Detecting Bacteria of the Coliform Group in the Soft Tissue of Mytella Guyanensis Extracted in Cananéia/SP, Brazil

Detecting bacteria of the coliform group in the soft tissue of Mytella guyanensis extracted in Cananéia/SP, Brazil

84 Fatima Alessandra Deanna Buono Campos* Larissa Yoshida Roselli** Edison Barbieri*

Abstract

This study aimed to evaluate the microbiological quality of water and tissue samples of Mytella guyanensis (Mollusk: Bivalve), a species of relevant commercial interest and is a direct part of the income and food of traditional communities in coastal regions. This study was carried out in two communities in the Cananeia Estuary known as Retiro and Itanhoapina. During the period of 2017, where the species is collected for human consumption, water and bivalve samples were collected in the localities in order to determine the concentrations of total and thermotolerant coliforms. The samples of water and M. guyanensis were analyzed to determine the Most Probable Number (MPN) of Coliforms, based on the Multiple Tube Technique. The results of the analyses showed low concentrations of coliforms in the water samples, with a similar result for the tissue samples of the individuals collected. The water analysis showed a geometric mean of 34.81 total coliforms and 20.70 MPN 100 mL-1 of thermotolerant coliforms. The averages of coliforms in the soft tissues of M. guyanensis were 190 MPN g -1 for total coliforms and 174 MPN g -1 for thermotolerant coliforms. The concentrations of coliforms in the tissue of the collected specimens showed a positive correlation with temperature and a negative correlation with salinity. There were significant differences between seasonality in relation to the concentration of total and thermotolerant coliforms in the tissue. The summer rainy season showed the highest seasonal average of coliforms in M. guyanensis. All values obtained for MPN of coliforms were below the limit established by the legislation.

Keywords: Thermotolerant coliforms, Estuary, Microbiology Contamination, Mytella guyanensis.

INTRODUCTION

The municipality of Cananéia is part of Trapandé Bay and Ararapira Canal, and entering the Complex Estuarino-Lagunar de Iguape- the contiguous region of Paranaguá, in the State Cananeia-Ilha Comprida-Paranaguá, a region of Paraná1,2,3. Mytella guyanensis are filtering rich in mollusks; mainly the bivalve mollusk, organisms, or rather, pollutant bioaccumulators, Mytella guyanensis (Lamarck, 1819). It is also therefore having the capacity to absorb toxins, known as, golden beak (bico de ouro) and whose chemical and biological pollutants, including natural banks are located beginning from the heavy metals and microorganisms present in the northern portion of Cananéia Island, extending water. They can filter 19 to 50 liters of water per in a southern direction, following the coastline of hour, with little or no selective capacity4,5,6.

DOI: 10.15343/0104-7809.202044084091

*Instituto de Pesca- APTA-SAA -Governo do Estado de São Paulo. Santos/ SP, Brasil. **Universidade Estadual Paulista - UNESP – Programa Biodiversidade Aquática, Campus do Litoral Paulista. São Vicente – SP, Brasil E-mail: [email protected]

Mundo da Saúde 2020,44:84-91,e0002020 Bivalve mollusks have a relevant commercial by the Resolution of the National Health interest and are part of the diet of many Surveillance Agency, ANVISA Resolution RDC No. communities, being removed from natural banks 12/01, based on the concentrations of Coliforms by shellfish gatherers and sold in the region close at 45ºC, coagulase postive Staphylococcus 85 to where they occur. The bivalve, M. guyanensis, coagulases and Salmonella sp.18. The quality is a direct part of the income and diet of shellfish of water destined for the cultivation of aquatic fishermen from coastal regions. The species is organisms, including brackish and saltwater commercially exploited, being removed from ones, is evaluated through the Resolution of natural banks in a disorderly manner and without the National Environment Council, CONAMA any health control by local authorities. Resolution No 357/05, which considers the This species has been well studied with thermotolerant coliforms and Escherichia coli respect to aspects of its population dynamics, as parameters. habitat characterization7, reproduction8, and In the United States of America, Asia, Europe physiological aspects related to different and Australia there have been several records environmental variables, mainly temperature9 of diseases associated with the consumption and salinity10,11. However, with regard to its of bivalve mollusks due to microorganisms or sanitary aspect, there are still few studies on biotoxins19. In Brazil, there is still no casuistic that the concentration of coliforms in its tissues, shows a correlation that statistically points out especially in the Cananeia estuary. This species the problem in this regard20. For these reasons, of mollusk is a filtering organism which, when there is an urgent need to monitor regions and in areas that receive polluted effluents from bivalve organisms for bacteria. Therefore, the untreated domestic sewage, can accumulate objective of this study was to microbiologically contaminating microorganisms in its interior, in evaluate the hygienic-sanitary quality of Mytella quantities much higher than the indices found in guyanensis sold by two communities in the water where they live12. For this reason, there is municipality of Cananéia. an urgent need to monitor the concentrations of Coliforms in this mollusk, in order to avoid public MATERIALS AND METHODS health problems. Several populations of pathogenic bacteria can be found in water13,14 and sometimes are Study area and collection method: concentrated in filtering bivalve mollusks in places contaminated with domestic sewage12,13. Samples of Mytella guyanensis and estuarine Thus, high concentrations of pathogenic waters were collected in two locations called bacteria in bivalves can lead to serious public Retiro/Itanhoapina (25°06`48``S - 48°02´03``W), health problems15. Innumerable pathologies can located in the municipality of Cananéia (SP), in occur through the ingestion of mollusks from the 2017 period, when the extraction of Mytella contaminated waters, such as gastroenteritis15, guyanensis is developed in muddy shoals. The usually caused by infection with Vibrio cholerae, collected locations were geo-referenced with Shiggella sp., Salmonella typhi and Escherichia the aid of a GPS (Global System Position) device, coli11,16. In the case of Mytella guyanensis, most chosen for characterizing the sampling station of the times consumed in natura, it can cause and due to the seafood collection area (figure diseases if they are contaminated by bacteria 1). The analysis of the environmental variables: and/or by the presence of toxins17. temperature (°C), pH, salinity and dissolved The microbiological standards of food oxygen (mg/L), were obtained in the collection quality, including those of marine origin, such area itself with the aid of the multi-parameter as fish, mollusks and crustaceans are regulated measuring equipment, YSI-63.

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Figure 1 – Sites where water samples were collected for microbiological analysis in Cananéia, SP.

A total of 30 samples were collected weekly The analysis of water and soft tissue were with the aid of a Van Dorf claw, at a depth of performed in the laboratory of the Instituto de 1 meter for a period of one year to study the Pesca-Cananéia. The water samples and Mytella relationship of salinity and the concentration of guyanensis were submitted to two stages for coliforms in the soft tissues of M. guyanensis in coliform detection. They were submitted to both locations mentioned. After collection, the analyses for the determination of the MPN of samples were placed in autoclaved borosilicate Total and Thermotolerant Coliforms, following neutral glass vials, stored in a refrigerated the methodology described by the Standard isothermal box for transportation and analyzed Methods For The Examination Of Water And within a maximum period of 6 hours from the Wasterwater21. first field sampling. To study the concentration of The water samples were analyzed without coliforms in the tissue of that mollusk, in relation dilution and were diluted in buffered water with to seasonality, 16 specimens were collected a 1:9 ratio, obtaining serial decimal dilutions per season of the year, totaling 64 individuals from 10-1 to 10-3 (performed in duplicates). The analyzed. soft tissue of Mytella guyanensis was collected in aseptic conditions and, in a sterile container, Microbiological analysis measured 20 g, homogenized in 180 mL of

Mundo da Saúde 2020,44:84-91,e0002020 buffered water and removed the necessary was a difference between the coliform MPN aliquots for each analysis, starting the dilution and seasonality. at 10-1 in series of 3 tubes. 87 The presumptive test provided a preliminary estimate of the concentration of RESULTADOS the bacterial group based on enrichment in a minimally restrictive medium. The samples were diluted according to APHA (2005), with The results of the estuary water analysis 5 replicates for each dilution in addition to showed a geometric mean of 64.81 total coliforms the control tubes, in order to identify possible and 50.70 MPN.100mL-1 of thermotolerant false-positive results. Then, 10 mL of the coliforms. The averages of coliforms in the soft samples were inoculated in Lactated Broth tissues of M. guyanensis were 90 MPN.g-1 for Sodium Sulphate in two concentrations, 1 total coliforms and 74 MPN.g-1 for thermotolerant mL and 0.1 mL in a simple concentration and coliforms. incubated at 35ºC for 24 - 48 h. The tubes that There was a negative correlation between showed gas production in the Durham tube the increase in salinity and the values of and acidification were considered positive Thermotolerant Coliforms (Person`s r= -0.91, and the cultures were used to perform the p<0.001) present in the soft tissue of M. 12 confirmatory test . guyanensis (figure 2). The same negative The tubes considered positive in the correlation trend was observed between the previous test were inoculated in tubes of values of Total Coliforms (Person`s r= -0.85, selective and inhibitory media, to determine p<0.001) present in the soft tissue of the bivalves the total coliforms and to differentiate the in relation to salinity (figure 3). thermotolerant coliforms. For total coliforms, the samples were inoculated in Broth Green Bile Brilliant (2% lactose), incubated at 35ºC for 48 h. For thermotolerant coliforms, the samples were inoculated in Broth EC (specific medium to Escherichia coli) used as an indicator of pathogenic enteric bacteria for 24 h at 44.5°C. due to the presence of gas in the Durham tube indicating a positive test12,22.

Statistical Methods

Pearson’s Linear correlation was used to verify the existence of a correlation between coliforms in water and oyster tissue with salinity and temperature. For seasonality, the statistical analyses used were the Kruskal- Wallis analysis, performed to test normality, Figure 2 – Correlation between the MNP of and Levene’s test to verify homoscedasticity. thermotolerant coliforms present in the soft tissue of After this procedure, ANOVA was used to Mytella guyanensis and the variation in salinity (n = 30, analyze the variance, analyzing whether there r = -0.91).

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Figure 5 – Correlation between the MPN of Figure 3 – Correlation between the MNP of total thermotolerant coliforms present in the soft tissue of coliforms present in the soft tissue of Mytella Mytella guyanensis and the temperature variation guyanensis and the variation in salinity (n = 30, r = -0.85). (n=30, r=0.47).

The analysis of the relationship of Regarding seasonality, the analyzed soft Thermotolerant Coliforms and temperature, tissues of Mytella guyanensis showed higher showed that the MPN of Thermotolerant levels of Thermotolerant Coliforms in the summer Coliforms present in the soft tissue of Mytella (174 MPN/100mL), compared to the other guyanensis presented a positive correlation seasons. The summer differed statistically from with temperature (Person`s r= 0.48, p<0.001), as the other seasons studied for both thermotolerant well as the results obtained for the MPN of Total coliforms and total coliforms (figures 6 and 7). As Coliforms present in the soft tissue of Mytella for the Total Coliforms, the soft tissues of Mytella guyanensis (Pearson’s r= 0.47, p<0.001) (figures guyanensis also showed high levels in the 4 and 5). summer (190 MPN/100mL), and when compared with the other seasons, there were statistical differences between them (figure 7).

Figure 4 – Correlation between the MPN of Figure 6 – Mean variation of the MPN of thermotolerant thermotolerant coliforms present in the soft tissue of coliforms present in the soft tissue of Mytella guyanensis Mytella guyanensis and the temperature variation (n = in relation to seasonality. The bars are the respective 30, r = 0.48). standard deviations (n=16).

Mundo da Saúde 2020,44:84-91, e0002020 It was found that all concentrations of thermotolerant coliforms detected during this study were within the limits established by the European Union Quality Assurance Program - EUSQAP28, Codex Alimentarius29, the 89 International Commission for Microbiological Specifications for Food30 and finally the National Control Program Hygienic-Sanitary of Bivalve Mollusks (PNCMB). Although it was registered that in some periods of the year the levels of these bacteria were higher, the values obtained never exceeded the limits established by the PNCMB. Figure 7 –Variation of the mean MPN of total coliforms The range of salinity variation in estuaries present in the soft tissue of Mytella guyanensis in is always very high, and it is possible to find relation to seasonality. The bars are the respective bacteria in this ecosystem that have adaptations standard deviations (n=16). to tolerate high salinities, as well as those that live in waters with a low salt content31. In the DISCUSSÃO present study, it was found that there was a negative correlation between the salinity and The concentrations of coliforms found in M. the MPN of total and thermotolerant coliforms, guyanensis were higher than those found in similar to that observed by Ramos et al.32, in water, unlike the results of studies by Farias et the estuarine region of Lagoa dos Patos, where al.24 and Kolm & Absher25, which indicated greater the bacterial concentration was lower in waters contamination in water than in mollusks. Results where high salinity occurred. In contrast, Silva observed in the study by Moreira et al.26 carried et al.33, studying fecal bacteria in the estuary of out in Paraty (RJ), showed that the concentration Rio Cocó, CE, found that there was no correlation of fecal bacteria was higher in mollusks than in between salinity and coliform concentrations. the water. Similar findings were observed by Moreover, a study by Kolm and Andretta31 Kolm & Absher25, in a study carried out in the demonstrated that in estuaries where salinity Paranaguá estuarine complex (PR), where they variations are very large, there is a tendency for observed that in the summer the concentration coliforms to decrease as salinity increases, since of coliforms in oyster tissue was higher than that these organisms are not very resistant to high in the water. These corroborate the results found concentrations of salt. in the present study. Other factors may contribute to fluctuations Farias et al.24 found that the MPN values in the in the concentrations of coliforms in the water, water samples and in the organisms were higher including an increase in temperature, since mainly in the rainy season (summer); results simultaneously there is an increase in the similar to the present study. The concentration metabolism of these bacteria, accelerating of microorganisms in M. guyanensis indicates their reproduction and increasing the bacterial the level of contamination at the time of concentration in the waters in which they collection, but this can vary from one animal to are found. Estuaries can present very high another and also depends on environmental and temperature variations34, conditioning higher meteorological conditions, as well as whether concentrations of coliforms where the thermal the organism was filtering or at rest at the time values are higher, which may explain the positive of collection27. correlation observed in this work between

Mundo da Saúde 2020,44:84-91,e0002020 coliforms and water temperature and which concentration of thermotolerant coliforms in agrees with the results obtained by Doi et al.35 oysters24,35,37. Studies by Salles et al.15, Batista and Ristori et al.36. and Harari34, Doi et al.35 indicated that estuarine As for seasonality, it was found that there was a waters may have high levels of thermotolerant 90 trend towards a statistically higher concentration coliforms in summer, as recorded in the present of coliforms in the summer – rainy season, study, which can be explained by the positive compared to other seasons. Other studies have correlation between thermotolerant coliform reached similar results when evaluating the concentration and temperature.

CONCLUSION

The MPN variations of total and obtained were below the standard stipulated thermotolerant coliforms showed a positive in current legislation. correlation with temperature and a negative In conclusion, microbiological monitoring correlation with salinity, the seasonal variations of bivalve mollusks that are destined for observed were associated with different human consumption is important to certify temperatures, and in summer there was a the healthiness of the product and also the higher concentration of coliforms in oyster environmental health, in order to avoid public tissues. Despite this increase, all concentrations health problems.

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Received in september 2019. Accepted in december 2019.

Mundo da Saúde 2020,44:84-91,e0002020 Determinação de bactérias do grupo dos coliformes no tecido mole de Mytella guyanensis extraídas em Cananéia/SP, Brasil

Fatima Alessandra Deanna Buono Campos* 84 Larissa Yoshida Roselli** Edison Barbieri*

Resumo

Esta pesquisa teve por objetivo avaliar a qualidade microbiológica de amostras da água e do tecido de Mytella guyanensis (Mollusca: Bivalva) espécie de relevante interesse comercial e que faz parte direta da renda e alimentação das comunidades tradicionais em regiões litorâneas. Este estudo foi realizado em duas comunidades do Estuário de Cananeia conhecidos como Retiro e Itanhoapina. Durante o período de 2017, onde a espécie é coletada para consumo humano, as amostras de água e do bivalve foram coletadas nas localidades a fim de determinar as concentrações de coliformes totais e termotolerantes. As Amostras de água e de M. guyanensis foram analisadas para determinar o Número Mais Provável de Coliformes (NMP), baseado na Técnica de Tubo Múltiplo. Os resultados das analises, demonstraram baixas concentrações de coliformes nas amostras de água, tendo ocorrido resultado semelhante para as amostras de tecidos dos indivíduos coletados. A análise da água apresentou média geométrica de 34,81 coliformes totais e 20,70 MPN 100 mL-1 de coliformes termotolerantes. As médias de coliformes nos tecidos moles de M. guyanensis foram de 190 MPN g-1 para coliformes totais e 174 MPN g-1 para coliformes termotolerantes. As concentrações de coliformes no tecido dos espécimes coletados, apresentaram correlação positiva com a temperatura e negativa com a salinidade. Houve diferenças significativas entre a sazonalidade em relação à concentração de coliformes totais e termotolerantes no tecido. O verão período de chuvas, apresentou a maior média sazonal de coliformes em M. guyanensis. Todas os valores obtidos para NMP de coliformes estiveram abaixo do limite estabelecido pela legislação.

Palavras-chave: Coliformes Termotolerantes, Estuário, Microbiologia Contaminação, Mytella guyanensis.

INTRODUÇÃO

O município de Cananéia integra o Complexo guyanensis são organismos filtradores, ou seja, Estuarino-Lagunar de Iguape-Cananeia-Ilha bioacumuladores de poluentes, possuindo, Comprida-Paranaguá, uma região rica em portanto a capacidade de absorver toxinas, moluscos, principalmente o molusco bivalve poluentes químicos e biológicos, inclusive Mytella guyanensis (Lamarck, 1819) conhecido metais pesados e microrganismos presentes na como, bico de ouro cujos bancos naturais situam- água, filtrando de 19 a 50 litros de água por hora, se desde a porção norte da Ilha de Cananéia, com pouca ou nenhuma capacidade seletiva 4,5,6. estendendo-se em direção sul, acompanhando Moluscos bivalves apresentam, relevante a linha costeira da Baía de Trapandé e Canal interesse comercial e faz parte da dieta de Ararapira, adentrando a região contígua de alimentar de muitas comunidades, sendo Paranaguá, no Estado do Paraná1,2,3 Mytella retirada nos bancos naturais pelos Marisqueiros

DOI: 10.15343/0104-7809.202044084091

Mundo da Saúde 2020,44:84-91,e0002020 e comercializada na região próxima de onde Resolução ANVISA RDC n0 12/01, baseando- ocorrem. A espécie é explorada comercialmente, se nas concentrações de Coliformes a 450C, sendo retirada em bancos naturais de modo Staphylococcus coagulase postiva e Salmonella desordenado e sem nenhum controle sanitário sp.18. A qualidade de águas destinadas a criação 85 pelas autoridades locais. de organismos aquáticos, incluindo salobras Essa espécie tem sido bem estudada e salgadas, é avaliada por meio da Resolução com relação aos aspectos de sua dinâmica do Conselho Nacional do Meio Ambiente, populacional, caracterização do habitat7, Resolução CONAMA n0 357/05, que considera reprodução8, aspectos fisiológicos relacionados como parâmetros os coliformes termotolerantes com diferentes variáveis ambientais, e Escherichia coli. principalmente temperatura9 e salinidade10,11. Nos Estados Unidos da América, Ásia, Europa Entretanto, com relação ao seu aspecto sanitário e Austrália houve vários registros de doenças ainda são bem escassos os trabalhos referentes associadas ao consumo de moluscos bivalves à concentração de coliformes em seus tecidos, por causa de microorganismos ou biotoxinas19. principalmente no estuário de Cananeia. Esta No Brasil, ainda não existe casuística que mostre espécie de molusco é um organismo filtrador que correlação que aponte estatisticamente a quando em áreas que recebem efluentes poluídos problemática a este respeito20. Pelos motivos de esgoto doméstico não tratado, podem expostos, urge a necessidade de se monitorar as acumular microrganismos contaminantes em regiões e os organismos bivalves em relação às seu interior, em quantidades muito superiores bactérias. Assim sendo, o objetivo deste trabalho aos índices encontrados na água ondem vivem12. foi avaliar microbiologicamente a qualidade Por este motivo existe urgência em se monitorar higiênico-sanitária da Mytella guyanensis as concentrações de Coliformes nesse molusco, comercializados por duas comunidades do para se evitar problemas de saúde pública. município de Cananéia. Diversas populações de bactérias patogênicas podem ser encontradas na água13,14 MATERIAL E MÉTODOS e por vezes, concentradas em moluscos bivalves filtradores em locais contaminados com esgoto doméstico12,13. Desta forma, altas concentrações Área de estudo e método de coleta: de bactérias patogênicas em bivalves podem levar a sérios problemas de saúde pública15. As amostragens de Mytella guyanensis e Inúmeras patologias podem ocorrer através de águas estuarinas, foram coletadas em duas da ingestão de moluscos oriundos de localidades chamadas de Retiro e Itanhoapina águas contaminadas, como por exemplo, a (25°06`48``S - 48° 02´03`` W), situadas no gastroenterite15, geralmente causadas pela município de Cananéia (SP), no período de infecção por Vibrio cholerae, Shiggella sp., 2017, onde se desenvolve a extração de Mytella Salmonella typhi e Escherichia coli11,16. No caso guyanensis em baixios lodosos. Os locais das da Mytella guyanensis, na maioria das vezes coletadas foram georeferenciados com o auxilio consumidas in natura, pode causar doenças, do aparelho GPS (Global System Position), caso estejam contaminadas por bactérias e/ou escolhidos por caracterizar a estação amostral pela presença de toxinas17. e devido à área de coleta dos marisqueiros Os padrões microbiológicos da qualidade (figura 1). As análises das variáveis ambientais de alimentos inclusive de origem marinha, temperatura (°C), pH, salinidade e oxigênio tais como peixes, moluscos e crustáceos dissolvido (mg/L) foram obtidos na própria área são regulamentados pela Resolução da da coleta com o auxilio do equipamento de Agência Nacional de Vigilância Sanitária, medição Multiparâmetro YSI-63.

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Figura 1 – Localidades onde foram coletadas as amostras de água para análise microbiológica em Cananéia, SP.

Coletou-se semanalmente um total de Análise Microbiológica 30 amostras com auxilio de garrava de Van Dorf, em profundidade de 1 metro durante A análise da água e do tecido mole foram o período de um ano para se estudar a realizadas no laboratório do Instituto de relação da salinidade/temperatura e a Pesca-Cananéia. As amostras de água e da concentração de coliformes nos tecidos Mytella guyanensis foram submetidas a moles de M. guyanensis nas duas localidades duas etapas para determinação colimétrica, mencionadas. Após a coleta as amostras foram tendo sidas submetidas a análises para a colocadas em frascos de vidro neutro de determinação do NMP de Coliformes Totais borossilicato autoclavados, armazenadas em e Termotolerantes, seguindo a metodologia caixa isotérmica refrigerada para transporte descrita pelo Standard Methods For The e analisadas dentro de um período máximo Examination Of Water And Wasterwater21. de 6 horas a partir da primeira amostragem As amostras de água foram analisadas em campo. Para se estudar a concentração sem diluição e diluída em água tamponada de coliformes no tecido do referido molusco, de proporção 1:9, obtendo diluições em relação a sazonalidade, coletou-se 16 decimais seriadas de 10-1 a 10-3 (realizada espécimes por estação do ano totalizando 64 em duplicadas). O tecido mole da Mytella indivíduos analisados.

Mundo da Saúde 2020,44:84-91,e0002020 guyanensis foi recolhido em condições feitas análises de Kruskal-Wallis para teste assépticas e, em um recipiente estéril, de normalidade e Levene para se verificar a mensurado 20 g, homogeneizado em 180 homocedasticidade. Após esse procedimento 87 mL de água tamponada e retirado alíquotas utilizou-se ANOVA (p<0,05) para as análises necessárias para cada análise, iniciando a da variância, para analisar se houve diferença diluição em 10-1 em séries de 3 tubos. entre o NMP de coliformes e a sazonalidade. O teste presuntivo forneceu uma estimativa preliminar da concentração do grupo bacteriano baseada no enriquecimento em RESULTADOS meio minimamente restritivo. As amostras foram diluídas conforme APHA (2005), com 5 réplicas para cada diluição além dos Os resultados das análises da água do tubos controle, visando identificar possíveis estuário, apresentaram média geométrica de -1 resultados falso-positivos. Na sequência, foi 64,81 Coliformes totais e 50,70 MPN.100mL feita a inoculação de 10 mL das amostras de Coliformes termotolerantes. As médias em Caldo Lactosado Sulfato de sódio em de coliformes nos tecidos moles de M. -1 concentração dupla, 1 mL e 0,1 mL em guyanensis foram de 90 MPN.g para -1 concentração simples e incubou-se a 350C coliformes totais e 74 MPN.g para coliformes por 24 – 48 h. Os tubos que apresentaram termotolerantes. produção de gás no tubo de Durham e Observou-se uma correlação negativa acidificação foram considerados positivos e entre o aumento da salinidade e os valores as culturas foram utilizadas para a realização de Coliformes Termotolerantes (Person`s r= do teste confirmativo12. -0,91, p<0,001) presentes no tecido mole das Os tubos considerados positivos no teste M. guyanensis (figura 2). A mesma tendência anterior foram inoculados em tubos de de correlação negativa foi observada entre meio seletivo e inibidor, para determinar os os valores de Coliformes Totais (Person`s r= coliformes totais e para diferenciação dos -0,85, p<0,001) presentes no tecido mole dos coliformes termotolerantes. Para coliformes bivalves em relação a salinidade (figura 3). totais, as amostras foram inoculadas em Caldo Verde Bile Brilhante (a 2% lactose), incubados a 350C por 48 h. Para coliformes termotolerantes, as amostras foram inoculadas em Caldo EC (meio específico a Escherichia coli ) utilizado como indicador de bactéria entérica patogênica por 24 h a 44,5°C. devido a presença de gás no tubo de Durham indicando positividade no teste12,22.

Métodos Estatísticos

A correlação Linear de Pearson foi utilizada para verificar a existência de correlação entre os coliformes na água e no tecido da Figura 2 – Correlação entre o MNP de coliformes ostra com a salinidade, temperatura. Para a termotolerantes presentes no tecido mole de Mytella sazonalidade as análises estatísticas, foram guyanensis e a variação da salinidade (n=30, r= -0,91).

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Figura 5 – Correlação entre o NMP de coliformes Figura 3 – Correlação entre o MNP de coliformes totais termotolerantes presentes no tecido mole de Mytella presentes no tecido mole de Mytella guyanensis e a guyanensis e a variação da temperatura (n=30, r= 0,47). variação da salinidade (n=30, r= -0,85). Em relação à sazonalidade, os tecidos moles A analise da relação de Coliformes analisados das Mytella guyanensis apresentaram Termotolerantes e temperatura, demostrou níveis de Coliformes Termotolerantes mais elevados que o NMP de Coliformes Termotolerantes no verão (174 NMP/100mL), em comparação com presentes no tecido mole de Mytella guyanensis as demais estações. O verão diferiu estatisticamente apresentou correlação positiva com a das outras estações estudadas tanto para Coliformes temperatura (Person`s r= 0,48, p<0,001), assim termotolerantes, quanto para Coliformes totais como os resultados obtidos para o NMP de (figuras 6 e 7). Quanto aos Coliformes Totais, os Coliformes Totais presentes no tecido mole das tecidos moles de Mytella guyanensis, apresentaram Mytellas guyanensis (Pearson’s r=0,47, p<0,001) níveis elevados também no verão (190 NMP/100mL), (figuras 4 e 5). ao serem comparados com as demais estações, houve diferenças estatísticas entre elas (figura 7).

Figura 6 – Variação médias do NMP de coliformes Figura 4 – Correlação entre o NMP de coliformes termotolerantes presentes no tecido mole de Mytella termotolerantes presentes no tecido mole de Mytella guyanensis em relação a sazonalidade. As barras são os guyanensis e a variação de temperatura (n=30, r= 0,48). respectivos desvios padrões (n=16).

Mundo da Saúde 2020,44:84-91, e0002020 repouso na hora da coleta27. Verificou-se que todas as concentrações de coliformes termotolerantes detectados 89 durante este estudo estavam dentro dos limites estabelecidos pelo Programa de Garantia de Qualidade da União Européia – EUSQAP28, o Codex Alimentarius29, a Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos30 e por fim Programa Nacional de Controle Higiênico-Sanitário de Moluscos Bivalves (PNCMB). Embora tenha sido registrado que em alguns períodos do ano os níveis dessas bactérias foram mais elevados, os valores obtidos Figura 7 – Variação das médias do NMP de coliformes nunca ultrapassaram os limites estabelecidos totais presentes no tecido mole de Mytella guyanensis pelo PNCMB. em relação a sazonalidade. As barras são os respectivos A amplitude da variação da salinidade em desvios padrões (n=16). estuários é sempre muito alta, sendo possível encontrar neste ecossistema bactérias que DISCUSSÃO possuem adaptações para tolerar elevadas salinidades, bem como aquelas que vivem em As concentrações de coliformes encontradas águas com baixo teor de sal31. No presente estudo na M. guyanensis foram maiores que as verificou-se que houve uma correlação negativa encontradas na água, diferentemente dos entre a salinidade e o NMP de coliformes totais resultados dos estudos de Farias et al.24, Kolm e termotolerantes, semelhante ao observado & Absher25 , que indicaram maior contaminação por Ramos et al.32, na região estuarina da Lagoa na água do que nos moluscos. Resultados dos Patos, onde a concentração bacteriana observados nos estudos de Moreira et al.26 apresentou-se menor em águas onde ocorreram realizado em Paraty (RJ), demostrou que a salinidades elevadas. Em contrapartida, Silva concentração de bactérias fecais foi maior nos et al.33, estudando as bactérias fecais no moluscos que na água. Semelhantes achados estuário do Rio Cocó, CE, constataram que foram observados por Kolm & Absher25, em não houve correlação entre a salinidade e as estudo realizado no complexo estuarino de concentrações de coliformes. Estudo de Kolm e Paranaguá (PR), onde observaram que no verão Andretta31 demonstrou que em estuários onde a concentração de coliformes no tecido de ostras as variações de salinidade são muito grandes, há era maior que na água. Corroborando com os uma tendência de diminuição dos coliformes à resultados encontrados no presente estudo. medida que a salinidade aumenta, já que estes Farias et al.24 verificaram que os valores de NMP organismos não são muito resistentes às altas nas amostras de água e nos organismos, foram concentrações de sal. maiores principalmente na estação chuvosa Outros fatores podem contribuir para as (verão), resultados semelhantes ao do presente flutuações das concentrações de coliformes na estudo. A concentração de microrganismos na água, entre eles o aumento da temperatura, pois M. guyanensis indica o nível de contaminação simultaneamente há o aumento do metabolismo no momento da coleta, mas isso pode variar de dessas bactérias, acelerando sua reprodução e um animal para outro e também depende das elevando a concentração bacteriana nas águas condições ambientais e meteorológicas, bem em que se encontram. Os estuários podem como se o organismo estava filtrando ou em apresentar variações de temperaturas muito

Mundo da Saúde 2020,44:84-91, e0002020 altas34, condicionando concentrações maiores estatística para o verão. Outros trabalhos de coliformes onde os valores térmicos são chegaram a resultados semelhantes ao avaliarem mais elevados, o que pode explicar a correlação concentração de coliformes termotolerantes em positiva observada neste trabalho entre os ostras24,35,37. Estudos de Salles et al.15 , Batista 90 coliformes e a temperatura da água, a qual e Harari34, Doi et al.35 indicaram que águas concorda com os resultados obtidos por Doi et estuarinas podem apresentar elevados índices al.35 e Ristori et al.36. de coliformes termotolerantes no verão, assim Quanto à sazonalidade, verificou-se que como registrado no presente estudo, o que houve uma tendência de maior concentração pode ser explicado pela correlação positiva entre de coliformes no verão – período de chuvas, em concentração de coliformes termotolerantes e a comparação às outras estações, com diferença temperatura.

CONCLUSÃO

As variações do NMP de coliformes totais estiveram abaixo do padrão estipulado na e termotolerantes apresentaram correlação legislação vigente. positiva com a temperatura e negativa com a Conclui-se a importância do monitoramento salinidade, as variações sazonais observadas microbiológico de moluscos bivalves que são estiveram associadas às diferentes temperaturas, destinados para o consumo humano, para sendo que no verão houve a maior concentração atestar a sanidade do produto e também a saúde de coliformes nos tecidos das ostras. Apesar ambiental, afim de, evitar problemas de saúde desse aumento, todas as concentrações obtidas pública.

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Recebido em setembro de 2019. Aceito em dezembro de 2019.

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