BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
BÙI NGỌC THANH
NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG ẤU TRÙNG SÁN LÁ CÓ KHẢ NĂNG LÂY TRUYỀN CHO NGƢỜI NHIỄM TRÊN CÁ Ở KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI - 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
BÙI NGỌC THANH
NGHIÊN CỨU HIỆN TRẠNG ẤU TRÙNG SÁN LÁ CÓ KHẢ NĂNG LÂY TRUYỀN CHO NGƢỜI NHIỄM TRÊN CÁ Ở KHU VỰC MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM
CHUYÊN NGÀNH: KÝ SINH TRÙNG HỌC
MÃ SỐ: 62.42.01.05
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. PHAN THỊ VÂN
2. TS. NGUYỄN VĂN HÀ
HÀ NỘI - 2017 i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình do bản thân tôi thực hiện. Các trích dẫn trong Luận án theo các nguồn công bố đầy đủ. Số liệu, kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chƣa công bố hoặc công bố trong các bài báo khoa học mà tôi là tác giả hoặc đồng tác giả.
Tác giả luận án
Bùi Ngọc Thanh
ii
LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Phan Thị Vân, ngƣời thầy đã luôn động viên, khích lệ đúng lúc và có những góp ý, phản biện khoa học sâu sắc giúp tôi hoàn thành Luận án này.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Hà, một ngƣời thầy hƣớng dẫn có nhiều kinh nghiệm và chuyên môn sâu về lĩnh vực ký sinh trùng, làm việc với TS. Hà đã giúp tôi tích lũy nhiều kinh nghiệm quý báu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt cho GS. Darwin Murrell, ngƣời đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong công tác nghiên cứu và cũng là ngƣời cộng tác khoa học nhiệt tình của tôi trong hơn 10 năm qua.
Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Tập thể cán bộ và Lãnh đạo Trung tâm Quan trắc Môi trƣờng và Bệnh Thủy sản khu vực miền Bắc, đặc biệt là chị Nguyễn Thị Nguyện và em Phạm Thị Thanh vì những hỗ trợ đắc lực trong công tácphân tích, xét nghiệm và làm thí nghiệm. Xin đƣợc cảm ơn ông Trần Anh Tuấn, giám đốc Trung tâm Tƣ vấn, Sản xuất, Dịch vụ và Chuyển giao Công nghệ Thủy sản, đã luôn tạo điều kiện thuận lợi trong công việc để tôi có thể hoàn thành tốt Luận án này. Xin cảm ơn tất cả những tình cảm và chia sẻ của tập thể Phòng ký sinh trùng, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Xin đƣợc cảm ơn Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ quốc gia (NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này.
Cuối cùng, tôi xin giành lời cảm ơn đặc biệt vợ đã luôn ở bên cạnh, động viên, chăm sóc và lo lắng mọi công việc gia đình để tôi yên tâm nghiên cứu, học tập và hoàn thành Luận án này.
Một lần nữa xin đƣợc cảm ơn tất cả vì sự ủng hộ cho bản Luận án này!
Bùi Ngọc Thanh iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...... i
LỜI CÁM ƠN ...... ii
MỤC LỤC ...... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...... vi
DANH MỤC BẢNG ...... vii
DANH MỤC HÌNH ...... ix
PHẦN MỞ ĐẦU ...... 1
Đặt vấn đề______1
Mục tiêu nghiên cứu ______2
Nội dung nghiên cứu ______2
Những đóng góp mới của Luận án ______3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU ...... 4
1.1. Đặc điểm vòng đời sán lá truyền qua cá ______4
1.2. Nghiên cứu sán lá truyền lây qua cá trên thế giới ______5 1.2.1. Sán lá truyền qua cá trên ngƣời ______5 1.2.2. Ấu trùng sán lá truyền qua cá ở động vật thủy sản ______8
1.3. Nghiên cứu sán lá truyền lây qua cá trong nƣớc ______12 1.3.1. Sán lá truyền qua cá trên ngƣời ______12 1.3.2. Sán lá truyền qua cá trên động vật ______14 1.3.3. Ấu trùng sán lá truyền qua cá trên ốc ______16 1.3.4. Ấu trùng sán lá trên cá ______17
1.4. Điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội khu vực miền núi phía Bắc ______29 1.4.1. Điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội ______29 1.4.2. Đặc điểm hồ Thác Bà, Yên Bái ______30 iv
1.5. Những tồn tại trong nghiên cứu về sán lá truyền qua cá ______32
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 34
2.1. Cách tiếp cận ______34
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ______35
2.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu ______35
2.4. Phƣơng pháp thu mẫu, bảo quản và định danh cá ______36
2.5. Kỹ thuật phân lập và định loại sán lá truyền qua cá ______39 2.5.1. Phân lập ấu trùng sán lá từ cá ______40 2.5.2. Định loại sán lá truyền qua cá ______42
2.6. Xác định điều kiện bất hoạt và lƣu giữ ấu trùng sán lá truyền qua cá ______45 2.6.1. Bố trí các thí nghiệm xác định điều kiện bất hoạt ______46 2.6.3. Kỹ thuật xác định ấu trùng bất hoạt ______54
2.6. Phân tích và xử lý số liệu ______54
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...... 56
3.1. Thành phần ấu trùng sán lá nhiễm trên cá ở khu vực miền núi phía Bắc ____ 56 3.1.1. Ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ______56 3.1.2. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio ______59 3.3.3. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui ______62 3.3.4. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis yokogawai ______64 3.3.5. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Procerovum varium ______65 3.1.6. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Centrocestus formosanus ______66
3.2. Kết quả khảo sát nhanh ấu trùng sán ở khu vực miền núi phía Bắc ______68 3.2.1. Tình hình nhiễm ấu trùng sán lá trên cá ______68 3.2.2. Thành phần ấu trùng sán lá nhiễm trên cá ở các loại hình mặt nƣớc ______68
3.3. Kết quả nghiên cứu về sán lá nhiễm trên cá tại hồ Thác Bà ______75 3.3.1. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ ______75 3.3.2. Ấu trùng sán lá gan nhỏ ______79 v
3.4. Điều kiện bất hoạt ấu trùng sán lá truyền qua cá ______85 3.4.1. Điều kiện đông lạnh ______85 3.4.2. Điều kiện gia nhiệt ______91 3.4.3. Điều kiện ƣớp muối ______94 3.4.4. Điều kiện kháng sinh và praziquantel ______97 3.4.5. Điều kiện nƣớc chanh và rƣợu ______99
3.5. Thảo luận chung ______102 3.5.1. Hiện trạng ấu trùng sán lá nhiễm trên cá ở Khu vực miền núi phía Bắc ___ 102 3.5.2. Sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ______104
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...... 112
4.1. Kết luận ______112
4.2. Kiến nghị ______113
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ...... 114
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...... 115
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CĐN Cƣờng độ nhiễm
Viện trợ phát triển quốc tế của Đan Mạch - Danish International DANIDA Development Agency
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu long
ĐBSH Đồng bằng sông Hông
Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu - European Food Safety EFSA Authority
Tổ chức quản lý thuốc và thực phẩm Hoa kỳ - Food Drug FDA Administration
Dự án Ký sinh trùng có nguồn gốc Thủy sản – Fishborne Zoonotic FIBOZOPA Parasites in Vietnam
Hiệp hội nghiên cứu ung thƣ quốc tế - International Association IARC Research Cancers
Max Giá trị lớn nhất – Maximum
Min Giá trị nhỏ nhất – Minimum
MNPB Miền núi phía Bắc Việt Nam
N Số lƣợng mẫu kiểm tra
NTTS Nuôi trồng thủy sản
PBS Nƣớc muối sinh lý (0,89% muối) – Physical Biology Saline
SD Độ lệch chuẩn – Standard deviation
SLTQC Sán lá truyền qua cá lây nhiễm cho ngƣời
TLN Tỉ lệ nhiễm
WHO Tổ chức Y tế thế giới – World Health Organization
vii
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Sán lá truyền qua cá trên người tại một số vùng dịch tễ ở nước ta ...... 14 Bảng 1.2: Sán lá truyền qua cá trên động vật tại một số vùng dịch tễ ở nước ta ..... 15 Bảng 1.3: Danh mục loài cá đã được xác định nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ ...... 23 Bảng 1.4: Danh mục loài cá đã được xác định nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ ...... 24
Bảng 2.1: Địa điểm thu mẫu khảo sát ấu trùng sán lá truyền qua cá ...... 35 Bảng 2.2: Các loài cá thu được ở khu vực miền núi phía Bắc ...... 36 Bảng 2.3: Các loài cá thu được ở hồ Thác Bà, Yên Bái ...... 38 Bảng 2.4: Thí nghiệm thực nhằm xác định điều kiện bất hoạt ấu trùng sán lá ...... 46 Bảng 2.5: Thí nghiệm đông lạnh nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá ruột nhỏ ...... 47 Bảng 2.6: Thí nghiệm đông lạnh bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ ...... 48 Bảng 2.7: Thí nghiệm đông lạnh bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ trong cá...... 48 Bảng 2.8: Thí nghiệm gia nhiệt nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá ruột nhỏ ...... 49 Bảng 2.9: Thí nghiệm gia nhiệt nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ ...... 50 Bảng 2.10: Thí nghiệm ngâm muối nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ ...... 50 Bảng 2.11: Thí nghiệm ướp muối cá nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ ...... 51 Bảng 2.12: Thí nghiệm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ bằng praziquantel ...... 52 Bảng 2.13: Thí nghiệm dùng nước chanh để bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ ...... 53 Bảng 2.14: Thí nghiệm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ bằng rượu gạo ...... 53 Bảng 2.15: Tiêu chí căn cứ xác định ấu trùng sán lá bất hoạt ...... 54
Bảng 3.1: Ấu trùng các loài sán lá truyền qua cá ở khu vực miền núi phía Bắc ..... 56 Bảng 3.2: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ...... 58 Bảng 3.3: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio ...... 60 Bảng 3.4: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui ...... 63 Bảng 3.5: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis yokogawai...... 64 Bảng 3.6: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Procerovum varium ...... 66 Bảng 3.7: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruôt nhỏ Centrocestus formosanus ...... 67 Bảng 3.8: Tỉ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng sán lá trên cá ...... 68 viii
Bảng 3.9: Thành phần và mức độ nhiễm ấu trùng sán lá theo thủy vực ...... 69 Bảng 3.10: Thành phần và mức độ nhiễm ấu trùng sán lá trên cá ao ...... 70 Bảng 3.11: Thành phần ấu trùng sán lá nhiễm trên cá sông suối ...... 71 Bảng 3.12: Thành phần ấu trùng sán lá trên cá hồ chứa ...... 73 Bảng 3.13: Ấu trùng sán lá ruột nhỏ nhiễm trên cá hồ Thác Bà ...... 75 Bảng 3.14: Thành phần, tỉ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng sán lá ...... 77 Bảng 3.15: Tỉ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ ...... 79 Bảng 3.16: Biến động mùa vụ ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá tại hồ Thác Bà...... 81 Bảng 3.17: Vật chủ của sán lá gan nhỏ ở khu vực miền núi phía Bắc ...... 106
ix
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vòng đời sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ...... 4 Hình 1.2: Các tinh thuộc khu vực miền núi phía Bắc, Việt Nam ...... 30 Hình 1.3: Khu vực vùng của hồ Thác Bà, Yên Bái ...... 31
Hình 2.1. Cách tiếp cận của nghiên cứu ...... 34 Hình 2.2: Quy trình chung để xác định thành phần ấu trùng sán nhiễm trên cá .... 39 Hình 2.3: Quy trình phân lập ấu trùng sán lá truyền qua cá ...... 40 Hình 2.4: Ấu trùng sán thoát khỏi bào nang ...... 43
Hình 3.1: Ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis ...... 57 Hình 3.2: Sự khác biệt về kích cỡ ấu trùng sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ ...... 57 Hình 3. 3: Bào nang ấu trùng Haplorchis pumilio ...... 60 Hình 3. 4: Bào nang ấu trùng Haplorchis taichui ...... 62 Hình 3. 5: Bào nang ấu trùng Haplorchis yokogawai ...... 64 Hình 3. 6: Bào nang ấu trùng Procerovum varium ...... 65 Hình 3. 7: Bào nang ấu trùng Centrocestus formosanus ...... 66 Hình 3.8: Tép dầu, vật chủ ấu trùng sán lá gan nhỏ ở hồ Thác Bà, Yên Bái ...... 80 Hình 3.9: Mương xanh, vật chủ của sán lá gan nhỏ tại hồ Thác Bà ...... 82 Hình 3.10: Biến động ấu trùng sán lá gan nhỏ theo tháng trên cá tại hồ Thác Bà .. 83 Hình 3.11: Biến ấu trùng sán lá gan nhỏ trên Tép dầu hồ Thác Bà ...... 84 Hình 3.12: Tỷ lệ sống sót của ấu trùng H. pumilio trong điều kiện đông lạnh ...... 85 Hình 3.13: Ấu trùng sán lá ruôt nhỏ H. pumilio trong điều kiện đông lạnh ...... 87 Hình 3.14: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong điều kiện đông lạnh ...... 88 Hình 3.15: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong cá đông lạnh ...... 89 Hình 3.16: Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong cá đông lạnh ...... 90 Hình 3.17: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng H. pumilio trong điều kiện gia nhiệt ...... 91 Hình 3.18: Ấu trùng sán lá ruột nhỏ H. pumilio trong điều kiện gia nhiệt ...... 92 Hình 3.19: Tỉ lệ ấu trùng C. sinensis sống sót trong điều kiện gia nhiệt ...... 93 x
Hình 3.20: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong điều kiện muối ...... 94 Hình 3.21: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong cá ướp muối ...... 95 Hình 3.22: Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong điều kiện muối ...... 96 Hình 3.23: Tỉ lệ sống của ấu trùng C. sinensis lưu giữ trong kháng sinh ...... 97 Hình 3.24: Tỉ lệ ấu trùng C. sinensis bất hoạt trong praziquantel ...... 98 Hình 3.25: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong nước chanh ...... 100 Hình 3.26: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong rượu ...... 101 Hình 3.27: Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong điều kiện đông lạnh ...... 110
1
PHẦN MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Sán lá truyền lây qua cá (SLTQC) hiện vẫn đang là một vấn nhức nhối đối với sức khỏe cộng đồng các nƣớc thuộc khu vực Châu Á. SLTQC nhƣ sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis và Opisthorchis viverrini gây ra các bệnh lý về gan mật, nhƣ xơ gan, tắc ống mật và thậm chí là có thểdẫn tới ung thƣ đƣờng ống mật ở ngƣời bệnh [1–3]. Con ngƣời nhiễm SLTQC do ăn gỏi cá hoặc cá nấu chƣa chín có nhiễm ấu trùng các loài sán này. Do vậy, việc nghiên cứu về ấu trùng SLTQC trên cá là yêu cầu cấp bách nhằm tạo cơ sở khoa học để kiểm soát SLTQC, bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Ở nƣớc ta, những năm gần đây, SLTQC trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản (NTTS) đã bắt đầu đƣợc quan tâm bởi nó liên quan đến an toàn vệ sinh thực phẩm. Đã có nhiều nghiên cứu khảo sát về ấu trùng SLTQC tại nhiều vùng trong cả nƣớc nhƣ đồng bằng sông Hồng (ĐBSH), đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và miền Trung. Những khảo sát này đều đã ghi nhận sự hiện diện ấu trùng SLTQC trên động vật thủy sản (cá) nhƣ một mối nguy đối với sức khỏe cộng đồng. Đặc biệt, ấu trùng của các loài sán lá ruột nhỏ nhƣ Haplorchis pumilio chƣa từng đƣợc ghi nhận trên ngƣời thì thì nay xuất hiện phổ biến ở cá. Trong khi đó, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis, đƣợc cho là nhiễm phổ biến trên ngƣời [4–6] và động vật thủy sản [5,7] thì những nghiên cứu gần đây lại ít gặp và có mức độ nhiễm thấp trên động vật thủy sản, cá [8–11].
Khu vực miền núi phía Bắc (MNPB) là vùng thƣợng nguồn của hệ thống sông ngòi tạo nên vùng châu thổ sông Hồng; nơi này có các hệ thống sông suối, hồ chứa lớn, là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của động vật thủy sản nhƣ cá, tôm,… đây là nguồn thực phẩm quan trọng của ngƣời dân và cũng có thể là mối nguy với sức khỏe bởi SLTQC do tập quán ăn gỏi cá ở đây [12]. Hiện nay, hầu nhƣ chƣa có khảo sát nào về vấn đề SLTQC trên các động vật thủy sản tại MNPB, ngoại trừ có báo cáo về ấu trùng sán lá ruột Centrocestus formosanus nhƣng là trên khía cạnh tác nhân gây bệnh cho cá [13]. Chính vì vậy, cần thiết phải tiến hành khảo sát 2 về ấu trùng SLTQC tại đây nhằm bổ sung thông tin về vùng dịch tễ, đối tƣợng nhiễm và sự biến động mùa vụ để thấy đƣợc bức tranh tổng thể về hiện trạng SLTQC ở Việt Nam nói chung.
Hơn nữa, hầu hết các nghiên cứu về SLTQC ở Việt Nam trong thời gian gần chủ yếu trung vào điều tra, khảo sát nhằm xác định vùng phân bố của SLTQC, mức độ nhiễm và đối tƣợng nhiễm. Tập quán ăn gỏi cá vẫn khá phổ biến không chỉ ở khu vực ĐBSH [14] mà cả MNPB [12]. Trong khi đó, những mô hình can thiệp thử nghiệm nhằm giảm thiểu sự lây nhiễm ấu trùng SLTQC trong nuôi hệ thống NTTS vẫn chƣa thực sự hiệu quả [10,15,16]. Do vậy cần phải có những nghiên cứu xác định các điều kiện để vô hiệu hóa khả năng lây nhiễm của ấu trùng SLTQC cho con ngƣời, đây là cơ sở khoa học để xây dựng các hƣớng dẫn trong bảo quản, chế biến sản phẩm thủy sản đảm bảo an toàn với SLTQC nhƣ sán lá gan nhỏ C. sinensis.
Với kinh nghiệm, hiểu biết và trăn trở của bản thân về vấn đề SLTQC ở Việt Nam, chúng tôi đã triển khai Đề tài “Nghiên cứu hiện trạng ấu trùng sán lá có khả năng lây truyền cho người nhiễm trên cá ở Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam” làm Luận án tiến sỹ với những mục tiêu cụ thể nhƣ sau:
Mục tiêu nghiên cứu
1) Xác định đƣợc thành phần ấu trùng sán lá truyền qua cá và sự phân bố của chúng trên cá ở khu vực miền núi phía Bắc; 2) Xác định đƣợc sự biến động mùa vụ của ấu trùng sán lá truyền qua cá phổ biến trên cá ở khu vực miền núi phía Bắc; 3) Xác định đƣợc các điều kiện chế biến và bảo quản có khả năng bất hoạt ấu trùng sán lá truyền qua cá;
Nội dung nghiên cứu
Để đạt đƣợc những mục tiêu nêu trên, Đề tài đã thực hiện 3 nội dung nghiên cứu chính nhƣ sau: 1) Nghiên cứu thành phần ấu trùng sán lá có khả năng gây bệnh cho ngƣời trên cá tại một số tỉnh (Thái Nguyên, Yên Bái, Lào Cai, Điện Biên, và Sơn 3
La) thuộc khu vực miền núi phía Bắc; 2) Nghiên cứu sự biến động của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên một số loài cá tại khu vực hồ Thác Bà, Yên Bái; 3) Nghiên cứu điều kiện bất hoạt và lƣu giữ ấu trùng sán lá truyền qua cá;
Những đóng góp mới của Luận án
Đƣa Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam vào trong bản đồ phân bố chung của sán lá truyền qua cá (ấu trùng của 6 loài sán lá gồm C. sinensis, H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, C. formosanus và P. varium) ở Việt Nam, trong đó đặc biệt là nghiên cứu đã xác định đƣợc vùng dịch tễ mới và hết sức quan trọng của sán lá gan nhỏ C. sinensis là vùng hồ Thác Bà, Yên Bái, đây không chỉ là đóng góp mới với Việt Nam mà cả với khu vực.
Nghiên cứu đã phát hiện thêm 6 loài vật chủ mới gồm Tép dầu, Ngão gù, cá Nhƣng, Cháo thƣờng, Dầm đất và Bống hoa vào danh mục vật chủ của sán lá gan nhỏ tại Việt Nam, trong đó đặc biệt là cá Tép dầu T. houdemeri đƣợc xác định nhƣ vật chủ đặc trƣng, vật chủ chỉ thị của sán lá gan nhỏ C. sinensis ở Việt Nam. Việc xác định đƣợc vật chủ chỉ thị có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc khảo sát xác định vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ này.
Nghiên cứu đã bổ sung cơ sở khoa học mới về điều kiện bất hoạt ấu trùng sán lá truyền qua cá, đặc biệt là ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis góp phần xây dựng các hƣớng dẫn trong việc chế biến và bảo quản đúng quy trình nhằm đảm bảo an toàn đối với ấu trùng sán lá trong các sản phẩm thủy sản.
4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Đặc điểm vòng đời sán lá truyền qua cá
SLTQC có vòng đời phức tạp qua nhiều giai đoạn vật chủ khác nhau; vật chủ trung gian thứ 1 (ốc, nhuyễn thể), vật chủ trung gian thứ 2 (cá, tôm) và vật chủ cuối cùng hay vật chủ chính (ngƣời và động vật ăn cá). Hình 1.1 là vòng đời của sán lá gan nhỏ C. sinensis, đại diện cho SLTQC.
Nguồn: [17]
Hình 1.1: Vòng đời sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis Sán lá gan nhỏ C. sinensis trƣởng thành sản sinh ra trứng (b), trứng thoát ra ngoài theo phân của vật chủ cuối cùng, vào môi trƣờng nƣớc. Ốc (B) – Vật chủ trung gian thứ 1, trong môi trƣờng nƣớc đã thụ động hoặc chủ động nhiễm trứng sán 5 trong quá trình lọc mùn bã hữu cơ làm thức ăn. Trong vật chủ ốc phù hợp, trứng sẽ phát triển qua một số giai đoạn (c, d, e, f) để thành trùng đuôi gọi là cercariae (f). Cercariae đƣợc thải ra ngoài môi trƣờng nƣớc khi đã phát triển hoàn thiện, sau đó xâm nhập vào cá – Vật chủ trung gian thứ 2 (C). Cercariae rụng đuôi, xâm nhập qua da, di chuyển đến các mô và phát triển thành bào nang gọi là metacercariae (g) trong loài vật chủ cá phù hợp. Ngƣời hoặc động vật ăn (A) cá sống hoặc cá nấu chƣa chín có chứa ấu trùng, nang ấu trùng bị phá vỡ trong tá tràng, sán non thoát khỏi nang và phát triển thành sán trƣởng thành (a) trong túi mật và đƣờng ống mật trong gan [17].
1.2. Nghiên cứu sán lá truyền lây qua cá trên thế giới
1.2.1. Sán lá truyền qua cá trên người
1.2.1.1. Sự phân bố của sán lá truyền qua cá
Ngƣời đƣợc xem là vật chủ chính của SLTQC. Tổng kết qua những công trình nghiên cứu đăng trên tạp chí quốc tế, Nguyễn Mạnh Hùng và cs. (2013) đã công bố; toàn cầu có 12 loài sán lá gan nhỏ thuộc họ Opisthorchiidae và 47 loài sán lá ruột nhỏ thuộc 3 họ trong đó 36 loài thuộc họ Heterophidae, 10 loài thuộc họ Echinostomatidae và 1 loài thuộc họ Nanophyetidae [18]. Hầu hết các nghiên cứu về SLTQC đều quan tâm đến nhóm sán lá gan nhỏ trong đó đặc biệt là C. sinensis và O. viverrini.
Sán lá gan nhỏ C. sinensis phân bố chủ yếu ở các quốc gia và khu vực bao gồm Trung Quốc, Hàn Quốc, khu vực miền Bắc Việt Nam và vùng Viễn Đông Nga [1,19–21]. Hiện có khoảng 200 triệu ngƣời có nguy cơ lây nhiễm và hơn 15 triệu ngƣời đã nhiễm C. sinensis trên toàn cầu, trong đó Trung Quốc có số ngƣời nhiễm nhiều nhất, khoảng 13 triệu ngƣời [17], Hàn Quốc có khoảng 1,4 triệu ngƣời nhiễm C. sinensis và nơi có tỉ lệ nhiễm cao nhất (40-48%) là cộng đồng dân cƣ gần Sông Nakdong [22]. Vùng Viễn Đông thuộc Nga, đặc biệt khu vực gần Sông Amur, ƣớc tính có khoảng 3000 ngƣời nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis [23,24].
Vùng dịch tễ của O. viverrini chủ yếu là các khu vực thuộc hệ thống sông 6
Mekong qua các nƣớc Thái Lan, Lào, Căm-Phu-Chia và Việt Nam. Trong đó, Thái Lan là vùng dịch tễ lớn nhất của sán lá gan nhỏ O. viverrini, tỉ lệ nhiễm trung bình là 14%, ƣớc tính khoảng 7 triệu ngƣời nhiễm theo kết quả điều tra năm 1980-1981 [25]. Sau nhiều nỗ lực can thiệp, Thái Lan hiện có khoảng 6 triệu ngƣời nhiễm O. viverrini [26]. Tại Lào, có khoảng 1,7 triệu ngƣời nhiễm sán lá gan nhỏ O. viverrini năm 1992 [24]. Vùng dịch tễ của O. viverrini trên ngƣời tại Lào cũng nằm dọc theo sông Mekong, nhƣ tỉnh Khammuane, Saravane hoặc Savannakhet, nơi có tỉ lệ nhiễm tƣơng ứng là 32,2%; 21,5% và 25,9% [27], một số vùng của huyện Saravane còn đƣợc ghi nhận tỉ lệ nhiễm loài sán lá gan này tới 58,5% trong báo cáo cách đây khoảng 10 năm [28]. Tại Căm – Pu - Chia, trong một điều tra nghiên cứu tập trung vào sán lá gan nhỏ O. viverrini tại một số cộng đồng ngƣời sống dọc sông Mekong cho thấy tỉ lệ nhiễm O. viverrini là trên 10% [29] và trƣớc đó O. viverrini cũng đƣợc báo cáo tại đây [30].
Sán lá gan nhỏ O. felineus, mới đây tiếp tục đƣợc ghi nhận trên ngƣời ở khu vực phía Tây Siberia (Liên Bang Nga) nhƣ Tomsk Oblast, Khanty Mansiysk Autonomous Okrug [31]. Một điều tra dịch tễ trên ngƣời dựa trên phƣơng pháp Kato-Katz, các nhà khoa học đã cho biết có tới 55,3% số ngƣời đƣợc xét nghiệm dƣơng tính với trứng của O. felineus tại cộng đồng dân cƣ khu vực phía Tây Siberia [32].
1.2.1.2. Vấn đề sức khỏe cộng đồng
Một số loài SLTQC có ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng nhƣ sán lá gan nhỏ. Sán lá gan nhỏ có thể tồn tại trong ống mật của ngƣời bệnh tới 26 năm [33]. Năm 2009, Hiệp hội nghiên cứu ung thƣ quốc tế đã xếp sán lá gan nhỏ C. sinensis và O. viverrini vào nhóm tác nhân gây ung thƣ (nhóm 1) ở ngƣời [34].
Phân tích dựa trên hàng loạt các công trình nghiên cứu đƣợc xuất bản đăng trên tạp chí quốc tế cho thấy nguy cơ (Incidence Risk Ratio - IR) dẫn đến ung thƣ của các nhóm ngƣời; 1) nhiễm sán lá gan nhỏ, 2) nhiễm vi rút gây viêm gan B và 3) nhiễm vi rút viêm gan C tƣơng ứng là là 4,8; 2,6 và 1,8. Nhƣ vậy, có thể thấy nhiễm sán lá gan nhỏ có nguy cơ dẫn đến ung thƣ gan ở ngƣời cao hơn so với ngƣời nhiễm 7 vi rút viêm gan B và viêm gan C [35]. Tại Hàn Quốc, một nghiên cứu dịch tễ đã chứng minh điều tƣơng tự; nghiên cứu tại 3 vùng có tỉ lệ ngƣời chết do ung thƣ đƣờng ống mật là 0,3; 1,8 và 5,5 trên 100.000 ngƣời thì tỉ lệ ngƣời nhiễm C. sinenis tƣơng ứng là 2,1%, 7,8%, và 3,3% [36]. Phân tích những bệnh nhân bị bệnh ung thƣ gan cũng cho thấy mối tƣơng quan chặt chẽ của những ngƣời có tiền sử ăn gỏi cá nƣớc ngọt với kết quả xét nghiệm máu dƣơng tính sán lá gan nhỏ C. sinensis và bệnh ung thƣ gan [37]. Và có khoảng 10% số bệnh nhân bị ung thƣ đƣờng ống mật là do nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis [20].
Sán lá gan nhỏ O. viverrini có thể gây một số những bệnh lý về gan bao gồm tiến triển xơ hóa mô gan và ung thƣ đƣờng ống mật. Gần 25% số ngƣời nhiễm sán lá gan nhỏ này bị xơ hóa và 1% tiển triển thành ung thƣ đƣờng ống mật [38]. Theo thống kê, có khoảng 10.000 đến 20.000 ca bệnh ung thƣ đƣờng ống mật mới đƣợc chỉ định phẫu thuật mỗi năm [3]. Trong một nghiên cứu tại khu vực Đông Bắc Thái Lan, 47.258 ngƣời đƣợc sàng lọc thì có 42,2% ngƣời nhiễm O. viverrini và 2.661 trƣờng hợp đƣợc xác định đã bị ung thƣ đƣờng ống mật [39].
Sán lá ruột nhỏ hầu hết không gây bệnh nghiêm trọng nhƣ sán lá gan nhỏ trừ một số trƣờng hợp nhiễm nặng. Bệnh lý thông thƣờng gây ra bởi sán lá ruột nhỏ là hiện tƣợng teo lông nhung ruột, tăng sinh tế bào niêm mạc với mức độ khác nhau [40]. Nghiêm trọng hơn, một số loài nhƣ Stellantchasmus falcatus, Haplorchis spp. và Procerovum spp. ký sinh lạc chỗ ở ngƣời, có thể dẫn đến tử vong; vị trí lạc chỗ gây nguy hiểm là van tim, não bộ và tủy sống [41]. Trứng của sán lá ruột nhỏ Heterophyes heterophyes đã đƣợc tìm thấy đóng kén trong não của bệnh nhân có triệu chứng thần kinh là một bằng chứng cụ thể về hiện tƣợng lạc chỗ của SLTQC [42].
Rất khó để thống kê đầy đủ về những tổn thất/thiệt hại do SLTQC gây ra cho xã hội trên toàn cầu. Chỉ riêng Thái Lan, hàng năm nƣớc này mất khoảng 120 triệu đô la Mỹ cho chi phí y tế (khám và chữa bệnh) và giảm công lao động do ngƣời bệnh không thể tham gia vào hoạt động sản xuất [26].
8
1.2.2. Ấu trùng sán lá truyền qua cá ở động vật thủy sản
1.2.2.1. Những nghiên cứu về ấu trùng sán lá truyền qua cá ở động vật thủy sản
Các nhà ký sinh trùng học ngƣời Nhật bản là những ngƣời đã góp công lớn trong việc làm sáng tỏ vòng đời của sán lá gan C. sinensis là đại diện cho những loài SLTQC nói chung và những hiểu biết về dịch tễ học của bệnh. Harujiro Kobayashi là ngƣời đầu tiên xác định cá thuộc họ cá chép là ký chủ trung gian thứ 2 của C. sinensis vào năm 1912 [43].
Trung Quốc là vùng dịch tễ của SLTQC, đặc biệt là sán lá gan nhỏ C. sinensis. Nghiên cứu điều tra dịch tễ học trên cá nƣớc ngọt và tôm tại 32 điểm, 9 vùng thuộc Đồng bằng Sông Pearl. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ trung bình trên cá là 37,09% (2,160/5,824) với cƣờng độ là 14.269 ấu trùng trên mỗi cá nhiễm và 0,460 ấu trùng/g. Trong đó cá nuôi nhiễm 36,69% với 10,743 ấu trùng/cá nhiễm và 0,312 ấu trùng/g; cá tự nhiên nhiễm tới 40,50% với 41,829 ấu trùng/cá nhiễm và 8,812 ấu trùng/g. Tôm nhiễm 3,07% với cƣờng độ 1,00 ấu trùng/tôm nhiễm. Cá Pseudorasbora parva và Ctenopharyngodon idellus (Trắm cỏ) có tỷ lệ nhiễm cao nhất [44].
Shen và cs. (2010) cũng đã có nghiên cứu dịch tễ học về hiện trạng sán lá gan nhỏ trên cá tƣ nhiên tại các Sông thuộc các địa hạt Sanjiang, Rongan, Rongshui, Liucheng, Liuzhou và Xiangzhou, Trung Quốc. Tổng số 16.204 cá thể thuộc 35 loài thu đƣợc, đã tìm thấy C. sinensis trên 32 loài với tỷ lệ nhiễm chung là 10,5% và cƣờng độ 4,6 metacercariae/g. Tỷ lệ nhiễm cao nhất 21,5% và cƣờng độ 9,9/g trên cá P. parva, tiếp theo là Zacco platypus 17,8% và 8,9/g. Có sự dao động về tỷ lệ nhiễm giữa các vùng; Xiangzhou 12,3% Sanjiang 9,1% và Liuzhou 9,7% và giữa các mùa trong năm; cao ở mùa Hè và Thu, nhƣng thấp hơn ở mùa Xuân và Đông. Cá sống các tầng đáy có tỷ lệ nhiễm cao hơn so với tầng mặt và tầng giữa. Các loài cá ăn tạp và ăn thực vật nhiễm cao hơn so với các loài cá ăn động vật [44].
Năm 2007 - 2008, Hàn Quốc đã có một khảo sát toàn quốc về hiện trạng ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá nƣớc ngọt. Khảo sát thực hiện tại 34 vùng 9 trong cả nƣớc và thu đƣợc 677 mẫu cá thuộc 21 loài khác nhau. Trong đó 8 loài thuộc 17 vùng khác nhau dƣơng tính. Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm khác nhau giữa các loài: cá P. parva nhiễm với tỉ lệ 48% (1- 1.142 ấu trùng/cá), Pungtungia herzi nhiễm 60% (1-412 ấu trùng/cá); Pseudogobio esocinus nhiễm 15,7% (1-23 ấu trùng/cá); Acheilognathus intermedia nhiễm 29% (1-7 ấu trùng/cá); Odontobutis interrupta nhiễm 21% (1-4 ấu trùng/cá); Zacco temmincki nhiễm 33% (1- 6 ấu trùng/cá), Z. platypus nhiễm 3,6% (1-4 ấu trùng/cá) và Hemibarbus labeo nhiễm với tỉ lệ 26,3% và cƣờng độ trung bình là 1 ấu trùng/cá [45]. Một nghiên cứu khác trên diện rộng về sán lá gan nhỏ ở 2 loài cá là P. herzi và Squalidus japonicus coreanus tại 3 vùng địa lý khác nhau Bắc, Trung và Nam, Hàn Quốc. Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm trên 2 loài cá này ở miền Bắc đƣợc ghi nhận là rất thấp; 0,7% và 2,6 ấu trùng/cá trong khi đó miền Trung nhiễm 12,8% và 164 ấu trùng/cá và miền Nam tỷ lệ nhiễm rất cao 39,5% và 159 ấu trùng/cá [46]. Bên cạnh sán lá gan nhỏ, sán lá ruột nhỏ cũng đƣợc xác nhận có sự phân bố khá phức tạp tại Hàn Quốc. Có 8 loài sán lá ruột nhỏ bao gồm M. yokogawai, M. takahashii, M. miyatai, C. armatus, E. hortense, E. cinetorchis, E. japonicus, hoặc P. muris phát hiện nhiễm trên cá nƣớc ngọt và 6 loài bao gồm H. nocens, H. continua, P. summa, S. falcatus, S. fuscata, và S. lari nhiễm trên cá nƣớc lợ [40].
Hồ Nhật Nguyệt, miền Trung của Đài Loan cũng đƣợc biết đến nhƣ là vùng dịch tễ bệnh sán lá gan nhỏ Clonorchiasis. Một nghiên cứu điều tra về thành phần loài và tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá trên cá Mƣơng xanh đã đƣợc thực hiện tại hồ này vào tháng 10 năm 1995. Số lƣợng ấu trùng sán thu đƣợc dao động từ 2 đến 2,185 ấu trùng/cá, trung bình là 254 ấu trùng/cá với tổng số 11,443 ấu trùng. Ấu trùng đƣợc phân loại là 4,064 (96,23%) H. taichui; 90 (2,13%) H. pumilio, chỉ 2 (0,05%) là C. sinensis và 67 (1,59%) ấu trùng chƣa định loại [47]. Wang và ctv (2002) đã ghi nhận H. pumilio, H. taichui và C. sinensis nhiễm với tỷ lệ lần lƣợt là 16,2%, 3,3% và 0,9% trên cá cá Trắm cỏ thu đƣợc từ các ao nuôi tại thị trấn Meinug, Đài Loan [48].
Tại Thái Lan, 9 loài cá tự nhiên thuộc họ cá chép thu tại Hồ chứa nhân tạo và 10 tự nhiên tại huyện Ban Pao, tỉnh Chiang Mai, Thái Lan có nhiễm sán lá gan nhỏ O. viverrini, ngoài ra còn phát hiện ấu trùng sán lá ruột nhỏ họ Heterophidae nhƣ H. taichui, H. pumilio và Centrocestus spp. Đặc biệt sán lá ruột nhỏ H. taichui nhiễm cao hơn 384 lần so với sán lá gan nhỏ O. viverrini. Trong số các loài cá, Puntius leiacanthus nhiễm H. taichui với cƣờng độ cao nhất; 182 ấu trùng/cá trong khi đó P. orphoides nhiễm O. viverrini nặng nhất; 1,4 ấu trùng/cá [49].
Hồ chứa lớn không những là môi trƣờng sống cho các loài động vật thủy sản mà còn là môi trƣờng sinh thái phù hợp cho sự phát triển của sán lá truyền qua cá. Thu mẫu và xét nghiệm tới 62 loài cá khác nhau tại 2 hồ chứa là Mae Ngad và Mae Kuang Udomtara tại tỉnh Chiang Mai, Thái Lan. Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện ít nhất 2 loài sán lá ruột nhỏ là Haplorchis taichui và Haplorchoides sp., nhiễm với tỷ lệ; 83,9 và 74,2% tƣơng ứng ở các hồ chứa nói trên [50].
1.2.2.2. Tính đặc trưng vật chủ của metacercariae
Một số loại ấu trùng SLTQC đƣợc xem là có vật chủ trung gian (loài cá) đặc trƣng. Theo Rhee et al (1980) đó là a xít linoleic trong nhớt đƣợc tiết ra từ biểu mô cá nó giúp vật chủ kháng lại ấu trùng cercariae [51]. Nghiên cứu trƣớc đây cho thấy nhớt tiết ra từ biểu mô của cá vàng Cyprinus carpio và Aplocheilus latipes không chỉ hoạt hóa với cercariae mà còn cả với metacercariae [52]. Khả năng hoạt hóa của thành phần hóa học này khác nhau ở mỗi loài cá cũng nhƣ tác dụng đặc hiệu với mỗi loại ấu trùng sán. Đây cũng chính là lý do cá P. parva là vật chủ đặc trƣng của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis. Bởi theo nghiên cứu, nhớt của P. parva cần đến 8,5 giờ để làm chết cercariae của C. sinensis trong khi đó nhớt của loài cá khác chỉ mất đến 3-6 phút, mà thông thƣờng, cercariae chỉ cần cần 2-3 phút để xâm nhập qua da cá [52].
Theo tổng hợp, có đến khoảng 102 loài cá thuộc 59 giống, 15 họ tại Trung Quốc [53] và 80 loài thuộc 9 họ, trong đó 71 loài thuộc họ cá Chép tại Hàn Quốc [54,55] đƣợc xác định là vật chủ trung gian thứ 2 của sán lá gan nhỏ C. sinensis. Trong số đó phải kể đến các loài cá gồm Pseudorasbora parva, P. herzi và Abbottina spp. đƣợc xem là vật chủ đặc trƣng của ấu trùng C. sinensis [44–46,53]. Tại Thái 11
Lan, nhiều loài cá thuộc họ cá Chép nhƣ Puntius orphoides, P. leiacanyhus, Cyclochelicthys apogon, C. armartus, C. siaja và Hampala dispar đƣợc xác định nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini [56].
1.2.2.3. Biến động mùa vụ ấu trùng sán lá truyền qua cá
Trong thí nghiệm gây nhiễm cercariae của C. sinensis với cá Trắm cỏ, ở nhiệt độ dƣới 10oC, ấu trùng này không thể xâm nhập đƣợc vào cá, chỉ một số lƣợng nhỏ ấu trùng xâm nhập đƣợc ở nhiệt độ 15oC. Nhiệt độ tối ƣu nhất cho ấu trùng nhiễm vào cá là 25oC. Ở nhiệt độ này, có 84,5% ấu trùng phát triển một cách hoàn thiện sau 20 ngày nhƣng ở nhiệt độ 15oC để 75,6% ấu trùng phát triển hoàn thiện phải mất tới 50 ngày [57]. Nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy ấu trùng C. sinensis bắt đầu xuất hiện và nhiễm trên cá vào giai đoạn tháng 4 khi nhiệt độ tăng lên từ 16 đến 22,9oC và có xu hƣớng tăng cao vào tháng 6 và 7 khi nhiệt độ là 24- 27oC rồi sau đó giảm dần [53].
Tại Hàn Quốc, nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, ấu trùng C. sinensis nhiễm trên cá nhiều nhất là vào tháng 9 và thấp nhất vào tháng 12 và tháng 1 [58]. Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây lại cho thấy ấu trùng C. sinensis thƣờng thấy nhiễm nhiều trên cá giai đoạn từ tháng 4 đến tháng 7, đỉnh điểm là tháng 6 (giai đoạn mùa Hè) do cercariae thƣờng ít thoát ra khỏi ốc giai đoạn từ tháng 11 đến tháng 3 (giai đoạn mùa Đông) [55]. Huang và Khaw (1964) đã có khảo sát về mùa vụ nhiễm ấu trùng trên cá Pseudorasbora parva tại Đài Loan cho thấy; tỉ lệ cá P. parva nhiễm ấu trùng C. sinensis là 100% vào mùa Hè (tháng 6-8) với 418 ấu trùng/cá, 96,6% vào mùa Thu - Đông (tháng 9-11) với 309 ấu trùng/cá; 80% vào Đông - Xuân (tháng 12- 2) với 96 ấu trùng/cá; rồi lại dần tăng lên vào giai đoạn Xuân - Hè (tháng 3-5) với 227 ấu trùng/cá. Đáng lƣu ý là cƣờng độ nhiễm tăng một cách đột biến vào tháng 5, từ 152 ấu trùng/cá vào tháng 4 lên đến 313 ấu trùng/cá vào tháng 5 chỉ sau 1 tháng [53].
Tại Thái Lan, lƣợng ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini trong cá cũng biến động theo mùa vụ tại vùng Đông Bắc - vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ O. viverrini. Nghiên cứu cho thấy, sự biến động khác nhau tùy theo vật chủ nhƣng lƣợng ấu trùng 12 tìm thấy trên cá có xu hƣớng cao hơn vào cuối mùa mƣa từ tháng 7 đến tháng 1 và thấp hơn vào mùa Hè từ tháng 3 đến tháng 6 [59]. Tƣơng tự, điều tra nghiên cứu tại Chiang Mai, Thái Lan, cho thấy ấu trùng sán lá ruột nhỏ họ heterophyid cũng biến động theo mùa vụ. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng các loài sán lá ruột trên cá cao nhất 95% trong thời kỳ mùa đông tháng 11 đến tháng 1 và thấp nhất 90% trong giai đoạn mùa Hè; tháng 2 đến tháng 4 [60].
1.2.2.4. Điều kiện bất hoạt ấu trùng sán lá truyền qua cá
Nghiên cứu khả năng sống sót của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong cá P. parva, ở nhiệt độ -12oC ấu trùng vẫn còn sống trong vòng 10-20 ngày, tuy nhiên ở -20oC ấu trùng này chết sau 3-7 ngày [61]. Quy chế số 852/2004 của Nghị viện và Hội đồng cộng đồng Châu Âu có quy định; ấu trùng sán trong sản phẩm thủy sản phải đƣợc bất hoạt (không còn khả năng lây nhiễm) bằng phƣơng pháp đông lạnh ở -100C trong 10 ngày, –200C trong 3 - 4 ngày, -280C trong vòng 28 giờ hoặc -350C trong vòng 15 giờ. Theo khuyến cáo của Bộ Y tế, USSR - Cộng hòa liên bang Soviet (1990), ấu trùng sán lá gan nhỏ O. felineus trong cá cần đƣợc bảo quản ở -280C trong 32 giờ hoặc -400C trong 7 giờ để bất hoạt chúng. Fattakhov (1989) cho biết đông lạnh cá ở -28, -35 và -400C sẽ cần 20 giờ, 8 giờ và 2 giờ tƣơng ứng để bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ O. felineus [62].
Muối cũng đƣợc sử dụng nhƣ một biện pháp làm bất hoạt ấu trùng sán. Trong điều kiện nƣớc muối (3 mg muối/10 mg cá) ử ở 26oC, ấu trùng sống từ 5-15 ngày [61]. Ở nồng độ muối 13,6% ấu trùng Opisthorchis sp. trong cá đƣợc lên men sẽ bị chết sau 24 giờ [63] nhƣng ở độ muối 20%, ấu trùng bị bất hoạt sau 5 giờ [64]. Tuy nhiên, ấu trùng C. sinensis ở cá nhiễm tự nhiên trong để bất hoạt dung dịch nƣớc muối 30% cần phải mất 8 ngày [61].
1.3. Nghiên cứu sán lá truyền lây qua cá trong nƣớc
1.3.1. Sán lá truyền qua cá trên người
Trƣớc đây, Tổ chức Y tế thế giới, đã báo cáo có khoảng 1 triệu ngƣời nhiễm sán lá gan nhỏ; C. sinensis ở miền Bắc và O. viverrini ở miền Trung Tây Nguyên, 13
Việt Nam [24]. Một số khảo sát cũng đã xác nhận về sự phân bố của sán lá gan nhỏ trên ngƣời ở nhiều tỉnh thành trong cả nƣớc, đặc biệt là một số vùng dịch tễ quan trọng nhƣ Nam Định, Ninh Bình và Phú Yên [4,65,66]. Trong giai đoạn 10 năm qua, đã có nhiều điều tra trên ngƣời tại các vùng dịch tễ hoặc vùng có nguy cơ nhiễm SLTQC. Nhìn chung, có sự biến động rất khác biệt giữa các vùng; tỉ lệ nhiễm sán lá trên ngƣời thƣờng rất thấp ở các tỉnh phía Nam, cao dần ở khu vực miền Trung đến khu vực các tỉnh đồng bằng Bắc bộ. Tỉ lệ nhiễm sán lá trên ngƣời đƣợc báo cáo chỉ 0,6% đối với các hộ nuôi trồng thủy sản tại 5 huyện thuộc tỉnh Nghệ An [67]. Trong khi đó, tại Nam Định tỉ lệ nhiễm SLTQC trên ngƣời là 64,9%. Nghiên cứu cũng xác định đƣợc 1 loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và 4 loài sán lá ruột nhỏ bao gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai và S. falcatus. Chọn lựa môt số trƣờng hợp dƣơng tính SLTQC để đãi phân thu sán; có 51,5% thu đƣợc sán lá gan nhỏ C. sinensis trƣờng thành, hầu nhƣ 100% số ngƣời này đều thu đƣợc sán lá ruột nhỏ trƣởng thành từ 1 - 4 loài, đặc biệt là H. pumilio chiếm đến 90,4% [68]. Ở một địa điểm khác tại Nam Định, sán lá gan nhỏ C. sinensis cũng đƣợc xác định nhiễm tới 26%, trong đó nam giới nhiễm nhiều hơn nữ giới 3,6 lần do thói quen ăn gỏi chủ yếu ở nam giới [69]. Giải thích cho sự khác nhau này, nghiên cứu tập trung vào nhóm đối tƣợng ăn gỏi cá tại Hải Hậu, Nam Định, xét nghiệm đối tƣợng có nguy cơ này cho thấy có 40,2% mẫu dƣơng tính với SLTQC [70]. Tại Ninh Bình, nghiên cứu gần đây cho thấy có 16,5 - 20,5% và 31,7% ngƣời nhiễm SLTQC lần lƣợt ở các huyện Gia Viễn và Kim Sơn [11,71]. Những điều tra khác trên ngƣời đƣợc triển khai bởi Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ƣơng xác nhận vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ C. sinensis ở Hà Nam, Thanh Hóa, Hòa Bình và Hà Nội và O. viverrini ở Phú Yên, Bình Định, Quảng Trị và Đắc Lắc [72]. Một vùng dịch tễ của sán lá truyền lây qua cá mới gần đầy vừa đƣợc phát hiện tại huyện Lục Yên, Yên Bái. Kết quả xét nghiệm phân dƣơng tính với trứng sán lá lên tới 35% [73].
Hầu hết các khảo sát về SLTQC trên ngƣời (Bảng 1.1) trong thời gian qua đều đƣợc trực tiếp hoặc gián tiếp thực hiện bởi Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ƣơng dựa trên phƣơng pháp xét nghiệm mẫu phân hay gọi là Kato- 14
Katz. Sự tƣơng đồng về hình thái trứng của các loài SLTQC trong tiêu bản Kato- Katz là một trở ngại trong chẩn đoán đòi hỏi các kỹ thuật viên xét nghiệm cần có kinh nghiệm. Tuy nhiên, hầu hết các khảo sát trên ngƣời chỉ dừng lại ở việc xác định tỉ lệ nhiễm SLTQC nói chung. Để xác định rõ hơn về thành phần loài SLTQC thì cần phải cho bệnh nhân uống thuốc và đãi phân để thu sán trƣờng thành - đây là việc hết sức phức tạp.
Bảng 1.1: Sán lá truyền qua cá trên người tại một số vùng dịch tễ ở nước ta
SLTQC THỜI GIAN ĐỊA ĐIỂM NGUỒN Sán lá 2005 Nghệ An [67] Sán lá và sán lá gan nhỏ 2006 Nam Định [68] Sán lá gan nhỏ 2006 Nam Định [69] Sán lá và sán lá gan nhỏ 2012 Nam Định [70] Sán lá và sán lá gan nhỏ 2013 Ninh Bình [11] Sán lá và sán lá gan nhỏ 2015 Yên Bái [73] Sán lá gan nhỏ - Hòa Bình, Hà Nội, Thanh [72] Hóa, Ninh Bình Sán lá gan nhỏ 2016 Hà Nam [72] Sán lá gan nhỏ * - Phú Yên, Bình Định, [72] Quảng Trị, Đắc Lắc Sán lá gan nhỏ 2017 Ninh Bình [71]
SLTQC: Sán lá truyền qua cá *Opisthorchis viverrini 1.3.2. Sán lá truyền qua cá trên động vật
Những nghiên cứu đã xác định chó, mèo là vật chủ lƣu trữ quan trọng đối với sán lá gan nhỏ C. sinensis tại khu vực miền Bắc nƣớc ta [5,74] và O. viverrini ở miền Trung Tây Nguyên [5,65]. Những nghiên gần đây, ngoài sán lá gan nhỏ, hàng loạt các loài sán lá ruột nhỏ cũng đã đƣợc phát hiện nhiễm trên nhiều vật chủ lƣu trữ khác nhau nhƣ chó, mèo, lợn, gà, vịt và chuôt (Bảng 1.2).
Động vật nuôi nhƣ chó, mèo và lợn là nguồn lây truyền SLTQC chính trong vùng dịch tễ. Tại cùng một địa điểm ở Nghệ An, mặc dù ngƣời chỉ xác định nhiễm 15 dƣới 1% [67], tuy nhiên tỉ lệ nhiễm ở mèo, chó và lợn tƣơng ứng là 48,6%; 35,0% và 14,4% và có đến 7 loài sán lá ruột nhỏ đƣợc xác nhận tại nghiên cứu này [73]. Kết quả nghiên cứu này cùng phù hợp với một công bố gần đây về thành phần loài ấu trùng tìm đƣợc trên cá [76].
Bảng 1.2: Sán lá truyền qua cá trên động vật tại một số vùng dịch tễ ở nước ta SLTQC VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM NGUỒN Sán lá Mèo, chó, lợn Nam Định [77] Sán lá Mèo, chó, lợn Nghệ An [75]
Sán lá Vịt, gà Nam Định [78] Sán lá Chuôt Nam Định [79]
Sán lá Mèo, chó, lợn Ninh Bình [11] Sán lá gan nhỏ* Vịt Bình Định [80,81]
Sán lá gan nhỏ* Mèo# Thái Bình [82]
Sán lá gan nhỏ** Mèo# Thái Bình [82]
Sán lá gan nhỏ** Mèo# Đồng Tháp, Tây Ninh [83]
SLTQC: Sán lá truyền qua cá; *Clonorchis sinensis; **Opisthorchis viverrini; # mèo từ lò mổ Tại Nam Định, kết quả điều tra về vật chủ lƣu trữ phản ảnh đúng tình hình nhiễm sán trên ngƣời [68], tỉ lệ nhiễm đƣợc công bố là 70,2% ở mèo; 56,9% ở chó và 7,7% ở lợn. Nghiên cứu xác định đƣợc 1 loài sán lá gan nhỏ C. sinensis và 11 loài sán lá ruột nhỏ thuộc các giống Haplorchis, Stellantchasmus, Stictodora và Centrocestus [77]. Cũng tại vùng dịch tễ này; vịt, gà và chuột cũng đƣợc xem là vật chủ chính của một số loài sán lá ruột nhỏ mặc dù tỉ lệ nhiễm thấp [78,79].
Tại Ninh Bình, chó, mèo và lợn cũng đƣợc xác nhận là vật chủ chính của SLTQC bởi tỉ lệ nhiễm khá cao, tƣơng ứng là 32,7%; 9,0%, và 6,0% trong đó có sán lá gan nhỏ C. sinensis [11]. Nghiên cứu gần đây của Dao et al. (2013, 2016) đã công bố loài O. viverrini đƣợc phát hiện nhiễm trên vịt nuôi tại Bình Định thuộc khu vực miền Trung với tỉ lệ nhiễm là 34,3% [80,81], đây vốn là vùng dịch tễ của O. viverrini. Nhóm tác giả cũng cung cấp bằng chứng về phân tử giữa những mẫu 16 nghiên cứu so sánh với các trình tự của loài O. viverrini đã công bố trên GenBank. Tuy nhiên Nawa et al. (2015) đã phân tích và cho rằng nhóm tác giả trên đã nhầm lẫn về định loại giữa loài O. viverrini và O. paragenimus, cũng nhƣ khoảng cách di truyền giữa những mẫu nghiên cứu so với loài O. viverrini là quá lớn, vƣợt qua khoảng cách biến dị trong loài [84].
Mới đây, nghiên cứu tại các lò mổ mèo, chủ yếu tại Thái Bình đã phát hiện 42,9% mèo tìm thấy sán lá gan nhỏ C. sinensis trong gan, mật với cƣờng độ 2- 1.724 sán/mèo và 2,0% sán lá gan nhỏ O. viverrini 20-140 sán/mèo [82]. Việc có mặt C. sinensis trên mèo thu tại lò mổ ở Thái Bình không lạ, nhƣng ngạc nhiên là O. viverrini đƣợc phát hiện trên mèo tại đây mặc dù tỉ lệ thấp. Ở các tỉnh phía Nam, mèo tại các lò mổ ở Đồng Tháp và Tây Ninh cũng đƣợc xác nhận nhiễm sán lá gan nhỏ O. viverrini với tỉ lệ nhiễm lần lƣợt là 2,5% và 17,8% [83].
1.3.3. Ấu trùng sán lá truyền qua cá trên ốc
Ốc là vật chủ trung gian thứ 1 của sán lá truyền lây qua cá. Các dạng ấu trùng khác nhau của sán lá truyền qua cá đƣợc mô tả khi phát hiện nhiễm trên một số loài ốc; ấu trùng Parapleurolophocercous nhiễm trên ốc T. scabra, M. tuberculata, B. fuchsiana và S. messageri trong khi đó pleurolophocercous nhiễm trên B. fuchsiana và S. messageri [85]. Tuy nhiên, trong giới hạn nhất định, nghiên cứu chƣa xác định chính xác loại ấu trùng nào thuộc loài sán cụ thể. Nhƣng ở một nghiên cứu khác, dạng ấu trùng parapleurolophocercous đƣợc mô tả tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu này đã đƣợc xác định là H. pumilio [86]. Trong môi trƣờng tự nhiên, paraleurolophocercous chiếm khoảng 40% tất cả các dạng ấu trùng cercariae nhiễm trên ốc, đặc biệt là loài M. tuberculata, vật chủ phổ biến nhất ở tất cả các môi trƣờng (kênh mƣơng, ruộng và ao). Loại ấu trùng này còn đƣợc phát hiện trên các loài ốc thuộc họ Thiariidae và S. mesageri tại Nam Định [87]. Ấu trùng parapleurolophocercous phát hiện nhiễm trên ốc Bithynidae (B. fuchsiana và P. striatus) và Thiaridae (M. tuberculata…) ở miền Bắc [88]. Ở Ninh Bình, M. tuberculata và B. fuchsiana là loài phổ biến nhất, tuy nhiên parapleurolophocercous cercariae chỉ phát hiện trên ốc M. tuberculata [11]. 17
Mặc dù, tỉ lệ ốc nhiễm ấu trùng rất nhỏ nhƣng rủi ro lây truyền rất lớn bởi nó có thể thải ra một lƣợng lớn ấu trùng. Nhóm ấu trùng parapleurolophocercous phát triển thành các loài sán lá ruột nhỏ trong khi đó pleurolophorcercous phát triển thành cả sán lá ruột và sán lá gan nhỏ. Những kết quả nghiên cứu trên cho thấy ấu trùng nhóm parapleurolophocercous chiếm ƣu thế [11,85,87,88]. Điều này giải thích tại sao sán lá ruột nhỏ là những loài chủ yếu nhiễm trên vật chủ cuối cùng và cá tại các tỉnh miền Bắc [15,68,75,77,89]. Hình thái ấu trùng cercariae của sán khá phức tạp – khó xác định dựa vào hình thái, cả C. sinensis và O. viverrini đã phát trên cá nƣớc ngọt, động vật (chó, mèo…) và ngƣời nhƣng vẫn chƣa rõ về ấu trùng của chúng ở các vật chủ tiềm năng là ốc B. fuchsiana và P. manchouricus.
1.3.4. Ấu trùng sán lá trên cá
1.3.4.1. Một số kết quả nghiên cứu về ấu trùng sán lá trên cá
Có 2 loài sán lá gan nhỏ bao gồm C. sinensis và O. viverrini và ít nhất 14 loài sán lá ruột nhỏ đƣợc xác định nhiễm trên cá ở nƣớc ta [90]. Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis phát hiện ở các tỉnh thuộc khu vực ĐBSH và O. viverrini ở khu vực miền Trung và ĐBSCL. Trong số các loài sán lá ruột nhỏ, H. pumilio là loài phổ biến nhất và chỉ phát hiện ở cá nƣớc ngọt. Mức độ nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ cao nhất ở khu vực ĐBSH, rồi đến khu vực miền Trung và thấp nhất là ở khu vực ĐBSCL.
Ở khu vực ĐBSH: Báo cáo đầu tiên về hiện trạng nhiễm ấu trùng SLTQC ở Việt Nam đƣợc thực hiện bởi Lê Văn Châu và cộng sự (1997) tại huyện Kim Sơn, tỉnh Ninh Bình. Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis đƣợc xác định trên cá Mè trắng với tỷ lệ nhiễm 44,47%, cá Chép 25%, cá Trắm cỏ 13,33%, cá Trôi việt 13,85% và cá Rô đồng là 32% [5]. Hà Duy Ngọ (2003) có công bố thứ 2 về ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá tại 2 tỉnh Nam Định và Ninh Bình. Các loài cá đƣợc xác định nhiễm loại ấu trùng này bao gồm cá Rô phi đen, cá Diếc, cá Thiểu và cá Quả [7]. Giai đoạn năm 2002-2003, Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng Trung Ƣơng đã thực hiện một Đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu mầm bệnh giun sán ký sinh trên thịt lợn, trâu, bò và cá nƣớc ngọt tại Hà Nội”. Báo cáo cho thấy ấu trùng sán lá gan nhỏ C. 18 sinensis nhiễm ở 7/10 loài cá bao gồm cá Diếc (21,7%), Trắm cỏ (13,3%), Trê đen (6,7%), Chép 3,3%, cá Chuối (3,3%), Rô phi đen 1,7% và cá Trôi việt cùng nhiễm tỷ lệ 1,7% [91]. Những nghiên cứu về ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá phản ánh đúng hiện trạng sán lá gan nhỏ C. sinensisi công bố trên ngƣời [4,24].
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu gần đây lại cho thấy ấu trùng sán lá gan nhỏ có tỷ lệ nhiễm rất thấp trong khi đó ấu trùng nhiều loài sán lá ruột nhỏ có tỷ lệ nhiễm cao [8–11,89] mà hầu hết các loài sán lá ruột này chƣa đƣợc công bố trong các nghiên cứu trƣớc đây, cụ thể; nghiên cứu trên cả cá nuôi (829 mẫu) và cá tự nhiên (714 mẫu), Phan et al., (2010a) phát hiện ấu trùng của 6 loài sán lá truyền qua cá (C. sinensis, H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, P. varium và C. formosanus) trên 23 loài cá nƣớc ngọt tại Nam Định. Tuy nhiên, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis chỉ phát hiện nhiễm trên 1 cá thể duy nhất (0,1%) trong khi đó ấu trùng sán lá ruột nhỏ H. pumilio nhiễm phổ biến với tỷ lệ nhiễm chung là hơn 59,8% [8]. Một nghiên cứu khác, xét nghiệm 3820 cá thể thuộc 17 loài cá trong 61 ao nuôi thƣơng phẩm tại huyện Nghĩa Hƣng, tỉnh Nam Định, Phan et al., (2010b) đã xác định tỷ lệ nhiếm ấu trùng SLTQC là 72%. Ngoài ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensiscòn có ấu trùng của 5 loài sán lá ruột nhỏ gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, C. formosanus và P. varium. Tuy nhiên, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis chỉ phát hiện nhiễm trên cá Mè trắng (1/1185 mẫu kiểm tra) trong khi đó ấu trùng sán lá ruột nhỏ nhƣ H. pumilio nhiễm trên tất cả các loài cá kiểm tra. Cá Rohu nhiễm 58%, Mè trắng 86%, Mrigal 74%, Trắm cỏ 87%, cá Diếc 65%, Chày mắt đỏ 71%, Chim trắng 73%, Rô phi vằn 24%, Chép 82%, Trôi việt 38%, Trê vàng 78%, cá Chuối sộp 88%, Rô đồng 94%, Mè vinh 50%, Mƣơng xanh 33%, Mè hoa 100% và Thát lát 100% [89]. Ấu trùng C. sinensis, H. pumilio, H. taichui và C. formosanus cũng đƣợc phát hiện nhiễm trên cá giống tại Nam Định và Ninh Bình. Trong đó C. sinensis nhiễm với tỷ lệ 1,5% trên cá Trắm cỏ, Rohu và cá Mè trắng nhƣng không phát hiện ở cá Mrigal và Chim trắng. Trong khi đó, tỷ lệ nhiễm ấu trùng H. pumilio là 55,6% và C. formosanus là 41,0% ngoại trừ ấu trùng H. taichui nhiễm thấp 0,3% trên cá Trắm cỏ và Mè trắng [9]. Tƣơng tự, ấu trùng sán lá nhỏ chỉ phát hiện với tỷ lệ 0,05% trên cá hƣơng và cá giống tại Nam Định, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hóa trong khi đó 19
ấu trùng sán lá ruột nhỏ chiếm tới 94% [10].
Nƣớc thải sinh hoạt có thể chứa nhiều trứng giun sán là nguy cơ rủi ro cho sự lan truyền của giun sán. Mặc dù vậy, nghiên cứu hiện trạng nhiễm ấu trùng sán trên cá trong hệ thông nuôi cá sử dụng nƣớc thải tại Nam Định và Hà Nội lại cho thấy tỷ lệ nhiễm khá thấp. Ấu trùng các loài sán là ruột H. pumilio, H. taichui và C. formosanus đƣợc phát hiện nhiễm trên cá Chép, Trắm cỏ, Mè trắng và Rô phi vằn nhƣng tỷ lệ nhiễm thấp từ 2,0 - 6,2% [92]. Ấu trùng của 6 loài sán lá ruột bao gồm H. taichui, H. pumilio, C. formosanus, P. varium, S. falcatus và H. continua cũng đƣợc ghi nhận nhiễm trên cá nuôi nƣớc thải tại Hà Nội và Nam Định trong một nghiên cứu khác [93]. Cả 2 nghiên cứu trên đối tƣợng nuôi nƣớc thải đều không phát hiện ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis điều đó cho thấy điều kiện môi trƣờng sinh thái có vai trò quan trọng đối với ấu trùng sán lá gan nhỏ.
Tỷ lệ nhiễm ấu trùng C. sinensis trên cá nuôi trong ao tại xã Hợp Thịnh, Kỳ Sơn, Hòa Bình là 20,8% (51/245 mẫu kiểm tra), cụ thể tỷ lệ nhiễm trên cá Trắm cỏ là 55,2% (48/87 mẫu), Mè trắng 4,3% (2/46 mẫu) và Mè hoa 100% (1/1 mẫu) trong khi đó cá tự nhiên có nguồn gốc từ đầm hồ, sông suối và đồng ruộng trong vùng đều không nhiễm ấu trùng này [94]. Ngƣợc lại, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis lại không nhiễm trên các loài cá nuôi nhƣ Mè trắng, Trắm cỏ tại Gia Viễn, Ninh Bình nhƣng lại phát hiện trên cá tự nhiên đó là cá Mƣơng 12,5% (1/8). Tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán (C. sinensis, Haplorchis spp., P. varium và C. formosanus) nói chung trên cá tại đây là khá cao 56,1% [11]. Tƣơng tự, ấu trùng C. sinensislại đƣợc phát hiện trên cá Mƣơng và cá Thiểu với tỷ lệ tƣơng ứng 21,95% (92/419) và 43,75% (7/16) thu đƣợc tại Ninh Bình đều là các loài cá tự nhiên[95]. Nghiên cứu gần đây ghi nhận có đến 7 loài cá bao gồm Mè trắng, Rohu, Trắm cỏ, Chép, Diếc, Rô đồng và Rô phi vằn thu đƣợc tại các tỉnh Hải Dƣơng, Hà Nội và Nam Định nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis, trong đó cá Mè trắng nhiễm cao nhất 53,33%, cá Diếc nhiễm 44% [14].
Cá nƣớc lợ và mặn cũng nhiễm ấu trùng sán lá truyền qua cá. Nguyễn Thị Hà (2008) báo cáo cá Song chấm nâu, cá Bống bớp và cá Đối mục nuôi nƣớc lợ tại 20
Nam Định có nhiễm ấu trùng sán lá truyền qua cá với tỷ lệ cao. Ấu trùng S. falcatus ở cá Bống bớp chiếm 87,22% (cƣờng độ nhiễm 30,57 ấu trùng/cá), cá Song chấm nâu 17,92% (cƣờng độ nhiễm 6,95 ấu trúng cá), đặc biệt là cá Đối mục có tỷ lệ nhễm 87,80% và cƣờng độ trung bình 345,36 ấu trùng/cá. Metagonimus sp. cũng đƣợc xác định nhiễm trên cá Bống bớp với tỷ lệ 21,11% (5,22 ấu trùng/cá). Ấu trùng sán H. continua nhiễm trên cá Bống bớp (11,39%; 3,44 ấu trùng/cá) và cá Song chấm nâu (16,35%; 6,95 ấu trùng/cá). Ấu trùng P. varium nhiễm trên cá Bống bớp với tỷ lệ 63,61% và cƣờng độ 5,99 ấu trùng/cá. Ấu trùng C. formosanus phân lập đƣợc từ cá Bống bớp và cá Song với tỷ lệ tƣơng ứng là 3,09% (1,29 ấu trùng) và 5,03% (1,4 ấu trùng), ấu trùng S. lari nhiễm nhiều trên cá Bống bớp (69,44%; 9,99 ấu trùng) và cá Đối (32,95%; 16,81 ấu trùng) nhƣng cá Song chấm nâu chỉ nhiễm với tỷ lệ 4,4% và cƣờng độ 1,93 ấu trùng/cá. Ấu trùng Echinostoma sp. cũng đƣợc phát hiện trên cá Bống bớp 38,06% với 7,42 ấu trùng/cá [96]. Ấu trùng 2 loài sán lá ruột nhỏ H. continua và P. varium cũng đƣợc ghi nhận có nhiễm trên cá song nuôi lồng tại Cát bà, Hải Phòng. Ấu trùng P. varium nhiễm 10% ở cá Song chấm nâu (E. coioides) và 1,2% ở cá Song dẹt (E. bleekeri) trong khi đó ấu trùng H. continua chỉ nhiễm trên cá Song dẹt với tỷ lệ 1,2% [97].
Khu vực miền Trung: Phát hiện đầu tiên về hiện trạng nhiễm ấu trùng sán lá truyền qua cá là ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini năm 1992. Trong số 1721 cá thể thuộc 10 loài cá nƣớc ngọt thu đƣợc tại xã An Mỹ, huyện Tuy An, Phú Yên đã phát hiện cá Diếc nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ với tỷ lệ 28,65% [98]. Cũng tại Phú Yên, nghiên cứu gần đây xác 4 loài cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini; ngoài cá Diếc (28,1%; 28,2 ấu trùng/cá) là cá Mè đất Puntius brevis (62,5%; 2,2 ấu trùng/cá), cá Lóc Channa spp. (8,3%; 1,0 ấu trùng/cá) và cá Lòng tong Rasbora sp. (4,3%; 2,0 ấu trùng/cá). Trong nghiên cứu này, ấu trùng O. viverrini cũng đã đƣợc xác nhận thông qua gây nhiễm động vật (chuột hamster) và sinh học phân tử [99]. Các loài H. continua, P. varium và Pygiopsis sp. cũng đƣợc xác định nhiễm trên cá Song, cá Đối nuôi và tự nhiên tại Khánh Hóa [100]. Trƣơng Thị Hoa và Nguyễn Ngọc Phƣớc (2009) báo cáo tình hình nhiễm ấu trùng sán lá song chủ trên cá Chép và Trắm cỏ giai đoạn giống nuôi tại Thừa Thiên Huế. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng trên cá 21
Chép và Trắm cỏ lần lƣợt là 65,4% và 55,8%. Ấu trùng C. formosanus nhiễm trên mang cá với cƣờng độ tƣơng ứng là 5,7 và 4,4 ấu trùng/mang cá Chép và Trắm cỏ. Ấu trùng H. pumilio nhiễm trên cá Chép là 32,9% và Trắm cỏ là 27,5%. Đặc biệt, là sự hiện diện của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá Chép 27,5% và Trắm cỏ 24,6% [101]. Tại Nghệ An, tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá truyền qua cá là 44,6%, dao động từ 12,5% đến 61,0% trên cá nuôi thƣơng phẩm và 43,6% dao động từ 7,4% đến 62,8% ở cá giống. Ấu trùng đƣợc phát hiện đều là của sán lá ruột nhỏ bao gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, C. formosanus, S. falcatus và Echinochasmus sp. [76]. Cá Rohu giai đoạn cá giống ƣơng nuôi tại Thanh Hóa cũng phát hiện nhiễm ấu trùng của một số loài sán lá ruột trong đó điển hình là H. pumilio [10].
Khu vực ĐBSCL: là khu vực nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh, đặc biệt là cá Tra, cá Lóc, Tai tƣợng...Những khảo sát đầu tiên về hiện trạng nhiễm ấu trùng sán lá truyền qua cá đƣợc thực hiện năm 2006 tại An Giang, Tiền Giang và Cần Thơ. Mặc dù có xuất hiện ấu trùng nhƣng hầu hết tỷ lệ nhiễm khác thấp. Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ao chỉ nhiễm ấu trùng sán lá ruột, trong đó cao nhất là nhiễm H. pumilio 0,6%. Ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini nhiễm trên cá Lóc nhím (Channa striata) tự nhiên 1,9%. Ngoài ra, cá Rô đồng và cá Lóc tự nhiên tại An Giang cũng nhiễm ấu trùng P. varium [102]. Ấu trùng các loài sán lá ruột H. pumilio, H. taichui, S. falcatus và C. formosanusnhiễm trên nhiều loài cá trong hệ thống ao nuôi tại Cần Thơ, Tiền Giang, Vĩnh Long và Đồng Tháp [103– 105]. Tại Tiền Giang và Cần Thơ, tỷ lệ nhiễm ấu trùng trong mô hình nuôi đơn cá Tai tƣợng là 1,7% và nuôi mô hình Vƣờn - Ao - Chuồng (VAC) là 6,6%. Trong số ấu trùng các loài sán, ấu trùng sán lá ruột H. pumilio chiếm ƣu thế tới hơn 58,0% số lƣợng ấu trùng phân lập đƣợc. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng, tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá nói chung vào mùa mƣa cao hơn so với mùa khô [103]. Trong hệ thống sản xuất giống, mặc dù cá bột âm tính nhƣng giai đoạn cá giống ở các loài cá Nheo, Trê lai, Tai tƣợng, Rô đồng, Chép, Sặc bƣớm, Mè vinh, Mè trắng, Rohu, Chim trắng, Rô phi và Sặc rằn đều nhiễm ấu trùng với tỷ lệ dao động từ 1,2 – 29,7% [104]. Ấu trùng H. taichui nhiễm trên cá Tra tại Cần Thơ là 43,47%; C. formosanus nhiễm trên cá Tra tại Vĩnh Long là 2,1%. Đặc biệt, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. 22 sinensis đƣợc tác giả thông báo nhiễm trên cá Tra thu đƣợc tại Vĩnh Long là 14,89% [106]. Tuy nhiên, sự sai khác trình tự gen 28S của C. sinensis với mẫu chuẩn trên Genbank là 8,3% [106] là quá lớn điều đó cho thấy ấu trùng sán lá phân lập đƣợc từ cá Tra trong nghiên cứu nói trên không phải là C. sinensis [107]. Hơn nữa, ký chủ đặc trƣng của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis thƣờng là các loài thuộc họ cá chép và vùng phân bố của chúng thƣờng ở khu vực miền Bắc.
1.3.4.2. Vật chủ của ấu trùng sán lá truyền qua cá
Những nghiên cứu về ấu trùng SLTQC hầu hết đƣợc thực hiện trong khoảng 10 năm trở lại đây từ khi có Dự án FIBOZOPA (Ký sinh trùng có nguồn gốc thủy sản) do DANIDA tài trợ. Qua hàng loạt những nghiên cứu trong và sau thời gian Dự án này tới nay có thể thấy rằng rất ít báo cáo về ấu trùng sán lá gan nhỏ trong khi đó sán lá ruột nhỏ chiếm ƣu thế gần nhƣ tuyệt đối;
Nghiên cứu của Phan Thị Vân và cộng sự (2010) tại Nam Định đã xét nghiệm 3.822 mẫu cá với 18 loài cá (chủ yếu là cá nuôi ao) thì chỉ phát hiện duy nhất 1 mẫu cá Mè trắng nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis, trong khi đó 100% số loài cá này đều nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ với cƣờng độ nhiễm rất cao [89]. Cũng tại đây, nghiên cứu xét nghiệm 2.524 mẫu cá hƣơng và giống thuộc 5 loài cá khác nhau, tác giả cũng chỉ phát hiện ấu trùng C. sinensis nhiễm trên cá Rohu với tỷ lệ 1,9% và cá Mè trắng là 0,5%, trong khi đó ấu trùng sán lá ruột nhỏ nhƣ H. pumilio và C. formosanus có tỷ lệ nhiễm tƣơng ứng là 55,6% và 41,0% [9]. Nguyễn Thị Hợp và cộng sự (2015) xét nghiệm 15 loài cá khác nhau nhƣng chỉ phát hiện 3 loài nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ [94]. Và cũng chỉ 1/9 loài cá đƣợc xét nghiệm phát hiện nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis là cá Mƣơng xanh tại Ninh Bình trong khi đó tất cả các loài cá khác đều nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ [11].
Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng phát hiện ấu trùng sán lá gan nhỏ trên một số ít loài cá [10,95,99] trong khi đó nhiều nghiên cứu không phát hiện ấu trùng này [76,92,103,104,108]. Tổng hợp dựa trên những công bố gần đây hiện mới có 6 loài cá đƣợc xác định có nhiễm ấu trùng C. sinensis ở khu vực miền Bắc và 5 loài cá 23 nhiễm ấu trùng O. viverrini ở khu vực miền Trung và Nam nƣớc ta (Bảng 1.3), trong khi đó, Trung Quốc ghi nhận 102 loài, Hàn Quốc và Nhật Bản là 80 loài đƣợc xác định nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis [53–55]. Sự khác nhau này cho thấy có thể chúng ta đã chƣa có nhiều khảo sát rộng hơn về ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá tại các khu hệ cá khác nhau mà hầu nhƣ tập trung nhiều vào đối tƣợng cá nuôi.
Thực ra, có một số công bố khác cho rằng vật chủ của C. sinensis bao gồm cá Đối mục ở Khánh Hòa (miền Trung) và cá Tra ở Vĩnh Long, khu vực ĐBSCL [106], cá Diếc, Rô đồng, Chép và Rô phi ở khu vực đồng bằng sông Hồng [14], tuy nhiên, những kết quả này theo chúng tôi là chƣa xác đáng. Thứ nhất, miền Trung và Đồng bằng sông Cửu Long là vùng dịch tễ của O. viverrini, nên có chăng là O. viverrini chứ không phải là C. sinensis. Thứ hai, vật chủ trung gian 2 của C. sinensis chủ yếu là các loài thuộc họ cá Chép Cyprinidae nhƣng cá Tra và Đối mục không thuộc họ cá Chép. Hơn nữa, cá Đối mục là cá nƣớc lợ trong khi đó ốc Bithynidae, vật chủ trung gian 1 của C. sinensis hầu nhƣ không phân bố ở môi trƣờng nƣớc lợ. Thứ ba, hầu hết những kết quả trên cho thấy tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ khá cao nhƣng chƣa có bằng chứng xác nhận bằng gây nhiễm động vật. Do đó, nhiều khả năng có sự nhầm lẫn ấu trùng sán lá ruột nhỏ với ấu trùng sán lá gan nhỏ. Thực tế, hầu hết các nghiên cứu khác nhau trên cá đều cho thấy ƣu thế vƣợt trội của ấu trùng sán lá ruột (đặc biệt là H. pumilio) so với sán lá gan nhỏ.
Bảng 1.3: Danh mục loài cá đã được xác định nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ TT VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM NGUỒN Clonorchis sinensis 1 Hypophthamychthys molitrix Nam Định, Ninh Bình [9,89]
2 Aristichthys nobilis Hòa Bình [94] 3 Ctenopharyngodon idellus Nam Định, Ninh Bình, Hòa [9,94] Bình 4 Labeo rohita Nam Định, Ninh Bình [9,10] 24
TT VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM NGUỒN 5 Hemiculter leucisculus Ninh Bình [11,95]
6 Cultrichthys erythropterus Ninh Bình [95] Opisthorchis viverrini 1 Carrasius auratus Phú Yên [98,99] 2 Channa striatus An Giang [102] 3 Channa spp. Phú Yên [99] 4 Puntius brevis Phú Yên [99] 5 Rasbora spp. Phú Yên [99]
Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013) tổng hợp từ các kết quả nghiên cứu trong giai đoạn thực hiện Dự án FIBOZOPA, có ít nhất 14 loài sán lá ruột nhỏ (H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, P. varium, S. falcatus, H. continua, P. summa, S. lari, Echinostoma sp., Echinochamus sp., Metagonimus sp. và C. formosanus đƣợc phát hiện ấu trùng nhiễm trên cá bao gồm cả cá nƣớc ngọt và nƣớc mặn, lợ trong khi đó chỉ có 2 loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và O. viverrini [90].
Bảng 1.4: Danh mục loài cá đã được xác định nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ TT VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM NGUỒN 1 Rô đồng (Anabas Nam Định, Ninh Bình, [8,11,89,102– testudineus) Khánh Hòa, Cần Thơ, 104,106] Tiền Giang, Vĩnh Long, An Giang 2 Mè hoa (Aristichthys nobilis) Nghệ An [76]
3 Chép (Cyprinus carpio) Hà Nội, Nam Định, [9,11,76,89,101,10 Ninh Bình, Nghệ An, 4,108] Thừa Thiên Huế, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long 4 Cá Lóc, Quả, Chuối (Channa Hà Nội, Nam Định, [8,11,89,102,108] 25
TT VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM NGUỒN spp.) Ninh Bình, An Giang
5 Sặc rằn (Osphronemus Cần Thơ, Tiền Giang, [103,104] gourami) Vĩnh Long 6 Trắm cỏ (Ctentopharyngodon Hà Nội, Nam Định, [8,9,76,92,104,108 idellus) Ninh Bình, Nghệ An, ] Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long 7 Cá Trê (Clarius spp.) Nam Định, Cần Thơ, [8,89,103] Tiền Giang 8 Cá Diếc (Carrasius auratus) Nam Định, Ninh Bình [8,11,89]
9 Cá Hƣờng (Helostoma Cần Thơ, Tiền Giang, [103,104] temmincki) Vĩnh Long 10 Mrigal (Cirrhinus mrigala) Nam Định, Ninh Bình, [8,9,76,89,104] Nghệ An, Cần Thơ, Tiền Giang, Vĩnh Long 11 Trôi Việt (Cirrhinus Nam Định, Ninh Bình [8,89] molitorella) 12 Rohu (Labeo rohita) Hà Nội, Nam Định, [8–11,76,89,108] Ninh Bình, Thái Bình, Thanh Hóa, Nghệ An 13 Chim trắng (Colossoma Cần Thơ, Tiền Giang, [104] macroponmum) Vĩnh Long 14 Thát lát (Notopterus Nam Định [8,89] notopterus) 15 Chim trắng (Piaractus Nam Định [8,89] brachypomum) 26
TT VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM NGUỒN 16 Rô phi vằn (Oreochromis Nam Định, Ninh Bình, [9,11,76,89,104] niloticus) Cần Thơ, Tiền Giang, Vĩnh Long
17 Diêu hồng (Oreochromis sp.) Hà Nội, Nam Định, [104,108] Cần Thơ, Tiền Giang, Vĩnh Long 18 Cá Tra (Pangasianodon Cần Thơ, Tiền Giang, [102,103,106] hypophthalmus) Vĩnh Long 19 Cá Rằm (Puntius gonionotus) Cần Thơ, Tiền Giang, [104] Vĩnh Long 20 Mè vinh (Barbonymus Nam Định [89] gonionotus) 21 Mè trắng Nam Định, Hà Nội, [8,9,89,92,104,108 (Hypophthamychthys Ninh Bình, Cần Thơ, ] molitrix) Tiền Giang, Vĩnh Long 22 Chày mắt đỏ (Squaliobarbus Nam Định [8,89] curriculus)
23 Sặc rằn (Trichogaster Cần Thơ, Tiền Giang, [104] pectoralis) Vĩnh Long 24 Sặc bƣớm (Trichogaster Cần Thơ, Tiền Giang, [104] trichopterus) Vĩnh Long 25 Nhệch (Anguilla marmorata) Nam Định [8] 26 Mai trắng (Rasborionus Nam Định, Ninh Bình [8,11] hautus) 27 Cá Mại (Rasborinus lineatus) Nam Định [8] 28 Cá Nhệch (Pisodonophis Hà Nội, Nam Định [108] 27
TT VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM NGUỒN boro) 29 Bống đen (Eleotris Nam Định [8] melanosoma) 30 Cá Cờ (Istiophorus sp.) Nam Định [8]
31 Bống (Glossogobius aureus) Nam Định [8] 32 Bống cau (Prionobutis Nam Định [8] koilomatodon) 33 Đối mục (Mugil cephalus) Nam Định, Khánh [8,100,106] Hòa 34 Song chấm nâu (Epinephelus Khánh Hòa, Hải [96,97,100,108] coioides) Phòng, Nam Định
35 Song dẹt (Epinephelus Nam Định, Hải Phòng [96,97,100] bleekeri)
36 Bống bớp (Bostrychus Nam Định [96] sinensis)
Do hầu hết các nghiên cứu trong thời gian qua chủ yếu tập trung vào các đối tƣợng cá nuôi, vì vậy,mặc dù số lƣợng điều tra/khảo sát nhiều nhƣng số lƣợng loài cá đƣợc xét nghiệm ít. Do đó, hiện mới chỉ có khoảng 36 loài cá (32 loài cá nƣớc ngọt và 4 loài cá nƣớc lợ) đƣợc xác định là vật chủ trung gian thứ 2 của sán lá ruột nhỏ (Bảng 1.4). Thực tế, một số ấu trùng sán lá ruột nhỏ nhƣ H. pumilio hầu nhƣ đƣợc phát hiện trên 80% loài cá đƣợc xét nghiệm ở vùng dịch tễ nhƣ Nam Định và Ninh Bình. Tuy nhiên, với chỉ 36 loài đƣợc xác định là vật chủ của ấu trùng sán lá ruột nhỏ và 11 loài là vật chủ của sán lá gan nhỏ cho thấy vẫn còn nhiều khoảng trống cần đƣợc lấp đầy trong nghiên cứu xác định vật chủ của SLTQC nói chung tại Việt Nam. 28
1.3.4.3. Kiểm soát ấu trùng sán lá trong nuôi trồng thủy sản
Sán lá truyền qua cá có vòng đời phức tạp gồm 3 giai đoạn phát triển qua 3 nhóm ký chủ khác nhau, trong đó ký chủ trung gian thứ 1 là nhuyễn thể và các loài ốc; ký chủ trung gian 2 là các loài cá và ký chủ cuối cùng là con ngƣời và động vật ăn cá). Việc ngăn ngừa sự lây truyền sán lá cần dựa trên cơ chế của vòng đời của chúng. Trong nuôi trồng thủy sản, để ngăn ngừa có hiệu quả, về nguyên tắc cần phải áp dụng biện pháp can thiệp tổng hợp nhằm loại bỏ tối đa những rủi ro từ nguồn giống đầu vào, môi trƣờng ao nuôi, vật chủ trung gian 1 và vật chủ cuối cùng.
Thử nghiệm dựa trên nguyên lý này đã đƣợc triển khai trong mô hình ƣơng nuôi cá giống tại Nam Định, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hóa. Nhìn chung, mô hình áp dụng biện pháp can thiệp tổng hợp có hiệu quả so với mô hình đối chứng, tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán ở mô hình can thiệp thấp hơn so với mô hình đối chứng. Tuy nhiên, tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán trên cá trong cả 2 mô hình (đối chứng và can thiệp) đều tăng lên theo thời gian nuôi [10]. Kết quả tƣơng tự cũng đƣợc ghi nhận trong nghiên cứu thử nghiệm tại Đồng bằng sông Cửu Long trên đối tƣợng là cá Tra và cá Tai tƣợng giai đoạn giống [16]. Nhƣ vậy, biện pháp can thiệp tổng hợp thực sự chƣa có hiệu quả triệt để trong việc ngăn ngừa sự lây nhiễm ấu trùng sán trong hệ thống ƣơng nuôi cá giống.
Với hệ thống nuôi thƣơng phẩm, thử nghiệm đƣợc triển khai tại Nam Định với 2 nhóm can thiệp (nhóm 1: điều trị ngƣời và động vật; nhóm 2: quản lý và cải tạo vệ sinh ao nuôi, loại bỏ ốc-ký chủ trung gian) và 1 nhóm đối chứng - không can thiêp. Kết quả sau quá trình thử nghiệm cho thấy, tỷ lệ nhiễm ấu trùng ở cả 2 nhóm can thiệp đều giảm so với trƣớc khi áp dụng biện pháp can thiệp. Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm ấu trùng ở các nhóm can thiệp vẫn rất cao (nhóm 1 là 60%, nhóm 2 là 40%). Cƣờng độ nhiễm ấu trùng trên cá ở nhóm 1 sau can thiệp lại cao hơn so với trƣớc khi can thiệp trong khi đó ở nhóm 2, cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán trên cá sau can thiệp thấp hơn nhiều so với trƣớc can thiệp. Kết quả thử nghiệm này cho thấy việc quản lý và cải tạo vệ sinh ao nuôi có hiệu quả hơn trong kiểm soát ấu trùng SLTQC trên cá nuôi thƣơng phẩm [15]. Mặc dù vậy, nhìn chung những biện pháp 29 can thiệp trong nghiên cứu này chƣa thực sự tác dụng, hiệu quả chƣa triệt để trong việc ngăn ngừa sự lây nhiễm của ấu trùng SLTQC trên cá nuôi thƣơng phẩm.
Trong một số điều tra về tập quán ăn gỏi gần đây ở khu vực các tỉnh miền Bắc cho thấy tỷ lệ ngƣời ăn gỏi cá vẫn khá phổ biến ở một số vùng dịch tễ [12,14] trong khi đó các biện pháp can thiệp sinh học trong nuôi trồng thủy sản [10,15,16] chƣa tỏ ra có hiệu qủa thì cần phải có những giải pháp trong chế biến bảo quản để vô hiệu hóa khả năng lây nhiễm ấu trùng SLTQC cho con ngƣời. Đông lạnh, gia nhiệt, ƣớp muối....là những biện pháp thƣờng đƣợc sử dụng trong chế biến và bảo quản nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm. Tuy nhiên, hiệu quả của các phƣơng pháp này đối với ấu trùng SLTQC tại nƣớc ta vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu một cách nghiêm túc. Việc nghiên cứu xác định các điều kiện giới hạn cần thiết để bất hoạt ấu trùng có ý nghĩa khoa học và thực tiễn góp phần cung cấp những bằng chứng khoa học để xây dựng các hƣớng dẫn trong chế biến bảo quản thực phẩm (cá) để phòng tránh lây nhiễm SLTQC cho con ngƣời.
1.4. Điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội khu vực miền núi phía Bắc
1.4.1. Điều kiện tự nhiên, kinh tế - xã hội
Khu vực miền núi phía Bắc có tổng diện tích 95.272 km2, gồm 15 tỉnh bao gồm Phú Thọ, Hà Giang, Tuyên Quang, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Bắc Giang, Quảng Ninh, Lào Cai, Lai Châu, Điện Biên, Yên Bái, Sơn La và Hòa Bình (Hình 1. 2). Phía Đông giáp với Vịnh Bắc Bộ, phía Tây giáp Thƣợng Lào, phía Bắc giáp với Trung Quốc và phía Nam giáp nối liền với các tỉnh đồng bằng sông Hồng [109].
Khu vực MNPB có hệ thống ngòi lớn nhƣ sông Hồng, sông Đà, sông Cầu, sông Công, sông Chảy...vv đây là điều kiện vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của động vật thủy sản, là nguồn sinh kế của ngƣời dân [110]. Diện tích mặt nƣớc có thể phát triển nuôi trồng thủy sản của các tỉnh miền núi phía Bắc chủ yếu là các hồ chứa nhƣ hồ Thác Bà (Yên Bái) 19.000ha, hồ Núi Cốc (Thái Nguyên) 19.000ha, hồ Sông Đà (Hòa Bình và Sơn La) gần 15.000 ha, hồ Cấm Sơn (Bắc 30
Giang) 2.700 ha [111].
Hình 1.2: Các tinh thuộc khu vực miền núi phía Bắc, Việt Nam Với hơn 40 dân tộc, trong đó 63% là dân tộc thiểu số với 14,542 triệu ngƣời, chiếm 13,5% dân số của cả nƣớc. Trong số 10 tỉnh có tỉ lệ hộ nghèo nhiều nhất trong cả nƣớc thì có đến 9 tỉnh thuộc khu vực miền núi phía Bắc, đứng đầu là Điện Biên 48,14%, sau là Hà Giang 43,65%, Cao Bằng 42,53%, Lai Châu 40,40%, Sơn La 34,44%, Lào Cai 34,30%, Yên Bái 32,21%, Bắc Cạn 29,40% và Tuyên Quang 27,81% [112].
1.4.2. Đặc điểm hồ Thác Bà, Yên Bái
Hồ Thác Bà có chiều dài 80 km qua địa phận của 2 huyện Yên Bình và Lục Yên, tỉnh Yên Bái với có tổng diện tích mặt nƣớc 19.000 ha gồm nhiều đảo nhỏ có ngƣời dân sinh sống (Hình 1.3).
Nguồn lợi thủy sản hồ Thác Bà trƣớc đây đa dạng và phong phú. Năm 1962- 1964, khảo sát thành phần loài cá ở đây, Nguyễn Văn Hảo đã mô tả 57 loài sinh sống tại hồ, tổng kết toàn bộ kết quả nghiên cứu liên tục trong 5 năm (1971-1975), nhóm tác giả này đã thống kê, mô tả 79 loài. Gần đây nhất, khảo sát lại hiện trạng nguồn lợi thủy sản hồ Thác Bà, Ngô Sỹ Vân (1997) đã báo cáo cáo 76 loài, trong đó 31
50 loài thuộc họ cá Chép, chiếm 65,79%, họ cá Vƣợc 13 loài chiếm 17,1%, họ cá Nheo chiếm 13,16% và còn lại là một số ít họ cá khác [113].
Hình 1.3: Khu vực vùng của hồ Thác Bà, Yên Bái Nguồn lợi thủy sản hồ Thác Bà góp phần quan trọng đối với sinh kế của ngƣời dân vùng ven hồ. Xã Mông Sơn có 923 hộ, trƣớc đây có đến 30% số hộ sống bằng nghề đánh bắt, khai thác thủy sản đến nay còn 10-12% [114]. Nguyên nhân do nguồn lợi cá tự nhiên bị suy giảm do đánh bắt khai thác bằng những ngƣ cụ tận diệt. Tuy nhiên, gần đây, công tác bảo vệ nguồn lợi đƣợc tăng cƣờng; 400 vó bè của ngƣời dân ở hồ Thác Bà đã đƣợc dỡ bỏ để bảo vệ nguồn lợi thủy sản [115]. Hiện nay, nguồn lợi thủy sản hồ Thác Bà đã và đang dần đƣợc khôi phục; ƣớc tính một ngƣời dân mỗi ngày có thể đánh bắt đƣợc trung bình từ 7-10 kg cá [116].
Để giảm áp lực khai thác tự nhiên, trong những năm gần đây tỉnh Yên Bái đã có chủ trƣơng hỗ trợ phát triển nuôi trồng thủy sản và tái tạo nguồn lợi thủy sản ở các hồ chứa trong đó đặc biệt là hồ Thác Bà. Hàng năm tỉnh Yên Bái cho thả hàng chục tấn cá giống xuống hồ Thác Bà nhằm bổ sung khôi phục nguồn lợi. Chỉ riêng huyện Yên Bình hiện có khoảng 500 lồng cá trên hồ Thác Bà, năm 2016 tỉnh đã hỗ trợ 223 lồng, trong đó 193 lồng cho ngƣời dân và 30 lồng cho doanh nghiệp thủy sản. Năm 2017 các xã ven hồ Thác Bà đăng ký xây dựng 400 lồng. Hiện nay, sản 32 lƣợng cá hàng năm đánh bắt trên hồ Thác Bà trên 5.800 tấn, trong đó khai thác tự nhiên 1.500 tấn và cá lồng bè 4.300 tấn [117].
1.5. Những tồn tại trong nghiên cứu về sán lá truyền qua cá
Nghiên cứu về ấu trùng SLTQC, giai đoạn metacercariae nhiễm trên cá, giai đoạn khoảng 10 năm gần đây đƣợc quan tâm rất nhiều bởi có liên quan đến an toàn vệ sinh thực phẩm trong nuôi trồng thủy sản. Trong những năm qua, hầu hết các nghiên cứu chỉ tập trung vào các vùng dịch tễ của SLTQC qua ghi nhận trên ngƣời nhƣ Nam Định, Ninh Bình, Phú Yên hay các vùng có nuôi trồng thủy sản tập trung nhƣ các tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu long. Tất cả các nghiên cứu đều có ghi nhận về ấu trùng SLTQC tuy nhiên mức độ nhiễm khác nhau. Từ những nghiên cứu đã triển khai, có thể thấy rằng mức độ nhiễm ấu trùng SLTQC rất cao ở khu vực đồng bằng sông Hồng [8–10,89] và có xu hƣớng giảm nhẹ ở khu vực miền Trung [76,99,101] và xuống thấp ở khu vực đồng bằng sông Cửu long [102–104]. Riêng khu vực miền núi phía Bắc hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu nào về ấu trùng SLTQC, ngoại trừ có nghiên cứu của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2007) có ghi nhận về ấu trùng Centrocestus formosanus nhƣng là trên khía cạnh tác nhân gây bệnh của cá [13] và nghiên cứu của Nguyễn Thị Hợp và cs (2015) báo cáo về ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá nuôi tại huyện Kỳ Sơn, Hòa Bình [94], tuy nhiên đây là điểm giáp gianh với Hà Nội - thuộc khu vực đồng bằng Sông hồng hơn là khu vực MNPB. Do đó cần phải có nghiên cứu để đánh giá cụ thể hiện trạng SLTQC tại khu vực MNPB để thấy đƣợc bức tranh tổng thể về SLTQC tại Việt Nam.
Qua khá nhiều khảo sát về ấu trùng SLTQC ở khu vực đồng bằng sông Hồng nhƣng có thể thấy mức độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis hầu hết rất thấp Hơn nữa, hiện mới chỉ phát hiện 6 loài cá nƣớc ngọt nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ này [90]. Trong khi đó, có đến hơn 100 loài cá đã đƣợc xác định nhiễm ấu trùng của loài sán lá gan nhỏ này tại Trung Quốc và Hàn Quốc. Nhƣ vậy có thể nói rằng nghiên cứu của chúng ta về SLTQC vẫn còn nhiều hạn chế, cần tiếp tục mở rộng phạm vi vùng nghiên cứu, đối tƣợng nghiên cứu và thời gian nghiên cứu nhằm xác định đƣợc thành phần loài vật chủ của ấu trùng sán lá gan nhỏ, vùng dịch tễ của chúng, những 33 biến động mùa vụ (nếu có) và cả những điều kiện có thể bất hoạt ấu trùng này nhằm đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.
Để góp phần giải quyết một phần những hạn chế còn tồn tại nói trên chúng tôi triển khai thực hiện Đề tài "Nghiên cứu hiện trạng ấu trùng sán lá có khả năng lây truyền cho ngƣời nhiễm trên cá ở Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam" với Mục tiêu cụ thể nhƣ sau;
1) Xác định đƣợc thành phần ấu trùng sán lá và sự phân bố của chúng trên cá ở khu vực miền núi phía Bắc;
2) Xác định đƣợc sự biến động mùa vụ của ấu trùng sán lá phổ biến trên cá ở khu vực miền núi phía Bắc;
3) Xác định đƣợc các điều kiện chế biến và bảo quản có khả năng bất hoạt ấu trùng sán sán lá. 34
CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Cách tiếp cận
MNPB là khu vực mới và hầu nhƣ chƣa có nghiên cứu về SLTQC, đặc biệt là ấu trùng SLTQC nhiễm trên cá. Để thực hiện các Nội dung đề tài, đạt đƣợc các mục tiêu đề ra, nghiên cứu đƣợc tiếp cận theo 3 bƣớc (Hình 2.1).
Hình 2.1. Cách tiếp cận của nghiên cứu Cụ thể; 1) khảo sát nhanh về ấu trùng SLTQC trên bình diện chung, tổng thể các loại hình mặt nƣớc đại diện ở khu vực MNPB nhằm xác định sơ bộ thành phần loài, bƣớc đầu xác định vùng dịch tễ của SLTQC - vùng phân bố chủ yếu của SLTQC, các nhóm loài vật chủ trung gian (cá) nhiễm ấu trùng SLTQC; 2) nghiên cứu sâu ấu trùng SLTQC trên cá tại vùng dịch tễ, nhằm xác định và xác nhận rõ hơn về thành phần loài SLTQC, xác định loài vật chủ nhiễm ấu trùng SLTQC và biến động của ấu trùng SLTQC trên một số loài vật chủ quan trọng; 3) nghiên cứu các điều kiện bất hoạt ấu trùng SLTQC nhiễm trên cá ở khu vực MNPB, đối tƣợng thử nghiệm là các SLTQC quan trọng ở MNPB đã đƣợc xác định, nghiên cứu giúp xác 35
định rõ các điều kiện trong mức giới hạn cụ thể về thời gian để bất hoạt và lƣu giữ ấu trùng SLTQC (Hình 2.1).
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Sán lá truyền lây qua cá có khả năng lây nhiễm cho ngƣời – giai đoạn ấu trùng metacercariae nhiễm trên cá
2.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu này đƣợc thực hiện từ tháng 1 năm 2014 đến tháng 12 năm 2016.
Địa điểm thu mẫu đƣợc lựa chọn dựa trên tham vấn thông tin qua các Chi cục Thủy sản, Trung tâm Thủy sản, Trung tâm Y tế dự phòng và Trung tâm phòng chống sốt rét của 5 tỉnh gồm Điện Biên, Sơn La, Lào Cai, Yên Bái và Thái Nguyên để thực hiện khảo sát nhanh về ấu trùng SLTQC nhằm xác định vùng dịch tễ của SLTQC. Tiêu chí lựa chọn điểm thu mẫu là các vùng có nguy cơ cao về SLTQC qua thông tin về tập quán ăn gỏi cá, hoạt động nuôi trồng và khai thác thủy sản.
Cụ thể có 7 điểm thu cá ao nuôi, 6 điểm thu cá sông suối và 6 điểm thu cá hồ chứa (Bảng 2.1). Trong nghiên cứu này, Ao đƣợc hiểu là các ao hồ nhỏ nằm trong khu vực dân cƣ đƣợc sử dụng để thả nuôi cá, Sông suối là con sông tự nhiên nằm trong hệ thống sông ngòi chính ở khu vực miền núi phía Bắc, Hồ chứa là các hồ nhân tạo hoặc hồ tự nhiên lớn có tên tuổi ở khu vực miền núi phía Bắc.
Bảng 2.1: Địa điểm thu mẫu khảo sát ấu trùng sán lá truyền qua cá TT AO SÔNG SUỐI HỒ CHỨA 1 Phú Bình, Thái Nguyên Sông Cầu (Thái Bảo Linh (Thái Nguyên) Nguyên) 2 Trấn Yên, Yên Bái Sông Công (Thái Núi Cốc Thái Nguyên) Nguyên) 3 Yên Bình, Yên Bái Sông Hồng (Yên Bái) Thác Bà (Yên Bái) 4 Nghĩa Lộ, Yên Bái Sông Thia (Yên Bái) Cốc Ly (Lào Cai) 5 Bắc Hà, Lào Cai Nậm Rốn (Điện Biên) Pa Khoang (Điện Biên) 36
6 Mƣờng Thanh, Điện Biên Sông Chảy (Lào Cai) Sông Đà (Sơn La) 7 Bản Cá, Sơn La - - 186 mẫu 450 mẫu 210 mẫu
Kết quả khảo sát nhanh đã bƣớc đầu xác định đƣợc vùng dịch tễ của SLTQC là hồ Thác Bà, Yên Bái. Do đó, địa điểm nghiên cứu tiếp theo của đề tài là hồ Thác Bà nhằm đánh giá đầy đủ hơn về thành phần SLTQC và đặc biệt là sự biến động của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá tại đây.
Địa điểm phân tích mẫu và triển khai thí nghiệm: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I, tại Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh.
2.4. Phƣơng pháp thu mẫu, bảo quản và định danh cá
Đối với khảo sát nhanh về ấu trùng SLTQC: tập trung vào đối tƣợng cá bản địa đƣợc nuôi và khai thác phổ biến ở khu vực MNPB. Tiến hành thu mẫu ngẫu nhiên từ các hộ nuôi cá và ngƣời đánh bắt cá tự nhiên hoặc ngƣời bán cá tại các chợ địa phƣơng có xác định đƣợc nguồn gốc rõ ràng. Tổng số 846 mẫu cá thuộc 31 loài, thu từ 3 loại hình mặt nƣớc gồm ao, sông suối và hồ chứa từ tháng 5 năm 2014 đến tháng 8 năm 2014 ở khu vực miền núi phía Bắc (Bảng 2.2), đã đƣợc định danh theo tài liệu định loại cá nƣớc ngọt Việt Nam của kỹ sƣ Nguyễn Văn Hảo [118–120].
Bảng 2.2: Các loài cá thu được ở khu vực miền núi phía Bắc TT TÊN LOÀI CÁ N TL Khoa học Tiếng Việt (con) TB (g) SD 1 Acheilognathu macropterus Thè be 17 5,6 1,7 2 Anabas testudineus Rô đồng 21 15,4 6,7 3 Beaufortia leverettii Vây bằng vẩy 15 4,6 2,6 4 Carassius auratus Cá Diếc 8 39,2 47,7 5 Channa maculata Cá Quả 7 171,3 70,8 6 Cirrhinus cirrhosis Trôi Việt 13 135,9 87,1 7 Clarias fuscus Trê đen 17 25,4 14,8 8 Ctenopharyngodon idellus Trắm cỏ 55 85,8 84,9 37
TT TÊN LOÀI CÁ N TL Khoa học Tiếng Việt (con) TB (g) SD 9 Cultrichthys erythropterus Cá Thiểu 59 40,2 82,9 10 Cyprinus carpio Cá Chép 27 153,1 169,9 11 Elopichthys bambus Cá Măng 2 251,3 17,7 12 Garra sp. Cá Bậu 4 23,3 12,9 13 Glyptothorax honghensis Chiên suối 15 1,4 0,3 14 Hemibarbus macracanthus Đục chấm 5 4,9 1,6 15 Hemibarbus medius Đục cờ 14 6,6 3,1 16 Hemiculter leucisculus Mƣơng xanh 193 25,1 20,5 17 Hypophthalmichthys molitrix Mè trắng 42 234,2 173,2 18 Mastacemblus armatus Chạch sông 3 68,7 11,7 19 Microphysogobio sp. Cá Bống 1 6,1 0 20 Opsariichthys bibdens Cháo thƣờng 20 10,8 7.,3 21 Oreochromis niloticus Rô phi 33 58,9 60,5 22 Osteochilus salisburyi Dầm đất 42 9,4 3,4 23 Rhinogobius sp. Bống hoa 30 14,0 11,2 24 Sarcocheilichthy nigripinis Nhọ chảo 14 8,0 1,8 25 Schistura spp. Chạch suối 38 3,8 2,0 26 Squaliobalbus curriculus Chày mắt đỏ 21 52,5 41,3 27 Toxabramis houdemeri Tép dầu 81 3,3 1,3 28 Traccatichthys pulcher Chạch cật 15 5,3 1,2 29 Onychostoma laticeps Sỉnh gai 11 41,9 24,5 30 Xenocypris argentea Nhàng bạc 6 10,4 4,9 31 Prochilodus lineatus Trôi Nam mỹ 17 51,7 40,5
Đối với nghiên cứu biến động ấu trùng SLTQC: đối tƣợng thu mẫu chủ yếu là Tép dầu, Thiểu và Mƣơng xanh (không giới hạn đến các loài cá khác) có nguồn gốc từ hồ Thác Bà, mẫu đƣợc thu định kỳ 1 lần/tháng, trong vòng 1 năm từ tháng 9 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015. 38
Tổng số 1429 mẫu cá thuộc 22 loài (Bảng 2.3), thu đƣợc từ ngƣời đánh bắt trực tiếp và ngƣời thu mua cá tại hồ Thác Bà, Yên Bái, đƣợc định danh theo tài liệu định loại cá nƣớc ngọt Việt Nam của kỹ sƣ Nguyễn Văn Hảo [118–120].
Đối với thí nghiệm xác định điều kiện bất hoạt ấu trùng: thừa kế kết quả nghiên cứu của đề tài này, cá Tép dầu hồ Thác Bà, đƣợc thu phục vụ thí nghiệm.
Mẫu ngay sau khi thu, đƣợc bảo quản trong thùng bảo ôn (cách nhiệt) có chứa đá khô để duy trì nhiệt độ ở 4-5oC cho đến khi chuyển về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm, mẫu cá đƣợc chuyển vào ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC cho đến khi xử lý mẫu.
Bảng 2.3: Các loài cá thu được ở hồ Thác Bà, Yên Bái TT LOÀI CÁ N TL Tên khoa học Tên tiếng Việt (con) TB (g) SD 1 Acheilognathu macropterus Thè be 6 4,3 1,3 2 Anabas testudineus Rô đồng 26 15,9 4,7 3 Carassioides cantonensis Cá Nhƣng 38 52,5 26,4 4 Carassius auratus Cá Diếc 19 31,1 20,8 5 Channa maculata Cá Quả 44 45,7 34,8 6 Clarias fuscus Trê đen 3 29,1 39,6 7 Culter recurvirostris Ngão gù 25 38,9 38,3 8 Cultrichthys erythropterus Cá Thiểu 253 41,7 41,7 9 Cyprinus carpio Cá Chép 44 74,6 66,8 10 Glossogobio sp. Bống trắng 14 0,7 0,3 11 Hemiculter leucisculus Mƣơng xanh 353 17,7 15,7 12 Mastacembelus armatus Chạch sông 6 29,8 11,9 13 Neosalanx tangkakeii Tiểu bạc 8 1,2 0,2 14 Opsariichthys bidens Cháo thƣờng 15 113,5 36,1 15 Oreochromis niloticus Rô phi 15 29,4 13,4 16 Osteochilus salisburyi Dầm đất 102 20,7 14,8 17 Rhinogobius sp. Bống hoa 10 27,5 9,6 39
TT LOÀI CÁ N TL Tên khoa học Tên tiếng Việt (con) TB (g) SD 18 Pelteobagrus flavimanus Bò vàng 25 33,2 19,4 19 Prochilodus lineatus Trôi Nam mỹ 12 116,4 109,5 20 Squaliobarbus curriculus Chày mắt đỏ 24 75,2 40,8 21 Toxabrasmis houdemeri Tép dầu 373 4,8 4,6 22 Xenocypris argentea Nhàng bạc 13 29,7 6,8
2.5. Kỹ thuật phân lập và định loại sán lá truyền qua cá
Cá sau khi thu mẫu về đƣợc xét nghiệm riêng từng cá thể để xác định thành phần ấu trùng SLTQC theo quy trình (Hình 2.2) với 3 bƣớc chính nhƣ sau; 1) phân lập ấu trùng SLTQC; 2) định loại ấu trùng theo hình thái; 3) gây nhiễm động vật để xác nhận loài SLTQC.
Hình 2.2: Quy trình chung để xác định thành phần ấu trùng sán nhiễm trên cá Ấu trùng sau khi phân lập đƣợc quan sát trên kính hiển vi (Olympus CX31) để phân loại dựa vào một số đặc điểm hình thái quan trọng, đối chiếu với khóa định loại ấu trùng, có thể xác định đƣợc loài SLTQC. Mặc dù vậy, việc gây nhiễm động 40 vật để thu sán trƣởng thành vẫn cần thiết nhằm xác nhận loài SLTQC. Sán trƣởng thành đƣợc nhuộm bằng carmine để thẫy rõ hơn các đặc điểm hình thái, đối chiếu với khóa định loại sán trƣởng thành, xác định loài SLTQC.
2.5.1. Phân lập ấu trùng sán lá từ cá
Quy trình phân lập ấu trùng SLTQC (Hình 2.3) thực hiện trong nghiên cứu này dựa theo phƣơng pháp của Phan Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2013) đƣợc phát triển từ Sổ tay hƣớng dẫn phân lập và định loại ấu trùng sán lá của Dự án FIBOZOPA.
Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện dựa trên nguyên lý sử dụng dung dịch pepsin (6 g pepsin + 8 ml HCl + 1000 ml nƣớc cất) để tiêu hóa toàn bộ cơ của vật chủ (cá) qua đó bào nang chứa ấu trùng sán đƣợc tách ra khỏi cơ cá, khi lọc, rửa và lắng cặn sẽ thu đƣợc bào nang ấu trùng này. Cụ thể quy trình đƣợc thực hiện theo 4 bƣớc chính nhƣ sau;
Hình 2.3: Quy trình phân lập ấu trùng sán lá truyền qua cá [90] 41
Bƣớc 1: Nghiền mẫu cá: Lấy toàn bộ cá thể có trọng lƣợng ≤ 100 g (một số mẫu lớn >100 g, lấy mẫu đại diện các phần cơ khác nhau từ gốc vây đuôi đến phần đầu sao cho trọng lƣợng đạt ≤100 g), cắt nhỏ mỗi mẫu (con) trong mỗi cốc đong thủy tinh (500ml) riêng biệt, cho dung dịch pepsin vào mẫu tỷ lệ 1/1, sử dụng máy xay sinh tố cầm tay (Phillip), nghiền nhỏ các mẫu cá trong mỗi cốc này. Trong quá trình xay, có thể bổ sung thêm dung dịch Pepsin để mẫu cá đƣợc nghiền nhỏ và nhuyễn hơn giúp quá trình tiêu cơ đạt hiệu suất cao.
Bƣớc 2: Ủ để tiêu cơ: Bổ sung thêm dung dịch pepsin vào các mẫu sau khi nghiền sao cho thể tích dung dịch pepsin trong mỗi cốc đong chiếm từ 1-1,5 lần so với thể tích mẫu cá. Tủ ấm (Memmert 5000 ml) đã đƣợc bật sẵn và điều chỉnh ở nhiệt độ 37oC. Đặt các cốc đong chứa mẫu sau khi nghiền nhỏ với pepsin vào tủ ấm. Cứ sau 30 phút, dùng đũa thủy tinh khuấy đều mẫu trong mỗi cốc đong để dung dịch tiêu cơ hoạt động hiệu quả hơn. Sau 2-3 giờ, lấy mẫu ra khỏi tủ ấm để lọc, rửa và thu ấu trùng.
Bƣớc 3: Lọc, rửa và lắng cặn: Mỗi mẫu đƣợc lọc và rửa riêng biệt nhằm tránh lẫn chéo giữa các mẫu. Đối với mỗi mẫu, sử dụng 1 cốc đong 500 ml sạch, đặt bên dƣới lƣới lọc (inox, mắt lƣới 1 x 1 mm) vào bên trong chậu rửa, pha thêm dung dịch nƣớc muối sinh lý vào mẫu cần lọc, khuấy đều, để làm loãng mẫu. Đổ từ từ mẫu đã làm loãng này qua lƣới lọc, sử dụng thêm nƣớc muối sinh lý để rửa lại nhiều lần phần cặn phía trên lƣới lọc.
Dịch lọc thu đƣợc ở cốc đong bên dƣới lƣới lọc đƣợc để lắng trong vòng 30 giây, sau đó từ từ đổ nhẹ phần dịch nổi ở phía trên cốc đong. Cho thêm nƣớc muối sinh lý vào đầy cốc đong, tiếp tục để lắng mẫu trongng 30 giây, sau đó từ từ đổ phần dịch nổi phía trên của cốc đong (1/2), giữ lại phần lắng cặn. Lặp lại chu trình để lắng và đổ dịch nổi cho đến khi dung dịch mẫu trong cốc đong trở lên trong suốt thì kết thúc bƣớc lọc, rửa và lắng cặn của mỗi mẫu.
Bƣớc 4: Kiểm tra và thu ấu trùng: Hút phần lắng cặn cho vào đĩa Petri lớn (12 cm) sạch, đƣa lên kính giải phẫu (Olympus CZ 21- Nhật Bản) quan sát. Kiểm tra toàn bộ phần lắng cặn, dùng ống hút thủy tinh để hút các bào nang ấu trùng 42 chuyển sang 1 đĩa Petri nhỏ (5 cm) có chứa sẵn nƣớc muối sinh lý. Hút toàn bộ ấu trùng thu đƣợc từ mỗi mẫu vào 1 đĩa Petri riêng, giữ ở điều kiện 4oC trong lạnh phục vụ định loại.
2.5.2. Định loại sán lá truyền qua cá
2.5.2.1. Định loại ấu trùng
Mỗi mẫu cá có thể nhiễm 1 đến nhiều loại ấu trùng khác nhau, nhƣng trong đó thƣờng có 1 loại chiếm ƣu thế về số lƣợng. Việc định loại ấu trùng đƣợc chia làm 2 giai đoạn; 1) phân loại thô dựa trên kích thƣớc hình thái ban đầu thông qua kính giải phẫu ở độ phóng đại thấp; 2) định loại chi tiết ở độ phóng lớn ở kính hiển vi quan sát các đặc điểm hình thái quan trọng của ấu trùng.
Trƣớc tiên toàn bộ ấu trùng thu đƣợc từ mỗi mẫu giữ trong đĩa Petri nhỏ (5 cm) đƣợc quan sát bằng kính giải phẫu (Olympus CX21), sử dụng kim nhỏ để tách những ấu trùng có kích thƣớc, hình thái khác biệt với những ấu trùng còn lại. Sử dụng ống hút để hút các ấu trùng này, đƣa lên lam kính, đậy lamen và quan sát bằng kính hiển vi (Olympus CX41) ở các vật kính 10X, 40X và 100X. Sau đó, những ấu trùng còn lại cũng đƣợc hút đƣa lên lam kính và quan sát dƣới kính hiển vi (Olympus CX41) tƣơng tự ở các vật kính 10X, 40X và 100X.
Dƣới kính hiển vi, ở vật kính 10X, 40X, 100X, quan sát kỹ các đặc điểm hình thái cơ bản bao gồm giác miệng, giác bụng, túi bài tiết, răng trên giác bụng hoặc giác miệng…vv. Sử dụng trắc vi thị kính để đo kích, thƣớc ấu trùng chiều dọc và ngang, kích thƣớc giác miệng, giác bụng (nếu có), đếm số lƣợng răng trên giác miệng hoặc giác bụng (nếu có)…vv. Sử dụng khóa định loại ấu trùng đƣợc mô tả [90] kết hợp với tài liệu mô tả hình thái [54] để xác định loài sán.
Môt số trƣờng hợp chƣa quan sát rõ đƣợc các đặc điểm định loại có thể tiến hành phá nang bằng cách; dùng giấy thấm, rút nhẹ nƣớc ở dƣới lamen chứa bào nang ấu trùng để ấu trùng bị ép mỏng hoặc bào nang có thể vỡ, ấu trùng thoát khỏi bào nang có thể giúp quan sát rõ hơn một số đặc điểm định loại. Hoặc lật lamen khỏi lam kính, vừa quan sát dƣới kính giải phẫu, vừa dùng 2 kim nhọn để làm vỡ 43 thành bào nang giúp ấu trùng thoát khỏi bào nang (Hình 2.4).
A B
Hình 2.4: Ấu trùng sán thoát khỏi bào nang (A- sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis; B- sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio) 2.5.2.2. Gây nhiễm cho động vật
Gây nhiễm động vật để xác nhận loài, củng cố cho định loại ấu trùng và trong một số trƣờng hợp, gây nhiễm động vật để xác định loài mới (nếu có). Đối với gây nhiễm xác nhận loài, sử dụng chuột hamster (Cricetus frumentarius) để gây nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ [99] và chuột chuột bạch (Mus musculus) để gây nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ [121]. Chuột bạch và hamster đƣợc mua từ Trung tâm chăm sóc động vật thí nghiệm, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng, Hà Nội. Quy trình gây nhiễm đƣợc thực hiện nhƣ sau;
Chuẩn bị trƣớc ấu trùng với số lƣợng xác định đƣợc để trong đĩa Petri (5cm) có chứa nƣớc muối sinh lý 0,89% (BPS). Làm sạch kim gây nhiễm (kim cong, đầu tròn) bằng nƣớc nóng 100oC bằng cách bơm và hút 3 - 5 lần. Gây mê cho chuột bằng cách cho chuột vào trong một bình kín có chứa bông hoặc vải sợi, sau đó bơm một lƣợng nhỏ Ether vào bình. Bắt chuột ra sau 5 - 10 giây, khi chuột bắt đầu có dấu hiệu mê thuốc. Một tay giữ chuột; ngón cái và ngón trỏ cầm nhẹ vào da phần 44
đỉnh đầu của chuột, ngón út giữ lấy phần đuôi, thân chuột nằm trong lòng bàn tay. Một tay dùng kim gây nhiễm (kim cong, đầu tròn) hút hết số ấu trùng đã đƣợc chuẩn bị sẵn trong đĩa Petri để trên kính giải phẫu. Nhẹ nhàng đƣa đầu kim vào miệng, luồn qua hầu thực quản và đến dạ dày chuột để không làm tổn thƣơng đến đƣờng tiêu hóa. Chuột sau gây nhiễm đƣợc nuôi tách riêng và chăm sóc trong thời gian 7 ngày đối với chuột gây nhiễm sán lá ruột nhỏ và 30 - 40 ngày với sán lá gan nhỏ.
Sử dụng Ether để gây mê sâu cho chuột trƣớc khi mổ; chuột đƣợc cho vào bình thủy tinh có lắp kín sau đó bơm Ether, trong thời gian 3 -5 phút sau khi bơm Ether, chuột đã bất động tiến hành mổ chuột. Dùng kéo sắc mổ khoang bụng, thu toàn bộ ruột non (đối với sán lá ruột) và toàn bộ gan mật (đối với sán lá gan nhỏ) đặt trong đĩa Petri có chứa nƣớc muối sinh lý. Dùng dùi nhọn, kéo và panh nhỏ để rạch, tách ruột (sán lá ruột nhỏ) và tách gan, mật (sán lá gan nhỏ) cho sán trƣởng thành thoát ra ngoài.
Soi trên kính giải phẫu để tìm và thu sán trƣởng thành sau đó đƣợc cố định bảo quản trong cồn 70% hoặc cồn 96% phục vụ cho nghiên cứu hình thái và sinh học phân tử khi cần thiết.
2.5.2.3. Nhuộm tiêu bản
Sán lá trƣởng thành gây nhiễm từ động vật thí nghiệm trong nghiên cứu này đều là các loài sán có kích cỡ nhỏ nên đƣợc tiến hành nhuộm theo 7 bƣớc cơ bản nhƣ sau;
Bƣớc 1: Rửa sán: Dùng chổi lông vớt sán đang bảo quản trong cồn ra đĩa Petri (12 cm) chứa 10 ml nƣớc cất.
Bƣớc 2. Nhuộm sán: Sử dụng pipet thủy tinh hút khoảng 10 ml dung dịch carmine cho vào đĩa Petri sạch (12 cm) sau đó dùng chổi lông đảo nhẹ sán trong nƣớc cất rồi vớt sang dung dịch nhuộm sao cho sán ngập trong dung dịch, ngâm trong trong thời gian 20 phút;
Bƣớc 3. Tẩy màu: Vớt sán ra khỏi thuốc nhuộm chuyển vào đĩa petri có 20 ml nƣớc cất sau đó vớt một sán cho vào đĩa Petri có 10 ml dung dịch tẩy màu, quan sát sán 45 dƣới kính lúp điện trong dung dịch tẩy màu đến khi quan sát rõ nội quan. Sau khi quan sát rõ nội quan, vớt sán chuyển sang đĩa Petri có 20 ml nƣớc cất. Lặp lại quá trình trên đối với mỗi mẫu sán khác đến khi tẩy màu xong tất cả các mẫu sán. Đảo nhẹ sán rồi đổ hoặc hút bỏ nƣớc rồi thêm 20 ml nƣớc cất mới, lặp lại 3 lần để rửa sán.
Bƣớc 4. Hút nƣớc: Vớt sán chuyển vào đĩa Petri (12 cm) có 20 ml cồn 70%, để ít nhất 1 giờ sau đó chuyển sán vào đĩa Petri (12 cm)có 20 ml cồn 80%, để ít nhất 1 giờ rồi chuyển sán vào đĩa Petri (12 cm) có 20 ml cồn 90% rồi tiếp tục ngâm trong 1 giờ hoặc qua đêm và sau đó chuyển sán vào cồn tuyệt đối lần 1 trong ít nhất 1 giờ rồi chuyển vào cồn tuyệt đối lần 2 và để trong ít nhất 1 giờ.
Bƣớc 5. Loại cồn: Chuyển từng mẫu sán vào đĩa Petri có 20 ml cồn: xylen với tỷ lệ 1:1, để khoảng 1-5 phút sau đó chuyển sán sang đĩa Petri 20 ml có chứa xylen (lần 1), để khoảng 1-5 phút và rồi chuyển sán sang đĩa Petri 20 ml có chứa xylen (lần 2) và ngâm trong khoảng 1-5 phút.
Bƣớc 6. Gắn tiêu bản: Thực hiện gắn tiêu bản sán dƣới kính lúp điện, dùng đũa thủy tinh nhỏ 1 giọt Canada balsam lên lam kính, vớt sán lá đặt lên trên giọt Canada balsam, dùng kim nhọn đầu chỉnh sán ngay ngắn trong giọt balsam.
Bƣớc 7. Để khô tiêu bản: Để tiêu bản vào nơi bằng ph ng, khô ráo ít nhất 3 tháng ở nhiệt độ phòng hoặc 3 tuần trong tủ ấm 45oC.
2.5.2.4. Định loại sán trưởng thành
Dựa theo các khóa định loại [122,123] để xác định loài sán trƣởng thành thu đƣợc từ động vật thí nghiệm sau khi nhuộm và làm tiêu bản.
2.6. Xác định điều kiện bất hoạt và lƣu giữ ấu trùng sán lá truyền qua cá
Nghiên cứu sử dụng ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis và H. pumilio làm đối tƣợng nghiên cứu. Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis đƣợc phát hiện nhiễm với tỷ lệ và cƣờng độ cao trên một số loài cá tự nhiên ở khu vực MNPB, đặc biệt là cá Tép dầu ở hồ Thác Bà, Yên Bái. Sán lá gan nhỏ C. sinensis là một vấn đề của sức khỏe cộng đồng vì có thể gây ung thƣ đƣờng ống mật ở ngƣời [34]. Trong 5 loài sán lá ruột nhỏ, ấu trùng sán lá ruột nhỏ H. pumilio là loài nhiễm phổ biến nhất ở trên cá 46 tại khu vực MNPB. Theo những kết quả khảo sát gần đây về SLTQC tại Việt Nam, H. pumilio cũng là loài phổ biến nhất ở trên cá nƣớc ngọt [8–10,76,89,103]. Do đó, ấu trùng C. sinensis và H. pumilio đƣợc lựa chọn để thử nghiệm các điều bất hoạt trong nghiên cứu này.
2.6.1. Bố trí các thí nghiệm xác định điều kiện bất hoạt
Nghiên cứu triển khai 11 thí nghiệm với ấu trùng SLTQC (H. pumilio và C. sinensis) và cá Tép dầu nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis và 7 nhóm điều kiện thí nghiệm khác nhau (Bảng 2.4).
Bảng 2.4: Thí nghiệm thực nhằm xác định điều kiện bất hoạt ấu trùng sán lá ĐIỀU KIỆN ẤU TRÙNG ẤU TRÙNG CÁ NHIỄM H. pumilio C. sinensis C. sinensis Đông lạnh 0 oC, -20oC, -80oC 0oC, -20oC, -80oC 0oC, -20oC, -80oC
Gia nhiệt 50 o C, 70oC, 100oC 50oC, 70oC, 100oC - Ƣớp muối - 5%, 7%, 10% 5%, 7%, 10% Kháng sinh - 0,001; 0,05; 0,1% - Praziquantel - 75, 150, 300ppm - Nƣớc chanh - 100% - Rƣợu - 30%, 40%, 50% -
Các ngƣỡng điều kiện thử nghiệm đƣợc sử dụng dựa trên các cơ sở khoa học và thực tiễn. Nhiệt độ 0oC là điều kiện thông dụng đƣợc sử dụng để bảo quản thực phẩm hàng ngày của con ngƣời, nhiệt độ -20oC và -80oC là điều kiện trong phòng thí nghiệm. Ngƣỡng 100oC là mức gia nhiệt tối ƣu trong hầu hết các phƣơng thức chế biến thông thƣờng. Đã có các nghiên cứu trƣớc thử nghiệm với độ muối 20- 30% và khảo sát sơ bộ chũng tôi cũng thấy ở độ mặn 15 – 30% ấu trùng sán bị bất hoạt nhanh, do vậy chúng tôi muốn khảo sát ở các độ muối thấp hơn 5-7%. Nƣớc chanh và rƣợu thƣờng đƣợc sử dụng trong khi ăn gỏi cá với suy nghĩ là sẽ diệt đƣợc giun sán nói chung, để làm rõ điều này chúng tôi đã sử dụng nƣớc chanh 100%, rƣợu ở các nồng độ 30, 40 và 50%. Nghiên cứu cũng thử nghiệm với kháng sinh với mục đích đánh giá khả năng lƣu giữ ấu trùng trong khi đó praziquantel đƣợc thử 47 nghiệm với mục đích diệt ấu trùng sán lá truyền qua cá. Nồng độ 75 ppm đƣợc sử dụng là căn cứ dựa trên liều điều trị ở ngƣời [70].
2.6.1.1. Ấu trùng sán lá trong điều kiện đông lạnh
Ấu trùng sán lá ruột nhỏ: lựa chọn các ấu trùng H. pumilio còn khỏe mạnh - khả năng vận động tốt, hút từ 10-30 ấu trùng cho vào mỗi đĩa petri (đƣờng kích 5 cm) khô, sạch sau đó đƣa vào các tủ lạnh/âm sâu (0oC, -20oC và -80oC). Sau mỗi khoảng thời gian đông lạnh, lấy một đĩa petri ở mỗi điều kiện ra (Bảng 2.5).Ngay sau giã đông ở nhiệt độ phòng, ấu trùng đƣợc hút đƣa lên lam kính và soi trên kính hiển vi Olympus CX 31 (Nhật Bản) để xác định số lƣợng ấu trùng bất hoạt theo tiêu chí Bảng 2.15.
Bảng 2.5: Thí nghiệm đông lạnh nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá ruột nhỏ SỐ LƢƠNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM THỜI GIAN Nhiệt độ 0⁰C Nhiệt độ -20⁰C Nhiệt độ -80⁰C 05 phút 15 14 30 10 phút 12 11 25 15 phút 15 13 15 30 phút 12 11 17 01 giờ 15 15 16 05 giờ 13 15 13 12 giờ 17 11 11 24 giờ 18 12 19 36 giờ 10 14 16
Ấu trùng sán lá gan nhỏ: Thí nghiệm đƣợc bố trí với 21 nghiệm thức; 3 mức đông lạnh x 7 khoảng thời gian (Bảng 2.6). Ấu trùng C. sinensis ngay sau khi phân lập từ cá Tép dầu đƣợc hút bằng micropipette 200 µl từ 20-69 ấu trùng (1 lần) sang 1 đĩa Petri (5 cm) khô và sạch sau đó đƣa vào đông lạnh ở mỗi mức nhiệt độ và thời gian xác định. Sau thời gian đông lạnh, mẫu sẽ đƣợc giã đông ở nhiệt độ phòng từ 10-15 phút trƣớc khi kiểm tra bằng kính hiển vi. Ấu trùng bất hoạt đƣợc xác định theo tiêu chí (Bảng 2.15) 48
Bảng 2.6: Thí nghiệm đông lạnh bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM THỜI GIAN Đông lạnh 0oC Đông lạnh -20oC Đông lạnh -80oC 05 phút 30 30 46 10 phút 50 61 69 30 phút 30 31 30 01 giờ 35 30 30 06 giờ 30 30 40 12 giờ 38 30 38 24 giờ 30 20 30
Ấu trùng sán lá gan nhỏ trong cá: Thí nghiệm đƣợc bố trí với 15 nghiệm thức; 3 mứcđông lạnh với 5 khoảng thời gian (Bảng 2.7). Cá Tép dầu sau khi thu đƣợc từ hồ Thác Bà, Yên Bái đƣợc xếp đều vào các khay kim loại, mỗi khay chứa từ 30-100 cá thể sau đó đƣa đông lạnh ở các mức nhiệt độ xác định (0oC, -20oC, -80oC). Sau mỗi khoảng thời gian đông lạnh xác định, mỗi khay mẫu ở mỗi mức đông lạnh đƣa ra giã đông ở nhiệt độ phòng (25 - 28oC) trong thời gian 30 - 60 phút. Cá ở từng khay riêng đƣợc đƣa vào các cốc đong thủy tinh 500ml, mỗi cốc từ 5-10 cá thể.
Bảng 2.7: Thí nghiệm đông lạnh bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ trong cá THỜI GIAN SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM (ngày) Nhiệt độ 0oC Nhiệt độ -20oC Nhiệt độ -80oC 1 51 50 50 3 50 50 50 5 30 30 30 7 100 90 90 10 90 70 70
Phân lập ấu trùng từ các mẫu cá sau khi đông lạnh bằng phƣơng pháp tiêu cơ để thu ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis. Kiểm tra ấu trùng bằng kính hiển vi ở vật kính 40X để quan sát hình thái, ấu trùng bất hoạt đƣợc xác định dựa theo tiêu chí mô tả ở Bảng 2.15. 49
2.6.1.2. Ấu trùng sán lá trong điều kiện gia nhiệt
Ấu trùng sán lá ruột nhỏ:ấu trùng H. pumilio sau khi đƣợc phân lập từ cá đƣợc đƣa vào các ống eppendoft 0,5 ml (Bảng 2.8), điều chỉnh máy nâng nhiệt VLM (Đức) ở mức nhiệt xác định 50⁰C, 70⁰C hoặc 100⁰C, sau khi nhiệt độ ổn định, tiến hành đƣa ống eppendoft có chứa ấu trùng vào khay nâng nhiệt và lần lƣợt lấy mỗi ống eppendoft chứa ấu trùng ra sau 30 giây, 1, 5, 10, 15 và 20 phút. Đƣa ấu trùng lên lam kính, đậy lam men và kiểm tra ở vật kính 40X kính hiển vi (Olympus CX 31). Ấu trùng bất hoạt đƣợc xác định dựa vào tiêu chí mô tả ở Bảng 2.15.
Bảng 2.8: Thí nghiệm gia nhiệt nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá ruột nhỏ SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM THỜI GIAN Nhiệt độ 50⁰C Nhiệt độ 70⁰C Nhiệt độ 100⁰C 30 giây 21 20 18 01 phút 22 20 20 05 phút 20 20 19 10 phút 20 19 17 15 phút 20 18 15 20 phút 20 15 10
Ấu trùng sán lá gan nhỏ: thí nghiệm đƣợc bố trí với 21 nghiệm thức; 3 mức gia nhiệt trong 7 khoảng thời gian xác định (Bảng 2.9). Ấu trùng C. sinensis sau khi phân lập đƣợc từ cá Tép dầu thu từ hồ Thác Bà, Yên Bái đƣợc hút bằng micropipette, 50 - 82 ấu trùng trong 100 µl/lần sang 1 ống eppendoft 0,5 ml khô, sạch. Sử dụng máy ủ nhiệt VMLs đã đƣợc cài đặt ở mức nhiệt độ xác định (50oC, 70oC và 100oC), cho các ống eppendoft chứa ấu trùng vào các giếng ủ và lấy khỏi giếng sau mỗi khoảng thời gian xác định (15 giây, 30 giây, 1 phút, 5 phút, 10 phút, 15 và 20 phút. Mẫu lấy ra khỏi giếng ủ nhiệt để cân bằng ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 - 10 phút sau đó dùng micropipette hút hết ấu trùng đƣa lên lam kính để kiểm tra. Ấu trùng sán lá gan nhỏ bất hoạt đƣợc xác định dựa theo tiêu chí Bảng 2.15.
50
Bảng 2.9: Thí nghiệm gia nhiệt nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM THỜI GIAN Nhiệt độ 50oC Nhiệt độ 70oC Nhiệt độ 100oC 15 giây 75 76 82 30 giây 70 76 75 01 phút 50 50 51 05 phút 50 50 50 10 phút 50 50 - 15 phút 50 - - 20 phút 50 - -
2.6.1.3. Ấu trùng sán lá trong điều kiện muối
Ấu trùng sán lá gan nhỏ: thí nghiệm đƣợc bố trí ƣớp muối ở 3 nồng độ muối tƣơng ứng với 5 khoảng thời gian (Bảng 2.10). Ấu trùng C. sinensis sau khi phân lập đƣợc từ cá đƣợc đƣợc chuyển sang các đĩa Petri (5cm) có chứa hàm lƣợng muối (NaCl) khác nhau 5%, 7% và 10%. Tiến hành hút cùng lúc ấu trùng ở cả 3 nồng độ muối (5%, 7%, 10%) sau khoảng thời gian xác định (1 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ) để kiểm ấu trùng bất hoạt. Ấu trùng bất hoạt đƣợc kiểm tra theo tiêu chí Bảng 2.15.
Bảng 2.10: Thí nghiệm ngâm muối nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ THỜI GIAN SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM (giờ) 5% NaCl 7% NaCl 10% NaCl 01 50 52 51 06 50 55 55 12 50 50 50 24 50 50 55 48 50 - -
Ấu trùng sán lá gan nhỏ trong cá: thí nghiệm đƣợc bố trí với 12 nghiệm thức tƣơng ứng với 3 nồng độ ƣớp muối và 4 khoảng thời gian (Bảng 2.11). Mỗi nghiệm thức đƣợc bố trí với 45-50 mẫu cá Tép dầu, cân trọng lƣợng cá tổng của mỗi nghiệm thức sau đó trộn đều với muối tinh NaCl theo tỉ lệ tƣơng ứng 5, 7, 10% 51 trọng lƣợng cá. Sau mỗi khoảng thời gian ƣớp muối xác định (1 ngày, 5 ngày, 10 ngày và 15 ngày), mẫu cá ƣớp muối đƣợc đƣa vào tiêu cơ để phân lập ấu trùng.
Bảng 2.11: Thí nghiệm ướp muối cá nhằm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ THỜI GIAN SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM (ngày) 5% NaCl 7% NaCl 10% NaCl 01 50 51 50 05 50 50 50 10 50 50 50 15 45 50 50
2.6.1.4. Ấu trùng sán lá trong điều kiện kháng sinh
Ấu trùng sán lá gan nhỏ: ấu trùng C. sinensis phân lập từ cá Tép dầu thu tại hồ Thác Bà đƣợc bố trí lƣu giữ trong dung dịch BPS có chứa kháng sinh florfenicol
(C12H14Cl2FNO4S) ở 3 nồng độ khác nhau 0,01%; 0,05% và 0,1% (đối chứng không chứa kháng sinh). Mỗi nồng độ kháng sinh đƣợc bố trí 3 lần lặp lại, 30 ấu trùng/lần trong mỗi ống eppendoft 2,0 ml và đƣợc lƣu giữ trong ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Kiểm tra và thay thế dung dịch bảo quản định kỳ 2 tháng/lần. Ấu trùng ở mỗi nồng độ kháng sinh đƣợc hút ra đĩa Petri 5ml chứa nƣớc muối sinh lý vô trùng và quan sát bằng kính giải phẫu. Ấu trùng bất hoạt đƣợc loại bỏ, ấu trùng sống sót đƣợc giữ lại và chuyển sang ống eppendoft mới có chứa nƣớc muối sinh lý với hàm lƣợng kháng sinh tƣơng tự. Thí nghiệm đƣợc theo dõi trong thời gian 12 tháng với 6 lần kiểm tra và thay dung dịch lƣu giữ.
2.6.1.5. Ấu trùng sán lá trong điều kiện xử lý bằng praziquantel
Ấu trùng sán lá gan nhỏ: thuốc Praziquantel dạng viên nén 600 mg đƣợc cung cấp bởi TS. Đỗ Trung Dũng, Viện Sốt rét, Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ƣơng, Hà Nội. Dùng cối chày sứ nghiền nhỏ thuốc bằng sau đó pha loãng với dung dịch nƣớc muối sinh lý để tạo thành các dung dịch có hàm lƣợng 75ppm, 150ppm, 300ppm. Thí nghiệm đƣợc bố trí 3 nghiệm thức; mỗi nghiệm thức tƣơng ứng với 1 nồng độ praziquantel và 1 đối chứng chứa dung dịch BPS (Bảng 2.12). 52
Sử dụng ống hút lấy 10 ml praziquantel cho vào đĩa Petrri (5cm); mỗi nồng độ 3 đĩa và 10ml nƣớc muối sinh lý cho vào 1 đĩa tƣơng tự. Hiệu chỉnh micropipette ở mức 100µl sau đó hút 26 - 39 metacercariae chuyển vào mỗi đĩa Petri nói trên. Thí nghiệm đƣợc bố trí trong điều kiện nhiệt độ phòng (25- 30oC) . Sau 3, 6 và 24 giờ ủ trong dung dịch praziquantel, hút lại ấu trùng ở 1 đĩa lồng trong mỗi nghiệm thức, chuyển sang 1 đĩa lồng mới và có chứa BPS.
Dùng kính giải phẫu (Olympus CZ21) để quan sát xác định và đếm số lƣợng ấu trùng bất hoạt. Trong một số trƣờng hợp nghi nghờ ấu trùng còn sống, ấu trùng đƣợc tách riêng, hút đƣa lên lam kính, đậy bằng lamen và soi trên kính hiển vi (Olympus CX31), quan sát ở độ phòng đại 400 lần để chắc chắn rằng ấu trùng đã bất hoạt theo tiêu chí (Bảng 2.15).
Bảng 2.12: Thí nghiệm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ bằng praziquantel THỜI GIAN SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM (giờ) 75ppm 150ppm 300ppm BPS 03 36 31 37 29 06 31 27 26 30 24 35 39 31 33
2.6.1.6. Ấu trùng sán lá trong điều kiện ngâm bằng nước chanh
Ấu trùng sán lá gan nhỏ: đƣợc bố trí với 5 nghiệm thức tƣơng ứng với 5 mức thời gian (30 phút, 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ và 12 giờ) ngâm ấu trùng trong nƣớc vắt từ quả chanh tƣơi (Citrus limonia) - 100% và 1 đối chứng là nƣớc muối sinh lý (Bảng 2.13). Dùng micropipette, hiệu chỉnh 100µl, hút 26-39 ấu trùng cho ngẫu nhiên vào 6 đĩa lồng (5cm) sạch. Nƣớc chanh đƣợc vắt trực tiếp từ quả chanh tƣơi vào lần lƣợt 5 đĩa (5 nghiệm thức) đã chứa ấu trùng sán sao cho nƣớc chanh dàn đều hết đáy đĩa. Thay vì nƣớc chanh, nƣớc muối sinh lý đƣợc cho vào đĩa lồng còn lại có chứa ấu trùng sán làm đối chứng. Thí nghiệm đƣợc theo dõi trong phòng điều hòa, nhiệt độ hiệu chỉnh 250C. Sau mỗi mức thời gian (30 phút, 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ và 12 giờ), dùng nƣớc muối sinh lý pha loãng nƣớc chanh ở 1 đĩa lồng và tiến hành soi trên kính giải phẫu để xác định và đếm số lƣợng ấu trùng bất hoạt. 53
Bảng 2.13: Thí nghiệm dùng nước chanh để bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM THỜI GIAN (giờ) Nƣớc chanh BPS 1/2 112 30 1 98 30 3 106 30 6 120 30 12 100 30
2.6.1.7. Ấu trùng sán lá trong điều kiện ngâm với rượu
Ấu trùng sán lá gan nhỏ: bố trí với 3 nghiệm thức tƣơng ứng với 3 nồng độ rƣợu 30%, 40% và 50% (rƣợu gạo đƣợc mua tại Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh) và đối chứng là nƣớc muối sinh lý. Mỗi nghiệm thức bố trí 3 đĩa lồng (5cm) chứa 5ml rƣợu với nồng độ tƣơng ứng và đối chứng là 1 đĩa lồng chứa 5ml nƣớc muối sinh lý. Sử dụng micropipette, hiệu chỉnh 100µl, hút 22 - 66 ấu trùng cho vào mỗi đĩa lồng ở các nghiệm thức và đối chứng (Bảng 2.14).
Bảng 2.14: Thí nghiệm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ bằng rượu gạo THỜI GIAN SỐ LƢỢNG ẤU TRÙNG THỬ NGHIỆM (phút) Rƣợu 30% Rƣợu 40% Rƣợu 50% BPS 30 26 30 22 27 60 30 32 41 27 90 66 52 66 27
Thí nghiệm đƣợc đặt trong điều kiện phòng thí nghiệm có điều hòa nhiệt độ đƣợc hiệu chỉnh ở mức 25oC trong suốt thời gian theo dõi. Sau 30, 60 và 90 phút, sử dụng nƣớc muối sinh lý pha loãng rƣợu ở 1 đĩa mỗi nghiệm sau đó hút ấu trùng sang đĩa lồng khác đã có sẵn nƣớc muối sinh lý. Đƣa đĩa lồng này lên kính giải phẫu quan sát để xác định và đếm số lƣợng ấu trùng bất hoạt. Trong một số trƣờng hợp, ấu trùng đƣợc kiểm tra lại bằng kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần để xác nhận ấu trùng bất hoạt theo tiêu chí trình bày tại Bảng 2.15.
54
2.6.2. Xác định ấu trùng bất hoạt
Ấu trùng SLTQC đƣợc xem là bất hoạt có thể có những biến đổi về hình thái quan sát thấy rõ qua kính hiển vi hoặc có thể không, mức độ biến đổi hình thái ấu trùng phụ thuộc vào cả điều kiện và thời gian bất hoạt. Tuy nhiên, ấu trùng SLTQC bất hoạt đƣợc xác dịnh dựa vào những tiêu chí về hình thái và khả năng vận động của chúng (Bảng 2.15).
Bảng 2.15: Tiêu chí căn cứ xác định ấu trùng sán lá bất hoạt STT TIÊU CHÍ Ấu trùng bị teo nhỏ không bình thƣờng tạo thành khoảng trống lớn trong 1 bào nang, không rõ cấu trúc ấu trùng 2 Tổng thể bào nang ấu trùng chuyển màu đen hay màu nhạt 3 Túi bài tiết trống do chất bài tiết bị vỡ và giải phóng, Ấu trùng trƣơng lớn lấp đầy khoang bào nang, không còn gianh giới giữa 4 các cấu trúc 5 Không vận động
2.7. Phân tích và xử lý số liệu
Số liệu đƣợc nhập vào cơ sở dữ liệu trên excel sheet (Microsoft Office version 2010) và chuyển sang Stata sheet Stata IC12.1 (StataCorp LP) để phân tích và xử lý số liệu, cụ thể nhƣ sau;
Tỉ lệ nhiễm = 100 x số mẫu nhiễm ấu trùng/số mẫu kiểm tra (%)
Cƣờng độ nhiễm = tổng số ấu trùng/số mẫu nhiễm ấu trùng (ấu trùng/mẫu)
Mật độ ấu trùng = tổng số ấu trùng/khối lƣợng mẫu nhiễm (ấu trùng/g)
Sử dụng hàm thống kê mô tả (trong Stata IC12.1) để tính giá trị trung bình trọng lƣợng mẫu cá, chiều dài trung bình, độ lệch chuẩn, tính tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán trên cá theo loại hình mặt nƣớc (ao, sông suối, hồ chứa), theo loài, mùa vụ (mùa Khô và mùa Mƣa), theo kích cỡ cá (ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá Tép dầu, mật độ ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis phân bố trên Tép dầu (Cƣờng độ nhiễm đƣợc tính bằng tổng số ấu trùng SLTQC/số mẫu cá có 55 nhiễm ấu trùng SLTQC đó).
So sánh tỷ lệ nhiễm ấu trùng sán giữa các loại hình mặt nƣớc, loài vật chủ, mùa vụ (sán lá gan nhỏ C. sinensis), kích cỡ cá (ấu trùng sán lá gan nhỏ) bằng hàm “logistic regression”. So sánh cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán giữa các loại hình mặt nƣớc, loài vật chủ, mùa vụ (sán lá gan nhỏ C. sinensis), kích cỡ cá (ấu trùng sán lá gan nhỏ) bằng hàm “generalized negative binomial regression.
So sánh tỷ lệ sống của ấu trùng giữa các nghiệm thức trong cùng một thí nghiệm tại các thời điểm tƣơng đồng bằng hàm Anova, sai khác có ý nghĩa khi giá trị P nhỏ hơn 0,05.
56
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần ấu trùng sán lá nhiễm trên cá ở khu vực miền núi phía Bắc
Khảo sát nhanh về SLTQC ở khu vực MNPB và nghiên cứu về SLTQC tại hồ Thác Bà, Yên Bái, đã phân loại đƣợc ấu trùng của 6 loài thuộc 2 họ và 4 giống SLTQC, trong đó đặc biệt quan trọng là sự hiện diện ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá tại đây (Bảng 3.1).
Bảng 3.1: Ấu trùng các loài sán lá truyền qua cá ở khu vực miền núi phía Bắc HỌ GIỐNG LOÀI Opisthorchiidae Clonorchis Clonorchis sinensis (Looss, 1907) Heterophyidae Haplorchis Haplorchis pumilio (Looss, 1896) Haplorchis taichui (Nishigori, 1924) Haplorchis yokogawai (Katsuta, 1932) Procerovum Procerovum varium (Onji & Nishio, 1916) Centrocestus Centrocestus formosalus (Nishigori, 1924)
3.1.1. Ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis
Bào nang ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis phân lập từ cá trong nghiên cứu này có dạng hình tròn hoặc elip (173,3 x 151,3 μm), giác bụng (48,1 x 43,2 μm) và giác miệng (51,3 x 47,4 μm) nổi rõ và tƣơng đƣơng nhau (Hình 3.1).
Phân biệt ấu trùng sán lá gan nhỏ với sán lá ruột nhỏ bƣớc đầu có thể dựa vào sự khác biệt về kích cỡ quan sát qua kính giải phẫu; có thể nhận thấy qua Hình 3.2. Tuy nhiên, kích thƣớc bào nang của C. sinensis nhiễm trên cá ở khu vực MNPB (Hồ Thác Bà, Yên Bái) tƣơng đồng với ấu trùng C. sinensis đƣợc phân lập từ cá tại Hàn Quốc [124]. 57
OS
VS
EX
Hình 3.1: Ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis (OS: giác miệng; VS: giác bụng; EX: túi bài tiết; Đầu mũi tên: thành bào nang) OS
CS
VS
HP
Hình 3.2: Sự khác biệt về kích cỡ ấu trùng sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ (CS: Clonorchis sinensis; HP: Haplorchis pumilio) 58
Hình thái ấu trùng sán lá gan nhỏ khá khác biệt với ấu trùng sán lá ruột nhỏ; kích thƣớc bào nang thƣờng nhỏ hơn - có thể phân biệt đƣợc ở độ phòng đại của kính giải phẫu, đặc điểm định loại cũng nhận dạng khá đơn giản. Tuy nhiên, giữa 2 loài sán lá gan nhỏ C. sinensis và O. viverrini lại không thể phân biệt nếu chỉ dựa vào hình thái giai đoạn ấu trùng metacercariae. Ấu trùng sán C. sinensis trong nghiên cứu này đã đƣợc xác nhận thông qua gây nhiễm trên chuột hamster. Sán trƣởng thành sau khi nhuộm carmine đã quan sát thấy rõ tinh hoàn hình rễ cây, đây là đặc điểm định loại của C. sinensis để phân biệt với O. viverrini, có tinh hoàn dạng thùy.
Bảng 3.2: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis TT TÊN VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM Tên khoa học Tiếng Việt 1 Toxabramis houdemeri Tép dầu Hồ Thác Bà (Yên Bái) 2 Hemiculter leucisculus Mƣơng xanh Sông Cầu (Thái Nguyên) Hồ Thác Bà, Sông Hồng, Sông Chảy (Yên Bái) 3 Culterichthys erythropterus Cá Thiểu Thác Bà, Sông Hồng (Yên Bái) 4 Culter recurvirostris Ngão gù Hồ Thác Bà (Yên Bái) 5 Carassius cantonensis Cá Nhƣng Hồ Thác Bà (Yên Bái) 6 Opsariichthys bidens Cháo thƣờng Hồ Thác Bà (Yên Bái) 7 Osteochilus salsburyi Dầm đất Hồ Thác Bà (Yên Bái) 8 Rhinogobius sp. Bống hoa Hồ Thác Bà (Yên Bái)
Nghiên cứu đã ghi nhận 8/35 loài thuộc 2 họ, 8 giống cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinenis, trong đó 4 loài cá có mức độ nhiễm cao đều thuộc họ cá Chép Cyprinidae bao gồm: Tép dầu, Mƣơng xanh, Thiểu và Ngão gù. Các loài cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ đều là cá tự nhiên, có nguồn gốc từ sông suối và hồ chứa ở khu vực miền núi phía Bắc, đặc biệt là hồ Thác Bà, Yên Bái (Bảng 3.2).
Có thể nói rằng đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam ghi nhận một số lớn 59 các loài cá (8 loài) nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis. Trong một nghiên cứu gần đây tại Nam Định, Phan et al (2010b) xét nghiệm hơn 3800 mẫu cá của 18 loài khác nhau nhƣng chi phát hiện 1 loài duy nhất 1 cá thể Mè trắng nhiễm ấu trùng này [89]. Ở một nghiên cứu khác, nhóm tác giả này cũng chỉ phát hiện 3 loài nhiễm ấu trùng sán lá gan là Mè trắng, Rohu và Trắm cỏ [9]. Tại Ninh Bình, một trong những vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ nhƣng các nghiên cứu trên cá cũng chỉ phát hiện 2 trong số nhiều loài cá xét nghiệm nhiễm ấu trùng này là Mƣơng xanh và Thiểu [11,95]. Và cũng chỉ cá Mè trắng, Mè hoa và Trắm cỏ đƣợc ghi nhận là vật chủ trung gian của C. sinensis tại Hòa Bình [94]. Nhƣ vậy có thể nói rằng, nghiên cứu đã ghi nhận thêm 6 loài cá là vật chủ mới của sán lá gan nhỏ C. sinensis tại Việt Nam bao gồm Tép dầu, Ngão, cá Nhƣng, Cháo thƣờng, Dầm đất và Bống hoa. Ở khu vực Châu Á, trong số 6 loài vật chủ mới ghi nhận tại Việt Nam, có Tép dầu và Cháo thƣờng đã đƣợc xác định nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ này tại Đài Loan [125]. Xác định đƣợc 8 loài vật chủ trong nghiên cứu này là một con số lớn đối với sán lá gan nhỏ C. sinensis. Điều đó cho thấy, tính đặc trƣng vật chủ của sán lá gan nhỏ rất cao.
3.1.2. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio
Bào nang hình tròn hoặc ovan (238,6 x 219,4µm), quang thân có nhiều gai nhỏ xếp rải rác từ đầu đến gần hết túi bài tiết. Giác miệng lớn (53,4 x 32,9µm), giác bụng không phát triển nhƣng có 2 hàng gai với số lƣợng từ 36 đến 42 răng. Đây cũng là đặc điểm định loại, phân biệt giữa H. pumilio với H. taichui và H. yokogawai (Hình 3.3).
Sán lá ruột nhỏ H. pumilio là SLTQC phổ biến nhất tại khu vực MNPB, ấu trùng của chúng đƣợc phát hiện trên 34 loài (Bảng 3.3).
Kết quả nghiên cứu này xác nhận sự phổ biến của sán lá ruột nhỏ H. pumilio trên cá, ngƣời và động vật ở khu vực miền Bắc nƣớc ta đã đƣợc ghi nhận trong các nghiên cứu thời gian gần đây [10,11,68,77,89,92]. 60
EX
OS
EX
Hình 3. 3: Bào nang ấu trùng Haplorchis pumilio (OS: giác miệng; EX: túi bài tiết; Mũi tên đỏ: 2 hàng gai nhỏ trên giác bụng; Mũi tên đen: thành bào nang ấu trùng)
Bảng 3.3: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio A TT TÊN LOÀI VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM Tên khoa học Tiếng Việt 1 Anabas testudineus Rô đồng Yên Bái, Điện Biên 2 A. macropterus Thè be Thái Nguyên, Yên Bái 3 C. cantonensis Nhƣng Yên Bái 4 Carassius auratus Cá Diếc Thái Nguyên, Yên Bái 5 Channa maculata Cá Quả Yên Bái 6 Cirrhnus cirrhosis Trôi trắng Thái Nguyên 7 Clarias fuscus Trê đen Yên Bái 8 C. idellus Trắm cỏ Lào Cai 9 Culter recurvirostris Ngão gù Yên Bái 61
TT TÊN LOÀI VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM Tên khoa học Tiếng Việt 10 C. erythropterus Thiểu Yên Bái, Thái Nguyên 11 Cyprinus carpio Cá Chép Thái Nguyên, Yên Bái, Lào Cai 12 Garra sp. Cá Bậu Yên Bái 13 Glossogobius sp. Bống trắng Yên Bái 14 Glyptothorax honghensis Chiên suối Yên Bái 15 H. molitrix Mè trắng Thái Nguyên, Yên Bái, Lào Cai, Điện Biên 16 H. macracanthus Đục chấm Thái Nguyên 17 Hemibarbus medius Đục cờ Thái Nguyên 18 Hemiculter leucisculus Mƣơng xanh Thái Nguyên, Yên Bái, Lào Cai 19 M. armatus Chạch sông Yên bái 20 Microphysogobio sp. Cá Bống Thái Nguyên 21 Neosalanx tangkakeii Tiểu bạc Yên Bái 22 Onychostoma laticeps Sỉnh gai Yên Bái 23 Opsariichthys bidens Cháo thƣờng Yên Bái 24 Oreochromis niloticus Rô phi vằn Yên Bái, Lào Cai 25 Osteochilus salisburyi Dầm đất Thái Nguyên, Yên Bái 26 Pelteobagrus flavimanus Bò vàng Yên Bái 27 Prochilodus lineatus Trôi Nam mỹ Lào Cai 28 Rhinogobius sp. Bống hoa Thái Nguyên, Yên Bái 29 S. nigripinnis Nhọ chảo Thái Nguyên 30 Schistura spp. Chạch suối Thái Nguyên, Yên Bái 31 Squaliobarbus curriculus Chày mắt đỏ Yên Bái 32 Toxabramis houdemeri Tép dầu Thái Nguyên, Yên Bái 33 Traccatichthys pulcher Chạch cật Thái Nguyên 62
TT TÊN LOÀI VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM Tên khoa học Tiếng Việt 34 Xenocypris argentea Nhàng bạc Yên Bái
3.3.3. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui
Bào nang có dạng hình tròn (244,8 x 214,4 µm) xung quanh thân ấu trùng có nhiều gai nhỏ xếp từ đầu xuống gần cuối túi bài tiết, giác miệng nổi rõ có kích thƣớc lớn, giác bụng không phát triển với 1 hàng gai lớn (15-18 gai) xếp hình nải chuối (Hình 3.4). Phân biệt giữa các loài trong nhóm Haplorchis đó là số lƣợng và hình dạng của gai trên giác bụng này. Nghiên cứu phát hiện 22 loài, thuộc 8 họ 22 giống nhiễm ấu trùng này tại Lào Cai, Điện Biên, Yên Bái và Thái Nguyên (Bảng 3.4).
OS
EX
Hình 3. 4: Bào nang ấu trùng Haplorchis taichui (OS: Giác miệng; EX: túi bài tiết; Mũi tên đỏ: 1 hàng gai lớn trên giác bụng; Mũi tên đen: thành bào nang)
63
Bảng 3.4: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui TÊN LOÀI VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM TT Tên khoa học Tiếng Việt 1 Anabas testudineus Rô đồng Yên Bái 2 Beaufortia leverettii Vây bằng vẩy Yên Bái 3 Cyprinus carpio Cá Chép Lào Cai 4 C. erythropterus Cá Thiểu Yên Bái, Lào Cai 5 C. idellus Trắm cỏ Lào Cai 6 C. cantonensis Cá Nhƣng Yên Bái 7 Carassius auratus Cá Diếc Thái Nguyên, Yên Bái 8 Channa maculata Cá Quả Yên Bái 9 Clarius fuscus Trê đen Yên Bái 10 Culter recurviostris Ngão gù Yên Bái 11 Garra sp. Cá Bậu Yên Bái 12 G. honghensis Chiên suối Yên Bái 13 H. molitrix Mè trắng Lào Cai 14 Hemibarbus medius Đục cờ Thái Nguyên 15 Hemiculter leucisculus Mƣơng Thái Nguyên, Yên Bái, Lào Cai 16 Onychostoma laticeps Sỉnh gai Yên Bái 17 Opsariichthys bidens Cháo thƣờng Yên Bái 19 Osteochilus salisbury Dầm đất Yên Bái 20 Prochilodus lineatus Trôi Nam mỹ Lào Cai 21 S. curriculus Chày mắt đỏ Yên Bái 22 T. houdemeri Tép dầu Thái Nguyên, Yên Bái, Điện Biên
64
3.3.4. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis yokogawai
Bào nang ấu trùng có dạng hình tròn, kích thƣớc (250,1 x 230,4µm), xung quanh thân ấu trùng có nhiều gai nhỏ, giác miệng nổi rõ có kích thƣớc lớn, giác bụng tiêu biến – không phát triển với nhiều răng nhỏ li ti (50-76 gai), túi bài tiết lớn (EX) (Hình 3.5). Trong số các loài thuộc giống Haplorchis, loài H. yokogawai ít gặp nhất, chỉ 3 loài thuộc 3 giống, 3 họ khác nhau nhiễm ấu trùng loài sán lá ruột này (Bảng 3.5), trong đó vật chủ đặc hiệu nhất là cá Trê đen
OS
VS
EX
Hình 3. 5: Bào nang ấu trùng Haplorchis yokogawai (OS: giác miệng; VS: giác bụng; EX: túi bài tiết; Mũi tên đen: thành bào nang ấu trùng) Bảng 3.5: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis yokogawai TT TÊN LOÀI VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM Tên khoa học Tiếng Việt 1 Anabas testidineus Rô đồng Yên Bái 2 Clarias fuscus Trê đen Yên bái 3 Pelteobagrus flavimanus Bò vàng Yên Bái 65
3.3.5. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Procerovum varium
Bào nang có dạng hình tròn hoặc elip, kích thƣớc bào nang 281,1x219,3µm, giác miệng lớn nhƣng không nổi rõ, giác bụng không phát triển, túi bài tiết phân thùy (Hình 3.6) và có 1 gai giao phối expulser - khó quan sát ở gia đoạn ấu trùng.
OS
VS
EX
Hình 3. 6: Bào nang ấu trùng Procerovum varium (OS: giác miệng; VS: giác bụng; EX: túi bài tiết phân thùy) Ấu trùng P. varium chỉ phát hiện nhiễm ở 5 loài cá ở khu vực MNPB nhƣ trình bày tại Bảng 3.6, trong đó Rô đồng (A. testudineus) là vật chủ đặc trƣng do nhiễm với tỉ lệ và cƣờng độ cao nhất.
66
Bảng 3.6: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruột nhỏ Procerovum varium TT TÊN LOÀI VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM Loài Tiếng Việt 1 Anabas testudineus Rô đồng Yên Bái, Điện Biên 2 Culter recurvirostris Thiểu Yên Bái 3 Sarcocheilichthys nigripinis Nhọ Chảo Thái Nguyên 4 Rhinogonius sp. Bống hoa Điện Biên 5 Schistura spp. Chạch suối Điện Biên
3.1.6. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ Centrocestus formosanus
Bào nang ấu trùng có dạng hình elip, kích thƣớc nhỏ (215,3 x 130,5µm), giác bụng và giác miệng lớn nổi rõ, có 2 hàng gai (32 gai) xếp so le xung quanh giác miệng, túi bài tiết có dạng hình chữ X (Hình 3.7).
OS
VS
EX
Hình 3. 7: Bào nang ấu trùng Centrocestus formosanus (OS: giác miệng, VS: giác bụng; EX: túi bài tiết hình chữ X; Mũi tên đỏ: gai quang giác miệng) 67
Ấu trùng sán lá ruột nhỏ C. formosanus khá phổ biến ở khu vực miền núi phía Bắc với 19/35 loài cá nhiễm loại ấu trùng này (Bảng 3.7).
Bảng 3.7: Loài cá nhiễm ấu trùng sán lá ruôt nhỏ Centrocestus formosanus TÊN LOÀI VẬT CHỦ ĐỊA ĐIỂM TT Tên khoa học Tiếng Việt 1 Anabas testidineus Rô đồng Yên Bái, Điện Biên 2 Acheilognathus macropterus Thè be Thái Nguyên 3 Channa maculata Cá Quả Yên Bái 4 Clarias fuscus Trê đen Yên Bái 5 Ctenopharyngodon idellus Trắm cỏ Lào Cai 6 Cultrichthys erythropterus Thiểu Thái Nguyên, Yên Bái 7 Cyprinus carpio Chép Yên Bái, Lào Cai 8 Glyptothorax honghensis Chiên suối Yên Bái 9 Hemibarbus macracanthus Đục chấm Thái Nguyên 10 Hemibarbus medius Đục cờ Thái Nguyên 11 Hemiculter leucisculus Mƣơng xanh Thái Nguyên, Yên Bái 12 Hypophthalmichthys molitrix Mè trắng Lào Cai 13 Microphysogobio sp. Cá Bống Thái Nguyên 14 Osteochilus salsburyi Dầm đất Yên Bái 15 Rhinogobius sp. Bống hoa Yên Bái 16 Sarcocheilichthysnigripinis Nhỏ chảo Thái Nguyên 17 Schistura sp. Chạch suối Thái Nguyên 18 Traccatichthys pulcher Chạch cật Thái Nguyên 19 Xenocypris argentea Nhàng bạc Thái Nguyên
68
3.2. Kết quả khảo sát nhanh ấu trùng sán ở khu vực miền núi phía Bắc
3.2.1. Tình hình nhiễm ấu trùng sán lá trên cá
Khảo sát nhanh về ấu trùng SLTQC thu đƣợc từ các thủy vực; ao, hồ chứa và sông suối tại khu vực MNPB cho thấy ấu trùng sán lá có tỉ lệ và cƣờng độ khá cao 47,4% và 25,16 ấu trùng/mẫu. Có sự khác biệt đáng kể về tỉ lệ nhiễm ấu trùng trên cá thu đƣợc từ ao, hồ chứa và sông suối trong đó cá ao nhiễm với tỉ lệ cao nhất và thấp nhất là cá sông suối. Cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán lá cao nhất là 38,6 ấu trùng/mẫu cá ao, 22,1 ấu trùng/mẫu cá ở sông suối và thấp nhất là 18,8 ấu trùng/mẫu cá thu từ hồ chứa (Bảng 3.8).
Bảng 3.8: Tỉ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng sán lá trên cá SỐ LƢỢNG TLN CĐN KHOẢNG MẶT NƢỚC (cá) (%)* (ấu trùng/mẫu)* (min – max) Ao (7 địa điểm) 186 46,7a 38,6a(±67,8) 1 - 432 Hồ chứa (6 hồ chứa) 210 28,1b 18,8b(±30,3) 1 - 485 Sông suối (6 sông) 450 56,8c 22,1b(±54,7) 1 - 335 Trung bình 846 47,4 25,16 (± 55,43) 1 - 485
(*) biểu thị sự khác biệt thống kê (p≤0,05) giá trị trong cùng 1 cột là khác nhau nếu dấu biểu thị khác nhau; TLN: tỉ lệ nhiễm; CĐN: cường độ nhiễm Nghiên cứu bƣớc đầu đã xác định SLTQC có xuất hiện trên cá ở cả 3 loại hình mặt nƣớc tiêu biểu (ao, sông suối, hồ chứa) ở khu vực MNPB. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên khặng định có sự phân bố của SLTQC trên cá tại đây. Mức độ nhiễm SLTQC ở khu vực MNPB ít nhiều giống với hiện trạng nhiễm ấu trùng SLTQC ở khu vực ĐBSH [8,9,11,89] và khu vực miền Trung [76,101] nhƣng cao hơn nhiều so với khu vực ĐBSCL [102,103]. Kết quả nghiên cứu này xác nhận rằng SLTQC phân bố phổ biến ở Việt Nam, đây là một mối nguy đối với sức khỏe cộng đồng cần đƣợc quan tâm khi tập quán ăn gỏi cá hiện đang còn khá phổ biến, đặc biệt là các tỉnh miền Bắc nƣớc ta [12,14].
3.2.2. Thành phần ấu trùng sán lá nhiễm trên cá ở các loại hình mặt nước
Khảo sát nhanh đã xác định đƣợc ấu trùng của 6 loài SLTQC ở khu vực 69
MNPB, trong đó 1 loài sán lá gan nhỏ C. sinensis và 5 loài sán lá ruột nhỏ gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, P. varium và C. formosanus (Bảng 3.9).
Bảng 3.9: Thành phần và mức độ nhiễm ấu trùng sán lá theo thủy vực TLN (%)* CĐN (ấu trùng)* SLTQC Hồ Ao Hồ chứa Sông suối Ao Sông suối chứa Clonorchis sinensis 0 10,9a 2,7a 0 29,7a 2,1b Haplorchis pumilio 44,1a 25,2a 44,7a 22,6a 7,2a 16,3a Haplorchis taichui 11,3a 1,4b 14,2a 6,1a 1,0a 6,2a H. yokogawai 0,5a 0 1,3a 1,0a 0 5,5a C. formosanus 4,3a 1,9a 14,2b 1,6a 1,0a 10,7b Procerovum varium 5,4a 0 4,9a 135,7a 0 55,7a
*biểu thị sự khác biệt thống kê (p≤0,05) - giá trị trong cùng 1 hàng là khác nhau nếu chữ/dấu biểu thị khác nhau; TLN: tỉ lệ nhiễm, CĐN: cường độ nhiễm; Ấu trùng C. sinensis chỉ đƣợc phát hiện trên cá ở 2 loại hình mặt nƣớc là sông suối và hồ chứa. Mặc dù, không có khác biệt về tỉ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ giữa cá ở sông suối và hồ chứa, tuy nhiên cá hồ chứa có cƣờng độ nhiễm cao hơn so với cá ở sông suối. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ H. pumilio có tỉ lệ nhiễm cao nhất ở cả 3 loại hình mặt nƣớc ao, hồ chứa và sông suối, mặc dù vậy không có sự khác biệt giữa các loại hình mặt nƣớc này. Đặc biệt ấu trùng P. varium có cƣờng độ nhiễm rất cao trên cá ở ao và sông suối những không phát hiện ấu trùng này trên cá thu từ hồ chứa. Các loài sán lá ruột khác H. taichui, H. yokogawai và C. formosanus có tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm trên cá ở cả 3 thủy vực thấp hơn so với H. pumilio.
3.2.2.1. Ấu trùng sán lá nhiễm trên cá thu được từ ao
Phân tích 186 mẫu, 8 loài cá, phát hiện ấu trùng của 5 loài sán lá ruột nhỏ bao gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, C. formosanus và P. varium (Bảng 3.10) - không phát hiện ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên ở loại hình mặt nƣớc này. 70
Ấu trùng sán lá ruột nhỏ H. pumilio nhiễm trên 7 loài thu đƣợc từ ao, H. taichui nhiễm ở 6 loài, C. formosanus nhiễm 4 loài nhƣng H. yokogawai và P. varium chỉ phát hiện nhiễm trên 1 loài duy nhất là Rô đồng. Trong số 5 loài, H. pumilio có tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm cao ở Trắm cỏ, Chép, Mè trắng và Rô đồng. Trong khi đó H. taichui nhiễm với cƣờng độ cao ở cá Quả (79 ấu trùng/mẫu) trong khi đó P. varium lại nhiễm rất cao ở Rô đồng (135 ấu trùng/mẫu).
Bảng 3.10: Thành phần và mức độ nhiễm ấu trùng sán lá trên cá ao
TT TÊN VẬT CHỦ N TỈ LỆ NHIỄM (CƢỜNG ĐỘ NHIỄM) Tên khoa học Tiếng Viêt (cá) H. pumilio H. taichui H. yokogawai C. formosanus P. varium
1 Anabas testudineus Rô đồng 10 70,0 (6,0) 40,0 (13) 10,0 (1,0) 20,0 (2,5) 100 (135,7) 2 Channa maculata Cá Qủa 1 0 100(79,0) 0 0 0 3 Cirrhinus cirrhosis Trôi việt 13 7,7 (2,0) 0 0 0 0 4 Ctenopharyngodon idellus Trắm cỏ 55 43,6 (47,7) 16,4 (2,6) 0 7,3 (1,5) 0 5 Cyprinus carpio Cá Chép 16 50,0 (33,6) 18,7 (5,7) 0 6,3 (1,0) 0 6 H. molitrix Mè trắng 41 60,9 (9,2) 4,8 (1,0) 0 2,4 (1,0) 0 7 Oreochromis niloticus Rô phi vằn 33 6,1 (1,0) 0 0 0 0 8 Prochilodus lineatus Trôi Nam mỹ 17 88,2 (11,2) 11,7 (1,5) 0 0 0
N: số lượng mẫu phân tích
71
3.1.2.2. Ấu trùng sán lá nhiễm trên cá thu được từ sông suối
Nghiên cứu đã thu và phân tích 450 cá thể thuộc 26 loài cá ở sông suối khu vực MNPB đã phát hiện ấu trùng 1 loài sán lá gan nhỏ C. sinensis và 5 loài sán lá ruột nhỏ bao gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, P. varium và C. formosanus. Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhiễm trên cá Mƣơng xanh với tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm tƣơng ứng 10,5% và 2,2 ấu trùng/cá. Cá Cháo thƣờng cũng phát hiện nhiễm với tỉ lệ thấp hơn. Trong số ấu trùng các loài sán lá ruột, H. pumilio phổ biến nhất, tỉ lệ nhiễm ở một số loài lên tới 100% (Bảng 3.4).
Bảng 3.11: Thành phần ấu trùng sán lá nhiễm trên cá sông suối TT TÊN VẬT CHỦ TỈ LỆ NHIỄM (CƢỜNG ĐỘ NHIỄM) N Tên khoa học Tiếng Viêt C. H. C. (cá) H. pumilio H. taichui P. varium sinensis yokogwai formosanus 1 A. macropterus Thè be 17 0 70,6 (30,0) 0 0 17,6 (28,0) 0 2 Anabas testudineus Rô đồng 11 0 90,9 (9,1) 0 0 90,9 (8,7) 100(101,2) 3 Beaufortia leverettii Vây bằng 15 0 0 6,7 (1,0) 0 0 0 4 Carassius auratus Cá Diếc 8 0 25,0 (1,5) 12,5 (1,0) 0 0 0 5 Channa maculata Cá Quả 1 0 100 (21,0) 0 0 0 0 6 Clarias fuscus Trê đen 16 0 100(119,1) 12,5 (4,0) 37,5(5,5) 62,5 (8,3) 0 7 C. erythropterus Cá Thiểu 19 0 47,4 (3,0) 10,5 (4,0) 0 5,3 (1,0) 0 8 Cyprinus carpio Cá Chép 2 0 100 (1,5) 0 0 0 0 9 Garra sp. Cá Bậu 4 0 25,0 (1,0) 50,0 (4,5) 0 0 0 10 Gly. honghensis Chiên suối 15 0 66,7 (2,8) 6,7 (14,0) 0 6,7 (1,0) 0 72
TT TÊN VẬT CHỦ TỈ LỆ NHIỄM (CƢỜNG ĐỘ NHIỄM) N Tên khoa học Tiếng Viêt C. H. C. (cá) H. pumilio H. taichui P. varium sinensis yokogwai formosanus 11 Hemibarbabus medius Đục cờ 14 0 50,0 (2,4) 14,3 (1,5) 0 7,1 (1,0) 0 12 H. macracanthus Đục chấm 5 0 20,0 (1,0) 0 0 40,0 (6,0) 0 13 Hemiculter leucisculus Cá Mƣơng 105 10,5(2,2) 38,1 (7,2) 21,9(11,5) 0 6,7 (16,7) 0 14 Glossogobius sp. Bống trắng 1 0 100 (1,0) 0 0 100 (3,0) 0 15 Opsariichthys bidens Cháo thƣờng 20 0 30,0 (2,0) 50,0 (2,1) 0 0 0 16 Osteochilus salisbury Dầm đất 42 2,4(1,0) 66,7 (8,7) 19,0 (4,5) 0 7,1 (1,3) 0 17 Rhinogobius sp. Bống hoa 30 0 16,7 (1,8) 0 0 0 3,3 (10,0) 18 Sar. nigripinnis Nhọ chảo 14 0 78,6 (2,7) 0 0 21,4 (1,3) 14,3 (1,0) 19 Schistura spp. Chạch suối 38 0 52,6 (3,9) 0 0 23,7(10,2) 21,1 (11,0) 20 Squaliobarbus curriculus Chày mắt đỏ 21 0 38,1 (14,4) 42,8 (2,5,) 0 0 0 21 Toxabramis houdemeri Tép dầu 15 0 13,3 (3,0) 13,3 (4,0) 0 0 0 22 Traccatichthys pulcher Chạch cật 15 0 33,3 (6,8) 0 0 80,0 (16,4) 0 23 Onychostoma laticeps Sỉnh gai 11 0 18,2 (1,0) 9,1 (1,0) 0 0 0 24 Xenocypris argentea Nhàng bạc 6 0 33,3(1,5) 0 0 16,7 (2,0) 0 N: số lượng mẫu phân tích 73
3.2.2.3. Ấu trùng sán lá nhiễm trên cá thu được từ hồ chứa
Tổng số 210 mẫu cá thuộc 7 loài thu đƣợc từ các hồ chứa khác nhau tại khu vực MNPB đã phát hiện ấu trùng của 1 loài sán lá gan nhỏ C. sinensis và 4 loài sán lá ruột nhỏ gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogwai và C. formosanus. Trong đó, ấu trùng C. sinensis phát hiện nhiễm ở 3 loài cá thu đƣợc từ hồ chứa, đặc biệt là ở Tép dầu. Ấu trùng H. pumilio nhiễm 6 loài nhƣng H. taichui, H. yokogawai và C. formosanus chỉ nhiễm trên 1 loài. Cá Quả hồ chứa không phát hiện nhiễm trùng SLTQC (Bảng 3.12).
Bảng 3.12: Thành phần ấu trùng sán lá trên cá hồ chứa TT TÊN VẬT CHỦ TỈ LỆ NHIỄM (CƢỜNG ĐỘ NHIỄM) N (cá) Tên khoa học Tiếng Viêt C. sinensis H. pumilio H. taichui H. yokogwai C. formosanus 1 Channa maculata Cá Quả 5 0 0 0 0 0 2 Clarius fuscus Trê đen 1 0 100(11,0) 0 0 0 3 C. erythropterus Cá Thiểu 40 2,5 (2,0) 17,5 (4,1) 0 0 5 (1,0) 4 Cyprinus carpio Cá Chép 9 0 66,7 (13,0) 0 0 0 5 H. leucisculus Mƣơng xanh 88 6,7 (1,0) 13,6 (2,2) 0 0 0 6 H. molitrix Mè trắng 1 0 100(12,0) 0 0 0 7 T. houdemeri Tép dầu 66 31,8 (32,4) 39,4(8,7) 4,5 (1,0) 3,0 (1,0) 0
N: số lượng mẫu phân tích
74
Kết quả khảo sát nhanh đã xác định đƣợc ấu trùng của 6 loài SLTQC bao gồm C. sinensis, H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, P. varium và C. formosanus nhiễm trên cá ở khu vực MNPB. Trong đó, H. pumilio là loài chiếm ƣu thế cả về loài vật chủ cũng nhƣ mức độ nhiễm. Kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu vật chủ chính và vật chủ trung gian nhƣ cá tại Việt Nam trong thời gian gần đây. Sau kết quả xét nghiệm Kato-Katz, một số trƣờng hợp dƣơng tính với SLTQC đƣợc chọn để đãi phân, thu sán trƣởng thành, kết quả cho thấy tỉ lệ thu đƣợc sán H. pumilio trƣờng thành là 100% với 13.734 sán, H. taichui là 69,7% với 1.323 sán, C. sinensis là 51,5% và 72 sán [68]. Hay khảo sát nhằm xác định ấu trùng SLTQC tại vùng dịch tễ Nam Định, Phan et al (2010) cũng đã phát hiện ấu trùng của 6 loài SLTQC nhƣ trong nghiên cứu này và kết quả cũng cho thấy 17/17 loài cá đều nhiễm ấu trùng H. pumilio trong khi đó C. sinensis chỉ nhiễm ở 1 loài, H. taichui là 6 loài, H. yokogawai là 7 loài, cả P. varium và C. formosanus nhiễm ở 10 loài [89]. Những nghiên cứu trên cá khác cũng đều cho thấy H. pumilio là loài chiếm ƣu thế [8–11,76,92].
Khảo sát nhanh bƣớc đầy đã xác định đƣợc ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhiễm trên 4 loài cá ở sông suối và hồ chứa, đây là kết quả hết sức quan trọng về vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ. Trong suốt nhiều năm qua, đã có rất nhiều nghiên cứu về SLTQC với mục đích xác định ấu trùng sán lá gan nhỏ nhƣng trong số đó rất ít có ghi nhận về ấu trùng này trên cá. Chính điều này đã đặt ra câu hỏi rằng, sán lá gan nhỏ phân bố ở đâu, có sự biến động nhƣ thế nào mà ít có ghi nhận trên cá trong khi đó nó vẫn đƣợc khặng định nhiễm trên ngƣời và động vật ở các vùng dịch tễ.Trong nghiên cứu này chúng tôi lƣu ý đến vai trò của hồ chứa đối với sán lá gan nhỏ vì có thành phần loài, tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cao hơn so với cá ở sông suối. Trong đó, đặc biệt là cá Tép dầu có tỉ lệ nhiễm lên tới 31,8% và cƣờng độ nhiễm là 32,4 ấu trùng/cá.Phân tích số liệu chúng tôi thấy rằng chỉ có cá Tép dầu ở hồ Thác Bà nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ, trong khi đó cũng cá Tép dầu nhƣng thu tại hồ Pa Khoang (Điện Biên) và Núi Cốc (Thái Nguyên) lại không nhiễm. Điều này cho thấy ngoài yếu tố vật chủ đặc hiệu, sán lá gan nhỏ còn liên quan đến vùng dịch tễ. 75
3.3. Kết quả nghiên cứu về sán lá nhiễm trên cá tại hồ Thác Bà
3.3.1. Ấu trùng sán lá ruột nhỏ
3.3.1.1. Tình hình nhiễm ấu trùng sán lá ruột
Nghiên cứu phát hiện 21/22 loài cá có nhiễm ấu trùng sán lá ruột (ngoại trừ 1 loài duy nhất không phát hiện nhiễm là cá rô phi) có khả năng lây nhiễm cho ngƣời với tỷ lệ nhiễm chung là 66,1% và cƣờng độ nhiễm chung là 10,8 ấu trùng/mẫu cá phân tích (Bảng 3.13). Phân tích thống kê cho thấy tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán lá ruột có khác biệt ý nghĩa giữa các loài cá.
Bảng 3.13: Ấu trùng sán lá ruột nhỏ nhiễm trên cá hồ Thác Bà TT TÊN VẬT CHỦ N (cá) TLN CĐN (±SD) Tên khoa học Tiếng Việt (%) (ấu trùng) 1 A. macropterus Thè be 6 100 32,0 (±57,9) 2 Anabas testudineus Rô đồng 26 100 39,8 (±48,8) 3 Carassioides cantonensis Cá Nhƣng 38 55,3 7,5 (±9,9) 4 Carassius auratus Cá Diếc 19 47,4 9,6 (±22,0) 5 Channa maculata Cá quả 44 68,2 50,9 (±89,6) 6 Clarias fuscus Trê đen 3 100 165,7 (±276,6) 7 Culter recurvirostris Ngão gù 25 60,0 4,1 (±4,1) 8 Cultrichthys erythropterus Cá Thiểu 253 63,2 17,1 (±48,8) 9 Cyprinus carpio Cá Chép 44 65,9 8,7 (±9,9) 10 Glossogobio sp. Bống trắng 14 100 54,6 (±56,1) 11 Hemiculter leucisculus Mƣơng xanh 353 59,2 10,5 (±38,5) 12 Mastacembelus armatus Chạch sông 6 66,7 13,7 (±8,4) 13 Neosalanx tangkakeii Tiểu bạc 8 37,5 1,7 (±0,6) 14 Opsariichthys bidens Cháo thƣờng 15 33.3 9,0 (±11,4) 15 Oreochromis niloticus Rô phi 15 44,1 3,9 (±3,6) 16 Osteochilus salisburyi Dầm đất 102 68,0 28,5 (±36,6) 17 Pelteobagrus flavimanus Bò vàng 25 8,3 1,0 (-) 76
18 Prochilodus lineatus Trôi nam mỹ 12 37,5 5,9 (±5,1) 19 Rhinogobius sp. Bống hoa 10 90,0 11,0 (±9,6) 20 Squaliobarbus curriculus Chày mắt đỏ 24 87,1 15,3 (±23,3) 21 Toxabrasmis houdemeri Tép dầu 373 30,8 8,3 (±9,7) 22 Xenocypris argentea Nhàng bạc 13 - -
2.3.1.2. Thành phần loài và mức độ nhiễm ấu trùng sán lá khác nhau
Nghiên cứu phát hiện ấu trùng của 5 loài sán lá ruột nhiễm trên cá bao gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, C. formosanus và Procerovum varium. Có 21/22 loài cá nhiễm ấu trùng H. pumilio, 14 loài nhiễm ấu trùng H. taichui, 2 loài nhiễm H. yokogawai, 11 loài nhiễm C. formosanus và 2 loài nhiễm ấu trùng của P. varium (Bảng 3.14). Tỉ lệ nhiễm ấu trùng H. pumiliochung là 61,7%; có sự khác biệt ý nghĩa về tỉ lệ này giữa các loài cá; dao động từ 26,7% ở cá Dầm đất, đến 100% ở cá Bống trắng và Thè be. Ấu trùng H. taichui và H. yokogawai có tỷ lệ nhiễm tƣơng ứng là 12,8% và 1,3% và cũng có sự khác biệt ý nghĩa giữa các loài cá nhiễm . Ấu trùng C. formosanus có tỷ lệ nhiễm là 5,8% và tỷ lệ nhiễm giữa các loài có khác biệt ý nghĩa thống kê. Ấu trùng P. varium nhiễm trên cá rô đồng 92,3% cao hơn so với cá thiểu 0,4%. Cƣờng độ nhiễm ấu trùng H. pumilio chung trên các loài cá là 12,1 ấu trùng/mẫu, dao động từ 1-242 ấu trùng/mẫu, H. taichui là 16,5 ấu trùng/mẫu, dao động từ 1 - 69,9 ấu trùng/mẫu, H. yokogawai là 20,7 ấu trùng, dao động 2,0 - 21,8 ấu trùng, C. formosanus là 7,2 ấu trùng, dao động 1,0 - 27,1 ấu trùng và P. varium là 33,0 ấu trùng dao động từ 1,0 - 34,3 ấu trùng. Mặc dù, có 21/22 loài cá nhiễm nhƣng cƣờng độ nhiễm H. pumilio giữa các loài cá là không khác biệt, 14/22 loài cá nhiễm H. taichui và có cƣờng độ nhiễm khác nhau giữa các loài cá, cá Bò vàng có cƣờng độ nhiễm H. yokogawai cao hơn so với cá cá trê nhƣng khác biệt này là không có ý nghĩa. Cƣờng độ nhiễm ấu trùng C. formosanus và P. varium có sự khác biệt giữa các loài cá. Phân tích kỹ hơn đƣợc trình bày trong công trình đƣợc đăng trên tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn số 7 năm 2016. 77
Bảng 3.14: Thành phần, tỉ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng sán lá TT TÊN VẬT CHỦ TỈ LỆ NHIỄM/CƢỜNG ĐỘ NHIỄM (±SD) Tên khoa học Tiếng Việt H. pumilio H. taichui H. yokogawai C. formosanus P. varium 1 A. macropterus Thè be 100 32,0 (±57,9) - - - - 2,3 (±1,9) - - 2 A. testudineus Rô đồng 73,1 9,8 (±20,4) 11,5 2,7 (±2,9) - - 26,9 - 92,3 34,3 (±36,7) 3 C. cantonensis Cá Nhƣng 47,4 2,9 (±3,2) 42,1 6,6 (±8,6) ------4 C. auratus Cá Diếc 36,8 11,7 (±24,9) 15,8 1,3 (±0,6) - - - 4,3 (±4,3) - - 5 C. maculata Cá quả 47,7 7,5 (±10,4) 43,2 69,9 - - 20,5 10,0 - - (±101,6) 6 C. fuscus Trê đen 66,7 242,0 33,3 1,0 33,3 2,0 33,3 - - - (±326,7) 7 C. recurvirostris Cá Ngão gù 56,0 4,2 (±4,2) 12,0 1,3 (±0,6) - - - 1,6 (±1,1) - - 8 C. erythropterus Cá Thiểu 62,8 16,5 (±47,9) 6,7 5,9 (±6,3) - - 2,8 1,0 0,4 1,0 9 C. carpio Cá Chép 61,0 7,8 (±8,8) 11,4 7,6 (±6,2) - - 4,5 27,1 - - (±23,9) 10 Glossogobio sp. Bống trắng 100 27,5 (34,3) - - - - 100 1,5 (±0,6) - - 11 H. leucisculus Mƣơng xanh 54,3 5,7 (±11,8) 14,5 21,5 - - 1,1 - - - (±70,4) 12 M. armatus Chạch sông 66,7 13,7 (±8,4) ------78
TT TÊN VẬT CHỦ TỈ LỆ NHIỄM/CƢỜNG ĐỘ NHIỄM (±SD) Tên khoa học Tiếng Việt H. pumilio H. taichui H. yokogawai C. formosanus P. varium 13 N. tangkakeii Cá Tiểu bạc 37,5 1,7 (±0,6) ------14 O. bidens Cháo thƣờng 26,7 11,0 (±12,1) 6,7 1,0 - - - 1,0 - - 15 O. niloticus Rô phi 42,2 3,9 (±3,5) 5,9 1,0 - - 0,9 6,8 (±7,8) - - 16 O. salisburyi Dầm đất 32,0 5,0 (±3,9) 12,0 4,3 (±4,9) 68,0 21,8 36,0 - - - (±31,3) 17 P. flavimanus Bò vàng 8,3 1,0 ------18 P. lineatus Trôi nam mỹ 37,5 5,8 (±5,2) 4,2 1,0 - - - 1,5 (±0,7) - - 19 Rhinogobius sp. Bống hoa 80,0 7,6 (±6,4) - - - - 60,0 6,3 (±6,7) - - 20 S. curriculus Chày mắt đỏ 85,3 14,6 (±22,8) 14,5 5,7 - - 6,2 - - (±11,7) 21 T. houdemeri Tép dầu 30,8 8,3 (±9,7) - - - - -
(-): âm tính; (SD) độ lệch chuẩn 79
3.3.2. Ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis
3.2.2.1. Vật chủ của sán lá gan nhỏ
Trong thời gian 1 năm, phân tích 1219 cá thể thuộc 22 loài cá thuộc hồ Thác Bà, chúng tôi đã xác định đƣợc có 7 loài cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis (Bảng 3.15). Trong đó, 4 loài cá có tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm cao là Tép dầu, Mƣơng xanh, Thiểu và Ngão gù; riêng Tép dầu có tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm cao nhất (76,72% và 65,76 ấu trùng/cá) trong số 4 loài cá nói trên. Còn lại, 3 loài cá khác có tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm thấp; cá Nhƣng (7,89%; 4,0 ấu trùng/cá), Cháo thƣờng (13,3%; 5,5 ấu trùng/cá) và Bống hoa (20,0%; 4,0 ấu trùng/cá).
Bảng 3.15: Tỉ lệ và cường độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ TT VẬT CHỦ NHIỄM N+ TLN CĐN (ấu Tên khoa học Tiếng Viêt (cá) (%)* trùng)* 1 Toxabramis houdemeri Tép dầu 244 76,7a 65,8 (±121,3)a 2 Cultrichthys erythropterus Cá Thiểu 117 58,8b 38,1 (±185,2)b 3 Hemiculter leucisculus Mƣơng xanh 79 31,1c 11,7 (±40,4)c 4 Culter recurvirostris Ngão gù 17 68,0a,b 3,9 (±4,1)d 5 Opsariichthys bidens Cháo thƣờng 2 13,3 5,5 (±3,5) 6 Carassioides cantonensis Cá Nhƣng 3 7,9 4,0 (±4,4) 7 Rhinogobius sp. Bống hoa 2 20,0 4,0 (±1,4)
*biểu thị sự khác biệt thống kê (p≤0,05) - giá trị trong cùng 1 cột là khác nhau nếu chữ biểu thị khác nhau; N+: số mẫu nhiễm; TLN: tỉ lệ % cá nhiễm; CĐN: cường độ nhiễm Có sự khác biệt ý nghĩa thống kê về tỷ lệ nhiễm giữa các loài cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ; Tép dầu có tỉ lệ nhiễm cao hơn so với các loài khác ngoại trừ cá Ngão. Nguy cơ nhiễm ấu trùng này ở Tép dầu, Ngão gù, Thiểu và Mƣơng xanh lần lƣợt là 26,4; 17,0; 11,4 và 3,6 lần so với các nhóm các loài cá khác có nhiễm C. sinensis bao gồm cá Nhƣng, Cháo thƣờng và Bống hoa. Tỉ lệ nhiễm ấu trùng ở cá Ngão gù và Thiểu không có khác biệt nhƣng đều cao hơn so với Mƣơng xanh. Cƣờng độ nhiễm ấu trùng này cũng có sự khác nhau giữa các loài cá nói trên. Cƣờng độ nhiễm ở Tép dầu (Hình 3.8) là cao nhất, sau đó là ở cá Thiểu, tiếp đến là Mƣơng xanh và Ngão gù. Đặc biệt độ lệch chuẩn của cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán 80
ở cá Tép dầu, Thiểu và Mƣơng xanh là rất cao, tƣơng ứng là 121,3; 185,2 và 40,4 ấu trùng/cá nhiễm. Cƣờng độ nhiễm ấu trùng này ở cá Tép dầu dao động từ 1 đến 900 ấu trùng/cá và cá Thiểu dao động từ 1 đến 1950 ấu trùng/cá nhiễm. Và Mƣơng xanh có cƣờng độ dao động từ 1 đến 234 ấu trùng/cá thể nhiễm.
Hình 3.8: Tép dầu, vật chủ ấu trùng sán lá gan nhỏ ở hồ Thác Bà, Yên Bái Có thể nói rằng hồ Thác Bà là vùng dịch tễ mới của sán lá gan nhỏ C. sinensis ở khu vực miền Bắc nƣớc ta. Trong giới hạn nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện tới 33,3% (7/22) số loài cá đƣợc xét nghiệm có nguồn gốc từ hồ này nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ. Điều đó chứng tỏ rằng, hồ Thác Bà là vùng dịch tễ mới và hết sức quan trọng của sán lá gan nhỏ C. sinensis. Sở dĩ bởi hầu hết các nghiên cứu trƣớc đây ở khu vực đồng bằng sông Hồng đều không hoặc ít có ghi nhận tƣơng tự về ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá nhƣ tại hồ Thác Bà trong nghiên cứu này [9,11,89,92,95]. Sự hiện diện của ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá hồ Thác Bà với tỷ lệ cao là một vấn đề rất đáng quan tâm. Ngay sau phát hiện ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá tại đây, một khảo sát trên ngƣời tại xã Phan Thanh, huyện Lục Yên (thuộc vùng hồ Thác Bà) đã đƣợc triển khai bởi Trung tâm Y tế Dự phòng tình Yên Bái. Kết quả đã xác nhận sán lá gan nhỏ cùng với một số loài SLTQC khác có tỉ lệ nhiễm cao, 34% [73]. Hồ Thác Bà, có chiều dài hơn 80 km với diện tích vùng hồ lên tới 23.400 ha với 1.300 hòn đảo nằm trên 2 huyện Lục Yên và Yên Bái. Sự hiện diện của sán lá gan nhỏ là một mối nguy lớn đối sức khỏe cộng đồng dân cƣ vùng hồ Thác Bà. 81
3.3.2.2. Biến động của sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis
Nghiên cứu biến động ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên 3 đối tƣợng gồm Tép dầu, Mƣơng xanh và Thiểu theo mùa; mùa mƣa, tháng 5 - 10 và mùa khô tháng 11-4, kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 3.16.
Bảng 3.16: Biến động mùa vụ ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá tại hồ Thác Bà VẬT CHỦ N TLN (%)* CĐN (ấu trùng)* (cá) Mùa khô Mùa mƣa Mùa khô Mùa mƣa Toxabramis houdemeri 318 79,4a 76,0a 82,6a 60,9a (Tép dầu) (±45,6) (±113,5) Hemiculter leucisculus 254 33,3a 29,7a 7,4a 14,8b (Mƣơng xanh) (±14,5) (±51,6) Cultrichthys erythropterus 199 62,9a 56,9a 21,9a 33,3a (Cá Thiểu) (±25,7) (±120,5) Trung bình 61,3a 54,7a 49,7a 48,0a (±111,2) (±146,4)
*biểu thị sự khác biệt thống kê (p≤0,05) - giá trị trong cùng 1 hàng là khác nhau nếu chữ biểu thị khác nhau;TLN: tỉ lệ nhiễm, CĐN: cường độ nhiễm; N: mẫu phân tích Phân tích trên 3 loài vật chủ cho thấy, tỉ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ vào mùa khô có cao hơn so với mùa mƣa, tuy nhiên không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê. Cƣờng độ nhiễm ấu trùng khá tƣơng đồng giữa mùa mƣa và mùa khô, và cũng không có sự khác biệt ý nghĩa, mặc dù độ lệch cƣờng độ nhiễm ấu trùng trên mỗi cá thể vào mùa mƣa (± 146,4) cao hơn so với mùa khô (± 111,2). Xét riêng từng loài vật chủ, Tép dầu, tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng vào mùa khô cao hơn so với mùa mƣa nhƣng không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở cá Mƣơng xanh (Hình 3.9), tỉ lệ nhiễm vào mùa khô cũng cao hơn so với mùa mƣa nhƣng không có sự khác biệt. Mặc dù vậy, cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán trên cá Mƣơng xanh vào mùa mƣa cao hơn so với mùa khô, khác biệt có ý nghĩa thống kê. Xu hƣớng biến động ấu trùng sán lá gan nhỏ ở cá Thiểu tƣơng tự nhƣ Mƣơng xanh; tỉ lệ nhiễm vào mùa khô cao hơn nhƣng cƣờng độ nhiễm vào mùa khô lại thấp hơn, tuy nhiên khác biệt nói chung là không có ý nghĩa về mặt thống kê (Bảng 3.16). 82
Hình 3.9: Mương xanh, vật chủ của sán lá gan nhỏ tại hồ Thác Bà Hình 3.10 biểu diễn sự biến động về mức độ nhiễm ấu trùng sán lá nhỏ C. sinensis ở các tháng khác nhau từ tháng 9 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015. Tỉ lệ nhiễm dao động từ 21,9% đến 96,7%; thấp nhất vào tháng 2 và 9 và cao nhất vào tháng 3, 7, 10 và 12. Cƣờng độ nhiễm biến động khá lớn giữa các tháng; từ 4,56 ± 3,8 ấu trùng/cá vào tháng 2 đến 153,7 ± 179,8 ấu trùng/cá vào tháng 7/2015. Tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán lá gan cao nhất vào tháng 7, thời điểm giữa mùa mƣa và thấp nhất vào tháng 2 là khoảng giữa mùa khô.
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, mặc dù có nhiều nghiên cứu nhằm phát hiện ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá, tuy nhiên không có nhiều công bố hoặc có nhƣng mức độ nhiễm nhìn chung thấp. Điều này đã đặt ra câu hỏi rằng liệu thực sự sán lá gan nhỏ có phải là vấn đề lớn ở nƣớc ta hay không?! Có một số lý do có thể các nghiên cứu trƣớc đây chƣa quan tâm đến đó là yếu tố vật chủ và vùng sinh thái. Hầu hết các nghiên cứu nói trên tập trung vào khảo sát trên đối tƣợng cá nuôi trong điều kiện nuôi trồng thủy sản. Hơn nữa, một số nghiên cứu chỉ tiến hành trong một thời gian nhất định nên có thể bỏ sót sự hiện diện của loại ấu trùng này nếu nhƣ có sự biến động mùa vụ. Chính vì những lý do này mà chúng tôi chọn vùng nghiên cứu là khu vực MNPB trên nhiều vùng sinh thái khác nhau. Khi đã phát hiện ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá hồ chứa, chúng tôi đã tiến hành tập trung nghiên 83 cứu với thời gian dài - 1 năm nhằm kiểm chứng nếu có sự biến động lớn về lƣợng ấu trùng nhiễm trên cá trong năm.
Hình 3.10: Biến động ấu trùng sán lá gan nhỏ theo tháng trên cá tại hồ Thác Bà Kết quả nghiên cứu cho thấy, mặc dù có sự biến động khác nhau về mức độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ giữa các tháng, nhƣng có thể thấy rằng ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis luôn đƣợc phát hiện trên cá ở mọi thời điểm (tháng). Điều này chỉ ra rằng rủi ro với sức khỏe con ngƣời là thƣờng trực nếu tập quán ăn gỏi cá vẫn tồn tại. Cũng theo kết quả nghiên cứu này, một số thời điểm trong năm nhƣ tháng 7 hoặc tháng 3 và 12 mức độ rủi ro bị lây nhiễm sán lá gan nhỏ là rất cao bởi tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng trung bình cao. Thông tin về sự biến động ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis không những có ý nghĩa thực tiễn mà còn có ý nghĩa về mặt khoa học. Nắm đƣợc quy luật biến động của SLTQC sẽ giúp các nhà khoa học trong thiết kế nghiên cứu, xác định thời điểm thu mẫu nhằm đánh giá chính xác hơn về hiện trạng ấu trùng SLTQC nói chung và sán lá gan nhỏ C. sinensis nói riêng. Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam bƣớc đầu đã có đánh giá về sự biến động ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá do trƣớc đây chƣa phát hiện đƣợc vật chủ đặc trƣng nhƣ Tép dầu và vùng dịch tễ tự nhiên nhƣ hồ Thác Bà. Tuy nhiên, do giới hạn về thời gian nên việc thu và phân tích mẫu chỉ dừng lại trong chu kỳ 1 năm vì vậy nghiên cứu bƣớc đầu mới chỉ ra sự biến động của ấu trùng sán lá gan nhỏ trên 84 cá mà chƣa có nghiên cứu lặp lại để xác nhận điều này. Do đó cần có nghiên cứu tiếp nhằm làm sáng tỏ hơn sự biến động của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá hồ Thác Bà.
Hình 3.11: Biến ấu trùng sán lá gan nhỏ trên Tép dầu hồ Thác Bà Theo kết quả nghiên cứu có thể thấy Tép dầu là vật chủ đặc hiệu của ấu trùng sán lá gan nhỏ bởi chúng nhiễm với tỉ lệ và cƣờng độ cao nhất (Bảng 3. 16). Phân tích dựa trên 244 mẫu cá Tép dầu đƣợc xác định nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ thu đƣợc từ tháng 9 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015 nhằm xem xét nếu có sự biến động về mức độ nhiễm ấu trùng này theo cỡ cá hay không? Nhìn chung tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng C. sinensis khá đồng đều giữa các nhóm kích cỡ cá Tép dầu. Tỉ lệ nhiễm dao động từ 44,4 - 93,1% theo các nhóm cỡ cá; nhóm cá cỡ nhỏ (<2 gram) có tỉ lệ nhiễm ấu trùng thấp hơn so với cá có kích cỡ lớn hơn (> 2 gram) và có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Các nhóm mẫu Tép dầu có kích cỡ ≥ 2 gram, tỉ lệ nhiễm có dao động nhƣng không khác nhau. Về cƣờng độ nhiễm, mặc dù có sự động từ 54,4 đến 97,5 ấu trùng/cá, nhƣng sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm cỡ cá (Hình 3.11)
Có thể nói rằng, ngoại trừ nhóm cá Tép dầu kích cỡ nhỏ (<2 g) có tỉ lệ nhiễm thấp hơn, còn lại không có sự khác nhau cả về mức độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ giữa các nhóm cỡ cá ở hồ Thác Bà. Thực ra, các mẫu cá Tép dầu thu đƣợc từ hồ 85
Thác Bà có kích cỡ trung bình nhỏ (4,8 gram) và khác biệt là không lớn giữa câc nhóm cỡ khác nhau. Do đó các nhóm cỡ này có sự tƣơng đồng về mặt sinh học đối với sự cảm nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis. Có thể đây là giải thích cho sự biến động ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá Tép dầu ờ hồ Thác Bà, Yên Bái.
3.4. Điều kiện bất hoạt ấu trùng sán lá truyền qua cá
3.4.1. Điều kiện đông lạnh
Nhƣ kết quả nói trên, trong số ấu trùng các loài sán lá ruột nhỏ, H. pumilio là ấu trùng phổ biến nhất trên cá ở khu vực MNPB. Ấu trùng H. pumilio sau khi phân lập từ cá đƣợc đông lạnh ở 0oC, -20oC và -80oC trong khoảng thời gian khác nhau. Kết quả cho thấy tỉ lệ sống sót của ấu trùng ở có xu hƣớng giảm theo thời gian và nhiệt độ đông lạnh (Hình 3.12). Nhiệt độ 0⁰C, tỉ lệ sống của ấu trùng là 100% trong thời gian 15 phút và để bất hoạt đƣợc hoàn toàn ấu trùng ở nhiệt độ này thì cần đến ít nhất 12 giờ bảo quản. Ở nhiệt độ đông lạnh -20⁰C, để bất hoạt 100% ấu trùng thời gian cũng cần ít nhất 12 giờ. Trong khi đó, thời gian này chỉ 15 phút khi bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh -80⁰C. Tuy nhiên, cần lƣu ý đây là điều kiện bất hoạt với ấu trùng sau khi đã đƣợc phân lập từ cá. Do đó để bất hoạt ấu trùng trong cá đông lạnh thì thời gian cần thiết sẽ dài hơn.
Hình 3.12: Tỷ lệ sống sót của ấu trùng H. pumilio trong điều kiện đông lạnh 86
Ấu trùng bất hoạt có xu hƣớng chuyển màu tối nhạt, túi bài tiết thƣờng bị vỡ, ban đầu ấu trùng trƣơng to, lấp đầy khoảng trống bào nang nhƣng dần teo nhỏ lại theo thời gian đông lạnh, các đặc điểm hình thái cũng dần biến đổi và trở nên khó xác định nhƣng đặc điểm hình thái quan trọng nhƣ giác miệng và gai trên giác bụng (Hình 3.13)
Sán lá gan nhỏ C. sinensis có ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng, là tác nhân gây ung thƣ đƣờng ống mật ở ngƣời [34,35]. Nghiên cứu của chúng tôi đã xác định ấu trùng này nhiễm với tỉ lệ và cƣờng độ cao trên một số đối tƣợng cá ở khu vực MNPB, đặc biệt là Tép dầu ở hồ Thác Bà, Yên Bái. Do đó ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis đƣợc chọn làm đối tƣợng thử nghiệm để xác định điều kiện bất hoạt. Đối với điều kiện đông lạnh, ấu trùng sán lá gan nhỏ đƣợc thực hiện với 2 nhóm; 1) thí nghiệm đông lạnh ấu trùng sán lá gan nhỏ sau khi phân lập đƣợc từ cá (Hình 3.14); 2) thí nghiệm đông lạnh cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ (Hình 3.15). 87
A B
Hình 3.13: Ấu trùng sán lá ruôt nhỏ H. pumilio trong điều kiện đông lạnh (A: đối chứng, ấu trùng sống với giác miệng nổi rõ, gai trên giác bụng và túi bài tiết chứa đầy chất bài tiết màu đen; B: ấu trùng bất hoạt ở -80oC sau CA DB 10 phút, tế bào biểu mô bất hoạt trương lớn, giác miệng không rõ, gai trên giác bụng còn quan sát thấy nhưng túi bài tiết đã bị vỡ nên trống rỗng) 88
Ở điều kiện 0oC, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis có thể sống sót với tỉ lệ 100% trong thời 30 phút, tỉ lệ sống giảm xuống 85,7% sau 1 giờ, 40% sau 6 giờ và 10% sau 12 giờ. Ấu trùng bị bất hoạt hoàn toàn sau 24 giờ ở điều kiện 0oC. Trong điều kiện -20oC, ấu trùng có thể sống sót với tỉ lệ 100% trong 15 phút, nhƣng tỉ lệ giảm mạnh trong 30 phút đến 1 giờ và bị bất hoạt hoàn toàn trong 6 giờ. Ở điều kiện -80oC, ngày sau 5 phút đông lạnh, ấu trùng đã bị bất hoạt, tỉ lệ sống chỉ còn 65,2% và đến 10 phút tỉ lệ sống giảm còn 31,9% và ấu trùng bị bất hoạt hoàn toàn trong 30 phút ở điều kiện đông lạnh này.
Hình 3.14: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong điều kiện đông lạnh
Đối với ấu trùng trong cá đông lạnh, tại cùng một thời điểm 24 giờ, tỉ lệ sống của ấu trùng khác nhau theo các điều kiện nhiệt độ đông lạnh, cao nhất là 93,3% ở 0oC; đến 54,3% ở -20oC và thấp nhất là 7,3% ở -80oC và có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Sau 72 giờ (3 ngày), tỉ lệ sống tiếp tục giảm xuống 13,4% ở 0oC, cao hơn so với 4,5% và 3,1% ở -20oC và -80oC. Đến 120 giờ (5 ngày) hầu nhƣ ấu trùng sán lá gan nhỏ trong cá đông lạnh bị bất hoạt; tỉ lệ sống chỉ còn 1,3% ở 0oC, 1,9% ở -20oC và 0% ở -80oC và không có sự khác biệt giữa các điều kiện đông lạnh. Nhƣ vậy, để bất hoạt 100% ấu trùng trong cá Tép dầu ở điều kiện đông lạnh ở -80oC cần thời gian là 120 giờ (5 ngày), ở -20oC là 168 giờ (7 ngày) và 0oC là 240 giờ (10 ngày). 89
Hình 3.15: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong cá đông lạnh Có thể thấy rằng, thời gian để bất hoạt ấu trùng bên ngoài cá (sau khi phân lập) nhanh hơn so với ấu trùng bên trong cá ở các điều kiện đông lạnh. Hình thái của ấu trùng có những biến đổi nhất định trong điều kiện đông lạnh. Các ấu trùng còn sống sót mặc dù còn quan sát rõ các đặc điểm định loại nhƣng sự vận động của ấu trùng bên trong bào nang chậm - yếu (Hình 3.16A). Ấu trùng đã bất hoạt không phân biệt rõ giác bụng và giác miệng, túi bài tiết thƣờng bị vỡ và trống, biểu mô của ấu trùng có xu hƣơng trƣơng lớn lấp đầy khoảng trống bào nang (Hình 3.16B). 90
A -20oC, 5 ngày B 0oC, 3 ngày
Hình 3.16: Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong cá đông lạnh (A: ấu trùng trong cá còn sống sau 5 ngày đông lạnh ở -20oC ; B: ấu trùng trong cá đã bất hoạt sau 3 ngày ở 0oC) 91
3.4.2. Điều kiện gia nhiệt
Ấu trùng sán lá ruột nhỏ H. pumilio: trong thời gian thí nghiệm 20 phút, tỉ lệ sống của ấu trùng có xu hƣớng giảm dần theo thời gian ở nhiệt độ 70⁰C và 100⁰C nhƣng tỉ lệ này không khác biệt ở 0⁰C (p> 0,05). Trong điều kiện nhiệt độ 70⁰C, 80% ấu trùng vẫn còn sống ở 30 giây nhƣng chỉ 50% ấu trùng sống sót ở điều kiện nhiệt độ 100⁰C. Thời gian cần thiết để bất hoạt 100% ấu trùng trong điều kiện nhiệt độ 70⁰C là 10 phút và 100⁰C chỉ cần 1 phút (Hình 3.17). Ấu trùng bất hoạt trong điều kiện gia nhiệt có những biến đổi về mặt hình thái; túi bài tiết vỡ, chất bài tiết thoát ra ngoài làm cho ấu trùng có màu đen, cơ thể ấu trùng có xu hƣớng bị teo nhỏ tạo thành khoảng trống lớn giữa ấu trùng và bào nang (Hình 3.18).
Hình 3.17: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng H. pumilio trong điều kiện gia nhiệt Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis: ấu trùng sau khi phân lập từ cá Tép dầu, gia nhiệt trong điều kiện nhiệt độ khác nhau. Tỉ lệ sống ấu trùng giảm mạnh ngay sau 15 giây đầu tiên khi gia nhiệt ở 100oC nhƣng ở 50oC và 70oC, ấu trùng vẫn sống sót với tỉ lệ 100%. Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỉ lệ sống giữa nghiệm thức 100oC so với các nghiệm thức khác (50oC & 70oC). Thời gian cần thiết để bất hoạt 100% ấu trùng là 1 phút ở nhiệt độ 100oC và 5 phút ở 70oC. Nhiệt độ 50oC không làm bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong thời gian 20 phút (Hình 3.20). Ấu trùng bất hoạt có những biến đổi hình thái tƣơng tự nhƣ sán lá ruột nhỏ H. pumilio. 92
A B Hình 3.18: Ấu trùng sán lá ruột nhỏ H. pumilio trong điều kiện gia nhiệt (A: ấu trùng sống; B: ấu trùng bất hoạt) 93
Hình 3.19: Tỉ lệ ấu trùng C. sinensis sống sót trong điều kiện gia nhiệt Đây mới là kết quả thử nghiệm trên ấu trùng sau khi phân lập từ cá mà chƣa có thử nghiệm với cá nhiễm ấu trùng, đây cũng là một hạn chế chƣa đƣợc giải quyết trong nghiên cứu này. Gia nhiệt là phƣơng pháp chế biến thực phẩm nói chung phổ biến nhất trong xã hội hiện nay. Kết quả nghiên cứu cho thấy, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis khá nhạy cảm với nhiệt độ cao (Hình 3.17 & Hình 3.19). Trong khi đó phƣơng pháp chế biến bằng gia nhiệt thông thƣờng đều đảm bảo ở nhiệt độ cao (100oC) và trong thời gian ít nhất là tính bằng phút, nhƣ vậy là hoàn toàn đảm bảo an toàn với ấu trùng SLTQC. Tuy nhiên, trong một số phƣơng pháp chế biến nhiệt độ có thể ở mức dƣới 100oC nhƣ nƣớng, thì thời gian thƣờng dài có thể lên tới giờ đồng hồ và điều này cũng hoàn toàn đảm bảo an toàn đối với SLTQC.
Đây là nghiên cứu đầu tiên về khả năng bất hoạt của điều kiện nhiệt độ đối với ấu trùng SLTQC ở Việt Nam. Ở khu vực Châu Á - nơi phân bố chủ yếu của SLTQC, đặc biệt là sán lá gan nhỏ. Các kết quả nghiên cứu cho thấy cá nƣớng ở 80oC trong 5 - 12 phút là đủ để làm chết ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis [126] và O. viverrini [127]. Theo khuyến cáo của Hiếp hội an toàn thực phẩm Châu Âu, để đảm bảo an toàn thì nhiệt độ gia nhiệt cần đạt là 65oC ở trong cá ít nhất 5 phút. Có sự khác nhau giữa kết quả nghiên cứu của chúng tôi và các nghiên cứu kế trên là do phƣơng pháp thí nghiệm. Thí nghiệm của chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên ấu trùng đƣợc phân lập từ cá trong khi đó các nghiên cứu kể trên là thử nghiệm với cá 94 nhiễm ấu trùng, tuy nhiên các kết quả đều có tính logic và bổ sung cho nhau.
3.4.3. Điều kiện ướp muối
Ƣớp muối là phƣơng thức chế biến và lƣu giữ thực phẩm dân giã nhất mà đã đƣợc áp dụng từ lâu đời. Những nghiên cứu trƣớc đây đã từng sử dụng nồng độ muối lên tới 30% để bất hoạt ấu trùng sán. Thừa kế kết quả của các nghiên cứu trƣớc, một thí nghiệm sàng lọc nhỏ đã đƣợc triển khai với các nồng độ muối 10%, 15% và 30% làm căn cứ cho thử nghiệm này. Kết quả cho thấy, các nồng độ 15% và 30% đã nhanh chóng làm bất hoạt ấu trùng sán (< 1 giờ), thực tế thời gian ƣớp muối thƣờng tính theo ngày , tuần và thậm chí tháng. Do đó chúng tôi lựa chọn các nồng độ thấp hơn đó là 10%, 7% và 5% để xác định thời gian cần thiết để bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis. Thí nghiệm đƣợc bố trí với 2 nhóm; 1) ấu trùng sau khi phân lập từ cá và 2) ấu trùng trong cá.
Hình 3.20: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong điều kiện muối Với ấu trùng phân lập từ cá: Ở nồng độ muối 5%, ấu trùng có tỉ lệ sống lên tới 100% sau 1 giờ, nhƣng ở nồng độ 7% và 10%, lệ sống giảm xuống lần lƣợt là 82,7% và 78,4%. Trong thời gian 1 giờ, nồng độ muối 7% và 10% có khả năng bất hoạt ấu trùng sán cao hơn so với nồng độ muối 5% (P≤0,05). Tỉ lệ sống của ấu trùng ngâm ở các nồng độ muối đều giảm sau 6, 12 và 24 tƣơng ứng là 90,0%, 76,4% và 45,5%. Có sự biệt ý nghĩa thống kê về khả năng bất hoạt ấu trùng ở các 95 nồng độ muối. Sau 12 giờ, tỉ lệ bất hoạt ở ấu trùng đạt tối thiểu 80% và không có sự khác biệt giữa các nồng độ muối. Và thời gian cần thiết để bất hoạt 100% ấu trùng ở nồng độ 10% và 7% là 24 giờ nhƣng ở nồng độ muối 5% là 48 giờ (Hình 3.20).
Với ấu trùng trong cá ƣớp muối: thời gian để bất hoạt ấu trùng trong cá ƣớp muối dài hơn so với ấu trùng đã đƣợc phân lập đƣa vào ƣớp muối. Sau 1 giờ, tỉ lệ sống của ấu trùng lần lƣợt là 98,6%; 98,8% và 97,2% tƣơng ứng ở nồng độ muối 5%, 7% và 10%; không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê giữa các nồng độ muối tại thời điểm này. Tuy nhiên, sau 120 giờ (5 ngày), tỉ lệ ấu trùng sống sót ở các nồng độ muối là khác nhau; tỉ lệ sống sót cao nhât là 98,8% ở nồng độ 5%, cao hơn so với nồng độ 7% và 10% tƣơng ứng với 82,9% và 77,1%. Thời gian cần để bất hoạt 100% ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis ở nồng độ muối 10% là 240 giờ (10 ngày), ở 5% và 7% là 360 giờ (15 ngày) (Hình 3.21). Hình thái của ấu trùng bất hoạt do muối thƣờng có xu hƣớng teo nhỏ, các tề bào biểu mô bị hoại tử, túi bài tiết bị vỡ, giác bụng và giác miệng khó xác định (Hình 3.22).
Hình 3.21: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong cá ướp muối Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy với ấu trùng sán lá gan nhỏ trong cá ƣớp muối, ở nồng độ 10%, thời gian cần thiết là 10 ngày. Thời gian tƣơng đƣơng (8-11 ngày) cũng đƣợc xác định để bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhƣng ở nồng độ muối lên tới 30% [61]. Sự khác biệt về này có thể liên quan đến loài vật chủ hoặc kích cỡ cá khác nhau bởi hàm lƣợng mỡ và độ dày của cá có thể ảnh 96 hƣởng đến khả năng bất hoạt [128]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, vật chủ là cá Tép dầu có kích cỡ nhỏ, trung bình 4,8 gram do đó khả năng thẩm thấu của muối vào trong mô cá nhanh hơn.
12 giờ, 5% muối
Ấu trùng còn sống
10 ngày, 7% muối
Hình 3.22: Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong điều kiện muối (sao màu đỏ: ấu trùng sống sót; sao màu đen: ấu trùng đã bị bất hoạt) 97
3.4.4. Điều kiện kháng sinh và praziquantel
Nghiên cứu này cho thấy, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis có thể sống sót đến 12 tháng trong điều kiện bảo quản có bổ sung kháng sinh flofernicol. Mặc dù vậy, tỉ lệ ấu trùng sống sót có xu hƣớng giảm dần từ tháng thứ 2 đến tháng thứ 12. Trong khi đó ấu trùng C. sinensis trong nƣớc muối sinh lý phát hiện bất hoạt hoàn toàn ngay sau 2 tháng bảo quản (Hình 3.23). Tỉ lệ sống sót của C. sinensis ở 3 nồng độ kháng sinh tại cùng một thời điểm kiểm tra là không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Việc bổ sung kháng sinh giúp tăng tỉ lệ ấu trùng sán lá gan nhỏ sống sót đến tháng thứ 6 so với đối chứng với khác biệt có ý nghĩa thống kê. Mặc dù, ấu trùng vẫn còn sống sót đến tháng 12 nhƣng tỉ lệ khác biệt là không có ý nghĩa thông kê so với nghiệm thức đối chứng (PBS).
Hình 3.23: Tỉ lệ sống của ấu trùng C. sinensis lưu giữ trong kháng sinh Ở mức độ phòng thí nghiệm việc bảo lƣu tác nhân gây bệnh để phục vụ nghiên cứu cơ bản chuyên sâu là hết sức cần thiết. Kết quả nghiên cứu này cho thấy, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis có thể đƣợc bảo lƣu trong trong thời gian dài đáp ứng đƣợc các yêu cầu phục vụ nghiên cứu. Việc sử dụng kháng sinh bổ sung vào môi trƣờng bảo lƣu ấu trùng sán đã đƣợc Li et al (2006) báo cáo. Ở nghiên cứu này, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis có tỉ lệ sống đạt 18,7 - 63,7% sau 6 tháng bảo quản với kháng sinh [129]. Kết quả này cũng ít nhiều giống với kết quả nghiên cứu của chúng tôi khi sử dụng flofernicol để bảo quản ấu trùng. Nghiên cứu của chúng 98 tôi cho thấy rằng nồng độ 0,05% flofernicol nên đƣợc bổ sung để bảo quản ấu trùng này (Hình 3.23).
Nghiên cứu cho thấy praziquantel có khả năng bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis (Hình 3.24). Tỉ lệ ấu trùng bất hoạt khác nhau theo thời gian mà không phụ thuộc vào nồng độ praziquantel. Sở dĩ xảy ra điều này có thể do nồng độ praziquantel sử dụng trong nghiên cứu này là bão hòa hay nói cách khác là cao hơn mức cần thiết. Mà cơ sở việc lựa chọn nồng độ 75 ppm là căn cứ trên liều dùng đƣợc khuyến cáo điều trị bệnh nhân đƣợc xác định nhiễm sán lá gan nhỏ [70]. Tại thời điểm kiểm tra thứ nhất, sau 3 giờ, praziquantel hầu nhƣ không có tác dụng với ấu trùng sán lá gan nhỏ ở cả 3 nồng độ. Chỉ có 2/37 ấu trùng ở nghiệm thức praziquantel 300ppm bị chết, tỉ lệ chết này không khác biệt với đối chứng và 2 nồng độ praziquantel thấp hơn. Sau 6 giờ, praziquantel mới phát huy tác dụng; số lƣợng ấu trùng bị chết ở cả 3 nồng độ đều tăng đột biến; tỉ lệ ấu trùng bất hoạt (33,3 - 57,7%) cao hơn so với thời điểm sau 3 giờ (P<0,05). Tỉ lệ ấu trùng bị bất hoạt tiếp tục tăng lên ở cả 3 nghiệm thức sau 24 giờ; dao động 48,6 - 60,3%, mặc dù vậy tỉ lệ này không khác biệt so với thời điểm 6 giờ. Ấu trùng sống sót đều ở dạng còn nguyên bào nang, trong khi đó, ấu trùng bị chết lại hầu hết ở dạng đã thoát nang, chỉ một số ít ấu trùng dạng thoát nang vẫn còn sống.
Hình 3.24: Tỉ lệ ấu trùng C. sinensis bất hoạt trong praziquantel 99
Praziquantel là dẫn xuất pyrazino-isoquinolein, có chế tác dụng của thuốc là làm tăng tính thẩm thấu của màng tế bào của ấu trùng và sán trƣởng thành dẫn đến làm mất canxi nội bào, làm co cứng và tê liệt sán một cách nhanh chóng. Chính vì lý do này mà hiện praziquantel đƣợc dùng phổ biến để điều trị sán giai đoạn trƣởng thành trên ngƣời và động vật trong đó có SLTQC nhƣ sán lá gan nhỏ C. sinensis [130]. Praziquantel cũng đã đƣợc thử nghiệm điều trị ấu trùng SLTQC là C. formosanus tác nhân gây bệnh kênh mang có hiệu quả [131]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phần nào khặng định praziquantel có khả năng bất hoạt ấu trùng SLTQC nhƣ sán lá gan nhỏ C. sinensis. Tuy nhiên, tỉ lệ ấu trùng C. sinensis chỉ bất hoạt đƣợc 48,6% đến 60,3% là do thời gian thử nghiệm của chúng tôi chỉ tiến hành trong vòng 24 giờ. Trong khi đó, Van et al (2012) thử nghiệm bằng phƣơng pháp cho ăn trong 5-7 ngày liên tục [131].
Sán lá gan nhỏ là một vấn đề lớn đối với sức khỏe cộng đồng, việc ngăn ngừa sự lây nhiễm sán bằng biện pháp phổ biến tuyên truyền đã tỏ ra không có hiệu quả. Trong khi đó, giải pháp can thiệp trong nuôi trồng thủy sản đối với ấu trùng SLTQC chƣa có hiệu quả thực sự [10,15,16]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi gợi mở khả năng can thiệp bằng praziquantel đối với sản phẩm nuôi trồng thủy sản ngay trƣớc thời điểm thu hoạch có thể đảm bảo an toàn với SLTQC. Tuy nhiên, cần tiếp tục có những thử nghiệm và xem xét một cách thấu đáo mọi vấn đề trong việc sử dụng thuốc đối với sản phẩm thủy sản nói chung làm thực phẩm.
3.4.5. Điều kiện nước chanh và rượu
Nƣớc chanh và rƣợu là những nguyên liệu thƣờng đƣợc sử dụng trong chế biến và ăn gỏi cá. Trong tập quán ăn gỏi cá, cá sống đƣợc thái lát mỏng sau đó ngâm với nƣớc chanh ngay trƣớc khi ăn và uống rƣợu gạo trong quá trình thƣởng thức món gỏi [132]. Nhiều ngƣời dân ở các vùng dịch tễ về SLTQC cho rằng đây là một biện pháp giúp ngăn ngừa sự lây nhiễm bệnh từ gỏi cá.
Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis có khả năng sống sót trong điều kiện ngâm với nƣớc chanh. Hình 3.25 là tỉ lệ sống của ấu trùng khi đƣợc ngâm với nƣớc chanh trong khoảng thời gian khác 100 nhau. Tỉ lệ sống là 100% trong thời gian 1 giờ, sau 3 giờ tỉ lệ sống có giảm nhẹ (95,3%), chỉ giảm mạnh sau 6 giờ (70,8%) và tỉ lệ này giƣờng nhƣ không tăng lên sau 12 giờ (70,0%). Với ấu trùng các loài sán khác nhau, sự mẫn cảm với nƣớc chanh cũng khác nhau.Trong nghiên cứu khác khi sử dụng nƣớc chanh ở các nồng độ 25%, 50%, 75% và 100% để thử bất hoạt ấu trùng sán lá ruột nhỏ S. falcatus phân lập từ cá. Kết quả cho thấy, nƣớc chanh ở cả 3 nồng độ đều không có hiệu quă trong việc bất hoạt ấu trùng này [133]. Thực tế, khi ăn gỏi cá, thông thƣờng ngƣời ta chỉ ngâm lát cá sống trong nƣớc chanh với thời gian rất ngắn, tối đa chỉ đến một vài phút trƣớc khi ăn. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã theo dõi đến 12 giờ nhƣng ấu trùng vẫn sống sót với tỉ lệ cao. Điều đó cho thấy nƣớc chanh không phải là giải pháp hiệu quả trong việc phòng ngừa sự lây truyền của ấu trùng sán lá gan nhỏ cho ngƣời.
Hình 3.25: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong nước chanh Kết quả thử nghiệm với rƣợu gạo có nồng cồn khác nhau 30%, 40% và 50% cũng cho thấy rƣợu không phải là giải pháp ngăn ngừa sự lây nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ cho ngƣời (Hình 3.26). Ấu trùng có khả năng sống sót trong môi trƣờng rƣợu ở cả 3 nồng độ cồn khác nhau, tỉ lệ sống dao động từ 85,4 - 98,5%, không khác biệt với đối chứng nƣớc muối sinh lý. Tuy nhiên, sau 90 phút tỉ lệ sống của ấu trùng ở nồng độ cồn 30% và 40% cao hơn so với nồng độ 50% và đối chứng (P<0,05). Đặc biệt, nghiệm thức rƣợu 50% cồn, tỉ lệ sống ấu trùng ở cả 3 thời điểm 101
đều tƣơng đƣơng nhau – khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). So sánh tỉ lệ sống của ấu trùng ở các nghiệm thức sau 90 phút chúng tôi nhận thấy ấu trùng có khả năng chịu đựng tốt nhất với rƣợu 50% cồn; tỉ lệ sống ở rƣợu 50% cồn cao hơn so với rƣợu 30% (p=0,004) và rƣợu 40% (p=0,011). Khác biệt về khả năng sống sót của ấu trùng ở rƣợu 30% và rƣợu 40% là không có ý nghĩa (p=0,765).
Kết quả này cũng tƣơng tự nhƣ báo cáo của Sriraj et al., (2013) khi thí nghiệm với ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini. Ấu trùng bị bất hoạt mà rƣợu đã đẩy nhanh quá trình phá nang của ấu trùng này trong rƣợu. Và nhóm tác giả đã khuyến cáo việc ăn gỏi cá khi uống rƣợu càng làm tăng khả năng nhiễm sán lá gan nhỏ O. viverrini [134].
Hình 3.26: Tỉ lệ sống sót của ấu trùng C. sinensis trong rượu Nghiên cứu này đã chỉ rõ; nƣớc chanh và rƣợu không phải là những liệu pháp hữu hiệu để ngăn chặn sự lây truyền của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis vào ngƣời. Để đảm bảo an toàn với SLTQC, đặc biệt là sán lá gan nhỏ, cá và các sản phẩm thủy sản cần đƣợc bảo quản trong đông lạnh hoặc đƣợc chế biến theo phƣơng thức gia nhiệt với thời gian đảm bảo bất hoạt ấu trùng sán. Các cơ quan an toàn thực phẩm cần xây dựng những hƣớng dẫn trong bảo quản và chế biến sản phẩm thủy sản dựa trên cơ sở khoa học để đảm bảo an toàn với SLTQC. Bên cạnh đó, các cơ quan nghiên cứu cần tiếp tục nghiên cứu các giải pháp nuôi trồng thủy sản nhằm kiểm soát chẽ mối nguy liên quan đến SLTQC trong sản phẩm sau thu hoạch. 102
3.5. Thảo luận chung
3.5.1. Hiện trạng ấu trùng sán lá nhiễm trên cá ở khu vực miền núi phía Bắc
Nghiên cứu này ghi nhận ấu trùng của 6 loài SLTQC bao gồm C. sinensis, H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, P. varium và C. formosanus nhiễm trên nhiều loài cá tại khu vực MNPB và là bằng chứng khặng định SLTQC phân bố rộng khắp các vùng, miền tại Việt Nam. Điều tra trên ngƣời sau đó của Trung tâm Y tế Dự phòng tỉnh Yên Bái, tại huyện Lục Yên, kết quả cũng hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi khi ghi nhận tới 34% ngƣời có nhiễm SLTQC [73]. Ở các tỉnh thuộc đồng bằng sông Hồng nơi đƣợc xem là vùng dịch tễ chính của SLTQC, đặc biệt là sán lá gan nhỏ, các điều tra trên ngƣời, động vật và cá đều ghi nhận kết quả ít nhiều giống với nghiên cứu của chúng tôi ở khu vực MNPB. Nghiên cứu tiêu biểu nhất đƣợc triển khai tại 2 xã Nghĩa Phú và Nghĩa Lạc, huyện Nghĩa Hƣng, tỉnh Nam Định năm 2005 đã ghi nhận chính xác 6 loài SLTQC [68] giống nhƣ kết quả của chúng tôi tại khu vực MNPB. Cũng tại đây, một số các khảo sát trên ngƣời đều khặng định SLTQC nhiễm với tỉ lệ khá cao 40,2% tại Hải Hậu [70], 26% tại Nghĩa Hƣng [69], có sự khác biệt mức độ nhiễm SLTQC giữa nam (29,3%) và nữ giới (16,0%) tại Hải Hậu trong đó C. sinensis (14,58%), H. taichui (32,29%), H. pumilio (52,08%) và C. formosanus (1.04%) [135]. Trên động vật; chó, mèo và lợn, số loài SLTQC đƣợc xác định lên tới 11 loài và tỉ lệ nhiễm SLTQC nói chung ở mèo là 70,2%; chó là 56,9% và lợn là 7,7% tại Nam Định [77]. Và gần đây khảo sát trên ngƣời và động vật tại Ninh Bình, một trong những vùng dịch tễ quan trọng của sán lá gan nhỏ, STLQC cũng đƣợc xác định nhiễm với tỉ lệ: 20,5% ở ngƣời và 32,7% ở chó, 49,0% ở mèo và 13,0% ở lợn [11].
Các khảo sát trên cá ở các tỉnh thuộc khu vực miền Bắc cũng đều ghi nhận ấu trùng của 5 - 6 loài STQC nhƣ trong nghiên cứu của chúng tôi nhƣng không có ấu trùng sán lá gan nhỏ [8,76,92,108] hoặc tỉ lệ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ thấp [9– 11,89]. Ngoại trừ có nghiên cứu xác định ấu trùng sán lá gan nhỏ nhiễm với tỉ lệ cao trên một số loài cá tự nhiên[95] giống với nghiên cứu của chúng tôi và cá nuôi [94] mà đối tƣợng này ở khu vực MNPB chƣa phát hiện nhiễm. Có duy nhất một nghiên 103 cứu cho kết quả khác biệt với hầu hết các nghiên cứu nói trên, là phát hiện ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhiễm trên tất cả các loài cá xét nghiệm trong khi đó không có bất kỳ thông tin nào về ấu trùng sán lá ruột nhỏ [14]. Theo chúng tôi, nhiều khả năng có sự nhầm lẫn do nhóm tác giả không quan tâm nhiều đến hình thái ấu trùng các loài SLTQC khác nhau. Cũng tƣơng tự, ở các tỉnh thuộc khu vực đồng bằng sông Cửu long cũng đều ghi nhận có sự hiện diện của ấu trùng SLTQC nhƣ trong nghiên cứu của chúng tôi nhƣng mức độ nhiễm thấp hơn rất nhiều và không có ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis [102–104] nhƣng có ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini [102]. Tuy nhiên, cũng có nghiên cứu cho thấy ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhiễm trên cá Tra ở Vĩnh Long [106], mặc dù vậy, căn cứ vào khoảng cách trong phân tích phả hệ cho thấy đây không phải là sán lá gan nhỏ C. sinensis [107]. Hơn nữa, sán lá gan nhỏ C. sinensis thƣờng phân bố ở khu vực miền Bắc, cho nên ghi nhận chúng trên cá Tra ở đồng bằng sông Cửu long là bất thƣờng. Ở khu vực miền Trung, Vo et al. (2014) có xác nhận về ấu trùng sán lá gan nhỏ O. viverrini trên một số loài cá, trong đó đặc biệt là cá Diếc [99], ấu trùng một số loài SLTQC bao gồm sán lá gan nhỏ cũng đƣợc phát hiện nhiễm trên một số loài cá nuôi nhƣ Trắm cỏ tại Thừa Thiên Huế [101] nhƣng nghiên cứu của chúng tôi chƣa phát hiện các đối tƣợng này nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ ở khu vực MNPB.
Sự giống và khác nhau về kết quả giữa các nghiên cứu do nhiều yếu tố, tuy nhiên tất cả các nghiên cứu đều cho thấy SLTQC phổ biến trên ngƣời, động vật và các loài cá khác nhau ở Việt Nam. Sự phân bố của SLTQC ở Việt Nam là không mới nhƣng mức độ nhiễm ấu trùng của chúng trên cá tại khu vực MNPB là ghi nhận mới có ý nghĩa cả về khoa học và thực tiễn. Nghiên cứu đã bổ sung thông tin về vùng dịch tễ mới của SLTQC tại Việt Nam, là thông tin tham khảo cho các nhà khoa học trong và ngoài nƣớc thông qua các công bố trên tạp chí quốc tế cũng nhƣ trong nƣớc. Sự phổ biến ấu trùng của SLTQC cho thấy nguy cơ lây nhiễm cao bởi tình trạng ăn gỏi cá hiện vẫn khá phổ biến tại nhiều nơi nƣớc ta [12,14]. Thế giới có khoảng 500 triệu ngƣời có nguy cơ lây nhiễm SLTQC [136,137]. Một số SLTQC có thể gây bệnh nguy hiểm cho con ngƣời, nhƣ bệnh ung thƣ đƣờng ống mật và các bệnh liên quan đến gan mật do sán lá gan nhỏ C. sinensis và O. viverrini gây ra 104
[1,3,35,36]. Sự xuất hiện của ấu trùng SLTQC, đặc biệt là sán lá gan nhỏ C. sinensis với tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm cao trên cá ở khu vực MNPB là một cảnh báo nguy hiểm đối với sức khỏe ngƣời dân nơi đây. Chính vì vậy các cơ quan y tế địa phƣơng cần khẩn trƣơng tiến hành những khảo sát nhằm xác định các vùng dịch tễ trên ngƣời để tiến hành điều trị loại bỏ kết hợp với biện pháp giáo dục, tuyên truyền về nguyên nhân nhiễm và hậu quả của bệnh nhằm góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng, giữ vững sự ổn định đời sống tinh thần của đồng bào dân tộc các tỉnh khu vực MNPB nƣớc ta.
3.5.2. Sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis
Nghiên cứu xác định 8/35 loài cá ở khu vực MNPB, đặc biệt là cá ở hồ Thác Bà, Yên Bái nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis với tỉ lệ và cƣờng độ cao chƣa từng ghi nhận ở Việt Nam. Tép dầu, một loài cá tự nhiên có kích cỡ nhỏ (trung bình 4,8 gram/ca) đƣợc xác định có tỉ lệ nhiễm trung bình 76,7% và 65,7 (±121) ấu trùng/cá. Trong khi đó, các nghiên cứu khác, mặc dù ở vùng dịch tễ nhƣng có mức độ nhiễm thấp hơn rất nhiều. Phan et al. (2010) xét nghiệm 18 loài cá nuôi cao tại Nam Định chỉ phát hiện duy nhất 1 mẫu cá Mè trắng nhiễm 1 ấu trùng sán lá gan này [8]. Ở nghiên cứu khác tại đây, nhóm tác giả này cũng chỉ phát hiện Trắm cỏ nhiễm 1,9%, Rohu 0,5% và Mè trắng 2,4% [9]. So sánh với ấu trùng sán lá ruột, sán lá gan nhỏ trên cá Rohu chỉ chiếm 0,05% so với 94% của sán lá ruột nhỏ nhiễm trên cá Rohu tại Nam Định, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hóa [10]. Thậm chí một số nghiên cứu còn không hề phát hiện thấy ấu trùng sán lá gan nhỏ trong khi vẫn thấy ấu trùng sán lá ruột nhỏ nhƣ H. pumilio [8,76,92,108]. Sự khác biệt về mức độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis giữa nghiên cứu của chúng tôi có thể do yếu tố vật chủ và vùng dịch tễ. Ở nghiên cứu nói trên hầu hết đều tập trung vào các đối tƣợng cá nuôi ao trong khi đó nghiên cứu của chúng tôi tập trung nhiều vào đối tƣợng cá tự nhiên. Điều này có thể thấy rõ ở một số nghiên cứu sau này khi hƣớng đến các đối tƣợng cá tự nhiên. Tại Ninh Bình, xét nghiệm một số loài cá tự nhiên đã bắt gặp cá Mƣơng xanh và cá Thiểu nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ với tỉ lệ tƣơng ứng là 21,7% và 43,9% [95] và cũng tại đây cá Mƣơng xanh một lần nữa đƣợc xác 105
định nhiễm ấu trùng này với tỉ lệ 12,5% [11]. Mặc dù mức độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá tự nhiên tại Ninh Bình không cao nhƣ nghiên cứu của chúng tôi ở khu vực MNPB nhƣng cao hơn so với mức độ nhiễm trên cá nuôi tại Nam Đinh. Vậy có chăng ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis có liên quan nhiều đến môi trƣờng tự nhiên hơn là môi trƣờng ao nuôi?.
Rủi ro lây nhiễm ấu trùng này từ cá tự nhiên lớn hơn so với cá nuôi trong nghiên cứu này cũng tƣơng tự nhƣ những báo cáo tại Trung Quốc nơi báo cáo là ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhiễm trên cá tự nhiên cao hơn so với cá nuôi [124,125,138,139] ở Hàn Quốc cá tự nhiên cũng là vật chủ trung gian quan trọng của sán lá gan nhỏ C. sinensis [140–142]. Nguyên nhân dẫn đến sự lây nhiễm ấu trùng sán nói chung trên cá là do ốc. Sán lá gan nhỏ C. sinensis, O. viverrini và O. felineus sử dụng các loài ốc thuộc giống Alocinma, Bithynia, Thiara và Parafossarulus làm vật chủ trung gian thứ 1. Ở khu vực Đông Nam Á, giống Bithynia bao gồm một vài loài [143,144] môi trƣờng sống của chúng là vùng nƣớc cạn, nƣớc trong và chảy nhẹ (ví dụ nhƣ; kênh, mƣơng, suối nhỏ, đầm, ruộng lúa và hồ) hơn là vùng nƣớc tĩnh nhƣ ao [11,85,143,145–148]. Đặc điểm sinh thái ở những loại hình mặt nƣớc tự nhiên có thể đáp ứng tốt hơn nhu cầu của ốc Bithynia hơn là những điều kiện trong ao nơi môi trƣờng nƣớc bị tù đọng và ô nhiễm cao. Nghiên cứu gần đây về chất lƣợng nƣớc tối ứu minh chứng Bithynia chịu ảnh hƣởng của mực nƣớc, nhiệt độ, mức oxy hòa tan, độ muối và đặc biệt là độ pH của nƣớc [145,149,150].
Hơn nữa, đặc tính vật chủ đặc trƣng của sán lá gan nhỏ cũng có vai trò quyết định đến việc một số loài nhiễm ấu trùng này nhiều hơn so với các loài khác. Điều này càng thể hiện ngay trong nghiên cứu này khi sán lá ruột nhỏ phát hiện đƣợc trên hầu hết các loài cá thì ấu trùng sán lá gan nhỏ chỉ là 8 loài. Còn nữa, trong 8 loài nhiễm, xác định 4 loài nhiễm mức độ cao hơn nhƣ Tép dầu, Thiểu, Mƣơng xanh và Ngão. Giải thích cho sự khác nhau giữa các loài vật chủ là khả năng miễn dịch tự nhiên ở các nhóm loài cá. Theo Rhee et al (1980) đó là a xít linoleic trong nhớt đƣợc tiết ra từ biểu mô cá nó giúp vật chủ kháng lại ấu trùng cercariae [51]. Nhớt tiết ra từ 106 biểu mô của cá Chép vàng Cyprinus carpio và Aplocheilus latipes không chỉ hoạt hóa với cercariae mà còn cả với metacercariae [52]. Khả năng hoạt hóa của thành phần hóa học này khác nhau ở mỗi loài cá cũng nhƣ tác dụng đặc hiệu với mỗi loại ấu trùng sán. Cá P. parvađƣợc coi là vật chủ đặc trƣng nhất của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensistại Hàn Quốc cũng nhƣ Trung Quốc [17,45]. Nhớt của cá P. parva mất đến 8,5 giờ để làm chết cercariae của C. sinensis trong khi đó nhớt của loài cá khác chỉ mất đến 3-6 phút,mà thông thƣờng, cercariae chỉ cần 2-3 phút để xâm nhập qua da cá [52].
Bảng 3.17: Vật chủ của sán lá gan nhỏ ở khu vực miền núi phía Bắc TT VẬT CHỦ THẾ GIỚI VIỆT NAM
1 Cultrichthys erythropterus (cá Thiểu) [54] [95]
2 Hemiculter leucisculus (Mƣơng xanh) [54] [11,95]
3 Toxabramis houdemeri (Tép dầu) [125] -
4 Opasariichthys bidens (Cháo thƣờng) [125] - 5 Culter recurvirostris (Ngão gù) - -
6 Osteochilus salisburyi (Dầm đất) - -
7 Rhinogobius sp. (Bống hoa) - -
8 Casioides cantonensis (cá Nhƣng) - -
Theo tổng hợp, có đến khoảng 102 loài cá thuộc 59 giống, 15 họ tại Trung Quốc [53] và 80 loài thuộc 9 họ, trong đó 71 loài thuộc họ cá Chép tại Hàn Quốc [54,55] đƣợc xác định là vật chủ trung gian thứ 2 của sán lá gan nhỏ C. sinensis. Tuy nhiên, cho đến trƣớc thời điểm nghiên cứu của chúng tôi ở khu vực MNPB, mới chỉ có 6 loài cá nƣớc ngọt đƣợc khặng định là vật chủ của loài sán này [8,10,11,89,94,95]. Trong số 8 loài cá đƣợc xác định là vật chủ của sán lá gan nhỏ C. sinensis ở khu vực MNPB có 4 loài chƣa từng đƣợc xác nhận trƣớc đó trên thế giới và 6 loài chƣa ghi nhận tại Việt Nam (Bảng 3.17).
Nhƣ vậy cho đến nay, theo tổng hợp của chúng tôi mới chỉ có khoảng 12 loài 107 cá nƣớc ngọt đƣợc ghi nhận là vật chủ của sán lá gan nhỏ C. sinensis ở miền Bắc, Việt Nam. Con số này ít hơn rất nhiều so với những gì đã ghi nhận từ lâu tại Trung Quốc, 102 loài [53] và Hàn Quốc, 80 loài [55]. Việc mới chỉ phát hiện 12 loài cá là vật chủ của C. sinensis cho thấy vai trò sán lá gan nhỏ C. sinensis và SLTQC nói chung ở Việt Nam chƣa đƣợc đánh giá một cách đầy đủ. Tuy nhiên, số lƣợng loài vật chủ lớn thì mức độ rủi ro lây nhiễm ở ngƣời cao. Trung Quốc có khoảng 13 triệu ngƣời nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis [17], Hàn Quốc có 1,4 triệu ngƣời nhiễm [22] và Việt Nam có khoảng 1 triệu ngƣời nhiễm sán lá gan nhỏ trong đó gồm cả C. sinensis và O. viverrini [24], nhƣng thực tế số liệu về ngƣời nhiễm có thế thấp hơn rất nhiều nguyên nhân là do phƣơng pháp xét nghiệm Kato-Katz không hoàn toàn phân định rõ giữa trứng sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ. Minh chứng cụ thể nhất là cuộc khảo sát năm 2005 tại Nam Định, tỉ lệ xét nghiệm dƣơng tính với SLTQC nói chung là 64,5% nhƣng tỉ lệ thu đƣợc sán lá gan nhỏ trƣởng thành là 54% trong khi đó tỉ lệ này ở sán lá ruột nhỏ, đặc biệt là H. pumilio là 100% [68].
Trong số 8 loài vật chủ của sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá ở khu vực MNPB, 4 loài vật chủ gồm Tép dầu, Thiểu và Mƣơng xanh có thể xem là loài vật chủ đặc trƣng vì nhiễm với mức độ cao. Mật độ ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trung bình ở Tép dầu là 13,9 ấu trùng/g, Mƣơng xanh là 1,3 ấu trùng/g và Thiểu là 1,5 ấu trùng/g. Ở Trung Quốc và Hàn Quốc, các loài cá P. parva, P. herzi và Abbottina spp. đã đƣợc xem là vật chủ đặc trƣng của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis [44–46,53]. Nghiên cứu về sự biến động của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên 3 đối tƣợng (Tép dầu, Mƣơng xanh, Thiểu) tại hồ Thác Bà cho thấy có sự biến động mùa vụ nhƣng không khác biệt ý nghĩa giữa mùa mƣa và mùa khô, ngoại trừ ở Mƣơng xanh, cƣờng độ nhiễm vào mùa mƣa cao hơn so với mùa khô. Tuy nhiên, khi phân tích biến động theo tháng chúng tôi thấy mức độ nhiễm ấu trùng này cao nhất vào tháng 7 và thấp nhất vào tháng 2. Sự biến động mức độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ phụ thuộc vào biến động quần thể ốc (Bithynia) và sự phát triển của trùng đuôi (cercariae). Sự phát triển của cả 2 yếu tố này đều phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ. Nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy ấu trùng C. sinensis bắt đầu xuất hiện và nhiễm trên cá vào giai đoạn tháng 4 khi nhiệt độ tăng 108 lên từ 16 đến 22,9oC và có xu hƣớng tăng cao vào tháng 6 và 7 khi nhiệt độ là 24- 27oC rồi sau đó giảm dần [53]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với Huang và Khaw (1964) khi khảo sát về mùa vụ ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá P. parva tại Đài Loan. Tỉ lệ cá P. parva nhiễm ấu trùng là 100% vào mùa Hè (tháng 6-8) với 418 ấu trùng/cá, 96,6% vào mùa Thu - Đông (tháng 9-11) với 309 ấu trùng/cá; 80% vào Đông-Xuân (tháng 12-2) với 96 ấu trùng/cá; rồi lại dần tăng lên vào giai đoạn Xuân-Hè (tháng 3-5) với 227 ấu trùng/cá. Đáng lƣu ý là cƣờng độ nhiễm tăng một cách đột biến vào tháng 5, từ 152 ấu trùng/cá vào tháng 4 lên đến 313 ấu trùng/cá vào tháng 5 chỉ sau 1 tháng [53]. Tuy nhiên, nghiên cứu tại Thái Lan, cho thấy sự biến động ấu trùng O. viverrini trên cá có xu hƣớng cao hơn vào cuối mùa mƣa từ tháng 7 đến tháng 1 và thấp hơn vào mùa Hè từ tháng 3 đến tháng 6 [59]. Ngoài yếu tố nhiệt độ, sự biến động mức độ nhiễm ấu trùng SLTQC nói chung có thể khác nhau tùy theo đặc điểm sinh học của loài SLTQC và đặc trƣng vùng sinh thái. Nghiên cứu tại hồ Thác Bà, Yên Bái xu hƣớng nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ cao hơn vào tháng giữa mùa mƣa, nhiệt độ cao (tháng 7) và thấp nhất vào tháng cuối mùa khô, nhiệt độ thấp nhất (tháng 2). Hồ Thác Bà có chiều dài hơn 80 km chạy dọc qua 2 huyện Yên Bình và Lục Yên với nhiều cộng đồng dân cƣ sinh sống quan khu vực hồ. Khu vực miền núi nói chung tỉ lệ hộ gia đình có nhà vệ sinh tự hoại thấp. Tỉ lệ ngƣời nhiễm SLTQC gần đây đƣợc xác định là 34% tại xã Phan Thanh, Lục Yên [73]. Mùa mƣa, các chất thải cùng mùn bã hữu cơ đƣợc dồn theo nƣớc mƣa xuống hồ tại khu vực ven bờ, đây cũng là môi trƣờng sống của ốc Bithynia, vật chủ trung gian của sán lá gan nhỏ và cũng là vùng nƣớc (nƣớc nông) thích hợp cho các loài cá tự nhiên kích cỡ nhỏ nhƣ Tép dầu, Mƣơng xanh, Thiểu ...vv tìm kiếm thức ăn là mùn bã hữu cơ. Sự hội tụ các điều kiện tự nhiên và đặc điểm sinh thái học này khiến cho mức độ rủi ro nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ cao hơn vào giai đoạn mùa mƣa so với mùa khô.
Mặc dù, có sự biến động về giữa các tháng nhƣng có thể thấy rằng ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis luôn hiện diên trên cá hồ Thác Bà, đây là mối nguy thƣờng trực đối với sức khỏe cộng đồng dân cƣ sống xung quanh hồ này. Sán lá gan nhỏ C. sinensis gần đây đƣợc xác định là tác nhân ung thƣ đƣờng ống mật ở ngƣời 109
[35] vì vậy cần phải có những nghiên cứu tổng thể nhằm xác định đầy đủ và đánh giá chính xác những yếu tố rủi liên quan đến sự lây truyền sán lá gan nhỏ tại vùng dịch tễ hồ Thác Bà. Ví dụ nhƣ, cần xác định rõ những loài cá tự nhiên nào nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ? các đối cá nuôi lồng ở hồ Thác Bà có nhiễm ấu trùng này không? Những loài động vật (nuôi, hoang dã) nào đóng vai trò là nguồn lƣu trữ sán lá gan nhỏ? tình trạng nhiễm sán lá gan nhỏ trên ngƣời ra sao? có liên quan gì đến vấn đề văn hóa của đồng bào dân tộc thiểu số? những loài ốc nào mang cercariae của loài sán này?
Sự xuất hiện của SLTQC tại khu vực miền núi phía Bắc, dù là ấu trùng sán lá gan nhỏ hay ấu trùng sán lá ruột nhỏ thì đây vẫn là vấn đề an toàn thực phẩm cần đƣợc quan tâm trong lĩnh vực thủy sản. Nghiên cứu của chúng tôi đã xác định đƣợc các điều kiện bất hoạt ấu trùng SLTQC nhƣ điều kiện đông lạnh, gia nhiệt và ƣớp muối. Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về điều kiện bất hoạt ấu trùng SLTQC, là cơ sở khoa học để xây dựng các hƣớng dẫn nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm và có ý nghĩa thực tiễn trong đời sống hàng ngày góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Có những điểm tƣơng đồng cũng nhƣ khác biệt giữa kết quả nghiên cứu của chúng tôi với các nghiên cứu trƣớc đây [61,62,126,127,151]. Sự khác biệt có thể do nhiều nguyên nhân nhƣ đối tƣợng cá sử dụng làm thí nghiệm bởi kích cỡ các loài cá có thể khác nhau, hàm lƣợng mỡ khác nhau dẫn đến hiệu quả đông lạnh hay gia nhiệt có khác nhau. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi là bổ sung cần thiết cho những nghiên cứu và những hƣớng dẫn về an toàn vệ thực phẩm. Ví dụ, Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu (EFSA) có khuyến cáo thời gian đông lạnh ở - 20oC trong 24 giờ là đảm bảo an toàn với tác nhân ký sinh trùng nói chung [151]. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của chúng tôi, trong 24 giờ ở nhiệt độ -20oC, ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong cá Tép dầu có tỉ lệ sống lên tới 54,5%. Điều đó cho thấy hƣớng dẫn của Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu đã chƣa bao quát đến vấn đề SLTQC và lý do có lẽ là do SLTQC không phổ biến ở khu vực Châu Âu. Và phải mất 8-11 ngày, ấu trùng C. sinensistrong cá P. parva ƣớp muối ở 30% mới bất hoạt hoàn toàn [61] nhƣng nghiên cứu của chúng tôi cho thấy cá Tép dầu chỉ cần ƣớp với 10% muối trong 10 ngày là có thể bất hoạt hoàn toàn ấu trùng này. Ngoài 110 ra, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng xác nhận và củng cố cho những nghiên cứu trƣớc đó về điều kiện gia nhiệt ấu trùng sán lá gan nhỏ [126,127] và hƣớng dẫn của Cơ quan an toàn thực phẩm Châu Âu trong điều kiện này [151].
o o A 0 C, 3 ngày B 0 C, 6 giờ
Hình 3.27: Ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trong điều kiện đông lạnh (A: ấu trùng bất hoạt; B: ấu trùng sống sót, vận động yếu) Hơn nữa, nghiên cứu này nƣớc chanh và rƣợu không phải là liệu pháp hữu hiệu để ngăn chặn sự lây nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis cho ngƣời. Ở nghiên cứu khác còn cho thấy, thậm chí rƣợu còn làm tăng khả năng nhiễm của ấu trùng sán bởi nó đẩy nhanh quá trình thoát nang của sán lá gan nhỏ O. viverrini [134]. Ăn gỏi cá hoặc cá nấu chƣa chín có mang ấu trùng sán là nguyên nhân dẫn đến sự lây nhiễm SLTQC ở ngƣời. Do đó mà hầu hết các điều tra trên ngƣời ở nƣớc ta đều cho thấy tỉ lệ nhiễm sán ở nam giới cao hơn nữ giới [68,69,73,135] bởi trong gia đình những ngƣời nam giới thƣờng ăn gỏi nhiều hơn nữ giới [132]. Tuy nhiên, có thể rƣợu đã làm tăng mức độ nhiễm SLTQC cho nhóm nam giới uống rƣợu trong khi ăn gỏi cá.
Nghiên cứu này cho thấy rằng việc xác định ấu trùng bất hoạt bằng phƣơng pháp kính hiển vi - quan sát sự vận động, biến đổi hình thái là chính xác và phù hợp: những ấu trùng này hoàn toàn không còn khả năng gây nhiễm (Hình 3.27A) . Ngƣợc lại, những ấu trùng đƣợc xác định là còn sống sót có khả năng lây nhiễm hay không là điều cần bàn. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy nhiều ấu 111 trùng mặc dù còn sống nhƣng khả năng vận động yếu (Hình 3.27B) và những ấu trùng này có còn là mối nguy với an toàn thực phẩm hay không?. Ví dụ, ở điều kiện đông lạnh -80oC, sau 24 giờ vẫn còn 7,5% ấu trùng đƣợc xác định còn sống sót, tuy nhiên, có bao nhiều ấu trùng còn khả năng lây nhiễm cho vật chủ chính (ngƣời và động vật). Trong một giới hạn nhất định, nghiên cứu chƣa thể giải quyết một cách triệt để vấn đề này mà cần có những nghiên cứu tiếp sau thừa kế và phát triển
112
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
1). Nghiên cứu này khặng định có sự phân bố của ấu trùng sán lá trên cá có khả năng lây nhiễm cho ngƣời ở Khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam:
Ấu trùng của 6 loài sán lá truyền qua cá trong đó1 loài sán lá gan nhỏ là C. sinensis và 5 loài sán lá ruột nhỏ gồm H. pumilio, H. taichui, H. yokogawai, P. varium và C. formosanus; Có 8 loài cá là vật chủ trung gian thứ 2 của sán lá gan nhỏ C. sinensis ở khu vực miền núi phía Bắc trong đó Tép dầu, Thiểu, Mƣơng xanh và Ngão gù là những vật chủ quan trọng; Vùng dịch tễ quan trọng của sán lá gan nhỏ C. sinensis ở Khu vực miền núi phía Bắc là hồ Thác Bà, Yên Bái;
2) Có sự biến động của ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhiễm trên một số loài cá ở vùng dịch tễ - hồ Thác Bà, Yên Bái:
Tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis chung trên các loài cá Tép dầu, Mƣơng xanh và Thiểu cao nhất vào tháng 7 và thấp nhất vào tháng 2; Cƣờng độ nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis trên cá Mƣơng xanh vào mùa mƣa cao hơn so với mùa khô;
3) Nghiên cứu đã xác định đƣợc một số điều kiện có thể bất hoạt hoàn toàn ấu trùng sán lá truyền qua cá, đặc biệt là ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis nhƣ sau:
Đông lạnh -80oC trong 30 phút, -20oC trong 6 giờ và 0oC trong 24 giờ đối với ấu trùng đã phân lập; Đông lạnh -80oC trong 5 ngày, -20oC trong 7 ngày và 10 ngày đối với ấu trùng trong cá; Gia nhiệt 100oC trong 1 phút và 70oC trong 5 phút đối với ấu trùng đã phân lập từ cá; Muối 10% và 7% trong 24 giờ và 5% trong 48 giờ đối với ấu trùng đã phân 113
lập từ cá; Muối 10% trong 10 ngày, 7% và 5% trong 15 ngày đối với ấu trùng trong cá;
4.2. Kiến nghị
Sự hiện diện của ấu trùng sán lá truyền qua cá, đặc biệt là ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis ở khu vực miền núi phía Bắc, cụ thể là ở hồ Thác Bà, Yên Bái với tỉ lệ và cƣờng độ nhiễm cao cho thấy đây là nguy cơ rủi ro đến sức khỏe cộng đồng. Nhằm tiếp tục làm rõ những vấn đề liên quan đến vùng dịch tễ của sán lá gan nhỏ tại hồ Thác Bà, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng chúng tôi có một số kiến nghị nhƣ sau:
(1) Khảo sát hiện trạng nhiễm sán lá gan nhỏ C. sinensis trên ngƣời tại các khu vực dân cƣ vùng hồ Thác Bà, Yên Bái;
(2) Nghiên cứu xác định danh mục loài cá nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ C. sinensis ở hồ Thác Bà, đặc biệt là các loài cá đang đƣợc nuôi tại đây;
(3) Nghiên cứu xác định các loài vật chủ ốc của sán lá gan nhỏ C. sinensis tại vùng hồ Thác Bà, Yên Bái;
(4) Nghiên cứu xác định vai trò của các loài động vật nuôi và hoang dã đến sự lây truyền sán lá gan nhỏ C. sinensis tại vùng hồ Thác Bà, Yên Bái;
114
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .1. Bui, T. N., T. T. Pham, N. T. Nguyen, H. Van Nguyen, D. Murrell, and V. T. Phan, 2016: The importance of wild fish in the epidemiology of Clonorchis sinensis in Vietnam. Parasitol. Res., 115, 3401–3408, doi:10.1007/s00436-016- 5100-8.
2. Phan, T. Van, N. T. Bui, V. H. Nguyen, and D. Murrell, 2016: Comparative Risk of Liver and Intestinal Fluke Infection from Either Wild-Caught or Cultured Fish in Vietnam. VECTOR-BORNE ZOONOTIC Dis., 16, 790–796, doi:10.1089/vbz.2016.1997.
3. Bùi Ngọc Thanh, Phạm Thị Thanh, Nguyễn Thị Nguyện, Nguyễn Văn Hà, Nguyễn Văn Đề, và Phan Thị Vân, 2016: Ấu trùng sán lá ruột (Metacercariae) trên cá tự nhiên tại hồ Thác Bà, Yên Bái có khả năng lây nhiễm cho ngƣời. Tạp chí NN&PTNT, 7, 94–101.
4. Phan Thị Vân, Bùi Ngọc Thanh và Nguyễn Văn Hà, 2016: Hiệu quả của praziquantel, nƣớc chanh và rƣợu trong việc bất hoạt ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis. Tạp chí NN&PTNT, 8, 101–105.
5. Bùi Ngọc Thanh và Phan Thị Vân, 2015: Khả năng sống sót của ấu trùng sán lá ruột nhỏ Haplorchis pumilio (Looss, 1896) trong điều kiện gia nhiệt và đông lạnh. Tuyển tập Hội nghị Ký sinh trùng toàn quốc lần thứ 42, Cửu Lò, Nghệ An, NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, 58–63
6. Bùi Ngọc Thanh, 2016: Fishborne Zoonotic Trematodes in the Northern Mountain Region, Vietnam. The 16th national workshop of Regional Network on Asian Schistosomasis and Other Helminth Zoonoses, Yangon, Myanmar, 8.
7. Thanh, B. N., D. Murrell, P. T. Van, and K. D. Murrell, 2017: Inactivation of Clonorchis sinensis in fish by freezing, heating and pickling treatments relevant to homes and restaurants. Asian Neglected Tropical Disease Conference NTDs without Borders: From Bench to Community, Khon Khean, Thailand, 45. 115
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Qian, M.-B.; Chen, Y.-D.; Liang, S.; Yang, G.-J.; Zhou, X.-N. The global epidemiology of clonorchiasis and its relation with cholangiocarcinoma. Infect. Dis. poverty 2012, 1, 4, doi:10.1186/2049-9957-1-4.
2. Sithithaworn, P.; Yongvanit, P.; Duenngai, K.; Kiatsopit, N.; Pairojkul, C. Roles of liver fluke infection as risk factor for cholangiocarcinoma. J. Hepatobiliary. Pancreat. Sci. 2014, 21, doi:10.1002/jhbp.62.
3. Sripa, B.; Bethony, J. M.; Sithithaworn, P.; Kaewkes, S.; Mairiang, E.; Loukas, A.; Mulvenna, J.; Laha, T.; Hotez, P. J.; Brindley, P. J. Opisthorchiasis and Opisthorchis-associated cholangiocarcinoma in Thailand and Laos. Acta Trop. 2011, 120.
4. Kieu, T. L.; Bronshein, A. M.; Fan, T. I. [Clinico-parasitological research in a mixed focus of clonorchiasis and intestinal nematodiasis in Hanamnin Province (the Socialist Republic of Vietnam)]. [Russian]. Med. Parazitol. (Mosk). 1990, 24–26.
5. Lê Văn Châu; Kiều Tùng Lâm; Nguyễn Văn Đề. Ứng dụng phƣơng pháp tiêu cơ để nghiên cứu vật chủ trung gian của Clonorchis sinensis (Cobbold. 1875). Phòng chống bệnh ký sinh trùng sốt rét 1992, 4, 44–48.
6. De, N. Van; Murrell, K. D.; Cong, L. D.; Cam, P. D.; Chau, L. Van; Toan, N. D.; Dalsgaard, A. The food-borne trematode zoonoses of Vietnam. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 2003, 34 Suppl 1, 12–34.
7. Hà Duy Ngọ. Sán lá gan nhỏ ở hai tỉnh Nam Định và Ninh Bình. Báo cáo khoa học của Viện khoa học công nghệ Việt Nam; 2003;
8. Phan, V. T.; Ersbøll, A. K.; Bui, T. Q.; Nguyen, H. T.; Murrell, D.; Dalsgaard, A. Fish-Borne Zoonotic Trematodes in Cultured and Wild-Caught Freshwater Fish from the Red River Delta, Vietnam. Vector-Borne Zoonotic 116
Dis. 2010, 10, 861–866, doi:10.1089/vbz.2009.0134.
9. Phan, V. T.; Ersbøll, A. K.; Nguyen, T. T.; Nguyen, K. V.; Nguyen, H. T.; Murrell, D.; Dalsgaard, A. Freshwater aquaculture nurseries and infection of fish with zoonotic trematodes, Vietnam. Emerg. Infect. Dis. 2010, 16, 1905– 9, doi:10.3201/eid1612.100422.
10. Clausen, J. H.; Madsen, H.; Murrell, K. D.; Van, P. T.; Thu, H. N. T.; Do, D. T.; Thi, L. A. N.; Manh, H. N.; Dalsgaard, A. Prevention and control of fish- borne zoonotic trematodes in fish nurseries, Vietnam. Emerg. Infect. Dis. 2012, 18, 1438–1445, doi:10.3201/eid1809.111076.
11. Hung, N.; Dung, D.; Lan Anh, N.; Van, P.; Thanh, B.; Van Ha, N.; Van Hien, H.; Canh, L. Current status of fish-borne zoonotic trematode infections in Gia Vien district, Ninh Binh province, Vietnam. Parasit. Vectors 2015, 8, 21, doi:10.1186/s13071-015-0643-6.
12. Nguyễn Viết Khuê; Bùi Ngọc Thanh; Nguyễn Văn Đề; Đào Xuân Trƣờng; Phạm Thế Việt; Phan Thị Vân. Tập quán ăn gỏi cá và nhận thức về nguy cơ lây nhiễm sán lá truyền qua cá ở khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam. In Tuyển tập toàn văn Hội nghị ký sinh trùng toàn quốc lần thứ 43; Quang, L. B., Luc, P. Van, Eds.; NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ: Buôn Ma Thuột, Đắc Lắc, 2016; pp. 127–131.
13. Hà Ký; Bùi Quang Tề. Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam; Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, 2007;
14. Trần Văn Quyên; Nguyễn Văn Thọ; Nguyễn Thị Hoàng Yến; Nguyễn Thị Hồng Chiên; Nguyễn Văn Phƣợng. Một số đặc điểm dịch tễ sán lá gan nhỏ do Clonorchis sinensis. Tạp chí Khoa học và phát triển - ĐH Nông Nghiệp Hà Nội 2012, 10, 142–147.
15. Clausen, J. H.; Madsen, H.; Murrell, K. D.; Bui, T. N.; Nguyen, N. T.; Do, D. T.; Thi, L. A. N.; Manh, H. N.; Dalsgaard, A. The effectiveness of different intervention strategies for the prevention of zoonotic metacercariae infection 117
in cultured fish. Aquaculture 2013, 416–417, 135–140, doi:10.1016/j.aquaculture.2013.09.006.
16. Madsen, H.; Thien, P. C.; Nga, H. T. N.; Clausen, J. H.; Dalsgaard, A.; Murrell, K. D. Two-year intervention trial to control of fish-borne zoonotic trematodes in giant gourami (Osphronemus goramy) and striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in nursery ponds in the Mekong Delta, Vietnam. Acta Trop. 2015, 152, 201–207, doi:10.1016/j.actatropica.2015.09.012.
17. Tang, Z.-L. L.; Huang, Y.; Yu, X.-B. B. Current status and perspectives of Clonorchis sinensis and clonorchiasis: epidemiology, pathogenesis, omics, prevention and control. Infect. Dis. Poverty 2016, 5, 71, doi:10.1186/s40249- 016-0166-1.
18. Hung, N. M.; Madsen, H.; Fried, B. Global status of fish-borne zoonotic trematodiasis in humans. Acta Parasitol. 2013, 58, 231–58, doi:10.2478/s11686-013-0155-5.
19. Lun, Z.-R.; Gasser, R. B.; Lai, D.-H.; Li, A.-X.; Zhu, X.-Q.; Yu, X.-B.; Fang, Y.-Y. Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China. Lancet Infect. Dis. 2005, 5, 31–41, doi:10.1016/S1473-3099(04)01252-6.
20. Shin, H. R.; Oh, J. K.; Lim, M. K.; Shin, A.; Kong, H. J.; Jung, K. W.; Won, Y. J.; Park, S.; Park, S. J.; Hong, S. T. Descriptive epidemiology of cholangiocarcinoma and clonorchiasis in Korea. J. Korean Med. Sci. 2010, 25, 1011–1016, doi:10.3346/jkms.2010.25.7.1011.
21. Tatonova, Y. V.; Chelomina, G. N.; Besprozvannykh, V. V. Genetic diversity of Clonorchis sinensis (Trematoda: Opisthorchiidae) in the Russian southern Far East based on mtDNA cox1 sequence variation. Folia Parasitol. (Praha). 2013, 60, 155–162, doi:10.1016/j.parint.2012.07.005.
22. Shin, E.-H.; Guk, S.-M.; Kim, H.-J.; Lee, S.-H.; Chai, J.-Y. Review Trends in parasitic diseases in the Republic of Korea. Trends Parasitol 2008, 24, 143– 118
150, doi:DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.pt.2007.12.003.
23. Qian, M.-B.; Chen, Y.-D.; Yan, F. Time to tackle clonorchiasis in China. Infect. Dis. Poverty 2013, 2, 4, doi:10.1186/2049-9957-2-4.
24. WHO Control of foodborne trematode infections : report of a WHO study group. WHO Technical Report Series 849; Geneva, 1995; ISBN 924120849X.
25. Jongsuksuntigul, P.; Imsomboon, T. Opisthorchiasis control in Thailand. In Acta Tropica; 2003; Vol. 88, pp. 229–232.
26. Kaewpitoon, N.; Kootanavanichpong, N.; Kompor, P.; Chavenkun, W.; Kujapun, J.; Norkaew, J.; Ponphimai, S.; Matrakool, L.; Tongtawee, T.; Panpimanmas, S.; Rujirakul, R.; Padchasuwan, N.; Pholsripradit, P.; Eksanti, T.; Phatisena, T.; Loyd, R. A.; Kaewpitoon, S. J. Review and current status of Opisthorchis viverrini infection at the community level in thailand. Asian Pacific J. Cancer Prev. 2015, 16, 6825–6830.
27. Rim, H. J.; Chai, J. Y.; Min, D. Y.; Cho, S. Y.; Eom, K. S.; Hong, S. J.; Sohn, W. M.; Yong, T. S.; Deodato, G.; Standgaard, H.; Phommasack, B.; Yun, C. H.; Hoang, E. H. Prevalence of intestinal parasite infections on a national scale among primary schoolchildren in Laos. Parasitol. Res. 2003, 91, 267– 272, doi:10.1007/s00436-003-0963-x.
28. Sayasone, S.; Odermatt, P.; Phoumindr, N.; Vongsaravane, X.; Sensombath, V.; Phetsouvanh, R.; Choulamany, X.; Strobel, M. Epidemiology of Opisthorchis viverrini in a rural district of southern Lao PDR. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2007, 101, 40–47, doi:10.1016/j.trstmh.2006.02.018.
29. Miyamoto, K.; Kirinoki, M.; Matsuda, H.; Hayashi, N.; Chigusa, Y.; Sinuon, M.; Chuor, C. M.; Kitikoon, V. Field survey focused on Opisthorchis viverrini infection in five provinces of Cambodia. Parasitol. Int. 2014, 63, 366–373, doi:10.1016/j.parint.2013.12.003.
30. Lee, K. J.; Bae, Y. T.; Kim, D. H.; Deung, Y. K.; Ryang, Y. S.; Kim, H. J.; 119
Im, K. Il; Yong, T. S. Status of intestinal parasites infection among primary school children in Kampongcham, Cambodia. Korean J. Parasitol. 2002, 40, 153–155, doi:10.3347/kjp.2002.40.3.153.
31. Kovshirina, Y. V.; Fedorova, O. S.; Kovshirina, A. E.; Katanakhova, L. L.; Brazhnikova, N. A.; Vtorushin, S. V.; Onishchenko, S. V.; Taslitsky, S. S.; Chizhikov, A. V.; I.A.Tataurov; Ogorodova, L. M.; Odermatt, P. Opisthorchis felineus infection in Western Siberia: real clinical practice review. In Asian Neglected Tropical Disease Conference NTDs without Borders: From Bench to Community; 2017; p. 72.
32. Fedorova, O. S.; Kovshirina, Y. V.; Fedotova, M. M.; Sokolova, T. S.; Golovach, E. A.; Kovshirina, A. E.; Saltykova, I. V.; Gutor, S. S.; Ogorodova, L. M.; Odermatt, P. P. Opisthorchis felineus in Shegarsky district, Western Siberia: Preliminary results of a cross-sectional study. In Asian Neglected Tropical Disease Conference NTDs without Borders: From Bench to Community; 2017; p. 7.
33. Attwood, H. D.; Chou, S. T. The longevity of Clonorchis sinensis. Pathology 1978, 10, 153–156.
34. IARC A review of human Carcinogens: Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis. IARC Monographs on the Evaluation of carcinogenic risks to human. 100B 2012, 341–370.
35. Shin, H. R.; Oh, J. K.; Masuyer, E.; Curado, M. P.; Bouvard, V.; Fang, Y. Y.; Wiangnon, S.; Sripa, B.; Hong, S. T. Epidemiology of cholangiocarcinoma: An update focusing on risk factors. Cancer Sci. 2010, 101, 579–585, doi:10.1111/j.1349-7006.2009.01458.x.
36. Min, K. L.; Ju, Y. H.; Franceschi, S.; Oh, J. K.; Kong, H. J.; Hwang, S. S.; Park, S. K.; Cho, S. Il; Sohn, W. M.; Kim, D. Il; Yoo, K. Y.; Hong, S. T.; Shin, H. R. Clonorchis sinensis infection and increasing risk of cholangiocarcinoma in the republic of korea. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006, 120
75, 93–96, doi:75/1/93 [pii].
37. Choi, D.; Lim, J. H.; Lee, K. T.; Lee, J. K.; Choi, S. H.; Heo, J. S.; Jang, K. T.; Lee, N. Y.; Kim, S.; Hong, S. T. Cholangiocarcinoma and Clonorchis sinensis infection: A case-control study in Korea. J. Hepatol. 2006, 44, 1066– 1073, doi:10.1016/j.jhep.2005.11.040.
38. Salao, K.; Mảiiang, E.; Suttipriprapa, S.; Tangkawattana, S.; Edwards, S. W.; Sripa, B. Advanced periductal fibrosis in chronic Opisthorchis viverrini infection is associated with macrophages with high phagocytic and proteolytic activities. In Asian Neglected Tropical Disease Conference NTDs without Borders: From Bench to Community; 2017; p. 19.
39. Khuntikeo, N.; Chamadol, N.; Yongvanit, P.; Loilome, W.; Namwat, N.; Sithithaworn, P.; Andrews, R. H.; Petney, T. N.; Promthet, S.; Thinkhamrop, K.; Tawarungruang, C.; Thinkhamrop, B. Cohort profile: cholangiocarcinoma screening and care program (CASCAP). BMC Cancer 2015, 15, 1–8, doi:10.1186/s12885-015-1475-7.
40. Chai, J. Y.; Lee, S. H. Food-borne intestinal trematode infections in the Republic of Korea. Parasitol. Int. 2002, 51, 129–154.
41. Chai, J.-Y. Intestinal Flukes. In World Class Parasites Volume 11. Food- borne parasitic zoonoses. Fish and plant-borne parasites.; Murrell, K. D., Fried, B., Eds.; Springer, 2007; pp. 53–116.
42. Murrell, K. D.; Fried, B. World Class Parasites: Volume 11. Food-Borne Parasitic Zoonoses. Fish and Plant - Borne Parasites; Springer, 2007;
43. Yoshida, Y. Clonorchiasis--a historical review of contributions of Japanese parasitologists. Parasitol. Int. 2012, 61, 5–9, doi:10.1016/j.parint.2011.06.003.
44. Chen, D.; Chen, J.; Huang, J.; Chen, X.; Feng, D.; Liang, B.; Che, Y.; Liu, X.; Zhu, C.; Li, X.; Shen, H. Epidemiological investigation of Clonorchis sinensis infection in freshwater fishes in the Pearl River Delta. Parasitol. Res. 121
2010, 107, 835–9, doi:10.1007/s00436-010-1936-5.
45. Kim, E.-M.; Kim, J.-L.; Choi, S. Y.; Kim, J.-W.; Kim, S.; Choi, M.-H.; Bae, Y. M.; Lee, S.-H.; Hong, S.-T. Infection status of freshwater fish with metacercariae of Clonorchis sinensis in Korea. Korean J. Parasitol. 2008, 46, 247–51, doi:10.3347/kjp.2008.46.4.247.
46. Cho, S.; Sohn, W.; Na, B. Prevalence of Clonorchis sinensis Metacercariae in Freshwater Fish from Three Latitudinal Regions of the Korean Peninsula. Korean J. Parasitol. 2011, 49, 385–398, doi:10.3347/kjp.2011.49.4.385.
47. Ooi, H. K.; Chen, C. I.; Lin, S. C.; Tung, K. C.; Wang, S.; Kamiya, M. Metacercariae in fishes of sun moon lake which is an endemic area for Clonorchis sinensis in Taiwan. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 1997, 28, 222–223.
48. Wang, J. J.; Chung, L. Y.; Lee, J. D.; Chang, E. E.; EngRin, C.; Chao, D.; ChuanMin, Y. Haplorchis infections in intermediate hosts from a clonorchiasis endemic area in Meinung, Taiwan, Republic of China. J. Helminthol. 2002, 76, 185–188.
49. Sukontason, K.; Piangjai, S.; Muangyimpong, Y.; Sukontason, K.; Methanitikorn, R.; Chaithong, U. Prevalence of trematode metacercariae in cyprinoid fish of Ban Pao district, Chiang Mai Province, northern Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 1999, 30, 365–370.
50. Nithikathkul, C.; Wongsawad, C. Prevalence of Haplorchis taichui and Haplorchoides sp. metacercariae in freshwater fish from water reservoirs, Chiang Mai, Thailand. Korean J. Parasitol. 2008, 46, 109–112, doi:10.3347/kjp.2008.46.2.109.
51. Rhee, J. K.; Bae, B. K.; Ahn, B. Z.; Park, Y. J. The wormicidal substance of freshwater fishes on Clonorchis sinensis: II. Preliminary Research on the wormicidal substances from mucous substances of various freshwater fishes. Kisaengchunghak Chapi 1980, 18, 98–104. 122
52. Chun, S. K. Studies on the experimental mode of infections of Clonorchis sinensis: III. Studies in the wormicidal effect of external mucous substance of some freshwater fish on the larva of Clonorchis sinensis. Kisaengchunghak Chapi 1964, 2, 148–158.
53. Qi, X. L.; Hai, Y. Sen; CHen Ying Dan Clonorchis sinensis in China. In Food -Borne Helminthiasis in Asia, Asian Parasitology; 2005; pp. 1–26.
54. Sohn, W. M. Fish-borne zoonotic trematode metacercariae in the Republic of Korea. Korean J. Parasitol. 2009, 47, 103–114, doi:10.3347/kjp.2009.47.S.S103.
55. Hong, S. T.; Hong, S. J. Clonorchis sinensis ad clonorchiasis in Korea. In Food-Borne Helminthiasis in Asia, Asian Parasitology; 2005; pp. 35–56.
56. Tesana, S. Opisthorchis in Thailand. In Asia Parasitology. Vol. 1 Food-Borne Helminthiasis In Asia; 2005; pp. 113–124.
57. Xu, B. Clonorchis sinensis. In Proceedings of Presentation at the training course, Institute of Parasitic Disease, Guang Xi; 1979.
58. Shin, D. S. An epidemiological studies of Clonorchis sinensis along the Hyunsan River district. Chonghap 1964, 8, 79–95.
59. Sithithaworn, P.; Pipitgool, V.; Srisawangwong, T.; Elkins, D. B.; Haswell- Elkins, M. R. Seasonal variation of Opisthorchis viverrini infection in cyprinoid fish in north-east Thailand: Implications for parasite control and food safety. Bull. World Health Organ. 1997, 75, 125–131.
60. Saenphet, S.; Wongsawad, C.; Saenphet, K.; Rojanapaibul, A.; Vanittanakorm, P.; Chai, J. Y. The occurence of heterophyid metacrcariae in cyprinoid fish in Chiang Mai province. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 2008, 39, 56–61.
61. Fan, P. C. Viability of metacercariae of Clonorchis sinensis in frozen or salted freshwater fish. Int. J. Parasitol. 1998, 28, 603–605, 123
doi:10.1016/S0020-7519(97)00215-4.
62. Fattakhov, R. G. Low- temperature regimes for decontamination of fish of the larvae Opisthorchis (in Russian). Med. Parazitol. 1989, 5, 63–64.
63. Kruatrachue, M.; Chitramvong, Y. P.; Upatham, E. S.; Vichari, S.; Viyanant, V. Effects of physico-chemical factors on the infection of hamsters by metacercariae of Opisthorchis viverrini. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 1982, 13, 614–617.
64. Tesana, S.; Kaewkes, S.; Phinlaor, S. Infectivity and survivorship of Opishorchis viverrini metacercariae in fermenated fish. J. Parasitol. Trop. Med. Assoc. Thail. 1986, 9, 21–30.
65. Nguyễn Văn Chƣơng; Bùi Văn Tuấn; Lê Văn Châu. Một số đặc điểm dịch tễ của sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini. Phòng chống bệnh ký sinh trùng sốt rét 1997, 2, 91–94.
66. De, N. V. Fish-borne trematodes in Vietnam. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 2004, 33, 299–301.
67. Olsen, A.; Thuan, L. K.; Murrell, K. D.; Dalsgaard, A.; Johansen, M. V.; De, N. Van Cross-sectional parasitological survey for helminth infections among fish farmers in Nghe An province, Vietnam. Acta Trop. 2006, 100, 199–204, doi:10.1016/j.actatropica.2006.10.010.
68. Dung, D. T.; De, N. Van; Waikagul, J.; Dalsgaard, A.; Chai, J.-Y.; Sohn, W.- M.; Murrell, K. D. Fishborne zoonotic intestinal trematodes, Vietnam. Emerg. Infect. Dis. 2007, 13, 1828–33, doi:10.3201/eid1312.070554.
69. Dang, T. C. T.; Yajima, A.; Nguyen, V. K.; Montresor, A. Prevalence, intensity and risk factors for clonorchiasis and possible use of questionnaires to detect individuals at risk in northern Vietnam. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008, 102, 1263–8, doi:10.1016/j.trstmh.2008.06.002.
70. Lier, T.; Do, D. T.; Van Johansen, M.; Nguyen, T. H.; Dalsgaard, A.; Asfeldt, 124
A. M. High Reinfection Rate after Preventive Chemotherapy for Fishborne Zoonotic Trematodes in Vietnam. PLoS Negl. Trop. Dis. 2014, 8, doi:10.1371/journal.pntd.0002958.
71. Vinh, H. Q.; Phimpraphai, W.; Tangkawattana, S.; Smith, J. F.; Kaewkes, S.; Dung, D. T.; Duong, T. T.; Sripa, B. Risk factors for Clonorchis sinensis infection transmission in humans in northern Vietnam: A descriptive and social network analysis study. Parasitol. Int. 2017, 66, 74–82, doi:10.1016/j.parint.2016.11.018.
72. Do, D. T. Updates on country burden of Foodborne Zoonotic Trematodes, taeniasis and cysticercosis (Vietnam). In Expert Consultation to Accelerate Control of Foodborne Trematode Infections, Taeniasis and Cysticercosis17- 19 May 2017; Seoul, Republic of Korea; WHO: Seoul, 2017; p. 15.
73. Nguyễn Trọng Phú. Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm bệnh sán lá gan nhỏ và một số yếu tố nguy cơ của người dân xã Phan Thanh, huyện Lục Yên, tỉnh Yên Bái - năm 2014 - 2015; Yen Bai, 2015;
74. Phạm Văn Khuê; Nguyễn Huy Thùy. Nghiên cứu bệnh sán lá gan nhỏ Clonorchiasis và con đƣờng lây truyền giữa động vật và ngƣời. Tạp chí Y học thực hành 1996, 3, 27.
75. Anh, N. T. L.; Phuong, N. T.; Murrell, K. D.; Johansen, M. V.; Dalsgaard, A.; Thu, L. T.; Chi, T. T. K.; Thamsborg, S. M. Animal reservoir hosts and fish- borne zoonotic trematode infections on fish farms, Vietnam. Emerg. Infect. Dis. 2009, 15, 540–546, doi:10.3201/eid1504.081147.
76. Chi, T. T. K.; Dalsgaard, A.; Turnbull, J. F.; Tuan, P. a; Murrell, K. D. Prevalence of zoonotic trematodes in fish from a Vietnamese fish-farming community. J. Parasitol. 2008, 94, 423–428, doi:10.1645/GE-1389.1.
77. Lan Anh, N. T.; Phuong, N. T.; Johansen, M. V.; Murrell, K. D.; Van, P. T.; Dalsgaard, A.; Thu, L. T.; Thamsborg, S. M. Prevalence and risks for fishborne zoonotic trematode infections in domestic animals in a highly 125
endemic area of North Vietnam. Acta Trop. 2009, 112, 198–203, doi:10.1016/j.actatropica.2009.07.027.
78. Anh, N. T. L.; Madsen, H.; Dalsgaard, A.; Phuong, N. T.; Thanh, D. T. H.; Murrell, K. D. Poultry as reservoir hosts for fishborne zoonotic trematodes in Vietnamese fish farms. Vet. Parasitol. 2010, 169, 391–4, doi:10.1016/j.vetpar.2010.01.010.
79. Anh Thi, N. L.; Madsen, H.; Thanh Ha, D.; Hoberg, E.; Dalsgaard, A.; Murrell, K. D. Evaluation of the role of rats as reservoir hosts for fishborne zoonotic trematodes in two endemic northern Vietnam fish farms. Parasitol. Res. 2012, 111, 1045–1048, doi:10.1007/s00436-012-2929-3.
80. Dao, T. T. H.; Bui, T. Van; Abatih, E. N.; Gabriël, S.; Nguyen, T. T. G.; Huynh, Q. H.; Nguyen, C. Van; Dorny, P. Opisthorchis viverrini infections and associated risk factors in a lowland area of Binh Dinh Province, Central Vietnam. Acta Trop. 2016, 157, 151–157, doi:10.1016/j.actatropica.2016.01.029.
81. Dao, T. H.; Nguyen, T. G.; Victor, B.; Gabriël, S.; Dorny, P. Opisthorchis viverrini-like liver fluke in birds from Vietnam: morphological variability and rDNA/mtDNA sequence confirmation. J. Helminthol. 2013, 1–6, doi:10.1017/S0022149X13000400.
82. Nguyen, H. M.; Bui, T. N.; Loan, H. T.; Madsen, H. Infection status of hepatic trematodes infecting cats from slaughter houses in Vietnam; Hanoi, Vietnam, 2017;
83. Lê Hữu Khƣơng. Phát hiện mới về sán lá gan trên mèo tại một số tỉnh phía Nam Available online: http://hoithuyvietnam.org.vn/vn/171n/phat-hien-moi- ve-san-la-gan-tren-meo-tai-mot-so-tinh-phia-nam.html.
84. Nawa, Y.; Doanh, P. N.; Thaenkham, U. Is Opisthorchis viverrini an avian liver fluke? J. Helminthol. 2015, 89, 255–256, doi:10.1017/S0022149X13000709. 126
85. Dung, B. T.; Madsen, H.; The, D. T. Distribution of freshwater snails in family-based VAC ponds and associated waterbodies with special reference to intermediate hosts of fish-borne zoonotic trematodes in Nam Dinh Province, Vietnam. Acta Trop. 2010, 116, 15–23, doi:10.1016/j.actatropica.2010.04.016.
86. Skov, J.; Kania, P. W.; Dalsgaard, A.; Jørgensen, T. R.; Buchmann, K. Life cycle stages of heterophyid trematodes in Vietnamese freshwater fishes traced by molecular and morphometric methods. Vet. Parasitol. 2009, 160, 66–75, doi:10.1016/j.vetpar.2008.10.088.
87. Madsen, H.; Dung, B. T.; The, D. T.; Viet, N. K.; Dalsgaard, A.; Van, P. T. The role of rice fields, fish ponds and water canals for transmission of fish- borne zoonotic trematodes in aquaculture ponds in Nam Dinh Province, Vietnam. Parasit. Vectors 2015, 8, 11, doi:DOI 10.1186/s13071-015-1237-z.
88. Clausen, J. H.; Madsen, H.; Murrell, K. D.; Phan Thi, V.; Nguyen Manh, H.; Viet, K. N.; Dalsgaard, A. Relationship between snail population density and infection status of snails and fish with zoonotic trematodes in Vietnamese carp nurseries. PLoS Negl. Trop. Dis. 2012, 6, e1945, doi:10.1371/journal.pntd.0001945.
89. Phan, V. T.; Ersboll, A. K.; Nguyen, K. V.; Madsen, H.; Dalsgaard, A. Farm- level risk factors for fish-borne zoonotic trematode infection in integrated small-scale fish farms in northern Vietnam. PLoS Negl. Trop. Dis. 2010, 4, e742, doi:10.1371/journal.pntd.0000742.
90. Phan Thị Vân; Bùi Ngọc Thanh. Sán lá lây truyền qua cá tại Việt Nam (Fishborne Zoonotic Trematodes in Vietnam); Nhà xuất bản nông nghiệp: Hà Nội, 2013;
91. Nguyễn Văn Đề. Nghiên cứu mầm bệnh giun sán ký sinh trên thịt lợn, trâu, bò và cá nước ngọt tại Hà Nội; 2005;
92. Nguyen, T. H.; Nguyen, V. De; Murrell, D.; Dalsgaard, A. Occurrence and 127
species distribution of fishborne zoonotic trematodes in wastewater-fed aquaculture in northern Vietnam. Trop. Med. Int. Health 2007, 12 Suppl 2, 66–72, doi:10.1111/j.1365-3156.2007.01943.x.
93. Chai, J. Y.; Van De, N.; Sohn, W. M. Foodborne trematode metacercariae in fish from northern Vietnam and their adults recovered from experimental hamsters. Korean J. Parasitol. 2012, doi:10.3347/kjp.2012.50.4.317.
94. Nguyễn Thị Hợp; Đỗ Trung Dũng; Trần Thanh Dƣơng; Nguyễn Hƣơng Bình; Nguyễn Thị Hồng Ngọc; Bùi Ngọc Thanh. Nghiên cứu xác định ấu trùng sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis trên một số loài cá tại xã Hợp Thịnh, huyện Kỳ Sơn, tỉnh Hòa Bình. In Hội nghị Ký sinh trùng toàn quốc lần thứ 42; NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ: Cửa Lò, Nghệ An, 2015; pp. 256–264.
95. Bùi Ngọc Thanh; Nguyễn Thị Thu Bình; Phan Thị Vân. Ấu trùng sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis) trên cá mƣơng (Hemiculter sp.) và cá Thiểu (Cultrichthys erythropterus) tại Gia Viễn, Ninh Bình. Tạp chí NN&PTNT 2014, 16, 80–86.
96. Nguyễn Thị Hà; Bùi Quang Tề; Darwin Murrell. Ký sinh trùng có nguồn gốc từ cá (FZP) nhiễm trên cá Bống bớp (Bostrychus sinensis) và cá Song (Epinephelus coioides) tại Nghĩa Hƣng, Nam Định. Tạp chí NN&PTNT 2009, 64–71.
97. Thanh, B. N.; Dalsgaard, A.; Evensen, O.; Murrell, K. D. Survey for fishborne zoonotic metacercariae in farmed grouper in Vietnam. Foodborne Pathog. Dis. 2009, 6, 1037–9, doi:10.1089/fpd.2008.0230.
98. Nguyễn Văn Chƣơng. Báo cáo tình hình nhiễm giun sán ký sinh khu vực miền Trung Tây Nguyên. Viện sốt rét, ký sinh trùng và côn trùng Quy Nhơn; Quy Nhơn, Bình Định, 2005;
99. Vo, D. T.; Thanh, B. N.; Vo, D. T.; Nguyen, D. N.; K.D Endemicity of Opisthorchis viverrini Liver Fluke, Vietnam, 2011–2012. Emerg. Infect. Dis. 2014, 20, 152–154. 128
100. Vo, D. T.; Murrell, D.; Dalsgaard, A.; Bristow, G.; Nguyen, D. H.; Bui, T. N.; Vo, D. T. Prevalence of zoonotic metacercariae in two species of grouper, Epinephelus coioides and Epinephelus bleekeri, and flathead mullet, Mugil cephalus,in Vietnam. Korean J. Parasitol. 2008, 46, 77–82, doi:10.3347/kjp.2008.46.2.77.
101. Trƣơng Thị Hoa; Nguyễn Ngọc Phƣớc. Nghiên cứu mức độ nhiễm ấu trùng sán lá song chủ (metacercariae) trên cá Chép và Trắm cỏ giai đoạn giống nuôi tại Thừa Thiên Huế. Tạp chí Khoa học - ĐH Huế 2009.
102. Thu, N. D.; Dalsgaard, A.; Loan, L. T.; Murrell, K. D. Survey for zoonotic liver and intestinal trematode metacercariae in cultured and wild fish in An Giang Province, Vietnam. Korean J. Parasitol. 2007, 45, 45–54, doi:10.3347/kjp.2007.45.1.45.
103. Thien, P. C.; Dalsgaard, A.; Thanh, B. N.; Olsen, A.; Murrell, K. D. Prevalence of fishborne zoonotic parasites in important cultured fish species in the Mekong Delta, Vietnam. Parasitol. Res. 2007, 101, 1277–1284, doi:10.1007/s00436-007-0633-5.
104. Thien, C. P.; Dalsgaard, A.; Thanh Nhan, N.; Olsen, A.; Murrell, K. D. Prevalence of zoonotic trematode parasites in fish fry and juveniles in fish farms of the Mekong Delta, Vietnam. Aquaculture 2009, 295, 1–5, doi:10.1016/j.aquaculture.2009.06.033.
105. Thien, P. C.; Madsen, H.; Nga, H. T. N.; Dalsgaard, A.; Murrell, K. D. Effect of pond water depth on snail populations and fish-borne zoonotic trematode transmission in juvenile giant gourami (Osphronemus goramy) aquaculture nurseries. Parasitol. Int. 2015, 64, 522–6, doi:10.1016/j.parint.2015.07.005.
106. Đặng Thúy Bình; Vũ Đặng Hạ Quyên; Lê Thị Thu Hà; Trần Quang Sáng; Nguyễn Đắc Kiên. Xác định ấu trùng sán lá song chủ (metacercariae) ký sinh trên một số loài cá dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền. Tạp chí Khoa học-ĐH Cần Thơ 2014, 2, 15–23. 129
107. Doanh, P. N.; Nawa, Y. Clonorchis sinensis and Opisthorchis spp. in Vietnam: current status and prospects. Trans R Soc Trop Med Hyg 2016, 13– 20.
108. Tran, T. K. C.; Murrell, K. D.; Madsen, H.; Nguyen, V. K.; Dalsgaard, A. Fishborne zoonotic trematodes in raw fish dishes served in restaurants in Nam Dinh Province and Hanoi, Vietnam. J. Food Prot. 2009, 72, 2394–9.
109. Khuyết Danh. Miền núi phía Bắc Available online: http://ipcn.mpi.gov.vn/Home/NewsDetail.aspx?CatId=36&id=549.
110. Mạnh Tráng. Thông tin về dân cƣ, văn hóa vùng Trung du và miền núi phía Bắc Available online: http://ptit.edu.vn/wps/portal/nongthonvn/!ut/p/c4/04_SB8K8xLLM9MSSzPy 8xBz9CP0os3hLizBHd1cfIwN_MyM3A08vc2cXVx83Y49AY_2CbEdFAO8 ydjg!/?WCM_GLOBAL_CONTEXT=/wps/wcm/connect/nongthonvn/nongth onvn/vungnongthon/trungdumiennuiphiabac/f7add400404c96cea7cfff9171cb 77.
111. TTXVN Miền núi phía Bắc phát triển nuôi thủy sản nƣớc ngọt Available online: https://tepbac.com/tin-tuc/full/Mien-nui-phia-Bac-phat-trien-nuoi- thuy-san-nuoc-ng ot-3232.html (accessed on May 8, 2017).
112. Nguyễn Tuân. 10 địa phƣơng nghèo nhất cả nƣớc, có 9 là các tỉnh miền núi phía Bắc Available online: http://www.baomoi.com/10-dia-phuong-ngheo- nhat-ca-nuoc-co-9-la-cac-tinh-mien-nui-phia-bac/c/20561198.epi.
113. Ngô Sỹ Vân. Hiện trạng khu hệ cá hồ chứa Thác Bà, tỉnh Yên Bái, Đại học Thủy sản Nha Trang, 1999.
114. Nguyễn Văn Tôn. Bảo vệ nguồn lợi thủy sản trên hồ Thác Bà Available online: http://baotintuc.vn/dan-toc/bao-ve-nguon-loi-thuy-san-tren-ho-thac- ba-20110324092900191.htm.
115. TTXVN Tháo dỡ vó bè để bảo vệ nguồn lợi thủy sản hồ Thác Bà Available online: http://www.thiennhien.net/2012/06/21/thao-vo-de-bao-ve-nguon-loi- 130
thuy-san-ho-thac-ba/ (accessed on May 8, 2017).
116. Khuyết Danh BẢN TIN SẢN XUẤT THỊ TRƢỜNG/TIN THUỶ SẢN TRONG NƢỚC Yên Bái: Khôi phục và phát triển nguồn lợi thuỷ sản ở hồ Thác Bà Available online: http://xttm.mard.gov.vn/Site/vi- vn/76/tapchi/67/78/7398/Default.aspx.
117. Thái Sinh. Hồ Thác Bà - Vựa cá khổng lồ Tây Bắc Available online: http://nongnghiep.vn/ho-thac-ba-vua-ca-khong-lo-tay-bac-post190278.html.
118. Nguyễn Văn Hảo; Ngô Sỹ Vân. Cá nước ngọt Việt Nam; Tập I, Họ cá chép Cyprinidae; Nhà xuất bản nông nghiệp: Hà Nội, 2001;
119. Nguyễn Văn Hảo. Cá nước ngọt Việt Nam; Tập III, Ba liên bộ của lớp cá xương (liên bộ cá dạng mang ếch, liên bộ cá dạng suốt và liên bộ cá dạng vược); Nhà xuất bản nông nghiệp: Hà Nội, 2005;
120. Nguyễn Văn Hảo. Cá nước ngọt Việt Nam; Tập II, Lớp cá sụn và bốn liên bộ của nhóm cá xương (Liên bộ cá Thát lát, liên bộ cá dạng trích, tổng bộ cá dạng cháo và liên bộ cá dạng chép); Nhà xuất bản nông nghiệp, 2005;
121. Kay, H.; Murrell, K. D.; Hansen, A. K.; Madsen, H.; Trang, N. T. T.; Hung, N. M.; Dalsgaard, A. Optimization of an experimental model for the recovery of adult Haplorchis pumilio (Heterophyidae: Digenea). J. Parasitol. 2009, 95, 629–33, doi:10.1645/GE-1785.1.
122. Pearson, J.; Ow-Yang, C. ew species of haplorchis from Southeast Asia, together with keys to the Haplorchis -group of heterophyid trematodes of the region. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 1982, 35–60.
123. Yamaguti, S. Synopsis of Digenetic Trematodes of Vetrtebrates; Keigaku Publishin Company: Tokyo, 1971;
124. Sohn, W.-M. M.; Eom, K. S.; Min, D.-Y. Y.; Rim, H.-J. J.; Hoang, E.-H. H.; Yang, Y.; Li, X. Fishborne trematode metacercariae in freshwater fish from Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. Korean J. Parasitol. 2009, 47, 131
249–257, doi:10.3347/kjp.2009.47.3.249.
125. Lin, R.; Li, X.; Lan, C.; Yu, S.; Kawanaka, M. Investigation on the epidemiological factors of Clonorchis sinensis infection in an area of south China. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 2005, 36, 1114–1117.
126. Cho, Y. J.; Chu, J. P.; Rim, H. J.; Hwang, S. K. Viability of Clonorchis sinensis Metacercaria according to the Food-processing Methods. Korean J. Parasitol. 2002, 34, 242–247.
127. Prasongwatana, J.; Laummaunwai, P.; Boonmars, T.; Pinlaor, S. Viable metacercariae of Opisthorchis viverrini in northeastern Thai cyprinid fish dishes - As part of a rational program for control of O. viverrini-associated cholangiocarcinoma. Parasitol. Res. 2013, 112, 1323–1327, doi:10.1007/s00436-012-3154-9.
128. FDA Chapter 5: Parasites. In Fish and Fishery Products Hazards and Controls Guidance; Washington, DC., 2001; pp. 91–98.
129. Li, S.; Kang, H. W.; Choi, M.-H. H.; Hong, S.-T. T. Long-term storage of Clonorchis sinensis metacercariae in vitro. Parasitol. Res. 2006, 100, 25–29, doi:10.1007/s00436-006-0242-8.
130. Keiser, J.; Duthaler, U.; Utzinger, J. Update on the diagnosis and treatment of food-borne trematode infections. Curr. Opin. Infect. Dis. 2010, 23, 513–20, doi:10.1097/QCO.0b013e32833de06a.
131. Van, K. Van; Hoai, T. D.; Buchmann, K.; Dalsgaard, A.; Tho, N. Van Efficacy of praziquantel agaist Centrocestus formosanus metacercariae infection in common carp (Cyprinus carpio Linnaeus). J. South. Agric. 2012, 43, 520–523.
132. Phan, V. T.; Ersbøll, A. K.; Do, D. T.; Dalsgaard, A. Raw-fish-eating behavior and fishborne zoonotic trematode infection in people of northern Vietnam. Foodborne Pathog. Dis. 2011, 8, 255–60. 132
133. Wongsawad, C.; Kawin, S.; Wongsawad, P.; Paratasilpin, T. Some factors affecting Stellantchasmus falcatus metacercaria in laboratory. Southeast Asian J. Trop. Med. public Heal. 2005, 36 Suppl 4, 117–119.
134. Sriraj, P.; Aukkanimart, R.; Boonmars, T.; Wonkchalee, N.; Juasook, A.; Sudsarn, P.; Pairojkul, C.; Waraasawapati, S.; Pinlaor, S. Alcohol and alkalosis enhance excystation of Opisthorchis viverrini metacercariae. Parasitol. Res. 2013, 112, 2397–2402, doi:10.1007/s00436-013-3346-y.
135. De, N. Van; Le, T. H. Human infections of fish-borne trematodes in Vietnam: prevalence and molecular specific identification at an endemic commune in Nam Dinh province. Exp. Parasitol. 2011, 129, 355–61, doi:10.1016/j.exppara.2011.09.005.
136. Lima dos Santos, C. A. M.; Howgate, P. Fishborne zoonotic parasites and aquaculture: A review. Aquaculture 2011, 318, 253–261, doi:10.1016/j.aquaculture.2011.05.046.
137. WHO The World Health Organization Report 2004 changing history. World Health 2004, 95, 96p, doi:10.2105/AJPH.2004.042002.
138. Yu, S.-H.; Kawanaka, M.; Li, X.-M.; Xu, L.-Q.; Lan, C.-G.; Rui, L. Epidemiological investigation on Clonorchis sinensis in human population in an area of South China. Jpn. J. Infect. Dis. 2003, 56, 168–71.
139. Liu, W.-Q.; Liu, J.; Zhang, J.-H.; Long, X.-C.; Lei, J.-H.; Li, Y.-L. Comparison of ancient and modern Clonorchis sinensis based on ITS1 and ITS2 sequences. Acta Trop. 2007, 101, 91–4, doi:10.1016/j.actatropica.2006.08.010.
140. Chai, J. Y.; Murrell, K. D.; Lymbery, A. J. Fish-borne parasitic zoonoses: Status and issues. Int. J. Parasitol. 2005, 35, 1233–1254, doi:10.1016/j.ijpara.2005.07.013.
141. Kim, Y. J.; Choi, M.-H.; Hong, S.-T.; Bae, Y. M. Proliferative effects of excretory/secretory products from Clonorchis sinensis on the human 133
epithelial cell line HEK293 via regulation of the transcription factor E2F1. Parasitol. Res. 2008, 102, 411–7, doi:10.1007/s00436-007-0778-2.
142. Cho, S. H.; Cho, P. Y.; Lee, D. M.; Kim, T. S.; Kim, I. S.; Hwang, E. J.; Na, B. K.; Sohn, W. M. Epidemiological survey on the infection of intestinal flukes in residents of Muan-gun, Jeollanam-do, the Republic of Korea. Korean J. Parasitol. 2010, 48, 133–138, doi:10.3347/kjp.2010.48.2.133.
143. Petney, T. N.; Andrews, R. H.; Saijuntha, W.; Wenz-M??cke, A.; Sithithaworn, P.; Wenz-Mücke, A.; Sithithaworn, P. The zoonotic, fish-borne liver flukes Clonorchis sinensis, Opisthorchis felineus and Opisthorchis viverrini. Int. J. Parasitol. 2013, 43, 1013–1046, doi:10.1016/j.ijpara.2013.07.007.
144. Hung, N. M.; Duc, N. V; Stauffer, J. R.; Madsen, H. Use of black carp (Mylopharyngodon piceus) in biological control of intermediate host snails of fish-borne zoonotic trematodes in nursery ponds in the Red River Delta, Vietnam. Parasit. Vectors 2013, 6, 142, doi:10.1186/1756-3305-6-142.
145. Brockelman, W. Y.; Upatham, E. S.; Viyanant, V.; Ardsungnoen, S.; Chantanawat, R. Field studies on the transmission of the human liver fluke, Opisthorchis viverrini, in northeast Thailand: population changes of the snail intermediate host. Int. J. Parasitol. 1986, 16, 545–552, doi:10.1016/0020- 7519(86)90091-3.
146. Petney, T.; Sithithaworn, P.; Andrews, R.; Kiatsopit, N.; Tesana, S.; Grundy- Warr, C.; Ziegler, A. The ecology of the Bithynia first intermediate hosts of Opisthorchis viverrini. Parasitol. Int. 2012, 61, 38–45, doi:10.1016/j.parint.2011.07.019.
147. Madsen, H.; Hung, N. M. An overview of freshwater snails in Asia with main focus on Vietnam. Acta Trop. 2014, 140, 105–117, doi:10.1016/j.actatropica.2014.08.005.
148. Wang, Y. C.; Ho, R. C. Y.; Feng, C. C.; Namsanor, J.; Sithithaworn, P. An 134
ecological study of Bithynia snails, the first intermediate host of Opisthorchis viverrini in northeast Thailand. Acta Trop. 2014, 141, 244–252, doi:10.1016/j.actatropica.2014.02.009.
149. Lohachit, C. Ecological studies of Bithynia siamensis goniomphalos, a snail intermediate host of Opisthorchis viverrini, in Khon Kaen Province, Northeast Thailand. Malacol Rev 2004, 37, 1–26.
150. Ngern-Klun, R.; Sukontason, K. L.; Tesana, S.; Sripakdee, D.; Irvine, K. N.; Sukontason, K. Field investigation of Bithynia funiculata, intermediate host of Opisthorchis viverrini in northern Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 2006, 37, 662–672.
151. EFSA Scientific Opinion on risk assessment of parasites in fishery products. EFSA J. 2010, 8, 91, doi:10.2903/j.efsa.2010.1543.