Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro De Biociências Programa De Pós-Graduação Em Ciências Biológicas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Jarmilla Bow-ltaif Garcia

Investigação do papel dos receptores 5-HT3 da substância cinzenta periaquedutal dorsal na modulação dos comportamentos relativos à ansiedade no labirinto em cruz elevado e no campo aberto em ratos

Natal Junho/2015 Jarmilla Bow-ltaif Garcia

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte-UFRN, como pré-requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientadora: Profa. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti.

Natal Junho/2015

Jarmilla Bow-Ltaif Garcia

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte-UFRN, como pré-requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.

Dissertação aprovada em: 25/06/15

Banca examinadora:

Profa. Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti - Orientadora Departamento de Biofísica e Farmacologia - UFRN

Profa. Dra. Elaine Cristina Gavioli Departamento de Biofísica e Farmacologia – UFRN

Prof. Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti Departamento de Ciências Biomédicas - UERN

AGRADECIMENTOS

Agradeço:

A Deus pelo dom da vida, por me iluminar nos momentos difíceis, pela força e determinação para a realização desse trabalho.

Aos meus pais pelo amor e afeto incondicionais, por me acompanharem e me darem apoio em todos os momentos importantes da minha vida, por me ensinarem que devemos fazer tudo com alegria e entusiasmo e que devemos ter perseverança frente aos desafios, por oferecerem suporte educacional, que além de outras coisas, foi importante para a execução desse trabalho.

Ao meu irmão Khalil pelos momentos de alegria e companheirismo, apesar da distância física que estamos.

Ao meu namorado Ícaro pelo seu amor, carinho, companheirismo, paciência e tranquilidade nos meus ―momentos de estresse‖, por me apoiar e incentivar durante toda essa jornada, e fora dela. Somos parceiros para toda a vida, te amo!

Aos meus amigos do Farmacolab: a Raliny, ao Aldo, a Rebecca (a menina mais chique do CB!), a Marana (Ops! Manara) e a Bárbara, pelo apoio em diversas atividades do laboratório, pela convivência sempre afetuosa de vocês, pelas conversas bastante animadas e enriquecedoras sobre temas científicos, pelos momentos de descontração também, enfim a minha experiência no laboratório não teria sido a mesma sem vocês!

Aos amigos com que a vida me presenteou: a Marília Oliveira, a Raíza Guerra, a Sarah Sakamoto, a Juliana Oliveira, a Luênia Tavares e a Daniele Almeida que sempre me apoiaram e torceram pelo meu sucesso.

À professora Dra. Vanessa de Paula Soares Rachetti por todo o suporte durante o mestrado, pelos ensinamentos que muitas vezes extrapolaram os assuntos de trabalho, pela paciência, por me ajudar a desenvolver um pensamento crítico acerca dos assuntos científicos, o que me fez ser uma pessoa ainda mais empolgada com a psicofarmacologia, além de ser uma incentivadora e entusiasta da vida! Jamais vou esquecer esses momentos de aprendizado e alegria! Muito obrigada por tudo!

Ao Dr. Bruno Lobão Soares e à Dra. Alianda Maíra Cornélio da Silva pela disponibilidade e importantes considerações.

À Dra. Elaine Cristina Gavioli e ao Dr. José Rodolfo Lopes de Paiva Cavalcanti por aceitarem o convite para participar da banca de defesa e pelas sugestões que irão contribuir com o desenvolvimento desse trabalho. . Aos técnicos do Laboratório de Farmacologia Experimental, à Carla, ao César e ao Flávio, que, em diversas vezes, me deram apoio durante as atividades realizadas no laboratório.

Ao LEME (Laboratório de Estudos da Memória) pela disponibilização do criostato para o preparo das lâminas histológicas.

Aos ratinhos que foram importantes para a realização desse trabalho.

A Capes pelo auxílio financeiro.

A todos que de alguma forma contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.

Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos (Isaac Newton) RESUMO

A ansiedade é um estado emocional caracterizado por alterações fisiológicas e psicológicas que oferecem uma sensação desagradável ao indivíduo. No entanto, esse comportamento tem grande valor adaptativo, uma vez que alerta o indivíduo sobre os possíveis perigos que determinada situação possa oferecer. Já foram identificadas várias regiões encefálicas relacionadas ao substrato neural da ansiedade e dentre elas pode-se citar a substância cinzenta periaquedutal (SCP). Além disso, diversos estudos demonstraram o envolvimento do sistema serotonérgico da porção dorsal da SCP (SCPD) na modulação de comportamentos relativos à ansiedade. Tendo em vista isso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o papel dos receptores 5-HT3 da SCPD na modulação de comportamentos relacionados à ansiedade e locomoção em ratos testados no labirinto em cruz elevado (LCE) e no campo aberto (CA). Ratos Wistar receberam a microinjeção do antagonista do receptor 5-HT3 dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) (experimento

1), do agonista do receptor 5-HT3 m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG) (2,5 µg, 5 µg e 10 µg) (experimento 2) ou de salina na SCPD. Após as administrações os ratos foram colocados no LCE e seus comportamentos foram avaliados durante 5 minutos. Vinte e quatro horas depois, os animais receberam as mesmas doses com que foram microinjetados no dia anterior na SCPD e seus comportamentos foram avaliados no CA durante 15 minutos. No experimento 1, a microinjeção do dolasetron não alterou os parâmetros de ansiedade e locomoção no LCE e CA. Já no experimento 2, o mCPBG nas doses de 5 µg e de 10 µg produziu efeito ansiolítico no LCE sem promover alteração locomotora no animal. Esses resultados sugerem que a ativação dos receptores 5-HT3 da SCPD favorece um efeito ansiolítico em ratos avaliados no LCE.

Palavras-chave: Ansiedade. Substância cinzenta periaquedutal dorsal. Serotonina.

Receptor 5-HT3. Dolasetron. m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG). Labirinto em cruz elevado. Campo aberto.

ABSTRACT

Anxiety is an emotional state characterized by physiological and psychological changes that provide an unpleasant feeling to the individual. However this behavior has great adaptive value, since it alerts the individual about possible dangers that particular situation can offer. It has been identified various brain regions related to neural substrate of anxiety and, among them, it is the periaqueductal gray matter (PAG). Several studies have demonstrated the involvement of serotonergic system of the dorsal portion of PAG (DPAG) in the modulation of behaviors related to anxiety.

In view of this, the objective of this study was to evaluate the role of 5-HT3 receptors of the DPAG in the modulation of behaviors related to anxiety and locomotion in rats tested in the elevated plus maze (EPM) and open field (OF). Wistar rats received microinjection of 5-HT3 receptor antagonist dolasetron (100ng, 500ng and 1000ng)

(experiment 1), 5-HT3 receptor agonist m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG) (2,5μg, 5μg and 10mg) (Experiment 2) or saline 0.9% in the DPAG. After 10 minutes (experiment 1) or 5 minutes (Experiment 2), the rats were placed in the EPM and their performances were evaluated during 5 minutes. Twenty-four hours later the animals received the same doses that were microinjected on the previous day in the DPAG and after 10 minutes (experiment 1) or 5 minutes (experiment 2) were placed in OF and their behaviors were assessed for 15 minutes. In experiment 1 microinjection of dolasetron did not change the parameters of anxiety and locomotion in EPM and OF. In the experiment 2, the mCPBG at doses of 5μg and 10mg produced anxiolytic effect in EPM without changes in locomotor behavior. These results suggest that activation of 5-HT3 receptors in the SCPD eliciate an anxiolytic effect in rats evaluated in EPM.

Key words: Anxiety. Dorsal periaqueductal gray matter. Serotonin. 5-HT3 receptor. Dolasetron, m-Chlorophenylbiguanide (mCPBG). Elevated plus maze. Open field. LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Modelo da SCP 18

Figura 2 – Arquitetura do receptor 5-HT3 26

Figura 3 – Dolasetron 34

Figura 4 – mCPBG 34

Figura 5 – Labirinto em cruz elevado 37

Figura 6 – Campo Aberto 38

Figura 7 – Fluxograma geral das etapas metodológicas empregadas no trabalho 38

Figura 8 – Fluxograma do experimento 1 39

Figura 9 – Fluxograma do experimento 2 40

Figura 10 – Representação esquemática dos sítios de microinjeção na SCPD de ratos 42

Figura 11 – Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas e tempo nos braços abertos do LCE 43

Figura 12 – Efeito do mCPBG (10µg, 5µg e 2,5µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas e tempo nos braços abertos do LCE 46

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 44 na SCPD de ratos sobre o número de entradas e tempo nos braços abertos, número de entradas nos braços fechados e número total de entradas do LCE

Tabela 2 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 44 na SCPD de ratos sobre os índices etológicos do LCE.

Tabela 3 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 45 na SCPD de ratos sobre o índice de locomoção do CA.

Tabela 4 Efeito do dolasetron (100ng, 500ng e 1000ng) microinjetado 45 na SCPD de ratos sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no CA.

Tabela 5 Efeito do mCPBG (2,5µg, 5µg e 10µg) microinjetado na SCPD 47 de ratos sobre o número de entradas e tempo nos braços abertos (valores absolutos), número de entradas nos braços fechados e número total de entradas do LCE.

Tabela 6 Efeito do mCPBG (2,5µg, 5µg e 10µg) microinjetado na SCPD 47 de ratos sobre os índices etológicos do LCE

Tabela 7 Efeito do mCPBG (10µg, 5µg e 2,5µg) microinjetado na SCPD 48 de ratos sobre o índice de locomoção do CA.

Tabela 8 Efeito do mCPBG (10µg, 5µg e 2,5µg) microinjetado na SCPD 48 de ratos sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no CA.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BDZ Benzodiazepínico

DALY Disability-Adjusted Life Year

DEC Domínio extracelular

DMT Domínio transmembrana

DIC Domínio intracelular

DSM Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais

LCE Labirinto em cruz elevado

LTE Labirinto em T elevado

NMR Núcleo mediano da fafe

NDR Núcleo dorsal da rafe

PCPA Paraclorofenilalanina

PEC Postura de esticar o corpo protegido

RBF Retorno aos braços fechados

SCP Substância cinzenta periaquedutal

SCPD Substância cinzenta periaquedutal dorsal

TIS Teste de interação social

TP Transtorno do pânico

TAG Transtorno de ansiedade generalizada

WHO World Health Organization

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...... 13 1.1 ANSIEDADE...... 13 1.2 A SUBSTÂNCIA CINZENTA PERIAQUEDUTAL NO SUBSTRATO NEURAL DA ANSIEDADE...... 17 1.3 O SISTEMA SEROTONÉRGICO NA ANSIEDADE...... 19

1.4 O RECEPTOR 5-HT3: ESTRUTURA E FUNÇÃO...... 25

1.5 O RECEPTOR 5-HT3 NA ANSIEDADE: ESTUDOS CLÍNICOS E PRÉ-CLÍNICOS...... 27 2. OBJETIVOS...... 32 2.1 OBJETIVO GERAL...... 32 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...... 32 3. MATERIAIS E MÉTODOS...... 33 3.1 ANIMAIS...... 33 3.2 DROGAS...... 33 3.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS...... 34 3.3.1 CIRURGIA ESTEREOTÁXICA PARA O IMPLANTE DA CÂNULA GUIA...... 34 3.3.2 HABITUAÇÃO...... 35 3.3.3 MICROINJEÇÃO INTRA-SCPD...... 35 3.4 APARATOS EXPERIMENTAIS...... 36 3.4.1 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE)...... 36 3.4.2 CAMPO ABERTO...... 37 3.5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL...... 38 3.5.1 EXPERIMENTO 1...... 39 3.5.2 EXPERIMENTO 2...... 39 3.6 PERFUSÃO...... 40 3.7 HISTOLOGIA...... 40 3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA...... 41 4. RESULTADOS...... 42 4.1HISTOLOGIA...... 42

4.2 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE...... 43 4.3 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO CA ...... 44 4.4 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO MCPBG NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE...... 45 4.5 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO mCPBG NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO CA...... 47 5. DISCUSSÃO...... 49 6. CONCLUSÃO...... 59 REFERÊNCIAS...... 60

1 INTRODUÇÃO

1.1 ANSIEDADE

Não é de hoje a curiosidade e o temor dos seres humanos com relação ao universo que abrange os transtornos mentais. Era tendência dos médicos dos séculos XVI e XVII, por exemplo, inferir que entidades sobrenaturais seriam, em parte, responsáveis por alterações comportamentais visualizadas em pacientes portadores de epilepsia, cuja causa racional ainda não havia sido completamente elucidada (RIEMENSCHNEIDER, 2004).

Atualmente, centenas de transtornos mentais são classificados e catalogados, podendo ser encontrados em um guia denominado Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM), o qual ao longo dos anos se tornou ferramenta indispensável aos profissionais da saúde para o diagnóstico dessas enfermidades (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).

A fim de criar as bases para o entendimento desses transtornos, é imprescindível primeiramente compreender como funcionam os sistemas de neurotransmissão e áreas encefálicas correlacionadas, em indivíduos normais, e com isso produzir o conhecimento científico que futuramente pode contribuir para resolução dessas afecções. Tendo em vista isso, tornar-se-ia interessante ampliar os conhecimentos a respeito do substrato neural da ansiedade, já que alterações nos mecanismos neurais relativos a essa emoção poderiam ser a causa dos transtornos de ansiedade (ROTH, 1994; BELZUNG; GRIEBEL, 2001).

A ansiedade é um estado emocional caracterizado por alterações psicológicas e fisiológicas que causam uma sensação desagradável ao indivíduo. O componente psicológico caracteriza-se pela percepção negativa de determinada situação e da necessidade de desvencilhar-se da mesma, a fim de eliminar o desconforto gerado por esse estado de desprazer. Além disso, indivíduos ansiosos podem ser acometidos por pensamentos negativos, gerando preocupação e antecipação de possíveis sofrimentos. Por fim, a dificuldade de dormir também pode se configurar em estados ansiosos. É interessante observar que o conceito atual de ansiedade, em sua essência, não se desligou da sua origem grega, proveniente do radical 14

Anshein, o qual significa estrangular, sufocar e oprimir (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005; BRANDÃO, 2004).

Já com relação ao componente fisiológico, destaca-se a ativação do sistema nervoso autônomo, o qual é dividido em sistema nervoso simpático e parassimpático. A estimulação do primeiro pode promover a elevação da frequência cardíaca e da pressão arterial, sudorese, tremores ou sensação de falta de ar. Quando o segundo sistema é excitado, pode-se observar aumento da secreção gástrica e aumento da motilidade intestinal (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005).

É interessante salientar que estas alterações, tanto psicológicas quanto fisiológicas, são normais e fazem parte da vida cotidiana de qualquer indivíduo durante uma situação que gere ansiedade (DURANT; CHRISTMAS; NUTT, 2010). Mas, apesar de a ansiedade ser responsável por essas sensações incômodas, ela possui grande valor adaptativo para o ser humano, uma vez que alerta o indivíduo sobre os possíveis perigos que determinada situação possa oferecer (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005).

Essa emoção também é fundamental para promover o bom desempenho em atividades cognitivas. De fato, adaptando-se a curva de Yerkes-Dodson para o contexto da ansiedade, a elevação da mesma causa um aumento no desempenho das tarefas, até determinado ponto, em que a eficiência seria máxima. No entanto, a partir desse limite, o aumento da ansiedade passa a ser prejudicial e promove uma redução na performance do indivíduo (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Nesse contexto, quando a ansiedade afeta o desempenho, apresentando uma resposta com intensidade ou frequência desproporcional a situação que a originou, ou ainda quando a sua causa não é bem determinada, pode-se afirmar que esse estado ansioso abandonou o seu caráter benéfico/protetor e tornou-se nocivo (BRANDÃO, 2004; BRAGA ET AL, 2010).

Assim, quando esses mecanismos de autopreservação encontram-se desbalanceados, estabelece-se o estado de ansiedade patológica (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Esta pode ter origem secundária quando ela é uma consequência de outras enfermidades (psiquiátricas ou não) ou primária quando se trata da única ou principal manifestação clínica da doença. É nesse último quesito em que se enquadram os transtornos de ansiedade (PITTA, 2010). Segundo o DSM- 15

V, os transtornos de ansiedade podem ser classificados em vários subtipos, tais como: o transtorno do pânico (com ou sem agorafobia) (TP), a agorafobia sem história de transtorno do pânico, o transtorno de ansiedade generalizada (TAG), a fobia específica, a fobia social, o transtorno devido a uma condição médica geral, o transtorno de ansiedade induzido por substância e o transtorno de ansiedade sem outra especificação (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).

A fim de ilustrar como esses transtornos são extremamente debilitantes e interferem no estilo de vida das pessoas (MENEZES ET AL, 2007), o TAG, o TP e a fobia social são descritos a seguir. O primeiro caracteriza-se por um estado de ansiedade e preocupação excessivo durante um período de seis meses (ocorrendo na maioria dos dias) no qual o indivíduo sente dificuldades em controlar essa emoção. Além disso, a ansiedade sentida é desproporcional ao evento que a gerou. Já o transtorno do pânico caracteriza-se pelo surgimento de ataques de pânico recorrentes e inesperados. Estes se caracterizam por configurar um estado de medo intenso ou desconforto ao indivíduo e é frequentemente acompanhado da sensação de morte eminente e do desejo de fugir. Além disso, os ataques aparecem associados a alguns sintomas, tais como: sensação de sufocamento, sudorese, sensação de tontura, medo de morrer, medo de enlouquecer e tremores. Esse conjunto de sintomas surge de maneira súbita e alcança um pico dentro de dez minutos. Por outro lado, a fobia social se caracteriza por uma ansiedade exagerada devido à exposição a situações sociais ou de desempenho na qual o indivíduo tem receio de que vá agir de forma humilhante ou vergonhosa. Além disso, o indivíduo, apesar de reconhecer que esse comportamento é exagerado e irracional, tende a esquivar-se das situações embaraçosas ou executá-las com intenso desconforto. Por fim, para configurar-se como patologia também é necessário que esse comportamento interfira significativamente na rotina diária, no trabalho e nas relações sociais (AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION, 2013).

Com relação aos estudos epidemiológicos, em uma pesquisa realizada pela World Health Organization (WHO), em 2012, foram avaliados os anos de vida saudável perdidos por incapacitação (Disability-Adjusted Life Year –DALY) num panorama global e demonstrou-se que os transtornos psiquiátricos estão entre as seis maiores causas de anos de vida perdido por incapacitação e dentro desse grupo os transtornos de ansiedade situam-se na terceira posição (WORLD HEALTH 16

ORGANIZATION, 2014). Em um estudo realizado em São Paulo, no Brasil, demonstrou-se que 12,5 % dos entrevistados já tiveram o diagnóstico de transtorno de ansiedade em algum momento de sua vida (ANDRADE, 2002).

É importante salientar que o tratamento para os transtornos de ansiedade são realizados através de intervenções psicológicas e farmacológicas e quanto a estas últimas, os inibidores seletivos da recaptação da serotonina (ISRS) e os inibidores da recaptação da serotonina e noradrenalina (IRSN) são os fármacos mais indicados pela ANVISA para o tratamento desses transtornos (ANVISA, 2013). Contudo, na situação atual, os benzodiazepínicos (BZDs), drogas que foram largamente utilizados na década de 70 pensando ser uma opção totalmente segura (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PSIQUIATRIA, 2008), são ainda os medicamentos mais empregados no tratamento desses transtornos, sendo a terceira classe de drogas mais prescritas no Brasil (NORDON; HÜBNER, 2009). Apesar de ter efeito rápido e ser bem aceita, essa classe de fármacos apresenta muitos efeitos nocivos para o indivíduo, tais como: piora da memória e da coordenação motora fina, sedação e risco de dependência (ANVISA, 2013; ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PSIQUIATRIA, 2008). Além disso, apesar dos ISRS serem os medicamentos de escolha, eles apresentam alguns efeitos colaterais como a piora dos sintomas no início do tratamento e a espera de cerca de quatro a doze semanas para o início do efeito (ANVISA, 2013).

Outro ponto crucial é que os transtornos de ansiedade estão atrelados a um maior risco de suicídio, a comorbidades médicas e psiquiátricas e, além disso, as intervenções farmacológicas ou psicossociais são efetivas apenas em uma parte dos pacientes (ETKIN, 2012).

Tendo em vista o impacto negativo dos transtornos de ansiedade na vida das pessoas e a carência de medicamentos que sejam eficazes e ao mesmo tempo possuam efeitos colaterais menos deletérios, é imprescindível que haja o desenvolvimento de estudos nesse contexto, a fim de expandir os conhecimentos referentes à fisiologia e patologia da ansiedade e, assim, futuramente contribuir com a melhoria da qualidade de vida dos pacientes. Dessa forma, diversos estudos pré- clínicos vem sendo realizados com o intuito de esclarecer o substrato neural da 17

ansiedade, bem como apontar novos alvos terapêuticos para o tratamento desses transtornos.

1.2 A SUBSTÂNCIA CINZENTA PERIAQUEDUTAL NO SUBSTRATO NEURAL DA ANSIEDADE

Com o avanço nas pesquisas, várias áreas encefálicas vêm sendo vinculadas ao substrato neural da ansiedade e, dentre elas, pode-se citar: a substância cinzenta periaquedutal (SCP), a amígdala, o hipotálamo medial, o septo, o hipocampo, o locus coeruleus e córtex pré-frontal (BRANDÃO ET AL, 2003).

Com relação à SCP, sabe-se que ela é um conjunto de células densas que circundam parcialmente o aqueduto mesencefálico (aqueduto de Sylvius) o qual é um ducto que conecta o terceiro e quarto ventrículos, localizado no mesencéfalo de mamíferos (KEAY; BANDLER, 2004). Essa estrutura possui o mesmo tamanho relativo entre humanos, ratos e gatos correspondendo à aproximadamente 10% do tamanho do mesencéfalo numa secção transversal (CARRIVE, 1993). Além disso, o mesencéfalo demonstra ser uma das regiões do encéfalo que sofreu poucas modificações evolutivas de modo que a SCP é uma estrutura bastante conservada entre os mamíferos (CARRIVE, 1993; LINNMAN ET AL., 2012). Outro ponto interessante é que a SCP não é uma estrutura funcionalmente homogênea, uma vez que sub-regiões diferentes podem conduzir a reações emocionais distintas. Levando em consideração esse raciocínio e aspectos anatômicos, ela foi dividida em quatro colunas longitudinais que são paralelas ao aqueduto mesencefálico, denominadas: dorsomedial e dorsolateral, que compõem a porção dorsal, lateral e ventrolateral (DEPAULIS; BANDLER, 1991; KEAY; BANDLER, 2004; CARRIVE, 1993; LINNMAN ET AL., 2012) (figura 1). Quanto a sua função, diversos estudos in vivo têm demonstrado que a SCP está implicada na modulação da dor, no controle da ansiedade e do medo, na vocalização, na regulação cardiovascular, no comportamento sexual, no controle da micção, na termorregulação, na respiração e nos mecanismos de regulação do sono (CARRIVE; MORGAN, 2012; LINNMAN ET AL., 2012; BEHBEHANI, 1995; KEAY; BANDLER, 2004; BENARROCH, 2012; HOLSTEGE, 2014). Essa diversidade de funções pode estar relacionada com a variedade de neurotransmissores (glutamato, o GABA, a acetilcolina e a serotonina) 18

e de neuropeptídeos (somatostatina, substância P, neuropeptídeo Y) que atuam na SCP (CARRIVE; MORGAN, 2012).

Figura 1 - Modelo da SCP. Ao longo do eixo rostrocaudal estão representadas as colunas dorsomedial (dm), dorsolateral (dl), lateral (l) e ventrolateral (vl).

Fonte: LINNMAN ET AL, 2012

As primeiras conexões entre a SCP e a ansiedade se deram através de estudos que empregaram a estimulação elétrica da substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPD) em animais de laboratório. Nesses trabalhos foi visto que o estímulo incitou reações de defesa do tipo luta e fuga (BRANDÃO; AGUIAR; GRAEFF, 1982; VIANNA; LANDEIRA-FERNANDEZ; BRANDÃO, 2001; SCHENBERG; AGUIAR; GRAEFF, 1983; BRANDÃO ET AL, 2003; GRAEFF, 2002; HESS; BRUGGER, 1943 citado por CARVALHO-NETTO, 2009) que foram acompanhadas por alterações neurovegetativas (aumento da pressão sanguínea, taquicardia, e exoftalmia), indicando que o animal estava diante de uma situação desconfortante (SCHENBERG ET AL, 2001). Esses comportamentos são usuais de animais que se encontram sob uma ameaça proximal, como por exemplo, quando estão diante de um predador em ambiente natural (GRAEFF, 2004), e, além disso, são sensíveis a fármacos utilizados na clínica para o tratamento de transtornos de ansiedade (BLANCHARD; GRIEBEL; BLANCHARD, 2003). Da mesma forma, em humanos, já foi visto que a estimulação elétrica da SCPD durante procedimentos neurocirúrgicos para o alívio da dor crônica desencadeou sensações de medo e morte eminente, vontade de fugir, hiperventilação, parada respiratória, ruborização da face, piloereção e sudorese (NASHOLD; WILSON; SLAUGHTER, 1974 citado por GRAEFF, 2002). Tais reações são semelhantes aos sintomas de transtorno do 19

pânico, um tipo de transtorno de ansiedade (LOVICK, 2000; JENCK; MOREAU; MARTIN, 1995).

Além disso, sabe-se que a SCP recebe aferências de regiões prosencefálicas e do próprio tronco encefálico. Com relação às regiões prosencefálicas, as principais projeções se originam na amígdala, no córtex insular, no córtex pré-frontal, no córtex temporal e no hipotálamo. Já no tronco encefálico, as projeções partem dos colículos superior e inferior, da formação reticular do mesencéfalo, da substância negra, do núcleo cuneiforme do tegumento mesencefálico, do locus coeruleus, dos núcleos parabraquial, vestibular, grácil e solitário, do dorsal da ponte, da medula ventromedial e ventrolateral e do núcleo dorsal da rafe (NDR) (CARRIVE; MORGAN, 2012).

Com relação ao NDR, sabe-se que ele é um dos núcleos formados predominantemente por corpos celulares serotonérgicos situados ao longo da linha média do tronco encefálico em humanos e em animais (HORNUNG, 2003; TABER; BRODAL; WALBERG, 1960) e que projetam fibras serotonérgicas para SCPD (STEZHKA; LOVICK, 1994; LOVICK, 1994). Portanto, a SCPD através das aferências oriundas do NDR recebe projeções de um dos sistemas de neurotransmissão implicados na modulação da ansiedade, o sistema serotonérgico (DURANT; CHRISTMAS; NUTT, 2010).

1.3 O SISTEMA SEROTONÉRGICO NA ANSIEDADE

A serotonina, também conhecida como 5-hidroxitriptamina (5-HT), foi descoberta há mais de sessenta anos atrás através do trabalho de caracterização realizado por Maurice Rapport e Irvine Page (NICHOLS; NICHOLS, 2008; RAPPORT; GREEN; PAGE, 1948). Essa amina biogênica possui importantes funções no sistema cardiovascular, genitourinário, endócrino e gastrointestinal, no controle da respiração, na modulação da dor, e, em especial, no sistema nervoso central (BERGER; GRAY; ROTH, 2009; DUTTON; BARNES, 2008). Com relação a esse último, é de conhecimento que esse neurotransmissor está implicado em processos neurofisiológicos importantes para a manutenção de funções relevantes para o organismo, como por exemplo, o humor, a recompensa, a raiva, a agressão, o apetite, a memória, a sexualidade, a atenção, a regulação da temperatura, os 20

ciclos do sono, a êmese, a dor, a cognição e a ansiedade (BERGER; GRAY; ROTH, 2009; MOHAMMAD-ZADEH; MOSES; GWALTNEY-BRANT, 2008; DUTTON; BARNES, 2008). Também foi constatado que a desregulação do sistema serotonérgico está relacionada à patogênese de alguns transtornos neurológicos, dentre eles o de ansiedade (ROTH, 1994; DUTTON; BARNES, 2008).

Sabe-se que os receptores serotonérgicos atualmente são classificados em sete famílias (5-HT1 – 5-HT7), compostas por quatorze subtipos distintos de receptores. Com exceção dos receptores 5-HT3, os quais são canais iônicos operados por ligante, as demais famílias são receptores metabotrópicos acoplados a proteína G (HOYER; HANNON; MARTIN, 2002; BARNES; SHARP, 1999).

Os primeiros trabalhos envolvendo o sistema serotonérgico e a ansiedade utilizaram um modelo experimental de ansiedade denominado teste de conflito (teste de punição). Nesse modelo um animal privado de alimento é treinado a pressionar uma barra (rato) ou bicar um disco (pombo) com o intuito de obter uma recompensa (líquido ou alimento). Após essa fase de treino, o animal é colocado novamente no sistema, de modo que quando o disco era bicado ou a barra pressionada o animal recebia um choque elétrico leve, caracterizando uma situação de conflito (GELLER; SEIFTER, 1960; WUTTKE; KELLEHER, 1970; CRUZ; LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012). Assim, foi demonstrado que fármacos ansiolíticos (BZDs) liberavam a resposta punida (aumento da taxa de pressionamento da barra ou bicadas no disco) e que fármacos não ansiolíticos, como antipsicóticos, analgésicos, antidepressivos e psicoestimulantes não alteravam essa resposta (LANDEIRA-FERNANDEZ, 2012; BRANDÃO ET AL, 2003).

Dessa forma, em um estudo em que foi administrado um inibidor da síntese de serotonina, denominado paraclorofenilalanina (PCPA), perifericamente em ratos, observou-se um aumento na taxa de pressão da barra (liberação do comportamento punido) (ROBICHAUD; SLEDGE, 1969). Em outro trabalho semelhante, utilizando-se pombos, notou-se que a administração periférica do metisergida (antagonista não seletivo de receptor serotonérgico) também promoveu a liberação do comportamento punido (GRAEFF; SCHOENFELD, 1970 citado por GRAEFF, 2002). Além disso, esses efeitos foram semelhantes aos encontrados com a administração de BDZs (WUTTKE; KELLEHER, 1970; GRAEFF, 2002). 21

Posteriormente, em 1972, surgiram indícios que solidificaram a inserção da serotonina na modulação da ansiedade, ainda que com mecanismos não totalmente esclarecidos. De fato, foi visto que a injeção intraventricular da serotonina promoveu a supressão do comportamento punido e antagonizou a redução da ansiedade promovida pelos BDZs (WISE; BERGER; STEIN, 1972). Além disso, a partir de evidências neuroquímicas, acreditou-se, na época, que os BDZs induziam a diminuição da taxa de renovação da serotonina no mesencéfalo do rato, numa dose igual a que promoviam efeito ansiolítico no teste de conflito (WISE; BERGER; STEIN, 1972). Como o NDR envia projeções serotonérgicas para áreas prosencefálicas e o tronco encefálico (CARRIVE; MORGAN, 2012; GRAEFF, 2002), sugeriu-se que a serotonina inibiu o comportamento punido por atuar nessas duas regiões e que os BDZs realizaram seu efeito ansiolítico diminuindo a liberação de serotonina nessas áreas (WISE; BERGER; STEIN, 1972). Contudo, atualmente, sabe-se que os BDZs geram seu efeito ansiolítico por mecanismos de ação distintos (FERRERO; GUIDOTTI; COSTA, 1984). Considerando que a SCP recebe projeções do NDR (CARRIVE; MORGAN, 2012) e possui um papel no controle da aversão (GRAEFF, 2002), inferiu-se na época que a serotonina poderia aumentar a ansiedade promovida nos testes de conflito através de sua ação sobre a SCP, além de outras estruturas prosencefálicas (WISE; BERGER; STEIN, 1972; GRAEFF, 2002).

Contudo, a partir de trabalhos que envolveram a administração de ligantes serotonérgicos e a estimulação elétrica da SCPD, obtiveram-se resultados que sugeriram que a serotonina teria um papel antiaversivo na SCPD.

Assim, alguns estudos utilizaram um teste no qual a SCPD do animal é estimulada eletricamente e o mesmo é treinado a evadir-se desse estímulo aversivo através do pressionamento de uma barra. Neste teste, era esperado que a serotonina facilitasse o comportamento de fuga, uma vez que ela aumentaria a ansiedade de acordo com a hipótese sugerida anteriormente (GRAEFF, 2002). Contudo, foi observado que a administração do PCPA perifericamente aumentou a taxa de pressão na barra para reduzir a estimulação (KISER; LEBOWITZ, 1975). De maneira recíproca, a administração intraperitoneal de um precursor da serotonina (5- HTP) ou de um inibidor da recaptação da serotonina (clomipramina) mostrou um 22

decaimento na taxa de pressionamento da barra (KISER; GERMAN; LEBOWITZ, 1978).

Também foi registrado que a estimulação elétrica do NDR diminuiu a fuga motivada pela estimulação elétrica na SCPD (KISER ET AL., 1980). Ou seja, o aumento da atividade serotonérgica reduziu os efeitos aversivos promovidos pela estimulação elétrica na SCPD (atenuação da taxa de pressionamento da barra), ao passo que a sua diminuição favoreceu os efeitos aversivos dessa estimulação (facilitação do comportamento de fuga).

Por sua vez, trabalhos combinando administração de substâncias intracérebro e a estimulação elétrica na SCPD também corroboraram a ideia de que a serotonina inibe a aversão na SCPD. No modelo utilizado nesses trabalhos, ratos com quimitrodos, instrumentos que permitem a estimulação elétrica e a microinjeção de substâncias ao mesmo tempo na SCPD, são colocados dentro de uma caixa com dois compartimentos. A intensidade da corrente é aumentada gradualmente até que o animal corra para o compartimento oposto, o que desliga a corrente. Assim, depois de três repetições do procedimento, o limiar elétrico aversivo basal (corrente mínima necessária para provocar o deslocamento do animal) é determinado. Após um tempo, o animal é microinjetado com a droga e um novo limiar é determinado. Quanto maior o limiar pós-droga comparado ao limiar basal, maior será o efeito antiaversivo daquela droga (SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985). Assim, foi visto que a administração da serotonina e do 5-MeODMT (agonista não seletivo de receptor 5-HT2 e 5-HT1) aumentou o limiar elétrico necessário para induzir o comportamento de fuga. Ainda nesse mesmo experimento, a microinjeção da ketanserina (antagonista seletivo do receptor 5-HT2) ou da metergolina (antagonista de receptor serotonérgico) trinta minutos antes da administração da serotonina bloqueou o efeito antiaversivo dessa monoamina e o pré-tratamento com um inibidor da recaptação de serotonina fortaleceu o efeito antiaversivo da mesma (SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985).

Tendo em vista esses resultados, é bastante sugestivo que os efeitos antiaversivos da serotonina sobre a estimulação elétrica na SCPD sejam mediados por receptores 5-HT2 uma vez que o antagonista desse receptor conseguiu reverter os efeitos da serotonina na SCPD (SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985). 23

Pesquisas utilizando subtipos dos receptores 5-HT2 e 5-HT1 também foram bem sucedidas em mostrar que esses subtipos estão implicados nos efeitos antiaversivos da serotonina. Utilizando o modelo experimental supracitado, observou-se que a microinjeção de agonistas do receptor 5-HT1A (8-OH-DPAT e

BAY-R-1531) ou do agonista do receptor 5-HT2A/2C (DOI) aumentou o limiar elétrico aversivo (inibição da fuga) de forma dose dependente; no entanto o tratamento com o agonista do receptor 5-HT2B/2C (mCPP) foi ineficaz. Já a microinjeção prévia do antagonista do receptor 5-HT1A (NAN-190) reverteu o efeito antiaversivo do 8-OH-

DPAT. De maneira similar, o antagonista do receptor 5-HT2A (espiperona) também neutralizou o efeito do DOI. Portanto, a ativação dos receptores 5-HT1A e 5-HT2A provavelmente é a responsável pela inibição da aversão gerada pela estimulação elétrica da SCPD (NOGUEIRA; GRAEFF, 1995).

Tendo em vista isso, através dos dados obtidos com a estimulação elétrica da SPCD, foi possível inferir que a serotonina inibiu a aversão na SCPD, por meio de sua atuação em receptores 5-HT1A e 5-HT2A e, consequentemente, esses resultados não concordam com hipótese criada na década de 70, de que a serotonina aumentaria a ansiedade ao atuar na SCP (GRAEFF, 2002).

Já em modelos que se baseiam no repertório natural de defesa do rato, como o labirinto em cruz elevado (LCE), foram observadas respostas distintas de acordo com o subtipo de receptor envolvido. Esse modelo é um aparato constituído por dois braços abertos (destituídos de paredes) perpendiculares a dois braços fechados (protegidos por paredes). O centro, ou seja, o ponto de encontro entre os braços abertos e fechados é destituído de paredes e todo o aparato é elevado do solo. Assim, o animal é colocado no centro do labirinto e seu comportamento é avaliado (HANDLEY; MITHANI, 1984). O LCE se baseia no medo inato dos roedores por espaços abertos o qual é confrontado pelo o ímpeto de explorar ambientes desconhecidos, de modo que esse aparato confere ao animal um conflito de aproximação e esquiva, no qual os braços abertos do LCE representam um estímulo aversivo (MONTGOMERY, 1955; HANDLEY; MITHANI, 1984). Já foi visto que ratos colocados no LCE demonstraram preferência pelos braços fechados (HANDLEY; MITHANI, 1984). Além disso, drogas ansiolíticas empregadas na clínica como o diazepam promoveram o aumento no número de entradas e tempo nos braços abertos, ao passo que drogas que induzem ansiedade em humanos como o 24

pentilenotetrazol diminuíram esses valores. Logo, esses parâmetros são usados como índices de ansiedade no LCE (PELLOW ET AL, 1985).

Assim, a microinjeção de um agonista de receptor 5-HT2B/2C (mCPP) na SCP de camundongos produziu efeito ansiolítico no LCE, o qual foi bloqueado pelo pré- tratamento com um antagonista de receptores 5-HT2A/2C (ketanserina) (NUNES-DE- SOUZA ET AL,2008). Por outro lado, a microinjeção isolada de um antagonista e de agonista do receptor 5-HT1A, o WAY-100135 e o 8-OH-DPAT, respectivamente, na SCPD de ratos não alterou os índices de ansiedade do LCE (MORAES; BERTOGLIO; CAROBREZ, 2008).

Já em outro modelo etológico derivado do LCE, o labirinto em T elevado (LTE; GRAEFF; NETTO; ZANGROSSI, 1998; TEIXEIRA; ZANGROSSI; GRAEFF, 2000; POLTRONIERI; ZANGROSSI; VIANA, 2003), resultados interessantes tem sido obtidos. Nesse sentido, alguns estudos demonstraram que a microinjeção da serotonina ou de agonistas de receptores serotonérgicos, tais como: o mCPP

(agonista do receptor 5-HT2B/2C), o 8-OH-DPAT (agonista de receptor 5-HT1A) e o

DOI (agonista preferencial do 5-HT2A) na SCPD produziram efeito antiaversivo no LTE (ZANOVELI; NOGUEIRA; ZANGROSSI, 2003; SOARES; ZANGROSSI, 2004). Além disso, o efeito antiaversivo do 8-OH-DPAT e do DOI foram bloqueados pela microinjeção prévia dos antagonistas do receptor 5-HT1A (WAY 100635) e do antagonista preferencial do receptor 5-HT2A (ketanserina), respectivamente (SOARES; ZANGROSSI, 2004). De maneira semelhante, o efeito antiaversivo da serotonina também foi bloqueado pela microinjeção prévia desses mesmos antagonistas e do antagonista preferencial do receptor 5-HT2C (SDZ SER 082) (SOARES; ZANGROSSI, 2004). É interessante notar que esses resultados estão de acordo com os efeitos antiaversivos observados com a microinjeção de agonistas dos receptores 5-HT1A e 5-HT2A ou da própria serotonina no modelo de estimulação elétrica da SCPD (SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985; NOGUEIRA; GRAEFF,

1995). Tendo em vista esses dados, sugeriu-se que os receptores 5-HT1A, 5-HT2A e

5-HT2C poderiam mediar o efeito antiaversivo da serotonina na SCPD (SOARES; ZANGROSSI, 2004) Ainda em estudos posteriores, foi visto que, nesse mesmo teste, a microinjeção de um agonista seletivo do receptor 5-HT2C, o MK-212, na SCPD promoveu efeito ansiogênico no LTE, o qual foi revertido pela microinjeção 25

prévia do antagonista seletivo do receptor 5-HT2C, o SB 242084 (YAMASHITA; BORTOLI; ZANGROSSI, 2011).

Portanto, com essas informações, é possível inferir que a SCPD é uma estrutura diversificada quanto aos mecanismos que envolvem a ansiedade, uma vez que a serotonina pode ativar diferentes receptores e gerar efeitos comportamentais distintos. Então, com o intuito de compreender melhor a participação da SCPD em mecanismos de ansiedade é de suma importância investigar os efeitos decorrentes da ativação e bloqueio de outros receptores serotonérgicos nessa região.

1.4 O RECEPTOR 5-HT3: ESTRUTURA E FUNÇÃO

O receptor 5-HT3 é um dos receptores serotonérgicos presentes na SCP (LAPORTE ET AL, 1992; GE ET AL, 1997) e faz parte da família de canais iônicos operados por ligante Cys-loop. Os membros dessa família têm em comum o fato de serem proteínas transmembranas ativadas por neurotransmissores e de desencadear neurotransmissões rápidas de caráter excitatório ou inibitório. A principal característica dos componentes desse grupo é a presença de uma alça de 13 aminoácidos, na porção extracelular dos receptores, delimitada por uma ponte dissulfeto entre dois resíduos de cisteína (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010).

Esse receptor serotonérgico é formado por cinco subunidades que estão dispostas pseudosimetricamente ao redor de um poro central, permeável à passagem de cátions, quando ativado. Cada subunidade pode ser dividida em três domínios: o domínio extracelular (DEC), o domínio transmembrana (DTM) e o domínio intracelular (DIC) (figura 2) (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010; LUMMIS, 2012). O DEC contém o local de ligação do ligante e é um importante sítio para a ação de agonistas e antagonistas competitivos. Já o DTM é formado por quatro α-hélices (M1-M4) que permitem a passagem de íons positivos através da membrana (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010; LUMMIS, 2012). No entanto, na região central dessa estrutura, na linha do poro, situa-se uma constrição hidrofóbica em M2 que funciona como o portão do canal impedindo a passagem dos íons quando o neurotransmissor não está associado ao receptor (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010). Quando essa ligação ocorre, ele se move permitindo o fluxo dos 26

íons através da membrana. Assim, a ligação de ao menos duas moléculas de serotonina na porção DEC do canal provocaria uma rotação que se propagaria ao longo do eixo do canal até à α-hélice M2. Nessa região, a alteração conformacional gerada promoveria a ruptura das interações hidrofóbicas no centro de M2, permitindo a passagem dos íons (LUMMIS, 2004; PANICKER ET AL., 2002). Esse domínio também é o sítio de ligação para alguns compostos como o álcool, anestésicos e esteroides (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010). Por sua vez, o DIC é constituído por um grande laço (loop) intracelular que é responsável pela condutância iônica do canal e é susceptível à modulação por compostos intracelulares (fosforilação). Além disso, forma uma abertura que permite a passagem dos íons através do poro (THOMPSON; LESTER; LUMMIS, 2010; LUMMIS, 2012). Ademais, as cinco subunidades que podem estar presentes no receptor são denominadas: 5-HT3A, 5-HT3B, 5-HT3C, 5-HT3D e 5HT3E (WALSTAB; RAPPOLD; NIESLER, 2010). A subunidade 5-HT3A pode formar homopentâmeros ou heteropentâmeros com outras subunidades, de modo que a presença dessa subunidade é fundamental para a constituição funcional do receptor

5-HT3 (LUMMIS, 2012; NIESLER ET AL., 2007). Por fim, todas estão presentes em humanos, porém em roedores (ratos e camundongos) apenas as subunidades 5- HT3A e 5-HT3B foram identificadas (LUMMIS, 2012; HOLBROOK, 2009; HANNA ET AL., 2000).

Figura 2 - Arquitetura do receptor 5-HT3. É possível observar os domínios de cada subunidade do receptor num corte longitudinal (fig.2A) e transversal (fig.2B) do receptor. Fig.2A Fig.2B

Fonte: HASSAINE ET AL., 2014.

A localização desse canal iônico é bastante diversificada no organismo, podendo ser encontrado em células enterocromafins intestinais, em linfócitos e em neurônios dos sistemas nervoso periférico e central. No sistema nervoso periférico 27

estão envolvidos em atividades autonômicas, como na transferência de informações relacionadas ao vômito no trato gastrointestinal e no controle da motilidade intestinal e peristaltismo (THOMPSON; LUMMIS, 2006). Já no sistema nervoso central, ele está principalmente implicado na cognição, na ansiedade, nos processos relativos ao reflexo do vômito, à dor e ao sistema de recompensa (THOMPSON; LUMMIS, 2006; FAERBER ET AL, 2007). Com relação à localização no SNC, esse receptor além de estar presente na SCP, ele pode ser encontrado, por exemplo, no córtex frontal e etorrinal, no hipocampo, na amígdala, no nucleus accumbens, na substância negra, na área tegumental ventral, nas camadas superficiais do corno dorsal da medula espinhal, na área postrema, no núcleo do trato solitário e no núcleo dorsal da rafe (THOMPSON; LUMMIS, 2006; LAPORTE ET AL, 1992; GE ET AL, 1997).

Quanto aos mecanismos de ativação, esse receptor promove a despolarização da membrana por meio da corrente de íons positivos que atravessam o canal. Nesse fluxo de íons, ocorre a entrada de Na+ e Ca+2 na célula e a saída de K+. Já foi visto que os receptores 5-HT3 estão localizados predominantemente em regiões pré- sinápticas, tais como as terminações nervosas e axônios, onde apresentam alta +2 permeabilidade ao Ca (MIQUEL ET AL., 2002; RONDÉ; NICHOLS, 1998; NAYAK ET AL., 1999). Esse fato é interessante uma vez que a entrada de Ca+2 no terminal pré-sináptico da célula promove a exocitose das vesículas contendo neurotransmissores. De fato alguns estudos confirmaram que a ativação desse receptor promove a liberação de muitos neurotransmissores, como o GABA e a dopamina (TURNER; MOKLER; LUEBKE, 2004; CHEN; PRAAG; GARDNER, 1991;

FAERBER ET AL, 2007). Já nos terminais pós-sinápticos, os receptores 5-HT3 destacam-se pela despolarização causada pela passagem de Na+ e K+ pelo poro do canal, uma vez que ele apresenta alta permeabilidade a esses cátions e a baixa permeabilidade ao Ca+2 (NAYAK ET AL., 1999; RONDÉ; NICHOLS, 1998).

1.5 O RECEPTOR 5-HT3 NA ANSIEDADE: ESTUDOS CLÍNICOS E PRÉ-CLÍNICOS

É de conhecimento que uma das principais áreas terapêuticas nas quais os antagonistas do receptor 5-HT3 atuam são o controle do vômito induzido pela 28

quimioterapia. No entanto, em ensaios clínicos demonstrou-se que esses fármacos possuem também funções diferentes da convencional, em especial na ansiedade. Em um desses ensaios, o tropisetron gerou efeito ansiolítico num estudo duplo cego, no qual 91 indivíduos com o TAG receberam cápsulas de tropisetron ou cápsulas de placebo durante 21 dias de tratamento (LECRUBIER ET AL., 1993). Além disso, em outros estudos clínicos, o ondansetron demonstra ser uma alternativa interessante na redução do abuso de substâncias. De fato, viu-se que esse fármaco conseguiu reduzir o consumo de álcool e aumentou o período de abstinência, conforme demonstrado em um estudo duplo cego com 271 indivíduos diagnosticados com alcoolismo precoce (JOHNSON ET AL., 2000; THOMPSON; LUMMIS, 2006).

Com relação aos estudos pré-clínicos, a maioria das pesquisas fez uso de testes comportamentais que se baseiam na apresentação de estímulos incondicionados, tais como: o LCE, a transição claro/escuro e o teste de interação social (TIS), para avaliar a participação do receptor 5-HT3 no desenvolvimento dos comportamentos relacionados à ansiedade.

Observou-se que a administração periférica de diversos antagonistas do receptor 5-HT3 gerou respostas discordantes num mesmo ou em modelos animais de ansiedade distintos, nos quais efeito ansiolítico ou ausência de efeito foram encontrados. Uma hipótese provável para a origem dessas discrepâncias poderia ser a seletividade dos antagonistas por uma subunidade específica do receptor 5-

HT3. Outra possibilidade seria as diferenças sutis empregadas pelos pesquisadores num mesmo modelo comportamental, o que poderia interferir nos resultados encontrados (EGUCHI; INOMATA; SAITO, 2001; GRIEBEL, 1995).

Então, já foi demonstrado que a administração periférica de antagonistas do receptor 5-HT3 tais como: o zacopride, o BRL 46470, o tropisetron, o MDL 72222, o ondansetron, o granisetron e o WAY100289 em ratos (SETEM ET AL, 1999; FILE; JOHNSTON, 1989; WRIGHT, 1992; GRIEBEL ET AL., 1997; FILE; JOHNSTON, 1989) e em camundongos (TANYERI ET AL., 2013; RODGERS; COLE; TREDWELL, 1995) não alterou os comportamentos relativos à ansiedade no LCE e no TIS. Além disso, os camundongos submetidos a um regime crônico de 21 dias de ondansetron também não diferiram dos animais controle no LCE (RODGERS; CUTLER; JACKSON, 1997). 29

Considerando os estudos que demonstraram alteração nos parâmetros de ansiedade, já foi visto que a administração periférica de todos os antagonistas do receptor 5-HT3 citados no parágrafo anterior, além do Y-25130, do RS-42358, do VA21B7 e do 6K, produziu efeito ansiolítico em ratos (DUNN; CARLEZON; CORBETT, 1991; ANDREWS; FILE, 1993; BLACKBURN ET AL, 1993; FILIP ET AL, 1992; COSTALL ET AL, 1993; ARTAIZ ET AL, 1995; JONES, 1988; BELL ET AL, 2014; GARGIULO ET AL, 1996) e em camundongos (SÁNCHEZ, 1995; JONES ET AL., 1988; COSTALL ET AL., 1989a; ARTAIZ ET AL., 1995; COSTALL ET AL., 1993; KURHE ET AL. 2014) em diversos modelos comportamentais (LCE, TIS, labirinto em zero elevado, LTE, teste de conflito de Vogel e o modelo de transição claro/escuro). Somado a isso, um estudo que empregou o regime crônico de ondansetron durante 14 dias em ratos gerou aumento do número de entradas e tempo de permanência nos braços abertos do LCE (efeito ansiolítico) (WRIGHT, 1992). Com relação às medidas etológicas, pesquisadores mostraram que o zacopride e o ondansetron foram aptos em diminuir a avaliação de risco no LCE, o que é indicativo de um perfil ansiolítico (GRIEBEL ET AL., 1997).

Por outro lado, observou-se que a administração periférica do agonista 1-(m- Chlorophenyl)-biguanide (mCPBG) diminuiu o tempo de permanência nos braços abertos do LCE e a interação social no TIS, gerando efeito ansiogênico em ambos os testes. (EGUCHI; INOMATA; SAITO, 2001; ANDREWS; FILE, 1992). Além disso, administração combinada de antagonistas com agonistas de receptor 5-HT3 revelou resultados interessantes. De fato, foi visto que a administração isolada do ondansetron em ratos, por via oral, aumentou a interação social no TIS. No entanto, quando o mCPBG foi administrado subsequente à aplicação do ondansetron, o efeito ansiolítico gerado pelo antagonista foi anulado. Portanto, o efeito ansiolítico promovido pelo ondansetron possivelmente se deve à ativação de receptores 5-HT3 (EGUCHI; INOMATA; SAITO, 2001).

Com relação às administrações intracérebro de antagonista e agonistas de receptor 5-HT3, diversas respostas comportamentais são observadas de acordo com teste comportamental empregado ou com a região onde essa substância é administrada. 30

Por exemplo, foi visto que a microinjeção na amígdala de antagonistas de receptores 5-HT3 (ondansetron, do tropisetron e do MDL 72222) em ratos aumentou a interação social no TIS (efeito ansiolítico), ao passo que, a microinjeção do 2-Me-

5-HT (agonista de receptor 5-HT3) ou da própria serotonina promoveu efeito ansiogênico nesse modelo. A microinjeção de antagonistas de 5-HT3 na amígdala de ratos também promoveu efeitos ansiolíticos no LCE (HIGGINS ET AL., 1991; TOMKINS; COSTALL; KELLY, 1990; MENARD; TREIT, 1999). É interessante notar que esses dados corroboram os resultados ansiolíticos encontrados através da administração periférica de antagonistas. Assim, a amígdala provavelmente seria um das regiões neuroanatômicas pela qual os antagonistas de receptor 5-HT3 exerceriam seus efeitos ansiolíticos. Por outro lado, a administração dos mesmos antagonistas em ratos no NDR não foi capaz de alterar os parâmetros de ansiedade no TIS (HIGGINS ET AL., 1991).

Já no teste de conflito, a microinjeção do ondansetron e do tropisetron na amígdala não foi capaz de gerar alterações comportamentais em ratos (HIGGINS ET AL., 1991). No entanto, quando esses antagonistas foram administrados no hipocampo e núcleo accumbens facilitaram os comportamentos suprimidos pela punição (efeito ansiolítico) em testes de conflito nesses mesmos animais.

(STEFANSKI ET AL., 1993). Isso denota que os receptores 5-HT3 do núcleo accumbens e do hipocampo possivelmente contribuem para o efeito ansiolítico no teste de conflito (STEFANSKI ET AL., 1993).

Em estudos realizados em camundongos, resultados semelhantes foram encontrados. De fato a microinjeção de ondansetron ou tropisetron na amígdala ou no NDR aumentou o tempo gasto e o número de linhas cruzadas na área clara no teste de transição claro e escuro (efeito ansiolítico). Já a administração do 2-Me-5-

HT (agonista do receptor 5-HT3) na amígdala ou no NDR causou efeito oposto (COSTALL ET AL., 1989b). Portanto, a amígdala ou NDR possivelmente são um dos locais de ação de antagonistas administrados perifericamente que tiveram seus efeitos ansiolíticos demonstrados em testes comportamentais em camundongos (COSTALL ET AL., 1989b). Contudo quando esses mesmos antagonistas são microinjetados no núcleo mediano da rafe (NMR), núcleo accumbens, núcleo caudado e putâmen não alteram as medidas espaço temporais no teste de transição claro e escuro (COSTALL ET AL., 1989b). 31

Além das regiões já citadas, os antagonistas de receptor 5-HT3 também promoveram resultados interessantes quando microinjetados na SCP de camundongos. Assim, foi visto que a administração do ondansetron promoveu a redução do número de entradas e do tempo decorrido nos braços abertos do LCE, um efeito ansiogênico (SILVA, 2009). Contudo, esses resultados não concordam com o efeito ansiolítico observado com a administração periférica de antagonistas do receptor 5-HT3 (DUNN; CARLEZON; CORBETT, 1991; ANDREWS; FILE, 1993; BLACKBURN ET AL, 1993; FILIP ET AL, 1992; COSTALL ET AL, 1993; ARTAIZ ET AL, 1995; WRIGHT, 1992; JONES, 1988) e, além disso, esse estudo não diferenciou as sub-regiões da SCP, as quais podem processar informações distintas (BANDLER, ET AL, 2000; VIANNA; LANDEIRA-FERNANDEZ; BRANDÃO, 2001).

Assim, sabendo-se que os resultados obtidos com a administração periférica e central de ligantes do receptor 5-HT3 não ofereceram resultados conclusivos em relação a comportamentos relacionados à ansiedade, torna-se interessante investigar se a SCPD estaria envolvida nesse processo em ratos.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Investigar o envolvimento dos receptores 5-HT3 da SCPD na modulação de comportamentos associados à ansiedade em ratos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Investigar o efeito da injeção intra-SCPD do antagonista do receptor 5-HT3 dolasetron sobre os parâmetros de ansiedade e locomoção avaliados no LCE e no teste do campo aberto;

 Investigar o efeito da administração intra-SCPD do agonista do receptor 5-HT3 m- Chlorophenylbiguanide (mCPBG) sobre os parâmetros de ansiedade e locomoção avaliados no LCE e no teste do campo aberto. 33

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 ANIMAIS

Foram utilizados ratos machos Wistar com o peso entre 220 g - 270 g provenientes do biotério do Departamento de Biofísica e Farmacologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (DBF-UFRN). Durante toda a fase de desenvolvimento do animal e no período de experimentos os ratos foram dispostos em grupos de 5 animais e alojados em caixas com dimensões de 41 cm x 34 cm x 16 cm, em que receberam água e comida ad libitum e viveram num ciclo de claro e escuro de 12 hrs (luzes acesas: 06:00-18:00) num ambiente climatizado a 23 ºC ± 1ºC. Além disso, todos os procedimentos experimentais realizados nesse trabalho foram efetuados de acordo com a lei nº 11.794 de 08/10/2008 (Lei Arouca) e aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRN sob o número 049/2013.

3.2 DROGAS

As drogas empregadas durante realização dos experimentos comportamentais ® foram o antagonista do receptor 5-HT3 dolasetron (Sigma-Aldrich , EUA) nas doses de 100 ng, 500 ng e 1000 ng (figura 3) (HIGGINS ET AL, 1990) e o agonista m- Chlorophenylbiguanide (mCPBG) (Tocris Bioscience®, Reino Unido) nas doses de 2,5 µg, 5 µg e 10 µg (figura 4) (HIGGINS ET AL., 1990), ambos solubilizados em salina estéril. Já durante a cirurgia foram empregadas as seguintes drogas: o cloridrato de cetamina (BioChimico®) (80 mg/kg/ml), a xilazina (Sigma-Aldrich®, EUA) (10 mg/kg/ml), o cloridrato de lidocaína 2% (Xylestesin®, Cristália) (0,2 ml/ por animal), a flunixina meglumina 5% (Banamine®, MSD) (0,2 ml/ por animal) e uma combinação de antibióticos (benzilpenicilina benzatina, benzilpenicilina procaína, benzilpenicilina potássica, diidroestreptomicina base e espreptomicina base) (Pentabiótico®, Zoetis - Fort Dodge) de uso veterinário para animais de pequeno porte (0,2 ml/ por animal). Por fim, durante a perfusão foi empregado tiopental sódico (Thiopentax®, Cristália) (100 mg/kg) para indução da anestesia.

Figura 3 - Dolasetron. Figura 4 - mCPBG.

.Fonte: CHONG;CHOO, 2010 Fonte: http://goo.gl/l0IAit

3.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

3.3.1 CIRURGIA ESTEREOTÁXICA PARA O IMPLANTE DA CÂNULA GUIA

Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina (80 mg/kg/ml) e xilazina (10 mg/kg/ml) e em seguida foi realizada a tricotomia da região posterior da cabeça para facilitar a execução dos procedimentos posteriores. O próximo passo consistiu em fixar o animal no estereotáxico com a barra de incisivos a 2,5 mm abaixo da linha interaural. Com o animal já fixado no aparelho, foi feita a higienização da porção posterior da cabeça, da região da coxa e da região dorsal do tronco do animal com solução de iodopovidona a 10 % (PVP-I) para a administração subcutânea de 0,2 ml de cloridrato de lidocaína a 2% (anestésico local), para a injeção intramuscular de 0,2 ml do Pentabiótico® e a administração subcutânea de 0,2 ml de Banamine® 5% (analgésico, anti-inflamatório e antipirético), respectivamente. Em seguida, foram realizadas uma incisão na pele da porção posterior da cabeça e a limpeza da superfície do crânio com H2O2 a 3%, a fim de evitar infecções, melhorar a visualização das suturas e, assim, permitir a perfuração de dois orifícios na calota craniana. O primeiro orifício destinou-se à fixação do parafuso de aço inoxidável cuja função consiste em auxiliar na sustentação do capacete de acrílico a ser produzido no final do processo. O segundo orifício foi produzido com a intenção de permitir a implantação da cânula guia constituída de aço inoxidável com 12 mm de comprimento e 0,7 mm de diâmetro no mesencéfalo do rato, numa região 2 mm acima da substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPD). O procedimento para a determinação do local onde deveria ser introduzida a cânula foi realizado antes da confecção do segundo orifício. Esse procedimento consistiu em posicionar a cânula fixada na haste do estereotáxico sobre o ponto de encontro das suturas sagital e lambdóide e deslocá-la 1,9 mm lateralmente para a 35

esquerda, sob um ângulo de 22°. Em seguida, o orifício foi perfurado nesse ponto e a cânula foi introduzida 3,2 mm abaixo da superfície do crânio. Após a colocação da cânula no posicionamento desejado, foi confeccionado o capacete de acrílico autopolimerizante, com a função de fixar a cânula na coordenada almejada. Por fim, foi introduzido na cânula um mandril de aço inoxidável de mesmo tamanho para evitar a entrada de detritos, sendo retirado apenas no dia do teste (PAXINOS; WATSON, 2005).

3.3.2 HABITUAÇÃO

Esse procedimento consistiu na manipulação do animal durante 5 minutos e após esse período, o animal foi colocado numa caixa de 30 cm x 19 cm x 13 cm por mais 5 minutos, sendo essa mesma caixa utilizada no procedimento de microinjeção de substâncias e, ao terminar essa etapa, o animal foi devolvido para a caixa de origem (41 cm x 34 cm x 16 cm). A finalidade dessa tarefa consistiu em habituar o animal às condições de experimentação que serão empregadas no dia do teste. Por fim, essa atividade foi realizada nos dois dias que antecederam o teste do labirinto em cruz elevado (LCE) e no mesmo período do dia em que os experimentos foram realizados (08:00-13:00).

3.3.3 MICROINJEÇÃO INTRA-SCPD

Para a microinjeção de drogas na SCPD foi necessário a preparação de um sistema de infusão composto por uma seringa de Hamilton de 54,10 mm de comprimento e 10 µl de volume, uma bomba de infusão (Insight®), tubos de polietileno e agulhas gengivais de 14 mm de comprimento. Assim, para criar o ambiente necessário para a administração de substâncias, a seringa de Hamilton foi acomodada na bomba de infusão e a sua extremidade foi conectada a um tubo de polietileno, o qual também foi conectado a uma agulha gengival na outra extremidade. Em seguida, o êmbolo da seringa foi deslocado para a formação de uma bolha dentro do tubo de polietileno, a fim de impedir o contato da droga com a água destilada previamente utilizada para a limpeza do sistema, evitando assim alterações na concentração do fármaco. Após a formação da bolha, a agulha 36

gengival foi colocada num tubo de microcentrífuga (eppendorf) contendo a droga e a mesma foi aspirada com o auxílio da seringa de Hamilton. O próximo passo consistiu em proceder com a infusão da droga, através da inserção da agulha gengival na cânula do animal, o qual foi alojado na mesma caixa utilizada no dia da habituação (30 cm x 19 cm x 13 cm). Durante todo o procedimento de infusão o animal pôde percorrer livremente a caixa enquanto o fármaco estava sendo infundido. Além disso, o tempo (2 minutos) e o volume de injeção (0,2 µl) foram controlados pela bomba de infusão. Após o tempo necessário para realizar a microinjeção, a agulha permaneceu por mais um minuto no local de injeção a fim de evitar o refluxo da droga.

3.4 APARATOS EXPERIMENTAIS

3.4.1 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE)

O LCE é um aparato de madeira elevado a 50 cm do solo constituído por dois braços fechados (com barreiras de 40 cm de altura) que se cruzam perpendicularmente com dois braços abertos (sem paredes), de mesmas dimensões (50cm x 10cm) (figura 5). Além disso, as laterais dos braços abertos são constituídas de pequenos batentes feitos de material acrílico transparente de 0,5cm cuja função é evitar a queda do animal durante o experimento. A iluminação empregada no teste foi de baixa intensidade (luz vermelha fluorescente de 15W) e o experimento foi realizado durante a fase clara do ciclo claro e escuro (08:00-13:00). Durante a realização do teste o animal foi colocado no centro do aparato, que é desprovido de paredes, com a cabeça voltada para um dos braços fechados e os seus comportamentos foram avaliados durante 5 minutos. Para proceder com a avaliação desses comportamentos, o período em que o animal ficou no labirinto foi gravado por uma câmera de segurança para posterior análise dos parâmetros comportamentais relativos à ansiedade, tais como: a porcentagem de entrada nos braços abertos [(número de entradas nos braços abertos/ entradas no centro + entradas no aberto + entradas fechado) x 100], a porcentagem de tempo nos braços abertos [(tempo nos braços abertos/300 x 100)] e o número absoluto de entradas e tempo nos braços abertos (HANDLEY; MITHANI, 1984, PELLOW ET AL, 1985). Além desses parâmetros convencionais, foram investigados parâmetros etológicos 37

como a postura de esticar o corpo (PEC) protegido e o retorno aos braços fechados (RBF). O primeiro consiste num comportamento exploratório no qual o animal estica- se para frente e depois retorna a posição original sem se locomover. Esse comportamento foi avaliado quando o animal estava dentro dos braços fechados ou na plataforma central do labirinto. Já o RBF é um comportamento no qual o animal sai do braço fechado com as duas patas dianteiras e, em seguida, retorna ao mesmo braço (RODGERS; JOHNSON, 1995). Por fim, com relação aos parâmetros de locomoção foram analisados o número absoluto de entradas nos braços fechados e o total de entradas (entradas no centro + entradas no aberto + entradas fechado). Após o teste de cada animal, o aparato foi limpo cuidadosamente com uma solução de álcool 5% (HANDLEY; MITHANI, 1984, PELLOW ET AL, 1985).

Figura 5 - Labirinto em cruz elevado.

Fonte: Laboratório de Farmacologia Comportamental (DBF-UFRN)

3.4.2 CAMPO ABERTO

O campo aberto (CA) é uma caixa cúbica (60 cm x 60 cm x 60 cm) com paredes internas brancas e base preta (figura 6). A iluminação empregada no teste foi a luz branca indireta e o experimento foi realizado durante a fase clara do ciclo claro e escuro (08:00-13:00). Durante a realização do teste o animal foi colocado no centro do CA e os seus comportamentos foram avaliado durante 15 minutos. Para 38

proceder com a avaliação desses comportamentos, o período em que o animal ficou no CA foi registrado por uma câmera de segurança para posterior análise dos parâmetros comportamentais relativos à ansiedade e à locomoção pelo programa ANY-maze (Stoelting, USA). Com relação à ansiedade foram avaliados o número de entradas, o tempo e a distância percorrida na região central do CA durante os primeiros 5 minutos e com relação à locomoção foi avaliado a distância percorrida pelo animal em todo o aparato durante 15 minutos. Após o teste de cada animal, o aparato foi limpo cuidadosamente com uma solução de álcool 5% (HALL, 1934).

Figura 6 - Campo aberto.

Fonte: adaptado de http://goo.gl/w5Jm8N

3.5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Decorridos de 6 a 7 dias do término da cirurgia, os ratos foram submetidos aos testes comportamentais (figura 7).

Figura 7 – Fluxograma geral das etapas metodológicas empregadas no trabalho

Fonte: Autor

3.5.1 EXPERIMENTO 1

No experimento 1 os ratos foram microinjetados na SCPD com o antagonista do receptor 5-HT3 dolasetron nas doses de 100 ng/0,2µl/2 minutos, 500 ng/0,2µl/2 minutos e 1000 ng/0,2µ/2 minutos ou com salina (0,2 µl/2 minutos). Após 10 minutos, os animais foram colocados no centro do LCE e seus comportamentos foram avaliados durante 5 minutos. Vinte e quatro horas depois, os animais receberam as mesmas doses com que foram microinjetados no dia anterior na SCPD e após 10 minutos foram colocados no CA e seus comportamentos foram avaliados durante 15 minutos (figura 8).

Figura 8 – Fluxograma do experimento 1

Fonte: Autor

3.5.2 EXPERIMENTO 2

No experimento 2 os ratos foram microinjetados na SCPD com o agonista do receptor 5-HT3 mCPBG nas doses de 2,5 µg/ 0,2µl/2 minutos, 5 µg/0,2µl/2 minutos e 10 µg/0,2µl/ 2 minutos ou com salina (0,2 µl/2 minutos). Após 5 minutos, os animais foram colocados no centro do LCE e seus comportamentos foram avaliados durante 5 minutos. Vinte e quatro horas depois, os animais receberam as mesmas doses com que foram microinjetados no dia anterior na SCPD e após 5 minutos foram 40

colocados no CA e seus comportamentos foram avaliados durante 15 minutos (figura 9).

Figura 9 – Fluxograma do experimento 2

Fonte: Autor

3.6 PERFUSÃO

Com a finalização dos testes comportamentais, os animais foram anestesiados com tiopental sódico (100 mg/kg) e submetidos à perfusão intracardíaca com salina. Em seguida, foi realizada a infusão do corante azul de metileno (0,2 µl/2 minutos) via cânula para a marcação do sítio de injeção. Após essa etapa, os encéfalos foram removidos e armazenados numa solução de formol 10% para posterior análise histológica.

3.7 HISTOLOGIA

Nessa última etapa do experimento, os encéfalos obtidos durante a perfusão foram cortados em secções coronais de 50 µm por meio de um criostato (Leica CM1510S) e dispostos numa lâmina. O objetivo dessa etapa consistiu em verificar a localização do sítio de injeção e determinar se a microinjeção foi realizada na SCPD através da comparação com as figuras do atlas de George Paxinos e Charles Watson, as quais compreenderam o intervalo entre a figura 92 (interaural: 1,92 mm e 41

bregma: -7,08 mm) e a figura 100 (interaural: 0,96 mm e bregma: -8,04 mm) (PAXINOS; WATSON, 2005). Apenas os animais que tiveram sítio de injeção localizado na SCPD foram considerados para a análise estatística.

3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados obtidos no LCE e CA foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via e, quando houve diferenças significativas entres os grupos, o teste de Duncan foi empregado.

4 RESULTADOS

4.1 HISTOLOGIA

Os sítios de microinjeção na substância cinzenta periaquedutal dorsal (SCPD) estão representados na figura 10. Durante a realização de todos os experimentos foram utilizados 191 animais dos quais 79 obtiveram canulação positiva para SCPD. Desses, 44 animais correspondiam ao experimento 1 e 35 animais correspondiam ao experimento 2.

Figura 10 - Representação esquemática dos sítios de microinjeção na SCPD de ratos. O número de pontos observados é menor que o número total de animais com canulação positiva devido às sobreposições.

Fonte: adaptado de PAXINOS; WATSON, 2005.

4.2 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE.

A análise de variância ANOVA mostrou que os tratamentos com dolasetron nas doses de 100 ng, 500 ng e 1000 ng não geraram diferenças significativas na porcentagem de entrada [F (3,43) = 0,06; p = 0,979] e de tempo [F(3,43) = 0,12; p = 0,944] nos braços abertos do LCE (figura 11). Com relação ao número absoluto de entradas [F(3,43) = 0,28; p = 0,839] e tempo [F(3,43) = 0,12; p = 0,944] nos braços abertos também não foram observadas diferenças significativas entre os grupos (tabela 1).

Além disso, nenhuma das doses alterou a atividade locomotora dos animais, o que foi percebido pela análise do número de entradas nos braços fechados [F(3,43) = 0,80; p = 0,498] e do número total de entradas [F(3,43) = 0,85; p = 0,470] (tabela 1).

Já com relação aos índices etológicos, a análise de variância ANOVA mostrou que não houve diferença significativa entre os grupos para os parâmetros: postura de esticar o corpo protegido (PEC) [F(3,43) = 0,37; p = 0,770] e retorno aos braços fechados (RBF) [F(3,43) = 0,13; p = 0,938] (tabela 2).

Figura 11 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas (fig. 8A) e tempo (fig. 8B) nos braços abertos do LCE. Os dados representam a média ±EPM. N = 8-13. Análise estatística: ANOVA.

Fig.8A Fig.8B 25 30 20

15 20

10 % entrada

% tempo 10

nos braços abertos braços nos nos braços abertos braços nos 0 0

100ng 500ng Salina 1000ng Salina 100ng 500ng Dolasetron 1000ng Dolasetron

Tabela 1 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre o

número de entradas e tempo nos braços abertos, número de entradas nos braços

fechados e número total de entradas do LCE

Comportamentos Dolasetron Salina 100 ng 500 ng 1000 ng Nº entradas braços abertos 4,55 ±1,12 4,00 ±1,10 4,17 ±0,84 3,13 ±0,85 Tempo braços abertos (s) 65,73 ±16,47 62,31 ±18,15 64,67 ±12,48 51,63 ±16,34 Nº entradas braços fechados 8,18 ±0,88 7,85 ±0,88 8,33 ±0,84 6,38 ±0,96 Total de entradas 24,36 ±2,88 21,85 ±2,66 23,67 ±2,45 18,00 ±3,29

S = segundos. Os dados representam a média ±EPM. N = 8-13. Análise estatística: ANOVA.

Tabela 2 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre os índices etológicos do LCE. Comportamentos Dolasetron etológicos Salina 100 ng 500 ng 1000 ng PEC 1,00 ±0,50 0,69 ±0,29 0,50 ±0,23 0,63 ±0,32 RBF 1,64 ±0,86 1,23 ±0,61 1,08 ±0,48 1,13 ±0,79

PEC = postura de esticar o corpo protegido e RBF = retorno aos braços fechados. Os dados representam a média ±EPM. N = 8-13. Análise estatística: ANOVA.

4.3 EXPERIMENTO 01: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO DOLASETRON NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO CA.

Segundo a análise de variância ANOVA, a microinjeção de dolasetron intra- SCPD, nas doses 100 ng, 500 ng e 1000 ng, não alterou a atividade locomotora dos ratos, o que pode ser constatado pela ausência de diferença significativa entre as doses no parâmetro distância percorrida [F(3,36) = 1,91; p =0,146] (tabela 3).

Já com relação aos índices de ansiedade avaliados no CA, a ANOVA demonstrou que não houve diferença significativa entre os grupos para as variáveis: número de entradas no centro [F(3,36) = 1,73; p = 0,178], tempo no centro [F(3,36) = 0,40; p = 0,747] e distância percorrida no centro [F(3,36) = 1,21; p = 0,321] (tabela 4).

Tabela 3 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre o índice de locomoção do CA. Comportamentos Dolasetron Salina 100 ng 500 ng 1000 ng Distância percorrida (m) 17,53 ±2,44 17,15 ±2,43 23,93 ±4,82 12,39 ±2,23

M = metros. Os dados representam a média ±EPM. N = 6-13. Análise estatística: ANOVA.

Tabela 4 - Efeito do dolasetron (100 ng, 500 ng e 1000 ng) microinjetado na SCPD de ratos sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no CA. Comportamentos Dolasetron Salina 100 ng 500 ng 1000 ng Nº entradas no centro 1,73 ±0,38 3,23 ±0,69 2,83 ±1,11 1,43 ±0,48

Tempo no centro (s) 2,80 ±0,63 4,40 ±1,49 4,65 ±1,52 4,73 ±2,11

Distância percorrida no centro 0,26 ±0,08 0,55 ±0,17 0,60 ±0,23 0,30 ±0,14 (m) S = segundos e M = metros. Os dados representam a média +EPM. N = 6-13. Análise estatística: ANOVA.

4.4 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO mCPBG NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO LCE.

Os efeitos da microinjeção de mCPBG sobre os parâmetros convencionais de ansiedade podem ser visualizados na figura 12. Através da análise de variância ANOVA notou-se que houve diferenças significativas entre os grupos para porcentagens de entradas [F(3,34) = 3,85; p = 0,019] e tempo [F(3,34) = 3,15; p= 0,039] nos braços abertos. Em seguida, o teste de post hoc de Duncan especificou essas distinções demonstrando que os tratamentos com as doses de 10 µg e de 5 µg promoveram o aumento das porcentagens de entrada e tempo nos braços abertos, comparando-se os valores correspondentes ao grupo controle. Assim, para essas doses, o mCPBG promoveu efeito ansiolítico em ratos. Já a dose de 2,5 µg não diferiu de forma significativa do controle.

Já com relação à outras medidas espaço-temporais, como a frequência [F(3,34) = 4,86; p = 0,007] e tempo [F(3,34) = 3,15; p = 0,039] nos braços abertos, a 46

análise demonstrou que há diferenças significativas entre os grupos. De forma semelhante às variáveis anteriores, o teste de Duncan revelou que as doses de 10 µg e de 5 µg promoveram aumento da frequência e tempo nos braços abertos, ao passo que a dose de 2,5 µg não alterou esses comportamentos (tabela 5).

Para as medidas etológicas, a análise estatística ANOVA não demonstrou diferenças significativas entre os grupos para todos os parâmetros avaliados: postura de esticar o corpo protegido (PEC) [F(3,34) = 1,28; p = 0,295] e retorno aos braços fechados (RBF) [F(3,34) = 0,38; p = 0,763] (tabela 6).

Por fim com relação à atividade locomotora, a análise de variância ANOVA indicou que nenhum dos grupos diferiu significativamente no parâmetro número de entradas nos braços fechados [F(3,34) = 1,72; p = 0,182] e que houve diferença significativa entre os grupos para o numero total de entradas [F(3,34) = 3,19; p = 0,037]. Contudo, o teste de post hoc de Duncan demonstrou que os grupos tratados não se distinguiam estatisticamente do grupo salina, de modo que a diferença observada na ANOVA se referia apenas a uma distinção entre os grupos que receberam as doses de mCPBG. Portanto, a microinjeção do mCPBG não promoveu alteração locomotora nos animais tanto para o número total de entradas quanto para o número de entradas nos braços fechados, quando comparado ao controle (tabela 5).

Figura 12. Efeito do mCPBG (2,5 µg, 5 µg e 10 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre a porcentagem de entradas (fig. 9A) e tempo (fig. 9B) nos braços abertos do LCE. Os dados representam a média ±EPM. N = 08-09. Análise estatística: ANOVA seguida de teste de Duncan. * P < 0,05 comparado ao grupo salina.

Fig.9B Fig.9A 50 30 * * * 40 *

20 30

20 % tempo

% entrada 10

nos braços abertos braços nos nos braços abertos braços nos

0 0

5µg 5µg 10µg 2,5µg 10µg Salina 2,5µg Salina mCPBG mCPBG

Tabela 5 - Efeito do mCPBG (2,5 µg, 5 µg e 10 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre o número de entradas e tempo nos braços abertos (valores absolutos), número de entradas nos braços fechados e número total de entradas do LCE. Comportamentos mCPBG Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg Nº entradas braços abertos 3,88 ±0,69 3,89 ±1,11 7,56 ±0,88* 7,22 ±0,89* Tempo braços abertos (s) 54,00 ±11,33 60,56 ±17,47 103,44 ±15,58* 109,56 ±17,99* Nº entradas braços fechados 8,50 ±0,82 6,22 ±0,68 7,00 ±0,62 7,33 ±0,71 Nº total de entradas 24,50 ±2,63 20,89 ±2,35 29,22 ±1,53 29,11 ±2,49 S = segundos. Os dados representam a média ±EPM. N = 08-09. Análise estatística: ANOVA seguida de teste de Duncan. * P < 0,05 comparado ao grupo salina.

Tabela 6 - Efeito do mCPBG (2,5 µg, 5 µg e 10 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre os índices etológicos do LCE. Comportamentos etológicos mCPBG Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg

PEC 1,00 ±0,50 0,67 ±0,33 0,22 ±0,22 0,22 ±0,22

RBF 0,75 ±0,31 0,33 ±0,33 0,33 ±0,24 0,44 ±0,34

PEC = postura de esticar o corpo protegido e RBF = retorno aos braços fechados. Os dados representam a média +EPM. N = 08-09. Análise estatística: ANOVA.

4.5 EXPERIMENTO 02: OS EFEITOS DA MICROINJEÇÃO DO mCPBG NA SCPD DE RATOS SUBMETIDOS AO CA.

Após a análise de variância ANOVA, nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos para a variável distância percorrida, a qual avalia a atividade locomotora dos animais no CA [F(3,20) = 1,74; p = 0,195] (tabela 7).

Com relação aos índices de ansiedade avaliados no CA, a ANOVA seguida do teste de Duncan também demostrou não haver diferenças significativas entre os grupos para todas as variáveis testadas: número de entradas no centro [F(3,20) = 0,92; p = 0,449], distância percorrida no centro [f(3,20) = 0,12; p = 0,944] e tempo no centro [f(3,20) = 1,72; p = 0,199] (tabela 8).

Tabela 7 - Efeito do mCPBG (10 µg, 5 µg e 2,5 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre o índice de locomoção do CA. Comportamentos mCPBG Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg

Distância percorrida (m) 16,64 ±2,88 19,50 ±6,17 15,12 ±2,00 25,11±1,26

Os dados representam a média +EPM. N = 05-06. Análise estatística: ANOVA.

Tabela 8 - Efeito do mCPBG (10 µg, 5 µg e 2,5 µg) microinjetado na SCPD de ratos sobre os parâmetros de ansiedade avaliados no CA Comportamentos mCPBG Salina 2,5 µg 5 µg 10 µg Nº entradas no centro 2,20 ±0,73 2,20 ±0,37 3,60 ±0,68 3,67 ±1,20

Tempo no centro (s) 1,18 ±0,39 5,96 ±2,19 4,26 ±1,01 4,02 ±1,57

Distância percorrida no centro 0,44 ±0,16 0,46 ±0,15 0,48 ±0,08 0,73 ±0,27 (m) Os dados representam a média +EPM. N = 05-06. Análise estatística: ANOVA.

5 DISCUSSÃO

O objetivo desse trabalho foi investigar a função dos receptores 5-HT3 presentes na SCPD na modulação de comportamentos relativos à ansiedade experimental produzidos pela exposição de ratos ao LCE.

No experimento 1 foi possível constatar que o dolasetron, um antagonista seletivo de receptores 5-HT3 (Ki: 20,03 ±6,58 nM) (MILLER ET AL.,1993; BOEIJINGA ET AL., 1992), para todas as doses testadas, não modificou os comportamentos relativos à ansiedade no LCE e no CA, e que essa ausência de efeitos não está relacionada às alterações na locomoção do animal. Com relação à avaliação etológica do comportamento no LCE, como o retorno aos braços fechados (RBF) e a postura de esticar o corpo (PEC), a mesma tem se mostrado uma ferramenta auxiliar na interpretação dos resultados relativos à ansiedade no LCE (RODGERS; JOHNSON, 1995; GRIEBEL, 1997). Assim, a microinjeção do dolasetron na SCPD, para todas as doses testadas, não alterou de forma significativa os valores do PEC protegido e do RBF, ratificando os resultados obtidos com as análises convencionais do LCE. Com isso, é possível inferir que, nas condições experimentais aqui descritas, a ativação do receptor 5-HT3 parece não estar sendo requerida para a execução dos comportamentos relativos à ansiedade gerados pela exposição ao LCE.

Em outro estudo demonstrou-se que a microinjeção isolada de um antagonista

(ondansetron) e de um agonista (mCPBG) do receptor 5-HT3 na SCP de camundongos produziu efeito ansiogênico e ausência de efeito, respectivamente, no LCE (SILVA, 2009). Tendo em vista a ausência de efeito para o agonista, investigou- se se haveria alguma interação entre os receptores 5-HT3 e 5-HT2 da SCP com relação à ansiedade avaliada no LCE. Com isso, demonstrou-se que a microinjeção prévia do ondansetron na SCP bloqueou o efeito ansiolítico do agonista do receptor

5-HT2B/2C mCPP, observado quando o mesmo foi microinjetado isoladamente na SCP de camundongos (SILVA, 2009). Assim, os autores sugeriram que poderia existir uma interação entre os receptores 5-HT3 e 5-HT2B/2C da SCP na modulação da ansiedade de camundongos avaliada no LCE (SILVA, 2009). 50

Os resultados obtidos por Silva e colaboradores (2009) diferenciaram-se do obtido nesse trabalho e a razão para essa distinção pode estar assentada no emprego de espécies de animais diferentes e condições metodológicas distintas, os quais podem influenciar as respostas comportamentais e os efeitos farmacológicos observados no LCE (CAROBREZ; BERTOGLIO, 2005). Como exemplo, no presente trabalho utilizou-se um LCE de madeira e luz vermelha de baixa intensidade para a iluminação da sala experimental, enquanto que no estudo supracitado foi utilizado um LCE feito de vidro transparente e luz branca de baixa intensidade (77 lux). Nesse sentido, foi observado que o diazepam produziu efeito ansiolítico mais contundente, quando administrado perifericamente em ratos submetidos a condições experimentais de baixa luminosidade (luz vermelha) e testados no LCE com braços fechados de madeira do que quando submetido a outras condições experimentais (braços fechados de material transparente com luz de alta ou baixa intensidade e braços fechados de material opaco com luz de alta intensidade) (VIOLLE, 2009). Assim, as condições experimentais empregadas no presente estudo estão de acordo com as escolhas metodológicas citadas acima, as quais favoreceram o efeito ansiolítico do Diazepam. Além disso, Silva e colaboradores (2009) realizaram a microinjeção dos ligantes do receptor 5-HT3 em uma região não especificada da SCP o que poderia gerar resultados variados, uma vez que a SCP é dividida em quatro colunas paralelas ao aqueduto de Sylvius, que podem apresentar funções distintas (CARRIVE, 1993; LINNMAN ET AL., 2012; BRANDÃO ET AL, 2003; VIANNA; LANDEIRA-FERNANDEZ; BRANDÃO, 2001).

Curiosamente, de forma semelhante aos resultados obtidos com o dolasetron, a microinjeção isolada de outros antagonistas serotonérgicos na SCPD, como os antagonistas dos receptores 5-HT2A/2C (espiperona e ketanserina) e 5-HT1A (NAN- 190), também não alterou o comportamento de ratos avaliados no teste da estimulação elétrica da SPCD (NOGUEIRA; GRAEFF, 1995; SCHÜTZ; AGUIAR;

GRAEFF, 1985). Contudo, quando os antagonistas dos receptores 5-HT2A/2C e do 5-

HT1A foram microinjetados antes dos agonistas do receptor 5-HT2 (DOI) e do 5-HT1A (8-OH-DPAT), respectivamente, ou da própria serotonina, conseguiam reverter o efeito antiaversivo dos agonistas (NOGUEIRA; GRAEFF, 1995; SCHÜTZ; AGUIAR; GRAEFF, 1985). Além disso, o mesmo foi observado em modelos etológicos quando a microinjeção isolada dos antagonistas dos receptores 5-HT1A, 5-HT2A e 5-HT2C 51

também não produziu efeitos no LTE; contudo a microinjeção prévia desses antagonistas conseguiu bloquear o efeito antiaversivo da serotonina sobre a fuga no LTE (SOARES; ZANGROSSI, 2004). É importante salientar que a fuga observada no modelo de estimulação elétrica da SCPD e no LTE vem sendo relacionada ao TP e configura-se como um modelo para o estudo representativo desse transtorno (SCHENBERG ET AL., 2001; GRAEFF; NETTO; ZANGROSSI, 1998). Em outro trabalho, a microinjeção de um antagonista do receptor 5-HT1A (WAY-100135) na SCPD de ratos também não alterou os índices de ansiedade do LCE (MORAES; BERTOGLIO; CAROBREZ, 2008). O mesmo ocorreu com a microinjeção da ketanserina (antagonista de receptor 5-HT2A/2C) na SCP de camundongos avaliados no LCE (NUNES-DE-SOUZA ET AL., 2008). Portanto, os resultados obtidos por esses autores, juntamente com os encontrados nesse trabalho, reforçam a ideia de que a serotonina realiza um controle regulatório fásico sobre os neurônios da SCPD. Ou seja, a ativação dos receptores serotonérgicos da SCPD, inclusive o receptor 5-

HT3, parece não se realizar de forma contínua na modulação de respostas de ansiedade (GRAEFF, 2004; GRAEFF, 2002).

Com relação aos estudos que empregaram a administração periférica de antagonistas do receptor 5-HT3 observaram-se alguns resultados contraditórios. De fato, a administração periférica do zacopride, do BRL 46470, do tropisetron, do MDL

72222, do granisetron ou do ondansetron (antagonistas de receptor 5-HT3) não promoveu efeitos relacionados à ansiedade em ratos testados no LCE (SETEM ET AL, 1999; FILE; JOHNSTON, 1989; WRIGHT, 1992; GRIEBEL ET AL., 1997) e no TIS (FILE; JOHNSTON, 1989), ao passo que administração intraperitoneal ou oral desses antagonistas gerou efeitos ansiolíticos em outros estudos empregando tanto o LCE (DUNN; CARLEZON; CORBETT, 1991; ANDREWS; FILE, 1993; BLACKBURN ET AL, 1993; FILIP ET AL, 1992) quanto o TIS (DUNN; CARLEZON; CORBETT, 1991; BLACKBURN ET AL, 1993; JONES, 1988). Além disso, ratos administrados perifericamente com o BRL46470 e o Y-25130 (antagonistas do receptor 5-HT3) também exibiram efeito ansiolítico quando testados no LTE (GARGIULO ET AL, 1996) e no labirinto em zero elevado (BELL ET AL, 2014).

Assim, os dados obtidos no presente estudo sugerem que os receptores 5-HT3 da SCPD provavelmente não estão envolvidos com os efeitos ansiolíticos observados com a administração periférica de antagonistas do receptor 5-HT3 em ratos. 52

Uma questão interessante é o fato de que o LCE é tido como um modelo misto, pois o animal pode emitir diferentes reações de defesa, como a esquiva e a fuga dos braços abertos, ao percorrer livremente o labirinto. Assim, sabendo-se que as vias serotonérgicas estão relacionadas à modulação dessas reações de defesa, o efeito dos fármacos sobre os receptores serotonérgicos poderia variar de acordo com a predominância ou não de uma determinada reação de defesa durante o teste (GRAEFF, 2002; HANDLEY, 1993). Do ponto de vista desse trabalho, a ausência de efeito do dolasetron também poderia ser explicada pelos múltiplos comportamentos de defesa que poderiam ocorrer no LCE. Sendo assim, sob essa ótica, seria pertinente verificar os efeitos do dolasetron no LTE, um modelo que permite avaliar dois comportamentos de defesa separadamente num mesmo animal (esquiva inibitória e a fuga), a fim de confirmar os resultados obtidos no LCE.

Em relação especificamente aos ligantes do receptor 5-HT3, somando-se ao fato sugerido acima, é possível que a ausência de efeito do dolasetron no presente estudo também possa estar relacionada a uma maior afinidade do dolasetron por uma determinada subunidade do receptor 5-HT3. De fato sabe-se que o receptor 5-

HT3 é um canal iônico constituído por cinco subunidades dispostas ao redor de um poro central, cujo arranjo pode variar de acordo com a presença ou não de alguma das diferentes subunidades já identificadas (5-HT3A, 5-HT3B, 5-HT3C, 5-HT3D e 5- HT3E) (WALSTAB; RAPPOLD; NIESLER, 2010). Além disso, já foi demonstrado que para estabelecer uma configuração funcional é necessário que ao menos a subunidade 5-HT3A esteja presente no receptor. Assim, é possível formar receptores homoméricos constituídos apenas da subunidade 5-HT3A e receptores heteroméricos constituídos pela combinação de uma subunidade 5-HT3A com outra de tipo diferente (LUMMIS, 2012; NIESLER ET AL., 2007).

É interessante notar que, através da técnica de ensaio de ligação do ligante

(ligand binding assay), a afinidade do mCPBG, um agonista do receptor 5HT3, ou da própria serotonina é diferente entre os receptores homoméricos contendo subunidade 5-HT3A (mCPBG: 0,15 µM e serotonina: 0,42 µM) e receptores heteroméricos formados pelas subunidades 5-HT3A e 5-HT3B (mCPBG: 0,43 µM e serotonina: 2,69 µM), sendo essa afinidade maior entre os integrantes do primeiro tipo de receptor (THOMPSON; LUMMINS, 2013). O mesmo foi observado para um antagonista do receptor 5-HT3, o VUF10166, que também apresentou afinidades 53

distintas entre os receptores homopentâmeros formados pelas subunidades 5-HT3A (Ki: 0,04 nM) e heteropentâmeros que continham as subunidades 5-HT3A e 5-HT3B (Ki: 22 nM), sendo essa afinidade muito superior em receptores homoméricos (THOMPSON ET AL., 2012). Assim, tendo em vista a variedade de subunidades existentes e os diferentes resultados obtidos entre receptores homoméricos e heteroméricos, seria interessante investigar quais subtipos de receptor 5-HT3 estão presentes na SCPD de ratos e promover ensaios de ligação do ligante envolvendo o dolasetron e esses subtipos identificados, a fim de assegurar que a ausência de efeito do dolasetron não esteja relacionada a uma maior afinidade desse antagonista por um subtipo de receptor que não esteja presente na SCPD.

Já com relação às administrações intracérebro de antagonistas do receptor

5HT3 tem-se observado resultados variados de acordo com a região em que eles foram administrados. Dessa forma, com relação à amígdala, os antagonistas ondansetron, MDL 72222 e tropisetron causaram efeito ansiolítico em ratos testados no TIS, ao passo que a microinjeção da serotonina ou do agonista do receptor 5-

HT3, o 2-Me 5-HT, causou efeito ansiogênico nesse mesmo teste (HIGGINS ET AL., 1991). Em camundongos, foi possível constatar que o ondansetron e o mCPBG

(agonista de receptor 5-HT3) microinjetados na amígdala causaram efeitos ansiolítico e ansiogênico, respectivamente, no LCE. Além disso, a microinjeção prévia do ondansetron seguida da injeção local do mCPBG foi capaz de reverter o efeito ansiogênico gerado por esse agonista quando microinjetado isoladamente na amígdala de camundongo (LAINE, 2010). Com esses resultados, foi possível inferir que a serotonina através da ativação de receptores 5-HT3 parece contribuir com o seu efeito ansiogênico na amígdala. Além disso, esses resultados corroboram alguns estudos com administração periférica que atribuíram efeito ansiolítico aos antagonistas de receptores 5-HT3 (LAINE, 2010; HIGGINS ET AL., 1991). Por outro lado, quando antagonistas do receptor 5-HT3 foram microinjetados no NDR de ratos não alteraram os parâmetros de ansiedade no TIS (HIGGINS ET AL., 1991). O mesmo foi observado após a microinjeção do ondansetron e tropisetron no NMR, núcleo accumbens, caudado e putâmen de camundongos avaliados teste de transição claro e escuro (COSTAL ET AL., 1989b) o que leva a sugestão de que o efeito ansiolítico observado pela administração periférica de antagonistas do receptor 5-HT3 se deva à sua atuação sobre receptores 5-HT3 da amígdala. 54

Com relação ao experimento 2, a microinjeção do mCPBG, um agonista seletivo dos receptores 5-HT3 (KILPATRICK ET AL, 1990), nas doses de 5 µg e de 10 µg, na SCPD produziu efeito ansiolítico por meio do aumento da porcentagem de entrada e de tempo nos braços abertos do LCE, assim como nos seus respectivos valores absolutos. Além disso, os animais testados com essas doses não demonstraram alterações nos parâmetros de locomoção no LCE e no CA, de maneira que os efeitos ansiolíticos observados não estão relacionados às alterações locomotoras do animal. Com relação às medidas etológicas avaliadas no LCE, houve diminuição, porém não significativa, da quantidade de PEC protegido e RBF realizados pelos animais, sendo essa diminuição mais acentuada para o PEC nas doses de 5 µg e de 10 µg. Essa diminuição é sugestiva de um perfil ansiolítico, que concorda com os efeitos ansiolíticos das medidas clássicas obtidas para essas doses.

Em relação aos parâmetros de ansiedade avaliados no CA, não houve diferenças significativas para todas as doses de mCPBG testadas quando comparadas ao grupo salina. A diferença de resultados entre o LCE (efeito ansiolítico) e o CA (ausência de efeito), para as doses de 5µg e de 10µg pode ter ocorrido em virtude da possibilidade desses modelos produzirem tipos de ansiedade diferentes (CAROLA, 2002; GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Um fato interessante é que o CA também é afetado por alterações nas condições experimentais como, por exemplo, a idade do animal e a iluminação da sala experimental (PENG ET AL, 1994; BOUWKNECHT ET AL, 2007). Com relação à iluminação, assim como no LCE, níveis baixos de luz são menos aversivos ao animal do que a luz de alta intensidade (HALL ET AL, 2000; BOUWKNECHT ET AL, 2007) e, nesse trabalho, foi utilizada a luz branca (de intensidade maior do que a luz vermelha usada no LCE) durante a execução do CA. Portanto, sabendo-se que a luz de alta intensidade não seria um interferente para detecção de drogas ansiolíticas (HOOG, 1996) e que mCPBG produziu efeito ansiolítico no LCE, é possível que essa variação na quantidade de iluminação não tenha alterado o resultado. Além disso, foi possível notar que o mCPBG, para todas as doses testadas, aumentou o tempo em que o animal passou na região central do CA. Assim, esse resultado reforça o efeito ansiolítico das doses de 5µg e de 10µg observado no LCE, apesar do aumento do valor dessa variável não ter sido significativo. 55

Nesse contexto, as administrações intracérebro foram uma ferramenta imprescindível para o aprofundamento dos conhecimentos acerca do papel do sistema serotonérgico na fisiopatologia da ansiedade. Assim, alguns autores demonstraram que a serotonina na SCPD tem uma função antiaversiva na modulação da fuga causada pela estimulação elétrica da SCPD (NOGUEIRA; GRAEFF, 1995) e pela exposição ao LTE (ZANOVELI; NOGUEIRA; ZANGROSSI, 2003) e que, além disso, anormalidades nesse sistema poderiam estar relacionadas ao TP (GRAEFF; NETTO; ZANGROSSI, 1998). Por outro lado, foi visto que a serotonina na SCPD também produziu efeito ansiogênico na tarefa de esquiva inibitória do LTE (ZANOVELI; NOGUEIRA; ZANGROSSI, 2003) e que desequilíbrios nesse sistema poderiam estar relacionados ao TAG (GRAEFF; NETTO; ZANGROSSI, 1998). Assim, a partir dos resultados obtidos pelos autores supracitados, foi possível depreender que a SCPD não é uma estrutura exclusivamente relacionada ao pânico (reações de fuga), como a princípio se pensou, mas também com a ansiedade.

Esse elo entre a ansiedade e o sistema serotonérgico da SCPD também foi revelado nesse trabalho, através do efeito ansiolítico produzido pelo mCPBG microinjetado na SCPD de ratos testados no LCE.

De maneira similar aos resultados obtidos nesse estudo com o agonista do receptor 5-HT3 (mCPBG), a microinjeção do agonista do receptor 5-HT1A (8-OH- DPAT) na SCPD de ratos produziu efeito ansiolítico no parâmetro de esquiva inibitória do LTE, o qual foi revertido pela microinjeção prévia do antagonista do receptor 5-HT1A (WAY 100135) (SOARES; ZANGROSSI, 2004). Por outro lado, a microinjeção de um agonista seletivo do receptor 5-HT2C, o MK-212, na SCPD de ratos gerou efeito ansiogênico no LTE o qual foi bloqueado pela microinjeção prévia de um antagonista seletivo do receptor 5-HT2C (YAMASHITA; BORTOLI;

ZANGROSSI, 2011). Assim, os receptores 5-HT3 e 5-HT1A parecem modular respostas similares relativas à ansiedade na SCPD (efeito ansiolítico), as quais são opostas a dos receptores 5-HT2C (efeito ansiogênico) (ZANOVELI; NOGUEIRA; ZANGROSSI, 2003).

É interessante ressaltar que a afinidade do mCPBG é consideravelmente maior por receptores 5-HT3 do que por outros subtipos de receptores serotonérgicos, 56

sendo necessário uma concentração 1000 vezes maior de mCPBG para que o mesmo se ligue a receptores 5-HT1A e 5-HT2 (IC50 do mCPBG para os receptores 5-

HT3: 1,47 ±0,07nM, 5-HT1A: 10µM e 5-HT2: 10µM) (KILPATRICK ET AL., 1990).

Contudo, ainda que o mCPBG apresente elevada afinidade por receptores 5-HT3, seria pertinente avaliar o efeito da microinjeção combinada do antagonista

(dolasetron) com o agonista (mCPBG) do receptor 5-HT3 na SCPD de ratos testados no LCE, a fim de ratificar o envolvimento do receptor 5-HT3 na ação ansiolítica do mCPBG.

Tendo em vista o exposto acima, uma possível explicação para efeito ansiolítico do mCPBG microinjetado na SCPD poderia residir na relação entre receptores 5-HT3 e os interneurônios GABAérgicos.

Sabe-se que a utilização de benzodiazepínicos (BDZs) no tratamento de enfermidades relativas à ansiedade (principalmente o TAG, mas também o TP), pôs em destaque o mais ubíquo sistema de neurotransmissão inibitório, o sistema

GABAérgico. Os BDZs, ao atuarem nos receptores GABAA (um dos receptores desse sistema), potencializam a ação do neurotransmissor GABA, cujo um dos efeitos consiste em ligar-se a esse receptor e causar a hiperpolarização da célula, através de um influxo de cloro para o interior da mesma, gerando a inibição da excitabilidade celular (DAVIDSON, 2004; SUSMAN; KLEE, 2005; RICKELS; RYNN, 2002; ATACK, 2005).

Dentro desse contexto, já foi demonstrado que interneurônios GABAérgicos estão presentes em estruturas consagradamente relevantes para a fisiologia da ansiedade, tais como: a SCPD, o hipocampo e a amígdala (MILLAN, 2003; SPAMPANATO; POLEPALLI; SAH, 2011; KULLMANN, 2011; DEPAULIS; BANDLER, 1991; REICHLING, 1991). Além disso, estudos pré-clínicos vêm mostrando a relevância desse sistema para a ansiedade. De fato, já foi constatado que a microinjeção de um agonista BZD (midazolam) na SCPD gerou efeito ansiolítico em ratos testados no LCE (MOTTA; BRANDÃO, 1993; RUSSO, 1993) e que a microinjeção prévia de um antagonista BZD (flumazenil) foi apta em reverter esse efeito ansiolítico, sugerindo que os receptores GABAérgicos da SCPD podem estar participando de mecanismos relacionados à ansiedade nessa região (RUSSO, 1993). 57

Alguns trabalhos utilizando técnicas de imuno-histoquímica e hibridização têm demonstrado a presença de receptores 5-HT3 em internêuronios GABAérgicos da amígdala, do hipocampo, da região septal, do córtex e do córtex olfatório. (MORALES; BLOOM, 1997; JAKAB; GOLDMAN-RAKIC, 2000). Somado à disso, em outros trabalhos utilizando técnicas eletrofisiológicas in vitro, demonstrou-se que a serotonina facilita a transmissão sináptica inibitória por aumentar a liberação de

GABA através da ativação de receptores 5-HT3 presentes em interneurônios GABAérgicos do hipocampo, amígdala e giro dentado (ROPERT; GUY, 1991; McMAHON; KAUER, 1997; PIGUET; GALVAN 1994; KOYAMA ET AL, 2000; KOYAMA, 2002; KATSURABAYASHI, 2003). Em estudos empregando técnicas eletrofisiológicas bastante conceituadas, como o patch clamp, foi possível demonstrar que esse aumento da liberação de GABA no terminal era consequência da atuação da serotonina em receptores 5-HT3 pré-sinápticos dos interneurônios GABAérgicos do hipocampo e da amígdala, e que o influxo de cálcio gerado pela ativação do receptor facilitava a exocitose das vesículas contendo GABA (KATSURABAYASHI, 2003; TURNER; MOKLER; LUEBKE, 2004; KOYAMA, 2002; KOYAMA, 2000). De fato sabe-se que o Ca+2 é um cátion imprescindível para a exocitose de vesículas contendo neurotransmissores (SÜDHOF, 1995). Tendo em vista esses resultados, pode-se inferir que a serotonina, ao ligar-se aos receptor 5-

HT3 de interneurônios GABAérgicos, facilitaria a liberação do GABA, favorecendo as sinapses inibitórias das quais participe, atribuindo-se à serotonina, dessa forma, o papel de moduladora da circuitaria inibitória dessas regiões.

Assim, em suma ao que foi descrito até agora, viu-se que a potencialização do sistema GABAérgico gera efeito ansiolítico quando BZDs são microinjetados na SCPD e que a terapia com BZD é efetiva no tratamento dos transtornos de ansiedade. Além disso, já foi visto que os BZDs de alta potência, como o alprazolam, são eficazes no tratamento do TP, afecção correlacionada à SCPD (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005; MELLO, 2006). Além disso, viu-se que a SCP contém receptores 5-HT3 e interneurônios GABAérgicos (na sua porção dorsal), e tendo em vista que há sobreposição dos receptores 5-HT3 nos interneurônios GABAérgicos em diversas estruturas límbicas já citadas, é plausível sugerir que os receptores 5-HT3 da SCP também possam estar localizados em interneurônios GABAérgicos da SCPD. Portanto, transferindo tal raciocínio para o universo desse 58

trabalho, o efeito ansiolítico observado após a microinjeção do mCPBG nas doses de 5µg e de 10µg poderia ser fruto do efeito do agonista em receptores 5-HT3 presentes em interneurônios GABAérgicos da SCPD. Isso favoreceria as sinapses inibitórias, tal como os BZDs, que por um caminho diferente, também facilitam essas sinapses ao potencializar o efeito do GABA em receptores GABAA.

De maneira interessante, já foi demonstrado, por meio de técnicas de imuno- histoquímica, que outro subtipo de receptor serotonérgico, o 5-HT2A, está presente em neurônios GABAérgicos da SCPD. Além disso, essa colocalização foi observada ao longo de todo o eixo rostrocaudal da SCP, sendo superior a 70%. Dessa forma, foi possível constatar que uma grande quantidade de neurônios GABAérgicos da

SCP expressam receptores 5-HT2A (GRIFFITHS; LOVICK, 2002).

Sendo assim, com o intuito de aprofundar os estudos realizados nesse trabalho seria interessante comprovar a presença dos receptores 5-HT3 nos interneurônios GABAérgicos da SCPD, através de técnicas de imuno-histoquímica. Além disso, também seria interessante realizar a microinjeção combinada de um antagonista do receptor GABAA e de um agonista do receptor 5-HT3 (mCPBG) na SCPD, a fim de verificar se o bloqueio dos receptores GABAA dessa região interfere no efeito ansiolítico observado com a microinjeção do mCPBG na porção dorsal da SCP de ratos testados no LCE.

6 CONCLUSÃO

Tendo em vista os resultados obtidos nesse trabalho, foi possível constatar que a microinjeção dos dois ligantes serotonérgicos empregados geraram resultados diferentes no LCE. O dolasetron, antagonista do receptor 5-HT3, quando microinjetado na SCPD, nas doses de 100ng, 500ng e 1000ng, não alterou os comportamentos relativos à ansiedade de ratos avaliados no LCE e CA e esta ação não foi influenciada por alterações na locomoção do animal. Já a microinjeção do mCPBG (agonista do receptor 5-HT3) na SCPD, nas doses de 5µg e de 10µg, reduziu os comportamentos relacionados à ansiedade no LCE sem promover alteração na atividade locomotora. Portanto, os resultados obtidos nesse estudo sugerem que a ativação dos receptores 5-HT3, presentes na SCPD, modulam um efeito ansiolítico no LCE.

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