AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ÓLEORESINA DE Copaifera Reticulata Ducke E DO ÓLEO DE COPAÍBA COMERCIAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ÓLEORESINA DE Copaifera reticulata Ducke E DO ÓLEO DE COPAÍBA COMERCIAL.

Natasha Cristina Silva da Silva

Belém-PA

2018

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ÓLEORESINA DE Copaifera reticulata Ducke E DO ÓLEO DE COPAÍBA COMERCIAL.

Autor: Natasha Cristina Silva da Silva Orientadora: Profa. Dra. Maria Fani Dolabela Co-orientador: Prof. Dr. Julio Cesar Pieczarka

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas, área de concentração: Fármacos e Medicamentos, do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará como requisito final para obtenção do Título de mestre em Ciências Farmacêuticas.

Belém-PA 2018

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Sistema de Bibliotecas da Universidade Federal do Pará Gerada automaticamente pelo módulo Ficat, mediante os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

S586a Silva, Natasha Cristina Silva da AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ÓLEORESINA DE Copaifera reticulata Ducke E DO ÓLEO DE COPAÍBA COMERCIAL. / Natasha Cristina Silva da Silva. — 2018 94 f. : il. color

Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas (PPGCF), Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Pará, Belém, 2018. Orientação: Profa. Dra. Maria Fani Dolabela Coorientação: Prof. Dr. Julio Cesar Pieczarka.

1. Antileishmania. 2. Citotóxico. 3. Antimicrobiano. 4. Copaifera. I. Dolabela, Maria Fani, orient. II. Título

CDD 615.323749

FOLHA DE APROVAÇÃO

Natasha Cristina Silva da Silva

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ÓLEORESINA DE Copaifera reticulata Ducke E DO ÓLEO DE COPAÍBA COMERCIAL.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará como requisito final para obtenção do Título de mestre em Ciências Farmacêuticas.

Área de concentração: Fármacos e Medicamentos.

Aprovado em: _____/_____ /2018

Banca Examinadora

______Profa. Dra. Maria Fâni Dolabela (Orientadora) Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas UFPA

______Prof. Dr. Julio Cesar Pieczarka (Co-orientador) Instituto de Ciências Biológicas/UFPA

______Prof. Dr. José Luiz Fernandes Vieira Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas UFPA

______Prof. Dr. Flávio Vasconcelos Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas UFPA

Belém-PA 2018

DEDICATÓRIA

A DEUS, por ser tudo em minha vida, autor do meu destino, meu guia e meu socorro presente nas horas de angústia. As minhas mães, Maria das Graças S. da Silva e Kelem Cristina S. da Silva, por serem minhas bases de sustento com amor, dedicação e apoio, minha imensa gratidão.

AGRADECIMENTOS

Á Deus, pois o que seria de mim sem a fé que tenho nele? Sem ele nada seria possível. A ele, a minha eterna gratidão por ter me guiado e protegido durante toda a minha vida.

À minha família, são infinitos os agradecimentos, pois sempre me apoiaram e entenderam os dias de ausência. Especialmente as minhas duas mães, Graça e Kelem, que por diversas vezes deixaram para trás suas vidas e me apoiaram para que eu pudesse conquistar os meus sonhos. Aos meus irmãos, Marcielem, Mauro Junior e Mayke, por tornarem meus dias melhores através da nossa união. As minhas sobrinhas, Maria Doralice e Ana Cecília, por serem os meus melhores e verdadeiros sorrisos.

À minha orientadora Profa. Dra. Maria Fani Dolabela, por todo apoio durante minha caminhada desde a vida acadêmica. Seu empenho e dedicação na minha orientação foram essências, pois sempre propôs o melhor para mim.

Ào meu co-orientador Prof. Dr. Julio Cesar Pieczarka pelas suas orientações. Agradeço também aos membros do Laboratório de Citogenética Humana da Universidade Federal do Pará (UFPA), pelo companheirismo em várias etapas do meu estudo, em especial Karina Melo, Luana Calandrini e seu Jorge Rissino.

Agradeço as minhas amigas Farmacats (as de sempre para sempre) e Derrota quase certa (a melhor parte que ganhei do meu estudo), os quais tornaram essa caminhada mais leve e especial pelos diversos momentos que compartilhamos. Foi excepsional a ajuda de cada uma, o meu muito obrigado, por tudo.

As minhas amigas de infância, Crislayne Morais e Sabrina Carvalho, às agradeço pelos vários momentos árduos de angústia, aflição e medo, que fizeram eu enchergar que nunca estive sozinha.

Sou grata a todos os membros do laboratório de Farmacologia e Doenças Negligenciadas, em especial, Kelly Alburquerque, Dayse Brandão, Valdicley Vale, Alexandre Rosa, Heliton Brígido, Analu Damasceno, Milena Martins, Andreza Veiga, Juliana Corrêa, Ana Laura e aos que participaram direta ou indiretamente dessa pesquisa. Obrigado por serem pessoas tão prestativas e dispostas. Agradeço por tornarem o ambiente de trabalho tão amavél.

Minha eterna gratidão ao meu irmão, João Victor, que por infinitas vezes esteve sempre ao meu lado, mesmo que distante. A Profa. Dra. Katia da Silva Calabrese do Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia do Instituto Oswaldo Cruz - IOC/FioCruz e ao seu grupo de pesquisa, que apoiaram a parceria para a realização deste estudo, o meu muito obrigado.

Ao Prof. Dr Lourivaldo da Silva Santos, assim como a Luely Oliveira do Laboratório de Produtos Naturais do Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade

Federal do Pará (UFPA), obrigado pela parceria e toda a colaboração que tive durante este caminho.

Às secretárias do curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Pará (UFPA), Brasília e Cliciane, pela paciência e carinho durante o mestrado.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela bolsa concedida.

Por fim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho, minha sincera gratidão.

EPÍGRAFE

Aqueles que semeiam com lágrimas, com cantos de alegria colherão. Aquele que sai chorando enquanto lança a semente, voltará com cantos de alegria, trazendo os seus feixes. Salmos 126:5-6

RESUMO

SILVA, N. C. S. AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES BIOLÓGICAS DA ÓLEORESINA DE Copaifera reticulata Ducke E DO ÓLEO DE COPAÍBA COMERCIAL. 94 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Pará, Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas, Belém, 2018.

O objetivo do trabalho foi avaliar e comparar a atividade antitumoral, leishmanicida e antimicrobiana da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke ao óleo de copaiba comercial (Copaifera sp.), assim como suas frações e substâncias puras. Através da reação de epoxidação houve a síntese do óxido de cariofileno. Realizou a extração ácido/base da óleoresina de Copaifera reticulata (ORCR) e do óleo de copaíba comercial (OCC), obtendo duas frações ácidas (frações de diterpenos) e duas frações de neutros (frações de sesquiterpenos). A atividade leishmanicida foi realizada contra formas de promastigota, duas cepas de Leishmania amazonensis e uma de Leishmania infantum. A viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium) frente ás células de adenocarcinoma gástrico primário (ACP02). A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método de microdiluição em cepas de Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis e Candida albicans, sendo a viabilidade microbiológica verificada pelo método de TTC (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio). As amostras não foram citotóxicas em células ACP02. A ORCR, fração de neutros de C. reticulata (FNCR), fração ácida do óleo comercial (FAOC) e fração de neutros do óleo comercial (FNOC) foram ativas em L. amazonensis, mas somente a FNCR e FAOC inibiram a cepa de L. infantum. As substâncias puras (β-cariofileno e óxido de cariofileno) apresentaram atividade frente às cepas e com aumento da seletividade. Todas as amostras se mostraram ativas, mas pouco seletivas em Salmonella spp. Apenas as frações dos óleos contribuíram para a inibição das cepas de P. mirabilis, porém com pouca seletividade, se tratando de P. aeruginosa, as frações do OCC e as substâncias puras tiveram o mesmo comportamento. Entretanto, ao analisar o fracionamento da ORCR, tanto esta quanto suas frações apresentaram atividade, mas suas frações foram mais seletivas para a inibição de P. aeruginosa. Os resultados foram bastante promissores frente às bactérias gram-negativas e o fracionamento dos óleos contribuiu com a atividade leishmanicida e antimicrobiana. Ao analisar estes resultados antimicrobianos com os de leshmanicida, apenas a FACR (fração ácida de C. reticulata) e FNCR se apresentaram eficazes frente à bactéria P. aeruginosa, sendo que o ORCR, FNCR, β-cariofileno e o óxido de cariofileno foram promissores para atividade antileishmania. Estes resultados sugerem que há diferenças entre os óleos, portanto a origem do óleo influência nas respostas biológicas e possivelmente a atividade seja interferida pela composição química das amostras. A ORCR e FNCR são ativas e seletivas para a atividade leishmanicida e é bem provável que os sesquiterpenos (β-cariofileno e óxido de cariofileno) sejam os responsáveis por esta atividade, sendo o β-cariofileno altamente seletivo para L. amazonensis.

Palavras-chave: Antileishmania, Citotóxico, Antimicrobiano, Copaifera.

ABSTRACT

SILVA, N. C. S. EVALUATION OF THE BIOLOGICAL ACTIVITIES OF THE OLEORESIN OF Copaifera reticulata Ducke AND THE OIL OF COPAÍBA COMERCIAL. 94 f. Dissertation (Master degree) – Universidade Federal do Pará, Degree in Pharmacology Sciences, Belém, 2018.

The aim of this work was to evaluate and compare antitumor, leishmanicide and antimicrobial activity of Copaifera reticulata Ducke oleoresin to commercial copaiba oil (Copaifera sp.), As well as its fractions and pure substances. Through the epoxidation reaction there was the caryophyllene oxide synthesis. From acid/base extraction of Copaifera reticulata oleoresin (ORCR) and commercial copaiba oil (OCC) two acid fractions (diterpene fractions) and two neutral fractions (sesquiterpene fractions) were obtained. Leishmanicidal activity was performed against promastigote forms, two strains of Leishmania amazonensis and one of Leishmania infantum. Cell viability was assessed by MTT method (3- (4,5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) against primary gastric adenocarcinoma cells (ACP02). The antimicrobial activity was evaluated by microdilution method in strains of Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis and Candida albicans, and the microbiological viability verified by TTC method (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride). Samples were not cytotoxic in ACP02 cells. The ORCR, neutral fraction of C. reticulata (FNCR), commercial oil acid fraction (FAOC) and commercial oil neutral fraction (FNOC) were active in L. amazonensis, but only FNCR and FAOC inhibited the L infantum strain. The pure substances (β-caryophyllene and caryophyllene oxide) showed activity against the strains and increased selectivity. All samples were active but not selective in Salmonella spp. Only the fractions contributed to P. mirabilis strains inhibition, but with little selectivity, in the case of P. aeruginosa, the OCC fractions and pure substances had the same behavior. However, when analyzing ORCR fractionation, both showed activity, but their fractions were more selective for P. aeruginosa inhibition. The results were promising for gram-negative bacteria and the fractionation contributed to leishmanicide and antimicrobial activity. When analyzing these antimicrobial and leshmanicide results, only the FACR (acidic fraction of C. reticulata) and FNCR were effective against P. aeruginosa, and the ORCR, FNCR, β-caryophyllene and caryophyllene oxide were promising for antileishmanial activity. These results suggest there are differences between the oils, therefore their origin influences the biological responses and the activity is possibly interfered by samples chemical composition. The ORCR and FNCR are active and selective for leishmanicide activity and sesquiterpenes (β-caryophyllene and caryophyllene oxide) are probably responsible for this activity, and β-caryophyllene is highly selective for L. amazonensis.

Keywords: Antileishmanial, Cytotoxic, Antimicrobial, Copaifeira.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Metabólitos isolados da óleoresina de Copaifera L. 22 Figura 2 - Metabólitos isolados de Copaifera reticulata 29 Figura 3 - Fotografia do tronco de Copaifera reticulata Ducke 44 Figura 4 - Fluxograma da Extração ácido/base da óleoresina de 46 Copaifera reticulata Ducke e Copaifera sp.

Figura 5 - Reação de epoxidação 47 Figura 6 - Enzimas mitocondriais fazendo a redução do MTT para 49 formazano Figura 7 - Esquema das placas para o ensaio de viabilidade celular em 50 células ACP02 Figura 8 - Esquema das placas para a atividade antipromastigota 53 Figura 9 - Conversão do cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio em 1-fenil-2- 57 [(Z)-fenil(fenilhidrazono)metil]diazeno

Figura 10 - Esquema das placas para a atividade antimicrobiana 59 Figura 11 - Viabilidade celular da óleoresina de Copaifera reticulata 65 Ducke, frações e β-cariofileno em linhagem ACP02 Figura 12 - Estereoisômero de sesquiterpeno 66

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Atividades biológicas de terpenos 24

Quadro 2 - Interpretação dos resultados baseado na faixa do CC50 51

Quadro 3 - Interpretação dos resultados baseado na faixa do CI50 54/60 Quadro 4 - Interpretação do índice de seletividade (IS) 55

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Atividade farmacológica atribuída aos metabólitos isolados de 30 espécies de Copaifera sp. Tabela 2 - Avaliação da citotoxicidade das amostras de C. reitulata frente 64 à linhagem ACP02 Tabela 3 - Avaliação da atividade leishmanicida das amostras de C. 67 reitulata frente à L. amazonensisa Tabela 4 - Avaliação antipromastigota e citotoxicidade de óleos, frações e 70 substâncias puras Tabela 5 - Avaliação da atividade antimicrobiana 74 Tabela 6 - Síntese das atividades biológicas 76

LISTA DE EQUAÇÕES

Equação 1 - Percentual de células viáveis 51 Equação 2 - Percentual da viabilidade 54/60 Equação 3 - Índice de seletividade 55

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

> Maior % Porcentagem (E) Isomeria geométrica (Z) Isomeria geométrica Cis Isomeria geométrica Trans Isomeria geométrica < Menor µg Micrograma µM Micromolar ACP02 Adenocarcinoma gástrico primário AGP-01 Adenocarcinoma gástrico AMP ciclíco Adenosina 3',5'-monofosfato cíclico ATCC American type culture collection ATP Trifosfato de adenosina BETA β-cariofileno CBM Concentração bactericida mínima

CE50 Concentração do efluente que causa efeito agudo de 50% CEM Células estromais mesenquimais

CC50 Concentração citotóxica mínima 50% CG-MS Cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa CIM Concentração inibitória mínima

CI50 Concentração inibitória mínima 50%

CL50 Concentração letal média

CL90 Concentração letal de 90% CLSI Clinical & laboratory Standards institute cm Centímetro CN Controle negativo

CO2 Gás carbônico CP Controle positivo DLD-1 Adenocarcinoma colorretal

DL50 Dose letal 50% DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico DP Desvio padrão

Emax Resposta máxima

Et2O Éter de petróleo FACR Fração ácida de Copaifera reticulata FAOC Fração ácida do óleo de copaíba comercial FNCR Fração de neutros de Copaifera reticulata FNOC Fração de neutros do óleo de copaíba comercial g Grama H Horas HCl Ácido clorídrico HCT116 Células de câncer colorretal HCT-8 Células de adenocarcinoma ileocecal humana Hela Célula imortalizada de linhagem celular humana HepG2 Células de hepatocarcinoma humano HT-29 Células de carcinoma de cólon humano IFN-γ Interferon gamma IL Interleucina IS Índice de seletividade J774G8 Células de linhagem macrofágica JNK2 c-Jun proteínas N-terminais quinases 2 Kg Quilograma KOH Hidróxido de potássio L-929 Fibroblastos de camundongos MCF-7 Células de câncer de mama Mg Miligrama min. Minuto mL Mililitro Mm MiliMolar MM Massa molar mRNA RNA mensageiro

MTT Brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium) N.A Não avaliado NaCl Cloreto de sódio NaOH Hidróxido de sódio ND Não determinado NF-kB Fator nuclear kappa B NIH-OVCAR Células de carcinoma ovariano NK Células natural killer NNN Novy-nicolle-mcneal Nm Nanômetro NO Óxido nítrico ºC Graus celsius OCC Óleo de copaíba comercial OECD Organização para a cooperação e desenvolvimento econômico ORCR Óleoresina de Copaifera reticulata ÓXIDO Óxido de cariofileno PBS Phosphate buffered saline (Tampão fosfato-salino) pc Peso corporal pH Potencial hidrogeniônico PPM Partes por milhão RAW 264.7 Células de linhagem macrofágica rpm Rotação por minuto RPMI 1640 Roswell park memorial institute 1640 SBF Soro bovino fetal SF-295 Células de glioblastoma humano SKAMELL-4 Células de melanona Th1 Células T helper1 Th2 Células T helper 2 TP53 Gene supressor tumoral da proteína p53 TTC Cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio U87 Células da glia V79 Fibroblastos de hamster chinês Walker 256 Adenocarcinoma de mama

α Alfa β Beta δ Delta μL Microlitro

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 20 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 25 2.1 Atividades biológicas ...... 25 2.2 Usos populares e atividades biológicas da óleoresina de Copaifera ...... 32 2.2.1 TRATAMENTO DE FERIDAS, CICATRIZANTES E LEISHMANIOSE ...... 32 2.1.2 USO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS OCASIONADAS POR MICRORGANISMOS E ESTUDOS DE AVALIAÇÃO ANTIMICROBIANA...... 34 2.1.3 USO COMO ANTICÂNCER E PRINCIPAIS RESULTADOS DOS ESTUDOS PARA A ATIVIDADE ANTITUMORAL...... 37 3 OBJETIVOS ...... 39 3.1 Objetivo geral ...... 39 3.2 Objetivos específicos ...... 39 4 MATERIAL E MÉTODOS ...... 40 4.1 Material ...... 40 4.1.1 EQUIPAMENTOS ...... 40 4.1.2 MATERIAIS PLÁSTICOS, DE METAL E DE VIDRO ...... 41 4.1.3 VIDRARIAS ...... 42 4.1.4 OUTROS ...... 42 4.1.5 MATERIAL BIOLÓGICO ...... 43 4.1.6 MATERIAL VEGETAL ...... 44 4.2 Métodos ...... 45 4.2.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS ...... 45 4.2.1.1 Aquisição do material vegetal ...... 45 4.2.1.2 Obtenção das frações e perfis químicos...... 45 4.2.1.3 Síntese do óxido de cariofileno ...... 46 4.2.2 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA ...... 47 4.2.2.1 Cultivo e manuntenção das linhagens celulares ...... 47 4.2.2.2 Ensaio de viabilidade celular (método MTT) ...... 48 4.2.2.2.1 Células ACP02 ...... 49 4.2.2.3 Atividade antileishmania ...... 51

4.2.2.3.1 Manutenção do parasita e curva de crescimento ...... 51 4.2.2.3.2 Ensaio da atividade antipromastigota ...... 52 4.2.2.3.3 Determinação do índice de seletividade (IS) ...... 55 4.2.2.4 Atividade antimicrobiana e antifúngica ...... 56 4.2.2.4.1 Cultivo de micro-organismos e preparo das amostras ...... 56 4.2.2.4.2 Ensaio de viabilidade de micro-organismos (método TTC) ...... 56 4.2.2.4.2.1 Método de microdiluição ...... 57 4.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...... 61 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 62 6 CONCLUSÃO ...... 77 REFERÊNCIAS ...... 78 ANEXOS ...... 93

1 INTRODUÇÃO

A população indígena da Amazônia utilizava o óleo de copaíba (Copaifera sp.) com fins medicinais antes da chegada dos portugueses, sendo o primeiro registro descrito deste uso em 1576 (GÂNDAVO, 1576; VOGT e LEMOS, 1982). Em 1587, o “Tratado Descritivo do Brasil” catalogou a utilização do óleo de copaíba, denominando-as de “as árvores e ervas da virtude” (CARRERA et al. 1996), para o tratamento de feridas dos guerreiros após a batalha e no umbigo dos recém- nascidos. Este uso indígena se originou da observação de animais que, quando feridos, esfregavam-se no tronco da copaíba para curar suas feridas (SALVADOR, 1975). Também este óleo vem sendo utilizado, desde o século XVI, como anti- inflamatório e para cicatrização de feridas (BRAGA et al. 1998; VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002; FALCÃO et al. 2005). Vale ressaltar que, um tipo de ferida que pode ter sido tratada com este óleo é a ocasionada por Leishmania. São inúmeros os relatos de uso popular deste óleo, mas se destacam os usos para o tratamento de doenças ocasionadas por bactérias, tais como: antiblenorrágico (OLIVEIRA, 1905; SILVA, 1911; FONSECA, 1927; FONSECA, 1939; FREISE, 1933; GOODMAN e GILMAN, 1945; PECKOLT, 1942; CESAR, 1956; BRAGA, 1960; MATOS, 1997); anti-séptico (OLIVEIRA, 1905; GOODMAN e GILMAN, 1945); para cistite (FREISE, 1933; CESAR, 1956); inflamação de garganta (FIGUEIREDO, 1979; FERREIRA, 1980; VIEIRA, 1992) e antitetânico (RODRIGUES, 1894; SILVA, 1911; TEIXEIRA, 1923; FONSECA, 1927; FREISE, 1933; CESAR, 1956; VIEIRA, 1992). Conforme dito anteriormente, muitas feridas tratadas com o óleo podem ter sido ocasionadas por Leishmania e alguns estudos avaliaram o seu potencial leishmanicida. Entretanto, observa-se que os trabalhos existentes possuem algumas limitações, isto é, algumas vezes utilizaram apenas promastigotas (SANTOS et al. 2008), outras vezes avaliaram apenas o óleo e, consequentemente, o metabólito responsável não foi identificado (SANTOS et al. 2008; RONDON et al. 2012; SANTOS et al. 2012). De qualquer modo, os resultados obtidos demonstraram que este óleo é promissor como leishmanicida (ALBUQUERQUE et al. 2017) e que os diterpenos, talvez, sejam os responsáveis pela atividade (SANTOS et al. 2013).

Vários estudos demonstraram que óleo de copaíba foi ativo em: Escherichia coli (MENDONÇA e ONOFRE, 2009; PIERI et al. 2012), Staphylococcus aureus (BRAGA; SILVA, 2007; SANTOS et al. 2008; MENDONÇA e ONOFRE, 2009; PIERI et al. 2012) e Pseudomonas aeruginosa (MENDONÇA e ONOFRE, 2009; PIERI et al. 2012). Outra alegação de uso popular é como anticancerígeno (RANIERI, 2015). A óleoresina de C. reticulata demonstrou atividade antitumoral em linhagens de células tumorais pulmonar, esta atividade pode estar relacionada à indução de apoptose e alteração no ciclo celular (RANIERI, 2015). A óleoresina de C. duckei induz a expressão do gene TP53, o que leva a indução de morte celular por apoptose e independente da indução de danos no DNA (CASTRO et al. 2017). A óleoresina de copaíba contém ácidos diterpênicos na parte sólida resinosa não volátil (CASCON e GILBERT, 2000; RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004; OLIVEIRA et al. 2006), e contendo sesquiterpenos (RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004; OLIVEIRA et al. 2006). De óleoresinas de Copaifera sp. foram isolados os seguintes sesquiterpenos: β-cariofileno, óxido cariofileno, α-humuleno, δ-cadieno, α- cadinol, α-cubebeno, α-selineno, β-selineno, β-elemeno, α-copaeno, trans-α- bergamoteno e β-bisaboleno. E os diterpenos são os ácidos: copálico, hardwíckiico, poliáltico,caurenóico, colavênico, 3-hidroxi-copálico, 3-acetoxi-copálico, ent-agático, 7-hidroxi-hardwickiico e 7-acetoxi-hardwickiico (Figura 1; BRAGA et al. 2000; VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002; RAMOS, 2006; ROMERO, 2007; VALDEVITE, 2007; LEANDRO et al. 2012). Porém variam na concentração dependendo da espécie (VEIGA JUNIOR et al. 1997; CASCON e GILBERT, 2000; LEANDRO et al. 2012).

O CH2 CH3 CH3 O CH3 CH3 H3C H CH O H CH 3 3 H C CH CH3 3 3 CH3 CH CH2 2 CH3 CH CH CH 3 3 2 CH3 H3C H3C OH H3C H H C CH OAc 3 H C 3 H C CH CH H C CH 3 H3C COOH HO O H3C 3 3 3 3 3 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8)

H CH3 CH CH3 H C 3 O OH O 3 H H C H H CH3 3 O O H3C O O H H3C H H O CH3 CH3 CH H3C H C 2 H C H H C CH2 2 H C 3 3 H H H C 3 CH 3 3 CH H H 2 CH3 H C H H C 3 H 3 H3C CH3 CH3 H O O O O H O O O CH3 H C CH CH CH 3 3 H HO O 3 3 COOH H CH3 O (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)

O CH3 H H CH3 O H3C CH3 H H C CH3 CH3 CH3 3 CH CH2 CH3 CH 2 3 H H2C CH3 CH3 CH CH3 CH3 3 H2C CH3 H H O CH CH CH CH CH H C CH CH 3 2 2 3 2 3 3 2 H H3C O (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) Figura 1 - Metabólitos isolados da óleoresina de Copaifera L. Legenda: (1) - β-cariofileno, (2) - óxido cariofileno, (3) - ácido 7-acetoxi-hardwickiico, (4) - ácido 7-hidroxi-hardwickiico, (5) - α-humuleno, (6) - δ-cadieno, (7) - trans-α-bergamoteno, (8) - α-copaeno, (9) - ácido copálico, (10) - ácido 3-hidroxi-copálico, (11) - ácido 3-acetoxi-copálico, (12) - ácido ent-agático, (13) - ácido hardwickiico, (14) - ácido colavênico, (15) - ácido caurenóico, (16) - β-selineno, (17) - α-selineno, (18) - β-bisaboleno, (19) - β-elemeno, (20) - α-cadinol, (21) - α-cubebeno, (22) - ácido poliáltico

Vários estudos comprovaram o potencial leishmanicida (ALBUQUERQUE et al. 2017), antimicrobiano (PORTO et al. 2009; SOUZA et al. 2011) e antitumoral (GOMES et al. 2008; BRITO et al. 2010) da óleoresina de diferentes espécies de Copaifera, no entanto, ainda existe carência de estudos que avaliem o potencial de seus sesquiterpenos e diterpenos. A atividade antitumoral dos sequisterpenos isolados de outras espécies tem sido relatada, e acredita-se que diferentes vias de sinalização estejam envolvidas nesta atividade, dentre estas se destacam: inibição a ligação ao DNA do fator nuclear κB do fator de transcrição antiapoptótico (NF-κB), ativação das c-Jun proteínas N-terminais quinases 2 (JNK2), inibição de respostas inflamatórias, prevenção de metástases e indução de apoptose (JOHNSON et al. 2008; CHUN et al. 2014; Quadro 1). Estudos demonstraram que diterpenos, obtidos de outras espécies vegetais, são ativos em promastigota de Leishmania donovani (KATHURIA et al. 2014), esta pode estar relacionada a disfunção mitocondrial (KATHURIA et al. 2014; CHÁVEZ et al. 2015). Em relação à atividade antimicrobiana, os diterpenos foram submetidos a estudos que avaliaram sua atividade sobre as bactérias que ocasionam a placa dentária, obtendo-se efeitos inibitórios significativos em: Streptococcus salivarius, Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis e Lactobacillus casei. O ácido copálico também foi ativo contra Porphyromonas gingivalis (PORTO et al. 2009; SOUZA et al. 2011; Quadro 1). Alguns trabalhos demonstraram que diterpenos podem ser promissores na prevenção do câncer, isto é, inibir o processo de carcinogênese (SWEENEY et al. 2005; ZHANG et al. 2005; Quadro 1). Entretanto, seu potencial antitumoral não pode ser descartado, pois a atividade antitumoral de terpenos vem sendo amplamente relatada na literatura (PADUCH et al. 2007). Diante do exposto, ficam algumas questões que precisam ser respondidas: a óleoresina de Copaifera é mais ativa como antitumoral, leishmanicida ou antimicrobiana? Qual classe de metabólito é responsável para cada atividade? Ou a mesma classe de metabólito é responsável por todas as atividades? Existe maior seletividade para qual atividade biológica?

Quadro 1: Atividades biológicas de terpenos Sesquiterpenos Diterpenos Referência  Ativo e pode ocasionar disfunção mitocondrial; SANTOS et al. 2013;  Alterações na membrana e  Ácido hidroxi-copálico: SOARES et al. 2013; mitocôndrias; Leishmanicida ativo em promastigota; KATHURIA et el. 2014;  β-cariofileno: ativo em amastigota  Ácido pinifólico e ácido CHAVEZ et al. 2015; intracelular caurenóico: ativo em amatigota ALBUQUERQUE et al. 2017 axênica  Ativos em Streptococcus salivarius, Streptococcus sobrinus, Streptococcus mutans,  Ativo em Bacillus megaterium, Streptococcus mitis, PORTO et al. 2009; Antimicrobiana Candida albicans, Candida Streptococcus sanguinis e TOSCAN, 2010; pseudotropicalis e Pichia guilliermondii Lactobacillus casei; SOUZA et al. 2011

 Ácido copálico: ativo em Porphyromonas gingivalis  Inibição da ligação do DNA ao fator nuclear κB do fator de transcrição antiapoptótico (NF-κB) e a ativação da SWEENEY et al. 2005; c-Jun proteína N-terminal quinase 2 ZHANG et al. 2005; Anticâncer (JNK2);  Inibição da carcinogênese JOHNSON et al. 2008;

CHUN et al. 2014  Inibição de respostas inflamatórias, prevenção de metástases e indução de apoptose

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Atividades biológicas

As copaíbas pertencem à classe Equisetopsida C. Agardh; subclasse Magnoliidae Novák ex Takht.; superordem Rosanae Takht.; ordem Fabales Bromhead (MOBOT, 2018); família Leguminosae Juss.; subfamília Caesalpinioideae Kunth. e gênero Copaifera L. Este gênero é composto por 72 espécies, em relação ao número de espécies na América e Brasil existe controversas, há relato de 28 espécies nas Américas e 16 espécies no Brasil (VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002), entretanto outro estudo relatou 38 espécies nas Américas, com 29 espécies encontradas no Brasil e dentre estas, 22 são exclusivas deste país (COSTA, 2007). No Brasil, ocorrem nas regiões Norte (Acre, Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins), Nordeste (Bahia, Ceará, Maranhão, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte), Centro-Oeste (Distrito Federal, Goiás, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso), Sudeste (Espírito Santo, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo) e Sul (Paraná, Rio Grande do Sul, Santa Catarina; QUEIROZ et al. 2015). No Brasil já foram relatadas a ocorrência das espécies: Copaifera arenicola (Ducke) J.Costa & L.P. Queiroz; C. coriacea Mart.; C. depilis Dwyer; C. duckei Dwyer; C. elliptica Mart.; C. glycycarpa Ducke; C. guyanensis Desf.; C. langsdorffi Desf.; C. lucens Dwyer; C. luetzelburgii Harms; C. magnifolia Dwyer; C. majorina Dwyer; C. malmei Dwyer; C. marginata Benth; C. martii Hayne; C. multijuga Hayne; C. nana Rizzini; C. oblongifolia Mart. Ex Hayne; C. officinalis (Jacq.) L.; C. paupera (Herzog) Dwyer; C. piresii Ducke; C. pubiflora Benth; C. reticulata Ducke; C. sabulicola J. Costa & L.P. Queiroz; C. trapeifolia Hayne e C. venezuelana F. Ritter & Harms (QUEIROZ et al. 2015). A maior diversidade de Copaifera ocorre na Bahia com 13 espécies, Mato Grosso com 11, no Pará tem a presença de 7, em Goiás, Minas Gerais e Tocantins possuem 6 espécies e no Maranhão tem 5 (COSTA, 2007). As espécies de Copaiferas com maior incidência na região amazônica são: C. reticulata (80%), C. guianensis (10%), C. multijuga (5%) e C. officinalis (5%; PLOWDEN, 2003).

Em termos medicinais destacam-se as seguintes espécies: C. officinalis L. (norte do Amazonas, Roraima, Colombia, Venezuela e San Salvador; ANDRADE JUNIOR et al. 2000), C. guianensis Desf. (Guianas), C. reticulata Ducke, C. multijuga Hayne (Amazônia), C. confertiflora Bth (Piauí), C. langsdorffii Desf. (Brasil, Argentina e Paraguay), C. coriácea Mart. (Bahia), C. cearenses Huber ex Ducke (Ceará; PIO CORRÊA, 1931; WOOD et al. 1940; MORS et al. 1966; SOUZA et al. 1977; PERROT, 1994). A C. langsdorfii Desf. é na verdade um complexo formado por: C. langsdorffii Desf., C. langsdorffii var. grandifolia Benth., C. langsdorffii var. krukovii Dwyer, C. glabra Vogel, C. laxa Hayne, C. malmei Harms, C. laevis Dwyer, C. lucens Dwyer, C. nitida Hayne, C. sellowii Hayne, C. oblongifolia Mart. ex Hayne e C. sabulicola J.A.S. Costa & L.P. Queiroz (COSTA, 2007), C. langsdorfii var. grandifolia, grandiflora, laxa e glabra (LEITE e LLERAS, 1993). As características botânicas do gênero apresentam-se, como árvores. Estípulas precocemente caducas, em disposição opostas, lineares, lanceoladas, ovais ou ainda falciformes, membranáceas a cartáceas. As folhas podem apresentar de 2-12 pares de folíolos, panículas axilares e/ou terminais, pedúnculo ou raque da inflorescência, glabras a densamente hirsutas, espiciformes com flores dispostas alterna e dísticas. As flores são geralmente sésseis ou subsésseis com 4 sépalas, em geral uma, duas ou três mais larga que as demais, são ovais, elípticas ou oblongas, não possuindo pétalas, mas com presença de androceu e estames, livres entre si, filetes glabros, anteras dorsifixas e rimosas, o gineceu é estipitado com ovário orbicular, elíptico-orbicular, ou podendo encontrar oblongo orbicular, glabro, pubescente ou hirsuto, o estilete é glabro, estigma capitado, e contém 2 óvulos. O fruto legume é curto, elíptico-orbicular, em geral com estilete persistente formando um “apêndice”; bivalvado, suculentos após o amadurecimento e depois da dispersão da semente é seco, normalmente uma semente com testa preta, oblonga a orbiculares, o arilo carnoso pode ser branco, amarelo, laranja, vermelho ou purpúreo (COSTA, 2007). As copaibeiras têm crescimento vagaroso, alcançando cerca de 25 a 40 metros de altura e podendo sobreviver cerca de 400 anos. Seu tronco é áspero e tem coloração escura, com medição de 0,4 a 4 metros de diâmetro (VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002). São adaptadas a vários ambientes, em florestas de terra firme, terras alagadas, margens de lagos e igarapés da Bacia Amazônica e nas matas do Cerrado do Brasil. É encontrada em solos arenosos e/ou argilosos e ocupam o

dossel da floresta ou as emergem (ALENCAR et al. 1979; SHANLEY et al. 1998; SAMPAIO, 2000). A época de floração e frutificação não é semelhante entre as regiões e até mesmo entre espécies de copaíba (RIGAMONTE-AZEVEDO et al. 2004). O nome copaíba tem origem remota, historicamente vem do tupi cupa-yba, possuindo significado de a árvore de depósito, ou que ainda a que tem jazida, em menção ao óleo armazenado em seu interior (SAMPAIO, 1928). Denominado então de copaíva (PECKOLT, 1942) ou copahu (LÉRY, 1992) pelos indígenas (do tupi: Kupa’iwa e Kupa’ü, respectivamente), e ainda cupay, na Argentina e no Paraguai (guarani). De forma geral, as Copaiferas são chamadas popularmente de copaíba, e sua óleoresina é amplamente utilizada na medicina popular por via oral e tópica (VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002; PIERI et al. 2009). A óleoresina extraída desta árvore é chamada popularmente como óleo de copaíba ou óleo de pau, apresenta aspectos medicinais propagados desde os índios latino-americanos (ROMERO, 2007). Uma única árvore pode produzir em torno de 40 a 50 litros de óleo por ano (PISO e MARCGRAVE, 1648; MATTA, 1913; GRIEVE, 1994), mas nem todas as espécies têm esta capacidade de produção (PIO CÔRREA, 1931) e dentre a mesma espécie pode ocorrer variações de qualidade e quantidade de óleo (VEIGA JUNIOR et al. 1997). Não tem fatores que determinam a variabilidade de fato, mas sabe-se que as condições ambientais de origem, época do ano e características genéticas das árvores são grandes influenciadores na variação para a produção (ALENCAR, 1982). As espécies com mais recorrência de uso na produção de óleo são: C. reticulata (70%), C. guianensis (10%), C. multijuga (5%) e C. officinalis (5%; LAWRENCE, 1980). A óleoresina de Copaifera reticulata foi caracterizada através de cromatografia gasosa acoplada a espectrofotometria de massa, sendo identificados os constituintes: β-cariofileno, óxido de cariofileno, α-humuleno, δ-cadineno, trans-α- bergamoteno, α-copaeno, ácido copálico, ácido 3-acetoxi-copálico, ácido hardwickiico, β-selineno, α-selineno, β-bisaboleno, β-Elemeno, ácido poliáltico, trans- β-cariofileno, α-gurjuneno, β-chamigreno, β-farneseno, ciclosativeno, aromadendreno, β-sesquifelandreno, α-cedreno, germacreno D, (Z)-α-bisaboleno, (E)-γ-bisaboleno, agatato de dimetila, 16-caureno, α-bulneseno, γ-amorfeno, germacreno B, γ-cadineno, γ-muuroleno, 7-epi-α-selineno, epóxido de humuleno II,

cauranoato de metila (VEIGA JUNIOR et al. 2007; ZOGHBI et al. 2009; SACHETTI et al. 2011; GUIMARÃES-SANTOS et al. 2012; ZIECH et al. 2013; BARDAJÍ et al. 2016; Figura 2). Porém há uma alta variação na composição e concentração dos constituintes na óleoresina desta espécie tanto inter quanto intraespecífica (ZOGHBI et al. 2009; HERRERO-JÁUREGUI et al. 2011). Apenas 5 espécies de Copaífera tiveram a composição descrita na literatura (C. multijuga Hayne, C. langsdorffii, C. cearensis, C. officinalis L. e C. reticulata Ducke), totalizando apenas 17 relatos químicos no total (VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002; LIMA NETO et al. 2008). Na tabela 1 encontram-se os principais metabólitos isolados das diferentes espécies de Copaifera e suas atividades farmacológicas. As cromatografias das óleoresinas, de várias espécies de copaíba, demonstram variações entre si, distinguindo os compostos predominantes nos sesquiterpenos e diterpenos, mas tendo como marcadores biológicos o ácido copálico e β-cariofileno, presentes em todas as espécies (VEIGA JUNIOR et al. 2007, PIERI et al. 2009). A óleoresina de copaíba, em geral, contém ácidos diterpênicos na parte sólida resinosa não volátil (CASCON e GILBERT, 2000; RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004; OLIVEIRA et al. 2006), que é utilizada como bálsamos (FREIRE et al. 2006), diluída na outra parte chamada de óleo essencial (CASCON e GILBERT, 2000; RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004) que contém sesquiterpenos (RIGAMONTE AZEVEDO et al. 2004; OLIVEIRA et al. 2006). Em síntese, já foram descritos em torno de 72 sesquiterpenos e 35 diterpenos isolados da oleoresina de copaíbas (VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002; ROMERO, 2007).

CH3 H

H C H C 3 CH3 3 H H H H C H3C H 3 CH2 H H C H CH3 3 CH2 CH H CH3 3 H3C CH3 CH2 CH H H 3 H3C H H C H C H C CH CH H C CH 2 3 3 3 3 3 3 CH3 (23) (24) (25) (26) (27) (28)

N H3C CH3 H3C CH3 H H O H3C H CH3 H2C H H C CH 3 3 O H O H C H3C O 3 CH3 H H3C CH CH O O CH 3 3 CH 2 H C H3C 3 CH 3 OH H3C 3 CH H3C 3 CH3 H H H O O CH CH CH CH CH H C CH 2 3 3 3 3 CH3 3 3 H (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36)

CH2 CH CH2 CH CH3 CH3 2 H 2 CH3 CH3 H CH2 CH3 H CH3 H H C 3 CH3 H H3C CH CH3 CH3 3 CH3 H H H C CH H C CH CH CH3 3 3 H H3C CH3 3 3 3 (37) (38) (39) (40) (41) (42) (43) Figura 2 - Metabólitos isolados de Copaifera reticulata Legenda: (23) - trans-β-cariofileno, (24) - α-Gurjuneno, (25) - β-chamigreno, (26) - β-farneseno, (27) - ciclosativeno, (28) - aromadendreno, (29) - β- sesquifelandreno, (30) - α-cedreno, (31) - germacreno D, (32) - (Z)-α-bisaboleno, (33) - (E)-γ-bisaboleno, (34) - agatato de dimetila, (35) - 16-caureno, (36) - epóxido de humuleno II, (37) - α-bulseneno, (38) - γ-amorfeno, (39) - germacreno B, (40) - γ-cadineno, (41) - γ-muuroleno, (42) - 7-epi-α-selineno, (43) - cauranoato de metila

Tabela 1 - Atividade farmacológica atribuída aos metabólitos isolados de espécies de Copaifera sp. Espécies Atividade Metabólitos Isolados da Espécie Referências farmacológica Copaifera reticulata Larvicida Ácido (-)-3β-acetoxilabdan-8 (17)-13-dien-15-óico GERIS et al. 2008 Ducke (CL50 = 0.8 ppm e CL90 = 8.2 ppm) Copaifera officinalis Leishmanicida Em promoastigota : ácido hidroxi-copálico (CI50 = 2,5 µg/mL) e SANTOS et al. 2013 Metil copalato (CI50 = 6,0 µg/mL). Em amastigota axênica: ácido pinifólico (CI50 = 4,0 µg/mL); ácido caurenóico (CI50 = 3,5 µg/mL) Copaifera langsdorffi Antitumoral (-) - colavenol (I.L.S. 98%, 41 mg / kg / dia, 4 dias) OHSAKI et al. 1994 Desf. Copaifera langsdorffi Genotóxica ácido caurenóico (Dose ≥ 30 µg/mL) CAVALCANTI et al. 2006 Desf. Copaifera langsdorffi Citotóxico e ácido caurenóico (CC50 = 78 mM; CE50 = 74 mM em ratinhos e COSTA-LOTUFO et al. 2002 Desf. Embriotóxico CE50 = 56,4 mM em humanos ) Patogênica: ácido caurenóico (CIM50 = 5,0 a 20,0 µg/mL); ABRÃO et al. 2015 Copaifera langsdorffi Antimicrobiana (-) - ácido copálico (CIM50 = 0,5 a 15,0 µg/mL). Desf. Multirresitentes: (-) - ácido copálico (CIM50 e CBM50 = 15,60 a 31,25 µg/mL) Copaifera langsdorffi Antiproliferativa ácido caurenóico ABRÃO et al. 2015 Desf. (CI50 = 44,03 µg/mL e IS = 2,43) Copaifera spp. Anti-inflamatória ácido 3-hidróxi-copálico; VARGAS et al. 2015 ácido colávico-15-metil éster; ácido 3-acetoxi-copálico; ácido copálico e ácido carenóico Copaifera langsdorffi Gastroprotetora α-humuleno (76,20%); β-cariofileno (76,57%); óxido de LEMOS et al. 2015 Desf. cariofileno (70,17%) e ácido carenóico (51,45%) Copaifera langsdorffi Antimicrobiana ácido (-) - copálico (CIM = 3,1 µg mL) SOUZA et al. 2011 Desf. Copaifera langsdorffi Relaxamento ácido carenóico CUNHA et al. 2003 Desf. uterino (Emax da ocitocina= 91% e Emax da acetilcolina = 83%)

A óleoresina obtida de Copaifera reticulata apresentou baixa citotoxicidade para a linhagem de macrófagos J774G8, além de ser mais tóxico para promastigotas e amastigotas, o que lhe atribui alta seletividade (SANTOS et al. 2008). Acredita-se que os diterpenos, presentes nesta óleoresina, como a α-copaeno, bergamoteno, ácido copálico e ácido caurenóico e β-cariofileno que foi o majoritário, possuam baixa toxicidade (LIMA et al. 2003). Além disso, esta óleoresina não foi citotóxica frente às células RAW 264.7 (concentração = 78,45% de viabilidade; RONDON et al. 2012). Não observou-se alteração na viabilidade de macrófagos peritoniais de camundongos, nas três concentrações testadas (500, 50 e 5 µg/mL) da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke e sua atividade anti-inflamatória foi avaliada in vitro na produção de óxido nítrico (NO) em macrófagos murinos no qual inibiu 85% da produção, na concentração de 500 µg/mL (VEIGA JUNIOR et al. 2007). Os estudos toxicológicos do óleo de copaíba são escassos. Camundongos foram submetidos ao tratamento agudo com a óleoresina de C. multijuga (VO, 500 mg/kg), não foram observadas alterações clinicas, bem como não houve aumento do consumo de ração e água, não houve alterações no peso. Estudos histologicos não demonstraram alterações estomacais e nem apresentou hemorragia (GOMES et al.

2007). A toxicidade letal desta espécie foi 4300 mg/kg (GOMES et al. 2010), logo esta óleoresina foi considerada não tóxica (OECD). Os camundongos foram submetidos à exposição aguda oral da óleoresina de C. reticulata, porém não foram observadas alterações clinicas significativas, a função motora, sensorial e comportamental estava semelhante ao controle negativo (SACHETTI et al. 2009), a dose letal foi 3900 mg/kg (GOMES et al. 2007). Ratas wistar grávidas foram tratadas por gavagem (0, 500, 1000 e 1250 mg/kg/dia) com óleoresina de Copaifera reticulata, após avaliou-se a presença de alterações externas, viscerais e esquéleticas. Em nenhuma dose observou alterações fetais, logo a óleoresina não foi considerada embriotóxica e nem teratogênica. Apesar de preliminares, estes resultados sugerem que está espécie não apresenta risco a mulheres grávidas (SACHETTI et al. 2011). A utilização da óleo resina de Copaifera duckei não apresentou perfil de genotoxicidade em ratos a 10%, 25% e 50% (mg/kg pc/dia) da DL50 administrada por três dias consecutivos (MAISTRO et al. 2005). No entanto, o ácido caurenóico nas

32 concentrações de 30 e 60 µg/mL, mostrou-se tóxico ao DNA em células V79 (fibroblastos de hamster; CAVALCANTI et al. 2006). Este mesmo ácido estimulou o relaxamento da musculattura uterina de ratos, provavelmente através de duas ações distintas: bloqueio do canal de cálcio e a abertura dos canais de potássio sensíveis ao ATP (CUNHA etal. 2003). Camundongos com tratamento agudo (24 e 48h) em múltiplas doses (7, 15 e 21 dias) do extrato hidroetanólico das folhas de C. langsdorffii. Após o tratamento foi avaliada a formação de micronucleos em eritrócitos, não sendo observado o aumento da frequência de micronúcleos nas células de camundongos tratados de forma aguda ou doses múltiplas, logo o extrato não foi genotóxico, o tempo e a dose não interferem nesta toxicidade (ALVES et al. 2012). Esta não genotoxidade pode estar relacionada a capacidade antioxidante dos constituintes presentes neste extrato (BATISTA et al. 2016). Os efeitos adversos da copaíba estão relacionados à dose, estes são: irritação gastrointestinal, diarréia, salivação e depressão do sistema nervoso central (MACIEL et al. 2002). O uso de uma única dose de 10g do óleo ocasiona náuseas, vómitos, cólicas, diarréia e erupção cutânea (RIBEIRO, 1989). O óleo de Copaíba é usado na medicina tradicional da Amazônia com diferentes objetivos terapêuticos, no entanto este trabalho irá focar no uso para o tratamento de feridas, cicatrizantes, leishmaniose, doenças ocasionadas por microrganismos e câncer.

2.2 Usos populares e atividades biológicas da óleoresina de Copaifera

2.2.1 TRATAMENTO DE FERIDAS, CICATRIZANTES E LEISHMANIOSE

Alguns estudos etnobotânicos, realizados em diferentes localidades da amazônia brasileira, relatam o uso do óleo de Copaifera para a cicatrização de feridas (SALVADOR, 1975; FLEURY, 1997; BRAGA et al. 1998; VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002; FALCÃO et al. 2005; COELHO-FERREIRA, 2009; SANTANA et al.

2014). Porém muitos destes não relatam o uso da óleoresina relacionado à uma espécie específica. O modo de uso destes óleos de copaíba é através da aplicação nas áreas com presença de úlceras e feridas, duas vezes ao dia (ESTRELLA e BOTTO, 1995), porém sem abudância (REVILLA, 2001). Para problemas de pele e feridas, o óleo é indicado em uso tópico (RIOS e PASTORE JUNIOR, 2011). O uso do chá obtido das cascas de Copaifera também foi relato em estudo etnobotânico realizado em Presidente Médici (Rondônia). Neste, 11% dos entrevistados utilizavam este chá para lavagem de ferimentos e como depurativo sanguíneo. Mas todos os entrevistados fazem uso de uma a três gotas da óleoresina (76%) ou misturada a outro alimento como leite, café, chá ou pão (24%; SANTANA et al. 2014). Existe apenas uma alegação de uso para o tratamento de leishmaniose (FLEURY, 1997), tal fato pode estar relacionado ao desconhecimento das populações sobre a doença e seu agente causador. Muitas vezes, as feridas de “difícil cicatrização” são ocasionadas por este parasito e o uso de determinada espécie vegetal contribui para sua cicatrização. Visando avaliar o potencial cicatrizante da óleoresina, foram induzidas feridas em ratos (modelo de ferida aberta) e estas feridas teve tratamento tópico com óleo de copaíba, sendo observado o aumento de tecido de granulação e do número de vasos sanguíneos, porém com diminuição da quantidade de fibras colágenas (BRITO et al. 1998, 1999). O inicio do processo de cicatrização (2 vezes ao dia, por via tópica) foi observado em 7 dias de tratamento, isto é, neste o local de indução da ferida já apresentava epitelização, no entanto o reparo do tecido conjuntivo foi mais lento (CAVALCANTI NETO et al. 2005). Estudos avaliaram atividade antileishmania da óleoresina de Copaifera reticulata contra Leishmania amazonensis para formas promastigotas (CI50 = 5

µg/mL), amastigotas (CI50 = 15 µg/mL) e formas de amastigotas intracelulares em camundongos BALB’s (CI50 = 20 µg/mL), tendo a inibição do índice de sobrevida dos parasitas em 47.7% (SANTOS et al. 2008; 2012). Assim como a óleoresina de C. multijuga e de C. officinalis também apresentaram atividade em formas promastigotas de Leishmania amazonensis (CI50 = 10 µg/mL; CI50 = 20 µg/mL, respectivamente), porém o presente estudo não demonstrou a avaliação em formas amastigota e nem foi relatado se óleo possuía citotoxicidade (SANTOS et al. 2008).

Acredita-se que esta atividade leishmanicida reportada ao óleoresina esteja relacionada ao efeito sinérgico entre sesquiterpeno e diterpeno (LIMA et al. 2003). A óleoresina de C. reticulata também foi eficaz contra as formas promastigotas (CI50 = 7,88 μg.mL) e amastigotas (CI50 = 0,52 μg.mL) de Leishmania chagasi, e além do mais, não apresentou citoxicidade frente às células RAW 264.7 com 78,45% de viabilidade, o que torna esta espécie altamente efetiva para o tratamento de leishmanioses (RONDON et al. 2012). A infecção em camundongos Balb C com promastigotas de Leishmania major levou ao desenvolvimento de lesões cutâneas no sítio de inoculação e falha na resposta imune ao parasito mediada por células, já os camundongos resistentes curam-se rapidamente, graças à resposta imune celular. A resistência é conferida por células Th1, enquanto a susceptibilidade é conferida por células Th2 (LOCKSLEY et al. 1987; AWASTHI et al. 2004), isto é, está associada à produção de IL-4 em camundongos susceptíveis e de IFN-γ em camundongos resistentes (HEINZEL et al. 1989). A doença progressiva e severa envolve o aumento na expressão de mRNA para IL-4 e na produção de IL-5, IL-10 e IL-13 (HOWARD et al. 1980; SCOTT e FARREL, 1998; HIMMELRICH et al. 2000). IL-4 diminui a regulação da expressão da subunidade β dos receptores da IL-12 nas células Th1, suprimindo o desenvolvimento de IFN-γ, o que leva ao desenvolvimento da resposta Th2 (WANG et al. 1994; CARRERA et al. 1996). A IL-10 inibe a ativação macrofágica e contribui para o crescimento do parasito nas lesões, enquanto que a células NK representam uma fonte inicial de IFN-γ, que é mediador da resistência inata contra o parasito (BECKER et al. 2003; REIS et al. 2006).

2.1.2 USO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS OCASIONADAS POR MICRORGANISMOS E ESTUDOS DE AVALIAÇÃO ANTIMICROBIANA.

Na medicina tradicional amazônica o óleo de Copaifera é utilizado para o tratamento de diferentes patologias ocasionadas por microrganismos, dentre estes usos, destacam-se: antiblenorrágico (OLIVEIRA, 1905; FONSECA, 1927; FREISE, 1933; PECKOLT, 1942; CESAR, 1956; BRAGA, 1960; MATOS, 1997), antitetânico

(RODRIGUES, 1894; SILVA, 1911; TEIXEIRA, 1923; FONSECA, 1927; FREISE, 1933; CESAR, 1956; VIEIRA, 1992; SANTANA et al. 2014), sífilis (RODRIGUES, 1894), cistite (FREISE, 1933; CESAR, 1956) e pneumonia (RIBEIRO, 1971). A oléoresina de C. reticulata quando testado contra patógenos orais mostrou- se ativo em: Lactobacillus casei (C.I), Streptococcus salivarius (ATCC25975) e Streptococcus mitis (ATCC 49456) com CIM = 25 µg/mL e CBM= 50 µg/mL, em Enterococcus faecalis (ATCC 4082) com valores de CIM = 100 µg/mL e CBM= 200 µg/mL, Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277; CIM = 6,25 µg/mL e CBM= 12,5 µg/mL), possuindo efeito bacteriostático. Já em Enterococcus faecalis (C.I), Stretococcus salivarius (C.I), Streptococcus sanguinis (C.I), Streptococcus sanguinis (ATCC 10556) e Streptococcus mutans (ATCC 25175), com CIM = 25 µg/mL e CBM = 100 µg/mL, Fusobacterium nucleatum (ATCC 25586; CIM e CBM de 50 µg/mL), tiveram atividade bactericida. Para Actinomyces naeslundii (ATCC 19039) e Prevotella nigrescens (ATCC 33563), têm valores de CIM = 50 µg/mL e CBM = 100 µg/mL, esta atividade é devido à presença de diterpenos, como ácido ent-copálico, ácido ent-agático-15-metil éster e ácido ent-poliáltico (BARDAJÍ et al. 2016). Em outro estudo, demonstrou-se atividade bacteriostática (0,164 mg/mL) e bactericida (1,31 mg/mL), mesmo em cepas multirresistentes de Staphylococcus coagulase- positiva (ZIECH et al. 2013). A Copaifera reticulata coletada no Pará se mostrou ativa contra espécies Gram-positivas: Staphylococcus aureus (CIM > 1.000 µg/mL), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA; CIM = 1.000 µg/mL e CBM = 1.000 µg/mL), Staphylococcus epidermidis (CIM = 1.000 µg/mL e CBM > 1.000 µg/mL), Bacillus subtilis (CIM = 250 µg/mL e CBM = 250 µg/mL) e Enterococcus faecalis (CIM = 250 µg/mL e CBM = 1.000 µg/mL). Neste mesmo estudo, esta mesma espécie porém coletada no Acre também apresentou atividade tendo como resultados: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalise Staphylococcus epidermidis (CIM = 62,5 µg/mL e CBM = 62,5 µg/mL), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA; CIM = 125 µg/mL e CBM = 250 µg/mL), e Bacillus subtilis (CIM = 31,25 µg/mL e CBM = 31,25 µg/mL; SANTOS et al. 2008). As diferenças dos resultados nesta atividade entre as óleoresinas de C. reticulata coletados no Acre e no Pará pode ser explicado devido a variação na composição química, que é comum entre espécies diferentes e até mesmo entre as mesmas espécies (CASCON e GILBERT

2000; SANTOS et al. 2008). O extrato etanólico da óleoresina de Copaifera reticulata também (estado do Amapá, Brasil) apresentou atividade contra cepas multirresistente de Staphylococcus aureus (CIM = 2,5 µg/mL) e Staphylococcus aureus ATCC (CIM = 5 µg/mL), através do método de difusão em ágar (CORREIA et al. 2008). A óleoresina de Copaifera officinalis também é bastante promissora em vários microrganismos, tais como: Streptococcus mutans (ATCC 25175; CIM = 30.000 µg/mL) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923; CIM e CBM = 15.000 µg/mL), demonstrou ter atividade bacteriostática sobre estes microrganismos, entretanto a ação bactericida foi apenas para Staphylococcus aureus (OLIVEIRA et al. 2016). E frente às espécies de Paenibacillus: P. alginolyticus, P. pabuli, P. azotofixans, P. borealis, P. gluconolyticus, P. validus, P. thiaminolyticus e P. larvae, obtiveram valores do CIM de 1,56 a 12,5%. Com a finalidade de determinar o efeito tempo- resposta do óleo em P. larvae, este foi exposto ao óleo por até 48h, após este tempo, não foi possivél observar células viáveis de P. Larvae (ATCC 9545; SANTOS et al. 2012). Outro estudo avaliou 27 isolados de Escherichia coli obtidos de leite mastítico, 7 dos isolados foram inibidos pela solução com a óleoresina de Copaifera officinalis com o halo de inibição de 16,5 mm (PIERI et al. 2011). Esta espécie é ativa contra bactétias Gram-positivas: Staphylococcus aureus (CIM e CBM = 62,5 µg/mL), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA; CIM = 125 µg/mL e CBM = 250 µg/mL), Staphylococcus epidermidis e Bacillus subtilis (CIM e CBM = 31,25 µg/mL) e Enterococcus faecalis (CIM = 31,25 µg/mL e CBM = 62,5 µg/mL; SANTOS et al. 2008). Copaifera multijuga apresentou atividade antimicrobiana, sua óleoresina foi ativa contra espécies: Staphylococcus aureus (CIM = 500 µg/mL e CBM = 1.000 µg/mL), Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA; CIM = 125 µg/mL e CBM = 250 µg/mL), Staphylococcus epidermidis (CIM = 1000 µg/mL e CBM > 1.000 µg/mL), Bacillus subtilis (CIM e CBM = 125 µg/mL) e Enterococcus faecalis (CIM = 250 µg/mL e CBM = 500 µg/mL). Também foi observado uma atividade moderada contra o fungo Trichophyton Rubrum (CIM = 250-500 μg/mL; SANTOS et al. 2008). Esta espécie foi capaz de inibir o crescimento das seguintes bactérias: Escherichia coli ATCC-25922 (1,56%), Staphylococcus aureus ATCC-25923 (3,12%) e Pseudomonas aeruginosa ATCC-9027 (12,5%), a atividade antimicrobiana variou de

37 acordo com a diluição do óleo, sendo observada nas concentrações de 100% a 1,56%, a inibição do crescimento das cepas. Os resultados obtidos utilizando o óleo puro, ou seja, na maior concentração (100%), mostrou uma atividade de 46,15% (Escherichia coli), e 68,42% (Pseudomonas aeruginosa), comparando-se com o cloranfenicol (MENDONÇA e ONOFRE, 2009).

2.1.3 USO COMO ANTICÂNCER E PRINCIPAIS RESULTADOS DOS ESTUDOS PARA A ATIVIDADE ANTITUMORAL.

Há relatos do uso popular da Copaífera no tratamento do câncer (FIGUEIREDO, 1979; RODRIGUES, 1989). Em um estudo etnobotânico com 27 pessoas, 11% dos entrevistados relataram usarem a óleoresina de Copaifera com finalidade antitumoral, sendo consumida três gotas da óleoresina ou misturada a outro alimento como leite, café, chá ou pão (SANTANA et al. 2014). Tanto o óleoresina da Copaifera multijuga quanto algumas de suas frações apresentaram propriedades antineoplásica em tumor ascítio e tumor sólido de Ehrlich nas concentrações variando de 100 a 200 mg/g. Houve também a inibição do aumento do volume pulmonar em camundogos inoculados com o tumor e ainda foi possivel obter a redução na produção de mediadores inflamatórios (GOMES et al. 2008). Quando se avalivou a óleoresina de Copaifera officinalis na dose de 4,8 mL/kg em ratas wistar inoculadas com carcinona de Walker 256, não foi possível observar efeito inibitório no crescimento tumoral, pelo contrário, o óleo incentivou o aumento do carcinona em mais de 70% e apresentou perda de peso significativa. Esta dose utilizada pode ser capaz de imunossupreção sistêmica ou induzir apoptose (BRITO et al. 2010). O óleo in natura de Copaifera reticulata e sua fração resina apresentaram efeito citotóxico em linhagens de células cancerosas de pulmão de camundongo

(E9). O óleo in natura foi mais citotóxico para células de câncer (E9; CI50 = 0,0287

µL/mL) do que para as células não cancerosas (E10; CI50 = 0,3142 µL/mL), concluiu- se que é necessário uma dose 11 vezes menor do óleo para inibir o crescimento das células cancerosas. A fração resina também inibiu a proliferação celular de E10 (CI50

= 0,0930 µL/mL) e E9 (CI50 = 0,8002 µL/mL). O autor ainda afirma que os tratamentos induziram a morte das células por apoptose, portanto o óleo in natura da C. reticulata Ducke tem efeito antitumoral assim como sua fração, mas sugere que este efeito se dá pelo sinergismo entre as frações do óleo já que o óleo apresentou ser mais eficaz para atividade antitumoral (DOMINGUES, 2017).

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral

Avaliar e comparar a atividade antitumoral, leishmanicida e antimicrobiana da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke ao óleo de copaiba comercial (Copaifera sp.), assim como suas frações e substâncias puras.

3.2 Objetivos específicos

 Determinar a citotoxicidade da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke, frações, β-cariofileno em células de câncer gástrico humano (ACP02);  Determinar a citotoxicidade da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke, óleo de copaíba comercial, frações, β-cariofileno e óxido de cariofileno em células de macrófagos murinos (J774.G8);  Avaliar a atividade leishmanicida da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke, óleo de copaíba comercial, frações, β-cariofileno e óxido de cariofileno em Leishmania (L.) amazonensis e Leishmania (L.) infantum;  Avaliar a atividade antimicrobiana da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke, óleo copaíba comercial, frações, β-cariofileno e óxido de cariofileno frente à Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Candida albicans e Proteus mirabilis

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

4.1.1 EQUIPAMENTOS

 Agitador magnético mini com aquecimento - Quimis;  Autoclave 75 L - Phoenix;  Balança analítica - Bioprecisa, modelo FA2104 N Eletronic Balance;  Banho-maria - SOLAB Científica, modelo SL 150;  Banho de Ultrassom - Tecnal Equipamentos para laboratório, modelo 2210 Branson.  Cabine de fluxo laminar vertical - Pachane, modelo PA 310;  Câmara de contagem de Neubauer espelhada - Improved.  Capela - Quimis;  Centrifuga refrigerada - Cientec Eqipamentos para Laboratório, modelo CT-600R;  Contador manual de células - DIGETIMER;  Destilador de água;  Estufa BOD (Demanda Bioquímica de Oxigênio) - Byosistens com Importadora e Exportadora de Equipamentos para Laboratório LTDA, modelo HF212 UV;  Espectrofotômetro - Biospectro SP 220;  Estufa - Medicate Produtos Médicos, modelo Md 1.2;  Evaporador rotatório, Fisatom;  Forno Mufla - Forlabo nº 2750;  Geladeira - Electrolux;

 Incubadora CO2 - Ultrasafe, modelo Hf212 UV;  Leitor de Microplacas - Biotek, modelo ELX 808;

 Micopipetas, volume ajustável de 10-100 µL e de 100-1000 µL - Paguepet;  Microscópio Óptico Eclipse, modelo E200-NIKON;  Sistema de filtração a vácuo 250 mL, membrana 0,22 µm - TPP – Switzerland.

4.1.2 MATERIAIS PLÁSTICOS, DE METAL E DE VIDRO

 Espátulas de metal;  Espalhador;  Estantes plásticas;  Garrafas para cultura de células 75 cm2 - TPP-Switzerland;  Garrafas para cultura de células 25 cm2 - SPL Life Sciences;  Lâminas;  Pipetas automáticas de 10, 50, 100, 500 e 1000µL;  Pipetas de Pasteur de vidro (VWR);  Pipetas graduadas de 2, 5, e 10 mL;  Pipetas volumétricas de 10 e 20 mL;  Placas de cultura de células de 96 poços, fundo chato com tampa - TPP;  Placas petri descartável 90X15 cm (J. Prolab);  Placas preparativas - tamanho 20 x 20 cm;  Ponteira 200 μl amarela, tipo universal - Labware Manufacturing CO;  Ponteira 100-1000 μl, azul, tipo universal - Kartell SPA;  Tubo cônico graduado 15 mL não estéril (Tipo Falcon);  Tubo cônico graduado 50 mL estéril (Tipo Falcon) - Becton-Dicknson;  Tubos de microcentrifuga (Tubos eppendorf) de 1,5 mL- Kartell SPA;  Suporte de ferro.

4.1.3 VIDRARIAS

 Balão volumétrico de 500 e 1000 mL - Laborquimi;  Bastão de vidro;  Becker de 600 e 1000 mL - Satelit;  Erlenmeyes de 250 e 2000 mL - Vidrolabor;  Frascos Eppendorf - Sigma Chemical Company;  Membranas filtrantes Millipore, Millex F6 0,2 mm;  Pipetas de Pasteur de vidro;  Pipetas de vidro graduadas de 1 mL, 5 mL e 10 mL - Vidrolabor;  Pipetas volumétricas de 10 e 20 mL;  Proveta de 250, 500 e 1000 mL - Vidrolex;

4.1.4 OUTROS

 Ágar Müller Hinton (Himedia);  Anfotericina B 50 mg solução injetavél - Cristália produtos farmacêuticos;  Bicarbonato de sódio - Sigma Aldrich;  Caldo Müller Hinton (Difco);  Citrato de sódio PA Tribásico -Vetec;  Corante Azul de Tripano em solução (0,4%/100 mL) testado para cultura de célula- Sigma-Aldrich;  Corante Giemsa - Dinâmica química contemporânea Ltda;  Dimetil-sulfóxido-DMSO (Aldrich);  Estreptomicina - Sigma-Aldrich;  Etanol (Migako);  Gentamicina (Química Haller);  Hepes - Sigma-Aldrich;

 Meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) com glutamina e 25 MM HEPES, isento de bicarbonato de sódio - Sigma-Aldrich;  MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium 500 mg - Sigma-Aldrich;  Nistatina (Neoquímica);  Penicilina G - Sigma Aldrich;  Soro bovino fetal - Gibco®;

 β-cariofileno (C15H24, MM=204,36 g/mol), marca TCI com pureza >90%;  Papel de filtro MN 618;  Papel alumínio comercial;  TTC (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio) 20mg - Dinâmica.

4.1.5 MATERIAL BIOLÓGICO

Utilizou-se no estudo realizado em Belém-PA, o parasita Leishmania (L.) amazonensis isolado de caso humano procedente do município de Ulianópolis do Estado do Pará com o registro – MHOM/BR/2009/M26361. Este foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Fernando Tobias Silveira. Já estudos realizados em parceria, os parasitas Leishmania (L.) amazonensis, cepa H21 (MHOM/BR/76/MA-76) e a Leishmania (L.) infatum (MCAN/BR/2008/1112), foram gentilmente cedidos pela Profª. Dra. Katia da Silva Calabrese do Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia do Instituto Oswaldo Cruz - IOC/FIOCRUZ. Nos estudos de citotoxicidade foram utilizadas duas linhagens celulares: ACP02 e J774 A.1. A linhagem tumoral ACP02 (Adenocarcinoma Gástrico Primário), cedida pelo Laboratório de Citogenética Humana do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará - UFPA. E a linhagem de células macrofágicas J774.G8, adquiridas do Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia do Instituto Oswaldo Cruz - IOC/FioCruz pela Profª. Dra. Katia da Silva Calabrese. Por fim, foram usadas cepas padrão American Type Culture Collection (ATCC) de Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Pseudomonas aeruginosa (ATCC

27853), Salmonella spp. (ATCC 14029), Candida albicans (ATCC 1009) e Proteus mirabilis (ATTC 7002), obtidas da FIOCRUZ/Laboratório Central do Estado (LACEN- PA).

4.1.6 MATERIAL VEGETAL

Um espécime foi coletado em outubro de 2015, na Fazenda Guaripe, S/N Marg Interior Tucuruí, estado do Pará (Latitude: -4,095494/4° 5' 43,78'' S, Longitude: -49,958473/ 49° 57' 30,5'' W) pelo Sr Raimundo Nonato funcionário da fazenda, sendo identificada por comparação como Copaifera reticulata (Figura 3) pelo parataxônomo do Museu Paraense Emílio Goeldi (MPEG) com uma excicata sob o registro de número MG14974, catalogada no Herbário João Murça.

Figura 3 - Fotografia do tronco de Copaifera reticulata Ducke Fonte: SILVA, 2016

4.2 Métodos

4.2.1 ESTUDOS FITOQUÍMICOS

4.2.1.1 Aquisição do material vegetal

Para obtenção da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke, utilizou-se o trado manual de 7/8 polegadas diâmetro e tendo 1,0 metro de comprimento para perfurar o tronco. Perfurou-se a árvore em altura de 1 metro do chão (35 cm de profundidade no tronco), com declive para o escoamento do óleo. Um tubo de PVC 3/4 polegadas foi colocado e ajustado no orifício, e no outro extremo do tubo colocou-se um frasco de vidro âmbar de 1L. Porfim, o furo foi vedado com rolha de madeira (SILVA, 2016). Já o óleo de copíaba (500 mL) do qual não se sabe a espécime, foi adquirido comercialmente em feira livre, no Mercado do Ver-o-peso em Belém do Pará.

4.2.1.2 Obtenção das frações e perfis químicos

Silva (2016), solubilizou as óleoresinas com éter etílico (400 mL), extraíu com hidróxido de potássio (5x100 mL) e obteve as frações orgânica e aquosa. A fração orgânica foi lavada com solução saturada de cloreto de sódio, secada com sulfato de sódio anidro e evaporada, fornecendo 80% da fração neutra (120g). A fração aquosa alcalina foi acidificada com ácido clorídrico (pH = 2), extraída com éter etílico (5x100 mL), sendo obtidas as frações aquosa ácida e orgânica. A fase aquosa resultante foi descartada e a fase orgânica foi lavada com solução de cloreto de sódio saturada até pH = 7, secada com sulfato de sódio anidro e evaporada, o que forneceu 20% da fração ácida (30g; Figura 4; ROMERO, 2007).

ÓLEORESINA 150g

400 mL Et2O; 5 x 100 mL KOH

Fase Orgânica Fase Aquosa

HCl conc. Até pH = 2; FRAÇÃO DE NEUTROS 120g (80%) 5 x 100 mL Et2O

FRAÇÃO DE Fase Aquosa Fase Orgânica SESQUITERPENOS

FRAÇÃO ÁCIDA 30g (20%)

FRAÇÃO DE DITERPENOS

Figura 4 - Fluxograma da Extração ácido/base da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke e Copaifera sp. Legenda: HCl - Ácido clorídrico; Et2O - Éter de petróleo; KOH - Hidróxido de potássio Fonte: SILVA, 2016

4.2.1.3 Síntese do óxido de cariofileno

O óxido de cariofileno foi sintetizado apartir do β-cariofileno através da reação de epoxidação (Figura 5). Em um balão volumétrico (50 mL) foram adicionados 253,75 mg de β-cariofileno (98,5%), 316,7 mg de ácido meta-cloroperbenzóico (m-

CPBA), 3 mL de álcool terc-butanol (terc-BuOH) e 3 mL de diclorometano (CH2Cl2), esta mistura foi mantida sob agitação magnética à temperatura ambiente, por 10

horas. Após este tempo, a mistura foi transferida para um funil de decantação e extraída com diclorometano (3 x 10 mL), a fase orgânica foi tratada sequencialmente com solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 10% (3 x 25 mL), solução de cloreto de

sódio (NaCl) saturada (3 x 25 mL), secada com sulfato de sódio anidro (Na2SO4) e posteriormente filtrada. O filtrado foi concentrado em rotaevaporador e o resíduo purificado em coluna de sílica 60 com hexano/acetato de etila

(CH3(CH2)4CH3/C4H8O2 - 7:3), obtendo-se assim o óxido de cariofileno. A caracterização fitoquímica do óxido de cariofileno foi comprovada pela análise cromatográfica e espectrométrica, com uma área relativa de 98,57% (ANEXO A e B; SILVA, 2016).

CH3 CH3 H3C CH3 H3C CH3

m-CPBA O

CH2Cl2; terc-BuOH H C H C 2 2 Figura 5 - Reação de epoxidação Legenda: m-CPBA - ácido meta-cloroperbenzóico; CH2Cl2 - diclorometano; terc-BuOH - álcool terc- butanol Fonte: adapatado de SILVA, 2016

4.2.2 AVALIAÇÃO BIOLÓGICA

4.2.2.1 Cultivo e manuntenção das linhagens celulares

A linhagem de células ACP02 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Roswell Park memorial institute médium) completo (5% de Soro bovino fetal, penicilina 100 UI/mL, estreptomicina 100 mcg/mL, e Anfotericina B 2,5 mcg/mL), em garrafas de cultura e armazenadas em incubadora de células a 37ºC em atmosfera úmida com

5% de CO2. Quando se verificava sob microscopia ótica a propagação de células por toda superfície de crescimento da garrafa de cultivo, estas eram lavadas com PBS

(Phosphate buffered saline), adicionada tripsina-EDTA para que as células se desprendessem da garrafa de cultivo, após este procedimento novo meio de cultura era acrescentado para ressuspender às células e distribuir em outras garrafas de cultura (MOSSMAN et al. 1983). Para a realização dos experimentos, as células foram desaderidas das garrafas de cultivo através da exposição à tripsina por 3 minutos, transferidas para tubo de fundo cônico (15 mL) e centrifugadas (1500-2000 rpm/5 minutos), sendo que o sobrenadante era descartado, se fazia a ressuspenção das células em meio RPMI 1640, e em seguida, utilizava a câmara de Neubauer para a contagem das mesmas e assim obter determinada concentração celular (ACP02 = 8x103 células/mL em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SBF). Após 24h, as células foram expostas as amostras testes e realizados os procedimentos experimentais.

4.2.2.2 Ensaio de viabilidade celular (método MTT)

É um ensaio colorimétrico que verifica a viabilidade de células utilizando o sal de tetrazólio MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]), onde a leitura é realizada em espectrofotômetro de varredura de múltiplos poços. Nas mitocôndrias de células vivas o sal de tetrazólio MTT é reduzido em cristais de formazano, processo esse que ocorre através da clivagem da enzima succinato desidrogenase, levando a exibição da coloração púrpura (Figura 6); estes cristais são extraídos das células através da adição de solvente apropriado. Com isso, o número de células viáveis (cristais formados) é quantificado (GALUCIO, 2014).

H3C

N N H3C N + S H3C N N Dehidrogenases N N N N S mitocondriais NH H3C

- Br

Figura 6 - Enzimas mitocondriais fazendo a redução do MTT para formazano Fonte: Adpatado de GOMES, 2008

As absorbâncias das amostras através do método de MTT são determinadas em espectrofotômetro (MOSMANN, 1983). A absorbância de cada amostra (diferentes concentrações) é comparada com controle negativo (100% células viáveis), calculando-se o percentual de células viáveis em todas as concentrações utilizadas. A partir do percentual de células viáveis de cada diluição das amostras foi calculada a concentração citotóxica 50% (CC50; DAGUANO et al. 2007).

4.2.2.2.1 Células ACP02

Distribuíram-se as células ACP02 (8x103 células/mL em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de SBF) em placas de 96 poços (100 µL/poço). As quais foram incubadas a 37 °C em atmosfera úmida com 5% de CO2 por 24h (MOSSMAN et al. 1983). A seguir, realizou-se o tratamento com sete concentrações decrescentes das amostras testes (500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625 e 7,812 μg/mL) da óleoresina de Copaifera reticulta Ducke, fração de neutros, fração ácida e β-cariofileno. Para o controle negativo, utilizou-se apenas o meio completo com células em triplicata e o controle positivo utilizou a doxorrubicina. Após o tratamento, as placas foram novamente incubadas a 37°C, em atmosfera úmida com 5% de CO2.

Figura 7 - Esquema das placas para o ensaio de viabilidade celular em células ACP02 Legenda: Beta - β-cariofileno, ORCR - óleoresina de C. reticulata, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata e DMSO - Dimetilsulfóxido

Após 24h de tratamento foi adicionado 100 µL da solução brometo de [3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] (MTT, 5 mg/mL) para 100 µL de meio contido nos poços. As placas foram incubadas a 37°C em atmosfera úmida com 5% de CO2 durante 3 horas. Foi então desprezado o sobrenadante e adicionado 100 µL de DMSO (dimetilsulfóxido) a todos os poços, para dissolver os cristais de formazano. As placas foram homogeneizadas para a completa dissolução dos cristais. Após 1 hora, as absorbâncias dos poços foram lidas em um espectrofotômetro de varredura de múltiplos poços, utilizando um comprimento de onda de referência de 570 nm.

A CC50 (concentração citotóxica 50%) foi obtida em três experimentos independentes em triplicata, utilizando-se curvas de dose-resposta. Para o cálculo da viabilidade celular, foi utilizada a Equação (1; GALUCIO, 2014):

푨풃풔풐풓. 풅풐풔 풑풐ç풐풔 풕풓풂풕풂풅풐풔 − 푨풃풔풐풓. 풅풐 풃풓풂풏풄풐 % 푪é풍풖풍풂풔 풗풊á풗풆풊풔 = × ퟏퟎퟎ 푨풃풔풐풓. 풅풐 풄풐풏풕풓풐풍풆 풏풆품풂풕풊풗풐 − 푨풃풔풐풓. 풅풐 풃풓풂풏풄풐 (1)

A concentração citotóxica de 50% (CC50) foi determinada por regressão linear (programa GraphPad Prism versão 6.0) em citotóxico, moderadamente citotóxico e não citotóxico (Quadro 2; SILVA-SILVA, 2016).

Quadro 2 - Interpretação dos resultados baseado na faixa do CC50 CC50 µg/Ml Resultados Menor ou igual a 100 Citótoxico Entre 101 – 500 Moderadamente citotóxico Acima de 500 Não citotóxico Fonte: SILVA-SILVA, 2016

4.2.2.3 Atividade antileishmania

4.2.2.3.1 Manutenção do parasita e curva de crescimento

As formas promastigotas da espécie L. (L.) amazonensis foram cultivadas em meio de cultivo Novy-Nicolle-Mcneal (NNN). 1000 µL de parasitas (2x106 parasitas/mL) foram transferidos para o meio de crescimento Roswell Park memorial institute medium (RPMI-1640; 5,0 mL), mantidos a 25ºC ± 1ºC. Para avaliação do desenvolvimento e multiplicação das formas de L. (L.) amazonensis realizou-se curvas de crescimento adaptada para microscópio binocular. Esta curva é a quantificação de formas promastigotas e foi realizada em câmara hemocitométrica de Neubauer. A contagem foi realizada sob microscópio óptico em aumento de 40X onde se retirou 10 μL da suspensão de promastigotas. Na contagem, rosetas ou emaranhados não foram incluídos. Os quatro quadrantes foram contados, calculando-se a média (URDAPILLETA, 2006).

4.2.2.3.2 Ensaio da atividade antipromastigota

Formas promastigotas de L. (L.) amazonensis obtidas durante a fase logarítmica de crescimento, foram reunidas por centrifugação em meio RPMI-1640 completo a 3500 rpm durante 10 minutos. O precipitado foi resuspendido em meio RPMI-1640 completo, as promastigotas foram quantificadas em câmara de Neubauer e ajustadas para uma concentração correspondente a 5x106 parasitas/mL. Esta suspensão foi distribuída em placas contendo culturas de células com fundo chato previamente dosificadas abarcando a óleoresina, frações e substância pura em diferentes concentrações (200; 100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125 µg/mL). Logo, as placas foram incubadas a 26°C por 72 horas. O controle negativo consistiu de uma suspensão do parasita e meio de cultura. O controle do solvente continha metanol evaporado, suspensão do parasito e meio. O controle positivo incluiu uma suspensão de promastigotas e adicionando- se anfotericina B em diferentes concentrações (Figura 8).

Figura 8 - Esquema das placas para a atividade antipromastigota Legenda: CN - controle negativo, BRA - branco, CP - controle positivo, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata, ORCR - óleoresina de C. reticulata e BETA - β-cariofileno

Após o período de incubação de promastigotas com as amostras e fármacos, adicionou-se 10 µL de MTT (Brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5- difeniltetrazolium; 5 mg/mL) em todos os poços. A placa foi recoberta com papel alumínio, sucedendo de nova incubação por 4 horas em estufa a 26°C. Depois de 4 horas, foi adicionado 10 µL de dimetilsufóxido (DMSO), para solubilizar os cristais de formazano gerados, através da agitação manual por 5 minutos. Posteriormente, realizou-se a leitura da densidade óptica (D.O.) das amostras em leitor de placas de ELISA em comprimento de onda de 490 nm. A viabilidade das formas promastigotas foi avaliada com base no metabolismo do MTT, sendo a mesma proporcional ao valor da absorbância gerada. A porcentagem de promastigotas foi calculada pela seguinte equação (2), adaptada de Ngure et al. (2009):

푨풃풔풐풓. 풅풐풔 풑풐ç풐풔 풕풓풂풕풂풅풐풔 − 푨풃풔풐풓. 풅풐 풃풓풂풏풄풐 % 푽풊풂풃풊풍풊풅풂풅풆 = × ퟏퟎퟎ 푨풃풔풐풓. 풅풐 풄풐풏풕풓풐풍풆 풏풆품풂풕풊풗풐 − 푨풃풔풐풓. 풅풐 풃풓풂풏풄풐 (2)

A concentração inibitória de 50% (CI50) é a concentração que causa a redução de 50% das células em crescimento (viáveis) e foi determinada pelo programa GraphPad Prism versão 6.0. Pela leitura de placas de ELISA, adotaram-se como amostras ativas, com potencial leishmanicida, aquelas com CI50 < 100 µg/mL (Quadro 3).

Quadro 3 - Interpretação dos resultados baseado na faixa do CI50 CI50 µg/mL Resultados Menor ou igual a 100 Ativo Entre 101-200 Moderadamente ativo Acima de 200 Inativo Fonte: adaptado de MOTA et al. (2015)

4.2.2.3.3 Determinação do índice de seletividade (IS)

O Índice de Seletividade (IS) representa o grau de segurança para a utilização de uma amostra em teste in vitro (ABRANTES, 2006), onde determina a seletividade das amostras com atividade leishmanicida em macrofágos, definido pela seguinte expressão adaptada de Reimão (2009):

푪푪ퟓퟎ 풆풎 풎풂풄풓풐풇풂품풐풔 푰푺 = 푪푰ퟓퟎ 풄풐풏풕풓풂 풐 풑풂풓풂풔풊풕풂 (3)

Para interpretação dos resultados do índice de seletividade, se considera que um IS superior indica maior toxicidade para o parasita do que para o macrófago. Já um IS inferior a 10 indica maior toxicidade para o macrófago do que para o parasita. Quanto maior o valor numérico do índice de seletividade, mais seletivo é a amostra em estudo, ou seja, pouco tóxico para o macrófago e ativo para o parasita (Quadro 4; REIMÃO, 2009).

Quadro 4 - Interpretação do índice de seletividade (IS) IS Resultados ˃ 10 Tóxico para o parasita ˂ 10 Tóxico para o macrófago Fonte: REIMÃO, 2009

4.2.2.4 Atividade antimicrobiana e antifúngica

4.2.2.4.1 Cultivo de micro-organismos e preparo das amostras

As cepas ATCC foram semeadas em placas de petri contendo meio de cultura de enriquecimento, sendo utilizado o Ágar Muller-Hinton. Posteriormente as placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 h para as bactérias e para o fungo por 48h, tendo o crescimento apropriado para a avaliação da atividade antimicrobiana.

4.2.2.4.2 Ensaio de viabilidade de micro-organismos (método TTC)

O TTC é considerado como um método colorimétrico eficiente para avaliação da atividade antibacteriana de agentes antimicrobianos (MOUSSA et al. 2013). É realizada a avaliação quantitativa da sobrevivência e multiplicação de células, detectando a viabilidade de microrganismos. Ele se apresenta como um sal de tetrazólio incolor (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio) que é convertido a formazano vermelho (1-fenil-2- [(Z)-fenil(fenilhidrazono)metil]diazeno; Figura 9), auxiliando na visualização do crescimento de microrganismos. Seu mecanismo de reação é baseado na dupla tetrazólio/formazano, ocasionando uma reação de oxirredução que age como aceptor de prótons ou oxidante na presença de bactérias metabolicamente ativas (VEIGA, 2016). O TTC é um excelente aceptor de elétrons para colônias de bactérias e fungos, cultivadas em placas (KUMAR e TARAFDAR, 2003).

+ 2e +2H+ N (Metabolismo celular de NH N N + micro-organismos) N N N N + HCl - Cl

Figura 9 - Conversão do cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio em 1-fenil-2- [(Z)- fenil(fenilhidrazono)metil]diazeno Fonte: Adaptado de MATTSON et al. (1947), MOUSSA et al. (2013) e VEIGA, (2016)

As absorbâncias das amostras através do método TTC são determinadas em espectrofotômetro (MOUSSA et al. 2013). A absorbância de cada amostra (diferentes concentrações) é comparada com controle negativo (100% células viáveis), calculando-se o percentual de células viáveis em todas as microdiluições realizadas das amostras. A partir do percentual de células viáveis de cada microdiluição das amostras foi calculada a concentração inibitória 50% (CI50; DAGUANO et al. 2007).

4.2.2.4.2.1 Método de microdiluição

As amostras foram submetidas ao método, para a determinação da CI50, utilizando-se as seguintes microdiluições: 500; 250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,8125; 3,906; 1,953; 0,976; 0,488 e 0,244 µg/mL por poço e em triplicata da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke (ORCR), óleo de copaíba comercial (OCC), fração de neutros de C. reticulata (FNCR), fração ácida de C. reticulata (FACR), fração de neutros do óleo de copaíba comercial (FNOC), fração ácida do óleo de copaíba comercial (FAOC), β-cariofileno (BETA) e óxido de cariofileno (ÓXIDO). Preparou-se uma suspensão de cada cepa em caldo Muller Hinton, ajustando-se a turbidez com o tubo 0,5 da escala de Mac Farland (CLSI, 2012).

As amostras foram solubilizadas em álcool metílico e em placas de 96 poços, as quais foram depositadas 10 μL das amostras nas diferentes diluições, 180 μL de caldo de enriquecimento Muller Hinton e 10 μL das suspensões das cepas. Como controle positivo utilizou-se gentamicina para as bactérias e nistatina para o fungo em diferentes concentrações, previamente estabelecidas. O controle negativo consistiu de 10 μL da suspensão do microrganismo e 190 μL de caldo Muller Hinton, o branco teve somente 200 μL de caldo Muller Hinton e o controle do solvente continha 10 μL de suspensão do microrganismo, 190 μL de caldo Muller Hinton e 20 μL de álcool metílico (Figura 10).

Figura 10 - Esquema das placas para a atividade antimicrobiana Legenda: CN - controle negativo, CS - controle do solvente, BRA - branco, CP - controle positivo, FAOC - fração ácida do óleo de copaíba comercial, FNOC - fração de neutros do óleo de copaíba comercial, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata, OCC - óleo de copaíba comercial, ORCR - óleoresina de Copaifera reticulata Ducke, BETA - β-cariofileno e ÓXIDO - óxido de cariofileno

Após o semeio, as placas foram cobertas com parafilme e incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 22h para as bactérias e 46h para o fungo. Depois do período de incubação das cepas com as amostras e fármacos, adicionou-se 20 µL de TTC (cloreto de 2,3,5 trifeniltetrazólio; 0,125%) em todos os poços. A placa foi recoberta com papel alumínio, sucedendo de nova incubação por 2 horas em estufa bacteriológica a 37°C, para que o TTC fosse metabolizado e assim tendo a formação de cristais de formazano. Depois de 2 horas, foi realizado a leitura da densidade óptica (D.O.) das amostras em leitor de placas de ELISA em comprimento de onda de 570nm. A viabilidade das cepas foi avaliada com base no metabolismo do TTC, sendo a mesma proporcional ao valor da absorbância gerada. A porcentagem de cepas foi calculada pela seguinte equação (2), adaptada de Ngure et al. (2009):

A concentração inibitória de 50% (CI50) é a concentração que causa a redução de 50% das cepas e foi determinada pelo programa GraphPad Prism versão 6.0. Pela leitura de placas de ELISA, adotaram-se como amostras ativas, aquelas com CI50 < 100 µg/mL (Quadro 3).

Quadro 3 - Interpretação dos resultados baseado na faixa do CI50 CI50 µg/Ml Resultados Menor ou igual a 100 Ativo Entre 101-200 Moderadamente ativo Acima de 200 Inativo Fonte: adaptado de MOTA et al. (2015)

4.2.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos em cada experimento foram comparados pelo teste T de “Student” utilizando o programa BioEstat 5.0, com nível de confiança de 95% e nível de significância α = 5% (p< 0,05). Para o cálculo da CI50 e da CC50 utilizou-se o programa GraphPad Prism versão 6.0.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Como o objetivo deste trabalho foi avaliar e comparar as atividades biológicas dos óleos de copaíba selecionou-se uma linhagem de câncer (câncer de estomago não metastático - ACP02), uma espécie de Leishmania (L. amazonensis), uma espécie de fungo (Candida albicans) e espécies de bactérias Gram positivas e negativas. No caso da atividade antitumoral, avaliou se o tempo de exposição das células as amostras testes influenciaram na resposta. A óleoresina de C. reticulata

(ORCR), após 24h de tratamento, não se mostrou ativa (CC50 = 296,3 µg/mL), quanto maior o tempo de exposição menor foi sua atividade inibitória sobre as células (48h - CC50 = 365,6µg/mL e 72h - CC50 = 451,4µg/mL; Tabela 2; Figura 11). De modo semelhante, outro estudo demonstrou que o óleo de copaíba não é promissor como antitumoral. Neste estudo, avaliou a atividade antitumoral deste óleo em tumor de Walker 256, sendo as células inoculadas na vagina e colo uterino de ratas, observou-se maior perda de peso do animal e crescimento tumoral. Também foi relatado que altas doses, leva à imunossupressão e possível inibição de apoptose em certas linhagens tumorais (BRITO et al. 2010). A ORCR parece não ser promissora para esta linhagem tumoral, entretanto, outro estudo demonstrou que este óleo apresenta maior potencial citotoprotetor que o omeprazol, reduzindo o volume de secreção e elevando o pH gástrico (ARROYO et al. 2009). Logo, provavelmente, o óleo de copaíba tem maior potencial citoprotetor gástrico, do que citotóxico. Diferente do observado neste estudo, outro trabalho relatou a atividade antitumoral do óleo in natura em linhagens de células tumorais de pulmão de camundongo (E9; CI50 = 0,0287 µL/mL). Esta atividade foi relacionada ao sinergismo dos sesquiterpenos e diterpenos, sendo a apoptose o mecanismo responsável pela atividade (DOMINGUES, 2017). Entretanto, outros estudos relatam que os diterpenos previnem o processo de carcinogênese (JOHNSON et al. 2008; CHUN et al. 2014) e os sesquiterpenos induzem a apoptose de células tumorais (SHEENEY et al. 2005; ZHANG et al. 2005). Visando identificar se os sesquiterpenos são ativos como antitumorais, a óleoresina de Copaifera foi submetida ao fracionamento e suas fações foram avaliadas. Observou-se que o fracionamento não contribuiu para

atividade antitumoral, sendo a fração que continha os sequisterpenos (fração de neutros) e diterpenos (fração ácida) consideradas inativas (Tabela 2; Figura 11). A seguir, avaliou a atividade antitumoral do β-cariofileno, pois estudo anterior demonstrou que o β-cariofileno aumentava a concentração intracelular (linhagens tumorais MCF-7, DLD-1 e L-929) de paclitaxel, porém este acúmulo não está relacionado ao bloqueio da glicoproteína P (LEGAULT e PICHETTE, 2007). Esta proteína está envolvida na extrusão ativa do fármaco, reduzindo sua concentração intracelular e seu efeito (NAKUMURA et al. 2003). Como alguns sesquiterpenos possuem atividade antitumoral (JOHNSON et al. 2008; CHUN et al. 2014), surgiu os seguintes questionamentos: será que, além de elevar a concentração intracelular de outros antitumorais, o β-cariofileno possui atividade antitumoral? Será que a elevação do tempo de exposição contribui para esta atividade? O β-cariofileno não inibiu o crescimento das células ACP02 e o tempo de exposição não contribuiu para esta atividade (Tabela 2; Figura 11). Inicialmente, pensou-se em realizar o isolamento dos diterpenos e avaliar sua atividade antitumoral, porém os ácidos copálico, 3-acetoxi-copálico, 3-hidróxi- copálico, hardwickiíco, colávico-15-metil éster e o caurenóico não apresentaram efeitos citotóxicos frente às células tumorais (AGP-01, HCT116, MCF-7, NIH- OVCAR, SKAMELL-4 e SF-295), após 72h de exposição a 20 μmol/L (VARGAS et al. 2015). O ácido caurenóico inibiu o crescimento de células leucêmicas (CEM), células de câncer de cólon (HCT-8) e células de câncer mamário (MCF-7; COSTA- LOTUFO et al. 2002), também induz a apoptose em células de tumores cerebrais (glioblastoma U87) por supressão de sinais anti-apoptóticos e ativação de proteases de cisteína (LIZARTE-NETO et al. 2013). Outros derivados dos cauranos induziram apoptose em vários tipos de células tumorais (RAW 264.7, Hela, HepG2 e HT-29; HUESO-FALCÓN et al. 2010). O teor de caureno no óleo é muito reduzido, a fração que continha os diterpenos (fração ácida) não apresentou efeito inibitório sobre ACP02. Em virtude disso, optou-se por não realizar tal fracionamento.

Tabela 2 - Avaliação da citotoxicidade das amostras de C. reitulata frente à linhagem ACP02 CI50 + DP (µg/mL) Amostras 24h 48h 72h ORCR 296,3 ± 1,224 365,6 ± 1,176 451,4 ± 1,198 FACR 795,8 ± 1,215 716,1 ± 1,095 820,4 ± 1,173// FNCR 767,1 ± 1,159 722,4 ± 1,053 987,8 ± 1,210 BETA 624,8 ± 1,263 585,0 ± 1,131 654,0 ± 1,248 ANFOTERICINA B 0,42 ± 0,09 1,79 ± 0,06 0,1 ± 0,0 Legenda: ORCR - óleoresina de Copaifera reticulata, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata, BETA - β-cariofileno

Neste trabalho foram incluídos 2 óleos, sendo 1 de origem comercial e por isso não foi possível determinar a espécie e 1 óleoresina originada de C. reticulata. Os dois óleos foram submetidos ao mesmo processo de fracionamento, sendo obtidas duas frações de neutros e frações ácidas, também foram incluídos 2 sesquiterpenos (β-cariofileno e óxido de cariofileno). Inicialmente, avaliou-se a atividade antitumoral de apenas 1 óleo (ORCR), 1 fração ácida (FACR), 1 fração de neutros (FNCR) e 1 sesquiterpeno (BETA) e devido os resultados negativos obtidos, optou-se por não prosseguir este estudo com as demais frações.

Figura 11 - Viabilidade celular da óleoresina de Copaifera reticulata Ducke, frações e β-cariofileno em linhagem ACP02 Legenda: BETA - β-cariofileno; ORCR - óleoresina de Copaifera reticulata; FACR - fração ácida de C. reticulata; FNCR - fração de neutros de C. reticulata; CP - controle positivo; DMSO - dimetilsulfóxido; CN - controle negativo

No caso da avaliação da atividade leishmanicida, utilizou-se promastigota de L. amazonensis, sendo o tratamento realizado por 72h. O ORCR apresentou moderada atividade contra a forma promastigota. O fracionamento contribuiu com a obtenção de uma fração ativa, a fração de neutros (FNCR; Tabela 3). A FACR foi inativa. Possui predominantemente diterpenos, enquanto a fração ativa, FNCR é constituída por sesquiterpenos. Esta atividade foi relacionada aos sesquiterpenos, visto que o trans-β-cariofileno ocasionou alterações morfológicas e estruturais, com dano mitocondrial e instabilidade da membrana plasmática (SANTOS et al. 2008; 2011). A forma promastigota de L. amazonensis foi submetida ao tratamento com β- cariofileno, por 72h, porém não foi observado efeito inibitório significativo nas concentrações utilizadas (Tabela 3). β-cariofileno e trans-cariofileno são estereoisômeros (Figura 12). As alterações moleculares podem levar a uma modificação na sua função, podendo o isômero não possuir a atividade, ser mais ativo ou até mesmo apresentar efeitos adversos que o análogo não possuía (MAGALHÃES, 2016).

CH3

H3C

CH3 CH2

H3C H H3C H C H C 3 2 (A) (B) Figura 12 - Estereoisômero de sesquiterpeno Legenda: (A) - β-cariofileno; (B) - trans-β-cariofileno

Tabela 3 - Avaliação da atividade leishmanicida das amostras de C. reitulata frente à L. amazonensisa Amostras CI50 + DP (µg/mL) ORCR 140,0 + 1,34 FACR 392,9 + 1,19 FNCR 49,6 + 1,25 BETA >200 Legenda: ORCR - óleoresina de Copaifera reticulata, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata, BETA - β-cariofileno L. amazonensisa - cepa com registro MHOM/BR/2009/M26361

Visando esclarecer a resposta leishmanicida do óleo, frações e sequisterpeno, estas amostras foram encaminhadas para o grupo da Profa. Dra. Katia da Silva Calabrese (IOC/FIOCRUZ) e sua atividade antipromastigota contra L. amazonensis e L. infantum foi avaliada (Tabela 4). A óleoresina de C. reticulata

apresentou atividade em L. amazonensis (CI50 = 31,90 µg/mL; Tabela 4). Além disso, foi avaliada a atividade antipromastigota da ORCR em L. infantum, mas esta não foi ativa. Assim como o OCC não foi ativo contra promastigotas de L. amazonensis, e ainda apresentou toxicidade para células

J774.G8 (CC50 = 23,06 µg/mL; Tabela 4). Em síntese, a ORCR mostrou-se promissora para promastigota de L. amazonensis (Tabela 4). No estudo realizado em Belém utilizou-se um isolado de L. amazonensis obtido de paciente que não respondeu satisfatoriamente ao tratamento com antimonial, enquanto que no estudo realizado no Laboratório de Imunomodulação e Protozoologia do Instituto Oswaldo Cruz (IOC/FIOCRUZ), utilizou-se um parasito obtido do isolamento de caso humano de leishmaniose cutânea difusa. Sabe-se que a virulência de promastigotas de Leishmania pode ser reduzida quando estes são mantidos em cultivo, in vitro, por longos períodos e pode ser recuperada por sucessivas passagens do parasita pelo hospedeiro vertebrado (GAMA et al. 2007). Talvez, alterações na virulência do parasito possam interferir na resposta da substância teste. Logo, a distinção entre os perfis das cepas utilizadas, podem explicar as diferenças observadas entre as Tabela 3 e 4. Quando se analisou as frações, foi possivél observar que o fracionamento das amostras contribuiu para potencializar a atividade. Portanto, as frações ácidas obtidas do óleo comercial (FAOC) e da óleoresina de C. reticulata (FACR) foram submetidas aos ensaios contra promastigotas de L. amazonensis e L. infantum, e citotoxicidade (J774.G8). A FACR não se mostrou promissora em promastigota de L.

amazonensis (CI50 = 66,62 µg/mL) e nem inibiu de forma significativa as promastigotas de L. infantum (CI50 = 68,41 µg/mL). Mas ao analisar a FAOC, esta se mostrou ativa contra promastigota de L. amazonensis (CI50 = 26,27 µg/mL) e L. infantum (CI50 = 28,68 µg/mL), no entanto houve redução na seletividade (IS = 0,291; 0,267; respectivamente), aja vista que se observou um aumento na citotoxicidade (CC50 = 7,656 µg/mL Tabela 4). Ademais a fração FAOC não se mostrou promissora. Apesar dos processos de obtenções de FACR e FAOC serem iguais, observou-se respostas diferentes. A FACR foi obtida da óleoresina de C. reticulata, enquanto que a FAOC foi obtida do óleo copaíba comercial sem identificação de espécie. A composição química da óleoresina pode variar de acordo com a espécie, época de coleta e local da coleta (CASCON e GILBERT, 2000; VEIGA JUNIOR e PINTO, 2002; BARBOSA et al. 2013). As diferenças entre os constituintes químicos destas frações podem explicar as diferenças nas respostas observadas (Tabela 4). As demais frações, FNCR e FNOC, também foram submetidas aos ensaios para atividade antipromastigota de L. amazonensis e L. infantum, sendo que FNCR

(CI50 = 29,13 µg/mL; IS = 1,47) e FNOC (CI50 = 30,16 µg/mL) foram ativas contra promastigota de L. amazonensis. Em L. infantum, somente a FNCR (CI50 = 12,91µg/mL; IS = 3,33), mostrou-se ativa. No estudo realizado em Bélem-PA, FNCR também foi ativa contra L. amazonensis (CI50 = 49,6 µg/mL; Tabela 3). Um fato muito relevante observado foi à seletividade que a amostra apresentou para ambas as espécies (Tabela 4). Como a fração de neutros é formada pelos sesquiterpenos de Copaifera, então é provável que estes metabólitos sejam responsáveis pela capacidade inibitória em promastigotas de Leishmania. Diferente do resultado encontrado em Belém-PA, o β-cariofileno foi ativo contra promastigota de L. amazonensis (CI50 = 6,692 µg/mL) e L. infantum (CI50 = 36,18 µg/mL), sendo observada elevada seletividade para L. amazonensis (IS = 10,4; Tabela 4). Este resultado sugere que fatores relacionados ao parasita possam interferir na atividade antipromastigota e enfatiza que o sesquiterpenos seja mais promissor para esta atividade. O óxido de cariofileno é o composto majoritário do óleo de copaíba comercial e parece que esta substância tem atividade contra Leishmania, pois o óleo se mostrou ativo em forma amastigota de Leishmania amazonensis (2,9 µg/mL) e elevada seletividade (29,3). O trans-β-cariofileno possuía maior teor em outro óleo

de copaíba comercial e este óleo também apresentou atividade na forma amastigota

(CI50 = 2,3 µg/mL e IS = 40,1), quando se testou a substância pura (trans-β- cariofileno) esta se mostrou mais ainda promissora para atividade antileishmania

(CI50 = 1,3 µg/mL e IS = 48,9), e com valores de citotoxicidade frente a macrófagos murinos peritoneais (CC50 = 85,0; 92,4 e 63,6 µg/mL respectivamente; SOARES et al. 2013). Como este óxido é o metabolito majoritário da FNOC, espera-se que este apresente baixa citotoxicidade e elevada atividade leishmanicida, assim, espera-se também uma excelente atividade leishmanicida e não citotóxica testando as substâncias puras (β-cariofileno e óxido de cariofileno). Considerando-se que o óxido de cariofileno nunca foi testado para esta atividade. O sesquiterpeno óxido de cariofileno mostrou-se ativo em isolados de L. amazonensis (CI50 = 14,56 µg/mL) e ainda mais ativo em L. infantum (CI50 = 6,767 µg/mL), porém foi menos seletivo em promastigostas de L. amazonensis (IS = 3,62) em relação a L. infantum (IS = 7,79). Além do mais, o mesmo comportamento não foi observado para β-cariofileno (Tabela 4). Estes resultados sugerem que alterações estruturais podem influênciar na atividade antipromastigota (LIMA et al. 2004; SALUSTIANO et al. 2010) e modificar as respostas frente aos parasitas testados, potencializando ou reduzindo a atividade. Estudos etnobotânicos relatam o uso do óleo de Copaifera para o tratamento de feridas e para cicatrização destas feridas (COELHO-FERREIRA, 2009; SANTANA et al. 2014), este estudo demonstrou que a ORCR, FNCR, β-carifioleno e óxido de cariofileno podem ser promissores como agentes leishmanicida (Tabela 4). Portanto estas amostras precisam ser submetidas a estudos que avaliem seu efeito contra forma amastigota intracelular e estudos in vivo, desta forma pode-se confirmar este uso popular.

Tabela 4 - Avaliação antipromastigota e citotoxicidade de óleos, frações e substâncias puras L. amazonensisa L. infantumb J774.G8 Amostras IS CI50 + DP (µg/mL) CI50 + DP (µg/mL) CC50 + DP (µg/mL) ORCR 31,90 ± 1,155 57,32 ± 1,725 43,83 ± 1,306 1,37; 0,765 FACR 66,62 ± 1,166 68,41 ± 1,221 49,87 ± 1,318 0,749; 0,729 FNCR 29,13 ± 1,139 12,91 ± 1,401 42,95 ± 1.396 1,47; 3,33 BETA 6,692 ± 1,160 36,18 ± 1,238 69,89 ± 1,315 10,4; 1,93 ÓXIDO 14,56 ± 1,184 6,767 ± 1,586 52,71 ± 1,303 3,62; 7,79 OCC 73,16 ± 1,343 N.A 23,06 ± 1,251 0,315; N.D FAOC 26,27 ± 1,183 28,68 ± 1,563 7,656 ± 1,169 0,291; 0,267 FNOC 30,16 ± 1,142 72,57 ± 1,286 16,56 ± 1,196 0,549; 0,228 ANFOTERICINA B 0,0384 ± 1,173 0,1652 ± 1,340 19,07 ± 1,150 496,6; 115,4 Legenda: ORCR - óleo resina de Copaifera reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNOC - fração de neutros do óleo de copaíba comercial, FAOC - fração ácida do óleo de copaíba comercial, BETA - β-cariofileno e ÓXIDO - Óxido de cariofileno, N.A - Não avaliado, N.D - Não determinado. L. amazonensisa - cepa H21, com registro MHOM/BR/76/MA-76 b L. infantum - cepa com registro MCAN/BR/2008/1112

Outra atividade avaliada foi à antimicrobiana, sendo todas amostras submetidas ao ensaio de microdiluição e quando possível eram calculadas as CI50.

Contra Candida albicans, apenas o ORCR (CI50 = 86,9 µg/mL) e FAOC (CI50 = 43,2 µg/mL; Tabela 5), foram ativas. A FAOC é composta por diterpenos do óleo de copaíba comercial, provavelmente o composto majoritário desta fração seja o ácido copálico. Embora o ácido copálico esteja presente em todos os óleos de copaíba, ainda sim pouco se avalia este diterpeno em atividades biológicas, como antifúngicas (PORTAPILLA, 2014). A avaliação da atividade antifúngica da óleoresina e óleo essencial de Copaifera multijuga Hayne (0,08 mg/mL-1 a 1,6 mg/mL-1), pelo método de difusão em discos de papel de 5 mm, foi bastante promisora frente às espécies de Candida e Aspergillus. O óleo essencial apresentou alta atividade contra Candida parapsilosis quanto comparada com o controle positivo (miconazol; DEUS et al. 2011). Deste modo, a óleoresina de Copaiferas é promissora contra Candida spp. Todas as amostras testadas foram ativas contra Salmonella spp. (Tabela 5), infelizmente não foi possível estabelecer sua CI50. Esta bactéria gram-negativa, em forma de bacilo, não esporulada, não capsulada e a maioria não fermenta a lactose. A Salmonella spp. após ser ingerida pelo hospedeiro, se multiplicam, aderindo-se e penetrando nas células epiteliais da região ileocecal, levando à resposta inflamatória mediada por liberação de prostaglandinas, que estimulam o AMP cíclico produzindo secreção ativa de fluidos, que resulta em diarréia (CARDOSO e CARVALHO, 2006). Em Igarapé Miri (Estado do Pará, Brasil), nos anos 2000 e 2008, um estudo foi realizado com “informantes” de plantas medicinais, no qual relatou o uso do óleo e do chá das cascas de copaíba. Um dos objetivos terapêuticos era para o tratamento de diarréia e problemais estomacais (PINTO, 2008).

A FARC (CI50 = 4,1 µg/mL), FAOC (CI50 = 7,8 - 15,6 µg/mL), FNCR (CI50 = 5,6

µg/mL), FNOC (CI50 = 7,8 - 15,6 µg/mL), β-cariofileno e óxido de cariofileno (CI50 = 7,8 - 15,6 µg/mL) apresentaram atividade contra Pseudomonas aeruginosa (Tabela 5). Pseudomonas são bactérias gram-negativas, bacilares, encontradas em diversos ambientes, porém a espécie mais patógena é a Pseudomonas aeruginosa (NEVES et al. 2011). Esta espécie pode causar infecções respiratórias, urinárias ou bacteriemia oportunistas em pacientes hospitalizados, com cateteres ou imunodeprimidos, otite em crianças e conjuntivite em quem usa lentes (ARRUDA, 1998). Infelizmente, esta bactéria possui ampla resistência aos antimicrobianos

disponíveis (SANTOS et al. 2015), logo a busca de alternativas terapêuticas para esta bactéria é urgente. Estudos adicionais precisam ser realizados para identificar o possível mecanismo de ação, bem como se em modelos de sepse in vivo observa- se resposta satisfatória. A utilização do extrato etanólico de Copaifera reticulata apresentou atividade contra cepas multirresistente, incluindo a Pseudomonas aeruginosa (CORREIA et al. 2008). Em um outro estudo utlizando o óleo de Copaifera multijuga este mostrou uma atividade de 68,42% (Pseudomonas aeruginosa), comparando-se com o cloranfenicol (MENDONÇA e ONOFRE, 2009). Os habitantes do Parque Nacional Jaú (JNP), Estado do Amazonas, utilizam a espécie Copaifera guyanensis Desf., sendo a óleoresina utilizada para problemas dermatológicos, distúrbio geniturinário, dor e febre (RODRIGUES, 2006). Porém contraindica o uso desta espécie na gestação (RODRIGUES, 2006; YAZBEK et al. 2016). Outro estudo etnobotânico realizado em Igarapé Miri (Estado do Pará), relatou o uso do óleo e do chá das cascas de copaíba com a finalidade de tratar a asma e problemas no útero (PINTO, 2008). Sabe-se que a Pseudomonas aeruginosa é resistente a múltiplos fármacos, portanto há dificuldades nas opções de tratamentos de diversas patologias, o que torna emergente novas opções terapêuticas (FIGUEIREDO et al. 2007; NEVES et al. 2011). A óleoresina de Copaifera se mostrou bastante promissora através dos resultados obtidos neste estudo, sendo provável que o composto ativo é um sesquiterpeno, aja vista que tanto o β-cariofileno quanto o óxido de cariofileno foram ativos. Cerca de 90% das infecções humanas por Proteus é ocasionada por Proteus mirabilis, uma bactéria gram-negativa, anaeróbia facultativa, com motilidade e capaz de produzir grande quantidade de urease. Pode fazer parte da flora normal do intestino, quando invade vias urinárias causa infecção urinária alcalina, por converter ureia em amônio, podendo levar à formação de cristais de carbonato de cálcio e/ou apatita (pedras nos rins; JACOBSEN et al, 2008). Atividade antimicrobiana dos óleos, suas frações e substâncias puras foram avaliadas contra Proteus mirabilis, sendo ativas FARC (CI50 = 7,8 - 15,6 µg/mL),

FAOC (CI50 = 7,8 - 15,6 µg/mL), FNCR (CI50 = 7,8 - 15,6 µg/mL), FNOC (CI50 = 7,8 - 15,6 µg/mL). A ORCR apresentou-se ativa (Tabela 5), porém quando se relacionada

à CI50 (Tabela 3; 4) e a CC50 (Tabela 4) observa-se baixa seletividade.

As espécies de C. multijuga, C. officinalis, C. reticulata, C. lucens, C. langsdorffii, C. paupera, C. martii e C. cearensis foram avaliados através do ensaio de microdiluição frente à Proteus mirabilis (ATCC 25933) e através de um ensaio de difusão em ágar com Proteus mirabilis (CDC 305) sendo que estes foram inativos frente à inibição dessas cepas (SANTOS et al. 2008). Porém vale ressaltar que é necessária uma investigação mais detalhada quanto a sua eficácia. Em geral, as plantas medicinais e seus metabólitos são mais promissores em bactérias Gram positivas (CORREIA et al. 2008; SOUZA et al. 2011; ABRÃO et al. 2015; BARDAJÍ et al. 2016), porém neste estudo observou que as frações de

Copaifera foram mais promissoras para Gram negativas. Apenas FAOC (CI50 = 23,4

µg/mL) e ORCR (CI50 = 48,6 µg/mL) apresentaram atividade contra S. aureus (Tabela 5). Foi realizada avaliação de oito óleos de Copaifera sp., mas só 3 espécies (C. martii, C. officinalis e C. reticulata) foram mais ativas, a qual apresentou inibição frente às cepas de S. aureus (CIM = 62,5 µg/mL). Mas para S. aureus meticilina resistente (MRSA; CIM = 62,5 µg/mL) apenas a C. martii apresentou maior atividade, utilizando-se da técnica de microdiluição em caldo (SANTOS et al. 2008). Em outro estudo houve um potencial de inibição, in vitro, de Staphylococcus aureus pelo óleo de copaíba da Copaifera multijuga com discos de papel filtro impregnados com solução de óleo de copaíba na concentração de 1,56% (MENDONÇA e ONOFRE, 2009).

Tabela 5 - Avaliação da atividade antimicrobiana Candida albicans Proteus mirabilis Staphylococcus Salmonella spp. Pseudomonas Amostra aureus Aeruginosa (µg/mL + DP) (µg/mL + DP) (µg/mL + DP) (µg/mL + DP) (µg/mL + DP) OCC 148,4 ± 1,3 169,0 ± 1,2 269,0 ± 1,2 15,6 - 7,8 297,7 ± 1,2 FAOC 43,2 ± 1,4 15,6 - 7,8 23,4 ± 1,2 15,6 - 7,8 15,6 - 7,8 FNOC 274,2 ± 1,2 15,6 - 7,8 > 500 15,6 - 7,8 15,6 - 7,8 BETA > 500 > 500 > 500 15,6 - 7,8 15,6 - 7,8 ÓXIDO > 500 > 500 > 500 15,6 - 7,8 15,6 - 7,8 ORCR 86,9 ± 1,2 51,0 ± 1,1 48,6 ± 1,2 15,6 - 7,8 52,0 ± 1,1 FACR 343,4 ± 1,2 15,6 - 7,8 329,3± 1,1 15,6 - 7,8 4,1 ± 1,2 FNCR 330,4 ± 1,2 15,6 - 7,8 254,6 ± 1,2 15,6 - 7,8 5,6 ± 1,1 Legenda: OCC - óleo de copaíba comercial, FAOC - fração ácida do óleo de copaíba comercial, FNOC - fração de neutros do óleo de copaíba comercial, BETA - β-cariofileno e ÓXIDO - óxido de cariofileno, ORCR - óleo resina de Copaifera reticulata Ducke, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata

O fracionamento dos óleos contribuiu com a atividade antimicrobiana. Todas as amostras se mostraram ativas, mas pouco seletivas em Salmonella spp. Apenas as frações dos óleos contribuíram para a inibição das cepas de Proteus mirabilis, porém com pouca seletividade. Se tratando de Pseudomonas aeruginosa, as frações do óleo de copaíba comercial e as substâncias puras (β-cariofileno e óxido de cariofileno) tiveram o mesmo comportamento, tendo atividade e com pouca seletivadade. Entretanto ao analisar o fracionamento da óleoresina de Copaifera reticulata, tanto esta quanto suas frações apresentaram atividade, mas suas frações foram altamente seletivas para a inibição de Pseudomonas aeruginosa (Tabela 6). De modo geral, os resultados foram bastante promissores frente às bactérias Gram negativas. Ao comparar estes resultados de antimicrobianos com os de leshmanicida, apenas as FACR e FNCR se apresentaram eficazes frente à bactéria Pseudomonas aeruginosa, porém há necessidade de se investigar esta atividade para verificar qual metabólito esta atuando seletivamente ou se o sinergismo entre as substâncias é o real influenciador na atividade antimicrobiana, pois tanto o β-cariofileno quanto o óxido de cariofileno foram poucos seletivos para esta cepa e inativos para a maioria dos microrganismos. Mas o ORCR, FNCR, BETA e o ÓXIDO foram promissores para atividade antileishmania. Estes resultados sugerem que há diferenças entre os óleos, que possivelmente a atividade seja influenciada pela composição química das amostras, sendo os melhores resultados obtidos da óleoresina de Copaifera reticulata, e que possivelmente os sesquiterpenos (β-cariofileno e óxido de cariofileno) sejam os responsáveis pela atividade leishmanicida (Tabela 6).

Tabela 6- Síntese das atividades biológicas CLASSIFICAÇÃO DA ATIVIDADE E SELETIVIDADE Leishmania Leishmania Salmonella Pseudomonas Proteus Staphylococcus Candida amazonensis infantum spp. aeruginosa mirabilis aureus albicans ORCR Ativa e seletiva Inativa Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco seletiva seletiva seletiva seletiva seletiva OCC Inativa N.A Ativa e pouco Pouco ativa e Pouco ativa e Pouco ativa e Pouco ativa e seletiva seletiva seletiva seletiva seletiva FACR Inativa Inativa Ativa e pouco Ativa e seletiva Ativa e pouco Pouco ativa e Pouco ativa e seletiva seletiva seletiva seletiva FAOC Ativa e não Ativa e não Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco seletiva seletiva seletiva seletiva seletiva seletiva seletiva FNCR Ativa e seletiva Ativa e seletiva Ativa e pouco Ativa e seletiva Ativa e pouco Pouco ativa e Pouco ativa e seletiva seletiva seletiva seletiva FNOC Ativa e não Inativa Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco Inativa Pouco ativa e seletiva seletiva seletiva seletiva seletiva BETA Ativa e seletiva Ativa e seletiva Ativa e pouco Ativa e pouco Inativa Inativa Inativa seletiva seletiva ÓXIDO Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco Ativa e pouco Inativa Inativa Inativa seletiva seletiva seletiva seletiva Legenda: OCC - óleo de copaíba comercial, FAOC - fração ácida do óleo de copaíba comercial, FNOC - fração de neutros do óleo de copaíba comercial, BETA - β-cariofileno e ÓXIDO - óxido de cariofileno, ORCR - óleo resina de Copaifera reticulata Ducke, FACR - fração ácida de C. reticulata, FNCR - fração de neutros de C. reticulata, N. A - não avaliado

6 CONCLUSÃO

Estes resultados sugerem que há diferenças entre os óleos, portanto a origem do óleo influência nas respostas biológicas e possivelmente a atividade seja interferida pela composição química das amostras. A óleoresina de Copaifera reticulata e sua fração de neutros é ativa e seletiva para a atividade leishmanicida e é bem provável que os sesquiterpenos (β-cariofileno e óxido de cariofileno) sejam os responsáveis por esta atividade, sendo o β-cariofileno altamente seletivo para Leishmania amazonensis.

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ANEXO A - Cromatograma do óxido de cariofileno

ANEXO B - Espectro de massa do óxido de cariofileno