Marlon Felix Pazian

CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Piabina argentea (TELEOSTEI, CHARACIFORMES, CHARACIDAE) DAS BACIAS DOS RIOS PARANAPANEMA E TIETÊ.

Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) do Instituto de Biociências de Botucatu, para a obtenção do título de mestre.

BOTUCATU-SP 2008

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Marlon Felix Pazian

CITOGENÉTICA DE POPULAÇÕES DE Piabina argentea (TELEOSTEI, CHARACIFORMES, CHARACIDAE) DAS BACIAS DOS RIOS PARANAPANEMA E TIETÊ.

Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) do Instituto de Biociências de Botucatu, para a obtenção do título de mestre. Orientador: Prof. Dr. Fausto Foresti

Botucatu - SP 2008

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“Para acumular conhecimento, acrescente uma coisa nova todos os dias. Para acumular sabedoria, descarte algo todos os dias”. Lao Tsé

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AGRADECIMENTOS

Com estas palavras espero conseguir expressar meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização desta dissertação.

Gostaria de agradecer primeiramente a Deus.

Agradeço ao CNPq pela bolsa concedida, que sem ela não poderia ter desenvolvido este projeto.

Gostaria de agradecer ao Prof. Dr. Fausto Foresti pela paciência, disposição, pelo entusiasmo e pela orientação.

Ao prof.Dr. Claudio de Oliveira por sempre estar pronto a ajudar no que foi preciso.

Ao Zeca, que sem ele hoje não estaria aqui, obrigado

Ao Artur, muito obrigado pelos ensinamentos como professor e como pessoa.

A Cristiane pela amizade, grande paciência e disposição para ajudar e pelas discussões e ensinamentos que foram muito úteis.

A toda minha família e em especial aos meus pais por sempre acreditarem em mim mesmo nos momento em que eu já não acreditava.

Ao Renato pela disposição em ajudar nas coletas, nas preparações cromossômicas e pelas nossas conversas.

Ao Igor o Heleno e o Treco por me acolherem em Botucatu por um mês.

Ao Alex (Alfinete), Celso, Dani, Fábio (Fio), Guilherme (Varvito), Heraldo,

Jefferson (Menudo), Kelly, Luiz (Ziriguidum), Márcio, Michele (Virgim), Mahmoud,

Tati e Vanessa, pelo companheirismo.

Aos amigos de longa data, Hugo e Marcio, em especial ao Hugo que agüentou dividir a mesma casa por um ano.

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A todos os integrantes do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes pela ajuda e companheirismo: Alex, Andréia Alves, Bruno, Claudinha, Celso, Cristiane,

Daniela, Emanuel, Fábio, Fernando, Gláucia, Gleise, Guilherme (Varvito), Guilherme,

Gustavo, Heraldo, Jefferson, Karina, Kelly, Lessandra, Luiz, Márcio, Marina,

Mahmoud, Natália, Patrícia, Renato, Ricardo, Tati, Vanessa, Zeca.

Também gostaria de agradecer ao Fábio, Fernanda, Diogo e Tati e todo o pessoal do Laboratorio de Genética de Peixes de Bauru pela colaboração.

Gostaria de agradecer aos integrantes da sessão de pós-graduação pela grande disposição em ajudar. Obrigado.

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Resumo

Foi realizada a análise citogenética de duas espécies do Gênero Piabina, P. anhembi e P. argentea, utilzando-se técnicas de coloração cromossômica convencional com Giemsa, localização das Ag-RONs, coloração com CMA3, hibridação in situ com as sondas de DNAr 18S e 5S e bandamento C. Todas as quatro amostras de P. argentea apresentaram 2n=52 cromossomos e números fundamentais diferentes, com exceção de duas amostras populacionais coletadas na bacia do rio Paranapanema. Três apresentaram Ag-RONs múltiplas (Avaré, Botucatu e Bauru) e a amostra da população coletada na localidade Itatinga apresentou Ag- RONs simples e um polimorfismo de tamanho das mesmas. A hibridação in situ com o uso de sondas de DNAr 5S mostrou diferenças entre as amostras das populações. O bandamento C marcou em sua maioria as regiões terminais e centroméricas dos cromossomos. As análises evidenciaram a existência de diferenças citogenéticas entre as amostras de P. argentea coletadas, sugerindo a existência de diferenciação populacional. As diferenças citogenéticas encontradas podem ocorrer devido ao fato de que P. argentea habite apenas riachos, o que poderia levar ao isolamento destas populações. Também foi analisada a amostra de uma população de P. anhembi coletada no município de Salesópolis, que também apresentou 2n=52 cromossomos, Ag-RONs simples e polimorfismos de tamanho das Ag-RONs. A hibridação in situ com a utilização da sonda de DNAr 18S mostrou três cromossomos marcados e com a sonda de DNAr 5S mostrou dois cromossomos marcados. O Bandamento C mostrou bandas nas regiões pericentromérica de dois pares cromossômicos nos exemplares desta espécie. Considerando-se o fato deste grupo habitar geralmente regiões específicas dos ambientes de cabeceira dos riachos, isto pode constituir um fator determinante de fixação de modificações pontuais ocorridas nos cromossomos, sem, contudo causar alterações na macroestrutura cariotípica das espécies.

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Abstract

Two species of the genus Piabina have been analyzed, P. argentea and P. anhembi using cytogenetic techniques (Staining of Giemsa, staining of Ag-NORs, fluorescent staining CMA3, hybridization in situ using probe of rDNA 18S and 5S and C-band). All samples of P. argentea presented 2n=52 chromosome and different fundamental numbers, with exception of the individuals of two population collected in the Paranapanema river basin. Three samples analyzed from Avaré, Botucatu and Bauru presented multiple NORs and individuals from Itatinga presented the single NOR and the polymorphic NOR. The in situ hybridization technique using the DNAr 5S probe showed differences between samples of all the populations. The technique C-banding showed marks in most of terminals and centromeric regions of the chromosomes. The existence of cytogenetic differences between the individuals of different samples collected of P. argentea, suggests a possible population differentiation. The occurrence of cytogenetic differences happened by the fact that P. argentea live only in upper stream rivers, and this can determine a process of population isolation. A sample of P.anhembi collected in the Salesópolis city was also analyzed and presented 2n=52 chromosomes, simple Ag-NORs and polymorphism of the NORs. The use of in situ hybridization technique with DNAr 18S probe revealed three labellad chromosomes, and with the rDNA 5S probe showed two labellad chromosomes. The technique of C-banding revealed the presence of heterochromatin in the pericentromeric regions of two chromosome pairs. The species Piabina argentea most of the time live in a specific environment in upper stream rivers. This possible isolation can fix spot modifications in the chromosome if it occurs. However this fact don`t change the macro structure of the chromosome in different generations.

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SUMÁRIO

1 - Introdução 1

1.1 - Aspectos sistemáticos e taxonômicos 1 1.2 - Aspectos citogenéticos 4

2 - Objetivos 8

3 - Materiais 9

3.1 - Materiais 9 4 - Métodos 11 4.1 - Métodos citogenéticos 11 4.2 - Estimulação de células mitóticas 11 4.3 - Obtenção de cromossomos mitóticos 12 4.4 - Coloração convencional com Giemsa 12 4.5 - Localização das regiões organizadoras de nucléolos (Ag- RONs), através da técnica de impregnação com nitrato de Prata 13 4.6 - Localização de heterocromatina constitutiva utilizando a técnica de bandamento C 14 4.7 - Coloração com o fluorocromo base-específico Cromomicina

A3 (CMA3) 14 4.8 - Hibridação in situ por fluorescência – FISH 15 4.9 - Estudos cariotípicos 18 4.10 - Montagem dos cariótipos 18

5 - Resultados 19

5.1 - Localidade Avaré-SP (Rio Novo) 19 5.2 - Localidade Botucatu – SP (ribeirão Araquá) 22 5.3 - Localidade Botucatu – SP (ribeirão Araquá) 25 5.4 - Localidade Bauru-SP (ribeirão Campo Novo) 28 5.5 - Localidade Salesópolis-SP (ribeirão Paraitinguinha) 31

6 - Discussão 35

7 - Conclusões 42

8 - Referências Bilbliográficas 43

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1 – INTRODUÇÃO

1.1 - Aspectos sistemáticos e taxonômicos

Os peixes constituem mais da metade do número total de espécies de vertebrados existentes (Pough, 2003). Segundo Nelson (2006), existem aproximadamente 54.711 espécies de vertebrados, das quais cerca de 27.977 são espécies válidas de peixes. Deste total, cerca de 26.761 espécies são Actinopterygii (peixes com nadadeiras raiadas), 10.100 são Chondrichthyes (tubarões, raias e quimeras), 108 são Myxinoidea e Petromyzontoidea (feiticeiras e lampréias) e oito são Actinistia e Dipnoi (celacanto e pirambóia). As demais 26.734 espécies de vertebrados estão incluídas no grupo dos tetrápodas (Nelson, 2006). A ictiofauna de água doce Neotropical é a mais rica de todo o planeta (Schaefer, 1998). De acordo com Reis et al. (2003), das 13.000 espécies de peixes de água doce existentes estimadas, aproximadamente 6.000 espécies encontram-se na região Neotropical, das quais 4.475 são consideradas válidas e cerca de 1.550 são conhecidas, porém ainda não descritas formalmente. A fauna de peixes de águas continentais do Brasil é a mais rica do mundo com cerca de 2.587 espécies já descritas e existindo ainda, muitas desconhecidas (Buckup et al., 2007). Dentro desse universo de espécies de água doce destacam-se os representantes da superordem Ostariophysi que representam 71% da ictiofauna de água doce neotropical (Fink e Fink, 1981; Reis et al., 2003). Entre os Ostariophysi, os Characiformes são peixes exclusivamente de água doce e encontram-se distribuídos nas Américas e na África, atingindo maior diversidade nas principais drenagens Neotropicais (Buckup, 1998). Esta ordem compreende 1.460 espécies divididas em 14 famílias, sendo quatro africanas e as demais Neotropicais (Reis et al., 2003). Os Characiformes apresentam uma grande variação na forma corporal, estrutura da mandíbula, dentição e anatomia interna (Vari, 1998). Além disso, nessa ordem são encontradas desde espécies predadoras, que alcançam cerca de 100 cm de comprimento total até espécies cujas formas adultas não ultrapassam 15 mm de comprimento total, as chamadas espécies miniaturas (Weitzman e Vari, 1988). A família Characidae é o grupo com maior número de espécies entre os Characiformes, abrangendo cerca de 12 subfamílias, 170 gêneros e 950 espécies

1 válidas (Reis et al., 2003), o que corresponde à aproximadamente 65% das espécies da ordem. Ao longo dos anos, essa família vem sofrendo várias modificações na sua classificação, mas muito pouco se conhece sobre as relações filogenéticas de seus membros constituintes. A própria condição de monofilia da família ainda é muito discutida. Entre os vários trabalhos realizados em diversos táxons de Characidae, o realizado por Lucena (1993) propôs a primeira hipótese filogenética abrangente para a família. Nesse estudo, o autor considerou a família Characidae monofilética e incluiu neste clado gêneros de Characiformes africanos e outros pertencentes às famílias Cynodontidae e Acestrorhynchidae. Estudos filogenéticos posteriores sugeriram diversos rearranjos na família Characidae, questionando profundamente sua monofilia (Lucena e Menezes, 1998; Weitzman e Malabarba, 1998; Zanata, 2000). Portanto, as dúvidas ainda existentes em relação à família Characidae, assim como muitas de suas subfamílias e gêneros, fazem com que não possa ser considerada monofilética, tornando necessárias análises cladísticas mais abrangentes a fim de investigar a monofilia de seus táxons e as relações destes com os demais Characiformes (Weitzman e Malabarba, 1998). A subfamília Tetragonopterinae, outrora considerada como a subfamília mais bem sucedida entre os Characidae, estando presente em quase todos os ambientes neotropicais (Géry, 1977), não pode ser reconhecida como monofilética, assim como muitos de seus gêneros mais especiosos (Weitzman e Malabarba, 1998, Malabarba e Weitzman, 2003). Recentemente, para assegurar a monofilia de Tetragonopterinae, somente o gênero Tetragonopterus foi mantido no grupo e todos os demais gêneros de Tetragonopterinae foram considerados Incertae Sedis em Characidae (Reis et al., 2003). Desta forma, dos 88 gêneros, envolvendo cerca de 620 espécies, anteriormente alocados em Tetragonopterinae, Cheirodontinae, Characinae, Bryconinae, Paragoniatinae e Aphyocharacinae, foram alocados como “Incertae Sedis” em Characidae (Reis et al., 2003). Entre esses gêneros estão alguns dos grupos com maior quantidade de espécies e taxonomicamente pouco conhecidos de Characidae, como Hyphessobrycon (97 espécies), Astyanax (86 espécies), Moenkhausia (58 espécies), Bryconamericus (51 espécies), Hemigrammus (43 espécies) e Creagrutus (64 espécies) (Reis et al., 2003). Portanto, somente as subfamílias de Characidae que apresentavam alguma evidência de monofilia foram mantidas no grupo, sendo elas: Clupeacharacinae (uma espécie), Agoniatinae (duas espécies), Tetragonopterinae (duas espécies), Roadsiinae (seis espécies),

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Aphyocharacinae (10 espécies), Stethaprioninae (12 espécies), Bryconinae (43 espécies), Cheirodontinae (46 espécies), Glandulocaudinae (50 espécies), Characinae (70 espécies) e Serrasalminae (72 espécies), num total de 79 gêneros e cerca de 325 espécies (Reis et al., 2003). O gênero Piabina anteriormente estava alocado na subfamília Tetragonopterinae. Devido à incerteza do monofiletismo de Teragonopterinae foi criado o grupo “Incertae Sedis” em Characidae, sendo que o gênero Piabina passou a fazer parte deste grupo (Reis et al., 2003). O gênero e a espécie tipo, P. argentea, foram descritos por Reinhardt em 1867. Em 1910, Eigenmmann descreveu uma nova espécie pertencente ao gênero Piabina que recebeu o nome de P. piquira. Posteriormente, P. piquira foi considerada sinônimo de P. argentea (Eigenmmann e Myers 1929). As outras duas espécies descritas até então como pertencentes ao gênero Piabina, P. analis (Reis et al., 2003) e P. Beni (Pearson, 1924), hoje pertencem, respectivamente, aos gêneros Piabarchus e Creagrutus (Reis et al., 2003). Vari e Harold (1998; 2001) chegaram à conclusão de que Piabina é um gênero monotípico, grupo irmão do gênero Creagrutus. Segundo Vari e Harold (2001), P. argentea ocorre em toda a bacia do alto Paraná, no nordeste do Paraguai e sudeste do Brasil (acima dos saltos de Guairá) e no rio São Francisco, rio Itapicuru, rio Paraíba do Sul e rio Itapemirim (bacias do leste do Brasil). Godoy (1975) reporta que a espécie P. argentea, no alto Paraná, fica apta à reprodução no mês de setembro. O autor também reporta que essa espécie, nas suas primeiras fases de desenvolvimento, alimenta-se de fitoplâncton e diversos grupos de insetos aquáticos (Chironomidae, Ephemerophtera, Odonata, Simulidae e Trichoptera). No conteúdo estomacal de exemplares desta espécie foram encontrados restos de insetos, pequenas sementes intactas, sementes trituradas e uma pequena quantidade de fitoplâncton. Da Silva e Kaefer (2003) descreveram uma nova espécie denominada Piabina anhembi para a região do alto rio Tietê. No entanto, ainda são escassas as informações sobre esta espécie.

1.2 - Aspectos citogenéticos

Nos primeiros estudos citogenéticos de peixes no Brasil a citogenética clássica era a mais utilizada. E relevou sua importância para tornar a área de pesquisa conhecida. No inicio, a maioria das publicações na área eram descrições cariotípicas

3 que incluíam dados de coloração convencional com Giemsa, bandamento C e a localização das RONs pelo Nitrato de prata (Ag-RONs). Neste período constatou-se uma grande diversidade nos cariótipos dos peixes neotropicais, com a descrição de variações numéricas, polimorfismos estruturais, cromossomos supranumerários e sistemas sexuais. Na última década, as metodologias usadas na citogenética de peixes passaram por várias modificações. Os cariótipos de várias espécies de peixes foram descritos e alguns cariótipos já descritos foram corroborados. Atualmente são estudadas a estrutura e composição dos cromossomos. Com a utilização de fluorocromos base-específicos, substâncias análogas de bases e enzimas de restrição foi possível a identificação e localização de segmentos cromossômicos específicos e também de genes, com a aplicação da técnica de Hibridação in situ com fluorescência (FISH). A hibridação de sondas de DNA em núcleos interfásicos e em cromossomos metafásicos é de grande auxílio na construção de mapas cromossômicos e na descrição dos cariótipos dos peixes. A fusão da citogenética básica e da citogenética molecular mostra um grande potencial no entendimento da estrutura e composições dos cromossomos. Neste sentido, considera-se que a citogenética molecular está ainda no seu início e poderá ser muito explorada (Foresti, 2008). Em uma análise geral, os dados citogenéticos disponíveis em peixes indicam que os estudos estão concentrados principalmente na fauna de peixes neotropicais. Segundo Oliveira et al. (2006) existem informações citogenéticas para cerca de 475 espécies de Characiformes, 318 Siluriformes, 48 Gymnotiformes, 199 espécies não pertencentes à superordem Ostariophysi e 109 espécies de peixes marinhos. Nestes dados, estão incluídos os números e a estrutura dos cromossomos e também informações a respeito da presença de cromossomos sexuais, supranumerários e a localização das regiões organizadoras de nucléolo (RONs) (Almeida-Toledo et al., 2000). Os estudos citogenéticos vêm demonstrando a enorme variabilidade cariotípica dos peixes, tanto em relação ao número de cromossomos quanto à morfologia. Segundo Almeida-Toledo et al. (2000), dentre as espécies de peixes neotropicais já estudadas citogeneticamente, o número cromossômico varia de 2n=20 em Pterolebias longipinnis (Oliveira et al., 1988) a 2n=134 em Corydoras aeneus (Turner et al., 1992), podendo ser identificados grupos de espécies bastante conservados em relação ao número e à morfologia dos cromossomos e também grupos bastante variáveis.

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Os primeiros estudos citogenéticos na família Characidae foram realizados por Post (1965), que relatou os números cromossômicos de 18 espécies. No trabalho de Falcão (1988), foi realizado um levantamento dos dados cariotípicos de 135 espécies de Characidae, evidenciando uma grande variabilidade cromossômica, com uma variação de 2n=28 em Hemigrammus sp (grupo neon) (Scheel, 1973) a 2n=64 para Serrasalmus holandi (Muramoto et al., 1968). No entanto, a maioria das espécies de Characidae apresenta números cromossômicos compreendidos entre 2n=48 e 2n=54 (Oliveira et al., 1988). Os peixes pertencentes à família Characidae possuem grande variabilidade de número e fórmula cariotípica entre espécies de um mesmo gênero (Falcão et al.,1984), e entre populações de uma mesma espécie (Moreira-Filho e Bertollo, 1991). Os Characidae “Incertae Sedis” possuem uma variabilidade cariotípica considerável, pois eles apresentam números diplóides que variam de 2n=28 até 2n=54 cromossomos (Oliveira et al., 2006). O gênero mais estudado é o Astyanax e as espécies desse grupo apresentam uma macroestrutura cariotípica não conservativa, em particular o complexo de espécies A. scabripinnis que possui números diplóides de 2n=46 (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Maistro et al., 2000;), 2n=48 (Maistro et al.; 2000; Alves e Martins-Santos, 2002;) e 2n=50 (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Maistro et al.,1998) com diversas fórmulas cariotípicas, padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva, número e posição das regiões organizadoras de nucléolo, além da presença ou ausência de cromossomos supranumerários. Entretanto, algumas famílias de Characiformes (Anastomidae, Curimatidae, Hemiodontidae, Paradontidae, Prochilodontidae) apresentam estabilidade na macroestrutura cariotípica com 2n=54 cromossomos tipo metacêntrico/submetacêntrico (Pauls e Bertollo, 1990; Galetti Jr et al., 1994; Margarido e Galetti Jr, 2000, entre outros). De acordo com Vari (1983), as famílias Anastomidae, Chilodontidae, Curimatidae e Prochilodontidae são filogeneticamente relacionadas, sugerindo-se que a similaridade cariotípica possa ser conseqüência da relação evolutiva entre esses grupos. Dados citogenéticos obtidos em diferentes populações de Piabina argentea demonstraram número diplóide de 2n=52 cromossomos, com várias fórmulas cariotípicas. Portela et al. (1988) descreveram o cariótipo de exemplares de P. argentea do rio Mogi Guaçu que apresentaram 2n=52 cromossomos (26M+SM/26ST+A). Wasko (1996) realizou uma análise citogenética em exemplares

5 dessa espécie, coletados no rio Piracicaba e descreveu número diplóide de 2n=52 cromossomos (2M+10SM+16ST+24A) e número fundamental igual a 80. Peres (2005) estudou exemplares de P. argentea da bacia hidrográfica do rio São Francisco e relatou para a espécie 2n=52 cromossomos (8M+14SM+16ST+14A) e número fundamental igual a 90. De acordo com os trabalhos descritos na literatura, a técnica de detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-RONs) por meio da impregnação por nitrato de prata, marca vários pares de cromossomos portadores das Ag-RONs (Portela et al.,1988; Wasko,1996). Entretanto, a população de P.argentea do rio São Francisco apresentou Ag-RONs simples (Peres et al ., 2008). A técnica de Ag-RONs é muito utilizada em vários organismos. No entanto, esta técnica possui limitações na sua interpretação, pois, o nitrato de prata liga-se apenas às proteínas associadas à estrutura nucleolar e não às regiões de DNA ribossomal, ou seja, ela identifica apenas as RONs que estiverem ativas na interfase precedente (Goodpasture e Bloom 1975; Miller et al., 1976; Hofgatner et al. 1979; Howell e Black 1980; Roussel et al, 1996; Zurita et al, 1997; Paintner-Marques et al, 2002; Gromicho et al, 2004). Já a coloração com fluorocromos GC específicos como a cromomicina A3 e a mitramicina MM, geralmente detecta nos peixes as Ag-RONs independente da sua atividade (Schimid, 1980). Porém, estes fluorocromos podem, em algumas espécies, evidenciar regiões heterocromáticas ricas em GC não associadas às Ag- RONs (Souza et al., 2001) ou mesmo deixar de marcar alguma região de DNAr 18S (Souza et al., 2001). A técnica de FISH que consiste em realizar uma hibridação com sondas de DNAr marcadas com compostos isotópicos ou não isotópicos em preparações citogenéticas, tem se mostrado eficiente na localização e investigação dos genes ribossomais (Long e Dawid 1980). Assim, pode-se identificar as Ag-RONs independentemente da atividade da região. O conhecimento sobre a localização cariotípica dos genes ribossomais 18S e 5S no genoma da espécie Piabina argentea por meio da técnica de FISH é ainda muito restrito. No trabalho de Peres et al. (2008), é descrito pela primeira vez a localização in situ de genes ribossomais 18S e 5S, Sendo o DNAr 18S observado na região terminal de seis cromossomos subtelocêntricos/acrocêntricos e o DNAr 5S também observado na região terminal, mas em dois cromossomos submetacêntricos e dois cromossomos subtelocêntricos/acrocêntricos. Estudos de bandamento C evidenciaram a presença de heterocromatina constitutiva nas regiões centroméricas, intersticiais e terminais em Piabina argentea

6 na população do rio Piracicaba (Wasko, 1996). No entanto, Peres (2005) descreveu bandas C positivas para região das Ag-RONs e para a região pericentromérica de alguns cromossomos em exemplares da população do rio São Francisco. Estudos realizados anteriormente em alguns grupos de peixes evidenciaram que em diversas bacias ou em diferentes tributários pertencentes a uma mesma bacia hidrográfica pode-se encontrar espécies ou até mesmo populações de mesma espécie distintas citogeneticamente (Bertollo et al., 2000). Assim, devido à pequena quantidade de estudos citogenéticos e a possível ocorrência de diferenças citogenéticas entre as espécies e entre as populações, faz-se necessário a realização de estudos citogenéticos de diversos grupos de peixes pertencentes às bacias hidrográficas dos rios Paranapanema e Tietê. Neste contexto, o presente trabalho visou estudar citogeneticamente populações de Piabina destas duas bacias. O estudo desse gênero se faz necessário devido às escassas informações existentes e a maioria destes estudos não serem detalhados, apresentando poucos dados para a espécie P. argentea. Já para a espécie P. anhembi ainda não existe nenhum trabalho citogenético disponível.

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2 - Objetivos

O presente trabalho consistiu em realizar a análise cariotípica de exemplares das espécies Piabina argentea e P. anhembi, a fim de identificar suas particularidades cromossômicas e avaliar a possível ocorrência de variabilidade entre as populações/espécies naturais existentes nas cabeceiras de alguns tributários dos rios Paranapanema e Tietê. Assim este estudo teve como principais objetivos: a) Caracterizar as populações/espécies de P. argentea e P. anhembi por meio da utilização de marcadores citogenéticos (Giemsa, Banda C, Ag-RONs e CMA3), e citogenéticos-moleculares (FISH) com a utilização de sondas dos genes ribossomais DNAr 5S e DNAr 18S; b) Contribuir com informações cariotípicas para a taxonomia desse grupo, bem como para o entendimento dos mecanismos envolvidos no processo de diversificação, ocorridos no sentido de esclarecer possíveis relações evolutivas entre as espécies.

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3 - Materiais e Métodos

3.1 - Materiais

No presente trabalho foram analisadas duas espécies de peixes do gênero Piabina, P. argentea e P. anahembi (Figura 01), capturadas nos componentes das bacias hidrográficas dos rios Paranapanema e Tietê. Todos os exemplares foram coletados utilizando-se peneirões e/ou redes de arrasto. Os exemplares coletados foram levados ao laboratório onde foram acondicionados em aquários e logo depois sacrificados e submetidos à análise cromossômica. Depois de sacrificados e analisados os exemplares foram fixados em formol a 10% e conservados em álcool 70% e se encontram depositados na Coleção do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes da UNESP de Botucatu, São Paulo.

Locais de Coleta

Os exemplares de P. argentea e P. anahembi foram cletados nas localidades abaixo relacionadas e constam na Tabela 01 e Figura 02. Piabina argentea Foram alisados exemplares de quatro populações de Piabina argentea num total de cinqüenta e sete exemplares, das seguintes localidades: - doze exemplares (04 machos e 08 fêmeas) da localidade Avaré, ribeirão rio Novo, bacia do rio Paranapanema, município de Avaré, São Paulo (S 23° 01’ 26.2’’ W 48° 49’ 32.6’’). - quatorze exemplares (05 machos 09 fêmeas) da localidade Itatinga, ribeirão Tamanduá, bacia do rio Paranapanema, município Itatinga, São Paulo (S 23° 13’ 50’’ W 48° 31’ 58’’). - onze exemplares (05 machos e 06 fêmeas) da localidade Botucatu, ribeirão Araquá, bacia do rio Tietê, município de Botucatu, São Paulo (S 22° 47.135’ W 48° 28.892’). - vinte exemplares (12 machos e 08 fêmeas) da localidade Bauru, ribeirão Campo Novo, bacia do rio Tietê, município de Bauru, São Paulo (S 22° 20’ 27.1’’ W 48° 56’ 05.0’’).

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Piabina anhembi Foram analisados exemplares de uma população dessa espécie, com uma amostragem constituída de dez indivíduos (07 machos e 03 fêmeas) da localidade Salesópolis, ribeirão Paraitinguinha, bacia do Tietê, município de Salesópolis, São Paulo (S 23° 30’ 40.3’’ W 45°51’ 32.6’’)

Figura 01 -. a) Foto de exemplar de P. argentea e b) Foto de exemplar de P anhemb i.

Tabela 01 - Sumário das espécies e populações de Piabina estudadas. Exemplares Localidade Bacia Espécie M F Hidrográfica Localidade P. argentea 04 08 Avaré Paranapanema Avaré-SP P. argentea 05 09 Itatinga Paranapanema Itatinga-SP P. argentea 05 06 Botucatu Tietê Botucatu-SP P. argentea 12 08 Bauru Tietê Bauru-SP P. anhembi 07 03 Salesópolis Tietê Salesópolis-SP (M=macho e F= fêmea)

Figura 02.- Mapa do Estado de São Paulo indicando os locais de coleta de exemplares de peixes do gênero Piabina. 1 Avaré (ribeirão Rio Novo); 2 Itatinga (ribeirão Tamanduá); 3 Botucatu (ribeirão Araquá); 4 Bauru (ribeirão Campo Novo); 5 Salesópolis (ribeirão Paraitinguinha). 10

4 - Métodos

4.1 - Métodos citogenéticos

Foram obtidas preparações cromossômicas dos exemplares de Piabina argentea e Piabina anhembi coletados para a caracterização citogenética pelos métodos de coloração convencional com Giemsa, detecção das Ag-RONs, bandamento C, coloração com o fluorocromo CMA3 e hidridação in situ fluorescente (FISH).

4.2 - Estimulação de células mitóticas

Com o objetivo de conseguir uma maior quantidade de células mitóticas nas preparações, foi utilizada a técnica de injeção prévia de uma solução de fermento biológico nos animais, descrita inicialmente por Cole e Levans (1971) para répteis e anfíbios e adaptada por Oliveira et al (1988) para peixes. Foi seguido o seguinte protocolo:

1) Preparação de uma solução de fermento biológico na seguinte proporção: 0,5 g de fermento, 0,5 g de açúcar e 7,0 ml de água destilada. A solução foi encubada em estufa por aproximadamente 20 minutos; 2) Injetou-se esta solução na região dorso-lateral do animal, na proporção de 1,0 ml para 100 g de peso vivo. O animal é então acondicionado em um aquário bem aerado e com a temperatura mantida em torno de 26º C por um período de aproximadamente 48 horas;

Algumas variações do procedimento acima citado foram testadas para se obter melhores preparações. A que apresentou melhores resultados foi a seguinte:

1) Preparar uma solução de fermento biológico na seguinte proporção: 0,5 g de fermento, 0,5 de açúcar e 14 ml de água destilada. A solução foi encubada em estufa por aproximadamente 20 minutos e injetou-se 0,5ml dessa solução para cada 100g de peso vivo. 2) Proceder á técnica de obtenção de cromossomos mitóticos.

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4.3 - Obtenção de cromossomos mitóticos

Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica anteriormente descrita por Egozcue (1971), Cestari (1973) e posteriormente adaptada para peixes por Foresti et al., (1981). Essa metodologia consiste em inibir a polimerização dos microtúbulos do fuso mitótico com a utilização de colchicina. A metodologia é descrita a seguir:

1) injetar solução aquosa de colchicina 0,025% (na proporção de 0,5ml/100g de peso do animal) intra-abdominalmente no animal com uma seringa, entre as nadadeiras peitorais e ventrais. Deixá-lo nadando livremente por 34 minutos. 2) sacrificar o animal para retirada do rim (região anterior), brânquias e testículos com o auxílio de tesoura e pinças de ponta fina; 3) colocar o tecido retirado em placa de Petri contendo 6,0 ml de solução hipotônica (KCl 0,075 M), dissociar o material, procurando obter uma suspensão de células. Para tal, primeiro deve-se dissociar o material com pinças de ponta fina, depois, homogeneizar com o auxílio de uma Pipeta Pasteur; 4) transferir a solução obtida para um tubo de centrífuga e manter em estufa a 37ºC durante 21 minutos; 5) retirar a suspensão celular da estufa, colocar 7 gotas de solução fixadora (metanol e ácido acético na proporção de 3:1, respectivamente) gelada. Agitar levemente a mistura com o auxílio de uma pipeta Pasteur. Deixar em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente; 6) adicionar cerca de 6,0 ml do fixador e novamente agitar a mistura. Levar para centrífuga a 1000 rpm por 10 minutos; 7) retirar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 6,0 ml de fixador. Centrifugar por 7 minutos a 1000 rpm; 8) centrifugar por mais 2 ou 3 vezes durante 7 minutos; 9) pingar o material em lâminas e secas ao ar livre.

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4.4 - Coloração convencional com Giemsa

As preparações cromossômicas depositadas nas lâminas passaram pelo seguinte processo de coloração: 1) hidrolisar o material contido na lâmina em HCL 1N a 60ºC por aproximadamente 3 minutos; 2) corar com solução de Giemsa a 5% em tampão fosfato (ph=6,7) por 10 minutos.

4.5 - Localização das regiões organizadoras de nucléolos (Ag-RONs), pela técnica de impregnação com nitrato de Prata.

As Ag-RONs foram localizadas utilizando a técnica descrita por Howell e Black (1980), com modificações. Foram utilizadas duas soluções:

Solução A: solução coloidal reveladora: dissolver 1,0 g de gelatina em 50,0 ml de água destilada. Acrescenta-se 0,5 ml de ácido fórmico.

Solução B: solução de nitrato de prata: 1,0 g de AgNO3 dissolvida em 2,0 ml de água destilada. O procedimento de coloração das RONs é o seguite:

Hidrolisar o material por 3 minutos em HCl 1N à temperatura de 60ºC; lavar em água destilada e deixar secar ao ar. Pingar sobre uma lâmina, preparada conforme a técnica adotada para cromossomos mitóticos, 1 gota de solução A a 2% (acrescida de ácido fórmico na proporção de 1,0 ml para cada 100,0 ml de solução) mantida em frasco escuro e em geladeira. Pode-se utilizar gelatina comercial sem sabor e incolor. Adicionar, sobre a gota anterior, 2 gotas de solução B a 50% mantida em frasco escuro e a 4oC. Misturar bem e cobrir com uma lamínula. Incubá- la no interior do banho-maria a 60o C, sobre um suporte, por aproximadamente 3 minutos. Após a preparação assumir uma tonalidade amarelada, lavar em água destilada, possibilitando que a lamínula seja retirada pela própria água. Pode-se corar com Giemsa a 5% diluído em tampão fosfato (pH 6.8), durante 20 a 30 segundos. Lavar em água corrente e deixar secar ao ar.

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4.6 - Localização de heterocromatina constitutiva utilizando a técnica de bandamento C

Para a obtenção de Bandas C, foi utilizada a técnica descrita por SUMNER (1972), com algumas modificações, que consiste em tratar o material preparado segundo a técnica descrita para obtenção de cromossomos mitóticos com HCl 0,2 N à temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar a lâmina em água corrente e deixar secar ao ar. Mergulhar a lâmina em solução aquosa de hidróxido de bário o (Ba(OH)2.8H2O) 5%, recém-preparada e filtrada, a 60 C, por aproximadamente 6 segundos. Para interromper a ação da solução de hidróxido de bário, submergir rapidamente a lâmina em solução de HCl 1 N e lavá-la em água destilada. Colocar a lâmina em solução salina 2xSSC a 60oC durante 30 minutos. Após este período, lavá- la em água destilada e deixar secar ao ar. Corar com solução de Giemsa diluída a 2% em tampão fosfato (pH=6.8), durante 15 minutos.

4.7 - Coloração com o fluorocromo base-específico Cromomicina A3 (CMA3).

Para a detecção de regiões ricas em pares de bases G-C foi utilizada a técnica descrita por SCHWEIZER (1976), empregando o corante CMA3. Esta técnica consiste em confeccionar a lâmina conforme a técnica descrita para cromossomos mitóticos, colocar sobre as lâminas uma solução de tampão

Mcllvaine + MgCl2 e cobrir com lamínula. Incubar em placa de Petri umidecida com o mesmo tampão por 10 minutos. Posteriormente retirar o tampão da lâmina com pipeta Pasteur e, sem lavar as lâminas, secar a parte de trás das mesmas. Após isso, depositar as lâminas em placa de Petri, colocar 150,0 )l de CMA3 (0,5 mg/ml), cobrir com lamínulas lavadas com etanol no momento do uso e deixar o conjunto dentro de uma caixa escura por 15 minutos. Então, retirar as lamínulas em tampão Mcllvaine lavando as lâminas vagarosamente nessa solução, incubar as lâminas em solução de Methyl-greem\Hepes por 15 minutos e lavar as lâminas em solução de Hepes\NaCl. Secar as lâminas e pingar uma gota de glicerol com 2,5% de propilgalato sobre elas, a seguir deve-se depositar uma lamínula para montagem de uma lâmina permanente. Deixar as lâminas no escuro e na geladeira por pelo menos 30 dias antes da análise.

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4.8 - Hibridação in situ por fluorescência – FISH

O protocolo descrito a seguir foi baseado nos procedimentos adotados por Pinkel et al. (1986) com modificações:

4.8.1 - Obtenção e Marcação da sonda

A sonda de DNAr 18S a ser utilizada na hibridação “in situ” fluorescente foi obtida através da PCR utilizando-se os oligonucleotídeos desenhados para a região do DNAr 18S, NS1 (5’ – GTAGTCATATGCTTGTCTC - 3’) e NS8 (5’ – TCCGCAGGTTCACCTACGGA – 3’) (White, 1990). A sonda de DNAr 5S foi obtida também através da PCR com a utilização dos oligonucleotídeos (primer A 5’ – TACGCCCGATCTCGTCCGATC – 3’ e primer B 5’ – CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC – 3’) segundo descrito por Wasko e Galletti (2000). A sonda foi marcada pelo método de nick translation utilizando o Kit BioNickTM Labeling System (Invitrogen). Utilizou-se o seguinte protocolo: a) para cada lâmina preparar um mix contendo: 1,0 μL 10x dNTP mix; 1,0 μL do DNA sonda (200ng/μL); 1,0 μL do mix de enzima; 6,0 μL de água Milli Q. b) misturar bem, centrifugar brevemente e incubar a 16ºC por 30 minutos; c) adicionar 1,0 μl de stop buffer, 1,0 μl de acetato de sódio 3M e o dobro do volume (22,0 μl) de etanol 100% gelado; d) misturar invertendo o tubo, centrifugar rapidamente e colocar em ultrafreezer (- 70ºC) por 1 hora; e) centrifugar por 15 minutos a 15.000 rpm a 4ºC; f) descartar o sobrenadante e adicionar 50,0 μl de etanol 70% gelado; g) centrifugar por 5 minutos a 15.000 rpm a 4º C; h) descartar o sobrenadante com cuidado e deixar secar; i) ressuspender em 12,0 μl de água Milli-Q.

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4.8.2 - Tratamento das lâminas

As lâminas podem ser preparadas com os cromossomos com um dia de antecedência ou no momento do uso. Para cada lâmina: a) colocar 100,0 μl de RNAse (0,4μl de RNAse 10mg/mL e 99,6μl de 2xSSC) sobre a lamínula, aderir a lâmina sobre esta lamínula e deixar em câmara úmida (umedecida com 2xSSC) a 37ºC por 1 hora e 30 minutos; b) lavar a lâmina duas vezes em 2xSSC durante 10 minutos cada; c) desidratá-las em série alcoólica 70%, 85% e 100% gelado durante 10 minutos cada; d) mergulhar a lâmina em formamida 70% em 2xSSC por 4 minutos a 70ºC (guardar a formamida para reutilizá-la no dia seguinte); e) desidratar em série alcoólica 70%, 85% e 100% a – 20ºC por 5 minutos cada (este passo é muito importante, pois as lâminas devem ser passadas rapidamente da formamida para o álcool). Deixar secar ao ar.

4.8.3 - Solução de hibridação

Em um tubo Eppendorf contendo 12,0 μl da sonda, adicionar 30,0 μl de formamida (concentração final 50%), 12,0 μl de sulfato de dextrano 50% (concentração final 10%) e 6,0 μl de 20xSSC (concentração final de 2xSSC). Desnaturar a sonda a 95º C por 10 minutos e passar imediatamente ao gelo.

4.8.4 - Hibridação

Colocar 60,0 μl de solução de hibridação sobre a lamínula e inverter a lâmina sobre a lamínula. Manter as lâminas com o material voltado para baixo em câmara úmida (2xSSC) a 37ºC de 12 a 18 horas.

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4.8.5 - Lavagens

Lavar em 2xSSC em temperatura ambiente apenas para tirar a lamínula e escorrer bem a lâmina sem deixar secar. Deste momento em diante as lâminas não podem secar: a) lavar em formamida 50%/2XSSC por 15 minutos a 37º C (utilizar a mesma solução do dia anterior – formamida 70% e transformá-la para 50%); b) lavar em 2xSSC por 15 minutos a 37ºC por uma vez; c) lavar em 2xSSC por 15 minutos à temperatura ambiente; d) lavar em 4xSSC à temperatura ambiente (só para enxaguar).

4.8.6 - Detecção e amplificação do sinal da sonda a) sobre uma lamínula colocar 0,1μl de avidina-FITC 0,07% em 70,0 μl de tampão C (0,1M de bicarbonato de sódio, pH 8,5 e 0,15M de NaCl); b) inverter a lâmina sobre esta lamínula e deixar por 1 hora em câmara úmida com 2xSSC a 37º C; c) após este tempo, lavar as lâminas 3 vezes por 5 minutos cada, com agitação, em

tampão de bloqueio (NaHCO3 1.26% / citrato de sódio 0, 018% / Triton 0,0386% em água destilada pH 8,0 e leite em pó desnatado 1%) recém-preparado a 42ºC. Escorrer a lâmina e secá-la por baixo; d) sobre uma lamínula colocar 80,0 μl de anti-avidina biotina-conjugada 2,5% (2,0 μl de anti-avidina estoque em 78,0 μl de tampão de bloqueio), inverter a lâmina sobre a lamínula e deixar em câmara úmida com 2xSSC a 37ºC por 30 minutos; e) novamente lavar em tampão de bloqueio três vezes por 5 minutos cada com agitação a 42ºC; f) repetir os passos de (a) até (e); g) aplicar novamente o FITC e fazer as lavagens como descrito no passo (e); h) lavar em 4xSSC/Triton 2% duas vezes por 3 minutos cada com agitação; i) lavar em 4xSSC/Triton 0,2% duas vezes por 3 minutos cada com agitação; j) escorrer as lâminas e deixar secando ao ar.

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4.8.7 - Montagem das lâminas

Secar a lâmina e montar com iodeto de propídio na proporção de 20,0 μl de meio de montagem antifading com 0,7μl de solução de iodeto de propídio a 50 μg/mL.

4.9 - Estudos cariotípicos

A partir dos dados obtidos através das análises e contagens dos cromossomos de cerca de 30 metáfases em cada indivíduo estudado, foi estabelecido o número diplóide modal para os exemplares de cada espécie. Assim sendo, as melhores metáfases, bem como as que apresentaram uma melhor dispersão e morfologia mais nítida dos cromossomos, foram fotografadas em fotomicroscópio digital (OLYMPUS BX-UCB) com objetiva de imersão de 100x, do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências de Botucatu (IBB). As preparações de FISH foram analisadas em microscópio de fluorescência. Foi utilizado nas análises das fotos o programa Adobe PhotoShop 7.0.

4.10 - Montagem dos cariótipos

Os cromossomos foram arranjados de acordo com os tipos metacêntrico (M), submetacêntrico (SM), subtelocêntrico (ST) e acrocêntrico (A), seguindo a classificação proposta por Levan et al., (1964), emparelhados com seus prováveis homólogos e organizados em ordem decrescente de tamanho para a disposição final do cariótipo.

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5 - Resultados

Foram analisados exemplares de quatro populações de Piabina argentea e uma de P. Anhembi. Entre as populações de P. argentea analisadas, duas são pertencentes à bacia hidrográfica do rio Tietê e duas pertencentes à bacia hidrográfica do rio Paranapanema (Figura 02). A população de P. anhembi foi coletada no rio Paraitinguinha, bacia do rio Tietê - Salesópolis/SP (Figura 02). Os resultados obtidos são apresentados a seguir por localidade:

5.1 - Localidade Avaré-SP (Rio Novo).

No rio Novo, bacia do rio Paranapanema-Avaré/SP, foram analisados 12 exemplares (04 machos e 08 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com Giemsa mostrou que os indivíduos da população do rio Novo apresentam número diplóide de 2n=52, (08M+16SM+12ST+16A) (Figura 03a) e número fundamental igual a 88 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das preparações cromossômicas por nitrato de prata marcou cinco cromossomos do tipo submetacêntricos (Figura 04b) e a distribuição de regiões ricas em GC com a utilização do fluorocromo CMA3, mostrou seis cromossomos com regiões ricas em GC na sua porção terminal (Figura 04a). A análise da distribuição da heterocromatina constitutiva mostrou a presença de blocos centroméricos e terminais em vários cromossomos (Figura 03b).

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Figura 03 - a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após coloração convencional com Giemsa, b) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após o emprego do bandamento C.

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Figura 04 - a) Metáfase somática após aplicação do fluorocromo GC especifico CMA3 de um exemplar de P. argentea. As setas indicam as regiões de cromomicina A3 positiva, b) Metáfase somática após impregnação com nitrato de prata. As setas indicam as regiões organizadoras de nucléolo (Ag- RONs).

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5.2 - Localidade Itatinga-SP (Ribeirão Tamanduá).

No ribeirão Tamanduá, bacia do rio Paranapanema-Itatinga/SP, foram analisados 14 exemplares (05 machos 09 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com Giemsa mostrou que os indivíduos dessa população apresentaram número diplóide de 2n=52 cromossomos, (06M+22SM+08ST+16A) (Figura 05a) e número fundamental igual a 88 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das preparações cromossômicas por nitrato de prata, a marcação ocorreu em dois cromossomos subtelocêntricos (Figura 05a) e detectou um polimorfismo de tamanho desta região (Figura 06b). A coloração por CMA3 mostrou um par de cromossomos subtelocêntricos com marcações na região terminal (Figura 06a). A hibridação in situ mostrou sítios ribossomais nos braços menores de um par de cromossomos subtelocêntricos, coincidentes com as marcações evidenciadas pela prata (Figura 06c). A hibridação in situ utilizando se a sonda de DNAr 5S evidenciou quatro regiões portadoras dos genes (Figura 06d). A análise de distribuição de heterocromatina constitutiva mostrou a presença de marcações centroméricas na maioria dos cromossomos e o braço menor de um par de cromossomos submetacêntricos completamente heterocromáticos (par 05) (Figura 06b).

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Figura 05 - a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após coloração convencional com Giemsa. No detalhe, os cromossomos portadores das Ag-RONs (par 15), b) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após o emprego do bandamento C.

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Figura 06 - a) Metáfase somática após aplicação do fluorocromo GC especifico

CMA3 de um exemplar de P. argentea. As setas indicam as regiões de cromomicina A3 positiva, b) polimorfismo de tamanho das regiões

organizadoras de nucléolo evidenciado por Impregnação por nitrato de prata

(01)(par 15), coloração com CMA3 (02) (par 15) e hibridação in situ utilizando a

sonda 18S (03)(par 15), c) Metáfase somática após aplicação da técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 18S. As setas indicam as regiões onde

estão presentes os genes DNAr 18S e d) Metáfase somática após aplicação da técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 5S. As setas indicam as

regiões onde estão presentes os genes DNAr 5S.

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5.3 - Localidade Botucatu – SP (ribeirão Araquá).

No ribeirão Araquá, bacia do rio Tietê - Botucatu/SP foram analisados 11 exemplares (05 machos e 06 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com Giemsa mostrou que os indivíduos possuem número diplóide igual a 2n=52 cromossomos, (08m+16SM+18ST+10A) (Figura 07a) e número fundamental igual a 94 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das preparações cromossômicas por nitrato de prata marcou quatro cromossomos, sendo dois submetacêntricos e dois subtelocêntricos (Figura 08b). A distribuição de regiões ricas em GC com a utilização do fluorocromo CMA3 mostrou dois cromossomos subtelocêntricos e dois submetacêntricos, coincidentes com as marcações obtidas com a prata (Figura 08c). A hibridação in situ utilizando a sonda de DNAr 5S evidenciou seis regiões portadoras dos genes (Figura 08d). A análise da distribuição da heterocromatina constitutiva mostrou–se restrita ás regiões centroméricas da maioria dos cromossomos do complemento cariotípico (Figura 07b).

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Figura 07 - a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após coloração convencional com Giemsa, b) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após o emprego do bandamento C.

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Figura 08 - a) Metáfase somática após coloração convencional com Giemsa, b) Metáfase somática após impregnação com nitrato de prata de um exemplar de P. argentea. As setas indicam as regiões organizadoras de nucléolo (Ag- RONs), c) Metáfase somática após aplicação do fluorocromo GC especifico

CMA3. As setas indicam as regiões de cromomicina A3 positiva e d) Metáfase somática após aplicação da técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 5S. As setas indicam as regiões onde estão presentes os genes DNAr 5S.

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5.4 - Localidade Bauru-SP (ribeirão Campo Novo).

No ribeirão Campo Novo, bacia do rio Tietê-Bauru/SP foram analisados 20 exemplares (12 machos e 08 fêmeas) de P. argentea (Tabela 01). A análise com Giemsa mostrou que os indivíduos da população desta localidade apresentaram numero diplóide igual a 2n=52, (08M+22SM+10ST+12A) (Figura 09a) e número fundamental igual a 92 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das preparações cromossômicas por nitrato de prata marcou três cromossomos submetacêntricos (Figura 10b) e a distribuição de regiões ricas em GC com a utilização do fluorocromo CMA3, mostrou quatro cromossomos com regiões ricas em GC na sua porção terminal (Figura10c). A hibridação in situ utilizando se a sonda de DNAr 5S evidenciou oito regiões portadoras dos genes (Figura 10d). A análise da distribuição da heterocromatina nos cromossomos mostrou que ela está distribuída nas regiões centroméricas na maioria dos cromossomos, estando localizada também na região terminal nos pares números dois, cinco e dezessete (Figura 09b).

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Figura 09 - a) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após coloração convencional com Giemsa, b) Cariótipo de um exemplar de P. argentea com 2n=52, após o emprego do bandamento C.

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Figura 10 - a) Metáfase somática após coloração convencional com Giemsa de um exemplar de P. argentea, b) Metáfase somática após impregnação com nitrato de prata. As setas indicam as regiões organizadoras de nucléolo (Ag- RONs), c) em destaque os cromossomo possuidores de regiões de cromomicina

A3 positiva (Pares 02 e 08), d) Metáfase somática após aplicação da técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 5S. As setas indicam as regiões onde estão presentes os genes DNAr 5S.

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5.5 - Localidade Salesópolis-SP (ribeirão Paraitinguinha).

No ribeirão Paraitinguinha, bacia do Tietê-Salesópolis/SP foram analisados 10 indivíduos (07 machos e 03 fêmeas) de P. anhembi (Tabela 01), a análise com Giemsa mostrou que os indivíduos da população do ribeirão Paraitinguinha apresentam número diplóide de 2n=52 cromossomos (8M+10SM+16ST+18A) (Figura 11a) e número fundamental igual a 104 (Tabela 02). Não foram encontrados polimorfismos cromossômicos ligados ao sexo nos indivíduos analisados. A impregnação das preparações cromossômicas por nitrato de prata marcou dois cromossomos subtelocêntricos (Figura 11a) e a distribuição de regiões ricas em GC com a utilização do fluorocromo CMA3, mostrou duas regiões marcadas na porção terminal de dois cromossomos subtelocêntricos, coincidentes com as marcações obtidas com a prata (Figura 12a). A hibridação in situ utilizando a sonda de DNAr 18S revelou três marcações (Figura 12c), a hibridação utilizando-se a sonda 5S evidenciou duas regiões portadoras dos genes (Figura 12d). A análise da distribuição da heterocromatina constitutiva mostrou a presença de blocos de heterocromatina constitutiva na região centromérica de alguns cromossomos, na região pericentromérica de dois pares de cromossomos subtelocêntricos (pares 10 e 12) e na região terminal de um par de metacêntricos (par 01) (Figura 11b).

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Figura 11 - a) Cariótipo de um exemplar de P. anhembi com 2n=52, após coloração convencional com Giemsa. No detalhe, os cromossomos portadores das Ag-RONs (par 21), b) Cariótipo de um exemplar de P. anhembi com 2n=52, após o emprego do bandamento C.

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Figura 12 - a) Metáfase somática após aplicação do fluorocromo GC especifico

CMA3 de um exemplar de P. anhembi. As setas indicam as regiões de cromomicina A3 positiva, b) polimorfismo de tamanho das regiões organizadoras de nucléolo evidenciado por Impregnação por nitrato de prata (01) (par 21), coloração com CMA (02) (par 21), c) Metáfase somática após aplicação da 3 técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 18S. As setas indicam as regiões onde estão presentes os genes DNAr 18S e d) Metáfase somática após aplicação da técnica de hibridação in situ com a sonda de DNAr 5S. As setas indicam as regiões onde estão presentes os genes DNAr 5S.

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Tabela 02: Representação das fórmulas cariotípicas, número fundamental, Ag-RONs, CMA3, Hibridação in situ utilizando as sondas de DNAr 18S e 5S, Bandamento C e localidades de coleta dos exemplares de P.argentea e P.anhembi. Ag- Espécie Localidade Fórmula cariotípica NF CMA3 5S 18S Bandamento C Autor RONs Portela et P. argentea Rio Mogi Guaçu-SP 26M,SM+26ST,A - 04 - - - - al. (1988) Wasko, P. argentea Rio Piracicaba-SP. 02M+10SM+16ST+24A 80 05 - - - Cen, Int, Ter, Per (1996) Peres P. argentea Três Marias-MG (São Francisco) 08M+14SM+16ST+14A 90 02 - 06 04 Per (2005) Presente P. argentea Avaré-SP (rib. Novo) 08M+16SM+12ST+16A 88 05 06 - - Cen e Ter trabalho Presente P. argentea Itatinga-SP (rib. Tamanduá) 06M+22SM+08ST+16A 88 02 02 04 - Cen e bh trabalho Presente P. argentea Botucatu-SP (rib. Araquá) 08M+16SM+18ST+10A 94 04 04 06 - Cen trabalho Presente P. argentea Bauru-SP (rib. Campo Novo) 08M+22SM+10ST+12A 92 04 04 08 - Cen e Ter trabalho Presente P. anhembi Salesópolis-SP (rib. Paraitinga) 08M+10SM+16ST+18A 104 02 02 03 03 Cen, Per e Ter trabalho (Int.=intersticial, bh.= braço curto heterocromático, Cen.=centromérica, Per.=pericentromérica, Ter.=terminal)

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6 - Discussão

A região de Botucatu possui uma situação geomorfológica particularmente interessante para o estudo de peixes, pois engloba parte da Cuesta Basáltica (Serra de Botucatu) e parte de depressão Periférica, apresentando relevo constituído por partes altas e baixas, com desníveis de 300 a 400 metros (Moreira e Camelier, 1977). Estas características possivelmente isolem populações de peixes, uma vez que a drenagem da região envolve rios que nascem na Cuesta e deságuam no Tietê e Paranapanema. Os dados citogenéticos obtidos dos exemplares das populações de P. argentea capturados na localidade Avaré, Itatinga, Botucatu e Bauru e da população de P. anhembi, de Salesópolis (Tabela 02), mostraram número diplóide de 2n=52 cromossomos e não foram constatadas diferenças entre os sexos, como é descrito anteriormente para P. argentea (Portela et al., 1988; Wasko, 1996; Peres, 2005). No presente estudo encontramos fórmulas cariotípicas distintas para cada população (Tabela 02). A existência de várias fórmulas cariotípicas nas diferentes populações de uma mesma espécie é comum no grupo dos peixes. Estudos realizados em Hoplias malabaricus evidenciaram que em diversas bacias ou em diferentes tributários pertencentes a uma mesma bacia hidrográfica podem ser encontradas populações distintas citogeneticamente (Bertollo et al., 2000). Isso ocorre porque algumas espécies possivelmente migrem pequenas distâncias ou não realizem migrações, ou possuam diferenças ecológicas, conservando uma identidade própria para cada grupo de indivíduos. Nas populações de P. argentea coletadas nos tributários dos rios Paranapanema e Tietê observou-se variação no número de braços dos cromossomos, com correspondente modificação das fórmulas cariotípicas, quando comparadas aos trabalhos existentes para a espécie. O número de braços em P. argentea variou de 80 a 94 (Tabela 02). A população de P. anhembi analisada apresentou número de braços igual a 104 (Tabela 02). Tal variação sugere a possível ocorrência de eventos não robertsonianos nos cariótipos destas espécies. Os valores de número fundamental (NF) das amostras analisadas por Wasko (1996) e Peres (2005) diferiram dos encontrados neste trabalho (Tabela 02). As duas populações do rio Paranapanema apresentaram o mesmo NF e isso

35 possivelmente ocorra em função da proximidade das cabeceiras dos riachos amostrados. No entanto, o NF das populações da bacia do rio Paranapanema é diferente dos observados para as duas amostras dos tributários do rio Tietê (Tabela 02). Além disso, o NF variou entre as amostras da bacia do Tietê. Nas quatro populações de P. argentea analisadas, em três foi constatada a existência de Ag-RONs múltiplas (Avaré, Botucatu e Bauru). Portela et al. (1988) e Wasko (1996) também relatam a ocorrência de Ag-RONs múltiplas para a espécie. A população de Itatinga apresentou Ag-RONs simples (Figura 05a) e, além de dois cromossomos marcados, foi encontrado também um polimorfismo de tamanho (Figura 06b), uma forma com o segmento duplicado e outra com o segmento simples. São observados indivíduos homozigotos para a forma não duplicada e indivíduos heterozigotos, porém nenhum indivíduo analisado apresentou a forma homozigota para a forma duplicada. Nos trabalhos anteriores é descrita a ocorrência de Ag-RONs simples apenas para uma população de P. argentea coletada na Bacia hidrográfica do rio São Francisco (Peres, 2005) no qual não foi evidenciado polimorfismo das Ag-RONs. A população de P. anhembi apresentou Ag-RONs simples (Figura 11a) e também apresentou polimorfismo de tamanho. Foram encontrados indivíduos homozigotos para a forma não duplicada, e indivíduos heterozigotos (Figura 12b), e, como na população de P. argentea de Itatinga, também não foram encontrados indivíduos homozigotos para a forma duplicada. No entanto, os indivíduos de P. anhembi que apresentaram o cariótipo heterozigoto teve apenas o homólogo que possui a duplicação marcado. O polimorfismo de tamanho das Ag-RONs é relativamente comum em peixes neotropicais (Foresti et al., 1981; Brum et al., 1998; Vicari., 2006; entre outros) e é descrito também para outras espécies, incluindo humanos (Markovic et al., 1978), suínos (Zenzes et al., 1977) e anuros (Ward, 1977). A ocorrência de polimorfismos dos sítios homólogos das Ag- RONs dos exemplares de P. argentea coletados pode ter ocorrido devido a permutas desiguais entre cromátides irmãs durante a meiose ou trocas entre cromátides irmãs ou ainda devido à duplicação envolvendo a seqüência desta região. O fato de encontrarmos somente a forma heterozigota do polimorfismo das Ag- RONs possivelmente seja devido ao tamanho da amostragem, ou a freqüência desse polimorfismo na forma homozigota ser um fenômeno de ocorrência de muito baixa freqüência nas populações estudadas. Numa hipótese alternativa o

36 polimorfismo na sua forma homozigota poderia apresentar um fenótipo letal, como proposto para a espécie Oncorhynchus mykiss (Porto-Foresti et al., 2004), determinando a sua ausência na população. A técnica de detecção das Ag-RONs tem sido exaustivamente estudada em peixes e é considerada um bom marcador citogenético, auxiliando em estudos citotaxonômicos das espécies (Galetti Jr, 1998). Esta técnica tem demonstrado a alta variabilidade da região das Ag-RONs nos diferentes grupos de peixes em termos de número, localização e tamanho dos cistrons ribossomais (Foresti et. al., 1981; Jesus e Moreira-Filho, 2003). A marcação de apenas um cromossomo do par que possui as RONs observado na população de P. anhembi (Figura 12b), poderia ser explicada também pelo fato de um dos cromossomos homólogos do par ter essa região inativa na interfase anterior. A aplicação da técnica de coloração por nitrato de prata permite evidenciar as Ag-RONs, mas apresenta a limitação de que a prata não se liga às regiões de DNAr mas sim às proteínas associadas a estrutura nucleolar, limitando-se a identificar apenas as Ag-RONs que estavam ativas na interfase anterior (Goodpasture e Bloom 1975; Miller et al., 1976; Hofgatner et al. 1979; Howell e Black 1980; Roussel et al, 1996; Zurita et al, 1997; Paintner-Marques et al, 2002; Gromicho et al, 2004).

A técnica de impregnação com cromomicina (CMA3), por sua vez, evidencia as regiões organizadoras de nucléolo, tanto ativas quanto as inativas, pois esta substância liga-se as regiões ricas em GC presentes na seqüência do DNAr (Schweizer, 1976; Schmid e Guttenbach, 1988 e Ozouf-Costaz e Foresti, 1992). No presente trabalho a coloração com CMA3 foi coincidente com as regiões organizadoras de nucléolo evidenciadas pela impregnação por nitrato de prata (Ag- RONs). Ajudou também a identificar as possíveis regiões de RONs inativas, que não foram reveladas pela técnica de impregnação por nitrato de prata, como no caso do polimorfismo das RONs identificado na espécie P. anhembi (Figura 12b), no qual havia sido evidenciado apenas um cromossomo do par portador da RON. Desta forma, a técnica de impregnação por cromomicina (CMA3) mostrou-se um bom marcador para identificar estas regiões nestas espécies. Para confirmar a localização das RONs nos cromossomos de indivíduos das populações analisadas foi empregada a técnica de hibridação in situ (FISH) com a sonda de DNAr 18S. Esta técnica vem sendo utilizada atualmente por ser mais confiável na identificação destas regiões, uma vez que ela se utiliza de sondas de DNAr previamente conhecidas e marcadas, as quais tem homologia com as regiões

37 a serem identificadas, evitando-se assim a obtenção de falsos-positivos. Esse fato pode ocorrer quando se aplica as outras duas técnicas (Ag-RONs e CMA3), que possuem algumas limitações já referidas. A técnica por Ag-RONs marca somente as

RONs ativas e a técnica por CMA3 marca regiões ricas em GC, podendo assim marcar, além das RONs, regiões heterocromáticas presentes ao longo do cromossomo, as quais também podem ser ricas em GC. No entanto, por limitações técnicas, só foi possível obter a marcação por 18S em duas das populações analisadas. As marcações obtidas para a população de P. argentea, de Itatinga (Figura 06c) e de P. anhembi, de Salesópolis (Figura 12c), corroboraram os dados obtidos pelas técnicas de Ag-RONs e CMA3. A técnica de hibridação in situ (FISH) utilizando a sonda de DNAr 5S marcou quatro cromossomos nas populações de P. argentea de Itatinga e Botucatu e seis na população de Bauru. Para a população de P. argentea de Avaré, por problemas técnicos, não foi possível obter pela sonda do DNAr 5S. Na população de P. Anhembi de Salesópolis foram obtidas marcações para um par de cromossomos. A localização nos cromossomos da região de DNAr 5S é descrita para mais de 60 espécies de peixes pertencentes a sete ordens, (Characiformes, Siluriformes, Acipenseriforme, Perciforme, Cypriniformes, Aguilliformes e Tetraodontiformes). Os estudos nestas ordens se mostram de grande importância para a compreensão da organização e estrutura das seqüências de DNAr 5S existentes nos cromossomos dos peixes (revisão Martins e Wasko, 2004). Em muitos vertebrados o gene DNAr 5S está em apenas um par cromossômico (Suzuki et al., 1996; Makinem et al., 1997). Em anfíbios (Schimid et al., 1987; Lucchini et al., 1993) e peixes (Martins e Wasko, 2004; Mazzei et al., 2004; Nirchio e Oliveira, 2006) o gene pode ser detectado em dois ou em vários cromossomos. No gênero Leporinus foi identificada a existência de mais de uma classe de DNAr 5S. E as classes de DNAr 5S identificadas consistiam de duas unidades, uma de aproximadamente 200 pb e a outra de 920 pb (Martins e Galetti, 2001). Cada classe apresentou seqüências distintas nos NTS (espaçador não transcrito) e estavam em pares cromossômicos distintos (Martins e Galetti, 2001). Nos Perciformes (Martins et al., 2002) e Salmoniformes (Pendás et al.,1994) observa-se a presença de dois tipos de repetições em tandem deste RNA ribossômico. Vários estudos tem identificado tipos variantes do DNAr 5S que são caracterizados por diferenças nos NTSs. Além das variações nos NTS, nestes segmentos genômicos também são encontrados

38 pseudogenes do DNAr 5S (Martins et al., 2002). Variações do DNAr 5S podem ocorrer, portanto, devido à presença de pseudogenes, inserções, deleções e mine repetições, os quais tem sido freqüentemente caracterizado para vários organismos (Suzuki et al., 1996; Baum e Bailey, 1997; Sadjak et al., 1998; Martins et al., 2002 e Alves-Costa et al., 2006). Nos Characidae encontramos como exemplo, em Astyanax, estudos que relatam um par cromossômico portador do gene DNAr 5S e em outras populações/espécies de Astyanax que mostram a existência de quatro cromossomos portadores do DNAr 5S (Ferro et al., 2001; Almeida-Toledo et al., 2002; Domingues, 2005; Mantovani et al., 2005; Vicari, 2006). Nos exemplares de A. scabripinnis estudados por Vicari (2006) foram encontrados quatro cromossomos portadores das regiões DNAr 5S, que também foram identificados em outros exemplares pertencentes ao complexo A. scabripinnis (Ferro et al., 2001; Almeida-Toledo et al., 2002; Mantovani et al., 2005). Já em Astyanax janeiroensis foi constatado apenas um par de cromossomos portador das regiões de DNAr 5S (Vicari, 2006). Estudo realizado na espécie A. altiparanae mostrou que apenas dois cromossomos possuíam marcações (Domingues, 2005). Na espécie P. argentea é descrita a ocorrência de quatro cromossomos que possuem as regiões DNAr 5S (Peres, 2008). Tais referências são coincidentes com os dados obtidos para a população de Itatinga analisada no presente trabalho (Figura 06d). No entanto, para a população de Bauru foram encontradas marcações em oito cromossomos (Figura 10d) e na população de Botucatu foram encontrados seis cromossomos marcados (Figura 08d), mostrando a utilidade dessa técnica como ferramenta na separação e identificação de diferentes populações como já demonstrado para representantes do gênero Astyanax (Ferro et al., 2001; Almeida- Toledo et al., 2002; Domingues, 2005; Mantovani et al., 2005; Vicari, 2006). Assim, para a espécie em estudo tal fato também foi evidenciado, tendo sido encontradas quatro ou seis marcações para P. argentea e apenas duas para P. anhembi (Figura 12d). A técnica de bandamento C realizada nas populações de P. argentea estudadas no presente trabalho marcaram regiões heterocromáticas nas posições terminais, no braço menor de um par de cromossomos e principalmente na região centromérica. Na população de Itatinga o braço menor do par de cromossomos submetacêntricos número cinco é heterocromático e o par dois possui um bloco de heterocromatina na

39 sua porção terminal. A população de Bauru também possui o braço menor do par seis heterocromático. Já na população de P. anhembi foram evidenciados blocos heterocromáticos na região pericentromérica dos pares número 10 e 12 (Figura 12b), que estabelece diferença visível com as das populações de P. argentea analisadas no presente estudo, além das marcações centroméricas e terminais em vários cromossomos. Os resultados do bandamento C marcaram, na sua maioria, as regiões centroméricas e terminais que são regiões importantes para o cromossomo, e possuem grande quantidade de DNA repetitivo. Apenas dois estudos realizados anteriormente relatam a distribuição de segmentos de banda C positivos (Wasko, 1996; Peres, 2005) para a espécie P. argentea. Os estudos relatam a presença de regiões heterocromáticas na região centromérica, intersticial, terminal e pericentromérica. Porém no presente trabalho foram evidenciadas marcações principalmente nas regiões centroméricas e terminais. A técnica de Bandamento C vem se mostrando muito útil nos estudos citogenéticos de peixes detectando eficientemente as regiões de heterocromatina constitutiva. Ela possibilita a detecção de diferenças na distribuição de heterocromatina cromossomal e tem sido considerada como um importante marcador em vários grupos de peixes neotropicais. As diferenças na distribuição de segmentos positivos de bandas C podem nos dar indícios para a caracterização de gêneros, espécies e populações (Mantovani et al., 2000). Entre as populações de P. argentea analisadas no presente trabalho foram encontradas diferenças cromossômicas que também foram observadas quando comparadas com os dados da literatura. Essas diferenças dão indícios da existência de populações estruturadas em cada local de coleta. Como a formação da Cuesta data de aproximadamente 13 milhões de anos e não há registro de fenômeno de captura de cabeceiras entre as bacias do Tietê e Paranapanema, considera-se que desde então o fluxo gênico entre as populações de uma mesma espécie que habitam os tributários do Tietê e Paranapanema só poderiam se manter através do rio Paraná (Caramaschi, 1986). Porém, segundo Lowe MC Connell (1969) os grandes rios tropicais poderiam se apresentar como barreiras físicas, químicas ou bióticas, que gerariam “isolamento geográfico” para as espécies de pequeno porte que habitam as cabeceiras de seus tributários. Desta forma, populações de diferentes tributários estariam isoladas, submetidas ao seu próprio e independente modelo de evolução. Em Lowe MC Connell (1999) é relatado que as espécies do

40 gênero Piabina são endêmicas de riachos na bacia do alto rio Paraná. Tais observações levariam a crer na hipótese de que os rios Paranapanema, Paraná e Tietê atuariam como barreiras que isolariam as diferentes populações de P. argentea, explicando assim, a ocorrência das diferenças citogenéticas nas populações coletadas. Análises moleculares utilizando marcadores do tipo microssatélite ou do DNA mitocondrial podem confirmar os resultados citogenéticos obtidos no presente trabalho sobre a origem e processos de diferenciação existentes nas diferentes populações de P. argentea nos tributários dos rios Paranapanema e Tietê.

41

7 - Conclusões

As análises citogenéticas realizadas em espécies e populações de peixes pertencentes ao gênero Piabina, capturadas em tributários das bacias dos rios Paranapanema e Tietê, permitiram concluir que: O gênero Piabina possui o seu número diplóide conservado. No entanto, nota-se uma heterogeneidade do ponto de vista citogenético nas populações analisadas, com a variação da estrutura dos cariótipos. A análise dos dados citogenéticos dos exemplares de P. argentea fornece indícios de que as populações formam grupos únicos em cada localidade estudada no presente trabalho, caracterizando citótipos específicos. O fato de existir uma conservação no número de cromossomos dos cariótipos desta espécie e diferentes fórmulas cariotípicas parece indicar que rearranjos estruturais dos cromossomos, possivelmente inversões ou translocações, estariam determinando o processo de diferenciação das fórmulas cariotípicas dos indivíduos destas populações.

42

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