Dinámica Ecológica Y Evolutiva De Las Chinches Del Género Dysdercus

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA UNIDAD XOCHIMILCO

DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD DEPARTAMENTO EL HOMBRE Y SU AMBIENTE LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

Informe final de servicio social

Dinámica ecológica y evolutiva de las especies del género Dysdercus presentes en las metapoblaciones de Gossypium hirsutum.

Para obtener el título de Bióloga presenta:

Atsiry Yareli López Fabila

Matrícula 208238586

ASESORES:

Dra. Ana Wegier Briuolo Mtro. Roberto Alejandro Terron Sierra Asesor Externo Asesor interno

Laboratorio de biotecnología forestal Departamento de Producción Agrícola y Animal Instituto Nacional de Investigaciones, Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco Forestales, Agícolas y Pecuarias

México, D.F. Fecha 13 de Octubre de 2014

Índice 1. Introducción 1 2. Revisión de literatura 2 2.1. Definición y dinámica poblacional de las especies plaga 2 2.2. Importancia económica y daños ocasionados por Dysdercus sp. en el algodón 4 2.3. Descripción de la especie y clasificación taxonómica del género Dysdercus 6 2.4. Ciclo de vida 6 2.5. Descripción de los factores ambientales en el ciclo de vida 8 2.6. Dieta 9 2.7. Migración 10 2.8. Enemigos naturales 11

3. Objetivos 12

4. Material y Métodos 12 4.1. Sitio de estudio y colecta de material biológico 12 4.2. Extracción de ADN, amplificación y secuenciación 14 4.3. Diversidad genética y pruebas de neutralidad 15 4.4. Red de haplotipos 15 4.5. Definición de escalas para el modelo de evaluación ecológica y evolutiva de una especie plaga 15

5. Resultados 16 5.1. Determinación taxonómica y Diversidad de la comunidad 16 5.2. Diversidad y estructura genética de las especies de Dysdercus 19 5.3. Diferenciación y flujo genético entre las poblaciones de Dysdercus 20 5.4. Modelo de evaluación del ecológico-evolutivo para Dysdercus sp. 20 6. Discusión 23 7. Conclusiones 26

8. Perspectivas 27

9. Referencias 27 10. Anexos 31 Anexo 1. Determinación taxonómica de Dysdercus sp. 32 Anexo 2. Laboratorio molecular: Protocolo de extracción de ADN para Dysdercus sp. , 33 Protocolo de amplificación y secuenciación para Dysdercus sp. Anexo 3. BLAST 35 Anexo 4. Mapa de la Distribución puntual y potencial de las especies de Dysdercus 38

Resumen.

Él carácter no específico de la presencia de Dysdercus en el algodón, ha hecho que esta especie sea difícil de combatir en los cultivos por medio de los métodos convencionales de aplicación masiva de insecticidas, ya que pueden refugiarse en otros hospederos, al tiempo que desarrollan. Por lo tanto es necesario entender los rasgos ecológicos y evolutivos de cada especie, que pueda ser potencialmente plaga. Mediante la comprensión de la estructura genética de una especie, se puede evaluar su potencial a largo plazo para adaptarse y ser resistente, más devastadora, y una plaga más invasiva. Por otro lado, el reconocimiento de ciertos rasgos de la historia de vida, pueden ayudar a predecir la abundancia y la distribución potencial de una especie. En este trabajo se llevó a cabo la determinación taxonómica y molecular (mediante la amplificación de gen mitocondrial Citocromo Oxidasa 1). Se determinaron ocho especies del genero Dysdercus presentes en las metapoblaciones de G. hirsutum de México. Para la estimación de la diversidad y estructura genética, se analizaron 99 individuos de cuatro metapoblaciones (MPN, MBB, MPS, MPC). La mayoría de los individuos poseen secuencias únicas, dando lugar a una gran diversidad de haplotipos (de 99 secuencias 38 haplotipos únicos) con una alta diversidad haplotípica (0.886) y una diversidad nucleotídica de π=0.057. El modelo de evaluación ecológica y evolutiva como especie plaga permitió obtener el área generada por las especies de Dysdercus dentro del sistema de múltiples ejes, obteniendo que la cuantificación de los diferentes factores representó de polígono trazado entre los umbrales tres y cuatro, se concluye que la categoría de especies plaga se encuentra en el nivel plaga moderada potencialmente plaga letal. Con la evaluación de cada rasgo se propone la aplicación de múltiples estrategias de control integrado a una escala amplia y al mismo tiempo la aplicación de múltiples estrategias como técnicas biológicas (hormonal, conocimiento del ciclo de vida), físicas (alternancia de cultivos), químicas (considerando la alternancia en la aplicación debido a la existencia de genotipos resistencias) y control manual.

Palabras clave: Dysdercus sp., citocromo oxidasa I, especie plaga, modelo ecológico y evolutivo, manejo integral.

1. Introducción

Los insectos plaga representan uno de los principales problemas del cultivo de algodonero (Gossypium hirsutum L.). Las especies del género Dysdercus, que se conocen como chinches manchadoras del algodón, incluyen a un importante número de especies de la familia Pyrrhocoridae que afectan a los cultivos en diferentes partes del mundo provocando daños por pudrición a los botones florales y daño a las plantas juveniles; retrasando su crecimiento (Stadler et al., 1987), teniendo efectos sobre el reclutamiento y en general sobre la biología reproductiva de la especie. La presencia de las chinches del genero Dysdercus en la planta de algodón puede tener repercusiones para su conservación en estado silvestre sobre todo considerando que las poblaciones silvestres de Gossypium hirsutum L. suelen tener tamaños censales reducidos. A pesar de la importancia económica y ecológica, se tiene poco conocimiento de la dinámica de las especies de Dysdercus asociadas al algodón en México, de la distribución geográfica de estas asociaciones, estructura y diversidad genética. El conocimiento ecológico evolutivo referente al género Dysdercus, puede contribuir a su manejo, ya que se conoce el éxito del establecimiento y su posible potencial como población invasora. La eficacia de una estrategia de control a largo plazo debe incluir también este análisis. Contribuir al entendimiento de estos factores que forman parte de la dinámica poblacional de las especies del género Dysdercus asociado a las plantas de algodón en México y con esta información aplicar un modelo que permita evaluar el alcance de cada uno y conocer el potencial de Dysdercus sp. para convertirse en especie plaga y obtener estrategias integrales de manejo a largo plazo de las especies de Dysdercus presentes en G. hirsutum en México. En la figura 1, se muestra la representación del modelo para la evaluación ecológica y evolutiva de una especie plaga propuesto por Cerritos et al. (2012), donde cada borde del gráfico representa un rasgo. Cuando todos los valores se conectan, se forma un polígono que representa el potencial de una especie a convertirse en una plaga y las características que se deberán tomar en cuenta para lograr un manejo eficiente a largo plazo.

Adecuación

Fig. 1. Modelo de evaluación ecológica-evolutiva de una especie plaga. Tomado de Cerritos et al. (2012).

2. Revisión de literatura 2.1. Definición y dinámica poblacional de las especies plaga Los insectos son un grupo muy diverso, representan casi el 60% de la diversidad existente en el planeta, poseen características únicas, como tiempos generacionales cortos, numerosa descendencia y por lo tanto grandes tamaños poblacionales. En la actualidad los insectos son el principal grupo más devastador de los agroecosistemas, produciendo graves pérdidas económicas, ocasionado el uso intensivo de insecticidas siendo el principal método de control a corto plazo para solucionar este problema. El uso de insecticidas como medida de control presenta seis problemas fundamentales que son irreversibles para el medio ambiente: 1) la evolución de las especies plagas resistentes a insecticidas; 2) erradicación de organismos no- blanco, 3) eliminación de las interacciones ecológicas; 4) modificaciones a los ciclos biogeoquímicos; 5) contaminación ambiental; y 6) impactos a la salud humana (Cerritos et al., 2012). Las poblaciones de insectos son reguladas básicamente por las relaciones ecológicas que sustentan, siendo la depredación y el parasitismo las interacciones más relevantes (Huffaker et al., 1984). Por lo tanto cuando los enemigos naturales de una especie plaga son eliminados, estas poblaciones pueden someterse a un incremento acelerado, de tal manera que se convierte en una plaga (Cerritos et al., 2012). En el contexto agrícola se denomina plaga a cualquier ejemplar que a determinado nivel de población o inoculo compite y causa daño económico sobre una especie animal o vegetal en cualquiera de las etapas de establecimiento, desarrollo o producción, o en el manejo posterior que el hombre hace de ella para su beneficio.

La severidad de una plaga depende de la biología oportunista de la especie para adaptarse al ambiente y las condiciones ambientales. Las plagas en general, surgen como consecuencia de las actividades humanas (Uvarov, 1964). Teniendo en cuenta que en la naturaleza estas especies suelen presentarse en densidades bajas, su número puede aumentar drásticamente cuando surgen las condiciones ambientales favorables (Domínguez, 1992). Según Nicholls (2008), un umbral se expresa como la densidad de la población o el nivel de la infestación; esta densidad o este nivel significan un punto importante en el desarrollo del cultivo en relación con el desarrollo de la plaga. Los umbrales dicen cuál nivel de infestación de una plaga se puede aceptar en un momento dado del desarrollo del cultivo, y cuál densidad de la población supuestamente causa daño y cuál no (Nicholls, 2008).

El umbral de control constituye aquella densidad de la población que tiene que ser controlada para prevenir que la población que está en aumento alcance el umbral de daño (Nicholls, 2008). La habilidad de pronosticar los daños que pueda ocasionar una plaga en un futuro cercano, con base en una estimación de densidad de población y su correspondiente relación con el grado de daño, depende de una mejor comprensión de la dinámica poblacional de la plaga (Nicholls, 2008). La dinámica de poblaciones plaga se refiere al desarrollo de dichas poblaciones en el tiempo y en su ambiente relacionado con los factores que regulan este desarrollo. La dinámica de poblaciones incluye la taxonomía, biología y comportamiento de la plaga en el contexto fenológico del hospedero, la distribución espacial, temporal, dispersión y migración (Nicholls, 2008). Los artrópodos plaga se distribuyen aproximadamente como su hospedante, desde el punto de vista de la colonización de hábitats pueden considerarse dos tipos de insectos: los buenos colonizadores, por ejemplo las especies de malezas, con alto potencial (capacidad reproductivo), adaptable e invasor, que se dispersan fácilmente, llamados estrategas-r esta estrategia caracteriza a los individuos que se reproducen por estación (en hospedantes efímeros), o durante el lapso que un hospedante perenne tiene renuevos, en este caso suceden explosiones poblacionales, dependiendo del cultivo y dependiendo del voltinismo o número de generaciones de la plaga “por temporada”. Los estrategas-K llamados los buenos competidores, tienen alta supervivencia, exhiben poblaciones estables, explotan ambientes estables y ganan en la competencia. La mayoría de las plagas (los áfidos y en general los insectos fitófagos) de los cultivos son estrategas-r (Nicholls, 2008). Las plagas surgen por tres razones principales (Uvarov, 1964; Speight et al., 1999.):

Aumento de los recursos: Las actividades humanas proveen a las especies de insectos con los mejores recursos cuando estos son ilimitados. Un buen ejemplo es el de las grandes extensiones de monocultivos que suministran una gran cantidad de alimentos. Decremento de los enemigos naturales por los métodos de control: Muchos parásitos, parasitoides y depredadores controlan el crecimiento de las poblaciones de insectos fitófagos y limitan su distribución y densidad. Introducción de especies exóticas: Cuando una especie se introduce en una nueva región, se puede multiplicar rápidamente debido a la falta de enemigos naturales y la abundancia de recursos.

2.2. Importancia económica y daños ocasionados por Dysdercus sp. en el algodón El algodón es un cultivo anual, por lo que no proporciona un nicho sostenible a largo plazo para el establecimiento de enemigos naturales. Sin embargo, proporciona una fuente continua de alimentos para una amplia variedad de plagas de insectos en toda la temporada, haciendo necesario el uso de insecticidas, que pocas veces ayudan a prevenir que la plaga sobrepase los umbrales de acción económica. Las plagas de insectos del cultivo de algodón, que están expuestas a la aplicación repetida de insecticidas han desarrollado resistencias, lo cual las ha convertido en las plagas más importantes en reducción de la eficacia de los insecticidas rociados, además de los impactos ambientales y económicos que esto ocasiona. El daño económico que ocasionan las especies del género Dysdercus es el efecto devastador en el algodón, ya sea por la pérdida de peso de semillas, contenido de aceite y calidad de las fibras ocasionadas por crecimiento de bacterias y hongos oportunistas que pueden afectar cuando los frutos son perforados por los insectos. El tipo de daño en el algodón puede ser de dos maneras: primario y secundario. El daño primario impacta de diferente manera según el desarrollo de la bellota; en bellotas jóvenes, el desarrollo de la semilla se verá afectado al secarse la semilla o la bellota completa, si presenta un daño más profundo. A pesar de que los excrementos de los estadios son incoloros, el de un adulto es de color amarillento y mancha la fibra del algodón, provocando que las fibras sean inútiles para poder comercializarse, principalmente porque las tinciones y blanqueados resultan disparejos, por lo que el manchado es permanente.

El daño secundario es más común, los hongos y las bacterias entran en las bellotas a través de los pinchazos del estilete dando lugar a una variedad de enfermedades de las cuales casi todas destruyen por completo las bellotas. Los síntomas de este tipo varían de pudrición húmeda a una podredumbre seca por completo del fruto. De los efectos secundarios el de mayor impacto es la enfermedad interna de la bellota, la cual es

4 causada por Nematosp.ora gossypii y otros hongos relacionados; estos son probablemente transmitidos de una planta a la otra, a través de las partes bucales del insecto (Van Doesburg, 1968). Los piquetes a las bellotas desarrollan puntos oscuros, circulares y hundidos; tanto los adultos como las ninfas tienen preferencia por las bellotas tiernas, aunque también pican los cuadros (botones en crecimiento) y bellotas maduras; para esto inyectan toxinas anticoagulantes y después chupan el contenido de las semillas en formación. Todo esto hace que las bellotas desarrollen fibra anormal, con lo que se produce una anastomosis dando como resultado una fibra manchada (Pacheco, 1996).

Varias especies de Dysdercus se han reportado en México, causando daños moderados al algodonero a nivel nacional. Pacheco (1985) refiriéndose a tres especies de chiches manchadoras en el noroeste de México menciona que, las especies de Dysdercus por si solas no causan daños de importancia a nivel regional, ya que las infestaciones fuertes son debidas a inmigraciones de hospedantes silvestres. En el sur de Sonora se han localizado solo focos de infestación, comúnmente en las orillas de los campos colindantes, con profusa vegetación silvestre o invaden los cultivos de aéreas baldías cercanas a los lechos de ríos y arroyos. De acuerdo a Pacheco (1996) las especies de Dysdercus que se han reportado para México como plagas del algodonero son: • D. mimus Say, 1832. • D. bimaculatus Stäl, 1854. • D. obliquus Herrich-Schaeffer, 1843. • D. flavolimbatus Stäl. 1861. • D. concinnus Stäl, 1861. • D. mimulus Hussey, 1929. • D. obscuratus Distant, 1883. • D. suturellus Herrich-Schaffer, 1842.

2.3. Descripción de la especie

Clasificación taxonómica del género Dysdercus

El orden Hemiptera comprende dos subórdenes, Homoptera y Heteroptera. El género Dysdercus pertenece al suborden Heteroptera y a la familia Pyrrocoridae grupo hermano de la familia Coreoidea. La familia Pyrrocoridae está representada en todas las regiones zoogeográficas pero es particularmente abundante en los trópicos y subtrópicos. El género Dysdercus comprende 75 especies (Van Doesburg, 1968). Es el único género presente en el viejo y nuevo mundo.

Una de las características más llamativas de las especies de Dysdercus del nuevo mundo es la amplia variedad de patrones de color, que se componen de amarillo, rojo, blanco y negro, así como todos los tonos intermedios de estos colores. En la mayoría de los casos el color de fondo es amarillo, en varias especies es de color rojo y en pocas es color negro. Estas especies miden entre 1.5 a 2.0 cm de longitud; son alargadas y oblongas (Pacheco, 1996). La cabeza, el callo de pronoto, el escutelo y la pleura torácica suelen ser de color rojo. A veces se producen manchas en la cabeza, a lo largo del margen posterior del pronoto y en el corion. Además, una difusión en negro puede extenderse sobre casi todas las partes más claras de las chinches, sobre todo en el dorso (Van Doesburg, 1968).

2.4. Ciclo de vida Las especies de Dysdercus, viven en grandes colonias sobre frutos que presentan lana o fibras abundantes, son de hábitos gregarios en sus estados inmaduros y adulto, formando colonias. Son muy activos y de hábitos diurnos. Son insectos multivoltinos, ya que tienen de cinco a seis ciclos gonadotrópicos. Los huevos y el primer estadio ninfal de Dysdercus son muy difíciles de observar, debido a que los pirrocóridos generalmente dejan los huevos debajo de la superficie del suelo y porque las ninfas del primer estadio no toman nada de comida solo agua (Kohno y Bui thi, 2005). Entre fines de agosto y mediados de septiembre se observan las primeras hembras grávidas, fácilmente identificables por su abdomen distendido. Las hembras depositan de 50 a 70 huevos en grupos aislados, depositan los huevos en lugares húmedos, en grietas del suelo o entre la hojarasca, libres, y la mayoría son de forma elíptica, con la superficie lisa y brillante, (Stadler et al., 1987), son sensibles a los cambios de temperatura y humedad (Schaefer y Ahmad, 2000).

Fig. 2. Morfología de Pyrrhocoroidea (Dysdercus fuscomaculatus Stål.). Figura. 2a vista dorsal; Fig. 2b vista lateral. Abreviaturas: ant: antena; atu: antenniferous tuberculoso ; Buc: búcula; cly: clípeo; cal: callos; cla:

clavus; lc: comisura claval; coa: área coStäl; col: collar; cor: corion; Cu: cúbito; CX1, CX2, CX3: plano, coxas medias y traseras; dis: disco del pronoto; fem: fémur; lab: labio; lam: Margen lateral del pronoto; M: media; man: mandíbula; mem: membrana; msp: mesopleuron; mss: mesotorácicos lóbulos supracoxal; mtp: metapleuron; mts: metatorácicos lóbulos supracoxal; per: peritrema de ostiolo, glándula de olor; ppr: brida propleural posterior; pms: mesopleural brida posterior; pmt: Brida metapleurales posterior; prp: propleuron; prs: protorácica lóbulos supracoxal; R: radio; scu: escutelo; tar: tarso; tib: tibia; ver: a) b) vértice, II-VII: esternitos abdominales II-VII. (Rédei et al.,

Presentan metamorfosis incompleta, las ninfas pasan por cinco estadios; son usualmente rojizas, con franjas negras, en el tercer y cuarto estadio las alas aun son pequeñas; en el cuarto y quinto estas llegan a estar bien desarrolladas. En unos 30 días se transforman a los adultos alados. En ese momento de su historia de vida pueden dispersarse a otros árboles, o pueden permanecer y reproducirse en el mismo sitio. Un árbol con semillas disponibles para más de cuatro semanas puede admitir más de una generación de insectos. El ciclo de vida es diferente para cada una especies de Dysdercus, por lo cual aún no se encuentra definido si estas diferencias están dadas por las características propias de cada especie o si se trata de estrategias adaptativas, plasticidad fenotípica como lo denomina Solbreck (1978) o simplemente “timming” o sincronización. La flexibilidad del ciclo de vida como lo define, es un hecho sumamente evidente y dependiente de múltiples variables. Este “timming” ligado a la producción, al desarrollo ninfal, a la migración y a la diapausa, depende no solamente de la dieta sino también de variables como la temperatura humedad relativa, precipitaciones y fotoperiodo (Derr, 1980). El apareamiento en estas especies es un comportamiento complejo y elaborado; pasan la mayor parte de su vida adulta copulando. El apareamiento es iniciado por el macho tratando de acercarse a la hembra de manera lateral, tocando su cuerpo con sus antenas (Nóbrega, 1989). La hembra puede rechazar al macho al salir corriendo o puede permitir la cópula, después de numerosas posiciones de cortejo. El macho asume la postura final de la copulación, posicionándose en una dirección diametralmente opuesta en relación con el cuerpo femenino (cola-cola de inserción). Durante la cópula, que puede durar tres días, las hembras pueden seguir alimentándose (Siddiqi 1988; Almeida 1994).

2.5. Descripción de los factores ambientales en el ciclo de vida Los principales factores que intervienen en la dinámica poblacional de las especies del género Dysdercus son: a) La “flexibilidad de su ciclo vital” (Derr, 1980). b) Los factores ambientales y meteorológicos. c) La alimentación desde el punto de vista cualitativo y cuantitativo. La interacción entre estos factores se encuentra en relación directa con fenómenos tales como la diapausa, migración, histólisis de los músculos alares y estos se encuentran a su vez relacionados entre sí. Los factores ambientales y meteorológicos actúan directamente sobre la migración y el ciclo de vida en general. La aridez y la alta temperatura detienen la actividad de adultos, estados inmaduros y finalmente, mata a los huevos y ninfas (Duviard, 1977). La alta mortalidad entonces se produce debido al hundimiento de las colonias de las ninfas a causa de la lluvia y a una enfermedad letal fúngal asociada con una alta humedad (Duviard, 1977), también las temperaturas elevadas inducen a la rápida maduración sexual y/o la consecuente reducción de la fase migratoria. En aquellas especies que habitan zonas menos cálidas, las variaciones en el ciclo de vida se encuentran relacionadas con el fotoperiodo (Danielevskhii, 1965). El inicio y finalización de la diapausa se encuentran relacionados especialmente con la temperatura y el fotoperiodo, mientras que el desarrollo embrionario depende directamente de las precipitaciones y la temperatura. Los efectos de las condiciones ambientales sobre los ciclos de vida son muchas veces profundos y complejos. Para D. albofasciatus se conoce que en ambientes naturales sobrevive al invierno en diapausa; ésta finaliza en agosto, cuando se inicia el período pre-reproductivo. A principios de septiembre, con el incremento de las marcas térmicas y del fotoperiodo, comienza el período reproductivo. A mediados de septiembre, en función del incremento de las precipitaciones y la temperatura se producen las primeras oviposiciones. El período pre-reproductivo se extiende de cinco a ocho días, la primera oviposición se produce entre los 20 y 28 días después de la última muda y el ciclo de vida completo, de huevo a adulto, se desarrolla entre los 25 y 61 días. La diapausa comienza entre marzo y abril, a causa de la disminución de las marcas térmicas y del fotoperiodo. La "flexibilidad del ciclo vital" de D. albofasciatus le permite adoptar estrategias alternativas durante el desarrollo. De acuerdo a las condiciones meteorológicas y a la disponibilidad de alimento, éste puede migrar, postergando el período reproductivo; reproducirse, evitando la fase migratoria o comenzar la diapausa, postergando la reproducción (Stadler et al., 1987).

Un análisis genético cuantitativo de los caracteres del ciclo de vida de Dysdercus bimaculatus ha proporcionado una cierta comprensión de las fuerzas de la selección natural que configuran los caracteres del ciclo biológico de este insecto. Selección direccional y la imprevisibilidad del medio ambiente son dos factores que influyen en la variación fenotípica de diferentes rasgos de historia de vida. Las estrategias de historia de vida de las especies de Dysdercus puede ser entendida bajo términos de su adaptación a los patrones temporal de floración y fructificación de sus plantas hospederas. Derr et al. (1981) estudia y categoriza las estrategias de la historia de vida de las especies americanas y africanas de Dysdercus de acuerdo a la fenología de sus plantas hospederas. Esta gran plasticidad fenotípica permite que las especies puedan prosperar bajo una amplia gama de condiciones ambientales.

2.6. Dieta En el medio natural Dysdercus es predador de semillas de muchos hospederos de malváceas de árboles con gran dehiscencia de frutos tales como, Andansonia, Ceiba, Thesp.eciea, Sterculia, una variedad de hierbas y arbustos (Gossypium, Hibiscus, Sidae). Las ninfas y adultos se alimentan tanto de la semilla verde y turgente como de la seca (aún de aquellas que se encuentra caídas en el suelo, aunque en general todos los estadios muestran predilección por las semillas verdes y turgentes). Las experiencias de Berridge (1965) establecen que las especies de Dysdercus se alimentan perforando las semillas de sus plantas hospederas e introduciendo saliva en función de una predigestión enzimática. Dysdercus albofasciatus en su ambiente natural y laboratorio se alimenta de semillas, frutos y flores de Pavonia malvácea. En la mayoría de los hospederos y especialmente en los grandes árboles, las chinches arriban y colonizan después del inicio de la temporada seca de fructificación. Los insectos llegan por vía aérea durante el día atacando masivamente los frutos del árbol donde se instalan los individuos en estado inmaduro (Dingle, 1996). Para las especies de Dysdercus mejor estudiadas, se han elaborado listas de hospederos silvestres y el algodón se encuentra citado como hospedador alternativo. Ballard y Evans (1928) por ejemplo sostienen que D. sidae Montr encuentra a Gossypium sep. en forma accidental durante su migración ya que D. sidae se alimenta de frutos de Sida sep., Malvastrum sep. y otras plantas que se encuentran en los márgenes de las plantaciones de algodón. Dysdercus en general muestra poca especificidad en la dieta, entre las malváceas. El agua es uno de los principales factores limitantes para el desarrollo de las especies de este género la posibilidad de alimentarse depende de los recursos de agua disponibles para producir saliva, manteniendo simultáneamente el balance iónico del medio interno (Berridge, 1965).

Para el desarrollo normal del ciclo de vida de D. albofasciatus es indispensable la presencia de agua en forma líquida y una humedad relativa no menor de 60%. Especialmente durante el desarrollo embrionario se requieren condiciones de saturación. Los individuos adultos utilizan diferentes estrategias, la forma más directa es incorporar agua es por succión a partir de una gota de agua libre. En ausencia de agua libre, D. albofasciatus parece utilizar distintas especies vegetales, optando por aquellas plantas o sus partes con epidermis y cutinas delgadas. Saxena (1962) observa que D. koenigii succiona de la semilla de algodón para satisfacer sus requerimientos nutricionales, y de la hoja de algodón para satisfacer sus requerimientos hídricos. Según Derr (1980) para Dysdercus bimaculatus las fuentes de las que obtienen agua son a partir de: a) El contenido de agua libre de la propia semilla. b) El agua de la vegetación próxima. c) El agua del cuerpo de otros insectos, inclusive los conespecíficos. Los actos de canibalismo son protagonizadas en general por hembras grávidas (próximas a la oviposición) debido al estrés de humedad ya que sucede sólo en situaciones donde el agua libre a disposición es escasa o nula (Derr, 1980). Puede decirse que el canibalismo es la última opción, ya que implica una importante pérdida de agua y energía para sostener prolongadas persecuciones o enfrentamientos. El canibalismo permite extraer agua, proteínas y lípidos de las presas (Stadler et al., 1987).

2.7. Migración De acuerdo a la teoría de la colonización (MacArthur y Wilson, 1967) las características de los insectos migrantes responden a distintos aspectos: El comportamiento locomotor aumenta mientras que el comportamiento vegetativo, como la alimentación y la reproducción son suprimidos. La migración usualmente ocurre antes del periodo reproductivo en los insectos adultos (síndrome de oogénesis-flight). Ya que los individuos migrantes son por lo general prereproductivos, sus valores reproductivos y por lo tantos sus capacidades colonizadoras se encuentra en o cerca del máximo. Los migrantes normalmente residen en hábitats temporales. Los migrantes tienen un alto potencial de crecimiento de la población, estrategas r, que también es ventajoso para los colonizadores. Tanto los parámetros fisiológicos y ecológicos de la migración son modificables por factores ambientales (es decir, fenotípicamente modificable) para adaptarse a las condiciones imperantes. Tomados en conjunto, estos

10 criterios establecen una teoría comprensiva y bosquejan la estrategia básica para los insectos migratorios. Esta estrategia básica es modificada para adaptarse a las exigencias ecológicas de las especies individuales. El periodo migratorio para Dysdercus varía en extensión de año a año y depende a su vez de variables tales como: alimento disponible, condiciones meteorológicas y ambientales, duración de la diapausa etcétera (Derr, 1980). La migración es un fenómeno previo a la oogénesis en adultos jóvenes, en los que posteriormente la reducción de la capacidad de vuelo es un fenómeno simultáneo con el incremento de la reproducción “oogenesis-flight síndrome” (Dingle y Arora, 1973). Esta estrategia le permite escapar de ambientes desfavorables o en procesos de deterioro y colonizar ambientes más propicios, para iniciar luego una fase de rápido aumento. Durante el periodo migratorio los adultos hacen vuelos nocturnos, los cuales terminan al descubrir su planta hospedera, seguido de un periodo reproductivo y sedentario. Los vuelos migratorios que realizan son dependientes de las condiciones climáticas correctas: luz solar, temperatura y humedad atmosférica (Duviard, 1977). Los machos de Dysdercus son, capaces de volar durante toda la vida. La histólisis muscular no ocurre excepto en unos pocos individuos viejos (Dingle y Arora, 1973) y la mayoría, por lo tanto, conservan su capacidad de vuelo a medida que envejecen. Esto implica que en las poblaciones silvestres los machos son capaces de realizar movimientos, al menos, de corta distancia para buscar pareja. En las hembras es diferente, una vez que empieza a alimentarse de las semillas, las hembras inmigrantes histolisan sus músculos alares, comienza el desarrollo de un gran número de huevos y algunas veces una reproducción explosiva (Dingle y Arora, 1973; Fuseini y Kumar 1975, Derr 1980). La proteína que se origina de la histólisis de los músculos alares es removida y transferida a los ovocitos. Los machos viven más que las hembras con el resultado de que es probable que sean más numerosos en una población dada. En estas circunstancias es probable que sea selectivamente ventajosa la conservación de la movilidad (Dingle y Arora, 1973).

2.8. Enemigos Naturales La mayoría de los pyrrocóridos son aposemáticos y por lo tanto desagradables a los predadores, tales como vertebrados. Pero algunos a pesar de su color de advertencia son comidos por aves y anfibios. Las aves juegan un papel menor en el control de algunas especies de Dysdercus. Van Doesburg (1968) lista algunas aves reportadas como predadoras de Dysdercus de forma limitada en el neotrópico (Schaefer y Ahmad,

2000). Entre los artrópodos

11 se encuentran importantes enemigos naturales, los taquínidos insertan sus huevos dentro del cuerpo de las ninfas en segundo estadio. Acaulona peruviana Townsend y Paraphorantha peruviana Townsend se han reportado como enemigos en Dysdercus sp. En Perú Dysdercus howardi Ballou y D. howardi var. mino ballou son ocasionalmente parasitados por especies de Trichopoda. Se ha observado que Megilla maculata var. (Coleóptera) se alimenta de larvas jóvenes de D. andreaae L. Ballard y Evans (1928), por otra parte asignan a los ácaros parásitos de D. sidae un especial valor como elementos de control, dado que destruyen alas y ovarios: sostienen además que afectan la migración del hemíptero. A pesar de que existen enemigos naturales para Dysdercus, ninguno de estos predadores y parásitos son suficientemente abundantes o funcionan como hospederos definitivos para controlar a las chinches manchadores del algodón. Schaefer y Ahmad (2000) sugieren la eficacia de Phonoctonus como un agente de control de Dysdercus.

3. Objetivos Contribuir al manejo y conservación a largo plazo de las poblaciones de G. hirsutum de México mediante una aproximación de un modelo ecológica-evolutiva del género Dysdercus.

Objetivos particulares

• Determinar las especies del género Dysdercus presentes en las poblaciones de G. hirsutum. • Estimar la diversidad de la comunidad, y la estructura genética de las poblaciones de Dysdercus sp. asociadas a G. hirsutum en México.

• Complementar la información (ecológica y evolutiva) referente al género Dysdercus. • Proponer la aplicación del manejo integrado de control a largo plazo para Dysdercus sp.

4. MATERIAL Y MÉTODOS 4.1. Sitio de estudio y colecta de material biológico Se realizaron salidas para muestrear en seis de las ocho metapoblacines de Gossypium hirsutum de México; se colectaron 300 individuos en las metapoblaciones de: Pacífico norte (MPN), Bahía de Banderas (MBB), Pacífico centro (MPC), Pacífico sur (MPS) y Península de Yucatán (MPY) y la metapoblación Baja california sur MBCS, donde no se obtuvieron registros de Dysdercus.

La colecta se realizó de manera manual colectando solo las chinches en estadio maduro y que se encontraban sobre las plantas de algodón. Cada ejemplar se guardo en un tubo Eppendorf de 1.5 mL con alcohol de caña al 70%, etiquetado (por dentro con papel albanene y lápiz y por fuera con plumón indeleble) con los siguientes datos: el nombre de la localidad, fecha, hora, clave de determinación de la planta de algodón y parte de la planta donde se encontró al individuo. Las muestras fueron almacenadas a temperatura de -20 °C para conservar el ADN. Posteriormente para la determinación de los ejemplares se separaron en machos y hembras, si la punta del ápice presentaba parámero era macho y si solo se observaba la cápsula genital sin parámero se asignaba a las hembras. La determinación de las especies de Dysdercus colectadas se realizó siguiendo las claves taxonómicas de Van Doesburg (1968) y se comparó con el material biológico de la Colección Nacional de Insectos del Instituto de Biología de la UNAM.

MBCS

Fig. 3. Mapa de la distribución de las ocho metapoblaciones de G. hirsutum en México. Las metapoblaciones donde se realizaron las colectas de Dysdercus sp. están en círculos y codificadas de la siguiente manera: Baja california sur (MBCS): fucsia; Pacífico norte (MPN): gris; Bahía de Banderas (MBB): rojo; Pacífico centro (MPC): rojo oscuro; Pacífico sur (MPS): naranja; Golfo norte (MGN): de color verde oscuro; Golfo sur (MGS): morado; y la Península Yucatán (YPM): azul fuerte.

♀ ♀ ♂

Cápsula genital

Parámero

Fig. 4. Criterios para la determinación de los ejemplares macho y hembra de Dysdercus sp. Izquierda, la punta del ápice presenta parámero por lo tanto se toma como macho. Derecha, se observaba la cápsula genital sin parámero, se asigna a las hembras.

4.2 Extracción de ADN, amplificación y secuenciación El ADN se extrajo de las patas de las chinches; según el tamaño de la chinche se usaron de tres a cinco patas, siguiendo una modificación del protocolo CTAB 2% (Doyle y Doyle, 1990), moliendo el tejido con nitrógeno liquido y buffer de extracción (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 1.4 M, EDTA 20 mM, Betamercaptoetanol al 0.2%) e incubando en Proteinasa K (20 mg/mL Thermoscientific) 4 µL por cada muestra durante 1 h a 65 °C (Anexo 2). Se realizó la amplificación de la región mitocondrial 5' Cytocromo C oxidasa subunidad I de un tamaño de 658 pares de bases usando el set de primers Lep-F1 (5´- ATTCAACCAATCATAAAGATAT-3´) y Lep-R1, (5´-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAA-3´). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µL. Las concentraciones finales de los reactivos fueron los siguientes: Buffer 0.25X, MgCl2 1.25 mM, dNTPs 1.25 mM, 1.25 pM primers F y R, Taq DNA polimerasa 0.25 U/µL. En un termociclador Marca TECHNE PrimeQ se usó el siguiente programa para la amplificación del COI: 95°(1´), 35 ciclos 95° (15´´), 45° (15´´), 72° (1´) y 72° (7´) (Anexo 2). La visualización de los productos de PCR se llevó a cabo en gel de agarosa TBE 1X al 2,0% teñidos con Bromuro de etídio. Las secuencias de la región COI fueron generadas en el Laboratorio de High-Throughput Genomics en la Universidad de Washington. Las secuencias de nucleótidos fueron editadas y alineadas usando MAFFT 4.0 (Katoh y Toh, 2008) Posteriormente se realizó una búsqueda de las secuencias en las bases de datos The Barcode of Life Data System (BOLD) y NCBI para comparar con las especies determinadas taxonómicamente.

4.3. Diversidad genética y pruebas de neutralidad Para cada una de las metapoblaciones se calcularon diversos parámetros de la diversidad genética entre poblaciones (FST) número de sitios segregantes (S), número de haplotipos (Nhap), diversidad de haplotipos (Hd) que es una medida de la variación de la población, que mide la probabilidad de diferente. Se calcula con la fórmula descrita por Nei y Tajima (1981). Se calculó la diversidad nucleotídica (π) que se refiere al número de nucleótidos diferentes por sitio entre dos secuencias tomadas al azar (Nei y Li, 1979). Y el índice de polimorfismo (θ) que es calculado a partir de la expresión θ = 4 Neμ (Kimura, 1968). Estos estadísticos se obtuvieron utilizando el programa DnaSP v.5 (Librado y Rozas, 2009). Para analizar los cambios en la historia demográfica de Dysdercus, se utilizaron pruebas de neutralidad (D de Tajima). Las pruebas Neutralidad se utilizaron como un indicador de la reciente expansión de la población, cuando la hipótesis nula de neutralidad fue rechazada debido a los valores negativos significativos (P, 0,05 para D y FS). Según la teoría coalescente, una población general presenta una distribución unimodal desfasada tras una población con crecimiento demográfico reciente o expansión del área de distribución (Rogers y Harpending, 1992).

4.4. Red de Haplotipos Con el fin de investigar la historia evolutiva y relaciones entre los haplotipos encontrados en este estudio, se construyó una red de expansión mínima de los haplotipos utilizando el programa de TCS, 1.21 (Clemente et al., 2000).

4.5. Definición de escalas para el modelo de evaluación ecológica y evolutiva de una especie plaga Para la evaluación del potencial efecto o daño que pudieran ocasionar las poblaciones de las especies de Dysdercus (o visto desde otro ángulo, para analizar la complejidad de las estrategias que pudieran ser utilizadas para control) en cada uno de los rasgos ecológicos y evolutivos del modelo propuesto, se establecieron cuatro escalas para definir cada uno de los niveles de umbral de especie plaga. Siendo el nivel uno (menor daño) y nivel cuatro (mayor daño).

Tabla 1. Escalas del modelo de evaluación ecológica y evolutiva de una especie plaga. Escala Definición de la escala 1 Especie no plaga 2 Plaga incipiente 3 Plaga moderada 4 Plaga letal

La representación hipotética del modelo para la evaluación ecológica y evolutiva de una especie plaga propuesto por Cerritos et al. (2012), representa en cada eje del gráfico un rasgo o atributo ecológico y/o evolutivo; cuando todos los valores del borde se conectan, se forma un polígono que representa el potencial de una especie a convertirse en una plaga. Las especies hipotéticas plagas muestran historias de vida y rasgos genéticos muy diferentes con las poblaciones de especies que no son plagas. Cada uno de los círculos de línea continua representa un umbral hipotético del daño que podría causar una especie, por lo que el círculo rojo ilustra un umbral máximo que se espera para una especie de plaga, mientras que el círculo verde se ajustará a una especie no plaga. Los polígonos representan las tendencias de tres especies diferentes: una especie de plagas letales (polígono azul), una especie de plagas moderadas (polígono de línea de color negro sólido), y una especie de plagas incipientes (línea punteada).

5. Resultados

5.1. Determinación taxonómica y diversidad de la comunidad Se colectaron un total de 306 ejemplares de Dysdercus en estadio adulto. De las 12 morfoespecies encontradas se determinaron ocho especies (Anexo1): • D. concinnus Stäl.,1861 • D. flavolimbatus Stäl., 1861 • D. mimus Say., 1832

• D. mimulus Hussey, 1929 • D. obscuratus Distant, 1883 • D. suturellus Herrich-Schaeffer, 1842 • D bimaculatus Stäl., 1854 • D. obliquus H.S, 1843.

La mayor abundancia registrada fue de 136 individuos para PS, representados principalmente por D. concinnus con 118 ejemplares (Tabla 2), al mismo tiempo la diversidad fue de 0.637 y su riqueza fue de cinco especies. PN tuvo una abundancia de 76 individuos (Tabla 2), representados por cinco especies siendo D. obliquus la más abundante (52). La abundancia para la localidad BB fue de 51 está representada por la especie D. flavolimbatus con 47 individuos y una riqueza de cuatro especies. PC es la metapoblación con mayor riqueza de especies (seis), y una abundancia de 28 individuos, siendo D. concinnus la especie mejor representada con 12 individuos. La menor abundancia registrada fue para la Península de Yucatán con siete individuos. La riqueza obtenida fue de cuatro especies. D. obscuratus, D. suturellus y D. mimulus tienen una abundancia similar con un individuo cada una, cuatro individuos solo fueron determinados hasta género. A partir del índice de Shannon-Wiener se observa que los sitios con mayor diversidad de especies son Pacifico centro con 1.521 esto debido a que están presentes la mayoría de las especies de Dysdercus; el segundo sitio con mayor diversidad es la Península de Yucatán, aunque esta metapoblación tiene la menor abundancia de especies, D. suturellus y D. obscuratus se encuentran presentes solo en este sitio, por lo que se obtuvo un valor de 1.153.

Tabla 2. Índice de Diversidad, abundancia y riqueza de las chinches del género Dysdercus por metapoblación de G. hirsutum. BB, Bahía de banderas; PC, Pacífico centro, PN, Pacífico norte; PS, Pacífico sur, PY, Península de Yucatán. Especies BB PC PN PS PY

D. concinnus 1 12 1 118 0 D. flavolimbatus 47 2 1 0 0 D. mimus 0 0 17 2 0 D. mimulus 0 0 0 7 1 D. obscuratus 0 0 0 0 1 D. suturellus 0 0 0 0 1 D. bimaculatus 0 1 0 0 0 D. obliquus 1 3 52 2 0 Dysdercus sp. 2 10 5 7 4 Abundancia 51 28 76 136 7 Riqueza 4 6 5 5 4 H 0.451 1.521 0.887 0.637 1.153

Diversidad Beta. De acuerdo a la composición de especies entre las diferentes metapoblaciones se obtuvieron cuatro conjuntos distintos. Las metapoblaciones Pacifico centro y Pacifico norte integran un primer grupo (Fig. 5) ya que poseen una alta similitud entre las especies que comparten (D. concinnus, D. flavolimbatus y D. obliquus). El sitio con mayor disimilitud es la región de la Península de Yucatán, esto se explica ya que posee la una gran riqueza de especies y es la única metapoblación donde se encuentran presentes las especies D. obscuratus y D. suturellus.

Penín_yucatán

Altura

Pacíf_sur

Bahía_Bandd Pacif_centro Pacif_norte

Fig. 5. Dendograma de similitud obtenido con los valores del índice de Jaccard para

las cinco metapoblaciones de G. hirsutum.

5.2. Diversidad y estructura genética de las especies de Dysdercus Para el análisis de la diversidad genética se definieron ocho sets por especie de cada localidad. La metapoblación Península de Yucatán no se consideró dentro de este análisis debido al bajo número de individuos colectados. Las secuencias amplificadas para cada uno de los individuos fueron de un tamaño de 498 pb, con un total de 129 sitios segregantes.

Tabla 3. Análisis de diversidad genética de las especies de Dysdercus. Hd, diversidad haplotípica; π, diversidad nucleotídica; K, promedio de las diferencias nucleotídicas; S, número de sitios segregantes,**, P < 0.01, PN, Pacífico norte; BB, Bahía de Banderas; PC, Pacífico centro, PS, Pacífico sur Diversidad Molecular Test de Neutralidad

Especie Localidad N H Hd π K S D de Tajima

D. mimus PN 17 8 0.779 ± 0.099 0.022 10.764 48 -1.007

D. obliquus PN 20 6 0.516 ± 0.132 0.017 8.521 69 -2.388**

D. obliquus PS 2 2 1.000 ± 0.500 0.004 2.0 2 ---

D. concinnus PS 40 15 0.642 ± 0.088 0.014 6.924 47 -1.373

D. concinnus PC 4 2 0.500 ± 0.265 0.002 1.000 2 -0.709

D. mimus PC 6 5 0.933 ± 0.122 0.042 20.200 43 0.464

D. obliquus PC 2 2 1.000 ± 0.50 0.083 40.0 40 ---

D. flavolimabatus BB 9 4 0.583 ± 0.183 0.018 8.833 2 -1.946**

Total 99 38 0.886 ± 0.024 0.057 27.143 129 -0.063

La red de haplotipos muestra la agrupación de las especies de Dysdercus para cada población, el tamaño de los círculos representa la frecuencia haplotípica y los colores las poblaciones, la representación muestra que la mayoría de los individuos poseen secuencias de ADNmt únicas, dando lugar a una gran diversidad de haplotipos, de 99 secuencias 38 haplotipos únicos, (Fig. 6) dando como resultado una alta diversidad haplotípica (0.886) y una diversidad nucleotídica de π=0.057 (Tabla 3).

La distribución de los haplotipos por localidad y por especie se muestra en la fig. 6. La agrupación de haplotipos muestra que en la especie D. flavolimbatus los haplotipos muestran estructura y se registran en la misma localidad BB. Para D. concinnus los haplotipos resultan ser únicos y pertenecientes a Oaxaca (PS), a excepción del Hap1 se encuentra en compartido entre dos localidades (PN y PC). En D. mimus los haplotipos de los extremos de la red se encuentran compartidos en dos localidades Guerrero (PC) y Sinaloa (PN). D. mimus es la especie que registra presencia de haplotipos en más de una.

5.3. Diferenciación y flujo genético entre las poblaciones de Dysdercus basado en secuencias de ADNmt.

La diferenciación genética de todas las poblaciones fue medida a partir de los estadísticos FST y Nm. Los valores de FST entre las Metapoblaciones oscilaron de 0.602-0.901, lo que sugiere una gran diferenciación genética entre las poblaciones. La comparación del flujo genético entre poblaciones no fue significativa en todas las especies Nm>1 (Tabla 4).

5.4. Modelo de evaluación del ecológica-evolutiva para Dysdercus sp.

Los resultados del análisis del modelo de evaluación ecológico-evolutivo (Tabla 5 y 6), muestran que la categorización obtenida para la mayoría de los factores tanto ecológicos como evolutivos pertenece a la categoría de plaga moderada (fig. 7), a excepción de los factores dieta y ciclo de vida que se encuentran dentro de la escala cuatro, debido a que las especies de Dysdercus presentan una amplia elección de hospederos y una gran flexibilidad en su ciclo de vida.

Tabla 4. Diferenciación y flujo genético entre las especies de Dysdercus basado en secuencias de ADNmt.

FST / Nm D. mimus D. flavolimbatus D. obliquus D. concinnus D. mimus - 0.817 0.602 0.703 D. flavolimbatus 0.11 - 0.7 0.901 D. obliquus 0.33 0.21 - 0.68 D. concinnus 0.21 0.05 0.23 -

Fig. 6. Red de haplotipos de Dysdercus sp. presentes en las metapoblaciones de G. hirsutum. Cada círculo representa un haplotipo y el tamaño del círculo es proporcional a la frecuencia del haplotipo. Los colores indican la proporción de individuos muestreados en las diferentes localidades dentro del área de estudio.

Tabla 5. Resultados de la evaluación del efecto potencial de las poblaciones de Dysdercus como especies plaga. Factores evolutivos de Dysdercus sp. Factores ecológicos Escalas Evaluación 1. Alimentación específica, una especie de planta (especialista) 2. Alimentación de pocas especies de plantas relacionadas 4 Dieta 3. Alimentación de varias especies de plantas aunque todas pertenecientes a la misma familia 4. Alimentación de una amplia variedad de plantas de diferentes familias, muestra poca elección (generalista) polífago 1. No hay períodos migratorios Migración 2. Migración solo en machos ó hembras 3 3. Migración facultativa 4. Migración obligada. Machos y hembras migran durante todo su ciclo de vida

Enemigos naturales 1. Gran número de depredadores 2. Depredación selectiva 3 3. Pocos depredadores 4. Sin depredadores en el área 1. Especie endémica de una ecoregión Distribución 2. Distribución en una ecoregión biogeográfica 3. Distribución en más de dos ecoregiónes biogeográficas 4 4. Distribución cosmopolita 1. Metamorfosis completa, no multivoltinas Ciclo de vida 2. Metamorfosis completa, multivoltinas 3. Metamorfosis incompleta, no multivoltinas 4 4. Metamorfosis incompleta, multivoltinas

Tabla 6. Resultados de la evaluación del efecto potencial de las poblaciones de Dysdercus como especies plaga. Factores evolutivos de Dysdercus sp.

1. Ninguna especie de la familia son plaga. Inercia filogenética 2. Especies pertenecientes a la familia son plaga. 3. Especies pertenecientes al mismo género son plaga. 4 4. La especie o una especie relacionada filogenéticamente es plaga. 1. Unidades independientes. No hay flujo génico. 2. Nm menor a 1. Existe flujo génico pero no hay tendencia a la homogenización. 4 Flujo génico 3. Nm mayor a 1. Existe flujo génico, hay tendencia a la homogenización, pero aún las poblaciones no son iguales.

4. FST es igual a 0 y Nm tiende a infinito, Alto flujo génico. 1. 100 haplotipos /100 individuos (1.0). Diversidad genética 2. 50 haplotipos /100 individuos (0.50). 3. 25 haplotipos /100 individuos (0.25). 3 4. 1 haplotipo /100 individuos (0.01). 5. Alta estructura genética. Dysdercus sp. Estructura Genética 6. Varias unidades estructuradas. 7. Solo una unidad estructural definida. 3 Fig. 7. Modelo de evaluación ecológic8. o-evolutivoSin estructura de Dysdercusgenética. sp. presentes en las metapoblacionesde G. hirsutum en México.

6. Discusión

Ventajas y desventajas de la determinación molecular y morfológica de Dysdercus en México. Los límites de las especies resultan en ocasiones difíciles de definir basados solo en las características morfológicas, por lo cual el uso de herramientas moleculares para su determinación, algunas veces proporciona una mayor claridad en la delimitación de un taxón. Las diferentes regiones del genoma varían en tasas de mutación, mientras que en las regiones codificantes las tasas son lentas, en las regiones no codificantes, intergénicas y repetidas en tándem tienen tasas de cambio más rápidas. La correcta elección del marcador molecular permite encontrar variación interespecífica o específica según sea el objetivo del trabajo. En esta investigación caso para la determinación específica se utilizo la región mitocondrial 5' Cytocromo C oxidasa subunidad I, aproximadamente 700 nucleótidos de la secuencia molecular COI se pueden utilizar para consultar grandes bases de datos de COI para ayudar a determinar la identidad de muestras desconocidas a nivel de especie, a través de un método conocido como código de barras (Hebert et al., 2003). La variabilidad morfológica dentro de Dysdercus planteó la cuestión de los problemas de los límites y definición entre especies, por lo que en respuesta a estos problemas es que las secuencias de ADN pueden hacer las contribuciones más importantes. Entre los heteróptera, existe un gran número de grupos taxonómicamente difíciles de definir, los cuales incluyen a varias especies plaga (por ejemplo especies del género Lygus). Las formas inmaduras de este grupo son generalmente difíciles de verificar, usando claves basadas en la morfología. Los códigos de barras de ADN pueden ayudar en la determinación de Heteroptera en valores aplicados al permitir el reconocimiento de especies morfológicamente crípticos, asociando formas inmaduras con adultos (manejo de plagas), y mediante el reconocimiento de los huevos (aplicaciones fitosanitarias) y restos fragmentarios (calidad de los alimentos, análisis ecológicos) (Park et al., 2011). De las especies determinadas en este estudio y presentes en las metapoblaciones de algodón silvestre, D. mimus (Say), D. concinnus (Stäl), D. mimulus (Hussey), D. oscuratus F., D. bimaculatus (Stäl), D. obliquus (Herrich-Schaffer), Pacheco (1996) las menciona como plagas del algodonero y algunas en el girasol. Dentro del orden Pentatomidae Memon et al. (2006) describe nuevas especies de Halys fabricius utilizando secuencias de ADN e información morfológica. A partir del uso de marcadores mitocondriales los datos de las secuencias de ADN muestran diferentes patrones de variabilidad dentro de las nuevas especies descritas

23 para Halys; al igual que las especies de Dysdercus la gran variabilidad morfológica que se presenta dentro de las especies supone un problema al delimitar una especie de otra por lo que la información molecular confirma los resultados de variación entre especies.

Bases para la aplicación del modelo de evaluación ecológica evolutiva de las plagas del género Dysdercus en México. El modelo de evaluación ecológica-evolutiva propuesto por Cerritos et al. (2012) engloba dos aspectos generales para el entendimiento de la dinámica de las especies plaga y su manejo a largo plazo. Por un lado los rasgos ecológicos tales como migración, tasa reproductiva o tasa de mortalidad, dispersión o procesos que regulan el crecimiento de la población, son componentes clave para el análisis de la dinámica a corto plazo, mientras que la obtención de los atributos evolutivos; diversidad genética entre y dentro de las poblaciones, el flujo de genes entre las poblaciones la estructura genética y el tamaño efectivo, contribuye a conocer que tan rápido la resistencia a un determinado método de control puede evolucionar y con qué amplitud, en un sentido geográfico, este método debe de ser aplicado (Cerritos et al., 2012).

El propósito de la aplicación de este modelo, se basa en la formulación de estrategias para reducir o controlar especies plaga a largo plazo, a partir del conocimiento ecológico y evolutivo. La flexibilidad del modelo permite adaptar cada uno de los atributos de acuerdo al caso de estudio. Para las especies de Dysdercus la revisión de la literatura y el análisis de la información permitió establecer los atributos para cada uno de los ejes del modelo de evaluación, revisando ocho atributos de los doce atributos propuestos en el modelo original, diversidad de la dieta, distribución geográfica, migración, existencia de enemigos naturales, inercia filogenética, ciclo de vida, flujo genético entre poblaciones, diversidad genética y estructura genética.

La distribución de las especies de Dysdercus (Ver Anexo 4) es más amplia que la establecida por las metapoblaciones de G. hirsutum silvestre. La gran flexibilidad y múltiples estrategias que presentan estas especies cuando el ambiente es desfavorable y existen condiciones de estrés, suponen grandes ventajas de adaptación que permiten la dispersión y ocupación de un amplio nicho por parte de estos insectos. En términos de manejo, se debe considerar que Dysdercus puede vivir en más condiciones ambientales, alimentarse de otros hospederos y moverse rápidamente cuando el alimento es limitado. Aunque en el caso de las poblaciones de algodón silvestre la distribución de las especies de Dysdercus no se encuentre determinada por las plantas de algodón, existe una estrecha relación en el uso del recurso, debido a

24 la presencia en casi todo el ciclo de vida de Dysdercus en las plantas desde los primeros estadios hasta los adultos. Las estrategias de historia de vida de las especies de Dysdercus puede ser entendida bajo términos de su adaptación a los patrones temporal de floración y fructificación de sus plantas hospederas. Cuando Derr et al. en (1981), estudió y categorizó las estrategias de la historia de vida de las especies americanas y africanas de Dysdercus de acuerdo a la fenología de sus plantas hospederas, concluyó que la gran plasticidad fenotípica de estas especies permite que puedan prosperar bajo una amplia gama de condiciones ambientales. A partir del uso de herramientas de genética poblacional y la información referente a la ecología de las chinches del género Dysdercus, en este estudio se generó información de línea base para la aplicación de estrategias de control y la evaluación de su escala de aplicación. La información de la invasión de especies plagas como menciona (Abdelkrim et al., 2005) permite evaluar la eficacia de los esfuerzos de erradicación o control, determinar los agentes de control biológico adecuados o posiblemente incrementar la evaluación del riesgo de plagas evaluando el potencial de invasión de una especie.

7. Conclusiones Con la información generada en este estudio a partir del análisis de secuencias mitocondriales y la determinación morfológica, se describieron las especies de Dysdercus (Pyrrhocoridae) presentes en las metapoblaciones de G. hirsutum en México. Se determinaron molecular y morfológicamente 131 ejemplares, entre los cuales cinco no fueron consistentes o no se encontraron registros en las bases de datos (ver Anexo 3). Las especies de Dysdercus son especies generalistas lo cual influye en su amplio rango de distribución geográfica, por lo tanto fue posible encontrar en todas la metapoblaciones de Gossypium hirsutum desde el Pacífico norte hasta la Península de Yucatán la presencia de una o más especies de Dysdercus. La Península de Yucatán es el único sitio donde están presentes las especies de D. obscuratus Distant 1883, D. suturellus H.S, 1842. El registro de las especies de Dysdercus encontradas en las poblaciones de G.hirsutum es la siguiente: Bahía de Banderas; D. concinnus Stäl. 1861, D. flavolimbatus Stäl 1831; D. obliquus H.S 1843; Pacífico centro, D. concinnus Stäl. 1861, D. flavolimbatus Stäl 1831; D. obliquus H.S 1843, D. bimaculatus Stäl. 1854; Pacifico sur; D. concinnus Stäl. 1861, D. mimus Say. 1832, D. obliquus H.S 1843, D. mimulus H. 1929; Pacifico

norte, D. concinnus Stäl. 1861, D. flavolimbatus Stäl 1831, D. mimus Say 1832, D. obliquus H.S 1843; Península de Yucatán, D. obscuratus Distant 1883, D. suturellus H.S, 1842. Con el análisis molecular se obtuvo una estructura inter especifica del género Dysdercus en las poblaciones de algodón silvestre en México. De acuerdo al análisis ecológico realizado sobre la distribución del nicho ecológico, los hospederos y la dieta de las especies de Dysdercus, la baja estructura intrapoblacional encontrada, el alto flujo génico, las poblaciones de las especies Dysdercus presentan un comportamiento como una gran unidad. Debido a la gran movilidad, la naturaleza críptica o evasiva y el carácter no específico del parasitismo de Dysdercus hacia el algodón es necesario realizar la cuantificación del tamaño de la población pasada y presente; ya que esto contribuirá a dar una idea del éxito del establecimiento de Dysdercus como población invasora, y la eficacia de una estrategia de control que logre conservar las poblaciones silvestres del algodón. Los resultados sobre los parámetros evolutivos son consistentes con los ecológicos, por un lado el flujo genético entre las poblaciones es muy alto y por lo tanto, los límites de las poblaciones no están claramente definidos. La información en conjunto arroja que las especies de Dysdercus requieren de múltiples estrategias simultáneas y por periodos prolongados, para poder ser controladas a largo plazo.

8. Perspectivas Dentro de las preguntas importantes que se deben tener en cuenta para entender la dinámica poblacional de Dysdercus, son las interrogantes acerca del origen de las especies colonizadoras, si las invasiones incluyen uno o más eventos de colonización y la propagación de la infestación actual. Además de analizar las especies de Dysdercus registradas en México y entender las rutas de dispersión. Es necesario complementar el modelo de umbral de daño con los datos genéticos que permitan la comprensión de la biología de las especies y proponer las estrategias de manejo integral de control a largo plazo para las especies del género Dysdercus por medio de un modelo.

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10. ANEXOS

Anexo 1. Especies de Dysdercus presentes en las metapoblaciones de Gossypium hirsutum de México.

D. mimus Say., 1832 D. obliquus H.S, 1843 D. concinnus Stäl., 1861 D. flavolimbatus Stäl., 1831 Metapoblaciones: Bahía de Metapoblaciones: Bahía de Metapoblaciones: Pacífico Metapoblaciones: Bahía de Banderas, Pacífico centro, Banderas, Pacífico centro, sur, Pacífico norte. Banderas, Pacífico centro, Pacífico sur, Pacífico norte. Pacífico norte. Pacífico sur, Pacífico norte.

Anexo 2. Laboratorio Molecular.

Protocolo de extracción de ADN de Dysdercus sp.

Para la estandarización del protocolo de extracción de ADN para Dysdercus se realizaron distintas pruebas tomando diferentes tejidos, cuerpo; cabeza, cuerpo entero, abdomen y patas. El tejido se conservó en etanol al 70% y se almacenó a 20 °C.

Los mejores resultados, mayor concentración y mejor calidad de ADN, se obtuvieron con el método de CTAB y utilizando cuatro patas de cada individuo. Para la homogenización de los tejidos se molió en mortero con nitrógeno líquido. Las etapas de extracción consistieron en cuatro etapas principales (Doyle y Doyle, 1990):

Lisis celular. Durante esta etapa se lleva a cabo la liberación del ADN, por lo cual los tejidos se maceran empleado nitrógeno líquido y se homogenizan usando del buffer de extracción CTAB:

• Tris-HCl 100 mM pH8 • NaCl 1.4 M • EDTA 20 mM pH8 • CTAB 2%

• B-mercaptoetanol 0.2% (este reactivo se agrega hasta el momento de usar el buffer)

Eliminación de proteínas. Para degradar proteínas se añade 4 µl a cada muestra de proteínasa K (20 mg/m Thermoscientific) y se incuba durante 1hora a 56 °C, posteriormente las muestras se dejan enfriar a temperatura ambiente.

Para limpiar la muestra de cualquier residuo lipídico se usa una mezcla de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). Se agrega un volumen igual de cloroformo que el de la muestra (750 µL aproximadamente), mezclar con vortéx y centrifugar en frío a 6000 rpm durante 10 minutos para recuperar el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo previamente etiquetado.

Precipitación del ADN. Para concentrar el ADN se realizó una precipitación con isopropanol, agregando dos volúmenes de muestra. La precipitación del ADN es casi inmediata en presencia de la sal y el alcohol; la muestra se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente la mezcla es centrifugada por 10 min a 6000 rpm.

Eliminación de sales. Se desecha el sobrenadante y las pastillas o pellets de ADN se lavan una vez con etanol al 75% para la eliminación de sales que permanezcan en la mezcla, Las muestras se vuelven a centrifugar (5 minutos a 7 rpm), se elimina el etanol y se deja secar el ADN (30 minutos a temperatura ambiente) hasta que no haya más trazas de alcohol. Finalmente, el ADN se re suspende en 50 µL de agua bidestilada.

Anexo 2. Continuación.

Visualización del ADN. Las extracciones de ADN fueron visualizadas por electroforesis en un gel de agarosa al 1%, teñidas con bromuro de etidio.

Reactivo Volúmen

TBE 5X 60 mL

Agarosa 0.6 g

Bromuro de Etidio 1.8 µL

Para la carga del gel se añadió 5 µL de ADN mezclado con 3 µL de Buffer de carga GoTaq® Flexi DNA Polymerase (PROMEGA). El tamaño de cada banda fue de 600 pb. La cuantificación de DNA se llevó a cabo con Nanodrop 2000.

Protocolo de amplificación y secuenciación para Dysdercus sp.

Las amplificaciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µL, con los siguientes reactivos.

Reactivo Concentración Concentración Cantidad para una Cantidad para 10 inicial final reacción de PCR reacciones de PCR

dNTPs (Fermentas) 20 mM (todos) 1.25 mM 0. 5 μL 5 μL

Magnesio (Promega) 25 mM 1.25 mM 1.25 μL 12.5 μL

Oligo forward 10 pM 1.25 pM 1.25 μL 12.5 μL

Oligo Reverse 10 pM 1.25 pM 1.25 μL 12.5 μL

Taq (Promega) 5 U/μL 0.05 μL 1.25 μL 2.5 μL

Buffer 5x Colorless 10X 0.25X 0.25 μL 12.5 μL (GoTaq Promega)

Agua ddH2O (Gibco) -- -- 18 μL 180 μL

ADN (agregar después de 1.25 μL dividir el mix)

Anexo 2. Continuación.

Amplificación y secuenciación.

Para la amplificación de la región COI se usó el set de primer Lep-F1 5´ATTCAACCAATCATAAAGATAT-3´ y Lep-R1, 5´-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAA-3´

Visualización del gel de electroforesis para la Reacción en cadena de la Polimerasa región COI.

Las secuencias de la región COI fueron generadas en el Laboratorio de High-Throughput Genomics en la Universidad de Washington. Las secuencias fueron editas y alineadas en el Pograma MAFFT.

ETAPA Temperatura ºC Tiempo Ciclos Desnaturalización inicial 95 1´ 1 Desnaturalización 95 15´´ 35 Alineación 45 15´´ 1 Extensión 72 1´ 1 Exención final 72 7’ 1 Mantenimiento 10

Cromatogramas de las secuencias de nucleótidos para la región COI.

Anexo 3. BLAST.

Clave ejemplar Poblacion Localidad Taxonomía BOLDsystems % similitud HePy1GhSi_37-LepR Sinaloa Mazatlan(puente av. sábalo cerritos) obliquus obliquus 100 HePy1GhSi_46-LepF Sinaloa Mazatlan(puente av. sábalo cerritos) obliquus obliquus 100 HePy1GhSi1464_31-LepF Sinaloa Mazatlán, Playa Bruja obliquus obliquus 99.69 HePy1GhSi1472_-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus S/D S/D HePy1GhSi1476_26-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 100 HePy1GhSi1477_4-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.84 HePy1GhSi1477_8-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.84 HePy1GhSi1477_11-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.84 HePy1GhSi1481_20-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.37 HePy1GhSi1481_33-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 100 HePy1GhSi1481_35-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.85 HePy1GhSi1503_24-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.07 HePy1GhSi1510_18-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.83 HePy1GhSi1510_34-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.37 HePy1GhSi1510_44-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 100 HePy1GhSi1516_15-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.69 HePy1GhSi1517_19-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 93.02 HePy1GhSi1521_7-LepF Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.84 HePy1GhSi1521_38-LepR Sinaloa Mazatlán obliquus obliquus 99.53 HePy1GhSi1576_12-LepR Sinaloa Mazatlán Telleria obliquus albidiventris 98.98 HePy9Gh1033_1-LepF Guerrero Pie de la Cuesta mimus mimus 100 HePy9GhSi1481_23-LepR Sinaloa Mazatlan(puente) mimus concinnus 86.84 HePy9GhSi1507_7-LepR Sinaloa Mazatlan(puente) mimus mimus 99.84 HePy9GhSi1507_8-LepF Sinaloa Mazatlan(puente) mimus mimus 99.84 HePy9GhSi1507_21-LepR Sinaloa Mazatlan(puente) mimus mimus 99.37 HePy9GhSi1572_10-LepF Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 99.11 HePy9GhSi1572_22-LepR Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 99.22 HePy9GhSi1576_11-LepR Sinaloa Mazatlán Tellería mimus concinnus 96.08 HePy9GhSi1576_12-LepR Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 100 HePy9GhSi1576_13-LepR Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 99.68 HePy9GhSi1576_14-LepF Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 100 HePy9GhSi1576_15-LepF Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 99.69 HePy9GhSi1576_16-LepR Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 100 HePy9GhSi1576_18-LepF Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 98.87 HePy9GhSi1576_19-LepR Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 99.53 HePy9GhSi1576_20-LepR Sinaloa Mazatlán Tellería mimus mimus 99.53 9GhGu_5 Guerrero cayacal mimus concinnus 96.46 9GhGuC55_6 Guerrero Pie de la Cuesta mimus mimus 99.83 9GhGuC55_4 Guerrero Pie de la Cuesta mimus mimus 99.65 3GhBb1492_31 Sinaloa Mazatlan(puente) flavolimbatus mimus 99.67 3GhBb1429_26 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.49 3GhBb1452_40 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.31 3GhBb1429_35 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.15 3GhBb1449_14 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.35 3GhBb1429_17 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.45 3GhBb1429_16 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.49 3GhBb1448_5 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.2 3GhBb1449_42 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.35 8GhGu_3 Guerrero cayacal mimus concinnus 87.98 8GhGuC55_6 Guerrero Pie de la Cuesta mimus mimus 95.61 7GhGuB_5 Guerrero Rodecia concinnus 7GhGuB_2 Guerrero Rodecia concinnus concinnus 95.95 7GhGu_9 Guerrero cayacal concinnus concinnus 95.93 12GhOpB_48 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 77.33 12GhOpB_46 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.27 12GhOpB_78 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.89 12GhOpB_20 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.75 7GhGu_4 Guerrero cayacal concinnus concinnus 95.34 7GhGu_1 Guerrero cayacal concinnus mimus 100 1

Anexo 3. Continuación.

7Gh1033_3 Guerrero Pie de la Cuesta concinnus mimus 100 7GhGuC55_6 Guerrero Pie de la Cuesta concinnus mimus 100 7GhGu_8 Guerrero Pie de la Cuesta concinnus concinnus 96.12 4GhO1613_9 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 95.54 4GhO1613_10 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 96.16 9GhSi1575_9-LepF Sinaloa Mazatlán Telleria mimus concinnus 95.79 4GhO20_14 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 100 9GhSi1577_17-LepF Sinaloa Mazatlán Telleria mimus mimus 99.83 4GhO1613_11 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 96.15 7GhOt653_14 Oaxaca Barra del potrero concinnus concinnus 96.1 4GhOa20_1 Oaxaca chivela concinnus concinnus 96.19 4GhO_2 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.92 4GhO1613_3 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 98.88 4GhO20_4 Oaxaca Chivela concinnus mimus 99.66 4GhO1613_5 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 96.12 4GhO1613_6 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 96.05 4GhO1613_7 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 95.19 4GhO20_8 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.91 12GhO20_62 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 99.84 12GhOpB_55 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 99.52 12GhOpB_42 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.92 12GhOpB_38 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.22 12GhOpB_63 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.56 12GhOpB_37 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.17 GhOa20_33 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 99.05 12GhO1613_35 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 98.88 12GhO1613_17 Oaxaca Juchitán concinnus oncinnus 90.41 12GhO_50 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.27 12GhO1613_41 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 95.35 12GhO1613_76 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 95.99 12GhO1613_83 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 95.1 12GhO1613_40 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 94.93 12GhO1613_9 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 99.84 GhOa20_27 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.15 7GhOt652_15_ Oaxaca Barra del potrero concinnus SD SD 1GhGuC55_53 Guerrero Pie de la Cuesta obliquus bimaculatus 100 12GhOpD_58 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.04 12GhOpA_11 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 94.47 12GhO20_29 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 91.04 COLORADAS Yucatán sp. 99.68 GhYu1046_ Yucatán Celestún obscuratus obscuratus 99.04 COLOTMUL Yucatán Colotmul sp. 99.84 12GhO1613_65 Oaxaca juchitán concinnus concinnus 95.85 12GhO1613_28 Oaxaca juchitán concinnus concinnus 96.19 12GhOa20_23 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.95 1GhSi649_55 Oaxaca Playa Tilapias obliquus bimaculatus 100 12GhOpD_67 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.09 12GhOpB_22 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.31 12GhOpB_34 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.12 12GhO_69 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 94.66 12GhOpA_19 Oaxaca Chivela concinnus obliquus 93.02 12GhO20_51 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.73 12GhO20_70 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.04 6GhOpC_5 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 89.29 12GhOpB_54 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.92 12GhO20_66 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.95 3GhGu55_1 Guerrero Pie de la Cuesta SD 12GhOpA_47 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 99.35 12GhOpB_60 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 96.12 12GhOpB_49 Oaxaca Chivela concinnus concinnus 95.73

Anexo 3. Continuación.

12GhO1613_73 Oaxaca Juchitán concinnus concinnus 86.55 12GhOpB_64 Oaxaca chivela concinnus concinnus 95.42 7GhGuB_10 Guerrero Rodecia concinnus obscuratus 95.03 1GhOSi649_56 Oaxaca Playa Tilapias obliquus obliquus 99.22 5GhYu1044_4 Yucatán Celestún obscuratus obscuratus 89.23 5GhYu1044_6 Yucatán Celestún obscuratus obscuratus 87.84 3GhBb1451_6 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus SD SD 3GhBb1452_36 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 95.53 3GhBb1429_10 Bahía de Banderas Nayarit, Punta Mita flavolimbatus flavolimbatus 96.09 10Gh913_1 Bahía de Banderas Michoacán Colola obliquus obliquus 91.27 8GhGuC55_1 Guerrero PIe de la Cuesta mimus mimus 100

Anexo 4. Mapa de las distribuciones puntuales y potenciales de las especies de Dysdercus. .