Universidad Veracruzana Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada Maestría en Ciencias en Ecología y Biotecnología

FACTORES INVOLUCRADOS EN LAS ESTRATEGIAS REPRODUCTIVAS DE DOS ESPECIES DE HEMÍPTEROS Vulsirea violacea (Fabricius) y Ramosiana insignis (Blanchard) (HETEROPTERA: PENTATOMIDAE)

TESIS

PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN ECOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA

ING. JORGE ALFREDO MUÑIZ RAMIREZ

DIRECTOR DE TESIS

DR. MAURILIO LÓPEZ ORTEGA

XALAPA, VER. MAYO, 2021 1

DECLARATORIA DE AUTORIA

Quien suscribe Jorge Alfredo Muñiz Ramírez estudiante de la Maestría en Ciencias en Ecología y Biotecnología, hace constar que es autor del Trabajo para la obtención del Grado de Maestría intitulado: Factores involucrados en las estrategias reproductivas de dos especies de hemípteros, Vulsirea violacea (Fabricius) y Ramosiana insignis (Blanchard) (Heteróptera: Pentatomidae) el cual constituye la elaboración personal realizada únicamente con la Dirección del Comité Tutoral siguiente: Dr. Maurilio López Ortega, Dra. Diana Folger Pérez Staples y Dra. Norma Flores Estévez.

En tal sentido, manifiesto la originalidad de los conceptos, base de datos registrados, interpretación de los datos, conclusiones y recomendaciones. Por último, dejo establecido que los aportes intelectuales de otros autores se han referido debidamente en el texto y en la sección de literatura citada de dicho trabajo.

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Jorge Alfredo Muñiz Ramírez

Xalapa de Enríquez, Veracruz, mayo de 2021. 2

Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada Dirección General de Investigaciones

Universidad Veracruzana Programa de Posgrado

ECOBIOT-14RETD RESULTADO DE LA EVALUACIÓN DEL DOCUMENTO DE TESIS DE MAESTRÍA

Jorge Alfredo Muñiz Ramírez Estudiante del Posgrado INBIOTECA, Maestría en Ciencias en Ecología y Biotecnología,

PRESENTE

Por este conducto se hace de su conocimiento que el Comité Revisor de su Tesis de Maestría ha evaluado su documento intitulado “FACTORES INVOLUCRADOS EN LAS ESTRATEGIAS REPRODUCTIVAS DE DOS ESPECIES DE HEMÍPTEROS Vulsirea violacea (Fabricius) y Ramosiana insignis (Blanchard) (HETEROPTERA: PENTATOMIDAE)” y ha emitido el veredicto de aprobado ya que si reúne los elementos suficientes de fondo y forma. Se autoriza continuar con los trámites administrativos para la obtención del grado en la Coordinación del Posgrado INBIOTECA.

Xalapa de Enríquez a 21 de mayo de 2021 “Lis de Veracruz: Arte, Ciencia, Luz”

Presidente: Dr. Ángel I. Ortiz Ceballos

Secretario: Dra. Ana Elena Dorantes Acosta

Vocal 1 Externo: Dr. Trevor Williams

Suplente: Dr. Juan Carlos Noa Carrazana

C.c.p. Expediente correspondiente

Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada, Campus para la Cultura, las Artes y el Deporte, Zona Universitaria. Av. de las Culturas Veracruzanas No. 101. Col. Emiliano Zapata. C.P. 91090. Xalapa de Enríquez, Ve r . Tel. 01-228-8421700 ext 10867 correo-e: [email protected].

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DEDICATORIAS Y AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo está dedicado a Dios por bendecirme con esta vida y esta familia tan maravillosa, así como a mis padres por ser una fuente de inspiración y fuerza, además de su inmensurable apoyo y aliento a seguir siempre adelante en mi carrera académica.

Quiero agradecer en estas líneas con todo mi corazón a todos los que formaron una parte esencial para la culminación de este trabajo. Les agradezco a mis padres, a mi director de tesis junto con mi comité tutoral y jurado de grado, a mi pareja y a mis compañeros, ya que siempre estuvieron para brindarme una mano y una guía cuando lo necesite. También quiero agradecer al Instituto de Ecología y Biotecnología Aplicada, a la Universidad Veracruzana y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por todas las herramientas brindadas.

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AGRADECIMIENTOS Y CREDITOS INSTITUCIONALES

El presente trabajo se realizó bajo la dirección del Dr. Maurilio López Ortega dentro de la Línea de Generación y Aplicación del Conocimiento: Ecología y comportamiento de Artrópodos, pertenecientes a el Cuerpo Académico: “UVE-CA-173”, Ecología y Manejo de la Biodiversidad registrados en el Instituto de biotecnología y ecología aplicada de la Universidad Veracruzana en Xalapa, Veracruz.

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por su apoyo al estudiante con una beca académica bajo el No de becario 843339.

Se agradece al programa de posgrado de Maestría en Ciencias en Ecología y Biotecnología, siendo la Coordinadora la Dra. Ana Elena Dorantes Acosta y al Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada siendo director el Dr. Antonio Andrade Torres.

Xalapa de Enríquez, Veracruz, mayo de 2021.

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ÍNDICE DE CONTENIDO I. INTRODUCCIÓN ...... 9 II. ESTADO DEL ARTE ...... 11 2.1. Importancia del estudio de los insectos ...... 11 2.2. Generalidades de la clasificación taxonómica de Hemiptera: Heteroptera: Pentatomidae ...... 12 2.3. Características generales de la familia Pentatomidae (Hemiptera: Heteroptera)...... 13 2.3.1. Distribución y abundancia ...... 14 2.3.2. Comportamiento alimenticio ...... 14 2.3.3. Comportamiento reproductivo ...... 15 2.3.4. Estados inmaduros y desarrollo del huevo...... 16 2.3.5. Sistema reproductivo ...... 17 2.4. Asociaciones post-inseminación (Hipótesis del resguardo de la pareja) ...... 19 2.5. Enemigos naturales de la familia Pentatomidae ...... 20 2.6. Descripción de las especies de estudio ...... 22 2.6.1. Ramosiana insignis (Blanchard) ...... 22 2.6.2. Vulsirea violacea (Fabricius) ...... 24 2.6.3. Schoephia schreberi (J. F. Gmel.)...... 26 III. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN ...... 27 IV. HIPÓTESIS ...... 27 V. OBJETIVOS ...... 27 VI. MATERIALES Y MÉTODOS ...... 29 6.1. Área de estudio...... 29 6.2. Determinación de los parámetros de la biología reproductiva de Ramosiana insignis y Vulsirea violacea...... 29 6.2.1. Cría y captura ...... 30 6.2.2. Determinación del comportamiento de Ramosiana insignis y Vulsirea violacea en la cópula y en la asociación post-copulatoria ...... 31 6.2.3. Determinación del comportamiento de oviposición de Ramosiana insignis y Vulsirea violacea...... 31 6.3. Determinación del dimorfismo sexual en Vulsirea violacea y Ramosiana insignis . 32 6.3. Cuantificación de la carga ovárica en tres diferentes estados de desarrollo de Ramosiana insignis ...... 32 6.3.1. Disección y conteo de la carga ovárica...... 32 6.3.2. Tratamiento 1. Conteo de la carga ovárica post-apareamiento ...... 33 6.3.3. Tratamiento 2. Conteo de la carga ovárica post-oviposición de huevos normales ...... 33 6

6.3.4. Tratamiento 3. Conteo de la carga ovárica post-oviposición de huevos adicionales (después de la eclosión de los huevos)...... 33 6.4. Determinación del comportamiento de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides ...... 34 6.4.1. Método de obtención de parasitoides ...... 34 6.4.2. Tratamiento 1: Sin parasitoides ...... 34 6.4.3. Tratamiento 2: Presencia física de parasitoides ...... 35 6.5 Análisis estadísticos ...... 35 VII. RESULTADOS ...... 37 7.1. Determinación del dimorfismo sexual en Vulsirea violacea y Ramosiana insignis . 37 7.2. Determinación de parámetros en la biología reproductiva de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis ...... 43 7.2.1. Frecuencia, duración de la cópula y resguardo de pareja ...... 43 7.2.2. Oviposición ...... 48 7.3. Cuantificación de la carga ovárica en tres diferentes etapas de desarrollo de Ramosiana insignis ...... 55 7.3.1. Tratamiento 1. Carga ovárica de Ramosiana insignis post-apareamiento ...... 56 7.3.2 Tratamiento 2. Carga ovárica de Ramosiana insignis post-oviposición de huevos normales ...... 57 7.3.3 Tratamiento 3. Carga ovárica de Ramosiana insignis post-oviposición de huevos adicionales ...... 60 7.3.4. Comparación del tamaño de los huevos normales y adicionales ...... 61 7.4. Comportamiento de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides ...... 63 7.4.1 Parasitoides obtenidos ...... 63 7.4.2. Respuesta defensiva de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides..... 64 7.4.3. Desarrollo del parasitoide Telenomus sp. en los huevos de Vulsirea violacea .. 66 VII. DISCUSIÓN ...... 68 VIII. CONCLUSIÓN ...... 75 IX. REFERENCIAS ...... 76

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ÍNDICE DE TABLAS

Tabla Descripción Página Tabla I. Promedio (±ES) de la fecundidad y oviposición de Vulsirea violacea ...... 51 Tabla II. Promedio (±ES) de la fecundidad y oviposición de Ramosiana insignis...... 55 Tabla III. Promedio (±ES) de carga ovárica en diferentes estados de desarrollo de Ramosiana insignis ...... 56 Tabla IV. Promedios (±ES) de longitud y superficie de los huevos de Ramosiana insignis...... 62 Tabla V. Promedio (±ES) de la fecundidad y oviposición de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides...... 68

INDICE DE FIGURAS Figura Descripción Página Figura 1. Hembra de Ramosiana insignis cuidando la masa de huevos depositados en una hoja de S. schreberi...... 24 Figura 2. Hembra de Vulsirea violacea con ninfas de primer estadio ...... 25 Figura 3. Árbol de Schoepfia schreberi ...... 26 Figura 4. Comparación del tamaño entre hembras y machos de Vulsirea violacea...... 38 Figura 5. Presencia/ausencia de marcas en el pronoto de hembras y machos de Vulsirea violacea ...... 40 Figura 6. Comparación del tamaño entre hembras y machos de Ramosiana insignis...... 42 Figura 7. Vista dorsal de la hembra y el macho de Ramosiana insignis...... 43 Figura 8. Posición de apareamiento de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis...... 44 Figura 9. Frecuencia de la duración de la cópula de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis...... 45 Figura 10. Frecuencia de la duración de la segunda cópula de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis...... 46 Figura 11. Duración de la cópula de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis por fechas...... 47 Figura 12. Hembra de Vulsirea violacea cuidando masa de huevos ...... 48 Figura 13. Oviposición asincrónica de huevos adicionales y cuidado parental de Vulsirea violacea ...... 50 Figura 14. Oviposición y cuidado parental de Ramosiana insignis...... 53 Figura 15. Hembras de Ramosiana insignis ovipositando en el haz de las hojas de S. schreberi...... 54 Figura 16. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la asociación post-copulatoria...... 57 Figura 17. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la primera puesta de huevos ...... 58 Figura 18. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la primera puesta de huevos con ovocitos en distintos estados de desarrollo...... 59 Figura 19. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la eclosión de ninfas...... 61 Figura 20. Parasitoides presentes en las camadas de huevos de Ramosiana insignis...... 64 Figura 21. Hembras de Vulsirea violacea cuidando masa de huevos...... 66 Figura 22. Desarrollo del parasitoide Telenomus sp. en los huevos de Vulsirea violacea...... 67

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RESUMEN

Las especies de la familia Pentatomidae, mejor conocidas como chinches apestosas, tienen una distribución mundial y están ampliamente estudiadas en el entorno agrícola, sin embargo, los estudios en ambientes naturales son escasos. Vulsirea violacea (Fabricius) y Ramosiana insignis (Blanchard), especies clasificadas en esta familia, no están relacionadas directamente al entorno agrícola. En estudios previos se reportó que son especialistas del mismo hospedero Schoepfia schreberi J. F. Gmel. (Schoepfiaceae), sin embargo difieren de las estructuras de las que se alimentan y del sitio de oviposición. Además, R. insignis presenta una oviposición asincrónica de huevos adicionales y sufre parasitismo de huevos, hechos que en V. violacea no han sido abordados. El objetivo del presente trabajo fue determinar parámetros comparativos de la biología reproductiva, de V. violacea y R. insignis en su hospedero natural. El trabajo se realizó en la localidad de Tejería Municipio Teocelo, Veracruz y en el INBIOTECA-UV, durante el periodo que comprende del año 2018 al 2020. En este estudio, ambas especies presentan un comportamiento reproductivo muy similar e interesante, se descubrió que V. violacea utiliza la misma estrategia de oviposición que R. insignis, la cual solo es conocida en estos insectos. Ambas especies presentan dimorfismo sexual en tamaño, siendo las hembras significativamente más grandes que los machos. Además, presentan resguardo de pareja, y la duración de la cópula contabilizado en días en el caso de V. violacea fue en promedio de 22.32 ± 1.25 días y en el caso de R. insignis un promedio de 66.91 ± 3.9 días. El número de huevos depositados por V. violacea en promedio fue de 107 ± 13.81 huevos normales y 88.83 ± 8.9 huevos adicionales, y para R. insignis 256 ± 14.78 huevos normales y 64.22 ± 11.40 huevos adicionales. También se determinó que R. insignis es una especie que modula la puesta de huevos, es decir, no pone toda la carga ovárica con la que cuenta en la primera oviposición, pero el tamaño de los huevos normales y los adicionales varió significativamente siendo los normales más largos (U = 13748, p< 0.01) y los adicionales más anchos (U = 5919, p< 0.001) y con una mayor área de superficie (U = 10088, p< 0.05). Se descubrió que los parasitoides de Telenomus sp. atacan a los huevos de V. violacea, y pueden desarrollarse con éxito en un periodo promedio de 12.28 ± 0.28 días, al lograr evadir las respuestas defensivas de la madre cuidando la masa de huevos. Se concluye que las hembras de ambas especies, presentan similitudes en la provisión de huevos adicionales para su descendencia, y difieren en el comportamiento reproductivo, en la duración de la cópula, el número de huevos puestos, y el periodo de reproducción, factores que hacen que sus ninfas coexistan en la etapa de fructificación de su planta hospedera.

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I. INTRODUCCIÓN

La familia Pentatomidae (Hemiptera: Heteroptera), especies conocidas comúnmente como chinches apestosas, conforman una de las familias más grandes dentro de los heterópteros con aproximadamente 800 géneros y 5000 especies (Rider, 2012; Panizzi and Grazia, 2015;

Carrenho et al., 2018). Una gran diversidad de especies de esta familia, han sido ampliamente estudiadas alrededor del mundo debido a que son plagas de cultivos agrícolas

(Panizzi et al., 2000). En contraste, a pesar de su importancia ecológica y genética (Ojasti and Dallmeier, 2000), los estudios de las especies silvestres de esta familia son escasos

(Schuh and Slater, 1995; Panizzi et al., 2000; Silva and Oliveira, 2010).

Ramosiana insignis (Blanchard) y Vulsirea violacea (Fabricius) son dos especies clasificadas dentro de la familia Pentatomidae. Ambas son especialistas y para su reproducción utilizan la planta hospedera, Schoepfia schreberi J. F. Gmel. (Schoepfiaceae), especie endémica de México que se encuentra en el estado de Veracruz (Sánchez, 1996).

Los ciclos de vida de las dos especies tienen diferencias temporales, los adultos están presentes al mismo tiempo en la planta y parece que existe competencia por alimento entre ellos. Además de tener el mismo hospedero, estas especies presentan otras características similares como lo son: estados ninfales muy parecidos, una coloración aposemática y cuidado maternal de huevos y ninfas de primer estadio (López and Cervantes, 2010).

Sin embargo, una característica que las diferencia, es que R. insignis sufre parasitismo de huevos, principalmente por el parasitoide de Telenomus sp., y en V. violacea no ha sido observado el ataque por parasitoides (López and Cervantes, 2010). López-Ortega y Williams (2018) examinaron las estrategias reproductivas empleadas por R. insignis para 10

mejorar el número y la supervivencia de la descendencia, y demostraron que estos implican una combinación de defensa materna contra parasitoides y depredadores, la selección del sitio de oviposición y la producción asincrónica de huevos adicionales. Esta última es una estrategia de oviposición conocida únicamente en esta especie de insecto, por lo que es interesante saber si V. violacea al ser especialista del mismo hospedero y pertenecer a la misma familia, también presenta una estrategia de oviposición similar.

La presente investigación aborda el estudio de las estrategias reproductivas, entre las especies V. violacea y R. insignis por el hecho de que estas dos especies de pentatómidos interactúan con un mismo hospedero creciendo de manera silvestre y no están directamente relacionadas con el entorno agrícola, el cual es un tema que ha sido escasamente abordado en las especies de la familia Pentatomidae. Además, presentan características similares de comportamiento y reproducción, y por otro lado, diferencias, ya que en R. insignis se ha reportado parasitismo de huevos y en V. violacea no, el parasitismo de huevos en Pentatomidae es un tema muy interesante y muy abordado en todo el mundo como solución al problema de contaminación por los métodos más utilizados actualmente como el uso de plaguicidas de amplio espectro. Lo anterior aunado a la estrategia de oviposición que utiliza R. insignis para mejorar la supervivencia de la descendencia y que no ha sido descrita en ningún otro insecto motivan a esta investigación a la realización de experimentos de campo y laboratorio para estimar como se establecen estas relaciones entre las dos especies de pentatómidos y su hospedero.

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II. ESTADO DEL ARTE

2.1. Importancia del estudio de los insectos

Los insectos son por mucho la forma de vida animal dominante en la tierra, representan alrededor del 66% de todas las especies animales, constituyendo más de tres cuartas partes de la biodiversidad global actual (Schoonhoven et al., 2005; Jankielsohn, 2018), en términos de masa biológica, se estima un peso aproximado de 27 billones de toneladas

(Grissell and Goodpasture, 2001; Price et al., 2011). Los insectos son buenos dispersores y explotadores de casi cualquier tipo de materia orgánica, además de que pueden ser encontrados casi en cualquier lugar, formando una parte importante de cada ecosistema y realizando diversos servicios ecosistémicos, tales como, la dispersión de semillas, el ciclo de nutrientes, la biodegradación, el control de plagas y la polinización, por tanto, son partes fundamentales dentro de nuestras cadenas de suministros (Jankielsohn, 2018). Por consiguiente, es importante adquirir conocimientos generales, como su taxonomía, morfología, fisiología, ecología, etología, etc., así como también, conocimientos aplicados para el control y manejo eficiente de los insectos perjudiciales (De La Cruz, 2006).

Los insectos son poco estudiados en ambientes naturales porque su pequeño tamaño los hace más difíciles de ubicar en su hábitat natural y plantea desafíos para la captura, manipulación y marcado (Zajitschek et al., 2020). No obstante, el estudio de la fauna silvestre es de suma importancia debido a que es el resultado de un proceso evolutivo de millones de años, lo que confiere características genéticas y físicas únicas constituyendo la diversidad genética de los ecosistemas, y aún más por su valor ecológico debido a que todas las especies interactúan unas con otras y según su función específica o nicho 12

ecológico es indudable que son de vital importancia para el funcionamiento de los ecosistemas, aunque a veces no pueda afirmarse o negarse la importancia de los animales en los ecosistemas simplemente por la escasez de datos (Ojasti and Dallmeier, 2000).

2.2. Generalidades de la clasificación taxonómica de Hemiptera: Heteroptera:

Pentatomidae

Las especies de insectos descritos se aproximan a un millón de especies, aunque la mayoría aún continúan sin ser nombrados y se desconoce el número. La mayoría de los insectos descritos (aproximadamente el 90%) son especies herbívoras y están clasificados en los principales grandes órdenes de insectos que son: Coleoptera, Hymenoptera, Lepidoptera,

Diptera, Orthoptera, Tysanoptera y Hemiptera (Price et al., 2011).

Los hemípteros conforman el quinto grupo más grande y diversificado de insectos hemimetábolos (Schuh and Slater, 1995). Con aproximadamente 90,000 especies descritas, los hemípteros están distribuidos a nivel mundial en los subórdenes: Auchenorrhyncha,

Coleorryncha, Sternorrhyncha y Heteroptera. La sinapormofía del orden, es decir, los caracteres con los que se clasifican los hemípteros, son principalmente las adaptaciones de las piezas bucales para succión y perforación, ubicadas en una cresta recta paralela o cerca de la región gular (Araújo et al., 2020)

Dentro de los hemípteros el suborden Heteróptera comprende más de 42,000 especies descritas y están distribuidas en aproximadamente 90 familias reconocidas actualmente, con una gran diversidad morfológica, con formas y tamaños que van desde menos de 1 mm a más de 11 cm (Weirauch et al., 2019). Tienen una amplia distribución ya 13

que se encuentran presentes en islas y en todos los continentes con excepción de la

Antártida (Schuh and Slater, 1995) pudiendo ser de hábitats acuáticos, terrestres, parásitos de aves y murciélagos (Schuh and Slater, 1995; Banho, 2016). Las sinapormofías de este suborden son: presencia de gula, presencia de aparato olfativo metatorácico y glándulas olfativas dorsales abdominales también funcionales en ninfas (Forero, 2008).

Dentro de los Hemiptera – Heteroptera, la familia Pentatomidae es una de las más grandes y diversas con aproximadamente 5000 especies descritas en 800 géneros (Rider,

2012; Panizzi and Grazia, 2015; Carrenho et al., 2018). Estas especies son conocidas como chinches apestosas, también pueden ser encontradas en la literatura como pentatómidos y se caracterizan por su forma redonda u ovoide, las antenas están divididas en cinco segmentos, el tarso en tres segmentos y tienen un escutelo pequeño de forma más o menos triangular

(Panizzi et al., 2000). Las sinapormofías utilizadas para esta familia son principalmente los huevos con opérculo en forma de barril, tricobotria presente en esternitos abdominales incluso en los lados del abdomen, glándulas salivales accesorias y cápsula genital especializada (Grazia et al., 2008; Nunes, 2016).

2.3. Características generales de la familia Pentatomidae (Hemiptera: Heteroptera)

El estudio de este grupo se ha desarrollado principalmente en países como Estados Unidos,

Brasil y México, en su mayoría enfocadas a la taxonomía, morfología y distribución geográfica (Torres, 2005). Las chinches apestosas son acreedoras a este nombre común debido a que producen una sustancia de olor desagradable por medio de glándulas de olor, que también de ser manipuladas, pueden dejar manchas anaranjadas o amarillas en los dedos, estas secreciones provienen de un par de glándulas ubicadas en el tórax (McGavin, 14

1993; Panizzi et al., 2000). Las características biológicas y ecológicas de estas especies han sido ampliamente documentadas, principalmente por su interés económico en entornos agrícolas, sin embargo, en ambientes naturales han sido poco documentadas (Panizzi et al.,

2000; Silva and Oliveira, 2010).

2.3.1. Distribución y abundancia

La familia está conformada por 800 géneros y 5000 especies (Rider, 2012; Panizzi and

Grazia, 2015; Carrenho et al., 2018) divididas en diez subfamilias (Aphylinae, Asopinae,

Cyrtocorinae, Discocephalinae, Edessinae, Pentatominae, Phyllocephalinae, Podopinae,

Serbaninae y Stirotarsinae) (Banho, 2016). La distribución de los pentatómidos es a nivel mundial y pueden ser encontrados en todas las regiones zoogeográficas, pero las faunas tropicales y subtropicales son más diversas que las de las regiones templadas (Grazia et al.,

2015).

2.3.2. Comportamiento alimenticio

Los pentatómidos son en su mayoría especies fitófagas con excepción de las especies de la subfamilia Asopinae que se caracterizan por tener hábitos predadores y ser utilizados en programas de control biológico (Torres, 2005; Bianchi et al., 2017). Aunque hay especies oligófagas, los pentatómidos son principalmente polífagos y se alimentan tanto de plantas cultivadas como de plantas silvestres. Estos insectos obtienen los nutrientes insertando su estilete a la fuente de alimento y utilizan primordialmente las estructuras reproductivas de las plantas como las frutas en desarrollo, los cogollos y las semillas ya que les proporcionan una dieta de alta calidad y aseguran un mayor éxito reproductivo, sin excluir a los sistemas 15

vasculares de las plantas como recurso de alimentación para algunas de las especies (Silva and Oliveira, 2010).

Al alimentarse, estas especies causan daño en los tejidos de las plantas provocando plantas marchitas y en muchos casos, aborto de frutos y semillas, además de que pueden ser transmisores de patógenos a las plantas (Panizzi et al., 2000). Las especies que se alimentan de plantas de cultivos, constituyen plagas en muchas partes del mundo, afectando plantaciones de legumbres, soya, cereales, cítricos, cultivos forestales, palmas, cacao, café, coco y girasoles (Torres, 2005).

2.3.3. Comportamiento reproductivo

Existe una gran diversidad de estudios sobre el comportamiento reproductivo de los pentatómidos (Alcock, 1971; Drickamer and McPherson, 1992; Lundgren, 2011; Silva et al., 2012; Laumann et al., 2016). En general, el comportamiento reproductivo de estas especies es complejo, puede involucrar muchas cópulas y una gran cantidad de masas de huevos depositadas durante periodos que abarcan varios meses (Silva et al., 2012). La ubicación y el reconocimiento de la pareja esta mediado por señales químicas, a través de feromonas sexuales y señales vibratorias producidas principalmente por la vibración del abdomen y transmitidas a través de la planta o sustrato (Silva et al., 2012; Laumann et al.,

2016).

Cuando termina la temporada reproductiva de las plantas hospederas de los pentatómidos, estos pueden comenzar una fase de diapausa, en algunos casos una secuencia reproductora, ya sea en el follaje, la corteza u otros refugios o simplemente dispersarse en 16

busca de plantas hospederas secundarias (Silva and Oliveira, 2010). Al pertenecer a

Hemiptera–Heteroptera sus ciclos de vida siguen un patrón conocido como hemimetabolismo: en lugar de larvas, tienen ninfas sin alas que se parecen a los adultos en mayor o menor grado y presentan la posición de apareamiento típica de los heterópteros, los dos animales espalda con espalda (McGavin, 1993). Los pentatómidos pueden colocar las masas de huevos sobre todas las partes de la planta hospedera, por encima del nivel de suelo o en las plantas cercanas a la planta hospedera principal (Grazia y Schwertner 2008;

Silva y Oliveira, 2010; López-Ortega y Williams 2018).

Después de la emergencia, las ninfas de primer estadio adquieren endosimbiontes mutualistas de sus cáscaras de huevo (Abe et al., 1995) y permanecen agregadas, durante el primer estadio, tiempo en el cual, estas no se alimentan de tejidos vegetales (Abe et al.,

1995; Schuh y Slater 1995; Silva y Oliveira, 2010). Al igual que muchos heterópteros, son reconocidos debido a que presentan cuidado parental, algunos de ellos muestran principalmente la atención materna y rara vez la atención paterna (McGavin, 1993; Tallamy y Schaefer, 1997).

2.3.4. Estados inmaduros y desarrollo del huevo

Más de 150 especies de pentatómidos tienen sus estados inmaduros descritos, incluyendo huevos y ninfas, más que cualquier otra familia de Heteróptera (Matesco et al., 2009). Los huevos de la familia Pentatomidae son considerados como los más estudiados dentro del suborden Heteroptera (Yonke, 1991; Matesco, et al., 2009). Los huevos son siempre depositados en racimos y tienen forma de barril, cilíndricos o esféricos y pueden presentar diferentes patrones, ya sea liso, rugoso o espinoso en la superficie del corion. Presentan un 17

opérculo que corresponde a la porción del polo anterior que se levanta durante la eclosión, el cual parece estar siempre presente y rodeado por un anillo de procesos aero-micropilares, los cuales participan en el intercambio de gases y en la fertilización del huevo y pueden mostrar una morfología variable. Presentan una estructura conocida como “ruptor ovis”, la cual es una estructura esclerotizada en forma de "T" que permite la ruptura del corion durante la eclosión para que salgan de sus capsulas (Matesco et al., 2009).

Al ser organismos ovíparos, el desarrollo embrionario ocurre fuera del cuerpo materno, por lo tanto, los componentes necesarios para el desarrollo del embrión deben estar todos empaquetados dentro del huevo. La yema es un material complejo compuesto por proteínas, lípidos, carbohidratos y otros componentes menores que se empaquetan dentro del huevo de manera organizada. La acumulación de yema es un proceso en el que el cuerpo graso produce proteínas de la yema que se empaquetan en el huevo. La principal proteína, sintetizada por el cuerpo graso, que se acumula dentro del huevo, es la vitelogenina, tal proceso es conocido como vitelogénesis. La embriogénesis es desencadenada por la fertilización, proceso durante el cual se utilizará la yema para el desarrollo de un nuevo individuo, la ninfa del primer estadio (Atella et al., 2005).

2.3.5. Sistema reproductivo

Por medio de la examinación del sistema reproductivo de los insectos se puede determinar el estado reproductivo de un individuo o una población (Esquivel, 2009) y generar caracteres que pueden, además de ayudar en la sistemática, contribuir al conocimiento del comportamiento reproductivo (Araújo et al., 2020; Munhoz et al., 2020). Para

Pentatomidae la morfología del sistema reproductivo tanto masculino como femenino ha 18

sido ya descrita en diversas especies (Pendergrast, 1956; Nijhout, 1994; Chapman, 1998;

Soto et al., 2012; Cremonez et al., 2017; Grodowitz et al., 2019; Araújo et al., 2020).

En el caso de los machos de Pentatomidae el sistema reproductivo es, en general, más complejo que los de otras familias de heteróptera, esto debido a que tienen un bulbo eyaculatorio complejo y la presencia de glándulas accesorias ectodérmicas y mesodérmicas

(Pendergrast, 1956). El aparato reproductor de machos de Pentatomidae se localiza en el abdomen, encima o a un lado del intestino y consiste, típicamente, en un par de testículos, un par de conductos deferentes, un saco ectodérmico, glándulas accesorias emparejadas, un bulbo eyaculatorio complejo y un conducto eyaculador (Pendergrast, 1956; Nijhout, 1994;

Chapman, 1998; Soto et al, 2012). En general, cada testículo está compuesto por un número de tubos o folículos testiculares análogos a las ovariolas femeninas y el número varia de especie en especie incluso dentro de la misma familia (Nijhout, 1994; Soto et al,

2012). En el caso de Pentatomidae el número de folículos testiculares puede variar entre tres y siete (Araújo et al., 2020).

Respecto a las hembras de Pentatomidae, el aparato reproductor femenino puede estar ubicado en la parte superior o lateral del sistema digestivo, está constituido por un par de ovarios, conformado cada uno por estructuras denominadas ovariolas, ligados por el pedicelo a los oviductos laterales y éstos al oviducto común, que se abre en una cámara genital llamada vagina y de ahí hacia el exterior, en la bursa copulatrix (Nijhout, 1994;

Chapman, 1998; Soto et al., 2012). Cada ovario, generalmente, contiene de cuatro a siete ovariolas, sin embargo, la variación en el número de ovariolas es común incluso dentro de la misma especie o familia y puede ser estacional o influenciada por la estrategia 19

reproductiva del insecto, y puede tener implicaciones en el desarrollo de la progenie, la producción de huevos de diferentes tamaños o puede afectar la capacidad reproductiva femenina (Nijhout, 1994; Chapman, 1998). Las ovariolas se componen de dos regiones: el germario distal que contiene tejido trófico, oogonia y ovocitos (Chapman, 1998), y el vitellar tubular que alberga los folículos maduros (Grodowitz et al., 2019).

2.4. Asociaciones post-inseminación (Hipótesis del resguardo de la pareja)

El comportamiento de apareamiento incluye todos los eventos pre y post-copulatorios que rodean la inseminación (Omkar and Pervez, 2000; Chaudhary and Mishra, 2015). En muchas especies de insectos los machos prolongan la cópula con su pareja más allá del tiempo necesario para fecundar los óvulos de la hembra. Alcock (1994) refiere a estos comportamientos como asociaciones post-inseminación. Existen diversos mecanismos de selección sexual posteriores al apareamiento (Alcock, 1994), sin embargo, la protección post-copulatoria o resguardo de la pareja es el fenómeno más extendido en insectos

(Alcock, 1994), crustáceos (Sparkes et al., 1996), reptiles (Ancona et al., 2010), aves (Low,

2006) y mamíferos (Chaudhary and Mishra, 2015). Esté se ha explicado generalmente como la protección de la pareja por parte del macho, para reducir la competencia espermática tras un posible reapareamiento de la hembra por algún macho rival (McLain,

1989; Carroll and Loye, 1990; Zahn et al., 2008). El resguardo de la pareja ocurre en especies donde la receptividad femenina se limita a un período de tiempo breve y específico, o la temporada de reproducción es corta (Ridley, 1983; Jormalainen, 1998). Para los heterópteros, al igual que para varios ordenes de insectos, se ha reportado que la asociación post-copulatoria o resguardo de la pareja se presenta, de manera que, los machos 20

prolongan la cópula y la pareja mantiene los genitales en contacto todo el tiempo (Alcock,

1994).

2.5. Enemigos naturales de la familia Pentatomidae

Los parasitoides de huevos (Hymenoptera: Scelionidae) son importantes enemigos naturales de las chinches apestosas (Pacheco and Correa-Ferreira, 2000). En la literatura hay registros de parasitoides de los géneros Telenomus spp. y Trissolcus spp. que se asocian directamente con la regulación natural de pentatómidos (Koppel et al., 2009; Yang et al., 2009; Tillman, 2011; Castañeda-Vildózola et al., 2015). Estos parasitoides han sido considerados y utilizados con éxito en muchos países para el control biológico de las chinches apestosas por medio de la liberación masiva (Correa-Ferreira, 2002; De Almeida

Paz-Neto et al., 2015).

Los parasitoides de la familia Scelionidae son avispas de color negro que miden entre 1 y 2.5 mm de longitud. La familia se divide en tres subfamilias: Scelioninae,

Teleasinae y Telenominae (Masner, 1976) con más de 160 géneros y alrededor de 3,000 especies (Cingolani, 2011). Son endoparasitoides, oofagos, solitarios e idiobiontes, es decir, la larva del parasitoide se desarrolla en el interior del huevo del insecto del cual se alimenta, un solo individuo se desarrolla de un solo individuo del hospedero y detiene el crecimiento del hospedero al momento de la oviposición (Cingolani, 2011). Una vez que sus estados preimaginales (huevo, larva y pupa) se desarrollan en el interior del hospedero, emerge el adulto de vida libre, el cual solo se alimenta de néctar (Corrêa-Ferreira, 1993). El número de estadios larvales varía entre 2 y 5 dependiendo de las especies (Volkoff and

Colazza, 1992; Cingolani, 2011). 21

Las hembras de esta familia son arrenotóquicas, lo que significa que en su reproducción la progenie masculina es partenogenética y la femenina es por reproducción sexual. La relación de sexos en la progenie esta sesgada hacia las hembras. La tasa de emergencia de la progenie es máxima cuando el parasitoidismo se produce sobre huevos de menos de 48 h de desarrollo y las hembras pueden poner huevos inmediatamente después de la emergencia, alcanzando su fecundidad máxima alrededor de 48 h después de emergidas (Corrêa-Ferreira, 1993; Cingolani, 2011).

Su comportamiento de búsqueda de hospedero está condicionado por estímulos químicos, como los compuestos volátiles de las plantas que son expedidos debido a la alimentación de estas por las chinches apestosas (Michereff et al., 2011; Ferreira et al.,

2012), las feromonas de alarma, el sexo del hospedero (Ferreira et al., 2012) y también responden a las señales vibratorias transmitidas por los hospederos durante la comunicación sexual (Laumann et al., 2007, 2011; Ferreira et al., 2012). Se ha reportado que estos parasitoides de huevos inician el proceso de oviposición una vez que se ponen en contacto con el huevo, el cual exploran con las antenas, se suben y realizan la extrusión del ovipositor probando en diversos sitios, después perforan y empujan el abdomen en un movimiento de bombeo. El momento de la oviposición se caracteriza por un movimiento de balanceo (Austin et al., 2005). Cuando finaliza el proceso, la hembra pasa su ovipositor por el huevo y deja una marca química para indicar a otras hembras de la misma especie que el huevo está parasitado (Borges et al., 1999), sin embargo, no son capaces de distinguir cuando las marcas son hechas por hembras de otras especies (Okuda and Yeargan, 1988;

Sujii et al., 2002; Cingolani, 2011). Al momento de emerger la avispa corta el opérculo del 22

huevo del hospedero, lo que permite reconocer un huevo del cual emergió un parasitoide

(Cingolani, 2011).

2.6. Descripción de las especies de estudio

Ramosiana insignis y Vulsirea violacea están incluidas en la Sección 2 de la tribu

Pentatomini, ya que tienen un tubérculo o espina mediana en la base de la ventosa abdominal, pero no tienen el metasesterno ventral producido en aposición al ápice de ese tubérculo o espina (Rolston y McDonald, 1980; Rolston et al., 1980; López y Cervantes,

2010). Las ninfas de ambas especies podrían encontrarse simultáneamente en la misma planta, pero podrían diferenciarse porque las ninfas de R. insignis tienen una coloración más pálida que las de V. violacea, cuya coloración es más intensa y se vuelve rojiza con el desarrollo. Estas dos especies difieren en las estructuras de las plantas que utilizan como recursos alimenticios. Aunque pueden estar presentes en la misma planta, R. insignis aparece primero durante la temporada reproductiva de su planta huésped, mientras que V. violacea aparece más tarde en la temporada (López y Cervantes 2010).

2.6.1. Ramosiana insignis (Blanchard)

El pentatómido R. insignis se distribuye en México en los estados de Chiapas, Guerrero,

México, Michoacán, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, San Luis Potosí, Tamaulipas y

Veracruz, así como en Costa Rica y Panamá (Nielsen et al., 2004). Se alimenta solamente de los botones florales, brotes y frutos en desarrollo de su hospedero el árbol S. schreberi.

Esta especie deposita una masa de huevos de 330.67 ± 93.5 (n = 49) huevos y los organiza en una masa regular y uniforme de forma romboidal (Fig. 1). Los huevos los coloca en 23

masas individuales en el envés de las hojas de S. schreberi o en la vegetación circundante a este durante el periodo de septiembre a octubre (López y Cervantes, 2010).

Esta especie presenta cuidado maternal, desde la oviposición hasta el inicio del segundo estadio ninfal, y su comportamiento parece estar dirigido a disuadir parasitoides y depredadores. Las hembras cubren las masas de huevos con sus cuerpos generalmente mirando hacia la base de las hojas y cuando las ninfas empiezan a eclosionar, la hembra cambia su posición dejando a las ninfas expuestas. Su reproducción ocurre desde septiembre hasta diciembre. Las ninfas nacen principalmente en los meses de octubre y mediados de noviembre, se dispersan en noviembre y diciembre abandonando la masa de huevos colectivamente y llegan a la etapa adulta a finales de febrero o principios de marzo.

Después de la temporada de fructificación de S. schreberi a finales de marzo, los adultos entran en una fase de diapausa, se agrupan en árboles específicos y se quedan casi sin moverse hasta fines de junio. Esta especie es univoltina ya que solo tiene una camada de crías al año (López y Cervantes, 2010).

López-Ortega y Williams (2018) realizaron estudios con respecto a las estrategias reproductivas utilizadas por este insecto. Como resultado, encontraron que R. insignis utiliza una estrategia de oviposición que no ha sido descrita hasta la fecha para ningún otro insecto, la oviposición asincrónica de huevos adicionales. Esta estrategia consiste en que la hembra pone un primer lote de huevos que son color amarillo, después de aproximadamente tres semanas los huevos maduran y se ponen color rosados, una vez maduros, la hembra deposita un segundo lote de huevos de color amarillo, generalmente del lado más cercano al peciolo de la hoja. Cuando unos días más tarde las ninfas emergen 24

sincrónicamente, este segundo lote de huevos funciona como primera fuente de alimento.

Sin embargo, se demostró que los huevos de este segundo lote son fértiles, por lo cual no entran en la categoría de huevos tróficos y se les denominó “huevos adicionales”. Los autores determinaron que esta estrategia de oviposición en combinación con la defensa materna contra parasitoides y depredadores, así como la selección del sitio de oviposición, son las estrategias reproductivas empleadas por R. insignis para mejorar el número y la supervivencia de la descendencia.

Figura 1. Hembra de Ramosiana insignis cuidando la masa de huevos depositados en una hoja de S. schreberi. Los huevos de color rosa se encuentran ya maduros y están comenzando a emerger las ninfas, mientras que la de color amarillo es la masa de huevos adicionales. (Foto: López-Ortega)

2.6.2. Vulsirea violacea (Fabricius)

El pentatómido V. violacea se distribuye en México en los estados de Campeche, Oaxaca,

Querétaro y Veracruz, también se distribuye en Costa Rica y en Estados Unidos en el estado de Texas (López y Cervantes, 2010). Esta especie se alimenta exclusivamente de frutos inmaduros y maduros de su hospedero el árbol S. schreberi. La temporada 25

reproductiva de V. violacea es de diciembre a marzo. Las hembras de esta especie depositan una masa de 162 ± 42.6 (n = 7) huevos y los organiza en una masa regular y uniforme de forma romboidal. Los huevos los coloca en masas individuales en el haz de las hojas de S. schreberi (López y Cervantes, 2010).

Esta especie presenta cuidado maternal, desde la oviposición hasta el primer estadio ninfal (Fig. 2). Las hembras cubren las masas de huevos con sus cuerpos generalmente mirando hacia la base de las hojas. Las ninfas de V. violacea emergen en enero, llegando a la etapa adulta en marzo y se pueden encontrar dispersas en enero o febrero. Después de la temporada de fructificación de S. schreberi, a finales de marzo, los adultos se agrupan en

árboles específicos y entran en diapausa hasta finales de junio (López y Cervantes, 2010).

Figura 2. Hembra de Vulsirea violacea con ninfas de primer estadio. Hembra de V. violacea exhibiendo cuidado maternal de ninfas de primer estadio, rodeada de mucha fruta de su hospedero, S. schreberi. (Foto: López-Ortega)

26

2.6.3. Schoephia schreberi (J. F. Gmel.).

El árbol S. schreberi conocido también como Gulfgreytwig tree, coloradillo, its’am’te

(lengua huasteca), limoncillo, palo de hamaca, sinatuan o tecolotillo (Rzedowski, 1995), es un árbol que crece desde la selva baja caducifolia hasta el encinar (Fig. 3). Se distribuye desde Venezuela, a través de América Central y México, hasta Florida y en algunas islas del Caribe. Florece de septiembre a marzo, produce bayas de 5-12 mm, verde cuando están inmaduras y se ponen rojas cuando están maduras (Rzedowski, 1995). Este árbol ha sido objeto de estudio debido a que los frutos son utilizados por un gremio de insectos de varios

órdenes (Aluja et al., 2000, López-Ortega and Khalaim 2012; López-Ortega et al., 2013).

Figura 3. Árbol de Schoepfia schreberi, ubicado en la localidad de Tejerías, municipio de Teocelo, Veracruz. (Foto: Muñiz-Ramírez, 2019)

27

III. PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

1. ¿R. insignis y V. violacea utilizan las mismas estrategias reproductivas?

2. ¿Por qué la especie R. insignis presenta parasitismo de huevos y la especie V.

violacea no?

3. ¿Las hembras de R. insignis modulan la oviposición de huevos normales y

adicionales o ponen toda la carga de huevos?

IV. HIPÓTESIS

1. Vulsirea violacea, al igual que Ramosiana insignis, utiliza la oviposición

asincrónica de huevos adicionales como estrategia reproductiva.

2. Las hembras de R. insignis no ovipositan la carga ovárica total, sino que modulan la

oviposición estratégicamente.

3. Los huevos de las hembras de V. violacea no sufren parasitismo por que alcanzan a

cubrir toda la nidada con su cuerpo y R. insignis no.

V. OBJETIVOS

Objetivo general

Estudiar las estrategias reproductivas y defensa ante parasitoides de las especies Vulsirea violacea y Ramosiana insignis.

Objetivos específicos

1. Determinar parámetros de la biología reproductiva de R. insignis y V. violacea. 28

2. Evaluar el comportamiento de las hembras de V. violacea con la presencia de

parasitoides.

3. Cuantificar la carga ovárica de R. insignis en tres diferentes etapas de desarrollo

(post apareamiento, post oviposición de huevos normales y post oviposición de

huevos normales y adicionales).

4. Determinar si existe dimorfismo sexual en V. violacea y R. insignis.

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VI. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Área de estudio

Se eligieron dos sitios de estudio, ubicados en la localidad de Tejerías, (19º 21´ N, 96º 54´

O), municipio de Teocelo, Veracruz. El sitio 1 ubicado a una altura aproximada de 853 msnm, consta de una superficie de alrededor de 1 ha donde se tienen identificados 33 arboles de S. schreberi. El sitio 2, ubicado a una altura aproximada de 831 msnm, consta de una superficie mayor a las 3 ha donde se tienen identificados 37 arboles de S. schreberi.

Además, se realizaron salidas de campo y colectas en las localidades de Monte Blanco,

Llano Grande y Loma Alta, Municipio de Teocelo, Veracruz, México. La vegetación predominante en esta área es una mezcla de pastos con fragmentos de bosque de encino, asociados con plantaciones de café y vegetación secundaria.

6.2. Determinación de los parámetros de la biología reproductiva de Ramosiana insignis y Vulsirea violacea.

Para la determinación de los parámetros de la biología reproductiva de R. insignis y V. violacea, se estudió el comportamiento de las especies desde la fecundación hasta la oviposición. Se estudiaron los periodos de cópulas, el comportamiento en la asociación post-copulatoria y los periodos refractarios. Se estudiaron los periodos de oviposición, se describió dicho comportamiento y la cantidad de huevos puestos. La evidencia se obtuvo con registros y fotografías con una cámara fotográfica (Nikon modelo D3100) con lente

AF-S NIKKOR 18-55mm.

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6.2.1. Cría y captura

Las colectas se llevaron a cabo en árboles individuales de S. schreberi en las localidades de

Tejerías y Monte Blanco, Municipio de Teocelo, Veracruz, México con una frecuencia de dos veces por semana, durante el periodo de septiembre de 2018 a diciembre de 2019. Los individuos colectados fueron manipulados con la ayuda bolsas de tela de organdí de 40 cm×50 cm×40 cm y de recipientes de plástico transparentes de 400 ml, 1 L y 2 L, adaptados con mayas de plástico con orificios de 1 mm. Los individuos de las dos especies de pentatómidos fueron colocados en ramas frondosas de S. schreberi. Las ramas fueron cubiertas con las bolsas de tela de organdí y se sellaban para evitar que los insectos escaparan. Los arboles conteniendo los insectos en cautiverio se mantuvieron en la localidad de Tejerías.

Las ninfas de las dos especies fueron alimentadas con frutos hasta alcanzar la etapa adulta, para lo cual, los troncos de los árboles de S. schreberi se protegieron con barreras pegajosas hechas con cinta de vinil transparente y pegamento (Tree Tanglefoot Insect

Barrier) en la temporada de fructificación, y sus ramas con flores y frutos fueron protegidos con bolsas de tela para evitar la depredación u oviposición por otros insectos. En la época de ausencia de frutos de la planta hospedera, los adultos de ambas especies en cautiverio se alimentaron con ciruelas (Prunus domestica) y se proporcionaba agua en un recipiente con algodón humedecido que se cambiaba cada semana.

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6.2.2. Determinación del comportamiento de Ramosiana insignis y Vulsirea violacea en la cópula y en la asociación post-copulatoria

Para determinar cuándo se apareaban y el posible resguardo de pareja se embolsaron ramas de S. schreberi, en el área de los sitios 1 y 2. Se utilizó tela de organdí de 50 cm × 40 cm ×

50 cm introduciendo ramas con mucho follaje. Cada bolsa contenía: 10 hembras y 10 machos de una de las dos especies. Para la identificación y seguimiento de cada cópula, las parejas fueron marcadas en el tórax con un punto de pintura no tóxica de la marca Politec

(un color diferente para cada pareja). Se dio seguimiento a todas las parejas apareadas dos veces por semana, hasta la separación o finalización de la cópula.

6.2.3. Determinación del comportamiento de oviposición de Ramosiana insignis y

Vulsirea violacea

Para determinar los periodos y el comportamiento de las especies en la oviposición, se le dio seguimiento a la puesta de huevos normales y adicionales de las hembras una vez que finalizaron las asociaciones post-copulatorias. El conteo de huevos normales y adicionales se realizó por medio de fotos, las cuales se tomaron una sola vez cuando los huevos normales estaban de color rosados y los huevos adicionales estaban presentes. Las fotografías se obtuvieron moviendo las hembras cuidadosamente por un momento para tomar la fotografía y volviéndolas a colocar en su lugar.

Para evaluar si los huevos adicionales de V. violacea estaban fecundados, se retiraron los huevos “normales” de tres hembras de V. violacea para evitar que al eclosionar las ninfas éstas se alimentaran de los huevos. El procedimiento consistió en retirar la 32

hembra de la masa de huevos por un momento, colocándola en otra hoja, mientras que se retiraban con mucho cuidado los huevos normales con una espátula de acero inoxidable de

5 cm x 0.8 cm con mango de plástico, para después volver a colocar la hembra con los huevos adicionales. Las tres hembras con huevos adicionales fueron colocadas en su rama en un recipiente y los huevos normales se colocaron sobre hojas de S. schreberi en otro recipiente. Los recipientes fueron de 1 L, transparentes y se usó como tapa un cuadro de 15 cm x 15 cm de tela de organza ajustada al recipiente con una liga.

6.3. Determinación del dimorfismo sexual en Vulsirea violacea y Ramosiana insignis

Se obtuvieron las medidas del largo máximo (de la cabeza al último segmento abdominal) y ancho máximo (presente entre el III y IV segmento abdominal) de 35 hembras y 35 machos de la especie V. violacea y de 25 hembras y 25 machos de la especie R. insignis. Los valores obtenidos fueron comparados entre sexos para cada especie, como se especifica en la sección de análisis estadísticos.

6.3. Cuantificación de la carga ovárica en tres diferentes estados de desarrollo de

Ramosiana insignis

Para saber si las hembras de R. insignis modulan estratégicamente la puesta de huevos, se realizó una cuantificación de la carga ovárica de las hembras en tres tratamientos con 15 repeticiones (hembras individuales) para cada tratamiento.

6.3.1. Disección y conteo de la carga ovárica

Las hembras se colocaron en frascos de vidrio de 110 ml totalmente sellados con papel impregnado con acetato de etilo en su interior. Después de 5 min se inició la disección en 33

solución salina al 0.9%, usando tijeras quirúrgicas, pinzas, alfileres entomológicos y jeringas de 10 ml. El conteo de la carga ovárica se realizó con la ayuda de un contador portátil de aluminio. La disección y el conteo de la carga ovárica se realizó con un microscopio estereoscópico marca OLYMPUS modelo SZX7, con adaptador de cámara marca OLYMPUS modelo U-TV1XC y cámara fotográfica digital marca JENOPTIK modelo ProgRes C3. Los tratamientos y el método del conteo de la carga ovárica se describen a continuación.

6.3.2. Tratamiento 1. Conteo de la carga ovárica post-apareamiento

Se utilizaron 15 hembras de R. insignis que finalizaron la asociación post-copulatoria, estas fueron trasladadas al laboratorio en el INBIOTECA-UV vivas, con follaje y agua. La disección y el conteo de la carga ovárica se realizaron el mismo día de su traslado.

6.3.3. Tratamiento 2. Conteo de la carga ovárica post-oviposición de huevos normales

Se utilizaron 15 hembras de R. insignis que pusieron el primer lote de huevos, estas fueron separadas de su camada de huevos y trasladadas al laboratorio en el INBIOTECA-UV vivas, con follaje y agua. La disección y el conteo de la carga ovárica se realizó el mismo día de su traslado.

6.3.4. Tratamiento 3. Conteo de la carga ovárica post-oviposición de huevos adicionales (después de la eclosión de los huevos)

Se examinaron 15 hembras de R. insignis que pusieron el lote de huevos adicionales, estas fueron separadas y trasladadas al laboratorio en el INBIOTECA-UV vivas, con follaje y 34

agua, cuando los huevos eclosionaron. La disección y el conteo de la carga ovárica se realizó el mismo día de su traslado.

6.4. Determinación del comportamiento de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides

Para determinar el comportamiento de la hembra de la especie V. violacea ante la presencia de parasitoides se realizaron dos tratamientos, uno donde se introdujeron hembras parasitoides de Telenomus sp. y otro sin la presencia de parasitoides.

6.4.1. Método de obtención de parasitoides

Los parasitoides se obtuvieron de las primeras camadas de huevos de las hembras de R. insignis, en los meses de septiembre y octubre de 2019, y fueron identificados por medio del color negro al que se tornan. Se retiraron cuatro camadas de huevos casi completamente parasitadas y fueron trasladadas al INBIOTECA-UV. Las camadas parasitadas se colocaron en recipientes transparentes de 2 L adaptados con orificios, donde los parasitoides emergieron y se alimentaron con miel y agua en algodón, se observó que copularan y se llevaron al campo.

6.4.2. Tratamiento 1: Sin parasitoides

Este tratamiento consistió en seguir el comportamiento de hembras de V. violacea posadas en el envés de las hojas de S. schreberi (una en cada bolsa). Cada rama donde se encontraron las hembras se cubrió con una bolsa de tela de organdí de 40 cm × 50 cm × 40 cm, completamente sellada para evitar la entrada de los parasitoides. Se dio seguimiento a la puesta de huevos normales y adicionales en un ambiente libre de parasitoides. 35

6.4.3. Tratamiento 2: Presencia física de parasitoides

Consistió en seguir el comportamiento de 15 hembras de V. violacea posadas en las hojas de S. schreberi. Cada rama donde se encontraron las hembras se cubrió con una bolsa de tela de organdí de 40 cm × 50 cm × 40 cm. Al siguiente día de la observación de la puesta de huevos, cinco individuos hembras de Telenomus sp. se introdujeron a la bolsa. Se dio seguimiento a la puesta de huevos normales y adicionales ante la presencia física de los parasitoides.

6.5 Análisis estadísticos

La exploración de datos y análisis estadísticos se realizaron en el software SPSS compilación 1.0.0.1508. Para el experimento del conteo de la carga ovárica de R. insignis, se compararon los valores de longitud del largo, ancho y área de superficie de los huevos normales (tratamiento 1) con los huevos adicionales (tratamiento 2). Para contrastar la hipótesis de normalidad de la población, se utilizó la prueba de Kormogorov-Smirnov con corrección de significación de Lilliefors, donde solo la variable longitud del ancho, en el caso de los dos tratamientos, no pasó la prueba de normalidad. Para las variables largo y

área de superficie de los dos tratamientos se utilizó la prueba F de Fisher para la comparación de las varianzas y debido a la diferencia entre estas, se utilizó la prueba U de

Mann-Whitney para la comparación de las tres variables.

Se compararon los valores obtenidos de la longitud del largo máximo (de la cabeza al último segmento abdominal) y ancho máximo (presente entre el III y IV segmento abdominal) de 35 hembras y 35 machos de V. violacea, y de 25 hembras y 25 machos de R. 36

insignis seleccionados al azar. Para contrastar la hipotesis de normalidad de la población, se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para ambos casos. Para la comparacion de las varianzas entre hembras y machos de las variables “largo máximo” y “ancho máximo” de cada especie, se utilizó la prueba de Levene, resultando una diferencia significativa solo en la variable “largo máximo” para ambas especies. Por tanto, se utilizó la prueba U de Mann-

Whitney para la comparación entre sexos de las variables “largo máximo” y la prueba t para la comparación entre sexos de la variable “ancho máximo”.

También se realizó la comparación entre la duración de la primera y la segunda cópula de cada especie. Para contrastar la hipótesis de normalidad de la población, se utilizó la prueba de Kormogorov-Smirnov con corrección de significación de Lilliefors para la variable “duración de la primera cópula” y la prueba de Shapiro-Wilk en el caso de la variable “duración de la segunda cópula” para ambas especies. La variable “duración de la primera cópula” no pasó la prueba de normalidad de la población en comparación con la variable “duración de la segunda cópula” en el caso de ambas especies. La comparación de las varianzas se realizó con la prueba de Levene, resultando en una diferencia significativa solo entre las variables “duración de la primera cópula “y “duración de la segunda cópula” de R. insignis. Por lo tanto, se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para la comparación de la duración de la primera y la segunda cópula de ambas especies.

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VII. RESULTADOS

7.1. Determinación del dimorfismo sexual en Vulsirea violacea y Ramosiana insignis

En la determinación del dimorfismo sexual se obtuvo que las hembras de V. violacea midieron en promedio 13.91 ± 0.20 mm y los machos 11.75 ± 0.13 mm de largo máximo

(de la cabeza a último segmento abdominal) y de ancho máximo (presente entre el III y IV segmento abdominal) las hembras midieron en promedio 9.38 ± 0.121 mm y los machos

7.98 ± 0.128 mm. La comparacion de muestras resultó en una diferencia significativa tanto entre el largo máximo de hembras y machos (U = 73.50, p<0.001) (Fig. 4A) como en el ancho máximo de hembras y machos (t=7.932, g.l.= 68, P<0.001) (Fig. 4B), siendo las hembras, en ambos casos, más grandes.

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A) V. violacea

B) V. violacea

Figura 4. Comparación del tamaño entre hembras y machos de Vulsirea violacea. A) Comparación del largo máximo entre sexos. B) Comparación del ancho máximo entre sexos. 39

En la evaluación de la presencia/ausencia de marcas en el pronoto de las hembras y los machos que fueron medidos, el 80% (N=28) de las hembras presentaron una marca con coloración blanca amarillenta con forma de “M” en el pronoto (Fig. 5A) y el 20% (N=7) de las hembras no (Fig. 5B). En cambio ninguno de los machos presentó una marca con coloración blanca en el pronoto (Fig. 5C y D), sin embargo se observó una marca con coloración naranja en forma de “T” o triangular en el pronoto en el 14% (N=5) de los machos examinados (Fig. 5D). 40

Figura 5. Presencia/ausencia de marcas en el pronoto de hembras y machos de Vulsirea violacea. A) Hembra de V. violacea con presencia de coloración blanca en el pronoto. B) Hembra de V. violacea con ausencia de marca con coloración blanca en el pronoto. C) Macho de V. violacea con ausencia de marca con coloración blanca en el pronoto. D) Macho de V. violacea con presencia de marca con coloración naranja en el pronoto.

Con respecto a R. insignis, las hembras midieron en promedio 22.23 ± 0.24 mm de largo máximo (de la cabeza al último segmento abdominal) y 15.66 ± 0.17 mm de ancho 41

máximo (presente entre el III y IV segmento abdominal) (N 25). Los machos de R. insignis midieron en promedio 20.01 ± 0.16 mm de largo máximo (de la cabeza al último segmento abdominal) y 14.48 ± 0.12 mm de ancho máximo (presente entre el III y IV segmento abdominal) (N 25). La comparación del largo máximo entre hembras y machos de R. insignis resultó en una diferencia significativa (U = 54, P <0.001) (Fig. 6A). De igual forma la comparación del ancho máximo entre hembras y machos de R. insignis resultó en una diferencia significativa (t = 5.512, g.l.= 48 P<0.001) (Fig. 6B), siendo las hembras más grandes que los machos en ambos casos.

42

Largo máximo

Ancho máximo

Figura 6. Comparación del tamaño entre hembras y machos de Ramosiana insignis. A) Comparación del largo máximo entre sexos. B) Comparación del ancho máximo entre sexos. 43

En cuanto a presencia de marcas, a diferencia de V. violacea, el aspecto observado en los machos y las hembras de R. insignis que fueron estudiados, resultó uniforme (Fig. 7).

Figura 7. Vista dorsal de la hembra y el macho de Ramosiana insignis. A) Hembra de R. insignis. B) Macho de R. insignis.

7.2. Determinación de parámetros en la biología reproductiva de Vulsirea violacea y

Ramosiana insignis

7.2.1. Frecuencia, duración de la cópula y resguardo de pareja 44

Las observaciones de apareamientos de V. violacea descritas a continuación ocurrieron en los meses de diciembre de 2018, y enero de 2019, siendo la última semana del mes de diciembre de 2018 cuando más se registraron nuevos apareamientos. Para R. insignis las observaciones de nuevos apareamientos ocurrieron desde finales de mayo de 2019 hasta principios de septiembre de 2019, siendo los meses de junio y julio de 2019 cuando más se registraron nuevos apareamientos. Estas especies presentan la posición de apareamiento típica de los heterópteros, de forma que los dos individuos están espalda con espalda (Fig.

8).

Figura 8. Posición de apareamiento de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis. A) Pareja de V. violacea apareada sobre las hojas de S. schreberi. B) Pareja de R. insignis apareada sobre las ramas de S. schreberi.

45

Vulsirea violacea presentó un porcentaje de apareamiento del 65% para las hembras

(n=109) y también del 65% para los machos (n= 117). En cuanto a R. insignis, presentó un porcentaje de apareamiento del 38% para hembras (n=177) y del 34% para machos (n=

199). Ambas tuvieron cópulas por periodos de varias semanas. En V. violacea la duración de la cópula en promedio fue de 22.32 ± 1.25 días (n=71 parejas), con un rango de 8 a 50 días y para R. insignis la duración de la cópula en promedio fue de 66.91 ± 3.9 días (n=67 parejas), con un rango de 9 a 122 días (Fig. 9).

Figura 9. Frecuencia de la duración de la cópula de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis. Frecuencia de la duración de la copula de 71 parejas de V. violacea y de 67 parejas de R. insignis. Rango promedio indica el rango promedio de la duración de la cópula en días. 46

Ambas especies son poliándricas ya que presentaron reapareamientos, las cuales se presentaron principalmente en el mes de enero de 2019 en el caso de V. violacea y con respecto a R. insignis las observaciones fueron en el periodo julio – septiembre 2019. El porcentaje de reapareamientos para V. violacea fue del 14% para hembras y del 7% para machos y para R. insignis fue del 12% para hembras y del 10% para machos. La duración de la segunda cópula para V. violacea en promedio fue de 14 ± 1.85 días (n=10) y en el caso de R. insignis fue de 45.38 ± 6.15 días (n=8) (Fig. 10). La comparación entre la duración de la primera y la segunda cópula de V. violacea, resultó en una diferencia significativa (U = 548, P = 0.0056), siendo la primera cópula la que duró más tiempo. En la comparación de la duración entre la primera y la segunda cópula de R. insignis no se encontró una diferencia significativa (U = 373.5, P = 0.071).

Figura 10. Frecuencia de la duración de la segunda cópula de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis. Frecuencia de la duración de la segunda copula de 10 parejas de V. violacea y 8 parejas de R. insignis. 47

Se pudo observar una tendencia a la disminución de la duración de la cópula entre más cercana fuera la fecha de la temporada de fructificación de S. schreberi en el caso de V. violacea (Fig. 11A), y a la temporada de floración de S. schreberi en el caso de R. insignis

(Fig. 11B).

Figura 11. Duración de la cópula de Vulsirea violacea y Ramosiana insignis por fechas. A) Media de la duración de la cópula de V. violacea por semana. B) Media de la duración de la cópula de R. insignis por mes. 48

7.2.2. Oviposición

Durante el periodo enero – marzo 2019 se pudo observar el comportamiento de oviposición de V. violacea. Se observaron 28 hembras de esta especie ovipositando en las hojas de S. schreberi. Las oviposiciones tuvieron lugar principalmente en los meses de enero y febrero disminuyendo en marzo de 2019. En este periodo de estudio se corroboró que V. violacea es una especie que presenta cuidado maternal de huevos y ninfas de primer estadio (Fig.

12A), además se descubrió que esta especie utiliza la misma estrategia de oviposición reportada para R. insignis, es decir, la oviposición asincrónica de huevos adicionales (Fig.

12B).

Figura 12. Hembra de Vulsirea violacea cuidando masa de huevos. (A) Hembra de V. violacea cuidando masa de huevos. (B) Masa de huevos normales (naranjas) y adicionales (amarillos). 49

Las hembras de V. violacea ovipositan una masa de huevos que organizan uniformemente y de forma romboidal. Las hembras de esta especie colocan una primera camada de huevos de color amarillo (Fig. 13A), que cuando madura cambia su coloración a naranja (Fig. 13B). Después la hembra pone una segunda camada de huevos, la cual funge como primera fuente de alimento cuando nace la progenie (Fig. 13B y C). De las tres hembras con huevos adicionales que fueron colocadas en su rama en un recipiente y les fueron retirados los huevos normales, se obtuvo que al igual que R. insignis los huevos adicionales de V. violacea están fertilizados, ya que el 73.8% (N = 249) de los huevos produjo una progenie viable. Las hembras de esta especie protegen con su cuerpo, siempre mirando hacia la base de la hoja, la masa de huevos todo el tiempo, incluso durante todo el primer estadio de las ninfas (Fig. 13D). Esta especie oviposita principalmente en el haz de las hojas de su hospedero, sin embargo, durante este periodo de estudio, bajo las condiciones estudiadas y con un número de muestra mayor al encontrado en la literatura

(López y Cervantes, 2010), se observó que V. violacea no solo oviposita en el haz de las hojas sino también en el envés, puesto que, de las 28 hembras, nueve ovipositaron en el envés (Fig. 13B). 50

Figura 13. Oviposición asincrónica de huevos adicionales y cuidado parental de Vulsirea violacea. A) Hembra de V. violacea cuidando huevos “normales”. B) Hembra de V. violacea protegiendo masa de huevos maduros con huevos adicionales presentes, sobre el envés de las hojas de S. schreberi. C) Emergencia de ninfas de V. violacea, alimentándose de los huevos adicionales. D) Hembra de V. violacea cuidando ninfas de primer estadio.

51

En el periodo diciembre 2018 – marzo 2019 se obtuvieron algunos parámetros en relación con la oviposición y la fecundidad de V. violacea. Estos parámetros fueron, el periodo de pre-oviposición (una vez que termina la asociación post-copulatoria), es decir el tiempo promedio que tardaron las hembras en ovipositar después de que finalizaron la cópula, también se obtuvo el tiempo promedio que tardan las ninfas en emerger, el número de huevos normales y adicionales puestos, el número promedio de huevos normales no viables por camada, así como el tiempo promedio que las hembras se mantienen cuidando los estados inmaduros (Tabla I).

Tabla I. Promedio (±ES) de la fecundidad y oviposición de Vulsirea violacea Periodo de tiempo Número de huevos (días) Descripción (n)

Periodo de pre-oviposición 23.46 ± 2.73 28 (después del resguardo de pareja) Emergencia de ninfas 16.56 ± 1.75 18 Cuidado maternal 20.25 ± 4.59 8 Huevos normales 107 ± 13.8 8 Huevos adicionales 88.83 ± 8.9 8 Huevos normales no viables por 2.38 ± 0.5 8 camada Huevos parasitados 0 8

Respecto a R. insignis, se pudieron observar 32 hembras ovipositando en las hojas de S. schreberi. Las oviposiciones tuvieron lugar desde finales del mes de septiembre hasta finales del mes de octubre de 2019, siendo la tercera semana de octubre cuando se 52

presentaron más oviposiciones. En este periodo de estudio las hembras de R. insignis ovipositaron una masa de huevos uniforme y de forma romboidal (Fig. 14A). Esta especie oviposita los huevos empezando por la parte de abajo de la hoja y los va acomodando en líneas de izquierda a derecha y de derecha a izquierda utilizando las patas traseras, de manera que los va pegando a los lados y hacia abajo (Fig. 14B y C). Una vez que maduran los huevos (ver tabla II) estos tornan a color rojo y la hembra oviposita los huevos adicionales, esto lo hace en un periodo aproximado de 2 horas (Fig. 14B y C). Esta especie presenta cuidado maternal de huevos y ninfas. Durante la etapa inmadura de huevo, cubre los huevos con su cuerpo, esto lo hace mirando hacia el peciolo de la hoja (Fig. 14A) y una vez que los huevos eclosionan, las ninfas que emergen se alimentan de los huevos adicionales y la hembra cambia de posición dejando de cubrir a la nidada colocándose sobre la rama que da acceso a la hoja en manera de protección, así se mantiene hasta que las ninfas se dispersan (Fig. 14D). Durante el periodo de oviposición no se observaron hembras alimentándose. 53

Figura 14. Oviposición y cuidado parental de Ramosiana insignis. A) Hembra de R. insignis (utilizada en el estudio) con huevos normales puestos en la posición de cuidado maternal. B) y C) Hembra de R. insignis con huevos completamente maduros, depositando y organizando los huevos adicionales. D) Hembra de R. insignis cuidando ninfas de primer instar posada en la rama que da acceso a la hoja donde se encuentran las ninfas.

La mayoría de las hembras ovipositaron en el envés de las hojas de S. schreberi tal como lo indica la literatura, sin embargo, en este periodo de estudio se observaron 6 de las 54

32 hembras ovipositando también en el haz de las hojas de S. schreberi, tanto en condiciones del estudio (Fig. 15A) como en condiciones naturales (Fig. 15B).

Figura 15. Hembras de Ramosiana insignis ovipositando en el haz de las hojas de S. schreberi. A) Hembra bajo condiciones de estudio. B) Hembra en condiciones naturales.

Durante el periodo septiembre – octubre de 2019 se obtuvieron algunos parámetros en relación con la oviposición y la fecundidad de R. insignis. Estos parámetros fueron, el tiempo promedio que tardaron las hembras en ovipositar después de que finalizaron la cópula, también se obtuvo el tiempo promedio que tardan las ninfas en emerger, el número 55

de huevos normales y adicionales puestos, el número promedio de huevos normales no viables por camada, así como el tiempo promedio que las hembras se mantienen cuidando los estados inmaduros (Tabla II).

Tabla II. Promedio (±ES) de la fecundidad y oviposición de Ramosiana insignis. Periodo de tiempo Número de huevos en días Descripción (n)

Periodo pre-oviposición (después 16.37 ± 1.23 30 del resguardo de pareja) Maduración de huevos 16.76 ± 0.64 21 Emergencia de ninfas 25.58 ± 1.56 19 Cuidado maternal 35.63 ± 1.15 19 Huevos normales 256.97 ± 14.775 31

Huevos adicionales 64.22 ± 11.40 9

Huevos normales no viables por 15.31 ± 4.71 16 camada

7.3. Cuantificación de la carga ovárica en tres diferentes etapas de desarrollo de

Ramosiana insignis

El tratamiento 1 donde se realizó la cuantificación de la carga ovárica de R. insignis después de la asociación post-copulatoria para hacer el conteo de los huevos normales

(destinados a ser la progenie), se realizó durante el mes de octubre de 2019, y las 15 hembras estudiadas presentaron huevos. El tratamiento 2 donde se realizó la cuantificación de la carga ovárica después de que las hembras ovipositaron para hacer el conteo de los huevos adicionales, se realizó durante el mes de noviembre de 2019, y 10 de las 15 56

hembras estudiadas presentaron huevos. Mientras que el tratamiento 3 donde se realizó la cuantificación de la carga ovárica después de la emergencia de las ninfas para saber si presentan huevos, se realizó en el mes de noviembre de 2019, y solo 2 de las 15 hembras estudiadas presentaron huevos (Tabla III).

Tabla III. Promedio (±ES) de carga ovárica en diferentes estados de desarrollo de Ramosiana insignis Tratamiento Número de huevos n Número de hembras que tenían huevos presentes

Carga ovárica después del resguardo de 291.27 ± 16.37 15 15 pareja (huevos normales)

Carga ovárica después de la oviposición de 25.93 ± 9.52 15 10 la primera camada (huevos adicionales)

Carga ovárica después de la oviposición de 0.73 ± 0.61 15 2 toda la camada

7.3.1. Tratamiento 1. Carga ovárica de Ramosiana insignis post-apareamiento

En la cuantificación de la carga ovárica de las hembras de R. insignis después de la asociación post-copulatoria, al momento de disección, el abdomen de las hembras se encontraba completamente lleno de huevos a lo largo y ancho, tanto que no permitía ver ningún otro órgano (Fig. 16A y B). Los huevos fueron separados y acomodados en solución salina para su conteo y medición (Fig. 16C y D). 57

Figura 16. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la asociación post-copulatoria. (A y B) Interior del abdomen de R. insignis, después de la asociación post-copulatoria, completamente lleno de huevos al momento de disección. (C y D) Huevos normales de R. insignis en solución salina organizados para su conteo y medición (aumento 2x).

7.3.2 Tratamiento 2. Carga ovárica de Ramosiana insignis post-oviposición de huevos normales

Durante la cuantificación de la carga ovárica de las hembras de R. insignis que ya habían puesto los huevos normales, en algunas hembras se pudieron observar los huevos distribuidos uniformemente en los ovarios, los cuales están distribuidos en todo el largo del abdomen sobre los costados izquierdo y derecho, por debajo del sistema digestivo (Fig. 58

17A y B). También se pudieron observar en todas las hembras estudiadas, las ovariolas vacías de la primera camada de huevos puesta (Fig. 17C y D).

Figura 17. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la primera puesta de huevos. (A y B) Interior del abdomen de dos hembras de R. insignis con huevos adicionales por debajo del sistema digestivo de ambos costados y a todo lo largo del abdomen. (C y D) Interior del abdomen de R. insignis con ovariolas vacías después de la primera puesta (aumento 2x).

También se observaron algunas ovariolas con ovocitos con yema (Fig. 18A), así como ovocitos en estados primarios de maduración (Fig. 18B) y los huevos casi completamente formados (Fig. 18C). En varias hembras de R. insignis se pudo distinguir 59

que los ovarios estaban conformados por seis ovariolas con ovocitos y huevos en distintos estados de desarrollo (Fig. 18A, B y C).

Figura 18. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la primera puesta de huevos con ovocitos en distintos estados de desarrollo. (A) Ovario conformado por seis ovariolas con ovocitos con yema. (B) Ovariolas con ovocitos madurando. (C) Huevos casi maduros después de la primera puesta de huevos.

60

7.3.3 Tratamiento 3. Carga ovárica de Ramosiana insignis post-oviposición de huevos adicionales

En la cuantificación de la carga ovárica de R. insignis después de la eclosión de ninfas, en las hembras donde hubo presencia de huevos se pudo observar que estos se encontraban alrededor del sistema digestivo orientados hacia los costados del abdomen (Fig. 19A). Al igual que las hembras donde habían puesto la primera camada de huevos, se pudieron observar las ovariolas vacías con marcas de donde estuvieron los huevos (Fig. 19B). 61

Figura 19. Carga ovárica de Ramosiana insignis después de la eclosión de ninfas. (A) Huevos alrededor del sistema digestivo de R. insignis. (B) Ovariolas vacías con marcas de los huevos que estuvieron presentes. (C) Huevos acomodados para conteo y medición (aumento 2x).

7.3.4. Comparación del tamaño de los huevos normales y adicionales

Respecto a las medidas de largo, ancho y área de los huevos normales y adicionales de R. insignis, se midieron 15 huevos por hembra para un total de 225 en el caso de huevos normales, donde todas las hembras presentaron huevos, y para el caso de los huevos 62

adicionales, se midieron 15 huevos de las hembras que presentaron una cantidad igual o mayor, donde 7 hembras presentaron esa cantidad, para un total de 105 huevos (tabla IV).

Tabla IV. Promedios (±ES) de longitud y superficie de los huevos de Ramosiana insignis. Tratamiento Largo Ancho Área de (n) superficie mm mm mm#

Carga ovárica después 1.57 ± 0.07 0.92 ± 0.05 1.28 ± 0.08 225 del resguardo de pareja (progenie)

Carga ovárica después de 1.54 ± 0.10 0.97 ± 0.05 1.30 ± 0.12 105 la oviposición de la primera camada de huevos (huevos adicionales)

Con los datos obtenidos de la longitud del largo, ancho y el área de los huevos normales y adicionales (Tabla IV), se pudo determinar que entre los huevos normales y adicionales existe una diferencia significativa en el largo (U = 13748, p< 0.01) siendo los huevos normales los que presentan una mayor longitud. Con respecto al ancho de los huevos, también se encontró que existe una diferencia significativa (U = 5919, p< 0.001), sin embargo, en este caso los huevos adicionales son los que presentan una mayor longitud.

De igual forma se encontró que existe una diferencia significativa entre el área de superficie de los huevos normales y adicionales (U = 10088, p< 0.05), siendo los huevos adicionales los que presentan una mayor área. 63

7.4. Comportamiento de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides

Para este experimento se pudo trabajar con 19 hembras de V. violacea, las cuales fueron observadas ovipositando en las hojas de S. schreberi. Estas oviposiciones tuvieron lugar, desde la primera semana de diciembre hasta la segunda semana de enero, pero la mayor cantidad de oviposiciones observadas ocurrió en la cuarta semana de diciembre de 2019.

7.4.1 Parasitoides obtenidos

De las camadas de huevos parasitados de R. insignis se obtuvieron dos especies de parasitoides, una perteneciente al género Telenomus sp. (Fig. 20A) y otra aun no identificada (Fig. 20B). Se obtuvieron en total 302 individuos parasitoides de los cuales 278 pertenecen a la especie de Telenomus sp. y 24 a la especie aun no identificada. En total para este experimento, fueron utilizadas 97 hembras de Telenomus sp., los demás individuos obtenidos fueron colocados en frascos con alcohol después de la senescencia para continuar con su identificación. 64

Figura 20. Parasitoides presentes en las camadas de huevos de Ramosiana insignis. (A) Hembra de Telenomus sp. utilizada para la observación de la interacción con V. violacea. (B) Especie de parasitoide aún no identificada obtenida de la camada de huevos de R. insignis.

7.4.2. Respuesta defensiva de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides

En las observaciones de la presente investigación se determinó que las hembras de V. violacea detectan al parasitoide principalmente cuando tienen contacto físico. Las principales formas de contacto físico que se observaron fueron, el contacto físico del 65

parasitoide con las patas traseras y con los costados superiores del abdomen de la chinche.

En base a observaciones se determinaron cuatro principales respuestas de defensa a la presencia de los parasitoides. Una respuesta defensiva de la hembra es patear ágil y bruscamente con las patas traseras, dependiendo del lado donde se detecte el parasitoide.

Otra respuesta defensiva a la detección del parasitoide, consiste en un movimiento constante de ambas patas traseras de izquierda a derecha y de derecha a izquierda (en forma de abanico) sobre la masa de huevos. Las otras respuestas defensivas a la detección del parasitoide fueron regurgitaciones y aleteos.

Se pudo observar que las hembras de V. violacea cubren casi en su totalidad la nidada de huevos con su cuerpo. Además, la mayoría de las hembras ovipositan en el haz de las hojas de S. schreberi, las cuales, en su mayoría, presentan una morfología ovalada con una plegación involuta, es decir, los bordes de la hoja están doblados hacia adentro y les permite una mayor cobertura sobre la masa de huevos (Fig. 21) 66

Figura 21. Hembras de Vulsirea violacea cuidando masa de huevos. Hembras de V. violacea utilizadas en el experimento para determinar el comportamiento ante la presencia de parasitoides

7.4.3. Desarrollo del parasitoide Telenomus sp. en los huevos de Vulsirea violacea

En las observaciones fue muy evidente la dificultad que los parasitoides enfrentan, para poder acceder a los huevos de V. violacea a consecuencia de las respuestas defensivas, así 67

como el hecho de que las hembras alcanzan a cubrir casi en su totalidad la camada de huevos. Sin embargo, se constató que los huevos de V. violacea si llegan a ser parasitados por la especie de Telenomus sp. y que la temporada del parasitoide sí coincide con la de V. violacea. Los huevos que llegaron a ser parasitados empezaron a cambiar su color a negro alrededor de los 5 días (Fig. 22B) y 7 días después de que empiezan a cambiar la coloración los huevos, estos emergen (Fig. 22C). Por lo tanto, los parasitoides de Telenomus sp. tardaron en promedio 12 ± 0.28 días (n = 18) en desarrollarse en los huevos de V. violacea.

Figura 22. Desarrollo del parasitoide Telenomus sp. en los huevos de Vulsirea violacea. A) Parasitoide de Telenous spp. sobre los huevos de V. violacea con la hembra presente. B) Huevos de V. violacea parasitados por Telenomus spp. a los 5 días. C) Parasitoide de Telenomus spp. emergiendo de los huevos de V. violacea a los 12 días. Las flechas blancas indican el cambio de coloración y la emergencia a los 7 días después, de los mismos individuos. 68

Se obtuvieron algunos parámetros de la fecundidad y oviposición de V. violacea ante la presencia de parasitoides como el periodo entre la puesta de huevos normales y adicionales, el tiempo promedio que tardan en emerger las ninfas, la cantidad de huevos normales y adicionales puestos, así como el número de huevos parasitados por camada, el tamaño de la camada y el tiempo que la madre brinda protección a los huevos y ninfas (tabla V).

Tabla V. Promedio (±ES) de la fecundidad y oviposición de Vulsirea violacea ante la presencia de parasitoides. Descripción Periodo de tiempo Número de huevos (n) en días puestos

Maduración de huevos 11.75 ± 1.13 8

Emergencia de ninfas 15.50 ± 0.91 14 Cuidado maternal 28.89 ± 2.07 9 Huevos normales 101.75 ± 1.0 8 Huevos adicionales 63.75 ± 10.5 8

Tamaño de la camada 165.50 ± 15.8 8 Huevos parasitados 2.88 ± 2.0 8

VII. DISCUSIÓN

Los pentatómidos Vulsirea violacea y Ramosiana insignis exhiben patrones parecidos en su biología reproductiva y particularmente en la puesta de huevos en donde invierten huevos como alimento para las ninfas recién emergidas. Sin embargo, se observaron que las estrategias reproductivas difieren en el tiempo, lo que sugiere que V. violacea espera hasta 69

la formación de frutos del hospedero para ovipositar sus huevos y con esto la interacción con los parasitoides (sus enemigos naturales) también cambia.

En general, las hembras de R. insignis copulan por varias semanas. Tanto las hembras como los machos tienen reapareamientos. Las cópulas largas se observaron en ambos casos, sin embargo, el resguardo de pareja en la segunda cópula es de menor duración de tiempo solo en el caso de V. violacea. La frecuencia y duración de las cópulas de V. violacea y R. insignis, es un tema interesante que no había sido abordado en estas especies. Existen diversas hipótesis para tratar de explicar la prolongación de la cópula en insectos (McLain, 1980; Walker, 1980; Alcock, 1994), sin embargo, dentro de heteróptera se ha explicado generalmente como el resguardo de la pareja por parte del macho, para reducir la competencia espermática tras un posible reapareamiento de la hembra por algún macho rival (McLain, 1989; Carroll and Loye, 1990; Zahn et al., 2008). Por ejemplo, se ha estudiado el tiempo de transferencia del esperma, de la chinche apestosa Megacopta punctatissima (Heteroptera: Plataspidae), la cual presenta cópulas prolongadas hasta por más de 24 horas y en la cual se determinó que el tiempo de la transferencia de esperma fue completado en un periodo de entre dos y cuatro horas (Hosokawa and Suzuki, 2001), por lo que el resto del tiempo se considera como un resguardo de la pareja. El comportamiento que exhiben V. violacea y R. insignis en su hospedero natural S. schreberi, es muy similar al reportado por McLain (1980) en el pentatómido Nezara viridula, ya que esta llega a prolongar la cópula hasta por 14 días, y se determinó que el factor involucrado en la duración de la cópula es el entorno social, ya que las parejas apareadas que se rodeaban tanto de varias hembras como de varios machos prolongaron la cópula por mucho más 70

tiempo (Harris and Todd, 1980; McLain 1980; Zahn et al., 2008). Algo similar se encontró en la especie Jadera haematoloman (Heteroptera: Rhopalidae), en la cual se determinó que el entorno social es un factor involucrado en la duración de la cópula (Carrol, 1991).

Ambas especies recopulan, además, hay un porcentaje de apareamiento similar entre hembras y machos de ambas especies, por lo que el sistema de apareamiento de estas especies podría ser poligamia (Shuster y Wade 2003). Adicionalmente, podría haber un conflicto sexual entre machos por aparearse con las hembras, así como, conflictos intersexuales de hembras rechazando machos como ocurre en los caballitos del diablo

(Odonata: Zygoptera) (Price et al., 2011), los cuales al igual que las especies de estudio de esta investigación, presentan en la asociación post-copulatoria, resguardo de pareja

(Alcock, 1982).

En los datos obtenidos se observó una tendencia a la disminución en la duración de la cópula entre más cerca estuvo la fecha de inicio de cópula a la fecha de floración y fructificación de S. schreberi, para R. insignis y V. violacea respectivamente, es decir en las primeras parejas la duración de la cópula es más larga que la duración de la cópula de las

últimas parejas. Con relación a esto López y Cervantes (2010) reportaron que las ninfas de

R. insignis se alimentan de los botones florales, las semillas de frutos maduros y estructuras vegetativas, mientras que V. violacea, solo se alimenta de frutos ya desarrollados.

Entre las sustancias químicas que median las relaciones entre insectos y plantas, los metabolitos secundarios volátiles desempeñan un papel significativo debido a sus propiedades como atrayentes y como señales para anidación y cría (Knudsen et al., 1993; 71

Marín and Céspedes, 2007). Las observaciones de este estudio indican que el inicio de la floración y fructificación de S. schreberi podrían ser un factor que está involucrado en la duración de la cópula, así como en el inicio de la oviposición de ambas especies.

Se observó que existe dimorfismo sexual en ambas especies. El hecho de que las hembras sean más grandes que los machos es un fenómeno muy común en anfibios, peces, serpientes, tortugas y muchas especies de invertebrados y sugiere una relación positiva entre el tamaño y la fecundidad, es decir, el aumento en el tamaño de las hembras resulta en más espacio interno para la producción de huevos en mayores tasas, o en la producción de puestas más grandes (Serrano-Meneses et al., 2014). Lo anterior puede aplicarse a R. insignis debido a que además de presentar dimorfismo sexual en tamaño, sesgado hacia las hembras, presentan una elevada producción de huevos (López-Ortega y Williams 2018).

Este fenómeno también se presenta en otras especies de la familia Pentatomidae, por ejemplo, la especie Euthyrhyncus floridanus (L.) que presenta un conspicuo dimorfismo sexual donde los machos son más pequeños que las hembras (Brailovsky and Mayorga,

1994), así como en Podisus maculiventris que presenta un dimorfismo sexual en tamaño y una relación positiva en el tamaño y la fecundidad, ya que las hembras más grandes producen más huevos que las hembras más pequeñas (Legaspi y Legaspi, 2005).

En cuanto al dimorfismo en marcas de los adultos de V. violacea y R. insignis, los autores López y Cervantes (2010) reportaron el aspecto de ambas especies, así como la variación de colores en adultos y en estados ninfales. No obstante, la evaluación de la presencia o ausencia de las marcas dorsales, así como, la comparación entre sexos de R. insignis y V. violacea no había sido abordada. Los adultos de R. insignis presentan un 72

aspecto uniforme en el lado dorsal, a diferencia de V. violacea que presenta diferencias en el aspecto y color del pronoto, como lo es la presencia de una marca de coloración blanca amarillenta en forma de M en el pronoto, la cual se encuentre presente solo en una parte de la población de hembras. De igual forma una parte de la población de los machos de V. violacea presentan una marca en el pronoto de coloración naranja en forma de triángulo, la cual está ausente en otros. Este fenómeno donde se muestran estas formas genéticamente diferentes dentro de la misma población, es conocido como polimorfismo (Noriyuki and

Osawa 2015; Chura, 2020). El polimorfismo se encuentra presente en varias especies de la familia Pentatomidae, por ejemplo, en Oplomus pulcher (Dallas) o Stiretrus anchorago

(Fabricius), que presenta una variación cromática muy notable con algunos individuos anaranjado rojizos, entre otras diferencias (Brailovsky y Mayorga, 1994).

Ambas especies ovipositan una masa de huevos uniformemente en forma romboidal, V. violacea ovipositó durante los meses de diciembre, enero y febrero, mientras que R. insignis de septiembre a noviembre. En el presente trabajo se observó que V. violacea no solo oviposita en el haz, sino también en el envés de las hojas de S. schreberi, aunque en menor proporción. En el caso de R. insignis ovipositan en el envés la gran mayoría y en el haz de las hojas solo una pequeña proporción de la población. Analizando porque la mayoría de hembras de V. violacea ovipositan en el haz y la mayoría de hembras de R. insignis en el envés de las hojas de S. schreberi, es posible que esto se deba a la morfología de las hojas de S. schreberi, las cuales son en su mayoría ovaladas con una plegación involuta, es decir, los bordes de la hoja están doblados hacia adentro. En el caso de V. violacea, esta especie pone menos huevos abarcando una menor superficie. En 73

comparación, los huevos de R. insignis son más grandes y las hembras ponen una mayor cantidad de huevos, por lo que se sugiere que el envés de las hojas les proporciona un mayor espacio y facilidad para la puesta de huevos.

Ambas especies presentan cuidado maternal de huevos y ninfas de primer instar, semejante a lo observado por López y Cervantes (2010) y López-Ortega y Williams (2018).

Sin embargo, el hecho de que V. violacea utiliza la oviposición asincrónica de huevos adicionales como estrategia reproductiva, no ha sido reportado a la fecha. Por lo tanto, se señala que V. violacea es la segunda especie después de R. insignis en la que se reporta esta estrategia de oviposición tan singular, lo cual valida la hipótesis planteada por el presente estudio. La función principal de los huevos adicionales es la de proveer recursos nutrimentales para la progenie de R. insignis que en la mayoría de los casos tiene que emigrar (López-Ortega y Williams, 2018). El porcentaje de huevos destinados como adicionales representan aproximadamente el 25% del total de huevos normales. De manera interesante en V. violacea los huevos adicionales ovipositados representan el 80% aproximadamente del total de huevos normales y en algunos casos los huevos adicionales ovipositados superan en número a los normales. En las observaciones realizadas en campo se encontró que la progenie de V. violacea los consume en su totalidad, probablemente para contrarrestar la competencia con las ninfas de R. insignis con las que se ha observado comparten los recursos. El número de crías de V. violacea son muy inferiores al de R. insignis.

La cuantificación de la carga ovárica en R. insignis, indica que las hembras presentan huevos en todas las fases de desarrollo, es decir, después del resguardo de pareja, 74

después de la puesta de huevos “normales” e incluso después de la puesta de huevos adicionales y la emergencia de las ninfas. Lo anterior implica que esta especie no pone toda la carga de huevos, si no que la modula estratégicamente, por lo que la hipótesis planteada en esta investigación, con respecto a que las hembras de estas especies modulan estratégicamente la puesta de huevos, es confirmada.

Los resultados indicaron, además, que los huevos normales son más largos, menos anchos y con menor área que los adicionales. Esta diferencia en el tamaño de los huevos ha sido reportada en Elasmucha ferrugata (Heteroptera: Acanthosomatidae). Los huevos ubicados en el centro son más grandes que los huevos puestos en la periferia de la nidada, los del centro tienen una mayor supervivencia debido a su tamaño y también reciben una mayor protección contra la depredación (Mappes et al., 1997). En otras especies como el escarabajo Mimosestes amicus (Horn,1873) (Coleoptera: Chrysomelidae) las hembras cubren los huevos con huevos adicionales para reducir significativamente el ataque por parasitoides, los huevos superiores son más pequeños y sirven sólo como escudos protectores (Deas y Hunter 2012). Sí la función principal de los huevos adicionales en R. insignis es la de fungir como suministro de alimento para la progenie, entonces los huevos adicionales por ser más anchos y presentar una mayor área, podría suponer una mayor cantidad de alimento. Aunado a esto, este resultado supondría algo muy relevante, que es que las hembras de esta especie no solo modulan la puesta de huevos estratégicamente, sino que también modulan el tamaño de los huevos adicionales.

En referencia a la interacción entre hembras de V. violacea y sus parasitoides, se observó que Telenomus sp., el principal parasitoide que ataca R. insignis, está presente en la 75

temporada reproductiva de V. violacea. Las observaciones realizadas en campo y confirmadas en laboratorio es que Telenomus sp. parasita los huevos normales de V. violacea y se desarrolla con éxito emergiendo el adulto en un periodo aproximado de 12 días. También se obtuvo evidencia de que V. violacea es una especie que cubre casi en su totalidad la nidada con su cuerpo. Adicionalmente, la oviposición en el haz de las hojas de

S. schreberi, las cuales presentan una morfología con bordes doblados hacia adentro, le brinda una mayor protección de los huevos. Lo anterior aunado a los mecanismos de defensa de V. violacea ante la detección de los parasitoides, implica que los parasitoides de

Telenomus sp. tendrán varios obstáculos que sobrepasar en el parasitismo de los huevos de

V. violacea. Por lo tanto, que la especie de V. violacea sufra menos parasitismo en comparación con lo reportado por López-Ortega y Williams (2018) para R. insignis, esto debido a que V. violacea alcanza a cubrir la masa de huevos con todo su cuerpo, valida la hipótesis planteada por esta investigación.

VIII. CONCLUSIÓN

Finalmente se puede concluir que V. violacea y R. insignis presentan resguardo de pareja en la asociación post-copulatoria, prolongando la cópula por varios días, siendo la presencia de las flores o frutas de su hospedero un factor involucrado en la duración de las cópulas.

Ambas especies utilizan la oviposición asincrónica de huevos adicionales como estrategia reproductiva y al menos R. insignis no pone toda su carga ovárica si no que modula la puesta de huevos. Los huevos normales y adicionales presentan una diferencia en tamaño siendo más largos los huevos normales y más anchos y con una mayor área los huevos 76

adicionales, lo que sugiere no solo una modulación de la puesta de huevos si no también una modulación del tamaño del huevo. El costo para los parasitoides puede ser alto en V. violacea en comparación con R. insignis ya que en V. violacea existe una menor cantidad de huevos que son cubiertos con el cuerpo de la madre casi en su totalidad lo que sugiere una mayor protección. Dada la gran extinción de insectos en los últimos años debido a las actividades humanas, incluidas el cambio climático, es importante desarrollar estudios que nos permitan dar un vistazo a la historia natural de diversos insectos. La mayoría de los estudios en insectos se han enfocado a plagas o vectores de enfermedades, pero existe un sinfín de otras especies igual de valiosas para nuestro planeta. En este sentido, esta tesis brinda información sobre la gran diversidad de comportamientos maternales como la oviposición estratégica y de defensa ante parásitos. En un futuro se sugiere continuar con estudios sobre cómo distintos factores como la dieta, así como la cantidad de rivales, entre otros factores, pueden modular el comportamiento estratégico de oviposición en las hembras. Algo interesante desde el punto de vista de cómo los diferentes factores influyen en la sobrevivencia de la descendencia y en la reproducción, y de cómo las diferentes especies interactúan unas con otras, como es que sucede esta competencia y que tanto se ven afectadas las diferentes especies por la influencia de la interacción.

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