Παραγωγή Και Απομόνωση Αντιμικροβιακών Ουσιών Από Το Ακτινοβακτήριο Microbacterium Resistens ( ZKA15 )

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΤΟΜΕΑΣ ΒΟΤΑΝΙΚΗΣ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Παραγωγή και απομόνωση αντιμικροβιακών ουσιών από το ακτινοβακτήριο Microbacterium resistens ( ZKA15 )

ΕΛΕΝΗ ΛΙΑΝΟΥ

Α.Μ.: 1113201300069

Επιβλέπων Καθηγητής: Δημήτρης Γ. Χατζηνικολάου

Αθήνα, 2017

Ευχαριστίες

Σε όλη τη διάρκεια των πειραμάτων σημαντικό ρόλο έπαιξε η συμβολή του κυρίου Δ.Χατζηνικολάου με την παροχή γνώσεων και κατευθυντήριων γραμμών. Βέβαια, η βοήθεια της υποψήφιας διδάκτορος Δάφνης Γεωργιάδου ήταν πολύτιμη, με τη συνεχή στήριξη και τη βοήθεια τόσο σε πειραματικό όσο και σε ψυχολογικό τομέα. Γενικότερα, υπήρξε άριστη συνεργασία με όλα τα μέλη του εργαστηρίου, τα οποία ευχαριστώ για τις πολύωρες αναμονές που είχαμε μαζί στο εργαστήριο!

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ...... 3

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ...... 6

1.1. Περίληψη ...... 7

1.2. Αbstract ...... 8

1.3. Γενικά περί μικροοργανισμών...... 9

1.4. Βιοτεχνολογική σημασία ακτινοβακτηρίων ...... 10

1.5. Αντιβιοτικά και τρόπος δράσης τους ...... 12

1.6. Βιοσύνθεση αντιβιοτικών από ακτινοβακτήρια ...... 14

1.7. Φυλογένεση του γένους Microbacterium ...... 16

1.8. Σκοπός της παρούσας μελέτης ...... 18

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ...... 19

2.1. Μικροοργανισμοί...... 20

2.2. Μέσα και συνθήκες καλλιέργειας ...... 21

2.3. Ταυτόχρονη ανάπτυξη μικροβακτηρίων και δεικτών ...... 22

2.4. Διερεύνηση βέλτιστων συνθηκών ανάπτυξης μικροβακτηρίου ΖΚΑ15 ...... 23 2.4.1. Έλεγχος βέλτιστου pH ...... 23 2.4.2. Έλεγχος βέλτιστης θερμοκρασίας ...... 23 2.4.3. Έλεγχος βέλτιστης πηγής άνθρακα ...... 24 2.4.4. Έλεγχος βέλτιστης πηγής αζώτου ...... 24 2.4.5. Έλεγχος ανθεκτικότητας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αλατότητας ...... 24

2.5. Έλεγχος ανάπτυξης του βακτηρίου ΖΚΑ15 υπό αναερόβιες συνθήκες ...... 25 2.5.1. Ποσοτικός προσδιορισμός αναγωγικών σακχάρων σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας ...... 25

2.5.2. Έλεγχος παραγωγής αιθανόλη σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας ...... 25

2.6. Δοκιμή ανθεκτικότητας του στελέχους ΖΚΑ15 σε διάφορα αντιβιοτικά ...... 27

2.7. Απομόνωση και καθαρισμός αντιμικροβιακής ουσίας από το στέλεχος ΖΚΑ15 .... 27 2.7.1. Συλλογή και συμπύκνωση αντιμικροβιακής ουσίας ...... 27 2.7.2. Διαχωρισμός ουσιών υπερκείμενων δειγμάτων με χρωματογραφικές τεχνικές ...... 28 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε PD-10 στήλη με Sephadex G-25 για αφαλάτωση του δείγματος ...... 28 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε μεγαλύτερη στήλη με Sephadex G-25 για κλασμάτωση του δείγματος ...... 30 Σύγκριση του δείγματος με πρότυπα πρωτεϊνικά μόρια ...... 33 2.7.4. Τεχνικές διαχωρισμού και συμπύκνωσης ...... 34 Υπερδιήθηση ...... 34 2.7.5. Μέθοδος Bradford ...... 35

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ...... 36

3.1. Θρεπτικά υποστρώματα και συνθήκες ανάπτυξης ...... 37

3.2. Διερεύνηση παραγωγής αντιμικροβιακών ενώσεων από τα μικροβακτήρια ...... 43

3.3. Καμπύλη αύξησης στελέχους ΖΚΑ15 σε διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης ...... 48 3.3.1. Έλεγχος βέλτιστου pH ...... 48 3.3.2. Έλεγχος βέλτιστης θερμοκρασίας ...... 49 3.3.3. Έλεγχος βέλτιστης πηγής άνθρακα ...... 51 3.3.4. Έλεγχος βέλτιστης πηγής αζώτου ...... 52 3.3.5. Έλεγχος ανθεκτικότητας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αλατότητας ...... 52

3.4. Έλεγχος ανάπτυξης του βακτηρίου ΖΚΑ15 υπό αναερόβιες συνθήκες ...... 53 3.4.1. Ποσοτικός προσδιορισμός αναγωγικών σακχάρων σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας ...... 54 3.4.2. Έλεγχος παραγωγής αιθανόλη σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας ...... 55

3.5. Δοκιμή ανθεκτικότητας του στελέχους ΖΚΑ15 σε διάφορα αντιβιοτικά ...... 56

3.6. Απομόνωση και καθαρισμός αντιμικροβιακής ουσίας από το στέλεχος ΖΚΑ15 .... 57 3.6.1. Συλλογή και συμπύκνωση αντιμικροβιακής ουσίας ...... 57 3.6.2. Διαχωρισμός ουσιών υπερκείμενων δειγμάτων με χρωματογραφικές τεχνικές ...... 60 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε PD-10 στήλη με Sephadex G-25 για αφαλάτωση του δείγματος ...... 60 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε μεγαλύτερη στήλη με Sephadex G-25 για κλασμάτωση του δείγματος ...... 62

Σύγκριση του δείγματος με πρότυπα πρωτεϊνικά μόρια ...... 63 3.7.3. Τεχνικές διαχωρισμού και συμπύκνωσης ...... 64 Υπερδιήθηση ...... 64 3.7.4. Μέθοδος Bradford ...... 65

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ – ΣΥΖΗΤΗΣΗ ...... 66

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ...... 70

Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή

1.1. Περίληψη Η μελέτη των ακτινοβακτηρίων είναι σημαντική λόγω παραγωγής βιοενεργών ουσιών με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον, όπως τα αντιβιοτικά. Έτσι, σκοπός της μελέτης των μικροβακτηρίων είναι η ανίχνευση παραγωγής αντιμικροβιακών ενώσεων. Μελετήθηκαν συνολικά 7 στελέχη του γένους Microbacterium, από τα οποία το στέλεχος ΖΚΑ15, που ύστερα από ανάλυση 16S rRNA βρέθηκε να ανήκει στο είδος Microbacterium resistens, παρήγαγε ζώνη αναστολής με ταυτόχρονη ανάπτυξή του με τους μικροοργανισμούς – δείκτες Bacillus subtilis (DSM 10), Micrococcus luteus (DSM 1790), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Pseudomonas fluorescens (DSM 50090), Acinetobacter radioresistens (DSM 6976), Escherichia coli (NEB DH5a), Aspergillus niger (DSM 1957), Aspergillus nidulans (DSM 820), Fusarium oxysporum (DSM 62059), Saccharomyces cerevisiae (DSM 70449), Cyberlindera Saturnus Minter. Το στέλεχος ΖΚΑ15 μελετήθηκε διεξοδικά προκειμένου να προσδιοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξής του ως προς διάφορες θρεπτικές πηγές και συνθήκες επώασης. Προσδιορίστηκε το βέλτιστο pH, η βέλτιστη θερμοκρασία επώασης, οι βέλτιστες πηγές αζώτου και άνθρακα, η ανοχή σε διαφορετικές συνθήκες αλατότητας, η ανάπτυξη υπό αναερόβιες συνθήκες. Ύστερα από τον χαρακτηρισμό της φυσιολογίας του ΖΚΑ15 έγιναν πειράματα που αποδεικνύουν την παραγωγή αντιμικροβιακής ουσίας, όταν αυτό αναπτύσσεται σε ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα. Η αντιμικροβιακή ουσία απομονώθηκε από υπερκείμενα υγρών καλλιεργειών του στελέχους ΖΚΑ15 σε ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα, στην εκθετική φάση ανάπτυξης που παρατηρήθηκε ανασταλτική ικανότητα έναντι του Bacillus subtilis (DSM 10). Στη συνέχεια και αφού τα υπερκείμενα υπέστησαν συμπύκνωση, έγιναν προσπάθειες καθαρισμού αυτής της ουσίας με τη βοήθεια χρωματογραφικών τεχνικών. Χρησιμοποιήθηκε η στήλη PD-10 με Sephadex G-25 για μοριακή διήθηση και διαχωρισμό, ενώ με χρήση μεγαλύτερης στήλης με το ίδιο μέσο, έγινε κλασμάτωση της ουσίας και προσδιορίστηκε το κλάσμα που περιέχει την αντιμικροβιακή ένωση. Τέλος, με τη βοήθεια πρότυπων πρωτεϊνικών μορίων καθώς και την τεχνική της υπερδιήθησης, βρέθηκε ότι το μοριακό βάρος της αντιμικροβιακής ουσίας είναι εντός των ορίων 3.000daltons και 12.000daltons.

ΛΕΞΕΙΣ – ΚΛΕΙΔΙΑ:

μικροβακτήριο, μικροοργανισμοί-δείκτες, αντιβιοτικό, ζώνη αναστολής, ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα

1.2. Αbstract The study of Actinobacteria is important due to the production of bioactive substances, including antibiotics, with biotechnological interest. The purpose of this study is to test the antimicrobial activity of seven strains belonging to the genus of Microbacterium. Strain ZKA15, belonging to the Microbacterium resistens species based on 16S rRNA analysis, produced an inhibition zone with its simultaneous growth with microorganisms-indicators. The ZKA15 strain was extensively studied so as the optimal conditions of its growth could be defined. The optimal pH, temperature, nitrogen and carbon sources, the tolerance of different salinity conditions and the growth under anaerobic conditions were defined. Cultivation of the ZKA 15 strain in liquid minimal medium and collection of the supernatant at different time points revealed that the antimicrobial substance with an inhibitory effect against Bacillus subtilis (DSM 10) is produced during exponential growth phase. After the supernatant had been subject to concentration, attempts of isolating the antimicrobial substance with the aid of chromatographic techniques were made. A PD-10 column with Sephadex G-25 was used for molecular infiltration and separation. After using a bigger column with the same medium, a fractionation of the substance was achieved and the fraction that contains the antimicrobial compound was defined. Ultimately, with the aid of model protein compounds as well as the technique of ultrafiltration, it was found that the molecular weight of the antimicrobial substance is within the limits of 3000 daltons and 12000 daltons.

KEYWORDS:

Microbacterium, microorganisms-indicators, antibiotic, inhibition zone, minimal medium

1.3. Γενικά περί μικροοργανισμών Εδώ και εκατομμύρια χρόνια το ανθρώπινο είδος μαζί με άλλα ζωντανά όντα κυριαρχούσαν στη Γη. Η επιβίωση, όμως, όλων αυτών των ειδών εξαρτάται κυρίως από μικροοργανισμούς. Οι μικροοργανισμοί αποτελούν ένα σημαντικά μεγάλο ποσοστό στη Γη, που μάλιστα ξεπερνούν αριθμητικά κατά πολύ όλους τους υπόλοιπους ζωντανούς οργανισμούς. Βρίσκονται ακόμη και μέσα στο ανθρώπινο σώμα και μάλιστα ο πληθυσμός τους υπερβαίνει τον πληθυσμό των ανθρώπινων κυττάρων. Συμμετέχουν σε διάφορα γεγονότα που λαμβάνουν μέρος στο ανθρώπινο σώμα, όπως είναι η διαδικασία της πέψης. Οι μικροοργανισμοί απαρτίζονται από τις ομάδες των βακτηρίων, των μυκήτων, των ζυμών και των ιών, αν αυτοί θεωρηθούν ζωντανά οργανισμοί (εικόνα 1.1.). Διακρίνονται σε προκαρυώτες, όταν δεν υπάρχει πυρήνας, ευκαρυώτες, με πυρήνα, και σε αρχαία, τα οποία συνήθως ζουν σε ακραία περιβάλλονται. Διακρίνονται, επιπλέον, σε αυτούς που πολλαπλασιάζονται ανεξάρτητα και εκείνους που απαιτούν την ύπαρξη άλλων οργανισμών για να επιβιώσουν και να πολλαπλασιαστούν. Αναπτύσσουν, έτσι, σχέσεις συμβίωσης με άλλους οργανισμούς. Άλλοι μικροοργανισμοί απαιτούν όξινα περιβάλλοντα για να αναπτυχθούν (οξεόφιλοι) ενώ άλλοι ουδέτερα (ουδετερόφιλοι) ή αλκαλικά (αλκαλόφιλοι). Άλλοι, πάλι, ζουν σε πολύ θερμά περιβάλλοντα (θερμόφιλοι) ή πολύ ψυχρά (ψυχρόφιλοι), ενώ μερικοί είναι αερόβιοι και κάποιοι άλλοι αναερόβιοι ή δυνητικά αναερόβιοι. Ακόμη, ποικίλουν σε μέγεθος και το εύρος του μήκους τους κυμαίνεται από 100nm έως 1mm. Πέραν, όμως, του μεγέθους, υπάρχει μεγάλη διαφορετικότητα και σε άλλα χαρακτηριστικά, φυσιολογικά ή μορφολογικά. Έτσι, έγινε ταυτοποίηση του μεγέθους διαφοροποίησης των μικροοργανισμών, μέσω ανάλυσης DNA και κυρίως του 16S rRNA, που είναι συντηρημένο μεταξύ των ειδών (Batt, 2016).

Εικόνα 1.1. Φυλογενετικό δέντρο (Rokas & Carroll, 2006)

Όσον αφορά στην προσφορά των μικροοργανισμών στο περιβάλλον, πολλοί έχουν το ρόλο του αποικοδομητή, συμβάλλοντας στην ανακύκλωση της νεκρής οργανικής ύλης προς ανόργανη. Συμμετέχουν, έτσι, στη βιοαποικοδόμηση πολλών νεκρών οργανισμών, τα τελικά προϊόντα της οποίας είναι ανόργανες ενώσεις, για παράδειγμα του άνθρακα ή του θείου, που προσλαμβάνονται στη συνέχεια από παραγωγούς του οικοσυστήματος και μετατρέπονται σε οργανικές, κυρίως μέσω της διαδικασίας της φωτοσύνθεσης. Με άλλα λόγια, οι μικροοργανισμοί είναι υπεύθυνοι για την εξασφάλιση της κυκλικής ροής της ύλης, καθιστώντας δυνατή τη συνέχιση της ζωής (Emadian, Onay, & Demirel, 2017). Στη βιομηχανία τροφίμων, κύριο λόγο φέρουν και πάλι οι μικροοργανισμοί. Το κρασί και η μπύρα είναι αποτέλεσμα διαδοχικών αλκοολικών ζυμώσεων. Τα αρτοπαρασκευάσματα απαιτούν την ύπαρξη ζύμης για την παρασκευή τους, τη λεγόμενη μαγιά, ενώ η γαλακτική ζύμωση οδηγεί στην παρασκευή του γιαουρτιού. Όλοι οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε συγκεκριμένα θρεπτικά υποστρώματα, γεγονός που πολλές φορές οδηγεί στη διάκριση των μικροοργανισμών. Τα συστατικά του θρεπτικού υποστρώματος είναι αυτά που θα συμβάλλουν στην ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Πολλές φορές βέβαια ο μικροοργανισμός πρέπει να συνθέσει από μόνος του κάποια στοιχεία που δεν απαντώνται στα θρεπτικά και είναι απαραίτητα για την επιβίωσή του. Μέσω πρωτογενούς μεταβολισμού παράγονται οι πρωτογενείς μεταβολίτες, όπως λιπίδια, πρωτεϊνικά μόρια, πολυσακχαρίτες. Σε ορισμένες περιπτώσεις οι μικροοργανισμοί συνθέτουν και δευτερογενείς μεταβολίτες. Ο δευτερογενής μεταβολισμός ενεργοποιείται ως απόκριση σε κάποια στρεσογόνα κατάσταση, όπως είναι η έλλειψη θρεπτικού υλικού, και σε άλλες μη ακόμη γνωστές συνθήκες. Δευτερογενείς μεταβολίτες παράγονται από πολύπλοκα βιοσυνθετικά μονοπάτια και είναι τα αντιβιοτικά, που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών, προσδίδοντας οικολογικό πλεονέκτημα στους παραγωγούς τους, βιταμίνες, πτητικές ενώσεις που απαντώνται στις τροφές και στα αρώματα δίνοντας χαρακτηριστική οσμή, κιτρικό οξύ και άλλα (Spatafora & Bushley, 2015).

1.4. Βιοτεχνολογική σημασία ακτινοβακτηρίων Τα ακτινοβακτήρια απαρτίζουν μια από τις μεγαλύτερες φυλογενετικές ομάδες μεταξύ των βακτηρίων και εκπροσωπούνται από gram-θετικά βακτήρια, με υψηλό G+C ποσοστό στο DNA τους. Αυτή η ομάδα βακτηρίων περιλαμβάνει μικροοργανισμούς με ευρύ φάσμα μορφολογιών και μεταβλητά φυσιολογικά και μεταβολικά μονοπάτια. Επιπλέον, τα ακτινοβακτήρια έχουν υιοθετήσει πολλούς διαφορετικούς τρόπους διαβίωσης. Έτσι, μπορεί να είναι παθογόνοι μικροοργανισμοί, όπως Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Tropheryma, Propionibacterium, εδαφικοί μικροοργανισμοί, όπως Streptomyces, φυτικά παράσιτα, όπως Leifsonia ή συμβιώτες του γαστρεντερικού συστήματος, όπως Bifidobacterium. Η απόκλιση των ακτινοβακτηρίων από τα υπόλοιπα βακτήρια έγινε πριν πολλά χρόνια, κάτι που σημαίνει πως τα συγκεκριμένα βακτήρια διακρίνονται από χαρακτηριστικές απομορφίες. Για το λόγο αυτό, άλλα βακτήρια μπορούν εύκολα να χαρακτηρισθούν ως φυλογενετικά συγγενικά είδη, βάσει αυτών των απομορφών (Ventura et al., 2007).

Όσον αφορά στο γενετικό υλικό του φύλου των ακτινοβακτηρίων, μπορεί να είναι κυκλικό (Mycobacterium, Corynebacterium) ή γραμμικό (Streptomyces), με το μέγεθος του γονιδιώματος να κυμαίνεται μεταξύ 0,9Mb και 12Mb. Ο διαχωρισμός των διαφορετικών ταξινομικών ομάδων ακτινοβακτηρίων έχει επιτευχθεί βάσει αλληλούχισης του 16S rRNA (εικόνα 1.2.), αν και η αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος είναι αυτή που μπορεί να δώσει έναν ξεκάθαρο διαχωρισμό (Verma et al., 2013). Τα ακτινοβακτήρια, λόγω των μεταβλητών ενδιαιτημάτων που μπορούν να αποικίσουν, έχουν και ανάλογο μεταβλητό γονιδίωμα. Έτσι, ανάλογα τις σχέσεις που αναπτύσσουν με άλλους μικροοργανισμούς αλλά και της εξελικτικής πίεσης που ασκείται λόγω περιβαλλοντικών αλλαγών, το γονιδίωμά τους μπορεί να μεταβληθεί στο χρόνο και είδη που είναι πολύ συγγενικά να φέρουν διαφοροποιήσεις. Για το λόγο αυτό, μόνο μια γονιδιωματική αλληλούχιση μπορεί να παρουσιάσει τις ξεκάθαρες φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των βακτηρίων αυτών.

Εικόνα 1.2. Η κλάση Actinobacteria : φυλογενετικές σχέσεις ανάμεσα σε τάξεις, υποτάξεις και οικογένειες βάσει στοιχείων ανάλυσης του 16S rRNA (Ludwig et al., 2012)

Τα ακτινοβακτήρια καταλαμβάνουν πολλά διαφορετικά και ποικίλα ενδιαιτήματα. Έτσι, απαντώνται σε θαλάσσια ή εδαφικά οικοσυστήματα, σε συνθήκες υψηλής αλατότητας, σε υψηλές θερμοκρασίες, σε μεγάλα βάθη και γενικά σε ακραία περιβάλλοντα. Οι περισσότεροι από αυτούς τους μικροοργανισμούς είναι σαπροφυτικοί κοσμοπολίτικοι που απαντώνται κυρίως στο έδαφος σε μεγάλους πληθυσμούς. Έχουν ικανότητα αποικοδόμησης μεγάλου αριθμού και ποικιλίας οργανικών υποστρωμάτων, ενώ είναι εξαιρετικά σημαντικοί στις διαδικασίες ανοργανοποίησης του οργανικού υλικού. Λόγω των ολοένα μεταβαλλόμενων συνθηκών επιβίωσης, τα βακτήρια αυτά ενεργοποίησαν πολύπλοκα βιοσυνθετικά μονοπάτια παραγωγής κάποιων μορίων, που συμβάλλουν στην διαβίωσή τους και στην άμυνα έναντι άλλων οργανισμών. Ο δευτερογενής μεταβολισμός, όπως ονομάζεται, οδηγεί στην παραγωγή βιοενεργών ουσιών. Οι ουσίες αυτές μπορεί να είναι αντιβιοτικά, ενζυμικοί αναστολείς, μετασχηματισμένα στεροειδή, όπως ισομεράση της γλυκόζης. Ακόμη, άλλοι μεταβολίτες των ακτινοβακτηρίων χρησιμοποιούνται ως εντομοκτόνα, παρασιτοκτόνα ή αντικαρκινικοί παράγοντες και κάποιοι άλλοι έχουν ικανότητα αποικοδόμησης αλειφατικών και αρωματικών υδρογονανθράκων. Η μικροβιακή βιοτεχνολογία χρησιμοποιεί αυτούς τους μεταβολίτες στο χώρο της υγείας, της γεωργίας και της βιομηχανίας. Βιοδραστικοί μικροοργανισμοί έχουν απομονωθεί από χερσαία και υδάτινα οικοσυστήματα καθώς και από κλινικά δείγματα. Η βιοδραστικότητα των μικροοργανισμών του εδάφους είναι γνωστή. Οι οργανισμοί αυτοί λόγω εξελικτικής πίεσης παράγουν αντιμικροβιακές ουσίες που επιτρέπουν την επιβίωσή τους. Περισσότερα από 120 ισχυρά αντιβιοτικά (καναμυκίνη, γενταμικύνη, κυκλοσπορίνη Α, αδριαμικύνη) προέρχονται από τέτοιου είδους βακτήρια ή μύκητες (Gupta, Tuohy, Lohani, & O’Donovan, 2015).

1.5. Αντιβιοτικά και τρόπος δράσης τους

Όσον αφορά στα αντιβιοτικά, στόχος τους είναι η πορεία βιοσύνθεσης κυτταρικού τοιχώματος (πενικιλίνη, κεφαλοσπορίνες, καρβαπενέμες, μονοβακτάμες, κυκλοσερίνη, φωσφομυκίνη, γλυκοπεπτίδια, λιπογλυκοπεπτίδια), η πρωτεϊνική σύνθεση, κυρίως οι υπομονάδες 30S και 50S του ριβοσώματος (αμινογλυκοσιδάσες, τετρακυκλίνες (υπομονάδα 30S) και οξαζολιδινόνες, μακρολίδια, θειοπεπτίδια, χλωραμφενικόλη, φουσιδικό οξύ, κλινταμικύνη (υπομονάδα 50S)), η αντιγραφή του DNA και η επιδιόρθωση, στοχεύοντας στην DNA γυράση και RNA πολυμεράση (ριφαμικύνες, ανσαμικύνες, ακτινομυκίνες, τιακινομυκίνες (RNA πολυμεράση) και φλουροκινόλες, αμινοκουμαρίνες (DNA γυράση)), ο μεταβολισμός του φολικού οξέος (σουλφοναμίδες, τριμεθοπρίμη), η δομή των μεμβρανών (λιποπεπτίδια, πολυμιξίνες) (εικόνα 1.3.).

Εικόνα 1.3. Στόχοι των αντιβιοτικών μετά από είσοδό τους στο κύτταρο (Zampieri, Zimmermann, Claassen, & Sauer, 2017)

Η δράση των αντιβιοτικών είναι είτε βακτηριοκτόνος, δηλαδή προκαλούν θάνατο του βακτηρίου – στόχου, είτε βακτηριοστατική, όπου δεν νεκρώνουν το βακτήριο – στόχο απλώς αναστέλλουν την ανάπτυξή του. Το γεγονός ότι πολλά αντιμικροβιακά φάρμακα είναι βακτηριοστατικά, εντείνει το πρόβλημα της δημιουργίας ανθεκτικών στελεχών σε διάφορα αντιβιοτικά (B’Bhatt & Sharma, 2017). Όλα τα αντιβιοτικά έχουν βελτιωθεί ώστε να ανθίστανται στην ολοένα αυξανόμενη ανθεκτικότητα των βακτηρίων έναντι αντιβιοτικών. Ωστόσο, αρκετά βακτήρια εξακολουθούν να είναι ανθεκτικά σε αντιβιοτικά. Οι μηχανισμοί ανθεκτικότητας αφορούν στην ενζυμική αδρανοποίηση του αντιβιοτικού (ένζυμα β-λακταμάσες υδρολύουν β-λακταμικούς δεσμούς σε αντιβιοτικά όπως πενικιλίνη, κεφαλοσπορίνη και βρίσκονται κυρίως σε gram-αρνητικά βακτήρια), στην απέκκριση του αντιβιοτικού μέσω ενεργοποίησης πρωτεϊνικών διαύλων (στα βακτήρια P. aeruginosa και Acinetobacter spp.), στη μείωση πρόσληψης αντιβιοτικού μέσω αλλαγών στη διαπερατότητα της εξωκυτταρικής μεμβράνης (αυτές οι αλλαγές καθυστερούν την είσοδο του αντιβιοτικού), στην τροποποίηση του στόχου του αντιβιοτικού (αυτές οι αλλαγές μειώνουν ή καταστρέφουν την αποδοτικότητα σύνδεσης του αντιβιοτικού και συνεπώς οριοθετούν την δραστικότητά του) (εικόνα 1.4.) (González-Bello, 2017).

Εικόνα 1.4. Σχηματική αναπαράσταση του βασικού βακτηριακού μηχανισμού ανοχής σε αντιβιοτικά (Walsh, 2000)

1.6. Βιοσύνθεση αντιβιοτικών από ακτινοβακτήρια Τα ακτινοβακτήρια, όπως περιγράφηκε σε προηγούμενη ενότητα (§ 1.3.), περιέχουν αρκετά πολυπαραγωγά στελέχη μικροβιακών δευτερογενών μεταβολιτών. Η πλειονότητα αυτών των μεταβολιτών έχει ενδιαφέρουσες βιολογικές δραστηριότητες και χρησιμοποιούνται στην ιατρική, στη γεωργία και τη βιομηχανία. Ωστόσο, σε αρκετές περιπτώσεις, τα φυσικά συντεθειμένα μόρια είναι λιγότερο χρήσιμα από τα χημικά μόρια. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα νέα αναγνωρισμένα αντιβιοτικά έχουν μικρότερη απόδοση, δηλαδή ενώ για ένα συγκεκριμένο αντιβιοτικό απαιτούνται ποσότητες της τάξεως g/l, ένα φυσικό στέλεχος μπορεί να παράγει φυσιολογικά ποσότητες της τάξεως mg/l. Για να ξεπεραστεί το πρόβλημα αυτό, εφαρμόζονται κάποιες προσεγγίσεις, όπως επαναλαμβανόμενοι κύκλοι μεταλλαγών και επιλογής καθώς επίσης και βελτιωμένες συνθήκες καλλιέργειας. Η πρόοδος στη γονιδιωματική έρευνα και στην ανάλυση μονοπατιών δευτερογενών μεταβολιτών, καθώς και οι τεχνολογίες της Συνθετικής Βιολογίας, που ήδη έχουν εφαρμοστεί επιτυχώς σε αρκετά βακτήρια, προσφέρει εναλλακτικές προσεγγίσεις για την αύξηση απόδοσης παραγωγής μεταβολιτών. Τα τελευταία χρόνια, έχουν χαρακτηρισθεί περισσότερα από 100 βιοσυνθετικά μονοπάτια αντιβιοτικών. Αυτό οδήγησε σε μια καθολική γνώση του γενικού πρωτοκόλλου αυτών των βιοσυνθέσεων και σε μια τεράστια συλλογή από ένζυμα που συμμετέχουν σε όλους τους τύπους χημικών μετατροπών. Επιπρόσθετα, περισσότερα από 20 πλήρως αλληλουχημένα γονιδιώματα και αρκετές εκατοντάδες μερικώς αλληλουχημένα γονιδιώματα έχουν συγκεντρωθεί σε βάσεις δεδομένων (National Center for Biotechnology Information, NCBI). Αυτά τα δεδομένα γονιδίων μπορούν να μελετηθούν για τη συμμετοχή τους σε βιοσυνθετικά μονοπάτια αντιβιοτικών και εν συνεχεία να απομονωθούν. Ακόμη, με ετερόλογη έκφραση είναι δυνατό να δημιουργηθούν καινοτόμοι συνδυασμοί νέων μονοπατιών και έτσι να γίνει βιοσύνθεση καινούριων αντιβιοτικών (εικόνα 1.5.) (Wohlleben et al., 2012).

Εικόνα 1.5. Σχηματική αναπαράσταση συμβολής Συνθετικής Βιολογίας στην αύξηση απόδοσης αντιβιοτικών. (Α) Παραγωγή αντιβιοτικού από δευτερογενή μεταβολισμό. (Β) Με είσοδο τροποποιημένων μορίων δημιουργούνται καινούριοι δευτερογενείς μεταβολίτες και παράγονται τροποποιημένα αντιβιοτικά τα οποία (Γ) οδηγούν σε αύξηση απόδοσης παραγωγής αντιβιοτικών.

Όσον αφορά στην ανίχνευση παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών, ορισμένες από τις βιβλιογραφικά προτεινόμενες μεθόδους ανίχνευσης βιοδραστικών ουσιών από μικροοργανισμούς είναι εξής: Α. Μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας από πηγαδάκια (Well Diffusion Assay). Σε τρυβλίο με θρεπτικό υλικό ενοφθαλμίζεται εναιώρημα του μικροοργανισμού-δείκτη. Αυτή η μέθοδος εφαρμόστηκε στην παρούσα ερευνητική εργασία. Β. Μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υλικό (Agar Diffusion Assay). Ακολουθείται η ίδια διαδικασία όπως και στην προηγούμενη μέθοδο με τη διαφορά ότι αντί για δημιουργία μικρών οπών τοποθετούνται τμήματα αποικιών από τον μικροοργανισμό που ερευνάται για παραγωγή βιοδραστικών ουσιών. Γ. Μέθοδος κάθετου ενοφθαλμισμού του μικροοργανισμού-δείκτη (Cross streak method). Μεμονωμένη αποικία του υπό εξέταση μικροοργανισμού ενοφθαλμίζεται κάθετα σε τρυβλίο και επωάζεται σε κατάλληλες συνθήκες. Όταν αναπτυχθεί, ενοφθαλμίζεται κάθετα στην αρχική ανάπτυξη του μικροοργανισμού ο μικροοργανισμός-δείκτης. Δ. Μέθοδος κάθετου ενοφθαλμισμού για μύκητες (Cross streak method). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται όταν ο μικροοργανισμός-δείκτης αναπτύσσεται τείνοντας να καλύψει όλη την επιφάνεια του τρυβλίου (όπως υφομύκητες). Αρχικά, στο τρυβλίο αναπτύσσεται ο μικροοργανισμός που εξετάζεται για παραγωγή αντιβιοτικού. Όταν έχουν σχηματιστεί σπόρια, υποβάλλεται σε ακτινοβολία UV για 10 λεπτά και στη συνέχεια αντιδιαμετρικά καλλιεργείται ο μικροοργανισμός δείκτης. Ε. Μέθοδος με εφαρμογή ELISA. Ο μικροοργανισμός δείκτης είναι διαλυμένος σε εναιώρημα όπου η συγκέντρωση του δείγματος μπορεί να καθοριστεί. Οι μέθοδοι αραίωσης μπορούν να αυτοματοποιηθούν και να χρησιμοποιηθούν πλάκες μικροτιτλοδότησης τύπου ELISA

(microtiter plates) 96, 384 ή 1536 θέσεων. Στα κελιά της πλάκας τοποθετείται το υπό εξέταση στέλεχος και ο μικροοργανισμός-δείκτης μαζί με κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα. Το δείγμα φωτομετρείται και υπολογίζεται η συγκέντρωση. ΣΤ. Μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα – ποσοτική μέθοδος. Σύμφωνα με αυτή τη μέθοδο, η βιοενεργή ουσία απομονώνεται και τοποθετείται συγκεκριμένη ποσότητα σε δισκία από διηθητικό χαρτί διαμέτρου 6 mm. Σε τρυβλίο ενοφθαλμίζεται εναιώρημα του μικροοργανισμού-δείκτη πυκνότητας 0,5 κλίμακας MacFarland (108 cfu/ml) και τοποθετούνται τα δισκία με τη βιοενεργή ουσία. Ζ. Μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα – ποιοτική μέθοδος. Συνοπτικά, σε θρεπτικό υπόστρωμα εμβολιάζονται αποικίες του μικροοργανισμού που εξετάζεται για την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών και επωάζονται μέχρι να σχηματιστούν αποικίες. Στη συνεχεία αναστέλλεται η ανάπτυξή τους με υπεριώδη ακτινοβολία και γίνεται επικάλυψη με εναιώρημα του μικροοργανισμού δείκτη αραιωμένο σε θρεπτικό υπόστρωμα (Balouiri, Sadiki, & Ibnsouda, 2016). Η παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών εξαρτάται από τη σύσταση των θρεπτικών υλικών (ανάλογα με την πηγή, π.χ. γλυκόζη ή γλυκερόλη, ακολουθείται συγκεκριμένη βιοχημική οδό), το ρυθμό ανάπτυξης του μικροοργανισμού και την επαγωγή ή καταστολή ενζύμων που συμμετέχουν στη μεταβολική οδό βιοσύνθεσής τους. Οι υπεύθυνες συνθετάσες κωδικοποιούνται στο χρωμοσωμικό DNA (λιγότερο συχνά στο πλασμιδιακό) υπό τη μορφή συνεργιώματος (οπερονίου). Σε αντίθεση με τους πρωτογενείς μεταβολίτες, δεν έχει μελετηθεί πλήρως η βιοσύνθεση των δευτερογενών μεταβολιτών (Compounds, 2014). Στην παραγωγή των αντιβιοτικών είναι δύσκολη η επιλογή αναλογίας άνθρακα/αζώτου/φωσφόρου (C/N/P) στο θρεπτικό υπόστρωμα ζύμωσης. Οι ζυμώσεις γίνονται συνήθως κάτω από συνθήκες περιορισμένης συγκέντρωσης αζώτου ή φωσφόρου και υπάρχει παροχή οξυγόνου στην καλλιέργεια. Τα ακτινοβακτήρια απαιτούν κατά την αύξησή τους σίδηρο (Fe) και ψευδάργυρο (Zn) για την παραγωγή των αντιβιοτικών.

1.7. Φυλογένεση του γένους Microbacterium Τα μέλη του γένους Microbacterium χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη Ν-γλυκολικών καταλοίπων στο κυτταρικό τους τοίχωμα καθώς και από το υψηλό ποσοστό (>60% w/v ) αναλογίας G+C στο γενωμικό τους υλικό. Αναφορικά με τη δομή πεπτιδογλυκάνης, μερικά μικροβακτήρια χαρακτηρίζονται από την παρουσία L-διαμινικού οξέως, L-λυσίνης και γλυκίνης στα ενδιάμεσα πεπτίδια – γέφυρες των κυτταρικών τοιχωμάτων (πεπτιδογλυκάνη τύπου Β1). Από την άλλη, μερικά είδη του γένους Aureobacterium χαρακτηρίζονται από την παρουσία D-διαμινικού οξέως, D-ορνιθίνης και γλυκίνης στα ενδιάμεσα πεπτίδια – γέφυρες των κυτταρικών τοιχωμάτων (πεπτιδογλυκάνη τύπου Β2). Τα είδη του γένους Aureobacterium χαρακτηρίζονται και αυτά από την ύπαρξη Ν-γλυκολικών καταλοίπων στο κυτταρικό τους τοίχωμα καθώς και από το υψηλό ποσοστό (>60% w/v ) αναλογίας G+C στο γενωμικό τους υλικό. Οι διαφορές των διαμινικών οξέων και των δομών πεπτιδογλυκάνης (πεπτιδογλυκάνη τύπου Β1 ή Β2) είναι χρήσιμα κριτήρια ταξινόμησης σε επίπεδο γένους. Τα γένη Aureobacterium και Microbacterium ανήκουν φυλογενετικά σε ακτινοβακτήρια με πεπτιδογλυκάνη τύπου Β. Η τοποθέτηση των γενών αυτών στα ακτινοβακτήρια ενισχύεται από

ανάλυση του 16S rRNA τους. Μετά από αλληλούχιση ολόκληρων γονιδιωμάτων κάποιων ειδών από τα 2 παραπάνω γένη, φάνηκε πως έχουν ομοιότητα που αγγίζει το 99% w/v . Για το λόγο αυτό θεωρήθηκε ότι τα δύο αυτά γένη αποτελούν ένα ενιαίο γένος (Takeuchi & Yokota, 1994).

Εικόνα 1.6. Φυλογενετικό δενδρόγραμμα βασισμένο σε ανάλυση αλληλουχίας 16S rRNA, όπου φαίνονται οι φυλογενετικές σχέσεις των ειδών του γένους Microbacterium (Takeuchi & Yokota, 1994).

Το εύρημα ότι μέλη από το γένος Microbacterium και Aureobacterium είναι φυλογενετικά αναμεμιγμένα, υποστηρίζεται από την παρουσία γενικών κοινών χαρακτηριστικών, όπως η μορφολογία, η δημιουργία ποικιλίας χρωστικών, ο οξειδωτικός μεταβολισμός, παραγωγή οξέων από συγκεκριμένους υδατάνθρακες, τα Ν-γλυκολικά κατάλοιπα στο σακχαρικό σκελετών των αμινοξέων και η παρουσία γλυκίνης στα εσωτερικά πεπτίδια-γέφυρες των πεπτιδογλυκανών. Διαφορές στα μέλη των δύο γενών βασίζονται στον τύπο και τις παραλλαγές της πεπτιδογλυκάνης και στην παρουσία πολικών λιπιδίων. Στο γένος Microbacterium περιλαμβάνονται Gram-θετικά βακτήρια της οικογένειας Microbacteriaceae, που κατατάσσονται στο φύλο Actinobacteria. Είδη του γένους Microbacterium έχουν απομονωθεί από το περιβάλλον, από αγρωστώδη φυτά και από ανθρώπινα κλινικά δείγματα. Τα κύτταρα του γένους είναι μη σποριογόνα και ραβδόμορφα. Αναπτύσσονται υπό αερόβιες συνθήκες. Σε στερεή καλλιέργεια οι αποικίες αποκτούν κυκλική μορφή και είναι ελαφρώς κυρτές. Το χρώμα είναι υπόλευκο ενώ σε παλαιότερες καλλιέργειες γίνεται πιο σκούρο (Behrendt, Ulrich, & Schumann, 2001).

Τα είδη μικροβακτηρίων που εξετάσθηκαν στην παρούσα ερευνητική εργασία είναι τα Microbacterium resistens, Microbacterium thalassium, Microbacterium sp, Microbacterium pumilum, Microbacterium trichothecenolyticum, Microbacterium esteraromaticum. Από αυτά, το είδος Microbacterium resistens μελετήθηκε εκτενέστερα. Όσον αφορά στο είδος Microbacterium resistens, συναντάται και με την ονομασία Aureobacterium resistens. Ονομάστηκε έτσι λόγω της ανθεκτικότητάς του στο αντιβιοτικό vancomycin, ένα καθόλου συνηθισμένο φαινόμενο για τα πυρηνόμορφα βακτήρια του γένους του. Αντίθετα, είναι υπερευαίσθητο σε teicoplanin. Τα κύτταρά του είναι Gram-θετικά, μη σποριογόνα και πολύ μικρά σε μέγεθος (μήκος 1 έως 2 μm). Οι αποικίες του μετά από επώαση 24 ωρών έχουν διάμετρο περίπου 1,5mm, έχουν υπόλευκο έως κίτρινο χρώμα και καμπύλο σχήμα. Δίνουν θετική αντίδραση καταλάσης. Παράγεται οξύ από οξείδωση γλυκόζης, μαλτόζης και σουκρόζης, αλλά όχι από μαννιτόλη και ξυλόζη. Η δράση DNάσης είναι παρούσα στα κύτταρα του είδους αυτού. Όσον αφορά στο κυτταρικό τοίχωμα, ως διαμινικό οξύ υπάρχει ορνιθίνη και η πεπτιδογλυκάνη είναι τύπου Β2 (Funke, Lawson, Nolte, Weiss, & Collins, 1998).

1.8. Σκοπός της παρούσας μελέτης Στόχος της διπλωματικής εργασίας είναι η ανίχνευση αντιμικροβιακών ενώσεων από βακτηριακά στελέχη του γένους Microbacterium ενάντια σε μικροοργανισμούς – δείκτες, με τελικό σκοπό την απομόνωσή τους και το χαρακτηρισμό τους.

Κεφάλαιο 2: Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Μικροοργανισμοί Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν για το σύνολο των πειραμάτων απομονώθηκαν από εδαφικά δείγματα της περιοχής Κεριού Ζακύνθου στα πλαίσια διδακτορικής διατριβής του εργαστηρίου. Με βάση την πιο κοντινή ομοιότητα της αλληλουχίας του 16S rRNA τα στελέχη αυτά ταυτοποιήθηκαν ως εξής:

 ZKA 15: Microbacterium resistens  ΖΚΑ 21: Microbacterium thalassium  ΖΚΑ 27: Microbacterium sp  ΖΚΑ 30: Microbacterium pumilum  ΖΚΑ 43: Microbacterium resistens  ΖΚΑ 46: Microbacterium trichothecenolyticum  ΖΚΑ 56: Microbacterium esteraromaticum

Ως μικροοργανισμοί – δείκτες χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω στελέχη:

Βακτήρια

 Bacillus subtilis (DSM 10)  Micrococcus luteus (DSM 1790)  Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442)  Pseudomonas fluorescens (DSM 50090)  Acinetobacter radioresistens (DSM 6976)  Escherichia coli (NEB DH5a)

Νηματοειδείς μύκητες

 Aspergillus niger (DSM 1957)  Aspergillus nidulans (DSM 820)  Fusarium oxysporum (DSM 62059)

Ζύμες

 Saccharomyces cerevisiae (DSM 70449)  Cyberlindera Saturnus Minter

2.2. Μέσα και συνθήκες καλλιέργειας Στην συγκεκριμένη πειραματική ενότητα διερευνήθηκε η ικανότητα των μικροοργανισμών να αναπτύσσονται σε διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα. Για την ανάπτυξη των βακτηριακών στελεχών χρησιμοποιήθηκε διαφορετικό θρεπτικό υπόστρωμα από αυτό των μυκήτων και των ζυμών. Ακόμη χρησιμοποιήθηκε ελάχιστο θρεπτικό μέσο (Minimal Medium M9) για την ανάπτυξη τόσο των βακτηριακών στελεχών όσο και των μυκήτων και ζυμών. Τα μικροβακτήρια αναπτύχθηκαν και σε θρεπτικό μέσο κατάλληλο για στρεπτομύκητες (θρεπτικό υπόστρωμα τρυπτόνης και αλάτων TGS και θρεπτικό υπόστρωμα αργινίνης και αλάτων AGS). Όσον αφορά στις συνθήκες κάθε καλλιέργειας, αυτές ρυθμίστηκαν ώστε να είναι οι βέλτιστες για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Σε κάθε θρεπτικό υπόστρωμα έγινε ρύθμιση του pH. Έτσι, για τα βακτήρια ρυθμίστηκε στο 6,5-7 και για μύκητες/ζύμες στο 5-5,5. Επιπλέον, ρυθμίστηκε η θερμοκρασία επώασης στους 30οC ή 37οC. Όλα τα θρεπτικά αποστειρώνονται σε θερμοκρασία 121 oC και σε πίεση 1 atm για 20 λεπτά. Τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν απαρτίζονται από συγκεκριμένα συστατικά στοιχεία. Έτσι, για το Nutrient Agar (NA), ένα γενικού τύπου θρεπτικό υπόστρωμα βακτηρίων, απαιτούνται 8 g/L Nutrient Broth (ΝΒ) και 15 g/L Agar (ATCC, 2010). Για το Potato Dextrose Agar (PDA), ένα θρεπτικό υπόστρωμα μυκήτων, απαιτούνται 24 g/L Potato Dextrose Broth και 15 g/L Agar (Use & Use, 1938). Ακόμη, για τους μύκητες χρησιμοποιήθηκε και Malt Extract Agar (MEA) 50 g/L (ATCC, 2011). Για θρεπτικό υπόστρωμα τρυπτόνης ή αργινίνης και αλάτων (Tryptone or Arginine, Glucose Αgar – TGS or AGS), που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη βακτηρίων, απαιτούνται 12,5 g/L γλυκερόλης,

1 g/L αργινίνη (για AGS) ή 5 g/L τρυπτόνη (για TGS), 1 g/L K2HPO4, 1 g/L NaCl, 0,5 g/L . MgSO4 7H2O, 15 g/L Agar και προσθήκη ασηπτικά στο τέλος στοκ αλάτων 10x ( 0,1 g/L . . . . Fe2(SO4)3 6H2O, 0,01 g/L CuSO4 5H2O, 0,01 g/L ZnSO4 7H2O, 0,01 g/L MnSO4 H2O). Πριν την αποστείρωση ρυθμίζεται το pH στο 7. Το ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα Μ9 αποτελείται από μια σειρά αλάτων, όπου προστίθενται ιχνοστοιχεία και βιταμίνες. Έτσι, για διάλυμα M9 Salts (Taylor et al, 2012),

χρησιμοποιήθηκαν 6 g/L Na2HPO4 (άνυδρο), 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 1g/L NH4Cl, που . αποτέλεσαν το στοκ Α και 0,011 g/L CaCl2, 0,246 g/L MgSO4 7H2O, που αποτέλεσαν το στοκ Β. Οι ποσότητες προσαρμόστηκαν σε συγκέντρωση 10x. Η σύσταση του διαλύματος

ιχνοστοιχείων συγκέντρωσης 1000x είναι η εξής: 5,2 g/L Na2-EDTA, 2.100 mg/L . . . FeSO4 7H2O, 30 mg/L H3BO3, 100 mg/L MnCl2 4H2O, 190 mg/L CoCl2 6H2O, 24 mg/L . . . . NiCl2 6H2O, 29 mg/L CuCl2 5H2O, 144 mg/L ZnSO4 7H2O, 36 mg/L Na2MoO4 2H2O. Η σύσταση του διαλύματος βιταμινών συγκέντρωσης 1000x είναι η εξής: 50 mg/L vitB12, 50 mg/L PABA, 10 mg/L D(+)biotin, 100 mg/L nicotinate, 25 mg/L Ca-D(+)Panthothenoete, 250 mg/L Pyridoxamin-dinydrochloride, 50 mg/L Thiamin dinydrochloride. Στο ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα Μ9 προστίθεται η εκάστοτε πηγή άνθρακα σε συγκέντρωση 1 g/L. Το πρωτόκολλο είναι το εξής: (15 g/L Agar, 100ml στοκ Α 10x)/L, (100ml στοκ Β 10x)/L, (1ml διαλύματος ιχνοστοιχείων 1000x)/L, (1ml διαλύματος βιταμινών 1000x)/L, 1 g/L γλυκόζη (για διάλυμα συγκέντρωσης 0,1% w/v) ή 10 g/L γλυκόζη (για διάλυμα συγκέντρωσης 1% w/v). Το στοκ Β, τα ιχνοστοιχεία και οι βιταμίνες προστίθενται

ασηπτικά στο τέλος της αποστείρωσης στη φιάλη και η γλυκόζη ως θερμοευαίσθητη αποστειρώνεται χωριστά ως σκόνη.

Μεθοδολογία παρασκευής stock γλυκερόλης Για τα βακτηριακά στελέχη αρχικά έγινε γραμμική επίστρωση σε τρυβλία με πλήρες θρεπτικό υπόστρωμα ΝΑ και από εκεί απομονώθηκε μονήρης αποικία, η οποία ανακαλλιεργήθηκε σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα ΝΒ. Το ίζημα της καλλιέργειας αναδιαλύθηκε σε διάλυμα 20% w/v γλυκερόλης και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία -20οC. Για τις ζύμες ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία, με τη διαφορά ότι το θρεπτικό υπόστρωμα ήταν PDA και η τελική αναδιάλυση έγινε σε διάλυμα 50% w/v γλυκερόλης και 50% w/v Phosphate Buffered Saline (PBS) συγκέντρωσης 9,6 g/L. Για τους μύκητες εγχύθηκε σε τρυβλία με πλήρες θρεπτικό υπόστρωμα ΝΒ ποσότητα αποστειρωμένου ισοτονικού διαλύματος 50% w/v γλυκερόλης και 50% w/v PBS. Συλλέχθηκε ποσότητα με σπόρια του μύκητα σε αποστειρωμένο eppendorf. Το eppendorf τοποθετήθηκε σε θερμοκρασία -20οC.

2.3. Ταυτόχρονη ανάπτυξη μικροβακτηρίων και δεικτών Η καλλιέργεια σε ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα συνήθως προκαλεί στο μικροοργανισμό ένα είδος stress, που τον οδηγεί στην παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών. Έτσι, έγινε έλεγχος αυτής της παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών μέσω ταυτόχρονης καλλιέργειας μικροβακτηρίου και μικροοργανισμού – δείκτη. Αρχικά, σε τρυβλίο με ελάχιστο θρεπτικό Μ9 (2,5 ή 0,25 g/L γλυκόζη) επιστρώθηκαν 100μl μικροοργανισμού – δείκτη. Στη συνέχεια, ακολουθήθηκε η μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας από πηγαδάκια (Well Diffusion Assay), όπου σε τρυβλίο με θρεπτικό υλικό ενοφθαλμίζεται εναιώρημα του μικροοργανισμού-δείκτη. Αναλυτικότερα, με ειδικό φελλοτρυπητήρα διανοίχθηκαν μικρά πηγαδάκια στο θρεπτικό, μέσα στα οποία προστέθηκαν 20μl μικροβακτηρίου από stock γλυκερόλης. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία 30οC. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε και για τρυβλίο με θρεπτικό υπόστρωμα ΝΑ, AGS, TGS. Μια άλλη μέθοδος που ακολουθήθηκε ήταν η μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υλικό (Agar Diffusion Assay). Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως και στην προηγούμενη μέθοδο με τη διαφορά ότι αντί για δημιουργία μικρών οπών τοποθετούνται τμήματα αποικιών από τον μικροοργανισμό που ερευνάται για παραγωγή βιοδραστικών ουσιών. Τοποθετήθηκε ποσότητα μικροβακτηρίου με μορφή σταγόνας από stock γλυκερόλης σε τρυβλίο με ελάχιστο θρεπτικό Μ9 (1 ή 10 g/L γλυκόζη) που είχε επιστρωθεί ο μικροοργανισμός – δείκτης. Εφαρμόστηκε ακόμη η μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα-ποιοτική μέθοδος ή τεχνική sloppy agar, όπου η σύσταση για ΝΑ είναι 10,5 g/L agar και 8 g/L ΝΒ. Στην περίπτωση δεικτών ζυμών και μυκήτων η σύσταση για PDA είναι 10,5 g/L agar και 24 g/L PDB. Το θρεπτικό εμβολιάστηκε με ποσότητα από υγρή καλλιέργεια του δείκτη (η θερμοκρασία πρέπει να είναι περίπου 40οC δηλαδή στο όριο λίγο πριν αρχίσει να πήζει το θρεπτικό). Η αναλογία εμβολίου και όγκου θρεπτικού sloppy agar ήταν 1μl υγρής καλλιέργειας δείκτη ανά 1ml θρεπτικού sloppy agar (1-1 όγκοι). Όμως, υγρές καλλιέργειες παρασκευάστηκαν μόνο για βακτηριακούς δείκτες και για ζύμες – δείκτες. Για τους μύκητες –

δείκτες χρησιμοποιήθηκε τρυβλίο, όπου το μικκύλιο διαποτίστηκε με ισοτονικό διάλυμα PBS ώστε να συλλεχθούν τα σπόρια του μύκητα. Η ποσότητα που εμβολιάστηκε σε θρεπτικό PDA sloppy agar ακολουθεί τον κανόνα 1-1. Μετά τον εμβολιασμό του θρεπτικού και την καλή ανάδευση, με αποστειρωμένη πιπέτα επιστρώθηκε μικρή ποσότητα σε κάθε τρυβλίο με την λεπτή στρώση θρεπτικού και το μικροβακτήριο. Η πρώτη λεπτή στρώση περιελάμβανε το μικροβακτήριο καλλιεργούμενο σε θρεπτικό υπόστρωμα NA ή TGS ή ελάχιστο θρεπτικό Μ9 με 0,1% w/v γλυκόζη, και η δεύτερη στρώση ονομάζεται sloppy agar και περιείχε διαλυμένο το μικροοργανισμό δείκτη. Τα τρυβλία επωάστηκαν σε θερμοκρασία 30 οC ή 37 οC, ανάλογα τις συνθήκες ανάπτυξης του μικροοργανισμού δείκτη.

2.4. Διερεύνηση βέλτιστων συνθηκών ανάπτυξης μικροβακτηρίου ΖΚΑ15 Για το μικροβακτήριο που θα μελετηθεί ως προς την παραγωγή αντιμικροβιακών ενώσεων δεν έχει γίνει κάποιος χαρακτηρισμός ως προς τις βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης. Στις επόμενες παραγράφους παρουσιάζονται αναλυτικά οι πειραματικές διαδικασίες για την εύρεση αυτών των συνθηκών.

2.4.1. Έλεγχος βέλτιστου pH Το στέλεχος ΖΚΑ15 αναπτύχθηκε σε υγρές καλλιέργειες με θρεπτικό υπόστρωμα Μ9 και συγκέντρωση γλυκόζης 0,36% w/v (20Mm). Για τη ρύθμιση του pH έγινε κάθε φορά προσαρμογή στα φωσφορικά ισοδύναμα της βασικής σύστασης του ελάχιστου θρεπτικού Μ9, χωρίς να μεταβάλλεται η συνολική συγκέντρωση φωσφορικών. Σε κάθε κωνική φιάλη προστέθηκε εναιώρημα του βακτηρίου ΖΚΑ15 διαλυμένο σε ισοτονικό διάλυμα PBS. Υπολογίστηκε η ποσότητα του εμβολίου ώστε η αρχική οπτική πυκνότητα να είναι 0,2. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία 30oC με ανάδευση στις 100 στροφές/min. Κάθε 2 ώρες λαμβανόταν δείγμα για μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (OD). Για κάθε συνθήκη πραγματοποιηθήκαν 2 επαναλήψεις. Για τον υπολογισμό της ξηρής βιομάζας η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Σε προζυγισμένο eppendorf τοποθετήθηκε 1ml από την υγρή καλλιέργεια (από συγκεκριμένη χρονική στιγμή, στην οποία ήταν γνωστή η OD). Έγινε φυγοκέντρηση σε 10.000 rpm για 5min. Απορρίφθηκε το υπερκείμενο και το eppendorf με το ίζημα τοποθετήθηκε για ξήρανση στους 60oC για 16 ώρες. Μετά την ξήρανση ζυγίστηκε το eppendorf με το αποξηραμένο ίζημα και υπολογίστηκε το καθαρό ξηρό βάρος σε mg/ml. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για τον υπολογισμό ξηρής βιομάζας και από τα τρία διαφορετικά pH σε 2 διαφορετικές χρονικές στιγμές.

2.4.2. Έλεγχος βέλτιστης θερμοκρασίας Το στέλεχος ΖΚΑ15 αναπτύχθηκε σε υγρές καλλιέργειες με θρεπτικό υπόστρωμα Μ9, συγκέντρωση γλυκόζης 0,36% w/v και pH=7. Οι θερμοκρασίες που εξετάστηκαν είναι 25οC, 30οC, 35οC, 40οC. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία 30oC με ανάδευση στις 100 στροφές/min και. Κάθε 2 ώρες λαμβανόταν δείγμα για μέτρηση της OD και στις τέσσερις διαφορετικές

θερμοκρασίες καλλιέργειας. Η ξηρή βιομάζα υπολογίστηκε σε 2 διαφορετικές χρονικές στιγμές. Για κάθε συνθήκη πραγματοποιηθήκαν 2 επαναλήψεις.

2.4.3. Έλεγχος βέλτιστης πηγής άνθρακα Το υγρό θρεπτικό υπόστρωμα ανάπτυξης του στελέχους ήταν το ελάχιστο θρεπτικό Μ9, με συγκέντρωση γλυκόζης 0,36% w/v, pH=7 και θερμοκρασία 30οC. Ωστόσο το θρεπτικό υπόστρωμα προσαρμόστηκε κάθε φορά ώστε η πηγή άνθρακα που θα αντικαταστήσει τη γλυκόζη να έχει συγκέντρωση 30mM. Οι πηγές άνθρακα που εξετάσθηκαν είναι: Μονοσακχαρίτες: φρουκτόζη, ξυλόζη, μανόζη, ραμνόζη, αραβινόζη, γαλακτόζη, γλυκόζη Δισακχαρίτες: μαλτόζη, μελιβιόζη, τρεχαλόζη, σελοβιόζη, λακτόζη, σακχαρόζη Τρισακχαρίτες: ραφινόζη Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία 30oC με ανάδευση στις 100 στροφές/min. Κάθε 2 ώρες λαμβανόταν δείγμα για μέτρηση της OD. Για κάθε πηγή άνθρακα πραγματοποιηθήκαν δυο επαναλήψεις.

2.4.4. Έλεγχος βέλτιστης πηγής αζώτου Το στέλεχος ΖΚΑ15 αναπτύχθηκε σε υγρές καλλιέργειες με θρεπτικό υπόστρωμα Μ9, συγκέντρωση γλυκόζης 30mM και pH=7. Ωστόσο το θρεπτικό υπόστρωμα προσαρμόστηκε κάθε φορά ώστε τα ισοδύναμα αζώτου σε κάθε περίπτωση να είναι ίσα με αυτά του βασικού

θρεπτικού Μ9. Εξετάσθηκαν οι εξής πηγές αζώτου: NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4, KNO3, NaNO3, CH4N2O (ουρία), yeast extract. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία 30oC με ανάδευση στις 100 στροφές/min. Κάθε 2 ώρες λαμβανόταν δείγμα για μέτρηση της OD. Για κάθε πηγή αζώτου πραγματοποιηθήκαν δυο επαναλήψεις.

2.4.5. Έλεγχος ανθεκτικότητας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αλατότητας Το υγρό θρεπτικό υπόστρωμα ανάπτυξης του στελέχους ήταν το ελάχιστο θρεπτικό Μ9, με συγκέντρωση γλυκόζης 30mM και pH=7. Αυτό που μεταβάλλεται ως προς τη βασική σύσταση του ελάχιστου θρεπτικού Μ9 είναι η συγκέντρωση του NaCl. Έτσι, ελέγχονται οι παρακάτω συγκεντρώσεις αλατότητας: 0% w/v NaCl, 0,5% w/v NaCl, 1% w/v NaCl, 1,5% w/v NaCl, 2% w/v NaCl, 2,5% w/v NaCl, 3% w/v NaCl, 3,5% w/v NaCl, 4% w/v NaCl, 4,5% w/v NaCl, 5% w/v NaCl. Η επώαση έγινε σε θερμοκρασία 30oC με ανάδευση στις 100 στροφές/min. Κάθε 2 ώρες λαμβανόταν δείγμα για μέτρηση της OD Για κάθε συγκέντρωση άλατος έγιναν δυο επαναλήψεις καλλιεργειών.

2.5. Έλεγχος ανάπτυξης του βακτηρίου ΖΚΑ15 υπό αναερόβιες συνθήκες Στην συγκεκριμένη πειραματική ενότητα ελέγχθηκε εάν ο μικροοργανισμός ΖΚΑ15 είναι αναερόβιος, δυνητικά αναερόβιος ή αερόβιος. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε ειδική φιάλη αναερόβιας ζύμωσης που κλείνει αεροστεγώς με πώμα, στην κορυφή του οποίου διανοίχθηκε μικρή τρύπα με ακροφύσιο πιπέτας, το οποίο θα παραμείνει εκεί καθ’ όλη τη διάρκεια της ζύμωσης. Μέσα στο ακροφύσιο τοποθετήθηκε ένα μικρό κομμάτι από βαμβάκι, που αφήνει όμως να διαπεράσουν μόρια αέρα από την φιάλη προς τα έξω. Η ανάπτυξη του ΖΚΑ15 έγινε σε ελάχιστο υγρό θρεπτικό υπόστρωμα M9 με pH=7 και θερμοκρασία 30οC, σε τρεις διαφορετικές πηγές άνθρακα συγκέντρωσης 50mM, με 2 σειρές επαναλήψεων η καθεμιά. Οι πηγές άνθρακα που εξετάστηκαν ήταν η γλυκόζη, η ξυλόζη, η σελοβιόζη. Σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές λαμβανόταν δείγμα από όλες τις καλλιέργειες

προκειμένου να βρεθεί η OD και έτσι να υπολογισθεί η σχετική αύξηση του μικροβακτηρίου σε διάρκεια έξι ημερών.

2.5.1. Ποσοτικός προσδιορισμός αναγωγικών σακχάρων σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας Μέσω της μεθόδου DNS (δινιτρο-σαλικυλικού-οξέως) έγινε ποσοτικός προσδιορισμός των αναγωγικών σακχάρων (αναγωγή DNA από το ημι-ακεταλικό-ΟΗ των σακχάρων). Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη της ποσότητας αναγωγικού σακχάρου και η απορρόφηση γίνεται στα 540nm. Στη μέθοδο αυτή τηρείται ο κανόνας 1-1-8, όπου για έναν όγκο δείγματος σακχάρου προστίθεται ένας όγκος διαλύματος DNS και οκτώ όγκοι νερού. Τα τελικά αποτελέσματα συγκρίνονται με μια πρότυπη καμπύλη αναφοράς συγκέντρωσης σακχάρου ως

προς την απορρόφηση, η οποία έχει τη μορφή C(g/L)=κλίση*Α540. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: Από τις καλλιέργειες της αναερόβιας ζύμωσης έγινε δειγματοληψία σε δύο διαφορετικές χρονικές στιγμές προκειμένου να γίνει σύγκριση της ποσότητας αναγωγικών σακχάρων. Συγκεκριμένα, δείγμα 1ml από την 4η μέρα καλλιέργειας και 1ml από την 6η μέρα καλλιέργειας, φυγοκεντρήθηκε για 6-8 min στις 10.000rpm και απομονώθηκε το υπερκείμενο. Στα υπερκείμενα προστέθηκε ίση ποσότητα DNS. Ως τυφλό χρησιμοποιήθηκε αποσταγμένο νερό, στο οποίο προστέθηκε ίση ποσότητα DNS. Τα δείγματα επωάσθηκαν στους 100οC για 5min. Μετά το βρασμό και προκειμένου να τηρηθεί ο κανόνας 1-1-8, σε όλα τα δείγματα προστέθηκαν 8 όγκοι αποσταγμένου νερού και έγινε φωτομέτρηση στα 540nm.

2.5.2. Έλεγχος παραγωγής αιθανόλη σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας Η αέρια χρωματογραφία (Gas chromatography, GC) αναπτύχθηκε ως αναλυτική τεχνική για την ανάλυση πτητικών ουσιών σε τρόφιμα, φάρμακα, προϊόντα πετρελαίου κ.λπ. και κυρίως την ανίχνευση αιθανόλης στα δείγματα (εικόνα 2.1.).

Εικόνα 2.1. Η διάταξη ενός αέριου χρωματογράφου. Στην περίπτωση της αναερόβιας ζύμωσης, λήφθηκε δείγμα από την έκτη μέρα καλλιέργειας του ΖΚΑ15 σε γλυκόζη, ξυλόζη, σελοβιόζη, φυγοκεντρήθηκε και το υπερκείμενο επεξεργάστηκε στον αέριο χρωματογράφο, προκειμένου να ανιχνευθεί τυχόν παραγωγικότητα σε αιθανόλη. Το δείγμα είχε όγκο 1μL και εισήχθη στο ρεύμα του φέροντος αερίου στην αρχή της στήλης με μια μικροσύριγγα. Κατά την πορεία του δείγματος στη στήλη, τα συστατικά του συμπαρασύρονται από το φέρον αέριο κατά μήκος της στήλης και διαχωρίζονται (εικόνα 2.2.). Η επιλογή του φέροντος αερίου εξαρτάται κυρίως από τον τύπο του ανιχνευτή που

χρησιμοποιείται. Το φέρον αέριο (συνήθως Ν2, Ηe, H2, Ar) από τη φιάλη υψηλής πίεσης, μέσα από ρυθμιστές παροχής, οδηγείται στη στήλη. Στη συγκεκριμένη πειραματική διάταξη ως φέρον αέριο χρησιμοποιήθηκε το Ηe. H ταχύτητα και η ικανότητα του διαχωρισμού εξαρτώνται από τη θερμοκρασία. Για αυτό το λόγο η στήλη βρίσκεται σε φούρνο, του οποίου η θερμοκρασία ελέγχεται αυστηρά. Η στήλη αποτελείται από έναν επιμήκη σωλήνα, συνήθως με τη μορφή σπειράματος ή U, ώστε να καταλαμβάνει κατά το δυνατόν μικρότερο χώρο.

Εικόνα 2.2. Απεικόνιση της πορείας του δείγματος στη στήλη. Διακρίνονται η υγρή φάση, που αποτελείται από το δείγμα, και η αέρια φάση, που αποτελείται από το φέρον αέριο.

Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται εξαιτίας των διαφόρων δυνάμεων συγκράτησης και έκλουσης ανάμεσα στα συστατικά του μίγματος, το υλικό πλήρωσης της στήλης και της ροής του φέροντος αερίου. Το δεύτερο μέρος του χρωματογράφου περιλαμβάνει τον ανιχνευτή, ο οποίος τοποθετείται στο τέλος της στήλης. Τα σήματα ενισχύονται και καταγράφονται στο καταγραφικό σύστημα. Τα αποτελέσματα που καταγράφονται αντιστοιχούν στο εμβαδόν που ορίζουν οι κορυφές. Για την σύγκριση των αποτελεσμάτων κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη αναφοράς της αιθανόλης, όπου οι περιοχές των κορυφών αντιστοιχίζονται σε ποσότητα αιθανόλης (Eiceman, 2006).

2.6. Δοκιμή ανθεκτικότητας του στελέχους ΖΚΑ15 σε διάφορα αντιβιοτικά Στη συγκεκριμένη πειραματική ενότητα ελέγχθηκε η ικανότητα ανάπτυξης του ΖΚΑ15 παρουσία 17 διαφορετικών αντιβιοτικών. Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: Penicillin-G (Benzylpenicillin), Streptomycin sulfate, Chloramphenicol, Nystatin Dihydrate, Terramycin w/Polymyxin, Gentamycin sulfate, Erythromycin, Rifampicin, Ampicillin, Kanamycin disulfate salt from streptomyces Kanamyceticus, Lincomycin, Clindamycin, Viomycin, Oleandomycin, Gertemycin, Spectinomycin, Novobiocin. Για κάθε αντιβιοτικό παρασκευάστηκε διάλυμα με τελική συγκέντρωση 0,01 mg/ml. Σε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα NA επιστρώθηκαν 100μl stock γλυκερόλης από το βακτήριο ΖΚΑ15 και σε μικρά πηγαδάκια που διανοίχθηκαν ενοφθαλμίστηκε εναιώρημα 50μl από τα αντιβιοτικά. Τα τρυβλία επωάστηκαν σε θερμοκρασία 30oC και ύστερα από 24 ώρες επώασης ελέγχθηκε η αναστολή ανάπτυξης του μικροοργανισμού.

2.7. Απομόνωση και καθαρισμός αντιμικροβιακής ουσίας από το στέλεχος ΖΚΑ15

2.7.1. Συλλογή και συμπύκνωση αντιμικροβιακής ουσίας Αρχικά, το στέλεχος ΖΚΑ15 αναπτύχθηκε σε υγρή καλλιέργεια με ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα Μ9 και συγκέντρωση γλυκόζης 20mM (3,6 g/L), pH=7 και θερμοκρασία 30οC.

Υπολογίστηκε η αρχική οπτική πυκνότητα OD και συλλέχθηκαν δείγματα από την καλλιέργεια σε τρεις χρονικές στιγμές ως εξής: o στις 4ώρες από την έναρξη της ζύμωσης, όπου OD=0,170, συλλέχθηκαν 10ml από την

καλλιέργεια (t1) o στις 6ώρες από την έναρξη της ζύμωσης, όπου OD=0,338, συλλέχθηκαν 30ml από την

καλλιέργεια (t2) o στις 7ώρες από την έναρξη της ζύμωσης, όπου OD=0,489, συλλέχθηκαν 100ml από

την καλλιέργεια (t3) Οι παραπάνω ποσότητες φυγοκεντρήθηκαν για 20min στις 4.000rpm και το υπερκείμενο τοποθετήθηκε στον υπερκαταψύκτη σε θερμοκρασία -80οC σε μεγάλα ποτήρια ζέσεως, ώστε να μην ξεπερνά το 1cm το πάχος του υπερκείμενου. Η ψύξη διήρκησε 16 ώρες. Στη συνέχεια τα ποτήρια ζέσεως τοποθετήθηκαν στο λυοφιλιωτή. Ο λυοφιλιωτής αποτελείται

από ένα θάλαμο με σταθερή πίεση, ο οποίος συνδέεται με αντλίες κενού και είναι εφοδιασμένος με ένα σύστημα ψύξης. Πρόκειται για μια μέθοδο ξήρανσης που βασίζεται στην εξάτμιση του νερού σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες και εφαρμόζεται στην επεξεργασία ουσιών που διασπώνται ή αλλοιώνονται εύκολα με τη θέρμανση (Nireesha et al., 2013). Στη λυοφιλίωση η ξήρανση πραγματοποιείται με απευθείας μετατροπή του νερού από τη στερεή κατάσταση του πάγου στην κατάσταση του ατμού, χωρίς την μεσολάβηση υγρής κατάστασης, γίνεται δηλαδή εξάχνωση. Οι παράγοντες που ενεργούν ώστε να διατηρούνται σχεδόν αναλλοίωτα τα χημικά και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των ξηραινόμενων ουσιών είναι η χαμηλή θερμοκρασία, οι συνθήκες του υψηλού κενού και η απευθείας εξάχνωση του νερού (Nireesha et al., 2013). Από τα συμπυκνωμένα δείγματα, ενοφθαλμίστηκαν 50μl σε μικρά πηγαδάκια που διανοίχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα ΝΑ με επιστρωμένο δείκτη Bacillus subtilis και σε 24 ώρες έγινε παρατήρηση.

2.7.2. Διαχωρισμός ουσιών υπερκείμενων δειγμάτων με χρωματογραφικές τεχνικές Στη συγκεκριμένη πειραματική ενότητα ακολουθήθηκε χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε PD-10 στήλη με Sephadex G-25 για αφαλάτωση του δείγματος και χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε μεγαλύτερη στήλη με Sephadex G-25 για κλασμάτωση του δείγματος. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με πρότυπα πρωτεϊνικά μόρια.

Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε PD-10 στήλη με Sephadex G-25 για αφαλάτωση του δείγματος Ο πρωταρχικός σκοπός της χρωματογραφίας μοριακής διήθησης είναι ο ταχύς διαχωρισμός μορίων ανάλογα με το μέγεθος. Η χρωματογραφία μοριακής διήθησης είναι μια χρωματογραφία στήλης με στερεή στατική φάση (gel) και υγρή κινητή φάση (υδατικό ή άλλο διάλυμα οργανικής ουσίας). Τα gels έχουν πολύ ανοιχτά τρισδιάστατα επίπεδα πλέγματα, που σχηματίζονται με διασταυρούμενους συνδυασμούς από μεγάλες αλυσίδες. Τα περισσότερα από αυτά τα gels, έχουν πολικές ομάδες ικανές να προσροφούν νερό η άλλους πολικούς διαλύτες. Μερικά επίσης από αυτά είναι ικανά να προσροφούν και μη πολικούς διαλύτες. Σε κάθε περίπτωση, η προσρόφηση αποτελεί άνοιγμα της δομής ή διόγκωση και δημιουργεί διάκενα μέσα στο gel. Αυτά τα διάκενα ή οπές έχουν κάποιο συγκεκριμένο εύρος διαμέτρων. Ανάλογα με την έκταση των διασταυρούμενων δεσμών του gel υπάρχει ένα οριακό μέγεθος (exclusion limit) για το μόριο, που μπορεί να εισχωρήσει στο gel. Τα μεγαλύτερα μόρια διέρχονται από τη στήλη δίχως να επιβραδύνονται, γιατί δεν μπορούν να εισχωρήσουν στο gel. Τα μικρότερα όμως μόρια, εισχωρούν στο gel κατά ένα βαθμό που προσδιορίζεται από το μέγεθος τους. Με κατάλληλη εκλογή του gel διαχωρίζονται μόρια που έχουν μοριακό βάρος από 1000 μέχρι μερικά εκατομμύρια daltons (Ó’Fágáin, Cummins, & O’Connor, 2017). Για τις πρωτεΐνες και τα περισσότερα μεγάλα μόρια βιοχημικού ενδιαφέροντος, το Sephadex είναι το πιο συνηθισμένο από τα gels. Τα Sephadex gels είναι αδιάλυτα στο νερό και είναι σταθερά στις βάσεις, στα ασθενή οξέα και στα ήπια αναγωγικά και οξειδωτικά μέσα. Η PD-10 στήλη με το συγκεκριμένο gel χρησιμοποιείται για αφαλάτωση του δείγματος (εικόνα 2.3.). Ένα από τα πιο κοινά προβλήματα διαχωρισμού στη βιοχημεία είναι η αφαίρεση αλάτων και μικρών μορίων από τα μακρομόρια. Με Sephadex G-25 ουσίες πού έχουν μοριακό βάρος

πάνω από 5.000 daltons, εκλούονται σ' έναν όγκο V0. Τα μικρότερα μόρια με μοριακό βάρος κάτω από 1000 daltons, θα εκλούονται μετά τα μακρομόρια με μια σειρά αντίστροφη με το μέγεθος τους (Μαργαρίτης, 2010).

Εικόνα 2.3. Παρουσίαση της λειτουργίας της στήλης PD-10. Περιγράφεται πώς τα μικρά μόρια εισχωρούν στις περισσότερες ¨οπές¨ του gel ενώ τα μεγάλα σε λίγες και κατά συνέπεια τα μεγάλα μόρια εξέρχονται πρώτα με το υγρό έκλουσης (1ο κλάσμα) και έπειτα τα μικρότερα (2ο κλάσμα).

Στην προκειμένη περίπτωση χρησιμοποιήθηκε ως δείγμα λυοφιλιωμένο υπερκείμενο από τις 7 ώρες καλλιέργειας (§2.9.1.). Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε για χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού σε PD-10 στήλη, είναι το εξής: o Σε έτοιμη στήλη γίνεται 4-5 φορές ξέπλυμα με αποσταγμένο νερό (δεν χρειάζεται εξισορρόπηση με κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα). o Στη συνέχεια προστίθενται 2,5 ml του δείγματος στην στήλη. Εάν η διαθέσιμη ποσότητα είναι λιγότερη από 2,5 ml, προστίθεται στο δείγμα τόσο ρυθμιστικό διάλυμα (στην προκειμένη αποσταγμένο νερό) ώστε να αραιωθεί έως τα 2,5 ml και έπειτα εισάγεται στην στήλη. o Αφού προσροφήσει η ρητίνη της στήλης όλη την ποσότητα, προστίθενται 3,5 ml αποσταγμένο νερό ενώ παράλληλα συλλέγονται τα πρώτα 3,5 ml που εκλούονται από τη στήλη. Αυτό αποτελεί το 1ο κλάσμα έκλουσης (πρωτεϊνικό κλάσμα). Τα 3,5 ml νερού που προστέθηκαν θα συμπαρασύρουν μόνο όσα μόρια δεν έχουν εισέλθει στους πόρους του gel και είναι >5000 daltons. o Κατόπιν προστίθενται 6ml αποσταγμένο νερό στη στήλη (η ρητίνη έχει όγκο προσρόφησης 6ml) και συγχρόνως συλλέγονται τα 6ml που θα εκλουσθούν. Αυτό αποτελεί το 2ο κλάσμα έκλουσης (μη πρωτεϊνικό κλάσμα των αλάτων και διαφόρων

μικρομορίων) που περιέχει όσα μόρια είχαν προσροφηθεί στους πόρους του gel (<5000 daltons) και εκλούονται σε δεύτερο χρόνο. o Η στήλη ξεπλένεται αρκετές φορές με αποσταγμένο νερό.

o Προστίθεται αζίδιο του νατρίου NaN3 προκειμένου να εξουδετερωθούν τυχόν επιμολύνσεις στη ρητίνη και η στήλη φυλάσσεται.

Και από τα δύο κλάσματα έγινε δοκιμή σε τρυβλίο με θρεπτικό υπόστρωμα ΝΑ, επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10) και ελέγχθηκε η ανασταλτική δράση των δύο κλασμάτων. Η επώαση έγινε σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 30οC. Στη συνέχεια έγινε κλασμάτωση του ίδιου δείγματος και πάλι σε στήλη PD-10, με την εξής διαδικασία: σε στήλη που έχουν προηγηθεί αρκετά ξεπλύματα με αποσταγμένο νερό, εισάγονται 2,5 ml του δείγματος και εν συνεχεία 3,5 ml αποσταγμένο νερό, όπως δηλαδή περιγράφεται παραπάνω. Αφού συλλεχθεί το 1ο κλάσμα των 3,5 ml, στην στήλη εισάγονται και πάλι 3,5ml αποσταγμένο νερό και όχι 6ml που υποδεικνύονται από το βασικό πρωτόκολλο αφαλάτωσης. Έτσι συλλέγεται και το 2ο κλάσμα των 3,5ml. Η ίδια διαδικασία συνεχίζεται έως ότου συγκεντρωθούν συνολικά 5 κλάσματα των 3,5 ml το καθένα. Και για τα πέντε κλάσματα έγινε δοκιμή σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10) και ελέγχθηκε η ανασταλτική δράση των πέντε κλασμάτων.

Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε μεγαλύτερη στήλη με Sephadex G-25 για κλασμάτωση του δείγματος Η συγκεκριμένη στήλη αποσκοπεί στον πλήρη διαχωρισμό ενός μείγματος από συγγενείς ενώσεις (όσον άφορα στο μοριακό βάρος). Η στήλη διαφέρει από μια PD-10 στήλη, μιας και έχει μεγαλύτερο μήκος, μικρότερη διάμετρο και σταθερή ροή που ρυθμίζεται από αντλία. Συγκεκριμένα, η διάταξη της χρωματογραφικής μηχανής συνίσταται από μια μακρόστενη στήλη, ένα δοχείο ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει το ρυθμιστικό διάλυμα της έκλουσης και είναι συνδεδεμένο με τη στήλη μέσω σωλήνων, μια περισταλτική αντλία που ρυθμίζει την ταχύτητα ροής του ρυθμιστικού διαλύματος διαμέσου της στήλης και έναν καταγραφέας UV (εικόνα 2.4.). Ένας ανιχνευτής – καταγραφέας υπεριώδους ακτινοβολίας που είναι προσαρμοσμένος στην έξοδο της στήλης επιτρέπει την άμεση ανίχνευση της ουσίας (στα 280 nm), κατά τη δίοδο και έκλουση των διαδοχικών κλασμάτων (εικόνα 2.5.). Το καταγεγραμμένο προφίλ του άκρου της στήλης αναπαριστά ένα χρωματογράφημα, που εξοικονομεί χρόνο στην ανάλυση, καθώς κάνει περιττή την προσπάθεια ελέγχου κάθε κλάσματος χωριστά για την ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση της πρωτεΐνης (Χρωματογραφία & Περίληψη, 1990).

Εικόνα 2.4. Κλασμάτωση δείγματος μέσω στήλης που ελέγχεται από περισταλτική αντλία. Τα κλάσματα συλλέγονται σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα.

Εικόνα 2.5. Χρωματογράφημα όπου φαίνεται η σειρά έκλουσης των μορίων ανάλογα το μοριακό τους βάρος. Πρώτα εκλούονται τα υψηλού μοριακού βάρους μόρια και ακολουθούν ενδιάμεσου μοριακού βάρους μόρια, καταλήγοντας σε μηδενική καταγραφή όπου δεν ανιχνεύονται μόρια.

Οι ψηλές, λεπτές χρωματογραφικές στήλες έχουν αργότερους ρυθμούς ροής από ότι κοντύτερες με μεγαλύτερες διαμέτρους. Ανάλογα, όμως, και με το χρησιμοποιούμενο υλικό, ο ρυθμός ροής αλλάζει. Σαν γενικός κανόνας, η ανάλυση (ποιότητα) μειώνεται με την αύξηση του ρυθμού ροής. Με αύξηση της διαμέτρου της στήλης αυξάνεται και ο ρυθμός ροής. Αν όμως ο ρυθμός ροής είναι πολύ μικρός, η διάχυση θα μειώσει την ανάλυση (εικόνα 2.6.).

Εικόνα 2.6. Σχέση ανάλυσης χρωματογραφίας και μεγέθους στήλης. (α) Με αύξηση του μήκους της στήλης ο ρυθμός ροής μειώνεται και η ανάλυση αυξάνεται. (β) Με αύξηση της διαμέτρου της στήλης ο ρυθμός ροής αυξάνεται και η ανάλυση μειώνεται.

Το ίδιο δείγμα που επεξεργάστηκε με τη στήλη PD-10, θα εισαχθεί στη μεγαλύτερη αυτή στήλη μοριακής διήθησης με Sephadex G-25 για κλασμάτωση. Αρχικά, έγινε εξισορρόπηση της ρητίνης για 16 ώρες με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που εισάγεται στη στήλη μέσω περισταλτικής αντλίας. Το ρυθμιστικό αυτό διάλυμα έχει pH=6,5. Αρχικά, . παρασκευάστηκε διάλυμα όξινων φωσφορικών NaH2PO4 2H2O ( C=20mM, V=0,9L ) με pH=4,7 και διάλυμα βασικών φωσφορικών Na2HPO4 ( C=20mM, V=0,3L ) με pH=8,7. Στο δοχείο των βασικών φωσφορικών προστέθηκε ποσότητα από τα όξινα φωσφορικά, τέτοια ώστε τελικό pH=6,5. Στη συνέχεια, εισήχθη 0,5ml δείγματος στη στήλη. Μετά την προσαρμογή της αντλίας συλλέγονταν σε σωληνάκια κάθε 3min τα κλάσματα. Από το περιεχόμενο των κλασμάτων ενοφθαλμίστηκε ένα μέρος σε μικρά πηγαδάκια που είχαν διανοιχθεί σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10), ώστε να ελεγχθεί η ανασταλτική τους δράση. Τα τρυβλία επωάστηκαν σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 30οC.

Σύγκριση του δείγματος με πρότυπα πρωτεϊνικά μόρια Η εκτίμηση του μοριακού βάρους της ουσίας έγινε από τον όγκο έκλουσής της αλλά και συναρτήσει μιας ομάδας πρωτεϊνών γνωστού μοριακού βάρους, που χρησιμοποιήθηκε ως ομάδα αναφοράς. Οι πρωτεΐνες αυτές προστέθηκαν στη στήλη μοριακής διήθησης και μετρήθηκε ο όγκος έκλουσης της καθεμιάς. Έτσι, κατασκευάστηκε η γραφική παράσταση του όγκου έκλουσης ως συνάρτηση του μοριακού βάρους (στην πραγματικότητα του δεκαδικού λογαρίθμου του μοριακού βάρους) που αποτελεί την πρότυπη καμπύλη αναφοράς. Στην ίδια στήλη προστέθηκε το δείγμα που επεξεργάστηκε και με PD-10 στήλη. Από τον όγκο έκλουσής του και από την πρότυπη καμπύλη αναφοράς εκτιμήθηκε το μοριακό βάρος του δείγματος. Όσον αφορά στους όγκους της στήλης ισχύει: Vt = Vo + Vb, όπου: Vt ο συνολικός όγκος της στήλης Vo ο νεκρός όγκος ή όγκος έκλουσης που αφήνεται ανάμεσα στα σφαιρίδια κατά το πακετάρισμα του υλικού. Ο όγκος αυτός καταλαμβάνεται από τον διαλύτη και συνιστά τον όγκο της κινητής φάσης στη στήλη. Αντίστοιχα, νεκρός χρόνος είναι ο χρόνος που χρειάζεται μια μη κατακρατούμενη ουσία (κινητή φάση) για να φτάσει στον ανιχνευτή. Vb ο συνολικός όγκος των σφαιριδίων του υλικού, δηλαδή ο όγκος της κινητής φάσης που χρειάζεται να διέλθει από τη στατική φάση για να εκλουσθεί μια ουσία. Όταν διάλυμα μιας ουσίας προστεθεί στη στήλη τότε ανάλογα με το μέγεθος των μορίων της αυτή κατανέμεται στο διαλύτη που βρίσκεται εντός και εκτός των σφαιριδίων σύμφωνα με έναν συντελεστή κατανομής, σ. Ισχύει σ=Cb/Co όπου Cb είναι η συγκέντρωση της ουσίας στους πόρους των σφαιριδίων και Co είναι η συγκέντρωση της ουσίας στον εξωτερικό διαλύτη. Όταν ένα μίγμα ουσιών προστίθεται σε μια στήλη, κάθε ουσία εκλούεται από τη στήλη σε διαφορετικό όγκο ανάλογα με τον συντελεστή κατανομής της (σ). Μια ουσία μεγάλου μοριακού βάρους με μέγεθος μεγαλύτερο από το μέγεθος των πόρων θα εκλουσθεί πολύ γρήγορα σε όγκο ίσο με τον όγκο Vo. Αντίθετα, μια ουσία μικρού μοριακού βάρους με μέγεθος μικρότερο από το μέγεθος των πόρων θα εισχωρήσει στους πόρους πολλών σφαιριδίων κατά την κίνηση της στη στήλη και θα εκλουσθεί πολύ αργά σε όγκο ίσο σχεδόν με τον συνολικό όγκο Vt. Ο διαχωρισμός με μοριακή διήθηση εξαρτάται και από το σχήμα των μορίων (“Χρω µ ατογραφία µ οριακής διήθησης,” 2008). Τα πρότυπα πρωτεϊνικά δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι το κυτόχρωμα C (με μοριακό βάρος 12.000 daltons), η Blue dextran (με μοριακό βάρος 2.000.000 daltons) και η τρυπτοφάνη (με μοριακό βάρος 205 daltons). Και τα τρία δείγματα απορροφούν στα 280nm, μιας και αυτό το μήκος κύματος ανιχνεύεται από τον ειδικό ανιχνευτή που είναι προσαρμοσμένος στη στήλη. Αρχικά, εισήχθη στη στήλη σαν μίγμα το κυτόχρωμα C και η Blue dextran, στη συνέχεια εισήχθη στη στήλη σαν μίγμα το κυτόχρωμα C και η τρυπτοφάνη και τέλος εισήχθη το δείγμα που μελετήθηκε και στην PD-10 στήλη. Πριν από κάθε εισαγωγή μίγματος στη στήλη γινόταν εξισορρόπηση με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που εισάγει η αντλία. Η ποσότητα που εισαγόταν κάθε φορά στη στήλη είναι 0,5ml. Και στις τρεις πειραματικές διατάξεις μετρήθηκε η ροή (η οποία θα πρέπει να είναι περίπου ίδια και τις τρεις φορές μιας και η αντλία επιβάλει σταθερή ροή) και υπολογίστηκε ο νεκρός όγκος των δύο πρότυπων μιγμάτων. Ένας καταγραφέας καταγράφει κάθε χρονική στιγμή την απορρόφηση

των ουσιών στα 280nm. Στο τέλος έγινε ένα διάγραμμα απορρόφησης – χρόνου με τα δύο μίγματα και το δείγμα. Όσον αφορά στο μίγμα κυτοχρώματος C και Blue dextran, σε eppendorf τοποθετήθηκαν 100μl κυτόχρωμα C (20 mg/ml), 100μl Blue dextran (20 mg/ml) και 300μl αποσταγμένο νερό. Έτσι, προέκυψε μίγμα 500μl που εισήχθη στη στήλη. Από τη στιγμή που θα εισαχθεί το μίγμα στη στήλη έως ότου προσαρμοστεί η αντλία, συγκεντρώνεται ένας όγκος a και στη συνέχεια από την προσαρμογή της αντλίας έως ότου να εμφανισθεί η πρώτη κορυφή στον ανιχνευτή συγκεντρώνεται ένας όγκος b σε χρονικό διάστημα t. Οι όγκοι συλλέγονται σε προζυγισμένα κύπελλα και από τη διαφορά του γεμάτου και του άδειου κυπέλλου προκύπτει ο όγκος που εισήχθη σε αυτό. Το άθροισμα των δύο όγκων συνιστά το νεκρό όγκο της στήλης. Για τον υπολογισμό της ροής χρησιμοποιήθηκε μόνο ο όγκος b μιας και τότε προσαρμόστηκε η αντλία και άρχισε να επιβάλλεται σταθερή ροή σε καταγεγραμμένο χρόνο. Όσον αφορά στο μίγμα τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C, σε eppendorf τοποθετήθηκαν 50μl κυτόχρωμα C (20 mg/ml), 100μl τρυπτοφάνης (10 mg/ml) και 300μl αποσταγμένο νερό. Έτσι, προέκυψε μίγμα 500μl που εισήχθη στη στήλη, μετά από εξισορρόπηση. Ακολουθήθηκαν οι ίδιες διαδικασίες για τον υπολογισμό νεκρού όγκου και ροής. Όσον αφορά στο δείγμα, αφού η στήλη εξισορροπήθηκε, εισήχθη 0,5ml από αυτό και υπολογίστηκε η ροή.

2.7.4. Τεχνικές διαχωρισμού και συμπύκνωσης Οι τεχνικές που ακολουθούνται για το διαχωρισμό ενός δείγματος στα συστατικά του είναι πολλές. Αυτή που χρησιμοποιήθηκε στη συγκεκριμένη πειραματική ενότητα είναι η υπερδιήθηση. Έτσι, έγινε ένας καλύτερος προσδιορισμός του μοριακού βάρους του προς μελέτη δείγματος.

Υπερδιήθηση Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό, τον καθαρισμό και τη συμπύκνωση διαφόρων ουσιών – μορίων, βάσει του μοριακού τους βάρους. Γίνεται υπό πίεση με τη χρήση ειδικών ημιπερατών μεμβρανών, που ονομάζονται και ηθμοί υπερδιήθησης. Αυτοί οι ηθμοί έχουν ειδική ανισότροπη υφή και κατακρατούν τα σωματίδια στην επιφάνειά τους. Στη συγκεκριμένη πειραματική διάταξη χρησιμοποιήθηκαν μεμβράνες που συγκρατούν μόρια πάνω από 3.000 daltons (συμπυκνωμένο διάλυμα), ενώ μόρια μικρότερα από 3.000 daltons τις διαπερνούν και συνιστούν το αραιωμένο διάλυμα (Charcosset, 2012). Από τα κλάσματα που έγινε δοκιμή σε τρυβλίο με δείκτη (§ 2.9.3., ενότητα: «Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε μεγαλύτερη στήλη με Sephadex G-25 για κλασμάτωση του δείγματος» ), επιλέχθηκαν όσα κλάσματα δίνουν ζώνη αναστολής. Το περιεχόμενό τους εισήχθη σε ειδικό falcon με ηθμούς υπερδιήθησης. Έγινε φυγοκέντρηση για περισσότερο από μιάμιση ώρα σε 4.000 στροφές. Εν τέλει προέκυψε ένα συμπυκνωμένο διάλυμα με μόρια >3000 daltons και ένα αραιωμένο με μόρια <3000 daltons. Και για τα δυο διαλύματα έγινε δοκιμή σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10) ώστε να ελεγχθεί η ανασταλτική τους δράση.

2.7.5. Μέθοδος Bradford Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην ιδιότητα της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G- 250 να αλλάζει χρώμα όταν αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες σε όξινο περιβάλλον. Η ελεύθερη χρωστική έχει χρώμα καστανό και απορροφά στα 465nm ενώ το σύμπλοκο πρωτεΐνη – χρωστική είναι γαλάζιο και απορροφά στα 595nm. Η μέθοδος είναι αξιόπιστη για πρωτεϊνικά δείγματα των οποίων η συγκέντρωση κυμαίνεται από 0,04 mg/ml έως 20 mg/ml (40 – 200 μg/ml) (Hammond & Kruger, 1988).

Αρχικά σε πλάκα μικροτιτλοδότησης τοποθετήθηκαν 200μl Bradford + 10μl H2O (3 επαναλήψεις), σε άλλη σειρά 200μl Bradford + 10μl πρότυπο πρωτεϊνικό διάλυμα αλβουμίνης BSA (3 επαναλήψεις για 6 διαφορετικές συγκεντρώσεις BSA) και τέλος σε άλλη σειρά 200μl Bradford + 10μl από το δείγμα που δίνει ζώνη αναστολής και προήλθε από υπερδιήθηση (2 επαναλήψεις). Θα πρέπει να γίνει καλή κυκλική ανάδευση στην πλάκα και να μην δημιουργηθούν φυσαλίδες που εμποδίζουν την φωτομέτρηση. Αφέθηκαν 5min και τοποθετήθηκαν στο micro plate. Από τις τιμές αφαιρέθηκε το blank. Οι 6 διαφορετικές συγκεντρώσεις BSA έχουν τις ακόλουθες τιμές: 1,25 mg/ml, 1 mg/ml, 0,7 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml. Με αυτές τις τιμές συναρτήσει των αντίστοιχων τιμών απορρόφησης κατασκευάστηκε η πρότυπη καμπύλη αναφοράς. Με βάση την καμπύλη αυτή υπολογίστηκε η συγκέντρωση πρωτεΐνης στο δείγμα.

Κεφάλαιο 3: Αποτελέσματα

3.1. Θρεπτικά υποστρώματα και συνθήκες ανάπτυξης Στην αρχική αυτή ενότητα του πειράματος διερευνήθηκε η καταλληλότητα των διαφόρων θρεπτικών υποστρωμάτων και οι διάφορες συνθήκες για την ανάπτυξη του κάθε μικροοργανισμού. Αρχικά, τόσο τα μικροβακτήρια όσο και οι μικροοργανισμοί – δείκτες δοκιμάστηκαν ως προς την ανάπτυξή τους σε ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα Μ9 με γλυκόζη, στο οποίο και αναπτύχθηκαν. Ο χρόνος και η θερμοκρασία επώασης αλλά και το pH του θρεπτικού εξαρτώνται από το είδος του μικροοργανισμού που καλλιεργείται. Έτσι, όλα τα μικροβακτήρια και οι βακτηριακοί δείκτες αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα Μ9 με pH=6,7 και γλυκόζη 1% w/v και 0,1% w/v. Η επώαση έγινε σε κλίβανο με σταθερή θερμοκρασία 30οC. Οι μύκητες – δείκτες αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υπόστρωμα Μ9 με pH=5,5 και γλυκόζη 1% w/v και 0,1% w/v. Η επώαση για τα είδη Aspergillus niger (DSM 1957) και Aspergillus nidulans (DSM 820) έγινε σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 37 οC και για τα είδη Fusarium oxysporum (DSM 62059), Saccharomyces cerevisiae (DSM 70449) και Cyberlindera Saturnus Minter σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 30οC. Στις εικόνες που ακολουθούν (εικόνες 3.1. – 3.10.) είναι εμφανής η ανάπτυξη όλων των μικροοργανισμών σε θρεπτικό Μ9 με γλυκόζη 1% w/v και σε θρεπτικό Μ9 με γλυκόζη 0,1% w/v κατά την 5η μέρα επώασης, με κάποιες διαφοροποιήσεις στην μορφολογία ή το χρώμα των αποικιών όταν αλλάζει η συγκέντρωση γλυκόζης.

Εικόνα 3.1. Στελέχη μικροβακτηρίων ΖΚΑ15 (πάνω αριστερά), ΖΚΑ21 (πάνω δεξιά), ΖΚΑ27 (κάτω αριστερά), ΖΚΑ30 (κάτω δεξιά). Ανάπτυξη σε 1% w/v γλυκόζη και pH=6,7.

Εικόνα 3.2. Στελέχη μικροβακτηρίων ΖΚΑ15 (πάνω αριστερά), ΖΚΑ21 (πάνω δεξιά), ΖΚΑ27 (κάτω αριστερά), ΖΚΑ30 (κάτω δεξιά). Ανάπτυξη σε 0,1% w/v γλυκόζη και pH=6,7.

Εικόνα 3.3. Στελέχη μικροβακτηρίων ΖΚΑ43, ΖΚΑ46, ΖΚΑ56. Ανάπτυξη σε 1% w/v γλυκόζη και pH=6,7.

Εικόνα 3.4. Στελέχη μικροβακτηρίων ΖΚΑ43, ΖΚΑ46, ΖΚΑ56. Ανάπτυξη σε 0,1% w/v γλυκόζη και pH=6

Εικόνα 3.5. Στελέχη βακτηριακών δεικτών Bacillus subtilis (DSM 10), Micrococcus luteus (DSM 1790), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Pseudomonas fluorescens (DSM 50090), Acinetobacter radioresistens (DSM 6976), Escherichia coli (NEB DH5a). Ανάπτυξη σε 1% w/v γλυκόζη και pH=6,7.

Εικόνα 3.6. Στελέχη βακτηριακών δεικτών Bacillus subtilis (DSM 10), Micrococcus luteus (DSM 1790), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), Pseudomonas fluorescens (DSM 50090), Acinetobacter radioresistens (DSM 6976), Escherichia coli (NEB DH5a). Ανάπτυξη σε 0,1% w/v γλυκόζη και pH=6,7.

Εικόνα 3.7. Στελέχη δεικτών μυκήτων Aspergillus niger (DSM 1957) και Aspergillus nidulans (DSM 820). Ανάπτυξη σε 1% w/v γλυκόζη και pH=5,5.

Εικόνα 3.8. Στελέχη δεικτών μυκήτων Aspergillus niger (DSM 1957) και Aspergillus nidulans (DSM 820). Ανάπτυξη σε 0,1% w/v γλυκόζη και pH=5,5.

Εικόνα 3.9. Στελέχη δεικτών μυκήτων Fusarium oxysporum (DSM 62059) (κάτω), Saccharomyces cerevisiae (DSM 70449) (πάνω αριστερά) και Cyberlindera Saturnus Minter (πάνω δεξιά). Ανάπτυξη σε 1% w/v γλυκόζη και pH=5,5.

Εικόνα 3.10. Στελέχη δεικτών μυκήτων Fusarium oxysporum (DSM 62059) (κάτω), Saccharomyces cerevisiae (DSM 70449) (πάνω αριστερά) και Cyberlindera Saturnus Minter (πάνω δεξιά). Ανάπτυξη σε 0,1% w/v γλυκόζη και pH=5,5.

Στους πίνακες που ακολουθούν παρουσιάζονται συγκεντρωτικά οι συνθήκες ανάπτυξης κάθε μικροοργανισμού – δείκτη (πίνακας 3.1. – 3.2.) και των μικροβακτηρίων (πίνακας 3.2.), ώστε να παρασκευαστεί stock γλυκερόλης.

Πίνακας 3.1. Συνθήκες ανάπτυξης των μικροοργανισμών – δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν. Αρχικά έγινε ανάπτυξη σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα, όπου οι μικροοργανισμοί επωάστηκαν σε κλίβανο σταθερών συνθηκών. Οι μέρες επώασης αντιστοιχούν στις μέρες που απαιτήθηκαν προκειμένου να εμφανισθούν ξεκάθαρες μονήρεις αποικίες. Στη συνέχεια τα βακτηριακά στελέχη και οι ζύμες χρειάστηκε να καλλιεργηθούν και σε υγρό θρεπτικό υπόστρωμα για την τελική παρασκευή stock γλυκερόλης, ενώ οι νηματοειδείς μύκητες δεν απαιτούν ανακαλλιέργεια σε υγρό μέσο, κάτι που συμβολίζεται με ¨-¨. Οι μέρες επώασης αντιστοιχούν στις μέρες που απαιτήθηκαν προκειμένου να εμφανισθεί μια θολερότητα στο θρεπτικό, που υποδηλώνει ανάπτυξη μικροοργανισμού.

στερεό θρεπτικό μέρες επώασης θερμοκρασία επώασης υγρό θρεπτικό μέρες επώασης στον ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ στον κλίβανο αναδευτήρα

Gram+ bacteria Bacillus subtilis (DSM 10) NA 1 30oC NB 1 Micrococcus luteus (DSM 1790) NA 8-10 30oC NB 1-2 Gram- bacteria Acinetobacter radioresistens (DSM 6976) NA 2 30oC NB 1 Pseudomonas fluorescens (DSM 50090) NA 2 30oC NB 1-2 E.coli (NEB DH 5a) NA 2 30oC NB 1 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) NA 2 30oC NB 1 Filamentous fungus Aspergillus niger (DSM 1957) PDA & MEA 3 37oC PDB - Aspergillus nidulans (DSM 820) PDA & MEA 3 37oC PDB - Fusarium oxysporum (DSM 62059) PDA & MEA 3 30oC PDB - Yeast Saccharomyces cerevisiae (DSM 70449) PDA & MEA 3 30oC PDB 1 Cyberlindera Saturnus Minter MEA 4 30oC PDB 1

Πίνακας 3.2. Ανάπτυξη των μικροοργανισμών – δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν και των μικροβακτηριακών στελεχών σε ελάχιστο θρεπτικό Μ9 με γλυκόζη. Με ¨-¨ συμβολίζεται η μη ύπαρξη ανάπτυξης, με ¨+¨ υπάρχει μικρή ανάπτυξη, με ¨++¨υπάρχει κανονική ανάπτυξη¨, με ¨+++¨ υπάρχει μεγάλη ανάπτυξη.

ΜΙΚΡΟΒΑΚΤΗΡΙΑ ΖΚΑ15 ΖΚΑ21 ΖΚΑ27 ΖΚΑ30 ΖΚΑ43 ΖΚΑ46 ΖΚΑ56

pΗ 6,7 γλυκόζη 1% w/v ++ ++ +++ + ++ ++ + γλυκόζη 0,1% w/v ++ ++ +++ + ++ ++ +

ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΙ Bacillus Micrococcus Pseudomonas Acinetobacter Pseudomonas E.coli (NEB ΔΕΙΚΤΕΣ subtilis luteus (DSM aeruginosa radioresistens fluorescens DH 5a) (DSM 10) 1790) (ATCC 15442) (DSM 6976) (DSM 50090) pΗ 6,7 γλυκόζη 1% w/v +++ + +++ ++ + ++ γλυκόζη 0,1% ++ + ++ ++ + ++ w/v

ΔΕΙΚΤΕΣ Aspergillus niger Aspergillus Fusarium Saccharomyces Cyberlindera ΜΥΚΗΤΩΝ (DSM 1957) nidulans (DSM oxysporum (DSM cerevisiae (DSM Saturnus Minter 820) 62059) 70449) pΗ 5,5 γλυκόζη 1% w/v +++ +++ ++ + ++ γλυκόζη 0,1% ++ ++ ++ + ++ w/v

3.2. Διερεύνηση παραγωγής αντιμικροβιακών ενώσεων από τα μικροβακτήρια Στη συγκεκριμένη πειραματική ενότητα διερευνήθηκε η ικανότητα παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών από τα είδη του γένους Microbacterium. Για το λόγο αυτό εξετάστηκε η αναστολή μικροοργανισμών – δεικτών, που έχει τη μορφή διαυγούς ζώνης. Στη μέθοδο διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υλικό (Agar Diffusion Assay) κατά την οποία τα μικροβακτήρια τοποθετήθηκαν σαν σταγόνα επάνω σε επιστρωμένο τρυβλίο με μικροοργανισμό – δείκτη, δεν παρουσιάστηκε κάποια αναστολή του δείκτη με μορφή ευδιάκριτης ζώνης γύρω από τη σταγόνα. Η μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας από πηγαδάκια (Well Diffusion Assay) κατά την οποία διανοίχθηκαν πηγαδάκια σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα με ειδικό φελλοτρυπητήρα, εφαρμόστηκε σε τρυβλία με τέσσερα διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα, όπου αναπτύχθηκαν οι μικροοργανισμοί – δείκτες. Σε τρυβλίο με ελάχιστο θρεπτικό Μ9 (0,25 g/L γλυκόζη), ζώνη αναστολής εμφανίστηκε γύρω από τα στελέχη ΖΚΑ15, ΖΚΑ46 όταν αυτά ενοφθαλμίστηκαν σε πηγαδάκι τρυβλίου με δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10), ενώ έγιναν δοκιμές σε όλους τους βακτηριακούς δείκτες με όλα τα στελέχη μικροβακτηρίων. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε και για τρυβλίο με θρεπτικό υπόστρωμα ΝΑ, AGS, TGS. Σε τρυβλία ΝΑ δεν παρατηρήθηκε ξεκάθαρη ζώνη, αλλά μια μεγάλη αραίωση του δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10) γύρω από το στέλεχος ΖΚΑ15. Σε AGS και TGS θρεπτικό δεν είναι ξεκάθαρη ζώνη, εκτός γύρω από το στέλεχος ΖΚΑ15 σε δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10). Παρακάτω φαίνονται κάποια τρυβλία με ζώνη αναστολής ή πιθανή αραίωση (εικόνες 3.11. – 3.15.).

Εικόνα 3.11. 2η μέρα επώασης σε θρεπτικό Μ9 0,1% w/v γλυκόζης του δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10) και των μικροβακτηριακών στελεχών ΖΚΑ15, ΖΚΑ21, ΖΚΑ27, ΖΚΑ30, ΖΚΑ43, ΖΚΑ46, ΖΚΑ56. Ζώνη αναστολής διακρίνεται γύρω από το στέλεχος ΖΚΑ15 και μια μικρή αραίωση γύρω από τα στελέχη ΖΚΑ43, ΖΚΑ46.

Εικόνα 3.12. 10η μέρα επώασης σε θρεπτικό Μ9 0,1% w/v γλυκόζης του δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10) και των μικροβακτηριακών στελεχών ΖΚΑ15, ΖΚΑ21, ΖΚΑ27, ΖΚΑ30, ΖΚΑ43, ΖΚΑ46, ΖΚΑ56. Ζώνη αναστολής διακρίνεται σχεδόν γύρω από όλα τα στελέχη.

Εικόνα 3.13. 2η μέρα επώασης σε θρεπτικό Μ9 0,1% w/v γλυκόζης του δείκτη Escherichia coli (NEB DH5a) και των μικροβακτηριακών στελεχών ΖΚΑ15, ΖΚΑ21, ΖΚΑ27, ΖΚΑ30, ΖΚΑ43, ΖΚΑ46, ΖΚΑ56. Ζώνη αναστολής μικρής διαμέτρου εμφανίζεται γύρω από τα στελέχη ΖΚΑ15, ΖΚΑ43.

Εικόνα 3.14. 2η μέρα επώασης σε θρεπτικό Μ9 0,1% w/v γλυκόζης του δείκτη Micrococcus luteus (DSM 1790) και των μικροβακτηριακών στελεχών ΖΚΑ15, ΖΚΑ21, ΖΚΑ27, ΖΚΑ30, ΖΚΑ43, ΖΚΑ46, ΖΚΑ56. Μια όχι τόσο ξεκάθαρη ζώνη αναπτύσσεται γύρω από τα στελέχη ΖΚΑ15, ΖΚΑ46.

Εικόνα 3.15. 2η μέρα επώασης σε θρεπτικό TGS του δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10) και των μικροβακτηριακών στελεχών ΖΚΑ15, ΖΚΑ21, ΖΚΑ27, ΖΚΑ30, ΖΚΑ43, ΖΚΑ46, ΖΚΑ56. Γύρω από το στέλεχος ΖΚΑ15 διακρίνεται μια αραίωση των κυττάρων του δείκτη.

Στην τεχνική sloppy agar, ζώνη αναστολής παρατηρήθηκε όταν καλλιεργήθηκε το μικροβακτήριο ΖΚΑ15 σε θρεπτικό υπόστρωμα ΝΑ με μικροοργανισμό – δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10). Αποικίες του στελέχους ΖΚΑ15 τοποθετήθηκαν με μορφή σταγόνας και μετά το πέρας δύο ημερών το τρυβλίο τοποθετήθηκε σε υπεριώδη ακτινοβολία UV για περίπου 20 λεπτά, ώστε να ανασταλεί η ανάπτυξη του μικροβακτηρίου και να ελεγχθεί η πιθανή παραγωγή και ενεργότητα αντιμικροβιακής ουσίας έως τότε. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αραίωση της ανάπτυξης του Bacillus subtilis (DSM 10), όταν εμβολιάστηκε σε τρυβλίο με θρεπτικό TGS και ΖΚΑ15, που είχε τοποθετηθεί ως παχιά γραμμή, χωρίς επίδραση UV. Αναστολή δεν παρατηρήθηκε σε μύκητες και ζύμες. Παρακάτω παρουσιάζονται ενδεικτικές εικόνες – αποτελέσματα (εικόνες 3.16. – 3.17.) από την καλλιέργεια των μικροοργανισμών.

Εικόνα 3.16. Θρεπτικό υπόστρωμα ΝΑ με στέλεχος μικροβακτηρίου ΖΚΑ15 υπό την επίδραση UV και sloppy agar με μικροοργανισμό δείκτης Bacillus subtilis (DSM 10). Γύρω από το στέλεχος ΖΚΑ15 διακρίνεται αραίωση των κυττάρων του δείκτη.

Εικόνα 3.17. Θρεπτικό υπόστρωμα TGS με στέλεχος μικροβακτηρίου ΖΚΑ15 χωρίς επίδραση UV και sloppy agar με μικροοργανισμό δείκτης Bacillus subtilis (DSM 10). Εκατέρωθεν της γραμμής που βρίσκεται το στέλεχος ΖΚΑ15 διακρίνεται αραίωση των κυττάρων του δείκτη.

Πίνακας 3.3. Συγκεντρωτικός πίνακας όπου εμφανίζεται με ¨+¨ η ύπαρξη ζώνης αναστολής του μικροοργανισμού – δείκτη όταν καλλιεργείται ταυτόχρονα με κάποιο στέλεχος μικροβακτηρίου. ΖΚΑ15 ΖΚΑ21 ΖΚΑ27 ΖΚΑ30 ΖΚΑ43 ΖΚΑ46 ΖΚΑ56 Bacillus subtilis +++ _ _ _ + + _

Micrococcus + ______luteus

Pseudomonas ______aeruginosa

Pseudomonas ______fluorescens

Acinetobacter ______radioresistens

Escherichia coli + _ _ _ + _ _

Aspergillus ______niger

Aspergillus ______nidulans

Fusarium ______oxysporum

Saccharomyces ______cerevisiae

Cyberlindera ______Saturnus Minter

3.3. Καμπύλη αύξησης στελέχους ΖΚΑ15 σε διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης Σε προηγούμενο κεφάλαιο (κεφάλαιο 2) παρουσιάστηκαν αναλυτικά οι πειραματικές διαδικασίες που ακολουθήθηκαν ώστε να προσδιοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης του στελέχους ΖΚΑ15. Το στέλεχος αυτό επιλέχθηκε μεταξύ των υπόλοιπων στελεχών μικροβακτηρίων, διότι δίνει την πιο ευδιάκριτη ζώνη αναστολής σε ταυτόχρονη καλλιέργειά του με το μικροοργανισμό – δείκτη Bacillus subtilis. Κατασκευάστηκαν ξεχωριστές καμπύλες αύξησης σε κάθε συνθήκη μελέτης της ανάπτυξης, από τις οποίες προσδιορίστηκε το βέλτιστο pH, η βέλτιστη θερμοκρασία, οι βέλτιστες πηγές άνθρακα και αζώτου και η ανοχή σε διαφορετικές συγκεντρώσεις άλατος. Κατά τον υπολογισμό βέλτιστου pH και θερμοκρασίας υπολογίστηκε η ξηρή βιομάζα.

3.3.1. Έλεγχος βέλτιστου pH Στο διάγραμμα 3.1. παρουσιάζεται ο μέσος όρος των OD από τις δύο επαναλήψεις καλλιέργειας σε συνάρτηση με το χρόνο. Η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε για τις τρεις τιμές pH που εξετάστηκαν. Είναι φανερό ότι το pH στο οποίο ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται βέλτιστα είναι το pH=7, διότι τις ίδιες χρονικές στιγμές η OD στο pH=7 είναι μεγαλύτερη από το pH=9 και το pH=5. Έτσι, ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται καλύτερα σε pH=7, ακολουθεί το pH=9 και τέλος το pH=5.

2 1,8 1,6 1,4

1,2 1 pH=5 600nm

OD 0,8 pH=7 0,6 pH=9 0,4 0,2 0 0 5 10 15 20 25 30 χρόνος (ώρες)

Διάγραμμα 3.1. Απεικόνιση OD του ΖΚΑ15 συναρτήσει του χρόνου, σε τρεις διαφορετικές τιμές pH. Όπως φαίνεται, βέλτιστη ανάπτυξη παρατηρείται σε pH=7.

Για τον υπολογισμό της ξηρής βιομάζας Παρακάτω παρουσιάζονται σε πίνακα τα αποτελέσματα από τη μεθοδολογία υπολογισμού

ξηρής βιομάζας. Σημειώνεται ότι δείγμα λήφθηκε στις 9μιση (t1) ώρες και στις 24 (t2) ώρες.

Ξηρή Αντίστοιχη

pH βιομάζα OD (mg/ml) t1 5α 2,15 0,56 3,8 5β 7α 3,55 1,25 2,8 7β 9α 2,8 0,82 3,4 9β

t2 5α 1,8 0,99 1,8 5β 7α 2,6 1,85 1,4 7β 9α 2,15 1,34 1,6 9β

Κανονικά θα έπρεπε ο λόγος mg/ml/OD να είναι σταθερός και στις δύο χρονικές στιγμές και περίπου ίσος. Εδώ παρατηρείται κάποια απόκλιση, που πιθανόν να οφείλεται σε πειραματικό λάθος.

3.3.2. Έλεγχος βέλτιστης θερμοκρασίας Στην προκειμένη πειραματική ενότητα εξετάστηκαν τέσσερις διαφορετικές θερμοκρασίες: 25οC, 30οC, 35οC, 40οC. Στο διάγραμμα 3.2. παρουσιάζεται ο μέσος όρος των OD από τις τρεις επαναλήψεις καλλιέργειας σε συνάρτηση με το χρόνο. Είναι φανερό ότι η θερμοκρασία στην οποία ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται βέλτιστα είναι οι 30οC, διότι τις ίδιες χρονικές στιγμές η OD στους 30οC είναι μεγαλύτερη από αυτή στους 25οC, 35οC, 40οC. Ωστόσο δεν παρατηρείται μεγάλη διαφοροποίηση στην αύξηση του μικροοργανισμού στις θερμοκρασίες 25οC και 35οC, ενώ σε θερμοκρασία 40οC αναπτύσσεται βραδύτερα. Επομένως, πρόκειται για ένα μεσόφιλο μικροοργανισμό.

1 0,9 0,8 0,7

0,6

nm θ=25

600 0,5 θ=30

OD 0,4 θ=35 0,3 θ=40 0,2 0,1 0 0 2 4 6 8 10 χρόνος (ώρες)

Διάγραμμα 3.2. Απεικόνιση OD600 του ΖΚΑ15 συναρτήσει του χρόνου, σε τέσσερις διαφορετικές θερμοκρασίες. Όπως φαίνεται, βέλτιστη ανάπτυξη παρατηρείται στους 30οC.

Για τον υπολογισμό της ξηρής βιομάζας Παρακάτω παρουσιάζονται σε πίνακα τα αποτελέσματα από τη μεθοδολογία υπολογισμού ξηρής βιομάζας. Σημειώνεται ότι δείγμα λήφθηκε: ο o για τους 25 C τη χρονική στιγμή t1 (8 ώρες) ο o για τους 30 C τη χρονική στιγμή t2 (25 ώρες) ο o για τους 35 C τη χρονική στιγμή t3 (24 ώρες) ο o για τους 40 C τη χρονική στιγμή t4 (7 ώρες)

Ξηρή Αντίστοιχη ο θ C βιομάζα OD (mg/ml) ο t1 (25 C) Α Β 0,54 0,705 0,76 Γ ο t2 (30 C) Α Β 1,63 2,458 0,66 Γ ο t3 (35 C) Α Β 1,42 2,25 0,63 Γ ο t4 (40 C) Α Β 0,55 0,425 1,29 Γ

3.3.3. Έλεγχος βέλτιστης πηγής άνθρακα Κατασκευάστηκε ραβδόγραμμα συχνοτήτων (διάγραμμα 3.3.) όπου παρουσιάζεται η OD συναρτήσει του χρόνου σε κάθε πηγή άνθρακα. Γίνεται φανερό πως στις πρώτες 24 ώρες ο μικροοργανισμός παρουσίασε ελάχιστα μεγαλύτερη ανάπτυξη (μεγαλύτερη OD) στη γλυκόζη και στη σελοβιόζη. Επομένως, πιθανολογείται η γλυκόζη να είναι η βέλτιστη πηγή άνθρακα για την ανάπτυξη του ΖΚΑ15. Δεν είναι ωστόσο βέβαιο, καθώς λαμβάνουν ρόλο κι άλλοι παράμετροι, για αυτό και συνάγεται ότι το ακτινοβακτήριο ΖΚΑ15 χρησιμοποιεί ένα ευρύ φάσμα πηγών άνθρακα για να αναπτυχθεί.

4,5

3,5

nm 2,5 0 ώρες

600 4 ώρες OD 2 24 ώρες 48 ώρες 1,5

0,5

Διάγραμμα 3.3. Απεικόνιση OD του ΖΚΑ15 συναρτήσει του χρόνου σε διαφορετικές πηγές άνθρακα. Στη γλυκόζη και στη σελοβιόζη υπάρχει μεγαλύτερη ανάπτυξη στις πρώτες 24 ώρες καλλιέργειας.

3.3.4. Έλεγχος βέλτιστης πηγής αζώτου Κατασκευάστηκε ραβδόγραμμα συχνοτήτων (διάγραμμα 3.4.) όπου παρουσιάζεται η

OD συναρτήσει του χρόνου σε κάθε πηγή αζώτου. Γίνεται φανερό πως σε καλλιέργεια με πηγή αζώτου την ουρία η ανάπτυξη του ΖΚΑ15 είναι μεγαλύτερη, λόγω της μεγαλύτερης οπτικής πυκνότητας, καθώς και ότι το ακτινοβακτήριο ΖΚΑ15 χρησιμοποιεί ένα ευρύ φάσμα πηγών αζώτου για να αναπτυχθεί.

600nm 0 ώρες

6 OD 5 ώρες 4 30 ώρες

Διάγραμμα 3.4. Απεικόνιση OD του ΖΚΑ15 συναρτήσει του χρόνου σε διαφορετικές πηγές αζώτου. Στην ουρία υπάρχει μεγαλύτερη ανάπτυξη στις 30 ώρες καλλιέργειας.

3.3.5. Έλεγχος ανθεκτικότητας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις αλατότητας Κατασκευάστηκε ραβδόγραμμα συχνοτήτων (διάγραμμα 3.5.) όπου παρουσιάζεται η

OD συναρτήσει του χρόνου σε κάθε συγκέντρωση NaCl . Γίνεται φανερό πως σε καλλιέργεια με συγκέντρωση μεγαλύτερη από 5% w/v NaCl ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται βραδύτερα ενώ σε συγκέντρωση 2% w/v NaCl φαίνεται να αναπτύσσεται βέλτιστα.

2,5

1,5

0 ώρες nm

600 3,5 ώρες

OD 1 7 ώρες 24 ώρες

0,5

0 0% 0,50% 1% 1,50% 2% 2,50% 3% 3,50% 4% 4,50% 5% NaCl

Διάγραμμα 3.5. Απεικόνιση OD του ΖΚΑ15 συναρτήσει του χρόνου σε διαφορετικές συγκεντρώσεις άλατος. Σε 2% w/v NaCl το στέλεχος ΖΚΑ15 αναπτύσσεται βέλτιστα.

3.4. Έλεγχος ανάπτυξης του βακτηρίου ΖΚΑ15 υπό αναερόβιες συνθήκες Στην πειραματική αυτή ενότητα εξετάστηκε η αναερόβια ανάπτυξη του ΖΚΑ15 σε ελάχιστο θρεπτικό υπόστρωμα M9 με pH=7 και θερμοκρασία 30οC, σε τρεις διαφορετικές πηγές άνθρακα συγκέντρωσης 50mM. Οι πηγές άνθρακα είναι η γλυκόζη, η ξυλόζη και η σελοβιόζη. Σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές λαμβανόταν δείγμα από όλες τις καλλιέργειες

προκειμένου να βρεθεί η OD. Στη συνέχεια κατασκευάστηκε ραβδόγραμμα συχνοτήτων (διάγραμμα 3.6.) όπου παρουσιάζεται η OD συναρτήσει του χρόνου σε κάθε πηγή άνθρακα. Είναι φανερό ότι ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται παρουσία ελάχιστου οξυγόνου, για αυτό πιθανότατα πρόκειται για δυνητικά αναερόβιο στέλεχος

Εικόνα 3.18. Ειδικές φιάλες αναερόβιας ζύμωσης – 6η μέρα καλλιέργειας του στελέχους ΖΚΑ15.

1,8

1,6

1,4

1,2 0 ώρες

5,5 ώρες 1

nm 1η μέρα 600 0,8

OD 4η μέρα

0,6 5η μέρα 6η μέρα 0,4

0,2

0 γλυκόζη ξυλόζη σελοβιόζη

Διάγραμμα 3.6. Απεικόνιση OD του ΖΚΑ15 συναρτήσει του χρόνου σε 3 διαφορετικές πηγές άνθρακα. Η ζύμωση είναι δυνητικά αναερόβια.

3.4.1. Ποσοτικός προσδιορισμός αναγωγικών σακχάρων σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας Παρακάτω παρουσιάζεται η πρότυπη καμπύλη αναφοράς συγκέντρωσης σακχάρου ως

προς την απορρόφηση, η οποία έχει τη μορφή C (g/L)= κλίση* Α540 (διάγραμμα 3.7.).

1,2

ΓΛΥΚΟΖΗ Ξυλόζης

- 0,8

y = 1,5886x 0,6 R² = 0,9973 ΞΥΛΟΖΗ

0,4 y = 1,3804x R² = 0,9943 0,2

0 Συγκέντρωση Συγκέντρωση Γλυκόζης 0 0,2 0,4 0,6 0,8

Απορρόφηση Γλυκόζης-Ξυλόζης

Διάγραμμα 3.7. Καμπύλη αναφοράς DNS για γλυκόζη και ξυλόζη.

Παρακάτω παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από την επεξεργασία και με τη χρήση καμπύλης αναφοράς προσδιορίζεται η τελική συγκέντρωση σακχάρου που έχει απομείνει σε κάθε φιάλη.

Πηγή άνθρακα OD Αρχική συγκέντρωση Τελική συγκέντρωση σακχάρου (g/L) σακχάρου (g/L) 4η μέρα καλλιέργειας

Γλυκόζη 0,659 {50mM} 9 6,02 Ξυλόζη 0,710 {50mM} 7,5 4,38 6η μέρα καλλιέργειας Γλυκόζη 0,650 {50mM} 9 6,64 Ξυλόζη 0,500 {50mM} 7,5 5,83

Παρατηρείται μια αύξηση στη συγκέντρωση σακχάρου την 6η μέρα, σε σύγκριση με την 4η

μέρα, παρόλο που η αντίστοιχη OD μειώθηκε (μείωση των κυττάρων άρα μείωση της πηγής άνθρακα και επομένως μείωση των ημιακεταλικών υδροξυλίων που δεσμεύει το DNS). Συνεπώς η αυξημένη τιμή ίσως να μην οφείλεται σε δέσμευση ημιακεταλικού υδροξυλίου της γλυκόζης και της ξυλόζης, αλλά σε ημιακεταλικό υδροξύλιο άλλης ένωσης.

3.4.2. Έλεγχος παραγωγής αιθανόλη σε υπερκείμενο αναερόβιας καλλιέργειας Για την σύγκριση των αποτελεσμάτων κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη αναφοράς της αιθανόλης, όπου οι περιοχές των κορυφών αντιστοιχίζονται σε ποσότητα αιθανόλης (διάγραμμα 3.8.).

45000 40000 y = 504,04 x

35000 R² = 0,9993 30000 25000 20000 15000 10000

Περιοχές Περιοχές κορυφών 5000 0 0 20 40 60 80 100 Αιθανόλη (nmol)

Διάγραμμα 3.8. Καμπύλη αναφοράς αιθανόλης.

Πηγή άνθρακα Περιοχές κορυφών Συγκέντρωση αιθανόλης (nmol) Γλυκόζη α 0 0 Γλυκόζη β 174,20 0,34 Ξυλόζη α 270,90 0,53 Ξυλόζη β 326,09 0,64 Σελοβιόζη α 552,96 1,09 Σελοβιόζη β 460,79 0,91

Από τις μετρήσεις που λαμβάνονται είναι εμφανές ότι κατά την αναερόβια ανάπτυξη του ΖΚΑ15 δεν παράγεται ποσότητα αιθανόλης ή παράγεται ελάχιστη. Παραπάνω παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από την επεξεργασία και με τη χρήση καμπύλης αναφοράς προσδιορίζεται η συγκέντρωση αιθανόλης που πιθανόν ανιχνεύτηκε.

3.5. Δοκιμή ανθεκτικότητας του στελέχους ΖΚΑ15 σε διάφορα αντιβιοτικά Παρακάτω παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από τη δοκιμασία ανθεκτικότητας του ΖΚΑ15 (εικόνες 3.19. – 3.20.). Παρατηρείται ιδιαίτερα μεγάλη ζώνη αναστολής στα αντιβιοτικά Penicillin-G, Oleandomycin και Chloramphenicol, Rifampicin, Novobiocin που σημαίνει ότι το στέλεχος ΖΚΑ15 δεν είναι ανθεκτικό στα συγκεκριμένα αντιβιοτικά. Υπάρχει ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά Lincomycin, Viomycin και Terramycin, Clindamycin. Ακόμη, παρατηρείται ζώνη αναστολής στα αντιβιοτικά Spectinomycin, Kanamycin, Gentamycin sulfate, Streptomycin sulfate και Gentamycin sulfate, Erythromycin, Ampicillin, ενώ υπάρχει ανθεκτικότητα σε Nystatin Dihydrate.

Εικόνα 3.19. Επίστρωση σε θρεπτικό ΝΑ 100μl ΖΚΑ15 και ενοφθαλμισμός 50μl αντιβιοτικών.

Εικόνα 3.20. Επίστρωση σε θρεπτικό ΝΑ 100μl ΖΚΑ15 και ενοφθαλμισμός 50μl αντιβιοτικών.

3.6. Απομόνωση και καθαρισμός αντιμικροβιακής ουσίας από το στέλεχος ΖΚΑ15 Το στέλεχος ΖΚΑ15, όπως αποδείχθηκε από προηγούμενες πειραματικές ενότητες, έχει την ικανότητα παραγωγής αντιμικροβιακής ένωσης. Έτσι, έγινε προσπάθεια να καθαριστεί και να χαρακτηρισθεί η αντιμικροβιακή αυτή ουσία.

3.6.1. Συλλογή και συμπύκνωση αντιμικροβιακής ουσίας Παρακάτω παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από δοκιμή της συμπυκνωμένης ουσίας σε επιστρωμένο τρυβλίο με δείκτη (εικόνες 3.21. – 3.24.). Παρατηρήθηκε δημιουργία ζώνης αναστολής γύρω από δείγμα της 7ης ώρας καλλιέργειας με OD=0,458. Ακόμη είναι εμφανής μια αύξηση της διαμέτρου του δακτυλίου της ζώνης με την αύξηση της ποσότητας της αντιμικροβιακής ουσίας. Με θέρμανση της ουσίας στους 100οC, δεν αναπτύχθηκε ζώνη αναστολής.

Εικόνα 3.21. Στην αριστερή φωτογραφία ενοφθαλμίστηκαν 50μl ουσίας ενώ στη δεξιά 100μl. Παρατηρείται απουσία ζώνης αναστολής με θέρμανση στους 100οC.

Καμπύλη αύξησης ΖΚΑ15 (0,36% γλυκόζη / pH=7) 0,9 0,8 t3 0,7 0,6

0,5 OD t1 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 20 25 30 χρόνος (ώρες)

Διάγραμμα 3.9. Καμπύλη αύξησης του ΖΚΑ15 όπου φαίνεται η φάση εκείνη που οδηγεί σε εμφάνιση ζώνης αναστολής, δηλαδή η φάση παραγωγής της αντιμικροβιακής ουσίας.

Εικόνα 3.22. Ζώνη αναστολής αναπτύσσεται γύρω από δείγμα καλλιέργειας με OD0,500. Στην αριστερή η η φωτογραφία απεικονίζεται η 1 μέρα επώασης του Bacillus subtilis και στη δεξιά η 2 μέρα επώασης. Κατά τη 2η μέρα επώασης αναπτύσσεται ένας εσωτερικός δακτύλιος ενώ εμφανίζονται μεμονωμένες αποικίες Bacillus subtilis εσωτερικά της ζώνης αναστολής (πιθανή απόκτηση ανθεκτικότητας κάποιων κυττάρων του δείκτη).

Εικόνα 3.23. Σε κάθε πηγαδάκι ενοφθαλμίστηκε διαφορετική ποσότητα από την ανασταλτική ουσία, αρχίζοντας από 15μl αριστερά και συνεχίζοντας προς τα δεξιά με αύξηση 15μl κάθε φορά. Έτσι η κάτω ζώνη προήλθε ενοφθαλμισμό 75μl.

Εικόνα 3.24. Αριστερά 1η μέρα επώασης Bacillus subtilis με 80μl ανασταλτικής ουσίας και δεξιά 2η μέρα επώασης. Παρατηρείται η ανάπτυξη συγκεντρικών δακτυλίων γύρω από την κεντρική ζώνη αναστολής.

3.6.2. Διαχωρισμός ουσιών υπερκείμενων δειγμάτων με χρωματογραφικές τεχνικές Το δείγμα που απομονώθηκε από την καλλιέργεια του ΖΚΑ15 σε 0,36% w/v γλυκόζη και έχει ανασταλτική δράση, θα χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω καθαρισμό μέσω χρωματογραφίας.

Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε PD-10 στήλη με Sephadex G-25 για αφαλάτωση του δείγματος Από τα δύο κλάσματα που προέκυψαν έγινε δοκιμή σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10). Τα τρυβλία επωάστηκαν σε κλίβανο με σταθερή θερμοκρασία 30οC και μετά την επώαση έγινε παρατήρηση (εικόνα 3.25.).

Εικόνα 3.25. Γύρω από το πηγαδάκι που ενοφθαλμίστηκε το 2ο κλάσμα διακρίνεται ζώνη αναστολής του δείκτη.

Στη συνέχεια έγινε κλασμάτωση του ίδιου δείγματος και πάλι σε στήλη PD-10 ώσπου να συγκεντρωθούν συνολικά 5 κλάσματα των 3,5 ml το καθένα. Και για τα πέντε κλάσματα έγινε δοκιμή σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10) και ελέγχθηκε η ανασταλτική δράση των πέντε κλασμάτων. Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι η ουσία βρίσκεται στα 2 πρώτα κλάσματα, μιας και γύρω από τα πηγαδάκια στα οποία εμβολιάστηκαν εμφανίστηκε ζώνη αναστολής (εικόνα 3.26.). Τα υπόλοιπα τρία κλάσματα δεν εμφάνισαν κάποια ζώνη αναστολής.

Εικόνα 3.26. Γύρω από το πηγαδάκι που εμβολιάστηκε το 1ο και το 2ο κλάσμα διακρίνεται ζώνη αναστολής του δείκτη.

Εικόνα 3.27. Μετά από λυοφιλίωση των κλασμάτων που δίνουν ζώνη αναστολής, δεν παρατηρείται ζώνη ύστερα από εμβολιασμό σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με Bacillus subtilis.

Χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε μεγαλύτερη στήλη με Sephadex G-25 για κλασμάτωση του δείγματος Συλλέχθηκαν συνολικά 12 κλάσματα. Από το περιεχόμενο των κλασμάτων ενοφθαλμίστηκε ένα μέρος σε μικρά πηγαδάκια που είχαν διανοιχθεί σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10), ώστε να ελεγχθεί η ανασταλτική τους δράση. Τα τρυβλία επωάστηκαν σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 30οC. Από το χρωματογράφημα (διάγραμμα 3.9.) φαίνεται ότι σε 2 χρονικές στιγμές υπάρχει έκλουση μορίων που απορροφούν στα 280nm (2 κορυφές). Τα αποτελέσματα από τη δοκιμή στα τρυβλία δείχνουν ζώνη αναστολής στο 8ο και στο 9ο κλάσμα (εικόνα 3.28.). Αυτά τα κλάσματα αντιστοιχούν στο 24ο και 27ο λεπτό έκλουσης και σύμφωνα με το χρωματογράφημα ανήκουν στην 2η κορυφή. Επομένως η αντιμικροβιακή ουσία εκλούεται μεταξύ 20ου και 30ου λεπτού.

4 αντιμικροβιακή 3,5 3 ουσία

2,5

nm 2

280 1,5 Α 1 0,5 0 0 20 40 60 80 100 120 χρόνος (min)

Διάγραμμα 3.10. Χρωματογράφημα που απεικονίζεται η απορρόφηση στα 280nm των διαδοχικών κλασμάτων έκλουσης ως προς το χρόνο. Στη 2η κορυφή ανιχνεύτηκε, με δοκιμή σε ΝΑ τρυβλία επιστρωμένα με δείκτη, η αντιμικροβιακή ουσία.

Εικόνα 3.28. Στην αριστερή φωτογραφία φαίνεται ο εμβολιασμός των πρώτων 6 κλασμάτων και στη δεξιά των επόμενων 6 κλασμάτων, σε ΝΑ τρυβλίο με δείκτη Bacillus subtilis. Ζώνη αναστολής διακρίνεται γύρω από το πηγαδάκι του 8ου και του 9ου κλάσματος. Ακόμη στο κέντρο και των δύο τρυβλίων έχει εμφανισθεί μια αραίωση των κυττάρων του δείκτη.

Σύγκριση του δείγματος με πρότυπα πρωτεϊνικά μόρια Τα πρότυπα πρωτεϊνικά δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι το κυτόχρωμα C (με μοριακό βάρος 12.000 daltons), η Blue dextran (με μοριακό βάρος 2.000.000 daltons) και η τρυπτοφάνη (με μοριακό βάρος 205 daltons).

30 trypt cyt C 25

nm αντιμικροβιακή

δειγμα 280

A ουσία 10 cyt C & trypt

0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

-5 χρόνος (min)

Διάγραμμα 3.11. Χρωματογράφημα που απεικονίζεται η απορρόφηση στα 280nm των 2 μορίων έκλουσης του μίγματος κυτοχρώματος C και τρυπτοφάνης, καθώς και της αντιμικροβιακής ουσίας, ως προς το χρόνο. Αρχικά εκλούσθηκε το κυτόχρωμα C, στη συνέχεια η αντιμικροβιακή ουσία και τέλος η τρυπτοφάνη.

Όσον αφορά στο μίγμα κυτοχρώματος C και Blue dextran, από τη στιγμή που θα εισαχθεί στη στήλη έως ότου προσαρμοστεί η αντλία, συγκεντρώνεται ένας όγκος a=3,5ml και στη συνέχεια από την προσαρμογή της αντλίας (επιβάλλει σταθερή ροή σε καταγεγραμμένο χρόνο) έως ότου να εμφανισθεί η πρώτη κορυφή στον ανιχνευτή συγκεντρώνεται ένας όγκος b=6,2ml σε χρονικό διάστημα t=11,75min. Έτσι, ροή F=b/t=6,2ml/11,75min=0,53ml/min. Το άθροισμα των δύο όγκων συνιστά το νεκρό όγκο της

στήλης. Έτσι, Vνεκρός= a+b=3,5ml+6,2ml=9,7ml. Όμως, τα δύο δείγματα εκλούσθηκαν μαζί, δηλαδή δεν έγινε διαχωρισμός κυτοχρώματος C και Blue dextran, μιας και η Blue dextran

είναι ένα μόριο 2000kdaltons που δεν μπορεί να διαχωριστεί από τη ρητίνη με G-25 και απλώς διαπερνά τους πόρους χωρίς να εισέλθει σε αυτούς. Επομένως, στην 1η κορυφή έκλουσης αντιστοιχούν και τα δύο μόρια του μίγματος. Για το λόγο ότι δεν υπάρχει διαχωρισμός του μίγματος κυτοχρώματος C και Blue dextran, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο μίγμα για τον υπολογισμό μοριακών βαρών άλλων δειγμάτων. Όσον αφορά στο μίγμα τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C, ακολουθήθηκαν οι ίδιες διαδικασίες για τον υπολογισμό νεκρού όγκου και ροής. Έτσι, σε αντιστοιχία με την προηγούμενη διαδικασία, a=3,2ml και b=6,7ml σε χρόνο t=10,2min, F=0,65ml/min και

Vνεκρός=9,9ml. Τα δύο μόρια διαχωρίστηκαν κατά την έκλουση και έδωσαν 2 κορυφές στο χρωματογράφημα, όπου η 1η κορυφή αντιστοιχεί στην έκλουση του μεγαλύτερου μορίου (κυτόχρωμα C) και η 2η κορυφή αντιστοιχεί στην έκλουση του μικρότερου μορίου (τρυπτοφάνη). Όσον αφορά στο δείγμα, η αντιμικροβιακή ουσία εκλούσθηκε σε χρονικά διαστήματα ενδιάμεσα των δύο μορίων τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C, όπως φαίνεται στο διάγραμμα 3.10.. Έτσι, εκτιμήθηκε το μοριακό βάρος της ουσίας μεταξύ των μοριακών βαρών τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C. Δηλαδή, 205daltons< αντιμικροβιακή ουσία< 12.000daltons.

3.7.3. Τεχνικές διαχωρισμού και συμπύκνωσης Οι τεχνικές που ακολουθούνται για το διαχωρισμό ενός δείγματος στα συστατικά του είναι πολλές. Αυτή που χρησιμοποιήθηκε στη συγκεκριμένη πειραματική ενότητα είναι η υπερδιήθηση.

Υπερδιήθηση Μετά από επώαση σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 30οC, το αποτέλεσμα έδειξε ότι το συμπυκνωμένο διάλυμα είναι αυτό που περιέχει την αντιμικροβιακή ουσία, αφού γύρω από δοκιμή αυτού του διαλύματος σχηματίστηκε ζώνη αναστολής. Δηλαδή το μοριακό βάρος αντιμικροβιακής ουσίας είναι μεγαλύτερο από 3.000daltons. Σύμφωνα και με το αποτέλεσμα από την χρωματογραφία με το πρότυπο μίγμα τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C, όπου αποδείχθηκε ότι 205daltons< αντιμικροβιακή ουσία< 12.000daltons, συμπεραίνεται ότι 3.000daltons<αντιμικροβιακή ουσία< 12.000daltons.

Εικόνα 3.29. Ζώνη αναστολής έχει σχηματιστεί γύρω από το πηγαδάκι με το εμβόλιο του συμπυκνωμένου διαλύματος, που έχει μόρια >3000 daltons.

3.7.4. Μέθοδος Bradford Τα αποτελέσματα από τη φωτομέτρηση έδειξαν ότι το δείγμα δεν περιέχει κάποιο πρωτεϊνικό μόριο που να ανιχνεύεται με αυτή την αντίδραση, μιας και είχε απορρόφηση ίδια με την απορρόφηση που είχε το τυφλό. Έτσι, δε χρειάστηκε να γίνει σύγκριση του αποτελέσματος με πρότυπη καμπύλη.

Κεφάλαιο 4: Συμπεράσματα – Συζήτηση

Στην παρούσα εργασία επιχειρήθηκε η παραγωγή και απομόνωση αντιμικροβιακών ουσιών από το ακτινοβακτήριο Microbacterium resistens (ZKA15). Το συγκεκριμένο στέλεχος επιλέχθηκε μεταξύ 7 στελεχών του γένους Microbacterium, μιας και προκαλούσε αναστολή στην ανάπτυξη του βακτηρίου Bacillus subtilis (DSM 10). Βιβλιογραφικά δεν έχει αναφερθεί κάποιο άλλο είδος του γένους Microbacterium που να αναστέλλει την ανάπτυξη άλλου μικροοργανισμού και να παράγει κάποια αντιμικροβιακή ένωση. Ύστερα από ταυτόχρονη ανάπτυξη του βακτηρίου ΖΚΑ15 και του μικροοργανισμού – δείκτη Bacillus subtilis (DSM 10), παρατηρήθηκε σχηματισμός διαυγούς ζώνης αναστολής της ανάπτυξης του δείκτη γύρω από την περιοχή ενοφθαλμισμού του μικροβακτηρίου. Έγινε φανερό ότι το βακτήριο ΖΚΑ15 παρήγαγε κάποια αντιμικροβιακή ουσία. Έτσι, μελετήθηκε η φυσιολογία του συγκεκριμένου μικροβακτηρίου και έγινε προσπάθεια απομόνωσης της αντιμικροβιακής ουσίας. Μετά από πειράματα προσδιορισμού βέλτιστων συνθηκών αύξησης του ΖΚΑ15, διαπιστώθηκε, όπως συνάγεται και από τα αντίστοιχα διαγράμματα, ότι η ανάπτυξη είναι βέλτιστη σε pH=7 και πρόκειται για μεσόφιλο μικροοργανισμό με ένα ευρύ φάσμα ανάπτυξης σε πηγές άνθρακα και αζώτου. Ακόμη, σε καλλιέργεια με συγκέντρωση μεγαλύτερη από 5% w/v NaCl ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται βραδύτερα ενώ σε συγκέντρωση 2% w/v NaCl φαίνεται να αναπτύσσεται βέλτιστα. Δηλαδή, η αύξηση σε περιεκτικότητα άλατος επιβραδύνει την ανάπτυξη του βακτηρίου. Το γεγονός ότι υπάρχει ανάπτυξη σε σχετικά αυξημένη αλατότητα ενισχύεται λόγω του ότι το φυσικό περιβάλλον απομόνωσης του ΖΚΑ15 ήταν υφάλμυρη περιοχή. Έτσι, πρόκειται για έναν αλοανθεκτικό μικροοργανισμό. Η κάθε συνθήκη μελετήθηκε ξεχωριστά και κάθε φορά μεταβαλλόταν μία μόνο παράμετρος. Κατά τον έλεγχο ανάπτυξης του ΖΚΑ15 υπό αναερόβιες συνθήκες, διαπιστώθηκε ότι ο μικροοργανισμός αναπτύσσεται παρουσία ελάχιστου οξυγόνου, για αυτό πιθανότατα πρόκειται για δυνητικά αναερόβιο στέλεχος. Σε υπερκείμενα αναερόβιας καλλιέργειας εφαρμόστηκε ποσοτικός προσδιορισμός αναγωγικών σακχάρων, όπου δεν παρατηρήθηκε παραγωγή σημαντικής ποσότητας αιθανόλης από το ΖΚΑ15. Όσον αφορά στην ονομασία του είδους Microbacterium resistens, οφείλεται στην ανθεκτικότητά του στο αντιβιοτικό vancomycin, ένα καθόλου συνηθισμένο φαινόμενο για τα πυρηνόμορφα βακτήρια του γένους του. Ύστερα από πειράματα δοκιμής ανθεκτικότητας του ΖΚΑ15 σε διάφορα αντιβιοτικά, βρέθηκε ότι το στέλεχος είναι ανθεκτικό, πέραν του αντιβιοτικού που αναφέρεται βιβλιογραφικά, και στα αντιβιοτικά Lincomycin, Viomycin, Terramycin, Clindamycin, Nystatin Dihydrate. Εκτός από την vancomycin δεν έχει αναφερθεί ανθεκτικότητα σε κάποιο άλλο αντιβιοτικό. Στη συνέχεια ακολουθήθηκε η πειραματική διαδικασία για απομόνωση της αντιμικροβιακής ουσίας από το βακτήριο ΖΚΑ15. Υπερκείμενα συλλέχθηκαν από διαφορετικές φάσεις της ανάπτυξης του βακτηρίου, συμπυκνώθηκαν υπό πίεση και έγινε δοκιμή σε τρυβλίο ΝΑ επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10), ώστε να ελεγχθεί η ανασταλτική τους δράση. Παρατηρήθηκε δημιουργία ζώνης αναστολής γύρω από πηγαδάκι με εναιώρημα που προερχόταν κάθε φορά από την ίδια φάση ανάπτυξης. Η φάση αυτή αντιστοιχεί σε οπτική πυκνότητα OD0,5 και φάνηκε πως είναι η εκθετική φάση ανάπτυξης του ΖΚΑ15. Ακόμη, παρατηρήθηκε ότι με αύξηση της ποσότητας του εμβολίου της αντιμικροβιακής ουσίας, η διάμετρος της ζώνης αναστολής αυξανόταν, ενώ όταν η ουσία

θερμάνθηκε σε θερμοκρασία 100οC, δεν σχηματίστηκε ζώνη. Δηλαδή, πρόκειται για μια δοσοεξαρτώμενη και θερμοευαίσθητη ουσία. Πέραν όμως της φυσιολογικής ζώνης αναστολής, κάθε φορά εμφανιζόταν και μια αραίωση στην ανάπτυξη των κυττάρων του δείκτη, που μάλιστα δημιουργούσε συγκεντρικούς κύκλους στο μέσον του τρυβλίου. Αυτό ίσως οφείλεται στη φύση της ουσίας (ίσως είναι πτητική) και στη διάχυσή της στο θρεπτικό υπόστρωμα. Επιπλέον, όταν τα τρυβλία επωάζονταν για περισσότερο από 2 ημέρες, εντός της διαυγούς ζώνης άρχιζαν να αναπτύσσονται μεμονωμένες αποικίες του μικροοργανισμού – δείκτη. Αυτό σημαίνει ότι η αντιμικροβιακή ουσία έχει βακτηριοστατική δράση και όχι βακτηριοκτόνο. Δηλαδή, αρχικά αναστέλλει την ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού και με την πάροδο του χρόνου η δράση της εξασθενεί και ο μικροοργανισμός αρχίζει να αναπτύσσεται. Αφού έγινε απομόνωση της αντιμικροβιακής ουσίας από το βακτήριο ΖΚΑ15, ακολούθησε καθαρισμός της ουσίας μέσω χρωματογραφικών τεχνικών. Από χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε στήλη PD-10 προέκυψαν 2 κλάσματα. Όταν έγινε απευθείας εμβολιασμός σε τρυβλίο ΝΑ επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10) με ποσότητα από καθένα κλάσμα ξεχωριστά, το εμβόλιο του 2ου κλάσματος σχημάτισε μια πιο ξεκάθαρη ζώνη αναστολής στο δείκτη. Όταν τα 2 κλάσματα υπέστησαν συμπύκνωση με λυοφιλίωση και στη συνέχεια έγινε δοκιμή σε παρόμοιο τρυβλίο, δε σχηματίστηκαν ζώνες αναστολής αλλά δημιουργήθηκε μια περιοχή με αραίωση των κυττάρων του δείκτη γύρω από το πηγαδάκι με το 1ο κλάσμα. Για να προσδιοριστεί ακριβώς σε ποιο κλάσμα εκλούεται η ουσία, έγινε κλασμάτωση του δείγματος σε μεγαλύτερη στήλη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ουσία εκλούσθηκε μεταξύ 20ου και 30ου λεπτού, όπως φάνηκε και από την ύπαρξη κορυφής στο χρωματογράφημα. Στη μεγαλύτερη αυτή στήλη χρωματογραφίας εισήχθησαν και πρότυπα πρωτεϊνικά μόρια, προκειμένου να εκτιμηθεί το μοριακό βάρος της αντιμικροβιακής ουσίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αντιμικροβιακή ουσία εκλούσθηκε σε χρονικά διαστήματα ενδιάμεσα των πρότυπων μορίων τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C. Έτσι, εκτιμήθηκε το μοριακό βάρος της ουσίας μεταξύ των μοριακών βαρών τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C. Δηλαδή, 205daltons< αντιμικροβιακή ουσία< 12.000daltons. Ακολούθως, το κλάσμα εκείνο που παρουσίασε την αντιμικροβιακή δράση, επεξεργάστηκε με υπερδιήθηση, προκειμένου να συμπυκνωθεί και να διαχωριστούν τα μόριά του βάσει μοριακού βάρους. Προέκυψαν 2 διαλύματα, εκ των οποίων το ένα ήταν το συμπυκνωμένο με μόρια μοριακού βάρους μεγαλύτερα από 3000 daltons και το άλλο το αραιωμένο με μόρια μικρότερα από 3000 daltons. Και για τα δυο διαλύματα έγινε δοκιμή σε ΝΑ τρυβλίο επιστρωμένο με 100μ1 Bacillus subtilis (DSM 10) ώστε να ελεγχθεί η ανασταλτική τους δράση. Μετά από επώαση σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας 30οC, το αποτέλεσμα έδειξε ότι το συμπυκνωμένο διάλυμα είναι αυτό που περιέχει την αντιμικροβιακή ουσία, αφού γύρω από εμβόλιο αυτού του διαλύματος σχηματίστηκε ζώνη αναστολής. Δηλαδή το μοριακό βάρος αντιμικροβιακής ουσίας είναι μεγαλύτερο από 3.000daltons. Σύμφωνα και με το αποτέλεσμα από την χρωματογραφία με το πρότυπο μίγμα τρυπτοφάνης και κυτοχρώματος C, όπου αποδείχθηκε ότι 205daltons< αντιμικροβιακή ουσία< 12.000daltons, συμπεραίνεται ότι η αντιμικροβιακή ουσία έχει μοριακό βάρος εντός των ορίων των 3000daltons και 12000daltons, δηλαδή 3.000daltons< αντιμικροβιακή ουσία< 12.000daltons.

Εν τέλει, με τη μέθοδο Bradford δεν υπήρξε θετική αντίδραση, κάτι το οποίο ήταν αναμενόμενο, μιας και με τη μέθοδο αυτή δεν είναι δυνατό να ποσοτικοποιηθούν ως προς τις πρωτεΐνες βιοενεργά πεπτίδια. Ακόμη με τη μέθοδο αυτή αντιδρούν συγκεκριμένα αμινοξέα, τα οποία προφανώς δεν υπάρχουν στη συγκεκριμένη ένωση, η οποία, δεδομένου ότι απορροφά στα 280nm καθώς και της θερμοευαισθησίας της, πιθανότατα είναι κάποιο πεπτίδιο. Συνεπώς, η βακτηριοστατική αυτή αντιμικροβιακή ουσία ίσως αποτελεί κάποιο μόριο-πεπτίδιο που δεν αντιδρά με Bradford, και πρόκειται μάλλον για μια πτητική ένωση, λόγω της διάχυσης της ουσίας σε στερεό θρεπτικό, με μοριακό βάρος μεταξύ 3000 Da και 12000 Da.

Μελλοντικοί στόχοι

Το μοριακό βάρος της αντιμικροβιακής ουσίας αναμένεται να προσδιοριστεί με μεγαλύτερη ακρίβεια μέσω ηλεκτροφόρησης του δείγματος και σύγκρισης των ζωνών που θα προκύψουν με ζώνες γνωστού μοριακού βάρους. Ακόμη, θα γίνει καλύτερος διαχωρισμός της ουσίας μέσω χρωματογραφίας μοριακής διήθησης σε στήλη G-10 και θα προσδιοριστεί το ακριβές κλάσμα έκλουσής της. Τέλος, αναμένεται η ανάγνωση του ολικού γονιδιώματος του ΖΚΑ15 που έχει σταλεί για αλληλούχιση, προκειμένου να γίνει εκτενέστερη εξέταση των γονιδιακών τόπων, που πιθανόν να οδηγούν στην παραγωγή αντιμικροβιακής ουσίας.

Κεφάλαιο 5: Βιβλιογραφία

Μαργαρίτης, Γ. (2010). αρχές και εφαρ µ ογές Εισαγωγή Γενικά για τη χρω µ ατογραφία, 1– 10. Χρωματογραφία, Κ., & Περίληψη, Σ. (1990). Κεφάλαιο 5. Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή. Χρω µ ατογραφία µ οριακής διήθησης. (2008). ATCC. (2010). 0003 Nutrient Agar/Broth, (Bd 213000), 1. Retrieved from papers2://publication/uuid/F95B3D87-A579-484F-81CA-9276936B4F49 ATCC. (2011). Yeast Malt Extract Agar. Technical Manual of Microbiological Media, (800), 66215. B’Bhatt, H., & Sharma, S. (2017). Synthesis and antimicrobial activity of pyrazole nucleus containing 2-thioxothiazolidin-4-one derivatives. Arabian Journal of Chemistry, 10, S1590–S1596. http://doi.org/10.1016/j.arabjc.2013.05.029 Balouiri, M., Sadiki, M., & Ibnsouda, S. K. (2016). Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis, 6(2), 71–79. http://doi.org/10.1016/j.jpha.2015.11.005 Batt, C. A. (2016). Microorganisms. Reference Module in Food Science, 8–9. http://doi.org/10.1016/B978-0-08-100596-5.03436-3 Behrendt, U., Ulrich, A., & Schumann, P. (2001). Description of Microbacterium foliorum sp. nov. and Microbacterium phyllosphaerae sp. nov., isolated from the phyllosphere of grasses and the surface litter after mulching the sward, and reclassification of Aureobacterium resistens (Funke et al. 1998) as . International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51(4), 1267–1276. http://doi.org/10.1099/00207713-51-4- 1267 Charcosset, C. (2012). Ultrafiltration. In Membrane Processes in Biotechnology and Pharmaceutics (pp. 43–99). http://doi.org/10.1016/B978-0-444-56334-7.00002-2 Compounds, B. (2014). Screening for Bioactive Compounds From Alage, 33(1), 21–30. Eiceman, G. a. (2006). Instrumentation of Gas Chromatography. Encyclopedia of Analytical Chemistry, 1–9. http://doi.org/10.1002/9780470027318.a5505 Emadian, S. M., Onay, T. T., & Demirel, B. (2017). Biodegradation of bioplastics in natural environments. Waste Management, 59, 526–536. http://doi.org/10.1016/j.wasman.2016.10.006 Funke, G., Lawson, P. A., Nolte, F. S., Weiss, N., & Collins, M. D. (1998). Aureobacterium resistens sp. nov., exhibiting vancomycin resistance and teicoplanin susceptibility. FEMS Microbiology Letters, 158(1), 89–93. http://doi.org/10.1016/S0378-1097(97)00506-5 González-Bello, C. (2017). Antibiotic adjuvants – A strategy to unlock bacterial resistance to

antibiotics. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. http://doi.org/10.1016/j.bmcl.2017.08.027 Gupta, V. K., Tuohy, M. G., Lohani, M., & O’Donovan, A. (2015). Biotechnology of Bioactive Compounds: Sources and applications. Biotechnology of Bioactive Compounds: Sources and Applications. http://doi.org/10.1002/9781118733103 Hammond, J. B., & Kruger, N. J. (1988). The bradford method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 3, 25–32. http://doi.org/10.1385/0-89603- 126-8:25 Ludwig, W., Euzéby, J., Schumann, P., Busse, H.-J., Trujillo, M. E., Kämpfer, P., & Whitman, W. B. (2012). Road map of the phylum Actinobacteria. In Bergey’s Manual® of Systematic Bacteriology (pp. 1–28). http://doi.org/10.1007/978-0-387-68233-4_1 Nireesha, G., Divya, L., Sowmya, C., Venkateshan, N., Niranjan Babu, M., & Lavakumar, V. (2013). Lyophilization/Freeze Drying -An Review. Ijntps, 3(4), 87–98. Ó’Fágáin, C., Cummins, P. M., & O’Connor, B. (2017). Gel-filtration chromatography. In Methods in Molecular Biology (Vol. 1485, pp. 15–25). http://doi.org/10.1007/978-1-4939- 6412-3_2 Rokas, A., & Carroll, S. B. (2006). Bushes in the tree of life. PLoS Biology. http://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040352 Spatafora, J. W., & Bushley, K. E. (2015). Phylogenomics and evolution of secondary metabolism in plant-associated fungi. Current Opinion in Plant Biology, 26, 37–44. http://doi.org/10.1016/j.pbi.2015.05.030 Takeuchi, M., & Yokota, A. (1994). Phylogenetic analysis of the genus Microbacterium based on 16S rRNA gene sequences. FEMS Microbiol Lett, 124, 11–16. Use, I., & Use, I. F. O. R. (1938). Potato Dextrose Agar, 33(0), 33–35. Ventura, M., Canchaya, C., Tauch, A., Chandra, G., Fitzgerald, G. F., Chater, K. F., & van Sinderen, D. (2007). Genomics of Actinobacteria: Tracing the Evolutionary History of an Ancient Phylum. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 71(3), 495–548. http://doi.org/10.1128/MMBR.00005-07 Verma, M., Lal, D., Kaur, J., Saxena, A., Kaur, J., Anand, S., & Lal, R. (2013). Phylogenetic analyses of phylum Actinobacteria based on whole genome sequences. Research in Microbiology, 164(7), 718–728. http://doi.org/10.1016/j.resmic.2013.04.002 Walsh, C. (2000). Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature, 406(6797), 775–781. http://doi.org/10.1038/35021219 Wohlleben, W., Mast, Y., Muth, G., Röttgen, M., Stegmann, E., & Weber, T. (2012). Synthetic Biology of secondary metabolite biosynthesis in actinomycetes: Engineering precursor supply as a way to optimize antibiotic production. FEBS Letters. http://doi.org/10.1016/j.febslet.2012.04.025 Zampieri, M., Zimmermann, M., Claassen, M., & Sauer, U. (2017). Nontargeted Metabolomics Reveals the Multilevel Response to Antibiotic Perturbations. Cell Reports, 19(6), 1214– 1228. http://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.04.002