AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Qualea Parviflora SOBRE a DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL E a ÚLCERA GÁSTRICA INDUZIDAS EM ROEDORES

Lucilene Patrícia Mazzolin

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Qualea parviflora SOBRE A DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL E A ÚLCERA GÁSTRICA INDUZIDAS EM ROEDORES

Botucatu – SP 2013

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Qualea parviflora SOBRE A DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL E A ÚLCERA GÁSTRICA INDUZIDAS EM ROEDORES

Lucilene Patrícia Mazzolin

Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de Concentração: Biomoléculas – Estrutura e Função.

Orientadora: Prof. Adj. Clélia Akiko Hiruma-Lima

Botucatu – SP 2013

Aos meus pais, meus maiores amores, Irineu e Odila Às minhas irmãs e sobrinhas, Lâ, Gi, Cá, Bru, Mô Aos meus “preferidos”, Fernando e Davi

Foram tantos anos nesta jornada!!!

E nestes tantos anos, tantas pessoas. Tive a contribuição, a ajuda, a parceria, a cumplicidade, a amizade e até o amor de tanta gente do bem. Não me aventuraria, jamais, a fazer uma lista de nomes, certa de que, pela falta de tempo de debruçar sobre isso, esqueceria pessoas importantes. Formarei alguns grupos na tentativa de atingir todos com um largo sorriso e um terno abraço de agradecimento verdadeiro. Encaixe-se você onde quiser e receba meu respeito e minha gratidão...

- Minha família e todos os seus agregados (são tantos!) pela compreensão, força e apoio incondicional que sempre me dedicaram junto com o amor verdadeiro. Nela encontra-se o meu Fernando, que colocou flores nos últimos metros desta caminhada.

- Minha orientadora Prof. Adj. Clélia Akiko Hiruma-Lima e sua fiel escudeira (e/ou vice-versa, rs!) Prof. Dr. Lúcia Regina Machado da Rocha, pelos ensinamentos, compreensão e amizade.

- Companheiros do Laboratório de Ensaios Biológicos com Produtos Naturais pelas horas e horas de trabalho, ajuda e companhia agradável.

- Amigos de Botucatu, especialmente a amiga-irmã Ellen, pela amizade, companheirismo e pela luz de Davi que colocou em minha vida.

- Amigos de Barra Bonita, pela ação sócio-afetiva-emocional-cultural e o irremediável amadurecimento a mim “imposto”.

- Docentes, funcionários e alunos da FIRA, em especial, meus queridos alunos, pela compreensão, carinho e respeito.

- Docentes, funcionários e alunos do Departamento de Fisiologia, pelo agradável ambiente de trabalho.

- Docentes, funcionários e alunos do Departamento de Farmacologia, onde tudo começou um dia.

- Funcionários da Seção de Pós-graduação, pelas milhares de informações e socorros.

- A você, por dedicar alguns minutos para ler sobre meu trabalho... e vida!!!

"Isso de querer ser exatamente aquilo que a gente é ainda vai nos levar além"

Paulo Leminski DADOS CURRICULARES

Lucilene Patrícia Mazzolin

FORMAÇÃO: Licenciada em Ciências Biológicas e Mestre em Ciências Biológicas (Farmacologia).

ATUAÇÃO PROFISSIONAL: Professora da Faculdades Integradas Regionais de Avaré nos cursos de Ciências Biológicas e Educação Física. Leciona as disciplinas de Biologia Celular, Histologia, Fisiologia Humana, Imunologia e Práticas de Ensino de Ciências e Biologia.

Orientação de TCC:

2013 – Adriana Aparecida Pinto: Implantação de horta medicinal na Escola Estadual “Prof. Celso Ferreira da Silva” no município de Avaré-SP.

2013 – Keila Carriel R. de Oliveira: Perfil glicêmico dos pacientes diabéticos do município de Óleo-SP: conscientizar para viver bem.

2012 – Marcele Regina Barbosa: Levantamento das plantas medicinais utilizadas pela comunidade da Escola Estadual “Prof. Celso Ferreira da Silva” no município de Avaré-SP.

2011 – Laís Regina de Camargo Bergamo: Avaliação do grau de conhecimento sobre hipertensão arterial sistêmica dos alunos das FIRA.

Orientação de Iniciação Científica:

2010/2011 – Estela Oliveira da Maia: Avaliação da atividade de plantas sobre a colite induzida pelo TNBS.

2010/2011 – Liolana Taísa Luchezi Fernandes: Avaliação da atividade antidiarréica de plantas e seu mecanismo de ação.

ARTIGOS PUBLICADOS:

MAZZOLIN, L.P.; Nasser, A.L.M.; Moraes, T.M.; Santos, R.C.; Nishijima, C.M.; Santos, F.V.; Varanda, E.A.; Bauab, T.M., Rocha, L.R.M.; Di Stasi, L.C.; Vilegas, W.; Hiruma-Lima, C.A. Qualea parviflora Mart.: An integrative study to validate the gastroprotective, antidiarrheal, antihemorragic and mutagenic action. Journal of Ethnopharmacology, v.127, p.508-514, 2010. Nasser, A.L.M.; MAZZOLIN, L.P.; Hiruma-Lima, C.A.; Santos, L.S.; Eberlin, M.N.; Souza- Brito, A.R.M.; Vilegas, W. Preparative droplet counter-current chromatography for the separation of the new nor-seco-triterpene and pentacyclic triterpenoids from Qualea parviflora. Chromatographia (Wiesbaden), v.64, p.695-699, 2006.

ARTIGOS EM FASE FINAL DE REDAÇÃO:

MAZZOLIN, L.P., Severi, J.A., Moreira, T.M.S., Pietro, R.C.L.R., Carli, C.B.A., Carlos, I.Z., Bauab, T.M., Vilegas, W., Hiruma-Lima, C.A. Guapira noxia (Netto) Lundell: Evidences of its antioxidant, gastroprotective and antidiarrheal activities. Molecules (a ser submetido).

MAZZOLIN, L.P., Ferrazoli, C., Silva, M.A., Santos, L.C., Vilegas, W., Hiruma-Lima, C.A. Antioxidant and gastroprotective effects of Eriocaulon ligulatum in experimental models of gastric ulcer in rodents. Journal of Natural Medicines (a ser submetido).

EVENTOS:

2012 – Organização do X Workshop de Plantas Medicinais.

2012 – Monitoria no curso extensão universitária “Difundindo e Popularizando a Ciência na UNESP: Interação entre pós-graduação e ensino básico - Reprodução de A a Z”.

2011 – Participação na XXVI Reunião Anual da Federação de Sociedades de Biologia Experimental – FeSBE apresentando o trabalho: Effects of Qualea parviflora methanolic extract in the TNBS-induced colitis in rat. 2011.

2010 – Participação no IX Workshop de Plantas Medicinais de Botucatu.

2009 – Participação na IX Jornada Paulista de Plantas Medicinais apresentando o trabalho: Avaliação do mecanismo de ação antiulcerogênico do extrato metanólico de Guapira noxia (Nyctaginaceae): participação dos grupamentos sulfidrílicos e da glutationa na gastroproteção.

RESUMO

As principais espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são os radicais superóxido e hidroxila, o peróxido de hidrogênio e o peroxinitrito. Todos estes agentes, apesar de participarem de vários eventos biológicos importantes causam efeitos deletérios. Mecanismos naturais de combate destas espécies reativas incluem um eficiente sistema enzimático contando com a superóxido dismutase, a catalase, a glutationa peroxidase e redutase, além de compostos não enzimáticos que reagem diretamente com os agentes oxidantes como glutationa reduzida, -tocoferol, ascorbato, -caroteno e diversos compostos fenólicos derivados de plantas. O desequilíbrio entre a ação do sistema de defesa antioxidante e a força pró oxidativa caracteriza o estresse oxidativo cujos alvos são as macromoléculas celulares. Dessa forma a manutenção do equilíbrio entre o sistema antioxidante e pró-oxidativo têm grande importância em processos fisiológicos bem como em muitos processos patológicos como a doença inflamatória intestinal e a úlcera péptica. Embora a fisiopatologia exata destas doenças permaneça incerta sabe-se que se trata de processos multifatoriais onde o excesso de produção de espécies reativas ou a redução nos mecanismos antioxidantes estão envolvidos na iniciação ou na cronicidade da doença. Os desafios da ciência incluem a compreensão destes eventos de modo que se possibilitem intervenções terapêuticas mais eficazes. Neste contexto, são muitos os estudos que envolvem plantas como alternativas na busca de novas terapias, sendo Qualea parviflora o objeto deste estudo. Esta espécie conhecida como pau-terrinha é utilizada na medicina popular contra males do trato gastrointestinal como gastrite, úlcera gástrica, diarréia com sangue e cólicas intestinais, além de anti-séptico externo. O extrato metanólico das cascas (Qp) desta espécie contém diversos compostos derivados do ácido elágico, definido como um composto fenólico objeto de intensas investigações em decorrência de sua ação antioxidante. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar esta ação sobre patologias do trato gastrointestinal com envolvimento de espécies reativas em sua fisiopatologia como a doença inflamatória intestinal e a úlcera péptica. Qp foi capaz de prevenir as lesões intestinais induzidas pelo ácido trinitrobenzenosulfônico através de sua capacidade de manutenção dos níveis de glutationa, um potente antioxidante endógeno, que marcadamente reduziu o estresse oxidativo local, evidenciado pela redução dos níveis de malonildialdeído (marcador de lipoperoxidação). Além disso, Qp foi capaz de reduzir a ativação de células inflamatórias, vista pela menor atividade da enzima mieloperoxidase e por redução nos níveis das citocinas inflamatórias, TNF- e IL 1-, resultando também em menor estresse oxidativo. Adicionalmente, Qp também foi capaz de reduzir a diarréia induzida por óleo de rícino pela sua atuação na motilidade e permeabilidade intestinal. Qp foi capaz de atuar beneficamente sobre as úlceras gástricas induzidas por vários agentes como etanol, etanol acidificado e droga antiinflamatória não esteroidal, reduzindo as lesões gástricas também pela manutenção dos níveis de glutationa, além de reforço na barreira mucosa através de um aumento nos níveis de prostaglandina E2. Neste estudo ainda se observou a capacidade de Qp de agir contra a bactéria Helicobacter pylori. Estes dados em conjunto colocam a espécie vegetal Qualea parviflora em um cenário promissor de alternativa para novas terapias, uma vez que esta espécie apresentou potente ação antioxidante sobre patologias importantes do trato gastrointestinal como as úlceras pépticas e a doença inflamatória intestinal.

Palavras-chave: Qualea parviflora, ácido elágico, antioxidante, úlcera péptica, doença inflamatória intestinal. SUMÁRIO

RESUMO

INTRODUÇÃO...... 10

OBJETIVOS...... 20

CAPÍTULO 1: Antidiarrheal and intestinal anti-inﬂammatory activities of a methanolic extract of Qualea parviflora Mart. in experimental models...... 21

CAPÍTULO 2: Qualea parviflora Mart.: An integrative study to validate the gastroprotective, antidiarrheal, antihemorragic and mutagenic action…………...... 47

CONCLUSÃO...... 54

REFERÊNCIAS...... 55

INTRODUÇÃO

“Organismos aeróbios não podem existir sem o oxigênio, mas o oxigênio é inerentemente perigoso para sua existência.” Paradoxo do oxigênio, (Davies, 1995).

Características moleculares do oxigênio fazem com que o mesmo necessite receber elétrons um a um para ser reduzido. Nas células dos organismos aeróbios, mais especificamente nas mitocôndrias, essa redução é feita no complexo enzimático integrante da cadeia transportadora de elétrons denominado citrocromo c oxidase, que catalisa a transferência simultânea de quatro elétrons, produzindo H2O como produto final da reação. Entretanto, cerca de 2% do oxigênio consumido pela célula é reduzido univalentemente, dando início à formação de espécies reativas (Figura 1) (Fridovich, 2013).

Figura 1: Esquema ilustrativo da formação de espécies reativas de oxigênio.

Estas espécies reativas ocorrem em um cenário onde provocam ou resultam de reações de óxido-redução. São derivadas, em sua maioria, do metabolismo do oxigênio, sendo denominadas espécies reativas de oxigênio (EROs), e de sua relação com o metabolismo de outros compostos, como por exemplo, o óxido nítrico, formando as chamadas espécies reativas do nitrogênio (ERNs). Podem ser geradas a partir de condições endógenas como respiração celular, apoptose e fagocitose de patógenos, no citoplasma, nas mitocôndrias ou nas membranas, sendo, geralmente, o seu alvo celular relacionado com o sítio de formação. A produção destas espécies reativas também pode acontecer a partir da exposição a fatores exógenos como dieta, tabagismo, alcoolismo, medicamentos e patógenos (Fridovich, 1998; McCord, 2000; Davies, 2000). Dentre as principais EROs estão espécies radicalares como superóxido e hidroxila, e - não radicalares como o peróxido de hidrogênio. O radical superóxido (O2 ) é gerado continuamente na cadeia transportadora de elétrons na mitocôndria e através da ação de enzimas como xantina oxidase. É um potente agente oxidante capaz ainda de formar ERNs. O - O2 é altamente permeável às membranas e em fagócitos, como neutrófilos e macrófagos e é um importante microbicida (McCord e Fridovich, 1969; Fridovich, 1998). O radical hidroxila (OH-), apesar de seu limitado poder de difusão, é a ERO mais lesiva. Uma vez formado por processos catalisados por metais, principalmente ferro, o organismo não dispõe de mecanismos específicos de defesa. O peróxido de hidrogênio (H2O2) é formado na matriz - mitocondrial, pela ação de diversas oxidases dos peroxissomos e pela dismutação do O2 . Apesar de ser um oxidante fraco, é muito difusível e capaz de gerar OH- (Fridovich, 2013; Vasconcelos et al., 2007). O óxido nítrico (NO), sintetizado pela ação de um grupo de enzimas denominado óxido nítrico sintase (NOS), apresenta alta reatividade com espécies radicalares e possui papel biológico bastante crítico, podendo ser um importante antioxidante. Difunde-se rapidamente e produz como intermediário de sua reação o peroxinitrito (ONOO-), uma importante ERN e potente oxidante com propriedades semelhantes ao OH- (Gutteridge e Halliwell, 2010; Lundberg et al., 2008).

Figura 2: Esquema ilustrativo da participação de espécies reativas em eventos biológicos.

Todos estes agentes, apesar de participarem de vários eventos biológicos importantes (Figura 2), causam, em maior ou menor grau, efeitos deletérios como modificações no DNA, danos nas proteínas, inativação enzimática e peroxidação lipídica. Entretanto, mecanismos naturais de combate incluem um eficiente sistema antioxidante que se divide em duas grandes classes que atuam conjuntamente, o sistema antioxidante enzimático e o não enzimático. Entre as principais enzimas responsáveis pelo combate às espécies reativas estão a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa redutase - (GR). A SOD catalisa a reação de conversão de duas moléculas de O2 idênticas em dois diferentes produtos, o O2 e a H2O2, molécula esta que tem sua concentração controlada, assim como peróxidos provenientes da peroxidação lipídica, pela ação das outras enzimas do sistema antioxidante enzimático, ou seja, a CAT e a GPx/GR (Figura 3). Estas enzimas convertem hidroperóxidos e lipoperóxidos em O2 e H2O, cessando o processo de formação de outras espécies reativas (Davies, 2000; McCord, 2000). Além deste sistema, as células utilizam uma série de compostos antioxidantes não enzimáticos que reagem diretamente com os agentes oxidantes e são denominados varredores (scavengers). Dentre estes antioxidantes estão substâncias produzidas pelo organismo ou absorvidas da dieta, como glutationa reduzida (GSH), -tocoferol, ascorbato, -caroteno e diversos compostos fenólicos derivados de plantas (Anderson, 1996; Quideau et al., 2011).

Figura 3: Esquema ilustrativo da atuação de enzimas antioxidantes sobre espécies reativas.

O desequilíbrio entre a ação do sistema de defesa antioxidante e a força oxidativa caracteriza o estresse oxidativo, e pode dar-se devido à diminuição da proteção dos antioxidantes, aumento da exposição aos compostos oxidantes ou ambos acontecendo simultaneamente (Davies, 2000; Halliwell e Whiteman, 2004). Nos sistemas biológicos, vários são os alvos do estresse oxidativo, sendo as membranas celulares e suas principais macromoléculas, lipídios e proteínas, juntamente com o DNA, os principais focos da atuação de espécies reativas. Dentre as consequências desta atuação inclui-se a adaptação celular, proporcionando proteção completa ou parcial contra os danos, a lesão celular direta ou indireta e a morte celular (Chiurchiu e Maccarrone, 2011; Halliwell e Whiteman, 2004). Assim sendo, o estresse oxidativo tem grande importância nos processos fisiológicos de proliferação, diferenciação e morte celular, além de significativa contribuição em muitos processos patológicos isquêmicos como acidente vascular cerebral, isquemia cardíaca; doenças neurológicas como esclerose múltipla, Alzheimer, Parkinson; processos inflamatórios como doença inflamatória intestinal, gastrite e úlcera gástrica; e muitos outros (Chiurchiù e Maccarrone, 2011; McCord, 2000).

“A produção aumentada de espécies reativas contribuindo para a iniciação e progressão da doença inflamatória intestinal é um dos achados mais consistentes na pesquisa da fisiopatologia desta doença” (Zhu e Li, 2012; Rezaie et al., 2007; Pavlick et al., 2002).

Embora a fisiopatologia exata da doença inflamatória intestinal (DII) ainda necessite de informações sabe-se que se trata de um conjunto de condições inflamatórias do intestino delgado e do cólon, cujas principais formas são a retocolite ulcerativa (RCU) e a doença de Crohn (DC). Estas formas da doença são de grande importância clínica e caracterizada por desconforto ou dor abdominal, diarréia seguida de sangramento, febre, perda de peso, além de outros sintomas. Dentre as características histológicas estão abcesso e distorção de criptas e grande infiltração de neutrófilos e linfócitos (Baumgart e Carding, 2007; Xavier e Podolsky, 2007).

Figura 4: Imagem ilustrativa das características macro e microscópicas que diferenciam as duas formas da DII. Disponível em www.medicinageriatrica.com.br.

Apesar de não ser possível, em alguns casos, diferenciar entre as duas formas da doença, podem-se observar diferenças principalmente na extensão e localização das lesões (Figura 4). A RCU se limita ao cólon (cólon descendente e reto) e envolve basicamente a camada mucosa, manifestando-se como áreas contínuas de inflamação e ulceração, dano glandular e depleção de mucina. A DC é caracterizada por inflamação e ulceração descontínua que ultrapassa a camada transmural da mucosa de todo o trato digestório, podendo ocorrer fibrose, ulceração linfóide e formação de granulomas (Cho, 2008). Estas doenças apresentam alta incidência em países industrializados do hemisfério norte (Europa Ocidental e América do Norte), sendo duas vezes maior na Europa Ocidental que na Europa Oriental. Porém, nas regiões ditas de alta incidência observa-se um baixo crescimento do número de casos, ao passo que áreas até então relatadas com baixa incidência apresentam um número crescente de casos (Burisch e Munkholm, 2013). No Brasil estas taxas ainda são pouco conhecidas devido às dificuldades no processo de investigação (Zaltman, 2007). De acordo com Victoria et al. (2009) a baixa prevalência na região centro oeste do estado de São Paulo (22,61 casos/100.000 habitantes) assemelha-se a de outros países da América Latina. No entanto, o já relatado número crescente de casos nas regiões de baixa incidência justifica a implantação de políticas para sua abordagem. Estudos clínicos e experimentais recentes sugerem que o início e progressão da DII são multifatoriais, envolvendo interações entre a genética, o sistema imune do indivíduo e os fatores ambientais a que este indivíduo esta sujeito. Nos indivíduos geneticamente predispostos, o processo inflamatório geral se caracteriza por disfunção da barreira mucosa, invasão de microorganismos e ativação de uma resposta imune inadequada que contribui para uma exacerbada produção de espécies reativas (Brenna et al., 2013; Rezaie et al., 2007). O sistema imune intestinal, considerado o mais complexo do organismo, é capaz de distinguir entre nocivo e não-nocivo o grande número de antígenos endógenos e exógenos a que está constantemente exposto. Para tanto, mantém uma grande quantidade de leucócitos nesta região (Mowat, 2003). Células dendríticas atuam como apresentadoras de antígenos e a resposta imune celular envolve subconjuntos específicos de linfócitos T diferenciados e ativados como células Thelper1 (Th1), subsequente liberação de citocinas pró-inflamatórias como fator de necrose tumoral alfa (TNF-), interleucina 2 (IL-2) e interferon gama (IFN-), que causam a ativação de macrófagos intersticiais e outros fagócitos e liberação adicional de citocinas pró-inflamatórias como interleucina 1beta, 6, 8 e 12 (IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12) além de mais TNF-, bem como o aumento na produção de espécies reativas (Figura 5). Isto se dá de maneira equilibrada através da ativação de células T regulatórias (Tr) e liberação de citocinas antiinflamatórias como interleucina 10 (IL-10) e fator de transformação do crescimento beta (TGF-β) que inibem a ativação de células Th1 e de macrófagos e outros fagócitos. A disfunção de mecanismos regulatórios associada a alterações na barreira mucosa que levam a cronicidade do processo inflamatório e danos pelo estresse oxidativo, parecem ser componentes importantes na compreensão da fisiopatologia da DII (Brown e Mayer, 2007; Neuman, 2007).

Figura 5: Imagem ilustrativa da ativação do sistema imune e produção de citocinas e espécies reativas na DII (Pavlick et al., 2002).

A aumentada geração de espécies reativas que se dá pela ativação de células inflamatórias e indução da produção de enzimas oxidativas, como NADPH oxidase, mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase induzível (iNOS) resultam em importante papel na inflamação intestinal (Zhu e Li, 2012; Naito et al., 2007) e, na ausência de mecanismos de defesa antioxidantes promovem aumento de lesão, depleção dos níveis de agentes antioxidantes como a glutationa, ativação do fator de transcrição nuclear κB (NF-κB) que contribui para a ativação de mais células inflamatórias, além de influenciarem na ocorrência de sintomas como a diarréia (Dryden et al., 2005).

“Alterações nos mecanismos de defesa bem como o sucesso de terapias antioxidantes nas úlceras pépticas reforçam o envolvimento de espécies reativas na sua complexa fisiopatologia” (Calvino- Fernández e Parra-Cid, 2010; Bandyopadhyay e Chattopadhyay, 2006).

A grande maioria dos estudiosos de disfunções do trato gastrointestinal define úlcera péptica como uma doença multifatorial, geralmente crônica, provocada pelo desequilíbrio entre os mecanismos de defesa e os fatores agressores da mucosa. São lesões profundas causadas pela ação lesiva do ácido clorídrico e da pepsina frequentemente presentes no estômago e no duodeno (Figura 6) (Yeomans e Naesdal, 2008, Milani e Calabrò, 2001).

Figura 6: Imagem ilustrativa da ocorrência de úlceras gástricas e duodenais. Disponível em www.drfernandovalerio.com.br/blog.

Estima-se que a úlcera péptica afete cerca de 10% da população mundial. Apesar disto, estudos recentes indicam que sua incidência tenha diminuído nos últimos anos, o que pode ser devido, entre outros motivos, aos avanços na terapêutica que reduziram os riscos de recorrência da doença, bem como seu custo de tratamento. Contrariamente, o uso contínuo e indiscriminado de medicamentos como drogas antiinflamatórias não esteroidais (DAINEs), associadas à úlcera péptica pelos seus efeitos adversos, pode aumentar a incidência de ocorrência de úlceras e o risco de complicações como hemorragia e perfuração do órgão em questão (Lau et al., 2011; Barkun e Leontiadis, 2010). Apesar da multifatoriedade na fisiopatologia das úlceras, dados revelam que a infecção pela bactéria Helicobacter pylori juntamente com o uso excessivo e prolongado de DAINEs representam quase a totalidade dos casos. Nestes estudos foi demonstrado que no processo lesivo ocorre o aumento da produção e acúmulo de espécies reativas, bem como dos produtos de sua atuação como lipoperóxidos (Malfertheiner et al., 2009; Naito e Yoshikawa, 2006). O estresse oxidativo se dá pela ativação de células inflamatórias, principalmente neutrófilos, que acontece em resposta a presença da bactéria H. pylori (Figura 7) ou a inibição das enzimas cicloxigenases (COX), principalmente COX-1, e subsequente redução de prostaglandinas, além de alterações no fluxo e na permeabilidade vascular e comprometimento do balanço de substâncias importantes na proteção da mucosa gástrica (Malfertheiner et al., 2009; Wallace, 2008; Utsumi et al., 2006).

Figura 7: Imagem ilustrativa da ativação de células e produção de espécies reativas na lesão causada pelo H.pylori (Montecucco e Rappuoli, 2001).

“O desencadeamento de lesões geralmente está relacionado a uma associação de fatores complexos devido à característica multifatorial das doenças. Os desafios futuros para a ciência incluem a compreensão mais detalhada das fisiopatologias de modo que se possibilitem intervenções terapêuticas cada vez mais eficazes.” (Firuzzi et al., 2011; Calvino-Fernández e Parra-Cid, 2010).

Muitos são os estudos que envolvem plantas com potencial atuação sobre o estresse oxidativo participante de patologias do trato gastrointestinal. De acordo com Calixto et al. (2004), plantas e seus derivados apresentam uma variedade de ações terapêuticas e representam uma promissora área para busca de novas alternativas. Schmeda-Hirschmann e Yesilada (2005) consideram os produtos naturais fontes importantes de novas moléculas farmacologicamente ativas no tratamento e prevenção de doenças do trato gastrointestinal. É neste contexto que Qualea parviflora é o objeto deste estudo.

Figura 8: Imagem ilustrativa de Qualea parviflora. Árvore, folhas e flores, fruto, semente, casca e madeira (Lorenzi, 2000).

Qualea parviflora é uma espécie pertencente à família Vochysiaceae conhecida como pau-terra-de-flor-miudinha, pau-terra-mirim ou pau-terrinha (Figura 8), comum em diferentes fisionomias do cerrado brasileiro. Apresentam-se como árvores altas (30 m), cuja coloração interna do tronco é rosada ou avermelhada. Florescem durante os meses de novembro a janeiro e frutificam entre agosto e setembro. Apresentam folhas simples, opostas, rígidas e tomentosas na face abaxial (Lorenzi, 2000). Na medicina popular, espécies de Qualea são utilizadas na forma de infusão das folhas ou decocto das cascas. Q. parviflora é utilizada contra males do trato gastrointestinal como gastrite, úlcera gástrica, diarréia com sangue e cólicas intestinais, além de anti-séptico externo (Lorenzi, 2000; Silva et al., 2000). Estudos fitoquímicos demonstraram que o extrato metanólico das cascas desta espécie contém diversos compostos derivados do ácido elágico que apresentam menor citotoxicidade que o seu padrão comercial (Nasser et al., 2008). O ácido elágico (Figura 9) é definido por Quideau et al. (2011) como um composto fenólico objeto de intensas investigações em decorrência de suas notáveis atividades biológicas, que envolve além de uma potente ação antioxidante, uma importante ação modulatória de diversas funções celulares como crescimento, proliferação, apoptose e respostas imunes.

Figura 9: Estrutura molecular do ácido elágico

O ácido elágico é derivado dos taninos hidrolisáveis chamados elagitaninos. Muitos estudos comprovam suas ações benéficas tanto na DII (Rosillo et al., 2012; Singh et al., 2009, Romier et al., 2008) como na úlcera péptica (Chatterjee et al., 2011; Beserra et al., 2011; Rao et al., 2006). A efetividade do ácido elágico na prevenção da instalação dos processos lesivos e na redução dos sinais e sintomas destas patologias reforça o papel chave das espécies reativas nas mesmas.

OBJETIVOS

GERAL Estudar o efeito do extrato metanólico de Qualea parviflora (QP) sobre alterações do trato gastrointestinal de roedores.

ESPECÍFICOS - Avaliar o efeito protetor de QP sobre a doença inflamatória intestinal induzida experimentalmente em ratos; - Caracterizar o mecanismo de ação de QP sobre a inflamação intestinal; - Avaliar o efeito de QP sobre a diarréia induzida experimentalmente em camundongos; - Caracterizar o mecanismo de ação de QP sobre a diarréia; - Avaliar o efeito protetor de QP sobre as úlceras gástricas induzidas experimentalmente em ratos e camundongos; - Caracterizar o mecanismo de ação de QP sobre as úlceras gástricas.

CAPÍTULO 1

Journal of Ethnopharmacology - Research article

Antidiarrheal and intestinal anti-inﬂammatory activities of a methanolic extract

of Qualea parviflora Mart. in experimental models

Lucilene Patrícia Mazzolina; Estela Oliveira da Maiaa; Liolana Thaisa Luchesi Fernandesa;

Lucia Regina Machado da Rochaa; Wagner Vilegasb; Luiz Claudio Di Stasic*; Clélia Akiko

Hiruma-Limaa*

a Univ. Estadual Paulista-UNESP - Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, CEP 18618-970, Botucatu, SP, Brasil. b Univ. Estadual Paulista-UNESP - Departamento de Farmacologia, Instituto de Biociências,

CEP 18618-000, Botucatu, SP, Brasil.

c Univ. Estadual Paulista-UNESP - Campus Experimental do Litoral Paulista, CEP 11330- 900, São Vicente, SP, Brasil.

* Corresponding author:

C.A. Hiruma-Lima and L.C. Di Stasi contributed equally to the supervision of this study. Tel.:

00+5501438116077; fax: 00+551438153744; e-mail: (C.A. Hiruma-Lima – [email protected]; L.C.Di Stasi – [email protected]) ABSTRACT

Ethnopharmacological relevance: An ethnopharmacological survey indicated that the bark from

Qualea parviflora Mart. (Vochysiaceae), a medicinal species commonly found in the Brazilian

Cerrado, could be used to treat gastrointestinal disorders such as diarrhea and intestinal inflammation.

Aim of study: The objective of this study was to evaluate the effects of a methanolic extract of the bark of Qualea parviflora (QP) in an experimental model of diarrhea and intestinal inflammation induced in rodents. Material and Methods: The antidiarrheal effect of QP was investigated by measuring intestinal motility, diarrhea, and intestinal fluid accumulation in rodent after challenge with a cathartic agent (castor oil). Acute intestinal inflammation was induced by administration of trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) to rodents. QP was administered orally (for 4 days) prior to the induction of inflammation. The colonic injury and extent of inﬂammation were assessed by macroscopic damage scores and lesion length. The enhanced colonic mucosal injury, inﬂammatory response, and antioxidant system were evaluated by measuring of malondialdehyde levels (MDA), myeloperoxidase (MPO) activity, and glutathione (GSH) content. Tissue levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1β (IL1-β) were determined by enzyme immunoassay methods.

Results: Oral treatment with QP (500 mg/kg) delayed the onset of diarrhea, reduced the amount of liquid stool, and decreased the severity of the diarrhea and evacuation index in rodents challenged with castor oil (p<0.01). Oral treatment (25 and 50 mg/kg/day) with QP significantly reduced the intestinal inflammation induced by TNBS in rodents (52 and 45%, respectively). Improvement of colonic mucosal injury by treatment with QP was demonstrated by a decrease in MDA levels and maintenance in GSH content in colonic tissue. QP also prevented intestinal inflammation, as evidenced by reduced cytokine levels (TNF-α and IL1-β) and low MPO activity. Conclusions: The ethnopharmacological usefulness of barks from Q. parviflora against diarrhea containing blood and mucus was supported by the observed antidiarrheal and intestinal anti-inflammatory properties of an extract of this medicinal plant.

Keywords: Qualea parviflora, Vochysiaceae, diarrhea, intestinal inflammation.

1. Introduction

Qualea parviflora Mart. (Vochysiaceae) is a common tree found in different habitats in the Brazilian Cerrado. This medicinal plant is used in traditional medicine as an infusion of the bark to treat diarrhea containing blood and mucus (Silva et al., 2000). This species is also used as an antiulcerogenic, antidiarrheal, anti-inflammatory, antiseptic, and astringent treatment by local communities in regions in which this plant naturally thrives (Rodrigues and

Carvalho, 2001). The ethnopharmacological properties of Q. parviflora have been evaluated in pre-clinical studies, which have demonstrated the beneficial effects of this plant for some gastrointestinal diseases. An integrative study demonstrated that the methanolic extract of the bark of Q. parviflora is an effective antiulcerogenic and antimicrobial treatment that has no detectable acute toxic effects (Mazzolin et al., 2010). The gastroprotective effect of Q. parviflora is directly related to the maintenance of sulfhydryl compound (SH) and glutathione

(GSH) levels in the gastric mucosa, rather than the prevention of the damaging effects induced by either ethanol or indomethacin. The antioxidant effect of Q. parviflora through the action of the natural antioxidants SH and GSH was also demonstrated by an in vitro lipid peroxidation assay, which showed that the IC50 values for the Q. parviflora extract were as low as those for quercetin (Mazzolin et al., 2010). Based on these results, complementary studies are needed to determine if the beneficial effects of this antioxidant plant species are applicable to the treatment of other gastrointestinal disorders, such as diarrhea and intestinal inflammation, in which oxidative stress is an important etiological factor.

Antioxidants have the ability to counteract the harmful effects of oxidative agents and could thus either treat or prevent oxidative stress-related diseases. Several studies have shown the benefits of using natural antioxidant compounds to treat gastric ulcers and diarrhea

(Chatterjee et al., 2011; Luis-Ferreira et al., 2012; Rodrigues et al., 2012; Santos et al., 2012) and to prevent and/or treat inflammatory bowel disease (IBD) (Algieri et al., 2013; Faria et al., 2012; Hartmann et al., 2012; Récio et al., 2012; Witaicenis et al., 2012).

Diarrhea is defined as a decrease in stool consistency and an increase in volume or frequency of defecation for days or weeks. This ailment may be divided into several categories; however, not all types of diarrhea are easily categorized because some categories overlap. Although relatively common in the population, patients presenting with diarrhea can become a diagnostic challenge (Juckett and Trivedi, 2011). Diarrhea is a prevalent symptom of IBD and affects most patients diagnosed with IBD. Diarrhea may represent the first perceived manifestation of the intestinal inflammation that causes these patients to seek medical attention, and this symptom persists throughout the course of the disease (Wenzl,

2012). These episodes may result in bloody inflammatory diarrhea, abdominal pain, nausea, loss of appetite, rectal bleeding, perianal fistulae, weight loss, fever, and anemia (Juckett and

Trivedi, 2011).

IBD comprises two main types of chronic disorders—ulcerative colitis and Crohn’s disease—and is categorized as a gastrointestinal disease with unclear etiology. IBD is thought to involve several pathological factors such as immunological abnormalities, oxidative stress, gut microflora, an abnormal epithelial barrier, and inflammatory factors (Baumgart and

Carding, 2007). However, some authors claim that oxidative stress may be one of the most important components in the pathophysiology of IBD. Reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO), both of which are generated as a consequence of the stimulation of immune cells, play an important role in IBD by regulating intestinal inflammation and increasing the susceptibility to injury in the absence of normal oxidative defense mechanisms (Dryden et al.,

2005). It has been proposed that the anti-inflammatory effects of corticoids and aminosalicylates are partially due to their ability to ameliorate oxidative stress (Cronstein et al., 1992; Miyachi et al., 1987). Salicylazosulfapyridine (SASP), 5-aminosalicylic acid (5- ASA), glucocorticoid, anti-TNF-monoclonal antibodies, and immunosuppressants have been used to treat IBD for many years. However, these drugs produce several side effects, including allergies, liver damage, and kidney damage (Baumgart and Sandborn, 2007). Most conventional treatments for the management of IBD have serious adverse effects that reduce patient compliance, which has led researchers to study complementary and alternative medicines that can promote remission of disease activity with improved safety and tolerability. A variety of plants that have been historically used in traditional medicine for the management of IBD have been investigated, and different mechanisms have been proposed to underlie the effectiveness of medicinal plants in the treatment of colitis, including anti- inflammatory, antimicrobial, antioxidant, antiulcer, wound healing, and anti-diarrheal properties (Rahimi et al., 2009; Récio et al., 2012). Although Qualea parviflora has been used to treat diarrhea with blood and mucus (one of the most apparent symptoms of IBD), no reports have described the potential effects of this plant against this disease. In the present study, we investigated the effects of a methanolic extract of the bark of Qualea parviflora using different experimental models of diarrhea and a model of intestinal inflammation induced by trinitrobenzenesulphonic acid (TNBS) in rats.

2. Materials and Methods

2.1. Preparation of the methanolic extract

Qualea parviflora bark was collected by Dr. Hiruma-Lima from the Ypê Garden

(Cerrado region) in Porto Nacional (Tocantins State - TO), Brazil. A voucher specimen was identified by Dr. S.F. Lolis from UNITINS in Porto Nacional and deposited under no. 9226 at the UNITINS Herbarium. The air-dried powdered bark (500 g) was successively extracted three times with methanol (48 h, 4 L) at room temperature. The solvent was evaporated at 60

°C under reduced pressure to yield 10.7 g (2.14% yield) of the Qualea parviflora methanolic extract (QP). Phytochemical profiles indicate that this extract contains several ellagic acid derivatives, triterpenes, and saponins (Nasser et al., 2006, 2008).

2.2. Animals

Male Swiss mice (40 – 50 g) and Wistar rats (150 – 250 g) were used for the antidiarrheal and anti-inflammatory experiments, respectively. The animals were obtained from the Central Animal House (UNESP) in Botucatu, S.P., and housed in the Physiology

Department under a controlled temperature (23 2 °C) and a 12 h light/dark cycle. They were provided a certified Labina (Purina, Brazil) diet and tap water ad libitum. Before each experiment, the animals were deprived of food for either 6 or 16 h, as described in each experimental model. Standard drugs and the QP extract were administered orally using a saline solution (SAL) (10 mL/kg) as the vehicle. The protocols used were approved by the

UNESP Institutional Animal Care and Use Committee and followed the recommendations of the Canadian Council on Animal Care (Olfert et al., 1993) (Protocol 42/04 – CEEA).

2.3. Antidiarrheal activity

2.3.1. Castor oil-induced diarrhea: Groups of male mice (n = 7-8) were fasted 16 h prior to receiving an oral dose of vehicle (SAL, 10 mL/kg), QP (12.5, 25, 50, 125, 250, and

500 mg/kg), or loperamide (10 mg/kg) 30 min before oral administration of castor oil (0.2 mL/animal) (Awounters et al., 1978). Immediately after castor oil administration, each animal was placed in an individual cage lined with blotting paper and observed for 4 h. The following parameters were observed: onset of diarrhea, number of solid, semi-solid, and liquid feces, and total frequency of fecal outputs. A numerical score based on stool consistency was assigned: 1 (solid stool), 2 (semi-solid stool), and 3 (liquid stool). Each group received an evacuation index (EI) expressed according to the following formula: EI = 1×(n° stool 1) +

2×(n° stool 2) + 3×(n° stool 3) (Mukherjee et al., 1998). 2.3.2. Castor oil-induced intestinal fluid accumulation: The enteropooling assay, as described by Robert et al. (1976), was used to measure fluid accumulation, with modifications. After fasting for 6 h, male mice were assigned to three groups (n = 8) and treated orally with SAL (10 mL/kg), QP (500 mg/kg), or morphine (2.5 mg/kg, s.c.). After 1 h, the animals received castor oil (0.2 mL/animal/p.o.) and were euthanized 30 min later to collect and weigh the small intestines, which were ligated between the pyloric and ileocecal junctions. The contents of the intestine were then expelled onto a plate and weighed. The intestines were reweighed, and the difference between the full and empty intestines was calculated.

2.3.3. Castor oil-induced and normal intestinal motility: The effect of QP on castor oil-induced and normal intestinal motility in mice was tested using the charcoal method described by Stickney and Northup (1959), with modifications. For castor oil-induced motility, mice were fasted for 6 h and randomly assigned to three groups (n =7-8) that orally received SAL (10 mL/kg), QP (500 mg/kg), or morphine (2.5 mg/kg, s.c.). After 30 min, castor oil (0.2 mL/animal/p.o.) was administered to each mouse; after an additional 30 min,

10% activated charcoal (10 mL/kg, p.o.) was given. All animals were euthanized after 30 min, and the small intestine was rapidly dissected out. The distance traversed by the charcoal from the pylorus to the ileocecal junction was measured. To evaluate normal motility, mice were assigned to three groups (n = 7-8) and treated with SAL (10 mL/kg, p.o.), morphine (2.5 mg/kg, s.c.), or QP (500 mg/kg, p.o.). After 30 min, 10% activated charcoal (10 mL/kg, p.o.) was administered to each mouse. After an additional 30 min, the animals were euthanized and processed in the same manner described above.

2.4. Anti-inflammatory activity

2.4.1. Induction of acute intestinal inflammation: Rats were orally dosed with 12.5,

25, 50, 125, 250, and 500 mg/kg of QP (treated groups); 0.5 mg/kg dexamethasone (reference group); or 10 mL/kg saline (TNBS-control group) at 96, 72, 48, 24, and 2 h prior to induction of intestinal inflammation using the method originally described by Morris et al. (1989).

Animals were fasted overnight and then anesthetized with CO2. Under anesthesia, the rats were given 10 mg of 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) dissolved in 0.25 mL 50% ethanol (v/v) by means of a Teflon cannula inserted 8 cm into the anus. Rats in the non-colitic group received only 0.25 mL saline. Animal body weight, total food intake, and the occurrence of diarrhea were recorded daily for each group. All animals (n = 6-7 per group) were sacrificed 48 h after induction of the inflammatory processes by an overdose of CO2.

The colonic segments were obtained via laparotomy, placed on an ice-cold plate, cleaned of fat and mesentery, blotted on filter paper, weighed, and measured for length under a constant load. The segments were opened longitudinally and scored for macroscopic damage on a 0 -

10 scale according to the criteria described by Wallace and Keenan (1990), which takes into consideration the area of involvement and the presence of ulcers. After the initial evaluation, the tissue was scanned for further analysis of lesions by the image analyzer AVSoft BioView®

Campinas, Brazil and subsequently divided longitudinally into multiple sections to be used to determine the concentration/activity of malondialdehyde (MDA), reduced glutathione (GSH), myeloperoxidase (MPO), tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1-beta (IL-1β).

2.4.2. Biochemical determinations: All biochemical measurements were performed in duplicate. MDA was measured according to the method described by Ohkawa et al. (1979), and GSH was measured with the recycling assay described by Anderson (1985). For both parameters, the results were expressed as nanomoles per gram (nmol/g) of wet tissue. MPO activity was measured according to the technique described by Krawisz et al. (1984), and the results were expressed as MPO milliunits per gram (mU/g) of wet tissue. One unit of MPO activity was defined as the amount necessary to degrade hydrogen peroxide at 1 mmol/min at

25 °C. The cytokines (TNF-α and IL-1β) were quantified with enzyme immunoassay kits (R&D Systems) for rats according to the manufacturer's instructions. The results were expressed as picograms per gram (pg/g) of wet tissue.

2.5. Statistical analysis

The results are expressed as the mean ± standard error of the mean (S.E.M.), and differences between groups were determined by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnett’s test. Nonparametric data (score) are expressed as the median (range) and were analyzed with the Kruskal–Wallis test followed by Dunn’s test. Differences were considered to be statistically significant at p < 0.05.

3. Results and discussion

Many plant-derived constituents exhibit therapeutic actions, thus representing a promising area of research that has driven the development of efficacious and safe drugs for the management of several pathological processes (Calixto et al., 2004). Of particular interest are new therapies that target oxidative stress in diseases such as IBD, diarrhea, and other gastrointestinal tract complications. Oxidative stress has been postulated to play a role in the initiation and progression of several diseases, and antioxidant therapies markedly attenuate these diseases (Dryden et al., 2005). A preliminary study by Mazzolin et al. (2010) recognized the antidiarrheal effects of a single dose of QP and demonstrated that this extract was able to significantly reduce castor oil-induced diarrhea in rats. Our study evaluated the effect of the extract at different doses (12.5, 25, 50, 125, 250, and 500 mg/kg) in the castor oil-induced diarrhea model to evaluate the dose-response curve and determine the most effective dose of

QP against diarrhea. All of the mice in the control group (SAL) produced large amounts of diarrhea after castor oil administration (Table 1).

Table 1: Effects of the methanol extract of Qualea parviflora (QP) on castor oil-induced diarrhea in mice.

Number of stools

Group Dose Onset of diarrhea Solid Mild Wet Evacuation

(mg/kg) (min) Index (IE)

Control - 66.57 ± 5.82 0.29 ± 0.18 1.14 ± 0.60 20.14 ± 1.08 21.29 ± 0.64

Reference 10 240.00 ± 0.00** 0 0 0** 0**

QP 12.5 88.50 ± 8.51 0.66 ± 0.21 3.67 ± 0.52 17.50 ± 1.20 20.17 ± 1.19

25 101.33 ± 15.11 0.58 ± 0.27 2.76 ± 0.43 19.10 ± 2.14 22.31 ± 2.04

50 111.67 ± 16.75 0.61 ± 0.29 2.33 ± 0.61 16.80 ± 1.69 19.93 ± 1.72

125 118.25 ± 22.66 0.63 ± 0.32 1.75 ± 0.70 17.25 ± 2.52 19.63 ± 2.20

250 136.63 ± 14.95* 0.38 ± 0.26 3.50 ± 0.78 13.50 ± 1.50* 17.38 ± 1.36

500 141.17 ± 20.91** 0.57 ± 0.43 3.43 ± 0.95 8.14 ± 2.04** 12.14 ± 1.52**

The data are expressed as the mean ± S.E.M. ANOVA was performed, followed by Dunnett’s test. * p < 0.05 and ** p < 0.01 vs. control group.

The oral administration of the QP extract at lower doses (12.5, 25, 50, and 125 mg/kg) did not affect any of the parameters evaluated (p > 0.05). However, oral treatment with QP at doses of 250 and 500 mg/kg induced a delayed onset of diarrhea (2-fold longer) and reduced the amount of liquid stool (60 and 33%, respectively) compared to the control group.

However, the decrease in the severity of the diarrhea induced by castor oil and the measured evacuation index were only observed in the group treated with QP at 500 mg/kg, which showed inhibition of evacuation index of 45% (p < 0.01).

Castor oil is an effective laxative that decreases fluid absorption, increases electrolyte secretion, and produces alterations in intestinal motility (Mascolo et al., 1994). According to

Izzo et al. (1998), the induction of these effects by castor oil is dependent on nitric oxide and oxidative stress. A dose of 500 mg/kg QP (the most effective dose of QP with respect to all parameters in the castor oil-induced diarrhea model) was used for the remainder of the experiments to further evaluate the antidiarrheal activity of QP. Our results demonstrated that oral administration of castor oil resulted in increased intestinal fluid, which reached 1.47 ±

0.09 g in the control group (SAL), whereas the amount of intestinal fluid produced was significantly lower in the group treated with 500 mg/kg QP (1.26 ± 0.06 g, p < 0.05). In the intestinal motility evaluation (Table 2), this same dose of QP affected normal intestinal motility as well as the motility induced by castor oil. QP significantly reduced the intestinal motility induced by castor oil by decreasing peristalsis by 51% compared to the SAL-treated group (p < 0.01). The reduction in the distance traveled by charcoal in the QP-treated group

(51% of the distance of the SAL-treated group) suggests that QP also decreases intestinal motility in the absence of a cathartic agent (Table 2). These results demonstrate that QP exerts its antidiarrheal action by reducing the amount of intestinal fluid and intestinal motility, regardless of the presence of a cathartic agent.

Table 2: Effects of the methanol extract of Qualea parviflora (QP) on castor oil-induced and normal intestinal motility in mice. Total Charcoal

Model Treatment Dose length 10% Peristaltism

(p.o.) (mg/kg) (cm) (cm) (%)

Normal Control 65.4 ± 1.7 34.3 ± 2.0 53

Reference 2.5 63.4 ± 2.0 8.2 ± 1.0** 13

QP 500 64.1 ± 1.8 16.5 ± 3.2** 26

Castor oil Control 63.9 ± 1.5 42.6 ± 2.1 67

Reference 2.5 65.1 ± 2.2 11.2 ± 1.7** 17

QP 500 64.3 ± 1.8 21.5 ± 3.2** 33

The data are expressed as the mean ± S.E.M. ANOVA was performed, followed by Dunnett’s test. ** p < 0.01 vs. control group.

The antidiarrheal activity of QP, in conjunction with the ethnopharmacological data, led to the evaluation of this extract in the experimental model of rat colitis induced by TNBS.

This pre-clinical model is a well-established model of intestinal inﬂammation whose biochemical features resembling those of the human form of this disease (Brenna et al., 2013).

TNBS administration results in long-lasting ulceration and inflammation of the rat colon characterized by epithelial barrier thickening, neutrophil infiltration, and granuloma formation

(Morris et al., 1989). This experimental model promotes increased lipid peroxidation, which can be reduced by antioxidant compounds (Loguercio et al., 2003). Brenna et al. (2013) suggested that this is an appropriate IBD model for the study of specific biological processes.

We demonstrated that after intracolonic TNBS administration, all animals exhibited prostration, piloerection, and hypomotility. The response to the acute inflammation induced by TNBS, including diarrhea, decreased food intake, and decreased body weight, was not reversed during the experimental period (6 days). After 48 h of TNBS administration, a macroscopic inspection of the colon revealed a high damage score and lesion length in the control group (TNBS-control group). We also observed that the highest doses of QP (250 and

500 mg/kg) had no effect on intestinal inflammation (data not shown), despite their observed antidiarrheal effects. However, we observed a significant reduction in this parameter in the colon (2 points in score; 47 and 34%, respectively, in lesion length) in the groups treated with

QP doses of 25 and 50 mg/kg, which are 10 times lower than the QP doses needed to prevent acute diarrhea. The incidence of diarrhea induced by TNBS was also decreased after treatment with QP doses of 250 and 500 mg/kg, as evidenced by the absence of liquid stool in the cage and anal region of the animals (data not shown), but not at doses of 12.5, 25, and 50 mg/kg (Table 3). Dexamethasone (reference group) was also unable to reduce the diarrhea induced by TNBS (Table 3). Colon macroscopic lesions (area) were quantified with an image analyzer (Figure 1), and we observed a significant reduction in the damage in the groups treated with 25 and 50 mg/kg QP (reduction of 52% and 45%, respectively). The inflammatory changes in the intestinal tract were also associated with a significant increase in the weight/length of the colon in the groups that received TNBS, indicating the presence of inflammation. Neither dose of QP significantly reduced inflammation induced by TNBS

(Table 3). Among the doses tested, only 25 and 50 mg/kg QP were able to significantly reduce the damage score and the lesion area. However, treatment with QP at 25 mg/kg was most effective in preventing the damage process compared to the reference group, which did not exhibit a decrease in the damage score induced by TNBS (Table 3).

Figure 1. Effect of the methanol extract of Qualea parviflora on colonic inflammatory damage induced by trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS). Representative macroscopic images of the mucosa in the non-colitic group (A), TNBS-control group (B), reference group (C), group treated with 25 mg/kg QP (D), and group treated with 50 mg/kg QP (E).

Several studies of polyphenolic compounds have also reported dose-independent effects in the TNBS model, which is likely to manifest antioxidant effects at lower doses and pro-oxidant effects at higher doses (Crespo et al., 1999; Di Stasi et al., 2004; Sánchez de

Medina et al., 1996).

Table 3: Effects of the methanol extract of Qualea parviflora (QP-treated groups) on the colonic macroscopic damage score, lesion area, weight/length, and occurrence of diarrhea after trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)-induced intestinal inflammation. Group Dose Lesion area Lesion Damage Colon Diarrhea

(mg/kg) (mm2) length score weight/length (%)

(cm) (0-10) (mg/cm)

Control - 610.84 ± 47.35 4.39 ± 0.20 8 (7 – 8) 164.06 ± 3.69 100

Reference 0.5 425.47 ± 76.03** 3.52 ± 0.40 7 (6 – 7) 158.78 ± 5.14 100

QP 12.5 587.30 ± 81.76 3.77 ± 0.42 7 (5 – 8) 166.50 ± 8,18 86

25 293.81 ± 57.64** 2.35 ± 0.20** 6 (2 – 7)** 163.26 ± 9.84 86

50 337.27 ± 47.39* 2.90 ± 0.26** 6 (5 – 7)* 171.02 ± 8.95 86

Non-colitic - 0 0 0 123.61 ± 4.98** 0

The data are expressed as the mean ± S.E.M. with the exception of the damage score, which is expressed as the median. ANOVA was performed followed by Dunnett’s test for all parameters except the damage score, for which the Kruskal-Wallis test followed by Dunn’s test was used. * p < 0.05 and ** p < 0.01 vs. the TNBS-control group.

Oxidative stress occurs when there is an imbalance between the generation of oxidative species and inadequate antioxidant defense systems, which can cause cell damage either directly or by altering signaling pathways. It has been hypothesized that oxidative stress plays a role in the initiation and progression of IBD (Chiurchiù and Maccarrone, 2011;

Dryden et al., 2005). The TNBS-induced inflammatory process was accompanied by alterations in biochemical parameters such as MDA and GSH content, MPO activity, and cytokine (TNF-α and IL-1β) levels in the colon. MDA is a byproduct of lipid peroxidation and is widely used as a marker of oxidative stress. An increase in MDA levels in the colon was observed in the control group after TNBS administration. However, this parameter was significantly decreased in the animals treated with QP at doses of 25 and 50 mg/kg as well as those treated with dexamethasone (Table 4). These results are in agreement with those of other studies demonstrating that plant-derived molecules can reduce TNBS-induced lipid peroxidation (Liu and Wang, 2011; Wang et al., 2010, 2011).

The reduction in lesions promoted by QP was associated with the ability to maintain glutathione levels in the colonic mucosa. QP at doses of 25 and 50 mg/kg prevented colonic

GSH depletion, which occurred as a result of the colonic oxidative damage induced by TNBS, compared to the TNBS-control group (28% reduction, Table 4). The GSH levels in the QP group were similar to those in the group that did not receive any treatment (non-colitic group), confirming the ability of QP to preserve/strengthen the antioxidant system. This strengthening prevented the depletion of GSH; this effect was also observed in a gastroprotection study and was attributed to the ellagic acid-derived compounds present in the investigated extract

(Mazzolin et al., 2010). Several studies have reported that ellagic acid and ellagitannins act as potent antioxidants (Seeram et al., 2005; Singh et al., 2009).

GSH is an important biological antioxidant that was described by Winterbourn and

Brennan (1997) as a prime target for hypochlorous acid generated by myeloperoxidase, which is found primarily in neutrophil granules. Myeloperoxidase has been used as a marker of cell- specific infiltration and the severity of the inflammatory process because neutrophil accumulation in the inflamed intestinal mucosa may contribute to tissue damage and increase oxidative stress (Carlson et al., 2002; Masoodi et al., 2011). Sing et al., (2009) shown that

TNBS administration increased colonic MPO activity by nearly 200 percent compared to non- colitic animals. Dexamethasone treatment did not prevent neutrophil accumulation in the inflamed colon (Table 4), but treatment with QP at doses of 25 and 50 mg/kg significantly reduced MPO activity and local neutrophil infiltration (46% and 31%, respectively).

Table 4: Effects of the methanol extract of Qualea parviflora (QP-treated groups) on malondialdehyde (MDA) activity, glutathione (GSH) content, and myeloperoxidase (MPO) activity after trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)-induced intestinal inflammation. Group Dose MDA GSH MPO

(mg/kg) (nmol/g) (nmol/g) (mU/g)

Control - 24.83 ± 2.88 1080.95 ± 109.64 2740.13 ± 94.42

Reference 0.5 22.68 ± 2.56* 1416.40 ± 193.84* 2323.39 ± 355.96

QP 12.5 25.22 ± 2.29 1220.83 ± 151.90 2903.39 ± 256.30

25 21.82 ± 2.01* 1404.32 ± 107.30* 1478.50 ± 173.58**

50 22.19 ± 3.01* 1394.91 ± 263.12* 1899.29 ± 215.54*

Non-colitic - 16.27 ± 1.71** 1508.96 ± 206.13** 142.65 ± 24.21**

The data are expressed as the mean ± S.E.M. ANOVA was performed, followed by Dunnett’s test. * p < 0.05 and ** p < 0.01 vs. the TNBS-control group.

TNBS-induced inflammation is a complex cascade that involves the recruitment and activation of leukocytes and the release of cytokines and oxidant factors, resulting in the development of lesions (Neurath et al., 2000; Pavlick et al., 2002; Strober et al., 1998). TNF-

is involved in T-cell differentiation via a positive feedback mechanism as well as in the induction of the production and release of several cytokines, including the Th1 profile (e.g.,

IL-1β) and the Th2 profile (e.g., IL-10). Thus, TNF- is directly related to the altered permeability of the colonic mucosa, increased oxidative stress, and tissue injury (Strober and

Fuss, 2011; Strober et al., 1998; Wang and Fu, 2005). To evaluate the effect of QP treatment on some of the cellular mediators involved in the inflammatory response, the levels of selected inflammatory cytokines, including TNF-α and IL-1β, were measured. Animals with colitis induced by TNBS (TNBS-control group) exhibited a significant elevation of TNF- and IL-1β compared to the non-colitic group (Table 5), supporting the importance of these cytokines in the colitic process. These levels were significantly reduced by treatment with either 25 or 50 mg/kg QP (TNF-: 57 and 66%; IL-1β: 48 and 57%, respectively), indicating that QP also provides effective anti-inflammatory activity in the colonic environment by inhibiting the production of first-line cytokines such as TNF- and IL-1β. The animals treated with dexamethasone (reference group) only displayed a decrease in TNF- levels; IL1-β levels were unaffected.

Table 5: Effects of the methanol extract of Qualea parviflora (QP-treated groups) on the levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-) and interleukin 1-beta (IL-1) in the trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)-induced intestinal inflammation model.

Group Dose TNF- IL-1

(mg/kg) (pg/g) (pg/g)

Control - 324.75 ± 28.57 1805.03 ± 48.67

Reference 0.5 169.20 ± 16.44** 1537.86 ± 105.22

QP 12.5 247.82 ± 39.78 1626.06 ± 146.92

25 138.49 ± 8.89** 940.88 ± 128.19**

50 109.83 ± 19.63** 783.00 ± 137.19**

Non-colitic - 52.96 ± 10.69** 166.28 ± 20.82**

The data are expressed as the mean ± S.E.M. ANOVA was performed, followed by Dunnett’s test. * p < 0.05 and ** p < 0.01 vs. the TNBS-control group.

The reduction of cytokine levels (TNF- and IL-1β) observed after pre-treatment with

QP was accompanied by a reduction in neutrophil infiltration as evidenced by the inhibition of MPO activity and subsequent reduced oxidant production (MDA). The reduction in oxidative stress decreases inflammatory cell activation, thus reducing cytokine production.

Plant-derived polyphenols such as ellagic acid (which is present in the QP extract) exhibit multiple pharmacological actions, including antioxidant and anti-inflammatory activities, and have been demonstrated to be beneficial in the treatment of IBD (Ogawa et al., 2002; Romier et al., 2009; Sing et al., 2009).

4. Conclusion

These results demonstrate that, in addition to its gastroprotective effect, QP inhibits diarrhea by preventing the changes in intestinal motility/permeability induced by castor oil.

Furthermore, QP also prevented intestinal inflammation injuries by reducing the activation of inflammatory cells, as evidenced by a decrease in the levels of cytokines (TNF- and IL-1β) as well as the reduced activity of the enzyme MPO, which resulted in a decrease in oxidative stress (MDA) and the preservation of the non-enzymatic antioxidant system (GSH).

Conflict of interest

The authors declare no conﬂict of interest.

Acknowledgements

This work was supported by the Biota-FAPESP Project (Fundação de Amparo à

Pesquisa do Estado de São Paulo), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico), and CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de

Nível Superior).

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CAPÍTULO 2

CONCLUSÃO

O extrato metanólico de Qualea parviflora apresenta, em sua composição, elagitaninos como composto majoritário. Este extrato apresentou capacidade de prevenir a inflamação intestinal induzida pelo TNBS através de redução da ativação de neutrófilos e diminuição do estresse oxidativo causado pela liberação de enzimas como a MPO e de citocinas inflamatórias como o TNF-, além de manter os níveis de GSH, importante composto antioxidante não enzimático. Também foi capaz de prevenir a diarréia induzida pelo óleo de rícino através de redução da motilidade e do fluído acumulado no lúmen intestinal. A manutenção dos níveis de GSH também foi evidenciada no efeito gastroprotetor deste extrato frente a diferentes agentes lesivos. Nesta ação gastroprotetora também pode se observar a manutenção dos compostos sulfidrílicos e o aumento de prostaglandina, fatores importantes na integridade da barreira mucosa. Assim, conclui-se que a espécie estudada apresenta potente ação antioxidante, importante na prevenção de diversos processos lesivos que envolvem o estresse oxidativo na sua fisiopatologia como a inflamação intestinal, a diarréia e as úlceras pépticas.

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