UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONIA PERUANA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE ALCALOIDES A PARTIR DE HOJAS Y TALLOS DE Tabernaemontana siphilitica “Lobo Sanango” UTILIZADO COMO ANTIMALÁRICO EN LA REGIÓN LORETO” TESIS

Para Optar el Título de: INGENIERO QUÍMICO.

Presentado por los Bachilleres: Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Erick Vidal Taricuarima Asesores:

Ing. Lastenia Ruiz Mesía Dra.

Ing. Wilfredo Ruiz Mesía Dr.

IQUITOS - PERU 2013

UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

Tesis para optar el título profesional de “INGENIERO QUIMICO” aprobado por unanimidad con calificación de Buena, en Sustentación Publica por el Jurado Calificador nombrado por la Facultad de Ingeniería Química conformado por:

…………………………………. Ing. Maritza Grández Ruíz. Dra. Presidenta.

…..…………………….……………. ...………………………………… Ing. Maritza Echevarría Ordóñez.M.sc. Ing. Juan M. Rojas Amasifén. Dr. Miembro Miembro

……………………………… Ing. Lastenía Ruíz Mesía. Dra. Asesora

…………………….…………. Ing. Wilfredo Ruíz Mesía. Dr. Asesor

DEDICATORIA.

A DIOS

Porque:

Jamás nos dejó solos

En los momentos donde Hubo aflicción, vimos que no nos Olvidó, ¡gracias!, por darnos la Vida y permitirnos conocer

Amigos sinceros y verdaderos.

Hivelli & Erick

A LA FAMILIA

A nuestros hijos: Joab, Tracy y Caleb, que son nuestras inspiraciones y fuerzas para seguir luchando hasta lograr cumplir nuestras metas.

A nuestros padres: Marlenia,

Reynaldo y Nilda por su amor y apoyo incondicional, por estar siempre a nuestro lado en todo momento.

AGRADECIMIENTO.

Nuestro profundo agradecimiento a las instituciones y personas que hicieron posible su desarrollo: Al laboratorio de Investigación de Productos Naturales Antiparasitario de la Amazonía (LIPNAA - UNAP) “Gabriel de la Fuente Martin”.

Al Proyecto“Búsqueda y obtención de compuestos con actividad antimalárica y anthileishmanicida a partir de especies vegetales amazónicas.” por el apoyo financiero para la ejecución de esta tesis.

De una manera muy especial nos referimos, A la Dra. Lastenia Ruiz Mesía, por sembrar en nosotros el aprecio y el amor a esta ciencia, y por enseñarnos cualidades para ser mejores profesionales en este mundo globalizado y competitivo. Gracias por permitirnos formar parte de su equipo y por la oportunidad de hacer la tesis en mención, nuestro agradecimiento es infinito que no basta con simples palabras, solo nos queda decirle,..”No la defraudaremos”

Un profundo agradecimiento para el maestro y amigo; al Dr. Wilfredo Ruiz Mesia, por todo su apoyo en la elaboración de esta tesis.

Un agradecimiento especial para nuestra amiga incondicional; la Ing. Leonor Arévalo Encinas, por su importantísima e indispensable contribución a este trabajo, por su vitalidad, simpatía, y su gran paciencia.

Al instituto de productos Naturales y Agrobiología de Canarias-España, en mención del Dr. Matías Reina y Q.F. Liliana Ruiz por el apoyo en la espectroscopía de esta tesis. A todos los miembros del LIPNAA., Al Sr. Cesar Tuesta, Al Sr. Jaime del Águila, y a la Sra. Rosita Vásquez.

Tesis financiada por el Proyecto: “Búsqueda y obtención de compuestos con actividad antimalárica y anthileishmanicida a partir de especies vegetales amazónicas.” – UNAP.

INDICE GENERAL

RESÚMEN INTRODUCCIÓN 01

CAPITULO I 1. Marco teórico 1.1. Especie en estudio 04 1.1.1. Aspectos Botánicos 04 1.1.2. Descripción Botánica 04 1.1.3. Nombres Comunes 05 1.1.4. Usos Comunes 05 1.1.5. Distribución del Género Tabernaemontana 05

1.2. Alcaloides 1.2.1. Definición 09 1.2.2. Clasificación de los Alcaloides 12 1.2.3. Alcaloides Indólicos 13 1.2.4. Distribución de los Alcaloides Indólicos 18 1.2.5. Biogénesis de los Alcaloides Indólicos 20 1.2.6. Farmacología 24 1.2.7. Propiedades físicas y Químicas 27 1.2.8. Extracción de Alcaloides 28

CAPITULO II

2. Materiales y Métodos 2.1. Material Botánico 30 2.2. Materiales de Laboratorio y otros 30 2.2.1. Materiales de vidrio 30 2.2.2. Adsorbentes 31 2.2.3. Solventes Orgánicos 31 2.2.4. Reactivos 31 2.3. Técnicas Instrumentales y Equipos 31 2.3.1. Resonancia Magnética Nuclear (RMN) 31 2.3.2. Espectrometría de Masas (EM) 32 2.3.3. Espectroscopia de Infrarrojo (IR) 32 2.4. Técnicas Cromatográficas 32 2.4.1. Cromatografía de Columnas (C.C.) 32 2.4.2. Cromatografía de Capa Fina (C.C.F.) 33 2.4.3. Cromatografía en Capa Fina Preparativa. (C.C.F.P.) 33 2.5. Procedimiento Experimental 33 2.5.1. Preparación de las Muestras 33 2.5.2. Extracción de Alcaloides de las Hojas y Tallos de la Tabernaemontana Siphilitica 34 2.5.3. Fraccionamiento Cromatográfico del Extracto Alcaloidal ácido de Las Hojas y Tallos de la Tabernaemontana siphilitica 36 2.5.3.1. Aislamiento y purificación de las fracciones alcaloidales Obtenidas del extracto Alcaloidal acido de las hojas y tallos de Tabernaemontana siphilitica 36

2.5.4. Fraccionamiento Cromatográfico del extracto Alcaloidal Básico y residuo de hojas y tallos de Tabernaemontana Siphilitica 38 2.5.4.1 Aislamiento y purificación de las Fracciones alcaloidales Obtenidas del extracto Alcaloidal Básico y Residuo de las hojas y tallos de Tabernaemontana siphilitica 39 2.5.5. Datos Físicos y Espectroscópicos de los Alcaloides aislados 40 2.5.5.1. Coronaridina 41 2.5.5.2. 19 S- Heyneanina 42 2.5.5.3. Coronaridina hidroxindolenina 43 2.5.5.4. 3-Oxocoronaridina 44

CAPITULO III

3. Discusiones y Resultados. 3.1. Resultados 47 3.2. Determinación Estructural de los Alcaloides Aislados 47 3.2.1. Alcaloide Coronaridina 47 3.2.2. Alcaloide 19 S- Heyneanina 50 3.2.3. Alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 53 3.2.4. Alcaloide 3- Oxocoronaridina 55 Conclusiones 59 Recomendaciones 60 Referencias Bibliográficas 61 Anexos 76 Certificado del Herbarium Amazonense 94

LISTA DE TABLAS, FIGURAS Y DIAGRAMAS.

1. Lista de Tablas. Tabla N° 01. Distribución del género Tabernaemontana en el Perú 06 Tabla N° 02. Datos de RMN de 1H, 13C, HMQC, COSY, NOESY de 19S- Heyneanina 52 Tabla N° 03. Datos de RMN de1H, 13C, HMQC, COSY, NOESY de 3- OXO- Coronaridina 58

2. Lista de Figuras. Figura N° 01. Estructura de Alcaloides Indolicos 14 Figura N° 02 Subtipo de Alcaloides Plumerano, Aspidospermatano, Corinanteano e Ibogano 15 Figura N° 03 Alcaloides Oxoindólicos 18 Figura N° 04 Biogénesis de los Alcaloides Tipo Iboga y Aspidosperma 21 Figura N° 05 Biogénesis de los Alcaloides indol glucosídicos 21 Figura N° 06 Biogénesis de alcaloides tipo yohimbina, Ajmalicina y Corinanteina 22 Figura N° 07 Biogénesis de los alcaloides tipo Iboga y Aspidosperma 23 Figura N° 08 Biogénesis de los alcaloides tipo Piridocarbazol 24 Figura N° 09 Estructura de la Ellipticina 26 Figura N° 10 Diferentes Esqueletos Alcaloidales 28 Figura N° 11 Fraccionamiento de masas de Coronaridina 48 Figura N° 12 Alcaloide Coronaridina Publicado 49 Figura N° 13 Alcaloide Coronaridina Aislado en el LIPNAA-UNAP 49 Figura N° 14 Alcaloide Heyneanina Publicado 51 Figura N° 15 Alcaloide Heyneanina Aislado en el LIPNAA-UNAP 51 Figura N° 16 NOESY del Alcaloide 19S-Heyneanina 53 Figura N° 17 Fraccionamiento de masa de Coronaridina Hidroxindolenina 54 Figura N° 18 Alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina Publicado 55 Figura N°19 Alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina Aislado en el LIPNAA-UNAP 55 Figura N° 20 Alcaloide 3- Oxo Coronaridina Publicado 57 Figura N° 21 Alcaloide 3- Oxo Coronaridina Aislado en el LIPNAA- UNAP 57 Figura N° 22 NOESY del Alcaloide 3-Oxocoronaridina 58 Figura N° 23 Espectro de Masa del alcaloide Coronaridina 77

Figura N° 24 Espectro de IR del Alcaloide Coronaridina 77 Figura N° 25 Espectro de RMN de1H del alcaloide Coronaridina 78

Figura N° 26 Espectro de Masa del alcaloide 19S-HEYNEANINA 79

Figura N° 27 Espectro de IR del alcaloide 19S-HEYNEANINA 79 Figura N° 28 Espectro de RMN de H+ de alcaloide 19S-HEYNEANINA 80 13 Figura N° 29 Espectro de RMN de C del alcaloides 19S-HEYNEANINA 80

Figura N° 30 COSY del alcaloide 19S-HEYNEANINA 81

Figura N° 31 NOESY del alcaloide 19S-HEYNEANINA 82 13 Figura N° 32 HSQC de C del alcaloides 19S-HEYNEANINA 83 Figura N° 33 Espectro de Masa del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 84 Figura N° 34 Espectro de IR del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 84 Figura N° 35 Espectro de RMN de1H del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 85 Figura N° 36 Espectro de RMN de13C del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 85

Figura N° 37 COSY del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 86 Figura N° 38 NOESY del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 87

Figura N° 39 HSQC del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina 88 Figura N° 40 Espectro de Masa del alcaloide 3-Oxocoronaridina 89 1 Figura Nº 41 Espectro de RMN de H del alcaloide 3-Oxocoronaridina 89 13 Figura Nº 42 Espectro de RMN de C del alcaloide 3-Oxocoronaridina 90 Figura Nº 43 COSY del alcaloide 3-Oxocoronaridina 91

Figura Nº 44 NOESY del alcaloide 3-Oxocoronaridina 92 Figura Nº 45 HSQC del alcaloide 3-Oxocoronaridina 93

3. Lista de Diagramas.

Diagrama N° 01. Extracción de Alcaloides de las hojas y tallos de la Tabernaemontana siphilitica 35 Diagrama N° 02. Fraccionamiento, Aislamiento y Purificación de las hojas y tallos de la Tabernaemontana siphilitica del extracto Alcaloidal acido 45 Diagrama N° 03. Fraccionamiento, Aislamiento y Purificación de las hojas y tallos de la Tabernaemontana siphilitica del extracto Alcaloidal Básico y Residuo 46

RESÚMEN

El presente trabajo de investigación tiene por objetivo, aislar e identificar los alcaloides de las hojas y tallos de la Tabernaemontana siphilitica (Apocinaceae), especie vegetal que se utiliza tradicionalmente como antimalárico en la amazonia peruana. El estudio se realizó en las instalaciones del Laboratorio de Investigación de Productos Naturales Antiparasitarios de la Amazonia" Gabriel de la Fuente Martín" LIPNAA-UNAP, en lo referente a la extracción, fraccionamiento cromatográfico, purificación y aislamiento de los alcaloides y en el Instituto de Agrobiología de Canarias del Consejo Superior de Investigación Científico de Tenerife (España) se realizaron, la toma de los espectros de RMN, espectrometría de masas de alta y baja resolución, los experimentos, bidimensionales de coherencia cuántica homo y heteronucleares, los cuales permitieron determinar las estructuras químicas de los alcaloides aislados. Las hojas y tallos de Tabernaemontana siphilitica, se secaron a la temperatura de 20oC obteniéndose (1.27 Kg) de planta seca y molida, a partir del cual se obtuvo el extracto Etanólico (161.9g) por maceración con etanol por un periodo de 32 días. El extracto Etanólico (161.9g) se disolvió en H2SO4 0,5 N, se extrajo con CH2Cl2 obteniéndose 2.72g de extracto alcaloidal ácido, el extracto acuoso se basificó a pH=9 con NH4OH después de extraer con CH2Cl2 y evaporar se obtuvo (552.1 mg). Y (376 mg) de residuo Alcaloidal. El extracto alcaloidal acido se volvió a extraer a pH= 9 y se obtuvo (60.9 mg). Por cromatografía de capa fina se unieron los extractos alcaloidales dando un peso de 989 mg. Utilizando técnicas cromatográficas de columna, cromatografía de capa fina, cromatografía preparativa se aislaron cuatro alcaloides. La estructura química se determino por la interpretación de sus datos espectroscópicos (RMN 1H y 13C, COSY, NOESY y HSQC) y datos espectrométricos y por comparación con los datos publicados en la bibliografía química, los cuales fueron identificados como: CORONARIDINA, 19 S – HEYNEANINA, CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA, 3-OXO- CORONARIDINA. INTRODUCCIÓN

Las civilizaciones antiguas consideraron muchas plantas por sus propiedades curativas. Este conocimiento se fue transmitiendo a lo largo de los siglos, sin que se supiera por qué o cómo actuaban, pero sí era indiscutible que las plantas podían curar diversas enfermedades y constituían la mayor fuente de medicamentos para el hombre y los animales. Hoy se sabe que las propiedades medicinales de las plantas son responsabilidad de algunos grupos de sustancias de diversa composición química conocidas como metabolitos secundarios.

Las Plantas medicinales, son todas aquellas plantas que contienen, en alguno de sus órganos, principios activos, los cuales, administrados en dosis suficientes, producen efectos curativos en las enfermedades de los hombres y de los animales en general. Se calcula en unas 260.000 las especies de plantas que se conocen en la actualidad, de las que el 10% se pueden considerar medicinales. Las plantas poseen una gran cantidad de metabolitos primarios y secundarios que les permiten crecer, multiplicarse, defenderse y sobrevivir.

Los alcaloides, son las más numerosas de los metabolitos secundarios de gran diversidad estructural de carácter básico; en su mayoría de origen vegetal, algunos pocos de origen animal que suelen tener actividad biológica incluso a dosis muy bajas; La familia Apocinaceae se encuentra distribuida en todo el mundo, pero principalmente en las áreas tropicales, comprende 250 a 550 géneros que agrupa 3700 a 5100 especies, ricas en alcaloides indólicos y muchas de ellas reportadas como antimalárico por las diferentes etnias amazónicas (Vásquez Martínez. 1997).

La familia Apocynaceae en el Perú consta de 37 géneros y 158 especies (Brako & Zarucchi, 1993; Ulloa et al., 2004), pueden ser bejucos, lianas, árboles y arbustos. En este trabajo se reconoce 14 endemismos de 10 géneros.

Los alcaloides, se encuentran en las semillas, raíces, cortezas y hojas; al estado libre o como glucósidos, o formando sales con ácidos orgánicos. Ninguna otra

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 1 Erick Vidal Taricuarima clase de productos naturales posee tal enorme variedad de estructuras. La familia Apocynaceae, constituyen una de las familias de plantas con flor más importantes por su diversidad, distribución y utilidad, la misma ha sido poca estudiada a nivel regional. Estas especies se caracterizan por sintetizar alcaloides del tipo Indólicos, oxindólicos. (A. Situación Perú, 2003).

Los alcaloides se caracterizan por la presencia de nitrógeno básico, teniendo propiedades de formar sales solubles en el agua con ácidos orgánicos e inorgánicos, mientras que sus bases libres son solubles en solventes orgánicas. Se encuentran en todos los órganos de la planta: semilla, raíces, cortezas, hojas, flores. (Asociación latinoamericana. 2008).

Los antimaláricos conocidos actualmente, son producto de la investigación extranjera, en países donde la malaria fue superada y sus líneas de investigación se dirigen a otros campos, por ello en el Perú en especial Loreto (Iquitos) la UNAP, ha priorizado líneas de investigación en la Búsqueda y Obtención de nuevos compuestos con actividad antimalárica a partir de especies vegetales amazónicas, esta investigación permite validar las plantas que el poblador amazónico utiliza tradicionalmente para el tratamiento de la malaria. La selva amazónica alberga las 2/3 partes de la biodiversidad del mundo; reportándose 170 especies de uso antimalárico. (Maco M. et al; Ruiz L, et al.2007).

Tabernaemontana, es un género muy extenso, que pertenece a la familia de las Apocináceas y consta aproximadamente de 100 especies distribuidas por todo el trópico, así como en algunas regiones subtropicales, del mundo. Las especies se utilizan en la medicina tradicional y para otros fines, las formas y los usos medicinales son muy variados.

El género Tabernaemontana, presenta muchas aplicaciones biológicas la bibliografía científica reporta que se han encontrado extractos de plantas y compuestos puros con actividad citotóxica y antitumoral , actividad frente a diferentes bacterias: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli,

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Staphylococcus aureus meticilino resistentes, Streptococcus faecalis, Salmonella enteritidis, Shigella flexneri, Staphylococcus epidermidis, Acynetobacter lwoffii, actividad antimalárica, leishmanicida entre otras actividades biológicas(Geran. 1972), (V.S. Prakash. 2002), (Ramanitrahasimbola. et al., 2001).

Esta investigación, tiene como objetivo, la identificación de los alcaloides a partir del extracto etanólico de las hojas y tallos de la Tabernaemontana siphilitica. El aislamiento y purificación de los alcaloides se realizó utilizando técnicas cromatográficas de columna (C.C), Cromatográfica Preparativa(CP), Cromatografía de capa Fina(CCF), cromatografía de exclusión molecular y la elucidación estructural por medio de técnicas espectroscópicas, espectrométricas, y por comparación de sus datos físicos con los reportados en la bibliografía química.

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CAPITULO I

1. MARCO TEÓRICO

1.1. ESPECIE EN ESTUDIO La especie en estudio es Tabernaemontana siphilitica (Apocinaceae) conocida en la región Amazónica como “Lobo Sanango”. (Mejía y Rengifo)

1.1.1. ASPECTOS BOTÁNICOS. Descripción de la especie: . Nombre Común : “Lobo Sanango” . Nombre Científico : Tabernaemontana siphilitica . Familia : Apocinaceae . Género : Tabernaemontana . Especie : Siphilitica . Reino : planta . División : Magnoliophyta . Clase : Magnoliopsida . Orden : Gentianales . Autor Epíteto Específico : (L. f.) Leeuwenb . Determinador : Leeuwenberg, J. M. . Fecha determinación : 1992

1.1.2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA Árbol de hasta 8 metros de altura. Exudación de látex blanco abundante y pegajoso. Hojas simples, opuestas, con margen entero, glabras, color verde brillante. Flores agrupadas en inflorescencias terminales y axilares, con corola verde y bordes blancos. Frutos folículos fusionados uno al frente del otro, de color verde y amarillo al madurar, cada uno contiene una semilla. Posee también potencial ornamental. Se distribuye por Colombia,

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Guyana, Surinam, Guyana Francesa, Ecuador, Venezuela, Brasil y Perú. Crece en Loreto, San Martín, Huánuco, Junín, Madre de Dios y Ucayali. (Duke 2009).

1.1.3. NOMBRES COMUNES En la Amazonía Peruana esta especie es conocida como lobo sanango, capeshini, uchu sanango, (Rengifo y Mejía), en los países vecinos como Colombia también es conocido como Borrachero negro, borrachero arbustivo. (www.plantas toxicas).

1.1.4. USOS COMUNES Tabernaemontana siphilitica, es una especie vegetal muy utilizada por el poblador amazónico para el tratamiento como antiinflamatorio, febrífugo, analgésico, emético, sedante, sudorífico y tranquilizante. (Duke 2009). La revisión bibliográfica del género Tabernaemontana nos permitió verificar que esta especie, no reporta estudios químicos ni farmacológicos, por lo que es necesario aislar e identificar sus componentes químicos.(IICA, 1999).

1.1.5. DISTRIBUCIÓN DEL GÉNERO TABERNAEMONTANA. El género Tabernaemontana lleva el nombre de Jacob Theodor. Müller, Tabernaemontana que pertenece a la familia de las Apocynaceae (Leeuwenberg, 1991), es un gran género que presenta una gran variedad de especies, con estructuras químicas complejas e interesantes. Hay alrededor de 100 especies de Tabernaemontana, ampliamente distribuido en los trópicos, 18 en África, 15 en Madagascar, 21 en Asia tropical, y cerca de 50 en el neotrópico. Este género es una fuente muy rica de una serie de alcaloides indólicos con esqueletos de carbono interesantes y novedosas actividades biológicas (Van Beek. 1984,1988). En todas partes, las especies se utilizan en la medicina tradicional y para otros fines, las formas y los usos medicinales son muy variados y la decocción sirve para el lavado de heridas y para baños de vapor para el tratamiento de sífilis.

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En el Perú se encontraron 15 especies del género Tabernaemontana, 14 de ellos se encuentran en el Departamento de Loreto. Los cuales se indican en la Tabla 01.

TABLA N° 01. Distribución del género Tabernaemontana en el Perú. DISTRIBUCIÓN EN EL PERÚ ESPECIE UBICACIÓN Tabernaemontana Columbiensis Dpto. Huánuco y San Martin Tabernaemontana Cuspidata Dpto. Loreto y Ucayali Tabernaemontana Cymosa Dpto. Loreto y San Martin Tabernaemontana Flavicans Dpto. Huánuco, Loreto, Madre de Dios y San Martin Tabernaemontana heterophyla Dpto. Loreto, Madre de Dios y San Martin. Tabernaemontana hirtula var.maynensis Dpto. Loreto Tabernaemontana Luciliae Dpto. Huánuco, Loreto y San Martin Tabernaemontana Macrocalix Dpto. Amazonas y Loreto Tabernaemontana Markgrafiana Dpto. Amazonas, Loreto y Ucayali Tabernaemontana Sananho Dpto. Amazonas, Ayacucho, Huánuco, Junín, Loreto, Madre de Dios, Pasco, San Martin y Ucayali. Tabernaemontana Siphilitica Dpto. Amazonas, Huánuco, Loreto, Madre de Dios y San Martin. Tabernaemontana Stenolaba Dpto. Loreto, Madre de Dios Tabernaemontana Tessmannii Dpto. Loreto y San Martin. Tabernaemontana Undulata Dpto. Amazonas, Huánuco, Junín, Loreto, Pasco, San Martin y Ucayali. Tabernaemontana Vanheurckii Dpto. Cuzco, Huánuco, Loreto, Madre de Dios, San Martin y Ucayali.

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Del estudio de los diferentes géneros de Tabernaemontana Se detectó actividad frente a diferentes enfermedades como por ejemplo: De Tabernaemontana Catharinensis. (Pereira 1999. Burkart A. 1979) detectó actividad frente a Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus meticilino resistentes, Streptococcus faecalis, Salmonella enteritidis, Shigella flexneri, Staphylococcus epidermidis, Acynetobacter lwoffii. Tabernaemontana fuchsiaefolia, actualmente se utiliza en la medicina tradicional para el tratamiento de la malaria en Sao Paulo y Paraná (Zocoler et al. 2005). Atribuyó la actividad biológica a los alcaloides bisindolico, (Frederick et al. 2000). Voacamine es activa in vivo (43% de reducción de la parasitemia a 10 mg / kg por vía oral mediante la prueba de supresión de Peters) y presenta de cierta especificidad en la fase trofozoítos y esquizontes. (Ramanitrahasimbola. Et. 2001).

Los principales problemas de este género se refieren a la identificación taxonómica. En varios casos, los grupos de investigación han trabajado en la misma planta sin darse cuenta, porque los nombres utilizados en la identificación del material posteriormente han sido reconocidos como pertenecientes a la misma especie, por ejemplo, Tabernaemontana Crussa con 5 sinónimos y Tabernaemontana coffeoides con muchos sinónimos y numerosos taxones.

Los resultados químicos deben ser capaces de dar información acerca de las rutas biosintético implicadas en la producción de alcaloides indólicos, así como la quimiotaxonomía del género. También pueden ser de ayuda en la búsqueda de nuevos compuestos medicinales interesante o en la validación del uso de una planta o extracto frente a diferentes dolencias o enfermedades. En contraste con la enorme cantidad de investigación Fitoquímica, hay poca información farmacológica. Una mejor cooperación entre los fitoquímicos y farmacólogos podría llevar a conclusiones nuevas y útiles. La etnobotánica da muchos ejemplos de usos similares de

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diferentes especies del mundo, y aunque algunos de los usos son cuestionables, es difícil creer que todo lo informado carezca de valor científico, se espera que los estudios químicos y etnobotánicas contribuyan a la identificación taxonómica de las especies de este género. También se espera que los datos etnobotánicas proporcionen nuevas pistas y estimulen más investigación, porque muchas especies aún no se han investigado química y farmacológicamente; a fin de descubrir nuevas moléculas con actividades biológicas interesantes.

El género Tabernaemontana se caracteriza por sintetizar alcaloides indólicos y bisindólicos, así tenemos que de Tabernaemontana Accedens.

se aislaron los alcaloides: Accedine, N1-Demethyl-16-epi-accedine, N1- Methyl-16-epi-affinine, Accedinine Accedinisine, Voacamidine Voacamine. (Achenbach. 1975). De Tabernaemontana affinis. Se aislaron los alcaloides: Serpentine, Yohimbine, Affinisine, Affinine, Vobasine, Coronaridine, Coronaridine pseudoindoxyl, Olivacine. (Chaves.1960, F. Abreu 1976, J. Weisbach 1963). De Tabernaemontana Alba. Se aislaron los alcaloides: Tabersonine, Coronaridine. (0. Collera 1962, F. Abreu 1976). De Tabernaemontana albiflora, Se aislaron los alcaloides: Coronaridine, 18- hydroxycoronaridine, (20R)-18,19-dihydroxy-pseudovincadifformine, Ibophyllidine, 19-hydroxyibophyllidine (C. Kan, 1981). De Tabernaemontana amblyocarpa. Se aislaron los alcaloides: Akuammidine, Vallesamine, (+)- Tubotaiwine, Isovoacangine, Voacristine, Isovoacristine. (I. Pérez. 1980). De Tabernaemontana amygdalifolia. Se aislaron los alcaloides: 12- Demethoxycylindrocarpidine Homocylindrocarpidine, 5 Oxocylindrocarpidine, O-Demethylpalosine (H.Achenbach 1967 y I981). De Tabernaemontana arbórea. Se aislaron los alcaloides: Tabersonine, Voacangine, Isovoacangine, Voacamine, 19-epi-Voacorine. (Chaverri. 1980, D. Kingston. 1978 y 1980). De Tabernaemontana attenuata. Se aislaron los alcaloides: 16-epi- pleiocarpamine, (+)-Tubotaiwine, Conopharyngine, Conopharyngine hydroxyindolenine, (6R)-3,6-oxidocoronaridine, (-)-Heyneanine, 19-epi- Heyneanine, Coronaridine hydroxyindolenine, 11-Hydroxycoronaridine,

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10-Hydroxyheyneanine, Ibophyllidine. (A. Amico 1977). De Tabernaemontana brachyantha. Se aislaron los alcaloides: Normacusine B, Anhydrovobasindiol, Voacorine, Conopharyngine. (M.B. Patel. 1973). De Tabernaemontana bufalina. Se aislaron los alcaloides: Dregamine, Silicine, Aparicine Pandoline, 20-epi-pandoline Pseudotabersonine, Pandine. (M.J. Hoizey. 1995; M. Zeches. 1975). De Tabernaemontana capuronii. Se aislaron los alcaloides: Capuronine; Capuronidine; 14,15- Anhycrocapuronidine; 14,15-Anhydro-1,2-dihydrocapuronidine; (20R)- capuvosidine, Capubosine, Dehydroxycapuvosine, N4-Demethylcapuvosine (I. Chardon. 1978). De Tabernaemontana Divaricata. Se aislaron los alcaloides: Dregamine, Tabernaemontanine, Vobasine Voaphylline, Lochnericine Tabersonine. (B. Talapatra. 1975, M. Elkeiy. 1966). De Tabernaemontana Elegans. Se aislaron los alcaloides: Voacamine, Tabernaemontanine, Conoduramine, Tabernaelegantine A, Tabernaelegantine B, Tabernaelegantine C, Tabernaelegantine D, Tabernaelegantanine A, Tabernaelegantanine B, Tabernaelegantanine C, Tabernaelegantanine D (M. Gorman. 1960, B. Talapatra. 1975, B. Gabetta. 1975, E. Bombardelli. 1976). De Tabernaemontana Macrocalix. Se aislaron los alcaloides: Tabersonine, Coronaridine. (J. Bruneton. 1979). De Tabernaemontana Sananho. Se aislaron los alcaloides: Coronaridine, 3-Hydroxycoronaridine, (-)-Heyneanine, (-)-Ibogamine. (K. Raj, 1974).

1.2. ALCALOIDES.

1.2.1. Definición

Los alcaloides son sustancias orgánicas nitrogenadas con carácter básico y mayoritariamente de origen Vegetal. Tienen una estructura generalmente compleja y ejercen acciones fisiológicas diversas incluso a dosis muy bajas. Son tóxicos y capaces de precipitar con ciertos reactivos característicos. Hay, sin embargo, determinadas sustancias que se consideran alcaloides y que no cumplen las características generales de los alcaloides. (Kuklinski. 2000).

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Muchas plantas contienen compuestos con un profundo impacto fisiológico con dosis muy pequeñas. Los agentes activos de estas sustancias vegetales han sido aislados y se han descubierto que son sustancias con numerosas aplicaciones. (Ajarem et. al.1990).

Los alcaloides se caracterizan por tener sabor amargo, generalmente presentan propiedades básicas debidas al Nitrógeno de su estructura. Son compuestos orgánicos, se forman a partir de aminoácidos. En la mayoría de los alcaloides, el Nitrógeno pertenece a un ciclo. Como bases libres; son solubles en disolventes orgánicos (polares y apolares) e insolubles en agua y solubles en mezclas hidroalcoholicas. Y en forma de sal son solubles en agua y mezclas hidroalcoholicas, pero insolubles en disolventes orgánicos apolares. Su solubilidad depende del pH. Los alcaloides oxigenados son sólidos cristalizables, incoloros o blancos y con un punto de fusión característico. Se obtienen mediante extracción con disolventes. Los alcaloides no oxigenados son líquidos volátiles de olor característico se obtienen por destilación con arrastre de vapor. (Kuklinski. 2000).

Hasta la fecha se conocen alrededor de 26900 alcaloides aislados de plantas, hongos, organismos marinos y mamíferos, de los cuáles un total de 21120 son derivados de plantas. Se han encontrado 186 familias compuestas por 7231 especies pertenecientes a 1730 géneros (14.2%) que contienen alcaloides, 35 en las que se han detectado alcaloides pero aún no se han aislado, quedando aún 153 familias (aproximadamente 674 géneros y 5835 especies) por estudiar. (Cordell, G. A.et al. 2001).

Algunas familias poseen una marcada tendencia a elaborar alcaloides: esto ocurre tanto en las Monocotiledóneas (Amarilidácea, Liliácea) como en las Dicotiledóneas (Anonácea, Apocynaceae, Fumariaceae, Laurácea, Loganiácea, Magnoliácea, Menispermácea, Papaverácea, Ranunculácea, Rubiácea, Rutácea, Solanácea, etc.). En estas familias algunos géneros contienen alcaloides, mientras que otros se encuentran desprovistos de

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ellos. En pocos casos existen alcaloides en todos los géneros (Papaverácea). (Jean Bruneton et. al. 2001).

Los alcaloides se localizan en determinadas regiones de los vegetales, en forma de ácidos orgánicos; unos en las hojas (coca, tabaco); otros en las frutas y semillas (nuez vómica), en la corteza de los árboles (quina), en las raíces (altea), etc.

Durante mucho tiempo, los alcaloides han sido considerados como productos del metabolismo únicamente vegetal. Realmente también existen estructuras alcaloídicas en los animales. A veces se trata de productos formados a partir de alcaloides contenidos en los vegetales incluidos en la dieta alimenticia del animal: es el caso de la castoramina, que proviene de la metabolización de los alcaloides de los nenúfares que consume el castor, o bien el de los alcaloides pirrolizidinicos que se encuentran en algunas mariposas. Otras veces los alcaloides aislados parecen ser productos del metabolismo animal: este es el caso especial de los anfibios urodelos (salamandras) o de los anuros (sapos). (Jean Bruneton, 2001).

Los alcaloides poseen masas moleculares que varían entre 100 y 900. Las bases no oxigenadas son líquidas a temperatura ambiente (nicotina, esparteína, coniína), las que contienen oxígeno en su fórmula, sólidos cristalizables, raramente coloreados (berberina), capaces de desviar la luz polarizada, las bases cristalizadas dan puntos de fusión netos, sin descomposición por debajo de 200°C, en su forma libre, los alcaloides (bases) son insolubles o muy poco solubles en agua, solubles en disolventes orgánicos apolares (éter, cloroformo, hexano) o poco polares (acetato de etilo) y solubles en disolventes orgánicos polares (alcoholes de elevada graduación).

La basicidad de los alcaloides les permite formar sales con ácidos minerales (clorhidratos, sulfatos, nitratos) u orgánicos (tartratos,

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sulfamatos, maleatos). Las sales de alcaloides son generalmente solubles en agua y en alcoholes diluidos, salvo raras excepciones, son insolubles en disolventes orgánicos. Las sales cristalizadas se conservan bastante bien y constituyen habitualmente la forma comercial de estas moléculas. (Jean Bruneton. et al.2001).

1.2.2. CLASIFICACIÓN DE LOS ALCALOIDES. Para clasificar un compuesto como alcaloide es preciso tomar sus cualidades químicas y farmacológicas.

La clasificación de los alcaloides, se dio generalmente por la similitud con estructuras moleculares más simples, otras veces son designados según su origen, género o especie de plantas del cual fueron aislados por primera vez.

Dada la amplitud del tema, nos limitaremos a presentar ejemplos de los alcaloides más comunes en cada uno de los grupos siguiente. (GROS, E. 1995).

 Alcaloides Pirrolidínicos

 Alcaloides Piridínicos y Piperidínicos

 Alcaloides Isoquinolínicos y Fenilletilamínicos

 Alcaloides Morfínicos

 Alcaloides Quinolínicos

 Alcaloides Indólicos

 Alcaloides Imidazólicos

 Alcaloides Quinazolínicos

 Alcaloides Quinilizidínicos

 Alcaloides Pirrolizidinicos

 Alcaloides de la Erythrina

 Alcaloides de la Amaryllidacea

 Alcaloides de Lycopodio

 Alcaloides Esteroidales

 Alcaloides Diterpénicos

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1.2.3 ALCALOIDES INDÓLICOS.

Abarcan una gran variedad y diversidad estructural que va desde simples derivados de la triptamina, carbazoles, β-carbolinas, hasta esqueletos más elaborados que involucran la condensación de triptamina común segundo aminoácido, una molécula de isopreno, policétidos o terpeno.

4 5 4 5 4 5 6 3 3 2 6 3

6 1 NH2 7 7 N 9 2 9 7 N N 8 N 1 H 8 H 1 H Triptamina Carbazol -Carbolina

De todos ellos, el grupo más importante y más extensamente estudiado son los alcaloides indólicos monoterpénicos que derivan biogenéticamente de un único precursor construido por condensación del aminoácido triptófano con el monoterpenos ecologanina. (M.V. Kisakürec 1982). Kisakürec y Hesse los clasifica en nueve grupos que derivan de los esqueletos fundamentales I (Corinante), II (Aspidospermas) Y III (Ibogal) (Fig. 1).

Los grupos vincosano, vallesiacotamano, corinanteano, estrichnano y aspidospermatano adoptan el esqueleto I, los grupos plumerano y eburnano el esqueleto II y el ibogano y tacamano el III (Fig. 1).

  Esqueleto III Esqueleto I Esqueleto II Iboga Corinante Aspidosperma

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NH N N N H H

H H O

TIPO VINCOSANO TIPO VALLESIACOTAMANO

FIGURA 1. Estructura de Alcalóides Indólicos

Los alcaloides de los grupos plumerano, aspidospermatano, corinanteano e ibogano, se dividen en subtipos, dependiendo de la variación estructural del fragmento alicíclico o en unos pocos casos de la porción indólico, estos subtipos se nombran de acuerdo al miembro más representativo del mismo. (fig. 2).

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N N H

H

TIPO CORINANTEANO

H CH2OH N N N N H H H H H N N H H H H O H3COOC H3COOC

OCH3 Subtipo Co rinanteina Subtipo Ajmalicina Subtipo Sarpagina

H3COOC OH CH2OH N CH3 N N N H N N H O H CH3 H COOC 3 H H H

Subtipo Pleiocarpamina Subtipo Vobasina Subtipo Sarpagina

AcOH C COOCH 2 3 CH3 CH3 H3COOC N H N N N H H H N H H N O H H O Subtipo A kuammilina Subtipo Akuammilina Subtipo Ervitsinia

FIGURA 2. Subtipo de Alcaloides Plumerano, Aspidospermatano, Corinanteano e Ibogano

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N

N H H

TIPO ESTRICHNANO

N

N H H

TIPO ASPIDOSPERMATANO

N N N

H N H N N H H H H H COOC COOCH H COOC CH OH 3 3 3 2 H3COOC COOCH3 Subtipo Precondiocarpina Subtipo Stemmadenina Subtipo Vallesamina

N

N H

TIPO PLUMERANO

N N O

H N N H H COOCH3 Subtipo Voaphillina Subtipo Tabersonina

FIGURA 2. (Continuación) Subtipo de Alcaloides Plumerano, Aspidospermatano, Corinanteano e Ibogano

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N N

TIPO EBURNANO TIPO TACAMANO

N

N H

TIPO IBOGANO

OH O

N N N N N N H H

COOCH3 COOCH 3 COOCH3 Subtipo Coronaridina Subtipo Coronaridina Subtipo Iboluteina hidroxindolenina

OH N H3COOC N N N H H H N N O H H COOCH3 Subtipo Tabernoxidina Subtipo Cleavamina Subtipo Pseudotabersonina

OH H N N N H H H

H H

N N N O H H H COOCH3 COOCH3 Subtipo Dichomina Subtipo Pandina Subtipo Ibophillidina

FIGURA 2 (Continuación) Subtipo de Alcaloides Plumerano, Aspidospermatano, Corinanteano e Ibogano.

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Hay que decir que esta clasificación no es única (Geoffrey A. Cordell, 1981) y aunque atractiva por su sencillez deja de ser exhaustiva, dejando fuera a un numeroso grupo de estos compuestos, que involucran otros reagrupamientos, y entre los que citaremos los oxoindoles, como la gelsemina y la mitraphillina; los piridocarbazoles, como la ellipticina; los del grupo secodina, en los que el esqueleto secologanina está abierto; y el numeroso grupo de los bisindólicos, los cuales se clasifican según la identidad de las unidades monómeras constituyentes.

O H N

H CH3 N N O H N O H H H3COOC

Gelsemina Mitraphillina OCH3

CH3 N N

N N H H CH 3 H3COOC Ellipticina Secodina

Figura N° 03. Alcaloides Oxindólicos

1.2.4 DISTRIBUCIÓN DE LOS ALCALOIDES INDÓLICOS. Dejando a un lado los alcaloides indólicos simples, los cuales pueden encontrarse en al menos 35 familias de plantas (Philippe. 1985), los de mayor complejidad. los alcaloides monoterpénicos, se encuentran distribuidos casi en su totalidad entre las familias, Apocynaceae, Loganiácea y Rubiáceas, aunque también han sido encontradas en las familias Anonáceae, Euphorbiaceae, Sapotaceae, Alangiaceae e Icacinaceae. (M.V. Kisakürec).

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La mayoría de los botánicos dividen la familia Apocinaceae (la más prolífica) en tres subfamilias: Plumerioideade, Cerberoideade y Echitoídeade. Aunque de todas ellas se han aislado alcaloides, solo en la subfamilia es además dividida en siete tribus de las que en solo cuatro, Carisseae, Tabernaemontana, Alstonieae (Plumerieae) y Rauwolfíeae, los alcaloides indólicos están presentes.

Los alcaloides representativos del esqueleto I (Corinante) son los más ampliamente distribuidos habiéndose encontrado abundantemente en los géneros Alstonia, Amsonia, Aspidospermas, Catarantus, Ochrosia, Pleicoarpa, Rauwolfia, Tabernaemontana y Vinca (Apocinaceae), en el género Estríchnos (Loganiaceae) y los géneros Chinchonas Corinante, Mitragina y Uncaria (Rubíaceae). Los alcaloides representativos del esqueleto II (Aspidospermas) están restringidos a los géneros de Apocinaceae Alstonieae, Kopsia, Pleicoarpa, Stemmadenia, Tabernaemontana y Vinca, y los del esqueleto III (Iboga) se encuentran en los géneros Apocinaceae, Ervatamia, Tabernaemontana, Stemmadenia y Voacanga.

Especial mención por su importancia merece el género Rauwolfia (Apocinaceae) que incluye alrededor de 150 especies distribuidas a lo largo de las zonas tropicales y subtropicales del mundo, encontrando su hábitat típico en selvas y sabanas. Los sistemas anulares básicos encontrados son comunes a la mayoría de las especies y están representados por los compuestos yohimbina, Ajmalicina, Sarpagina y Ajmalina. (Manske, 1965) (Fig. 2). Estos alcaloides son también encontrados en otros géneros, la yohimbina es el constituyente principal de la corteza del árbol africano Corinante yohimbe (Rubíaceae) y también se ha encontrado en los géneros, Amsonia, Vallesia, Aspidosperma y Vinca (Apocinaceae), Gelsenium y Estríennos (Loganiaceae), Corinante, Pausinitalia (Rubíaceae) y Achorrea (Euphorbiaceae). La Ajmalicina se aisló por primera vez de la Rauwolfia serpentina, pero está distribuida en

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otros géneros como Vinca y Corinante. Los esqueletos tipo Sarpagina y Ajmalina, representados por los alcaloides del mismo nombre, están ampliamente distribuidos y han sido obtenidos, entre otros, de los géneros Aspidosperma, Catarantus, Picralima, Rhazia y Estríennos.

1.2.5 BIOGÉNESIS DE LOS ALCALOIDES INDÓLICOS Los alcaloides indólicos derivan biogenéticamente del triptófano. La mayor parte de los alcaloides de este tipo poseen un grupo indol que se presenta casi de forma invariable como triptamina. En los alcaloides indólicos complejos, la unidad de triptófano o triptamina se condensa con un fragmento alicíclico de 9 o 10 átomos de carbono al que Thomas, Wenkert y otros, atribuyen un origen monoterpenoide (Cordell, 1974). (Fig. 4 y 5). El conjunto sufre consecutivas transformaciones hasta adoptar alguno de los tres tipos de estructura que establecen la base para su clasificación (Fig. 4). El descubrimiento de alcaloides indol glucosídicos como la estrictosidina (Fig. 5), supuso un gran avance en la elucidación de las rutas biogenéticas que conducen a estos alcaloides. La estrictosidina se sintetiza fácilmente en el laboratorio a partir de cultivos celulares de diversas especies de Apocinaceae, que catalizan la condensación de secologanina y triptamina para dar estrictosidina. (Fig. 5). La administración de estrictosidina (Veerporte, 1997) marcada isotópicamente a plantas de Catarantusroseus, produjo una conversión eficaz y especifica del mismo en alcaloides representativos de los tres principales grupos estructurales. Por otro lado, la administración de loganina marcada (Fig. 4), monoterpeno natural que se produce junto con los alcaloides indólicos, a plantas de Vinca rosea produjo alcaloides representativos de los tres grupos fundamentales de unidad C-9 ó C-10 marcados en las posiciones previstas. Estos experimentos, sitúan a la secologanina como el último precursor no nitrogenado de los alcaloides indólicos y determinan con exactitud la etapa de 'introducción del nitrógeno en el proceso biosintético.

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COOH 6 2 3 5 4 4 HO HO 5 OH OH OH 4 5 3 2 6 3 6 2 COOH Mevalonato Geraniol

Esqueleto Iboga Esqueleto Corinante Esqueleto Aspidosperma

N N N N H H H H CH3 OH H3COOC H H3CO N COOCH O 3 H COOC 3 CH3 COOCH3 Coronaridina Ajamalicina Vindolina

FIGURA 04. Biogénesis de los Alcaloides Tipo Iboga y Aspidosperma

NH2 N H NH HO N H H H OGlu Triptamina CHO OGlu H H OGlu H O O H COOC H 3 H3COOC O H3COOC Secologanina Estrictosidina Loganina

FIGURA 05. Biogénesis de los Alcaloides indol glucosídicos

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En la Figura 6, se esquematizan las principales rutas biogenéticas conducentes a los tres principales tipos de esqueletos, donde los alcaloides estrictosidina, geisoschicina y stemmadenina ocupan un papel relevante.

NH NH N N N CHO N H H H H H H H OGlu H H H O H3COOC H3COOC CHO H3COOC CHO

Estrictosidina A B

N N N N N N H H H H H H H

H H H

H COOC C H H COOC H COOC 3 3 3 O OH Yohimbina OH

N N H H H

A H O H COOC N N 3 N N Ajmalicina H H H H H B H H OH N H3COOC H3COOC N H H OCH3 Corinanteina H

H3COOC

Geisoschizina OH

FIGURA 6. Biogénesis de alcaloides tipo yohimbina, Ajmalicina y Corinanteina.

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N N

N N H H H COOC CH OH H COOC 3 2 3 CH2OH Stemmadenina

H N N N

N N N H H H COOCH COOCH3 3 COOCH3

N

N N

N N H H N H COOCH COOCH3 COOCH3 3 Tabersonina Coronaridina Catarantina (Tipo Aspidosperma) (Tipo Iboga) (Tipo Iboga)

FIGURA 07. .Biogénesis de los alcaloides tipo Iboga y Aspidosperma

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Aunque a primera vista los piridocarbazoles tales como la ellipticina parecen estar fuera de las rutas biogenéticas generales, puede postularse su biogénesis a partir del alcaloide Stemmadenia (Kansal. 1986) (Fig. 6).

OX N N N

N N N H H H H COOC CH2OH H COOC CH2OH H COOC CH2OH 3 3 3 Stemmadenina

H O

CH2 N CH 3 N CH3 N CH3

H2O -CH2O N N N H H H

CH3 CH3

N N CH3

N N H H CH3 CH3 Ellipticina

FIGURA. 8 Biogénesis de los alcaloides tipo Piridocarbazol.

1.2.6 FARMACOLOGÍA El género Tabernaemontana ha sido mencionado en la literatura etnobotánica por su amplio uso en medicina tradicional. Su uso médico es común a muchas de sus especies, y está basado en sus propiedades antimicrobianas, frente a infecciones, heridas, inflamación de ojos, uñas y garganta; contra la sífilis y el mal de Hansen; antiparasitaria, frente a la disentería, diarrea y lombrices intestinales; y en el tratamiento de ulceraciones en la piel. Algunas especies son usadas como analgésicos en

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dolores de cabeza y muelas mientras que otras actúan sobre el sistema nervioso central. Estas actividades son probablemente debidas a la presencia de alcaloides, los cuales constituyen los principales metabolitos secundarios de las plantas. Se ha descrito una amplia miscelánea de actividades farmacológicas de diversos alcaloides de la Tabernaemontana, muchos de ellos comunes a otros géneros. Un estudio de la actividad farmacológica sobre 40 alcaloides obtenidos del género Tabernaemontana (Palmisano. 1986), indican que sólo la camptothecina, su 9-metoxi derivado, y la Vincamina, poseen actividad relevante, habiendo sido evaluada su viabilidad clínica (Palmisano. 1986; Monroe. 1998). Curiosamente estos alcaloides no son representativos del género, siendo encontrados en gran variedad de plantas. Así, la camptothecina, aislada originariamente del tronco del árbol chino Camptotheca acumminata, llamó la atención por la presencia en su estructura de un anillo indólico expandido, y por qué inhibía el crecimiento de un amplio rango de tumores experimentales (carcinosarcoma Walker 256, linfoma L5178Y, tumor celular de plasma YPC-1, etc...). Posteriores estudios indicaron que la camptothecina actuaba inhibiendo la enzima topoisomerasa I, la cual está implicada en varias funciones del ADN, incluyendo la síntesis de macromoléculas. Además, se encontró que esta enzima tenía una actividad exaltada en etapas avanzadas del cáncer de colon y otros tumores malignos. Actualmente, dos derivados solubles en agua de la camptothecina, son usados clínicamente en combinación con otras drogas antitumorales como cisplatinas, etoposido y taxol en Francia y Japón, mientras que otras están en fases avanzadas de evaluación clínica en Europa.

Se han descrito también propiedades antibióticas en los alcaloides del género Tabernaemontana, encontrándose la máxima actividad en los alcaloides bisindólicos del tipo Iboga frente a las bacterias gram-positivas. (Van Beek, 1984, 1985).

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La ellipticina, cuya síntesis se ha logrado en sólo tres pasos, es un alcaloide ópticamente inactivo aislado originariamente de las ramas de la Ochrosiaacumminata (Apocinaceae).Subsecuentemente la ellipticina y derivados se han aislado de otras especies de los géneros Aspidosperma, Tabernaemontana y Estriednos. En 1967, un grupo de científicos australianos mostró que la ellipticina y la 9-metoxiellipticina eran activas frente a varios tumores. (Sarcoma-180, adenocarcinoma 755 y leucemia L- 1210). Otro de sus derivados, el elliptinium, (N -2-metil -9- hidroxiellipticina), ha sido probado clínicamente contra diversos cánceres (mama, nasofaríngeo, mal de Hodgkin, renal, hepático etc.). Los autores concluyeron que tiene una modesta pero inconfundible actividad y que necesita ser evaluada en combinación con otras drogas. Así, en un estudio en el que su uso se combinó con mitomicina, vinblastina y/o etoposido puso de manifiesto que esta mezcla de agentes es activa y bien tolerada en pacientes con cáncer de mama avanzado. (Gribble. 1990) La forma en la que interactúan in vivo los piridocarbazoles, tales como la ellipticina, es todavía desconocido, aunque la investigación al respecto apunta a que deben estar involucrados en más de un mecanismo de acción. (Kansal. 1986).

CH3 CH3 10 11 1 10 11 1 HO CH3 9 N2 N

8 6 3 8 6 3 N N 7 5 4 7 5 4 H H CH3 CH3 Ellipticina Ellipticina

Figura N° 09. Estructura de la Ellipticina

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1.2.7 PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS Los alcaloides poseen pesos moleculares que varían entre 100 y 900. Aunque la mayoría de las bases no oxigenadas son líquidas a temperatura ambiente (nicotina, esparteína, coniína), las que contienen oxígeno en su fórmula como ocurre en la casi totalidad de las estructura conocidas, son normalmente sólidos cristalizables, raramente coloreados (berberina).

Casi siempre son capaces de desviar la luz polarizada, las bases cristalizadas dan puntos de fusión netos, sin descomposición sobre todo por debajo de 200°C. Por regla general, en su forma libre, los alcaloides bases son insolubles o muy poco solubles en agua, solubles en disolventes orgánicos apolares (éter, cloroformo, hexano) o poco polares (acetato de etilo) y solubles en disolventes orgánicos polares (alcoholes de elevada graduación).

La basicidad de los alcaloides es muy variable y esta propiedad se encuentra estrechamente ligada a la disponibilidad del doblete libre de nitrógeno. Los agrupamientos electro-atrayentes adyacentes al átomo de nitrógeno disminuyen la basicidad, los grupos electro-donadores la exaltan: colchicina y piperina son, debido a la existencia del carbonilo de la amida, prácticamente neutros.

El sistema heterocíclico puede poseer por sí mismo una basicidad variable: así en la piridina –con seis electrones - y también en la quinoleína e isoquinoleína, el doblete de nitrógeno está disponible y su basicidad es manifiesta. En el caso del pirrol o del indol, el doblete del nitrógeno participa en la aromaticidad por lo que no son básicos (incluso tienen cierto carácter ácido), también: la pirrolidina, insaturada, es una base fuerte. La basicidad se encuentra así mismo influida por los impedimentos estéricos (al menos en moléculas policíclicas complejas). Subrayemos finalmente que la basicidad es un factor de inestabilidad en estas moléculas, que al estado de base y en disolución, son sensibles al calor, a la luz y al oxígeno.

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La basicidad de los alcaloides les permite formar sales con ácidos minerales (clorhidratos, sulfatos, nitratos) u orgánicos (tartratos, sulfamatos, maleatos). Las sales de alcaloides son generalmente solubles en agua y en alcoholes diluidos, salvo raras excepciones, son insolubles en disolventes orgánicos. Las sales cristalizadas se conservan bastante bien y constituyen habitualmente la forma comercial de estas moléculas. (Bruneton. 2001).

N N N N N H H H H Pirrol Pirrolidina Piperidina Piridina Indol

O

O N N N O Quinoleina Isoquinoleina Piperina

Figura N° 10. Diferentes Esqueletos Alcaloidales

1.2.8 EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES.

La extracción de alcaloides se fundamenta, por regla general, en el hecho de que se encuentran habitualmente en la planta al estado de sales y en su basicidad, es decir, en la diferente solubilidad de las bases y de las sales en agua por una parte y en disolventes orgánicos.

El material vegetal contiene a menudo cantidades apreciables de grasas (especialmente en las semillas), así como ceras, terpenos, pigmentos y otras sustancias lipófilas que pueden interferir en el proceso extractivo, sobre todo induciendo la formación de emulsiones. Para evitar en todo o en parte estos problemas tecnológicos, se debe proceder a una

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deslipidación previa de la materia molturada. El éter de petróleo o el hexano se utilizan frecuentemente en esta operación: excepcionalmente los alcaloides pueden extraerse con estos disolventes si se emplean en medio neutro.

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 29 Erick Vidal Taricuarima CAPITULO II

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Material Botánico. Se utilizó las hojas y tallos de la Tabernaemontana siphilitica, las cuales fueron recolectadas en el rio Yarapa, Provincia de Maynas, Distrito de Fernando Lores, al extremo Suroeste de la reserva Pacaya-Samiria, comunidad Haldar, departamento de Loreto, Fue identificado por un botánico del Herbarium Amazónico de la UNAP, la exicata se encuentra depositada y codificada con el N° 025580 J. Ruiz.

2.2. Materiales de Laboratorio y otros.

2.2.1. Materiales de vidrio Matraz Baquetas Vaso de precipitado 500ml. Gradilla Vaso de precipitado 50 ml. Tubos de ensayo Embudo Probeta (1000,100, Envase (para macerar). 10 y 5 ml) Balón (1000, 250, 100 ml). Agua destilada Balón buchi Peras de separación Rotavapor y balones boca Capilares esmerilada para rota vapor. Papel filtro Bomba de vacío Papel aluminio Viales (pequeño para colocar Espátulas los extractos). Papel higiénico Pipetas Pasteur Nueces para soporte Soporte universal.

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2.2.2. Adsorbentes

Cromatofolios de Oxido de Aluminio 60- F254. Merck.

Cromatofolios de Oxido de Silicio 60 – F254. Merck. Silicagel y alúmina neutra para cromatografía de columna.

2.2.3. Solventes Orgánicos Hexano (Hx) Ciclo Hexano

Cloroformo (CHCl3) Acetato de etilo (OAcet) Di etilamina Metanol (MeOH) Etanol (EtOH)

2.2.4. Reactivos

Ácido cítrico (C5H8O7) Hidróxido de sodio (NaOH)

Hidróxido de amonio (NH4OH) Yoduro de potasio (KI)

Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4 anhidro)

Agua destilada (H2O)

Reactivo de Dragendorff. Se disuelve 8.0 g. de Bi (NO3)3. 5 H2O en

20 ml de HNO3 y 27,2 g. de KI en 50 ml de agua destilada se mezclan las 2 soluciones y se deja reposar por 24 horas. Se decanta la solución y se enrasa a 100 ml.

2.3. TÉCNICAS INSTRUMENTALES Y EQUIPOS.

2.3.1. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) Los espectros de RMN 1H y 13C, han sido realizados en espectrómetros Bruker, Avance 400 MHz y Bruker, AMX 500 MHz.

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 31 Erick Vidal Taricuarima

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Los productos se disolvieron en CDCls y como referencia interna se

usó CHCl3. Los experimentos de correlación homo y heteronuclear 1H - COSY, NOESY, HSQC y HMBC fueron realizados en el espectrómetro Bruker AMX de 500 MHz, usando los programas suministros por la firma de Bruker. Los valores de los desplazamientos químicos (6) se expresaron en ppm en relación con el disolvente empleado como referencia interna y las constantes de acoplamiento (J) en Hz.

2.3.2. ESPECTROMETRÍA DE MASAS (EM).

Los espectros de masas de baja y alta resolución fueron realizados con un espectrómetro Vg – Micromass modelo Zab 2F. La temperatura de la fuente fue de 220°C y la energía de ionización de 70 eV. Para cada producto se indica los picos más significativos y su intensidad relativa.

2.3.3. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO (IR) Los espectros de IR se realizaron en un espectrofotómetro Perkin - Elmer modelo 1600 / FTIR. El producto puro disuelto en CHCls seco se aplicó en la superficie de una pastilla de NaCl (5mm de espesor), evaporándose el disolvente a continuación. Los valores de frecuencia (v) se expresaron en cm-1

2.4. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS.

2.4.1. CROMATOGRAFÍA DE COLUMNAS (C.C).

Para las cromatografías en columna, se usaron como fase estacionaria Alúmina básica Actividad I art 1076, alúmina 90 Actividad II y III art 1097 y Silicagel 60 art 1.07734. Como fase móvil se utilizó mezclas de disolventes de hexano- hexano, hexano - acetato de etilo y acetato de etilo - metanol en polaridad creciente.

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2.4.2. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF). El seguimiento de las columnas cromatográficas se hizo por cromatografía de capa fina (CCF), utilizando placas comerciales:

Cromatofolios de óxido de aluminio 60 F254 neutro, tipo E (MERCK),

Cromatofolios de óxido de aluminio básico Polygram Alox N/UV254 (NACGEREY-NAGEL), Cromatofolios de gel de sílice F 1500/LS 254 (MERCK) y Cromatofolios de Oxido de Silicio POLIGRAM SIL

G/U V254. MACHEREY - NAGEL. Como eluyente se usaron los mismos solventes que para las columnas cromatográficas. Para la visualización de los alcaloides se empleó el reactivo de Dragendorff.

2.4.3. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA PREPARATIVA (CCFP).

Para la separación de los productos se utilizaron los mismos Cromatofolios que en cromatografía en capa fina 20 x 20cm, dichas placas se usaron a escala preparativa, sembrándose en éste caso entre 10 y 25 mg. de producto por placa. Como fase móvil se usó los mismos disolventes que en cromatografía de columna y en algunos casos se eluyó con ciclohexano y dietilamina.

2.5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

2.5.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. Las hojas y tallos de la Tabernaemontana siphilitica colectada, fue finamente dividida, secada a temperatura de 20°C durante 15 días, molida y pesada, obteniendo un peso de 1.27 Kg, la que se utilizó para preparar el extracto.

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2.5.2. EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES DE LAS HOJAS Y TALLOS DE LA TABERNAEMONTANA SIPHILITICA. A 1.27 kg de hojas y tallos de Tabernaemontana siphilitica seca y molida se adiciono 7 litros de etanol y se dejó en maceración durante 72 horas, se filtró; este proceso se repitió 5 veces hasta agotamiento. El filtrado se concentra a presión reducida en un rotavapor, obteniéndose el extracto Etanólico (161.9 g).

El extracto Etanólico (161.9 g) se disolvió con H2SO4 0.5 N, Se

extrajo con CH2Cl2, obteniéndose 2.72 g de extracto alcaloidal acido.

El extracto acuosa se basificó a pH= 9, con solución de NH4OH,

después de extraer con CH2Cl2 repetidas veces y evaporar se obtuvo 552.1 mg de extracto alcaloidal básico y 376 mg de residuo alcaloidal. El extracto alcaloidal acido se volvió a extraer a pH= 9 y se obtuvo 60.9 mg. Por cromatografía de capa fina se unieron los extractos alcaloidales dando un peso de 989 mg.

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DIAGRAMA N° 01. EXTRACCIÓN DE ALCALOIDES DE LAS HOJAS Y TALLOS DE LA TABERNAEMONTANA SIPHILITICA.

Hojas y Tallos secos de Tabernaemontana siphilitica 1.27 Kg

Etanol (Temp. 20°C) Filtrar

Extracto Etanólico 161.9 g

Disolver en H2SO4 0.5N Agitar 3 horas Filtra y Extraer con CH2Cl2

Solución acuosa Residuo

Agitar 3 horas Basificar a pH 9, con Filtra y Extraer con CH Cl NH4OH 2 2 Agitar 3 horas Filtra y Extraer con CH Cl 2 2 Ext. Alcaloidal Solución acuosa

Acido (2.72 g) Basificar a pH 9, con NH OH 4 Agitar 3 horas Filtra y Extraer con CH Cl 2 2 Ext. Alcaloidal Solución acuosa básico (60.9 mg) se desecha

Ext. Alcaloidal Básico Residuo Solución acuosa (552.1 mg) 376 mg se desecha

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2.5.3. FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL ÁCIDO DE LAS HOJAS Y TALLOS DE LA TABERNAEMONTANA SIPHILITICA.

A 2.72 g del extracto alcaloidal acido 1, se fraccionó en una columna cromatográfica de diámetro interno de 4.5 cm, se utilizó como fase

estacionaria el adsorbente óxido de aluminio actividad II y III (Al2O3), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano acetato de etilo, metanol de polaridad creciente. Se obtuvo 75 fracciones de 250 ml, cada una de estas fracciones se concentraron en rotavapor hasta sequedad. El análisis cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observados a la luz de la lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos permitió agrupar 2 fracciones: A 4-10 (848 mg), B 31-33 (121.6 mg).

2.5.3.1. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LAS FRACCIONES ALCALOIDALES OBTENIDAS DEL EXTRACTO ALCALOIDAL ACIDO DE LAS HOJAS Y TALLOS DE TABERNAEMONTANA SIPHILITICA. La fracción A 4-10 (848 mg), se fraccionó en una columna cromatográfica de diámetro interno de 5 cm, se utilizó como fase

estacionaria el adsorbente óxido de aluminio básica actividad I (Al2O3), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano acetato de etilo de polaridad creciente. Se obtuvo 74 fracciones de 250 ml, cada una de estas fracciones se concentraron en rotavapor hasta sequedad. El análisis cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observada a la luz de la lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos permitió agrupar 3 fracciones: C 13-15 (83.5 mg), D 14-21 (36.5 mg), E 35-42 (121.6 mg), F 59-64 (33.7 mg)

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La fracción C 13-15 (83.5 mg) después de realizar los estudios de: EM, RMN de 1H Y 13C experimentos homo y bidimensionales se identificó como: CORONARIDINA (codificado como C). La fracción D 14-21 (36.5 mg), se sembró en 03 cromatofolios de Óxido de Silicio – 60 a escala preparativa, se eluyó 3 veces en mezcla de Hexano – Acetato de Etilo (90:10), a la luz de la lámpara del U.V. Se observa dos alcaloides siendo uno de ellos mayoritario. Después de separar los alcaloides del adsorbente se obtuvo: PTLC- 1 (17.9 mg), PTLC- 2 (1.2 mg).

La fracción 14-21, PTLC 1 (17.9 mg), después de realizar los estudios de: EM, RMN de 1H Y 13C experimentos homo y bidimensionales se identificó como: CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA (codificado como H).

La fracción E 35-42, (121.6 mg). Se fraccionó en una columna cromatográfica de diámetro interno de 2 cm, se utilizó como fase estacionaria el adsorbente oxido de silicio 60 (0.063-0.200 mm) (SiO2), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano, acetato de etilo de polaridad creciente. Se obtuvo 34 fracciones de 100 ml, cada una de estas fracciones se concentraron en rotavapor hasta sequedad. El análisis cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observada a la luz de la lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos permitió agrupar 1 fracción: P 12-19 (9.2 mg). La fracción P 12-19 (9.2 mg), Después de realizar los estudios de: EM, RMN de 1H Y 13C experimentos homo y bidimensionales se identificó como: 19-S-HEYNEANINA (codificado como S).

La fracción F 59-64 (33.7 mg), Se sembró en 03 cromatofolios de Óxido de Silicio – 60 a escala preparativa, se eluyó 2 veces en mezcla de Hexano – Acetato de Etilo (50:50), a la luz de la lámpara del U.V.

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Se observa un alcaloide mayoritario. Después de separar el alcaloide del adsorbente se obtuvo: PTLC- 1 (19.3 mg).

La fracción 59-64, PTLC- 1 (19.3 mg), Después de realizar los estudios de: EM, RMN de 1H Y 13C experimentos homo y bidimensionales se identificó como: 3-OXOCORONARIDINA. (Codificado como O).

La fracción B 31-33 (121.6 mg). Se fraccionó en una columna cromatografica de diámetro interno de 2 cm, se utilizó como fase estacionaria el adsorbente oxido de aluminio actividad II y III

(Al2O3), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano, acetato de etilo de polaridad creciente. Se obtuvo 35 fracciones de 100 ml, cada una de estas fracciones se concentraron en rotavapor hasta sequedad. El análisis cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observada a la luz de la lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos permitió agrupar 2 fracciones: G 12-19 (9.5mg); H 31-35 (56.1 mg).

2.5.4. FRACCIONAMIENTO CROMATOGRÁFICO DEL EXTRACTO ALCALOIDAL BASICO, Y RESIDUO DE HOJAS Y TALLOS DE TABERNAEMONTANA SIPHILITICA.

A 989 mg del extracto alcaloidal residuo 1, se fraccionó en una columna Flash de diámetro interno de 9 cm, se utilizó como fase estacionaria el adsorbente oxido de silicio 60 (0.063-0.200 mm) (SiO2), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano, acetato de etilo, metanol de polaridad creciente. Se obtuvo 53 fracciones de 1L, cada una de estas fracciones se concentraron en rotavapor hasta sequedad. El análisis cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observados a la luz de la

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lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos permitió agrupar 2 fracciones: G 2- 4 (34.7 mg), H 5-12 (66 mg),

2.5.4.1. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LAS FRACCIONES ALCALOIDALES OBTENIDAS DEL EXTRACTO ALCALOIDAL BÁSICO Y RESIDUO DE LAS HOJAS Y TALLOS DE TABERNAEMONTANA SIPHILITICA.

La fracción G 2 - 4 (34.7 mg), se fraccionó en una columna Cromatográfica de diámetro interno de 1.5 cm, se utilizó como fase estacionaria el adsorbente oxido de aluminio actividad II y III

(Al2O3), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano, acetato de etilo de polaridad creciente. Se obtuvo 45 fracciones de 100 ml, cada una de estas fracciones se concentraron en rotavapor hasta sequedad. El análisis Cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observados a la luz de la lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos permitió agrupar 2 fracciones: I 8-9 (12.2 mg), J 14-19 (0.2 mg). no se trabajó por ser una mezcla compleja y poca cantidad

La fracción I 8-9 (12.2 mg, Después de realizar los estudios de: EM, RMN de 1H Y 13C experimentos homo y bidimensionales se identificó como: 19- S HEYNEANINA. (Codificado como S).

La fracción H 5-12 (66 mg). Se fraccionó en una columna cromatográfica de diámetro interno de 2 cm, se utilizó como fase estacionaria el adsorbente óxido de silicio 60 (0.063-0.200 mm)

(SiO2), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano, acetato de etilo de polaridad creciente. Se obtuvo 112 fracciones de 100 ml, cada una de estas fracciones se concentraron en rotavapor hasta sequedad. El análisis Cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observados a la luz de la lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos

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permitió agrupar 3 fracciones: I 36-38 (1.3 mg), J 63-65 (21.6 mg), La fracción 36-38 no se trabajó por ser una mezcla compleja y poca cantidad. La fracción L 63-65 (21.6 mg), Se purificó en una micro columna, se utilizó como fase estacionaria el adsorbente oxido de Aluminio

actividad II y III (Al2O3), como Fase móvil se utilizó mezclas de solventes como: hexano, acetato de etilo (90:10). Se obtuvo 13 fracciones. El análisis Cromatográfico de las fracciones obtenidas en cromatografía de capa fina y observados a la luz de la lámpara de U.V. y revelado con el reactivo de Dragendorff nos permitió agrupar 2 fracciones: M 5-7 (2.3 mg), N 20-26 (1.7 mg).

2.5.5 DATOS FISICOS Y ESPECTROSCÓPICOS DE LOS ALCALOIDES AISLADOS

De los extractos alcaloidales se aislaron cuatro alcaloides: Coronaridina, 19 S- Heyneanina, Coronaridina Hidroxindolenina,

3-Oxocoronaridina.

La estructura química de estos alcaloides se determinaron mediante datos físicos: punto de fusión, y por sus datos espectroscópicos: U.V, E.M, I.R, RMN, 1H y 13C.

La estructura de los alcaloides se determinaron haciendo uso de las correlaciones Homo y Hetero nucleares: HSQC y HMBC; y las correlaciones escalares y espaciales COSY y NOESY.

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2.5.5.1. CORONARIDINA. N

25 N αD Sólido amorfo, - 31.5º(c, H

0.314g/100mL, CHCl3). COOCH3

-1 IR (CHCl3) max. cm : 3366, 2930, 1676, 1238, 751.

EM de baja resolución, m/z (int. relativa. %): 338 M+ (100), 323 (40), 309 (8), 279 (11), 253 (14), 214 (36), 215 (11), 208 (19), 207 (11), 195 (11), 194 (9),180 (12), 168 (17), 167 (19), 154 (35), 148 (12), 136 (94), 135 (26), 130 (19), 124 (44), 122 (32), 108 (10).

EM de alta resolución, m/z: [M]+ 338.2004 calculado para un

C21H26N2O2, 338.2053.

1 RMN de H (500 MHz, CD Cl3): δH8.04 ( 1H,sa, N-H), 2.97 (1H,m, H-3R), 2.85( 1H,m, H-3S), 3.44 (1H, m, H-5R), 3.24 (1H, m, H-5S), 3.20 (1H, m, H-6R), 3.03 (1H,m, H-6S), 7.51 (1H,d, J= 7.6 Hz,H- 9),7.12 (1H,ddd, J=1.2, 7.7, 8.9 Hz, H-10), 7.18 (1H, DDD, J=1.2, 7.1,8.1 Hz, H-11),7.27(1H, da, J=7.8Hz, H-12), 1.96 (1H,m, H-14), 1.63 (1H,m, H-15R), 1.20 (1H,m, H-15S), 1.78 (1H, m, H-17R), 2.64 (1H, da, H-17S), 0.95 (1H,t, J=7.4, H-18), 1.49 (2H,m, H-19), 1.38

(1H,m, H-20), 3.62 (1H,sa, H=21), 3.75 (3H,S, COOCH3).

13 RMN C (400 MHz, CDCl3) :δC 136.0 (s, C-2), 52.1 (t, C-3), 53.4 (t, C-5), 21.0 (t, C-6), 110.7 (s, -7), 127.2 (s, C-8), 119.0 (d, C-9), 119.6 (d, C-10), 122.7 (d, C-11), 110.8 (d, C-12), 136.0 (s, C-13), 27.4 (d, C-14), 32.1 (t, C-15), 54.9 (s, C-16), 36.5 (t, C-17), 11.9 (q, C-18),

26.8 (d, C-19), 39.2 (d, C-20), 57.5 (d, C-21), 52.6(q, COOCH3),

176.2 (s, COOCH3).

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2.5.5.2. 19 S- HEYNEANINA

Alcaloide aislado como sólido amorfo N OH 25 (36.5mg):αD -25º(c,0.18 g/100mL, N H CHCl3). COOCH3

-1 IR (CHCl3) máx. cm : 3259, 1728,1658, 1462,1372, 1240, 1163,1068, 750.

EM de baja resolución, m/z (int. relativa. %): 354(100), 353 (20), 340(15), 339 (63), 337 (31), 336 (51), 310(16), 309(18), 277 (6), 249(6), 228(8), 224(10), 214(38),206(10),195(13), 180(13), 99(4),97(11), 96(20),94 (17) ,85(48), 83 (68), 81(11), 71(14), 69(20), 67(15),57(22), 55(23).

EM de alta resolución, m/z: [M]+ 354.1945 calculado para un

C21H26N2O3, 3541943.

1 RMN de H (500 MHz, CD Cl3) :δH7.82 (1H, sa, N-H), 3.03 (1H, m, H-3R), 2.83(1H, d, J=9.2 Hz, H-3S), 3.50 (1H, m, H-5R), 3.17 (1H, m, H-5S), 3,19 (2H, m, H-6R), 7.71 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-9), 7,11 (1H, ddd, J =1.0, 7.9, 8.8 Hz, H-10), 7.15 (1H, ddd, J= 1.2, 7.2, 8.1, Hz, H-11), 7.27 (1H, d, J=8.0, Hz, H-12), 2.05 (1H, sa H-14), 1,92 (1H, m, H-15R), 1.56 (1H, m, H-15S), 2.01 (1H, da, J=13.3 H- 17R), 2.61 (1H, dt, J=2,0, 9,5, H-17S), 1.10 (1H, d, J = 6.4 Hz, H- 18), 4.18 (1H, q, J = 5.6 Hz, H-19), 1.49 (1H, m, H-20), 3.90 (1H,

sa, H-21), 3.74 (3H, s, COOCH3).

13 RMN C (400 MHz, CD Cl3) :δC135.6 (s, C-2), 51.3 (t, C-3), 52.4 (t, C-5), 21.4 (t, C-6), 109.9 (s, -7), 128.5 (s, C-8), 118.5 (d, C-9), 119.6 (d, C-10), 122.4 (d, C-11), 110.5 (d, C-12), 135.5 (s, C-13), 26.8 (d, C-14), 22.9 (t, C-15), 54.0 (s, C-16), 37.0 (t, C-17), 20.5 (q, C-18), 71.3 (d, C-19), 39.6 (d, C-20), 59.8 (d, C-21), 53.0 (q,

COOCH3), 174.8 (s, COOCH3).

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2.5.5.3. CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA

Alcaloide aislado como sólido amorfo HO 25 (17.9mg),αD -8º(c, 1.04 g/100mL, N CHCl3). N

IR (CHCl )  cm-1: 3473, 1732, 3 máx. COOCH3 1660, 1461, 1236, 1144, 1087, 982,754.

EM de baja resolución, m/z (int. Rel. %): 354(100), 334 (17), 338 (17), 337(52), 325 (6), 295 (10),230 (7), 223 (4), 208 (4), 188(16), 160 (13), 136 (9), 122 (14), 108 (10), 96(8).

EM de alta resolución, m/z: [M]+ 354.1938 calculado para un

C21H26N2O3, 3541943.

1 RMN de H (500 MHz, CD Cl3):δH 2.71 (2H,sa, H-3), 3.45 (1H, m, H-5S¨), 2.91(1H, d, J=12.5Hz-H-5R), 1.93 (1H, da, J=14.4 Hz, H- 6R),1.77 (1H, m, H-6S), 7.47 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-9), 7,36 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-10), 7.32 (1H, d,7.3 Hz, H-11), 7.24 (1H, d,7.6Hz, H- 12), 1.89 (1H, sa, H-14), 1.80 (1H, m, H-15R), 1.12 (1H, m, H-15S), 2.69 (1H, m, H-17S), 2.44 (1H, da,J=12.7 Hz17R), 0.83 (3H, t, J = 7.2 Hz, H-18), 1.42 (2H, m, H-19), 1.37 (1H, m, H-20), 3.76 (1H, sa

H-21), 3.70 (3H, s,COOCH3).

13 RMN C (400 MHz, CDCl3) :δC189.3 (s, C-2), 48.8 (t, C-3), 49.1 (t, C-5), 33.9 (t, C-6), 88.4 (s, -7), 142.7 (s, C-8), 120.9 (d, C-9), 121.5(d, C-10), 129.2 (d, C-11), 126.8 (d, C-12), 151.4 (s, C-13), 27.1 (d, C-14), 32.1 (t, C-15), 58.8 (s, C-16), 34.8 (t, C-17), 11.5 (q, C-18), 26.6 (d, C-19), 37.6 (d, C-20), 58.5 (d, C-21), 53.2 (q,

COOCH3), 173.8 (s, COOCH3).

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2.5.5.4. 3-OXOCORONARIDINA.

Alcaloide aislado como sólido amorfo O N 25 N (9.0 mg), αD -12º(c, 0.38 g/100mL, H

CHCl3). COOCH3

EM de baja resolución, m/z (int. rel. %): 352 M+ (100), 351 ( 23), 350(41), 293 (8), 254 (9), 229 (23), 228 (26), 216(16), 214 (20), 197 (42), 195 (20), 180 (12), 168 (23), 150(10),143 (14), 138 (17), 124 (79), 84 (10).

EM de alta resolución, m/z: [M]+ 352.1780 calculado para un

C21H24N2O3, 3541943.

1 RMN de H (500 MHz, CD Cl3):δH 7.96 (1H,sa, N-H),4.50 (1H,m, H-5R), 3.22 (1H, m, H-5S¨), 3.22 (2H, m H-6), 7.48 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-9), 7,11 (1H, t, J = 7.9 Hz, H-10), 7.15 (1H, t,7.9 Hz, H-11), 7.24 (1H, d, 8.0 Hz, H-12), 2.63 (1H, m, H-14), 1.41 (1H, m, H- 15R), 1.99 (1H, m, H-15S), 2.63 (1H, d, J=1.6, 15.0H-17S), 2.33 (1H, dt,J=2.6, 13.0, Hz, H-17R), 0.99 (3H, t, J = 7.4 Hz, H-18), 1.53(1H, m, H-19 A), 1.43 (1H, m, H-19B), 1.75 ( 1H,m, H-20),

4.55 (1H, s H-21), 3.65 (3H, s,COOCH3).

13 RMN C (400 MHz, CDCl3) :δC136.1(s, C-2) 173.4 (s, C-3), 42.7 (t, C5), 21.1 (t, C-6), 109.9 (s, -7), 128.3 (s, C-8), 118.4 (d, C-9), 119.6(d, C-10), 122.4 (d, C-11), 110.6 (d, C-12), 134.2 (s, C-13), 38.2 (d, C-14), 31.0 (t, C-15), 55.9 (s, C-16), 35.9 (t, C-17), 11.4 (q, C-18), 27.6 (d, C-19), 35.5 (d, C-20), 56.1 (d, C-21), 53.0 (q,

COOCH3), 176.1 (s, COOCH3).

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DIAGRAMA N° 02. : FRACCIONAMIENTO, AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LAS HOJAS Y TALLOS DE LA TABERNAEMONTANA SIPHILITICA DEL EXTRACTO ALCALOIDAL ACIDO

EXTRACTO ALCALOIDAL ÁCIDO 2.72gr

C.C. Al2O2 Actividad II y III Hx/OAcet/MeoH

4-10 31-33 848 mg 121.6 mg C.C. C.C. Sílica gel Sílica gel Hx/OAcet/MeoH Hx/OAcet/MeoH

13-15 14-21 35-42 83.5 mg 59-64 31-35 31-35 C 36.5 mg 121.6 mg 33.7mg 56.1 56.1 mg C. C. P. C.C. C. C. P. Sílica gel silica gel Sílica gel Hx/OAcet Hx/OAcet Hx/OAcet /MeoH

PTLC-1 12-19 PTLC-1 17.9 mg PTLC-2 9.5 mg 19.3 mg H 1.2 mg S O

LEYENDA O: 3-OXO-CORONARIDINA C: CORONARIDINA H: CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA S: 19 S- HEYNEANINA

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DIAGRAMA N° 03: FRACCIONAMIENTO, AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LAS HOJAS Y TALLOS DE LA TABERNAEMONTANA SIPHILITICA DEL EXT. ALCALOIDAL. BÁSICO Y RESIDUO.

EXTRACTO ALCALOIDAL BÁSICO Y RESIDUO 989 mg

C.C. Sílicagel 60(0.063-0.200mm) Hx/oAcet/MeoH

2-4 5-12 34.7 mg 66 mg

C.C. C.C. Al2O2 Actividad II y III Sílicagel 60(0.063-0.200mm) Hx/OAC Hx/oAcet

8-9 14-19 36 -38 63-65 12.2 mg 0.2 mg 1.3 mg 21. 6 mg S C.C. Al2O2 Actividad II y III Hx/OAC

5-7 20-26 2.3 mg 1.7 mg

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CAPITULO III

3.0. DISCUSIONES Y RESULTADOS

3.1. RESULTADOS Del extracto alcaloidal básico (1.27g), se aislaron los alcaloides: Coronaridina, 19 S- Heyneanina, Coronaridina Hidroxindolenina, 3-Oxocoronaridina. La estructura química de los alcaloides se determinaron mediante la comparación, de los datos espectroscópicos como: 1H, EM, IR, RMN, RMN13C, Y por comparaciones con los datos publicados en la biografía y haciendo uso de las correlaciones homo nucleares (protón-protón) COSY Y NOESY y Heteronucleares: (Carbono-protón o protón-carbono).

3.2. DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS ALCALOIDES AISLADOS

3.2.1. ALCALOIDE CORONARIDINA Base aislada como sólido amorfo. En el espectro de IR se observan absorciones a -1 3366 cm que corresponden a un N-H ; 2930 (C-H); 1676 y 1238 (COOCH3); 751 (C-H, anillo aromático). El espectro de masas dio unión molecular a m/z 338 (100%), y fragmentos a: m/z

323 que representa la pérdida de un grupo CH3, 279, perdida del grupo éster

(COOCH3), y otros fragmentos a m/z: 253 (14%), 214 (36%), 195 (11%), 154 (35%) 136 (95%) 124 (44%) y 122(32%) típicos de un alcaloide tipo iboga. (Teris A. 1984, T.R. Govindachari. 1965)

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c

N M+ -1H m/e 337 (28%) b a + N M -CH3 m/e 323 (40%) + H M -C2H5 m/e 309 (8%) M+ -CO CH m/e 279 (11%) COOCH 2 3 3 m/e 338 (100%)

c a b

CH2 CH2

N N + +N CH2 + + N

H COOCH3

m/e 253 (14%) m/e 136 (95%) m/e 124 (44%)

CH2 CH2 CH 2 N + + + + COOCH N 3 N H H CH2 m/e 130 (19%) m/e 214 (36%) m/e 122 (33%)

+ N H m/e 154 (35%)

Figura 11. Fraccionamiento de masas de Coronaridina.

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En el espectro de 1H y 13C se observan las señales a: 0.95 (1H, t, J=7.4 Hz) 11.9 q,

3.75 (3H, s) ,52.6q y 176.2 s, que corresponde a ún grupo etilo y un grupo

metoxicarbonilo ubicado en el C-16. La señala : 8.04 ppm (1H,sa) se asignó a un

N-H aromático. Las señales de los protones δ: 7.51 (1H,d, J= 7.6 Hz,H-9),7.12

(1H,ddd, J=1.2, 7.7, 8.9 Hz, H-10), 7.18 (1H, ddd, J=1.2, 7.1,8.1 Hz, H-11),7.27(1H,

da, J=7.8Hz, H-12) y 13c a δ:119.0 d,119.6 d, 122.7 d, 110.8 d, indica la presencia

en la molécula de un anillo aromático sin sustituir

La identidad de nuestro compuesto quedó establecida principalmente por

comparación de sus datos de 13C-RMN con los publicados para Coronaridina

(Perera. 1983, Hans Achenbach. 1994, Perveen. 1988).

118.3 22.2 6 53.1 9 110.3 5 119.0 8 10 128.8 7 51.5 N 121.8 135.6 136.5 3 12 57.2 11 13 N 2 16 26.6 110.3 55.1 21 20 19 11.6 H 17 27.2 38.9 14 15 18 36.7 32.0 COOCH3 175.9 52.4

CORONARIDINA "Publicado"

Figura N° 12. Alcaloide Coronaridina Publicado

119.0 21.0 6 53.4 9 8 110.7 5 119.6 10 127.2 7 52.1 N 136.0 136.0 3 122.7 12 11 13 2 16 57.5 26.8 110.8 N 54.9 21 20 19 11.9 H 17 27.4 39.2 14 15 18 36.5 32.1 COOCH3 176.2 52.6 CORONARIDINA "Aislado en el LIPNAA" Figura N° 13. Alcaloide Coronaridina Aislado en el LIPNAA-UNAP

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3.2.2. ALCOLOIDE 19 S - HEYNEANINA

Alcaloide aislado como resina, en el espectro de IR se observan absorciones a 3252 y 1728 cm-1 que corresponden a un N-H y a un éster

respectivamente, su fórmula molecular C21H26N2O3, se confirmó por espectrometría de masa de baja y alta resolución. El espectro de masas registró el ión molecular am/z 354 (100%), así como + + también fragmentos a m/z 353 (20%)[M -1H],339 (63%) [M -CH3], 337 + + + (31%) [M - OH], 309 (18 %) [M - C2H5OH], 295 (7%) [M - CO2CH3] y otros fragmentos característicos de un alcaloide del tipo iboga. Los espectros de RMN dieron señales a δ 3.75 (3H, s) y 53.0 q y 174.8 s para un grupo metoxicarbonilo, el grupo metilo a 1.10 (3H, d, J = 6.4 Hz) y 20.5q, en el experimento COSY mostró acoplamiento escalar con otra señal a d 4.16 (1H,q) y 71.3d, asignable a un alcohol secundario que indica la funcionalización del grupo etilo esta señal se asignó al H-19. La señal a δ: 1.49 (1H, m), 39.9d, se asignó al H-20 por su conectividad espacial con los protones H-18, H-17S en el experimento NOESY, el protón H-21 por su desplazamientos químicos a δ3.90 (1H, sa), 59.8d, y su correlación espacial con los protones H-5S, H-6S, H-19, en el experimento NOESY. Las demás señales se asignaron por las correlaciones existentes de 1H, 13C, los experimentos HSQC, COSY y NOESY y por comparación con los datos espectroscópicos publicados en la bibliografía química. (Christiane Kan. 1996; Kamesh. 1980).

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119.4 22.1 6 53.1 9 110.9 5 120.4 8 10 129.7 7 52.2 N 136.6 136.9 3 OH 123.3 12 13 2 60.5 11 N 16 72.1 111.5 21 20 19 20.9 H 17 27.5 40.6 14 15 18 37.7 23.7 COOCH3 176.2 53.4

19s-HEYNEANINA "Publicado"

Figura N° 14. Alcaloide Heyneanina Publicado

118.5 21.4 6 52.4 9 8 110.9 5 119.6 10 128.5 7 51.3 N 135.5 135.6 3 OH 122.4 12 13 2 59.8 11 N 16 71.3 110.5 54.0 21 20 19 20.5 H 17 26.8 39.6 14 15 18 37.0 22.9 COOCH3 174.8 53.0

19s-HEYNEANINA "Aislado en el LIPNAA"

Figura N° 15. Alcaloide Heyneanina Aislado en el LIPNAA-UNAP

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Tabla 2.Datos de RMN de 1H, 13C, HMQC, COSY, NOESY DE 19S- HEYNEANINA

 (JH-H en Hz) (1) HSQC  COSY NOESY 7.82 sa (N-H) H-12, H-17R 136.5 s (C-2) H-3R 2.83m 51.3 t H-3S, H-15R H-14, H-15S H-3S 3.03 m 51.3 t H-14 H-17R, H-6R H-5S 3.17 m 52.4 t H-5R, H.6S H-21 H-5R 3.50 (m) 52.4 t H-5S, H-6R H-6R 3.19 (m) 21.4 t H-5R, H-6S H-6S 3.77 m 21.4 t H-5S, H-6R H-9 109.9 s (C-7) 124.5 s (C -8) H- 9 7.71 d (8.1) 118.5 d H-6 H-10 7.11ddd (1.0, 7.9, 8.8) 119.6 d H-11 7.15ddd (1.2, 7.2, 9.1 ) 122.4 d H-12 7.27 d (8.0) 110.5 d 135.5 s (C-13) H-14 2.05 (sa) 26.8 d H-3R, H-3S, H-15R H-15R, H-3R, H-3S, H-17S H-15S 1.92 m 22.9 t H-15R, H-20 H-18, H-3R H-15R 1.56 m 22.9 t H-3R, H-14, H-15S H-18, H-17S, 54.0 s (C-16) H-17S 2.61dt (2.0, 9.5) 37.0 t H-17R H-15S, H-20 H-17R 2.01 da (13.3) 37.0 t H-17S H-3S, N-H H-18 1.10d (6.4) 20.5 q H-19 H-20, H-15R, H-15S H-19 4.18 q (5.6) 71.3 t H-18, H-20 H-18, H-19, H-21 H-20 1.49(m) 39.6 d H-19 H-18, H-17S,H-19 H-21 3.90 (ss) 59.8 d H-5S, H-6S, H.19,H-20 COOCH3 3.74 (s) 53.0 q COOCH3 174.8 s

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Figura Nº 16: NOESY del Alcaloide 19S-Heyneanina

3.2.3 ALCOLOIDE CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA.

Alcaloide aislado como sólido amorfo, en el espectro de IR se observan bandas características a 2956- 2859 cm-1 (vibraciones C-H ), 1731 cm-1 de un grupo éster, 1660-1461 cm -1 (C=C extensión del anillo aromático), 754 cm-1 flexión del anillo del benceno. En el espectro de IR también se observa la banda a 3437 cm-1 y el fragmento a m/e 337 (M+-17) que confirma la presencia de un grupo hidroxilo en la molécula.

El espectro de masa mostró el ión molecular a m/z 354 (100%) M+, y el pico característico a m/z 337 (65%) [M+ -OH], típico de una Hidroxindolenina, 295 (10%) [M+- CO2Me], y otros fragmentos a m/z: 230 (7%), 188(16%), 173 (2%), 162 (4%) y 122 (14%). (T. R. Govindachari. 1965) (figura 2). La ausencia de la señal para el N-H aromático y las señales para carbono a  88.4 s y189.3 s, y la absorción a 3437 cm-1en el espectro de IR, confirmaron la estructura 7- hidroxindolenina para el compuesto.

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HO a M+ -1H m/e 353 (5%) + M -CH3 m/e 339 (17%) N + M -OH m/e 337 (65%) N M+ -C H m/e 325 (6%) b 2 5 + M -CO2CH3 m/e 295 (10%) COOCH3 m/e 354 (100%)

a b

CH OH OH 2 N + N + N N CH2 H COOCH3 m/e 188 (16%) m/e 232 (7%) m/e 122 (14%)

+

OH H3COOC + OH N N H H m/e 162 (4%) + N m/e 188 (16%) H m/e 17 3 (2%)

OH

N N H H m/e 160 (13%)

Figura 17: Fraccionamiento de masa de Coronaridina Hidroxindolenina

En el espectro de 1H, se observan señales comprendidas entre 7.24 -7.47 ppm que corresponden a un grupo de señales en la zona aromática y que confirman que el anillo indólico de la molécula no está sustituido. La presencia de la señal a δ: 3.70 (3H,s), 53.2 q y 173.8 s, indican la presencia de un grupo éster. Los protones metilénicos, H-3, H-5, H-6, H-15, H-17, H-19, se asignaron teniendo en cuenta los desplazamientos químicos, constantes de acoplamiento, las conectividades a un enlace en el experimento HSQC, y por comparación con los datos publicados en la bibliografía química (Hans. 1994; Christiane Kan. 1981).

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HO 120.6 33.6 6 48.9 9 8 88.1 5 121.3 10 142.4 7 48.5 N 129.1 151.0 189.1 3 12 58.2 11 13 N 2 16 26.3 126.6 58.5 21 20 19 11.4 17 26.8 37.4 14 15 18 34.7 31.8 COOCH3 173.5 53.1

CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA "Publicado"

Figura N°18. Alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina Publicado

HO 120.9 33.9 6 49.1 9 8 88.4 5 121.5 10 142.7 7 48.8 N 151.4 189.3 3 129.2 12 11 13 2 16 58.5 26.6 126.8 N 58.8 21 20 19 11.5 17 27.1 37.6 14 15 18 34.8 32.1 COOCH3 173.8 53.2 CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA "Aislado en el LIPNAA"

Figura N° 19. Alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina Aislado en el LIPNAA-UNAP

3.2.4. ALCALOIDE 3-OXOCORONARIDINA

Alcaloide aislado como sólido amorfo. El espectro de masas de baja resolución muestra un ion molecular a m/z 352 (100%), Calculado para un + + C21 H24 N2 O3, 352.1787, así como fragmentos a m/z: 351 [M - H] 293 [M -

CO2 CH3], 229 (23), 228 (26), 227 (9), 216 (16), 214 (20), 197(42),195 (20), 180 (30), 168(23), 151 (31), 143 (14), 124 (79).

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En el espectro de RMN 13C se observan 21 señales correspondientes a 21 carbonos de los cuales siete son metilenos, cinco metinos, dos metilos y siete carbonos cuaternarios. En el espectro de 1H, se observan señales muy parecidas al espectro de Coronaridina, a excepción del protón H-3 que se encuentra sustituido por un oxígeno, en el espectro de masas se observa 14 unidades más con respecto al ión molecular de la Coronaridina, la señal a δ: 4.50 (1H,m) fue asignado al H-5, adyacente a un nitrógeno, las señal a δ: 7.96 (1H, sa) se asignó a un N- H aromático, la señal singlete a δ 3.65 (3H) y la señal triplete a δ:0.99 (3H) fueron a signadas al metoxicarbonilo . (Hans. 1994; Kamesh. 1980) En él experimento NOESY se observa conectividades espaciales entre el protón a δ: 2.63dd (1,6, 15.0) con las señales a δ: 1.99 (m) y 1.75 (m), por lo que esta señal se asignó al H-17 S y al protón a δ: 2.33 dt (2.6, 13.0) como 17 R. Del mismo modo la estereoquímica del protón a δ:1.99 (m) por su conectividad en el experimento NOESY , con los protones a δ: 2.63dd (1,6, 15.0), 0.99 t (7.4), 1.75 (m) lo cual implica una configuración S para el H- 15 y una configuración 15 R para el protón a δ: 1.41 (m). (Tabla 03). La señal δ: 4.55 (s) quedó establecida como H-21, por su conectividad con el experimento HSQC con el carbono a 58.5 ppm y su conectividad en el experimento NOESY con los protones H-5S, y H-19A. Las demás señales fueron asignadas teniendo en cuenta las correlaciones escalares y espaciales de los 1H y 13C y por comparación con los datos publicados en la bibliografía. (Sarath. 1980).

La comparación de las actividades ópticas en este tipo de compuestos se hace necesaria, toda vez que se han encontrado en la naturaleza compuestos con la configuración enantiomérica tales como la catharantina (K. Bláha. 1972). Los valores del de los cuatro compuestos aislados son similares a los publicados en la bibliografía.

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118.1 20.9 6 42.6 9 8 109.1 5 119.3 7 10 127.6 O N 133.8 2 172.8 122.1 12 3 11 13 136.5 16 55.9 27.5 110.4 N 55.4 21 20 19 11.2 H 17 35.3 38.0 14 15 18 35.6 30.8 COOCH3 175.6 52.9 3-OXOCORONARIDINA "Publicado"

Figura N° 20 Alcaloide 3- Oxo Coronaridina Publicado

118.4 21.4 6 42.7 9 8 109.9 5 119.6 7 10 122.8 O N 122.4 134.2 2 173.4 3 12 56.1 11 13 N 136.1 16 27.6 110.6 55.9 21 20 19 11.4 H 17 38.2 35.5 14 15 18 35.9 31.0 COOCH3 176.1 53.0 3-OXOCORONARIDINA "Aislado en el LIPNAA"

Figura N° 21 Alcaloide 3- Oxo Coronaridina Aislado en el LIPNAA-UNAP

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Tabla 3. Datos de RMN de1H, 13C, HMQC, COSY, NOESY DE 3- OXO- CORONARIDINA

 (JH-H en Hz) (1) HSQC  COSY NOESY N-H 7.96 (sa) H-17R, H-12 136.5 (C-2) 173.4 s(C-3) H-5R 4.50 (m) 42.7 t H-5S, H-6R H-5S 3.22 (m) 42.7 t H-5R, H- 6S H-21 H-6R 3.22 (m) 21.1 t H-5R, H-6S

H-6S 3.22 (m) 21.1t H-5S, H-6R H-9 109.9 s (C-7) 128.3 s (C -8) H- 9 7.48 d (7.4) 118.4 d H-6S H-10 7.11 t (7.9) 119.6 d H-11 7.15 t (7.9) 122.4 d H-12 7,24 d (8.0) 110.6 d 134.2 s (C-13) H-14 2.63 (m) 38.2 d H-15R, H-15S H-15R, H-15S H-15S 1.99 (m) 31.0 t H-14, H-15R, H-20 H-18, H-17S, H-20 H-15R 1.41 (m) 31.0 t H-15S, H-14 H-18, H-19B 55.9 s (C-16) H-17 S 2.63dd (1,6, 15.0) 35.9 t H-17R H-20, H-15S H-17R 2.33 dt (2.6, 13.0) 35.9 t H-17S H-14 H-18 0.99 t (7.4) 11.4 q H-19A, H-19B H-15S, H-19A, H- 19B, H-20 H-19A 1.53 (m) 27.6 t H-18 H-21 H-19B 1.43 (m) 27.6 t H-18 H-15R, H-20 1.75 (m) 35.5 d H-15S H-15S- H-17S, H- 18 H-21 4.55 (s) 56.1 d H-5S, H-6S, H.19A COOCH3 3.65 (s) 53.0 q COOCH3 176.1 s

Figura Nº 22: NOESY del Alcaloide 3-Oxo-coronaridina

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3.3. CONCLUSIONES.

1. De Tabernaemontana siphilitica hojas y tallos se han aislado 06 alcaloides, se determinó la estructura química de cuatro alcaloides.

2. No se determinó la estructura química de dos alcaloides, porque estos compuestos se descomponen con mucha facilidad al estar en contacto con solventes clorados. (CHCl3, CH2Cl2, CDCl3, CD2Cl2).

3. Se determinó la estructura química de 04 alcaloides tipo ibogano, dos sub- tipo Coronaridina identificados como: Coronaridina y 19S Heyneanina y dos sub- tipo Coronaridina Hidroxindolenina: Coronaridina Hidroxindolenina y 3- Oxocoronaridina.

4. El extracto Etanólico de hojas y tallos de Tabernaemontana siphilitica presento una moderada actividad frente a Plasmodium falciparum con un % de inhibición del parasito del 68%

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3.4. RECOMENDACIONES

1. Realizar, la evaluación de la actividad Antimalárica de los alcaloides aislados, ya que el extracto bruto presentó moderada actividad antimalárica.

2. Comparar los tipos de metabolitos secundarios que pueden presentar la, corteza y raíz de la especie en estudio y otras especies de Tabernaemontana.

3. Investigar alcaloides y/o otros metabolitos en otras especies amazónicas, reportadas como antimalárica, aislándolos, elucidando su estructura química y verificando su actividad biológica.

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Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 75 Erick Vidal Taricuarima

ANEXOS

9 6 5 8 7 10 3 N 11 13 2 16 19 12 N 21 20 H 14 18 17 15 COOCH 3

Figura Nº 23. Espectro de Masa del alcaloide CORONARIDINA.

Figura N° 24. Espectro de IR del alcaloide CORONARIDINA.

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 77 Erick Vidal Taricuarima

8.0664 7.5493 7.5301 7.3150 7.2951 7.2044 7.2018 7.1852 7.1819 7.1634 7.1607 7.1435 7.1263 3.7869 3.7710 3.7630 3.7511 3.6472 3.2883 3.2724 3.2632 3.2539 3.2426 3.2274 3.2234 3.1023 2.8779 2.8567 2.6753 2.6706 2.6461 2.6428 2.6375 2.1066 1.9854 1.9801 1.9516 1.9463 1.9377 1.8066 1.8020 1.5213 1.4286 1.4101 1.3379 1.3267 1.3200 0.9916 0.9731

6 9 5 8 7 10 3 N 11 13 2 16 1 9 12 N 21 20 H 18 17 14 15 COOCH3

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shift (ppm)

Figura Nº 25. Espectro de RMN de1H del alcaloide CORONARIDINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 78 Erick Vidal Taricuarima

6 9 5 8 7 10 N 3 OH 11 13 2 16 N 21 12 19 H 20 14 18 17 15 COOCH3

Figura Nº 26. Espectro de Masa del alcaloides 19S-HEYNEANINA

Figura Nº27. Espectro de IR del alcaloide 19S-HEYNEANINA

7.8317 7.4931 7.4768 7.2788 7.2700 7.2624 7.1830 7.1691 7.1666 7.1301 7.1162 7.1143 4.1844 3.9026 3.7500 3.7463 3.5055 3.1897 3.1852 3.1802 3.1651 3.1544 3.1443 2.8430 2.8247 2.6362 2.6324 2.6280 2.6091 2.6053 2.6015 2.0550 1.9459 1.9283 1.6383 1.5816 1.5602 1.5104 1.4959 1.2677 1.1328 1.1195 0.8995 0.8863 Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 79 Erick Vidal Taricuarima

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shift (ppm)

6 9 5 8 7 10 N 3 OH 11 13 2 16 N 21 12 19 H 20 14 18 17 15 COOCH3

Figura Nº 28. Espectro de RMN de H+ de alcaloide 19S-HEYNEANINA

174.8009 135.5440 128.4493 122.3826 119.5514 118.4645 110.4934 109.8194 77.2612 77.0000 76.7472 71.2282 59.7519 53.0027 52.3370 51.2922 39.5632 36.9595 26.7219 22.9049 20.3687

176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 Chemical Shift (ppm)

Figura Nº 29. Espectro de RMN de13C del alcaloides 19S-HEYNEANINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 80 Erick Vidal Taricuarima

1.0

1.5

6 9 5 8 7 2.0 10 N 3 OH 11 13 2 16 2.5 N 21 12 19 20 H 18 17 14 15 3.0 COOCH3

3.5

4.0

ppm 4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

7 6 5 4 3 2 1 ppm

Figura Nº 30. COSY del alcaloide 19S-HEYNEANINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 81 Erick Vidal Taricuarima

1.0

1.5

2.0 6 9 5 8 7 10 N 2.5 3 OH 11 13 2 16 N 21 12 19 H 20 3.0 14 18 17 15 COOCH3 3.5

4.0

4.5 ppm

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

7 6 5 4 3 2 1 ppm Figura Nº 31. NOESY del alcaloide 19S-HEYNEANINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 82 Erick Vidal Taricuarima

24

32

40

9 6 5 48 8 7 10 N 3 OH 11 13 2 16 56 N 21 12 19 H 20 14 18 17 15 64 COOCH3

72 ppm 80

88

96

104

112

120

7 6 5 4 3 2 1 ppm

Figura Nº 32. HSQC de13C del alcaloides 19S-HEYNEANINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 83 Erick Vidal Taricuarima

HO 6 9 5 8 10 7 3 N 11 2 13 16 21 19 12 N 20 14 1 8 17 15 COOCH3

Figura Nº 33. Espectro de Masa del alcaloide CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA

Figura Nº 34. Espectro de IR del alcaloide CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 84 Erick Vidal Taricuarima

9.9868 7.3979 7.3827 7.2762 7.2617 7.2403 7.1905 7.1886 7.1722 7.1577 3.7373 3.6718 3.6321 3.6081 3.4663 3.4228 2.9078 2.8838 2.6872 2.6664 2.4312 2.4035 1.9515 1.9206 1.8519 1.8021 1.7082 1.5966 1.3936 1.3665 1.3520 1.2127 1.1837 1.0337 0.8339 0.8150 0.8005 0.7866

HO 6 9 5 8 10 7 3 N 11 2 13 N 16 21 19 12 20 14 18 17 15 COOCH 3

10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Chemical Shift (ppm) Figura Nº 35. Espectro de RMN de1H del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina

189.2684 173.7055 151.3260 142.6809 129.1655 126.7725 121.4220 120.8490 88.3583 77.2528 77.0000 76.7472 58.7492 58.4038 53.1796 49.0762 48.7054 37.5578 34.7603 33.8840 32.0472 29.6710 27.0168 26.5113 11.5382

192 184 176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 8 Chemical Shift (ppm)

Figura Nº 36. Espectro de RMN de13C del alcaloide Coronaridina Hidroxindolenina

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 85 Erick Vidal Taricuarima

0.5

1.0

HO 6 9 5 8 1.5 10 7 3 N 11 2 13 16 21 19 2.0 12 N 20 18 17 14 15 2.5 COOCH3 3.0

3.5

4.0

ppm

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7 6 5 4 3 2 1 ppm

Figura Nº 37. COSY del alcaloide CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 86 Erick Vidal Taricuarima

1.0

1.5

2.0

2.5 HO 6 9 5 8 10 7 3.0 3 N 11 2 13 16 21 19 12 N 3.5 20 14 18 17 15 4.0 COOCH3 ppm 4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7 6 5 4 3 2 1 ppm

Figura Nº 38. NOESY del alcaloide CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 87 Erick Vidal Taricuarima

16 HO 6 9 5 8 24 10 7 3 N 11 2 13 16 21 19 32 12 N 20 14 18 17 15 40 COOCH3 48

56 64

72 ppm 80

88 96

104 112

120 128

7 6 5 4 3 2 1 ppm Figura Nº 39. HSQC del alcaloide CORONARIDINA HIDROXINDOLENINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 88 Erick Vidal Taricuarima

6 9 5 8 10 7 O N 11 3 2 13 16 21 19 12 N 20 H 14 18 17 15 COOCH3

Figura Nº40. Espectro de Masa del alcaloide 3-OXOCORONARIDINA

7.9722 7.4957 7.4799 7.2700 7.2618 7.2460 7.1584 7.1559 7.1156 7.1130 7.0992 7.0979 4.5267 4.5153 4.5021 4.4914 4.4800 3.7671 3.7601 3.7381 3.2603 3.2464 3.2432 3.2294 3.2218 3.2174 3.2004 3.1865 2.6746 2.6715 2.6444 2.6368 2.6330 2.3380 2.3109 2.0140 2.0077 1.9812 1.7669 1.5602 1.5476 1.5331 1.5186 1.4700 1.4549 1.4404 1.4284 1.4133 1.2670 1.0105 0.9960 0.9809

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 Chemical Shift (ppm)

Figura Nº41. Espectro de RMN de1H del alcaloide 3-OXOCORONARIDINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 89 Erick Vidal Taricuarima

175.7115 173.0505 135.7115 133.8509 127.8688 122.4133 119.6399 118.3902 110.5685 109.4592 77.3159 77.0000 76.6840 56.1680 55.5712 52.9874 42.7083 38.2287 35.9539 35.5115 31.0179 29.6839 27.6267 27.4301 21.0829 11.3374

6 9 5 8 10 7 O N 11 3 2 13 16 21 19 12 N 20 H 18 14 17 15

COOCH3

176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 72 64 56 48 40 32 24 16 Chemical Shift (ppm)

Figura Nº 42. Espectro de RMN de13C del alcaloide 3-OXOCORONARIDINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 90 Erick Vidal Taricuarima

6 1.0 9 5 8 10 7 O N 1.5 11 3 2 13 16 21 19 12 N 20 2.0 H 18 14 17 15 COOCH 3 2.5

3.0

3.5

4.0

4.5 ppm

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

7 6 5 4 3 2 1 ppm Figura Nº 43. COSY del alcaloide 3-OXOCORONARIDINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 91 Erick Vidal Taricuarima

1.0 6 9 5 8 1.5 10 7 O N 11 3 2 13 16 21 19 2.0 12 N 20 H 14 18 17 15 2.5 COOCH 3 3.0

3.5

4.0

4.5 ppm 5.0 5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

7 6 5 4 3 2 1 ppm Figura Nº 44. NOESY del alcaloide 3-OXOCORONARIDINA

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 92 Erick Vidal Taricuarima

8

16

24

32

40

48

56 64

72 ppm 80

6 9 5 88 8 10 7 O N 96 11 3 2 13 16 21 19 12 N 20 104 H 14 18 17 15 COOCH3 112

120

128

7 6 5 4 3 2 1 ppm Figura Nº 45. HSQC del alcaloide 3-OXOCORONARIDINA.

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 93 Erick Vidal Taricuarima

Hivelli Ericka Ricopa Cotrina Pág. 94 Erick Vidal Taricuarima