MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
INIBIÇÃO DA FUNÇÃO REDOX DE APE1/REF-1 E SUA INFLUÊNCIA NA REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL EM UM MODELO DE ESTIMULAÇÃO INFLAMATÓRIA
FABRÍCIA LIMA FONTES
NATAL/RN FABRÍCIA LIMA FONTES
INIBIÇÃO DA FUNÇÃO REDOX DE APE1/REF-1 E SUA INFLUÊNCIA NA REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL EM UM MODELO DE ESTIMULAÇÃO INFLAMATÓRIA
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde com habilitação em Biologia Molecular e Imunogenética.
Orientador: Profª. Drª. Lucymara Fassarella Agnez Lima
FICHA CATALOGRÁFICA
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Cataloga çã o de Publica çã o na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Sa úde - CCS
Fontes, Fabricia Lima. Inibi çã o da fun çã o redox de APE1/REF-1 e sua influ ência na regula çã o transcricional em um modelo de estimula çã o inflamat ória / Fabricia Lima Fontes. - Natal, 2016. 172f.: il.
Tese (Doutorado em Ci ências da Sa úde)-Programa de P ós-Gradua çã o em Ci ências da Sa úde, Centro de Ci ências da Sa úde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Orientadora: Profa. Dra. Lucymara Fassarella Agnez Lima.
1. APE1/REF-1 - Tese. 2. Reparo de DNA - Tese. 3. Regula çã o da transcri çã o - Tese. 4. Inflama çã o - Tese. 5. Biog ênese ribossomal - Tese. I. Lima, Lucymara Fassarella Agnez. II. T ítulo.
RN/UF/BSCCS CDU 615.015
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:
Prof. Dr. Eryvaldo Socrates Tabosa do Egito
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FABRÍCIA LIMA FONTES
INIBIÇÃO DA FUNÇÃO REDOX DE APE1/REF-1 E SUA INFLUÊNCIA NA REGULAÇÃO TRANSCRICIONAL EM UM MODELO DE ESTIMULAÇÃO INFLAMATÓRIA
Aprovada em: 09 de Dezembro de 2016
BANCA EXAMINADORA
Lucymara Fassarella Agnez Lima – (Orientador e Presidente da Banca)
Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN
Andre Ducati Luchessi – (Membro interno 1)
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas - DACT
Riva de Paula Oliveira – (Membro interno 2)
Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN
Carlos Renato Machado – (Membro externo 1)
Departamento de Bioquímica e Imunologia –UFMG
Jenifer Saffi – (Membro externo 2)
Departamento de Ciências Básicas da Saúde/Bioquímica- UFCSPA
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AGRADECIMENTOS
Um dos meus maiores desafios durante o desenvolvimento dessa Tese foi agradecer todas as pessoas que fizeram parte da minha trajetória de 12 anos na UFRN que vai desde a minha graduação em Farmácia e hoje finaliza com o Doutorado em Ciências da Saúde. Inicio agradecendo a Deus por sempre me fazer enxergar que com muito esforço, amor e dedicação tudo é possível. À minha orientadora Professora Lucymara Fassarella pela paciência, colaboração, me fazer enxergar a importância do meu trabalho e principalmente por sempre me induzir ao pensamento crítico. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao CNPq pelo suporte financeiro. Agradeço às professoras Tirzah Lajus e Julliane Tamara pelas colaborações científicas no meu trabalho ao longo desses anos e pelas inúmeras oportunidades que me foram oferecidas. Agradeço pelas parcerias a todos que fazem parte do Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), Instituto do Cérebro e Laboratório de Imunogenética da UFRN. À minha família, pela fé que sempre tiveram em mim, por lutarem para me dar uma educação digna e por aceitar e compreender a minha ausência ao longo desses anos. Obrigada a Solange Jácome, minha mãe, por ser o pilar da nossa família, por me oferecer a oportunidade de estudar e não ter medido esforços mesmo sem condições financeiras, para que eu e meu irmão pudéssemos ter uma profissão. Obrigada Lairton Fontes, meu pai, por todo amor incondicional e carinho que me oferece. Ao meu irmão Lairton Filho que foi meu alicerce por muitos anos fora de casa. Obrigada aos Tios, principalmente Jerry e Ariadna, Aluísio e Fátima por terem cuidado de mim nesses longos anos longe dos meus pais. Obrigada as meus primos Priscila, Gildácio, Aluisio Igor, Fabíola, Any Kelly, Arthur, Mabel, Larissa, Pedro, Bruna, Wilke, Hildérica e tantos outros não menos importantes por estarem andando um ao lado do outro, e sempre que necessário todos se apoiam. Agradeço em especial as minhas primas Letícia e Valentina que me
v mostraram da forma mais linda o que é amar. Agradeço aos meus Avós paternos Pedro Evaristo Fontes e Maria do Carmo Fontes, e meus Avós maternos Alexandre Jácome e Francisca Lima por serem exemplos de trabalho, força e respeito. Aos meus amigos de graduação que sempre foram meu porto seguro: Danúbia, Álamo, Ana Isabel, Carmem, Dária, Juliana Fernandes, Rodrigo e Marcelo Vitor, pelo apoio, companheirismo e sólida amizade que construímos. Agradeço ao Grupo da Meningite, que me mostrou que crescimento sólido só acontece quando se trabalha em equipe. Obrigada queridos Thayse, Leonam, Jule, Rayssa, Luiza, Ana Helena e em especial a Daniele e Thaís que nesses últimos anos foram meu braço direito. Agradeço aos meus queridos amigos do LBMG, dos 8 anos que estou no laboratório, que foram cruciais e meu suporte para que eu conseguisse dia após o outro conquistar o meu espaço e mesmo nos momentos de queda eles estavam lá para me estender a mão. Obrigada Aquiles, Lázaro, Angélica (Geka), Ana Rafaela (Lela), Jana, Marcos Felipe (Fifo), Wydemberg (Berg), Aline, Alaine, Mabela, Carolina (Carol) e Lucas. Aos queridos amigos itinerantes Amanda (UFRGS) e Jorge (portuga). Em especial para Rita, Sinara e Daniel, obrigada por fazerem meu doutorado ter dias mais leves. Meu ciclo de LBMG acaba aqui, mas tenho certeza que meu aprendizado tanto profissional como pessoal me abrirá muitas portas. Por fim, meu agradecimento mais profundo e especial só poderia ser dedicado ao meu esposo Thiago Dantas. Obrigada por me esperar por esses longos anos, por respeitar meus objetivos de vida e ficar o tempo todo ao meu lado, mostrando o quanto eu era capaz, sempre me fazendo acreditar que eu chegaria ao final desse ciclo. Sou grata por cada feriado e final de semana perdido que você me acompanhava no laboratório, e mesmo quando foi morar longe por se sentir confortável quando eu ia visita-lo apenas com a minha presença, mesmo que eu passasse a noite inteira no computador analisando os meus dados. Sou grata por cada gesto carinhoso, por cada demonstração de força e agora ansiosa para construir a minha carreira ao seu lado.
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Desistir? Eu já pensei seriamente nisso, mas nunca me levei realmente a sério. É que tem mais chão nos meus olhos do que o cansaço nas minhas pernas, mais esperança nos meus passos, do que tristeza nos meus ombros, mais estrada no meu coração do que medo na minha cabeça.
Cora Coralina
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RESUMO
A endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1/REF-1) humana é uma enzima multifuncional que possui atividade de reparo de DNA e regulação transcricional, atuando como proteína reguladora de várias vias importantes para a homeostase e sobrevivência da célula. Este trabalho teve como objetivo caracterizar os efeitos da inibição da função redox de APE1/REF-1 em um modelo de inflamação. Como modelo experimental células U937 foram estimuladas com 1 µg/ml de LPS e submetidas a dois diferentes tratamentos com 100 µM de E3330, um inibidor seletivo da função redox de APE1/REF-1. Foi realizada uma cinética de estimulação com um pré-tratamento de 1 hora com LPS e subsequente tratamento com E3330 por 2, 4, 6, 24 e 48 horas. No segundo modelo as células foram estimuladas com LPS por 24 horas e em seguida foi adicionado o E3330 por mais 4 horas. Após os tratamentos foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão de moduladores inflamatórios, avaliação da apoptose e potencial de membrana. Foi realizado também uma análise de transcriptoma utilizando a plataforma 454 GS-FLX Titanium seguida de sua caracterização e categorização e analise de interação proteína-proteína a partir de ferramentas de bioinformática. Para a validação da expressão diferencial e dos modelos propostos foi realizado experimentos de qPCR, western blotting, ensaio de degradação do rRNA, ensaio de incisão do sítio AP utilizando oligos marcados. E por fim foi utilizada a ferramenta iRegulon para localizar os sítios putativos de ligação à fatores de transcrição (FT) nos genes alvo identificados. Os nossos resultados mostram que após 24 horas de estimulação de células U937 com LPS e tratamento subsequente com E3330 durante mais quatro horas não afeta significativamente a viabilidade das células e a razão de apoptose. No entanto, no modelo de cinética inflamatória, foi possível observar uma redução das células viáveis como consequência do tratamento após 48 horas. Verificou-se também uma diminuição significativa de moduladores inflamatórios em presença de E3330. Em relação análise de interação proteína-proteína foi possível observar que as categorias funcionais mais enriquecidas na rede regulada negativamente estão relacionadas com expressão gênica, resposta imune, tradução, processamento de rRNA e biogênese ribossomal. Já na rede regulada positivamente foi observado um
viii enriquecimento para transdução de sinal, resposta ao estresse, modificação da cromatina, resposta ao dano de DNA e regulação positiva da apoptose. Na quantificação de níveis proteicos foi possível observar uma diminuição estatisticamente significante após o tratamento com E3330 para c-Myc, NF- κB(p65), e um aumento da MDM2 de 60 kDa. No ensaio de integridade de rRNA foi observado uma diminuição da razão 28S/18S nas amostras tratadas com E3330 em torno de 12% e 20% em relação ao controle e LPS respectivamente. Todos esses achados são associados a inibição seletiva da função redox de APE1/REF-1, visto que no ensaio de incisão de sítio AP, a concentração de E3330 utilizada não foi capaz de inibir a função de reparo de DNA da proteína. De uma forma geral, para os genes da lista regulada negativamente, os FTs identificados com a ferramenta iRegulon são modulados por regulação redox, e a inibição com E3330 da APE1/REF-1 pode estar alterando a função dos mesmos e por isso diminuindo a expressão dos genes em questão. Assim, nesse trabalho é proposto que o bloqueio seletivo da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 leva a uma redução da resposta inflamatória, bem como uma diminuição nos mecanismos que promovem a biogênese ribossomal e processamento do rRNA sem alterar a sua função de APendonuclease.
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ABSTRACT
The human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 ( APE1/REF-1) is a multifunctional enzyme that plays a role in both DNA repair and transcription pathways, being considered a hub protein, controlling key pathways in cell homeostasis and survival. This study aimed to investigate the mechanism behind the inhibition of APE1/REF-1 redox activity using an inflammation model. As the experimental model, U937 cells were incubated with LPS at 1 µg/ml and submitted to two different treatments with 100 µM of E3330, which inhibits specifically the APE1/REF-1 redox function. Inflammation stimulation kinetics was performed with LPS for 1 hour, followed by treatment with E3330 for 2, 4, 6, 24 and 48 hours. In the second model the cells were stimulated with LPS for 24 hours and a subsequent treatment with E3330 for 4 hours. After the treatments, parameters such as cell viability; the expression patterns of inflammatory markers; apoptosis and mitochondrial membrane potential were assessed. The transcriptome analysis was performed using the 454 GS-FLX Titanium platform, followed by functional enrichment and protein-protein interaction networks (PPI) design based on the differentially expressed genes list. In parallel, to validate the transcriptome data and the cellular mechanisms proposed, qPCR, western blotting, rRNA degradation and AP site incision assays were carried out. In addition, searching for putative transcription factors (TFs) binding sites in target genes, the iRegulon tool was used. Our results showed that after stimulation with LPS for 24 hours, the treatment with E3330 for 4 hours did not cause significant variations in cell viability and apoptosis ratio. However, the results obtained using the inflammatory kinetics model showed that cell viability was reduced after treatment with E3330 for 48 hours. Regarding to PPI networks, it was noticed that the most enriched functional categories in the downregulated network were associated to gene expression, immune response, rRNA processing and ribosome biogenesis. On the other hand, biological processes such as signal transduction, stress response, chromatin modification, DNA damage response and positive regulation of apoptosis were the most representative pathways in the network unique to upregulated genes. The protein quantification showed that E3330 lead to the decrease of c-Myc and NF- κB(p65) levels, concomitantly to the increase in MDM2 60 kDa isoform levels.
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The rRNA integrity assay indicated a decrease of 12 and 20% in the 28S/18S ratio in samples treated with E3330 or LPS respectively. It is noteworthy that all of this finds resulted from the specific inhibition of APE/REF-1 redox activity, since the AP site incision assay confirmed that E3330 at the concentration tested was not able to inhibit APE/REF-1 repair function. In general, regarding to downregulated genes, the TFs are modulated by redox regulation and inhibition of this function by E3330 might alter the activity of these factors, leading to the noticed decrease in the expression of key genes. In this work, it was possible to determine which cellular events are regulated by APE1/REF-1 redox function and it was suggested that inhibition of this function by E3330 reduces the inflammatory response as well as promotes the inhibition of pathways associated to ribosome biogenesis and rRNA processing, without causing any disturbance in its APendonucleases function.
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LISTA DE ABREVIATURAS
8-oxoG = 8-oxoguanina AP= Apurínico/Apirimidinico AP-1 = Proteína Ativadora 1 APE1/REF-1 = Endonuclease Apurínica/Apirimidínica 1 BER = Base Excision Repair (Reparo por Excisão de Bases) E3330= (E) - 3 - (5, 6 - dimetoxi - 3 - metil - 1, 4 - dioxociclohexa - 2, 5 - dienil) - 2 - ácido nonilpropenóico EGR-1= Early growth response protein-1 ERN = Espécies Reativas de Nitrogênio ERO = Espécies Reativas de Oxigênio FTs= Fatores transcricionais GSH= Glutationa redutase HIF-1α= Hypoxia inducible factor-1α Ig = Imunoglobulina LP-BER= Long patch- BER LPS = Lipopolissacarídeo MB = Meningite Bacteriana MTX= Metoxiamina nCaRE= Negative calcium responsive elements NF-κB = Fator Nuclear kappa B NLS= Nuclear localization signal NO = Óxido Nítrico NPM1= Nucleophosmin 1 OGG-1= 8-oxoguanina Glicosilase PARP-1 = Poli-ADP- ribose polimerase-1 PTH= Parathyroid hormone PTM= Post-translational modification SN-BER= Single nucleotide-BER TLRs = Receptor Tool Like TNF-α = Fator de Necrose Tumoral Alfa Trx= Tiorredoxina TSH = Thyroid-stimulating hormone
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Funções de APE1/REF-1 em diferentes tipos de células 22 durante condições diversas de indução ao estresse.
Figura 2. Uma representação esquemática do reparo de bases 24 oxidadas no DNA pela via BER.
Figura 3. Representação esquemática dos sítios de modificações pós- 28 traducionais na sequência da APE1/REF-1.
Figura 4. Rede de interações da APE1/REF-1 humana. 31
Figura 5. O papel da APE1/REF-1 na manutenção da integridade do 36 genoma em resposta ao estresse oxidativo ou inibição por produtos sintéticos e naturais
Figura 6. Resumo ilustrativo do sequenciamento na plataforma 454. 43
Figura 7.Topologia de uma rede de interações proteínas-proteínas. 47
Figura 8. Método de exclusão pelo trypan blue para verificar a 57 viabilidade celular.
Figura 9. Porcentagem de células apoptóticas determinada pela 58 marcação com Anexina V-FITC/PI analisada por citometria de fluxo.
Figura 10. Quantificação de moduladores inflamatórios após cinética de 59 estimulação inflamatória.
Figura 11. Visão geral de genes diferencialmente expressos após o 61 tratamento com E3330
Figura 12. Validação do transcriptoma 62
Figura 13. Processo Biológico das listas de genes diferencialmente 63 expressos analisados pelo programa DAVID.
Figura 14. Componente Celular das listas de genes diferencialmente 64 expressos analisados pelo programa DAVID.
Figura 15. Função Molecular das listas de genes diferencialmente 65 expressos analisados pelo programa DAVID.
Figura 16. Anotação de vias metabólicas. 66
Figura 17. Biologia de Sistemas gerada a partir do banco de dados 67 STRING 9.0 e visualizada pelo Cytoscape. Topologia da rede regulada negativamente.
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Figura 18. Biologia de Sistemas gerada a partir do banco de dados 68 STRING 9.0 e visualizada pelo Cytoscape. Topologia da rede regulada positivamente.
Figura 19. Cluster 4 da rede negativamente regulada: 72
Figura 20. Cluster 9 da rede negativamente regulada 73
Figura 21. Medidas de centralidade para os principais genes hub da 75 rede regulada positivamente.
Figura 22. Cluster 29 da rede positivamente regulada 76
Figura 23. A inibição da função redox de APE1/REF-1 afeta a expressão 77 de proteínas diferentes.
Figura 24. Potencial de membrana mitocondrial avaliado por citometria 78 de fluxo após incubação de cada grupo de estudo com a sonda Rodamina 123.
Figura 25. Expressão e processamento do rRNA. 79
Figura 26. Avaliação da atividade de APendonuclease de APE1/REF-1 80 com oligonucleotídeo marcado.
Figura 27. Co-Imunoprecipitação de proteínas APE1/REF-1 e NPM1. 81
Figura 28. Imunoprecipitação de cromatina com APE1/REF-1. 82
Figura 29. Rede de regulação trasncricional dos clusters 4 e 11 87 regulados negativamente.
Figura 30. Rede de regulação trasncricional dos clustesr 29, 33 e 35 88 regulados positivamente.
Figura 31. Modelo Proposto. 103
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Sequências dos primers utilizados para qPCR. 49
Tabela 2: Descrição quantitativa dos alinhamentos obtidos em cada 60 tratamento, porcentagem de mapeamento e abundância de rRNAs obtidos nas amostras.
Tabela 3: 25 top genes que se comportam como hub na rede 71 negativamente regulada com fold change ≤-3.
Tabela 4: 25 top genes que se comportam como hub na positivamente 74 regulada com fold change ≥3.
Tabela 5: Principais matrizes consensos reconhecidos nas regiões 83 promotoras dos transcritos da rede regulada negativamente
Tabela 6: Principais matrizes consensos reconhecidos nas regiões 85 promotoras dos transcritos da rede regulada positivamente.
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LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Distribuição dos principais processos biológicos da rede 69 regulada negativamente com um p valor com significância estatística após análise com o BINGO.
Gráfico 2: Distribuição dos principais processos biológicos da rede 70 regulada positivamente com um p valor com significância estatística após análise com o BINGO.
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SUMÁRIO
RESUMO viii
ABSTRACT x
LISTA DE ABREVIATURAS xii
LISTA DE FIGURAS xii
LISTA DE TABELAS xv
LISTA DE GRÁFICOS xvi
I. INTRODUÇÃO 20
II. REVISÃO DA LITERATURA 21
APE1/REF-1: Enzima Multifuncional 21
O papel de APE1/REF-1 na manutenção da homeostase celular 29
Interação proteína-proteína: Um pré-requisito para função de 30 APE1/REF-1
APE1/REF-1 e Doenças Humanas 32
Inibidores das funções de APE1/REF-1 33
III. OBJETIVOS 37
Objetivo Geral 37
Objetivos específicos 37
IV. MÉTODOS 39
Modelo celular de inflamação 39
Ensaio de viabilidade celular 39
Indução de morte celular por apoptose 40
Dosagens de citocinas e de quimiocinas 40
Extração de RNA e síntese de cDNA 41
RNA-Seq 43
Análise de Enriquecimento de funções biológicas 45
17
Interação Proteína-Proteína 46
PCR quantitativa em tempo real 48
Extração de proteínas totais e Western Blot 50
Determinação do Potencial de Membrana Mitocondrial 51
Avaliação da integridade do RNA ribossomal por electroforese 51 em gel de microfluído
Ensaio de excisão de sítio abásico 52
Padronização da preparação de extratos celulares e 53 imunoprecipitação de proteínas
Padronização da Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) 53
Predição de motivos de ligação e de fatores de transcrição 55
Análise estatística 56
V. RESULTADOS 57
A função redox de APE1/REF-1 regula é importante para a 57 viabilidade celular e a resposta infamatória.
Obtenção das sequências e montagem genômica 60
Impacto do tratamento com E3330 sobre transcrição: visão 60 global dos genes diferencialmente expressos
A análise do RNA-seq após inibição da função redox de 66 APE1/REF-1 revela várias interações gênicas importantes na regulação de importantes dos processos celulares
Função redox de APE1/REF-1 controla a expressão de várias 76 proteínas importantes
Análise de alterações no potencial de membrana mitocondrial 78
Função Redox de APE1/REF-1 controla o processamento de 78 rRNA
A inibição da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 não 80 interfere na sua atividade de APendonuclease.
Padronização da imunoprecipitação de proteínas com 80 APE1/REF-1 e NPM1
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Padronização da Imunoprecipitação de Cromatina com 81 APE1/REF-1
Busca de motivos para fatores de transcrição 82
VI. DISCUSSÃO 89
VII. CONCLUSÕES 104
VIII. PESPECTIVAS 105
IX. REFERÊNCIAS 106
ANEXOS 132
Lista de genes expressos diferencialmente regulados negativamente 132
Lista de genes expressos diferencialmente regulados positivamente 145
Participação como autor em artigo científico publicado produto da tese 158
Participação como autor em artigo científico a ser submetido produto da 160 tese
Outras publicações não relacionadas à Tese 163
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I. INTRODUÇÃO A endonuclease apurínica/apirimidínica 1 (APE1/REF-1) humana é uma enzima multifuncional, possui atividade de reparo de DNA e regulação da transcrição (1). APE/REF-1 pertencente à via de reparo de DNA por excisão de bases (do inglês: Base excision repair-BER), envolvido no reparo de lesões oxidadas, causadas por agentes endógenos e exógenos tanto no núcleo celular quanto na mitocôndria. Como principal endonuclease em células de mamíferos, essa proteína é essencial para o desenvolvimento embrionário (2). APE1/REF- 1 também atua como um regulador chave da expressão gênica, auxiliando a ligação ao DNA de fatores transcricionais (FT) tais como NF-kB, EGR1, p53, HIF-1α entre outros ou como um componente necessário para a montagem dos complexos de pré-iniciação da transcrição de uma forma dependente ou independente da função redox (3–6). Estas atividades são codificadas por duas regiões distintas da proteína: a região N-terminal relacionada à função redox e a região C-terminal com a função de reparo (7,8). Outra atividade de APE1/REF-1 ainda pouco caracterizada é representada por sua capacidade de atuar como um repressor transcricional, nos promotores dos genes do paratormônio (do inglês: Parathyroid hormone -PTH) e da própria APE1/REF-1, através da ligação a elementos negativos de resposta ao cálcio (do inglês: negative Calcium Responsive Elements- nCaRE) (9,10). Interações físicas proteína-proteína são também mediadas por APE1/REF-1, assim ela atua como uma proteína importante que controla várias vias importantes para a homeostase e sobrevivência da célula. Adicionalmente, alterações no perfil de expressão, localização aberrante e modificações pós-traducionais de APE1/REF-1 têm sido associados com a susceptibilidade de várias doenças de base inflamatórias e neurodegenerativas (11,12), ao aumento da agressividade de vários tumores, bem como maior ou menor sensibilidade a agentes quimioterápicos e rádioresistência em diferentes tipos de câncer (13,14). Portanto, APE1/REF-1 é uma proteína chave na regulação de vários processos biológicos essenciais para a sobrevivência da célula, indicando o seu grande potencial para uso como alvo terapêutico. Assim, existe uma grande necessidade de conhecer e caracterizar exatamente qual função biológica é dependente de determinada atividade de APE1/REF-1.
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II. REVISÃO DA LITERATURA APE1/REF-1: Enzima Multifuncional APE1/REF-1 é expressa ubiquamente em seres humanos, seu gene (APEX1 ) está localizado no cromossomo 14q11.2-q12. Consiste em cinco exons e quatro pequenos introns e a proteína codificada possui peso molecular de aproximadamente 36,5 kDa (15). Análises in silico das regiões promotoras de APE1/REF-1 revelam a existência de vários sítios de reconhecimento para o receptor de glicocorticoide, para Sp1 e proteínas ligadas a c-Myc tais como USF e AP-1 (1,16). Fung et al (2001) (17) mostraram em células de fibroblasto murino NIH3T3 que a transcrição de APE1/REF-1 é firmemente coordenada pelo ciclo celular, em que os níveis de mRNA começam a aumentar antes do início da síntese do DNA, continuam durante a fase S e depende de fatores transcricionais como o Sp1. Os mecanismos de indução da ativação do gene da APEX1 já são bem documentados, como por exemplo, o hormônio estimulador da tireoide (do inglês: thyroid-stimulating hormone- TSH) ou após estresse oxidativo em células de tireoide de ratos (FRTL-5) e de ovário de hamster (CHO) respectivamente (18,19). O sítio ativo para a sua função de reparo de DNA localiza-se dentro do domínio C-terminal; três resíduos nesta região (Fen266, Trp280 e Leu282) formam uma bolsa hidrofóbica que reconhece e captura os sítios apurínico- apirimidínico ou abásico (AP) (20). Na região N-terminal encontra-se o domínio relacionado à atividade redox e contém o sinal de localização nuclear (10,15). Seus 33-35 primeiros aminoácidos da região N-terminal são essencialmente envolvidos na interação proteína-proteína e são também importantes para a sua atividade de ligação ao RNA (21). APE1/REF-1 tem um papel distinto na regulação da transcrição, atuando como um ativador ou repressor de alguns genes dependente ou não da sua função redox (8,22,23). O dano oxidado tanto no DNA quanto no RNA (incluindo RNA mensageiro, ribossômico e de transferência) têm sido associadas com várias doenças humanas (24–26). Recentemente, o papel de APE1/REF-1 no metabolismo do RNA (incluindo a sua função como um riboendonuclease) foi identificado, mostrando que a proteína tem um papel importante na regulação pós-transcricional da expressão gênica (27,28).
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Nos diferentes tipos celulares de mamíferos, a distribuição subcelular da APE1/REF-1 é principalmente nucleolar e é crítica para o controle da taxa de proliferação da célula (29,30). Além disso, já foi relatado a sua localização citoplasmática, mitocondrial, e no retículo endoplasmático (13,31,32). Curiosamente, a expressão citoplasmática de APE1/REF-1 tem sido correlacionada com a agressividade de diferentes tumores (1,33), embora o seu papel nos processos tumorigênicos sejam ainda pouco conhecidos. Assim, APE1/REF-1 é uma proteína importante em termos de seu padrão de expressão, localização subcelular, atividade de reparo de DNA, regulação redox e interação proteína-proteína, a qual é sensível a diversas alterações celulares que podem levar a diferentes processos biológicos (Figura 1).
Figura 1: Funções de APE1/REF-1 em diferentes tipos de células durante condições diversas de indução ao estresse . Ativação de APE1/REF-1 ocorre devido a vários fatores estimuladores externos e internos (por exemplo, radiação, ERO/ERN e hipóxia). Além disso, muitas proteínas defeituosas, como beta-amilóide ( αβ ), α- sinucleína, Tau, PrP sc ou aumento de [Ca 2+ ] também causam a ativação de APE1/REF-1. Uma maior expressão de APE1/REF-1 ativa outras proteínas de forma direta ou indireta, controlando assim várias funções biológicas importantes incluindo o reparo do DNA, o equilíbrio redox, a proliferação celular, apoptose, modificação do citoesqueleto e metabolismo energético. Figura adaptada de Thakur et a l (2014).
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A oxidação do DNA acelera o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, câncer e o envelhecimento, resultado de uma série de alterações genéticas que ocasionam a perda progressiva do mecanismo normal de controle de crescimento celular, regulação de vias de sinalização, culminando no comprometimento do funcionamento da célula (34–36). Lesões oxidadas em bases de DNA são em geral reparadas através da via BER, mas essa via também é responsável pelo reparo de lesões de fitas simples, causadas por agentes metilantes e de um grande número de depurinação espontâneas (36,37). Para isso, enzimas envolvidas nesse sistema reconhecem as lesões e catalisam a excisão e substituição do nucleotídeo modificado (38). O BER possui duas subvias de reparo de bases, conhecidas como via curta (do inglês: single nucleotide -SP-BER) e via longa BER (do inglês: long patch- LP-BER), as quais estão envolvidas no reparo de pequenas alterações nas bases do DNA como a remoção de um nucleotídeo ou de 2 a 7 nucleotídeos respectivamente (36). As etapas dessa via de reparo são as seguintes (Figura 2): a) excisão da base com lesão por uma glicosilase específica, b) incisão dos sítios apurínicos ou apirimidínicos (AP), c) processamento das extremidades bloqueadas, d) preenchimento da lacuna (gap) formada e, e) ligação da nova fita sintetizada (39). Detalhadamente, a etapa inicial do BER que consiste no reconhecimento e excisão das bases lesionadas é realizada pelas glicosilases que são específicas para um limitado número de bases modificadas, algumas glicosilases conhecidas por serem bifuncionais também possuem a atividade AP-liase. Após a remoção da base, forma-se um sítio AP sem ou com incisão 3´, que é reconhecido por outro grupo de enzimas, as AP-endonucleases, capazes de produzir quebras na ligação fosfodiéster 5' do sítio AP, gerando uma lacuna. Esta é preenchida por ação de uma polimerase de reparo de DNA, e em seguida, ocorre à ação da ligase, concluindo o reparo. O tipo de lesão formada e os níveis iniciais de glicosilases e ATP celular determina o envolvimento de cada sub-via do BER (40,41).
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Figura 2: Uma representação esquemática do reparo de bases oxidadas no DNA pela via BER. O estresse oxidativo pode resultar em lesões de bases oxidadas no DNA, como por exemplo, formação de 8-oxoguanina (8-oxoG). A DNA glicosilase OGG1 é capaz de remover a lesão do tipo 8-oxoG deixando um sítio AP. Em seguida, APE1/REF-1 promove a incisão na região 5’ do esqueleto açúcar-fosfato do sítio AP, deixando um grupamento nativo não oxidado 5’-fosfatodesoxirribose (dRP) ou um grupo 3’-OH próximo ao espaço do nucleotídeo. A ponta com o grupo não oxidado é reparado pela sub via SN-BER (1), ao passo que a extremidade com o açúcar oxidado pode ser reparado pelo sub via LP-BER (2a e 2b). (1) Os próximos passos da via curta são a adição de um nucleotídeo na lacuna gerada e remoção do grupamento 5’-dRP pela DNA polimerase β (pol β). Subsequentemente, a pol β promove o preenchimento da lacuna deixando um intermediário de DNA livre para ligação. Neste cenário, o reparo envolve uma substituição de apenas um nucleotídeo por isso é a via SN-BER. (2) Para o cenário onde o açúcar oxidado é resistente a atividade de dRP liase da pol β o reparo desses intermediários bloqueados pode seguir pela via longa do BER, a qual envolve a resíntese de um oligonucleotídeo de 2 a 7 nucleotídeos de comprimento. A síntese de DNA nesta via é realizada por diversas polimerases e requer fatores de replicação e o produto final do DNA reparado é selado
24 por uma ligase. Dependente da quantidade de substituição de nucleotídeos necessários que é recrutado o aparato enzimático específico. Adaptado de Liu e Wilson 2012.
A principal AP-endonuclease de mamíferos é a APE1/REF-1 a qual é capaz de se ligar de forma rígida ao DNA, estabilizando a conformação necessária para formar os sítios AP (42). Tanto a via curta como a via longa do BER requerem a geração de uma extremidade 3’OH pela APE1/REF-1, mas utiliza diferentes enzimas para o completo reparo do DNA como demonstrado na Figura 2 (40). Os sítios AP gerados se não forem adequadamente processados podem levar a quebra das fitas de DNA, apoptose e aumento da citotoxicidade (43). Deficiências na via BER têm sido associadas à susceptibilidade a diversos tipos de câncer e doenças neurodegenerativas, e a APE1/REF-1 é uma enzima indispensável na manutenção dessa via, pois também atua coordenando o recrutamento de uma série de outras enzimas importantes (44,45). Atualmente, sabe-se que danos ao DNA induzem alterações locais na estrutura da cromatina, e consequentemente causam uma expressão gênica alterada (46,47). Além disso, a ativação da transcrição requer um controle pós- traducional de histonas que permite o recrutamento da RNA pol II ao promotor, e por sua vez podem causar lesões na estrutura do DNA (6,48). Bases oxidadas induzem o silenciamento de alguns genes por desencadear a degradação do DNA danificado, mas principalmente através de um estado persistente de repressão transcricional (49) . Por exemplo , a demetilação da histona 3 pela demetilase lisina 1 (LSD1), leva a produção de peróxido de hidrogênio (H 2O2) que promove a produção de 8-oxoG no DNA do enhancer ou do promotor de um determinado gene que e induz o recrutamento das enzimas do BER tais como APE1/REF-1 e OGG1 para reparar a lesão gerada (3,50). Assim, o reparo do DNA pode auxiliar nos processos de mudanças da conformação da cromatina e montagem dos complexos de iniciação da transcrição. Adicionalmente à sua função de reparo de DNA, a atividade redox de APE1/REF-1 regula a expressão gênica (10). A porção redox de APE1/REF-1 não parece em alinhamentos de sequências de uma série de organismos vivos, sendo encontrado com alta identidade em mamíferos, mas observado também
25 em Arabidopsis thaliana (51–53). Sete resíduos de Cisteínas (Cys) já foram relatados como conservados em APE1/REF-1 de mamíferos. Dos sete resíduos, três (Cys65, Cys93 e Cys99) são considerados importantes para a função redox (54). Vários estudos utilizando ensaios de expressão com gene repórter dependente de FT mostraram que a APE1/REF-1 com mutações em Cys65 não se comporta como a proteína selvagem (55,56). Além disso, a Cys65 também controla a translocação subcelular da APE1/REF-1 (57) e já foi visto que após a indução do estresse oxidativo mutações nessa região da proteína aumenta a taxa de apoptose de neurônios (58). Já tem sido bastante estudado a APE1/REF-1 como uma proteína capaz de regular a ligação de FT ao DNA, tais como as proteínas AP-1, NF-κB, Myb, EGR-1 e p53, através do controle do estado redox dos resíduos de Cys localizados nos domínio de ligação ao DNA ou em regiões reguladoras do FT (4,8,56,59,60). Especificamente em relação ao NF-kB, FT que está envolvido em várias vias de sinalização tais como resposta imune e inflamação, sabe-se que a perda de APE1/REF-1 ou diminuição da sua expressão dificulta a atividade de NF-kB em células endoteliais, aumentando assim a susceptibilidade celular à apoptose (61). Interessantemente, através da sua capacidade de modular a expressão de citocinas como IL-8, TNF α via regulação redox do NF-κB, a APE1/REF-1 desempenha papel essencial nos processos inflamatórios (62,63). Em um recente artigo de revisão publicado pelo nosso grupo foi discutido sobre a interação entre reparo de DNA e resposta imune, sem compartimentalizar as vias conhecidas, e sim entender o conjunto dos acontecimentos (64). Especificamente em relação a APE1/REF-1 esse artigo discute principalmente sua capacidade de regular a resposta imune e inflamação. A ativação de APE1/REF-1 pode ser iniciada pela ligação dos moduladores inflamatórios com receptores de superfície específicos, levando a sinalização de eventos como proliferação, diferenciação celular ou expressão de mais moduladores inflamatórios (13). Após a estimulação das células imunes por lipopolissacarídeo (LPS) vários sinais são iniciados para que o NF- κB possa auxiliar na transcrição de citocinas e quimiocinas, e é a APE1/REF-1 quem auxilia a sua translocação para o núcleo e permite que esse FT tenha acesso aos promotores de certos genes (56,62,65). Já foi visto também que a
26 resposta inflamatória a determinados agentes infecciosos como Helicobacter pylori, micro-organismos causadores da meningite bacteriana parecem ser modulada pela APE1/REF-1 (11,63,66). Além disso, a APE1/REF-1 também pode contribuir na regulação da imunidade humoral participando dos processos de troca de classe de imunoglobulina e proliferação das células B (67–69). A APE1/REF-1 também funciona como uma chaperona redox, pois regula a ligação de FT ao DNA através da redução dos seus resíduos de Cys por meio de outras moléculas redutoras tais como Glutationa redutase (GSH) e Tioredoxina (TRX). Dessa forma a APE1/REF-1 pode facilitar a redução de fatores de transcrição alvo fazendo uma ponte entre o alvo e a molécula redutora (modelo de recrutamento), ou ela pode alterar a conformação da proteína alvo, de forma que os resíduos sensíveis à regulação redox tornem-se mais acessíveis (modelo conformacional). E por fim pode estabilizar o estado reduzido dos fatores de transcrição alvo, através da formação de pontes de hidrogênio com os grupos tiol (modelo de barreira da oxidação) (56,70). APE1/REF-1 já foi identificada como um componente de um complexo de repressão transcricional dos genes do PTH, renina e dela mesmo através da ligação com regiões nCaRE de promotores (9,71,72). No entanto, alguns dados experimentais demonstram que a APE1/REF-1 não consegue se ligar diretamente a esses elementos, em que outras proteínas são necessárias como a ribonucleoproteína L (9). Já foi visto que o aumento da concentração de cálcio extracelular pode induzir a acetilação de APE1/REF-1 por p300, e essa acetilação aumenta a capacidade de ligação com os elementos nCaRE (73). No nível transcricional estímulos hormonais e mudança na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) podem aumentar a síntese de APE1/REF- 1 e alterar a sua translocação nuclear (13,74,75). Assim, APE1/REF-1 age como um coactivator transcricional ou um corepressor de forma direta ou indireta pelas vias dependente ou independente da função redox. Estudos recentes propõem um papel de APE1/REF-1 no metabolismo de RNA, a partir das observações que essa proteína também exerce sua atividade de endonuclease em DNA de fita simples, sendo possível observar essa mesma capacidade em moléculas de RNA (28,76). Vascotto et al (2009a) demonstraram que APE1/REF-1 afeta o crescimento celular, agindo diretamente sobre os mecanismos de controle de qualidade RNA, afetando
27 assim a expressão gênica através de mecanismos pós-transcricionais (21). Adicionalmente já foi identificado que a APE1/REF-1 é capaz de clivar o mRNA do gene c-myc in vitro (27). As funções regulatórias das atividades de APE1/REF-1 podem ser moduladas via três diferentes mecanismos: (1) aumento dos níveis da proteína após ativação trasncricional; (2) sua re-localização; e (3) regulação da APE1/REF-1 via modificações pós-traducionais (do inglês: posttranslational modifications-PTMs) (4). O conhecimento sobre as PTMs afetando as funções de APE1/REF-1 tem crescido bastante na última década, várias dessas modificações têm sido descritas in vitro , no entanto apenas as seguintes ocorrem in vivo (Figura 3): acetilação, fosforilação, ubiquitinação, S-nitrosação, clivagem proteolítica dos 33 aminoácidos na região N-terminal e regulação redox (77).
Figura 3: Representação esquemática dos sítios de modificações pós- traducionais na sequência da APE1/REF-1: Regiões onde foi demonstrado cada tipo de modificação. Adaptado de Tell 2010.
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O papel de APE1/REF-1 na manutenção da homeostase celular A homeostase refere-se à capacidade da célula de regular seu ambiente interior para garantir o equilíbrio dos processos fisiológicos. Qualquer desequilíbrio entre a produção de ERO e no controle pelos antioxidantes provoca estresse oxidativo nas células. Os agentes antioxidantes retardam ou previnem reações oxidativas que geram metabólitos tóxicos, os quais iniciam uma cascata de eventos que resulta em danos celulares (78). Oxidantes tais como ERO e espécies reativas de nitrogênio (ERN) têm tanto efeitos benéficos como deletérios sobre os organismos, dependendo se os seus níveis são normais ou anormais (79,80). O balanço apropriado entre esses agentes é realizado tanto por sistemas enzimáticos tais como superóxido desmutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidases, quanto por sistemas não enzimáticos como glutationa, vitamina C e Vitamina E (78). O balanço ERO/ERN tem um importante papel na manutenção do estado redox da célula, pois eles são continuamente gerados durante a respiração normal e durante as respostas inflamatórias (81). Fisiologicamente, níveis basais de ERO e ERN estão envolvidos na sinalização intracelular como segundos mensageiros, ao passo que altos níveis podem causar citotoxicidade (82). O acúmulo dessas espécies também pode conferir efeitos genotóxicos e induzir várias lesões ao DNA, incluindo oxidação de bases nitrogenadas, indução de sítios AP e até quebra da dupla fita de DNA (27,38). Altos níveis de ERO ativa a expressão de APE1/REF-1, e em resposta ao estresse oxidativo existe um aumento da sua atividade de endonuclease (4,40). APE1/REF-1 também participa do controle do estresse oxidativo limitando a produção intracelular de ERO em células endoteliais através da modulação de Rac1 GTPase na regulação do complexo NADPH oxidase (83). Esse complexo é composto por várias subunidades envolvidas na resposta imune inata de fagócitos e sua ativação gera ERO, que são importantes na defesa do hospedeiro contra a infecção. Angkeow et al (2002) descobriram que uma alta expressão de APE1/REF-1 protege células endoteliais contra o estresse oxidativo gerado após indução com TNF α, mas esse mecanismo ainda não é bem caracterizado (84). Além disso, foi visto também que a interação física entre a proteína de choque térmico 70 (do inglês heat shock protein -hsp) e APE1/REF-1 também
29 protege as células do estresse oxidativo (85). Portanto, APE1/REF-1 regula o estado redox da célula, seja de forma direta ou indireta, contribuindo assim para a manutenção da homeostase celular (86).
Interação proteína-proteína: Um pré-requisito para função de APE1/REF-1 Interações moleculares proteína-proteína têm um papel importante tanto na função de reparo quanto de redox de APE1/REF-1 e são essenciais para o entendimento de várias doenças humanas. (86). Interações fracas entre as proteínas da via BER podem conduzir a uma diminuição na eficiência do reparo. A via BER é dependente da interação entre proteínas específicas, que mutuamente estabilizam o sistema ou recrutam outros fatores importantes para cada passo da via (87). Em relação ao reparo de DNA já foi determinado a interação de APE1/REF-1 com a DNA polimerase β (pol β), XRCC1(do inglês x- ray repair cross-complementing protein 1) , PARP1( do inglês Poly [ADP-ribose)] polymerase 1 ), FEN1(do inglês flap endonuclease 1 ), DNA Ligase I, XPC e outras (88–93). Já em relação à função redox, a redução de FT como, por exemplo, c- Jun por APE1/REF-1 necessita da interação específica com a TRX (94). A APE1/REF-1 tem sido ligada significantemente a rede de interações (95), em que sua região N-terminal além de conter o domínio relacionado à regulação redox da proteína, também é responsável pela interação proteína-proteína (96). Diversas interações já bem estudadas envolvem proteínas com diferentes funções biológicas como STAT3 (do inglês- transducer activator of transcription 3), p300, proteínas endoplasmáticas como ERp57, YB-1, EGR1, p53, NPM1, SIRT1 entre outros (1,10,21,32,97,98). A figura 4 ilustra as principais interações da APE1/REF-1 com inúmeras proteínas de diferentes funções.
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Figura 4. Rede de interações da APE1/REF-1 humana: A figura mostra a interação entre várias proteínas com a APE1/REF-1 utilizando o banco de dados online STRING. As associações mais fortes são ilustradas com linhas mais grossas e algumas interações são incorporadas devido à desatualização do banco de dados utilizado. Essas diversas interações indicam a natureza multifuncional da APE1/REF-1, bem como a sua complexidade em relação às diversas funções biológicas. Figura de Thakur et al (2015). As interações não canônicas com APE1/REF-1 também tem sido bastante relatadas e desempenham um papel importante nas funções biológicas no metabolismo de RNA (48). Tell et al (2010) demonstraram que a APE1/REF-1 cliva sítios AP no RNA e regulam a expressão de c-Myc através de sua atividade de endoribonuclease. A nucleofosmina (NPM1) é conhecida como uma proteína cujo seu translocamento entre núcleo e citoplasma está relacionado com a biogênese ribossomal (28,99). A NPM1 interage na porção N-terminal de APE1/REF-1 no nucléolo, e essa ligação dificulta a atividade de endonuclease da APE1/REF-1 no RNA de fita simples com sítios AP (21). Ainda em relação ao metabolismo de RNA, existe um forte envolvimento da APE1/REF-1 com proteínas de montagem do ribossomo como a RSSA, RLA0 e a PRP19 (100). Em adição ao papel na regulação da expressão gênica, transdução de sinal e degradação de proteínas, várias PTMs também modulam a interação proteína-proteína. Assim, a atividade de APE1/REF-1 pode ser regulada de forma redox-independente, como mencionado anteriormente, por PTMs tais
31 como acetilação, oxidação, nitrosilação, ubiquitinação, metilação e fosforilação (1,77).
APE1/REF-1 e Doenças Uma série de patologias humanas, incluindo câncer, doenças neurodegenerativas, doenças cardiovasculares e doenças infecciosas são resultantes do dano oxidado ao DNA causados por agentes endógenos ou exógenos (1,37,64). APE1/REF-1 pode modular a susceptibilidade a essas patologias através da sua desregulação, PTMs ou até polimorfismos em sua sequência gênica, conforme observado por vários grupos de pesquisa (101). Estes estudos delimitam a associação diversificada da APE1/REF-1 com uma série de diferentes doenças humanas, indicando assim seu grande potencial de estudo na área da pesquisa terapêutica e no manejo de pacientes. Vários estudos experimentais sugerem APE1/REF-1 como sendo um fator chave para a sobrevivência celular e a redução dos seus níveis normalmente ocorre antes do início do processo de apoptose (102). Além disso, a superexpressão de APE1/REF-1 em vários tumores humanos (13,14,51) leva a uma diminuição sensibilidade às drogas antineoplásicas, especialmente para agentes alquilantes (74,103). Mesmo que a superexpressão de APE1/REF-1 seja insuficiente para promover transformação celular ou alterações no controle do ciclo celular, pode tornar as células mais resistentes a diferentes tratamentos genotóxicos (74). Interessantemente, tanto as funções de endonuclease quanto de reguladora redox da APE1/REF-1 são necessárias para a sobrevivência celular (104). Devido à importância da APE1/REF-1 na manutenção da integridade do genoma tem crescido o número de estudos de associação de polimorfismos no gene da APEX1 e doenças. Os polimorfismos mais comuns nesse gene incluem Gln 51 His, Ile 64 Val, e Asp 148 Glu (105,106). A troca Asp 148 Glu é um dos mais frequentes e está entre as regiões de reparo e redox da proteína (105). Existem vários relatos de polimorfismos em APE1/REF-1, em cooperação com outras proteínas de reparo de DNA que afetam certos tipos de câncer, incluindo: pâncreas, melanoma cutâneo, endométrio, próstata, radiodermite em paciente com câncer de mama, câncer de pulmão e outros (12,107–111). Recentemente foi publicado por nosso laboratório, trabalho
32 resultante da minha dissertação de mestrado, um estudo que investigou a associação entre os polimorfismos em TNF -308G/A , TNF -857C/T , IL-8 - 251A/T (resposta inflamatória), AADAT +401C/T (via do triptofano), APEX1 Asp148Glu , OGG1 Ser326Cys e PARP-1 Val762Ala (reparo de DNA) com a ocorrência da Meningite Bacteriana. Foi realizada a análise individual dos polimorfismos e diversas combinações foram feitas, objetivando o melhor conhecimento entre as interações gene-gene em rotas importantes que são ativadas durante a fisiopatologia da doença. Nesse trabalho observou-se que o alelo polimórfico de APEX1 148Glu atua em sinergismo com outros polimorfismos proporcionando um fator de susceptibilidade importante para a ocorrência da Meningite Bacteriana (11). Outro trabalho publicado também pelo nosso grupo demonstrou um aumento dos sítios sensitivos à enzima Fpg pelos pacientes portadores do alelo polimórfico de APEX1 148Glu, sugerindo que esse SNP afeta a sua atividade de reparo de DNA (66).
Inibidores das funções de APE1/REF-1 A APE1/REF-1 é essencial para o controle de diversas atividades na célula e, portanto, uma compreensão detalhada de suas funções moleculares tem sido objeto de muitos estudos. Estratégias usando modelos knock-out ou knock-down tem confirmado a sua importância e permitiu o estabelecimento de modelos celulares para conhecer e caracterizar com mais detalhes as suas principais funções (29,100). Essas abordagens têm identificado um papel da APE1/REF-1 na regulação do crescimento celular, apoptose, homeostasia celular, função mitocondrial e estrutura do citoesqueleto (57,100). No entanto, esse conhecimento por derivar de experimentos com silenciamento do gene APEX1 não identifica exatamente qual das atividades da proteína é responsável por determinado evento biológico. Inibidores tanto naturais quanto sintéticos das funções de APE1/REF-1 têm sido alvo de vários estudos nos últimos anos (Figura 5). A diminuição da expressão de APE1/REF-1 utilizando oligonucleótidos anti-senso torna as células hipersensíveis ao tratamento com Metil Metano Sulfonato (MMS), H 2O2, Bleiomicina, Temozolomida (TMZ) e Gemcitabina (112–115). A inibição específica da sua função redox demonstrou ser crítica na hematopoiese embrionária (116), e por outro lado, a inibição específica da função de reparo
33 de APE1/REF-1 leva a uma maior sensibilidade de tumores a certas drogas. Em particular, estudos com o agente quimioterápico TMZ, usado clinicamente, em combinação com inibidores da função de reparo demonstraram poucos efeitos tóxicos (117–119). Outro inibidor da função de reparo de APE1/REF-1 é a droga lucantona, mas ele é também um inibidor da Topoisomerase II (120). O tratamento de linhagem celular proveniente de câncer de mama com a lucantona causa um aumento dos sítios AP de forma dose-dependente devido à inibição direta da APE1/REF-1, e aumenta a citotoxicidade do MMS e TMZ (117). Na clínica a lucantona já tem sido bastante utilizada para tratar esquistossomose (121) e pacientes com tumores no cérebro (122). Alguns grupos tem demonstrado a eficiência da Metoxiamina (MTX) em potencializar a citotoxicidade do TMZ em modelos murinos de câncer de cólon, ovário e de mama (123,124). A MTX é um composto derivado de alcoxiamino, capaz de bloquear a clivagem do sítio abásico por APE1/REF-1, sendo assim considerado um inibidor indireto da sua função de reparo (125). A reação de MTX com os sítios AP é mais rápida do que a reação de APE1/REF-1 e o bloqueio do reparo por MTX ocorre pela modificação química dos sítios AP (126). Apesar de ser notadamente importante na ativação redox de fatores de transcrição como NF-kB e AP-1, a atividade de reparo de APE1/REF-1 ainda não foi associada à resposta inflamatória. Nosso grupo também vem estudando os efeitos da MTX em um modelo celular de resposta inflamatória. Em relação à inibição da atividade de reparo de APE1/REF-1 os resultados preliminares demonstraram que o tratamento de células U937 com LPS e co-tratamento com MTX foi capaz de reduzir a expressão de citocinas, quimiocinas e receptores toll-like, e regular negativamente processos biológicos da imunidade, como ativação de macrófagos, e as vias ativadas pelo NF-κB, TNF α e interferon, sem induzir morte celular. Em uma análise de transcriptoma observamos que o tratamento LPS/MX induz disfunções mitocondriais, estresse de retículo endoplasmático e ativação de vias de autofagia, provavelmente ativadas pelo comprometimento da energética celular e/ou pelo acúmulo de danos ao DNA, nuclear e mitocondrial (127). Adicionalmente, produtos naturais como isoflavonoides, resveratrol, curcumina, decursina que podem regular de alguma forma as funções de
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APE1/REF-1 já são utilizados no tratamento e prevenção de uma série de doenças humanas (128–131). Um dos compostos naturais mais estudados é o resveratrol, que em estudo in silico demonstrou capacidade de inibir a função redox de APE1/REF-1 (129). Neste mesmo estudo foi observado que concentrações crescentes de resveratrol também inibem a atividade de reparo de APE1/REF-1 in vitro , no entanto esse resultado não foi observado in vivo . A análise do efeito do antioxidante resveratrol sobre a função de APE1/REF-1 também em um modelo de estimulação inflamatória vem sendo continuamente investigado pelo nosso grupo. Temos verificado uma diminuição da expressão de moduladores inflamatórios sem alterar a viabilidade celular após uma estimulação com LPS por 24 horas e subsequente tratamento com resveratrol por mais 4 horas. Ensaios de transcriptoma também foram realizados para esse modelo, e partindo das listas de regulação positiva foi possível observar um enriquecimento de genes envolvidos na cadeia de transporte de elétrons, transcrição, ciclo celular e resposta ao estresse Em relação ao conjunto de genes regulados negativamente existe um enriquecimento para genes que atuam na regulação da resposta imune e processos envolvidos com a acetilação de histonas e proteínas. Corroborando com esses dados, foi observada por ensaio de imunoprecipitação da lisina acetilada uma diminuição no padrão total de acetilação no tratamento com resveratrol, podendo sugerir que a participação desse antioxidante na regulação da resposta inflamatória pode ser por remodelagem da cromatina (Pinheiro 2016, comunicação pessoal). Foi de interesse do presente trabalho o entendimento da inibição seletiva da função redox pelo E3330 ((E) - 3 - (5, 6 - dimetoxi - 3 - metil - 1, 4 - dioxociclohexa - 2, 5 - dienil) - 2 - ácido nonilpropenóico). Vários estudos já demonstraram que E3330 inibe a expressão gênica via regulação de NF-κB, sem afetar a sua translocação para o núcleo, degradação do I κB alfa e PTMs (132). O mecanismo de ação ao certo ainda está sendo mais bem investigado, mas já se sabe que o E3330 inibe a ligação do NF-κB às regiões promotoras dos genes via regulação redox (71,132,133). E3330 também tem sido relacionado com a diminuição da expressão de moduladores inflamatórios (132,134–136). Pré-tratamento de macrófagos murinos com E3330 reduz os
35 níveis de TNF α, IL-6, IL-12, NO, prostaglandinas E2 após estimulação com LPS (137). Neste contexto, E3330 tem sido utilizado em vários estudos como um inibidor seletivo da função redox de APE1/REF-1 (54,138). Em um estudo realizado por Zhang et al (2013) usando espectrometria de massa (do inglês: mass spectral -MS) e marcação com N-ethylmaleimide (NEM), foi visto que E3330 interage com a APE1/REF-1. Em experimentos de footprinting químicos com marcação NEM, a incubação de APE1/REF-1 com E3330 modifica completamente a proteína, em que todos os sete resíduos de Cys são marcados com a NEM. Somente dois dos sete resíduos de Cys são acessíveis aos solventes, logo, APE1/REF-1 é desdobrada na presença de E3330 (139). Além disso, E3330 medeia o aumento da formação de ligações dissulfeto nos resíduos de Cys65 e Cys93, os quais são críticos para a atividade redox de APE1/REF-1, inibindo assim esta função(140).
Figura 5: O papel da APE1/REF-1 na manutenção da integridade do genoma em resposta ao estresse oxidativo ou inibição por produtos sintéticos e naturais. Produtos naturais e sintéticos estão sendo bastante estudados no intuito de modular a expressão e as funções de APE1/REF-1, representando, assim, possíveis interversões terapêuticas promissoras contra várias doenças humanas. Figura adaptada de Thakur et a l (2014).
Vários estudos têm identificado o papel da APE1/REF-1 no crescimento celular, apoptose, danos ao DNA, estado redox, regulação da função mitocondrial e da estrutura do citoesqueleto. No entanto, continua a persistir uma lacuna na literatura sobre qual atividade de APE1/REF-1 regula especificamente determinada função biológica.
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III. OBJETIVOS: Objetivo principal Este trabalho tem como objetivo principal caracterizar melhor o mecanismo de ação da inibição da função redox de APE1/REF-1 em um modelo de inflamação, no intuito de entender melhor essa atividade.
Objetivos específicos • Investigar o papel da inibição redox de APE1/REF-1 com E3330 em um modelo de inflamação em células U937 e suas interações na resposta ao crescimento celular, apoptose e resposta inflamatória; • Caracterização do transcriptoma de células U937 após estimulação inflamatória e subsequente ao tratamento com um inibidor da função redox de APE1/REF-1 e identificar os mecanismos moleculares da regulação redox; • Validação da expressão diferencial dos genes identificados por qPCR nas células U937; • Caracterização e categorização dos genes identificados no transcriptoma através de anotação de enriquecimento funcional; • Construir redes de interação dos resultados obtidos nos transcriptomas identificando os agrupamentos e processos biológicos envolvidos, bem como definir quais nós são considerados hubs e gargalos; • Avaliar comparativamente entre os grupos de estudo a expressão das proteínas associadas à regulação da expressão gênica, estresse oxidativo, dano ao DNA, apoptose, biogênese ribossomal e processamento de rRNA em células U937; • Verificar se a inibição da função redox de APE/REF-1 em células U937 proporciona alguma alteração no potencial elétrico e da integridade da membrana mitocondrial; • Analisar o possível efeito da inibição da função redox de APE1/REF-1 com E3330 no processamento de RNA ribossômico em células U937; • Avaliar se a inibição da função redox de APE1/REF-1 por E3330 altera a sua função de reparo de DNA in vitro ;
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• Padronização da preparação de extratos celulares e imunoprecipitação de proteínas com anticorpos anti-APE1 e anti-NPM1; • Padronizar experimentos de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em células U937 com anticorpo anti-APE1 após estimulação inflamatória e identificação de regiões promotoras reguladas transcricionalmene pela APE1/REF-1 após utilização de inibidores específicos; • Utilizar ferramentas de bioinformática para localizar os sítios putativos de ligação à fatores de transcrição nos genes alvo identificados.
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IV. MÉTODOS Modelo celular de inflamação O modelo experimental foi realizado utilizando a linhagem celular U937(ATCC ® CRL1593.2), derivada de fluido pleural de pacientes com linfoma histiocítico difuso (141). Essa linhagem cresce em suspensão no meio de cultura, tem uma superfície lisa, é bastante usada como modelo de diferenciação macrófago-monócito e estimulação inflamatória (142,143). Por ser de origem histiocítica é capaz de produzir lisozima e esterases de forte atividade, no entanto, possui uma baixa capacidade de fagocitose (144). As células U937 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com bicarbonato de sódio 44 mM (NaHCO3) (Sigma), 10% de soro fetal bovino (SBF) (Gibco) e 1% de solução de antibiótico (Sigma). O modelo celular de inflamação foi estabelecido com a estimulação de 5x10 5/poço células com 1 µg/ml de LPS durante 24 horas antes do tratamento com E3330. Foram gerados três grupos: células não estimuladas (controle), estimulada por LPS e estimuladas por LPS com subsequente tratamento com
100 µM de E3330 durante 4 horas e incubadas a 37 ºC e 5% CO 2. Além disso, para entender melhor a regulação da resposta inflamatória foi realizada uma cinética de inflamação (analisadas apenas para a dosagem de moduladores inflamatórios e a viabilidade celular), 5x10 6/poço células foram pré-estimuladas com 1 µg/ml LPS durante 1 hora, e a seguir incubadas com E3330 (100 µM) durante 2, 4, 6, 24 e 48 horas e incubadas a 37 ºC e 5% CO 2. Os dois modelos experimentais foram realizados em placas de 6 poços, em um volume final de 3 ml de meio quando usamos 3x10 5/poço células, ou 4 ml de meio quando usamos 5x10 6/poço células.
Ensaio de viabilidade celular As células U937 foram cultivadas e tratadas de acordo com os modelos anteriormente descritos, marcadas com o corante azul de Trypan e contadas. É importante enfatizar que esta metodologia avalia células mortas que possuem danos na membrana, mas pode não detectar células inviáveis cujos danos afetam outros compartimentos celulares que também podem progredir para a morte celular (145).
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Resumidamente, após cada tratamento, as células foram centrifugadas e o pellet foi ressuspendido num volume conhecido de meio e retirado alíquotas de 10 μL desse volume, homogeneizando com 10 μL de solução de azul de Trypan (1:1). As células positivas e negativas foram contadas com um hemocitómetro, sob um microscópio invertido (Olympus CKX41) e foi determinada a porcentagem de células viáveis.
Indução de morte celular por apoptose Células em apoptose foram avaliadas a partir da marcação com o corante fluorescente anexina V conjugada com FITC (Isotiocianato de fluoresceína) e iodeto de propídio (do inglês propidium iodide - PI) utilizando o kit Anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences). Após o tratamento, as células U937 foram lavadas com solução de salina fosfatada (PBS), pH 7,4, e o pellet foi ressuspendido em tampão de ligação 1X, 5 μl de anexina V, e 5 μl de PI e incubada por 15 minutos, a temperatura ambiente, sob abrigo da luz. A intensidade de fluorescência (FITC e PI) foi avaliada pelo separador de células (FACS), 10.000 eventos para cada amostra foram adquiridos no sistema FACSCANTO II (BD Biosciences) utilizando um lazer de argônio com excitação de 488nm e emissão de 510 nm para FITC e 617 nm o PI. A análise foi realizada usando software de FlowJo 7.6.4 (Treestar Ashland, EUA). Foram avaliados três experimentos independentes. Todas as análises utilizando citometria de fluxo presentes nessa Tese foram realizadas no Laboratório de Imunogenética, Departamento de Bioquímica da UFRN.
Dosagens de citocinas e de quimiocinas Os níveis de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias foram medidas após os tratamentos nas células U937 com o sistema Bio-Plex 200 (Bio-Rad), utilizando o Human cytokine Lincoplex Kit (HCYTO-60k, Lincoplex®, Linco Research Inc., St Charles, MA, USA) que utiliza ensaios múltiplos baseado na tecnologia de microesferas. As cito/quimiocinas analisadas foram TNF-α, IL-6, IL-10, MIP1 α/CCL3, MIP-1β/CCL4, IL-8/CXCL8 e MCP1. As amostras foram processadas e medidas de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, após centrifugação das culturas, 50 µl do meio de cultura foi utilizado para os ensaios. A placa de 96 poços foi inicialmente lavada com
40 tampão de ensaio, em seguida adicionadas as microesferas conjugadas com anticorpos anti-cito/quimiocina e novamente lavadas com o tampão de lavagem, e por último adicionadas as amostras a serem testadas. As amostras foram incubados com o anticorpo acoplado ás microesferas por 16 horas, a 4 ºC, com agitação contínua. Em seguida, as microesferas foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem, e então, incubadas com anticorpo secundário ligado a biotina para detecção de cada cito/quimiocina por 1 hora, em agitação contínua. Posteriormente foi adicionada estreptavidina-ficoeritrina e incubado por 30 minutos. Após a incubação, as microesferas foram lavadas e ressuspendidas em sheath fluid, líquido de circulação do equipamento. Todas as amostras foram submetidas ao Bio-Plex suspension array system, que identificou cada diferente microesfera e quantificou cada proteína marcada baseada na fluorescência da ficoeritrina. As concentrações de citocinas foram calculadas automaticamente pelo software Bio-Plex Manager usando uma curva padrão derivada de citocinas recombinantes humana que varia de 10.000 a 3,2 pg/mL. Foram avaliados três experimentos independentes para cada modelo. Os dados do tratamento após 24 horas de estimulação inflamatória por LPS e subsequente inibição da função redox de APE1/REF-1 pelo E3330 foram obtidos por Leonam Coutinho e publicados em sua Tese em 2013. Nesta Tese foi realizada apenas a quantificação dos níveis de citocinas e quimiocinas da cinética inflamatória.
Extração de RNA e síntese de cDNA O RNA total foi isolado utilizando o kit comercial Illustra triplePrep (GE Healthcare) para extração rápida de DNA, RNA e Proteínas partindo de uma mesma amostra, usando colunas de purificação com formato mini spin e reagentes específicos. A extração seguiu as instruções do fabricante após os tratamentos das células U937, a quantificação foi realizada com o fluorímetro Quibit® 2.0 (Invitrogen) que é altamente específico e sensível para DNA dupla fita, DNA simples fita, RNA e proteínas. O RNA usado para o sequenciamento foi extraído com o kit comercial illustra RNA spin Mini RNA Isolation (GE Healthcare), o qual recupera o RNA total com alta qualidade. Esse procedimento foi realizado apenas após os tratamentos com as células U937. As seguir o RNA mensageiro (mRNA) foi
41 capturado usando kit de isolamento de mRNA (Roche Life Science) baseada na utilização de esferas magnéticas. Resumidamente, as esferas magnéticas possuem estreptavidina ligada covalentemente à sua superfície, em seguida utilizando-se um oligo dT biotinilado é possível capturar os mRNAs através da cauda de poli-A. Inicialmente as esferas foram lavadas e tratadas com soluções específicas do kit comercial, em seguida adiciona-se o RNA total que será purificado. Um separador magnético captura as esferas magnéticas hibridizadas pela cauda poli-A, lavadas para remover os contaminantes, e por fim o mRNA foi eluido em água. A quantidade de mRNA recuperada foi avaliada quanto à sua qualidade por meio de eletroforese microfluida no equipamento o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), utilizando o RNA Nano Chip kit (Agilent Technologies), de acordo com as recomendações do fabricante. A finalidade do BioAnalyzer é calcular a integridade e a concentração de amostras de RNA a partir de uma corrida eletroforética em um capilar contendo um polímero e subsequentemente detectado através da intensidade da fluorescência induzida por um laser. Os sinais das bandas são alinhados com um marcador padrão, e o equipamento detecta qualquer traço de degradação. Com o auxílio do Agilent 2100 Expert Software obteve-se os resultados referentes à qualidade das amostras pela atribuição do valor de integridade de RNA ( RNA Integrity Number - RIN). O RIN permite fazer uma estimativa da integridade do mRNA através da densitometria das bandas na corrida de eletroforese de cada amostra, e da razão entre as bandas dos RNA ribossomais. Valores de RIN entre 8 e 10 são amostras íntegras e de excelente qualidade, entre 4-7 estão parcialmente degradadas, e entre 1 e 3 são amostras muito degradadas. Apenas amostras que tinham uma boa integridade (RIN > 8) foram utilizadas para prosseguir com o RNA-Seq. Em seguida, a quantificação das amostras de mRNA de boa qualidade foram realizadas no espectrofotômetro NanoVue® (GE Healthcare Life Sciences) por análise da absorbância a 260nm, e sua pureza atestada pela razão 260/280nm. Para síntese de cDNA nas duas estratégias foi utilizado o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystem) e o mRNA purificado. Resumidamente, em um microtubo livre de nucleases foi adicionado 10x RT Buffer, 25x dNTP Mix (100mM), 10x RT Random Primers (200nM), 50U
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Multiscribe TM Reverse Transcriptase (50U/ μL) e água livre de nucleases a fim de completar 10 μL por reação. Em seguida, foi adicionado o mRNA. A preparação foi incubada em termociclador (Mastercycler ® ep, EPPENDORF) a 25°C por 10 minutos, seguidos de 120 minutos a 37°C e 5 minutos a 85°C. As amostras foram armazenadas a -80°C até o uso.
RNA-Seq A análise de transcriptoma é uma ferramenta poderosa para a quantificação da expressão gênica em diferentes populações de células ou condições específicas que elas podem ser submetidas. Dentre as novas plataformas de sequenciamento, nós utilizamos a 454 GS FLX titanium (Roche Life Sciences), a qual realiza o sequenciamento baseado no pirosequenciamento. O sequenciamento utilizando essa plataforma é baseado na combinação de reações enzimáticas que é iniciado pela detecção de um grupamento pirofosfato liberado após a incorporação de um novo nucleotídeo, gerando ao final do processo um sinal que é reconhecido por um detector que faz parte do sequenciador (Figura 6) (146,147).
Figura 6. Resumo ilustrativo do sequenciamento na plataforma 454: (A) O DNA genômico é isolado, fragmentado de forma aleatória e em seguida ligado a
43 adaptadores em suas extremidades. Esses fragmentos são então complexados com microesferas magnéticas por meio do pareamento com sequências complementares presentes na superfície da microesfera. Cada fragmento é amplificado de forma clonal em uma PCR em emulsão. A emulsão é quebrada, as cadeias de DNA são desnaturados, e as microesferas que transportam os clones de DNA de cadeia simples são depositados em poços de uma lâmina de fibra óptica. (B) Representação esquemática do progresso da reação enzimática no pirosequenciamento. Após a preparação do molde de DNA, acontece a liberação de pirofosfato quando há incorporação de um nucleotídeo pela DNA polimerase, a leitura da sequência é realizada a partir de uma combinação de reações enzimáticas. Após essa incorporação o pirofosfato é convertido para ATP, pela ATP sulfurilase, e auxilia na oxidação da luciferina pela luciferase, produzindo um sinal de luz. (C) O equipamento consiste nos seguintes subsistemas principais: (a) um conjunto de fluidos, (b) uma câmara de fluxo, (c) uma câmera que faz a montagem dos sinais de luz capturados e um computador que fornece a interface necessária para o usuário. (D) Flowgram da sequência obtida pelo 454. Os nucleotídeos são representados de acordo com uma cor específica. A sequência encontrada é mostrada acima do Flowgram . Adaptado de Margulies et al (2005) e Ronaghi (2001).
O sequenciamento do mRNA foi realizado utilizando aproximadamente 5 ug da biblioteca de cDNA em parceria com a Professora Dra. Ana Tereza Ribeiro de Vasconcelos pelo Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC). No processo de sequenciamento, os sinais quimioluminescentes são registrados individualmente para cada sequência, gerando arquivos de flowgrams contendo as sequências. Os arquivos obtidos referentes ao sequenciamento foram submetidos à alinhamentos e montagem em colaboração com o grupo de pesquisa em Bioinformática do Professor Dr. Sandro Jose de Souza do Instituto do Cérebro – UFRN. Resumidamente as sequências foram alinhados contra o banco de sequências de RefSeq humano, fornecido pela Universidade da Califórnia em Santa Cruz (UCSC), disponível em
44 comparados com os tratados apenas com LPS. A lista final de genes diferencialmente expressos foi obtido utilizando p <0,05 e |Fold Change|>1. Para as análises de enriquecimento funcional foi padronizado a utilização do fold change ≥3.0 ou ≤-3.0, e pra as análises de interação proteína-proteína (do inglês: protein-protein interaction - PPI) utilizamos as listas completas de genes identificados.
Análise de Enriquecimento de funções biológicas As listas de transcritos negativamente e positivamente reguladas foram utilizadas para análise de enriquecimento a partir de genes detectados pelo RNA-seq usando o software online e gratuito DAVID v 6.7. Esse software é capaz de identificar ontologias gênicas e vias metabólicas representadas pelos genes diferencialmente expressos, disponibilizando dados de diversos bancos para a realização de um enriquecimento funcional (149). Foi submetida cada lista de genes diferencialmente expressos separadamente no software e gerado os seguintes agrupamentos de anotação: Disease, Functional_Categories; Gene_Ontology; General Annotations; Literature; Main_Accessions; Pathways; Protein_Domains; Protein_Interactions; Tissue_Expression. Foram selecionadas apenas as categorias dos bancos internos Gene_Ontology e KEGG. O Gene_Ontology é uma base de dados que descreve e classifica agrupamento de genes em termos mais representados. Foram avaliadas as seguintes classificações de ontologia: componente celular (depende do local onde os produtos dos genes atuam), função molecular (depende da atividade que os produtos exercem) e processo biológico (uma série de eventos biológicos pertinentes ao funcionamento do organismo). Para cada item é informado o número total e os nomes dos genes da lista submetida que estão associadas a aquela classificação, a razão entre esse número e o número total de genes da lista, e alguns valores estatísticos que informam a significância daquele grupo de genes (valor-p, e correções de Bonferroni e Benjamini). O KEGG ( http://www.genome.jp/kegg/ ) é um banco de dados curado manualmente e retiradas da literatura que contem centenas de vias metabólicas e de interações de proteínas. As vias obtidas foram consideradas
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‘afetadas’ e foram incluídos na análise para este estudo, se três ou mais genes diferencialmente expressos estavam presentes (150).
Interação Proteína-Proteína Neste trabalho, nosso intuito de fazer a biologia de sistemas foi entender a interação entre os genes diferencialmente expressos encontrados após a utilização do nosso modelo. Aqui os nós representam os genes gerados pelo sequenciamento de RNA que vão ser possivelmente traduzidos em proteínas, enquanto que os conectores representam a ligação que está presente entre cada par de nós. Asseguir, definimos brevemente as medidas de centralidade avaliadas nesta tese com base nos conceitos do livro de Bioinformática: da Biologia à Flexibilidade Molecular - UFRGS (151) e exemplificados na Figura 7: Node degree: Representa à quantidade de nós adjacentes (diretamente conectados) a outro determinado nó. Proteínas com alto node degree são denominados de hubs , indicando que ela se liga a várias outras e acaba possuindo uma função regulatória importante na rede; Betweenness: É definido como o número de caminhos mais curtos que passam por um único nó, estimando a relação entre eles, e revela o quanto um nó específico está entre todos os outros nós na rede. Uma proteína com alto valor de betweenness, conhecida também como gargalo, apresenta uma elevada capacidade de interação e/ou sinalização com outras proteínas de diversos módulos diferentes, configura-se como um dos pontos chaves que controlam a propagação de informação para outros nós integrantes da rede. Proteínas gargalo não necessariamente possuem um grande número de interações com outras proteínas, no entanto sua remoção pode dividir a rede inteiramente.
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Figura 7:Topologia de uma rede de interações proteínas-proteínas: Os nós da rede indicam componentes presentes em cada um dos módulos ( clusters ) representados que podem ser vias metabólicas e/ou vias distintas nas regiões intersectadas pelos conectores. Em verde são apresentadas proteínas com alto grau de conectividade ( hubs ), em amarelo encontram-se as proteínas que não possuem alto valor de conectividade entre os nós e não conecta os módulos (não-hub /não gargalo), em azul estão as proteínas que possuem alto valor de conectividade entre os nós e conexão entre os módulos ( hub-gargalo), sendo consideradas fundamentais para o funcionamento de redes e em vermelho estão identificadas as proteínas essenciais na ligação entre módulos e processos biológicos (gargalo). Figura adaptada do e-book Bioinformática disponível em www.ufrgs.br/bioinfo/
Para desenhar as redes de interações relacionadas a cada lista de genes gerados após o sequenciamento de RNA, foi utilizada inicialmente a ferramenta online STRING 10.0 (Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins ) ( http://string-db.org/ ), o qual é um recurso que realiza metabuscas que prevê interações entre proteínas (152). Duas redes iniciais foram geradas com a lista total de transcritos obtidos a partir da lista de genes regulados negativamente e outra com a lista de genes regulados positivamente. Os métodos de predição ativados para gerar cada rede foram: Neighborhood, Gene Fusion, Co-occurrence, Co-expression, Experiments e Databases .
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Cada rede foi individualmente montada e exportada para analise subsequente pelo Cytoscape, versão 3.2.0. Inicialmente para selecionar as sub-redes ou clusters mais relevantes, foi utilizado o plugin MCODE (Molecular Detection Complex) com os seguintes parâmetros: inclusão de loops , degree cutoff 2, fluff e haircut ativados , node score cutoff de 0.2, K-core 2 e maximum depth de 100. Os clusters obtidos com score acima ou igual a 3 foram utilizados nas análises subsequentes. Os cálculos matemáticos para obtenção das medidas de centralidade ( Node degree e Betweenness ) de cada nó foram analisados com o plugin Centiscape 2.1 (153). As medidas de centralidades foram apenas relacionadas para aqueles genes que obtiveram uma diferença de expressão ≥3 ou ≤-3. A análise de ontologia gênica foi realizada com todas as proteínas descritas nas sub-redes usando o plugin Biological Network Gene Ontology (BiNGO) e comparadas com as listas com fold 3. As categorias foram geradas por enriquecimento funcional para um determinado cluster por distribuição hipergeométrica com correção para testes múltiplos (FDR) com nível de significância p<0,05 (154). O organismo selecionado para a análise foi Homo sapiens .
PCR quantitativa em tempo real As reações de PCR quantitativa em tempo real (qPCR) foram realizadas em três experimentos independentes para validar os resultados do RNA-seq e avaliar a expressão de alguns genes selecionados. Os oligonucleotídeos iniciadores ( Primers ) utilizados foram desenhados no programa online PrimerQuest Tool (IDT - Integrated DNA Technologies), obtidos da literatura ou que já existiam no nosso laboratório proveniente de Teses anteriores (Tabela 1). Para os primers desenhados nós seguimos os seguintes critérios: a) tamanho do fragmento dos oligonucleotídeos entre 18 a 30 pares de bases; (b) conteúdo de CG de 30 a 80%; (c) temperatura de anelamento em torno de 60° C; (d) a variação da temperatura de melting entre os oligonucleotídeos forward e reverse menor que 4° C; (e) ausência de repetição de nucleotídeos no final 3’; (f) ausência de complementaridade dentre dos oligonucleotídeos para evitar hairpins e (g) ausência de complementaridade da sonda com ambos os oligonucleotídeos. Para cada primer novo adquirido pelo laboratório foi realizada a otimização da concentração a ser utilizada (0,5 μM; 1,0 μM; 2,5 μM
48 e 5,0 μM). Em seguida foi realizada a validação com concentrações fixas de cada par de primers , previamente determinada, e variando a concentração de cDNA (100 ng, 50 ng, 25 ng, 10ng e 5 ng), afim de determinar os valores de “slope” e de “R 2” para calcular a eficiência de cada par de primers . Utilizamos apenas os primers com eficiência acima de 90% após a validação.
Tabela 1: Sequências dos primers utilizados para qPCR . Gene Primer Forward Primer Reverse Ref. GAPDH GGCATGGACTGTGGTCATGA TGCACCACCAACTGCTTAGC Tese: Julliane G Tamara (2014) CCL2 GTCTCTGCCGCCCTTCTGT TTGCATCTGGCTGAGCGAG Tese: Leonam Coutinho (2013) MYC GTGCAGCCGTATTTCTACT TCTTCCAGATATCCTCGCT Esse trabalho MINA GGTGTGTCAATGGGAAGA TCTCTGAGGTTGGTGAAAC Esse trabalho NCOA1 AGAATAAACCGCCAGCAGAG CAATCTGACTTCCGGGTGAG Esse trabalho ESRRA CAGGCCACAAGGAAGAGGAG CTCACAGGATGCCACACCAT Esse trabalho KLF10 TTCTGTGCCTTCCTCAGAGA TGGAGAGACCAACACTGACT Esse trabalho CRYZ GTCATTTGGCATGAGTGTGC AAACCCTTGGAAACTGAGCA Esse trabalho CDK9 ATGGCAAAGCAGTACGACTC CTTGGCGAGCTTCTCGTATT Esse trabalho ATR CATGTTTGAAGACGGTGTGC CATACCCAGCTGGCACAAAT Esse trabalho CYB5R4 GTCAGCCCTTATATGGAGTA AGTTCAGTACCATCTGATCC Esse trabalho APEX1 TCTCGCGAGTAGGGCAACGC TCTTCCGCCACCGCTCCCTT Tese: Julliane Tamara (2014) 47S CGCCGCGCTCTACCTTACCTA TAGGAGAGGAGCGAGCGACCA Vascotto et al (2009) 28S TGTCGGCTCTTCCTATCATTG ACCCAGCTCACGTTCCCTATTA Vascotto et al T (2009)
Para as reações foi usado o kit comercial 2Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies) utilizando o sistema da Applied Biosystems PCR em Tempo Real. Resumidamente, as reações de qPCR continham P rimers específicos, 1X Quantifast SYBR Green PCR master mix, 1µL (10ng) de cDNA modelo, num volume final de reação de 10 µL. A reação foi realizada no aparelho 7500 Real–Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando os parâmetros padrões do aparelho. O ciclo da qPCR no qual a intensidade de fluorescência do Sybr Green é detectada determina o Ct do gene ( Cycle threshold – ciclo referência). Este Ct é uma medida relativa da quantidade inicial de moléculas do transcrito alvo presente no cDNA. Quanto menor o Ct, mais expresso é o transcrito. Para tornar as medidas de expressão comparáveis entre as amostras usa-se como referência o Ct de um gene constitutivo ou que não tenha sua expressão alterada nas diferentes condições de estudo. Para a escolha de um gene de referência mais apropriado para a
49 normalização dos dados foi feito uma busca de genes constitutivos nas listas geradas pelo transcriptoma e observou-se que o GAPDH , já bem padronizado no nosso laboratório, não apresentou variação da expressão. Assim os Cts foram calculados para os genes-alvo e foram normalizados com GAPDH . Em seguida calcula-se o delta-Ct ( ΔCt) pela diferença entre o Ct do gene-alvo em análise e o Ct do normalizador. A partir dos valores de ΔCt calcula-se o valor de delta-delta-Ct ( ΔΔ Ct) que consiste na subtração do ΔCt obtido nas diferentes condições testadas: ΔΔCt E3330 = ΔCt E3330 – ΔCt Controle e ΔΔ Ct LPS= ΔCt LPS- ΔCt Controle. Especificamente para a validação do RNA-seq foi utilizado ΔΔ Ct E3330 = ΔCt E3330 – ΔCt LPS já que as listas geradas pelo transcriptoma relacionam a diferença de expressão entre E3330 e LPS. Por fim, a diferença de expressão relativa, fold change , foi realizada a partir das médias dos ΔΔ Ct obtidos para cada replicata biológica utilizando o método 2 - ΔΔ CT . Os dados de expressão da APE1/REF-1 em função da estimulação inflamatória por 24 horas e subsequente tratamento com E3330 já foram publicados por Leonam Coutinho em sua Tese em 2013. No entanto, novas replicatas foram inseridas totalizando seis experimentos independentes e uma nova análise estatística foi realizada e por isso estão incluídos nesse trabalho.
Extração de proteínas totais e Western Blot As proteínas totais foram extraídas usando o kit Illustra triplePrep (GE Healthcare), como descrito anteriormente, de acordo com as instruções do fabricante e quantificadas utilizando o fluorímetro Quibit® 2.0 (Invitrogen). 20 µg de cada lisado foi separado num gel de SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF de acordo com o método de Laemmli (155), para proteínas acima de 80 kDa foi utilizado 40µg do lisado proteico, com tempos de transferência e diluições específicas para cada proteína que desejávamos observar. Proteínas-alvo até 50 kDa foi transferida por 120 minutos, de 50 a 80 kDa 240 minutos e de 80 a 110 kDa 300 minutos. As membranas foram incubadas em tampão de bloqueio (5% de leite seco, 0,5 de Tween-20 em TBS, pH 7,2%) durante pelo menos 40 minutos. Subsequentemente, as membranas foram incubadas durante 16 horas a 4° C com os anticorpos primários para APE1 (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology), NPM1 (1:1000; Santa Cruz
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Biotechnology), MDM2 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology), RPS26 (1: 500; Santa Cruz Biotechnology), c-Myc (1: 1000; Abcam), Caspase 3 (1: 1000; Abcam), Peroxirredoxina 1 (1: 1000; Abcam), RPL35 (1: 500; Abcam), NFkB, subunidade p65, (1: 1000; Millipore), EGR1 (1: 1000; R & D sistema), e proteína β-actina (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology). As membranas foram lavadas com TBST e incubadas com o anticorpo secundário específico conjugado com HRP (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology) durante 1 hora a temperatura ambiente. Em seguida as membranas foram lavadas com TBST. As membranas foram reveladas utilizando o reagente de detecção ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (Amersham) e as imagens foram capturadas pelo Sistema Chemidoc (Bio-Rad). O valor de densitometria foi definido como a razão entre as médias das intensidades obtidas para cada proteína estudada normalizadas pela β-actina, em cada condição (Controle, LPS e E3330) em um total de pelo menos três réplicas biológicas utilizando o software ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html ).
Determinação do Potencial de Membrana Mitocondrial Após a incubação das células com o modelo experimental, as amostras foram centrifugas e ressuspendidas em PBS gelado, incubadas com 10 μg/mL de Rodamina 123 (Sigma-Aldrich) por 30 minutos protegida da luz a temperatura ambiente de acordo com Li et al (2014). A taxa de decaimento de fluorescência da Rodamina é proporcional ao potencial da membrana mitocondrial (156). Em seguida cada amostra foi transferida para os tubos de citometria e analisados com o auxílio do software FACSCANTO II (BD Biosciences), utilizando um lazer de argônio com excitação de 488nm e emissão de 525 nm para determinação da intensidade média de fluorescência de 10.000 células. A análise foi realizada usando software de FlowJo 7.6.4 (Treestar Ashland, EUA). Foram avaliados três experimentos independentes.
Avaliação da integridade do RNA ribossomal por electroforese em gel de microfluído Os ribossomos possuem entre 50 ou 80 proteínas ribossomais (R- proteínas) e até 6 tipos de rRNA que são montados em uma estrutura universalmente conservadas, embora com composição e complexidade
51 variável nos eucariotos (157). Nesse sentido, após os tratamentos, nós fizemos uma avaliação da integridade do utilizando o BioAnalyzer Agilent 2100 e o kit Agilent RNA 6000 Nano Chips como previamente mencionados. De acordo com as instruções do fabricante, foi preparado a matriz de corrida com 9 µl do gel com o corante fluorescente intercalante e aplicado no poço indicado. Em seguida foi aplicado o marcador de corrida (5 μL) com cada amostra (1 μL) e o padrão de peso molecular nos poços específicos. O microchip foi submetido a uma agitação de 2000 rpm por 30 segundos e em seguida introduzida no equipamento, que contém um detector de fluorescência induzida a laser. As corridas eletroforéticas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante e os resultados foram exibidos mostrando os perfis das corridas eletroforéticas para cada tratamento e na forma de um eletroferograma, através do qual é possível observar a integridade do rRNA pela razão dos picos 28S/18S.
Ensaio de excisão de sítio abásico Para avaliar se a inibição da função redox de APE1/REF-1 por E3330 também influencia a sua atividade de reparo, foi realizado um ensaio de excisão de sítios abásicos utilizando oligonucleotídeo marcados como previamente descrito em Silva-Portela et al (2016) e com algumas modificações (158). Foi utilizado um substrato de cadeia dupla de DNA (dsDNA) contendo um sítio abásico na posição 10 de um oligonucleotídeo marcado com Cy5 na posição 5’ (5'Cy5-CGGAATTAAAGXGCAAGACCT-3 'e 3'- 5'AGGTCTTGCCCTTTAATTCCG). A reação ocorreu conforme uma digestão enzimática comum na ausência ou na presença da enzima comercialmente disponível APE1/REF1 (NEB) contendo 100 fmol do oligonucleotídeo, 10X do tampão da enzima NEBuffer 4 e com ou sem 100 µM de E3330 durante 60 min a 37˚C. As reações foram finalizadas por adição de 20 µl de formamida e aquecidas a 95 °C durante 3 min. Amostras (20 µl) foram então aplicadas a um gel de poliacrilamida a 20% contendo Ureia 8 M em tampão TBE 1X a 300 volts durante 240 min. Os produtos da reação foram observados utilizando Sistema Chemidoc (Bio-Rad).
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Padronização da preparação de extratos celulares e imunoprecipitação de proteínas A padronização do ensaio de imunoprecipitação foi realizada após a estimulação inflamatória das células U937 como mencionada anteriormente, e subsequente tratamento com E3330. Resumidamente, ao final do modelo experimental as células foram então incubadas em formaldeído a 1% durante 10 minutos em homogeneização constante para garantir interações mais fortes entre as proteínas ( crosslink ). O crosslink foi então parado com a adição de 0,1 M de Glicina por 5 minutos no gelo. As células foram centrifugadas 2000 RPM por 5 min a 4º C e o sedimento lavado duas vezes em PBS gelado com inibidor de protease, colhidos por centrifugação e, em seguida, incubadas em tampão de lise (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, SDS a 0,1%, 1x inibidor de protease) durante 10 minutos à temperatura ambiente. O volume total do lisado celular para cada tratamento foi incubada durante 16 horas com os anticorpos apropriados e em tampão de diluição10X (Tris 50 mM pH 7,5, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM e 0,2% de Triton X-100). Duas imunoprecipitacões foram realizadas com diferentes anticorpos: anti-APE1 anti-NPM1 (3 µg da Santa Cruz Biotechnology) e uma alíquota foi marcado com uma IgG como controle negativo (Dako Cytomation, Colorado, EUA). Em seguida, os imunoprecipitados foram recuperados utilizando esferas de Sepharose G (GE Healthcare) e incubandos durante 2 horas. Em seguida, o imunoprecipitado foi submetido à centrifugação por 2 minutos, 2000 rpm a 4 ºC e lavado 3 vezes com tampão de diluição. Por fim, foi adicionado a cada imunoprecipitado tampão laemmli 5X e aquecido a 95ºC durante 10 minutos (159). O imunoprecipitado foi então analisado utilizando por western blotting como descrito anteriormente.
Padronização da Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) O ChIP é um ensaio poderoso para entender as interações proteína- DNA, modificações de histonas bem como para determinar se existe ligação direta uma dada proteína nuclear com um fator transcricional ou uma região promotora de interesse. Para este experimento foram induzidas a inflamação de 10 6 células por poço em um volume final de 4 ml de meio e subsequentemente tratadas com E3330. Após o período de tratamento as
53 células foram incubadas por 10 minutos a temperatura ambiente e agitação constante com 1% de formaldeído, para a formação dos crosslinks, adicionado diretamente ao meio de cultura. O meio foi então removido por centrifugação, e o precipitado de células foram lavadas 2 vezes com 2 ml de PBS 1X gelado contendo inibidores de protease. A partir desse passo, o ChIP foi realizado utilizando o kit comercial Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit (Merck Millipore) seguindo as orientações do fabricante. Esse Kit consiste nas etapas de neutralização do formaldeído, lavagens, recuperação das células, lise célular, fragmentação da cromatina, imunoprecipitação com anticorpos específicos, eluição das histonas, e para seguir as analises de DNA deve-se reverter os crosslinks. Um passo crucial nesse kit é a fragmentação do DNA, e como o interesse desta tese é analisar regiões promotoras, foi realizada uma padronização da sonicação no intuito de obter fragmentos de até 200 pares de bases. A fragmentação da cromatina foi feita após a lise celular com tampão específico do Kit utilizando um banho de ultrassom (Ciencor Scientific Ltda.) com repetições de 3 a 5 ciclos de fragmentação de 10 ou 20 segundos no banho e repouso de 30 segundos sempre com bastante gelo. As amostras foram visualizadas em gel de agarose 2% coradas com Syber Green para escolher o ciclo de sonicação ideal. Após a padronização da fragmentação da cromatina seguiu-se as instruções do Kit comercial utilizando o anticorpo anti- APE1 (3 µg da Santa Cruz Biotechnology) e dividiu as amostras em dois principais componentes: um para recuperação do DNA e a outra para realizar o western blotting de APE1/REF-1 e confirmar a eficiência do ChIP. O DNA foi recuperado por meio de extração fenol-clorofórmio, avaliado por eletroforese em gel de agarose a 2% corado com Syber Green e armazenado a 4ºC até a utilização na PCR. Para avaliar se o protocolo obteve sucesso e recuperou eficientemente fragmentos de DNA foi realizada uma PCR convencional para um promotor de TNF-α com primers para a região TNF -308 seguindo utilizando uma amostra de DNA e células MRC5 como controle positivo de amplificação de acordo com os procedimentos descritos em Fontes et al (2015b) (11).
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Predição de motivos de ligação e de fatores de transcrição Após a identificação dos clusters mais importantes em cada rede construída, foi feita uma análise nas regiões promotoras de cada grupo de transcrito com o objetivo de buscar consensos entre eles identificar possíveis matrizes ou padrões regulatórios, bem como os fatores de transcrição putativos que ali se ligariam. Esse protocolo se baseia em um método computacional utilizando o plugin iRegulon (http://iregulon.aertslab.org) do Cytoscape, o qual implementa uma abordagem de “genome-wide ranking-and-recovery ” que detecta regiões consenso enriquecidas para fatores de transcrição e seus conjuntos de alvos ideais (160). A coleção de matrizes reconhecidas pelo iRegulon são provenientes dos banco de dados TRANSFAC, Jaspar, FlyFactor- Survey, SelexConsensus, hPDI, YeTFaSCo, Factorbook, SwissRegulon, Tiffin e outros. A detecção dos pequenos e variáveis sítios de ligação para os FT (do inglês, short and variable TF binding sites -TFBS) utiliza o método matemático de Cluster-Buster, em que todas as regiões são ranqueadas e combinadas usando probabilidade (161). O valor para o score de enriquecimento do iRegulon é 3 que correspondente ao valor de FDR entre 3% e 9%. A busca de consensos foi feita em uma sequência de até 10 K da região promotora e selecionado Homo Sapiens como espécie, para os outros parâmetros foi utilizado o padrão do pluguin . As regiões motivo enriquecidas foram então encontradas a partir dos clusters 4 e 11 da rede regulada negativamente, e do 29, 33 e 35 da rede regulada positivamente. Em seguida foi predito os FTs que regulam as regiões promotoras de cada conjunto de transcrito estudado. Nessa análise apenas forão utilizado os FTs encontrados a partir dos bancos de dados curados SwissRegulon, TRANSFAC, Jaspar, de dados experimentais utilizando o hPDI, e provenientes de ensaios de Chip-seq depositados no ENCODE como Stark, Factorbook e o HOMER. O programa reconhece regiões consensos e busca fatores transcricionais a partir de um escore de enriquecimento normalizado mínimo (do inglês minimum normalized enrichment score -NES). NES acima de 3 é o valor padrão, acima de 4 tem uma boa significância e acima de 5 tem uma alta significância (162).
55
Análise estatística Para a análise estatística, os testes estatísticos 2-way ANOVA e teste T de Student foram aplicados usando Graphpad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA; http://www.graphpad.com). Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão quando necessário e foram considerados estatisticamente significativos os valores comparados ao nível de significância igual 95% ou menor (p < 0,05).
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V. RESULTADOS A função redox de APE1/REF-1 é importante para a viabilidade celular e a resposta inflamatória. Os nossos resultados mostram que após 24 horas de estimulação das células U937 com LPS e tratamento subsequente com E3330 durante mais quatro horas não houve mudanças na viabilidade das células (Figura 8A). No ensaio de cinética de estimulação inflamatória percebe-se que foi possível observar uma redução das células viáveis como uma consequência do tratamento apenas após 48 horas (Figura 8B). Adicionalmente, a inibição da atividade redox não induziu apoptose no modelo de inflamação por 24 horas e mais 4 horas com E3330 (Figura 9).
Figura 8. Método de exclusão pelo trypan blue para verificar a viabilidade celular : Detecção da viabilidade celular (A) após estimulação por LPS durante 24 horas, com subsequente tratamento E3330 durante 4 horas e (B) após 1 hora de estimulação com LPS e E3330 a incubação subsequente durante 2h, 4h, 6h, 24h e 48h. Os resultados representam a média das três repetições independentes para os ensaios de viabilidade celular, calculados em porcentagens relativas ao controle e analisados pelo teste estatístico ANOVA bi-caudal seguido pelo teste T de Student não pareado. p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. *p<0,05 e **p<0.01.
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Figura 11. Porcentagem de células apoptóticas determinada pela marcação com Anexina V-FITC/PI analisada por citometria de fluxo: (A), (B) e (C) mostram três experimentos independentes para a avaliação da razão da apoptose. Não houve indução significante de apoptose após 24 horas de resposta inflamatória e subsequente tratamento com E3330. Q1 marcação exclusiva com PI, Q2 Apoptose tardia, Q3 Apoptose inicial e Q4 Células viáveis.
Em um trabalho anterior do nosso grupo foi observado que após estimulação inflamatória por 24 horas e subsequente tratamento com E3330 por 4 horas os níveis de citocinas e quimiocinas tiveram uma diminuição significativa nos níveis de IL-6, IL- 8, TNF α e IL-10. Neste mesmo trabalho também foi realizado a análise de expressão do mRNA de IL-8, TNF-α e MCP1, e apesar de não haver significância estatística, observou-se uma redução na expressão de mRNA após o tratamento com E3330 (Coutinho 2013). No
58 entanto, as citocinas e quimiocinas possuem picos de expressão e tempos de meia-vida variando de horas até dias (163). Desta forma, por vezes não é possível quantificar e avaliar a ativação da expressão de várias destas moléculas em um mesmo tempo de tratamento. Assim, para obter achados adicionais sobre a regulação da resposta inflamatória, também observamos uma influencia sobre a expressão de cito/quimiocinas numa cinética de estimulação inflamatória. Os nossos resultados mostraram que, como esperado, o LPS induz a produção de cito/quimiocinas, e a co-incubação com E3330 diminui significativamente os níveis de IL-10 em todos os tempos estudados, MIP1 α depois de 4 e 6 horas de tratamento e IL-8, TNF-α, níveis MIP1 β apenas após 6 horas de tratamento (Figura 10).
Figura 10. Quantificação de moduladores inflamatórios após cinética de estimulação inflamatória: Foram quantificados os níveis de cito/quimiocinas após estimulação da inflamação por 1 hora com LPS e subsequente tratamento com E3330. As quantificações foram realizadas após 2 horas, 4 horas e 6 horas de estimulação inflamatória. Foi utilizado o teste T de Student não pareado para avaliar a significância do tratamento com LPS em relação ao E3330. p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. *p<0,05 e **p<0.01.
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De maneira geral, foi possível observar que a inibição da função redox de APE1/REF-1 foi capaz de inibir a expressão de citocinas e quimiocias após estimulação inflamatória nos dois modelos estudados.
Obtenção das sequências e montagem genômica O sequenciamento do RNA gerou 411.894 sequências para o tratamento apenas com LPS e 241.244 para o tratamento com E3330 e após mapeamento com 98% de identidade foi possível um alinhamento bruto de 74 % e 69,2% respectivamente (Tabela 2). Devido à obtenção de quantidades diferentes de sequências geradas para cada tratamento, todas as análises quantitativas basearam-se em dados normalizados, dividindo-se a ocorrência de cada hits de um gene pelo total de sequências obtidas em cada tratamento ×10000. A porcentagem de sequencias filtrados pelo pslCDnaFilter não levou a uma diminuição significativa. Tabela 2: Descrição quantitativa dos alinhamentos obtidos em cada tratamento, porcentagem de mapeamento e abundância de rRNAs obtidos nas amostras. Nº sequências Nº alinhadas sequências (98% Porcentagem Após filtro Porcentagem dado bruto identidade ) alinhada/bruto Ribossomal alinhada/bruto
LPS
411.894 305.332 74% 169.404 41%
E3330
241.244 166.943 69,2% 118.619 49%
Impacto do tratamento com E3330 sobre transcrição: visão global dos genes diferencialmente expressos Para avaliar a expressão global desses genes após inibição da função redox de APE1/REF-1 em um modelo de estimulação inflamatória nós realizamos uma análise de RNA-Seq. As listas de genes diferencialmente expressos foram geradas após comparação entre os reads encontrados para o tratamento com E3330 em relação aos encontrados no LPS. Sendo assim foram geradas duas listas com 619 genes regulados negativamente e 629
60 genes regulados positivamente com fold change ≥3.0 ou ≤-3.0 (Tabelas A1 e A2 em anexo). As análises preliminares utilizando os Top 50 genes regulados positivamente e negativamente são ilustrados na Figura 11. Podemos observar que as mais robustas alterações da expressão gênica apontam para uma regulação negativa de genes envolvidos com a biogênese ribossomal ( MINA , RRS1 , RPL27, RPL36AL e ISG20L2 ), expressão gênica ( PUF60, ESRRA, TAF7, NCOA1 e SS18L1 ), e regulação positiva de genes relacionados com diferenciação celular ( KLF10, SH3PXD2B e ACVR2B ) e processo catabólico de xenobióticos ( CRYZ ).
Figura 11. Visão geral de genes diferencialmente expressos após o tratamento com E3330: Top 50 regulados (A) Negativamente e (B) Positivamente.
Para validar os dados obtidos pelo RNA-Seq e as abordagens utilizadas para identificar as diferenças no nível de expressão gênica nas duas listas geradas, selecionamos 5 genes regulados negativamente ( MYC, CCL2, MINA, NCOA1 e ESRRA ) e 5 genes regulados positivamente ( ATR, KLF10, CRYZ,
61
CDK9 e CYB5R4 ). A expressão de cada um dos 10 genes selecionados foi confirmada por RT-qPCR e apresentaram padrões similares ao detectado no RNA-Seq (Figura 12). As diferenças mostradas entre os fold changes são provavelmente devido à abordagem e sensibilidade distintas entre os dois métodos.
30
qPCR 20 RNAseq
10
0 Fold Change
-10
CCL2 MYC MINA ESRRA NCOA1 ATR CYB5R4 CDK9 KLF10 CRYZ
-20 Figura 12. Validação do transcriptoma : Comparação entre os resultados de diferença de expressão dos dados do 454 (RNA-Seq) com a validação técnica (RT- qPCR).
Para entender melhor o impacto na transcrição global após o tratamento com E3330 sobre a expressão gênica e investigar as funções biológicas dos genes diferencialmente expressos de cada lista gerada, foi feita a classificação de acordo com Gene Ontology (GO) e com o banco de dados de vias metabólicas do KEGG. Cada lista foi inserida no programa e analisada individualmente. Apenas 575 (93%) genes regulados negativamente e 570 (90%) regulados positivamente foram anotados na ferramenta, os remanescentes são genes que não tem função definida ou são genes desconhecidos. Os resultados dessa classificação foram resumidos em gráficos de pizza, que mostram as porcentagens de genes alvo com função definida e que foram incluídos em alguma categoria de Processo Biológico, Componente Celular e Função Molecular.
62
As classes mais enriquecidas relacionadas aos Processos Biológicos Para os genes regulados negativamente foram: biogênese do complexo ribonucleoprotéico (7%), organização mitocondrial (6%), reações de óxido- redução (11%) e resposta celular ao estresse (10%), sendo este relacionado com genes pró-inflamatórios, (Figura 13A). Ubiquitinação de proteínas (6%), reparo de DNA (7%), fase M da divisão celular (7%), e modificação da cromatina (6%) foram os principais termos anotados relacionados com os genes regulados positivamente (Figura 13B). Interessantemente, para as duas listas o termo mais representado está relacionado à transcrição, mas esses genes regulam a expressão de outros genes em distintos processos biológicos.
A
Figura 13. Processo Biológico das listas de genes diferencialmente expressos analisados pelo programa DAVID: (A) Genes anotados regulados negativamente. (B) Genes anotados regulados positivamente. As áreas do gráfico são proporcionais ao número de genes classificados em cada termo.
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Em seguida, selecionamos a categoria Componente Celular e podemos observar que os termos organelas e núcleo estão presentes em grande ambulância nas duas listas. Em relação aos genes regulados negativamente foi possível observar as categorias ribossomo e mitocôndria, em contrapartida, os genes regulados positivamente estão mais associados a organelas membranosas tais como complexo de Golgi, retículo endoplasmático e endossomo (Figura 14).
A
Figura 14. Componente Celular das listas de genes diferencialmente expressos analisados pelo programa DAVID: (A) Genes anotados regulados negativamente. (B) Genes anotados regulados positivamente. As áreas do gráfico são proporcionais ao número de genes classificados em cada termo.
Já na análise da função molecular merece destaque a anotação de termos relacionados com expressão gênica para a lista de regulação negativa, e notadamente quase metade desses genes estão envolvidos à ligação com
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ácidos nucleicos (39%). A lista de regulação positiva revelou principalmente termos relacionados com função catalítica de enzimas e ubiquitinação (Figura 15).
A
Figura 15. Função Molecular das listas de genes diferencialmente expressos analisados pelo programa DAVID: (A) Genes anotados regulados negativamente. (B) Genes anotados regulados positivamente. As áreas do gráfico são proporcionais ao número de genes classificados em cada termo.
Além disso, para identificar vias metabólicas que estariam sendo reguladas após a inibição redox de APE1/REF-1 nós utilizamos os recursos da ferramenta KEGG. Segundo o banco de dados apenas 165 genes regulados negativamente puderam ser anotados e classificados em 6 vias bioquímicas enriquecidas, as quais são: Ribossomo (14 genes), Fosforilação oxidativa (10 genes), Replicação do DNA (5 genes), Metabolismo de pirimidinas (8 genes),
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Doença de Huntington (11 genes) e Metabolismo de glicerofosfolipidios (6 genes). No entanto apenas a via enriquecida do Ribossomo possuiu significância estatística após correção de Benjamini (Figura 16). Adicionalmente, nós identificamos 4 vias metabólicas dos 151 genes anotados da lista de regulação positiva, as quais são: FT (5 genes), Endocitose (11 genes), Via de sinalização da insulina (9 genes) e Biossíntese e processamento de N-glicanos (5 genes), mas nenhuma via enriquecida possuiu significância estatística.
Figura 16. Anotação de vias metabólicas: Proteínas ribossomais reguladas negativamente após inibição redox de APE1/REF-1, destacando em vermelho os genes que são reprimidos, adaptado de KEGG Pathway, Kanehisa Laboratories, Universidade de Kyoto, no Japão.
A análise do RNA-Seq após inibição da função redox de APE1/REF- 1 revela várias interações gênicas importantes na regulação de importantes dos processos celulares Cada lista de transcritos obtida foi utilizada individualmente para a construção de redes de interações utilizando o banco de dados online STRING 9.0 e em seguida visualizadas e analisadas pelo Cytoscape 3.2.0. Este
66 software suporta e reconhece diversas anotações funcionais de genes, tais como provenientes dos bancos de dados Gene Ontology, KEGG, modelos biológicos do Systems Biology Markup Language (SBML), interações proteicas dos bancos de dados BIND e TRASFAC. A nossa análise de PPI pelo Cytoscape mostrou que a rede de regulação negativa possui 1.540 nós e 3.323 conectores (Figura 17), enquanto a rede regulada positivamente apresentou 2.939 nós e 7.356 conectores (Figura 18). Para ambas as listas de genes não foi possível obter uma única rede, mostrando que existem várias vias diferencialmente expressas que não interagem entre si. A partir da análise com o plugin MCODE da rede negativamente regulada foram obtidos 23 clusters com score acima de 3, e 33 para as redes positivamente reguladas.
Figura 17. Biologia de Sistemas gerada a partir do banco de dados STRING 9.0 e visualizada pelo Cytoscape: Topologia da rede regulada negativamente e em destaque na cor amarela os genes que possuem um fold change ≤-3.
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Figura 18. Biologia de Sistemas gerada a partir do banco de dados STRING 9.0 e visualizada pelo Cytoscape: Topologia da rede regulada positivamente e em destaque na cor amarela os genes que possuem um fold change ≥3.
Em relação às categorias funcionais enriquecidas foram realizada duas abordagens de acordo com o valor de p encontradas em cada rede. Foi feito a categorização das listas completas e das listas com fold change ≥3.0 ou ≤-3.0 sem qualquer tipo de adição de outros genes. Na rede de regulação negativa a categoria com maior enriquecimento com valores de expressão ≤-3.0 continua sendo o processo metabólico de compostos nitrogenados como encontrado na
68 análise da lista total. No entanto, o número de categorias é reduzido e apenas continuam as relacionadas à expressão gênica, processo metabólico de ácidos nucleicos, biossíntese de macromoléculas, metabolismo de RNA, tradução, biogênese ribossomal e elongação na tradução (Gráfico 1).
Gráfico 1: Distribuição dos principais processos biológicos da rede regulada negativamente com um p valor com significância estatística após análise com o BINGO. Ao lado de cada barra está representado o número de genes encontrados em cada processo.
Adicionalmente, a análise de ontologia gênica para a rede regulada positivamente revelou que categorias funcionais como ciclo celular, transcrição, catabolismo de proteínas via ubiquitinação, Reparo de DNA e localização de macromoléculas modificações pós-traducionais foram mais enriquecida (Gráfico 2). É possível notar que Resposta ao estresse e transdução de sinal
69 não são categorias encontradas na análise da à lista com valores de expressão ≤-3.0.
Gráfico 2: Distribuição dos principais processos biológicos da rede regulada positivamente com um p valor com significância estatística após análise com o BINGO. Ao lado de cada barra está representado o número de genes encontrados em cada processo.
Foram calculadas as medidas de centralidade para cada uma dessas listas, o que permitiu a identificação dos nós centrais e que se comportavam como hubs na rede total de cada lista. Em relação à rede regulada negativamente obtivemos as seguintes métricas de centralidade: Betweenness Máximo 15.218; Betweenness Médio 604; Node Degree Máximo 34 e Node Degree médio 4, assim a Tabela 3 mostra os 25 top hubs para a essa rede, os quais possuem um fold change ≤-3, em ordem decrescente relacionado ao Node Degree .
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Tabela 3: 25 top genes que se comportam como hub na rede negativamente regulada com fold change ≤-3.
Gene Cluster Betweenness Node Degree Fold NIP7 4 4.103 16 -3,9 RPL35 4 1.585 16 -3,3 RPL36 4 741 15 -3,2 RPL39 4 545 15 -4,2 RPS12 4 1.003 15 -4,2 RPS19 4 545 15 -3,7 RPL21 4 153 14 -3,2 RPLP2 4 243 14 -3,5 RPS26 4 153 14 -3,2 RRS1 11 538 14 -8,4 NOP2 4 806 13 -4,0 PWP2 4 361 13 -3,1 RPL28 4 704 13 -3,3 SPCS1 4 807 12 -3,5 TBL3 4 683 12 -3,5 ISG15 4 3.741 11 -4,9 MRPS12 4 240 11 -4,2 NVL 4 697 11 -3,5 RRP9 4 241 11 -3,5 SRP14 4 511 11 -3,2 EIF3F 4 230 10 -3,2 NGDN 4 5 10 -3,5 PES1 4 534 10 -3,1 ABT1 4 0 9 -4,2 POLR1E 11 113 9 -5,6
Interessantemente a maioria dos genes que se comportam como hub na rede regulada negativamente são pertencentes ao cluster 4, o qual possui 78 nós e 359 interações entre si (Figura 19A). A avaliação das medidas de centralidades desse cluster mostrou que os genes NIP7, ISG15, RPS12 , RPS35, RPL36, NOP2, RLP28, SPCS1,TBL3, NVL se comportam como nós hub-gargalo (Figura 19B). Utilizando o plugin BINGO foi possível observar que as categorias funcionais enriquecidas desse cluster estão relacionadas com expressão gênica, tradução, processamento de rRNA e biogênese ribossomal. Esses dados corroboram com os resultados gerados pelo DAVID e KEGG, em que o tratamento com E3330 é capaz de diminuir a biogênese ribossomal em todas as três abordagens de bioinformática de forma estatisticamente significante.
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Figura 19. Cluster 4 da rede negativamente regulada: (A) Topologia do cluster 4 com 78 nós e 359 conectores. (B) Gráfico representando as métricas do Betweenness e Node Degree do cluster 4 e os genes que se comportam como hub - gargalo que possuem um fold change ≤-3.
Outro Cluster que merece destaque é o 9, o qual possui 62 nós 158 interações (Figura 20A) e está relacionado com ciclo celular e processos metabólico do DNA. Neste cluster encontramos o gene APEX1 o qual possui um fold chage de -1,5 pela metodologia do RNA-seq. Embora não possua os maiores valores de Betweenness e Node Degree , suas métricas estão acima da média encontrada, podendo ser considerada um gene hub-gargalo (Figura 20B e C).
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Figure 20. Cluster 9 da rede negativamente regulada: (A) Topologia do cluster 9 com 62 nós e 158 conectores. (B) Gráfico representando as métricas do Betweenness e Node Degree do cluster 9 mostrando que APEX1 se comportam como hub -gargalo. (C) Comparação das métricas de centralidade de APEX1 e os valores máximo, mínimo e médio encontrados na rede regulada negativamente.
Já na rede regulada positivamente obtivemos as seguintes métricas de centralidade: Betweenness Máximo 3.418.909; Betweenness Médio 11.282; Node Degree Máximo 59 e Node Degree médio 5. Os 25 top hubs para a essa rede, os quais possuem um fold change ≥3, em ordem decrescente relacionado ao Node Degree são representados na Tabela 4.
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Tabela 4: 25 top genes que se comportam como hub na positivamente regulada com fold change ≥3. Node Gene Cluster Betweenness Degree Fold GTF2H3 29, 33 160.437 13 4,6 PRKACB 33 116.820 12 4,2 MDM2 24, 29, 35 473.616 10 3,6 JAK2 33, 85 43.419 10 4,7 RAD50 35 109.450 10 3,9 ATR 35 273.796 9 3,5 CPS1 8 38.477 9 3,5 WDR36 87, 115 39.215 8 4,2 XPO1 46 228.329 8 3,1 BARD1 35 30.287 7 3,5 RNF2 35 58.527 7 5,7 PRKAG2 33 10.856 7 5,7 ACVR1 33 8.712 6 5,7 GTF2B 29 16.334 6 29,9 PHLPP2 33, 74, 85 24.572 6 9,9 RAD17 35 7.900 6 8,5 POLR2G 29 29.940 6 4,2 GTF2A1 29 5.400 6 4,2 ATF2 46, 92 6.023 6 3,1 EIF2C3 2, 56 190 6 6,4 RPP38 87 6.537 5 9,9 GNA11 74 13.072 5 4,2 RPA3 35 2.048 5 4,2 GTF2E2 29 125.719 5 4,9 RBM28 78 14.484 5 3,4
Analisando-se a rede de interações regulada positivamente, pode-se observar a formação de um núcleo central por genes essenciais para a resposta ao dano ao DNA, reparo de DNA, e modificação da cromatina. Tais genes são UBC (Node Degree 59), HDAC1 (Node Degree 46), BRCA1 (Node Degree 33 ) e APEX1 (Node Degree 30) e suas medidas de centralidades estão representadas nas Figuras 21, no entanto nenhum destes genes obtiveram um fold change maior que 3. Embora o gene da APEX1 tenha aparecido na lista negativamente regulada, como a sua inibição é alvo desse estudo, nós o inserimos para a montagem da rede regulada positivamente e avaliamos sua interação com os outros genes. A APEX1 apareceu no cluster 24, com 193 nós e 355 conectores,
74 o qual é relacionado com reparo de DNA, regulação do ciclo celular e replicação do DNA. Merece destaque, pois a APEX1 obteve métricas de centralidade bem acima da média, Betweenness 3.418.908 e Node Degree 30 comportando-se como um gene hub -gargalo, o qual faz muitas interações com outros genes e conecta vários outros módulos.
Figura 21. Medidas de centralidade para os principais genes hub da rede regulada positivamente: (A) UBC (Node Degree 59, Betweenness 2.254.240), (B) BRCA1 (Node Degree 33, Betweenness 5.122), (C) HDAC1 (Node Degree 46, Betweenness 86.641), (D) APEX1 (Node Degree 30, Betweenness 3.418.909).
Um importante cluster que contém vários genes hubs com um fold change acima de 3 foi o 29, o qual está relacionado com a iniciação da transcrição via RNA polimerase II. Neste cluster encontramos MDM2 , GTF2H3, GTF2E2, os quais se comportam como genes hub-gargalo já que suas métricas estão acima da média encontrada (Figura 22).
75
Figura 22. Cluster 29 da rede positivamente regulada: (A) Topologia do cluster 29 com 11 nós e 29 conectores. (B) Gráfico representando as métricas do Betweenness e Node Degree do cluster 29 e os genes que se comportam como hub - gargalo que possuem um fold change ≤3.
Função redox de APE1/REF-1 controla a expressão de várias proteínas importantes Curiosamente, embora APE1/REF-1 seja capaz de se autorregular (4), a inibição da sua atividade redox não foi suficiente para diminuir a sua expressão de forma significativa, tanto em nível de proteína quanto de mRNA (Figura 23A- C). Adicionalmente, na nossa análise do transcriptoma, c-Myc foi regulada negativamente após o tratamento com E3330 tanto em nível de mRNA quanto proteína, no nosso modelo de estudo utilizando células U937, em comparação com as células tratadas apenas com LPS (Tabela 1A Anexo, Figura 12 e 23A- B). Já é bem descrito na literatura que a ativação inflamatória por LPS induz a expressão de NF-κB e EGR-1, em nosso modelo de estudo também observamos por western blotting que o LPS induziu a expressão dessas proteínas, e após inibição da função redox de APE1/REF-1 houve diminuição significativa tanto em nível de mRNA quanto proteína da porção catalítica p65 de NF-κB, que é codificada pelo gene RELA , (Tabela 1A Anexo, Figura 23A-B), mas transcricionalmente EGR-1 teve um aumento de expressão de 1,8 vezes e em relação ao nível proteico observamos uma leve diminuição mas sem significância estatística (Figura 23A-B). Também foi possível observar um aumento dos níveis da MDM2 de 90 kDa e da sua porção clivada em 60 kDa, no entanto apenas a porção clivada obteve significância estatística na
76 comparação entre LPS e E3330. Corroborando com o encontrado o transcriptoma foi encontrado um leve aumento dos níveis de Peroxirredoxina 1 (PRX) na análise de proteínas (Figura 23A-B), mas sem significância estatística. Também foi possível observar uma leve diminuição dos níveis de RLP35 e nenhuma alteração de NPM1 e RPS26 quando comparamos o grupo estimulado com LPS ao com E3330. Na nossa análise encontramos que tanto os níveis proteicos de Caspase 3 quanto os de mRNA são menores após o tratamento com E3330 comparando apenas com o estimulado com o LPS, mas sem significância estatística (Tabela 1A Anexo, Figura 23A-B).
Figura 26: A inibição da função redox de APE1/REF-1 afeta a expressão de proteínas diferentes. (A) Análise da expressão proteica por Western blotting de 77 diferentes proteínas em células U937. (B) Representação gráfica dos níveis proteicos após a normalização com a β-actina seguida da comparação com os valores obtidos no controle não tratado. (C) Expressão dos níveis de mRNA de APE1/REF-1 no modelo experimental. Foi realizado o teste T de Student não pareado para análise estatística da comparação entre o grupo LPS em relação ao E3330. P <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. *p<0,05, **p<0.01 e ***p<0.001.
Análise de alterações no potencial de membrana mitocondrial O potencial de membrana alterado pode indicar uma atividade mitocondrial comprometida e fornecer parâmetros como ativas/inativas metabolicamente, em que as células permanecem preservadas ou sofrem alterações que podem levar até a morte. A intensidade de fluorescência indica a relação com a função mitocondrial inibida pela ligação das membranas mitocondriais do composto ou dos radicais livres produzidos, com a inibição do transporte de elétrons. Os nossos resultados mostram que não houve comprometimento da atividade mitocondrial em nenhum dos grupos de estudo (Figura 24).
Figura 24. Potencial de membrana mitocondrial avaliado por citometria de fluxo após incubação de cada grupo de estudo com a sonda Rodamina 123: Os valores são indicados em porcentagem relacionados ao grupo controle e o potencial de membrana não se alterou de forma significativa em nenhum dos grupos.
Função Redox de APE1/REF-1 pode controlar o processamento de rRNA A maior quantidade de RNA na célula corresponde aos rRNAs, e são encontrados agregados a proteínas ribossômicas. O processamento do rRNA corre no nucléolo e envolve vários passos, que começa com a associação das
78 proteínas ribossômicas ao pré-rRNA, e um processamento com problemas leva alterações dos níveis das sequências do pré-rRNA. Conforme mencionado anteriormente, o cluster com o maior número de proteínas hub-gargalos da rede regulada negativamente estão relacionadas com biogênese ribossomal e processamento de rRNA, indicando que existe alterações importantes nesses processos biológicos. Inicialmente observamos que no transcriptoma existe uma diminuição de aproximadamente 13% de sequências ribossomais na amostra de E3330 em relação a do LPS (Tabela 2). Para avaliar a relação da função redox de APE1/REF-1 com o processamento de rRNA inicialmente fizemos uma análise de expressão do rRNA 47S (imaturo) e do 28S (maduro) e observamos que não houve diferença significativas entre os grupos (Figura 25A-B). No entanto, para avaliar se existia um problema no processamento do rRNA nós realizamos uma eletroforese em capilar e quantificamos a razão entre as bandas correspondentes ao 28S e 18S. Curiosamente, foi observado uma diminuição da razão 28S/18S nas amostras tratadas com E3330 em torno de 12% e 20% em relação ao controle e LPS respectivamente, provavelmente devido a uma maior degradação do rRNA (Figura 25C).
Figura 25. Expressão e processamento do rRNA: Regulação da expressão de rRNA. (A) 47S (B) 28S. (C) Eletroferogramas de RNA isolado a partir de células de U937 na plataforma de microfluidos e o perfil eletroforetico de cada tratamento. 79
A inibição da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 não interfere na sua atividade de APendonuclease. Uma vez inibida a função redox de APE1/REF-1 a sua atividade de reparo poderia estar superativada e induzir danos na cromatina através do aumento dos sítios abásicos. No entanto, na concentração utilizada de E3330 não foi observado efeito sobre a sua atividade APendonuclease de DNA in vitro (Figura 30).
Figura 26. Avaliação da atividade APendonuclease de APE1/REF-1 com oligonucleotídeo marcado: Após inibição da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 não houve alteração na atividade de reparo da enzima.
Padronização da imunoprecipitação de proteínas com APE1/REF-1 e NPM1 Foram realizados ensaios de imunoprecipitação usando-se esferas de Sepharose G (GE Healthcare), seguindo as especificações do fabricante, a partir de extratos de proteínas totais após os tratamentos previamente padronizados. Tentou-se imunoprecipitar nos diferentes extratos as proteínas APE1/REF-1 e NPM1 usando seus respectivos anticorpos e nas concentrações indicadas pelo fabricante. As imunoprecipitações foram submetidas a ensaios
80 de Western blotting, no entanto, mesmo após duas tentativas para cada anticorpo ainda não foi possível recuperar uma boa quantidade de proteínas (Figura 27).
Figura 27. Co-Imunoprecipitação de proteínas APE1/REF-1 e NPM1: (A) Imunoprecipitação com anticorpo anti-APE1 seguido de Western blotting para a mesma proteína. (B) Imunoprecipitação com anticorpo anti-NPM1 seguido de Western blotting para a mesma proteína.
Padronização da Imunoprecipitação de Cromatina com APE1/REF-1 Como é sabido APE1/REF-1 regula vários FT (22), nesse sentido estamos tentando padronizar ensaios de ChIP para entender melhor a sua função da regulação transcricional de outras proteínas. O primeiro passo foi realizar uma sonicação seriada para determinar qual seria o melhor ciclo para a fragmentação ideal do DNA nas células U937. Após corrida eletroforética em gel de agarose 2% podemos avaliar que o melhor ciclo de fragmentação foi o de cinco séries de sonicação de 10 segundos e intervalos de 30 segundos entre cada (Figura 28A). Após escolha do ciclo de fragmentação adequado foi prosseguido o ChIP de acordo com as especificações do fabricante do Kit. Ao final dos procedimentos e lavagens foi possível separar o eluato em 2 porções, uma para analise de proteínas e outra para analise de DNA. Para verificar se conseguimos fazer o ChIP com o anticorpo de APE1/REF-1 foi realizado um Western blotting e incubado com o próprio anticorpo. Assim como a imunoprecipitção, não foi possível ter uma boa eficiência no ChIP (Figura 28B). Mesmo não tendo uma boa imunoprecipitação de cromatina foi realizada uma PCR convencional no intuito de identificar se foi possível recuperar DNA. Após
81 quantificação das amostras foi realizada uma PCR convencional com primer para o promotor 4 de TNF que possui 200 pares de base. Na Figura 28C pode- se observar que apenas não houve amplificação do promotor em questão para o LPS.
Figura 28. Imunoprecipitação de cromatina com APE1/REF-1: (A) Amostras de DNA fragmentado provenientes da padronização da sonicação. 1- 3 ciclos de sonicação de 10 segundos; 2 e 3- 3 ciclos de sonicação de 20 segundos; 4 e 5- 5 ciclos de sonicação de 10 segundos; 6- vazio; 7-4 ciclos de sonicação de 20 segundos; 8 e 9- 5 ciclos de sonicação de 10 segundos; 10 e 11- 5 ciclos de sonicação de 20 segundos; (B) Imunoprecipitação da cromatina com anticorpo anti-APE1 seguido de western blotting para a mesma proteína. (C) PCR convencional para o promotor 4 do gene TNF . M- Mercador de peso molecular e CP-controle positivo.
Busca de motivos para fatores de transcrição Para a análise das regiões promotora dos transcritos presentes nos principais clusters de cada rede de interações foi realizada a busca de padrões de ligação de sítios putativos de transcrição através do plugin iRegulon. Com essa abordagem foi possível identificar inicialmente os padrões de sequências motivos nos grupos de transcritos selecionados. Em seguida analisou-se o conjunto dessas regiões promotoras e foi possível predizer os FTs que
82 provavelmente se ligariam em cada conjunto de transcritos, os quais podem ser responsáveis pelas alterações da expressão gênica encontradas no transcriptoma. A representação do motivo consiste na identificação de uma matriz que mostra a diversidade da composição de base para cada posição, e a sequência apresenta em cada posição o nucleotídeo com o score mais elevado. Desta forma, as Tabelas 5 e 6 mostram as representações das principais matrizes encontradas por frequência de bases com alto valor de NES para a rede regulada negativamente e positivamente, respectivamente.
Tabela 5: Principais matrizes consensos reconhecidos nas regiões promotoras dos transcritos da rede regulada negativamente . Matriz consenso NES FT Genes do Cluster 11 com essa matriz
7,5 ZNF143 CD3EAP, DUS3LM UBQLN4, RRS1, PRPF31, EXOSC1, RPL41, ISG20L2, RPL35A, RSRC1, POLR2J, POLR1E, RPL27
7,6 ATF3 PRPF31, TRMT2A. NOC4L. RNASEH1
6,3 SIN3A, DDX55, TFB2M, ETV6, RRS1, SNRPD2, ETV3, RPL41, ISG20L2 ERF
6,1 MYC, TFB2M, RIOK1, GABPA, RPS25, CIRH1A, ELK1, WDR55, RRS1, ELK2 RPL41, DDX55, RPL27, POLR2J,
83
RPL36AL, TRMT2A, ISG20L2, PRPF31, PIN1
5,5 PITX2. PIN1, WDR55, PITX3, RPL27, RPL41 PITX1
Matriz consenso NES Genes do Cluster 4 com essa matriz
7,0 ZNF143 PAN2, RPS26, PES1, DHX30, GMPR2, RPLP2, THOC6
6,3 EHF, HDAC7, RPS19, ELF3, PAN2, MRPL17, ELF5 RPL28
6,1 FLI1, HDAC7, RPS19, ETV2, PAN2, GMPR2, ETV1, FURIN, MRPL17, ELK4 NGDN, RPL21,
RPS26, NIP7,
6,0 RELA, RPL28, PAN2, RELB, RPS19, FURIN STAT6
5,8 ELF2, HDAC7, RPS19, ELF1, RPL28, GMPR2, ELF4, FURIN, NOP2, ELK1, RPS26, RPLP2,
GABPA NGDN, PAN2, RPL21
84
Tabela 6: Principais matrizes consensos reconhecidos nas regiões promotoras dos transcritos da rede regulada positivamente. Matriz consenso NES FT Genes do Cluster 29 com essa matriz
5,9 LEF1, GTF2A1, MDM2, TASP1, TCF7, GTF2B TCF7L2
5,9 HOXC11, GTF2A1, TBPL1, TASP1 HOXC10, CDX1, HOXA10
5,4 TBP, GTF2A1, GTF2B TAF1, POLR2A. TBPL2
Matriz consenso NES FT Genes do Cluster 33 com essa matriz
10,3 BP1, TRAM1, RPN1, SRP54 CREB3, ATF6
6,8 NFYA, LMAN1, SPCS3, SRP54, NFYB SRP9
6,7 CREB3, RPN1, SRP9, SMC5, SRP54, XPB1, TRAM1 ATF6
6,4 SMAD1, MAGT1, SMC2, TRAM1, GFI1 LMAN1, SRP54, SRP9
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5,1 SRF MAGT1, SMC5, LMAN1, SPCS3, TRAM1, SMC2, MRPL16
4,6 E2F1, TRAM1, SMC2 E2F4, E2F3, E2F7
Matriz consenso NES FT Genes do Cluster 35 com essa matriz
6,0 HSF1, RYBP, UBE2B, EEF1E1, HSF4, DBF4 HSF2
5,3 ATF4, JMY, SENP2, RNF2, UBE2B ATF5, ATF6, ATF7, CREB1,
CREM
5,0 MAX, UBE2B, RPA3, EEF1E1 MYC, MXI1, USF1
Os clusters analisados foram escolhidos baseados nos seus parâmetros de centralidades, em que foi selecionado aqueles com transcritos que tivessem altos valores de Node Degree . Os cluesters 4 e 11 da rede regulada negativamente estão ambos relacionados com biogênese ribossomal e processamento de rRNA. Já os clusters 29, 33 e 35 da rede regulada positivamente estão respectivamente relacionados com início da transcrição, transdução de sinal e localização de proteínas, e reparo de DNA. Pela avaliação das matrizes apresentadas foi possível observar posições bastante conservadas entre os transcritos analisados. Nas matrizes que não se
86 observam nucleotídeo em determinada posição acontece porque tal base não surge com uma grande representatividade em tal sequência. Após a análise das sequências consensos, o iRegulon lista uma série de fatores transcricionais enriquecidos, ranqueados de acordo com o seu NES. A partir dos FT encontrados em cada analise dos clusters escolhidos foi possível gerar uma nova rede de interação para cada lista de transcritos inseridos no programa. Interessantemente, ao submeter toda a rede regulada negativamente à análise de FT foi possível observar um enriquecimento para os fatores transcricionais ETS1, ELK1, ATF3, ETV6 com NES acima de 5 e P53 com o NES de 3,1. A figura 29 apresenta os resultados obtidos apenas para os clusters 4 e 11, merecendo destaque para GABPA, MYC, MAX e ZNF143 que são fatores transcricionais comuns.
Figura 29: Rede de regulação trasncricional dos clusters 4 e 11 regulados negativamente . Em lilás estão representados os transcritos e em verde os FTs enriquecidos. Os genes alvos dos diferentes FTs estão conectados por diferentes cores de setas.
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Adicionalmente, a mesma abordagem foi feita em toda rede regulada positivamente e encontramos os seguintes FTs: YY1 (NES 5,2), ZBTB33 (NES 4,0), ZSCAN10 (NES 3,8) e ELK1 (NES 3,4). Na análise específica dos clusters apenas GATA1 foi encontrado em comum (Figura 30).
Figura 30: Rede de regulação trasncricional dos clusters 29, 33 e 35 regulados positivamente . Em verde estão representados os transcritos e em amarelo os FTs enriquecidos. Os genes alvos dos diferentes FTs estão conectados por diferentes cores de pontes.
88
VI. DISCUSSÃO O nosso genoma é constantemente exposto a diversos eventos que danificam o DNA como, por exemplo, radiação, infecção por microrganismos, produtos químicos, reações endógenas, formação de radicais livres e a sua própria replicação. A manutenção da integridade do genoma é vital aos organismos vivos. O entendimento de como a resposta ao dano é ativado após a tumorigênese, bem como após a indução da resposta imune tem sido bastante estudado nos últimos anos (164). Durante a infecção a geração de ERO e ERN ativa vários FT, sensitivos a regulação redox, tais como NF-κB, resultando na ativação da resposta pro-inflamatória, a qual intensifica o dano oxidado nas células e principalmente no DNA (165). No primeiro artigo produto dessa tese foi discutido o considerável progresso realizado para melhorar a compreensão dos papéis das vias de sinalização DDR e mecanismos de reparo do DNA no desenvolvimento e função do sistema imunológico. Muitas vias de reparo de DNA estão envolvidas tanto na proteção contra o estresse oxidativo, na regulação da transcrição de moléculas importantes para o controle da infecção, bem como possuem um papel fundamental na geração da diversidade e especificidade da resposta imune adquirida (64). A elucidação das vias que ativam a imunidade inata e adquirida é importante para o advento de novas intervenções que auxiliem o tratamento, diagnóstico e prognóstico de doenças. Adicionalmente, entender como ocorre à sinalização molecular que determina a ação multifuncional da APE1/REF-1 é essencial, uma vez que as suas várias atividades podem ser atribuídas à sua capacidade de interagir com diferentes proteínas parceiras (1,95). Uma diminuição da expressão de APE1/REF-1 pode provocar a parada do crescimento celular, disfunção mitocondrial, apoptose, alterações na homeostasia celular e na estrutura do citoesqueleto (100). No entanto, permanece uma lacuna na literatura no que diz respeito a qual atividade de APE1/REF-1 é responsável por determinada função biológica. O segundo passo do trabalho foi observar se existia alguma mudança na resposta da viabilidade celular após inibição redox de APE1/REF-1 em um modelo de estimulação inflamatória. A sinalização apoptótica adequada é de fundamental importância para preservar um equilíbrio entre a morte,
89 sobrevivência celular e manutenção da integridade do genoma, e essa sinalização leva certo tempo para ser processada (166,167). Inicialmente nós conseguimos observar que o equilíbrio entre as taxas de viabilidade celular após inibição da função redox da APE1/REF-1 foi perturbada apenas após 1 hora de tratamento com LPS e subsequente incubação com E3330 por 48 horas (Figura 8). Nesse sentido, foi visto que a inibição da função redox de APE1/REF-1 é capaz de diminuir o crescimento de linhagens celulares de pâncreas (168,169), de colón (170), de pulmão (171) e regulação da hematopoese (172). Já é bem discutida na literatura a importância da APE1/REF-1 durante a regulação da resposta imune e inflamatória através da ativação de diversos FTs que resultam na transcrição de diversas moléculas tais como citcinas, quimiocinas e receptores do tipo Toll-like (62,137,173). Nos nossos resultados também foi possível observar uma significante redução de citocinas e quimiocinas após a inibição redox de APE1/REF-1 (Figura 9) é inúmeros genes relacionados com a transcrição de moduladores inflamatórios (Tabela 1A Anexo). O NF-κB e um fator transcricional chave envolvido em vários processos da resposta imune inata e adaptativa e sua capacidade de ligação ao DNA é impedida após a inibição redox de APE1/REF-1 (133,165). Hiramoto et al (1988) já relataram que o E3330 inibe a ligação do NF-κB aos sítios de promotores no DNA sem afetar a sua translocação para o núcleo (132). A via de sinalização do NF-κB é capaz de controlar vários genes envolvidos na resposta imune, regulação do crescimento, carcinogêneas e apoptose. Assim, a inibição seletiva da atividade redox das APE1/REF-1 diminui a expressão de importantes moduladores inflamatórios não somente pelo impedimento da ligação do NF-κB ao DNA, mas também devido à redução da expressão do gene RELA , a sua subunidade catalítica, encontrada tanto ao nível de mRNA quanto proteico em nossos resultados (Tabela 1A Anexo, Figura 23). Já foi visto que o NF-κB sofre regulação dos seus níveis proteicos via PTMs através de ubiquitinação, bem como a diminuição da atividade de ligação do próprio NF-κB ao DNA pode levar a uma diminuição da expressão de RELA via autorregulação (174–176). As sequências geradas pela plataforma GS FLX Titanium System 454 tem um tamanho médio maior que de outros sequenciadores de nova geração,
90 o que permite um mapeamento mais robusto com um menor número de sequências (177). De uma forma geral o nosso trabalho é inédito, pois na busca das palavras chaves “E3330” e “ Transcriptome ” ou “E3330” e “RNA-seq” ou “U937” e “E3330” não foi encontrado nenhum resultado. Já em relação à busca de “U937” e “ Transcriptome” foram encontrados 13 trabalhos, e apenas um usava um modelo semelhante ao nosso, estimulando a resposta inflamatória com LPS e posterior análise por Microarray em tempos e utilizando inibidores diferentes do nosso (143). Especificamente em relação ao trabalho de Sharif e colabradores, 10 7 células U937 foram estimuladas com 2 μg/ml de LPS por 1 e 4 horas e corroborando com o nosso tratamento, pôde-se observar um aumento da expressão de genes relacionados a via do NF-κB. No entanto, a expressão de CXCL2, IL1 β, IL1RN, SOD2, CIAP2, GADD45 β, CMYB e BTG2 se mostraram contrarias em relação ao encontrado no nosso transcriptoma. Essa diferença provavelmente ocorreu devido a uma cinética de tempo necessária para a expressão de alguns genes durante a resposta imune (163,178). Na avaliação inicial do transcriptoma após indução inflamatória com LPS em células U937 e subsequente inibição da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 revelou uma regulação negativa de vários genes com funções essenciais na transcrição e na resposta imune tais como RELA , SRC , TAF7 , FOXO4 , bem como genes relacionado a biogênese ribossomal e processamento de rRNA (NIP7 , PES1 , MYC , C1D , NOP2 , RRS1 , TFB2M e RPL35A). Estes genes são essenciais para a biossíntese das macromoléculas constituintes do ribossomo e da sua montagem (179) e ainda na primeira análise de porcentagem de alinhamentos já foi possível notar uma redução de pelo menos 13% de sequências ribossomais nas amostras tratada com E3330 em comparação com a de LPS (Tabela 2). É importante destacar que na analise da rede regulada negativamente os genes que se comportaram como hub são praticamente todos do cluster 4, o qual está relacionado com processamento de rRNA e biogênese ribossomal, comprovando a importância da regulação redox da APE1/REF-1 nesses processos. Os genes NIP7 , RPL35 , RPS12 e NOP2 obtiveram as maiores métricas de centralidades sendo considerados hub -gargalos. Esses genes são essenciais para um processamento adequado do rRNA e consequentemente
91 desempenham um papel na regulação do ciclo celular e a um aumento da atividade nucleolar que está associado com a proliferação celular (157,180– 183). A expressão do rRNA precursor 47S e do 28S maduro não tiveram mudanças significativas nos nossos resultados, indicando que a transcrição do rRNA não foi modificada após a inibição redox de APE1/REF-1 (Figura 25). Por outro lado, podemos observar que após uma eletroforese me capilar a razão 28S/18S é menor nas células tratadas com E3330 comparada com os outros grupos, indicando assim que a função de regulação redox de APE1/REF-1 controla a biogênese ribossomal, uma vez que após a sua inibição foi observado uma diminuição de genes essenciais para esse processo e um ineficiente processamento do rRNA. Já é bem conhecido que a estimulação inflamatória por alguma doença infecciosa ou LPS estimula a produção de ERO. Em consequência ao estresse oxidativo gerado, uma série de mudanças na célula é induzida tais como ativação de moduladores inflamatórios e lesões tanto no DNA quanto no RNA (184). Adicionalmente, APE1/REF-1 tem uma importante função extranuclear que é a supressão da produção de ERO em células endoteliais, através da regulação do complexo NADPH-oxidase via Rac1 (84). O complexo de NADPH-oxidase é uma enzima de múltiplas subunidades envolvidas na resposta imune inata pelas células fagocíticas, a sua ativação gera ERO, que são importantes na defesa do hospedeiro contra a infecção (185). Já foi visto que o E3330 é capaz de aumentar os níveis de ERO em células pancreaticas humanas, provavelmente via de regulação envolvendo Rac1 (101,169). O excesso de ERO está diretamente envolvido nos processos de oxidação do DNA, RNA, proteínas e lipídeos, o que pode causar lesão tecidual direta ou induzir uma variedade de respostas celulares (186). Em condições de estresse oxidativo o complexo de iniciação a biogênese ribossomal falha podendo causar o estresse nucleolar (187), ocasionando o desequilíbrio da produção de várias proteínas ribossomais (RPLs e RPSs) podendo levar a parada do ciclo celular ou apoptose dependente ou independente de p53 (188). Adicionalmente, danos ao RNA ou seu processamento incorreto podem originar a uma tradução defeituosa, disfunções ribossomais, produção de agregados de proteínas tóxicas que eventualmente podem conduzir para a
92 parada do ciclo celular e, consequentemente, à morte celular (25,48). Em Vascotto et al (2009a), foi observado que em células APE1-knocked-down , não houve alteração na síntese pré-rRNA e do processamento de rRNA, no entanto, foi observado uma incapacidade de remover as lesões de 8- hydroxyguanine no rRNA após a indução do estresse oxidativo, levando a uma deficiência na tradução de proteínas e consequentemente afetando o crescimento celular pela ação direta no controle de qualidade do rRNA, afetando assim a expressão do gene através de mecanismos de pós- transcrição (21). Nesse sentido, nossos dados mostram que a inibição redox de APE1/REF-1 é suficiente para dificultar o processamento do rRNA e montagem do ribossomo o que pode levar a uma redução da viabilidade celular como a que encontramos após 48 horas no modelo de cinética inflamatória (Figura 10). Vascotto et al (2009b) observaram que uma forte inibição do crescimento celular após o silenciamento de APE1/REF-1, sugerindo que estes efeitos são devido a uma alteração da regulação da transcrição mediado pelo seu efeito redox em adição a sua função na reparo de DNA. No entanto, por análises de proteômica eles observaram um aumento da expressão da proteína DDX39A em oposição aos nossos resultados (100). Essa proteína é envolvida no splicing do pre-mRNA, é necessária para exportar o mRNA para fora do núcleo e níveis altos dessa proteína está relacionado com a indução da proliferação celular (189). Assim, uma diminuição dos níveis de DDX39A pode estar auxiliando a redução do crescimento celular, reforçando a nossa hipótese que a função redox de APE1/REF-1 coordena este evento biológico. É sabido que controle do status redox de APE1/REF-1 desempenha um papel significante no controle do tráfico subcelular da proteína, uma vez que já foi demonstrado que o tratamento com 140 μM E3330 causa um esvaziamento nucleolar da APE1/REF-1 e sua acumulação no nucleoplasma, favorecendo assim a parada da proliferação celular (48,57). Em resultados anteriores do nosso laboratório foi visto que após o estímulo inflamatório APE1/REF-1 se transloca para o citoplasma, ao passo que após sua inibição redox por E3330 a proteína permanece no núcleo (Coutinho 2013), provavelmente exercendo a sua função de reparo de DNA, já que o inibidor utilizado não exerce efeito sobre essa função. Ramana et al (1998) foram os primeiros a mostrar que APE1/REF-1 pode se deslocar para o núcleo após uma indução de estresse
93
(74). A localização nuclear da APE1/REF-1 é controlada na porção N-terminal e sua re-localização durante o estresse nucleolar é mediada pela migração simultânea de NPM1, uma proteína multifuncional que controla uma variedade de processos celulares, incluindo crescimento celular, duplicação do centrossoma, manutenção da integridade do genoma e a biogênese ribossomal (30,99). Ainda em Vascotto et al (2009a) foi demonstrado que a interação entre APE1/REF-1 e NPM1 é essencial para a localização nucleolar e para a modulação do controle de qualidade do rRNA (21). Nos nossos dados não foi possível observar diferença significativa de expressão da NPM1 tanto em nível de mRNA quanto a nível proteico (Figura 23), e entender se há uma mudança na interação entre APE1/REF1 e NPM1 e consequente redução no processamento de rRNA após inibição redox por E3330 já está sendo padronizado pelo nosso grupo, muito embora ainda não obtivemos sucesso conforme demonstrado na Figura 27. Enzimas antioxidantes e que regulam o estado redox do grupamento tiol de certas proteínas constituem os principais mecanismos celular de proteção contra o estresse oxidativo (80). Já é bem relatado na literatura que APE1/REF- 1 é fortemente associado com sistema da TRX, a qual é amplamente distribuída nos diversos organismos, sendo responsável pela regulação de vários processos bioquímicos na célula. A interação entre APE1/REF-1 e TRX promove a ligação de vários FT ao DNA a partir da regulação redox em resíduos específicos de cisteínas (190,191). Após silenciamento da APE1/REF- 1 existe uma diminuição da expressão da proteína TXNIP, a qual é responsável pela redução de TRX (100,192). Por outro lado, os nossos resultados demonstram que a inibição seletiva da função redox de APE1/REF-1 foi capaz de aumentar a expressão em nível de mRNA dessa proteína. A TXNIP age como um mediador do estresse oxidativo pela inibição da atividade de TRX ou limitando a sua biodisponibilidade. A superexpressão dessa proteína induz a parada do ciclo celular e do crescimento em certas células tumorais (193,194). De acordo com os resultados de enriquecimento funcional, podemos observar uma regulação positiva para os processos de resposta ao estresse, e em consequência disso várias vias de sinalização podem ser ativadas, principalmente as que levam à transcrição de genes sensitivos a mudança do estado redox da célula tais como EGR1 (195). APE1/REF-1 também é capaz
94 de regular tanto a expressão de EGR1 quanto a sua atividade (196), e por sua vez, EGR1 é capaz de formar complexos de regulação de forma redox- dependente de vários fatores transcricionais, bem como com APE1/REF-1 e TRX (197). Adicionalmente, APE1/REF-1 restabelece a ligação de EGR1 ao DNA via interação proteína-proteína sem a necessidade de uma nova síntese da proteína e, posteriormente aumenta a sua atividade transcricional via modificações pós-tradiconais. (55). A ativação de ambos APE1/REF-1 e EGR1 após o estresse oxidativo representa um ciclo retroalimentação positiva entre as duas proteínas (55). EGR1 ativa a transcrição de inúmeros genes em resposta a uma variedade de estímulos mitogênicos e não-mitogênicos, controle do crescimento celular e apoptose via regulação da expressão dos genes supressores de tumor TP53, PTEN e do fator transcricional JUN (59,198–200). Assim, embora não tenha sido visto uma diminuição significativa da expressão de EGR1 após inibição redox de APE1/REF-1, foi possível observar uma diminuição da expressão de genes alvos da EGR1, tais como MYC , ICAM1 , CD44 e outros (201,202). Atualmente, acredita-se que a APE1/REF-1 afeta o crescimento celular diretamente pelo controle de qualidade do RNA e como um regulador da expressão de MYC, pela influencia do tempo de meia vida do seu mRNA (13,21,27). c-Myc age como um regulador chave em vários processos biológicos na célula, incluindo o crescimento, apoptose, diferenciação e transformação celular (203). Recentemente, tem sido descrito o papel de c-Myc na regulação da biogênese ribossomal, desde a regulação da tradução de proteínas do ribossomo até a indução da expressão de genes relacionados (204,205). Por outro lado, antagonistas da ativação de c-Myc, bloqueiam a expressão de genes ribossomais, resultando numa redução do crescimento celular (206). A diminuição da expressão de MYC induz um aumento da proporção de heterocromatina, levando a uma diminuição da transcrição e biogênese ribossomal, consequentemente redução da síntese proteica, diminuição da proliferação celular e diferenciação(205). Outro complexo essencial para a biogênese ribossomal também foi regulado negativamente, conhecido como o complexo PeBow, composto pelos genes PES1, BOP1 e WDR12 que interagem umas com as outras. A integridade deste complexo é necessária para a biogênese ribossomal e a proliferação de células (207).
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Em recentes dados do nosso laboratório, foi observado uma diminuição da expressão de MYC tanto a níveis de mRNA como proteicos após estimulação da inflamação das células U937 e subsequente inibição da função de reparo de APE1/REF-1 com o 6 mM do composto Metoxiamina, mas as análises de enriquecimento funcional não mostram influencia na biogênese ribossomal, podendo estar relacionado a outro mecanismos molecular. De uma forma geral, após a estimulação da inflamação por 24 horas com LPS e co- tratamento com a Metoxiamina foi encontrado nas análises de transcriptoma uma lista com 503 genes regulados negativamente com mudança de expressão ≤-3. Os transcritos encontrados com maiores diferença de expressão nessa lista estavam envolvidos na resposta inflamatória, no reparo de DNA e na progressão do ciclo celular. Os processos biológicos de maior representatividade anotados foram “transcrição” (19%), “ciclo celular” (10%), “transporte intracelular” (9%), “processo metabólico de DNA” (7%) e “transporte mediado por vesículas” (7%). O processo “transcrição” engloba genes relacionados à transcrição celular global (CITED, PPARA, PARG ), remodelamento da cromatina ( ACTR5,SMARCD2,RSF1, CBX2 ) e genes associados ao complexo CREBBP/CBP/p300( CITED2,CITED4, NMI, MYC ). Alguns dos genes encontrados regulados positivamente estão envolvidos também com a transcrição e relacionados à regulação negativa de p53 (RUNDG1, LETMD1, E4F1 ), fatores responsivos ao cálcio ( EDF1 ) e inibição da atividade do complexo CREB/p300 ( SNIO, KLHDC2 ). Dentre os genes listados no processo biológico transcrição, nota-se o envolvimento em atividades de modificação de histonas, regulação da transcrição e metilação de biopolímeros. Os resultados do transcriptoma também demonstraram a regulação positiva de transcritos importantes relacionados às vias autofágicas, como Autophagy- related protein 2 homolog A ( ATG2 ), Cysteine protease ATG4C ( ATG4C ) e Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3B ( MAP1LC3B )(127). Assim, em relação à comparação entre os dois modelos estudados no nosso laboratório, sugere-se que a APE1/REF-1 pode funcionar como um regulador da resposta imune de maneira redox-dependente e redox-independente, além de participar de diferentes processos celulares utilizando especificamente uma de suas duas principais funções.
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A lista de genes com regulação positiva encontrada após estimulação inflamatória e co-tratamento com E3330 mostrou um enriquecimento de genes relacionados com a resposta ao estresse, dano de DNA, controle do crescimento celular e regulação positiva da apoptose . Por exemplo, foi observado um aumento da expressão em torno de 9 vezes do gene CCNG2, que está relacionado com uma regulação negativa da progressão do ciclo celular (208). APE1/REF-1 também coordena o recrutamento de outras proteínas de reparo de DNA envolvida no BER através de uma rede complexa de interações proteína-proteína de forma direta ou indireta (14,95). Nas analises realizadas foi observado um aumento da expressão de genes importantes na sinalização DDR, tais como ATR , BARD1, RAD17 e RAD50 e a dose utilizada de E3330 neste trabalho não foi suficiente para inibir a função de APendonuclease da APE1/REF-1 (Figura 26). Em relação a analise de PPI para a rede regulada positivamente podemos observar que os transcritos classificados como hub -gargalos estão principalmente relacionados com sinalização celular e reparo de DNA. Por exemplo, os genes PRKACB , JAK2 e RNF2 sinalizam diversos processos celulares desde proliferação e diferenciação celular, dinâmica de condensação do cromossomo bem como regulam o transporte intracelular de íons (209–213). E interessantemente o transcrito com os maiores valores de Node Degree e Betweenness está relacionado com a vida de reparo do NER, a qual foi encontrada enriquecida na rede regulada positivamente, o GTF2H3 que é um componente do fator de transcrição geral (TFIIH) que se ancora ao XPB e XPD (214,215). Dados recentemente publicados pelo nosso grupo mostram que após indução do estresse oxidativo em células deficiente na proteína XPC existe uma diminuição da expressão dos níveis de mRNA de APE1/REF-1 e OGG1, e também foi visto por imunoprecipitação uma interação física entre XPC e APE1/REF-1 (159). Já se é discutido na literatura que existe uma interação entre as vias do BER e do NER, e que esta associação pode estar mais relacionada com os processos de transcrição do que com o reparo de DNA propriamente dito (216). Outro transcrito encontrado no nosso transcriptoma que pode ser considerado um hub -gargalo é o MDM2 , o qual é considerado um sensor de estresse e regula a ubiquitinação e degradação de APE1/REF-1 após
97 tratamento com agentes genotóxicos (217). A ubiquitinação de APE1/REF-1 pode alterar a localização subcelular da proteína e sua interação com outras proteínas, interferindo assim de forma indireta com o reparo de DNA (77). Embora tenha sido encontrada uma regulação positiva para o gene MDM2 , não foi observada uma degradação em níveis proteicos de APE1/REF-1 após 4 horas de tratamento com E3330 (Figura 23). A proteína p53 é um importante supressor tumoral, principal mediador da parada do ciclo celular, senescência, reparo de DNA e apoptose em resposta a uma vasta variedade de danos celulares ou ativação de oncogenes (218). APE1/REF-1 como um regulador redox é responsável pela redução da p53 aumentando assim a sua ligação ao DNA por mecanismos dependentes e independentes da atividade redox (60,219). Por outro lado, já foi bastante reportado que p53 é um inibidor da inflamação via antagonização do NF-κB (220). O LPS leva a fosorilação do MDM2 via as cascatas de sinalização PI3K/Akt e JNK, e a ativação da MDM2 leva a degradação de p53. A degradação de p53 é um regulador positivo do NF-κB, assim, LPS induz a redução dos níveis de p53 e consequente prolongamento da inflamação via NF-κB (221). Portanto, a p53 e o NF-κB regulam de forma negativa um ao outro (222,223). Em células normais não estressadas, o p53 é uma proteína muito instável com uma meia-vida entre 5 a 30 min, devido a sua degradação contínua mediada pela MDM2 (224). Por sua vez, a MDM2 é uma proteína chave na regulação da atividade e estabilidade da p53, já que a interação entre elas duas promove a rápida ubiquitinação e subsequente degradação da p53 (225). A MDM2 é também um gene alvo de p53, estabelecendo um ciclo de retroalimentação negativa que inibe a propria atividade da da p53 após danos ao DNA (225). Após falha na biogênese ribossomal algumas proteínas ribossomais se ligam ao MDM2 (RPS3, RPS7, RPL5, RPL11 E RPL23) no nucleoplasma e impedem a ubquitinação de p53 (188,226). Logo, a alta expressão do gene MDM2 encontrado em nossos dados pode ser uma resposta a atividade aumenta de p53. Após a ativação, a p53 pode regular positivamente a expressão transcricional de certos genes pró-apoptóticos, incluindo CD95, CD95L, DR5, BAX, NOXA (PMAIP1), ou pode se translocar diretamente para as
98 mitocôndrias, iniciando a libertação de citocromo c, através de um mecanismo desconhecido (227). A inibição da função redox de APE1/REF-1 após estimuação inflamatória foi capaz de aumentar a expressão de PMAIP1 aproximadamente 4 vezes, indicando mais uma vez um provavel impacto sobre o controle da sobrevivência celular. Devido MDM2 funcionar como um regulador negativo de p53, e este induzir a apoptose em resposta a uma variedade de estímulos, a clivagem de MDM2 por proteases específicas pode resultar na desregulação de p53 e contribuir diretamente com o processo de morte celular por apoptose (228). Normalmente a MDM2 é clivada pela Caspase 3 durante a apoptose gerando um fragmento de 60 kDa, e esta é rapidamente degradada podendo ser menos detectável do que em uma cultura normal (229). No entanto, em linhagens de células tumorais muitas vezes ocorre a expressão de altos níveis da MDM2 de 60 kDa na ausência da apoptose. Nas células que não estão em apoptose ocorre a clivagem proteolítica da MDM2 pela caspase 3, mas não ocorre a clivagem da PARP1 (do inglês: poly(ADP-ribose) polymerase ), a qual é característica em células apoptóticas. Assim, essa clivagem ocorre na proliferação normal das células independente da apoptose (230), o que provavelmente deve está acontecendo nas nossas células. Além disso, tem se discutido muito sobre a participação da Caspase 3 na indução da apoptose, no entanto, em células U937 essa proteína está relacionada com diferenciação celular (231). É notório a alta expressão da Caspase 3 integra e clivada controle sem estimulação, podendo está relacionada ao processo de diferenciação celular, o que já pode ter acontecido nos outros grupos devido a estimulação com LPS (Tabela 1B Anexo, Figura 23). A regulação precisa da expressão gênica é essencial para todos os processos biológicos. Fatores de transcrição específicos ligam-se aos seus locais de reconhecimento no DNA e, assim, contribuem para o controle da taxa da transcrição de genes alvo através de uma interação com outros FT, co- fatores e proteínas capazes de modificar a cromatina (232). O mapeamento e caracterização de como acontece à regulação de determinado grupo de genes pode proporcionar uma visão mais ampla dos processos biológicos que eles controlam. Assim, a identificação de regiões consensos de uma rede de interações gênicas e dos FTs que a regulam, são etapas cruciais para um
99 melhor conhecimento sobre mecanismos moleculares de proteínas e na descoberta de novos alvos terapêuticos (233). A fim de compreender o sistema que regula a transcrição dessas listas de genes encontradas no nosso transcriptoma, e uma vez que a função redox APE1/REF-1 está diretamente ligada com os processos de expressão gênicas, nós construímos uma rede regulatória baseado no enriquecimento de motivos encontrados em cada conjunto de genes co-expressos utilizando a ferramenta iRegulon. Como mostrado nas Figuras 29 e 30 uma combinação de vários FTs explica a variação dos genes dos principais clusters de cada rede. Em relação à rede regulada negativamente podemos observar que os principais FTs essenciais para o cluster 11 são ETV6, SIN3A, ISL2, PITX1 e ZNF35, já em relação ao cluster 4 são os FTs SOX2, RELA, ETS1, ELK1 e ELF1 . E é importante notar que os FTs comuns aos dois Clusters são principalmente relacionados com a biogênese ribossomal, diferenciação de células mieloides e ciclo celular (205,234,235). Interessantemente os genes NIP7 , RPL35 , RPS12 e NOP2 os quais foram considerados hub -gargalo possuem a sua transcrição regulada pelos fatores de transcrição GABPA e ETS1. Já é bem descrito na literatura que o NF-κB sofre regulação redox pela APE1/REF-1, mas é a primeira vez que se relaciona um possível papel nos FTs SIN3A, ETS1 e ELK1 que também são dependentes de regulação redox (56,61,236–239). Ou ainda esses processos podem ser de forma indireta como seria o caso do FT c-Myc, em que sua expressão é induzida pelo NF-κB (240,241), e que por sua vez se autorregula e sofre regulação redox por APE1/REF-1(176,242). Portanto, de uma forma geral esses FTs são modulados por regulação redox, e a inibição com E3330 da APE1/REF-1 pode estar alterando a função dos mesmos e por isso diminuindo a expressão dos genes em questão (22,135,168). Já em relação a analise dos principais clusters da rede regulada positivamente podemos perceber que poucos FTs são comuns entre eles. O GATA1, único comum, é um regulador geral do desenvolvimento de células eritróides, encontrado também em baixa quantidade em outras células progenitoras hematopoiéticas (243). Mansat-De et al (2002) observaram em células U937 mudança de fenótipo após alta expressão desse fator transcricional (244) e já foi visto que em células mieloides de murinos, GATA1 não somente é capaz de reprogramar a célula, mas também agir sobre o ciclo
100 celular pela sustentação da expressão de Ciclina D1 e Bcl2 (245). O GATA1 também já foi encontrado em promotores de células U937 promovendo um aumento da expressão de DICER1 e consequente crescimento celular nas mesmas (246). De acordo com os nossos resultados, não houve diferença de expressão do GATA1 entre os grupos de estudo e não foi possível notar uma mudança de fenótipo em termos transcricionais ou morfológicos. É necessário estudos mais aprofundados a respeito desse FT na regulação do ciclo celular em nosso modelo experimental. Interessantemente alguns fatores transcricionais especialmente relacionados ao estresse como o YY1 e HSF1 e que são sensíveis à regulação redox, apareceram como potenciais moduladores dos genes da rede regulada positivamente e também estão com uma expressão aumentada de 2,4 e 1,12 vezes respectivamente. Esse dado não corrobora com o encontrado por Li et al (2014) em um modelo de estresse induzido por lipoproteína oxidada de baixa densidade (do inglês: oxidized low density lipoprotein- oxLDL) em células do epitélio da retina. Nesse trabalho foi observado uma diminuição da expressão de YY1 e HSF1 após o tratamento com oxLDL + 30µM de E3330 quando comparados as células tratadas apenas com oxLDL, e apenas o HSF1 permaneceu com a sua capacidade de ligação ao DNA reprimida (247). De acordo com o encontrado nos nossos dados, YY1 regula a expressão de TRAM1, LMNA1, SRP9, RPN1 e SRP54 os quais são relacionados com a tradução. Já o HSF1 regula SRP54, TRAM1, SRP9, MAGT1, SMC2, DBF4, LMAN1, RYBP, EEF1E1 e UBE2B os quais participam dos processos de biossíntese de proteínas. As ontologias gênicas estão de acordo com o banco de Dados String 10.0. Não foi possível encontrar na literatura nenhum trabalho que relaciona esses genes com a APE1/REF-1. No entanto, YY1 é um regulador negativo de p53, uma vez que estimula a ubquitinação e degradação de p53 mediado por MDM2, sugerindo que essa proteína também tem uma função independente da de regulação transcricional (248). Essas diferenças podem ser justificadas pelos distintos modelos experimentais, mas devem ser mais bem investigadas. Embora a identificação de FTs da nossa rede de regulação da expressão gênica seja apenas montada por ferramentas de bioinformática utilizando dados de expressão disponíveis em bancos de dados, essa metodologia ajuda
101 a conhecer e compreender de forma mais clara as diferenças de expressões encontradas pelo nosso transcriptoma. Apesar de sua importância, ainda não é completamente entendido como as diferentes funções de APE1/REF-1 são reguladas nas células e quais mecanismos moleculares são responsáveis por induzir sua translocação entre núcleo, citoplasma e mitocôndria, locais onde exerce suas funções (13,100). Em estudos de mecanismos da função de APE1/REF-1 já é bem claro o bloqueio da proliferação celular e diminuição da biogênese ribossomal após o silenciamento da proteína, no entanto ainda não se sabe se esses processos são devido à atividade de reparo ou de regulação redox da APE1/REF-1(249). Pela primeira vez com os dados obtidos nessa tese, é possível determinar que esses efeitos sejam regulados pela função redox de APE1/REF-1. Recentes achados sobre a inibição redox de APE1/REF-1 já vem sendo relatados com grades potenciais clínicos (135,136,250), assim, nesse trabalho é proposto que o bloqueio seletivo da atividade redox de APE1/REF-1 por E3330 pode levar a uma inibição da resposta inflamatória, bem como diminuição da biogênese ribossomal com consequente ativação dos processos de parada de ciclo celular sem modificar a sua atividade de APendonuclease (Figura 31).
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Figura 31. Modelo Proposto: Em condições de estresse que pode ser induzido pela resposta inflamatória o complexo de iniciação a biogênese ribossomal falha podendo causar o estresse nucleolar. Sob essa condição pode ocorrer também o desequilíbrio da produção de várias proteínas ribossomais (RPLs e RPSs) podendo levar a parada do ciclo celular ou apoptose dependente ou independente de p53. A inibição específica da atividade redox de APE1/REF-1 diminuiu a da transcrição de c-myc e do complexo PeBoW ( PES1, BOP1 e WDR12 ) que controla a biogênese ribossomal e o ciclo celular. A ligação do NF-kB ao DNA é interrompida após o tratamento com E3330, provocando uma diminuição da expressão de uma série de genes relacionados tanto com a resposta inflamatória quanto com a biogênese ribossomal. O principal mecanismo que liga a perturbação nucleolar com a ativação do p53 e parada do ciclo celular utiliza MDM2, o qual foi encontrado em níveis elevadosmtanto em relação ao mRNA quanto proteínas. A p53 e MDM2 formam um loop de feedback autoregulatório. O estresse consequentemente pode levar a danos ao DNA e promover a fosforilação da p53 via proteínas quinases como ATM e ATR. Além disso, certos genes pró- apoptóticos, incluindo NOXA (PMAIP1) tiveram a expressão aumentada, que ao se translocar diretamente para as mitocôndrias, iniciam a libertação de citocromo c, através de um mecanismo desconhecido. Além disso, apos inibição redox a APE1/REF-1 pode não se translocar para a mitocôndria, reparar as lesões, assim provoca desequilíbrio na função mitocondrial. E em consequência a todos esses eventos a célula pode sofrer parada de ciclo e em seguida parada do crescimento ou morte celular. As palavras na cor vermelha estão destacando os genes que foram regulados negativamente, e em azul os que foram regulados positivamente. Os outros não tiveram diferença de expressão.
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VII. Conclusões No presente trabalho foi possível realizar uma revisão de literatura, a qual foi publicada, sobre os principais mecanismos envolvidos no reparo de DNA que influenciam a resposta imune e inflamatória. A inibição da atividade redox da APE1/REF-1 por E3330 foi capaz de diminuir a viabilidade celular e resposta inflamatória após no modelo de cinética inflamatória. Após estimulação da inflamação por 24 horas e subsequente tratamento com E3330 por mais 4 horas não observamos alteração na razão da apoptose, potencial de membrana e produção de peróxido de oxigênio. A inibição seletiva da função redox de APE1/REF-1 foi capaz de aumentar os processos relacionados ao estresse e parada de ciclo celular de acordo com as abordagens de bioinformática utilizadas. Foi observado também a diminuição da expressão de proteínas chaves da regulação trasncricional e processamento de rRNA tais como RelA(p65), c-Myc, NIP7 e PES1, levando a uma deficiência da Biogênese Ribosomal sem alterar a sua função de APendonuclease.
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VIII. Perspectivas • Realizar ensaios de apoptose e quantificação do estresse oxidativo para o modelo de cinética inflamatória e comprovar se o nosso modelo proposto leva a parada do crescimento celular ou apoptose;
• Quantificar os níveis proteicos da p53 fosforilada para validar sua participação no modelo proposto;
• Efetivar as co-imunoprecipitações com APE1/REF-1 e NPM1;
• Realizar ensaio de Chip-seq para obter uma visão mais ampla dos fatores transcricionais que regulam os processos biológicos após inibição da função redox de APE1/REF-1;
• Validar as hipóteses aqui descritas em outro tipo celular.
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ANEXOS Lista de genes expressos diferencialmente regulados negativamente.
Gene ENSEMBLE fold_change description PUF60 ENSG00000179950 -15,43825666 poly-U binding splicing factor 60KDa SS18L1 ENSG00000184402 -15,43825666 calcium-responsive transactivator ANKRD22 NULL -12,63075061 ankyrin repeat domain-containing protein 22 CD151 ENSG00000177697 -12,63075061 CD151 molecule FABP5 ENSG00000164687 -12,63075061 uncharacterized protein LOC16592 isoform 3 PRPF31 ENSG00000105618 -11,92978208 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp31 WDR55 NULL -11,92978208 WD repeat-containing protein 55 ARMC5 ENSG00000140691 -11,22760291 armadillo repeat-containing protein 5 isoform b precursor TFB2M ENSG00000162851 -11,22760291 dimethyladenosine transferase 2, mitochondrial precursor ANKS1A ENSG00000064999 -10,52542373 ankyrin repeat and sterile alpha motif domain containing 1A ESRRA ENSG00000173153 -10,52542373 steroid hormone receptor ERR1 MOGS ENSG00000115275 -10,52542373 mannosyl-oligosaccharide glucosidase NREP ENSG00000134986 -10,52542373 neuronal regeneration-related protein COX8A ENSG00000176340 -9,82445521 cytochrome c oxidase subunit 8A, mitochondrial precursor DDX55 ENSG00000111364 -9,82445521 ATP-dependent RNA helicase DDX55 HSPA (heat shock 70kDa) binding protein, cytoplasmic HSPBP1 ENSG00000133265 -9,82445521 cochaperone 1 PSME1 ENSG00000092010 -9,82445521 proteasome activator complex subunit 1 RPL27 ENSG00000131469 -9,82445521 50S ribosomal protein L27 RPL36AL NULL -9,82445521 60S ribosomal protein L36a SLC17A9 ENSG00000101194 -9,82445521 solute carrier family 17 member 9 ZNF473 ENSG00000142528 -9,82445521 zinc finger protein 473 ARHGAP4 ENSG00000089820 -9,82405165 Rho GTPase activating protein 4 ISG20L2 ENSG00000143319 -9,12227603 interferon-stimulated 20 kDa exonuclease-like 2 LOC100129361 NULL -9,12227603 uncharacterized protein LOC100129361 MINA NULL -9,12227603 MYC induced nuclear antigen OSBPL5 ENSG00000021762 -9,12227603 oxysterol-binding protein-related protein 5 isoform b STRA13 ENSG00000169689 -9,12227603 centromere protein X isoform 3 ZFYVE27 ENSG00000155256 -9,12227603 zinc finger, FYVE domain containing 27 EPN1 ENSG00000063245 -8,4205004 epsin 1 B3GALT6 ENSG00000176022 -8,42009685 beta-1,3-galactosyltransferase 6 CCDC127 NULL -8,42009685 coiled-coil domain containing 127 CXorf40B ENSG00000197021 -8,42009685 protein CXorf40B EML2 ENSG00000125746 -8,42009685 echinoderm microtubule-associated protein-like 2 FAM65A ENSG00000039523 -8,42009685 uncharacterized protein LOC566573 HOXA9 ENSG00000078399 -8,42009685 homeobox A9 LDOC1L ENSG00000188636 -8,42009685 protein LDOC1L NCOA1 ENSG00000084676 -8,42009685 nuclear receptor coactivator 1 PARP6 ENSG00000137817 -8,42009685 poly (ADP-ribose) polymerase family, member 6 PELO NULL -8,42009685 protein pelota homolog PPP6R2 ENSG00000100239 -8,42009685 protein phosphatase 6, regulatory subunit 2 RRS1 ENSG00000179041 -8,42009685 disease resistance protein RRS1 SIVA1 ENSG00000184990 -8,42009685 SIVA1, apoptosis-inducing factor SLC37A1 ENSG00000160190 -8,42009685 glycerol-3-phosphate transporter SLX1A ENSG00000132207 -8,42009685 structure-specific endonuclease subunit slx1 STK11IP ENSG00000144589 -8,42009685 serine/threonine-protein kinase 11-interacting protein SYNE3 ENSG00000176438 -8,42009685 nesprin-3 TSTA3 ENSG00000104522 -8,42009685 tissue specific transplantation antigen P35B
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WDR13 ENSG00000101940 -8,42009685 WD repeat domain 13 TAF7 ENSG00000178913 -8,06961259 TBP-associated factor 7 ASB6 NULL -7,71912833 ankyrin repeat and SOCS box protein 6 DNAJC21 ENSG00000168724 -7,71912833 dnaJ homolog subfamily C member 21 HIBCH ENSG00000198130 -7,71912833 3-hydroxyisobutyryl-CoA hydrolase, mitochondrial PYCARD ENSG00000103490 -7,71912833 apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD RFX1 ENSG00000132005 -7,71912833 MHC class II regulatory factor RFX1 TADA1 ENSG00000152382 -7,71912833 transcriptional adapter 1 VKORC1 ENSG00000167397 -7,71912833 vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1 ZNF438 ENSG00000183621 -7,71912833 zinc finger protein 438 ARAF ENSG00000078061 -7,71872478 serine/threonine-protein kinase A-Raf USF2 ENSG00000105698 -7,25100888 upstream stimulatory factor 2 ALG5 ENSG00000120697 -7,01694915 dolichyl-phosphate beta-glucosyltransferase APOA1BP ENSG00000163382 -7,01694915 NAD(P)H-hydrate epimerase precursor CD3EAP ENSG00000117877 -7,01694915 DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA34 CNTNAP4 ENSG00000152910 -7,01694915 contactin-associated protein-like 4 isoform 1 precursor COX7A2 ENSG00000112695 -7,01694915 cytochrome c oxidase subunit VIIa polypeptide 2 (liver) CPNE2 ENSG00000140848 -7,01694915 copine-2 FOXO4 ENSG00000184481 -7,01694915 forkhead box O4 GOLGA8R ENSG00000232653 -7,01694915 golgin subfamily A member 8R HTATIP2 ENSG00000109854 -7,01694915 oxidoreductase HTATIP2 KIAA0247 ENSG00000100647 -7,01694915 uncharacterized protein LOC379885 precursor L3MBTL2 ENSG00000100395 -7,01694915 lethal(3)malignant brain tumor-like protein 2 METTL21A ENSG00000144401 -7,01694915 protein N-lysine methyltransferase METTL21A MIR17HG ENSG00000215417 -7,01694915 MRP63 ENSG00000173141 -7,01694915 ribosomal protein 63, mitochondrial MXD3 ENSG00000213347 -7,01694915 max dimerization protein 3 NAA60 ENSG00000122390 -7,01694915 N-alpha-acetyltransferase 60 NDUFAF1 ENSG00000137806 -7,01694915 complex I intermediate-associated protein 30, mitochondrial PIN1 ENSG00000127445 -7,01694915 auxin efflux carrier component 1 RNASEH2C ENSG00000172922 -7,01694915 ribonuclease H2 subunit C solute carrier family 25 (mitochondrial carrier: glutamate), member SLC25A22 ENSG00000177542 -7,01694915 22 TMEM147 ENSG00000105677 -7,01694915 transmembrane protein 147 TNK2 ENSG00000061938 -7,01694915 tyrosine kinase, non-receptor, 2 TRNT1 ENSG00000072756 -7,01694915 tRNA-nucleotidyltransferase 1, mitochondrial AKAP1 ENSG00000121057 -6,66646489 A-kinase anchor protein 1, mitochondrial precursor ALDH16A1 ENSG00000161618 -6,66646489 aldehyde dehydrogenase family 16 member A1 CIRH1A ENSG00000141076 -6,66646489 cirhin OSBPL3 ENSG00000070882 -6,66646489 oxysterol-binding protein-related protein 3 isoform c SEPHS2 ENSG00000179918 -6,54923325 selenophosphate synthetase 2 aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 1 ARNTL ENSG00000133794 -6,31598063 isoform 2 C9orf16 ENSG00000171159 -6,31598063 UPF0184 protein C9orf16 CCHCR1 ENSG00000204536 -6,31598063 coiled-coil alpha-helical rod protein 1 CNTROB ENSG00000170037 -6,31598063 centrobin isoform beta DIABLO ENSG00000184047 -6,31598063 diablo homolog, mitochondrial precursor EIF2B4 ENSG00000115211 -6,31598063 translation initiation factor eIF-2B subunit delta EXOSC1 NULL -6,31598063 exosome component 1 FAM213B ENSG00000157870 -6,31598063 prostamide/prostaglandin F synthase FAM58A ENSG00000147382 -6,31598063 cyclin-related protein FAM58A HES6 ENSG00000144485 -6,31598063 hairy and enhancer of split 6 HIGD2A ENSG00000146066 -6,31598063 HIG1 hypoxia inducible domain family, member 2A
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ITGB1BP1 ENSG00000119185 -6,31598063 integrin beta-1-binding protein 1 KATNB1 ENSG00000140854 -6,31598063 katanin p80 WD40 repeat-containing subunit B1 KCTD13 ENSG00000174943 -6,31598063 BTB/POZ domain-containing protein KCTD13 LOC100289561 NULL -6,31598063 uncharacterized protein LOC100289561 LSM5 ENSG00000106355 -6,31598063 U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm5 NCKAP5L ENSG00000167566 -6,31598063 nck-associated protein 5-like PI4K2A ENSG00000155252 -6,31598063 phosphatidylinositol 4-kinase type 2-alpha RCCD1 ENSG00000166965 -6,31598063 RCC1 domain containing 1 RDH14 ENSG00000240857 -6,31598063 Retinol dehydrogenase 14 RSRC1 ENSG00000174891 -6,31598063 arginine/serine-rich coiled-coil 1 SBDSP1 ENSG00000225648 -6,31598063 SLC25A11 ENSG00000108528 -6,31598063 mitochondrial 2-oxoglutarate/malate carrier protein SPPL2B NULL -6,31598063 signal peptide peptidase like 2B SRC ENSG00000197122 -6,31598063 proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src TEX30 ENSG00000151287 -6,31598063 uncharacterized protein LOC549282 TMEM158 ENSG00000249992 -6,31598063 transmembrane protein 158 precursor UNKL ENSG00000059145 -6,31598063 unkempt family zinc finger-like UQCR10 ENSG00000184076 -6,31598063 cytochrome b-c1 complex subunit 9 ZBTB45 ENSG00000119574 -6,31598063 zinc finger and BTB domain containing 45 C7orf55- LUC7L2 NULL -6,31557708 C7orf55-LUC7L2 protein OLIG1 ENSG00000184221 -6,31557708 oligodendrocyte transcription factor 1 DOK1 ENSG00000115325 -6,3153753 docking protein 1, 62kDa (downstream of tyrosine kinase 1) DUS3L ENSG00000141994 -6,3153753 tRNA-dihydrouridine synthase 3-like LRRC14 ENSG00000160959 -6,3153753 leucine-rich repeat-containing protein 14 NELFCD ENSG00000101158 -6,3153753 negative elongation factor complex member C/D PPM1F ENSG00000100034 -6,3153753 protein phosphatase 1F PTOV1 ENSG00000104960 -6,3153753 prostate tumor-overexpressed gene 1 protein TBCB ENSG00000105254 -6,3153753 tubulin-folding cofactor B UBQLN4 ENSG00000160803 -6,3153753 ubiquilin-4 RECQL4 ENSG00000160957 -6,08151735 RecQ protein-like 4 CDKL1 NULL -5,96489104 cyclin-dependent kinase-like 1 EIF1AD ENSG00000175376 -5,96489104 probable RNA-binding protein EIF1AD RPS25 NULL -5,96489104 40S ribosomal protein S25 ACOX3 ENSG00000087008 -5,61380145 acyl-Coenzyme A oxidase 3 ATG9A ENSG00000198925 -5,61380145 autophagy-related protein 9A BTG1 NULL -5,61380145 protein BTG1 CBWD1 ENSG00000172785 -5,61380145 COBW domain-containing protein 1 CEP128 ENSG00000100629 -5,61380145 centrosomal protein of 128 kDa CERS5 ENSG00000139624 -5,61380145 ceramide synthase 5 COMMD9 NULL -5,61380145 COMM domain-containing protein 9 DOCK3 ENSG00000088538 -5,61380145 dedicator of cytokinesis protein 3 ECE2 ENSG00000145194 -5,61380145 Endothelin-converting enzyme 2 EPHB4 ENSG00000196411 -5,61380145 ephrin type-B receptor 4 precursor ERF ENSG00000105722 -5,61380145 Ets2 repressor factor GABARAPL2 ENSG00000034713 -5,61380145 gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 2 GPR125 ENSG00000152990 -5,61380145 probable G-protein coupled receptor 125 precursor LIG4 ENSG00000174405 -5,61380145 DNA ligase (ATP) 4 LOC283788 NULL -5,61380145 leucine-rich repeat and fibronectin type-III domain-containing LRFN4 ENSG00000173621 -5,61380145 protein 4 precursor MANBA ENSG00000109323 -5,61380145 beta-mannosidase precursor MTBP ENSG00000172167 -5,61380145 mdm2-binding protein
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MYO19 ENSG00000141140 -5,61380145 unconventional myosin-XIX NAT6 ENSG00000243477 -5,61380145 N-acetyltransferase 6 isoform 2 NRROS ENSG00000174004 -5,61380145 negative regulator of reactive oxygen species precursor PIH1D1 ENSG00000104872 -5,61380145 PIH1 domain-containing protein 1 PILRB NULL -5,61380145 paired immunoglobulin-like type 2 receptor beta precursor POLR1E ENSG00000137054 -5,61380145 DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA49 PTGES2 ENSG00000148334 -5,61380145 prostaglandin E synthase 2 isoform 1 RIOK1 ENSG00000124784 -5,61380145 serine/threonine-protein kinase RIO1 SLC35A2 ENSG00000102100 -5,61380145 UDP-galactose translocator isoform d SLC52A2 ENSG00000185803 -5,61380145 riboflavin transporter 1 solute carrier family 8 (sodium/lithium/calcium exchanger), member SLC8B1 ENSG00000089060 -5,61380145 B1 SLC9A1 ENSG00000090020 -5,61380145 Na(+)/H(+) exchanger beta SPG7 ENSG00000197912 -5,61380145 spastic paraplegia 7 TCTN3 ENSG00000119977 -5,61380145 tectonic-3 TRMT2A ENSG00000099899 -5,61380145 tRNA (uracil-5-)-methyltransferase homolog A XKR8 ENSG00000158156 -5,61380145 XK, Kell blood group complex subunit-related family, member 8 RPL41 ENSG00000229117 -5,43825666 ribosomal protein L41 TFE3 ENSG00000068323 -5,43825666 transcription factor binding to IGHM enhancer 3 APOBEC3B ENSG00000179750 -5,37974173 DNA dC->dU-editing enzyme APOBEC-3B isoform a MADD ENSG00000110514 -5,37974173 MAP-kinase activating death domain EIF2B1 NULL -5,26271186 eukaryotic translation initiation factor 2B, subunit 1 alpha HLCS ENSG00000159267 -5,26271186 biotin--protein ligase RNASEH1 ENSG00000171865 -5,26271186 ribonuclease H1 isoform 1 RPL35A ENSG00000182899 -5,26271186 60S ribosomal protein L35a TMEM222 ENSG00000186501 -5,26271186 transmembrane protein 2226 TMSB10 ENSG00000034510 -5,26271186 thymosin beta 10 TP53RK ENSG00000172315 -5,26271186 TP53-regulating kinase FBRS ENSG00000156860 -5,14608555 probable fibrosin-1 LRP3 NULL -5,14608555 low density lipoprotein receptor-related protein 3 precursor ZNF37A ENSG00000075407 -5,14608555 zinc finger protein 37A ACOT7 ENSG00000097021 -5,14484567 cytosolic acyl coenzyme A thioester hydrolase ARF5 ENSG00000004059 -4,9122276 ADP-ribosylation factor 5 BEX1 ENSG00000133169 -4,9122276 protein BEX1 FZD1 ENSG00000157240 -4,9122276 frizzled-1 precursor GRPEL1 NULL -4,9122276 grpE protein homolog 1, mitochondrial IGFBP4 ENSG00000141753 -4,9122276 insulin-like growth factor-binding protein 4 precursor MAN2C1 ENSG00000140400 -4,9122276 mannosidase, alpha, class 2C, member 1 MKL1 ENSG00000196588 -4,9122276 myocardin-related transcription factor A SLC35C1 ENSG00000181830 -4,9122276 GDP-fucose transporter 1 TBCC ENSG00000124659 -4,9122276 tubulin-specific chaperone C CCDC88C ENSG00000015133 -4,91202583 protein Daple COMMD4 ENSG00000140365 -4,91192494 COMM domain-containing protein 4 ISG15 ENSG00000187608 -4,91192494 si:rp71-1c23.2 ABCA2 ENSG00000107331 -4,91162228 ATP-binding cassette sub-family A member 2 isoform b AJUBA ENSG00000129474 -4,91162228 ajuba protein ALCAM ENSG00000170017 -4,91162228 activated leukocyte cell adhesion molecule precursor ATP5J2 ENSG00000241468 -4,91162228 ATP synthase subunit f, mitochondrial ATPIF1 ENSG00000130770 -4,91162228 ATPase inhibitory factor 1 C1D NULL -4,91162228 nuclear nucleic acid-binding protein C1D C9orf40 ENSG00000135045 -4,91162228 uncharacterized protein C9orf40 CCDC28B ENSG00000160050 -4,91162228 coiled-coil domain-containing protein 28B CD58 ENSG00000116815 -4,91162228
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CEP41 ENSG00000106477 -4,91162228 centrosomal protein of 41 kDa CHTF18 ENSG00000127586 -4,91162228 CTF18, chromosome transmission fidelity factor 18 homolog DGUOK ENSG00000114956 -4,91162228 deoxyguanosine kinase, mitochondrial DNAJC6 ENSG00000116675 -4,91162228 DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 6 FERMT1 ENSG00000101311 -4,91162228 fermitin family member 1 FLAD1 ENSG00000160688 -4,91162228 FAD synthase GPN2 NULL -4,91162228 GPN-loop GTPase 2 HEXIM1 ENSG00000186834 -4,91162228 protein HEXIM MPDU1 ENSG00000129255 -4,91162228 MUC1 ENSG00000185499 -4,91162228 mucin-1 isoform 1 precursor NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex assembly NDUFAF3 NULL -4,91162228 factor 3 NOC4L ENSG00000184967 -4,91162228 nucleolar complex protein 4 homolog NUDT16L1 ENSG00000168101 -4,91162228 protein syndesmos precursor PCGF1 NULL -4,91162228 polycomb group RING finger protein 1 POLE4 NULL -4,91162228 DNA-directed DNA polymerase epsilon 4 POLR2J ENSG00000005075 -4,91162228 polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide J POU2F2 ENSG00000028277 -4,91162228 POU domain, class 2, transcription factor 2 isoform 2 PRICKLE3 ENSG00000012211 -4,91162228 prickle-like protein 3 PRRT4 ENSG00000224940 -4,91162228 proline-rich transmembrane protein 4 isoform 2 precursor RABEPK ENSG00000136933 -4,91162228 rab9 effector protein with kelch motifs RETSAT ENSG00000042445 -4,91162228 putative all-trans-retinol 13,14-reductase precursor SCFD2 ENSG00000184178 -4,91162228 sec1 family domain-containing protein 2 SIPA1 ENSG00000213445 -4,91162228 signal-induced proliferation-associated protein 1 SIRT7 ENSG00000187531 -4,91162228 sirtuin 7 SNAP29 ENSG00000099940 -4,91162228 synaptosomal-associated protein, 29kDa SNRPD2 ENSG00000125743 -4,91162228 small nuclear ribonucleoprotein Sm D2 SUGP1 ENSG00000105705 -4,91162228 SURP and G patch domain containing 1 TMEM126B ENSG00000171204 -4,91162228 transmembrane protein 126B isoform b YRDC ENSG00000196449 -4,91162228 yrdC domain-containing protein, mitochondrial ZDHHC9 ENSG00000188706 -4,91162228 palmitoyltransferase ZDHHC9 ZNF692 ENSG00000171163 -4,91162228 zinc finger protein 692 peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator- PPRC1 ENSG00000148840 -4,81099775 related protein 1 isoform 1 MESDC1 ENSG00000140406 -4,73668281 mesoderm development candidate 1 COASY ENSG00000068120 -4,6779661 bifunctional coenzyme A synthase precursor EBPL ENSG00000123179 -4,6779661 emopamil-binding protein-like GPAA1 ENSG00000197858 -4,6779661 glycosylphosphatidylinositol anchor attachment 1 PCNXL3 ENSG00000197136 -4,6779661 pecanex-like protein 3 SLC35C2 ENSG00000080189 -4,6779661 solute carrier family 35 member C2 TPCN1 ENSG00000186815 -4,6779661 two pore calcium channel protein 1 isoform 2 ULK3 ENSG00000140474 -4,6779661 serine/threonine-protein kinase ULK3 AGPAT2 ENSG00000169692 -4,56113801 1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase alpha C1orf85 ENSG00000198715 -4,56113801 lysosomal protein NCU-G1 isoform 1 precursor C4orf27 ENSG00000056050 -4,56113801 UPF0609 protein C4orf27 CCDC136 ENSG00000128596 -4,56113801 coiled-coil domain-containing protein 136 isoform 1 CDAN1 ENSG00000140326 -4,56113801 codanin-1 CHST2 NULL -4,56113801 Carbohydrate sulfotransferase 2 DCTPP1 ENSG00000179958 -4,56113801 dCTP pyrophosphatase 1 DNA2 ENSG00000138346 -4,56113801 DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease DNA2 GGT1 ENSG00000100031 -4,56113801 glutamate:glyoxylate aminotransferase IER3IP1 ENSG00000134049 -4,56113801 immediate early response 3-interacting protein 1 precursor multiple epidermal growth factor-like domains protein 8 isoform 2 MEGF8 ENSG00000105429 -4,56113801 precursor
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PDLIM7 ENSG00000196923 -4,56113801 PDZ and LIM domain 7 (enigma) POLRMT ENSG00000099821 -4,56113801 polymerase (RNA) mitochondrial (DNA directed) SNX17 ENSG00000115234 -4,56113801 sorting nexin-17 SUGT1 ENSG00000165416 -4,56113801 SGT1, suppressor of G2 allele of SKP1 TAF9B RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)- TAF9B ENSG00000187325 -4,56113801 associated factor, 31kDa UBE2T ENSG00000077152 -4,56113801 ubiquitin-conjugating enzyme E2 T WDTC1 ENSG00000142784 -4,56113801 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 ZNF12 ENSG00000164631 -4,56113801 zinc finger protein 12 isoform a DHX30 ENSG00000132153 -4,48995401 DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box helicase 30 ADD3 ENSG00000148700 -4,44430993 adducin 3 (gamma) ARID5A ENSG00000196843 -4,44430993 AT-rich interactive domain-containing protein 5A CD99L2 ENSG00000102181 -4,44430993 CD99 antigen-like protein 2 precursor CPSF4 ENSG00000160917 -4,44430993 cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 4 HPCAL1 ENSG00000115756 -4,44430993 hippocalcin-like protein 1 PSMG2 NULL -4,44430993 proteasome assembly chaperone 2 TJAP1 ENSG00000137221 -4,44430993 tight junction-associated protein 1 arf-GAP with coiled-coil, ANK repeat and PH domain-containing ACAP1 ENSG00000072818 -4,38559322 protein 1 STAM ENSG00000136738 -4,38559322 signal transducing adapter molecule 1 ABT1 ENSG00000146109 -4,21065375 activator of basal transcription 1 AMH ENSG00000104899 -4,21065375 muellerian-inhibiting factor precursor APC2 ENSG00000115266 -4,21065375 anaphase-promoting complex subunit 2 APEX2 NULL -4,21065375 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase 2 ARRDC1 ENSG00000197070 -4,21065375 arrestin domain containing 1 ASB3 ENSG00000115239 -4,21065375 ankyrin repeat and SOCS box protein 3 ASPHD1 ENSG00000174939 -4,21065375 aspartate beta-hydroxylase domain-containing protein 1 ATP5H ENSG00000167863 -4,21065375 ATP synthase subunit d, mitochondrial C11orf30 ENSG00000158636 -4,21065375 protein EMSY C12orf44 ENSG00000123395 -4,21065375 autophagy-related protein 101 C19orf44 ENSG00000105072 -4,21065375 uncharacterized protein LOC100093620 C8orf59 ENSG00000176731 -4,21065375 uncharacterized protein C8orf59 C8orf82 NULL -4,21065375 UPF0598 protein C8orf82 CARD9 ENSG00000187796 -4,21065375 caspase recruitment domain-containing protein 9 CXorf23 ENSG00000173681 -4,21065375 uncharacterized protein CXorf23 FAM162A ENSG00000114023 -4,21065375 protein FAM162B GANC ENSG00000214013 -4,21065375 glucosidase, alpha; neutral C HNMT ENSG00000150540 -4,21065375 histamine N-methyltransferase IFFO2 ENSG00000169991 -4,21065375 intermediate filament family orphan 2 INPP5K ENSG00000132376 -4,21065375 inositol polyphosphate-5-phosphatase K LEPR ENSG00000116678 -4,21065375 leptin receptor precursor MMP24-AS1 NULL -4,21065375 MRPL27 ENSG00000108826 -4,21065375 39S ribosomal protein L27, mitochondrial MRPS12 ENSG00000128626 -4,21065375 mitochondrial ribosomal protein S12 MRPS33 ENSG00000090263 -4,21065375 28S ribosomal protein S33, mitochondrial MS4A3 ENSG00000149516 -4,21065375 membrane-spanning 4-domains subfamily A member 3 isoform b NDUFB7 ENSG00000099795 -4,21065375 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 7 NFIX ENSG00000008441 -4,21065375 xenopus NFI-X2 transcription factor NPRL3 ENSG00000103148 -4,21065375 nitrogen permease regulator 3-like protein isoform 4 NRF1 ENSG00000106459 -4,21065375 nuclear respiratory factor 1 peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase isoform 1 PAM ENSG00000145730 -4,21065375 precursor PAN2 ENSG00000135473 -4,21065375 PAN2 poly(A) specific ribonuclease subunit homolog PCSK7 NULL -4,21065375 proprotein convertase subtilisin/kexin type 7 precursor
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PIGO ENSG00000165282 -4,21065375 phosphatidylinositol glycan anchor biosynthesis, class O POC1A ENSG00000164087 -4,21065375 POC1 centriolar protein homolog A PSMC3IP ENSG00000131470 -4,21065375 homologous-pairing protein 2 homolog PTOV1-AS1 ENSG00000268006 -4,21065375 RAB43 ENSG00000172780 -4,21065375 pre-mRNA-splicing factor ISY1 homolog RGL1 ENSG00000143344 -4,21065375 ral guanine nucleotide dissociation stimulator-like 1 putative RNA polymerase II subunit B1 CTD phosphatase rpap2 RPAP2 ENSG00000122484 -4,21065375 isoform 2 RPGR ENSG00000156313 -4,21065375 retinitis pigmentosa GTPase regulator SLC2A6 ENSG00000160326 -4,21065375 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 6 SNAP47 ENSG00000143740 -4,21065375 synaptosomal-associated protein 47 SVIL ENSG00000197321 -4,21065375 supervillin TIMM22 ENSG00000177370 -4,21065375 mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim22 TMEM11 NULL -4,21065375 transmembrane protein 11, mitochondrial TMEM182 ENSG00000170417 -4,21065375 transmembrane protein 182 precursor TPST2 ENSG00000128294 -4,21065375 tyrosylprotein sulfotransferase 2 precursor TRANK1 ENSG00000168016 -4,21065375 TPR and ankyrin repeat-containing protein 1 TSEN2 ENSG00000154743 -4,21065375 TSEN2 tRNA splicing endonuclease subunit UHRF2 ENSG00000147854 -4,21065375 UHRF2 protein USE1 ENSG00000053501 -4,21065375 unconventional SNARE in the ER 1 homolog USPL1 ENSG00000132952 -4,21065375 ubiquitin specific peptidase like 1 YARS2 ENSG00000139131 -4,21065375 tyrosyl-tRNA synthetase, mitochondrial ZMYND19 ENSG00000165724 -4,21065375 zinc finger MYND domain-containing protein 19 ZNF101 NULL -4,21065375 zinc finger protein 101 ZNF33B ENSG00000196693 -4,21065375 zinc finger protein 33B ZNF584 ENSG00000171574 -4,21065375 zinc finger protein 584 LSS ENSG00000160285 -4,21035109 lanosterol synthase NBPF11 ENSG00000152042 -4,2102502 neuroblastoma breakpoint family member 11 PALB2 ENSG00000083093 -4,2102502 partner and localizer of BRCA2 PANX1 ENSG00000110218 -4,2102502 pannexin 1 ST3GAL4 ENSG00000110080 -4,2102502 ST3 beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 4 ACACA ENSG00000132142 -4,21004843 acetyl-CoA carboxylase C17orf70 ENSG00000185504 -4,21004843 CABLES2 ENSG00000149679 -4,21004843 Cdk5 and Abl enzyme substrate 2 CDA ENSG00000158825 -4,21004843 cytidine deaminase CHURC1- FNTB NULL -4,21004843 CHURC1-FNTB protein isoform 2 LOC646719 NULL -4,21004843 MANEAL ENSG00000185090 -4,21004843 glycoprotein endo-alpha-1,2-mannosidase MPST ENSG00000128309 -4,21004843 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase NAA10 NULL -4,21004843 N-alpha-acetyltransferase 10, NatA catalytic subunit PAK1 ENSG00000149269 -4,21004843 serine/threonine-protein kinase PAK 1 RPL39 ENSG00000198918 -4,21004843 ribosomal protein L39 SCAMP4 ENSG00000227500 -4,21004843 secretory carrier-associated membrane protein 4 THOC6 ENSG00000131652 -4,21004843 THO complex subunit 6 homolog UBAP1 ENSG00000165006 -4,21004843 ubiquitin-associated protein 1 UQCRH ENSG00000173660 -4,21004843 cytochrome b-c1 complex subunit 6, mitochondrial WDR90 ENSG00000161996 -4,21004843 WD repeat-containing protein 90 RPS12 NULL -4,20940085 40S ribosomal protein S12 SEC13 ENSG00000157020 -4,20940085 protein SEC13 homolog CCL2 ENSG00000108691 -4,0823154 C-C motif chemokine 2 precursor GTF3A ENSG00000122034 -4,0348063 transcription factor IIIA NOP2 ENSG00000111641 -4,0348063 putative ribosomal RNA methyltransferase NOP2 isoform 1
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DCLRE1B ENSG00000118655 -3,97659403 5' exonuclease Apollo EXOC2 ENSG00000112685 -3,97659403 exocyst complex component 2 IL4I1 ENSG00000104951 -3,97659403 nuclear pore complex glycoprotein p62 NIP7 ENSG00000132603 -3,97659403 60S ribosome subunit biogenesis protein NIP7 homolog CMSS1 ENSG00000184220 -3,85956416 protein CMSS1 COX19 NULL -3,85956416 cytochrome c oxidase assembly protein COX19 DGCR2 ENSG00000070413 -3,85956416 DiGeorge syndrome critical region gene 2 precursor DNAH1 ENSG00000114841 -3,85956416 dynein heavy chain 1, axonemal E2F4 ENSG00000205250 -3,85956416 transcription factor E2F4 E2F8 ENSG00000129173 -3,85956416 E2F family member 8 JRK NULL -3,85956416 jerky protein homolog isoform b LYPLA2 ENSG00000011009 -3,85956416 acyl-protein thioesterase 2 MAPKAPK5 ENSG00000089022 -3,85956416 MAP kinase-activated protein kinase 5 MRPS27 ENSG00000113048 -3,85956416 28S ribosomal protein S27, mitochondrial NDUFAF4 ENSG00000123545 -3,85956416 NADH dehydrogenase (ubiquinone) complex I, assembly factor 4 PPP2CB ENSG00000104695 -3,85956416 protein phosphatase 2, catalytic subunit, beta isozyme RASGRP4 ENSG00000171777 -3,85956416 RAS guanyl-releasing protein 1 RNASEK ENSG00000219200 -3,85956416 ribonuclease kappa SLC2A1 ENSG00000117394 -3,85956416 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 1 SORBS3 ENSG00000120896 -3,85956416 vinexin SUN1 ENSG00000164828 -3,85956416 SUN domain-containing protein 1 VPS13D ENSG00000048707 -3,85956416 vacuolar protein sorting-associated protein 13D isoform 1 MFNG ENSG00000100060 -3,85907394 beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase manic fringe TACC3 ENSG00000013810 -3,85882887 transforming acidic coiled-coil-containing protein 3 SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of SMARCE1 ENSG00000073584 -3,78842895 chromatin subfamily E member 1 SUN2 ENSG00000100242 -3,77774674 SUN domain-containing protein 2 isoform b CES2 ENSG00000172831 -3,7425343 carboxylesterase 2-like precursor IKBIP ENSG00000166130 -3,7425343 IKBKB interacting protein LPPR2 ENSG00000105520 -3,7425343 lipid phosphate phosphatase-related protein type 2 isoform 2 RAB20 ENSG00000139832 -3,7425343 ras-related protein Rab-20 ZNF706 ENSG00000120963 -3,7425343 zinc finger protein 706 RPS19 ENSG00000105372 -3,74196369 40S ribosomal protein S19 ECD ENSG00000122882 -3,68401937 ecdysoneless MEPCE ENSG00000146834 -3,68401937 7SK snRNA methylphosphate capping enzyme TIMM13 ENSG00000099800 -3,68401937 translocase of inner mitochondrial membrane 13 homolog PKN1 ENSG00000123143 -3,60816185 serine/threonine-protein kinase N1 isoform 1 FURIN ENSG00000140564 -3,59570283 furin (paired basic amino acid cleaving enzyme) precursor ABHD16A ENSG00000204427 -3,50847458 protein BAT5 ACAD8 ENSG00000151498 -3,50847458 isobutyryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial ACD ENSG00000102977 -3,50847458 adrenocortical dysplasia protein homolog isoform 2 ALKBH6 ENSG00000239382 -3,50847458 alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 6 activating molecule in BECN1-regulated autophagy protein 1 AMBRA1 ENSG00000110497 -3,50847458 isoform 2 ANKRD49 ENSG00000168876 -3,50847458 ankyrin repeat domain-containing protein 49 ankyrin repeat and zinc finger domain-containing protein 1 isoform ANKZF1 ENSG00000163516 -3,50847458 1 UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 8 B3GNT8 ENSG00000177191 -3,50847458 precursor B4GALT3 ENSG00000158850 -3,50847458 UDP-Gal:betaGlcNAc beta 1,4- galactosyltransferase, polypeptide 3 BBS5 ENSG00000163093 -3,50847458 Bardet-Biedl syndrome 5 protein homolog BRAF ENSG00000157764 -3,50847458 serine/threonine-protein kinase B-raf BRF1, RNA polymerase III transcription initiation factor 90 kDa BRF1 ENSG00000185024 -3,50847458 subunit CACTIN ENSG00000105298 -3,50847458 cactin
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CAMK1 ENSG00000134072 -3,50847458 calcium/calmodulin-dependent protein kinase I CCDC12 ENSG00000160799 -3,50847458 coiled-coil domain-containing protein 12 CCDC130 ENSG00000104957 -3,50847458 coiled-coil domain-containing protein 130 carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 21 CEACAM21 ENSG00000007129 -3,50847458 isoform 2 precursor CLIP2 ENSG00000106665 -3,50847458 CAP-Gly domain-containing linker protein 2 isoform 2 CLK3 ENSG00000179335 -3,50847458 CDC-like kinase 3 CSF3R ENSG00000119535 -3,50847458 granulocyte colony-stimulating factor receptor precursor CYTH4 ENSG00000100055 -3,50847458 cytohesin-4 DBI ENSG00000155368 -3,50847458 diazepam binding inhibitor DRG2 ENSG00000108591 -3,50847458 developmentally-regulated GTP-binding protein 2 EEFSEC ENSG00000132394 -3,50847458 selenocysteine-specific elongation factor ELP5 ENSG00000170291 -3,50847458 elongator complex protein 5 ERO1LB ENSG00000086619 -3,50847458 ERO1-like protein alpha precursor EXOC3 ENSG00000180104 -3,50847458 exocyst complex component 3 FAM105A NULL -3,50847458 family with sequence similarity 105, member A FAM212B ENSG00000197852 -3,50847458 uncharacterized protein LOC100127801 FAM83D ENSG00000101447 -3,50847458 protein FAM83D FBXO25 ENSG00000147364 -3,50847458 F-box only protein 25 FUNDC1 ENSG00000069509 -3,50847458 FUN14 domain-containing protein 1 GPATCH2 ENSG00000092978 -3,50847458 G patch domain-containing protein 2 GRK6 ENSG00000198055 -3,50847458 G protein-coupled receptor kinase 6 HMBS ENSG00000256269 -3,50847458 hydroxymethylbilane synthase HPS6 ENSG00000166189 -3,50847458 Hermansky-Pudlak syndrome 6 protein IFITM1 ENSG00000185885 -3,50847458 interferon induced transmembrane protein 1 IGHMBP2 ENSG00000132740 -3,50847458 immunoglobulin mu binding protein 2 ING1 ENSG00000153487 -3,50847458 PHD finger protein ING1 KIFC3 ENSG00000140859 -3,50847458 kinesin family member C3 KLHL6 ENSG00000172578 -3,50847458 kelch-like protein 6 LACTB2 ENSG00000147592 -3,50847458 beta-lactamase-like protein 2 LAMTOR4 ENSG00000188186 -3,50847458 ragulator complex protein LAMTOR4 LINC00667 ENSG00000263753 -3,50847458 LOC284889 NULL -3,50847458 LOC652276 ENSG00000215154 -3,50847458 LOC80154 NULL -3,50847458 LYRM1 ENSG00000102897 -3,50847458 LYR motif containing protein 1 MAP2K7 ENSG00000076984 -3,50847458 mitogen-activated protein kinase kinase 7 MBD5 ENSG00000204406 -3,50847458 methyl-CPG-binding domain protein 5 MECR ENSG00000116353 -3,50847458 trans-2-enoyl-CoA reductase, mitochondrial precursor MED8 ENSG00000159479 -3,50847458 mediator subunit 8 METTL21B ENSG00000123427 -3,50847458 protein-lysine methyltransferase METTL21B isoform a MFSD8 ENSG00000164073 -3,50847458 major facilitator superfamily domain-containing protein 8 MMAB ENSG00000139428 -3,50847458 cob(I)yrinic acid a,c-diamide adenosyltransferase, mitochondrial MRPL17 ENSG00000158042 -3,50847458 39S ribosomal protein L17, mitochondrial MSH3 ENSG00000113318 -3,50847458 DNA mismatch repair protein MSH3 MSH5 ENSG00000204410 -3,50847458 DNA mismatch repair protein MSH5 MYL6B ENSG00000196465 -3,50847458 Myosin light polypeptide 6B MYLIP ENSG00000007944 -3,50847458 myosin regulatory light chain interacting protein NAIF1 ENSG00000171169 -3,50847458 nuclear apoptosis-inducing factor 1 NBPF25P NULL -3,50847458 NDUFA11 ENSG00000174886 -3,50847458 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 11 NDUFB4 ENSG00000065518 -3,50847458 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 4 NDUFS8 ENSG00000110717 -3,50847458 NADH dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur protein 8,
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mitochondrial
NFATC1 ENSG00000131196 -3,50847458 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1 NGDN ENSG00000129460 -3,50847458 neuroguidin NLRX1 ENSG00000160703 -3,50847458 NLR family member X1 NUP37 ENSG00000075188 -3,50847458 nucleoporin Nup37 NVL ENSG00000143748 -3,50847458 no vein-like protein ORAOV1 ENSG00000149716 -3,50847458 oral cancer overexpressed 1 PARD6G ENSG00000178184 -3,50847458 par-6 family cell polarity regulator gamma PCIF1 ENSG00000100982 -3,50847458 PDX1 C-terminal inhibiting factor 1 PDCL3 NULL -3,50847458 phosducin-like 3 CDP-diacylglycerol--glycerol-3-phosphate 3- PGS1 ENSG00000087157 -3,50847458 phosphatidyltransferase PHACTR3 ENSG00000087495 -3,50847458 phosphatase and actin regulator 3 PHF13 ENSG00000116273 -3,50847458 PHD finger protein 19 PINK1-AS NULL -3,50847458 pleckstrin homology domain containing, family G (with RhoGef PLEKHG4 ENSG00000196155 -3,50847458 domain) member 4 PNMA1 ENSG00000176903 -3,50847458 paraneoplastic antigen Ma1 PPP1R13B ENSG00000088808 -3,50847458 protein phosphatase 1, regulatory subunit 13B PPP1R37 ENSG00000104866 -3,50847458 protein phosphatase 1, regulatory subunit 37 PQLC2 ENSG00000040487 -3,50847458 PQ-loop repeat-containing protein 2-like RCE1 ENSG00000173653 -3,50847458 RUB1 conjugating enzyme 1 reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs RECK ENSG00000122707 -3,50847458 precursor RMND1 ENSG00000155906 -3,50847458 required for meiotic nuclear division protein 1 homolog RNASE2 ENSG00000169385 -3,50847458 non-secretory ribonuclease precursor RRP9 ENSG00000114767 -3,50847458 U3 small nucleolar RNA-interacting protein 2 RSRC2 ENSG00000111011 -3,50847458 arginine/serine-rich coiled-coil protein 2 RXRB ENSG00000204231 -3,50847458 retinoid X receptor, beta SCLY ENSG00000132330 -3,50847458 selenocysteine lyase SLC26A11 ENSG00000181045 -3,50847458 sodium-independent sulfate anion transporter SMG9 ENSG00000105771 -3,50847458 protein SMG9 SPCS1 ENSG00000114902 -3,50847458 signal peptidase complex subunit 1 STARD9 ENSG00000159433 -3,50847458 stAR-related lipid transfer protein 9 STMN3 ENSG00000197457 -3,50847458 stathmin-like 3 STYXL1 ENSG00000127952 -3,50847458 serine/threonine/tyrosine-interacting-like protein 1 TANGO2 ENSG00000183597 -3,50847458 transport and golgi organization 2 homolog TBCA ENSG00000171530 -3,50847458 tubulin-specific chaperone A TBL3 ENSG00000183751 -3,50847458 hypothetical protein TESC ENSG00000088992 -3,50847458 tescalcin THEMIS2 ENSG00000130775 -3,50847458 protein THEMIS2 isoform 3 TK1 ENSG00000167900 -3,50847458 thymidine kinase, cytosolic TMEM199 NULL -3,50847458 transmembrane protein 199 TOMM5 ENSG00000175768 -3,50847458 translocase of outer mitochondrial membrane 5 homolog TREX1 ENSG00000213689 -3,50847458 three prime repair exonuclease 1 isoform a TSPO ENSG00000100300 -3,50847458 tryptophan-rich sensory protein-like protein TUBGCP4 ENSG00000137822 -3,50847458 gamma-tubulin complex component 4 TXNL4B ENSG00000140830 -3,50847458 thioredoxin-like protein 4B UNK ENSG00000132478 -3,50847458 RING finger protein unkempt homolog USP28 ENSG00000048028 -3,50847458 ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 28 WDSUB1 ENSG00000196151 -3,50847458 WD repeat, SAM and U-box domain-containing protein 1 YDJC ENSG00000161179 -3,50847458 UPF0249 protein ydjC homolog ZBTB9 ENSG00000213588 -3,50847458 zinc finger and BTB domain containing 9 ZDHHC21 NULL -3,50847458 zinc finger, DHHC-type containing 21
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ZNF316 NULL -3,50847458 zinc finger protein 316 ZNF639 ENSG00000121864 -3,50847458 zinc finger protein 639 ZNF696 NULL -3,50847458 zinc finger protein 696 ZNF787 ENSG00000142409 -3,50847458 zinc finger protein 787 ZNF84 ENSG00000198040 -3,50847458 zinc finger protein 84 ZNRD1 ENSG00000066379 -3,50847458 DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA12 TCEB3 ENSG00000011007 -3,50809502 transcription elongation factor B (SIII), polypeptide 3 PCNT ENSG00000160299 -3,50804081 pericentrin RPLP2 NULL -3,50762527 60S acidic ribosomal protein P2 DDX39A ENSG00000123136 -3,42033591 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 39A PRDM2 ENSG00000116731 -3,40774684 PR domain containing 2, with ZNF domain RPL28 ENSG00000108107 -3,36787314 ribosomal protein L28 BRAT1 ENSG00000106009 -3,3674655 BRCA1-associated ATM activator 1 STEAP3 ENSG00000115107 -3,3674655 metalloreductase STEAP3 isoform b FAM78A ENSG00000126882 -3,33323245 uncharacterized protein LOC100145734 QSOX2 ENSG00000165661 -3,33323245 quiescin-sulfhydryl oxidase 2 RPL35 ENSG00000136942 -3,33323245 ribosomal protein L35 TDO2 ENSG00000151790 -3,33323245 tryptophan 2,3-dioxygenase ZMYM3 ENSG00000147130 -3,33323245 zinc finger MYM-type protein 3 isoform 1 ZNF655 ENSG00000197343 -3,33323245 zinc finger protein 655 isoform f C19orf59 NULL -3,33279532 mast cell-expressed membrane protein 1 CXCR4 ENSG00000121966 -3,3327281 chemokine (C-X-C motif), receptor 4 COPE ENSG00000105669 -3,31682624 coatomer subunit epsilon MYC ENSG00000136997 -3,30745288 transcription factor protein PHC2 ENSG00000134686 -3,30745288 polyhomeotic-like protein 2 DENND3 ENSG00000105339 -3,29766372 DENN domain-containing protein 3 C9orf69 ENSG00000238227 -3,2748184 protein C9orf69 CUL9 ENSG00000112659 -3,2748184 cullin 9 GLTPD1 ENSG00000224051 -3,2748184 ceramide-1-phosphate transfer protein GPR132 ENSG00000183484 -3,2748184 G protein-coupled receptor 132 GTPBP1 ENSG00000100226 -3,2748184 GTP-binding protein 1 HDAC7 ENSG00000061273 -3,2748184 histone deacetylase 7 HGS ENSG00000185359 -3,2748184 hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate LEMD2 ENSG00000161904 -3,2748184 LEM domain-containing protein 2 isoform 2 MRPL44 ENSG00000135900 -3,2748184 39S ribosomal protein L44, mitochondrial NANS ENSG00000095380 -3,2748184 sialic acid synthase PTGS1 ENSG00000095303 -3,2748184 prostaglandin G/H synthase 1 precursor RPL36 ENSG00000130255 -3,2748184 60S ribosomal protein L36 RPS26 ENSG00000197728 -3,2748184 ribosomal protein S26 SFT2D2 NULL -3,2748184 SFT2 domain containing 2 SLC39A3 ENSG00000141873 -3,2748184 solute carrier family 39 (zinc transporter), member 3 TAGAP ENSG00000164691 -3,2748184 T-cell activation Rho GTPase-activating protein TMC6 ENSG00000141524 -3,2748184 transmembrane channel-like 6 TMED1 NULL -3,2748184 Transmembrane emp24 domain-containing protein 1 TROAP ENSG00000135451 -3,2748184 tastin isoform 2 APH1A ENSG00000117362 -3,27438717 APH1A gamma secretase subunit RPL21 ENSG00000122026 -3,27438717 60S ribosomal protein L21 MIS18A ENSG00000159055 -3,27395602 protein Mis18-alpha RBM19 ENSG00000122965 -3,27395602 probable RNA-binding protein 19 FUT4 ENSG00000196371 -3,24496898 probable fucosyltransferase 4 TRERF1 ENSG00000124496 -3,2274543 transcriptional-regulating factor 1 CBX2 ENSG00000173894 -3,22706366 chromobox protein homolog 2
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CHPF2 ENSG00000033100 -3,22706366 chondroitin sulfate glucuronyltransferase EBP ENSG00000147155 -3,22706366 ethylene-responsive transcription factor RAP2-3 EIF3F ENSG00000175390 -3,22706366 eukaryotic translation initiation factor 3, subunit F-like POLD1 ENSG00000062822 -3,22706366 DNA-directed DNA polymerase delta 1 sterol regulatory element-binding protein cleavage-activating SCAP ENSG00000114650 -3,22706366 protein SNRPD1 ENSG00000167088 -3,22706366 small nuclear ribonucleoprotein Sm D1 KDM3B ENSG00000120733 -3,21587814 lysine-specific demethylase 3B SRP14 ENSG00000140319 -3,20733183 signal recognition particle 14 kDa protein AHSA2 ENSG00000173209 -3,15799031 activator of 90 kDa heat shock protein ATPase ARL8A ENSG00000143862 -3,15799031 ADP-ribosylation factor-like protein 8A-like bifunctional lysine-specific demethylase and histidyl-hydroxylase C14orf169 NULL -3,15799031 NO66 ERGIC1 ENSG00000113719 -3,15799031 endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 1 ETFB ENSG00000105379 -3,15799031 electron transfer flavoprotein subunit beta GDAP2 ENSG00000196505 -3,15799031 ganglioside-induced differentiation-associated protein 2 GET4 ENSG00000239857 -3,15799031 golgi to ER traffic protein 4 homolog GMPR2 ENSG00000100938 -3,15799031 GMP reductase 2 GPALPP1 ENSG00000133114 -3,15799031 GPALPP motifs containing 1 GPD1L ENSG00000152642 -3,15799031 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1-like protein ISOC2 ENSG00000063241 -3,15799031 isochorismatase domain-containing protein 2, mitochondrial KIF13B ENSG00000197892 -3,15799031 kinesin family member 13B LOC100506710 ENSG00000233137 -3,15799031 PDCL ENSG00000136940 -3,15799031 phosducin-like PFDN5 ENSG00000123349 -3,15799031 prefoldin subunit 5 PRAM1 ENSG00000133246 -3,15799031 PML-RARA-regulated adapter molecule 1 PSMG3 ENSG00000157778 -3,15799031 proteasome assembly chaperone 3 RAD51 ENSG00000051180 -3,15799031 DNA repair protein RAD51-like 1 RANBP10 ENSG00000141084 -3,15799031 ran-binding protein 10 RELA ENSG00000173039 -3,15799031 transcription factor p65 SIL1 ENSG00000120725 -3,15799031 nucleotide exchange factor SIL1 precursor TOR4A ENSG00000198113 -3,15799031 torsin-4A-A YEATS4 ENSG00000127337 -3,15799031 YEATS domain-containing protein 4 ZNF200 ENSG00000010539 -3,15799031 zinc finger protein 200 isoform 1 ZNF407 ENSG00000215421 -3,15799031 zinc finger protein 407 isoform 3 PWP2 ENSG00000241945 -3,15768765 Periodic tryptophan protein 2 homolog SSR4 ENSG00000180879 -3,15768765 translocon-associated protein subunit delta precursor ATAD3A ENSG00000197785 -3,1571515 ATPase family AAA domain-containing protein 3 PES1 ENSG00000100029 -3,1571515 pescadillo homolog isoform 2 UBE2S ENSG00000108106 -3,11835911 ubiquitin-conjugating enzyme E2 S IL4R ENSG00000077238 -3,10703787 interleukin-4 receptor subunit alpha isoform a precursor LYL1 ENSG00000104903 -3,0869039 protein lyl-1 MMP25 ENSG00000008516 -3,0869039 Matrix metalloproteinase-25 precursor PNPLA2 ENSG00000177666 -3,0869039 patatin-like phospholipase domain containing 2 BDH1 ENSG00000161267 -3,04075868 D-beta-hydroxybutyrate dehydrogenase, mitochondrial CD101 ENSG00000134256 -3,04075868 immunoglobulin superfamily member 2 isoform 1 precursor COG2 ENSG00000135775 -3,04075868 conserved oligomeric Golgi complex subunit 2 DHX37 ENSG00000150990 -3,04075868 probable ATP-dependent RNA helicase DHX37 FAM156B ENSG00000179304 -3,04075868 protein FAM156A/FAM156B FRMD8 ENSG00000126391 -3,04075868 FERM domain-containing protein 8 GDI1 ENSG00000203879 -3,04075868 guanosine nucleotide diphosphate dissociation inhibitor 1 NFYC ENSG00000066136 -3,04075868 nuclear transcription factor Y, gamma isoform 2 OSBPL2 ENSG00000130703 -3,04075868 oxysterol binding protein-like 2
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RARG ENSG00000172819 -3,04075868 retinoic acid receptor gamma SH3BP5-AS1 ENSG00000224660 -3,04075868 SLC11A2 ENSG00000110911 -3,04075868 natural resistance-associated macrophage protein 2 USP47 ENSG00000170242 -3,04075868 ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 47 FERMT3 ENSG00000149781 -3,0403497 fermitin family member 3 SRSF6 ENSG00000124193 -3,04026791 serine/arginine-rich splicing factor 6 solute carrier family 35 (adenosine 3'-phospho 5'-phosphosulfate SLC35B2 ENSG00000157593 -3,04014525 transporter), member B2 precursor VPS13B ENSG00000132549 -3,04014525 vacuolar protein sorting-associated protein 13B isoform 1 ELAV (embryonic lethal, abnormal vision, Drosophila)-like 1 (Hu ELAVL1 ENSG00000066044 -3,01706815 antigen R) GOLM1 ENSG00000135052 -3,00691683 Golgi membrane protein 1
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Lista de genes expressos diferencialmente regulados positivamente.
Gene Ensemble fold_change description CRYZ ENSG00000116791 29,9103448 crystallin, zeta (quinone reductase) GTF2B ENSG00000137947 29,9103448 transcription initiation factor IIB SH3PXD2B ENSG00000174705 24,2137931 SH3 and PX domains 2B SOS2 ENSG00000100485 21,3655172 son of sevenless homolog 2 SLC16A6 ENSG00000108932 19,9577222 solute carrier family 16 (monocarboxylic acid transporters), member 6 SUMF1 ENSG00000144455 19,9413793 sulfatase-modifying factor 1 precursor ZNF35 ENSG00000169981 19,9413793 zinc finger protein 35 SEC24A ENSG00000113615 17,1017826 protein transport protein Sec24A isoform 1 arf-GAP with Rho-GAP domain, ANK repeat and PH domain- ARAP2 ENSG00000047365 17,0913793 containing protein 2 ARRDC3 ENSG00000113369 15,6672414 arrestin domain containing 3 CCDC138 ENSG00000163006 15,6672414 coiled-coil domain containing 138 RC3H2 ENSG00000056586 15,6672414 roquin-2 isoform 1 UBTD2 ENSG00000168246 14,2431035 ubiquitin domain-containing protein 2 ZBED5 ENSG00000236287 14,2431035 zinc finger BED domain-containing protein 5 NEO1 ENSG00000067141 12,8189655 neogenin precursor NT5C3A ENSG00000122643 12,8189655 cytosolic 5'-nucleotidase 3 PCTP ENSG00000141179 12,8189655 phosphatidylcholine transfer protein serine/threonine-protein phosphatase 2A regulatory subunit B'' subunit PPP2R3C ENSG00000092020 12,8189655 gamma MTMR10 ENSG00000166912 11,4046592 myotubularin-related protein 10 ELMOD2 ENSG00000179387 11,3948276 ELMO/CED-12 domain containing 2 precursor GBP5 ENSG00000154451 11,3948276 guanylate binding protein 5 HPS5 ENSG00000110756 11,3948276 Hermansky-Pudlak syndrome 5 FAM45A NULL 10,6919758 uncharacterized protein LOC423928 GFPT1 ENSG00000198380 10,3352028 glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1 DCUN1D1 NULL 9,97929249 DCN1-like protein 1 FAM160B1 ENSG00000151553 9,97929249 uncharacterized protein LOC100038786 HAUS3 ENSG00000214367 9,97929249 HAUS augmin-like complex, subunit 3-like RGS18 ENSG00000150681 9,97929249 regulator of G-protein signaling 18 disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 22 ADAM22 ENSG00000008277 9,97068966 precursor CA5B ENSG00000169239 9,97068966 carbonic anhydrase VB, mitochondrial CCNG2 ENSG00000138764 9,97068966 cyclin-G2 bifunctional ATP-dependent dihydroxyacetone kinase/FAD-AMP lyase DAK ENSG00000149476 9,97068966 (cyclizing) FAM134B ENSG00000154153 9,97068966 uncharacterized protein LOC100145538 MCM3AP-AS1 ENSG00000215424 9,97068966 PDSS1 ENSG00000148459 9,97068966 decaprenyl-diphosphate synthase subunit 1 PHLPP2 ENSG00000040199 9,97068966 PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase 2 PTCD2 ENSG00000049883 9,97068966 pentatricopeptide repeat-containing protein 2, mitochondrial RPP38 ENSG00000152464 9,97068966 ribonuclease P protein subunit p38 SLC25A46 ENSG00000164209 9,97068966 solute carrier family 25 member 46 TRIM58 NULL 9,97068966 tripartite motif-containing protein 58 CRYBG3 NULL 9,26660915 beta/gamma crystallin domain-containing protein 3 LRRC57 ENSG00000180979 9,26660915 leucine-rich repeat-containing protein 57 ACVR2B NULL 9,02587694 activin receptor type-2B precursor FUBP3 ENSG00000107164 8,90983607 Far upstream element-binding protein 3 KLF10 ENSG00000155090 8,55306299 Kruppel-like factor 10 RNF167 ENSG00000108523 8,55306299 ring finger protein 167 precursor SENP2 NULL 8,55306299 sentrin-specific protease 2 ETNK1 ENSG00000139163 8,55089132 ethanolamine kinase 1 isoform A
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putative Dol-P-Glc:Glc(2)Man(9)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,2- ALG10B NULL 8,54655172 glucosyltransferase ANGEL1 ENSG00000013523 8,54655172 angel homolog 1 ANKRD50 ENSG00000151458 8,54655172 ankyrin repeat domain-containing protein 50 isoform 2 CTH ENSG00000116761 8,54655172 cystathionase (cystathionine gamma-lyase) DEPDC1 ENSG00000024526 8,54655172 DEP domain-containing protein 1A ERI2 ENSG00000196678 8,54655172 ERI1 exoribonuclease 2 FBXO46 ENSG00000177051 8,54655172 F-box protein 46 IFT52 ENSG00000101052 8,54655172 intraflagellar transport 52 homolog KIAA1430 ENSG00000164323 8,54655172 UPF0501 protein KIAA1430 homolog MSANTD2 ENSG00000120458 8,54655172 myb/SANT-like DNA-binding domain-containing protein 2 NTMT1 ENSG00000148335 8,54655172 N-terminal Xaa-Pro-Lys N-methyltransferase 1 RAD17 ENSG00000152942 8,54655172 cell cycle checkpoint protein RAD17 RANBP6 ENSG00000137040 8,54655172 ran-binding protein 6 isoform 3 ROGDI ENSG00000067836 8,54655172 protein rogdi homolog TK2 ENSG00000166548 8,54655172 thymidine kinase 2, mitochondrial TMEM41B ENSG00000166471 8,54655172 transmembrane protein 41B TMLHE ENSG00000185973 8,54655172 trimethyllysine hydroxylase, epsilon ZNF138 ENSG00000197008 8,54655172 zinc finger protein 138 isoform 2 ZSCAN26 NULL 8,54655172 zinc finger and SCAN domain-containing protein 26 isoform b SPOPL ENSG00000144228 8,07590569 speckle-type POZ protein-like DENND4C ENSG00000137145 7,84037964 DENN domain-containing protein 4C DUSP16 NULL 7,84037964 dual specificity protein phosphatase 16 KLHL24 NULL 7,84037964 kelch-like family member 24 RIPK2 ENSG00000104312 7,84037964 receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 OTUD3 ENSG00000169914 7,60092007 OTU domain-containing protein 3 EMB ENSG00000170571 7,53413853 embigin C22orf29 ENSG00000215012 7,12769629 protein Bop GCC2 ENSG00000135968 7,12769629 GRPEL2 ENSG00000164284 7,12769629 GrpE-like 2, mitochondrial NARS2 ENSG00000137513 7,12769629 probable asparaginyl-tRNA synthetase, mitochondrial NDFIP2 ENSG00000102471 7,12769629 NEDD4 family-interacting protein 2 TTBK2 ENSG00000128881 7,12769629 tau tubulin kinase 2 NCEH1 ENSG00000144959 7,12663906 neutral cholesterol ester hydrolase 1 precursor C2orf69 ENSG00000178074 7,12593445 uncharacterized protein LOC549281 MMGT1 ENSG00000169446 7,12593445 membrane magnesium transporter 1 precursor TXNIP ENSG00000117289 7,12593445 thioredoxin interacting protein BTBD10 ENSG00000148925 7,12241379 BTB (POZ) domain containing 10 C11orf83 ENSG00000204922 7,12241379 UPF0723 protein C11orf83 precursor C11orf84 ENSG00000168005 7,12241379 uncharacterized protein C11orf84 CSPP1 ENSG00000104218 7,12241379 centrosome and spindle pole-associated protein 1 CTPS2 ENSG00000047230 7,12241379 CTP synthase 2 DDX26B ENSG00000165359 7,12241379 integrator complex subunit 6 DDX59 ENSG00000118197 7,12241379 probable ATP-dependent RNA helicase DDX59 FAM220A ENSG00000178397 7,12241379 protein FAM220A FOXF1 ENSG00000103241 7,12241379 forkhead box protein F1 FSD1L ENSG00000106701 7,12241379 FSD1-like protein isoform 2 GTDC1 ENSG00000121964 7,12241379 glycosyltransferase-like domain-containing protein 1 HGSNAT ENSG00000165102 7,12241379 heparan-alpha-glucosaminide N-acetyltransferase precursor KLF9 ENSG00000119138 7,12241379 Kruppel-like factor 9 LIN9 ENSG00000183814 7,12241379 protein lin-9 homolog LMO1 ENSG00000166407 7,12241379 rhombotin-1 PCNXL2 ENSG00000135749 7,12241379 pecanex-like protein 2
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PDHX ENSG00000110435 7,12241379 pyruvate dehydrogenase complex, component X PLEKHA3 ENSG00000116095 7,12241379 pleckstrin homology domain-containing family A member 3 PSMD6-AS2 ENSG00000239653 7,12241379 PUSL1 ENSG00000169972 7,12241379 tRNA pseudouridine synthase-like 1 RIN2 ENSG00000132669 7,12241379 E3 ubiquitin protein ligase RIN2 RNF113A ENSG00000125352 7,12241379 RING finger protein 113A RUNDC1 ENSG00000198863 7,12241379 RUN domain-containing protein 1 TATDN3 ENSG00000203705 7,12241379 putative deoxyribonuclease tatdn3 TTC33 ENSG00000113638 7,12241379 tetratricopeptide repeat protein 33 TVP23B ENSG00000171928 7,12241379 Golgi apparatus membrane protein TVP23 homolog B UGCG NULL 7,12241379 ceramide glucosyltransferase ZDBF2 ENSG00000204186 7,12241379 DBF4-type zinc finger-containing protein 2 isoform 1 ZNF230 ENSG00000159882 7,12241379 zinc finger protein 230 ZNF449 ENSG00000173275 7,12241379 zinc finger protein 449 RAB5B ENSG00000111540 6,65094882 ras-related protein Rab-5B BIRC3 ENSG00000023445 6,41501294 baculoviral IAP repeat-containing protein 3 CDYL ENSG00000153046 6,41501294 KDM3A ENSG00000115548 6,41501294 lysine-specific demethylase 3A LAMTOR3 ENSG00000109270 6,41501294 ragulator complex protein LAMTOR3 MRPL50 ENSG00000136897 6,41501294 39S ribosomal protein L50, mitochondrial MXI1 ENSG00000119950 6,41501294 max-interacting protein 1 TDRD7 ENSG00000196116 6,41501294 tudor domain-containing protein 7A isoform 2 XYLB ENSG00000093217 6,41501294 xylulose kinase FASTKD3 ENSG00000124279 6,05867127 FAST kinase domains 3 TIPARP ENSG00000163659 6,05867127 TCDD-inducible poly [ADP-ribose] polymerase RNF138 ENSG00000134758 5,98619738 E3 ubiquitin-protein ligase RNF138 SLC38A2 ENSG00000134294 5,95230363 solute carrier family 38, member 2 AAAS ENSG00000094914 5,70232959 aladin ACVR1 ENSG00000115170 5,70232959 Activin receptor type-1 precursor C21orf33 ENSG00000160221 5,70232959 uncharacterized protein LOC100381155 CCDC144B ENSG00000154874 5,70232959 FBXO34 ENSG00000178974 5,70232959 F-box protein 34 MED29 ENSG00000063322 5,70232959 mediator of RNA polymerase II transcription subunit 29 NDUFC2 ENSG00000151366 5,70232959 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 subunit C2 PLSCR3 ENSG00000187838 5,70232959 phospholipid scramblase 3 PRKAG2 ENSG00000106617 5,70232959 protein kinase, AMP-activated, gamma 2 non-catalytic subunit PRMT3 ENSG00000185238 5,70232959 protein arginine N-methyltransferase 3 RFK ENSG00000135002 5,70232959 riboflavin kinase TPMT ENSG00000137364 5,70232959 Probable thiopurine S-methyltransferase precursor TRIP10 ENSG00000125733 5,70232959 cdc42-interacting protein 4 XAF1 ENSG00000132530 5,70232959 XIAP-associated factor 1 ZNF26 ENSG00000198393 5,70232959 zinc finger protein 26 isoform 2 TANK ENSG00000136560 5,70117322 TRAF interacting protein TANK PDE4DIP ENSG00000178104 5,70040253 phosphodiesterase 4D interacting protein POR ENSG00000127948 5,70040253 tubulin-folding cofactor C RNF2 ENSG00000121481 5,70040253 E3 ubiquitin-protein ligase RING2 ZBTB38 ENSG00000177311 5,70040253 zinc finger and BTB domain-containing protein 38 ABCA1 ENSG00000165029 5,69655172 ABC transporter A family member 1 ARL5B ENSG00000165997 5,69655172 ADP-ribosylation factor-like 5B ARMC7 ENSG00000125449 5,69655172 armadillo repeat containing 7 BICD1 ENSG00000151746 5,69655172 protein bicaudal D homolog 1 isoform 1 CCDC115 ENSG00000136710 5,69655172 coiled-coil domain-containing protein 115
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CCDC28A ENSG00000024862 5,69655172 coiled-coil domain-containing protein 28A CLECL1 ENSG00000184293 5,69655172 C-type lectin-like domain family 1 isoform 1 COG6 ENSG00000133103 5,69655172 component of oligomeric golgi complex 6 COLGALT2 ENSG00000198756 5,69655172 procollagen galactosyltransferase 2 precursor CORO1B ENSG00000172725 5,69655172 coronin, actin binding protein, 1B EEF1E1 ENSG00000124802 5,69655172 eukaryotic translation elongation factor 1 epsilon 1 FAM149B1 NULL 5,69655172 protein FAM149B1 FAM175A ENSG00000163322 5,69655172 BRCA1-A complex subunit Abraxas FAM214B ENSG00000005238 5,69655172 protein FAM214B GABARAPL1 ENSG00000139112 5,69655172 GABA(A) receptor-associated protein like 1 GGCX ENSG00000115486 5,69655172 gamma-glutamyl carboxylase GIMAP2 ENSG00000106560 5,69655172 GTPase IMAP family member 2 ITGA3 ENSG00000005884 5,69655172 integrin alpha-3 precursor JMY ENSG00000152409 5,69655172 junction-mediating and -regulatory protein KIAA0556 ENSG00000047578 5,69655172 uncharacterized protein KIAA0556 homolog KIAA1024 ENSG00000169330 5,69655172 uncharacterized protein LOC415485 KNOP1 NULL 5,69655172 lysine-rich nucleolar protein 1 LOC100506548 NULL 5,69655172 LOC613037 ENSG00000198064 5,69655172 METTL4 ENSG00000101574 5,69655172 methyltransferase-like protein 4 NDNL2 ENSG00000185115 5,69655172 necdin-like 2 PAFAH2 ENSG00000158006 5,69655172 platelet-activating factor acetylhydrolase 2, cytoplasmic PAX5 ENSG00000196092 5,69655172 paired box protein Pax-5 PCYT1A ENSG00000161217 5,69655172 phosphate cytidylyltransferase 1, choline, alpha PDF ENSG00000258429 5,69655172 pigment-dispersing factor precursor PGBD5 ENSG00000177614 5,69655172 piggyBac transposable element-derived protein 5 PPOX ENSG00000143224 5,69655172 pyridoxine/pyridoxamine 5'-phosphate oxidase 1 RAB3IL1 ENSG00000167994 5,69655172 guanine nucleotide exchange factor for Rab-3A RALGPS2 ENSG00000116191 5,69655172 Ral-A exchange factor RalGPS2 RMND5B ENSG00000145916 5,69655172 protein RMD5 homolog B RPS6KA5 ENSG00000100784 5,69655172 ribosomal protein S6 kinase alpha-5 RRN3P2 ENSG00000103472 5,69655172 SDHAP1 ENSG00000185485 5,69655172 SLC38A9 ENSG00000177058 5,69655172 putative sodium-coupled neutral amino acid transporter 9 SLC41A2 ENSG00000136052 5,69655172 solute carrier family 41 member 2 SNRK-AS1 NULL 5,69655172 SOCS6 ENSG00000170677 5,69655172 suppressor of cytokine signaling SPRED1 ENSG00000166068 5,69655172 sprouty-related, EVH1 domain-containing protein 1 STOML1 ENSG00000067221 5,69655172 stomatin-like protein 1 THAP9-AS1 ENSG00000251022 5,69655172 TREM1 ENSG00000124731 5,69655172 triggering receptor expressed on myeloid cells 1 precursor UBXN2A NULL 5,69655172 UBX domain protein 2A VWA5A ENSG00000110002 5,69655172 von Willebrand factor A domain containing 5A WWP1 ENSG00000123124 5,69655172 WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1 XRCC2 ENSG00000196584 5,69655172 DNA repair protein XRCC2-like protein ZGPAT ENSG00000197114 5,69655172 zinc finger CCCH-type with G patch domain-containing protein ZKSCAN3 ENSG00000189298 5,69655172 zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 3 isoform 1 ZNF271 ENSG00000257267 5,69655172 zinc finger protein 271 ZNF616 ENSG00000204611 5,69655172 zinc finger protein 616 ZNF618 ENSG00000157657 5,69655172 zinc finger protein 618 ZNF761 NULL 5,69655172 zinc finger protein 761 ZNRD1-AS1 ENSG00000204623 5,69655172
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DBF4 ENSG00000006634 5,34598792 protein DBF4 homolog A TMEM167B ENSG00000215717 5,34598792 protein kish-B precursor EXOC5 ENSG00000070367 5,34483502 exocyst complex component 5 C15orf52 ENSG00000188549 5,22541691 uncharacterized protein C15orf52 homolog SLC2A5 ENSG00000142583 5,22541691 SPRY2 ENSG00000136158 5,22541691 protein sprouty homolog 2 ZNF621 NULL 5,22541691 zinc finger protein 621 isoform 1 GDP-Man:Man(3)GlcNAc(2)-PP-Dol alpha-1,2-mannosyltransferase ALG11 ENSG00000253710 4,98964625 isoform 1 BLOC1S3 ENSG00000189114 4,98964625 biogenesis of lysosome-related organelles complex 1 subunit 3 C15orf57 ENSG00000128891 4,98964625 uncharacterized protein LOC100049764 C9orf64 ENSG00000165118 4,98964625 chromosome 9 open reading frame 64 CRBN ENSG00000113851 4,98964625 protein cereblon DNAAF2 ENSG00000165506 4,98964625 protein kintoun ECI1 ENSG00000167969 4,98964625 delta(3), delta(2)-enoyl CoA isomerase 1 FAM102B ENSG00000162636 4,98964625 uncharacterized protein LOC549525 FAM175B ENSG00000165660 4,98964625 family with sequence similarity 175, member B GTF2E2 ENSG00000197265 4,98964625 general transcription factor IIE, polypeptide 2, beta HERC4 ENSG00000148634 4,98964625 probable E3 ubiquitin-protein ligase HERC4 IP6K2 ENSG00000068745 4,98964625 inositol hexaphosphate kinase 2 MTIF3 ENSG00000122033 4,98964625 mitochondrial translational initiation factor 3 PET112 ENSG00000059691 4,98964625 glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit B, mitochondrial-like PEX26 ENSG00000215193 4,98964625 peroxisome assembly protein 26 PIGA ENSG00000165195 4,98964625 N-acetylglucosaminyl-phosphatidylinositol biosynthetic protein PPP1R3B ENSG00000173281 4,98964625 protein phosphatase 1 regulatory subunit 3B SLC25A17 ENSG00000100372 4,98964625 peroxisomal membrane protein PMP34 SLC37A4 ENSG00000137700 4,98964625 solute carrier family 37 (glucose-6-phosphate transporter), member 4 MTMR6 ENSG00000139505 4,9089515 myotubularin-related protein 6 IBTK ENSG00000005700 4,8871087 inhibitor of Bruton tyrosine kinase SKIL ENSG00000136603 4,8871087 ski-like protein LIPA ENSG00000107798 4,84610076 lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase precursor RYBP NULL 4,75062296 RING1 and YY1 binding protein lactosylceramide 1,3-N-acetyl-beta-D-glucosaminyltransferase B3GNT5 ENSG00000176597 4,75043128 precursor BCORL1 ENSG00000085185 4,75043128 BCL6 corepressor-like 1 CKS1B ENSG00000173207 4,75043128 CDC28 protein kinase 1B DOCK4 ENSG00000128512 4,75043128 dedicator of cytokinesis protein 4 FAM135A ENSG00000082269 4,75043128 protein FAM135A FBXO30 NULL 4,75043128 F-box protein 30 FRS2 ENSG00000166225 4,75043128 fibroblast growth factor receptor substrate 2 GALNT3 ENSG00000115339 4,75043128 polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 3 INPP4B ENSG00000109452 4,75043128 type II inositol 3,4-bisphosphate 4-phosphatase JAK2 ENSG00000096968 4,75043128 Janus kinase 2 KDM7A ENSG00000006459 4,75043128 lysine-specific demethylase 7 NSDHL ENSG00000147383 4,75043128 sterol-4-alpha-carboxylate 3-dehydrogenase, decarboxylating TRIM33 ENSG00000197323 4,75043128 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM33 ZCCHC8 NULL 4,75043128 zinc finger CCHC domain-containing protein 8 GTF2H3 ENSG00000111358 4,68350998 general transcription factor IIH, polypeptide 3 MOB1B ENSG00000173542 4,63330457 MOB kinase activator 1B SLC50A1 ENSG00000169241 4,63330457 sugar transporter SWEET1 TROVE2 ENSG00000116747 4,63330457 60 kDa SS-A/Ro ribonucleoprotein TTK ENSG00000112742 4,63330457 dual specificity protein kinase Ttk ZNF260 ENSG00000254004 4,63330457 zinc finger protein 260
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TIA1 ENSG00000116001 4,63208971 cytotoxic granule-associated RNA binding protein 1 CLDND1 ENSG00000080822 4,5610766 claudin domain containing 1 ITPR2 ENSG00000123104 4,5610766 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 2 SLC45A4 ENSG00000022567 4,5610766 solute carrier family 45 member 4 isoform 2 FNDC3A ENSG00000102531 4,4337742 fibronectin type-III domain-containing protein 3a ABHD8 ENSG00000127220 4,2769629 abhydrolase domain-containing protein 8 AP3B2 ENSG00000103723 4,2769629 adaptor-related protein complex 3, beta 2 subunit APOBEC3C ENSG00000244509 4,2769629 probable DNA dC->dU-editing enzyme APOBEC-3C CENPC ENSG00000145241 4,2769629 centromere protein C ELL2 ENSG00000118985 4,2769629 elongation factor, RNA polymerase II, 2 HMBOX1 ENSG00000147421 4,2769629 homeobox-containing protein 1 KIAA0922 ENSG00000121210 4,2769629 transmembrane protein 131-like isoform 1 precursor LINC00641 ENSG00000258441 4,2769629 LTBP1 ENSG00000049323 4,2769629 latent transforming growth factor beta binding protein 1 precursor MBNL2 ENSG00000139793 4,2769629 muscleblind-like 2 isoform A MTRNR2L8 ENSG00000255823 4,2769629 MTRNR2-like 8 PDIK1L ENSG00000175087 4,2769629 serine/threonine-protein kinase pdik1l PIK3C3 NULL 4,2769629 phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3 PTCHD3P1 ENSG00000224597 4,2769629 PUS7L ENSG00000129317 4,2769629 pseudouridylate synthase 7 homolog-like protein RIMKLB ENSG00000166532 4,2769629 beta-citryl-glutamate synthase B RPL26L1 ENSG00000037241 4,2769629 60S ribosomal protein L26-like 1 SIK2 NULL 4,2769629 serine/threonine-protein kinase SIK2 SPAG1 ENSG00000104450 4,2769629 sperm associated antigen 1 TBPL1 NULL 4,2769629 TATA box-binding protein-like protein 1 TET2 ENSG00000168769 4,2769629 tetraspanin2 TNF ENSG00000232810 4,2769629 tumor necrosis factor TRAF3IP2 ENSG00000056972 4,2769629 UCK1 ENSG00000130717 4,2769629 uridine-cytidine kinase 1 WDR83OS NULL 4,2769629 WD repeat domain 83 opposite strand ZNF518B ENSG00000178163 4,2769629 zinc finger protein 518B ZNF557 ENSG00000130544 4,2769629 zinc finger protein 557 isoform a ZNF654 ENSG00000175105 4,2769629 zinc finger protein 654 ECM1 ENSG00000143369 4,27653149 Extracellular matrix protein 1 precursor GPR180 ENSG00000152749 4,27653149 integral membrane protein GPR180 precursor GTF2A1 ENSG00000165417 4,27653149 transcription initiation factor IIA subunit 1 KANSL1 ENSG00000120071 4,27653149 KAT8 regulatory NSL complex subunit 1 NAA38 NULL 4,27653149 N(alpha)-acetyltransferase 38, NatC auxiliary subunit PKNOX1 ENSG00000160199 4,27653149 homeobox protein PKNOX1 isoform 1 TOX4 ENSG00000092203 4,27653149 TOX high mobility group box family member 4 RUFY1 ENSG00000176783 4,27606606 RUN and FYVE domain containing 1 WDR36 ENSG00000134987 4,27606606 WD repeat-containing protein 36 C12orf23 ENSG00000151135 4,27605245 UPF0444 transmembrane protein C12orf23 AHRR ENSG00000063438 4,27582489 aryl-hydrocarbon receptor repressor ARL6IP4 ENSG00000182196 4,27544566 ADP-ribosylation factor-like protein 6-interacting protein 4 ASB8 ENSG00000177981 4,27544566 ankyrin repeat and SOCS box protein 8 BAG4 ENSG00000156735 4,27544566 BAG family molecular chaperone regulator 4 COMMD1 NULL 4,27544566 copper metabolism (Murr1) domain containing 1 COX11 ENSG00000166260 4,27544566 COX11 homolog, cytochrome c oxidase assembly protein CYP1A1 ENSG00000140465 4,27544566 cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 CYSLTR1 NULL 4,27544566 cysteinyl leukotriene receptor 1 GAN ENSG00000127688 4,27544566 gigaxonin
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MIR4435-1HG ENSG00000172965 4,27544566 [Pyruvate dehydrogenase [acetyl-transferring]]-phosphatase 1, PDP1 ENSG00000164951 4,27544566 mitochondrial RBM18 NULL 4,27544566 probable RNA-binding protein 18 RNF139 NULL 4,27544566 RING finger protein 139 SPIRE1 ENSG00000134278 4,27544566 spire-type actin nucleation factor 1 ST6GAL1 ENSG00000073849 4,27544566 beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1 TBC1D31 ENSG00000156787 4,27544566 TBC1 domain family member 31 TMTC3 ENSG00000139324 4,27544566 transmembrane and TPR repeat-containing protein 3 UBE2W ENSG00000104343 4,27544566 probable ubiquitin-conjugating enzyme E2 W-A AGL ENSG00000162688 4,27241379 amylo-alpha-1, 6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase ARL15 ENSG00000185305 4,27241379 ADP-ribosylation factor-like 15 ASCC1 NULL 4,27241379 activating signal cointegrator 1 complex subunit 1 ATG2A ENSG00000110046 4,27241379 autophagy-related protein 2 homolog A ATP6V0D2 ENSG00000147614 4,27241379 ATPase, H+ transporting, lysosomal 38kDa, V0 subunit d2 ATPAF1 ENSG00000123472 4,27241379 ATP synthase mitochondrial F1 complex assembly factor 1 C15orf37 ENSG00000257028 4,27241379 C17orf51 ENSG00000212719 4,27241379 uncharacterized protein C17orf51 C1orf52 NULL 4,27241379 UPF0690 protein C1orf52 homolog C1RL-AS1 ENSG00000205885 4,27241379 C20orf197 ENSG00000176659 4,27241379 uncharacterized protein C20orf197 C9orf139 ENSG00000180539 4,27241379 uncharacterized protein C9orf139 CCDC104 ENSG00000163001 4,27241379 coiled-coil domain-containing protein 104 CCDC144A ENSG00000170160 4,27241379 coiled-coil domain-containing protein 144A CDR2L ENSG00000109089 4,27241379 cerebellar degeneration-related protein 2-like CENPV ENSG00000166582 4,27241379 centromere protein V CREB3 ENSG00000107175 4,27241379 cAMP responsive element binding protein 3 putative pre-mRNA-splicing factor ATP-dependent RNA helicase DHX32 ENSG00000089876 4,27241379 DHX32 DPH5 NULL 4,27241379 diphthine synthase DYRK3 ENSG00000143479 4,27241379 dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 3 EIF3CL ENSG00000205609 4,27241379 eukaryotic translation initiation factor 3 subunit C-like protein ERCC8 ENSG00000049167 4,27241379 DNA excision repair protein ERCC-8 F2RL3 NULL 4,27241379 proteinase-activated receptor 4 precursor FAM195A ENSG00000172366 4,27241379 uncharacterized protein LOC379127 FBN1 ENSG00000166147 4,27241379 fibrillin-1 precursor FBXO4 ENSG00000151876 4,27241379 F-box protein 4 FPGT ENSG00000254685 4,27241379 fucose-1-phosphate guanylyltransferase FRA10AC1 ENSG00000148690 4,27241379 FRA10AC1 protein FRMD3 ENSG00000172159 4,27241379 FERM domain-containing protein 3 GNA11 NULL 4,27241379 guanine nucleotide binding protein (G protein), alpha 11 (Gq class) GPR176 ENSG00000166073 4,27241379 probable G-protein coupled receptor 176 GVINP1 ENSG00000254838 4,27241379 HAUS4 ENSG00000092036 4,27241379 HAUS augmin-like complex subunit 4 HELB ENSG00000127311 4,27241379 DNA helicase B HHEX NULL 4,27241379 hematopoietically-expressed homeobox protein hhex HIF1A-AS2 NULL 4,27241379 HRSP12 ENSG00000132541 4,27241379 heat-responsive protein 12-like isoform 1 HSF2 ENSG00000025156 4,27241379 heat shock factor protein 2 isoform c JRKL ENSG00000183340 4,27241379 jerky protein homolog-like KCTD2 ENSG00000180901 4,27241379 BTB/POZ domain-containing protein KCTD2 KIAA1919 NULL 4,27241379 sodium-dependent glucose transporter 1 KLHL11 ENSG00000178502 4,27241379 kelch-like protein 11
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LOC284454 ENSG00000267519 4,27241379 LOC644961 NULL 4,27241379 LZTFL1 ENSG00000163818 4,27241379 leucine zipper transcription factor-like protein 1 MEIS2 ENSG00000134138 4,27241379 Meis homeobox 2 MVB12A ENSG00000141971 4,27241379 multivesicular body subunit 12A NEGR1 ENSG00000172260 4,27241379 neuronal growth regulator 1 precursor NEURL1B ENSG00000214357 4,27241379 uncharacterized protein LOC553620 NNT-AS1 NULL 4,27241379 NUDT9 ENSG00000170502 4,27241379 nudix hydrolase 9 PDCD2L ENSG00000126249 4,27241379 programmed cell death protein 2-like PGM2L1 ENSG00000165434 4,27241379 glucose 1,6-bisphosphate synthase PIWIL4 ENSG00000134627 4,27241379 piwi-like protein 4 PLAG1 ENSG00000181690 4,27241379 pleiomorphic adenoma gene 1 POLR2G ENSG00000168002 4,27241379 polymerase (RNA) II (DNA directed) polypeptide G PRKACB ENSG00000142875 4,27241379 protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, beta PRKAR2B ENSG00000005249 4,27241379 protein kinase, cAMP-dependent, regulatory, type II, beta PTPRG NULL 4,27241379 receptor-type tyrosine-protein phosphatase gamma precursor RAB28 ENSG00000157869 4,27241379 responsive to abscisic acid 28 RP9P ENSG00000205763 4,27241379 RPA3 NULL 4,27241379 replication protein A 14 kDa subunit RTN4RL2 NULL 4,27241379 reticulon-4 receptor-like 2 precursor SDR39U1 ENSG00000100445 4,27241379 short chain dehydrogenase/reductase family 39U, member 1 SHC3 NULL 4,27241379 SHC (Src homology 2 domain containing) transforming protein 3 SLC15A2 ENSG00000163406 4,27241379 solute carrier family 15 member 2 SLC16A10 ENSG00000112394 4,27241379 monocarboxylate transporter 10 SLC37A2 NULL 4,27241379 sugar phosphate exchanger 2 SLC41A3 ENSG00000114544 4,27241379 solute carrier family 41, member 3 SMC1B ENSG00000077935 4,27241379 meiosis-specific cohesin subunit SMC1 beta SNX15 ENSG00000110025 4,27241379 sorting nexin-15 STRADB ENSG00000082146 4,27241379 STE20-related kinase adaptor beta STX2 ENSG00000111450 4,27241379 syntaxin 2 TATA box-binding protein-associated factor RNA polymerase I subunit TAF1A ENSG00000143498 4,27241379 A TASP1 ENSG00000089123 4,27241379 threonine aspartase 1 TBCK ENSG00000145348 4,27241379 TBC domain-containing protein kinase-like protein TDRKH ENSG00000182134 4,27241379 tudor and KH domain-containing protein TMED8 NULL 4,27241379 protein TMED8 TMTC2 ENSG00000179104 4,27241379 transmembrane and TPR repeat-containing protein 2 precursor TNIP3 ENSG00000050730 4,27241379 TNFAIP3-interacting protein 3 isoform 1 TRUB2 ENSG00000167112 4,27241379 probable tRNA pseudouridine synthase 2 UBE2B ENSG00000119048 4,27241379 ubiquitin-conjugating enzyme E2 B UBL7-AS1 ENSG00000247240 4,27241379 UROS ENSG00000188690 4,27241379 uroporphyrinogen-III synthase USP53 ENSG00000145390 4,27241379 inactive ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 53 VIPAS39 ENSG00000151445 4,27241379 spermatogenesis-defective protein 39 homolog ZFAND4 ENSG00000172671 4,27241379 AN1-type zinc finger and ubiquitin domain-containing protein-like ZFPL1 ENSG00000162300 4,27241379 zinc finger protein-like 1 ZNF180 NULL 4,27241379 zinc finger protein 180 ZNF225 ENSG00000256294 4,27241379 zinc finger protein 225 ZNF302 ENSG00000089335 4,27241379 zinc finger protein 302 ZNF436 ENSG00000125945 4,27241379 zinc finger protein 436 ZNF708 ENSG00000182141 4,27241379 zinc finger protein 708 ZNF764 ENSG00000169951 4,27241379 zinc finger protein 764 isoform 2
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HOOK3 ENSG00000168172 4,11711712 protein Hook homolog 3 SSH1 ENSG00000084112 4,11711712 protein phosphatase Slingshot homolog 1 isoform 2 CYBRD1 ENSG00000071967 4,09769247 cytochrome b reductase 1 PHF6 ENSG00000156531 4,07246734 PHD finger protein 6 FASTKD1 ENSG00000138399 4,03795285 FAST kinase domain-containing protein 1 SPAST ENSG00000021574 4,03795285 spastin BMPR2 ENSG00000204217 3,9910283 bone morphogenetic protein receptor, type 2 (serine/threonine kinase) MAP7D3 ENSG00000129680 3,9910283 MAP7 domain-containing protein 3 isoform 2 RAD50 ENSG00000113522 3,9910283 DNA repair protein RAD50 SOCS4 ENSG00000180008 3,9910283 suppressor of cytokine signaling 4 GPR89A ENSG00000117262 3,92018982 PHC3 ENSG00000173889 3,92018982 polyhomeotic-like protein 3 STX5 ENSG00000162236 3,92018982 Syntaxin-5 TMEM97 ENSG00000109084 3,92018982 transmembrane protein 97 VRK2 ENSG00000028116 3,92018982 serine/threonine-protein kinase VRK2 MOB1A NULL 3,91976995 MOB kinase activator 1A HELLS ENSG00000119969 3,91956006 helicase, lymphoid-specific PLIN2 ENSG00000147872 3,91956006 perilipin-2 GNB4 NULL 3,89590522 guanine nucleotide binding protein (G protein), beta polypeptide 4 FOXJ3 ENSG00000198815 3,86886862 forkhead box J3 ANXA4 ENSG00000196975 3,80046003 annexin A4 ATG12 ENSG00000145782 3,80046003 autophagy related 12 BRIP1 NULL 3,80046003 BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1 CABLES1 ENSG00000134508 3,80046003 CDK5 and ABL1 enzyme substrate 1 CYB5R4 NULL 3,80046003 cytochrome b5 reductase 4 EMC10 ENSG00000161671 3,80046003 ER membrane protein complex subunit 10 isoform 1 precursor GOLPH3L ENSG00000143457 3,80046003 Golgi phosphoprotein 3-like LRRC37BP1 NULL 3,80046003 NBAS ENSG00000151779 3,80046003 neuroblastoma-amplified sequence NCOA7 ENSG00000111912 3,80046003 nuclear receptor coactivator 7 NFATC2 ENSG00000101096 3,80046003 nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2 isoform D PDSS2 ENSG00000164494 3,80046003 decaprenyl-diphosphate synthase subunit 2 RAB5A ENSG00000144566 3,80046003 ras-related protein rab-5a SLC10A7 ENSG00000120519 3,80046003 sodium/bile acid cotransporter 7 SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of SMARCAL1 ENSG00000138375 3,80046003 chromatin subfamily A-like protein 1 SNX13 ENSG00000071189 3,80046003 sorting nexin-13 TMED5 ENSG00000117500 3,80046003 transmembrane emp24 domain-containing protein 5 precursor WIPF2 ENSG00000171475 3,80046003 WAS/WASL interacting protein family, member 2 ZCCHC10 ENSG00000155329 3,80046003 zinc finger CCHC domain-containing protein 10 ZNF845 ENSG00000213799 3,80046003 zinc finger protein 845 SP100 ENSG00000067066 3,75737139 serine protease 100 precursor SOCS7 NULL 3,70600414 suppressor of cytokine signaling FAM20B ENSG00000116199 3,6652699 glycosaminoglycan xylosylkinase GOLIM4 ENSG00000173905 3,6652699 Golgi integral membrane protein 4 MDM2 ENSG00000135679 3,64213149 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 TBC1D23 ENSG00000036054 3,64213149 TBC1 domain family member 23 LPIN1 ENSG00000134324 3,62782309 phosphatidate phosphatase LPIN1 NIPBL ENSG00000164190 3,61088107 nipped-B-like protein isoform B ABHD5 NULL 3,56427955 abhydrolase domain containing 5 AC159540.1 NULL 3,56427955 ATR ENSG00000175054 3,56427955 serine/threonine-protein kinase ATR BRD8 ENSG00000112983 3,56427955 bromodomain containing 8
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C12orf29 ENSG00000133641 3,56427955 uncharacterized protein C12orf29 homolog CEP120 ENSG00000168944 3,56427955 centrosomal protein 120kDa 2-methoxy-6-polyprenyl-1,4-benzoquinol methylase, mitochondrial COQ5 ENSG00000110871 3,56427955 precursor CPS1 ENSG00000021826 3,56427955 carbamoyl-phosphate synthase [ammonia], mitochondrial CR1 ENSG00000203710 3,56427955 complement receptor type 1 precursor CSRP2BP ENSG00000149474 3,56427955 cysteine-rich protein 2-binding protein DVL2 ENSG00000004975 3,56427955 segment polarity protein dishevelled homolog DVL-2 FAM118B ENSG00000197798 3,56427955 family with sequence similarity 118, member B FBXO33 NULL 3,56427955 F-box protein 33 FGD2 ENSG00000146192 3,56427955 FYVE, RhoGEF and PH domain-containing protein 2 FZD5 ENSG00000163251 3,56427955 frizzled-5 precursor GCSH ENSG00000140905 3,56427955 mitochondrial glycine cleavage system h protein GPR137 ENSG00000173264 3,56427955 integral membrane protein GPR137 isoform 1 KIAA0355 ENSG00000166398 3,56427955 KIAA0355 low-density lipoprotein receptor class A domain-containing protein 4 LDLRAD4 ENSG00000168675 3,56427955 isoform gamma 1 MAML3 ENSG00000196782 3,56427955 mastermind-like protein 3 MOAP1 ENSG00000165943 3,56427955 modulator of apoptosis 1 OARD1 ENSG00000124596 3,56427955 O-acyl-ADP-ribose deacylase 1 ORAI3 ENSG00000175938 3,56427955 protein orai-3 OSER1 ENSG00000132823 3,56427955 oxidative stress responsive 1 RNF219-AS1 ENSG00000234377 3,56427955 RPL23AP53 NULL 3,56427955 SNAPC2 ENSG00000104976 3,56427955 SPATA5 ENSG00000145375 3,56427955 spermatogenesis-associated protein 5 TLDC1 NULL 3,56427955 TLD domain-containing protein 1 TRIAP1 ENSG00000170855 3,56427955 TP53-regulated inhibitor of apoptosis 1 TRUB1 ENSG00000165832 3,56427955 probable tRNA pseudouridine synthase 1 ZNF140 NULL 3,56427955 zinc finger protein 140 probable dolichyl pyrophosphate Glc1Man9GlcNAc2 alpha-1,3- ALG8 ENSG00000159063 3,56384814 glucosyltransferase BARD1 ENSG00000138376 3,56384814 BRCA1-associated RING domain protein 1 ECT2 ENSG00000114346 3,56384814 CIPK1 interacting protein ECT2 LPCAT3 ENSG00000111684 3,56384814 lysophospholipid acyltransferase 5 MAPK9 ENSG00000050748 3,56384814 mitogen-activated protein kinase 9 MARCH5 ENSG00000198060 3,56384814 E3 ubiquitin-protein ligase MARCH5 NADH dehydrogenase [ubiquinone] complex I, assembly factor 7 NDUFAF7 ENSG00000003509 3,56384814 precursor PPHLN1 ENSG00000134283 3,56384814 periphilin-1 RITA1 NULL 3,56384814 RBPJ-interacting and tubulin-associated protein isoform 1 UBA5 ENSG00000081307 3,56384814 ubiquitin-like modifier-activating enzyme 5 LRRC40 ENSG00000066557 3,56307958 leucine-rich repeat-containing protein 40 RP2 ENSG00000102218 3,56303142 pyruvate, phosphate dikinase regulatory protein 2 CHD1 ENSG00000153922 3,56296722 chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1 ERC1 ENSG00000082805 3,56296722 ELKS/RAB6-interacting/CAST family member 1 MSL3 ENSG00000005302 3,56296722 male-specific lethal 3 homolog SLC26A2 ENSG00000155850 3,56296722 sulfate transporter TMEM57 ENSG00000204178 3,56296722 transmembrane protein 57 FAM126A ENSG00000122591 3,48380295 hyccin CIZ1 ENSG00000148337 3,46167119 cip1-interacting zinc finger protein isoform 1 DPY19L1 ENSG00000173852 3,46167119 probable C-mannosyltransferase DPY19L1 HSPA13 ENSG00000155304 3,46124461 heat shock 70 kDa protein 13 precursor STRN ENSG00000115808 3,44457225 striatin, calmodulin binding protein UHMK1 ENSG00000152332 3,42953418 serine/threonine-protein kinase Kist
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C2CD5 ENSG00000111731 3,42080745 C2 domain-containing protein 5 ASPH ENSG00000198363 3,42063492 aspartate beta-hydroxylase FAM133B ENSG00000234545 3,42063492 protein FAM133 2-oxoglutarate and iron-dependent oxygenase domain-containing OGFOD1 NULL 3,42063492 protein 1 PAPOLG ENSG00000115421 3,42063492 poly(A) polymerase gamma RBM15 ENSG00000162775 3,42063492 RNA binding motif protein 15 RBM28 ENSG00000106344 3,42063492 RNA-binding protein 28 TRMT1L ENSG00000121486 3,42063492 tRNA methyltransferase 1 homolog (S. cerevisiae)-like UPF3A ENSG00000169062 3,42063492 regulator of nonsense transcripts 3A SF3B4 ENSG00000143368 3,32580877 splicing factor 3B subunit 4 AKAP17A ENSG00000197976 3,32547441 splicing factor, arginine/serine-rich 17A ALG2 NULL 3,32547441 alpha-1,3-mannosyltransferase ALG2 APPBP2 ENSG00000062725 3,32547441 amyloid protein-binding protein 2 B4GALT4 ENSG00000121578 3,32547441 beta-1,4-galactosyltransferase 4 CARS ENSG00000110619 3,32547441 cysteinyl-tRNA synthetase, cytoplasmic CYP20A1 ENSG00000119004 3,32547441 cytochrome P450, family 20, subfamily A, polypeptide 1 DYNLL2 NULL 3,32547441 dynein, light chain, LC8-type 2 EEA1 ENSG00000102189 3,32547441 early endosome antigen 1 FAM63B ENSG00000128923 3,32547441 protein FAM63B isoform a GOLGA1 ENSG00000136935 3,32547441 Golgin subfamily A member 1 HACE1 ENSG00000085382 3,32547441 E3 ubiquitin-protein ligase HACE1 NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 3, mitochondrial NDUFV3 ENSG00000160194 3,32547441 isoform b precursor PPP1R2 ENSG00000184203 3,32547441 protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 2 PTGES3L- AARSD1 ENSG00000108825 3,32547441 PTGES3L-AARSD1 protein isoform 2 RABGAP1 ENSG00000011454 3,32547441 RAB GTPase activating protein 1 SASH1 ENSG00000111961 3,32547441 SAM and SH3 domain-containing protein 1 SEPT10 ENSG00000186522 3,32547441 septin-10 SNRNP48 ENSG00000168566 3,32547441 U11/U12 small nuclear ribonucleoprotein 48 kDa protein SSX2IP ENSG00000117155 3,32547441 afadin- and alpha-actinin-binding protein STAMBP ENSG00000124356 3,32547441 STAM binding protein SYTL3 ENSG00000164674 3,32547441 synaptotagmin-like protein 3 isoform 2 TNKS ENSG00000173273 3,32547441 tankyrase-1 TRIM38 ENSG00000112343 3,32547441 tripartite motif-containing protein 38 TXNDC15 ENSG00000113621 3,32547441 thioredoxin domain-containing protein 15 precursor VPS45 ENSG00000136631 3,32547441 vacuolar protein sorting 45 ZNF746 ENSG00000181220 3,32547441 zinc finger protein 746 isoform 2 ZRANB1 ENSG00000019995 3,32547441 ubiquitin thioesterase zranb1 ITPK1 ENSG00000100605 3,29588096 inositol-tetrakisphosphate 1-kinase RLF ENSG00000117000 3,27829538 reduced lateral root formation protein ACTR10 NULL 3,25807247 actin-related protein 10 homolog ASAP1 ENSG00000153317 3,25807247 ArfGAP with SH3 domain, ankyrin repeat and PH domain 1 CLIP1 ENSG00000130779 3,25807247 CAP-GLY domain containing linker protein 1 MIB1 ENSG00000101752 3,25807247 E3 ubiquitin-protein ligase mib1 TSHZ3 ENSG00000121297 3,25807247 teashirt zinc finger homeobox 3 ZNF480 ENSG00000198464 3,25807247 zinc finger protein 480 PDCD6IP ENSG00000170248 3,23054805 programmed cell death 6 interacting protein ARL17A ENSG00000185829 3,20750647 ADP-ribosylation factor-like 17-like isoform a ATXN2 ENSG00000204842 3,20750647 ataxin-2 ATXN3 ENSG00000066427 3,20750647 ataxin-3 BRAP ENSG00000089234 3,20750647 BRCA1-associated protein CCR1 ENSG00000163823 3,20750647 serine/threonine-protein kinase-like protein CCR1
155
CDK9 ENSG00000136807 3,20750647 cell division protein kinase 9 CRIPT ENSG00000119878 3,20750647 cysteine-rich PDZ-binding protein dual adapter for phosphotyrosine and 3-phosphotyrosine and 3- DAPP1 ENSG00000070190 3,20750647 phosphoinositide DYNLT3 ENSG00000165169 3,20750647 dynein light chain Tctex-type 3 FGD3 ENSG00000127084 3,20750647 FYVE, RhoGEF and PH domain-containing protein 3 HSD17B12 ENSG00000149084 3,20750647 estradiol 17-beta-dehydrogenase 12 LEMD3 ENSG00000174106 3,20750647 inner nuclear membrane protein Man1 LRRCC1 ENSG00000133739 3,20750647 leucine-rich repeat and coiled-coil domain-containing protein 1 MUL1 ENSG00000090432 3,20750647 mitochondrial ubiquitin ligase activator of nfkb 1 NAF1 ENSG00000145414 3,20750647 nuclear assembly factor 1 phosphatidylinositol 4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing PIK3C2B ENSG00000133056 3,20750647 subunit beta PMAIP1 ENSG00000141682 3,20750647 phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1 RHBDF2 ENSG00000129667 3,20750647 inactive rhomboid protein 2 RNF168 ENSG00000163961 3,20750647 E3 ubiquitin-protein ligase RNF168 SGOL1 ENSG00000129810 3,20750647 shugoshin-like 1 TTLL5 ENSG00000119685 3,20750647 tubulin tyrosine ligase-like family, member 5 YOD1 ENSG00000180667 3,20750647 ubiquitin thioesterase OTU1 ZC3H6 ENSG00000188177 3,20750647 zinc finger CCCH domain-containing protein 6 GNPTAB ENSG00000111670 3,20681475 N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunits alpha/beta RBAK ENSG00000146587 3,20681475 RB-associated KRAB zinc finger protein XPO1 ENSG00000082898 3,18812286 exportin 1 (CRM1 homolog) CERS6 ENSG00000172292 3,17942933 ceramide synthase 6 isoform 2 FMNL3 ENSG00000161791 3,16695419 formin-like protein 3 isoform 1 GABPB1 ENSG00000104064 3,16695419 GA-binding protein subunit beta-1 GIGYF1 ENSG00000146830 3,16045308 GRB10 interacting GYF protein 1 LRIF1 ENSG00000121931 3,1357833 ligand-dependent nuclear receptor-interacting factor 1 isoform 1 ATF2 ENSG00000115966 3,13572579 activating transcription factor 2 CXorf56 ENSG00000018610 3,13561077 UPF0428 protein CXorf56 homolog EGF domain-specific O-linked N-acetylglucosamine transferase EOGT ENSG00000163378 3,13561077 precursor FCF1 ENSG00000119616 3,13561077 rRNA-processing protein FCF1 homolog PDLIM5 ENSG00000163110 3,13561077 PDZ and LIM domain 5 PPM1A ENSG00000100614 3,13561077 protein phosphatase 1A, magnesium dependent, alpha SLC35A3 ENSG00000117620 3,13561077 UDP-N-acetylglucosamine transporter TWSG1 ENSG00000128791 3,13561077 twisted gastrulation BMP signaling modulator 1 precursor TYW3 ENSG00000162623 3,13561077 tRNA wybutosine-synthesizing protein 3 homolog UGDH ENSG00000109814 3,13561077 UDP-glucose 6-dehydrogenase CCAR1 ENSG00000060339 3,08828181 cell division cycle and apoptosis regulator protein 1 NUFIP2 ENSG00000108256 3,08805981 nuclear fragile X mental retardation protein interacting protein 2 C16orf72 NULL 3,0879816 UPF0472 protein C16orf72 homolog DSTN ENSG00000125868 3,0879816 destrin (actin depolymerizing factor) FAM210A ENSG00000177150 3,0879816 uncharacterized protein C18orf19 homolog B FAR1 ENSG00000197601 3,0879816 fatty acyl-CoA reductase 1 GUF1 ENSG00000151806 3,0879816 translation factor GUF1, mitochondrial JDP2 ENSG00000140044 3,0879816 jun dimerization protein 2 KCTD7 ENSG00000243335 3,0879816 BTB/POZ domain-containing protein KCTD7 PAN3 ENSG00000152520 3,0879816 PAB-dependent poly(A)-specific ribonuclease subunit 3 RDH11 ENSG00000072042 3,0879816 retinol dehydrogenase 11 precursor SRPRB ENSG00000144867 3,0879816 signal recognition particle receptor subunit beta PAPD4 ENSG00000164329 3,06980756 poly(A) RNA polymerase GLD2 PTP4A1 ENSG00000112245 3,06444099 protein tyrosine phosphatase type IVA 1 DCLRE1C ENSG00000152457 3,05447375 protein artemis
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GNAQ NULL 3,05447375 guanine nucleotide-binding protein G(q) alpha subunit OSBPL11 ENSG00000144909 3,05447375 oxysterol binding protein-like 11 CASP8AP2 NULL 3,02868234 CASP8 associated protein 2 CD2AP ENSG00000198087 3,02868234 CD2-associated protein MEX3C ENSG00000176624 3,02868234 mex-3 RNA binding family member C PI4K2B ENSG00000038210 3,02868234 phosphatidylinositol 4-kinase type 2-beta PRDM4 ENSG00000110851 3,02868234 PR domain zinc finger protein 4 VPRBP NULL 3,02868234 protein VPRBP isoform 2 ZNF460 ENSG00000197714 3,02868234 zinc finger protein 460 NCAPD3 ENSG00000151503 3,01806373 condensin-2 complex subunit D3 CLN8 ENSG00000182372 3,00862565 protein CLN8 FAN1 ENSG00000198690 3,00862565 fanconi-associated nuclease 1 IDE ENSG00000119912 3,00862565 insulin-degrading enzyme TMEM39A ENSG00000176142 3,00862565 transmembrane protein 39A
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Participação como autor em artigo científico publicado produto da tese:
Título: Role of DNA repair in host immune response and inflammation
Autores: Fabrícia Lima Fontes , Daniele Maria Lopes Pinheiro, Ana Helena Sales de Oliveira, Rayssa Karla de Medeiros Oliveira, Tirzah Braz Petta Lajus, Lucymara Fassarella Agnez-Lima.
Revista: Mutation Research/Reviews in Mutation Research
Data: Novembro de 2014
Fator de Impacto: 6,21
Qualis CAPES: A1 MEDICINA II
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Participação como autor em artigo científico submetido produto da tese:
Título: Inhibition of APE1/REF-1 redox function by E3330 regulates the cellular growth and ribosome biogenesis in inflammation model
Autores: Fabrícia Lima Fontesa , Daniele Maria Lopes Pinheiro, Thais Teixeira Oliveira, Rayssa K. M. Oliveira, Leonam Gomes Coutinho, Ana Helena Sales, Vanderclécio Lira, Sandro José de Souza, Lucymara Fassarella Agnez-Lima
Revista : Cellular and Molecular Life Sciences
Fator de Impacto : 5,85
Qualis CAPES: A1 MEDICINA II
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Inhibition of APE1/REF-1 redox function by E3330 regulates the cellular growth and ribosome biogenesis in inflammation model
Fabrícia Lima Fontes a, Daniele Maria Lopes Pinheiro a, Thais Teixeira Oliveira a , Rayssa
K. M. Oliveira a, Leonam Gomes Coutinho a, Ana Helena Sales a, , Vanderclécio Lira b,
Sandro José de Souza b, Lucymara Fassarella Agnez-Lima a* a- Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Natal, Brazil; b- Instituto do Cérebro, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,
Brasil;
*Correspondence to: Lucymara Fassarella Agnez-Lima Departamento de Biologia Celular e Genética Centro de Biociências – UFRN Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal - RN, Brasil. 59078-970 Tel.: 55 84 3211.9209 e-mail:[email protected]
Abstract
APE1/REF-1 protects cells from oxidative stress acting as a multifunctional protein possessing both DNA repair and transcriptional regulatory activities. Several studies have identified their role in cell growth, apoptosis, DNA damage, intracellular redox state, mitochondrial function, and cytoskeletal structure. However, there remains a gap in the literature that APE1/REF-1 function regulates each activity. To identify genes preferentially regulated by redox function of APE1/REF-1, we performed an extensive genome-wide survey using the high throughput RNA-Seq analysis of U937 cells LPS- stimulated and subsequently treated with E3330, an inhibitor for redox function.
Comparative transcriptome analysis revealed 1250 gene expression changes, 620
161 downregulated and 630 upregulated genes with absolute fold change ≥-3 or ≤3.
Downregulated target genes were found to be primarily involved in the regulation of ribosome biogenesis, gene expression, mitochondrial ATP synthesis and immune response. The transcriptome upregulation showed an involvement with the cellular response to stress and DNA repair and regulation of cell cycle genes. Additionally it was observed that the redox inhibition reduces the expression of several inflammatory modulators during time kinetics and cell viability decrease after 48 hours of treatment.
Our data show that specific inhibition of APE1/REF-1 redox activity by E3330 decreased transcription of RelA(p65), c-Myc, ribossomal genes leading deficiency of ribosomal biogenesis and consequent growth arrest.
Keywords: APE1/REF-1, redox function, RelA(p65), c-Myc and ribosomal biogenesis.
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Participação como autor em artigo científico publicado. Outras produções não relacionadas à Tese
Título: Revisão dos achados sobre Cepas Staphylococcus aureus resistentes no Brasil entre 2010 2013
Autores: Juliana Fernandes de Carvalho, Fabrícia Lima Fontes
Revista: Arquivos de Ciências da Saúde
Data: Junho de 2014
Fator de Impacto: Não possui
Qualis CAPES: B5 MEDICINA II
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Título: The kynurenine pathway is involved in bacterial meningitis
Autores: Leonam G Coutinho, Stephan Christen, Caroline L Bellac, Fabrícia Lima Fontes , Fladjule Rejane Soares de Souza, Denis Grandgirard, Stephen L Leib and Lucymara F Agnez-Lima
Revista: Journal of Neuroinflammation
Data: Outubro de 2014
Fator de Impacto: 5,41
Qualis CAPES : A1 MEDICINA II
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Título: Genetic polymorphisms associated with the inflammatory response in bacterial meningitis
Autores: Fabrícia Lima Fontes , Luíza Ferreira de Araújo, Leonam Gomes Coutinho, Stephen L. Leib and Lucymara Fassarella Agnez-Lima
Revista: BMC Medical Genetics
Data: Agosto 2015
Fator de Impacto: 2,08
Qualis CAPES: B1 MEDICINA II
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Título: Association of the XPD and XRCC3 gene Polymorphisms with Oral Squamous Cell Carcinoma in a Northeastern Brazilian Population: A Pilot Study
Autores: Joabe dos Santos Pereira , Fabrícia Lima Fontes , Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros, Roseana de Almeida Freitas, Lélia Batista de Souza, Márcia Cristina da Costa Miguel
Revista: Archives of oral biology
Data: Dezembro 2015
Fator de Impacto: 1,74
Qualis CAPES: B1 MEDICINA II
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Título: Polymorphisms in DNA repair gene XRCC1 (Arg194Trp) and (Arg399Gln) and their role in the susceptibility of bacterial meningitis
Autores: Daniele Maria Lopes Pinheiro, Fabrícia Lima Fontes , Ana Helena Sales de Oliveira, Leonam Gomes Coutinho, Thayse Azevedo da Silva, Stephen L. Leib and Agnez-Lima LF
Revista: Journal of Meningitis
Data: Dezembro de 2015
Fator de Impacto: Edição inaugural
Qualis CAPES: Ainda não qualificado
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