UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica De Loja

CARÁTULA

UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA La Universidad Católica de Loja

ÁREA BIOLÓGICA Y BIOMEDICA

TITULO DE BIOQUÍMICO FARMACÉUTICO

Diversidad y composición de la comunidad de hongos micorrízicos en tres poblaciones de Stelis superbiens, la especie de orquídea epífita más común en un bosque tropical del Sur de Ecuador

TRABAJO DE TITULACIÓN

AUTORA: Jaramillo Tapia, Juliana Carolina.

DIRECTOR: Herrera Vargas, Paulo Ignacio, Mgtr.

LOJA – ECUADOR

2018 Esta versión digital, ha sido acreditada bajo la licencia Creative Commons 4.0, CC BY-NY- SA: Reconocimiento-No comercial-Compartir igual; la cual permite copiar, distribuir y comunicar públicamente la obra, mientras se reconozca la autoría original, no se utilice con fines comerciales y se permiten obras derivadas, siempre que mantenga la misma licencia al ser divulgada. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/deed.es

2018 APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN

Paulo Ignacio Herrera Vargas, Mgtr.

DOCENTE DE TITULACIÓN

De mi consideración:

El presente trabajo de fin de titulación: “Diversidad y composición de la comunidad de hongos micorrízicos en tres poblaciones de Stelis superbiens, la especie de orquídea epífita más común en un bosque tropical del Sur de Ecuador” realizado por Juliana Carolina Jaramillo Tapia, ha sido orientado y revisado durante su ejecución, por cuanto se aprueba la presentación del mismo.

Loja, Febrero del 2018

f)………………….…………………………………………

DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS

“Yo, Jaramillo Tapia Juliana Carolina declaro ser autor del presente trabajo de fin de titulación: Diversidad y composición de la comunidad de hongos micorrízicos en tres poblaciones de Stelis superbiens, la especie de orquídea epífita más común en un bosque tropical del Sur del Ecuador de la titulación de Bioquímico Farmacéutico, siendo Paulo Ignacio Herrera Vargas director del presente trabajo; y eximo expresamente a la Universidad Técnica Particular de Loja y sus representantes legales de posibles reclamos o acciones legales. Además certifico que las ideas, conceptos, procedimientos y resultados vertidos en el presente trabajo investigativo, son de mi exclusiva responsabilidad.

Adicionalmente declaro conocer y aceptar la disposición del Art. 88 del Estatuto Orgánico de la Universidad Técnica Particular de Loja que en su parte pertinente textualmente dice “Forman parte del patrimonio de la Universidad la propiedad intelectual de investigadores, trabajos científicos o técnicos y tesis de grado que se realicen a través, o con el apoyo financiero, académico o institucional (operativo) de la Universidad”.

f)………………….………………………… Autora: Jaramillo Tapia Juliana Carolina Cédula : 1105134314

III

DEDICATORIA

A Dios.

Por su infinito amor, por haberme dado la fortaleza, sabiduría y paciencia para seguir adelante a pesar de las adversidades que se me han presentado durante esta etapa.

A mis hijos.

Cristopher y Camila, que son lo más preciado que tengo y por ser mi mayor motivo de superación.

A mi esposo.

Por ser parte de mi vida, por su comprensión, y apoyo en los buenos y malos momentos.

A mis padres.

Por brindarme siempre su apoyo, por todo el sacrificio que hicieron para ayudarme en mi preparación profesional.

A mis hermanos,

Gabriel y Melany, por brindarme siempre su amor incondicional y sus palabras alentadoras para el logro de mis fines.

A la memoria de mi hermano Rubén, que en paz descanse, sé que desde el cielo me ayudaste para que este sueño se pueda cumplir.

Todo este trabajo ha sido posible gracias a ellos.

Juliana Jaramillo.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco infinitamente a mi Dios por las fuerzas que me ha dado para enfrentar muchas adversidades que se han presentado a lo largo de mi vida, y gracias por permitirme culminar esta meta tan anhelada.

También quiero expresar mi más sincero agradecimiento a mi Director de Trabajo de Fin de Titulación Mgtr. Paulo Herrera, por su enseñanza, comprensión, tiempo, paciencia y por su sabia dirección y grandiosa contribución a la realización de este trabajo.

A la Mgtr. Estefanía Cevallos por su gentil colaboración durante el desarrollo de este proyecto.

A la Universidad Técnica Particular de Loja, de manera muy especial a la Titulación de Bioquímica y Farmacia, por ser parte fundamental de mi formación personal y académica.

A mis amigos y compañeros de laboratorio, por compartir sus conocimientos y brindarme su apoyo en todo momento.

A toda mi familia, que de una u otra manera hicieron posible que este sueño se realice.

Juliana Jaramillo

ÍNDICE DE CONTENIDOS

CARÁTULA ...... I APROBACIÓN DEL DIRECTOR DEL TRABAJO DE FIN DE TITULACIÓN ...... II DECLARACIÓN DE AUTORÍA Y CESIÓN DE DERECHOS ...... III DEDICATORIA ...... IV AGRADECIMIENTOS ...... V ÍNDICE DE CONTENIDOS ...... VI RESUMEN ...... 1 ABSTRACT ...... 2 INTRODUCCIÓN ...... 3 CAPÍTULO I ...... 4 MARCO TEÓRICO ...... 4 1. Generalidades...... 5 1.1. Diversidad de la familia Orchidaceae...... 5 1.2. Las Micorrizas...... 7 1.3. Micorrizas de Orquídeas...... 8 1.4. Secueciación de nueva generación: Illumina...... 11 CAPÍTULO 2 ...... 4 MATERIALES Y MÉTODOS ...... 4 2. Materiales y Métodos...... 13 2.1. Sitio de Estudio...... 13 2.1. Muestreo...... 15 2.2. Análisis microscópico de raíces...... 15 2.3. Análisis molecular...... 15 2.4. Delimitación de OTUs...... 16 2.5. Análisis de la composición de la comunidad de hongos micorrízicos...... 17 CAPÍTULO 3 ...... 18 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 18 3. Muestreo, colonización de raíces y PCR...... 19 3.1. Riqueza de OTUs asociados a Stelis superbiens...... 19

3.2. Diferencia de la riqueza de OTUs micorrízicos entre sitios...... 21 3.3. Composición de la comunidad de hongos micorrízicos en los tres sitios...... 26 CONCLUSIONES ...... 27 RECOMENDACIONES...... 28 REFERENCIAS ...... ¡Error! Marcador no definido.

VII

RESUMEN

Las interacciones bióticas desempeñan funciones imprescindibles para la composición y estabilidad de las comunidades. Específicamente, las interacciones micorrízicas son importantes para la diversidad y distribución de las orquídeas. Sin embargo, se conoce poco acerca de los factores que determinan la estructura de la comunidad de hongos micorrízicos. Nosotros analizamos la comunidad de micobiontes asociados a Stelis superbiens en 50 individuos pertenecientes a tres sitios ubicados en dos bosques tropicales en el Sur de Ecuador. Para la caracterización de comunidades fúngicas se identificó unidades taxonómicas operacionales (OTUs) desde la región ITS2 del ADNnr, mediante la tecnología Illumina MiSeq. Obtuvimos 171 OTUs de hongos micorrízicos, correspondientes a Serendipitaceae (59 OTUs), Ceratobasidiaceae (56 OTUs), Tulasnellaceae (49 OTUs) y Atractiellales (7 OTUs). La mayor riqueza de micobiontes correspondió al sitio 2 y se encontró diferencias significativas entre las comunidades de micobiontes de los tres sitios/poblaciones. Un grupo de micobiontes (27 OTUs) se compartió entre los tres sitios y no existió preferencia en la interacción orquídea-hongos. Nuestros resultados sugieren que S. superbiens es una especie generalista, cuyas comunidades de hongos están determinadas por el sitio.

PALABRAS CLAVES: Estructura de la comunidad, hongos micorrízicos, orquídeas epifitas, OTUs, riqueza de especies, NGS, Illumina.

ABSTRACT

Biotic interactions play essential roles in the composition and stability of biotic communities. Specifically, mycorrhizal interactions are important for the diversity and distribution of orchids. However, it is little known about the factors that determine the structure of the mycorrhizal fungi communities. We analyzed the community of mycorrhizal fungi associated with Stelis superbiens in three sites located in two tropical forests in southern Ecuador. For the characterization of these fungal communities, operational taxonomic units (OTUs) were delimited from the ITS2 region of the ADNnr, using the Illumina MiSeq technology. We obtained 171 OTUs from mycorrhizal fungi, corresponding to Serendipitaceae (59 OTUs), Ceratobasidiaceae (56 OTUs), Tulasnellaceae (49 OTUs) and Atractiellales (7 OTUs). The highest number of mycobionts was present in site 2 and significant differences were found among the mycorrhizal fungal communities from the three sites / populations studied. A group of mycobionts (27 OTUs) was shared among all three sites, whitout specific preference in the orchid-fungal interaction. Our results suggest that S. superbiens is a generalist species, whose fungal communities are site dependent.

KEYWORDS: Community structure, mycorrhizal fungi, epiphytic orchids, OTUs, species richness, NGS, Illumina.

INTRODUCCIÓN

Las interacciones planta-hongo juegan un papel importante en los ecosistemas terrestres ya que contribuyen a la estructura de las comunidades vegetales (Smith & Read, 2008). Hay numerosas investigaciones sobre interacciones planta-hongo realizadas en los ecosistemas tropicales (Alexander & Selosse, 2009). Por ejemplo, varias plantas tropicales interaccionan con hongos endofíticos específicos de sus hojas (Arnold & Lutzoni, 2007), que les confieren mayor protección contra los patógenos (Arnold & Herre, 2003). Otro tipo de interacción que ocurre entre hongos y plantas son las micorrizas, un tipo de simbiosis mutualista que se produce entre las raíces de las plantas y uno o varios hongos con el fin de intercambiar nutrientes y minerales (Cameron et al., 2007). La asociación micorrízica potencia la supervivencia y el crecimiento de las plantas, reduciendo el estrés producido por factores bióticos y abióticos; tales como, tolerancia a escasez de nutrientes o agua, a cambios en la estructura del suelo o del pH, presencia de sales o metales tóxicos y patógenos (Fernández, 2010). Un tipo particular de micorriza se forma con la asociación entre orquídeas y hongos, conocida como micorriza de orquídeas. Dado que las orquídeas producen miles de semillas de tamaño pequeño y con escazas reservas de nutrientes, es crítica su asociación con uno o más hongos que provean esencialmente carbohidratos y minerales para promover la germinación en condiciones naturales (Duran, Rivero & Seemann, 2007; Smith & Read, 2008). Así mismo, en las primeras etapas de desarrollo de las orquídeas los hongos micorrízicos favorecen el establecimiento de los protocormos, mientras que en orquídeas adultas favorecen la obtención de nutrientes y compuestos como hidratos de carbono (Rivas, Warner & Bermudez, 1998). Además, se ha demostrado que factores como la especificidad o el recambio de especies de hongos puede afectar a la diversidad o distribución de orquídeas en los ecosistemas (van der Heijden et al., 1998). En Ecuador, la familia Orchidaceae es el grupo más diverso de plantas vasculares, con 4250 especies reportadas, de las cuales 1301 son endémicas (Dodson & Escobar, 2003). Varios esfuerzos se han realizado para la caracterización de hongos micorrízicos asociados a orquídeas terrestres y epífitas en bosques montanos del Sur de Ecuador (Cevallos et al. 2017; Herrera et al. 2017; Kottke et al., 2010, 2013; Suárez et al., 2006, 2008, 2016). Una de las especies de orquídeas más ampliamente distribuidas en los bosques de Ecuador es Stelis superbiens Lindl., una especie epífita perteneciente a la subtribu Pleurothallidinae (Endara, 2007). Estudios previos orientados a la caracterización morfológica y molecular de hongos

3 asociados a esta especie de orquídea han identificado como micobiontes a hongos de los grupos Tulasnellaceae, Serendipitaceae y Atractiellomicetes (Kottke et al., 2013; Suárez et al., 2006, 2008). Sin embargo, no se conoce aún si la diversidad y la riqueza de los hongos asociados cambia entre varias poblaciones de la especie, lo cual es importante para entender si los hongos están modulando o no la existencia y distribución de S. superbiens en los bosques tropicales. La diversidad y ecología de los hongos micorrízicos no ha sido completamente descrita en los bosques tropicales de montaña, y es por eso por lo que el empleo de las técnicas moleculares para su identificación está siendo cada vez más importante en la exploración de la riqueza de hongos existente en los bosques tropicales. Esto puede beneficiar de gran manera en la implementación de estrategias referentes a la conservación y restauración de las poblaciones existentes de orquídeas (Dearnaley et al., 2012) que están siendo amenazadas, a pesar de ser parte esencial del ecosistema. El objetivo de este trabajo fue identificar las comunidades de hongos micorrízicos asociados a tres poblaciones de S. superbiens usando secuenciación de nueva generación (NGS por sus siglas en inglés). Para ello, caracterizamos molecularmente la diversidad fúngica asociada a S. superbiens y analizamos la estructura de la comunidad de micobiontes asociada a la especie en cada localidad/sitio, como aporte para el entendimiento de la dinámica de esta simbiosis (orquídeas-micobiontes) y consecuentemente contribuir al conocimiento de la ecología de las orquídeas epífitas en los bosques tropicales del Sur de Ecuador. El primer capítulo de este trabajo contiene la revisión bibliográfica relevante para la comprensión del tema en general. Se detalla información con respecto a la familia Orchidaceae y a los hongos micorrízicos orquideoides. Además, se describe brevemente las principales herramientas moleculares empleadas para caracterizar los micobiontes, señalando la importancia de la tecnología de secuenciación de nueva generación, en este caso Illumina (Illumina, Inc). En el segundo capítulo se describe la metodología empleada en este estudio, que estuvo basada en el análisis molecular de las comunidades de hongos micorrízicos asociados a S. superbiens. En el tercer capítulo se exponen los resultados obtenidos y la discusión respectiva. Finalmente presentamos las conclusiones generales de este trabajo y las recomendaciones para futuros estudios relacionados con este tema de investigación.

CAPÍTULO I

MARCO TEÓRICO

1. Generalidades.

Las interacciones bióticas juegan un papel muy importante en el ensamblaje, persistencia y estabilidad de las comunidades (Fortuna et al., 2010; Friendman et al., 2017), llegando a ser consideradas como fundamentales (Molina et al., 1992). En especial, las interacciones micorrízicas son un componente vital de las comunidades vegetales (Bonfante & Anca, 2009). Entre ellas, las interacciones que ocurren entre las orquídeas y sus hongos micobiontes (micorrizas de orquídeas) pueden ser importantes para la existencia, diversidad y distribución de las orquídeas en los ecosistemas naturales (McCormick & Jacquemyn, 2014; Otero et al., 2007), y además, se ha considerado que esta relación micorrízica ha marcado una pauta importante en la evolución de la familia Orchidaceae (Benzing, 1981; Rasmussen, 1995). Entender la interacción entre las orquídeas y los micobiontes implica saber si hay una estructura especial de los micobiontes o si diferentes especies de orquídeas comparten micobiontes o dividen su nicho considerando los micobiontes disponibles (Herrera at al., 2017). A continuación describiremos algunas generalidades de la familia Orchidaceae y los hongos micorrízicos con los que interactúan. También describiremos una de las principales técnicas modernas para la identificación molecular de estos hongos, la cual está permitiendo analizar más profundamente las comunidades de hongos micorrízicos interaccionando con las orquídeas y plantas en general.

1.1. Diversidad de la familia Orchidaceae.

Las orquídeas son unas de las familias más rico de plantas vasculares en el mundo (Dressler, 1982, 1993). En Ecuador se han descrito 4250 especies de orquídeas, de las cuales más de 1301 son endémicas, encontrándose una de cada cinco especies del mundo en este país (Dodson & Escobar, 2003). Aproximadamente la mitad de todas las especies de plantas en el Ecuador crecen entre 900–3000 m s.n.m., sin embargo, esto solo representa el 10% del área total del país (Cueva & Gonzales, 2009). Dentro de la tribu Epidendreae (Orchidaceae) se encuentra la subtribu Pleurothallidinae, que es la mayor subtribu en los bosques montanos de Ecuador (Luer, 1986) con un total de más de 1650 especies, que corresponde al 44% del total de especies reportadas con más concurrencia (Dodson, 2002). El género Stelis pertenece a esta subtribu, en el que hasta ahora se han reportado 465 especies para el Ecuador, y muchas de ellas son endémicas de los bosques tropicales (Endara, 2007).

Stelis'

Stelis superbiens Lindl. (Figura 1) es una especie característica de los bosques nublados montanos, distribuida desde México hasta Brasil y las Antillas. Debido a su hábitat epífito, en su mayoría vive bajo la sombra de los árboles en especial en los bosques que se encuentran entre 1000 y 3000 m s.n.m. (Otero et al., 2002). Además esta especie de orquídea presenta una tendencia natural hacia la variación morfológica lo cual denota la importancia de su estudio (Duque, 2008).

Figura 1. Stelis superbiens Lindl. habitando un bosque tropical montano lluvioso del Sur de Ecuador (RBSF). Fuente Y Elaboración: Autora.

A pesar de la gran cantidad de especies de orquídeas hasta ahora descritas, la supervivencia de las mismas se encuentra cada vez más amenazada debido a diversos factores naturales y antrópicos que impiden su estabilidad en la naturaleza (Bayman, Tupac & Ackerman, 2003). Los principales factores que limitan la supervivencia de las orquídeas son la rápida pérdida de los hábitats consecuencia de la alteración estructural del suelo, deforestación, erosión y por el tráfico de especies debido a su alto valor comercial (Endara, 2007).

Otro limitante para la conservación y permanencia de las orquídeas en condiciones naturales son sus semillas, ya que a pesar de que pueden producir miles de ellas, estas son pequeñas y con escasas reservas de nutrientes para soportar la germinación (Arditti & Ghani, 2000). Por lo que las especies pertenecientes a la familia Orchidaceae, necesitan formar una asociación con hongos micorrízicos durante la germinación y establecimiento de las plántulas como una estrategia para que su desarrollo sea exitoso en los diferentes ecosistemas (Peterson et al., 2004; Suárez et al., 2006). 6

1.2. Las Micorrizas.

La relación simbiótica que se forma entre un hongo y las raíces de una planta vascular se denomina micorriza (Frank, 1885). Esta asociación que se establece en las raíces de las plantas se considera mutualista porque mientras la planta se beneficia obteniendo nutrientes y agua, el hongo obtiene hidratos de carbono y vitaminas como producto de la fotosíntesis (Harley & Smith, 1983). Sin embargo, las asociaciones mutualistas incluyen una amplia gama de asociaciones que pueden ser directas o indirectas, simbiótica o no simbióticas, pero la mayor parte implica el intercambio de nutrientes y no todas son mutualistas (Brundett, 2004). Hasta ahora se han identificado al menos 500 especies de hongos micorrízicos en plantas vasculares, la mayoría de ellos pertenecientes a la división Basidiomycota, mientras que en ciertas excepciones se observan integrantes de Ascomycota (Martos et al., 2009). También se ha podido identificar que hongos de la división Glomeromycota forman micorrizas (micorrizas arbusculares), del cual solo se conocen asociaciones micorrizógenas y cuyos miembros mueren cuando se les priva de la presencia de la raíz (Vacacela, 2012). Según la estructura de la micorriza formada, se pueden clasificar tres grupos fundamentales: Ectomicorrizas, también conocidas como formadoras de manto; Ectendomicorrizas, que abarca a los Arbutoides y Monotropoides; y las Endomicorrizas cuya característica principal es la colonización intracelular del hongo y a la cual pertenecen los miembros de la familia Ericoides, Orquidoides y Arbusculares (Figura 2) (Read, 1999).

Figura 2. Principales tipos de micorrizas Fuente y Elaboración: Obtenido de Vacacela (2012).

1.3. Micorrizas de Orquídeas.

Las micorrizas de orquídeas u orquidoides o también llamadas micorrizas de ovillo son formadas principalmente por hongos del filo Basidiomycota los cuales producen ovillos de hifas dentro de las células corticales de la raíz (Brundrett et al., 1996). Los hongos que hasta ahora se han detectado en asociación con orquídeas pertenecen a la división Basidiomycota, y en ciertas excepciones se han observado a intergrantes de Ascomycota (Martos et al., 2009). Las semillas de orquídeas son diminutas y pobres en endospermo, por lo que dependen de la colonización fúngica para su germinación y crecimiento, hasta alcanzar el estado clorofílico llamado protocormo (Rasmussen, 1995; Smith & Read, 2008). Los hongos micorrízicos que se encuentran en el ambiente colonizan a la orquídea a través de los tejidos del suspensor del embrión o por los pelos epidérmicos hasta poder ingresar a las células corticales gracias a sus hifas (Dearnaley, Martos & Selosse, 2012). La asociación entre los hongos y las orquídeas se puede dar de dos maneras, la primera que involucra orquídeas heterotróficas en las cuales su dependencia a los hongos micorrízicos es a lo largo de toda la vida de la orquídea; mientras que en orquídeas autotróficas esta

8 necesidad va disminuyendo por el desarrollo de funciones fotosintéticas, es decir la planta disminuye su dependencia hacia las micorrizas (Cameron et al., 2007). Algunas orquídeas fotosintéticas que poseen raíces rústicas conservan a los hongos micorrízicos para la suministración de nutrientes minerales principalmente el fósforo (Cameron et al., 2007). Los hongos involucrados en asocianes micorrízicas con orquídeas pueden ser identificados directamente desde protocormos de orquídeas, raíces, tubérculos y rizomas (Suárez et al., 2006; Swarts et al., 2010). Entre los hongos micorrízicos más comunes reportados hasta ahora en orquídeas autótrofas se encuentran los pertenecientes al filo Basidiomycota, con las familias Tulasnellaceae, Ceratobasidiaceae, Serendipitaceae y además Atractielalles (Otero et al., 2002; Suárez et al., 2006; Kottke et al., 2008; Suárez et al., 2008; Kottke et al., 2010); mientras que las orquídeas micoheterotróficas se asocian con un grupo diverso de hongos miembros de los filo Ascomycota o Basidiomycota (Bidartondo et al., 2004; Girlanda et al., 2006; Martos et al., 2009) Actualmente, la identificación de la diversidad de los diferentes grupos de hongos micorrízicos se basa en métodos moleculares a través del ADN barcode (Bellemain et al., 2010), en donde se emplea la variabilidad nucleotídica existente en regiones cortas y estandarizadas del genoma como auxiliar en la identificación y descubrimiento de especies (Hebert et al., 2003; 2005; Ratnasingham et al., 2007). El propósito del barcode es identificar especies, especialmente contribuir al descubrimiento de la diversidad y establecer un inventario total de especies vivas (para estudios demográficos y ecológicos) (Hebert et al., 2005). En estudios de hongos micorrízicos se ha utilizado la región transcrita interna (ITS) del gen que codifica para ARN ribosomal nuclear. Estos genes de ADN nuclear ribosomal (ADNnr) están organizados en largos tandem repetidos, consistiendo cada uno en una sola región transcrita que va desde 18S, 5.8S, 28S de ADNnr y dos pequeños espaciadores internos transcritos (ITS1 e ITS2) (Figura 3). Esto hace que esta región sea un blanco atractivo para la secuenciación -por su gran número de copias de ITS por célula (más de 250)- en sustratos ambientales donde la cantidad y calidad de ADN es bajo (Bellemain et al., 2010), como es en el caso de las raíces de plantas o de muestras de suelo. Los espaciadores ITS1 y ITS2 han demostrado ser una valiosa fuente de caracteres moleculares para reconstrucciones filogenéticas (Schoch et al., 2012), aunque también se puede utilizar las secuencias 5.8S-ITS2 cuando es necesario llegar a niveles filogenéticos más profundos (Hershkovitz et al., 1996).

Figura 3. Representación esquemática de las regiones del ADN ribosomal y los diferentes cebadores empleados en este estudio. Flechas azules (primer par de cebadores) y flechas negras (segundo par de cebadores) Fuente y Elaboración: Obtenido de Song (2016) y editado por la autora.

Estudios en los cuales se han usado multiples técnicas moleculares para la identificación de micobiontes directamente desde la micorriza han reportado a Tulasnellales como el orden de micobionte de orquídeas más abundantemente distribuido en distintas partes del mundo (Cruz et al., 2014; Herrera et al., 2017; Jacquemyn et al., 2011; Roche et al., 2010; Talbot, 1971; 1980). Hasta ahora se ha reportado 55 especies de Tulasnellales (Kirk et al., 2008). En Ecuador, en el bosque tropical montano lluvioso se encontró una dominancia de Tulasnellaceae, seguido en menor frecuencia por Serendipitaceae; por primera vez se encontró a Atractiellales formando micorrizas con orquídeas (Herrera et al., 2017; Kottke et al., 2010; Serato et al., 2011; Suárez et al., 2006, 2008; Suárez & Kottke, 2017) y actualmente también se pudo constatar la presencia de Ceratobasidiaceae (Cevallos et al. 2017). La información que se tiene acerca del papel que desempeñan las comunidades de hongos asociados a orquídeas es muy escasa, sin embargo se ha podido demostrar que los hongos micorrizícos pueden afectar la diversidad (van der Heijden et al., 1998) y por ende la distribución de las especies de plantas (Swarts et al., 2010). Por lo que la ausencia de estos microorganismos o el no poder formar una simbiosis en ciertas condiciones ambientales podría limitar la distribución de las orquídeas. A pesar de que se ha planteado que los hongos micorrízicos no son específicos de la planta que colonizan, diferentes simbiontes son más benéficos para algunos hospederos que otros (van der Heijden et al., 1998). Por lo que es importante conocer la distribución de los hongos de orquídeas que interactúan con sus hospederos para poder entender lo que limita el número y tamaño de las poblaciones de orquídeas (Phillips et al., 2011). Además, el conocimiento de los hongos involucrados y su interacción es clave para su aplicación en la reintroducción y restauración de especies nativas en los bosques (Schwartz et al., 2006)

1.4. Secueciación de nueva generación: Illumina.

En la actualidad la tecnología de metabarcode de Illumina se ha convertido en una herramienta indispensable para el estudio de la comunidad de hongos. A pesar de que es un método que genera lecturas más cortas, logra una secuenciación más profunda de la región de ADN fúngico (ITS) (Balint et al., 2014), permitiendo detectar un mayor número de especies fúngicas o según sea el caso, de unidades taxonómicas operacionales (OTUs) (Gweon et al., 2015). Una de las principales ventajas que hace a Illumina el método más idóneo para el metabarcode, es que podemos obtener un mayor número de secuencias a un costo considerablemente más bajo por par de bases y con una baja tasa de error (Schmidt et al., 2013). Además, debido a que las estimaciones precisas del número de especies fúngicas (riqueza) y su abundancia relativa sigue siendo difícil de obtener (Taylor et al., 2016), el rendimiento de la plataforma de Illumina mejora las estimaciones de cantidad y abundancia ya que facilita el uso de un número mayor de muestras. El empleo de estos métodos puede abrir paso al descubrimiento de patrones en la estructura de la comunidad de hongos que con los métodos anteriores pasaban desapercibidos (Schmidt et al., 2013).

CAPÍTULO 2

MATERIALES Y MÉTODOS

2. Materiales y Métodos.

2.1. Sitio de Estudio.

El estudio se desarrolló en dos zonas aledañas al Parque Nacional Podocarpus en la vía entre Loja y Zamora (provincia Zamora-Chinchipe), específicamente en la Reserva Biológica San Francisco (3°58’18’’S, 79°04’44’’O) y en la Reserva Arcoíris (3°59’03’’S, 79°5’28’’O) ubicadas en la Cordillera Real Oriental de los Andes del Sur de Ecuador. La Reserva Biológica San Francisco (RBSF) comprende bosques montanos entre los 1800 y 3150 m s.n.m. La topografía de estas áreas es escarpada con pendientes entre 40 y 60° pero frecuentemente pueden llegar hasta 90°. Las temperaturas anuales promedio en la RBSF están entre 15 y 17 °C en zonas bajas y en las zonas altas entre 9 y 11 °C. Los periodos de mayor precipitación son durante los meses de febrero a marzo y junio a septiembre, seguidos por épocas más secas que pueden causar temporadas áridas cortas especialmente durante los meses de octubre a enero (Bussmann, 2003). En las partes altas de la RBSF, la neblina está presente durante todo el año (Bussmann, 2003). La Reserva Arcoíris abarca una extensión de 6 hectáreas que incluye un bosque nublado localizado a 2180 m s.n.m. Presenta un clima templado húmedo sin estación seca, con alta humedad y frecuentes lluvias. Las máximas precipitaciones son a mediados del año con temperaturas que oscilan entre los 12° y 18 °C. La topografía es escarpada y presenta frecuentes deslizamientos de tierras que se pueden observar en las laderas. Existen considerables extensiones de vegetación en buenas condiciones, especialmente en las partes altas. En total, se escogieron tres poblaciones de S. superbiens, dos ubicadas en la Reserva Biológica San Francisco, en los transectos T2 y Q3 (sitio 1 y sitio 2, respectivamente), y la tercera población localizada en la Reserva Arcoíris (sitio 3) (Figura 3).

Figura 3. Ubicación de los sitios de estudio; dos sitios en la Reserva Biológica San Francisco (Sitio1 y Stio2) y uno en la Reserva Arcoiris (Sitio3). Las líneas azules representan las principales vertientes fluviales; las líneas naranja representan los caminos de ingreso a los sitios; las siglas ECSF significan Estación científica San Francisco. Fuete y Elaboración: Obtenido y modificado de Bussman, 2001.

2.1. Muestreo.

Durante el año 2015 y 2016 se muestrearon individuos en flor de S. superbiens. El número de individuos muestreados dependió del tamaño poblacional en cada sitio de estudio. De las poblaciones de S. superbiens localizadas en la Reserva Biológica San Francisco (sitio1) y en la Reserva Arcoíris (sitio 3) se muestrearon 15 individuos de orquídeas, mientras que en la población correspondiente al sitio 2 (RBSF) se muestreó 20 individuos. En total se obtuvo muestras de raíces de 50 individuos de orquídeas. De cada espécimen de orquídea se colectó de tres a cinco raíces que estuvieron en contacto directo con el sustrato. Se seleccionaron raíces jóvenes, con apariencia saludable y con color amarillento u opaco, característico de raíces con colonización (Zhu et al., 2008). Una vez colectadas las raíces se conservaron inmediatamente en etanol 50% para el análisis posterior en el laboratorio.

2.2. Análisis microscópico de raíces.

En el laboratorio se procedió a comprobar la colonización de las raíces mediante microscopía, para lo cual se seleccionó un pequeño fragmento de la raíz de aproximadamente 1 cm de longitud. Se realizó finos cortes transversales a cada extremo de dichos fragmentos, para luego ser montados en un porta objetos y teñidos con azul de metilo (0.05% en ácido láctico, Merck C.I. 42780) durante tres minutos (Kottke et al., 2010). Los cortes se observaron en un microscopio óptico para constatar la presencia de pelotones dentro de las células corticales de las raíces. Luego de verificar la colonización, se procedió a esterilizar los pequeños fragmentos de raíces sumergiéndolos en agua con unas gotas de jabón por 3 minutos, seguido por un lavado en etanol (70%) por 30 segundos, posteriormente un enjuague en una solución de hipoclorito de sodio (20%) por 10 minutos y finalmente tres enjuagues en agua destilada estéril por tres minutos cada uno (Suárez et al., 2006). Después que las raíces se desinfectaron, el velamen de cada raíz fue removido dejando únicamente el tejido cortical que contiene los pelotones. Los segmentos de raíz fueron colocados en micro-tubos de 1.5 mL para la inmediata extracción del ADN.

2.3. Análisis molecular.

El ADN de las raíces de orquídeas se extrajo usando el Plant Total DNA Purification Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA) basándonos en las instrucciones del fabricante. El ADN obtenido de las muestras colectadas se conservó a -20 °C. Seguidamente, la región ITS2 de ADNrn se 15 amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos pares de cebadores específicos para hongos: ITS86F (5’-GTGAATCATCGAATCTTTGAA-3’; Turenne et al., 2003) combinado con ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’; White et al., 1990) e ITS3 (5´- GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’; White et al., 1990) combinado con ITS4OF (5´- GTTACTAGGGGAATCCTTGTT-3’; Taylor & McCormick, 2007). Los cebadores utilizados fueron seleccionados ya que garantizan la identificación de una amplia gama de hongos micorrízicos de orquídeas (Jacquemyn et al., 2014, 2015; Waud et al., 2014, 2016). El volumen final de reacción de PCR fue de 20 uL que contenía: 12.2 uL de agua destilada desionizada estéril, 4 uL de 5x phusion HF Buffer, 0.4 uL de DNTPs, 0.4 uL de cada primer, 0.8 uL de Phusion DNA Polymerase (Thermo Fisher, California, USA) y 2 uL de ADN total. Las condiciones de la PCR para los dos pares de cebadores fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 98 °C por 30 s, seguido de 35 ciclos, cada uno constó de una desnaturalización de 98 °C por 10 s, anillamiento a 60 °C por 30 s, extensión a 72 °C por 30 s y una extensión final a 72 °C por 10 minutos. Todas las PCRs incluyeron un control negativo que contenía el mix de la PCR sin ADN. El éxito de la amplificación se confirmó por electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium, Baltimore, USA). Las muestras con el tamaño esperado (250 a 350 pb) se purificaron usando el kit Wizard SVClean (PROMEGA, Madison, USA) y finalmente se secuenciaron con la tecnología MiSeq® de Illumina (Illumina, Inc.) en los laboratorios IMGM (Martinsried, Alemania).

2.4. Delimitación de OTUs.

A partir de los datos crudos obtenidos de las 50 muestras secuenciadas con Illumina, se delimitó unidades taxonómicas operacionales (OTUs) usando el algoritmo UPARSE implementado en USEARCH Ver.8.0.1623 (Edgar, 2013). Se aplicó un filtro de calidad con un umbral máximo de error de 0.3 por secuencias individuales y estas secuencias fueron unidas en secuencias individuales. Todas las muestras fueron etiquetadas y mezcladas en un solo archivo para maximizar el descubrimiento de OTUs. Se eliminaron los singletons (secuencias que aparecieron una sola vez) y las secuencias quiméricas. Las OTUs fueron delimitados usando una homología de secuencias del 97%. Finalmente, las OTUs fueron asignados a nivel taxonómico usando la base de datos de UNITE a través de la plataforma PlutoF (Abarenkov et al., 2010).

2.5. Análisis de la composición de la comunidad de hongos micorrízicos.

Para determinar la riqueza de especies acumuladas por sitio de estudio frente al esfuerzo de muestreo se construyó una curva de acumulación de especies usando EstimateS Ver. 9.1.0 (Colwell, 2013). Para un proceso de “suavizado” de la curva se usó 100 permutaciones, considerando como esfuerzo de muestreo cada individuo colectado, independientemente en cada una de las tres poblaciones de orquídeas. En dicha curva se asume que la riqueza total en el número de especies se encontrará con un esfuerzo de muestreo infinito, es decir, la asíntota (Gonzáles et al., 2010). La riqueza de especies fúngicas fue evaluada ajustando los datos a la ecuación de Clench (Sn=a*n/(1+b*n)) usando el programa Statistica Ver. 7.0.61.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA), en donde a es la tasa de incremento de nuevas especies al inicio del inventario y b es un parámetro relacionado con la forma de la curva (Jiménez-Valverde & Hortal, 2003). Para evaluar la calidad del inventario se usó estos valores a y b, con lo que fue posible calcular la proporción de especies registradas (Jiménez-Valverde y Hortal, 2003) y el esfuerzo de muestro necesario para registrar el 95% de las especies estimadas. La simililaridad en la composición de las comunidades de hongos micorrízicos de orquídeas entre los sitios se evaluó calculando el índice de similitud de Chao-Jaccard y de Chao-Sørensen (Chao et al., 2005) con EstimateS (Colwell, 2013). Se usó un ordenamiento no paramétrico multidimensional (NMDS) para visualizar las diferencias entre los sitios en la estructura de la comunidad de las OTUs micorrízicos asociadas a S. superbiens. Además, se usó el análisis de similitud (ANOSIM) para evaluar las diferencias en la composición de las OTUs entre los sitios. El estadístico global R2 de ANOSIM indica el grado de separación entre los grupos, desde 0 (sin separación) hasta 1 (separación completa) (Clarke y Gorley 2001). El NMDS y ANOSIM se realizaron usando la distancia Bray-Curtis y 999 permutaciones. Todos los análisis se realizaron utilizando el paquete vegan en el entorno de estadística R Ver. 3.02 (R Development Core Team 2013) (Oksanen et al., 2013).

CAPÍTULO 3

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3. Muestreo, colonización de raíces y PCR.

Todas las muestras de raíces que se colectaron estaban colonizadas. Se pudo observar en el interior de las células corticales las hifas de los hongos formando ovillos que contenían hifas jóvenes; pero también se observaron algunas estructuras grumosas que denotaban pelotones colapsados. Se logró obtener mediante PCR amplicones -para cada par de cebadores- de la region ITS2 de ADNrn de todas las muestras colectadas.

3.1. Riqueza de OTUs asociados a Stelis superbiens.

Luego de la secuenciación con la tecnología Illumina MiSeq, se obtuvieron 3277318 secuencias crudas desde todas las muestras. De estas secuencias se reconstruyó y delimitó 3553 OTUs usando un porcentaje de similitud de secuencias del 97%. Este es el umbral que se usa normalmente para la delimitación de OTUs de hongos micorrízicos (Martos et al., 2012) ya que se lo considera el sustituto habitual de la delimitación de especies entre basidiomicetos (Hughes et al., 2009; Jacquemyn et al., 2010). Sin embargo, en otros estudios también se han usado diferentes umbrales, por ejemplo, 95% en Cruz et al. (2011), Herrera et al. (2017) y Linde et al. (2011). Esto puede afectar la diversidad y riqueza de los hongos obtenidos en cada estudio y las comparaciones de riqueza podrían fluctuar dependiendo del umbral que se use. A pesar de esto en Herrera et al. (2017) la riqueza obtenida de Tulasnellales fue apenas diferente cuando se usó un umbral de 97 y 95% de similaridad de secuencias. Las OTUs delimitadas pertenecieron a los siguientes grupos de hongos: 1846 (53%) al filo Basidiomycota, 1523 al filo Ascomycota, 54 a Glomeromycota y 48 correspondieron a otros grupos de hongos (Figura 4). El filo Basidiomycota incluye varias especies de hongos formadoras de asociaciones micorrízicas de orquídeas (Dearnaley et al., 2012). En nuestro estudio, Serendipitaceae fue el más rico con 59 OTUs, seguido por Ceratobasidiaceae con 56 OTUs; Tulasnellaceae con 49 OTUs, y finalmente el orden Atractiellales con 7 OTUs, obteniendo un total de 171 OTUs de hongos micorrízicos asociados a S. superbiens (Figura 5).

Glomeromycota Otros 2% 1%

Ascomycota 44% Basidiomycota 53%

Figura 4. Porcentaje de OTUs detectados en las raíces recolectadas de tres poblaciones de S. Superbiens ubicadas en la Reserva Biológica San Francisco y en la Reserva Arcoíris en el Sur de Ecuador. Fuente y Elaboración: Autora

70 60 50 40 30 20 10 0

Figura 5. Distribución de frecuencias de OTUs de hongos micorrízicos asociados a tres poblaciones de S. superbiens ubicadas en la Reserva Biológica San Francisco y la Reserva Arcoíris en el Sur de Ecuador. Fuente y Elaboración: Autora

Nuestros resultados concuerdan con estudios previos en los que se evaluó la diversidad de hongos micorrízicos de orquídeas en varias especies de orquídeas epífitas. En estos estudios se encontró hongos micobiontes pertenecientes a las familias Ceratobasidiaceae 20

(Cevallos et al., 2017), Tulasnellaceae (Herrera et al., 2017; Kottke et al., 2013; Suárez et al., 2006), Serendipitaceae (Cevallos et al., 2017; Herrera et al., 2017; Xing et al., 2015) y Atractiellales (Kottke et al., 2010, Suárez et al., 2016). Contrario a nuestro estudio, Herrera et al. (2017) y Suárez et al. (2006) detectaron que los micobiontes con mayor incidencia fueron los pertenecientes a la familia Tulasnellaceae en varias especies de orquídeas incluyendo a Stelis superbiens, Stelis halli, Stelis concinna que son especies epífitas del bosque tropical. Se ha sugerido que Tulasnellaceae podría ser el principal linaje de hongos implicados en la simbiosis de micorrizas de orquídeas epífitas (Martos et al., 2012; McCormick et al., 2004; Shefferson et al., 2005; Suárez et al., 2006). Pero, coincidente con nuestro estudio, Cevallos et al. (2017) detectaron a la familia Serendipitaceae como el grupo más rico de hongos micorrízicos asociados con orquídeas epífitas en una zona aledaña del Parque Nacional Podocarpus. A pesar de que Serendipitaceae es considerado un grupo que no presenta alta diversidad en ecosistemas montanos y subandinos (Serato et al., 2012), en nuestro estudio fue el grupo predominante. Esto se puede deber a que el grupo dominante de hongos tiende a variar entre especies de orquídeas e inclusive entre los sitios estudiados (Jacquemyn et al., 2016). Además, es posible que la riqueza detectada dependa de los cebadores utilizados para amplificar el ADN de los hongos (Herrera et al., 2017) y de los métodos de secuenciación empleados. A diferencia de los estudios previos mencionados (Herrera et al., 2017; Kottke et al., 2013; Suárez et al., 2006, 2008, 2016), nosotros utilizamos la tecnología de Illumina y una combinación de dos pares de cebadores para la PCR, con lo cual logramos una mejor capacidad de detección y por lo tanto una mayor estimación de la riqueza fúngica en estas comunidades complejas (Taylor et al., 2016; Schmidt et al., 2013) Por otra parte, no hay evidencia concluyente para considerar a los OTUs pertenecientes a Ascomycota como hongos micorrízicos de orquídeas epífitas (Suárez et al., 2006; Herrera et al., 2010). A pesar de ello estudios realizados por Dearnaley et al., (2012) revelaron que la diversidad de hongos asociados a orquídeas es mucho más compleja y que otros basidiomycetes e incluso ascomycetes pueden estar implicados en micorrízas de orquídeas.

3.2. Diferencia de la riqueza de OTUs micorrízicos entre sitios.

Se encontró 60 OTUs asociados a S. superbiens en el sitio 1, 106 OTUs en el sitio 2 y 81 OTUs en el sitio 3. En los tres sitios de estudio, la familia Ceratobasidiaceae fue la más rica (Figura 6), y también, en cada sitio las OTUs más frecuentes pertenecieron a la familia Ceratobasidiaceae. En el sitio 1, la OTU más frecuente fue la OTU 4 detectado en el 86% (13 en total); en el sitio 2

21 la OTU de mayor incidencia fue la OTU 1849 presente en el 80% de las muestras; y en el sitio 3 la más frecuente fue la OTU 128 que se encontró en el 73% de las muestras.

40 35 Ceratobasidiacea 30 Serendipitaceae 25 20 Tulasnellaceae 15 Atractiellales Número OTUs de 10 5 0 Sitio 1 Sitio 2 Sitio 3

Figura 6. Distribución de los cuatro grupos de hongos micorrízicos (Tulasnellaceae, Ceratobasidiaceae, Serendipitaceae y Atractiellales) asociados con tres poblaciones de S. superbiens localizadas en la RBSF y en la Reserva Arcoiris. Fuente y Elaboración: Autora

A pesar de que Serendipitaceae fue el grupo de hogos más rico asociado a S. superbiens (en todos los tres sitios), en cada sitio individual fue Ceratobasidiaceae. Esto se debe a que un buen número de las OTUs de Ceratobasidiaceae se están compartiendo entre los sitios. Este grupo de micobiontes ya se ha detectado como un hongo micorrízico de orquídeas epífitas (Dearnaley et al., 2012; Martos et al., 2012) y por primera vez reportamos a Ceratobasidiaceae interactuando con S. superbiens. Es posible que los cebadores ITS1 y TW14 usados en los trabajos previos no fueron capaces de detectar a Ceratobasidiaceae en las muestras de raíces (Herrera et al., 2017; Kottke et al., 2010, 2013; Suárez et al., 2006). En nuestro estudio se pudo evidenciar que S. superbiens no tiene especificidad por los hongos micorrízicos. Por ejemplo, encontramos que una sola muestra de la orquídea estaba asociada con 16 OTUs distintos. Existen otros reportes en que ciertas especies de orquídeas epífitas están asociadas específicamente con una sola especie de Ceratobasidium (Graham & Dearnaley, 2012; Otero et al., 2004, 2007) o de Tulasnella (Riofrío et al., 2013). Pero igual que en nuestro estudio algunos trabajos han reportado a S. superbiens asociados a multiples

22 especies de hongos pertenecientes a varias familias de hongos micorrízicos (Herrera et al., 2017; Kottke et al., 2010, 2013; Suárez et al., 2006). Las curvas de acumulación de especies revelaron diferencias significativas en la riqueza de OTUs micorrízicos asociados a S. superbiens (Figura 7). Sin embargo, estas fueron asintóticas (el porcentaje de OTUs estimada para los tres sitios llegó hasta el 70%) y nos indican que es necesario un mayor esfuerzo de muestreo (30 muestras en promedio) para completar el número de especies total estimado en cada sitio (Figura 7). Por lo tanto, es posible que aún exista un gran número de especies de hongos micorrízicos que no han sido detectados, y considerando el número total de hongos detectados (3553 OTUs fúngicos) creemos que aún podemos tener varias especies de hongos micorrízicos que aún no han sido descritas. A pesar de que es posible que estemos subsestimando la riqueza de hongos asociados a S. superbiens, el uso de Illumina nos permitió identificar una amplia riqueza de micobiontes, a diferencia de otros estudios en los que utilizando otros tipos de secuenciación se detectó una riqueza mucho menor (Herrera et al., 2017; Kottke et al., 2010, 2013; Suárez et al., 2006, 2008). La variación de la riqueza de OTUs en los diferentes sitios puede estar asociada con los factores medioambientales que afectan la distribución de los hongos en cada sitio (Cevallos et al., 2017; Herrera, 2017). Uno de los factores podría ser el acceso a diferentes recursos de nutrientes (Pellegrino et al., 2014) ya que la capacidad de las plantas para asociarse con múltiples hongos al mismo tiempo les permite tolerar condiciones ambientales más amplias y explotar los diferentes recursos nutricionales de manera más eficiente (Jacquemyn et al., 2012; McCormick et al., 2006). Este estudio apoya la idea de que las orquídeas epífitas interactúan con una amplia gama de micobiontes diseminados, lo que indica su presencia en los tres sitios y en otras localidades de los Andes del Sur del Ecuador (Herrera, 2017). No podemos descartar que estas diferencias se deban al número de individuos muestreados en cada sitio, ya que debido a la distribución no homogénea de esta orquídea en cada parcela el muestreo no fue uniforme.

Figura 7. Curva de acumulación de OTUs obtenidos al acumular muestras de orquídeas de Stelis superbiens en tres sitios localizados en la Reserva biológica San Francisco y en la Reserva Arcoíris. Los rombos muestran los valores asintóticos para cada curva de acumulación y las barras verticales en los puntos indican los intervalos de confianza al 95%. Fuente y Elaboración: Autora

Los índices de similaridad de Chao-Jaccard y Chao-Sørensen nos demostraron que hubo una alta similitud en la identidad de los OTUs entre los sitios 1 y 2 y una menor similitud entre los sitios 2 y 3 (Tabla 1). Se encontró un total de 27 OTUs compartidos entre los tres sitios, 17 OTUs son exclusivos del sitio 1, 63 OTUs del sitio 2 y 42 OTUs del sitio 3 (Figura 8). El sitio 1 y 3 fueron los que compartieron más OTUs. De estos 27 hongos, 12 pertenecieron a Ceratobasidiaceae, 7 a Serendipitaceae, 5 a Tulasnellaceae y finalmente 3 pertenecieron a Atractiellales. De estos resultados se evidencia que en el sitio 2 hay mayor cantidad de micobiontes propios del lugar, pero debemos tener en cuenta que en este sitio se pudo colectar más muestras que en los otros dos sitios. Estos resultados apoyan la observación de que esta especie de orquídea no tiene preferencias por los hongos y es más bien generalista, por lo que tiende a asociarse con diferentes comunidades de hongos según estén disponibles en cada sitio (Herrera et al. 2017). Además, existe un grupo de hongos ampliamente distribuidos a los que se asocia S. superbiens y que serían clave para la existencia de esta especie en cada sitio (Cevallos et al., 2017).

Figura 8. Distribución de OTUs micorrízicos por sitios. El número total de OTUs para cada sitio se encuentra subrayado; el número de OTUs exclusivo de cada sitio se representa en negrita y el número de OTUs compartidos entre sitios en cursiva. Fuente y Elaboración: Autora

Tabla 1. Análisis de Varianza de la similitud entre las comunidades de micobiontes de las tres poblaciones expresados como los índices de Chao-Jaccard y Chao-Sørensen. Estos índices toman valores desde cero a uno, cero cuando no se comparte ninguna especie y uno cuando los dos sitios comparten la misma especie.

Comparación Chao-Jaccard Chao-Sørensen

Sitio 1 vs. Sitio 2 0,743 0,852

Sitio 1 vs. Sitio 3 0,628 0,771

Sitio 2 vs. Sitio 3 0,513 0,679

Fuente: Autora

3.3. Composición de la comunidad de hongos micorrízicos en los tres sitios.

El análisis NMDS reveló que la comunidad de los OTUs micorrízicos entre sitios fue significativamente diferente (Figura 9). Esta diferencia además fue confirmado por el análisis de ANOSIM (R2 = 0.103, P = 0.002). Sin embargo, no se pueden considerar a estas comunidades como grupos totalmente independientes, ya que de acuerdo con Schiller (2003), dos grupos que están siendo comparados sólo pueden ser considerados totalmente diferentes cuando los valores de R están entre 0.75 y 1.

Figura 9. Análisis de ordenamiento no paramétrico multidimensional (NMDS) realizado para los tres sitios de estudio: sitio1 (puntos negros) sitio2 (puntos blancos) y sitio3 (triángulos blancos). Stress = 0.17. Fuente y Elaboración: Autora

En otras palabras, observamos que las comunidades de hongos micorrízicos encontrados en las tres poblaciones de S. Superbiens son significativamente distintas. Nuestros resultados concuerdan con estudios realizados por Jacquemyn et al. (2014), donde corroboran que la composición de las comunidades de micorrizas asociadas a orquídeas fueron diferentes entre sitios. Cevallos et al. (2017) propuso que las comunidades de micorrizas pueden ajustarse al sitio en torno a un núcleo de especies clave distribuidas globalmente. Aunque aún es difícil entender como las comunidades de micorrizas están construidas y cuáles son los factores que determinan la especificidad de la interacción, está claro que la simbiosis entre hongos y orquídeas involucra una gran variedad de especies de hongos que pueden tener diferentes roles para asegurar la adaptabilidad de la orquídeas en su hábitat natural (Cevallos et al., 2017). 26

CONCLUSIONES

Stelis superbiens en el bosque tropical montano lluvioso del Sur del Ecuador está asociada a una alta riqueza de hongos micorrízicos.

Serendipitaceae fue la familia de micobiontes más rico asociados a Stelis superbiens, seguido por Ceratobasidiaceae, Tulasnellaceae y finalmente Atractiellales.

La riqueza de hongos fue significativamente diferente entre los tres sitios de estudio. Sin embargo, el sitio con mayor riqueza fue el sitio 2.

Veintisiete hongos micorrízicos se compartieron entre los tres sitios de estudio, 17 de ellos pertenecieron a Ceratobasidiaceae.

Las comunidades de hongos micorrízicos se diferenciaron entre las tres poblaciones de Stelis superbiens, probablemente debido a que las comunidades de hongos micorrízicos están ajustadas a los distintos sitios.

Con la técnica de Illumina se puede tener una secuenciación más profunda de los hongos formadores de micorrizas de orquídeas, permitiendo que la estimación de los OTUs fúngicos sea más abundante, la caracterización de la comunidad de hongos sea más detallada y la recuperación de la riqueza fúngica más completa.

RECOMENDACIONES

Es necesario incrementar el número de individuos a muestrear para poder alcanzar un inventario completo y de esta manera abarcar la mayor diversidad fúngica.

Se recomienda que para estudios similares, se emplee técnicas moleculares nuevas como Illumina, ya que a pesar de la dificultad existente para la detección de micobiontes, estas tecnologías nos proporcionan una mayor información sobre la diversidad fúngica existente en una población de orquídeas.

Además, es necesario evaluar la diversidad y la estructura de la comunidad de los hongos micorrízicos asociados con otras especies de orquídeas, sobre todo, aquellas que están en peligro de extinción, pues la comunidad de los hongos a las que están asociadas pueden ser clave para su recuperación y conservación.

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