ao longo dos primeiros dias de vida das fêmeas e à influência do acasalamento na longevidade das fêmeas ainda carecem de atenção e têm aplicação prática na liberação a campo de pupas de T. podisi. O conhecimento da proporção ideal de fêmeas de T. podisi/ovo hospedeiro e também do número de ovos a partir do qual o parasitismo é estimulado nas fêmeas são de extrema importância para manter altas taxas de parasitismo ao longo de cada 72 geração de ovos ofertados em um contexto de criação em massa de parasitoides. Além disso, o emprego da proporção de ideal de fêmeas por ovos hospedeiro evita as chances de decréscimo do parasitismo por competição intraespecífica (PRATISSOLI et al., 2009). Portanto, o presente trabalho avaliou características biológicas de fêmeas virgens e copuladas de T. podisi ao longo de cinco dias, longevidades comparadas de fêmeas e machos em ausência ou não de cópula; assim como a constatou o número ideal de fêmeas de T. podisi/ovo de E. heros e o número mínimo de ovos para o estímulo de parasitismo em fêmeas com o intuito de aprimorar a criação massal de T. podisi. 3.2 MATERIAL E MÉTODOS Os bioensaios de estudo de parâmetros biológicos e proporção ideal de T. podisi para a criação massal em ovos de E. heros foram conduzidos nos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Manejo Integrado de Pragas na Agricultura – AGRIMIP localizados no Departamento de Proteção Vegetal da Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista, FCA/UNESP, Campus de Botucatu, SP (latitude 22º 53' 09"S longitude 48º 26' 42" W). 3.2.1 Obtenção dos insetos Os insetos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de criações mantidas em laboratório e conforme metodologia descrita anteriormente no tópico 2.2.1. 3.2.2 Biologia reprodutiva de T. podisi em ovos de E. heros No bioensaio de biologia de T. podisi em ovos de E. heros, foram individualizadas 30 fêmeas virgens e 30 fêmeas copuladas (foi permitida a cópula por um período de 24 h após a emergência) em tubos de vidro de tubo chato (Ø 20 mm x 80 mm de altura) e para cada uma das fêmeas foram ofertadas cartelas de 30 ovos frescos de E. heros por 24 h ao longo de cinco dias. Após o tempo de parasitismo, as cartelas foram acondicionadas em BOD a 25 ºC, 70% de URA e 14 h de fotofase para posterior análise de parasitismo, emergência e razão sexual. As fêmeas em atividade de parasitismo foram alimentadas com fios de mel puro ad libitum e foram acompanhadas diariamente para a análise de longevidade. Além disso, 73 foram acompanhadas diariamente, também, as longevidades de 30 fêmeas virgens e 30 fêmeas copuladas sem parasitar ovos e, de 30 machos virgens e 30 machos copulados. 3.2.3 Proporção ideal de T. podisi em ovos de E. Heros A proporção ideal de ovos de T. podisi/ovo hospedeiro foi avaliada a partir da variação do número de fêmeas de T. podisi para um número fixo (cinco) de ovos criopreservados de E. heros. Portanto, o tratamento um consistiu na oferta de cinco ovos para cinco fêmeas, o tratamento dois de cinco ovos para dez fêmeas e assim por diante até o tratamento dez em que cinco ovos foram fornecidos a 95 fêmeas (proporção 1:19). Foi conduzido também um bioensaio fixando o número de fêmeas (cinco) e variando o número de ovos de criopreservados de E. heros em arenas confeccionadas com um tubo de acrílico de Durhan fixado em um tubo Falcon de 15 mL (Figura 3.1), nas mesmas proporções já descritas. O parasitismo foi permitido por 24 horas e transcorrido este tempo, os ovos ofertados em cada repetição foram acondicionados em BOD (25 ºC, 70% de URA e 14 h de fotofase). Figura 3.1 - Arenas experimentais para os ensaios de proporção ideal de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em ovos de E. heros. Disposição das arenas durante o experimento (A); disposição dos tratamentos (B) e vista superior e aproximada das arenas (C). 3.2.4 Análises estatísticas Os resultados dos parâmetros biológicos avaliados em cada bioensaio (razão sexual, percentuais de parasitismo e emergência) foram submetidos à análise de 74 variância e, quando as premissas de normalidade dos resíduos e/ou homogeneidade de variância foram satisfeitas (Shapiro & Wilk, 1965), as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. Quando os dados não seguiram distribuição paramétrica, estes foram submetidos à análise de Kruskal-Wallis. As taxas de parasitismo oriundas do bioensaio de proporção ideal de T. podisi em ovos de E. heros foram submetidas à análise de regressão. Os dados de longevidade foram avaliados a partir do método estatístico de Kaplan-Meier e comparadas a partir do teste de Log-rank. Todas as análises e confecção de gráficos foram realizadas via software SigmaPlot versão 12.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). 3.3 RESULTADOS 3.3.1 Biologia e proporção ideal de T. podisi em ovos de E. heros Foram observadas diferenças nas porcentagens de parasitismo de T. podisi no bioensaio de biologia em ovos de E. heros: fêmeas virgens parasitaram uma média de 82,20% dos ovos ofertados nas primeiras 24 horas de vida, diferindo estatisticamente dos demais dias e parasitando um percentual maior (F = 24,02; p < 0,0001) que fêmeas copuladas, parasitaram 64,03% dos ovos ofertados no primeiro dia de oferta (F = 1,07; p = 0,376). A emergência se manteve acima de 71% para os ovos parasitados por fêmeas virgens e copuladas em todos os dias de oferta (Figura 3.2b) (F = 0,84; p = 0,500) e foi significativamente maior apenas em ovos parasitados por fêmeas copuladas no primeiro dia de oferta; 85,54% (F = 6,01; p = 0,017) (Figura 3.2a). Figura 3.2 - Parasitismo (A) e emergência (B) de fêmeas de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae): FVP. fêmea virgem parasitando e; FCP. fêmea copulada parasitando ao longo de cinco dias. Barras (médias ± erro padrão) acompanhadas pela mesma letra em minúsculo (comparação entre fêmeas copuladas) e maiúsculo (comparação entre fêmeas virgens) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. Histograma acima da letra indica média significativamente diferente entre fêmea virgem e copulada no mesmo dia. 75 Em relação à razão sexual, de todos os ovos parasitados por fêmeas virgens, emergiram 100% de parasitoides machos, denotando uma razão 0 em todos os cinco dias de parasitismo. Dos ovos parasitados por fêmeas copuladas, a porcentagem média de fêmeas emergidas variou de 73 a 91% (F = 2,22; p = 0,070) e foi estatisticamente maior no grupo de insetos que foram parasitados no primeiro dia de oferta (Figura 3.3). Figura 3.3 - Razão sexual de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae): FVP. fêmea virgem parasitando e; FCP. fêmea copulada parasitando ao longo de cinco dias. Barras (médias ± erro padrão) acompanhadas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. A longevidade de T. podisi foi estatisticamente menor em fêmeas copuladas parasitando ao longo de cinco dias, com tempo médio em dias de 16,87 ± 1,25 (Figura 76 3.4). Fêmeas virgens em ausência de atividade de parasitismo alcançaram a maior longevidade, um tempo médio de 26,73 ± 1,29 dias que não é diferente da longevidade média de fêmeas virgens em atividade de parasitismo (análise de LogRank = 35,03; p < 0,001). Figura 3.4 - Longevidade de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae): FV. Fêmea virgem; FVP. fêmea virgem parasitando ao longo de cinco dias; FC. fêmea copulada; FCP. fêmea copulada parasitando ao longo de cinco dias; MV. macho virgem; MC. macho copulado. Curvas acompanhadas por mesma letra não diferem entre si pelo método de Holm-Sidak a 5% de significância (análise de Kaplan-Meier: LogRank). A partir dos resultados obtidos no bioensaio de proporção ideal de fêmeas de T. podisi/ovo de E. heros e da proporção mínima de ovos de E. heros/fêmea de T. podisi capaz de gerar estímulos de parasitismo na população, uma curva de regressão quadrática foi ajustada conforme as fórmulas e valores de r e r² apresentados no gráfico abaixo (Figura 3.5). 77 Figura 3.5 - Curvas de parasitismo de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em crescentes proporções de fêmeas/ovo de Euschistus heros (A) e de ovos de E. heros/fêmea de T. podisi (B). De acordo com as análises de regressão (A), um número de 8,87 fêmeas de T. podisi/ovo hospedeiro atinge o parasitismo máximo de 85,71% dos ovos de E. heros e com o aumento do número de fêmeas o parasitismo tende a cair em decorrência de competição intraespecífica (F = 7,913; p = 0,064). A proporção mínima de ovos de E. heros/fêmea de T. podisi a partir da qual há um aumento exponencial das taxas de parasitimo superiores a 58% é de 9,28 ovos por fêmea (B) (F = 119,55; p = 0,008). 3.4 DISCUSSÃO Variados fatores bióticos e abióticos podem interferir em na dinâmica populacional e reprodutiva de parasitoides, interferindo na eficiência destes agentes em programas de controle biológico aplicado (HOFFMANN, 2001; GHAEMMAGHAMI et al., 2020). Em relação à liberação de parasitoides a campo, há a possibilidade de liberação de indivíduos adultos ou em estágio pupal. Neste último caso, a cópula dependerá do encontro de machos e fêmeas a campo. Portanto, o conhecimento de parâmetros biológicos e reprodutivos, como a ocorrência fenômenos partenogenéticos, de T. podisi é de extrema importância para melhor posicionar e liberar esta espécie a campo para o manejo de pentatomídeos-praga. O aumento de fêmeas em uma população de parasitoides é o desejável para aplicação em programas de CB (BUENO et al., 2011). Os resultados de razão sexual aqui obtidos sugerem a ocorrência de partenogênese arrenótoca, uma vez que fêmeas 78 virgens parasitando deram origem apenas a machos de T. podisi em todos os dias de oferta de ovos. A partenogênese arrenótoca já foi constatada em populações de Telenomus sp. anteriormente, enfatizando a importância do acasalamento na espécie para que mais fêmeas sejam liberadas a campo e população possa manter- se por mais tempo atuando no manejo de pentatomídeos fitófagos durante o ciclo da soja, diminuindo o número de sucessivas liberações (FARROKHI et al., 2010; QUEIROZ et al., 2017; SILVA, 2017). Em contrapartida, as influências da cópula e atividade parasitismo na longevidade e razão sexual de T. podisi também foram exploradas. Fêmeas virgens foram capazes de parasitar 21% a mais que fêmeas copuladas no primeiro dia de oferta de ovos, demonstrando que uma porcentagem de fêmeas virgens a campo não comprometeria o desempenho de T. podisi no manejo de percevejos. Além disso, fêmeas virgens em ausência ou não de atividade de parasitismo possuem maior longevidade em comparação a fêmeas copuladas. Machos virgens e copulados viveram tanto quanto fêmeas, podendo contribuir para o aumento das chances de encontro a campo e possibilidade de ocorrência de cópula mesmo que tardiamente (STOUTHAMER; 1993). As altas taxas de razão sexual, variando de 0,73 a 0,91 neste estudo, também tornam viável a liberação de parasitoides mesmo com características arrenótocas, podendo ocorrer uma segunda geração a campo (PRATISSOLI et al., 2009). A proporção de 9,28 fêmeas de T. podisi/ ovo de E. heros num contexto de criação em massa em biofábricas garante um parasitismo dos ovos ofertados superior a 85% enquanto que, quando há a proporção de 9,28 ovos hospedeiros para cada fêmea o parasitismo é estimulado, atingindo uma porcentagem superior a 58%. A proporção ideal de parasitoides por ovo hospedeiro é um fator de extrema importância a fim de evitar-se e/ou diminuir as chances de ocorrência de competição intraespecífica. Além disso, altas taxas de competição em uma população de parasitoides podem gerar sinais epigenéticos capazes de alterar a razão sexual em gerações seguintes (PARRA et al., 1989; MARTEL & BOIVIN, 2004; PATALANO et al., 2012). Diante o exposto, conclui-se que o conhecimento da dinâmica populacional e reprodutiva de T. podisi é fundamental para o melhor posicionamento e forma de 79 liberação, bem como o uso da proporção ideal de fêmeas/ovo hospedeiro pode gerar a otimização e aumento do parasitismo em criações laboratoriais em larga escala. 3.5 REFERÊNCIAS ÁVILA, C.J., GRIGOLLI, J.F.J. Pragas da Soja e Seu Controle. In: Lourenção, A.L.F., Grigolli, J.F.J., Melotto, A.M., Pitol, C., Gitti, D.C., Roscoe, R. (Eds.), Tecnologia e produção: Soja 2013/2014. Fundação MS, 247p, 2014. Disponível em: BELO, M.S. da S.P.; PIGNATI, W.; DORES, E.F.G. de C.; MOREIRA, J.C.; PERES, F. Uso de agrotóxicos na produção de soja do Estado do Mato Grosso: um estudo preliminar de riscos ocupacionais e ambientais. Revista Brasileira de Saúde Ocupacional, v.37, p.78‑88, 2012. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0303- 76572012000100011. Disponível em: BUENO, A.F., SOSA-GOMEZ, D.R., CÔRREA-FERREIRA, B.S., MOSCARDI, F., BUENO, R.C.O.F. 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O parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) é um dos principais inimigos naturais de pentatomídeos fitófagos, ocorrendo com maior frequência em ovos do percevejo-marrom Euschistus heros Fabricius (Hemiptera: Pentatomidae). Para a implantação de programas de controle biológico de E. heros a partir de liberações inundativas de T. podisi faz-se necessário o conhecimento de diversos parâmetros biológicos do parasitoide como a capacidade de dispersão, ditando a distribuição e o número de pontos de liberação/hectare. Portanto, o presente trabalho objetivou o estudo da capacidade de dispersão de T. podisi a partir de matrizes com 63 pontos equidistantes demarcados e liberação central do número recomendado de fêmeas de T. podisi, segundo a especificação de referência de uso, em plantações de soja. Foi determinada a distância máxima de forrageamento de T. podisi a campo: 39 metros durante o estágio Vn-R1 e de 30,90 metros durante o estágio R5-R6 de desenvolvimento da cultura da soja. O conhecimento da capacidade de dispersão máxima diferencial de T. podisi em ovos de E. heros permite o ajuste da logística e técnica de liberação de acordo com o estágio fenológico, otimizando o manejo de pentatomídeos-praga via programas de controle biológico aplicado em extensas áreas de monocultura. Palavras-chave: Controle biológico. Parasitoide de ovos. Dispersão. Percevejo- marrom-da-soja. ABSTRACT Applied biological control programs based on the use of egg parasitoids is reported as promising in the control of several pests as an alternative to chemical control, mainly in the management of the complex of soybean pentatomids that. The egg parasitoid Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) is one of the main natural enemies of phytophagous pentatomids, occurring more frequently in eggs of the brown stink bug Euschistus heros Fabricius (Hemiptera: Pentatomidae). For the implantation of biological control programs for E. heros management from mass releases of T. podisi, it is necessary to know several biological parameters of the parasitoid such as the dispersion capacity, dictating the distribution and the number of release points / hectare. Therefore, the present work aimed to study the dispersion capacity of T. podisi from matrices with 63 demarcated equidistant points and central release of the recommended number of T. podisi females, according to the reference use specification, in soybean crops. The maximum foraging distance of T. podisi in the field 84 was determined: 39 meters during the Vn-R1 stage and 30.90 meters during the R5- R6 stage of soybean development. The knowledge of the maximum dispersion capacity of T. podisi in E. heros eggs allows the adjustment of the logistics and release technique according to the phenological stage, optimizing the management of pest pentatomids via biological control programs applied in large monoculture areas. Keywords: Biological control. Egg parasitoid. Dispersion. Brown stink bug. 4.1 INTRODUÇÃO O controle biológico aplicado com o uso de parasitoides de ovos é relatado como eficiente no controle de diversas pragas, principalmente lagartas desfolhadoras e o complexo de pentatomídeos que atacam a soja (BUENO et al., 2011). O parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead, 1893 (Hymenoptera: Platygastridae) é relatado como um dos principais inimigos naturais de pentatomídeos fitófagos que atacam a cultura da soja (MICHEREFF et al., 2015), e está em fase de desenvolvimento programas de controle biológico aplicado mais assertivos com o uso de T. podisi a partir da liberação para a comercialização deste agente de controle biológico no Brasil (MAPA, 2019). O estudo da atividade de dispersão e forrageamento de parasitoides permite a geração de conhecimentos aplicáveis ao controle biológico de insetos-praga e visão ecológica nas interações entre parasitoides e hospedeiros (DINARDO-MIRANDA et al., 2014; UMBANHOWAR et al., 2003). Algumas características biológicas são consideradas essenciais na avaliação da eficiência de um inimigo natural, sobretudo para o desenvolvimento de estratégias de controle e metodologias de liberação a campo. Dentre as mais importantes destacam-se: taxa de desenvolvimento, longevidade, capacidade de forrageamento, fecundidade, capacidade de dispersão e razão sexual (DOETZER & FOERSTER, 2013). Dentre esses aspectos comportamentais, o estudo da capacidade de dispersão e distribuição espacial do parasitoide de ovos T. podisi ainda é incipiente, sendo muitas vezes subestimada a campo pela falta de desenvolvimento de técnicas mais assertivas na avaliação e coleta de dados. 85 Pesquisas anteriores indicam baixas taxas de parasitismo e dispersão de aproximadamente 39 metros a partir do ponto de liberação a campo (BUENO et al., 2013). Portanto, a dispersão de T. podisi deve ser reavaliada para a verificar o real deslocamento do parasitoide em campo através de métodos concisos e que certifiquem a dinâmica desses indivíduos na área após a liberação, excluindo-se a ocorrência natural para fins de constatação científica da distribuição espacial de T. podisi (BUENO et al., 2013; GOLIN, 2014). Além disso, o conhecimento da quantidade de pontos a serem estabelecidos nas liberações garante uma distribuição mais homogênea e assertiva do parasitismo e, consequentemente, do controle populacional de percevejos-praga. É valido salientar que os perfis de voláteis emitidos durante os estágios fenológicos da cultura também podem interferir nas relações tritróficas e no comportamento de dispersão de parasitoide de ovos (HAVILL et al., 2000). Informações sobre o comportamento de forrageamento e a determinação da distância máxima atingida por fêmeas de T. podisi a campo também podem contribuir na elaboração de pacotes tecnológicos de controle biológico de pentatomídeos mais promissores, permitindo o ajuste da liberação com precisão em cápsulas ou a granel de pupas do parasitoide via veículos aéreos não tripulados (VANTs) em pontos estratégicos (LI et al., 2013). Portanto, o presente estudo avaliou a capacidade de dispersão e distribuição espacial de T. podisi em ovos de E. heros na cultura da soja em dois estágios fenológicos diferentes (início da floração e durante o enchimento de grãos) a partir da geração de semivariogramas e mapas de krigagem. 4.2 MATERIAL E MÉTODOS O estudo da dispersão e distribuição espacial de T. podisi em ovos de E. heros em campos de soja foi conduzido no Setor Chiaparini da Agroterenas S/A, localizado em Santa Cruz do Rio Pardo, São Paulo (latitude 22°49'51.46"S longitude 49°19'16.35"O). O acondicionamento do material de campo para posterior análise foi feito nos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Manejo Integrado de Pragas na Agricultura – AGRIMIP localizados no Departamento de Proteção Vegetal da Fazenda Experimental Lageado, pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas da 86 Universidade Estadual Paulista, FCA/UNESP, Campus de Botucatu, SP (latitude 22º 53' 09"S longitude 48º 26' 42" W). 4.2.1 Obtenção dos insetos Os insetos utilizados neste estudo foram obtidos a partir de criações mantidas em laboratório e conforme metodologia descrita anteriormente no tópico 3.2.1. Entretanto, especificamente para este ensaio a campo, em seis potes plásticos transparentes de três litros foram colocadas cartelas de ovos parasitados colados com solução de cola branca (50%) com uma quantidade aproximada de 8100 ovos, garantindo a emergência de 6500 fêmeas de T. podisi previamente alimentadas (mel ad libitum) e possivelmente copuladas para a liberação central. Além disso, para as cartelas de ovos-sentinela foram utilizados ovos criopreservados de E. heros cedidos pela empresa Biopartner Agro Soluções. 4.2.2 Avaliação da dispersão a campo A avaliação da dispersão de T. podisi a campo foi realizada através da demarcação georreferenciada de matrizes de 6400 m² totais de área. Cada matriz era composta de 63 pontos equidistantes (13,33 m horizontalmente e 10 m verticalmente) em plantio de soja (variedade de ciclo indeterminado, Nidera 6700) no Setor Chiaparini da Agroterenas S/A. Em cada ponto da matriz foi posicionada uma bandeira vermelha de fibra de vidro de 1,50 m na qual uma cartela de tecido tule branco contendo de 30 ovos-sentinela de E. heros foi fixada com o auxílio de um fio de arame (Figura 4.1). Na bandeira- central de cada matriz demarcada foi liberada uma quantidade de 6500 fêmeas de T. podisi recém-emergidas e alimentadas com fios de mel puro ad libitum, conforme a “dose” recomendada pela especificação de referência deste agente de controle macrobiológico (MAPA, 2019). Cada cartela das seis repetições (cada repetição é correspondente a uma matriz de pontos) foi coletada e avaliada separadamente. Os ovos ficaram expostos ao parasitismo por 24 horas a partir da liberação central dos parasitoides e então, recolhidos e mantidos em câmara climatizada a 25 °C, UR de 60% e fotofase de 14 h no laboratório de multiplicação de parasitoides do AGRIMIP, até a emergência dos adultos de T. podisi. Como testemunha, foi realizada a infestação artificial com cartelas de ovos-sentinela igualmente posicionadas em seis matrizes que não receberam a liberação do parasitoide. A distância máxima de 87 dispersão foi a partir de análise geoestatística do parasitismo obtido em cada ponto demarcado, após a desconsideração do parasitismo natural ocorrido na área e constatado através das matrizes testemunhas. O ensaio foi realizado durante o estágio Vn-R1 (final do vegetativo - início do florescimento) e repetido durante o estágio R5-R6 (ínicio ao fim do enchimento de grãos). As condições de temperatura, umidade e velocidade de vento foram coletadas no momento da liberação central dos parasitoides em cada matriz e as condições durante as 24 h de ensaio foram extraídas de um conjunto de dados gerados a partir da estação meteorológica mais próxima ao Setor Chiaparini (pertencente à Agroterenas S/A, Santa Cruz do Rio Pardo - SP). Figura 4.1 - Desenho experimental do ensaio de dispersão de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em ovos de Euschistus heros em campo de soja. Total de 63 pontos equidistantes em 10 metros verticalmente e 13,33 metros horizontalmente em um quadrado de 80x80 metros. Nos centros de liberação de cada uma das seis matrizes demarcadas em cultivo de soja (variedade Nidera 6700), foi realizada a soltura de 6500 fêmeas de T. podisi. 4.2.3 Análises estatísticas A distância média de dispersão e as áreas atingidas por T. podisi foram inferidas pela porcentagem de parasitismo dos ovos-sentinela dispostos nas matrizes 88 de pontos equidistantes (devidamente georreferenciados em unidade utm) e constatadas a partir da geração de semivariogramas e de mapas de krigagem através do software de geoestatística GS+ (Gamma Design Software). 4.3 RESULTADOS Foram observadas diferenças nas porcentagens de parasitismo de T. podisi no bioensaio em ovos de E. heros entre os dois estágios fenológicos avaliados na soja. Nas matrizes 1 e 3 do estudo de dispersão, o parasitismo foi maior no estágio R5-R6 (H = 11.40, p = 0.0001; H = 13.50; p < 0.0001). No primeiro ensaio realizado a campo, as matrizes 2 e 5 apresentaram maiores taxas de parasitismo (H = 18,36; p = 0,0001) enquanto que no reprodutivo, as matrizes 1, 2 e 3 foram mais parasitadas (H = 16,15; p = 0,0013). De modo geral, o parasitismo médio a campo foi inferior à 7% dos ovos dispostos durante a infestação artificial, independente do estágio fenológico em que foi realizada a soltura de T. podisi (Figura 4.2). Figura 4.2 - Parasitismo de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em ovos de Euschistus heros dispostos artificialmente em 63 pontos a campo nos estágios Vn-R1 e R5-R6 nas matrizes de 1 a 6 durante o estudo de capacidade de dispersão em soja. Barras (médias ± erro padrão) acompanhadas pela mesma letra em minúsculo (comparação entre parasitismo no estágio Vn-R1) e maiúsculo (comparação entre entre parasitismo no estágio R5-R6) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. Histograma acima da letra indica média significativamente diferente entre as porcentagens de parasitismo obtidas nos dois estágios avaliados para a mesma matriz. 89 O parasitismo dos ovos de E. heros nas áreas testemunhas foi de aproximadamente 0,3% no estágio Vn-R1 e de 0,32% no estágio R5-R6 da soja, indicando baixa incidência natural de parasitoides na área de estudo. O número médio de ovos foi de aproximadamente 0,30/ m² em infestação artificial. Os valores obtidos no controle foram utilizados na correção do parasitismo obtido nas seis matrizes de liberação de T. podisi. Neste estudo, a média das velocidades eólicas nos estágios Vn-R1 e R5-R6 de desenvolvimento da soja foram 1,08 e 0,97 m/s, respectivamente. Portanto, a velocidade do vento foi considerada quase calma (0,5 a 1,5 m/s) segundo a escala de Beaufort, proposta por Silveira Neto et. al. (1976). Os elementos meteorológicos no momento de soltura e médios durante os ensaios encontram-se detalhados nas tabelas 4.1 e 4.2. Tabela 4.1 - Elementos meteorológicos no momento de soltura de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) a campo. Pontos coletados a partir de termo- anemômetro digital e manual no centro de cada matriz de liberação (ponto 32). Vn-R1 T ºC Vento (m/s) Direção UR % M1 23.3 0.9 Leste 71 M2 22.3 1.0 Leste 68 M3 22.7 1.5 Oeste 70 M4 22.1 1.5 Leste 71 M5 22.0 1.8 Leste 79 M6 22.5 2.1 Leste 83 R5-R6 T ºC Vento (m/s) Direção UR % M1 23.3 1.5 Oeste 77 M2 22.3 1.0 Leste 86 M3 22.7 2.0 Oeste 72 M4 22.1 1.0 Leste 82 M5 22.0 1.0 Leste 59 M6 22.5 1.2 Oeste 64 90 Tabela 4.2. - Elementos meteorológicos médios durante as 24 horas de duração dos ensaios de dispersão de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) a campo. Pontos coletados de dados gerados por estação meteorológica (Agroterenas S/A) em 06 de Janeiro e 18 de Fevereiro de 2020. T ºC Vento (m/s) UR (%) PAtm (hPa) Ppt mm Vn-R1 23.86 1.08 87.97 941.77 - 06 Jan. R5-R6 27.35 0.97 84.84 947.30 0.64 18 Fev. Ocorreu uma relação inversa entre o nível de parasitismo de T. podisi em ovos de E. heros com o aumento do distanciamento a partir ponto central de liberação (Figura 4.3). Os semivariogramas foram ajustados a partir da constatação de isotropia do parasitismo de T. podisi ao longo da atividade de forrageamento, ou seja, as direções não afetaram o deslocamento e um único padrão descreve a variabilidade espacial da dispersão. Além disso, o modelo exponencial gerou o melhor ajuste de r² e consequentemente, dos dados, para os dois semivariogramas gerados (Figura 4.3). O alcance máximo de T. podisi foi de 39 metros no estágio Vn- R1 com um parasitismo máximo de 42% e de 30,90 metros no estágio R5-R6 com parasitismo máximo de 73% (Figura 4.3). 91 Figura 4.3 - Semivariogramas isotrópicos e mapas de krigagem pontual gerados a partir das porcentagens de parasitismo de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em ovos de Euschistus heros dispostos artificialmente em 63 pontos a campo nos estágios Vn-R1 (A) e R5-R6 (B) na fazenda Chiaparini, Santa Cruz do Rio Pardo, São Paulo, Brasil. 4.4 DISCUSSÃO O decréscimo do parasitismo de ovos a partir do aumento da distância do ponto de liberação é geralmente constatada em diversos estudos de dispersão de parasitoide de ovos (BUENO et al., 2012; ASPLEN et al., 2016; ZHOU et al., 2019; SALAZAR-MENDONZA et al., 2020). À medida que o parasitoide se afasta do ponto 92 de soltura, há o aumento da possibilidade de exploração da área. Em consequência, há maior demanda por energia e acréscimo da incidência de fatores bióticos e abióticos que levam à mortalidade natural de inimigos naturais (BUENO et al., 2012; ZHOU et al., 2019). O parasitismo diferencial entre os estágios fenológicos avaliados (final do vegetativo e durante a fase de enchimento de grãos) pode ser devido ao perfil de voláteis distintos presentes na planta de soja. Principalmente durante o estágio reprodutivo da soja, em que há uma maior incidência de percevejos fitófagos, a liberação de voláteis voltados à interação tritrófica entre plantas e inimigos naturais, fazendo com que parasitoides mantenham um comportamento mais dinâmico sobre o dossel de plantas, entretanto, afetando a dispersão (HAVILL & RAFFA, 2001; HEIMPEL, 2019). As substâncias químicas características volatilizadas de ovos frescos de E. heros também funcionam como indutor do parasitismo de T. podisi e auxiliam na busca hospedeira, podendo ser atribuído como causa do baixo parasitismo encontrado nos ovos criopreservados utilizados na infestação artificial a campo (TOGNON et al., 2020). Além disso, com a soja mais alta e o dossel mais desenvolvido, formam-se barreiras, limitando a capacidade de dispersão e interferindo na ação do vento sobre o parasitoide (COLOMBARI & BATTISTI, 2016; ZHOU et al, 2019). Estudos anteriores sobre a dispersão de platygastrídeos parasitoides de ovos demonstram decréscimo da capacidade dispersiva com o avanço do desenvolvimento da cultura do milho, por exemplo (POMARI et al., 2013; SALAZAR-MENDONZA et al., 2020). O atual estudo, a partir do ajuste de semivariogramas exponenciais e análise de krigagem sobre a distribuição de porcentagens de parasitismo de T. podisi a campo, foi inferido que, quando as plantas de soja ainda apresentavam menor altura e densidade de folhas, foi constatada maior capacidade de parasitismo em 8,10 metros. Entretanto, apesar da influência direta da direção e velocidade do vento sobre a dispersão de parasitoides, não foi possível encontrar uma correlação entre o padrão eólico e a distribuição espacial de T. podisi, podendo ser atribuído às baixas velocidades do vento no momento de soltura e durante as 24 horas de ensaio. Quanto à avaliação da incidência natural de parasitoides de ovos de pentatomídeos a campo, foram encontrados porcentuais de parasitismo ínfimos na 93 área de estudo. Portanto, há a indicação de que a dispersão constatada de T. podisi na área refere-se majoritariamente aos parasitoides oriundos da liberação central. Além disso, o número reduzido de parasitoides na área pode ser atribuído ao intenso uso de inseticidas de amplo espectro de ação (o organofosforado acefato, por exemplo) durante a safra 2019/2020 da soja na área onde foi realizado o estudo. A distância máxima que parasitoides atingem comumente possui correlação direta com a velocidade e direção eólicas (POMARI et al., 2013). As diferentes arquiteturas de planta, tipo de porte e ciclo, também podem influenciar a distribuição espacial de microhimenópteros. Em contrapartida, os resultados aqui obtidos não sofreram influência significativa do vento e sugerem, a partir do alcance máximo de T. podisi de 30 a 39 metros, uma distribuição aproximada do número ideal de fêmeas de 7 a 12 pontos por hectare a depender do estágio fenológico em que a liberação inundativa foi administrada. É válido salientar a necessidade de estudos comparativos com populações silvestres de T. podisi a fim de detectar efeitos da pressão de endogamia sofrida ao decorrer de gerações multiplicadas em laboratório que pode levar à seleção de indivíduos menos férteis, menos agressivos e com menor atividade de voo, como já constatado em platigastrídeos (NARANJO-GUEVARA et al., 2020). Além de fatores de caráter meteorológico, fatores bióticos como índices de predação de ovos podem influir na eficiência de parasitismo encontrada a campo (SALAZAR-MENDONZA et al., 2020). Entretanto, diferentemente das taxas de parasitismo de ovos de pentatomídeos descritas por Tillman et al. (2020), não foi detectável o parasitismo de ovos de E. heros por percevejos predadores ou formigas na área de estudo. Tal fato pode ser atribuído à constante pulverização de inseticidas ao longo do histórico de cultivo da área-teste. Portanto, o baixo parasitismo de T. podisi encontrado a campo pode remeter-se à elevada infestação artificial para estudo da dispersão, e às variações de temperatura e umidade diferentes das quais os parasitoides estavam condicionados em laboratório. Ainda, a falta de fontes suplementares de alimento, por exemplo o néctar das plantas dispostas na área, pode ter contribuído para um parasitismo limitado de T. podisi, uma vez que grande parte da energia fora dispendida na atividade de voo e consequente forrageamento. Foi proposto anteriormente o estímulo maior de dispersão de parasitoides na presença de néctar suplementar (HEIMPEL, 2019). 94 Diversos estudos indicam o potencial de Telenomus sp. como agentes de controle biológico aplicado em grandes culturas como milho e soja (BUENO et al., 2011; POMARI et al., 2013). Em contrapartida, ainda são escassas as informações que podem favorecer a otimização do uso de T. podisi no manejo de populações resistentes de pentatomídeos-praga em soja. O presente estudo fornece informações basais para o início do aprimoramento da técnica e logística de liberação de T. podisi em extensas áreas, adequando-se à agricultura de precisão e ao possível uso de veículos aéreos não tripulados no desempenho do manejo. 4.5 REFERÊNCIAS ASPLEN, M. K.; CHACÓN, J. M.; HEIMPEL, G. E. Sex‑specific dispersal by a parasitoid wasp in the field. Entomologia Experimentalis et Applicata, v. 159, n. 2, p. 252-259, 2016. DOI: https://doi.org/10.1111/eea.12434. Disponível em: BUENO, R. C. O. F.; CARVALHO, M. C.; BUENO, N. M.; CARVALHO, L. C.; GODOY, A. L. F.; BUENO, A. F.; DORNELES JUNIOR, J.; MARTINS, P. M.; CARNIETTO JUNIOR, N. A. Capacidade de dispersão de Telenomus podisi para o controle de Euschistus heros na cultura da soja. 13º Siconbiol MS, Brasil, 2013. Disponível em: BUENO, R.C.O.F., PARRA, J.R.P., BUENO, A.F. Trichogramma pretiosum parasitism and dispersal capacity: a basis for developing biological control programs for soybean caterpillars. 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Acesso em: 19 Jun. 2020. 98 CAPÍTULO 5 IDENTIFICAÇÃO DE ENDOSSIMBIONTES E PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS DE Telenomus podisi (HYMENOPTERA: PLATYGASTRIDAE) EM OVOS DE DIFERENTES ESPÉCIES DE PENTATOMÍDEOS-PRAGA DA CULTURA DA SOJA RESUMO O parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) é destaque dentre os inimigos naturais de percevejos fitófagos da família Pentatomidae. Programas de controle biológico aplicado de pentatomídeos-praga da soja a partir de liberações inundativas de T. podisi estão em fase de desenvolvimento. Entretanto, pouco se sabe ainda sobre a dinâmica do parasitoide na presença de diferentes espécies de percevejos a campo e sobre características, presença de endossimbiontes e aceitação de T. podisi em diferentes ovos hospedeiros. Portanto, o presente trabalho visou a elucidação e exploração comparativa de caracteres morfométricos e a identificação dos principais grupos de endossimbiontes de T. podisi e ovos oriundos de seis espécies de percevejos. O estudo foi conduzido a partir da coleta a campo de percevejos fitófagos adultos das espécies Euschistus heros (Fabricius, 1798), Dichelops melacanthus (Dallas, 1851), Piezodorus guildinii (Westwood, 1837), Nezara viridula (Linnaeus, 1758), Thyanta perditor (Fabricius, 1974), Edessa meditabunda (Fabricius, 1974), e do asopíneo predador Podisus nigrispinus (Dallas, 1851). Os insetos adultos de campo foram acondicionados separadamente em laboratório (25 ºC, 70% de UR e 14 h de fotofase) para cópula e oviposição. Ovos de 24 h de cada espécie foram coletados e ofertados por 24 h em tubos de vidro de fundo chato (Ø 20 mm x 80 mm de altura) para a linhagem de T. podisi mantida em laboratório em ovos de E. heros. Amostras de adultos de T. podisi e ovos frescos oriundos de cada espécie de pentatomídeo coletado foram armazenadas para o estudo morfométrico e identificação de endossimbiontes. T. podisi oriundos dos ovos das diferentes espécies de pentatomídeos foram avaliados segundo os parâmetros largura e comprimento de asa; comprimento de tíbia e do corpo. Para o estudo morfométrico dos ovos, área e volume foram mensurados a partir de fotos tiradas com o auxílio de estereomicroscópio. Para a identificação de endossimbiontes, foram realizadas reações de PCR e sequenciamento a partir de primers específicos. Os ovos de maior volume são pertencentes à T. perditor, e T. podisi oriundo de ovos desta espécie detém de tíbias e asas mais compridas. Ovos de N. viridula e T. perditor possuem maiores áreas enquanto ovos de P. nigrispinus e P. guildinii possuem área menor. Fêmeas oriundas de ovos de P. guildinii possuem asas mais estreitas e menor comprimento de corpo. Entre todas as espécies comparadas, os machos de T. podisi possuem asas mais largas que fêmeas. A presença de endossimbiontes foi bastante variável entre os ovos hospedeiros e os parasitoides oriundos destes ovos. Wolbachia pipientis foi detectada apenas em T. podisi oriundo de ovos de T. perditor. A espécie de bactéria endossimbionte Serratia grimesii também foi detectada entre as amostras. Os resultados obtidos fornecem informações que auxiliam o entendimento sobre a dinâmica ecológica de parasitismo a campo e adaptação hospedeira de T. podisi em diferentes espécies de Pentatomidae. 99 Palavras-chave: Morfometria. Parasitoide de ovos. Pentatomidae. Endossimbiontes. ABSTRACT The egg parasitoid Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) is a highlight among the natural enemies of phytophagous bedbugs of the Pentatomidae family. Applied biological control programs to manage soybean pentatomids through mass releases of T. podisi are under development. However, little is known about the parasitoid dynamics in the presence of different species of stink bugs in the field and about characteristics, presence of endosymbionts and acceptance of T. podisi in different host eggs. Therefore, the present work aimed at elucidating and comparative exploration of morphometric characters and the identification of the main groups of T. podisi endosymbionts and eggs of six species of stink bugs. The study was conducted from the field collection of adult phytophagous stink bugs of the species Euschistus heros (Fabricius, 1798), Dichelops melacanthus (Dallas, 1851), Piezodorus guildinii (Westwood, 1837), Nezara viridula (Linnaeus, 1758), Thyanta perditor (Fabricius, 1974), Edessa meditabunda (Fabricius, 1974), and the asopineous predator Podisus nigrispinus (Dallas, 1851). The adult field insects were placed separately in laboratory (25 ºC, 70% RH and 14 h of photophase) for mating and oviposition. Eggs of each specie were collected and offered for 24 h in flat-base glass tubes (Ø 20 mm x 80 mm high) for the T. podisi strain maintained in the laboratory in E. heros eggs. Samples of T. podisi adults and fresh eggs from each species of pentatomide collected were stored for morphometric study and identification of endosymbionts. T. podisi from eggs of different species of pentatomids were evaluated according to the wing width and length parameters; tibia and body length. For the morphometric study of eggs, area and volume were measured from photos taken with the aid of a stereomicroscope. For the identification of endosymbionts, PCR reactions and sequencing were performed using specific primers. The largest volume of eggs belongs to T. perditor, and T. podisi originating from eggs of this specie has tibiae and longer wings. N. viridula and T. perditor eggs have larger areas while P. nigrispinus and P. guildinii eggs have smaller areas. Females from P. guildinii eggs have narrower wings and shorter body length. Among all the species compared, males of T. podisi have wider wings than females. The presence of endosymbionts was quite variable between host eggs and parasitoids from these eggs. Wolbachia pipientis was detected only in T. podisi originated from eggs of T. perditor. The species of endosymbiont bacteria Serratia grimesii was also detected among the samples. The results obtained provide information that helps to understand the ecological dynamics of parasitism in the field and host adaptation of T. podisi in different species of Pentatomidae. Keywords: Morphometry. Egg parasitoid. Pentatomidae. Endosymbionts. 5.1 INTRODUÇÃO A cultura da soja está sujeita ao ataque de insetos desde a germinação à colheita. Dentre os insetos-praga mais danosos à soja, está o complexo de percevejos 100 fitófagos formado pelas seguintes espécies de pentatomídeos: percevejo-marrom Euschistus heros (Fabricius, 1798), percevejo-barriga-verde Dichelops melacanthus (Dallas, 1851), percevejo-verde-pequeno Piezodorus guildinii (Westwood, 1837), percevejo-verde Nezara viridula (Linnaeus, 1758), percevejo-de-ombro-vermelho Thyanta perditor (Fabricius, 1974) e o percevejo-asa-preta Edessa meditabunda (Fabricius, 1974). Tanto as fases imaturas (ninfas) quanto os adultos ocasionam danos à cultura a partir da fase de formação das vagens até o final do desenvolvimento das sementes (R3 a R7), representando um risco na reta final do cultivo, quando se define o rendimento de grãos ou a qualidade da sementes (GALLO et al., 2002; PANIZZI et al., 2015). O manejo do complexo de percevejos fitófagos na cultura da soja é realizado majoritariamente pelo uso de inseticidas de amplo espectro de ação como os organofosforados, piretroides e neonicotinoides (PANIZZI, 2015). O uso indiscriminado de moléculas inseticidas com limitada rotação de ingredientes ativos favorece a seleção de populações resistentes, a ocorrência de surtos populacionais de pragas e o desequilíbrio ambiental (BUENO et al., 2011; BELO et al., 2012). Portanto, como alternativa a tais limitações do controle químico, outras estratégias como o uso do controle biológico dentro de um manejo integrado de pragas são promissoras. Os agentes de controle biológico podem reduzir a população de pragas para níveis abaixo do nível de danos econômico, de forma similar aos inseticidas sintéticos (BUENO et al., 2011). O parasitoide de ovos Telenomus podisi Ashmead, 1893 (Hymenoptera: Platygastridae) é destaque dentre os inimigos naturais de percevejos fitófagos da família Pentatomidae (MICHEREFF et al., 2015), apresentando altas taxas de parasitismo em ovos de E. heros a campo (PACHECO & CORRÊA-FERREIRA, 2000; MICHEREFF et al., 2016). Desenvolve-se, também, dentro de ovos de diferentes hospedeiros da família Pentatomidae, Scutelleridae e Coreidae (MARGARÍA et al., 2009), estando adaptados a diversos hospedeiros e condições climáticas. Em laboratório foi constatada a preferência de T. podisi por ovos de Dichelops melacanthus (QUEIROZ et al., 2018). Geralmente, os parasitoides de ovos avaliam a adequação hospedeira a partir de vários fatores como o tamanho e forma dos ovos, características físicas e químicas do córion, perfil de voláteis emitido e características 101 da superfície dos ovos (PAK & JONG, 1987; GODFRAY, 1994; ZHOU et al., 2014). Tal avaliação influi na determinação da atividade de oviposição e alocação de ovos em hospedeiros-alvo e, até mesmo, na aceitação de espécies não-alvo (MANSFIELD & MILLS, 2004). O efeito da presença de diferentes espécies de pentatomídeos em uma área sobre as taxas de parasitismo de T. podisi ainda carece de estudos e apresenta interesse teórico-prático para entender as preferências a campo e o uso potencial de hospedeiros alternativos a E. heros na produção massal de parasitoides de ovos de pentatomídeos-praga (QUEIROZ et al., 2018). A diversidade de Pentatomidae pode influenciar no desempenho de um parasitoide no manejo de uma espécie-alvo devido ao acréscimo na disponibilidade de ovos para o forrageamento (SIQUEIRA et al., 2012). A presença de endossimbiontes é também um fator capaz de influir na preferência e adequação hospedeira (STOUTHAMER et al., 2019). Os endossimbiontes são capazes de manipular seus hospedeiros suprimindo entomopatógenos e afetando a resistência de insetos a fatores adversos. Muitos parasitoides economicamente importantes, como os dos gêneros Trichogramma sp. e Cotesia sp., requerem a presença de Wolbachia para a manutenção de funções reprodutivas (DEDEINE et al., 2005). Endossimbiontes do gênero Rickettsia podem proporcionar melhora no condicionamento físico de insetos hospedeiros em condições de campo e laboratório e também estão associados ao aumento de fêmeas numa população (CASS et al., 2015). Endossimbiontes pertencentes à família Enterobacteriaceae, como os gêneros de bactérias Serratia sp., Hamiltonella sp., Regiella sp., e Arsenophonus sp.; também são relatados como mediadores nas relações de susceptibilidade versus resistência do hospedeiro a inseticidas (CASS et al., 2015). Outros gêneros de endossimbiontes que comumente estão presentes em parasitoides de ovos e hospedeiros são Sodalis sp., relacionado às adaptações metabólicas às condições ambientais; Spiroplasma sp., relatado como facilitadores da resistência do hospedeiro à entomopatógenos e; Cardinium sp., relatado como sendo um manipulador reprodutivo em insetos (STOUTHAMER et al., 2019). Há muito para ser esclarecido em relação aos mecanismos de ação de endossimbiontes sobre insetos. Entretanto, é inegável que alterações na frequência e presença destes microrganismos ao longo das gerações de parasitoides de ovos podem gerar 102 alterações biológicas e comportamentais significativas, sendo de fundamental importância a elucidação dos tipos de endossimbiontes presentes em populações silvestres e laboratoriais de parasitoides, bem como nos ovos hospedeiros. Microsporídios, como Nosema sp., são outros tipos de endossimbiontes que, quando presentes em populações de inimigos naturais, podem se tornar um problema de contaminação para os programas de controle biológico (SIMÕES et al., 2012), sendo importante a averiguação da presença de contaminantes do tipo em hospedeiros alternativos de parasitoides. Portanto, o presente trabalho visou a elucidação e exploração comparativa de caracteres morfométricos e a identificação dos principais grupos de endossimbiontes de T. podisi e ovos oriundos de seis espécies de percevejos a fim de fornecer informações sobre a dinâmica ecológica de parasitismo a campo e adaptação hospedeira de T. podisi em diferentes espécies de Pentatomidae. 5.2 MATERIAL E MÉTODOS O estudo de paramêtros morfométricos e identificação de endossimbiontes em ovos de seis espécies de pentatomídeos ocorrentes em soja e de T. podisi multiplicados nestes ovos foi conduzido nos laboratórios do Grupo de Pesquisa em Manejo Integrado de Pragas na Agricultura – AGRIMIP localizados no Departamento de Proteção Vegetal. As coletas de insetos para a execução do ensaio foram realizadas durante a safra 2019/2020 de soja na Fazenda Experimental Lageado, pertencente à Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista, FCA/UNESP, Campus de Botucatu, SP (latitude 22º 53' 09"S longitude 48º 26' 42" W). 5.2.1 Estudo morfométrico e identificação de endossimbiontes em T. podisi oriundos de diferentes ovos hospedeiros O estudo foi conduzido a partir da coleta a campo de percevejos fitófagos adultos das espécies Euschistus heros (Fabricius, 1798), Dichelops melacanthus (Dallas, 1851), Piezodorus guildinii (Westwood, 1837), Nezara viridula (Linnaeus, 1758), Thyanta perditor (Fabricius, 1974), Edessa meditabunda (Fabricius, 1974), e do asopíneo predador Podisus nigrispinus (Dallas, 1851). Para a identificação assertiva de cada espécie foi consultado o manual de identificação de insetos ocorrentes em soja baseado em chaves dicotômicas para cada espécies e proposto 103 por SÓSA-GOMEZ e colaboradores (2014). Os insetos adultos de campo foram acondicionados em laboratório (25 ºC, 70% de URA e 14 h de fotofase) para cópula e oviposição, garantindo que os ovos destes adultos fossem frescos e livres de parasitismo. Cada espécie coletada foi mantida separadamente em dieta natural descrita para E. heros anteriormente. Ovos de 24 h de cada espécie foram coletados e ofertados por 24 h em tubos de vidro de fundo chato (Ø 20 mm x 80 mm de altura) para a linhagem de T. podisi mantida em laboratório em ovos de E. heros. Amostras de 50 adultos de T. podisi oriundos de ovos de cada espécie, bem como 50 ovos frescos de cada espécie de pentatomídeo coletado, foram armazenados em álcool 70% para o estudo morfométrico e, em Chelex 100® a 10% para identificação de endossimbiontes. Quinze fêmeas e quinze machos adultos de T. podisi oriundos dos ovos das diferentes espécies de pentatomídeos tiveram os seguintes parâmetros avaliados no lado direito do corpo: largura e comprimento de asa; comprimento de tíbia e do corpo. Para o estudo morfométrico dos ovos, a altura, diâmetro e área de 15 exemplares de cada espécie foram mensurados. A partir da altura e diâmetro dos ovos, também foi calculado o volume cilíndrico médio dos ovos de cada espécie, segundo a fórmula (V = π x h x r²) adotada por Cônsoli e colaboradores (1999) (Figura 5.1). Figura 5.1 - Vista da lateral direita de um macho de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae), exemplificando como o estudo morfométrico foi realizado, mensurando a largura e comprimento de asas e o tamanho de tíbia e de corpo (em vermelho) a partir de fotos tiradas via estereomicroscópio (A) e disposição de ovos de Podisus nigrispinus Dallas (Hemiptera: Pentatomidae), exemplificando como eram mensurados volume em mm³ e área em mm² (B). 104 Não houve emergência de T. podisi de ovos de E. meditabunda. Dos ovos de N. viridula parasitados, houve a saída de poucos exemplares de T. podisi e dentre eles apenas um macho, impossibilitando a comparação de médias dos parâmetros morfométricos de machos de T. podisi oriundos das demais de pentatomídeos. Além disso, os adultos de T. podisi raramente concluíram a abertura no córion dos ovos de N. viridula para emergirem, assim, os insetos foram retirados, cuidadosamente, com o auxílio de estiletes de ponta fina e armazenados para a análise morfométrica comparativa e identificação de endossimbiontes. Toda a análise morfométrica foi realizada a partir de fotos tiradas com o auxílio de estereomicroscópio (Leica Application Suite-Version 1.6.0) e, posterior medição pelo software ImageJ, versão 1.47. Para a identificação de endossimbiontes, foram realizados os mesmos procedimentos de extração de DNA, reação de PCR e sequenciamento descritos anteriormente no tópico 2.2.5. 5.2.2 Análises estatísticas Os resultados dos parâmetros morfométricos de T. podisi oriundo de cada espécie de pentatomídeo coletada foram submetidos à análise de variância e, quando as premissas de normalidade dos resíduos e/ou homogeneidade de variância foram satisfeitas (Shapiro & Wilk, 1965), as médias serão comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. Quando os dados seguiram distribuição não paramétrica, estes foram submetidos à análise de Kruskal-Wallis. Todas as análises e confecção de 105 gráficos foram realizadas via software SigmaPlot versão 12.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). 5.3 RESULTADOS 5.3.1 Estudo morfométrico e identificação de endossimbiontes em T. podisi oriundos de diferentes ovos hospedeiros Dentre os ovos de pentatomídeos em comparação, as espécies com maior área (A) são N. viridula e T. perditor (H = 70,45; p < 0,0001) e os ovos de menor área são pertencentes às espécies P. nigrispinus e P. guildinii. Os ovos de maior volume (B) são de T. perditor enquanto os menores em volume e estatisticamente iguais são os ovos das espécies D. melacanthus, P. nigrispinus e P. guildinii (H = 77,70; p < 0,0001) (Figura 5.2). Figura 5.2 - Área em mm² (A) e volume em mm³ (B) de ovos dos pentatomídeos: Eh. Euschistus heros; Dm. Dichelops melacanthus; Pn. Podisus nigrispinus; Pg. Piezodorus guildinii; Nv. Nezara viridula e; Tp. Thyanta perditor. Barras (médias ± erro padrão) acompanhadas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. Dentre os parâmetros morfométricos mensurados, fêmeas de T. podisi oriundas de ovos de P. guildinii possuem uma menor largura de asas (F = 18,75; p < 0,0001) enquanto que, para o mesmo parâmetro (A), machos oriundos de ovos de P. nigrispinus e P. guildinii possuem asas significativamente mais estreitas (H 106 = 41,35; p < 0,0001). Entre os sexos de T. podisi oriundos de ovos da mesma espécie de pentatomídeo, os machos possuem asas mais largas que fêmeas (com exceção de machos oriundos de ovos de N. viridula, que, devido à emergência de apenas um macho, foi impossibilitada a comparação de todos os parâmetros morfométricos com os demais exemplares de T. podisi). Os comprimentos de asa e de tíbia de fêmeas de T. podisi oriundas de ovos de T. perditor são maiores estatisticamente em relação às fêmeas emergidas de ovos das outras espécies em comparação. O comprimento do corpo de fêmeas é menor em fêmeas quando o ovo hospedeiro é de P. guildinii (F = 12,28; p < 0,0001) e menor em machos quando oriundos de ovos de P. guildinii e T. perditor (H = 51,18; p < 0,0001). Os machos de T. podisi com asas mais compridas são oriundos de ovos de D. melacanthus e os de asas mais curtas são oriundos de ovos de P. guildinii (F = 6,62; p = 0,0001) (Figura 5.3). 107 Figura 5.3 - Parâmetros morfométricos de fêmeas e machos de Telenomus podisi Ashmead (Hymenoptera: Platygastridae) em diferentes ovos hospedeiros: Eh. Euschistus heros; Dm. Dichelops melacanthus; Pn. Podisus nigrispinus; Pg. Piezodorus guildinii; Nv. Nezara viridula e; Tp. Thyanta perditor. Largura (A) e comprimento de asa direita (B), comprimento da tíbia direita (C) e do corpo (D) em milímetros. Barras (médias ± erro padrão) acompanhadas pela mesma letra em maiúsculo (comparação entre fêmeas) e minúsculo (comparação entre machos) não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significância. Histograma abaixo da letra indica média significativamente diferente entre machos e fêmeas dentro do mesmo tratamento. Os gêneros de endossimbiontes presentes em adultos de T. podisi oriundos de seis espécies de pentatomídeos hospedeiros e em ovos de sete espécies de pentatomídeos-praga da soja constam na tabela abaixo (Tabela 5.1). 108 Tabela 5.1 - Gêneros de endossimbiontes presentes (+) em 1. ovos de E. heros; 2. adultos de T. podisi oriundos de ovos de E. heros; 3. ovos de D. melacanthus; 4. adultos de T. podisi oriundos de ovos de D. melacanthus; 5. ovos de P. nigrispinus; 6. adultos de T. podisi oriundos de ovos de P. nigrispinus; 7. ovos de P. guildinii; 8. adultos de T. podisi oriundos de ovos de P. guildinii; 9. ovos de N. viridula; 10. adultos de T. podisi oriundo de ovos de N. viridula; 11. ovos de E. meditabunda; 12. ovos de E. meditabunda parasitados por T. podisi; 13. ovos de T. perditor; 14. adultos de T. podisi oriundos de ovos de T. perditor. Gêneros testados: Ars.: Arsenophonus sp.; Card.: Cardinium sp.; Ham.: Hamiltonella sp.; Reg.: Regiella sp.; Ric.: Rickettsia sp.; Ser.: Serratia sp., Sod.: Sodalis sp.; Spi.: Spiroplasma sp.; Wol.: Wolbachia sp.; Nos.: Nosema sp. e; Cars.: Carsonella sp. Gêneros de endossimbiontes testados Ars. Card. Ham. Reg. Ric. Ser. Sod. Spi. Wol. Nos. Cars. 1 ------2 - - - - - + - - - - - 3 - - - - - + + - - - - 4 ------+ - - - - 5 - - - - - + + - - - - 6 ------+ - - - 7 ------+ 8 - - + - - + - + - - - 9 ------10 - - - - - + - + - - - 11 - - - - - + + - - - + 12 ------+ 13 ------14 - - + - - + - - + - - 109 O sequenciamento pelo método de Sanger realizado a partir de cada amostra de reação de PCR positiva para o gênero de endossimbionte testado indica a presença de Wolbachia pipientis (Rickettsiaceae) em T. podisi oriundo de ovos de T. perditor e de Serratia grimesii (Enterobacteriaceae) em T. podisi oriundos de ovos de E. heros; P. guildinii, N. viridula; T. perditor e em ovos de D. melacanthus; P. nigrispinus; E. meditabunda. Em relação às amostras de PCR que aplicaram bandas de mesma quantidade de pares de bases de Hamiltonella sp. em adultos de T. podisi oriundos de T. perditor e de Carsonella sp. em ovos de E. meditabunda parasitados por T. podisi, foram detectados Gossypium raimondii (algodão) e a bactéria Candidatus Providencia sidallii, respectivamente. 5.4 DISCUSSÃO O parasitoide de ovos Telenomus podisi possui uma gama variável de hospedeiros pertencentes às famílias de percevejos Pentatomidae, Coreidae e Scutelleridae (MARGARÍA et al., 2009). Por possuir uma preferência hospedeira flexível e passível de condicionamento pré-imaginal, o parasitismo de T. podisi é dependente das condições ambientais e da disponibilidade e proporções de oferta de ovos hospedeiros a campo (JONES et al., 2015). Contudo, apesar da espécie apresentar flexibilidade considerável na adaptação hospedeira, parâmetros biológicos e caracteres morfométricos podem variar de acordo com o ovo hospedeiro. O volume e área de ovos são características que influenciam na decisão de parasitismo pelas fêmeas de parasitoides (MOLINA et al., 2005; PLUKE & LEIBEE, 2006). Os ovos de maior volume, pertencentes à espécie T. perditor, permitiram o desenvolvimento de fêmeas de T. podisi com maior comprimento de asa, possivelmente pela maior quantidade de fonte de alimento para as larvas do parasitoide. 110 Em contrapartida, também devido ao menor volume, ovos de P. guildinii deram origem a fêmeas de asas mais estreitas e curtas e menor tamanho de corpo. Além disso, mesmo sendo um dos ovos de menor volume dentre as espécies avaliadas, dos ovos de D. melacanthus saíram machos com o maior comprimento de asas, indicando que T. podisi utiliza com sucesso o conteúdo nutricional de ovos do percevejo-barriga-verde e também poderia ser o hospedeiro principal em um contexto de produção massal (LAUMANN et al., 2010; QUEIROZ et al., 2018). O aspecto nutricional é de importância crucial para o desenvolvimento e escolha hospedeira de parasitoides, estando acima de caracteres como tamanho e forma de ovos (THOMPSON, 1986). A evolução de T. podisi para utilizar diferentes recursos dos hospedeiros em detrimento de alterações morfométricas influentes no condicionamento físico do parasitoide é uma característica diferencial de platigastrídeos (GOULART et al., 2011; ZHOU et al., 2014). Espécies de Telenomus sp. num geral podem apresentar características semelhantes e a confirmação de tal hipótese ainda carece de estudos mais aprofundados (QUEIROZ et al., 2018). Outro fator importante explorado no presente estudo é o de que T. podisi mesmo mantido em laboratório por várias gerações em ovos de E. heros não reduziu a possibilidade de parasitismo de outras espécies de percevejos-praga e do asopíneo predador T. nigrispinus. Com exceção de E. meditabunda, de todas as outras espécies de ovos hospedeiros houve emergência de T. podisi. Estudos anteriores já demonstraram a plasticidade de parasitoides no controle de diferentes espécies hospedeiras. No entanto, muitas espécies comercializadas em programas de CBA que possuem especificidade hospedeira são consideradas mais eficazes (HENRY et al., 2010). Tal hipótese pode ser diferencial em relação ao controle do complexo de pentatomídeos-praga que atacam a soja, uma vez que as dinâmicas populacionais das espécies de percevejos oscilam expressivamente durante os estágios fenológicos da soja e um agente de controle biológico mais flexível em relação à adequação hospedeira pode ser mais bem sucedido (QUEIROZ et al., 2018). 111 Os gêneros de endossimbiontes presentes em adultos de T. podisi oriundos de seis espécies de pentatomídeos hospedeiros e em ovos de sete espécies de pentatomídeos-praga da soja foram variáveis, indicando relação com os resultados de morfometria encontrados. A bactéria Candidatus Providencia sidallii detectada a partir do sequenciamento da amostra de PCR tida como positiva para Carsonella sp. em ovos de E. meditabunda pode indicar influência na não emergência de T. podisi de ovos parasitados desta espécie de pentatomídeo. Candidatus Providencia sidallii simbionte possui um genoma altamente reduzido, com alto teor de A + T e um conjunto reduzido de capacidades metabólicas, características comuns dos antigos endossimbiontes obrigatórios dos artrópodes. Seu genoma detém de muitas vias relacionadas à biossíntese de vitaminas do complexo B, apontando para um papel na suplementação da dieta restrita e em desequilíbrio nutricional à hemolinfa de seu hospedeiro, melhorando seu fitness (MANZANO-MARÍN et al., 2015). A presença da α-proteobactéria endossimbionte Wolbachia pipientis (Rickettsiaceae) comumente presente em Parasitica de T. podisi foi detectável apenas em parasitoides oriundos de ovos de T. perditor. W. pipientis é um simbionte citoplasmático frequentemente presente em insetos, manipulando-os a partir da indução partenogenética (aumento da razão sexual e, até mesmo, morte de machos antes da emergência) (STOUTHAMER; BREEUWER; HURST, 1999). A presença de W. pipientis pode ser tida como positiva, uma vez que influencia diretamente no aumento de fêmeas de T. podisi desejável num contexto de uso de parasitoide de ovos em programas de controle biológico aplicado (RUSSEL et al., 2018). A presença detectável da bactéria Serratia grimesii (Enterobacteriaceae), um importante endossimbionte capaz de mediar e evitar infecções por entomopatógenos, foi condicionada à passagem de T. podisi por ovos de E. heros; P. guildinii, N. viridula; T. perditor mesmo que também tenha sido detectada em ovos de D. melacanthus; P. nigrispinus e E. meditabunda. Além disso, os resultados registrados indicam que, mesmo entre uma geração de insetos, a presença detectável de endossimbiontes em T. podisi variou dentre as espécies de ovos hospedeiros, refletindo a importância de se conhecer a diversidade de endossimbiontes de ovos de pentatomídeos (RUSSEL et al., 2018). 112 A detecção de DNA de Gossypium raimondii (algodão) em adultos de T. podisi oriundos de T. perditor pode se dever ao fato de os ovos terem sido coletados em laboratório de posturas colocadas por sobre fibra de algodão. Em conclusão, a influência da diversidade de ovos de pentatomídeos hospedeiros de T. podisi ainda carece de mais estudos em relação aos parâmetros biológicos a fim de se entender dinâmicas populacionais de parasitismo a campo e da possível utilização de outros hospedeiros para a criação massal deste agente de controle biológico de pentatomídeos, além da possibilidade de uso de D. melacanthus. 5.5 REFERÊNCIAS BELO, M.S. da S.P.; PIGNATI, W.; DORES, E.F.G. de C.; MOREIRA, J.C.; PERES, F. Uso de agrotóxicos na produção de soja do Estado do Mato Grosso: um estudo preliminar de riscos ocupacionais e ambientais. Revista Brasileira de Saúde Ocupacional, v.37, p.78‑88, 2012. DOI: http://dx.doi.org/10.1590/S0303- 76572012000100011. Disponível em: BUENO, R.C.O.F., PARRA, J.R.P., BUENO, A.F. Trichogramma pretiosum parasitism and dispersal capacity: a basis for developing biological control programs for soybean caterpillars. Bulletin of Entomological Research, v. 102 p. 1-8, 2011. 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Parasitoides multiplicados em ovos frescos de E. heros têm o período de desenvolvimento ovo-adulto prolongado e tíbias mais compridas e as bactérias endossimbiontes Wolbachia pipientis e Serratia grimesii são encontradas em T. podisi; 2. A quantidade de fêmeas/ovo que atinje maior taxa de parasitismo a fim de se diminuir a competição intraespecífica e gerar o aumento das taxas de parasitismo em condições laboratoriais de multiplicação do parasitoide é de 8,87 fêmeas e a partir 9,28 ovos/fêmea há um estímulo de parasitismo de T. podisi; 3. A distância máxima de forrageamento atingida por T. podisi foi de 39 metros durante o estágio fenológico da soja Vn-R1 e de 30,90 metros no estágio R5-R6; 4. Fêmeas oriundas de ovos de P. guildinii possuem asas mais estreitas e menor comprimento de corpo e entre todas as espécies comparadas, os machos de T. podisi possuem asas mais largas que fêmeas. Além disso, T. podisi não completou ciclo em ovos de E. meditabunda; 5. Os resultados obtidos fornecem informações que auxiliam o entendimento sobre a dinâmica ecológica de parasitismo a campo e adaptação hospedeira de T. podisi e é base para a elaboração de programas de controle de qualidade da produção em massa e posterior liberação de T. podisi para o manejo de pentatomídeos-praga na cultura da soja. 118 119 REFERÊNCIAS AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, ANVISA: Sistema Eletrônico de Informações (SEI). 2019. Disponível em: ÁVILA, C.J., GRIGOLLI, J.F.J. Pragas da Soja e Seu Controle. In: Lourenção, A.L.F., Grigolli, J.F.J., Melotto, A.M., Pitol, C., Gitti, D.C., Roscoe, R. (Eds.), Tecnologia e produção: Soja 2013/2014. Fundação MS, 247p, 2014. Disponível em: BELO, M.S. da S.P.; PIGNATI, W.; DORES, E.F.G. de C.; MOREIRA, J.C.; PERES, F. Uso de agrotóxicos na produção de soja do Estado do Mato Grosso: um estudo preliminar de riscos ocupacionais e ambientais. Revista Brasileira de Saúde Ocupacional, v.37, p.78‑88, 2012. 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