Evaluación de la dinámica poblacional y de la variabilidad genética del mejillón cultivado, Mytilus galloprovincialis.

TESIS DOCTORAL

Borja Díaz Puente 2018

Escuela Internacional de Doctorado

Borja Díaz Puente

TESIS DOCTORAL

Evaluación de la dinámica poblacional y de la variabilidad genética del mejillón cultivado, Mytilus galloprovincialis

Dirigida por los Doctores:

Pablo Presa Martínez

Alfonso Pita Bugallo

2018

Escuela Internacional de Doctorado

El Dr. Pablo Presa Martínez, Profesor Titular del Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología de la Universidad de Vigo y el Dr. Alfonso Pita Bugallo, Investigador Posdoctoral (Xunta de Galicia) del Departamento de Ecología y Biología Animal.

HACEN CONSTAR que el presente trabajo, titulado “Evaluación de la dinámica poblacional y de la variabilidad genética del mejillón cultivado, Mytilus galloprovincialis”, que presenta Borja Díaz Puente para la obtención del título de Doctor, fue elaborado bajo su dirección en el programa de doctorado “Metodología y Aplicaciones en Ciencias de la Vida”.

Vigo, 3 de octubre de 2018.

Los directores de la tesis doctoral,

Dr. Pablo Presa Martínez Dr. Alfonso Pita Bugallo

A Espe, Juanjo, Junior y Eneko

Agradecimientos

En primer lugar quiero agradecer a mis directores de tesis, Pablo y Alfonso, por la oportunidad que me han brindado para realizar esta tesis doctoral en el grupo de investigación de Recursos Genéticos Marinos, así como el esfuerzo, dedicación y enseñanzas que me han aportado durante toda la tesis, que ha sido larga, pero fructífera.

En segundo lugar me gustaría agradecer a todos mis compañeros de laboratorio (Matusse, Manuel, María Isabel, José, Angie, Adil y María) los buenos momentos compartidos, así como a Marta Miñambres, Dr. Yassine Ouagajjou, Dr. Ricardo Guiñez, Dr. Gabriel Rosón y a Juan Carlos Uribe sus contribuciones técnicas, analíticas y científicas.

Agradecer también a la Universidad de Vigo por toda la financiación que me ha concedido a través de diversas becas y contratos a lo largo de mi etapa predoctoral.

Finalmente, quería agradecer a mis padres, Espe y Juanjo, porque siempre han estado ahí, apoyando y animando en todo momento. A Junior, Natalia, Gonza, Adri y al enano por todos esos grandes momentos que hemos vivido y los que nos quedan por vivir. Y a Aidé, por sus contribuciones esenciales, por su sonrisa y por su forma de ser.

ÍNDICE

Capítulo I. Introducción general ...... 21 I.1. Distribución y biología de la especie ...... 23 I.2. El cultivo de Mytilus galloprovincialis ...... 25 I.3. Aplicaciones de marcadores moleculares para la mejora en acuicultura y conservación de poblaciones naturales ...... 27 I.4. Objetivos generales ...... 29 I.5. Bibliografía general ...... 30 Capítulo II. Estima de mezcla de stocks cultivados de Mytilus galloprovincialis con marcadores microsatélites ...... 35 II.1. Introducción ...... 37 II.1.1. La mitilicultura en España ...... 37 II.1.2. El abastecimiento de semilla en zonas con bajo reclutamiento ...... 38 II.1.3. Control de riesgo en semilla importada para el cultivo de moluscos ...... 39 II.1.4. Objetivos ...... 41 II.2. Material y métodos ...... 42 II.2.1. Cruzamientos ...... 42 II.2.2. Cultivos larvarios ...... 42 II.2.3. Extracción de ADN, amplificación y genotipado de microsatélites ...... 43 II.2.4. Análisis de segregación en progenies ...... 45 II.3. Resultados ...... 47 II.3.1. Diversidad alélica en la generación parental ...... 47 II.3.2. Ajuste a la segregación genotípica esperada ...... 48 II.3.3. Potencia de asignación de los marcadores ...... 51 II.4. Discusión ...... 52 II.4.1. Diversidad alélica en la generación parental ...... 52 II.4.2. Ajuste genotípico a la segregación mendeliana ...... 52 II.4.3. Potencia de asignación de los marcadores ...... 54 II.5. Caso Práctico: Composición genética de Mytilus galloprovincialis en el Mar de Alborán: efectos del cómputo de alelos nulos ...... 55 II.5.1. Introducción...... 55 II.5.2. Material y métodos ...... 55 II.5.2.1. Muestreo y extracción de ADN ...... 55 II.5.2.2. Genotipado con microsatélites ...... 56 II.5.2.3. Análisis de los datos ...... 56 II.5.3. Resultados y discusión ...... 58 II.5.3.1. Diversidad genética de los marcadores ...... 58 II.5.3.2. Estimación de alelos nulos ...... 58 II.5.3.3. Diferenciación entre stocks ...... 60 II.5.3.4. Índice de fijación entre poblaciones ...... 60 II.5.3.5. Análisis de Coordenadas Principales ...... 61 II.5.3.6. Cálculo bayesiano del número de grupos génicos ...... 62 II.5.3.7. Detección de migrantes de primera generación con alelos visibles ...... 63 II.5.3.8. Detección de migrantes de primera generación con frecuencias génicas y genotípicas corregidas para nulos ...... 63 II.5.3.9. Detección de migrantes e híbridos ...... 63 II.5.4. Conclusiones ...... 65 II.6. Bibliografía ...... 66 Capítulo III. Asignación de origen de la semilla desde el criadero hasta la cosecha del mejillón Mytilus galloprovincialis ...... 71 III.1. Introducción ...... 73 III.2. Material y métodos ...... 76 III.2.1. Diseño experimental y cultivo de la progenie ...... 76 III.2.2. Genotipado con marcadores microsatélites ...... 79

III.2.3. Análisis estadísticos ...... 80 III.3. Resultados y discusión ...... 82 III.3.1. Polimorfismo de los marcadores microsatélites (STR) ...... 82 III.3.2. Patrones de segregación por locus y tratamiento ...... 82 III.3.3. Cambios en la heterocigosidad ...... 85 III.3.3.1. Diferencias de heterocigosidad dentro de tratamientos ...... 85 III.3.3.2. Diferencias de heterocigosidad entre tratamientos ...... 85 III.3.3.3. Diferencias de heterocigosidad entre muestreos de la progenie control (HCP) ...... 85 III.3.4. Asignación genética de los adultos cosechados ...... 88 III.3.4.1. EHCP (Progenie control experimental) ...... 88 III.3.4.2. ECRV (grupo control de la población natural de la Ría de Vigo) y ERCG (grupo control del reclutamiento) ...... 94 III.3.4.3. Zonas superior (UUSS) e inferior (UBSS) previamente muestreadas ...... 94 III.3.4.4. Distribuciones de máxima verosimilitud de asignación genotípica multilocus ...... 95 III.3.4.5. Estimación del reclutamiento entre abril y noviembre de 2008 ...... 96 III.4. Conclusiones...... 99 III.5. Bibliografía ...... 101 Capítulo IV. Mitílidos de la Región de Magallanes: identificación molecular y estructura genética poblacional de Mytilus chilensis ...... 107 IV.1. Introducción ...... 109 IV.1.1. Los mejillones de interés comercial en Chile ...... 109 IV.1.2. Importancia comercial del género Mytilus en Chile ...... 112 IV.1.3. Taxonomía molecular del mejillón chileno ...... 113 IV.1.4. La especificidad ecológica de la Región de Magallanes ...... 114 IV.1.5. Objetivos ...... 115 IV.2. Material y métodos ...... 117 IV.2.1. Muestreo y extracción de ADN...... 117 IV.2.2. Análisis genéticos ...... 118 IV.2.2.1. PCR-RFLP (Polimorfismos en longitud de fragmentos de restricción) ...... 119 IV.2.2.2. Genotipado de Mytilus chilensis con microsatélites ...... 121 IV.2.3. Análisis estadísticos ...... 122 IV.3. Resultados ...... 124 IV.3.1. Identidad molecular de los mejillones chilenos ...... 124 IV.3.2. Diversidad genética de Mytilus chilensis ...... 130 IV.3.3. Distancia genética entre muestras y entre regiones ...... 133 IV.3.4. Modelo de aislamiento por distancia ...... 133 IV.3.5. Análisis de coordenadas principales (PCoA) ...... 134 IV.3.6. Estructura poblacional de Mytilus chilensis ...... 135 IV.3.7. Distribución de la varianza molecular ...... 137 IV.4. Discusión ...... 139 IV.4.1. Identidad molecular de los mejillones chilenos ...... 139 IV.4.1.1. Choromytilus spp. de Punta Zenteno (Región de Magallanes) ...... 139 IV.4.1.2. Aulacomya spp. de Isla Larga (Región de Magallanes) ...... 140 IV.4.1.3. Perumytilus purpuratus del Sector Guairabo (Región de Magallanes)...... 141 IV.4.1.4. Presencia de Mytilus galloprovincialis en la costa sur de Chile...... 142 IV.4.2. La zona híbrida Mytilus chilensis x Mytilus edulis en el hemisferio sur ...... 144 IV.4.3. Mytilus trossulus en el Cono Sur ...... 145 IV.4.4. Diversidad y estructura genética poblacional de Mytilus chilensis ...... 147 IV.4.4.1. Macroestructura poblacional de Mytilus chilensis...... 148 IV.4.4.2. Microestructura poblacional de Mytilus chilensis ...... 150 IV.4.5. Implicaciones en la gestión del recurso ...... 152 IV.5. Conclusiones ...... 153 IV.6. Bibliografía ...... 155 Capítulo V. Cálculo de heredabilidad y análisis de regresión conjunta de la evolución del crecimiento en familias de hermanos completos de Mytilus galloprovincialis ...... 171 V.1. Introducción ...... 173

V.2. Material y métodos...... 178 V.2.1. Población base ...... 178 V.2.2. Inducción a la puesta y formación de familias ...... 178 V.2.3. Cultivo larvario y postlarvario ...... 180 V.2.4. Mediciones y toma de datos...... 181 V.2.5. Análisis estadísticos ...... 182 V.3. Resultados ...... 186 V.3.1. Variación fenotípica ...... 186 V.3.2. Composición de la varianza fenotípica Vp ...... 190 V.3.3. Heredabilidad...... 191 V.3.4. Interacción familia-ambiente y correlación genética (rG) entre ambientes ...... 192 V.4. Discusión ...... 195 V.4.1. Variación fenotípica ...... 195 V.4.2. Comparación de las estimas de heredabilidad ...... 197 V.4.3. Comparación de los métodos de análisis ...... 197 V.4.4. Composición de la varianza fenotípica (Vp)...... 199 V.4.5. Evolución de la heredabilidad en el ciclo vital ...... 199 V.4.6. Interacción familia-ambiente y correlación genética (rG) entre ambientes ...... 201 V.4.7. Ganancia genética y estrategias de selección ...... 202 V.5. Conclusiones ...... 203 V.6. Bibliografía ...... 205 Capítulo VI. Conclusiones generales ...... 213

INDICE DE TABLAS

Capítulo II. Estimas de mezcla de stocks cultivados de Mytilus galloprovincialis con marcadores microsatélites Tabla II.1. Características de los marcadores microsatélites empleados en este estudio ...... 45 Tabla II.2. Índices polimórficos en la generación parental y frecuencia estimada de alelos nulos ...... 48 Tabla II.3. Prueba de ji-cuadrado aplicada en la evaluación de la segregación mendeliana de diez loci microsatélites ...... 50 Tabla II.4. Asignación parental obtenida de descendientes (N) a su familia de origen ...... 52 Tabla II.5. Parámetros genéticos básicos de diversidad de microsatélites en los tres stocks de cultivo muestreados ...... 60 Tabla II.6. Frecuencia de alelos nulos para cada marcador microsatélite ...... 61

Tabla II. 7. Comparación por pares de la FST...... 62

Capítulo III. Asignación genética de origen de la semilla desde el criadero hasta la cosecha del mejillón Mytilus galloprovincialis Tabla III.1. Pruebas de contingencia de ji-cuadrado en segregaciones genotípicas de 6 microsatélites para siete tratamientos dentro de muestreo ...... 85 Tabla III.2. Comparación estadística de la heterocigosidad (*p < 0,01) por locus y tratamiento, entre tratamientos dentro de muestreo y entre tratamientos sobre todos los muestreos ...... 88 Tabla III.3. Genotipos observados y probabilidades de asignación de las progenies en los diferentes tratamientos a lo largo de los 4 muestreos ...... 90 Tabla III.4. Cantidad de reclutas externos detectados en las cuerdas experimentales de cultivo por muestreo y tratamiento entre abril y noviembre de 2008 ...... 99

Capítulo IV. Mitílidos de la Región de Magallanes: identificación molecular y estructura genética poblacional de Mytilus chilensis Tabla IV.1. Localización y códigos de identificación de las muestras de mejillón obtenidas en regiones del sur de Chile. Coordenadas geográficas según el sistema de referencia WGS84 ...... 119 Tabla IV.2. Identidad genética de especies de mitílidos en el sur de Chile mediante PCR-RFLP ..... 130 Tabla IV.3. Parámetros genéticos obtenidos sobre la variación alélica de cuatro marcadores microsatélite seleccionados en 10 muestras de Mytilus chilensis ...... 133

Tabla IV.4. Valores de diferenciación (FST) entre poblaciones de Mytilus chilensis ...... 134 Tabla IV.5. Análisis jerárquico de la varianza molecular (AMOVA) por locus sobre 456 individuos de Mytilus chilensis ...... 139 Tabla IV.6. Patrones RFLP obtenidos por Santaclara et al. (2006) mediante la amplificación del primer CHORO en la región 18S-ADNr en los géneros Perna y Choromytilus ...... 141 Tabla IV.7. Patrones RFLP obtenidos por Santaclara et al. (2006) mediante la amplificación del primer MusRFLP sobre la región 18S-ADNr en diferentes géneros como Mytilus, Perna, Choromytilus, etc...... 142 Tabla IV.8. Patrones RFLP obtenidos por Santaclara et al. (2006) mediante la amplificación del primer MusRFLP en la región 18S-ADNr en los géneros Brachidontes, Perumytilus y Semimytilus ...... 143

Capítulo V. Cálculo de heredabilidad y análisis de regresión conjunta de la evolución del crecimiento en familias de hermanos completos de Mytilus galloprovincialis Tabla V.1. Estimas de heredabilidad de rasgos fenotípicos relacionados con el crecimiento en moluscos bivalvos ...... 177 Tabla V.2. Datos y estadísticos descriptivos del experimento en cada muestreo ...... 188 Tabla V.3. Comparación por pares (T2 de Tamhane) de la longitud de concha (mm) de las 9 familias (S1-IL9) entre ambientes (Criadero, C vs. Exterior, E) a lo largo del cultivo (8 a 24 meses) ...... 190 Tabla V.4. Resultados del análisis linear mixto en el crecimiento de la longitud de concha en cada muestreo (Edad) ...... 194

Tabla V.5. Correlaciones genéticas (rG) entre ambientes en los muestreos realizados en los 24 meses de cultivo (Edad), estimados a partir de los métodos Pearson y REML ...... 194

Tabla V.6. Estimas de ganancia GE calculadas sobre la heredabilidad estimada con el modelo 2 2 animal (h AM) y la heredabilidad realizada (h r) en las líneas de selección superior ...... 195

INDICE DE FIGURAS

Capítulo II. Estimas de mezcla de stocks cultivados de Mytilus galloprovincialis con marcadores microsatélites Figura II.1. Situación geográfica del origen de las muestras de tres poblaciones europeas de Mytilus galloprovincialis empleadas en este estudio...... 57 Figura II.2. Análisis de coordenadas principales (PCoA) realizado con el programa GenAlEx sobre la matriz genotípica ...... 63 Figura II.3. Estructura poblacional en grupos obtenida mediante análisis bayesiano implementado en el programa Geneland ...... 63 Figura II.4. Probabilidad posterior de cada individuo muestreado en el Mar de Alborán (expresada en porcentaje) de pertenecer a otras poblaciones ...... 65

Capítulo III. Asignación genética de origen de la semilla desde el criadero hasta la cosecha del mejillón Mytilus galloprovincialis Figura III.1. Localización de la estación marina ECIMAT en la Ría de Vigo ...... 78 Figura III.2. Diagrama simplificado del diseño experimental efectuado para evaluar el reclutamiento de mejilla en cuerdas de cultivo en suspensión previamente sembradas ...... 80 Figura III.3. Distribución de la verosimilitud de las probabilidades de asignación de todos los genotipos multilocus a la progenie control experimental ...... 97

Capítulo IV. Mitílidos de la Región de Magallanes: identificación molecular y estructura genética poblacional de Mytilus chilensis Figura IV.1. Distribución de las especies de mitílidos relacionadas con esta investigación ...... 110 Figura IV.2. Zonas de muestreo de mejillón a lo largo de la costa meridional de Chile ...... 118 Figura IV.3. Patrones de restricción (RFLP) obtenidos mediante electroforesis en geles de agarosa 2%, de tres especies de mitílidos (Choromytilus chorus, Aulacomya atra y Perumytilus purpuratus) de la Región de Magallanes ...... 125 Figura IV.4. Patrones de bandas (RFLP) obtenidos mediante electroforesis en geles de agarosa 3%, tras la digestión con AciI del amplicón Me-15/16 obtenido sobre el gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) ...... 127 Figura IV.5. Patrones de bandas (RFLP) obtenidos mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%, tras la digestión enzimática con AciI del amplicón del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) con los cebadores Me-15/16 ...... 128 Figura IV.6. Patrones de bandas (RFLP) obtenidos mediante digestión con AciI, en electroforesis en agarosa de alta resolución al 3% (Sigma-Aldrich®) del amplicón del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) con los cebadores Me-15/16 ...... 129 Figura IV.7. Test de Mantel empleado para calcular la regresión entre la distancia genética y la distancia geográfica entre pares de muestras de M. chilensis...... 135 Figura IV.8. Análisis de coordenadas principales (PCoA) a partir de datos genotípicos de 10 muestras de M. chilensis y el grupo externo M. edulis ...... 136 Figura IV.9. Asignación genotípica individual a grupos génicos, basada en el método Bayesiano implementado en STRUCTURE...... 137 Figura IV.10. Asignación genética individual a grupos génicos, basada en el método Bayesiano implementado en el software BAPS ...... 137

Capítulo V. Cálculo de heredabilidad y análisis de regresión conjunta de la evolución del crecimiento en familias de hermanos completos de Mytilus galloprovincialis Figura V.1. Gráfico con los valores históricos de producción nacional (en toneladas, eje de ordenadas izquierdo), valor de la producción en primera venta (en euros, eje de ordenadas izquierdo) y la relación entre ambas (eje de ordenadas derecho) ...... 175 Figura V.2. Distribución de frecuencias de longitud anteroposterior de la concha, construida con individuos procedentes de la población base natural ...... 180 Figura V.3. Representación gráfica del crecimiento de la longitud (length, mm) anteroposterior de la concha del mejillón en 9 progenies de hermanos completos cultivadas en criadero (H) y en la Ría de Vigo (W) durante 24 meses (age, months) ...... 187 Figura V.4. Modelos de regresión polinómica obtenidos a partir del crecimiento de las familias a lo largo del cultivo ajustados de cuadráticamente (A) y cúbicamente (B) ...... 189 Figura V.5. Gráfico de frecuencias del promedio entre familias de los componentes de la varianza estimados a partir del modelo animal en ambos ambientes ...... 191 Figura V.6. Evolución temporal en ambos ambientes (A, criadero; B, cultivo exterior) de los componentes de la varianza estimados a partir del modelo animal ...... 192 2 Figura V.7. Evolución temporal de la heredabilidad calculada a través del modelo animal (h AM) 2 en cada uno de los dos ambientes. También puede observarse la tendencia lineal de la h AM para cada ambiente ...... 193

Resumen El mejillón mediterráneo Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819) es originario de las costas europeas y el paradigma de la acuicultura en España. Su cultivo genera una actividad económica elevada a todas las escalas geográficas, por lo que su estudio genético a escala de cultivo y de poblaciones resulta fundamental para la sostenibilidad de este recurso. En esta tesis se evalúa la potencia de los marcadores genéticos microsatélites y se aplican a la resolución de situaciones de cultivo, tales como el grado de introgresión de muestras exóticas de mejillón en cultivos locales (Capítulo II). También se aplican microsatélites para trazar dinámicas poblacionales en los cultivos, concretamente para medir la tasa de reclutamiento externo en cuerdas de cultivo sembradas con semilla seleccionada y su viabilidad futura (Capítulo III). El carácter dominante del mejillón mediterráneo hace que su introducción ocasional fructifique en muchos lugares del planeta, representando un peligro potencial para las especies locales. Mediante trazadores genéticos específicos se rastrea la expansión de esta especie en la costa chilena del Océano Pacífico, se realiza la identificación molecular de las especies de mitílidos de interés comercial en el Cono sur y se establece la estructura genética de las poblaciones de Mytilus chilensis en el Cono Sur, para asegurar su adecuada gestión (Capítulo IV). Por último se estima la heredabilidad del parámetro de longitud valvar en familias de hermanos completos de M. galloprovincialis cultivadas en dos ambientes durante todo el ciclo vital de la especie, lo que permite plantearse el diseño de un plan de selección para mejorar la productividad de este recurso (Capítulo V).

Capítulo I. Introducción general

Capítulo I

I.1. Distribución y biología de la especie

El phylum Mollusca, es uno de los más amplios de su categoría, albergando los grupos de mayor importancia y diversidad del reino animal, con más de 50.000 especies, de las que la mayoría son acuáticas. Dentro de este phylum, la clase Bivalvia es la segunda clase con mayor número de especies (~9.200) y está formada básicamente por especies comprimidas lateralmente, que se encuentran encerradas por dos valvas de concha, como mejillones, ostras, vieiras y almejas (Gosling, 2003). Dentro de la subfamilia Mytilinae (Rafinesque, 1815) encontramos especies de mejillón como las del género Perna (Philipson, 1788), que se distribuyen por regiones subtropicales y tropicales, mientras que las especies del género Mytilus (Linnaeus, 1758) se distribuyen a lo largo de las latitudes templadas y boreales (Koehn, 1991). Ambos géneros habitan de forma dominante el litoral rocoso desde la zona intermareal hasta la submareal. En este género encontramos 8 taxones bien descritos y aceptados por los registros taxonómicos como Mytilus californianus (Conrad, 1837), Mytilus chilensis (Hupé, 1854), Mytilus edulis (Linnaeus, 1758), Mytilus trossulus (Gould, 1850), Mytilus planulatus (Lamarck, 1819), Mytilus platensis (d'Orbigny, 1842), Mytilus unguiculatus (Valenciennes, 1858) y por último, Mytilus galloprovincialis (Lamarck, 1819), especie en la que se centra una gran parte de esta tesis doctoral.

Mytilus galloprovincialis presenta un rango de distribución natural que abarca el Mar Mediterráneo (Hickman, 1992) y la costa atlántica oriental, desde Irlanda y Reino Unido (Gosling, 1992) hasta la costa africana septentrional (Comesaña et al., 1998; Ouagajjou et al., 2010). Pero también ha sido observado en Islandia (Varvio et al., 1988) y en Groenlandia (Wanamaker et al., 2007). Por otro lado, esta especie también se encuentra a lo largo de las zonas costeras de otros continentes debido principalmente a la acción antropogénica, bien de manera accidental o deliberada, como la costa pacífica de Norteamérica (California) (McDonald y Koehn, 1988), Japón (Wilkins et al., 1983), Hong Kong (Lee y Morton, 1985), Sudáfrica (Grant y Cherry, 1985), Chile o Australia (Gérard et al., 2008; Hilbish et al., 2000). En Europa además de M. galloprovincialis existen otras dos especies del mismo género, M. edulis y M. trossulus. Con respecto a M. edulis aún existe cierto debate acerca del estatus taxonómico de ambas especies, ya que sus

23 Capítulo I distribuciones se solapan a lo largo de 2.000 km de costa noratlántica, dando lugar a una zona en la que se han encontrado poblaciones con individuos híbridos fértiles (Daguin et al., 2001). Debido a su gran tolerancia a la variabilidad ambiental, adaptabilidad, resistencia a la desecación o a la exposición al aire, M. galloprovincialis es capaz de colonizar y formar poblaciones naturales fuera de su rango de distribución natural. Por ello, se encuentra ampliamente distribuida y forma parte de la lista de las “100 especies exóticas más invasoras” (Global Invasive Species Database, 2018). Su rango óptimo de temperatura varía entre 10ºC y 20ºC, ya que en él se observan las mayores tasas de ingestión, absorción y crecimiento (van Erkom Schurink y Griffiths, 1992). Es una especie filtradora, que se alimenta del paso del agua a través de sus branquias, lugar en el que los cilios retienen las partículas en suspensión (principalmente fitoplancton) y las transporta hacia la boca. Su tamaño varía desde los 3 cm hasta los 13 cm, pudiendo alcanzar los 7 cm de longitud en su primer año de crecimiento si se fijan en zonas con condiciones favorables (Picker y Griffiths, 2011). En este sentido, los individuos fijados en la zona submareal de costas expuestas, presentan mayores tasas de crecimiento y reclutamiento que aquellos que se asientan en la parte alta intermareal de zonas protegidas o en zonas extremadamente expuestas al oleaje (Seed, 1976; Steffani y Branch, 2003). M. galloprovincialis es una especie cuyos sexos se encuentran separados (gonocórica) y que no presenta dimorfismo sexual externo (Figueras, 2007). Presentan fecundación externa, por la cual los gametos son liberados por las gónadas al medio oceánico, lugar donde se produce la fecundación. Según varios autores, p. ej. Figueras (2007); Villalba (1993), la liberación de gametos al medio oceánico en las Rías Gallegas se produce de forma masiva en primavera, mientras que a finales de verano y principios del otoño también se suceden puestas (en menor proporción) tras la restauración del tejido gonadal. Tras la fecundación del ovocito surge la mórula y a continuación diferentes larvas planctónicas (p. ej. larva trocófora, larva veliger) hasta llegar a la fase larvaria pediveliger (30-40 días tras la fecundación), momento en el que desarrollan el pie y se asientan sobre el sustrato rocoso sufriendo la metamorfosis hasta convertirse en juveniles (Widdows, 1991).

24 Capítulo I

I.2. El cultivo de Mytilus galloprovincialis

Si bien existen registros de cultivos acuícolas de peces en China desde el año 2500 antes del presente (a.p.), los primeros registros existentes en cultivos de bivalvos (ostras) en cajas datan del año 2350 a.p. en la antigua Grecia por parte de Aristóteles y hacia el año 2100 a.p. cerca de Nápoles (Italia) por parte de Plinio. Aunque en Galicia existen registros de recolección de bivalvos por parte de los pueblos celtas desde el S. VIII a.C, no fue hasta el año 1235, en la bahía de Aiguillon (Francia), cuando se empezó a cultivar el mejillón en estacas de madera, denominados comúnmente «bouchots». Sin embargo, hasta principios del S. XX no se instaló el primer cultivo de mejillón en España, efectuado en Tarragona en el año 1901 usando estacas similares a las francesas. En las Rías Gallegas, la primera batea se fondeó en la Ría de Arousa en el año 1945. A partir de este momento el cultivo de mejillón en Galicia se expandió desde la Ría de Arousa hacia el resto de Rías (i.e., Muros y Noia, Pontevedra, Vigo, etc.) desarrollándose de manera vertiginosa y aumentando el número de bateas hasta 3.300 en el año 1976, momento a partir del cual se limitan las concesiones de los emplazamientos (Figueras, 2007; Gosling, 2003; OESA- Fundación Biodiversidad, 2017).

El cultivo de mejillones se realiza siguiendo diferentes metodologías en función de las condiciones costeras de cada región. Por ello encontramos en primer lugar las estacas o bouchots, método de cultivo más antiguo, de origen francés, cuyo uso se extiende actualmente por la costa atlántica francesa y el canal de la mancha. El cultivo de fondo es empleado habitualmente por países europeos como Alemania, Holanda e Irlanda, además de otros países como Estados Unidos. El cultivo en long lines es relativamente reciente y es empleado en países como Canadá, China, Chile, Grecia o Nueva Zelanda y está especialmente indicado para zonas más expuestas o regiones con inviernos difíciles (i.e., heladas, temporales, etc.). Por último tenemos el cultivo en suspensión, que está basado en la suspensión de cuerdas de cultivo sobre estructuras de madera denominadas bateas (Figueras, 2007). Si bien el inicio del cultivo en España se efectuó sobre estacas, en la actualidad el ciclo de cultivo se realiza mayoritariamente en suspensión y consta de 5 fases bien diferenciadas:

25 Capítulo I

 Recolección. La obtención de semilla de mejillón, de unos 2 cm de longitud media, se realiza mediante la instalación de cuerdas colectoras en las bateas, entre los meses de marzo y junio, o bien se obtienen mediante el rascado de las poblaciones naturales de mejillón en el intermareal rocoso, entre los meses de diciembre y abril.

 Siembra. En esta fase del cultivo, la semilla que ha sido extraída de la roca o captada por los colectores, se envuelve en las cuerdas de cultivo con una malla biodegradable de algodón, permitiendo a los mejillones adherirse a las cuerdas de cultivo. La densidad media de siembra suele ser de unos 1,5 kg*m-1, alcanzando las cuerdas un peso de unos 14 kg (Figueras, 2007). Esta fase del cultivo se realiza entre los meses de noviembre y marzo (Pérez-Camacho et al., 1991).

 Desdoblamiento. Tras una fase de pre-engorde que dura entre 3 y 6 meses se lleva a cabo el desdoblamiento de las cuerdas de cultivo, momento en el que los individuos presentan un tamaño aproximado de 4-5 cm. Los individuos de la cuerda desdoblada son retirados de la cuerda sembrada al inicio del cultivo y sembrados de nuevo en otras cuerdas con una densidad cercana a 46 kg por cuerda, i.e., ~ 4 kg*m-1 (Pérez-Camacho et al., 1991). Por cada cuerda desdoblada se originan tres nuevas cuerdas de cultivo, descendiendo la densidad de individuos inicial y permitiendo el crecimiento óptimo de los mejillones durante los meses restantes de cultivo y evitando el desprendimiento de las piñas debido a un peso excesivo.

 Engorde. Tras el desdoble de las cuerdas ocurre la siguiente fase, el engorde, que se prolonga entre 8 y 14 meses hasta que los mejillones alcanzan el tamaño de comercialización.  Cosecha. Una vez que alcanzan la talla comercial, entre 7 y 10 cm, los mejillones son cosechados. De acuerdo con la legislación actual cada batea puede contener hasta 500 cuerdas, con un máximo de 12 metros de longitud. Al final del ciclo de producción cada cuerda puede contener unos 150 kg de mejillón, esto es unos 30

26 Capítulo I

o 35 individuos por kg. No se suele cosechar durante y tras la puesta, debido a que los mejillones bajan su rendimiento en carne por el desgaste de la reproducción.

I.3. Aplicaciones de marcadores moleculares para la mejora en acuicultura y conservación de poblaciones naturales

Los marcadores moleculares revolucionaron el campo de la acuicultura desde que fueron desarrolladas las alozimas, a principios de la década de 1960 (May et al., 1980). En aquella época, las alozimas y los marcadores de ADNmt eran muy populares en estudios genéticos en el campo de la acuicultura, pero en la actualidad, dichos marcadores han sido sustituidos por otros más informativos como los Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP), Short Tamden Repeats (STR), Single Nucleotide Polymorphism (SNP), y Expressed Sequence Tag (EST) (Liu y Cordes, 2004).

Los microsatélites también conocidos como Short Tandem Repeats (STR) o Simple Sequence Repeats (SSR) consisten en múltiples copias repetidas en tándem de secuencias que varían entre 1-6 pares de bases de tamaño p. ej,. (CT)n o (GT)n (Estoup et al., 1993). Estos se encuentran dispersos a lo largo del genoma nuclear en la mayoría de organismos eucariotas, tanto en regiones codificantes (Liu et al., 2001) como en no codificantes (Pérez et al., 2005), y son abundantes en todas las especies. Wright (1993) estimó la ocurrencia de los STR en peces y Estoup et al. (1993) también estimó su distribución genómica, obteniendo unos resultados de 1 repetición cada 10 - 20 kb. El polimorfismo de los microsatélites se debe a las diferencias de tamaño, debido al número variable de unidades que existen en los alelos de un locus determinado. Se ha estimado que la tasa de mutación de cada generación en los microsatélites es alta, variando entre 10-2 y 10-6 (Crawford y Cuthbertson, 1996; Gemayel et al., 2012; Weber y Wong, 1993). El mecanismo que mejor explica su alto grado de polimorfismo es la acumulación de errores producidos por el deslizamiento de la polimerasa durante la replicación del ADN (Ellegren, 2000; Tautz, 1994).

27 Capítulo I

Los STR son valiosos como marcadores moleculares porque son codominantes, baratos, detectan altos niveles de diversidad alélica, segregan de manera mendeliana y se analizan de manera sencilla mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el genotipado por electroforesis (Estoup et al., 1993). Por todas estas características, los marcadores STR son cada vez más empleados en el manejo y evaluación de especies salvajes, en (i) estudios de diversidad basados en las distancias genéticas; (ii) estimas de flujo génico y tasas de cruzamiento (Presa et al., 1994); y (iii) estudios microevolutivos, mediante la inferencia de las relaciones genéticas intraespecíficas. Por otro lado, en especies acuícolas cultivadas son usados comúnmente en (i) la construcción de mapas de ligamiento genético (Hubert y Hedgecock, 2004), (ii) el mapeo de loci relacionados con caracteres cuantitativos (Quantitative Trait Loci, QTL) (Ozaki et al., 2013), (iii) la estimación del grado de parentesco entre genotipos (Díaz-Puente et al., 2016; MacAvoy et al., 2008) y (iv) la selección asistida por marcadoras (Marker-Assisted Selection, MAS).

28 Capítulo I

I.4. Objetivos generales

1) El primer objetivo de esta tesis doctoral es la evaluación de los microsatélites utilizados a lo largo de la tesis y en estudios aplicados anteriores. Específicamente se analiza, en un caso práctico de introgresión de semilla de Mytilus galloprovincialis para cultivo, la señal genética modificada por la inclusión de correcciones de las frecuencias génicas y genotípicas de los alelos nulos que segregan en los microsatélites de invertebrados marinos (Capítulo II).

2) El segundo objetivo de la tesis es el cálculo del origen de la cosecha de Mytilus galloprovincialis en cultivos en suspensión, tras la siembra de los mismos con semilla de criadero. Esta trazabilidad se efectúa mediante asignación con microsatélites y permite conocer la viabilidad de producir y cosechar semilla seleccionada en condiciones naturales (Capítulo III).

3) El tercer objetivo de la tesis consiste en la identificación molecular de las especies de mitílidos de la Región de Magallanes, y el cálculo de la estructura genética poblacional de Mytilus chilensis como principal competidor de Mytilus galloprovincialis en los mercados europeos (Capítulo IV).

4) El cuarto objetivo de la tesis consiste en el cálculo de estimas de parámetros genéticos relacionados con la mejora de caracteres en Mytilus galloprovincialis. Se analiza la influencia del método en las estimas de heredabilidad, y se efectúa un análisis de regresión conjunta sobre la evolución del crecimiento de réplicas de mejillón de familias de hermanos completos en dos ambientes (Capítulo V).

29 Capítulo I

I.5. Bibliografía general

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33

Capítulo II. Estima de mezcla de stocks cultivados de Mytilus galloprovincialis con marcadores microsatélites

Capítulo II

II.1. Introducción

II.1.1. La mitilicultura en España

La acuicultura es una actividad muy antigua, datándose los primeros registros de ésta en el periodo Neolítico (6.000 años a.p.). Sin embargo, desde estas etapas iniciales hasta la industria global que conocemos hoy, se ha producido una transformación total de los métodos de cultivo y se ha domesticado un elevado número de especies (https://ec.europa.eu/fisheries/cfp/aquaculture/aquaculture_methods/history_en). Prueba de ello es que la producción mundial de la acuicultura marina alcanzó las 50 millones de toneladas en 2016 con un valor de mercado de 72.000 millones de dólares aproximadamente (FAO Statistics, 2016). Esto supone un negocio muy lucrativo que no para de crecer, ya que se ha revalorizado un 243% aproximadamente en lo que llevamos de siglo (FAO Statistics, 2016).

El grupo marino más importante a nivel productivo son los moluscos, que suponen aproximadamente el 33% de la producción global. Los informes del Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, revelan que el sector de la acuicultura en España trabajó en 2017 con trece especies de moluscos: pulpo común (Octopus vulgaris), cañaílla (Bolinus brandaris), abalón japonés (Haliotis discus hannai), almeja babosa (Venerupis corrugata), almeja fina (Ruditapes decussatus), almeja japonesa (Ruditapes philippinarum), berberecho (Cerastoderma edule), escupiña grabada (Venus verrucosa), mejillón (Mytilus galloprovincialis), navaja recta (Ensis ensis), ostión (Crassostrea gigas), ostra (Ostrea edulis) y volandeira (Aequipecten opercularis). La producción obtenida de su cultivo fue de 275.128,43 toneladas, repartidas fundamentalmente en Galicia (269.809,61 t), Cataluña (3.344,89 t), Andalucía (931,43 t) y la Comunidad Valenciana (922,29 t). A nivel de especie, el cultivo de mejillón mediterráneo es con diferencia el más importante a nivel productivo con 271.842,02 t (el 98,81% de la producción de moluscos), de las cuales el 98,19% (266.925,74 t) corresponden a la producción gallega. Este nivel de producción en el año 2017 se tradujo en un valor de primera venta de 121.953.289,84 € sólo en Galicia, un 80,45% del valor alcanzado en primera venta por todos los moluscos cultivados en España en ese año (JACUMAR, 2017). Estos datos sitúan a España como uno de los mayores productores mundiales de mejillón mediterráneo. 37 Capítulo II

II.1.2. El abastecimiento de semilla en zonas con bajo reclutamiento

El factor clave de todo el proceso de cultivo del mejillón es la obtención de semilla. Esta se obtiene del medio natural, bien a través del rascado de las rocas del litoral (forma tradicional), bien a través de la captación de larvas en otras estructuras, como las propias cuerdas de las bateas o algunos sustratos colectores desarrollados al efecto (Figueras, 2007). El proceso de rascado del litoral supone una presión ambiental, tanto por el impacto que genera en el medio y en el ecosistema, como por la posible reducción de la biomasa de las poblaciones naturales, resultado de la ingente cantidad de semilla necesaria para el mantenimiento de esta actividad económica (Aghzar et al., 2012). Esto está generando un mayor desarrollo y uso de métodos alternativos, los cuales no carecen de inconvenientes. La fijación de las larvas de mejillón al sustrato, o asentamiento, es un proceso muy variable que según algunos estudios previos puede estar influenciado por cambios en la magnitud y época de desove (Cáceres-Martínez y Figueras, 1998), retrasos en la metamorfosis (Seed y Suchanek, 1992), interacciones entre factores ambientales tales como la temperatura, disponibilidad de alimento y condiciones hidrodinámicas (Porri et al., 2006), y por la localización del sustrato de fijación (Aghzar et al., 2012; Cáceres- Martínez y Figueras, 1998). Por tanto, el conocimiento de estos procesos es de gran interés para el sector, que se beneficiaría de áreas de colecta de semilla con un buen índice de reclutamiento natural. Sin embargo, en muchos casos las empresas recurren a la importación de semilla de otras áreas geográficas, bien sea para maximizar la producción o para subsanar los problemas de reclutamiento natural, que puedan encontrar en sus propias zonas de producción (Aghzar et al., 2018).

Por ejemplo, a pesar de que esta especie lleva siendo cultivada en aguas andaluzas desde los años 90 del S. XX, este área presenta problemas para cubrir toda la demanda de producción de las empresas que se han instalado, debido a que es una zona con un pobre reclutamiento natural de semilla (Tirado et al., 2005). Esta demanda es cada vez mayor, lo que se refleja en la mejora notable de la producción a lo largo de la última década (se ha alcanzado la cota de 1.600 t de producción en 2015 y 2016, JACUMAR, 2017). Se estima que el bajo reclutamiento en el Mar de Alborán es debido a las condiciones hidrográficas de elevada turbulencia que dominan en la zona (Tintoré et al., 1988) y se

38 Capítulo II sospecha que existe una importación no reglada de semilla de otras localidades para asegurar una densidad de producción adecuada.

II.1.3. Control de riesgo en semilla importada para el cultivo de moluscos

La alternativa de importación de semilla de zonas alejadas geográficamente del cultivo, en respuesta al bajo reclutamiento local, es una acción que conlleva una serie de riesgos, tanto a nivel legal como a nivel biológico y social. A nivel legal cabe destacar que las competencias en materia de pesca y marisqueo en el Estado Español están transferidas a las Comunidades Autónomas, por lo que cada una de ellas regula el sector de forma independiente en función de sus características (tipo de costa, recursos explotables, etc.). En el caso de la Comunidad Autónoma de Galicia es la Ley 11/2008, de 3 de diciembre, de Pesca de Galicia modificada por la Ley 6/2009, de 11 de diciembre, la que regula entre otras cosas “el ejercicio de la pesca, el marisqueo y la acuicultura marina”, estableciendo en su Artículo 8º bis que “la inmersión y suelta de gametos, larvas, huevos, juveniles y adultos de cualquier especie en las aguas, instalaciones y territorio competencia de la Comunidad Autónoma gallega requerirá la correspondiente autorización de la consejería competente en materia de pesca, y siempre y cuando reúnan los requisitos y condiciones que reglamentariamente se determinen, en conformidad con la normativa vigente”. En la Comunidad Autónoma de Andalucía se establece como una infracción grave “la introducción para el cultivo o tenencia en un establecimiento acuícola de especies importadas sin cumplir los requisitos establecidos para su inmersión (Artículo 113 de la Ley 1/2002, de 4 de abril, de ordenación, fomento y control de la Pesca Marítima, el Marisqueo y la Acuicultura Marina).

Los riesgos ecológicos asociados a un trasvase de semilla entre zonas geográficamente distantes y administrativamente independientes en estas materias pueden resultar graves, como la diseminación de enfermedades (víricas, bacterianas o parasitarias), el reemplazo de especies autóctonas, la extinción de algunos recursos locales, el aumento del furtivismo o la alteración de las cadenas tróficas locales (Ibáñez et al., 2014; Gardner et al., 2016). Una de las prioridades actuales en las regiones con gran biodiversidad costera es la evaluación del impacto en las poblaciones locales, que producen las invasiones involuntarias (i.e., en aguas de lastre, por biofouling o por actividades turísticas) o 39 Capítulo II deliberadas (i.e., mediante introducción de semilla para refuerzo del cultivo). En el caso del mejillón, debería ser obligatorio un estudio preventivo consistente en una caracterización previa de la semilla que se pretende importar (i.e., morfología, parasitosis, procedencia, estatus genético, etc.) y de ensayos en criadero con un seguimiento a lo largo de todas las fases del cultivo, antes de permitir su cultivo extensivo en condiciones naturales. Estos controles preventivos son difíciles de llevar a cabo. En primer lugar, debido a limitaciones técnicas, pues la identificación de individuos de especies del género Mytilus no es sencilla y menos en fases tempranas del desarrollo. En segundo lugar, la elevada cantidad de gametos que se liberan al medio en un tiempo corto favorece la mezcla de los distintos pooles génicos (local e importado) en una sola generación (Westfall y Gardner, 2013). En tercer lugar, la compra, el transporte y la introducción de esa semilla pueden ser realizados al margen de la normativa legal, sin que el organismo regulador tenga conocimiento del hecho para abordar su trazabilidad.

Una de las posibles estrategias para evaluar el impacto de una introducción no declarada (ilegal), es la caracterización genética previa de las poblaciones locales, esto es, desarrollar una base de datos de referencia sobre los recursos genéticos locales. Esto permite, a través de un genotipado rápido, la detección de introducciones de material biológico exógeno, siempre que exista divergencia genética regional, como suele ser el caso cuando el origen de la semilla y el lugar de su implantación son lejanos (Diz y Presa, 2008).

Por lo tanto, en dicho genotipado es crucial emplear los marcadores más resolutivos y adecuados para la diagnosis. En este sentido, la información previa sobre el posible origen de la muestra, y la disponibilidad de marcadores de distinta resolución taxonómica, son aspectos esenciales en la trazabilidad molecular (Pérez y Presa, 2008). Por ejemplo, calibraremos marcadores conservados dentro de especie pero divergentes entre especies cuando se trate de detectar introducciones de especies próximas a la local (Pérez et al., 2005). Sin embargo, seleccionaremos marcadores variables dentro de especies cuando se trate de detectar introducciones conespecíficas (Presa y Pérez, 2003).

40 Capítulo II

II.1.4. Objetivos

Los marcadores genéticos que deben emplearse en situaciones de mezcla interespecífica (introducciones, invasiones, zonas híbridas, etc.) son objeto de estudio en el Capítulo IV, mientras que entre los más resolutivos dentro de especie para determinar el origen geográfico de los stocks (repoblación, importación de semilla, etc.) se encuentran los microsatélites como regiones hipervariables del genoma (Estoup et al., 1993). El primer objetivo de este capítulo ha consistido en el estudio de la segregación alélica de diez microsatélites en nueve familias de mejillón Mytilus galloprovincialis, que han sido diseñados y aplicados previamente en estudios poblacionales de esta especie (p. ej. Presa et al., 2002; Presa y Pérez. 2003; Diz y Presa, 2008, 2009; Ouagajjou et al., 2011; Ouagajjou y Presa, 2015). Concretamente se trata de estimar la frecuencia de alelos nulos a partir de la distorsión de las segregaciones de familias biparentales y su efecto en la asignación de parentesco. En segundo lugar nos planteamos evaluar el impacto del cómputo de alelos nulos en estudios poblacionales. Para ello se efectúa la comparación de las estimas de alelos nulos en segregaciones controladas frente a los stocks naturales. Ello permite evaluar el sesgo que se añade al realizar estudios poblacionales con marcadores portadores de alelos nulos. Para abordar este segundo objetivo se analiza una situación real de mezcla de stocks naturales e introducidos para cultivo en el Mar de Alborán, lo cual nos permite también estudiar el grado de mezcla poblacional de esa zona de cultivo, con semilla importada.

41 Capítulo II

II.2. Material y métodos

II.2.1. Cruzamientos

En invierno del año 2009 se recolectaron 300 individuos adultos de mejillón del intermareal rocoso de la isla de Toralla, con el objetivo de generar una serie de cruzamientos y progenies experimentales. Una vez recolectados se introdujeron en un tanque de acondicionamiento, con un sistema abierto con recirculación de agua a temperatura ambiente (18ºC) y sin alimentación hasta la inducción reproductiva. Tras limpiar y desinfectar con Lubacín los tanques y el material utilizado para la fecundación, estos se aclararon con agua dulce y después con agua de mar filtrada (1 μm) y esterilizada con UV. Una vez preparado el material se efectuó el choque térmico mediante la introducción de los parentales en la cámara frigorífica a 4ºC durante 2 horas, y posteriormente se transfirieron individualmente hacia vasos de precipitados dentro en un baño termostático a 20ºC. A medida que se efectuaban los desoves, se iban realizando los cruzamientos por parejas, teniendo en cuenta la calidad de la puesta, i.e., la evaluación de la esfericidad del ovocito en las hembras y de la motilidad del esperma en los machos. En total se realizaron nueve cruzamientos, generando familias simples de hermanos completos. Tras comprobar el progreso de la fecundación (segundo corpúsculo polar), los embriones se trasladaron a nueve tanques troncocónicos de 30 l. Las primeras larvas trocóforas se observaron 12 horas después de la fecundación, y tras 24 horas las primeras larvas D (Prodisoconcha I), que tenían un tamaño de 80 μm.

II.2.2. Cultivos larvarios

A cada larvario se le administró una concentración de fitoplancton de 100 células/μl de su volumen. La dieta inicial consistió en una mezcla de 50% de Isochrysis galbana (Clase Prymnesiophyceae; cepa celular #CCMP1323) y 50% de Pavlova luthery (Clase Prymnesiophyceae; cepa celular #CCMP1325). Posteriormente, se suministró una dieta cuya composición estaba formada por: 40% I. Galbana, 40% P. luthery y 20% Tetraselmis suecica (Clase Prasinophyceae; cepa celular #CCMP904). Como esta última especie tiene mayor peso, hay que convertir el dato en equivalentes, con una relación aproximada de 1 célula T. suecica = 10 células de I. Galbana - P. luthery (Miñambres et al., 2011). Para

42 Capítulo II mantener dicha relación se administraron 40 células de I. galbana, 40 células de P. luthery y 2 células de T. Suecica por cada μl de volumen. La efectividad de la dieta se evaluó mediante el recuento de las células fitoplanctónicas remanentes en el tanque al día siguiente de su administración, de modo que se evitara también un exceso de microalgas que facilitan la proliferación de ciliados, con el consiguiente deterioro de la calidad del agua. El cultivo se mantuvo hasta alcanzar los 3 mm de longitud valvar, suficientes para obtener una buena cantidad de ADN para el análisis genético.

II.2.3. Extracción de ADN, amplificación y genotipado de microsatélites

El ADN genómico de 355 juveniles y 18 adultos usados como parentales, se aisló en 2014 a partir de 50 mg del manto mediante el método FENOSALT (Pérez y Presa, 2011). Una vez extraído el ADN genómico se cuantificó mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% y las muestras se almacenaron a -20ºC hasta los análisis posteriores. La amplificación en todos los individuos (n = 355) de una batería de diez marcadores microsatélites (STR) diseñados para especies del genero Mytilus, se llevó a cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los microsatélites Mgμ1, Mgμ2, Mgμ3, Mgμ4, Mgμ5 y Mgμ8 son marcadores diseñados específicamente para la especie Mytilus galloprovincialis (Presa et al., 2002; Ouagajjou y Presa, 2015). Por otro lado, los microsatélites Mch1, Mch3, Mch5 y Mch8 fueron diseñados para la especie Mytilus chilensis (Ouagajjou et al., 2011) (Tabla II.1).

43 Capítulo II

Tabla II.1. Características de los marcadores microsatélites empleados en este estudio (motivos de repetición, secuencias de los cebadores, temperatura de anillamiento y número de acceso a Genbank).

Temp. Acceso Locus Motivo Secuencias de los cebadores (5’- 3’) Referencia (ºC) Genbank F: ATCAGAATGGCAAAGAAAAA Mg1 (TG)n…(AT)n 56 AF445370 Presa et al., 2002 R: ACTATGATGGCTGAGAGGATA F: GGGATCGTTCAATAAGTTC Mg2 (CT)n 55 AF445371 Presa et al., 2002 R: AAATTTTACTGAATAAATAAATCG F: AAACTAAAAACTTCATCTAATCCC Mg3 (TG)n 60 AF445372 Presa et al., 2002 R: AAGCAATCCAAAGTGAGAGG F: CCTTACTATGCGTCGTTCAA Mg4 (TG)n 55 AF445373 Presa et al., 2002 R: TGACCAACACTCCAAAAATC F: ACTTCTCCGGTAACATAATA Mg5 (TTTG)n 60 AF445374 Presa et al., 2002 R: AGTCTTTCCCCTATGATGA F: ATGTCTCCTCAATCTGG Mg8 (CA)6 55 - Ouagajjou y Presa, 2015 R: AAATCGTTAAAAAGCAAT F: GATGGCCGCATCTGTAATTC Mch1 (CA)6 52 JF894123 Ouagajjou et al., 2011 R: TGTCGCATGCTCATTTCTTC F: AGAGGAGTTGCGATGATT Mch3 (CAGA)8 52 JF894125 Ouagajjou et al., 2011 R: CGAAGTTGTGGAGGGTAT F: CTGTTGCTCAATCCTTGCAG Mch5 (CTGT)6 52 JF894127 Ouagajjou et al., 2011 R: GCGAAAAATAGGAAAAGATAAGCA F: AAACCTAAGTGCTGTTCA Mch8 (CA)6 55 JF894130 Ouagajjou et al., 2011 R: CATTTATTCGTCTGTCACA

Se utilizaron 50 ng de DNA por individuo en cada reacción de PCR de un volumen total de 15 μl, que contenía 1 U de Taq DNA Polymerase (BIOTAQTM) en 1X tampón de reacción NH4 (Bioline), 0,5 μmol de cada primer, 200 μM de cada desoxirribonucleótido- trifosfato (dNTP) y la concentración necesaria de MgCl2 para cada locus. El cebador directo de cada locus fue marcado fluorescentemente con Cy5’ para su posterior detección por láser. Las reacciones de amplificación por PCR se llevaron a cabo en un Mastercycler Gradient Thermocycler (Eppendorf) siguiendo el perfil que se indica a continuación: 1 ciclo a 95ºC durante 5 min para desnaturalizar las hebras de ADN, seguido de 35 ciclos de una rutina de 40 s a la temperatura de hibridación, 72ºC durante 1 min (elongación de la hebras) y 94ºC durante 1 min para volver a desnaturalizarlas. Se finalizó con un último ciclo de elongación final a 72ºC durante 30 min. La cantidad y calidad del ADN amplificado se estimó a partir de geles de agarosa al 2%. Posteriormente se sometieron los amplicones a una electroforesis en geles de acrilamida:bis-acrilamida

44 Capítulo II

6% en un analizador automático de fragmentos ALFexpressII (Amersham Pharmacia Biotech). La búsqueda de alelos se llevó a cabo con el programa de análisis de fragmentos ALFWin v1.0 (Amersham Pharmacia Biotech) tomando como referencia marcadores internos de diferentes tamaños (80 pb, 114 pb, 180 pb y 230 pb) en función de los tamaños alélicos esperados para cada locus. Los datos genotípicos brutos se recogieron en una hoja de cálculo de Excel para efectuar el análisis exploratorio de los datos. Dicho análisis consistió en reexaminar los geles de acrilamida para comprobar la veracidad de los datos cuando se detectaban distribuciones atípicas de frecuencias génicas, artefactos y lecturas alélicas erróneas (outliers), y en general para resolver ambigüedades en la lectura de los alelos que suelen aparecer en este tipo de marcadores, p. ej., desviaciones del tamaño de los fragmentos entre geles.

II.2.4. Análisis de segregación en progenies

La lectura alélica se efectuó varias veces y por tres investigadores, hasta que se alcanzó un consenso en la matriz genotípica final. A partir de la lectura validada se calcularon las frecuencias genotípicas observadas y esperadas en las progenies. Mediante la prueba de ji-cuadrado (χ2) (n-1 grados de libertad, n = número de clases fenotípicas) se comparó la bondad de ajuste de los patrones genotípicos observados en las nueve progenies frente a los patrones de segregación esperados según el modelo de herencia mendeliana disómica. En ese modelo se espera una segregación 1:1 si el genotipo de uno de los dos parentales es heterocigoto y el otro homocigoto, 1:2:1 si ambos padres son heterocigotos y comparten los alelos, y 1:1:1:1 si ambos progenitores son heterocigotos pero no comparten los alelos.

Las desviaciones significativas a las segregaciones esperadas se achacaron a alelos nulos cuando fue posible, y por tanto se efectuó la reasignación genotípica en los parentales y en las progenies para encajar tales alelos nulos. Tras la reasignación, se volvió a ejecutar la prueba de ji-cuadrado. Los datos genotípicos validados se importaron en el programa GENALEX 6.5 (Peakall y Smouse, 2012) para estimar los parámetros de diversidad pertinentes, esto es el numero alelos por locus en la generación parental, la frecuencia alélica, la frecuencia de alelos nulos y el PIC (Contenido de Información Polimórfica) de cada locus. La probabilidad de asignación de cada descendiente a una familia biparental 45 Capítulo II usando los genotipos microsatélites multilocus se calculó con el programa VITASSIGN (Vandeputte et al., 2006).

46 Capítulo II

II.3. Resultados

II.3.1. Diversidad alélica en la generación parental

Los parámetros de diversidad en la generación parental estimados con GENALEX se muestran en la Tabla II.2. Se observaron 63 alelos en el conjunto de los diez loci en los 18 parentales. El locus menos polimórfico fue Mch1 ya que el 66,66% de las familias amplificadas con este marcador se encontraban fijadas para un único alelo (Tabla II.2). El número de alelos por locus (con media aritmética 6,300 ± 2,830) osciló entre 2 (Mgμ1) y 11 (Mgμ4), mientras que el contenido de información polimórfica (PIC con media aritmética 0,637 ± 0,182) osciló entre 0,285 (Mch1) y 0,842 (Mgμ2). La frecuencia estimada de alelos nulos por locus en la generación parental varió entre 0 (Mgμ1) y 0,344 (Mgμ4), con media aritmética 0,162 ± 0,092 (Tabla II.2).

Tabla II.2. Índices de polimorfismo en la generación parental y frecuencia estimada de alelos nulos. K, número de alelos totales por locus; N, número absoluto de progenitores; Nm, número medio de progenitores; Na media, número medio de alelos por locus; Ne, número medio de alelos efectivos por locus; PIC, contenido de información polimórfica de cada locus; FEst, frecuencia estimada de alelos nulos por locus.

Nm Na Ne Locus K N PIC FEst (Media ± SE) (Media ± SE) (Media ± SE) Mgu1 2 16 1,778 ± 0,222 1,778 ± 0,222 1,511 ± 0,198 0,375 0,000

Mch5 7 16 1,778 ± 0,222 2,333 ± 0,333 2,104 ± 0,295 0,704 0,219

Mgu3 4 18 2,000 2,222 ± 0,147 2,104 ± 0,115 0,557 0,111 Mch8 7 18 2,000 2,556 ± 0,176 2,237 ± 0,175 0,765 0,139 Mgu5 6 18 2,000 1,778 ± 0,147 1,600 ± 0,129 0,629 0,167 Mgu8 7 18 2,000 1,889 ± 0,111 1,667 ± 0,105 0,768 0,167 Mch3 6 18 2,000 2,444 ± 0,176 2,207 ± 0,154 0,669 0,083 Mch1 3 18 2,000 1,444 ± 0,176 1,400 ± 0,163 0,285 0,167 Mgu2 10 18 2,000 3,111 ± 0,200 2,889 ± 0,222 0,842 0,222 Mgu4 11 16 1,778 ± 0,222 2,222 ± 0,324 2,030 ± 0,287 0,776 0,344 Media ± SE 6,300 ± 2,830 0,637 ± 0,182

47 Capítulo II

II.3.2. Ajuste a la segregación genotípica esperada

Los microsatélites o STR (Short Tandem Repeats) empleados en este estudio fueron polimórficos en las nuevec familias de mejillón construidas. La familia menos polimórfica fue la F9 con un 60% de loci polimórficos, mientras que las familias F1 y F2 fueron polimórficas en todos sus loci (100%). El resto de las familias presentaron un 80% (F8) y un 90% (F3, F4, F5, F6 y F7) de loci polimórficos. La prueba de ji-cuadrado utilizada para testar el ajuste de los patrones genotípicos observados para diez loci microsatélites en nueve progenies, frente a los esperados, se proporciona en la Tabla II.3. El ajuste genotípico se efectuó considerando que las desviaciones de las proporciones genotípicas esperadas eran debidas a alelos nulos. Para efectuar el ajuste de la segregación observada fue necesaria la introducción de 55 alelos nulos en el conjunto de los diez loci (media de 5,5 genotipos parentales por locus, portadores de nulos) con una frecuencia global de nulos de ~0,16.

Tras las correcciones introducidas en los genotipos se validaron 64 segregaciones con ajuste aceptable, y 14 de ellas mostraron desviaciones significativas de la segregación mendeliana (18% de los 78 tests efectuados). Entre las segregaciones que presentaban desviaciones significativas, en seis tests (7,69%) se obtuvo una probabilidad 0,01 < p < 0,05, mientras que en ocho tests (10,25%) se obtuvo una probabilidad p < 0,01.

48 Capítulo II

Tabla II.3. Prueba de ji-cuadrado (χ2) aplicada en la evaluación de la segregación mendeliana de diez loci microsatélites, donde χ2 es el estadístico de la prueba; gl, son los grados de libertad, p (χ2) es la significatividad estadística de la prueba. Los valores de χ2 significativos (p < 0,05) se indican mediante un asterisco (*). Los alelos nulos están indicados mediante la letra “n”. En los casos de fijación alélica no se puede realizar la prueba (S). na, significa que no hubo amplificación por motivos ajenos al marcador.

Locus Familia N indiv. Genotipo Genotipo Genotipos observados Segregación Segregación χ 2 gl p (χ 2) progenie paterno materno en la descendencia Esperada observada Mgμ1 F1 41 134/142 134/134 134/134 : 134/142 1 : 1 13 : 21 1,882 1 0,170 F2 40 134/142 142/142 134/142 : 142/142 1 : 1 16 : 21 0,676 1 0,411 F3 35 134/142 134/142 134/134 : 134/142 : 142/142 1 : 2 : 1 6 : 23 : 5 4,294 2 0,117 F4 48 134/142 134/134 134/134 : 134/142 1 : 1 24 : 24 0,000 1 1,000 F5 40 134/134 134/142 134/134 : 134/142 1 : 1 25 : 15 1,136 1 0,287 F6 40 134/142 134/142 134/134 : 134/142 : 142/142 1 : 2 : 1 11 : 21 : 8 0,550 2 0,760 F7 28 134/142 142/142 134/142 : 142/142 1 : 1 15 : 11 0,114 1 0,735 F8 42 142/142 134/142 134/142 : 142/142 1 : 1 11 : 5 0,970 1 0,325 F9na 41 ------Mch5 F1 41 219/219 215/235 215/219 : 215/235 1 : 1 19 : 17 0,000 1 0,990 F2 40 219/n 209/n 209/219 : 219/n : 209/n : n/n 1 : 1 : 1 : 1 12 : 12 : 0 : 16 14,400 3 0,002* F3 35 219/225 219/225 219 : 219/225 : 225 1 : 2 : 1 14 : 10 : 7 7,480 2 0,024* F4 48 219/219 225/227 219/225 : 219/227 1 : 1 24 : 18 1,154 1 0,283 F5 40 225/227 219/219 219/225 : 219/227 1 : 1 17 : 12 0,867 1 0,352 F6 40 225/227 219/225 219/225 : 225 : 219/227 : 225/227 1 : 1 : 1 : 1 9 : 12 : 15 : 0 3,527 3 0,317 F7 28 219/n 219/n 219/219 + 219/n : n/n 3 : 1 19 : 9 0,018 1 0,894 F8 42 219/n n/n 219/n : n/n 1 : 1 15 : 24 0,068 1 0,794 F9na 41 ------Mgμ3 F1 41 138/140 138/140 138/138 : 138/140 : 140/140 1 : 2 : 1 11 : 18 : 12 0,659 2 0,719 F2 40 138/140 138/140 138/138 : 138/140 : 140/140 1 : 2 : 1 16 : 18 : 6 5,400 2 0,067 F3 35 140/n 140/n 140/140 + 140/n : n/n 3 : 1 32 : 3 11,956 1 0,003* F4 48 138/140 138/140 138/138 : 138/140 : 140/140 1 : 2 : 1 8 : 30 : 10 3,167 2 0,205 F5 40 138/140 138/140 138/138 : 138/140 : 140/140 1 : 2 : 1 9 : 21 : 10 0,150 2 0,928 F6 40 138/140 138/140 138/138 : 138/140 : 140/140 1 : 2 : 1 11 : 18 : 11 0,400 2 0,819 F7 28 n/n 138/140 138/n : 140/n 1 : 1 16 : 12 0,571 1 0,450 F8 42 132/140 140/140 132/140 : 140 1 : 1 15 : 27 1,797 1 0,180 F9 41 138/140 132/140 132/138 : 132/140 : 138/140 : 140 1 : 1 : 1 : 1 8 : 14 : 10 : 9 2,996 3 0,392 Mch8 F1 41 197/203 203/207 197/203 : 197/207 : 203 : 203/207 1 : 1 : 1 : 1 1 : 11 : 22 : 6 24,200 3 0,001* F2 40 203/205 203/205 203/203 : 203/205 : 205/205 1 : 2 : 1 13 : 16 : 8 2,027 2 0,363 F3 35 201/203 203/n 201/n : 203/n: 203/203 : 201/203 1 : 2 : 1 10 : 18 : 7 0,829 2 0,661 F4 48 203/207 207/207 203/207 : 207/207 1 : 1 22 : 23 0,000 1 0,989 F5 40 207/n 203/207 203/n : 207/207 : 207/n : 203/207 1 : 2 : 1 8 : 19 : 13 1,350 2 0,509 F6 40 201/203 203/n 201/n : 203/n : 203/203 : 201/203 1 : 2 : 1 16 :16 : 8 4,800 2 0,091 F7 28 199/201 n/n 199/n : 201/n 1 : 1 14 : 11 0,360 1 0,549 F8 42 199/199 199/203 199 : 199/203 1 : 1 19 : 21 0,004 1 0,951 F9 41 199/203 199/199 199 : 199/203 1 : 1 28 : 13 3,422 1 0,064 Mgμ5 F1 41 128/128 128/132 128/128 : 128/132 1 : 1 22 : 19 0,001 1 0,974 F2 40 122/130 130/130 122/130 : 130/130 1 : 1 7 : 33 16,900 1 0,001* F3 35 130/n 130/n 130/130 + 130/n : n/n 3 : 1 26 : 9 0,914 1 0,339 F4S 48 132/132 132/132 132/132 1 44 F5 40 132/n 132/n 132/132 + 132/n : n/n 3 : 1 33 : 7 1,200 1 0,273 F6 S 40 132/132 132/132 132/132 1 38 F7 28 132/n 132/n 132/132 + 132/n : n/n 3 : 1 22 : 6 1,786 1 0,181 F8 42 126/132 132/132 126/132 : 132/132 1 : 1 17 : 22 0,641 1 0,423 F9 41 126/132 132/132 126/132 : 132 /132 1 : 1 22 : 19 0,220 1 0,639

49 Capítulo II

Tabla II.3. (Continuación)

N indiv. Genotipo Genotipo Genotipos observados Segregación Segregación Locus Familia χ 2 gl p (χ 2) progenie paterno materno en la descendencia esperada observada Mgμ8 F1 41 192/196 196/196 192/196 : 196/196 1 : 1 18 : 20 0,105 1 0,746 F2 40 190/196 196/196 190/196 : 196/196 1 : 1 15 : 25 1,197 1 0,274 F3 35 186/196 196/196 186/196 : 196/196 1 : 1 13 : 17 1,146 3 0,766 F4 48 192/198 198/198 192/198 : 198/198 1 : 1 13 : 34 6,789 1 0,009* F5 40 198/n 198/n 198/198 + 198/n : n/n 3 : 1 36 : 4 7,162 1 0,007* F6 40 190/198 198/198 190/198 : 198/198 1 : 1 7 : 33 16,900 1 0,001* F7 28 198/n 198/n 198/198 + 198/n : n/n 3:1 22 : 6 1,786 1 0,181 F8 42 200/n 200/n 200/200 + 200/n : n/n 3:1 34 : 8 3,857 1 0,050 F9S 41 200/200 200/200 200/200 1 41 Mch3 F1 41 117/117 117/125 117/117 : 117/125 1 : 1 16 : 24 2,543 1 0,111 F2 40 125/125 117/125 125/125 : 117/125 1 : 1 19 : 19 0,000 1 1,000 F3 35 117/125 117/125 117/117 : 117/125 : 125 1 : 2 : 1 10 : 18 : 7 0,829 2 0,661 F4 48 125/n 117/125 117/n : 125/125 + 125/n : 117/125 1 : 2 : 1 12 : 24 : 12 0,000 2 1,000 F5 40 125/n 117/125 117/n : 125/125 + 125/n : 117/125 1 : 2 : 1 11 : 16 : 13 2,296 2 0,317 F6 40 125/n 117/125 117/n : 125/125 + 125/n : 117/125 1 : 2 : 1 2 : 22 : 12 8,996 2 0,011* F7S 28 101/101 107/107 101/107 1 24 F8 42 101/125 101/125 101/101 : 101/125 : 125/125 1 : 2 : 1 12 : 16 : 14 2,888 2 0,236 F9 41 101/125 111/125 101/111 : 101/125 : 111/125 : 125/125 1 : 1 : 1 : 1 9 : 13 : 0 : 19 3,316 3 0,345 Mch1 F1S 41 153/153 153/153 153/153 1 40 F2 40 153/153 153/163 153/153 : 153/163 1 : 1 20 : 15 0,714 1 0,398 F3S 35 153/153 153/153 153/153 1 35 F4 48 153/n 153/n 153/153 : 153/n : n/n 3 : 1 40 : 8 6,000 1 0,010* F5S 40 153/153 153/153 153/153 1 40 F6 40 153/n 153/n 153/153 + 153/n : n/n 3 : 1 36 : 6 9,459 2 0,009 F7S 28 153/153 153/153 153/153 1 28 F8 42 153/n 153/n 153/153 + 153/n : n/n 1 32 : 10 1,714 1 0,190 F9S 41 153/153 153/153 153/153 1 41 Mgμ2 F1 41 193/201 201/203 193/201 : 193/203 : 201/201 : 201/203 1 : 1 : 1 : 1 9 : 7 : 11 : 14 2,610 3 0,456 F2 40 201/n 201/n 201/201 + 201/n : n/n 3 : 1 33 : 7 4,524 1 0,033* F3 35 189/203 201/203 189/201 : 189/203 : 201/203 : 203/203 1 : 1 : 1 : 1 6 : 7 : 14 : 8 4,429 3 0,219 F4 48 165/205 183/205 165/205 : 165/183 : 183/205 : 205/205 1 : 1 : 1 : 1 15 : 0 : 14 : 9 14,842 3 0,002* F5 40 165/n 205/n 165/n : 165/205 : 205/n : n/n 1 : 1 : 1 : 1 11 : 7 : 5 : 11 3,176 3 0,365 F6 40 165/n 165/205 165/n : 165/205 : 205/n 1 : 2 : 1 7 : 19 : 7 0,303 2 0,860 F7 28 165/165 199/n 165/n : 165/199 1 : 1 12 : 11 0,000 1 0,998 F8 42 165/183 199/n 165/199 : 165/n : 183/199 : 183/n 1 : 1 : 1 : 1 11 : 7 : 7 : 6 1,903 3 0,593 F9 41 175/183 199/n 175/199 : 175/n : 183/199 : 183/n 1 : 1 : 1 : 1 10 : 10 : 4 : 16 7,200 3 0,066 Mgμ4 F1 41 183/199 183/199 183/183 : 183/199 : 199/199 1 : 2 : 1 5 : 23 : 9 3,054 2 0,217 F2 40 165/n 183/n 165 : 165/183 : 183 : n/n 1 : 1 : 1 : 1 9 : 12 : 9 : 10 1,251 3 0,741 F3 35 183/n n/n 183/n : n/n 1 : 1 15 : 16 0,863 1 0,353 F4 48 173/183 183/173 173/173 : 173/183 : 183/183 1 : 2 : 1 6 : 23 : 13 2,714 2 0,257 F5 40 183/187 183/187 183/183 : 183/187 : 187/187 1 : 2 : 1 5 : 23 : 9 3,054 2 0,217 F6na 40 ------F7 28 197/n 177/n 177/n : 177/197 : 197/n : n/n 1 : 1 : 1 : 1 5 : 4 : 8 : 11 3,158 3 0,368 F8 42 189/n 171/n 171/n : 171/189 : 189 /n: n/n 1 : 1 : 1 : 1 8 : 8 : 2 : 24 10,108 3 0,018* F9 41 171/191 n/n 171/n: 191/n 1 : 1 26 : 13 4,333 1 0,037*

50 Capítulo II

II.3.3. Potencia de asignación de los marcadores

La probabilidad de asignación de cada descendiente a una familia biparental usando los genotipos microsatélites multilocus fue calculada con VITASSIGN y se muestra en la Tabla II.4. La potencia de asignación única esperada por simulación de 2.000 descendientes fue del 92,75%. La asignación real total conseguida con los diez microsatélites fue del 96,34%. La asignación sin mismatch ascendió a 64,79% y con un mismatch al 32%.

Tabla II. 4. Asignación parental obtenida de descendientes (N) a su familia de origen. Asignación perfecta: número de individuos (n) y porcentaje de adscripción (%) a una sola familia; asignación con 1 mismatch, número de individuos y porcentaje de adscripción a una sola familia; asignación total, suma de asignación perfecta y asignación con 1 mismatch.

Asignación perfecta Asignación con 1 mismatch Asignación total Familia N N % N % N % F1 41 41 100,00 0 0,00 41 100,00 F2 40 12 30,00 20 50,00 32 80,00 F3 35 22 62,86 13 37,00 35 100,00 F4 48 41 85,42 7 15,00 48 100,00 F5 40 29 72,50 11 28,00 40 100,00 F6 40 33 82,50 7 18,00 40 100,00 F7 28 7 25,00 17 61,00 24 85,71 F8 42 18 42,86 23 55,00 41 97,62 F9 41 27 65,85 14 34,00 41 100,00 Total 355 230 64,79 112 32,00 342 96,34

51 Capítulo II

II.4. Discusión

II.4.1. Diversidad alélica en la generación parental

La cantidad de 6,3 alelos por locus en la generación parental es baja pero esperada dado el bajo número de familias biparentales construidas. Algunos loci resultaron de baja utilidad (Mch1) por estar fijados en el 90% de los progenitores. Como dato comparativo, el número de alelos/locus en estudios poblacionales con estos microsatélites ascendió a 12,655 ± 6,354 (con 7 microsatélites de M. galloprovincialis, Ouagajjou y Presa, 2015), a 18,666 ± 7,230 (para 6 marcadores microsatélite de M. galloprovincialis de la Ría de Vigo, Diz y Presa, 2009), o a 19,500 ± 6,285 (para 6 microsatélites de M. galloprovincialis en el Atlántico, Diz y Presa, 2008).

El polimorfismo registrado en los diez marcadores se vio reducido en algunas familias, bien por azar de muestreo, bien por fallos experimentales (calidad de ADN, posición del locus, inhibición en coamplificación, etc.), p. ej. en la familia F9 sólo se consiguió un 60% de loci polimórficos por fallo en la coamplificación del dúplex Mgμ1 - Mch5 (20% de loci) y por fijación alélica azarosa (20% de loci). Dado que más del 90% de loci fueron polimórficos en el resto de las ocho familias, existe un polimorfismo suficiente en la generación parental para estudiar las desviaciones a la segregación esperada en presencia de alelos nulos y también para calcular la potencia de asignación de progenies a sus familias de origen. La potencia de asignación es similar a la de otros estudios; por ejemplo se obtuvieron valores superiores al 99% en cruzamientos de lubina (Dicentrarchus labrax) y superiores al 95% en carpa común (Cyprinus carpio) y trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) (Vandeputte et al., 2011), mientras que en Mytilus galloprovincialis se obtuvo entre el 94,75 y el 99% de asignación (Pino-Querido et al., 2015).

II.4.2. Ajuste genotípico a la segregación mendeliana

Las 14 tests significativos de ajuste a las segregaciones esperadas surgen tras la inclusión de alelos nulos necesarios para explicar las desviaciones a las segregaciones observadas. El número elevado de desviaciones inesperadas (18%) implica que no sólo se puedan asumir como debidas a error tipo I, i.e., no es asumible un rechazo aleatorio de la

52 Capítulo II hipótesis nula. Tampoco es asumible el error tipo I si se consideran solamente los desvíos significativos con probabilidad del 0,01 (10% de tests). Por ello debe de haber otros motivos para explicar las segregaciones atípicas que no se han podido descartar. Varias especies de moluscos bivalvos han mostrado distorsiones en la segregación mendeliana en estudios realizados con marcadores genéticos, lo cual acarrea problemas en el diseño de su mapa de ligamiento (Hare et al., 1996; Launey y Hedgecock, 2001). Por ejemplo, se ha registrado una distorsión significativa en la etapa larvaria de Crassostrea gigas y Ostrea edulis en aproximadamente un tercio de las pruebas de segregación de microsatélites (Naciri et al., 1995). También en Crassostrea virginica se observó el desvió de lo esperado en la dirección tanto del exceso de heterocigotos como de su déficit a partir de segregación de emparejamientos biparentales (Reece, 2004).

Aunque es sabido que los alelos nulos son un problema técnico, responsable de gran parte de las desviaciones genotípicas esperadas en moluscos (Presa et al., 2002), no se descartan en éstos otros motivos técnicos o funcionales. Por ejemplo, se pueden observar clases genotípicas inesperadas por a) intercambio de individuos entre familias, bien a nivel de batea, bien a nivel de extracción de ADN o a nivel de diseño de las migraciones electroforéticas, b) causas funcionales como una menor viabilidad de determinados genotipos en fase con regiones selectivas del genoma. Por ejemplo, se ha sugerido la existencia de una fuerte selección cigótica durante la etapa larvaria como causa de la distorsión de segregación en la ostra plana (Ostrea edulis) (Naciri et al., 1995), un fenómeno que ha sido también observado experimentalmente en familias de Crassostrea gigas (Launey y Hedgecock, 2001).

Los alelos nulos no son visibles en estudios poblacionales, pero pueden ser deducidos en estudios con progenies experimentales (Estoup et al., 1993; Van Oosterhaut et al., 2004). Los 55 alelos nulos necesarios para explicar las segregaciones observadas implica la inclusión de un alelo nulo por locus, que afecta a 5,5 genotipos parentales por locus e implica una frecuencia global de nulos de ~0,16. El reparto de dicha frecuencia media entre loci es desigual, i.e., frecuencia cero de nulos en el marcador Mgu1 y 0,344 en el marcador Mgu4. Esa frecuencia media de alelos nulos en el sistema puede ser corregida en estudios experimentales de asignación cuando se dispone de los genotipos parentales,

53 Capítulo II como en este caso, pero resulta más complicado en estudios poblacionales. En éstos se asigna el déficit de heterocigotos a la frecuencia de alelos nulos, asumiento que son los responsables de tal desequilibrio (Callen et al., 1993), pero dicha asunción es, en el mejor de los casos, incierta.

Puesto que uno de los objetivos de este estudio es la comparación de las estimas de alelos nulos en segregaciones controladas frente a genotipados poblacionales, en el caso aplicado de la segunda parte del capítulo se aborda la bondad del ajuste entre ambas estimas, las causas de sus posibles desviaciones y los efectos que la asunción de alelos nulos tiene en estudios poblacionales (p. ej. Pita et al., 2011).

II.4.3. Potencia de asignación de los marcadores

La potencia de asignación única esperada por simulación de 2,000 descendientes del 92,75% no es demasiado elevada para estudios que requieran un bajo error diagnóstico, tales como paternidad en humanos o criminalística. Por ejemplo, en esas disciplinas no sería asumible un 64,79% de asignación sin mismatches o la asunción de un mismatch para alcanzar el 96,34% de asignación. Sin embargo, dicha asignación total observada del 96,34% con un mismatch, se encuentra en el rango común publicado en otras especies, tales como peces (99% en lubina, Dicentrarchus labrax) y superiores al 95% en carpa común (Cyprinus carpio) y trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) (Vandeputte et al., 2011). Este nivel de resolución se entiende suficiente para estudios poblacionales en los que la pérdida de señal por subestima alélica (alelos nulos invisibles y menor heterocigosidad) se ve compensada por el elevado polimorfismo de estos marcadores (Chapuis y Estoup, 2007). No obstante, en el ejemplo aplicado de este trabajo, se estudia la pérdida de señal poblacional con y sin corrección genotípica en presencia de alelos nulos.

54 Capítulo II

II.5. Caso Práctico: Composición genética de Mytilus galloprovincialis en el Mar de Alborán: efectos del cómputo de alelos nulos

II.5.1. Introducción

Los productores de mejillón M. galloprovincialis del Mar de Alborán indican que diversos stocks de mejillón han sido o están siendo introducidos en fase de semilla, procedente de otras regiones, para el refuerzo del cultivo local. La mezcla de esos stocks podría producir un aumento deseable de la heterosis en el cultivo, pero tanto los acuicultores como los gestores y los políticos no pueden obviar las problemáticas ambientales y biológicas derivadas de la introducción de semilla exótica. En este caso aplicado evaluamos la capacidad una batería de 10 microsatélites testados en la fase anterior, para identificar fenómenos de mezcla poblacional, y evaluamos el ruido o desviación que producen los alelos nulos en la señal poblacional.

II.5.2. Material y métodos

II.5.2.1. Muestreo y extracción de ADN

Para evaluar este objetivo se realizó un muestreo en tres poblaciones de mejillón del Mar del Alborán. Por un lado se muestrearon 42 individuos de los sistemas de cultivo empleados en el Mar de Alborán, en la provincia de Málaga (36°44'10.7"N 4°04'37.6"W) (Figura II.1). Por otro lado, se muestrearon las dos poblaciones susceptibles de producir semilla para su posterior introducción en el Mar de Alborán: el stock atlántico gallego y el stock adriático. La muestra recogida en la fachada atlántica de Galicia, consistió en 52 individuos obtenidos en la Ría de Arousa (42°31'09.0"N 8°59'54.2"W), mientras que en la costa italiana del Mar Adriático se muestrearon 95 individuos de la Región del Veneto (45°13'22.4"N 12°15'58.1"E) (Figura II.1). De cada individuo se conservó el manto en etanol 95% para la preservación del ADN, que fue extraído posteriormente en el laboratorio siguiendo un protocolo específico diseñado para resina Chelex (Walsh et al., 1991).

55 Capítulo II

Figura II.1. Situación geográfica del origen de las muestras de tres poblaciones europeas de M. galloprovincialis empleadas en este estudio (▲, Mar de Alborán; ■, Ría de Arousa; ●, Mar Adriático).

II.5.2.2. Genotipado con microsatélites

Todos los individuos muestreados (189 individuos) se genotiparon con diez marcadores microsatélites, tal como se describe en la subsección II.2.3.

II.5.2.3. Análisis de los datos

La presencia de alelos nulos en el conjunto de datos se evaluó con el programa estadístico MICROCHECKER (Van Oosterhaut et al., 2004). Los parámetros genéticos tales como las frecuencias génicas, el número de alelos (A), la riqueza alélica (RS), el índice de fijación, FIS, y el parámetro de diferenciación entre poblaciones, FST, se calcularon con el programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 1995). El ajuste de las poblaciones genotípicas al equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE), la heterocigosidad esperada (HE) y la heterocigosidad observada (HO), se calcularon con GENEPOP 4.6 (Raymond y Rousset, 1995). La estructura poblacional de M. galloprovincialis se visualizó mediante un análisis de componentes principales (PCoA) realizado con el programa GenALEx 6.5 (Peakall y Smouse, 2012). La estructura poblacional se analizó también con el modelo espacial de frecuencias no correlacionadas (Guillot et al., 2005a) implementado en el programa

56 Capítulo II

Geneland 4.0 (Guillot et al., 2005b) diseñado para R. Además se realizó un test de asignación de individuos a las tres poblaciones de referencia y se estimó la presencia de migrantes de primera generación con el programa GeneClass 2.0 (Piry et al., 2004). El test de asignación se programó tanto para el criterio establecido por Baudouin y Lebrun (2000) como para el definido por Rannala y Mountain (1997), empleando el algoritmo de simulación de Paetkau et al. (2004), para simular 10.000 individuos. La detección de migrantes de primera generación se llevó a cabo bajo el criterio de Rannala y Mountain (1997) y el algoritmo de simulación de Paetkau et al. (2004) utilizando la razón de verosimilitud L_home / L_max. Por último se evaluó la existencia de híbridos entre individuos procedentes de semilla importada, con el programa NewHybrids 1.1 (Anderson y Thompson, 2002) utilizando 105 sweeps como burnin y 106 sweeps a continuación. Todos los análisis anteriores de divergencia entre muestras se efectuaron con dos matrices genotípicas: una considerando los datos brutos observados, i.e., frecuencias génicas y genotípicas de alelos visibles, otra considerando un ajuste de las proporciones genotípicas para encajar la frecuencia de alelos nulos, según la estima efectuada con el algorimo del programa FreeNa (Chapuis y Estoup, 2007).

57 Capítulo II

II.5.3. Resultados y discusión

II.5.3.1. Diversidad genética de los marcadores

Tras la revisión de las lecturas realizadas en el ALFexpress por parte de tres investigadores, se descartaron los marcadores Mgµ1 y Mch3. En el caso del marcador Mgµ1 sólo presentó alelos en la población gallega pero falló su amplificación en los otros dos stocks. En el caso del marcador Mch3, la baja señal de las amplificaciones aconsejó su descarte para evitar la introducción de sesgo artificial en los datos. El número observado de alelos fue elevado en las tres muestras del estudio, varió entre 3 de Mgµ3 y 28 de Mgµ8 y fue proporcional al tamaño muestral de cada stock (Tabla II.5). La riqueza alélica mostró el mismo patrón que el número de alelos y no difirió entre stocks. La heterocigosidad observada resultó significativamente menor que la esperada, proporcionando índices de fijación intrapoblacional muy significativos y desajuste a las proporciones genotípicas esperadas en el equilibrio de Hardy-Weinberg (Tabla II.5). No se observaron diferencias significativas entre muestras para ninguno de los parámetros de diversidad.

II.5.3.2. Estimación de alelos nulos

La frecuencia de alelos nulos en cada muestra para los ocho marcadores finalmente analizados, resultó elevada (>10%) en los tres stocks (Tabla II.6). En la tabla se muestra además las estimas de la frecuencia de alelos nulos efectuadas sobre la segregación de las familias (primera parte del capítulo). Las estimas de nulos efectuadas sobre la segregación son ligeramente mayores a las estimadas con los programas de detección de nulos basados en el defecto de heterocigotos.

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Tabla II.5. Parámetros genéticos básicos de diversidad de microsatélites en los tres stocks de cultivo muestreados. Para cada locus se muestra el número de alelos (A), la riqueza alélica (RS), la heterocigosidad observada (HO), la * heterocigosidad esperada (HE) y el índice de fijación FIS. El asterisco ( ) indica valores de p significativos (p < 0,05) para el test de Hardy-Weinberg realizado con el programa Genepop.

Parámetro Mar Adriático Mar de Alborán Océano Atlántico Locus N 95 42 52 A 22 17 14 RS 13,928 14,211 12,807 Mgµ2 HO 0,434 0,447 0,367 HE 0,818 0,862 0,849 * * * FIS 0,470 0,482 0,568 A 3 3 4 RS 2,631 2,988 3,937 Mgµ3 HO 0,371 0,551 0,463 HE 0,316 0,556 0,595 * FIS -0,172 0,009 0,222 A 13 14 14 RS 11,270 11,796 12,480 Mgµ4 HO 0,613 0,654 0,714 HE 0,906 0,902 0,896 * * * FIS 0,323 0,275 0,203 A 9 6 8 RS 6,911 6,000 6,516 Mgµ5 HO 0,349 0,320 0,487 HE 0,584 0,600 0,625 * * FIS 0,403 0,467 0,220 A 28 21 24 RS 21,266 19,864 20,987 Mgµ8 HO 0,554 0,700 0,632 HE 0,952 0,956 0,951 * * * FIS 0,418 0,268 0,336 A 4 5 4 RS 3,714 4,503 3,737 Mch1 HO 0,296 0,273 0,032 HE 0,607 0,344 0,157 * * FIS 0,512 0,208 0,795 A 11 10 11 RS 8,191 8,706 8,790 Mch5 HO 0,430 0,460 0,524 HE 0,794 0,808 0,779 * * * FIS 0,458 0,431 0,327 A 7 6 7 RS 6,121 5,691 6,247 Mch8 HO 0,441 0,531 0,460 HE 0,577 0,648 0,661 * * * FIS 0,236 0,180 0,305

59 Capítulo II

Tabla II.6. Frecuencia de alelos nulos para cada marcador microsatélite, estimada con el programa FreeNa en cada una de las tres muestras de mejillón.

Media nulos Estima de nulos Locus Mar Adriático Mar de Alborán Océano Atlántico Stocks por segregación Mgµ2 0,2104 0,2237 0,2498 0,228+0,020 0,222 Mgµ3 0,0000 0,0288 0,0997 0,043+0,051 0,111 Mgµ4 0,1515 0,1239 0,0827 0,119+0,035 0,344 Mgµ5 0,1295 0,1558 0,0527 0,113+0,054 0,167 Mgµ8 0,1992 0,1253 0,1543 0,160+0,037 0,167 Mch1 0,1931 0,0691 0,1628 0,142+0,065 0,167 Mch5 0,2062 0,1912 0,1292 0,176+0,041 0,219 Mch8 0,1063 0,0983 0,1098 0,105+0,006 0,139

II.5.3.3. Diferenciación entre stocks

A partir de aquí los análisis de divergencia entre stocks se efectúan con dos aproximaciones genotípicas. La primera de ellas basada en los alelos visibles, i.e., la estima tradicional de genotipos observados, y la segunda de ellas basada en una corrección de genotipos según la frecuencia de nulos estimada en las poblaciones, de modo que se efectuó un reajuste genotípico para encajar al alelo nulo segregante. Con esta medida se buscaba comparar el sesgo interpretativo que la computación o no de nulos incorporaría a las interpretaciones de divergencia poblacional.

II.5.3.4. Índice de fijación entre poblaciones

La variación genética entre las tres muestras del estudio fue alta y significativa (FST = 0,0545, p = 0,0001). La diferenciación genética por pares resultó significativa entre el la muestra adriática y las otras dos, i.e., Stock Adriático vs. Stock Atlántico (FST = 0,0589, p

= 0,0167) y entre Stock Adriático vs. Stock Alborán (FST = 0,0632, p =0,0167), mientras que la comparación entre el Stock Atlántico y el Stock del Mar de Alborán no fue significativa (FST = 0,0087, p = 0,0500). Las estimas de distancia FST entre pares de stocks fueron sistemáticamente mayores sin corrección de alelos nulos (sobre la diagonal de la Tabla II.7) que con su corrección (bajo la diagonal de la Tabla II.7).

Puesto que los índices de divergencia entre stocks son de mismo orden con ambos cuerpos de datos, su efecto sobre la interpretación de la divergencia a escalas de diferenciación elevadas (superiores al nivel de subpoblaciones) no son significativas. Sí

60 Capítulo II podrían resultar importantes dichas diferencias cuando los niveles de diferenciación fueran más bajos, lo que exigiría implementar un diseño experimental distinto.

La divergencia en el seno del Atlántico, i.e., entre las muestras de Galicia y de Alborán, corresponde con un nivel intraespecífico dentro de población, y por ello ambas muestras forman una metapoblación descrita anteriormente con estos marcadores (Diz y Presa, 2008). La divergencia entre las muestras atlánticas (Galicia y Mar de Alborán) y la del Mar Adriático es elevada y corresponde con la distancia observada entre subpoblaciones de esta especie (p. ej. Ouagajjou y Presa, 2015).

Tabla II. 7. Comparación por pares de la FST. Sobre la diagonal valores de FST calculados con las frecuencias genotípicas observadas, bajo la diagonal valores de FST calculados con las frecuencias genotípicas corregidas para alelos nulos.

Mar Adriático Mar de Alborán Océano Atlántico Mar Adriático - 0,0632* 0,0589* Mar de Alborán 0,0520* - 0,0087 Océano Atlántico 0,0473* 0,0062 -

II.5.3.5. Análisis de Coordenadas Principales

En ambos tratamientos genotípicos, la primera coordenada del PCoA separó claramente la muestra gallega de la muestra adriática, mientras que con la segunda coordenada se observó la diferenciación entre esas dos muestras y la muestra del Mar de Alborán (Figura II.2A). El número de unidades genéticas presentes en el conjunto de datos fue de K = 2, diferenciando la muestra adriática del stock formado por la muestra gallega y la del Mar de Alborán (Figura II.2B). No existen diferencias entre los dos tratamientos genotípicos, en la distribución de la varianza en ambos ejes. Al menos el tratamiento de la varianza molecular efectuado con PCoA no ejerce ningún sesgo interpretativo entre cuerpos de datos estos niveles de divergencia genética intraespecífica.

61 Capítulo II

Figura II.2. Análisis de coordenadas principales realizado con el programa GenAlEx sobre la matriz genotípica observada (A) y sobre la matriz genotípica corregida para alelos nulos (B).

II.5.3.6. Cálculo bayesiano del número de grupos génicos

No se apreció diferencia en la probabilidad a posteriori de pertenencia de cada muestra a uno de las dos subpoblaciones regionales de M. galloprovincialis (Figura II.3), i.e., la atlántica y la mediterránea. Por tanto a este nivel de análisis tampoco hay un efecto significativo de la corrección para alelos nulos en los estudios poblacionales.

Figura II.3. Estructura poblacional en grupos obtenida mediante análisis bayesiano implementado en el programa Geneland, utilizando unidades genéticas diferenciadas con alelos visibles (A) y unidades genéticas diferenciadas con corrección para alelos nulos (B). La región amarilla muestra las probabilidades de pertenencia a la subpoblación atlántica (Atlántico y Alborán) y en rojo aquella para la subpoblación mediterránea (Mar Adriático). Eje de abscisas (latitud), eje de ordenadas (longitud).

62 Capítulo II

II.5.3.7. Detección de migrantes de primera generación con alelos visibles

El número total de migrantes de primera generación detectados en el conjunto de datos fue de 12. De los tres migrantes detectados en la muestra adriática, dos se asignaron a la muestra gallega (ITA29, ITA91) y el otro a la del Mar de Alborán (ITA81). En el la muestra gallega (ocho migrantes detectados) cinco individuos se asignaron al Mar de Alborán (GAL2, GAL4, GAL18, GAL32, GAL42) y tre al adriático (GAL34, GAL37, GAL38). Por último, el migrante de primera generación detectado en el Mar de Alborán (ALB3) se asignó a la muestra gallega.

II.5.3.8. Detección de migrantes de primera generación con frecuencias génicas y genotípicas corregidas para nulos

El número total de migrantes de primera generación detectados en el conjunto de datos fue de siete. Sólo se detectó un migrante en el Adriático (ITA29) asignado a la muestra gallega. En la muestra gallega (5 migrantes detectados) 3 individuos (GAL2, GAL4, GAL42) se asignaron al Mar de Alborán y 2 (GAL34, GAL38) al Adriático. Por último, el migrante de primera generación detectado en el Mar de Alborán (ALB3) se asignó como procedente de la muestra gallega.

El número de migrantes de primera generación detectados sin corrección de nulos es el doble de aquel detectado con corrección de nulos. Esta corrección por tanto otorga menos sensibilidad en la detección que la ausencia de la misma, tal como se indicó en trabajos similares con microsatélites sobre poblaciones (Pita et al., 2011).

II.5.3.9. Detección de migrantes e híbridos

El análisis de híbridos efectuado por el programa NewHybrids sin la corrección para alelos nulos clasificó el 85% de la muestra de Alborán (44 individuos) como perteneciente a la subpoblación atlántica, si tenemos en cuenta aquellos valores de probabilidad posterior de pertenencia superiores a 0,5. El 15% de los individuos restantes (8) se asignaron a la subpoblación mediterránea (Figura II.4A).

El análisis de híbridos efectuado mediante el programa NewHybrids con la corrección para nulos clasificó el 90% de la muestra de Alborán (47 individuos) como perteneciente

63 Capítulo II a la subpoblación atlántica, si tenemos en cuenta aquellos valores de probabilidad posterior de pertenencia superiores a 0,5. El 10% de los individuos restantes (5) se asignaron a la subpoblación mediterránea (Figura II.4A).

En ambos tratamientos la probabilidad posterior de la existencia de híbridos en el Mar de Alborán (F1 y F2) fue menor de 0,05 en todos los individuos excepto en uno con probabilidad 0,10 de ser un individuo de F2 (Figuras II.4A, II.4B).

Figura II.4. Probabilidad posterior de cada individuo muestreado en el Mar de Alborán (expresada en porcentaje) de pertenecer a cada una de las siguientes categorías: linaje atlántico (gris oscuro), linaje mediterráneo (gris claro), F1 (negro) y F2 (blanco) según Newhybrids. Calculado a partir de frecuencias génicas observadas (A) y a partir de las frecuencias génicas corregidas para alelos nulos (B).

64 Capítulo II

II.5.4. Conclusiones

1) En estimas de diferenciación a nivel de subpoblación, p. ej. FST > 0,05, las diferencias entre poblaciones observadas con y sin corrección de las frecuencias génicas y genotípicas para alelos nulos, no son significativas en ninguno de los tratamientos de la variación molecular y la diferenciación genética. 2) Las diferencias entre matrices genotípicas son más acusadas en tareas de detección más finas, como las asignaciones bayesianas a grupos génicos para el cálculo de migrantes y de híbridos. En estos casos la corrección artificial efectuada en este trabajo empeora o disminuye la detección de los mismos respecto al uso de las frecuencias de alelos visibles. 3) La población del Mar de Alborán puede contener hasta un 15% de composición génica del Mar Adriático, por introducción de semilla exótica. Originalmente la población del Mar de Alborán es atlántica, por lo que un 15% de introgresión representa una tasa muy elevada para la escasa población local. 4) Son varios los stocks de mejillón que han sido o están siendo cultivados en el Mar de Alborán. La mezcla de estos stocks podría producir un aumento deseable de la heterosis en el cultivo del mejillón, pero tanto los acuicultores como los gestores y los políticos no pueden obviar las problemáticas ambientales y el riesgo de homogenización genética derivados de la introducción de semilla en este stock.

65 Capítulo II

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70

Capítulo III. Asignación de origen de la semilla desde el criadero hasta la cosecha del mejillón Mytilus galloprovincialis

Capítulo III

III.1. Introducción

La producción mundial del mejillón procedente de la acuicultura ha aumentado de forma continua desde las 70.000 toneladas al principio de los años 50 del S.XX hasta 1.755.694 toneladas en 2013 (FAO, 2016). En 2017 las empresas acuícolas españolas produjeron 275.128 t de moluscos, de las cuales el 97.01% correspondió al cultivo del mejillón mediterráneo (Mytilus galloprovincialis, Lamarck, 1819) en las Rías Gallegas, generando unos beneficios de 121.953.289 € (JACUMAR, 2017). En la actualidad existen en las Rías Gallegas 3.515 bateas dedicadas al cultivo de moluscos, de las cuales 3.337 están dedicadas al mejillón, 107 al cultivo de ostras y las 71 restantes contienen un cultivo mixto de mejillones y ostras. La Ría de Arousa es la ría que presenta mayor número de bateas (2.460), casi el 70% del total en Galicia, y llegó a alcanzar un máximo de 3.890 bateas entre 1972 y 1984 (Méndez-Martínez et al., 2011). La mayoría de la producción local se consume en España, bien en fresco (1,2 kg/año per cápita; 50-70 cents/kg en origen) bien en conserva (0,3 kg/año; 40 cents./kg en origen) (González-Laxe y Martín-Palmero, 2014).

El éxito de la miticultura local es debido, en parte, a la elevada producción primaria de las Rías Gallegas (Prego et al., 1999), fenómeno provocado por la combinación de agua oceánica rica en nutrientes que entra en las costas y rías durante los eventos de afloramiento y los patrones de circulación locales (Bode et al., 1996). Esa productividad fitoplanctónica permite una alta densidad larvaria durante la época de desove, que tiene lugar entre el inicio de la primavera y el principio del verano, tanto de mejillón como de otras especies cuyas larvas presentan fases planctónicas, i.e., ≈ 20 x 103 larvas/m3 en mar abierto (Cáceres-Martínez y Figueras, 1998a).

La semilla necesaria para el cultivo en suspensión en bateas se obtiene por los “bateeiros” de dos maneras diferentes, bien extrayendo la mejilla del intermareal rocoso, bien mediante la colocación de cuerdas colectoras cortas suspendidas en las bateas (Fuentes et al., 1998). Por ello, la disponibilidad de mejilla procedente del medio natural ha desempeñado un papel decisivo en el desarrollo del cultivo de mejillón en Galicia, así como en el crecimiento de toda la industria mejillonera (Cáceres-Martínez y Figueras, 1998b). El aumento de competitividad en el sector acuícola dedicado al marisco, ha provocado un incipiente crecimiento en la investigación de varios campos relacionados

73 Capítulo III con ese sector, tales como las estrategias de manejo costero y estuarino (Brigolin et al., 2009), la mejora de colectores y dispositivos de cultivo (Aghzar et al., 2012), la optimización nutricional de las dietas (Miñambres et al., 2011; Nevejan et al., 2007) o el estudio de procesos fisiológicos y conductuales relacionados con el cultivo (Liu et al., 2011). Sin embargo, existen varios factores que pueden afectar negativamente al cultivo y que ponen en peligro el aumento de la productividad o incluso la sostenibilidad de las cosechas. Dichos factores son los depredadores (Beadman et al., 2003), las ciclogénesis (Harger y Landenberger, 1971), la contaminación industrial (Lado-Ínsua et al., 2011) o las proliferaciones de algas nocivas (PAN), cuya frecuencia e intensidad están aumentando debido a causas climáticas y antropogénicas (Anderson et al., 2012).

Para poder atajar las pérdidas de productividad del cultivo del mejillón, sería recomendable la aplicación de un enfoque innovador, resultado de combinar las tecnologías de predicción ambiental con el cultivo de estirpes seleccionadas artificialmente. Ese enfoque nos permitiría acortar o reeditar el ciclo de cultivo tradicional, que hoy en día consta de 5 grandes etapas, i.e., recolección de semilla, siembra, desdoble, engorde y cosecha (Figueras, 2007), como ya se ha mencionado con más detalle en la Introducción general.

El conocimiento preciso del ciclo reproductivo y la nutrición del mejillón (p. ej., Miñambres et al., 2011; Villalba, 1995) y las estimas recientes de heredabilidad de diferentes caracteres relacionados con el crecimiento, tanto en Mytilus edulis (i.e., h2 = 0,230 para la longitud valvar; h2 = 0,392 para el peso corporal) (Alcapán et al., 2007) como en M. galloprovincialis (h2 = 0,640 para longitud valvar; h2 = 0,350 para el peso corporal) (Nguyen et al., 2014), sugieren que la selección artificial de juveniles podría ser efectiva en criadero para lograr una reducción de la extensión del ciclo de producción. Sin embargo se desconoce si la producción potencial que se obtendría en cosecha procedería o no, en parte o en su totalidad, de la semilla seleccionada en el criadero (i.e., 20 – 24 meses antes). Ello es debido a la gran cantidad de larvas planctónicas circundantes en el medio natural, que pueden ser reclutadas en las cuerdas en suspensión y a la poca información existente sobre la competencia entre la semilla reclutada y el asentamiento postlarvario (Cáceres-Martínez y Figueras, 1998a).

74 Capítulo III

Desde la primera caracterización de los marcadores microsatélites en peces hace algo más de dos décadas (Estoup et al., 1993), éstos han sido incorporados progresivamente en estudios de genética de poblaciones (p. ej., Presa et al., 1994) y posteriormente en programas de cría de distintas especies (Vandeputte et al., 2011) así como en estudios relacionados con la asignación de stocks, la trazabilidad genealógica o la identificación individual (Chistiakov et al., 2006). La incorporación del genotipado multilocus como tecnología de apoyo en la producción de mejillón es particularmente relevante, puesto que puede contribuir al manejo genético de poblaciones de origen natural (Diz y Presa, 2009), así como en el incremento de la productividad en criadero a través de la selección asistida por marcadores (Moen et al., 2009).

La utilización de una progenie de mejillones de hermanos completos cultivados en criadero y de una batería de seis marcadores microsatélites, nuestro objetivo ha consistido en calcular el momento, el lugar de fijación, la tasa de fijación y el porcentaje de semilla natural que es reclutada en las cuerdas de cultivo, que fueran originalmente sembradas con juveniles seleccionados en el criadero. El conocimiento de estas variables nos permitiría evaluar la identidad final de la población cosechada, aumentar la eficiencia del cultivo y rediseñar el ciclo de producción de acuerdo con las características de crecimiento del mejillón en cada zona geográfica. Pretendemos saber más específicamente: 1) cuándo y dónde se lleva a cabo el reclutamiento a lo largo de la manga de la cuerda y su impacto sobre cuerdas protegidas y desprotegidas, 2) la proporción de inmigrantes en cosecha, que han sido reclutados en las cuerdas sembradas inicialmente, 3) las implicaciones prácticas y la viabilidad de cultivar en suspensión estirpes de mejillón seleccionadas en criadero para caracteres de interés.

75 Capítulo III

III.2. Material y métodos

III.2.1. Diseño experimental y cultivo de la progenie

En octubre de 2007 se construyeron varias progenies de hermanos completos de M. galloprovincialis en la Estación de Ciencias Marinas (ECIMAT) situada en la isla de Toralla (Vigo), al objeto de llevar a cabo el diseño experimental que requiere esta investigación. En resumen, una treintena de mejillones maduros procedentes de la Ría de Vigo (noroeste de la Península Ibérica) se mantuvieron a 4ºC durante la noche, se lavaron con agua de mar y se sumergieron individualmente en un vaso con agua de mar filtrada (1 μm) y esterilizada con lámparas UV. El desove se indujo tras sumergir los vasos en un baño termostático que contenía agua corriente a 23ºC. A los individuos se les permitió completar su desove y cada lote de ovocitos se filtró a través de un tamiz de 40 μm y se sumergió en un vaso de precipitados que contenía agua de mar filtrada y esterilizada. A continuación, mediante el uso de un microscopio se realizó el conteo de los gametos y se evaluó la calidad de éstos. En el caso de los ovocitos, su estado de madurez se evaluó mediante la observación de su redondez y en el caso de los gametos masculinos (espermatozoides) se examinó su motilidad. Tras evaluar la calidad y la densidad de los gametos, éstos se mezclaron siguiendo una proporción 8:1 (espermatozoide:ovocito) a fin de llevar a cabo la fecundación.

Una vez efectuada la fecundación se contaron los ovocitos fertilizados a través de la inspección de su segundo cuerpo polar y se emplazaron en un tanque troncocónico de fibra de vidrio de 150 L de volumen, a una densidad de 20 embriones/ml. Cada tanque contenía una progenie de hermanos completos y se mantuvieron con un sistema de aireación constante mediante bombas individuales y un sistema de circulación de agua cerrado, cuyas tareas de mantenimiento, limpieza y renovación completa de agua se llevaron a cabo cada 48 horas. Las larvas se alimentaron diariamente con un 1 L de microalgas cultivadas (50% Isochrysis galbana – 50% Pavlova luthery) a una densidad media de 1,68 x 104 células/μl, hasta alcanzar una concentración final de 110 células/μl en el tanque de 150 L. Para llevar a cabo las tareas de mantenimiento, las larvas se extrajeron de los tanques usando tamices progresivos de diferente luz de malla, ajustada al crecimiento de las larvas. Cuando las larvas iniciaron su fase pediveliger, en torno a 76 Capítulo III los 28 días, comenzaron a ser competentes para su asentamiento en diferentes sustratos (Widdows, 1991). En ese momento se introdujeron 3 cuerdas de cultivo de poliéster, de 4,5 metros de longitud, en un tanque con 13.500 postlarvas procedentes de una sola familia, i.e., a una densidad promedio de 3.000 individuos/m. Se alimentó a las postlarvas cada 48 horas con una dieta de 10 L de microalgas y una densidad promedio de 7,3 x 103 células/μl, diseñada específicamente para postlarvas de mejillón (Miñambres et al., 2011), cuyo contenido consistió en 50% I. galbana (Clase Prymnesiophyceae; cepa #CCMP1323), 25% Tetraselmis suecica (Clase Prasinophyceae; cepa #CCMP904), y 25% Chaetoceros gracilis (Clase Coscinodiscophyceae; cepa #CCMP1317). A los 90 días de edad y con una longitud larvaria promedio de 3,224 ± 1,045 mm, se instalaron dos cuerdas en suspensión en el pantalán de la ECIMAT y la tercera se mantuvo en el tanque de cultivo del criadero como control interno (Figura III.1).

Figura III.1. Localización de la estación marina ECIMAT en la Isla de Toralla de la Ría de Vigo (fachada atlántica de la Península Ibérica), donde se realizaron los experimentos de cultivo.

Una de las réplicas trasladada al pantalán se protegió con un plástico tubular de 18 mm de luz de malla y 20 cm de ancho, cerrado por ambos bordes. La otra réplica se suspendió sin protección, permitiendo así la libre depredación. Dentro de la cuerda protegida se

77 Capítulo III colocaron tres varillas de PVC en el extremo superior, medio e inferior a fin de minimizar el desprendimiento del mejillón adulto. Además esas varillas se anclaron a la malla para aislarlos mejillones de su interior y minimizar la depredación (Figura III.2).

Las réplicas del pantalán (P, protegida; U, desprotegida) y el control se muestrearon mensualmente y se congelaron hasta la posterior extracción de ADN. Los muestreos mensuales se llevaron a cabo durante los meses de abril, mayo y junio de 2008, y en cada uno de ellos se tomaron 140 individuos entre las tres réplicas. De las dos réplicas situadas en el pantalán se muestrearon 60 individuos por cuerda, procedentes de 3 secciones de 10 cm situadas a diferentes profundidades, i.e., 20 individuos de la zona superior (U), 20 individuos de la zona media (M) y 20 individuos de la zona inferior (B) de la cuerda. Dado que la progenie control del criadero (HCP) se mantuvo durante todo el experimento ubicada dentro de las instalaciones del ECIMAT y no existía la posibilidad del reclutamiento externo ni depredación, se muestreó un lote de 20 individuos en cada muestreo.

Tras el tercer muestreo de junio de 2008, se retiró la cuerda protegida (P) del pantalán debido a que el crecimiento de los mejillones era limitante por la falta de espacio que provocaba la presencia de la malla exterior. Por el contrario, la cuerda desprotegida (U) permaneció en suspensión durante otros 6 meses, hasta los 14 meses (noviembre de 2008), momento en el que se realizó el cuarto y último muestreo. En esta última fecha se muestrearon cinco zonas: las dos primeras se tomaron de dos zonas de la cuerda que ya habían sido muestreadas en primavera (UUSS, zona superior previamente muestreada de la cuerda desprotegida; UBSS, zona inferior previamente muestreada de la cuerda desprotegida), la tercera muestra se tomó en una zona de la cuerda que no había sido previamente muestreada (EHCP), la cuarta muestra se tomó del peso muerto situado en el fondo de las cuerdas (ERCG) y la quinta muestra se recogió en el intermareal rocoso más cercano al pantalán a modo de control externo de la Ría de Vigo (ECRV).

78 Capítulo III

Figura III.2. Diagrama simplificado del diseño experimental efectuado para evaluar el reclutamiento de mejilla en cuerdas de cultivo en suspensión previamente sembradas. Tratamientos: HCP, progenie control del criadero; UUR, zona superior de la cuerda desprotegida; MUR, zona media de la cuerda desprotegida; BUR, zona inferior de la cuerda desprotegida; UPR, zona superior de la cuerda protegida; MPR, zona media de la cuerda protegida; BPR, zona inferior de la cuerda protegida; EHCP, control experimental de la progenie del criadero; UUSS, zona superior previamente muestreada de la cuerda desprotegida; UBSS, zona inferior previamente muestreada de la cuerda desprotegida; ERCG, control de reclutamiento externo, ECRV, control externo de la Ría de Vigo.

III.2.2. Genotipado con marcadores microsatélites

Se extrajo y purificó El ADN procedente de 10 μ de tejido del manto de 457 individuos, siguiendo el protocolo FENOSALT para organismos marinos (Pérez y Presa, 2011). A continuación el ADN se preservó a -20ºC en agua ultrapura hasta la amplificación y genotipado de los marcadores. Se llevó a cabo la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de una batería de 6 marcadores microsatélites (STR, “Short Tandem Repeats”) específicamente diseñados para el género Mytilus, i.e., Mgμ1, Mgμ3, Mgμ4 y Mgμ5 (Presa et al., 2002), Mch8 (Ouagajjou et al., 2011) y Mgμ8 (Ouagajjou y Presa, 2015). En cada reacción de PCR se emplearon unos 50 ng de DNA por individuo en un volumen total de 15 µL que contenía 1 U de Taq DNA Polymerase

TM (BIOTAQ ) en tampón de reacción NH4 1X (Bioline®), 0,5 µM de cada primer, 200 µM de cada desoxirribonucleótido-trifosfato (dNTP) y la concentración necesaria de

MgCl2 para cada locus según sus autores. El cebador directo de cada locus se marcó con Cy5’ para su posterior detección por láser. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf) siguiendo el perfil de amplificación

79 Capítulo III que se indica a continuación: 1 ciclo a 95ºC durante 5 min, para desnaturalizar las hebras de ADN; 35 ciclos con una combinación de 40 s a la temperatura de hibridación, 72ºC durante 1 min (elongación de la hebras), 94ºC durante 1 min para volver a desnaturalizarlas, y un último ciclo para realizar una elongación final a 72ºC durante 30 min.

Los productos obtenidos en la PCR se visualizaron en geles de agarosa al 2% y posteriormente se les sometió a una electroforesis en poli-acrilamida 6% en un analizador automático de fragmentos ALFexpressII (Amersham Pharmacia Biotech). La determinación de los alelos y la lectura de los geles se efectuaron por varios investigadores utilizando marcadores internos de tamaño (80 pb, 114 pb, 180 pb, 230 pb y 402 pb) en el programa ALFWin v1.0. (Amersham Pharmacia Biotech).

III.2.3. Análisis estadísticos

Los datos genotípicos brutos se recogieron en una hoja de cálculo de Excel para la validación de los datos, esto es inspección de las distribuciones de frecuencias genotípicas atípicas, interpretaciones alélicas erróneas (outliers) o ambigüedades diversas inherentes a los microsatélites. Tras la validación de los datos se efectuó el ajuste entre las distribuciones genotípicas observadas y las esperadas siguiendo las reglas de segregación mendeliana, mediante el test de ji-cuadrado de bondad de ajuste y el programa SPSS 17.0. Las frecuencias alélicas, la heterocigosidad observada y la heterocigosidad esperada, se estimaron mediante el software FSTAT 2.9.3.2. (Goudet, 1995) y éstas se compararon entre los tres primeros muestreos dentro de cada tratamiento (HCP, progenie control del criadero; UUR, zona superior de la cuerda desprotegida; MUR, zona media de la cuerda desprotegida; BUR, zona inferior de la cuerda desprotegida; UPR, zona superior de la cuerda protegida; MPR, zona media de la cuerda protegida; BPR, zona inferior de la cuerda protegida), así como entre tratamientos dentro de muestreo. La heterocigosidad de la progenie control (HCP) se evaluó comparando los valores obtenidos en los muestreos primaverales con la heterocigosidad obtenida en el último muestreo de otoño (EHCP, control experimental de la progenie de criadero en la cuerda desprotegida) utilizando el enfoque basado en permutaciones de FSTAT.

80 Capítulo III

El cálculo de la probabilidad bayesiana de los genotipos multilocus tuvo como objetivo detectar a los individuos que no pertenecían a la progenie control experimental del criadero, i.e., detectar el reclutamiento externo de larvas de mejillón procedentes de la Ría de Vigo. Los genotipos tomados al azar de la población de la Ría de Vigo se tomaron como referencia externa de la progenie control. Las probabilidades de asignación/exclusión, así como las probabilidades de ser inmigrantes de primera generación se calcularon mediante el método bayesiano de Rannala y Mountain (1997) implementado en GENECLASS 2.0. (Piry et al., 2004). Esta inferencia bayesiana en las frecuencias genotípicas de los grupos muestreados se realizó mediante el algoritmo de simulación y remuestreo de Monte-Carlo (Rannala y Mountain, 1997). Este método se ajusta mejor a nuestros datos, ya que otras alternativas como las propuestas por Paetkau et al. (2004) requerían que las muestras se encontrasen en el equilibrio de Hardy- Weinberg (HWE).

El método de distancia de Cornuet et al. (1999) no asume HWE, pero asignó individuos a la progenie control del criadero, que mostraban incompatibilidades en dos loci (Tabla III.3). La cantidad mínima de reclutamiento se estimó empíricamente como el número de genotipos multilocus incompatibles con la progenie control del criadero y se calculó matemáticamente como la proporción de individuos estadísticamente excluidos de la progenie control del criadero en las cuerdas. Las probabilidades de asignación calculadas fueron: L-Home, probabilidad de asignación al grupo de origen (un genotipo se asigna erróneamente si tiene una baja probabilidad multilocus dentro del grupo sobre el que se muestreó); Pim, probabilidad de ser inmigrante dentro de su grupo de muestreo (p < 0,01);

Pfs, probabilidad de pertenecer a la familia de hermanos completos del criadero; Ni/Ng, número de loci incompatibles entre descendientes y progenitores. Estos estadísticos se calcularon en todos los tratamientos, incluyendo el control externo de reclutas fijados en el peso muerto de la cuerda (ERCG) y el control externo de la Ría de Vigo (ECRV), compuesto por mejillones del intermareal rocoso próximo al pantalán.

81 Capítulo III

III.3. Resultados y discusión

Los programas de selección en acuicultura han sido implementados solamente en algunas especies y muchos de los cultivos comerciales son aun esencialmente salvajes (Gjedrem, 2000). Por ello la determinación del pedigrí durante el establecimiento de nuevos reproductores (Matusse et al., 2016), así como la trazabilidad de su descendencia tras la cosecha, será probablemente una aplicación al alza con las actuales tecnologías genéticas. El diseño experimental desarrollado en esta investigación, donde los reproductores y su descendencia son física y genéticamente identificables a escala individual, desde el inicio hasta el final del ciclo productivo, permite evaluar la viabilidad de cultivar stocks seleccionados de mejillón en suspensión.

III.3.1. Polimorfismo de los marcadores microsatélites (STR)

Los seis loci analizados fueron altamente polimórficos en poblaciones naturales (Ouagajjou et al., 2010) y exhibieron un total de 13 alelos en la descendencia de hermanos completos, i.e., dos alelos por locus y un alelo nulo inferido en el locus Mgμ4. Ambos parentales eran homocigotos distintos para el locus Mgμ1, el padre fue homocigoto y la madre heterocigota para los loci Mgμ5 y Mch8, el padre heterocigoto y la madre homocigota para el locus Mgµ8 y ambos parentales heterocigotos en los loci Mgμ3 y Mgμ4 (Tabla III.1). La población salvaje de la Ría de Vigo (ECRV) utilizada como control externo, mostró que el locus Mgμ3 era el menos polimórfico (5 alelos) y que el locus Mgμ4 era el más polimórfico (15 alelos). Los loci Mgµ8, Mgμ1, Mgμ5 y Mch8 exhibieron respectivamente 14, 10, 10 y 6 alelos (Tabla III.1).

III.3.2. Patrones de segregación por locus y tratamiento

En general, la segregación de la mayoría de los loci en todos los tratamientos se ajustó a las proporciones genotípicas esperadas en el equilibrio, pero también se observaron proporciones genotípicas inesperadas en 2 de las 126 pruebas realizadas en los tres primeros muestreos, dentro de tratamiento y locus, i.e., 1,58% de los casos para α = 0,01 (Tabla III.1). Estas dos desviaciones en las segregaciones mendelianas esperadas suceden en ambos casos en el segundo muestreo y se debieron a un exceso significativo de heterocigotos en el locus Mgµ8 (tratamiento BPR) y a un déficit significativo de

82 Capítulo III heterocigotos en el locus Mch8 (tratamiento MPR) (Tabla III.1). Ambos casos de proporciones genotípicas inesperadas se ajustaron a un error tipo I y por tanto es asumible un rechazo aleatorio de la hipótesis nula.

Al agrupar los datos por tratamientos se pudo observar un déficit de heterocigotos en los loci Mgμ3 y Mgμ4 del muestreo I, en los loci Mgµ8 y Mgμ4 del muestreo II y en el locus Mgμ3 del muestreo III. El déficit de heterocigotos del locus Mgμ4 en los tres muestreos fue debido a la presencia de alelos nulos, los cuales no fueron descritos previamente en dicho locus. Los marcadores Mgμ3, Mch8 y Mgμ4 también mostraron un déficit de heterocigotos altamente significativo en individuos pertenecientes a la progenie control experimental (EHCP) en el momento de la cosecha (muestreo IV, 14 meses de edad) (Tabla III.1), mientras que el locus Mgµ8 y el locus Mgμ5 segregaron como se esperaba. Algunos déficits pueden deberse a la presencia de alelos nulos, como se ha descrito anteriormente para el locus Mgμ4, pero cuando ese déficit sucede de manera sistemática en todos los loci, puede atribuirse a otras causas como la selección en contra de heterocigotos en etapas del desarrollo tempranas en moluscos (Zouros y Foltz, 1984). Esta última posibilidad ha sido formulada recientemente en investigaciones relacionadas con el mejillón mediterráneo, donde la pérdida de los individuos heterocigotos más expuestos, implicaría el aumento final de la homocigosis en la población como consecuencia de tales desprendimientos (Myrand et al., 2002).

83

Tabla III.1. Pruebas de contingencia de Ji-cuadrado en segregaciones genotípicas de seis microsatélites en siete tratamientos dentro de muestreo: HCP (progenie control de criadero); UUR (superior de la cuerda desprotegida); MUR (centro de la cuerda desprotegida); BUR (inferior de la cuerda desprotegida); UPR (superior de la cuerda protegida); MPR (centro de la cuerda protegida); BPR (inferior de la cuerda protegida); EHCP (progenie experimental de control de criadero sin protección). Muestreo I - juveniles de 6 meses (03/04/2008), Muestreo II - juveniles de 7 meses (08/05/2008), Muestreo III - juveniles de 8 meses (06/06/2008), muestreo IV - adultos 14 meses (14/11/2008). El tamaño de la muestra se indica entre paréntesis; las cifras en las primeras cuatro filas corresponden al genotipo parental y de la progenie, por locus. El asterisco indica una desviación significativa de la segregación mendeliana esperada (*p <0.01).

Locus Mgμ5 Mgμ8 Mgμ3 Mch8 Mgμ1 Mgµ4 Padre 132-132 194-200 138-140 203-203 142-142 173-191 Madre 126-132 200-200 138-140 203-205 156-156 173-null

¼ 173-173 Genotipos 1/2 1/2 1/2 1/2 1/4 1/2 1/4 1/2 1/2 1/4 1/4 p( χ2) p( χ2) p( χ2) p( χ2) 142-156 p( χ2) + p( χ2) esperados 126-132 132-132 194-200 200-200 138-138 138-140 140-140 203-203 203-205 173-191 191-null ¼ 173-null Muestreo HCP (20) 10 10 1,000 12 7 0,511 7 6 7 0,435 10 10 1,000 20 - 15 3 2 0,248 I UUR (20) 8 12 0,525 7 13 0,337 4 8 8 0,599 9 11 0,752 18 - 9 4 7 0,780 MUR 20) 9 11 0,752 13 5 0,171 14 5 1 0,014 11 9 0,752 17 - 15 3 2 0,248 BUR (20) 13 7 0,337 5 10 0,269 6 7 7 0,621 15 5 0,102 19 - 11 2 5 0,415 UPR (20) 7 13 0,337 4 16 0,047 11 8 1 0,077 12 8 0,525 20 - 17 2 1 0,056 MPR (20) 10 10 1,000 3 17 0,018 12 5 3 0,080 13 7 0,337 20 - 13 1 1 0,067 BPR (20) 9 11 0,752 9 9 1,000 7 7 4 0,747 8 12 0,525 19 - 15 1 2 0,048 Total (140) 66 74 0,632 53 77 0,135 61 46 31 0,003* 78 62 0,338 133 - 95 16 20 0,001*

Muestreo II HCP (19) 11 8 0,744 10 9 1,000 5 3 11 0,072 10 9 1,000 19 - 10 6 3 0,725 UUR (20) 7 13 0,337 7 13 0,337 7 6 7 0,435 11 9 1,000 20 - 11 3 6 0,727 MUR (20) 10 8 0,738 17 3 0,018 9 6 5 0,343 9 11 0,752 20 - 10 5 5 1,000 BUR (40) 18 17 0,598 29 9 0,017 13 17 10 0,728 30 10 0,021 40 - 21 8 8 0,897 UPR (20) 7 10 0,492 5 11 0,280 6 5 9 0,235 14 6 0,197 20 - 10 5 4 0,921 MPR (20) 7 10 0,492 17 2 0,012 3 9 8 0,372 18 2 0,006* 20 - 14 2 2 0,122 BPR (20) 9 5 0,445 19 1 0,001* 3 10 7 0,659 10 10 1,000 20 - 14 3 1 0,091 Total (159) 69 71 0,905 104 48 0,001* 46 56 57 0,026 102 57 0,011 159 - 90 32 29 0,001*

Muestreo III HCP (20) 12 6 0,310 7 12 0,328 2 5 13 0,039 10 10 1,000 20 - 12 2 5 0,424 UUR (20) 6 8 0,705 5 8 0,431 7 6 7 0,435 12 8 0,525 18 - 11 6 2 0,455 MUR (20) 7 9 0,723 2 11 0,039 3 8 9 0,394 14 6 0,197 20 - 6 6 6 0,792 BUR (20) 10 8 0,738 10 9 1,000 4 9 7 0,780 11 9 0,752 20 - 12 7 1 0,204 UPR (20) 8 9 0,732 9 10 0,746 5 6 9 0,343 15 5 0,102 20 - 9 6 3 0,723 MPR (20) 6 9 0,464 12 8 0,525 4 3 13 0,024 14 6 0,197 20 - 12 3 5 0,711 BPR (18) 8 10 0,738 10 8 1,000 8 3 7 0,105 12 6 0,310 18 - 8 5 3 0,881 Total (138) 65 59 0,703 55 66 0,440 33 40 65 0,001* 88 50 0,021 136 - 70 35 25 0,349

Muestreo IV EHCP (20) 7 10 0,502 14 6 0,197 0 0 20 0,001* 19 1 0,001* 20 - 19 0 1 0,005*

Capítulo III

III.3.3. Cambios en la heterocigosidad

III.3.3.1. Diferencias de heterocigosidad dentro de tratamientos

No hubo diferencias de heterocigosidad entre muestreos dentro de tratamiento (cuerda protegida/cuerda desprotegida) excepto una fluctuación significativa de la heterocigosidad entre el muestreo I y el muestreo III del locus Mgµ8 en los tratamientos MUR y MPR, y del locus Mgμ3 en los tratamientos MPR y BPR (Tabla III.2). Esas cuatro pruebas representaron el 9,52% de los casos, encontrándose dispersos entre tratamientos y locus, por lo que no respaldan ninguna tendencia de cambio especifica de este parámetro.

III.3.3.2. Diferencias de heterocigosidad entre tratamientos

No se observaron diferencias de heterocigosidad entre tratamientos durante los muestreos I, II y III (Tabla III.2), lo que indica que ni el tratamiento ni la posición de los individuos a lo largo de la cuerda tienen efecto sobre la heterocigosidad. En el muestreo II se observaron variaciones significativas de la heterocigosidad entre los tratamientos para los loci Mgμ5, Mgμ3 y Mch8, así como una variación a nivel general a lo largo de los loci (Tabla III.2). Dado que el cambio en la heterocigosidad entre tratamientos del muestreo II no mostró ninguna tendencia entre loci, éste puede atribuirse al azar.

III.3.3.3. Diferencias de heterocigosidad entre muestreos de la progenie control (HCP)

No se observaron diferencias de heterocigosidad en la progenie control del criadero (HCP) en los muestreos I, II y III. Sin embargo se observó un descenso significativo de la heterocigosidad en la progenie control experimental (EHCP) durante el muestreo IV, en 4 de los marcadores analizados, y un aumento de la heterocigosidad en el locus Mgµ8. La tendencia global en los 6 marcadores se encuentra significativamente sesgada hacia un déficit de heterocigotos (Tabla III.2). Mientras que la heterocigosidad se mantuvo estable durante los tres primeros muestreos (juveniles con 6, 7 y 8 meses de edad), en el muestreo IV (juveniles con 14 meses de edad) la heterocigosidad disminuyó un 30%, de 0,520 a 0,359. La reducción progresiva de la heterocigosidad en juveniles de mejillón

85 Capítulo III durante el periodo previo al engorde es un fenómeno que ya ha sido descrito en investigaciones previas (Raymond et al., 1997). También los datos aquí presentados son congruentes con la reducción de la heterocigosidad multilocus (MLH) descrita en individuos de M. edulis cultivados en suspensión (Myrand et al., 2009). En dicho estudio, la baja heterocigosidad observada en el momento de la cosecha se atribuyó a la pérdida selectiva de individuos heterocigotos, los cuales se moverían hacia las zonas del cultivo más oxigenadas y expuestas y por tanto serían los que sufrirían mayor mortalidad por desprendimiento y depredación (Myrand et al., 2009). Cabe destacar que esa hipótesis también es congruente con la correlación significativa encontrada por Gentili y Beaumont (1988) en M. edulis entre la heterocigosidad y la tasa de crecimiento en cultivos de alta densidad, así como con el descenso de heterocigosidad observado en M. galloprovincialis en este experimento.

86 Capítulo III

Tabla III.2. Comparación estadística de la heterocigosidad (*p < 0,01) por locus y tratamiento, entre tratamientos dentro de muestreo y entre tratamientos sobre todos los muestreos. La heterocigosidad media se comparó entre los muestreos primaverales (I, II y III) y también entre muestreos primaverales y los otoñales (IV). Los tratamientos se indican a continuación: HCP (progenie control del criadero); EHCP (progenie control experimental); UUR (zona superior de la cuerda desprotegida); MUR (zona media de la cuerda desprotegida); BUR (zona inferior de la cuerda desprotegida); UPR (zona superior de la cuerda protegida); MPR (zona media de la cuerda protegida); BPR (zona inferior de la cuerda protegida).

Tratamiento Muestreo Mgμ5 Mgμ8 Mgμ3 Mch8 Mgμ1 Mgμ4 6 loci I 0,500 0,600 0,300 0,500 1,000 0,200 0,520 II 0,600 0,500 0,200 0,500 1,000 0,300 0,520 HCP III 0,700 0,400 0,300 0,500 1,000 0,100 0,500 p (I-II-III) 0,180 0,520 0,340 0,990 1,000 0,100 0,900 Promedio (I-II-III) 0,579 0,509 0,237 0,492 1,000 0,190 0,501

IV 0,444 0,700 0,000 0,050 1,000 0,000 0,359 EHCP p (I-II-III vs IV) 0,003* 0,001* 0,001* 0,001* 1,000 0,001* 0,003*

I 0,400 0,400 0,400 0,600 1,000 0,200 0,500 II 0,400 0,400 0,300 0,500 1,000 0,200 0,470 UUR III 0,500 0,400 0,300 0,400 1,000 0,300 0,480 p (I-II-III) 0,740 0,990 0,510 0,520 1,000 0,250 0,820 Promedio (I-II-III) 0,389 0,358 0,333 0,483 1,000 0,220 0,461

I 0,450 0,720 0,250 0,450 1,000 0,150 0,500 II 0,560 0,850 0,300 0,550 1,000 0,250 0,590 MUR III 0,440 0,150 0,400 0,300 1,000 0,330 0,440

p (I-II-III) 0,400 0,010* 0,410 0,070 1,000 0,230 0,020 Promedio (I-II-III) 0,481 0,627 0,317 0,433 1,000 0,241 0,517

I 0,650 0,380 0,350 0,250 1,000 0,110 0,460 II 0,530 0,760 0,430 0,250 1,000 0,220 0,530 BUR III 0,560 0,530 0,450 0,450 1,000 0,350 0,560 p (I-II-III) 0,110 0,180 0,630 0,250 1,000 0,020 0,120 Promedio (I-II-III) 0,568 0,611 0,413 0,300 1,000 0,227 0,520

I 0,350 0,200 0,400 0,400 1,000 0,100 0,408 II 0,410 0,310 0,250 0,300 1,000 0,260 0,423 UPR III 0,470 0,470 0,300 0,250 1,000 0,330 0,471 p (I-II-III) 0,500 0,540 0,470 0,560 1,000 0,040 0,440 Promedio (I-II-III) 0,407 0,327 0,317 0,317 1,000 0,171 0,433

I 0,500 0,400 0,300 0,400 1,000 0,100 0,450 II 0,400 0,900 0,500 0,100 1,000 0,100 0,500 MPR III 0,400 0,600 0,200 0,300 1,000 0,200 0,450 p (I-II-III) 0,410 0,010* 0,010* 0,090 1,000 0,820 0,110 Promedio (I-II-III) 0,442 0,542 0,300 0,250 1,000 0,113 0,441

I 0,450 0,500 0,390 0,600 1,000 0,060 0,500 II 0,640 0,950 0,500 0,500 1,000 0,170 0,630 BPR III 0,440 0,560 0,170 0,330 1,000 0,310 0,470 p (I-II-III) 0,050 0,100 0,010* 0,110 1,000 0,030 0,020 Promedio (I-II-III) 0,500 0,679 0,357 0,483 1,000 0,173 0,532

Entre tratamientos en 0,100 0,490 0,840 0,340 1,000 0,970 0,410 todas los muestreos (p)

I 0,060 0,120 0,640 0,050 1,000 0,750 0,170 Entre tratamientos por II 0,010* 0,020 0,010* 0,010* 1,000 0,360 0,010* muestreo (p) III 0,070 0,590 0,030 0,490 1,000 0,020 0,450

87 Capítulo III

III.3.4. Asignación genética de los adultos cosechados

III.3.4.1. EHCP (Progenie control experimental)

Todos los individuos adultos que crecieron en la cuerda protegida y en la desprotegida se asignaron a la progenie control experimental de criadero (EHCP) (Tabla III.3). El individuo EHCP-11 fue excluido estadísticamente de su grupo de muestreo debido a la presencia de un genotipo infrecuente (191/191) en el locus Mgμ4. Dado que este locus mostró evidencias de poseer alelos nulos (véase Tabla III.1 y subsección III.3.2) y el resto de marcadores coincidían en los criterios de pertenencia a EHCP, su genotipo real probablemente es 191/nulo, y por tanto este individuo no puede clasificarse como inmigrante. El individuo EHCP-17 no fue excluido de su grupo muestral pero se clasificó como un inmigrante; ello se debe a que presenta un genotipo infrecuente 203/205 en el locus Mch8. Cabe destacar que la probabilidad de EHCP-17 de ser inmigrante (p < 0,01) dentro de su grupo de muestreo (Pim) lo clasificó erróneamente como un individuo inmigrante en su grupo real de procedencia. Estas dos clasificaciones erróneas debidas a la presencia de alelos nulos o a genotipos infrecuentes, son completamente compatibles con la progenie control experimental (EHCP). Por consiguiente no se observó reclutamiento de larvas silvestres en la cuerda de cultivo que fue sembrada 14 meses antes con mejilla seleccionada en el criadero.

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Tabla III.3. Genotipos observados y probabilidades de asignación de las progenies en los diferentes tratamientos a lo largo de los 4 muestreos. L-Home, probabilidad de asignación al grupo original (un genotipo no es asignado si tiene una baja probabilidad multilocus en el grupo en el que fue muestreado); Pim, probabilidad de ser inmigrante (p < 0.01) dentro de su grupo de muestreo; Pfs, probabilidad de pertenecer a la familia de hermanos completes; Ni/Ng, numero de locus incompatibles entre progenitores y descendencia. Niveles de significación: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.)

Locus Mgµ5 Mgµ8 Mgµ3 Mch8 Mgµ1 Mgµ4 Padre 132-132 194-200 138-140 203-203 142-142 173-191 P (L-Home) Pim Pfs Ni/Ng Madre 126-132 200-200 138-140 203-205 156-156 173-null Muestreo I ------Muestreo II ------Muestreo III UUR UUR-13 126-132 200-200 140-140 203-203 146-146 173-173 0.020* <0.001*** <0.001*** 1 / 6 Muestreo IV EHCP EHCP-1 132-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.812 0.799 0.812 0 / 6 EHCP -2 126-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.530 0.508 0.530 0 / 6 EHCP -3 na 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.796 0.788 0.796 0 / 5 EHCP -4 132-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.812 0.818 0.812 0 / 6 EHCP-5 126-132 194-200 140-140 203-203 142-156 na 0.447 0.448 0.447 0 / 6 EHCP -6 132-132 na 140-140 203-203 142-156 173-173 0.818 0.830 0.818 0 / 5 EHCP -7 132-132 na 140-140 203-203 142-156 173-173 0.832 0.841 0.832 0 / 5 EHCP -8 132-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.812 0.807 0.812 0 / 6 EHCP -9 na 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.807 0.787 0.807 0 / 5 EHCP -10 126-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.530 0.527 0.530 0 / 6 EHCP-11 126-132 194-200 140-140 203-203 142-156 191-191 0.007** <0.001*** 0.007** 0 / 6 EHCP -12 132-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.812 0.801 0.812 0 / 6 EHCP -13 132-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.812 0.819 0.812 0 / 6 EHCP -14 126-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.530 0.493 0.530 0 / 6 EHCP -15 126-132 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.530 0.501 0.530 0 / 6 EHCP -16 126-132 200-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.406 0.387 0.406 0 / 6 EHCP-17 132-132 200-200 140-140 203-205 142-156 173-173 0.097 0.007** 0.097 0 / 6 EHCP -18 132-132 200-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.719 0.712 0.719 0 / 6 EHCP -19 132-132 na 140-140 203-203 142-156 173-173 0.843 0.838 0.843 0 / 5 EHCP -20 na 194-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.795 0.799 0.795 0 / 5

Locus Mgµ5 Mgµ8 Mgµ3 Mch8 Mgµ1 Mgµ4 Padre 132-132 194-200 138-140 203-203 142-142 173-191 P (L-Home) Pim Pfs Ni/Ng Madre 126-132 200-200 138-140 203-205 156-156 173-null ERCG ERCG-1 128-132 196-202 140-140 203-203 138-138 191-191 0.041* 0.001** <0.001*** 3 / 6 ERCG-2 130-130 190-214 140-140 203-203 164-164 183-183 0.059 0.001** <0.001*** 4 / 6 ERCG-3 130-130 na 140-140 203-203 138-138 177-185 0.127 0.037** <0.001*** 3 / 5 ERCG-4 132-142 200-208 140-140 203-205 134-146 183-183 0.082 0.005** <0.001*** 4 / 6 ERCG-5 126-134 200-200 138-140 203-203 144-156 173-183 0.389 0.358 <0.001*** 3 / 6 ERCG-6 130-130 214-214 140-140 203-203 138-166 167-173 0.202 0.023* <0.001*** 4 / 6 ERCG-7 126-136 192-192 138-138 205-205 140-140 167-167 0.002** <0.001*** <0.001*** 5 / 6 ERCG-8 132-132 200-200 138-138 203-203 144-154 173-183 0.215 0.034* <0.001*** 2 / 6 ERCG-9 126-132 192-198 140-140 203-205 142-142 167-185 0.173 0.094 <0.001*** 3 / 6 ERCG-10 126-132 192-198 140-140 203-205 144-146 173-173 0.552 0.523 <0.001*** 2 / 6 ERCG-11 na 212-212 140-140 203-203 146-146 191-191 0.534 0.414 <0.001*** 2 / 5 ERCG-12 124-130 202-206 140-140 203-203 138-138 191-191 0.623 0.506 <0.001*** 3 / 6 ERCG-13 130-138 190-200 140-140 203-203 144-156 na 0.592 0.477 <0.001*** 3 / 5 ERCG-14 124-142 192-192 140-140 203-205 132-146 165-173 0.118 0.044* <0.001*** 4 / 6 ERCG-15 128-134 194-194 138-140 203-203 144-156 175-185 0.385 0.320 <0.001*** 3 / 6 ERCG-16 132-134 196-214 140-140 203-203 158-158 175-179 0.158 0.086 <0.001*** 4 / 6 ERCG-17 134-134 196-208 140-140 203-203 138-138 171-171 0.272 0.138 <0.001*** 4 / 6 ERCG-18 124-134 194-198 140-140 203-205 158-158 173-185 0.028* 0.003** <0.001*** 4 / 6 ERCG-19 124-134 na 138-140 203-203 140-140 191-191 0.195 0.128 <0.001*** 2 / 5 ERCG-20 134-140 na 140-140 203-203 144-158 167-183 0.493 0.422 <0.001*** 3 / 5 ERCG-21 140-140 194-202 140-140 203-203 138-142 171-173 0.175 0.086 <0.001*** 4 / 6 ERCG-22 126-132 192-200 140-140 203-203 140-144 183-183 0.717 0.683 <0.001*** 3 / 6 ERCG-23 132-132 200-200 140-140 201-211 138-138 175-179 0.013* <0.001*** <0.001*** 3 / 6 ERCG-24 132-138 200-200 138-140 203-203 144-150 167-175 0.151 0.022* <0.001*** 3 / 6 ERCG-25 132-132 190-198 140-140 203-203 138-146 173-173 0.665 0.595 <0.001*** 2 / 6 ERCG-26 132-132 200-200 140-140 203-203 132-140 175-179 0.302 0.191 <0.001*** 2 / 6 ERCG-27 132-132 192-198 140-140 203-203 146-156 183-183 0.544 0.503 <0.001*** 3 / 6 ERCG-28 126-132 192-192 140-140 203-203 138-144 169-177 0.181 0.083 <0.001*** 3 / 6 ERCG-29 132-134 190-198 140-140 205-205 144-156 169-175 0.035* 0.010* <0.001*** 5 / 6 ERCG-30 126-134 na 140-140 203-203 140-142 167-167 0.441 0.339 <0.001*** 3 / 5 ERCG-31 132-132 200-208 140-140 203-203 140-146 167-171 0.406 0.290 <0.001*** 3 / 6 ERCG-32 126-132 192-198 140-140 203-203 142-144 175-185 0.438 0.383 <0.001*** 3 / 6 ERCG-33 132-132 190-198 140-140 203-203 140-146 167-175 0.548 0.499 <0.001*** 3 / 6

Locus Mgµ5 Mgµ8 Mgµ3 Mch8 Mgµ1 Mgµ4 Padre 132-132 194-200 138-140 203-203 142-142 173-191 P (L-Home) Pim Pfs Ni/Ng Madre 126-132 200-200 138-140 203-205 156-156 173-null ERCG-34 124-132 190-190 140-140 203-209 142-146 167-167 0.026* 0.002** <0.001*** 5 / 6 ERCG-35 122-132 198-200 140-140 203-203 144-144 183-183 0.437 0.158 <0.001*** 4 / 6 ERCG-36 134-140 212-214 140-140 203-203 144-144 167-183 0.604 0.515 <0.001*** 4 / 6 ERCG-37 124-132 192-204 140-140 203-203 144-144 185-185 0.506 0.361 <0.001*** 4 / 6 ERCG-38 na 214-214 140-140 203-203 134-146 173-173 0.693 0.554 <0.001*** 2 / 5 ERCG-39 na 194-202 140-140 203-203 144-146 165-183 0.629 0.464 <0.001*** 3 / 5 ERCG-40 132-132 198-206 140-140 203-203 134-134 173-173 0.541 0.356 0.001** 2 / 6 ERCG-41 120-132 198-202 138-138 203-203 140-140 173-183 0.046* 0.004** <0.001*** 4 / 6 ERCG-42 132-132 198-198 138-138 203-203 144-144 173-173 0.321 0.243 <0.001*** 2 / 6 ERCG-43 132-138 200-200 140-140 203-203 140-140 167-173 0.482 0.366 <0.001*** 3 / 6 ERCG-44 134-134 200-200 140-140 203-205 138-144 173-173 0.386 0.333 <0.001*** 2 / 6 ERCG-45 132-136 192-202 140-140 203-203 140-144 173-183 0.766 0.677 <0.001*** 4 / 6 ERCG-46 132-132 192-208 132-140 203-203 138-146 191-191 0.297 0.103 <0.001*** 3 / 6 ERCG-47 132-134 194-214 138-138 203-205 162-168 175-185 0.005** <0.001*** <0.001*** 4 / 6 ERCG-48 126-132 192-212 140-140 203-203 144-158 173-173 0.804 0.734 <0.001*** 2 / 6 UBSS UBSS-1 134-134 200-200 138-140 203-203 138-146 183-183 0.830 0.695 <0.001*** 3 / 6 UBSS-2 na 202-208 140-140 203-203 136-136 177-177 0.026* <0.001*** <0.001*** 3 / 5 UBSS-3 132-132 198-198 138-142 203-203 138-138 173-173 0.129 0.047* <0.001*** 3 / 6 UBSS-4 122-132 200-200 140-140 201-201 150-158 181-181 0.004** <0.001*** <0.001*** 4 / 6 UBSS-5 126-132 192-198 140-142 205-205 138-138 165-173 0.016* <0.001*** <0.001*** 5 / 6 UBSS-6 132-132 194-194 140-140 203-203 138-146 167-167 0.437 0.040* <0.001*** 4 / 6 UBSS-7 132-132 200-200 138-140 195-195 140-140 179-181 0.041* <0.001*** <0.001*** 3 / 6 UBSS-8 132-132 198-198 140-140 203-203 144-160 167-177 0.229 0.013* <0.001*** 3 / 6 UBSS-9 132-132 200-200 140-140 203-205 144-156 155-183 0.827 0.608 <0.001*** 2 / 6 UBSS-10 124-134 200-200 140-140 203-203 146-146 181-189 0.305 0.044* <0.001*** 2 / 6 UBSS-11 134-134 198-200 138-140 203-205 134-146 173-183 0.327 0.056 <0.001*** 4 / 6 UBSS-12 134-134 202-208 132-138 203-203 138-152 173-173 0.016* <0.001*** <0.001*** 4 / 6 UBSS-13 132-132 200-200 138-140 203-203 144-156 167-167 0.873 0.770 <0.001*** 2 / 6 UBSS-14 134-134 200-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.880 0.782 <0.001*** 1 / 6 UBSS-15 134-140 208-208 140-140 203-203 156-156 173-189 0.152 0.011* <0.001*** 4 / 6 UBSS-16 132-132 200-200 140-140 203-203 156-156 167-167 0.987 0.957 <0.001*** 2 / 6 UBSS-17 132-132 192-208 140-140 203-203 142-156 167-167 0.662 0.509 <0.001*** 2 / 6 UBSS-18 126-132 192-200 140-140 203-203 140-140 167-169 0.350 0.040* <0.001*** 3 / 6

Locus Mgµ5 Mgµ8 Mgµ3 Mch8 Mgµ1 Mgµ4 Padre 132-132 194-200 138-140 203-203 142-142 173-191 P (L-Home) Pim Pfs Ni/Ng Madre 126-132 200-200 138-140 203-205 156-156 173-null UBSS-19 126-132 192-200 140-140 205-205 142-156 171-171 0.075 0.001** <0.001*** 3 / 6 UBSS-20 132-132 200-200 140-140 203-205 142-156 175-175 0.561 0.063 <0.001*** 1 / 6 UBSS-21 134-134 200-200 140-140 203-203 146-156 183-183 0.951 0.899 <0.001*** 3 / 6 UBSS-22 132-132 200-200 140-140 203-203 138-138 183-183 0.975 0.941 <0.001*** 2 / 6 UBSS-23 132-132 200-200 140-140 203-203 140-140 155-183 0.847 0.637 <0.001*** 2 / 6 UBSS-24 134-134 200-200 140-140 203-205 146-156 183-183 0.890 0.820 <0.001*** 3 / 6 UUSS UUSS-1 134-140 202-208 140-140 205-205 140-140 183-183 0.002** <0.001*** <0.001*** 5 / 6 UUSS-2 124-132 190-190 138-138 203-203 142-156 171-183 0.035* 0.004** <0.001*** 3 / 6 UUSS-3 132-132 200-200 140-140 203-203 142-156 173-181 0.945 0.896 0.007** 1 / 6 UUSS-4 132-132 200-200 138-138 203-203 140-146 167-173 0.905 0.850 <0.001*** 2 / 6 UUSS-5 132-132 200-200 138-138 203-203 138-146 167-173 0.841 0.790 <0.001*** 2 / 6 UUSS-6 124-132 192-198 138-140 203-203 144-146 167-173 0.063 <0.001*** <0.001*** 4 / 6 UUSS-7 132-132 200-200 140-140 203-203 144-156 173-173 0.974 0.969 0.009** 1 / 6 UUSS-8 132-132 196-206 140-140 203-203 140-140 185-185 0.767 0.551 <0.001*** 3 / 6 UUSS-9 na 200-204 138-140 203-205 160-160 185-185 0.135 <0.001*** <0.001*** 3 / 5 UUSS-10 126-134 200-200 140-140 205-205 140-140 185-185 0.106 0.030* <0.001*** 4 / 6 UUSS-11 132-132 200-200 140-140 201-201 142-156 173-181 0.403 0.226 <0.001*** 2 / 6 UUSS-12 132-132 200-200 138-140 205-205 142-166 173-187 0.223 0.002** <0.001*** 3 / 6 UUSS-13 134-134 200-200 138-142 203-205 170-170 157-157 0.006** <0.001*** <0.001*** 4 / 6 UUSS-14 126-132 194-200 138-140 203-203 142-156 173-173 0.540 0.175 0.016* 0 / 6 UUSS-15 132-132 200-200 140-140 203-203 146-170 173-179 0.818 0.366 <0.001*** 2 / 6 UUSS-16 132-132 212-214 138-140 203-205 134-138 173-173 0.694 0.156 <0.001*** 2 / 6 UUSS-17 132-132 200-208 140-140 203-203 138-138 175-183 0.471 0.161 <0.001*** 3 / 6 UUSS-18 130-140 192-204 140-140 203-203 146-146 171-175 0.041* 0.001** <0.001*** 4 / 6 UUSS-19 126-132 200-200 140-140 203-203 142-156 173-173 0.905 0.851 0.406 0 / 6 UUSS-20 134-140 192-200 140-140 203-203 132-144 173-173 0.189 0.012* <0.001*** 3 / 6 UUSS-21 132-132 200-200 138-140 203-203 150-156 169-181 0.330 0.007** <0.001*** 2 / 6 UUSS-22 132-140 190-200 138-140 201-201 148-148 167-167 0.014* <0.001*** <0.001*** 5 / 6 UUSS-23 132-132 200-200 140-140 203-203 144-146 167-167 0.838 0.723 <0.001*** 2 / 6 UUSS-24 124-132 200-200 138-140 203-203 170-170 167-173 0.727 0.588 <0.001*** 3 / 6 ECRV ECRV-1 132-132 196-196 140-140 203-203 144-144 171-183 0.577 0.091 <0.001*** 3 / 6 ECRV-2 130-130 198-198 138-138 201-203 134-144 167-175 0.330 0.116 <0.001*** 5 / 6

Locus Mgµ5 Mgµ8 Mgµ3 Mch8 Mgµ1 Mgµ4 Padre 132-132 194-200 138-140 203-203 142-142 173-191 P (L-Home) Pim Pfs Ni/Ng Madre 126-132 200-200 138-140 203-205 156-156 173-null ECRV-3 130-134 194-206 142-138 205-211 140-140 173-173 0.228 0.024* <0.001*** 5 / 6 ECRV-4 128-134 194-204 142-140 203-205 138-144 177-177 0.444 0.241 <0.001*** 5 / 6 ECRV-5 126-132 192-192 140-138 201-207 144-144 167-177 0.542 0.297 <0.001*** 4 / 6 ECRV-6 132-132 196-208 140-140 201-203 144-144 169-199 0.441 0.038* <0.001*** 4 / 6 ECRV-7 128-140 194-194 140-136 203-203 138-138 173-173 0.094 0.001** <0.001*** 4 / 6 ECRV-8 132-136 190-200 140-138 201-205 144-144 173-195 0.338 0.005** <0.001*** 5 / 6 ECRV-9 126-130 194-200 140-138 203-203 140-156 173-173 0.535 0.099 <0.001*** 2 / 6 ECRV-10 130-132 198-206 142-140 203-203 146-146 171-173 0.391 0.163 <0.001*** 5 / 6 ECRV-11 126-130 198-204 140-138 201-203 140-144 163-167 0.478 0.098 <0.001*** 5 / 6 ECRV-12 132-136 210-220 140-138 209-203 132-144 167-173 0.306 0.020* <0.001*** 5 / 6 ECRV-13 132-132 192-212 140-138 203-203 142-142 171-177 0.569 0.290 <0.001*** 3 / 6 ECRV-14 128-134 200-210 140-138 203-205 134-148 167-167 0.093 <0.001*** <0.001*** 4 / 6 ECRV-15 134-138 192-204 140-140 201-207 144-144 173-187 0.242 0.050 <0.001*** 5 / 6 ECRV-16 132-132 214-214 140-138 203-205 144-144 167-167 0.931 0.806 <0.001*** 3 / 6 ECRV-17 126-132 194-202 138-138 203-203 140-144 177-177 0.875 0.760 <0.001*** 3 / 6 ECRV-18 130-132 198-206 140-138 201-205 142-142 173-177 0.768 0.571 <0.001*** 5 / 6 ECRV-19 124-132 194-204 140-140 203-203 144-144 169-173 0.956 0.927 <0.001*** 4 / 6 ECRV-20 132-134 212-214 140-132 201-205 144-144 165-173 0.319 0.024* <0.001*** 6 / 6 ECRV-21 132-132 202-202 140-138 205-205 140-142 173-173 0.869 0.760 <0.001*** 3 / 6 ECRV-22 124-142 194-198 140-138 203-203 146-146 179-179 0.079 <0.001*** <0.001*** 4 / 6 ECRV-23 124-140 196-202 140-138 205-205 132-132 155-155 0.036* <0.001*** <0.001*** 5 / 6 ECRV-24 124-132 192-202 138-138 209-209 144-150 155-167 0.094 0.002** <0.001*** 5 / 6 ECRV-25 126-134 202-206 138-132 205-205 142-144 173-177 0.503 0.297 <0.001*** 6 / 6 ECRV-26 124-132 204-214 138-138 203-205 144-144 169-175 0.740 0.529 <0.001*** 4 / 6 ECRV-27 132-132 194-206 142-138 203-205 140-146 185-185 0.311 0.007** <0.001*** 4 / 6 ECRV-28 134-134 194-194 138-138 203-205 134-144 173-173 0.882 0.739 <0.001*** 2 / 6 ECRV-29 124-138 194-204 140-140 203-203 142-142 173-173 0.617 0.357 <0.001*** 3 / 6 ECRV-30 122-132 196-208 138-138 205-205 144-144 175-187 0.211 0.010* <0.001*** 5 / 6

Capítulo III

III.3.4.2. ECRV (grupo control de la población natural de la Ría de Vigo) y ERCG (grupo control del reclutamiento)

Todos los individuos que fueron extraídos del intermareal rocoso cercano al pantalán de ECIMAT y que se utilizaron como referencia de la población natural de la Ría de Vigo (ECRV), así como todos los que se utilizaron como control del reclutamiento obtenidos del peso muerto situado en el fondo de la cuerda de cultivo (ERCG), mostraron incompatibilidades genotípicas en al menos dos loci con respecto a HCP (Tabla III.3). Es reseñable que 8 de los 48 individuos de ERCG no fueran asignados a su grupo de muestreo (p. ej., ERCG-7, P (L-Home < 0,002) y que 7 individuos más fueran clasificados como inmigrantes (p. ej., ERCG-2, Pim = 0,001). La causa de tan alta asignación errónea (15/48) fue probablemente su baja probabilidad multilocus en su grupo muestral, un fenómeno que se encuentra facilitado por el alto polimorfismo que presentan los marcadores, el elevado tamaño poblacional de la especie en este área y la limitación del tamaño de la muestra de referencia. La divergencia genotípica de los marcadores entre la progenie control experimental (ECHP) y los controles del reclutamiento (ERCG) y de la población natural (ECRV), indica que existe una baja probabilidad de encontrar genotipos multilocus redundantes entre los reclutas de la población natural y el grupo de individuos seleccionados en el criadero. Este resultado nos permite confiar en las cifras de reclutamiento estimadas con la herramienta de genotipado utilizada en este experimento.

III.3.4.3. Zonas superior (UUSS) e inferior (UBSS) previamente muestreadas

Dos individuos pertenecientes a la zona superior previamente muestreada de la cuerda desprotegida (UUSS-14 y UUSS-19) fueron compatibles con la progenie control del criadero, mientras que ninguno fue compatible con ella en la zona inferior previamente muestreada (UBSS) (Tabla III.3). Por esta razón, todos los individuos de la UBSS y 46/48 individuos de la UUSS fueron reclutas silvestres dentro de los nichos que los muestreos anteriores habían dejado libres de competencia. La compatibilidad de dos individuos del UUSS (UUSS-14 y UUSS-19) con el genotipo multilocus de la progenie control experimental (EHCP) sugiere que los juveniles de ECHP que flanquean los claros muestreados, se movieron hacia esos nichos libres de la cuerda. Otra explicación alternativa puede ser que durante los muestreos

94 Capítulo III

(I, II y III) pasase inadvertida la extracción de todos los juveniles del área de muestreo, quedando alguno oculto que pudiese crecer a posteriori, o bien que exista una redundancia genotípica entre la progenie control del criadero y la población natural (véase la subsección III.3.4.2). En el primer caso el porcentaje de individuos que se desplazarían a lo largo de la cuerda sería cercano al 4%, lo que está en consonancia con las referencias bibliográficas existentes sobre el desplazamiento de los juveniles de mejillón en cultivos en suspensión (p. ej., Sénéchal et al., 2008).

Cabe destacar que 10 individuos fueron excluidos de los grupos UUSS y UBSS, i.e., P (L- Home < 0,05) así como de la progenie control experimental (EHCP) (Pfs < 0,001) y que un total de 23 individuos, incluyendo a los 10 anteriores, fueron clasificados como inmigrantes putativos (Pim < 0,01) de estos grupos (17 de ellos al 1% de probabilidad). Debido al alto grado de polimorfismo de los marcadores STRs utilizados (Presa et al., 2002) y a la alta tasa de fecundidad de los mejillones, no es improbable que los genotipos multilocus silvestres procedentes de fecundaciones independientes de la Ría de Vigo se recluten de forma aleatoria en los nichos libres de la cuerda.

III.3.4.4. Distribuciones de máxima verosimilitud de asignación genotípica multilocus

La figura de las distribuciones genotípicas multilocus frente a su máxima probabilidad de asignación a la progenie control del criadero (HCP) muestra dos escenarios distintos, i.e., una distribución gaussiana de genotipos multilocus, pertenecientes a la progenie control, altamente frecuentes (lado izquierdo de la Figura III.3), y una distribución dispersa de genotipos menos frecuentes procedentes de fuentes externas (inmigrantes en la cuerda, lado derecho de la Figura III.3). Si bien existe cierto solapamiento entre las dos distribuciones, la probabilidad de asignación global a la progenie control fue correcta en el 90% de los casos, i.e., los dos desajustes observados en la progenie de control experimental (EHCP, véase subsección III.3.4.1) fueron compatibles con la progenie de criadero. En este sentido, la eficiencia de los programas actuales de asignación para identificar inmigrantes depende de la composición y del tamaño de la muestra. En la mayoría de los casos donde los tamaños muestrales son limitados, los programas de asignación encuentran mayor número de inmigrantes que los que en realidad existen, p. ej., en el grupo ERCG. Esto no es un

95 Capítulo III

problema con cruzamientos acuícolas controlados, ya que se puede decidir si los genotipos multilocus desemparejados pertenecen a una familia u a otra, tras una inspección visual, incluso si tienen una baja probabilidad de ocurrencia.

Figura III.3. Distribución de la verosimilitud de las probabilidades de asignación (Eje X) de todos los genotipos multilocus (Eje Y; frecuencia absoluta) a la progenie control experimental (EHCP). La flecha indica el umbral de probabilidad más bajo para los genotipos multilocus EHCP.

III.3.4.5. Estimación del reclutamiento entre abril y noviembre de 2008

Durante el recuento de semillas en tramos de 10 cm de longitud a tres profundidades, no se observó depredación en la cuerda protegida desde enero hasta junio de 2008 (Tabla III.4). Esta observación indica que la protección inicial de la cuerda pudo haber impedido la acción depredadora. Tampoco se observaron efectos de la depredación en la cuerda desprotegida

96 Capítulo III

(datos no mostrados). Por tanto, se puede sugerir que el impacto de la depredación en los cultivos en suspensión fue muy bajo durante ese periodo en el área del cultivo. La fijación externa de larvas también fue prácticamente nula durante los tres primeros meses en suspensión, de abril a junio de 2008, en todas las zonas de muestreo de la cuerda desprotegida (Tabla III.4). Tan solo un individuo durante el muestreo III de junio (UUR-13) mostró un genotipo diploide (146/146) en el locus Mgμ1 que es incompatible con el genotipo parental (142/142 x 156/156) de la progenie control (Tabla III.4). Dado que dos mutaciones meióticas en ambos padres son altamente improbables (~10-6 - 10-8), lo más probable es que el individuo UUR-13 sea un recluta externo de la Ría de Vigo, lo que equivale a un 1,7% de reclutamiento externo entre abril y junio de 2008. También se debe destacar que el reclutamiento externo durante el muestreo IV (noviembre de 2008) fue nulo (EHCP, Tabla III.4), al contrario que en las zonas previamente muestreadas (UBSS y UUSS), donde el reclutamiento externo alcanzó sus cotas máximas. En resumen, lograr una cosecha completa a partir de semilla seleccionada en criadero es viable siempre y cuando se haya establecido una densidad juvenil apropiada en las cuerdas de cultivo durante la fase inicial del cultivo.

97 Capítulo III

Tabla III.4. Cantidad de reclutas externos detectados en las cuerdas experimentales de cultivo por muestreo y tratamiento entre abril y noviembre de 2008. R/G (%), relación entre el número de reclutas externos y el número de individuos genotipados. Los tratamientos se indican a continuación: UUR (zona superior de la cuerda desprotegida); MUR (zona media de la cuerda desprotegida); BUR (zona inferior de la cuerda desprotegida); UPR (zona superior de la cuerda protegida); MPR (zona media de la cuerda protegida); BPR (zona inferior de la cuerda protegida); UUSS (zona superior previamente muestreada); UBSS (zona inferior previamente muestreada); EHCP (progenie control experimental); ERCG (control del reclutamiento).

Muestreo Cuerda Tratamiento R/G Total I (Abril 2008) Protegida UPR 0/20 (0%) 0/60 (0%) MPR 0/20 (0%) BPR 0/20 (0%) Desprotegida UUR 0/20 (0%) 0/60 (0%) MUR 0/20 (0%) BUR 0/20 (0%)

II (Mayo 2008) Protegida UPR 0/20 (0%) 0/60 (0%) MPR 0/20 (0%) BPR 0/20 (0%) Desprotegida UUR 0/20 (0%) 0/60 (0%) MUR 0/20 (0%) BUR 0/20 (0%)

III (Junio 2008) Protegida UPR 0/20 (0%) 0/58 (0%) MPR 0/20 (0%) BPR 0/18 (0%) Desprotegida UUR 1/20 (5%) 0/60 (1,7%) MUR 0/20 (0%) BUR 0/20 (0%)

IV (Noviembre 2008) Desprotegida UUSS 22/24 (91,6%) UBSS 24/24 (100%) EHCP 0/20 (0%) ERCG 48/48 (100%)

98 Capítulo III

III.4. Conclusiones

El cultivo en suspensión de semilla de mejillón seleccionada presenta algunos hándicaps, como por ejemplo la depredación a cargo de peces y equinodermos, que ha sido identificada como la mayor causa de pérdida de juveniles en granjas de mejillón (Hayden, 1995), especialmente en individuos de pequeño tamaño (< 20 mm) (Rilov y Schiel, 2006). Esa alta depredación puede requerir una protección de los juveniles seleccionados a la hora de poner el cultivo en marcha, como la utilizada en este experimento piloto, con el fin de maximizar las probabilidades de cosechar por completo el stock seleccionado en hatchery. Es recomendable prevenir el reclutamiento externo mediante la optimización de la densidad de juveniles en las cuerdas y asegurar una asincronía temporal entre el desove natural y la época de siembra para evitar la competencia intraespecífica por el nicho. Teóricamente, los potenciales programas de mejora genética en mejillón permitirían obtener semillas seleccionadas para alto crecimiento (Nguyen et al., 2014), las cuales podrán ser usadas para alcanzar la talla comercial antes que las semillas procedentes del medio natural en un ciclo de producción clásico. Además, la semilla de mejillón producida en criadero podría convertirse en una solución para algunas de las necesidades de los productores, tales como: a) incrementar el número de cuerdas de producción en el lugar de los colectores de semillas; b) proporcionar semilla en localidades donde su reclutamiento natural es escaso (p. ej., Mar de Alborán) o en zonas donde cohabitan varias especies de mitílidos y existen dificultades para extraer la especie deseada (Kamermans et al., 2013), p. ej., en la costa andaluza, donde M. galloprovincialis, Mytilaster minimus y Perna picta comparten los sustratos rocosos del intermareal (Tirado et al., 2005); c) evitar las zonas de vertidos costeros en las cuales no está permitido la colecta de semilla del intermareal rocoso; d) evitar el conflicto entre diferentes sectores de la pesca artesanal, p. ej., los frecuentes enfrentamientos que se producen por las actividades extractivas del percebe (Pollicipes pollicipes) y del mejillón mediterráneo (M. galloprovincialis), los cuales ocupan los mismos nichos ecológicos en la costa rocosa gallega (Molares y Freire, 2003); y e) reducir el impacto ecológico producido por las actividades extractivas debido a la eliminación accidental de especies colaterales cuando se extraen los juveniles mediante rascado. Aunque la puesta en marcha del cultivo a gran escala de semilla seleccionada en criadero, no está aún en las agendas locales, es notorio que ya se esté

99 Capítulo III

llevando a cabo en varios países como USA, Chile o Australia desde hace más de una década. Su implementación a escala local requeriría una investigación previa pormenorizada sobre la producción, la transferencia y el impacto en el medio de semillas seleccionadas de mejillón, p. ej., sobre la variabilidad genética de las poblaciones naturales o sobre la capacidad de carga de los ecosistemas donde tienen lugar los cultivos. También son necesarias estimaciones precisas de la viabilidad económica de las principales variables que entran en juego, p. ej., el coste productivo de la semilla seleccionada en criadero y la remuneración de la mano de obra, en comparación con la producción tradicional a partir de semilla del medio natural (Aghzar et al., 2013). Por último, el control de la semilla seleccionada en criadero debería ser adecuadamente legislado, ya que la actual normativa regional no prevé su generación, distribución o cultivo masivo (p. ej., Ley 11/2008, de 3 de diciembre de Pesca de Galicia).

100 Capítulo III

III.5. Bibliografía

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105

Capítulo IV. Mitílidos de la Región de Magallanes: identificación molecular y estructura genética poblacional de Mytilus chilensis

Capítulo IV

IV.1. Introducción

Los mejillones de la subfamilia Mytilinae (Rafinesque, 1815) constituyen 7 géneros descritos y forman parte de las especies que habitan de manera dominante las comunidades biológicas del intermareal rocoso de aguas templadas. Se distribuyen en ambos hemisferios (distribución antitropical y antipolar) y desarrollan la mayor parte de su ciclo biológico de forma sésil, en la zona intermareal y submareal, tanto de áreas expuestas al oleaje como protegidas (Gosling, 1992).

Figura IV.1. Distribución de las especies de mitílidos relacionadas con esta investigación. Elaboración propia basada en Gosling, 1992, Santaclara et al., 2006 y Gaitán-Espitia et al., 2016.

IV.1.1. Los mejillones de interés comercial en Chile

El género Choromytilus está formado por 3 especies: Choromytilus chorus (Molina, 1782) es una especie nativa en Chile, que se distribuye desde las costas del sur del Perú hasta Magallanes, extendiendo su área de dispersión por la costa atlántica de Argentina hasta el sur de Brasil, incluyendo a las islas Malvinas (Osorio y Bahamonde, 1968) (Figura IV.1); Choromytilus meridionalis (Krauss, 1848) se distribuye a lo largo de la costa sudafricana (Figura IV.1) y Choromytilus palliopunctatus (Carpenter, 1857) muestra una distribución natural a lo largo de la costa pacífica oriental, desde los Estados Unidos hasta México. El

109 Capítulo IV

mejillón Choromytilus chorus es conocido en Chile como “choro zapato” y es la 4ª especie en importancia comercial dentro de sus moluscos bivalvos, con 1.079 toneladas de producción. El 84,89% de la producción ocurre en la Región de Los Lagos y a diferencia de otros bivalvos, su cultivo tiene también relevancia en otras regiones, como en la Araucanía (13,44%) y en la región de Los Ríos (1,67%).

El género Aulacomya está formado por 4 especies, que se distribuyen por los océanos del hemisferio sur (HS) a lo largo de la región subantártica. Por lo tanto, su distribución se extiende por la costa pacífica y atlántica de Sudamérica (Aulacomya atra, Molina, 1782) (Figura IV.1), la costa de Sudáfrica (Aulacomya capensis, Dunker, 1846), el Archipiélago de la Islas Kerguelen (Aulacomya regia, Powell, 1957) y las islas meridionales de Nueva Zelanda (Aulacomya maoriana, Iredale, 1915). La carne de la especie Aulacomya atra, conocida en Chile comúnmente como “cholga”, se considera de menor calidad que la de Mytilus chilensis (Lasta et al., 1998) y se destina básicamente al mercado interno. Su venta se realiza mayoritariamente como pieza entera, en fresco o congelada, y en menor medida en conserva (Gutiérrez et al., 2015). En Chile se produjeron 1.501 t de A. atra en 2017, todas ellas en la región de Los Lagos.

La especie Perumytilus purpuratus (Lamarck, 1819) o “chorito maico” en Chile, se distribuye a lo largo del Cono Sur, desde la costa pacífica de Ecuador (2ºS) hasta el Cabo de Hornos (56ºS), extendiéndose también a lo largo de la costa atlántica sudamericana por la región de la Patagonia (41ºS) (Argentina) (Figura IV.1) (Alvarado y Castilla, 1996; Zagal y Hermosilla, 2001). Su distribución abarca aproximadamente 8.100 km de línea costera (Figura IV.1). Es la única especie de su género y a diferencia del género Mytilus, Aulacomya y Choromytilus, no pertenece a la subfamilia Mytilinae, sino a la subfamilia Brachidontinae, al igual que las especies del género Brachidontes.

El género Mytilus es un complejo de especies muy próximas y ampliamente estudiadas en el hemisferio norte (HN) (Figura IV.1) (Koehn, 1991; McDonald et al., 1991), que comprende a M. edulis (Linnaeus, 1758), M. galloprovincialis (Lamarck, 1819) y M. trossulus (Gould, 1850) entre otras. La composición de este género en el hemisferio sur ha sido clarificada recientemente en Australia y Nueva Zelanda (Ab Rahim et al., 2016; Gardner et

110 Capítulo IV

al., 2016; Westfall y Gardner, 2010, 2013), pero no así en Sudamérica, donde su estatus específico no está resuelto (Larraín et al., 2018) debido a incertidumbres de identidad taxonómica (Daguin y Borsa, 2000; McDonald et al., 1991; Ouagajjou et al., 2011; Oyarzun et al., 2014, 2016; Westfall et al., 2010; Westfall y Gardner, 2013).

Las especies chilenas del género Mytilus se han estudiado con marcadores nucleares tales como alozimas (Cárcamo et al., 2005; McDonald et al., 1991; Toro et al., 2006), microsatélites (Larraín et al., 2014; Ouagajjou et al., 2011; Valenzuela et al., 2016), genes nucleares (Mac- 1, Glu-5’) y sus espaciadores (ITS) (Daguin y Borsa, 2000; Hilbish et al., 2000; Larraín et al., 2012; Tarifeño et al., 2012; Toro et al., 2005; Westfall y Gardner, 2010, 2013; Wood et al., 2003) y también marcadores mitocondriales (16S-ADNr, COI, COIII) (Gérard et al., 2008; Oyarzún et al., 2016; Toro, 1998;). Recientemente se han descrito nuevos métodos de secuenciación NGS, que han permitido identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) dispersos por todo el genoma (Araneda et al., 2016; Mathiesen et al., 2017; Saarman y Pogson, 2015; Zbawicka et al., 2012, 2014), que aumentan considerablemente la resolución de la identificación taxonómica (Larraín et al., 2018).

El estado taxonómico del mejillón del género Mytilus que habita la costa chilena desde Concepción (Río Tirúa, ~38ºS) hasta el Cabo de Hornos (~53ºS) (Hernández y González, 1976; Toro et al., 2006), ha sido objeto de gran debate en los últimos años, debido a discrepancias relativas a la distinta señal evolutiva de los marcadores empleados o bien a reivindicaciones históricas (Borsa et al., 2012). Por ejemplo ha sido denominado M. edulis utilizando alozimas (Koehn, 1991; McDonald et al., 1991; Seed, 1992), M. edulis chilensis usando análisis morfológicos y moleculares (Toro, 1998), M. chilensis (Oyarzún et al., 2016; Toro et al., 2004;, estos últimos identificándolo como el linaje de M. galloprovincialis del hemisferio sur), M. galloprovincialis chilensis (Cárcamo et al., 2005, 30 alozimas), M. platensis (Astorga et al., 2015) o M. edulis platensis, i.e., subespecies de M. edulis (Astorga et al., 2015; Borsa et al., 2012; Valenzuela et al., 2016). Incluso se ha propuesto el nombre de M. planulatus (Lamarck, 1819), descrito en Albany (Australia), que hace referencia al linaje de M. galloprovincialis del hemisferio sur (Astorga et al., 2015; Westfall y Gardner, 2010, 2013). Sin embargo los últimos trabajos de investigación, incluido éste, con múltiples

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marcadores y muestreos más amplios que los acostumbrados, no han detectado a M. planulatus en el Cono Sur.

El nombre M. chilensis o “chorito quilmahue” (Osorio et al., 1979) sigue empleándose tanto en estadística pesquera (FAO, 2016) como en etiquetas comerciales, tal como corresponde al principio de prioridad taxonómica, según el cual la especie nativa de la costa pacífica de Sudamérica, i.e., M. chilensis, fue ya descrita por Hupé (1854) en especímenes estudiados en Concepción (Chile). Los primeros trabajos con marcadores microsatélites (Ouagajjou et al., 2011) y con el gen mitocondrial COI (Seguel, 2011), demuestran que esta especie pertenece al género Mytilus y es genéticamente distinta al resto de las especies descritas en el hemisferio norte, validando su denominación original M. chilensis (Hupé, 1854). Este estatus ha sido corroborado en trabajos posteriores basados en la estructura del esperma (Oyarzún et al., 2014) y en otros marcadores nucleares (Araneda et al., 2016; Larraín et al., 2014; Oyarzún et al., 2016). Los trabajos más recientes en los que se emplean SNP resolutivos entre especies (Larraín et al., 2018; Zbawicka et al., 2018), así como el genoma mitocondrial de las hembras de M. chilensis (Smietanka y Burzynski, 2017), han confirmado la especificidad evolutiva de M. chilensis. Debido a toda la confusión generada por intereses y marcadores diversos, el nombre de M. chilensis sufrió en 2013 su eliminación de las clasificaciones taxonómicas (p. ej. World Register of Marine Species, WoRMS) como mejillón nativo chileno (Boxshall et al., 2014), pero finalmente ha conseguido recientemente su reconocimiento taxonómico oficial (Horton, 2018).

IV.1.2. Importancia comercial del género Mytilus en Chile

Los mejillones del género Mytilus muestran una distribución antitropical (Hilbish et al., 2000) y son una fuente alimentaria importante, por lo que se explotan en muchos países (FAO, 2016; Ferreira y Bricker, 2016). Analizando retrospectivamente la evolución temporal de la industria acuícola de mitílidos en Chile, ya en la década de 1930 existen registros de una gran actividad extractiva de mejillón procedente de bancos naturales. Desde su cultivo, la mitilicultura chilena ha dependido de la capacidad de suministro de semilla procedente de las poblaciones naturales, como sucede en otras regiones del mundo donde se cultivan extensivamente ésta u otras especies similares (Figueras, 2007). La mayoría de la semilla se

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recolecta mediante el uso de redes de nylon trenzadas a modo de colectores (Furci, 2009). Esa recolección se lleva a cabo principalmente en la franja costera que va desde Quillaipe hasta Hornopiren así como en el mar interior de Chiloé, en la región de Los Lagos (41- 44º S), de la cual procede la mayoría de la producción de mitílidos en Chile (SERNAPESCA, 2017). Es a partir de la década de 1960 cuando se comenzó a observar un declive en la semilla de las poblaciones naturales, por lo que el gobierno chileno inició un programa de investigación con el objetivo de desarrollar el cultivo de moluscos bivalvos (Leiva et al., 2007). Esta iniciativa ya está dando sus frutos, puesto que en la actualidad Chile es el segundo productor mundial de mejillón (Mytilus spp.) con una producción anual de 338.847 t durante el año 2017 (FAO, 2016), justo por detrás de China, lo que representa el 28,63% del volumen de mercado de la acuicultura chilena. Al igual que sucede con la recolección de larvas, toda esa producción procede mayoritariamente del Golfo de Reloncaví y de la Isla de Chiloé, situados en la Región de Los Lagos, que en el año 2017 representó el 99,99% de la producción, procediendo el 0,01% restante de la Región de los Ríos (SERNAPESCA, 2017).

IV.1.3. Taxonomía molecular del mejillón chileno

Las invasiones marinas bien sean naturales por dinámicas climáticas, por introducciones accidentales en aguas de lastre (Geller, 1999; Grant y Cherry, 1985), por hull fouling (Apte et al., 2000; Murray et al., 2011) o bien por introducciones deliberadas, se están registrando a escala planetaria (Gardner et al., 2016; Lee y Chown, 2007; Shaw et al., 2014). Su temprana identificación taxonómica puede ayudar a la protección de los equilibrios tróficos locales, así como a la explotación sostenible de los recursos locales (Mace, 2004; Seddon et al., 2005). Tal identificación en el cono sur está dificultada por varios factores. En primer lugar, todas las especies de Mytilus muestran una gran plasticidad fenotípica, como se ha demostrado a través del estudio de la morfología valvar ampliamente condicionada por el ambiente local (Krapivka et al., 2007; McDonald et al., 1991). En segundo lugar, todas las especies de Mytilus hibridan (Gardner, 1997; Michalek et al., 2016) dada su compatibilidad genética, p. ej. se ha comprobado in vitro la compatibilidad gamética en cruzamientos de M. galloprovincialis x M. trossulus (Matson et al., 2003) y de M. galloprovincialis x M edulis platensis (i.e., M. chilensis) (Toro et al., 2012; Valenzuela et al., 2016). En la naturaleza se

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han descrito poblaciones híbridas de M. edulis x M. galloprovincialis en la costa noratlántica europea (Bierne et al., 2003; Brooks y Farmen, 2013; Gardner y Skibinski 1988; Hilbish et al., 2002; Skibinski et al., 1978, 1983; Väinölä y Hvilsom, 1991), poblaciones híbridas de M. edulis x M. trossulus en la costa este de Canadá (Comesaña et al., 1999) y poblaciones híbridas de M. galloprovincialis x M. trossulus en la costa pacífica y atlántica de Norteamérica (Anderson et al., 2002; Bates e Innes, 1995; Elliot et al., 2008; Mcdonald y Koehn, 1988; Rawson et al., 1999; Toro et al., 2004), en el Mar Blanco (Skurikkhina et al., 2001) y en Japón (Brannock et al., 2009; Brannock y Hilbish, 2010; Inoue et al., 1995). En tercer lugar, la hibridación pasa inadvertida con marcadores mitocondriales, cuya herencia uniparental doble y la recombinación de mitogenomas complica aún más la tarea de identificación específica (Skibinski et al., 1994; Zouros et al., 1994).

La introducción de especies exóticas es uno de los puntos más delicados en las agendas medioambientales (Ojaveer et al., 2015). Los datos indican que M. galloprovincialis del hemisferio norte está presente en el Golfo de Arauco (Región de Bio-Bio, 37º 06’ 16’’S, 73º 21’ 33’’ W) (Astorga, 2012; Astorga y Toro, 2010; Daguin y Borsa, 2000; Tarifeño et al., 2005, 2012; Toro et al., 2005; Westfall y Gardner, 2010;) y que ha sido recientemente introducido desde el Mediterráneo hacia la costa chilena (Larraín et al., 2018), lo cual ha conllevado una larga polémica en Chile (Castilla y Neill, 2009) dada su facilidad de hibridación espontánea con especies locales (Branch y Steffani, 2004; McQuaid y Phylips, 2000;). Por ejemplo, algunos autores han llegado a proponer que el mejillón chileno actual es la mezcla de M. galloprovincialis HN, el mejillón M. galloprovincialis HS y M. edulis (Westfall y Gardner, 2010). Más recientemente se ha informado de la existencia de M. edulis (Gaitán-Espitia et al., 2016, denominado M. platensis) y de M. trossulus (Barrera, 2009; Larraín et al., 2012; Oyarzún et al., 2016) en el sur de Chile. Sin embargo, es bien dudosa la extensión de M. galloprovincialis hacia el sur de la Región de Concepción, como ha sido informado recientemente (Oyarzún et al., 2016; pero véase crítica en Araneda et al., 2016, pág. 3633).

IV.1.4. La especificidad ecológica de la Región de Magallanes

La región de Magallanes en el sur de Chile se caracteriza por un sistema único de fiordos y canales. Específicamente, el Estrecho de Magallanes es un complejo canal natural que

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conecta los océanos Pacífico y Atlántico. Se trata de un área de alto valor de conservación, dadas las diferencias bióticas entre ambos océanos, y es una de las tres provincias antárticas reconocidas clásicamente (Thatje y Mutschke, 1999). A lo largo de ese estrecho, los moluscos del género Mytilus son los macroinvertebrados más importantes de la fauna bentónica (Aldea y Rosenfeld, 2011). Han sido un componente ecológico clave de la línea costera desde el período Holoceno (Estévez et al., 2001; Gordillo et al., 2010; Rabassa et al., 2009) y el registro fósil indica que un mejillón azul con caparazón liso (Mytilus spp.) puede remontarse al Mioceno tardío (~ 10 Ma a.p.) en esa región (Aguirre et al., 2008; Martínez y del Río, 2002;). El estatus taxonómico de los mejillones de la región de Magallanes y de la costa atlántica argentina aún dista de estar resuelto, si bien se asume desde hace años que en ésta habita M. edulis platensis (Trucco, 2000) también llamado anteriormente M. edulis (McDonald et al., 1991).

En la Región Magallánica, al igual que en la de Los Lagos, con fuerte producción mitícola, se han detectado híbridos de M. edulis x M. chilensis (Larraín et al., 2012; Oyarzún et al., 2016; Toro et al., 2005) y de M. trossulus x M. chilensis (Larraín et al., 2012; Oyarzún et al., 2016). También se ha informado de la presencia de M. edulis, M. galloprovincialis y sus híbridos en el Estrecho de Magallanes (Oyarzún et al., 2016), si bien las herramientas moleculares empleadas (Inoue et al., 1995) parecen no haber sido aplicadas adecuadamente (Araneda et al., 2016) o bien carecen de carácter diagnóstico en el género Mytilus (Fernández-Tajes et al., 2011). Considerando la presencia descrita de especies de Mytilus del hemisferio norte y del Atlántico sur en la Región de Magallanes y la gran abundancia de mejillones en este área, existe alta probabilidad de que haya algún tipo de interacción genética con los mejillones nativos del Pacífico, donde las aguas costeras se encuentran y se mezclan con las atlánticas (Salinas et al., 2004).

IV.1.5. Objetivos

Dado el obligado etiquetado de las especies producidas en acuicultura para la trazabilidad, la seguridad y el márketing, es importante delimitar cuántas especies existen y dónde se localizan, cuáles son nativas y cuáles introducidas. El fraude comercial en productos marinos es hoy día muy amplio (Pérez et al., 2018; Pérez y Presa, 2008) e incluye la dilución, el

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etiquetado y la sustitución, entre otros (Reglamento CE 1005/2008, Reglamento CE 1224/2009). Dicha identificación molecular no sólo tiene relevancia en la gestión de los productos comerciales, sino en taxonomía, ecología y evolución.

En este sentido el primer objetivo de este trabajo ha consistido en identificar las especies comerciales de mejillones presentes en el área de alto valor de conservación de la Región de Magallanes (Chile). En segundo lugar, una vez identificadas las especies locales, es importante determinar su grado de hibridación con especies potencialmente invasoras, la posibilidad de introgresión (Dias et al., 2014; Michalek et al., 2016) y la estructura poblacional del recurso para su gestión adecuada. En este sentido, el segundo objetivo de este trabajo ha consistido en establecer la estructura poblacional de M. chilensis desde la Región de Los Lagos hasta las costas australes de la Región de Magallanes con fines de autentificación, gestión y conservación, incluido el estudio de la hibridación e introgresión potencial con las especies del hemisferio norte, en especial con el mejillón mediterráneo M. galloprovincialis descrito en la región central de Chile.

Para abordar esos dos objetivos se ha utilizado una propiedad importante de los marcadores genéticos. Para el primer objetivo hemos elegido una herramienta molecular variable entre especies, pero fijada o conservada dentro de especie. Sin embargo, para el segundo objetivo hemos elegido marcadores conservativos entre especies pero muy variables dentro de especie, lo que permite asegurar que trabajamos sobre el genoma exclusivo de M. chilensis.

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IV.2. Material y métodos

IV.2.1. Muestreo y extracción de ADN

Los mejillones se recolectaron durante el año 2013 en 12 poblaciones de mejillón procedentes del submareal e intermareal rocoso situados entre el paralelo 41ºS y el 55ºS de la costa meridional chilena. Una parte se muestreó en localidades pertenecientes a la Región de Magallanes, la más meridional de la costa chilena, mientras que otra parte se obtuvo en localidades de las regiones de Los Lagos y Aysén, situadas al norte de la Región de Magallanes (Figura IV.2).

Figura IV.2. Zonas de muestreo de mejillón a lo largo de la costa meridional de Chile. Las localizaciones se encuentran abreviadas de la siguiente manera: Pelluco (PE), Ilque (ILQ), Caicaén (CAI), Puerto Raúl Marín (PRM), Isla Larga (IL), Puerto Curtze (PC), Puerto Zenteno (PZ), Estuario Fanny (EF), Sector Guairabo (SG), Bahía Bell (BB), Seno Ventisquero (SV) y Puerto Williams (PW). Los gráficos circulares indican las proporciones de alelos específicos del gen que codifica la proteína adhesiva polifenólica (PAP) de Mytilus spp. (cebadores Me-15/16) en cada localidad: negro (alelo Ch-126 pb de Mytilus chilensis), blanco (alelo E-180 pb de Mytilus edulis) y gris (alelo T-168 pb de Mytilus trossulus).

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Se tomaron ≈50 individuos en cada localidad (n = 691) y se clasificaron in situ mediante la inspección visual de sus rasgos morfológicos. Los morfos pertenecían a cuatro géneros comerciales de mejillón que se encuentran presentes regularmente en esos hábitats (Tabla IV.1), i.e., Mytilus spp., Perumytilus purpuratus, Choromytilus spp. y Aulacomya spp. Las muestras se etiquetaron y enviadron al laboratorio hasta sus análisis posteriores y el tejido del manto se conservó en Etanol 95% para la extracción de ADN. Las muestras de referencia de las especies de Mytilus del hemisferio norte se obtuvieron de anteriores campañas realizadas por el grupo de investigación, i.e., M. edulis, M. galloprovincialis y M. trossulus.

Tabla IV.1 Localización y códigos de identificación de las muestras de mejillón obtenidas en regiones del sur de Chile. Coordenadas geográficas según el sistema de referencia WGS84.

Coordenadas Especies Localidad Código Región (Latitud/Longitud) Aulacomya atra Isla Larga IL Magallanes 52º 18’ S / 73º 37’ W Choromytilus chorus Punta Zenteno PZ Magallanes 52º 47’ S / 70º 44’ W Mytilus chilensis Pelluco PE Los Lagos 41º 30’ S / 72º 53’ W Ilque ILQ Los Lagos 41º 37’ S / 73º 05’ W Caicaén CAI Los Lagos 41º 48’ S / 73º 11’ W Puerto Raúl Marín PRM Aysén 43º 46’ S / 72º 57’ W Puerto Curtze PC Magallanes 52º 49’ S / 71º 23’ W Estuario Fanny EF Magallanes 53º 11’ S / 72º 06’ W Bahía Bell BB Magallanes 53º 56’ S / 71º 48’ W Seno Ventisquero SV Magallanes 54º 51’ S / 70º 19’ W Puerto Williams PW Magallanes 54º 56’ S / 67º 36’ W Perumytilus purpuratus Sector Guairabo SG Magallanes 53º 18’ S / 70º 56’ W Mytilus edulis Rønde (Dinamarca) OME Midtjylland 56º 17’ N / 10º 27’ E

IV.2.2. Análisis genéticos

La extracción del ADN genómico de los individuos muestreados se realizó a partir de 15 mg de tejido procedente del manto mediante el Kit para la extracción de ADN de moluscos E.Z.N.A.® (Omega Bio-Tek), según se indica en el protocolo del fabricante. El pellet de ADN obtenido tras la extracción se resuspendió en agua ultrapura y se preservó a -20ºC

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hasta los análisis moleculares, i.e., identificación de especies mediante PCR-RFLP y genotipado de microsatélites mediante PCR.

IV.2.2.1. PCR-RFLP (Polimorfismos en longitud de fragmentos de restricción)

Se emplearon análisis de RFLP basados en calibraciones previas para identificar las especies de mejillón muestreadas. La identidad molecular del genero Mytilus se exploró mediante la amplificación del exón Glu-5’ del gen de la proteína polifenólica adhesiva (PAP) (Waite, 1992). Los amplicones fueron generados en todas las especies de Mytilus (muestras y especies de referencia) mediante la pareja de cebadores específicos Me-15/16 (Inoue et al., 1995; Rawson et al., 1996). La identidad molecular de Choromytilus spp. se exploró mediante la amplificación del fragmento de ADN de 123 pb del espaciador interno ITS1- ADNr (Heath et al., 1995). Se generaron amplicones de PCR en todos los especímenes de Choromytilus usando cebadores específicos (Santaclara et al., 2006), seleccionados sobre la secuencia del espaciador ITS1-ADNr obtenida con los cebadores universales XelaITS1.1 y OnmyITS1.2 (Pérez et al., 2005). Por último, la identidad molecular de Perumytilus purpuratus y de Aulacomya spp. se exploró mediante la amplificación del gen 18s-ADNr (Bendezu et al., 2005). Se generaron amplicones de PCR en ambas especies usando la pareja de cebadores específicos MusRFLP (Santaclara et al., 2006).

Todas las reacciones de PCR se realizaron en un volumen total de 20 µl que contenía 1 µl de ADN molde (~100 ng), 0,75 unidades de ADN polimerasa BIOTAQTM (Bioline®), 2 μl de tampón de reacción, 0,3 mM de dNTP, 0,5 µM de cada cebador, 2 mM de MgCl2 y 6,9 µl de agua ultrapura. Las reacciones se llevaron a cabo en un Mastercycler Gradient Thermocycler (Eppendorf), programadas para un total de 37 ciclos de reacción. Estas reacciones consistieron en un primer ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 5 minutos; seguido de 35 ciclos, cada uno de ellos con un paso de desnaturalización a 95ºC durante 40 segundos, un paso de anillamiento a 56ºC durante 30 segundos y un paso de extensión a 72ºC durante 40 segundos; y por último, un ciclo de extensión final a 72ºC durante 15 minutos. Alícuotas de 2 μl que contenían el producto de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2% (SeaKem® LE) para comprobar la amplificación esperada, mientras que los 18 μl restantes se purificaron mediante ExoSAP-ITTM (Applied Biosystems™) según

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se indica en las instrucciones del fabricante. Casi la mitad del producto de amplificación (~8 μl) se utilizó en digestiones PCR-RFLP y el resto se usó como amplicones de control no digeridos, en los geles de electroforesis utilizados para la valoración.

Los amplicones de PCR obtenidos mediante los cebadores CHORO en la región del ITS1- ADNr, deberían mostrar un tamaño esperado de 100 pb, tanto en la especie Choromytilus chorus como en Choromytilus meridionalis (Santaclara et al., 2006). Tras la digestión del amplicón con AfaI (New England BioLabs®) se esperaría generar un producto con cuatro fragmentos (24 + 21 + 28 + 26) pb en la especie C. chorus o bien un patrón de 3 fragmentos (24 + 50 + 26) pb en la especie C. meridionalis (Santaclara et al., 2006).

Se espera que el tamaño de los amplicones generados con los cebadores MusRFLP en el gen 18S-ADNr sea de 237 pb en P. purpuratus y A. atra. La digestión del amplicón con MspI (New England BioLabs®) produciría un patrón de dos fragmentos (203 + 34) pb en la especie P. purpuratus, diferente al patrón que se generaría en caso de pertenecer al género Brachidontes (237 pb), pero idéntico al esperado en Semimytilus algosus. La digestión del amplicón mediante la enzima NlaIII (New England BioLabs®) producirá un patrón de dos fragmentos (174 + 63) pb en P. purpuratus, diferente al patrón que se obtendría en caso de pertenecer a la especie Semimytilus algosus (Santaclara et al., 2006).

Finalmente, también se esperaría que el tamaño de los amplicones obtenidos mediante los cebadores MusRFLP sobre el gen 18S-ADNr fuera de 237 pb en Aulacomya spp. La digestión de dicho amplicón mediante AfaI (New England BioLabs®) generaría un patrón de bandas para las especies del género Choromytilus (237 pb) y otro diferente para los géneros Semimytilus, Brachidontes y Aulacomya (213 + 24) pb, mientras que la digestión con Cac8I (New England BioLabs®) produciría un patrón especifico de 3 fragmentos (99 + 73 + 65) pb perteneciente a A. atra (Santaclara et al., 2006).

El tamaño de los amplicones de PCR obtenidos con los cebadores Me-15/16 sobre la proteína PAP sirvió para identificar a las especies del genero Mytilus del hemisferio norte, i.e., se esperarían amplicones específicos de 126 pb (M. galloprovincialis), 168 pb (M. trossulus) y 180 pb (M. edulis) (Inoue et al., 1995; Rawson et al., 1996). La digestión del

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amplicón generado con Me-15/16-PAP usando la enzima AciI (New England BioLabs®) permitiría distinguir entre el patrón digerido de M. galloprovincialis (75 + 51) pb y el amplicón no digerido de M. chilensis (126 pb) (Santaclara et al., 2006).

Todas las reacciones de digestión se realizaron de manera similar para cada enzima de restricción. Los amplicones se digirieron en un volumen de 20 µl, mediante la incubación de 14 µl de ADN molde, 2 µl de tampón de reacción 1X (CutSmart®), 0,2 µl (10 U/ µl) de cada endonucleasa y agua ultra pura hasta completar la reacción, en un baño termostático a 37ºC durante 5 horas. Finalmente, se sometieron 7 µl de cada producto digerido a electroforesis en geles de agarosa de alta resolución al 3% (Sigma-Aldrich®) durante 60 minutos a 70 voltios de tensión.

IV.2.2.2. Genotipado de Mytilus chilensis con microsatélites

Las 10 muestras chilenas de Mytilus spp. (n = 441) y 28 individuos de M. edulis del hemisferio norte, utilizado como grupo externo, se genotiparon con 4 marcadores microsatélites seleccionados por su calidad de amplificación. Tres de ellos (Mch1, Mch3 y Mch8) fueron desarrollados por Ouagajjou et al. (2011) para M. chilensis, mientras que el microsatélite Mgμ3 se describió en Presa et al. (2002) para la especie M. galloprovincialis. Para las reacciones de amplificación se emplearon alrededor de 100 ng de ADN por individuo y contenían un volumen de 15 μl con 0,75 unidades de ADN Polimerasa BIOTAQTM (Bioline®), 1,5 μl de tampón de reacción, 0,2 µM de cada cebador, 0,2 mM de cada dNTP y 1,5 mM MgCl2. El cebador directo de cada microsatélite se marcó con los fluorocromos 5’-FAM (Mch1, Mch3 y Mch8) y 5’-HEX (Mgμ3). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un Mastercycler Gradient Thermocycler (Eppendorf), y se programaron para 37 ciclos de reacción, que consistieron en un primer ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos, cada uno de ellos con un paso de desnaturalización a 95ºC durante 40 segundos, un paso de anillamiento a 55ºC durante 30 segundos y un paso de extensión a 72ºC durante 40 segundos, y por último, un ciclo de extensión a 72ºC durante 15 minutos. Los productos de la amplificación (amplicones) se sometideron a electroforesis capilar en un 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®) en el Servicio de secuenciación del Centro de Apoyo Científico y Tecnológico

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a la Investigación (CACTI) de la Universidad de Vigo. Los tamaños alélicos de los fragmentos de PCR se determinaron con ayuda del estándar de tamaño GeneScanTM 500 ROXTM (Applied BiosystemsTM). La lectura de los genotipos se realizó utilizando el software GeneMarker® (SoftGenetics®, LLC) y los datos genotípicos se tabularon en una hoja de cálculo para preparar los archivos de entrada a los programas analíticos.

IV.2.3. Análisis estadísticos

La identificación molecular de las muestras pertenecientes a géneros distintos de Mytilus spp. se evaluó cualitativamente mediante la comparación de los patrones RFLP observados en geles de agarosa, con los patrones específicos descritos en la bibliografía consultada. La composición de especies de cada localidad se tabuló con los patrones RFLP observados y esperados. Los patrones RFLP observados en las muestras de Mytilus spp. se compararon conjuntamente con las especies de Mytilus spp. del hemisferio norte en geles de agarosa de alta resolución. La frecuencia alélica de cada especie de Mytilus spp. se rerpresentó en un gráfico de frecuencias.

La diversidad genética de las poblaciones de mejillón chileno ha sido evaluada a través de la obtención de parámetros como las frecuencias alélicas, el número de alelos (Na) y la riqueza alélica (RS), utilizando el software FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 1995), así como a través de la heterocigosidad observada (HO), la heterocigosidad esperada (HE) y el equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE), calculados con el software GENEPOP 4.7 (Rousset, 2008). La frecuencia teórica de alelos nulos se infirió usando el Expectation-Maximization Algorithm (Dempster et al., 1977) implementado en FreeNA (Chapuis y Estoup, 2007).

La diferenciación genética entre poblaciones se evaluó usando el índice de fijación FST de Wright (Wright, 1965) calculado con FSTAT. La significatividad estadística de los valores

FST comparados por pares se obtuvo a través de 45.000 permutaciones y se corregió mediante el test False Discovery Rate (FDR) de Benjamini y Hochberg (1995). El test de Mantel (Mantel, 1967) se ejecutó para testar el modelo de aislamiento por distancia (IBD) desarrollado por Wright (1943), el cual explora la regresión entre la distancia genética

[FST/(1-FST)] y la distancia geográfica por comparación de pares de muestras. Para ello se

122 Capítulo IV

utilizó el programa ISOLDE implementado en GENEPOP 4.7. Las relaciones genéticas entre muestras basadas en la distribución matemática de sus genotipos se exploró a través de la distancia euclídea, mediante el análisis de coordenadas principales (PCoA) implementado en GenAlEx 6.5 (Peakall y Smouse, 2012).

La estructura genética de las poblaciones de M. chilensis se calculó a través de dos métodos bayesianos. En primer lugar, se realizó un análisis bayesiano conservador usando la opción “admixture based on mixture clustering” implementado en BAPS 6.0 (Corander y Marttinen, 2006), el cual nos permite calcular el número de grupos génicos existente en el conjunto de datos. En segundo lugar, se implementó un análisis de agrupamiento bayesiano basado en genotipo multilocus individual mediante el programa STRUCTURE 2.3.4 (Pritchard et al., 2000). El número más probable de grupos génicos se estimó usando el modelo “admixture”, asumiendo la correlación de las frecuencias alélicas entre poblaciones, empleando información previa de las localidades de muestreo y con un rango de grupos génicos posible (K) situado entre 1 y 11. Se realizaron 20 “runs” independientes para cada valor K experimental (30.000 repeticiones “burn-in” seguidas de 70.000 repeticiones MCMC). El número real de poblaciones se identificó mediante el método ΔK (Evanno et al., 2005) utilizando POPHELPER (Francis, 2016).

El análisis locus por locus de la varianza molecular (AMOVA) se efectuó utilizando el programa ARLEQUIN 3.5 (Excoffier et al., 2005), al objeto de dividir la varianza genética del set de datos entre regiones (FCT), entre poblaciones dentro de cada región (FSC) y dentro de poblaciones (FST), para los agrupamientos obtenidos con PCoA y BAPS (dos grupos génicos mayores, i.e., muestras de la región de Los Lagos y muestras de la región de Magallanes), así como con STRUCTURE (siete grupos génicos, i.e., 4 grupos en la Región de Los Lagos-Aysén y 3 grupos en la Región de Magallanes). La distribución de la varianza también se calcuó entre especies, i.e., Mytilus chilensis vs. Mytilus edulis del hemisferio norte.

123 Capítulo IV

IV.3. Resultados

IV.3.1. Identidad molecular de los mejillones chilenos

Los resultados del procedimiento de identificación de especies mediante la técnica PCR- RFLP se muestran resumidos en la Tabla IV.2 y gráficamente en las Figuras IV.3 - IV.6.

Choromytilus chorus. Los 150 individuos muestreados en la localidad de Punta Zenteno (PZ), preclasificados como C. chorus, exhibieron el mismo amplicón de 123 pb procedente de la amplificación del gen 18S-ADNr con los cebadores MusRFLP (Figura IV.3A). Ese amplicón es distinto al esperado en el género Perna. El tamaño esperado del amplicón para las especies C. chorus y C. meridionalis era de 100 pb (Santaclara et al., 2006). La digestión con la enzima AfaI produjo el patrón de (75 + 48) pb en todos los individuos, frente al esperado en C. chorus (24 + 21 + 28 + 26) pb y en C. meridionalis (24 + 50 + 26) pb.

Figura IV.3. Patrones de restricción (RFLP) obtenidos mediante electroforesis en geles de agarosa 2%, de tres especies de mitílidos de la Región de Magallanes: A) Choromytilus chorus; pocillo #2: amplicón de 123 pb procedente de la región ITS1-ADNr, pocillo #3: digestión enzimática con AfaI (75 + 48) pb, digestión parcial. B) Aulacomya atra; pocillos #5 y #8: amplicón de 237 pb procedente del gen 18S-ADNr; pocillo #6: digestión enzimática con AfaI (213 + 24) pb; pocillo #9 digestión enzimática con Cac8I (99 + 73 + 65) pb. C) Perumytilus purpuratus; pocillos #11 y #14: amplicón de 237 pb sobre el gen de proteína adhesiva polifenólica (PAP); pocillo#12: digestión enzimática con MspI (203 + 34) pb; pocillo#15: digestión enzimática con NlaIII (174 + 63) pb. Los pocillos #1, #4, #7, #10 y #13 contienen el marcador de tamaño molecular HyperLadderTM V (escala de 25 pb) cuyas bandas más intensas tienen tamaños de 100 y 200 pb.

Aulacomya atra. Los individuos muestreados en la localidad de Isla Larga (IL), situada en la Región de Magallanes, mostraron el mismo patrón de bandas RFLP (213 + 24) pb tras la digestión enzimática con AfaI del amplicón de 237 pb generado con los cebadores MusRFLP sobre el gen 18S-ADNr (Figura IV.3B, Tabla IV.2). Este patrón es compartido entre los géneros locales Semimytilus, Brachidontes y Aulacomya, pero excluye a Choromytilus (237 pb). La digestión ulterior con Cac8I produjo un patrón (99 + 73 + 65) pb

124 Capítulo IV

(Figura IV.3B), que resulta exclusivo de la especie Aulacomya atra, distinto al esperado para los géneros Semimytilus y Brachidontes (164 + 73) pb.

Perumytilus purpuratus. La amplificación del gen 18S-ADNr con los cebadores MusRFLP produjo un fragmento de 237 pb en 50 individuos clasificados a priori como Perumytilus purpuratus procedentes del Sector Guairabo (SG, Región de Magallanes) (Figura IV.3C, Tabla IV.2). El tamaño de ese amplicón es transversal a diversos géneros. Las digestiones enzimáticas produjeron 48 individuos con el patrón (203 + 34) pb para la enzima MspI, que es compartido con Semimytilus algosus pero excluyente de Brachidontes. Sin embargo, el patrón obtenido en todos los individuos con la enzima NlaIII (174 + 63) pb es específico de P. purpuratus (Figura IV.3C), i.e., por contraste con la ausencia de cortes en el amplicón de Semimytilus algosus (237 pb) (véase Tabla IV.7 de Santaclara et al., 2006).

Mytilus galloprovincialis. Para identificar la presencia del mejillón mediterráneo M. galloprovincialis introducido en tiempos recientes en la región chilena de Concepción, se efectuó el contraste de patrones RFLP producidos sobre el amplicón Me-15/16 del marcador Glu-5’ de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) de cada especie. El amplicón común a M. chilensis y M. galloprovincialis es de 126 pb y se espera un patrón de (69 + 57) pb en M. galloprovincialis (Santaclara et al., 2006) y una ausencia de corte en M. chilensis (126 pb) tras su digestión con la enzima AciI (Figura IV.4, Tabla IV.2). El patrón de restricción observado para M. galloprovincialis (control del hemisferio norte en este estudio) fue de (75 + 51) pb. No se ha observado el patrón de M. galloprovincialis en ninguna de las muestras analizadas en la costa central y meridional chilenas. Se ha observado el patrón esperado de M. chilensis en todos los individuos Mytilus spp. de todas las localidades muestreadas, tanto en la Región de Los Lagos como en la Región de Magallanes.

125 Capítulo IV

Figura IV.4. Patrones de bandas (RFLP) obtenidos mediante electroforesis en geles de agarosa 3%, tras la digestión con AciI del amplicón Me-15/16 obtenido sobre el gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP). Pocillos #3 y #6: Mytilus galloprovincialis (126 pb, no digerido); Pocillo #9: Mytilus chilensis (126 pb, no digerido): pocillos #4 y #7: patrón de digestión de M. galloprovincialis con AciI (75 + 51) pb; pocillo #10: patrón de digestión de Mytilus chilensis con AciI (126 pb). Los pocillos #1, #5, #8 y #116 contienen el marcador de tamaño molecular HyperLadderTM V (escala de 25 pb) cuyas bandas de mayor intensidad corresponden a 100 pb y 200 pb. El pocillo #2 contiene el control negativo de la amplificación Me-15/16 por PCR (dímero de cebadores de 46 pb). Mytilus edulis. La digestión con la endonucleasa AciI del amplicón del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) con los cebadores Me-15/16 produjo el patrón (126/99 + 81) pb en 11 individuos de cuatro muestras de la Región de Magallanes (SG, EF, SV, PW) (Tabla IV.2). Siendo el amplicón de 126 pb específico de M. chilensis, el patrón (99 + 81) pb corresponde a la digestión enzimática del amplicón de la especie M. edulis (180 pb) (Figura IV.5).

126 Capítulo IV

Figura IV.5. Patrones de bandas (RFLP) obtenidos mediante electroforesis en geles de agarosa al 2%, tras la digestión enzimática con AciI del amplicón del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) con los cebadores Me-15/16. Pocillos #2 y #7: Mytilus edulis (180 pb), no digerido; pocillo #3: Mytilus edulis (99 + 81) pb, digestión parcial; pocillo #4: híbrido Mytilus chilensis/Mytilus edulis (126/180) pb; pocillo #5: híbrido Mytilus chilensis/Mytilus edulis (126/99 + 81) pb, digestión parcial; pocillo #7: Mytilus trossulus (168 pb), no digerido; pocillo #8: Mytilus edulis (99 + 81) pb, digestión completa; pocillo #9: híbrido Mytilus chilensis/Mytilus trossulus (126/168) pb; pocillo #10: híbrido Mytilus chilensis/Mytilus trossulus (126/93 + 75) pb, digestión completa. Pocillos #1, #6 y #11 contienen el marcador de tamaño molecular HyperLadderTM V (escala de 25 pb), las bandas más intensas tienen un tamaño de 100 y 200 pb.

Mytilus trossulus. La digestión con la endonucleasa AciI del amplicón del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) con los cebadores Me-15/16 produjo el patrón (126/93 + 75) pb en cuatro individuos de tres muestras de la Región de Magallanes (PC, EF, SV) y en tres individuos de una muestra de la Región de los Lagos (ILQ) (Tabla IV.2). Siendo el amplicón de 126 pb específico de M. chilensis, el patrón (93 + 75) pb corresponde a la digestión enzimática del amplicón de la especie M. trossulus (168 pb) (Figura IV.5).

Dada la incertidumbre en la distinción de patrones RFLP similares sobre la proteína adhesiva PAP de M. edulis y M. trossulus se elaboró un gel de contraste de modo que se eliminasen las ambigüedades en la interpretación de los datos (Tabla IV.2). En el gel de alta resolución se observó la distinción clara de ambos patrones i.e., (99 + 81) pb de M. edulis y (93 + 75) pb de M. trossulus (Figura IV.5).

127 Capítulo IV

Figura IV.6. Patrones de bandas (RFLP) obtenidos mediante digestión con AciI, en electroforesis en agarosa de alta resolución al 3% (Sigma-Aldrich®) del amplicón del gen de la proteína adhesiva polifenólica (PAP) con los cebadores Me- 15/16. Pocillo #2: híbrido M. edulis/M. chilensis (180/126) pb; pocillo #3: híbrido Mytilus trossulus/Mytilus chilensis (168/126) pb; pocillos #4 y #7: híbridos Mytilus chilensis/Mytilus edulis (126/99 + 81) pb, digestión completa; pocillo #5: Mytilus chilensis (126 pb), no digerido; pocillo #8: híbrido Mytilus chilensis/Mytilus trossulus (126/93 + 75) pb. Obsérvese la diferencia de patrones de digestión entre Mytilus edulis (pocillo #7) y Mytilus trossulus (pocillo #8). Pocillos #1, #6 y #9 contienen el marcador de tamaño molecular HyperLadderTM V (escala de 25 pb) cuyas bandas más intensas tienen un tamaño de 100 y 200 pb. La banda de 46 pb que aparece sistemáticamente, corresponde a un dímero de los cebadores (véase control de amplificación en la Figura IV.4).

128

Tabla IV.2. Identidad genética de 3 especies de mejillón (C. chorus, P. purpuratus y A. atra) muestreadas en 3 localidades de la Región de Magallanes (PZ, IL, SG), y de las especies Mytilus spp. muestreadas en 10 localidades del sur de Chile (desde SG hasta PRM). La identificación de especie se efectuó mediante PCR-RFLP sobre 3 secuencias de ADN nuclear (ADN): gen PAP de la proteína adhesiva polifenólica (Inoue et al., 1995); gen 18S-ADNr (Bendezu et al., 2005), y espaciador intergénico ITS1-ADNr (Heath et al., 1995). Cebadores indica el nombre del par de oligonucleótidos empleados para generar los amplicones sobre el ADN nuclear. ER indica el nombre de la endonucleasa utilizada para generar patrones de restricción RFLP. Amplicón indica el tamaño en pares de bases generado por amplificación de los cebadores sobre al ADN diana. Patrón de restricción hace referencia a los patrones de digestión (en pares de bases) observados tras la digestión del amplicón con la correspondiente endonucleasa. El número de individuos analizados se muestra entre corchetes debajo del código de cada población. La frecuencia de individuos que presentan un patrón dado (en pares de bases) se muestra bajo cada patrón.

Patrón de Restricción PZ IL SG PC EF BB SV PW CAI PE ILQ PRM Especie ADN Cebadores ER Amplicón [150] [50] [100] [50] [50] [50] [50] [50] [33] [32] [36] [40]

75+48 C. chorus ITS1 CHORO AfaI 123 ------[150]

203+34 P. purpuratus 18S MusRFLP MspI 237 ------[48]

174+63 18S MusRFLP NlaIII 237 ------[48]

213+24 A. atra 18S MusRFLP AfaI 237 ------[49]

99+73+65 18S MusRFLP Cac8I 237 ------[49]

126 126 126 126 126 126 126 126 126 126 M. chilensis PAP Me 15/16 AciI 126 - - [45] [49] [48] [49] [44] [48] [33] [32] [33] [40]

126/99+81 126/99+81 126/99+81 126/99+81 M. chilensis/ M. edulis PAP Me 15/16 AciI 126/180 ------[5] [1] [4] [1]

126/93+75 126/93+75 126/93+75 126/93+75 M. chilensis/ M. trossulus PAP Me 15/16 AciI 126/168 ------[1] [1] [2] [3]

Capítulo IV

IV.3.2. Diversidad genética de Mytilus chilensis

Los cuatro marcadores microsatélites empleados (Mgμ3, Mch1, Mch3 y Mch8) fueron polimórficos en todas las muestras (Tabla IV.3). Su amplificación por PCR produjo 63 alelos, de los cuales 18 fueron únicos y se distribuyeron en tres muestras: Caicaén (CAI, 14 alelos), Estuario Fanny (EF, 3 alelos) y Pelluco (PE, 1 alelo). El alelo modal de cada locus se conservó en todas las muestras de la Región de Magallanes, pero difirió entre las de la Región de Los lagos, y ambas regiones entre sí, así como con el grupo externo M. edulis (Tabla IV.3). En este grupo externo se observó la fijación alélica del marcador Mgu3. El marcador más polimórfico fue Mch1, con una media alélica de (μ ± SD = 10,46 ± 5,54) mientras que Mgμ3 fue el marcador de menor media alélica (μ ± SD = 4,55 ± 2,34).

El mayor número de alelos (19) y de riqueza alélica se observaron en el locus Mch1, en la muestra de Puerto Williams (PW), mientras que la muestra de Caicaén (CAI) mostró los mayores índices de diversidad esperada y riqueza alélica media (Rs = 7,44 ± 1,07), frente a Pelluco (PE), que mostró el menor promedio alélico (Rs = 3,52 ± 1,42). La menor riqueza alélica se registró en el locus Mch3 en Los Lagos (PE, Rs = 1,97) y en el locus Mgμ3 en Magallanes (SG, Rs = 1,99). Puerto Raúl Marín (PRM) y Puerto Curtze (PC) fueron las localidades que menos Rs promedio mostraron, con valores respectivos de 3,43 ± 1,25 y 2,91 ± 0,96. Por otro lado, si examinamos el promedio del número de alelos por cada población, encontramos que Caicaén (CAI) fue la población con mayor promedio (13,00 ± 4,55) (Tabla IV.3). La Región de Los Lagos presentó una mayor riqueza alélica promedio (Rs = 4,73 ± 1,87) que la Región de Magallanes (Rs = 4,10 ± 1,02).

La heterocigosidad esperada (HE) por muestra osciló entre 0,42 ± 0,19 (PC) y 0,91 ± 0,04

(CAI), con una HE promedio de 0,64 ± 0,21. La heterocigosidad observada (HO) por muestra varió entre 0,12 ± 0,24 (PE) y 0,38 ± 0,12 (SG). La HO promedio para el total de las poblaciones fue de 0,28 ± 0,24 (Tabla IV.3). Las pruebas realizadas para testar el Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) revelaron que 33 de las 44 muestras (11 poblaciones por cuatro marcadores, i.e., el 75%) fueron incompatibles con las proporciones esperadas de Hardy- Weinberg (Tabla IV.3). El mayor desequilibrio se observó en todos los loci en la muestra

130 Capítulo IV

CAI en la Región de Los Lagos. La frecuencia media teórica de alelos nulos por locus osciló entre 0,11 ± 0,09 (Mch3) y 0,27 ± 0,18 (Mgμ3) (Tabla IV.3).

131

Tabla IV.3. Parámetros genéticos obtenidos sobre la variación alélica de cuatro marcadores microsatélite seleccionados, sobre 10 muestras de M. chilensis (códigos de identificación en la Tabla IV.1) y el grupo externo M. edulis (OME). N, número de individuos genotipados; Na, número de alelos; Rango, rango de tamaños alélicos en pares de bases; Modal, tamaño del alelo modal o multimodal (m.m.), en pares de bases; Rs, riqueza alélica; HE, heterocigosidad esperada; HO, heterocigosidad observada; FIS, índice de fijación por muestra; Nulo, frecuencia teórica de alelos nulos. * Desviación significativa de FIS respecto a cero (p < 0,01).

Locus Población (N) SG (48) PC (48) EF (48) BB (48) SV (46) PW (48) PE (32) CAI (33) ILQ (36) PRM (40) OME (28) Total Mch3 Na 5 5 10 8 7 7 2 14 7 5 6 6,909 ± 0,160 Rango 98-122 98-122 94-132 98-122 98-128 98-128 114-126 88-182 90-122 90-124 82-124 82 – 182 Modal 114 114 114 114 114 114 114 114 114 110 124 114 RS 3,214 3,338 5,068 3,795 4,004 4,361 1,974 7,064 4,981 4,408 4,586 4,254 ± 0,066 HE 0,486 0,500 0,715 0,524 0,571 0,672 0,368 0,858 0,716 0,767 0,790 0,633 ± 0,008 HO 0,535 0,525 0,583 0,422 0,333 0,511 0,000 0,458 0,714 0,448 0,471 0,455 ± 0,009 FIS -0,101 -0,050 0,184* 0,194 0,416* 0,239 1,000* 0,466* 0,002 0,416* 0,405* 0,288 ± 0,016 Nulo 0,000 0,000 0,095 0,083 0,136 0,091 0,281 0,212 0,000 0,162 0,167 0,112 ± 0,005 Mgμ3 Na 3 3 7 4 8 7 4 7 4 2 1 4,545 ± 0,131 Rango 130-140 138-142 130-146 130-140 130-150 130-150 128-142 126-154 138-148 130-132 132 126 – 150 Modal 138 138 138 138 138 138 132-142 140 m.m. 132 132 138 RS 1,992 2,202 3,911 2,790 4,528 4,216 3,917 6,136 3,936 2,000 1,000 3,330 ± 0,083 HE 0,269 0,349 0,662 0,493 0,680 0,687 0,787 0,909 0,791 0,513 0,000 0,558 ± 0,015 HO 0,292 0,427 0,122 0,054 0,077 0,091 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,097 ± 0,008 FIS -0,083 -0,228 0,816* 0,890* 0,887* 0,868* 1,000* 1,000* 1,000* 1,000* NA 0,715 ± 0,026 Nulo 0,000 0,000 0,328 0,303 0,359 0,352 0,426 0,455 0,428 0,325 0,001 0,271 ± 0,010 Mch1 Na 9 10 13 11 16 19 6 18 4 6 3 10,455 ± 0,286 Rango 152-170 152-178 144-178 146-174 144-176 140-178 144-156 130-168 146-164 142-164 140-156 130 – 178 Modal 160 160 160 160 160 160 148 152 160 150 140 160 RS 4,679 4,062 5,953 5,152 7,245 8,097 5,284 8,594 3,381 4,548 2,298 5,390 ± 0,101 HE 0,738 0,636 0,830 0,785 0,897 0,921 0,830 0,942 0,550 0,708 0,511 0,759 ± 0,008 HO 0,425 0,333 0,239 0,275 0,512 0,375 0,480 0,577 0,350 0,393 0,050 0,364 ± 0,007 FIS 0,424* 0,476* 0,712* 0,650* 0,429* 0,593* 0,422* 0,387* 0,364* 0,445* 0,902* 0,528 ± 0,009 Nulo 0,174 0,182 0,319 0,280 0,195 0,279 0,186 0,175 0,001 0,161 0,297 0,204 ± 0,005 Mch8 Na 3 5 11 5 3 7 3 13 7 3 5 5,909 ± 0,187 Rango 200-210 198-210 190-220 202-214 200-210 180-220 180-218 180-232 180-242 180-242 180-194 180 – 242 Modal 202 202 202 202 202 202 180 200 208 190 188 202 RS 2,080 2,047 5,015 3,394 2,727 4,422 2,917 7,962 5,775 2,773 4,456 3,961 ± 0,099 HE 0,272 0,195 0,661 0,507 0,409 0,751 0,638 0,933 0,860 0,558 0,759 0,595 ± 0,013

HO 0,271 0,167 0,075 0,103 0,091 0,080 0,000 0,400 0,121 0,000 1,000 0,210 ± 0,016 FIS 0,005 0,146* 0,887* 0,796* 0,778* 0,893* 1,000* 0,571* 0,859* 1,000* -0,318 0,602 ± 0,025 Nulo 0,044 0,060 0,356 0,277 0,237 0,375 0,382 0,262 0,391 0,357 0,000 0,249 ± 0,008 Total Na 5,000 ± 1,414 5,750 ± 1,493 10,250 ± 1,250 6,750 ± 1,547 8,500 ± 2,723 10,000 ± 3,000 3,750 ± 0,853 13,000 ± 2,273 5,500 ± 0,866 4,000 ± 0,912 3,750 ± 1,108 RS 2,991 ± 0,093 2,912 ± 0,073 4,986 ± 0,063 3,782 ± 0,081 4,626 ± 0,167 5,274 ± 0,148 3,523 ± 0,151 7,439 ± 0,118 4,518 ± 0,107 3,432 ± 0,126 3,085 ± 0,214 HE 0,441 ± 0,108 0,420 ± 0,093 0,717 ± 0,039 0,577 ± 0,068 0,639 ± 0,105 0,757 ± 0,056 0,655 ± 0,100 0,910 ± 0,021 0,729 ± 0,063 0,636 ± 0,064 0,515 ± 0,177 HO 0,380 ± 0,061 0,363 ± 0,076 0,255 ± 0,115 0,213 ± 0,079 0,253 ± 0,104 0,264 ± 0,106 0,120 ± 0,120 0,358 ± 0,125 0,296 ± 0,157 0,210 ± 0,122 0,380 ± 0,232 FIS 0,061 ± 0,018 0,086 ± 0,023 0,650 ± 0,024 0,632 ± 0,025 0,627 ± 0,021 0,648 ± 0,023 0,855 ± 0,030 0,606 ± 0,030 0,556 ± 0,046 0,715 ± 0,030 0,329 ± 0,075 Nulo 0,054 ± 0,006 0,060 ± 0,006 0,274 ± 0,009 0,235 ± 0,007 0,231 ± 0,007 0,274 ± 0,009 0,318 ± 0,008 0,276 ± 0,009 0,205 ± 0,017 0,251 ± 0,007 0,116 ± 0,010

132 Capítulo IV

IV.3.3. Distancia genética entre muestras y entre regiones

El mayor rango de distancia genética se observó entre regiones (0,089 – 0,467), seguido de la Región de Los Lagos (0,098 – 0,275) y de la Región de Magallanes (0,050 – 0,135) (Tabla IV.4). El 57,14% (12/21 tests) de las distancias genéticas entre pares de muestras dentro de región fue significativo. El 83,3% (5/6 tests) de las distancias entre pares de muestras dentro de la Región de Los Lagos fue significativo. El 46,67% (7/15 tests) de las distancias entre pares de muestras dentro de la Región de Magallanes fue significativo. El 79,17% (19/24) de las distancias entre pares de muestras de diferentes regiones fue significativo (Tabla IV.4).

Tabla IV.4. Valores de diferenciación (FST) entre muestras (véanse códigos en la Tabla IV.1). Las líneas punteadas de color gris muestran la separación de las muestras por regiones (Los Lagos: PE, CAI, ILQ, PRM; Magallanes: SG, PC, EF, BB, SV, PW). Se indica con un asterisco (*) los pares de muestras que presentan una divergencia significativa (p < 0,01).

PE CAI ILQ PRM SG PC EF BB SV PW PE - 0,110 0,218* 0,224* 0,390* 0,402* 0,229* 0,290* 0,235* 0,163* CAI - 0,098* 0,158* 0,256* 0,274* 0,089* 0,154* 0,122 0,052 ILQ - 0,275* 0,240* 0,243* 0,116 0,162* 0,140 0,092 PRM - 0,453* 0,467* 0,278* 0,357* 0,295* 0,211* SG - 0,000 0,057* 0,016 0,047 0,118* PC - 0,060* 0,020 0,063* 0,135* EF - 0,005 0,017 0,033* BB - 0,013 0,050* SV - 0,025 PW -

IV.3.4. Modelo de aislamiento por distancia

El test de Mantel que regresa la distancia genética sobre la distancia geográfica, realizado sobre todas las poblaciones de ambas regiones, produjo una pendiente significativa (R2 = 0,239, p = 0,001). A pesar de la significatividad se observó una elevada dispersión de valores en torno a la recta patrón (Figura IV.7). Además, también se realizó un test de mantel jerárquico para cada región en los que no se observó una pendiente significativa: Los Lagos (R2 = 0,194, p = 0,099) y Magallanes (R2 = 0,496, p = 0,118).

133 Capítulo IV

Figura IV.7. Test de Mantel empleado para calcular la regresión entre la distancia genética y la distancia geográfica entre pares de muestras de M. chilensis (R2 = 0,239, F = 13,488, p = 0,006).

IV.3.5. Análisis de coordenadas principales (PCoA)

Las tres primeras coordenadas principales (PCoA) computadas a partir de la matriz de similitud de distancias entre muestras, explicaron un 86,20% del total de la variación observada en el cuerpo muestral. La primera coordenada (eje X) explicó el 65,39% de la variación, la segunda coordenada (eje Y) explicó el 14,49% de la variación y la tercera coordenada (eje Z) explicó el 6,32% de la variación (Figura IV.8).

134 Capítulo IV

Figura IV.8. Análisis de coordenadas principales (PCoA) a partir de datos genotípicos de 10 muestras de M. chilensis (véanse códigos en Tabla IV.1) y el grupo externo M. edulis (OME). Las elipses a trazo discontinuo indican los grupos de muestras de la Región de Los Lagos (PE, CAI, PRM, ILQ) y de la Región de Magallanes (SV, PW, BB, EF, SG, PC).

IV.3.6. Estructura poblacional de Mytilus chilensis

El número de grupos génicos identificados con el método bayesiano implementado en STRUCTURE varió en función del universo muestral considerado, i.e., K = 2 en el conjunto muestral; K = 4 en la Región de Los Lagos; K = 2 en la Región de Magallanes (Figura IV.9).

135 Capítulo IV

Figura IV.9. Asignación genotípica individual a grupos génicos, basada en el método Bayesiano implementado en STRUCTURE. Cada color representa un grupo génico sin divergencia interna, compuesto por las muestras cuyos códigos se indican bajo el gráfico. A) Región de Los Lagos (gráfico superior); B) conjunto de ambas regiones (gráfico central); C) Región de Magallanes (gráfico inferior).

El número de grupos génicos identificados con el método bayesiano implementado en BAPS entre los testados (K = 1 - 11) con un modelo de mezcla (Mixture Analysis) fue de K = 8 en el conjunto muestral, que incluye a M. edulis (Figura IV.10), a razón de K = 3 en la Región de Magallanes (se agrupan 2 a 2 las muestras más cercanas geográficamente) y de K = 4 en la Región de Los Lagos (cada muestra es un grupo génico identificable).

Figura IV.10. Asignación genética individual a grupos génicos, basada en el método Bayesiano implementado en el software BAPS. Cada color representa un grupo génico sin divergencia interna, compuesto por las muestras cuyos códigos se indican bajo el gráfico.

136 Capítulo IV

IV.3.7. Distribución de la varianza molecular

El análisis de la varianza molecular locus a locus (AMOVA) se efectuó a 5 niveles jerárquicos (Tabla IV.5). La mayor variación significativa se registró entre las especies M. chilensis y M. edulis (FCT = 0,240). La diferenciación genética entre todas las muestras fue significativa (FST = 0,187) y más elevada que la observada entre las muestras de M. chilensis (FST = 0,167). La divergencia entre regiones (K = 2, PCoA y STRUCTURE) fue significativa (FCT = 0,151) y también lo fue dentro de regiones (FSC = 0,101). La varianza entre los 7 grupos de muestras (K = 7, BAPS) fue la más elevada de los niveles jerárquicos analizados dentro de M. chilensis (FCT = 0,172) y la única partición con composición genética homogénea dentro de grupo génico (FST = 0,012, no significativa) (Tabla IV.5).

137 Capítulo IV

Tabla IV.5. Análisis jerárquico de la varianza molecular (AMOVA) por locus sobre 456 individuos de Mytilus chilensis procedentes de su completa distribución en el sur de Chile. La significatividad de los estadísticos F se indica mediante un asterisco (*, p  0,01; ns, no significativo).

Nivel de distribución Fuente de variación SS Componente Variación Estadístico-F varianza

Todas las muestras Entre muestras 186,884 0,286 18,73% FST = 0,187*

Dentro de muestras 864,043 1,241 81,27%

M. chilensis Entre muestras 153,485 0,250 16,74% FST = 0,167* Dentro de muestras 824,240 1,241 83,26%

M. chilensis, 2 Entre regiones 0,609 0,245 15,10% FCT = 0,151* regiones: Entre muestras dentro de 2,876 0,139 8,55% FSC = 0,101* Los Lagos (PE, CAI, región ILQ, PRM) vs. Dentro de muestra 24,240 12,41 76,35% FST = 0,237* Magallanes (SG, PC, EF, BB, SV, PW)

M. chilensis, 7 grupos: Entre grupos 146,386 0,260 17,16% FCT = 0,172* PE vs. CAI vs. ILQ vs. ns Entre muestras dentro de 7,099 0,015 1,01% FSC = 0,012 PRM vs. [SG, PC] vs. grupo [EF, BB] vs. [SV, PW] Dentro de muestras 824,240 1,241 81,82% FST = 0,182*

M. chilensis vs. M. Entre especies 33,399 0,470 23,97% FCT = 0,240* edulis Entre muestras dentro de 153,485 0,250 12,73% FSC = 0,167* spp. Dentro de especies 864,043 1,241 63,30% FST = 0,367*

138 Capítulo IV

IV.4. Discusión

IV.4.1. Identidad molecular de los mejillones chilenos

IV.4.1.1. Choromytilus spp. de Punta Zenteno (Región de Magallanes)

El amplicón de 123 pb del gen 18S-ADNr observado en todos los individuos preclasificados como C. chorus procedentes de Punta Zenteno (PZ), es distinto al esperado en el género Perna ((171 – 207) pb, véase aquí Tabla IV.6 obtenida de Santaclara et al. (2006), pág. 8468)), lo cual excluye a las especies de este último género, por otra parte, no descritas en el Pacífico sur hasta la fecha. Tanto el tamaño de dicho amplicón (123 pb), como su patrón de digestión con AfaI (75 + 48) pb, también difieren de los esperados para las especies C. chorus y C. meridionalis, i.e., 100 pb ambos: C. chorus (24 + 21 + 28 + 26) pb y C. meridionalis (24 + 50 + 26) pb, según se describe en la Tabla IV.6 obtenida de Santaclara et al. (2006). Este resultado no permite asignar el patrón AfaI-18S-ADNr observado (75 + 48) pb a ninguna de las dos especies incluidas con anterioridad en dicha clave molecular. Dado que las muestras de Choromytilus spp. se clasificaron a priori morfológicamente como Choromytilus chorus, que es la única especie del género descrita en el Cono Sur, y que todos los individuos analizados procedentes de tres réplicas de la estación de Puerto Zenteno presentaron el mismo patrón RFLP, es factible que la divergencia entre ambos estudios, el presente y el de Santaclara et al. (2006), sea debida a un error de diseño o de ejecución experimental. No obstante, en el trabajo de Santaclara et al. (2006) no se proporciona a) la información de origen geográfico de las muestras, b) ni los tamaños de amplificación esperados tras el diseño de los nuevos cebadores CHORO, c) ni el número de individuos analizado, d) ni los datos brutos de RFLP obtenidos en ese trabajo. Por ello damos mayor fiabilidad a las réplicas efectuadas en el presente trabajo y por tanto al patrón (75 + 48) pb de AfaI-18S- ADNr observado en C. chorus. No se dispone sin embargo ni de los amplicones ni de los patrones RFLP que los cebadores CHORO producirían en las especies congenéricas Choromytilus meridionalis y Choromytilus palliopunctatus, por lo que ignoramos el carácter diagnóstico de este patrón.

139 Capítulo IV

Tabla IV.6. Patrones RFLP (en pares de bases) obtenidos por Santaclara et al. (2006) mediante la amplificación del primer CHORO en la región 18S-ADNr en los géneros Perna y Choromytilus.

Tamaño del Enzima de Especies Patrón RFLP Haplotipos producto de PCR restricción

Perna viridis 171 / 100 BtgI 171 / 100 A

Perna canaliculus 207 / 100 BtgI 207 / 100 B

Perna perna 200 / 100 BtgI 98 / 102 /100 C

Choromytilus chorus 100 AfaI 24 / 21 / 28 / 26 D

Choromytilus meridionalis 100 AfaI 24 / 50 / 26 E

IV.4.1.2. Aulacomya spp. de Isla Larga (Región de Magallanes)

El patrón de bandas RFLP (213 + 24) pb observado con AfaI sobre el amplicón de 237 pb del gen 18S-ADNr en 49 especímenes de Aulacomya spp. es compartido con los géneros locales Semimytilus, Brachidontes y Aulacomya, pero excluye a Choromytilus (237 pb, no se digiere con AfaI) (Tabla IV.7, obtenida de Santaclara et al. (2006)). Sin embargo, el patrón RFLP obtenido con Cac8I produjo un patrón (99 + 73 + 65) pb en Aulacomya spp., que difiere del esperado para los géneros Semimytilus y Brachidontes (164 + 73) pb (Tabla IV.7, obtenida de Santaclara et al. (2006)). Por ello, la evidencia de la preclasificación morfológica como Aulacomya spp. y la concordancia de patrones esperados respecto al trabajo de referencia y la procedencia geográfica de la muestra, sugieren que se trata de la especie Aulacomya atra. Este patrón molecular pudiera no ser específico, ya que en la mencionada clave molecular no se incluyeron las especies congenéricas de otras latitudes, Aulacomya capensis, Aulacomya maoriana, Aulacomya regia.

140 Capítulo IV

Tabla IV.7. Patrones RFLP (en pares de bases) obtenidos por Santaclara et al. (2006) mediante la amplificación del primer MusRFLP sobre la región 18S-ADNr en diferentes géneros como Mytilus, Perna, Choromytilus, etc.

Enzimas de restricción BsaHI AfaI Cac8I Haplotipos

Especies Patrón RFLP Patrón RFLP Patrón RFLP

Mytilus edulis 169, 68 213, 24 85, 73, 51, 28 AAA

Mytilus galloprovincialis 169, 68 213, 24 85, 73, 51, 28 AAA

Mytilus trossulus 169, 68 213, 24 85, 73, 51, 28 AAA

Mytilus chilensis 169, 68 213, 24 85, 73, 51, 28 AAA

Mytilus californianus 169, 68 213, 24 85, 79, 73 AAB

Perna perna 237 237 86, 78, 73 BBB

Perna canaliculus 237 237 86, 78, 73 BBB

Perna viridis 237 237 86, 78, 73 BBB

Choromytilus meridionalis 237 237 86, 78, 73 BBB

Choromytilus chorus 237 237 86, 78, 73 BBB

Aulacomya atra 237 213, 24 99, 73, 65 BAC

Otras especies 237 213, 24 164, 73 BAD

IV.4.1.3. Perumytilus purpuratus del Sector Guairabo (Región de Magallanes)

Mientras que el amplicón no digerido del gen 18S-ADNr en 48 especímenes de Perumytilus purpuratus del Sector Guairabo (237 pb) es transversal a diversos géneros, el patrón de bandas RFLP generado por MspI sobre él (203 + 34) pb es compartido con Semimytilus algosus y excluye a Brachidontes. Sin embargo, el patrón obtenido en todos los individuos con la enzima NlaIII (174 + 63) pb es específico de P. purpuratus por contraste con la ausencia de cortes en el amplicón de Semimytilus algosus (237 pb) (Tabla IV.8, obtenida de Santaclara et al. (2006)). Esta diagnosis común entre ambos estudios, unida a la existencia de una sola especie dentro de este género y a la evidencia morfológica, hace muy probable que los individuos muestreados pertenezcan a la única especie descrita de este género en la costa chilena Perumytilus purpuratus. No obstante, se ha descrito que esta especie cuenta con dos poblaciones aparentemente diferenciables por morfología espermática (Briones et al., 2012, 2013) y por variabilidad molecular de

141 Capítulo IV microsatélites (Guiñez et al., 2016), que podrían albergar divergencias moleculares susceptibles de alcanzar la capacidad diagnóstica entre stocks.

Tabla IV.8. Patrones RFLP (en pares de bases) obtenidos por Santaclara et al. (2006) mediante la amplificación del primer MusRFLP en la región 18S-ADNr en los géneros Brachidontes, Perumytilus y Semimytilus.

Enzimas de restricción MspI NlaIII Haplotipos Especies Patrón RFLP Patrón RFLP

Brachidontes rodriguezii 237 174, 63 AA

Brachidontes granulatus 237 174, 63 AA

Perumytilus purpuratus 203, 34 174, 63 BA

Semytilus algosus 203, 34 237 BB

IV.4.1.4. Presencia de Mytilus galloprovincialis en la costa sur de Chile.

El contraste de patrones RFLP producidos por AciI sobre el amplicón Me-15/16 de la proteína PAP confirma la divergencia de las especies M. chilensis (126 pb, no digerible) y M. galloprovincialis (126 pb, patrón (75 + 51) pb). Ese patrón es similar al indicado por Santaclara et al. (2006) (69 + 57) pb, y las diferencias entre ellos se deben probablemente a las distintas condiciones electroforéticas empleadas en ambos estudios. El objeto del contraste de patrones era el de rastrear la presencia del mejillón mediterráneo M. galloprovincialis, introducido en tiempos recientes en Chile, y confinado experimentalmente a la Región de Concepción (Tubul). El patrón no digerido de 126 pb, descrito por Santaclara et al. (2006) para la especie M. chilensis, observado en los 446 individuos del estudio, que comprende las regiones de Los Lagos y Magallanes, indica que M. galloprovincialis no se ha extendido a las regiones muestreadas, o que su presencia es mínima, debido a la incertidumbre generada por el tamaño muestral del estudio.

La presencia de M. galloprovincialis del hemisferio norte en Chile ha sido descrita hace dos décadas (Daguin y Borsa, 2000; Toro et al., 2005, 2006) y se cree restringida al Golfo de Arauco (37º 06’ 16’’S, 73º 21’ 33” W) (Tarifeño et al., 2012). Su origen parece asignarse al Mar Mediterráneo (Larraín et al., 2018) y se desconoce el medio de introducción, si bien se ha descrito recientemente un evento similar de colonización de M.

142 Capítulo IV galloprovincialis en ausencia de déficit de heterocigotos (al contrario de lo observado en las zonas híbridas del hemisferio norte, p. ej., Wenne et al., 2016); esto es, no tiene barreras reproductivas con M. edulis platensis en la costa argentina (Zbawicka et al., 2018). Esta introducción de M. galloprovincialis en la localidad de Puerto Madryn (Argentina) no parece ser deliberada en el cultivo de M. e. platensis (Dellatorre et al., 2007), ni un ensayo experimental, sino una introducción accidental por biofouling o agua de lastre en buques procedentes de Europa, Norteamérica y Chile (Zbawicka et al., 2018).

Hay gran incertidumbre sobre la extensión de M. galloprovincialis hacia el sur de su localización inicial, i.e., el Golfo de Arauco (Daguin y Borsa, 2000). Actualmente no se la considera una especie peligrosa y su cultivo experimental se restringe a la Región del Bio- Bio (Regulación Nº 96/2015, Ministerio de Economía, Desarrollo y Turismo, www.leychile.cl/Navegar?idNorma=256174). Sin embargo, dado su historial de invasiones exitosas en otras latitudes (Branch y Steffani, 2004; Lowe et al., 2000; McQuaid y Phylips, 2000; Oyarzún et al., 2013), el riesgo de bioseguridad que representa M. galloprovincialis podría ser elevado para las poblaciones locales de mitílidos chilenos (ver Ley Chilena Nº 18892 www.leychile.cl/Navegar?idNorma=30265).

Algunos autores indican que M. galloprovincialis es el mitílido dominante en la región central de chile (Oyarzún et al., 2016) y en una primera evaluación poblacional extensiva en el sur, efectuada con tres marcadores moleculares, se detectó una elevada frecuencia de M. galloprovincialis en la Región de Magallanes (Oyarzún et al., 2016). Sin embargo, tal abundancia parece ser un artefacto surgido de un fallo técnico en la ejecución de la herramienta molecular Me-15/16-PAP (Araneda et al., 2016; pág. 3633) y a una falta de especificidad en la herramienta COIXba-RFLP desarrollada por Fernández-Tajes et al. (2011) (véase la elevada frecuencia de M. galloprovincialis en la Tabla 2 de Oyarzún et al. (2016), pág. 578). Un trabajo reciente empleando los cebadores Me-15/16 sobre la proteína PAP solo detectó un híbrido M. chilensis x M. galloprovincialis en la localidad de Piedra Azul, en la Región de Chiloé (Larraín et al., 2018) y otros los trabajos anteriores no detectaron su presencia en el Golfo de Trinidad (49º S) (Westfall y Gardner, 2013). En el presente trabajo no se detecta ni un solo alelo de M. galloprovincialis en el sur de Chile.

143 Capítulo IV

Sin duda, el monitoreo continuo de la expansión de esta especie es una tarea de la administración local al objeto de evaluar el interés o el peligro que representaría la expansión de M. galloprovincialis para la biota local, dado que existen nuevas herramientas moleculares resolutivas para ello (Jilberto et al., 2017; Zbawicka et al., 2012). Aparte de la introducción putativa de parásitos exóticos, la especie entrante puede hibridar con las locales, modificar por introgresión los genomas adaptados, y ocasionar cambios crípticos en la estructura y funcionamiento del ecosistema, así como en el cultivo local (Michalek et al., 2016).

IV.4.2. La zona híbrida Mytilus chilensis x Mytilus edulis en el hemisferio sur

En este trabajo se describen los patrones en el gen digerido con AciI sobre el amplicón generado por Me-15/16 sobre de la proteína PAP de M. edulis (180 pb + AciI = (99 + 81) pb) y la de M. trossulus (168 pb + AciI = (93 + 75) pb) y se aporta evidencia experimental de su distinción electroforética. El patrón RFLP (126/99 + 81) pb obtenido en 11 individuos de cuatro muestras de la Región de Magallanes (SG, EF, SV, PW) indica que se trata de individuos heterocigotos (126/180) pb para dicho gen. Mientras que el alelo 126 pb ha sido descrito como específico de M. chilensis (Santaclara et al., 2006), su homólogo de 180 pb ha sido descrito como el específico de M. edulis (Inoue et al., 1995). Es importante resaltar que el alelo de M. edulis ha sido detectado en cuatro de las seis (67%) localidades muestreadas en la Región de Magallanes (con una frecuencia poblacional que varía entre el 2% y el 10 % (media de 3,66%)) pero está ausente de la Región de los Lagos. Este alelo de M. edulis extendido a esta región puede corresponder a la especie M. edulis platensis distribuida en la costa del Atlántico sur, i.e., Brasil, Uruguay y Argentina (Trucco, 2000; Zbawicka et al., 2018).

Existe aún incertidumbre sobre la existencia de esta zona híbrida en función del marcador molecular analizado. Por ejemplo, utilizando la variabilidad en RFLP sobre la proteína PAP, el gen 16S y el gen COIXba describen la primera zona híbrida en 125 km en Magallanes, entre Muelle Loreto (Punta Arenas) y San Gregorio (Oyarzún et al., 2016), si bien por error técnico incluyen en ella una elevada presencia de alelos específicos de M. galloprovincialis del hemisferio norte (p. ej., véase detección del fallo técnico en Araneda et al. (2016), pág. 3633). Estudios ecológicos y fisiológicos previos han sugerido

144 Capítulo IV una distribución simpátrica para M. chilensis y M. platensis en el límite sur de su distribución latitudinal (Dellatorre et al., 2007). Sin embargo, algunos estudios sobre los mitogenomas de esta especie sugieren que ambos morfos mantienen un estatus de variantes conespecíficas regionales y por tanto deben integrarse en M. platensis (Gaitán- Espitia et al., 2016).

En otro estudio efectuado también con la proteína PAP, está ausente el alelo específico de M. edulis en una localidad de Isla Peel (50º 50’ 29, 83’’S y 74º 00’ 41, 27’’O) próxima a la Región de Magallanes (Larraín et al., 2012). Además, tampoco se detecta M. edulis en una muestra de 33 individuos de Punta arenas en Magallanes i.e., PUCL 53-9-16-12 con un panel de 49 SNP (Larraín et al., 2018), aunque indican que son necesarios estudios más amplios en esa región. Curiosamente, con un panel de 19 SNP utilizado mayormente sobre la costa argentina, tampoco se observaron híbridos M. chilensis x M. platensis en la supuesta zona híbrida descrita aquí en torno a Punta Arenas, sino que se describieron individuos puros de ambas especies en Isla Grande (Tierra de Fuego) (Zbawicka et al., 2018). En ese trabajo se cita la presencia de M. chilensis en el puerto de Ushuaia (54º 48’ 31,14’’S y 68º 18’ 10,20’’O) y también observan un híbrido M. chilensis x M platensis en zonas más al norte, como Buenos Aires. Esto nos indica que la zona híbrida de estas dos especies es probablemente mucho más extensa que la descrita en Oyarzún et al. (2016), y alcanzaría al menos desde Estuario Fanny (53º S) hasta Ushuaia (54º 48’ S), i.e., ~300 km. La presencia de M. edulis en la costa Atlántica de Sudamérica es conocida desde hace mucho (Hilbish et al., 2000; McDonald et al., 1991), y se ha sugerido que los mejillones de Magallanes proceden por migración este-oeste en estadio larval a través de la corriente costera Atlántica que entra en el Estrecho de Magallanes (Piola y Falabella, 2009). Bajo esa hipótesis es esperable encontrar alelos de M. edulis a mayor frecuencia en la zona este (atlántica) del Estrecho (Oyarzún et al., 2016) hasta donde penetran las aguas atlánticas (Salinas et al., 2004) y en la línea de costa, tal como hemos observado en este trabajo y en trabajos recientes (Oyarzún et al., 2016; Zbawicka et al., 2018).

IV.4.3. Mytilus trossulus en el Cono Sur

El patrón (126/93 + 75) pb observado en cuatro individuos se corresponde con el genotipo heterocigoto no digerido (126/168) pb, siendo el alelo 126 pb descrito como específico de

145 Capítulo IV

M. chilensis (Santaclara et al., 2006) y el homólogo de 168 pb como específico de M. trossulus (Inoue et al., 1995). Se ha detectado la presencia de alelos de M. trossulus en el 50% de las localidades muestreadas en la Región de Magallanes, con un porcentaje de individuos híbridos que varía entre el 2% (PC, EF) y el 4% (SV), y una frecuencia media de individuos híbridos de 1,33%. Por otro lado, en la Región de Los Lagos sólo se detectaron alelos de M. trossulus en el 25% de las localidades, con una frecuencia media de 2,12 individuos híbridos por población. Esto nos indica que el alelo de M. trossulus se encuentra presente en toda el área de distribución de la especie M. chilensis, con una frecuencia media de individuos por población del 1,58%. Este dato es congruente con la observación de un 4% del alelo PAP de M. trossulus en zonas de recolección de semilla en torno a Chiloé (Larraín et al., 2012) y con el 1% de individuos híbridos de M. galloprovincialis (posiblemente M. chilensis) x M. trossulus en la Región de Magallanes (Oyarzún et al., 2016).

La especie M. trossulus es circumpolar en el hemisferio norte, y ha sido ambiguamente identificado en el hemisferio sur (Wonham, 2004). Dado que su alelo específico sólo se detectó en heterocigosis, caben al menos dos explicaciones para su presencia en Chile. En primer lugar, puede que se trate de individuos híbridos M. chilensis/M. trossulus y dada su baja frecuencia (1,59% de heterocigotos) el parental M. trossulus introducido (deliberada o accidentalmente a través de hull biofouling) en los puertos comerciales de Punta Arenas y Chiloé, debería encontrarse a muy baja frecuencia en el área muestreada (0,0079%), máxime si se trata de introducciones antiguas de M. trossulus, i.e., híbridos de varias generaciones. La segunda hipótesis apunta a la no especificidad de los alelos PAP en el hemisferio sur, i.e., el alelo 168 pb adscrito respectivamente como específico de M. trossulus del hemisferio norte pudiera ser un polimorfismo génico natural en M. chilensis. Tradicionalmente se ha considerado el polimorfismo del marcador Glu-5’ de la PAP como diagnóstico entre especies del hemisferio norte (Inoue et al., 1995; Rawson et al., 1996), aunque se han descrito frecuencias bajas de alelos heteroespecíficos (Hamer et al., 2012). Un fenómeno parecido para el gen PAP amplificado con cebadores Me-15/17 se ha descrito también para el mejillón M. edulis planulatus de las Islas Kerguelen. En este archipiélago los alelos G (160 pb) y E (210 pb), respectivamente de M. galloprovincialis y M. edulis del hemisferio norte, son equifrecuentes (Gérard et al., 2015) y se encuentran

146 Capítulo IV en equilibrio poblacional, sin que se haya registrado la existencia de M. galloprovincialis del hemisferio norte en ese archipiélago.

Astorga et al. (2015) no encuentran alelos M. trossulus en Chile al contrario de lo descrito en el resto de trabajos (Larraín et al., 2012; Oyarzún et al., 2016; el presente). La información disponible sobre polimorfismo isoenzimático indica que los mejillones Mytilus de América del Sur contienen alelos de las tres especies de Mytilus (McDonald et al., 1991). Además, se ha observado alelos de la proteína PAP de M. chilensis y M. trossulus en dos individuos heterocigotos procedentes de una lata de conserva de M. chilensis, y se ha confirmado su identidad alélica específica mediante secuenciación (Fernández-Tajes et al., 2011), si bien dicha herramienta pudiera ser inespecífica (véase M. galloprovincialis detectado con ella en Oyarzún et al. (2016)).

El polimorfismo heteroespecífico podría también deberse a una retención de polimorfismo ancestral, producto de la migración transecuatorial seguida por este género desde el hemisferio norte (0.5-1,3 Ma a.p.) (Gérard et al., 2008). No se trataría por tanto de una invasión de M. trossulus tal como ha sido propuesto recientemente para explicar su presencia en Punta Arenas (Oyarzún et al., 2016), sino de una ocurrencia natural en el Cono Sur.

IV.4.4. Diversidad y estructura genética poblacional de Mytilus chilensis

El polimorfismo de los microsatélites en todas las muestras era un resultado esperado, pues se trata de cuatro loci seleccionados de entre los testados en M. chilensis (Ouagajjou et al., 2011) y M. galloprovincialis (Presa et al., 2002). También era esperado el menor polimorfismo observado en el grupo externo M. edulis, y la diferencia de sus alelos modales respecto a las muestras de M. chilensis, a causa del uso de cebadores heterólogos (Presa y Guyomard, 1996). La conservación del alelo modal de cada locus en Magallanes (Mch3, 114; Mgu3, 138; Mch1, 160; Mch8, 202) sugiere una mayor conectividad genética en esta región, frente a una mayor variación en la Región de Los Lagos. Esa mayor diversidad alélica de la Región de Los Lagos frente a la de Magallanes, se corrobora también con otros parámetros como el número total de alelos en cada población, respectivamente, 16 frente a 14, la heterocigosidad esperada (HE) 0,738 frente a 0,583, o en la riqueza alélica media (RS) 4,728 frente a 4,095. Sin embargo, las comparaciones de

147 Capítulo IV estos dos útlimos parámetros entre regiones, así como para la heterocigosidad observada

(HO) y los índices de fijación FIS y FST, no resultaron significativas. Además las muestras con mayor HE media pertenecen a la Región de Los Lagos, esto es, CAI, HE = 0,910; ILQ,

HE = 0,729, pero muestran muy baja HO media, lo que provoca un elevadísimo desequilibrio genotípico (déficit de heterocigotos) en todos sus loci. Este déficit elevado de heterocigotos se ha observado también en esta misma especie con nueve marcadores microsatélites (HE media= 0,674, HO media= 0,395) (Larraín et al., 2015) y con alozimas

(HE media = 0,408; HO media = 0,294) (Toro et al., 2006).

El déficit de heterocigotos es un fenómeno bien referenciado en invertebrados marinos, si bien poco comprendido (p. ej., Mallet et al., 1985; Presa et al., 2002; Zouros y Foltz, 1984), que ha sido causalmente asignado a endogamia, alelos nulos, aneuploidía, imprinting molecular, selección y efecto Wahlund (Beaumont, 1991; Gaffney et al., 1990). Aunque los alelos nulos parecen ser la principal fuente técnica del desequilibrio genotípico en invertebrados marinos (Presa et al., 2002), no son su única causa ni la principal (Diz y Presa, 2009). En este caso, el déficit de heterocigotos en Los Lagos podría responder a un fenómeno Wahlund de mezcla poblacional (Wahlund, 1928) por el cual el exceso de homocigotos (o déficit de heterocigotos) sería consecuencia de la introducción de semilla para cultivo procedente de diversas localidades geográficas. Este fenómeno es verosímil en Los Lagos, dado que se trata de la región de mayor cultivo intensivo y extensivo de mejillón en Chile, p. ej. Bagnara y Maltraín (2008). La mayor riqueza alélica de la Región de Los Lagos apunta en la misma dirección: el trasiego de la semilla desde los bancos naturales en Bahía Yaldad (Winter et al., 1984) y su cultivo en el entorno de Chiloé, acumula la mayor biomasa poblacional del país, tal como ha sido observado para M. galloprovincialis en Galicia (Diz y Presa, 2009). Por otro lado, los menores índices de diversidad genética de la Región de Magallanes apuntan a un escenario de menor intervención humana sobre sus poblaciones, dada la menor actividad acuícola y menor alteración de la composición génica local.

IV.4.4.1. Macroestructura poblacional de Mytilus chilensis

El número más conservativo de grupos génicos obtenido con inferencia bayesiana (K = 2, STRUCTURE) refuerza al del método multivariante de coordenadas principales

148 Capítulo IV

(PCoA), en el cual se distinguen dos grupos de muestras que corresponden con las dos regiones estudiadas. Además, el alto valor de distancia genética observado entre regiones, señala una heterogeneidad en la distribución latitudinal de la especie, y por tanto una ausencia de flujo génico sistemático entre ambas. Esta hipótesis está apoyada por la observación de un aislamiento por distancia débil pero significativo. La debilidad de la regresión genético-geográfica sugiere asimismo que existe una alta divergencia genética entre muestras dentro de región. El flujo génico reducido entre ambas regiones es esperable, puesto que las separan ~1.200 km, y su conectividad ocasional podría producirse mediante fenómenos geoclimáticos actuando sobre la fase planctónica de 45 días (Corriente Costera de Chile en dirección sur). Sin embargo, a día de hoy no existen evidencias experimentales del patrón de conectividad de las fases planctónicas entre ambas regiones.

Se han efectuado estudios poblacionales sobre M. chilensis con seis alozimas (Toro et al., 2006), 26 alozimas (Cárcamo et al., 2005) y RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) (Toro et al., 2004), en muestras distribuídas en un rango de 1.800 km en la costa sur chilena, i.e., desde Arauco (35º S) hasta Punta Arenas (53º S). En esos trabajos se muestra un aislamiento por distancia significativo, pero no se indica la existencia de estructura poblacional en la especie (0,011 < FST < 0,055), si bien todos ellos albergan dudas sobre el estatus de la muestra de Punta Arenas. En otro estudio efectuado con nueve microsatélites y un escenario de K = 2 grupos génicos en la región de Chiloé, no encuentran correlación alguna entre distancia genética y geográfica, debido a una elevada divergencia local entre muestras (Larraín et al., 2015).

Otros estudios realizados sobre componentes morfométricos valvares (Kraprivka et al., 2007) y con 981 SNP neutrales y 58 outliers (Araneda et al., 2016) también identifican la población de Punta Arenas como divergente del mejillón de Chiloé (SNP, FST = 0,228). La concordancia de la señal divergente de Punta Arenas, entre SNPs neutrales y no neutrales, se interpretó como una señal de divergencia neutral (Cape Horn current) y otra adaptativa de origen abiótico. Sin embargo, el modelo IBD no resultó significativo al excluir a la muestra patagónica y se explicó por el elevado intercambio de semilla en las zonas de producción (Pantoja et al., 2011), que generaría una ausencia de diferenciación local. La muestra de Punta Arenas fue la más divergente del conjunto muestral, lo que

149 Capítulo IV interpretaron como ausencia de flujo génico hacia el norte debido a la corriente del Cabo de Hornos (Cape Horn Current, CHC) provocada por los vientos del oeste (West Wind Drift, WWD), que impediría la homogeneización de la población de Punta Arenas. El estudio concluye la ausencia de stocks regionales discretos a excepción de Punta Arenas y un modelo stepwise de alta conectividad que genera una sola población reproductiva. Todos los trabajos con distintos marcadores concuerdan en la divergencia de la población de Punta Arenas respecto al norte (Araneda et al., 2016; Cárcamo et al., 2005; Toro et al., 2004, 2006;). Pero no es hasta Oyarzún et al. (2016), cuando se profundiza con un muestreo más fino en la Región de Magallanes, que, sin embargo, no incluye las regiones más norteñas, i.e., Los Lagos, Aysén, etc., impidiendo una evaluación global del recurso en las mismas condiciones analíticas. Recientemente, Araneda et al. (2016) emplearon un conjunto de 1.240 SNP, siendo 58 SNP outliers, para estudiar la adaptación local (FST = 0,114) de seis poblaciones situadas en tres regiones: la Patagonia, Seno Reloncaví (interior) y la Isla de Chiloé (exterior), lo cual concuerda con los resultados de divergencia regional apuntados en nuestro trabajo.

M. chilensis con una FST observada de 0,167 constituye por tanto una metapoblación con dos subpoblaciones mayores, tal como ya se ha descrito para M. galloprovincialis en la Península Ibérica (Diz y Presa, 2008) y difiere muy significativamente de la especie M. platensis de la Patagonia Atlántica, p. ej., M. platensis y M. chilensis muestran una diferenciación FST = 0,421 (Zbawicka et al., 2018), el cual es un nivel de divergencia similar al de M. edulis y M. galloprovincialis del hemisferio norte (FST = 0,427) en concordancia con lo apuntado por Ouagajjou et al. (2011).

IV.4.4.2. Microestructura poblacional de Mytilus chilensis

El análisis bayesiano BAPS, menos conservativo que el algoritmo de STRUCTURE, identificó K = 8 como el número de grupos génicos más probable dentro de la distribución de M. chilensis (incluyendo M. edulis). Los cuatro grupos de Los Lagos corresponden a cada una de las poblaciones allí muestreadas e indica que la mayor diversidad genética de esa región, detectada con todos los parámetros genéticos, se traduce además en una mayor complejidad y heterogeneidad poblacional. Por su parte, los tres grupos identificados en la Región de Magallanes reúnen a las muestras por pares

150 Capítulo IV según su proximidad geográfica, esto es, un patrón esperado en zonas con poca injerencia humana. Dicha partición en 7 grupos es consistente (K = 7, BAPS), pues la varianza entre ellos es la más elevada de los niveles jerárquicos ensayados dentro de M. chilensis (FCT = 0,172) y la única partición con composición genética homogénea dentro de grupo génico (FST = 0,012, no significativa). Obsérvese que la partición de la varianza entre regiones con K = 2, (FCT = 0,151) no agota la varianza interna (FSC = 0,101), que es el objetivo a la hora de establecer grupos génicos con coherencia interna.

Algunos estudios previos han observado rangos de distancias entre siete poblaciones meridionales del entorno de Chiloé (p. ej., RAPD, D_Nei = 0,030 – 0,080; Alozimas,

D_Nei = 0,004 – 0,048 y FST = 0,011 – 0,055) (Toro et al., 2004, 2006) que se han interpretado por los autores como una consecuencia del amplio flujo génico en la larga fase planctotrófica de 45 días (Toro y Sastre, 1995). También en un estudio realizado con nueve microsatélites sobre cinco muestras cultivadas de la región de Chiloé y una muestra natural de Isla Peel (Magallanes), también se observó un elevado déficit de heterocigotos (45 de 54 tests) e incidencia de alelos nulos en todos los loci (Larraín et al., 2015). En él se describen dos grupos mayores (STRUCTURE) con alto nivel de mezcla dentro de ellos, una estructura genética parcheada sin un patrón definido y alta diferenciación entre localidades próximas a Chiloé (FST = 0,043). Concluyen que el elevado manejo en la Región de los Lagos, la fase planctotrófica extensa y las corrientes marinas, i.e., Cabo de Hornos y Corriente Costera Chilena (Strub y Mesías, 1998) promoverían la dispersión de individuos, impidiendo la diferenciación poblacional en todo el rango de la especie (Larraín et al., 2015). Si bien la baja representatividad de la muestra patagónica en ese trabajo hace que las poblaciones cercanas difieran más entre sí que las poblaciones lejanas (p. ej., Larson y Julian, 1999), es un trabajo que concuerda con los resultados presentes. Esto es, el mosaicismo poblacional en Chiloé puede entenderse como una mezcla de cohortes larvarias de distintas edades y su distinta procedencia de bancos naturales (Avendaño et al., 2011), tal como han subrayado recientemente algunos autores locales (Araneda et al., 2016).

En definitiva, nuestro escenario macrogeográfico describe la estructura de M. chilensis como una metapoblación con conectividad muy limitada (FST = 0,167) y ocasional entre dos regiones. El modelo interno difiere muy significativamente entre cada región: la

151 Capítulo IV

Región de Los Lagos, donde el escenario metapoblacional parcheado es antropogénico y por tanto inestable (p. ej., Diz y Presa, 2009), y la Región de Magallanes, donde la menor intervención humana permite observar un escenario natural de conectividad entre sus poblaciones, cuya composición alélica se enriquece hacia el oeste a medida que nos adentramos en la influencia distributiva de M. e. platensis del Océano Atlántico. Obsérvese que otras especies locales con menor manejo, como Aulacomya atra muestran unos valores de diferenciación poblacional mucho más elevados, i.e., FST = 0,147 (Mena et al., 2001), que los informados para M. chilensis en el mismo rango (i.e., muy parecida a la distancia media observada en nuestro trabajo entre regiones y entre las muestras de Los Lagos, Tabla IV.4).

IV.4.5. Implicaciones en la gestión del recurso

Los alelos de los marcadores microsatélites no permiten el diagnóstico entre especies de Mytilus del hemisferio norte, pues hay solapamiento de rangos alélicos entre ellas. Lo mismo ocurre con M. chilensis y M. edulis en este caso, por lo que desconocemos la extensión e intensidad de la mezcla poblacional de ambas especies en la Región de Magallanes. Sin embargo, esa intensidad la estimamos entre un 2-10% con marcadores específicos (PAP-AciI), lo cual nos da una idea de la composición molecular de dicha población. Es atractivo especular con la introducción deliberada o inadvertida de alelos de M. edulis del hemisferio norte en el Cono Sur. Sin embargo, la hipótesis más verosímil es que se trate de una zona híbrida natural M. chilensis x M. edulis en el Cono Sur, producto de la concomitancia de M. chilensis del Pacífico y del M. e. platensis del Atlántico (costa argentina). La extensión de esta zona híbrida M. chilensis x M. e. platensis en el Estrecho de Magallanes es mayor de lo que nuestro estudio y otro precedente indican en torno a Punta Arenas (Oyarzún et al., 2016), pues recientemente se ha descrito la extensión de M. chilensis hasta la costa patagónica de Isla Grande en Tierra de Fuego y de Ushuaia (Argentina) (Zbawicka et al., 2018). Por tanto, la introgresión M. chilensis x M. edulis platensis es un fenómeno natural que ocurre en todo el este del Cono Sur patagónico de Chile y Argentina y que ocupa al menos 300 km de costa.

El valor conservacional de la Región de Magallanes comprende a esta extensa zona híbrida natural entre dos regiones biogeográficas con mezcla natural de faunas del

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Atlántico y del Pacífico (véanse propiedades de zonas híbridas en Gardner, 1996). Su interacción biótica con la Región Antártica la hace además de elevado interés biogeográfico (Arnzt y Rios, 1999), pues contiene el mayor número de especies endémicas y con menor distribución de Chile (Fernández et al., 2000; Fernández y Castilla, 2005; Saavedra et al., 2011). Es además una región complicada por el elevado tráfico marítimo que soporta alrededor del Cono Sur (más de 2.000 buques/año, Directemar, 2015) con un elevado riesgo de introducciones antropogénicas. Por ello, la gestión de los recursos en la Región de Los Lagos es y debe ser muy distinta a la de Magallanes, donde su cultivo intensivo y el trasiego de semilla han alterado el escenario natural de conectividad entre sus poblaciones. Un escenario de explotación requiere de políticas diferenciales (Winter et al., 1984). La gestión del recurso M. chilensis no debe pues hacerse conjuntamente para todas las regiones chilenas (independiente de la macrogeografía, i.e., Toro et al., 2006) sino individualmente para cada uno de los stocks o regiones descritas, una con mayor valor económico (Los Lagos) y otra con mayor valor conservacionista (Magallanes).

IV.5. Conclusiones

1. Dado su estatus taxonómico específico, es posible efectuar la trazabilidad molecular de los mejillones chilenos a escala global interespecífica. Existen sin embargo dudas razonables sobre la especificidad del patrón RFLP diagnóstico dentro del género, pues los desarrollos moleculares efectuados hasta la fecha no incluyen a todas las especies congenéricas, p. ej., Choromytilus palliopunctatus. No se han desarrollado estudios poblacionales exhaustivos que permitan saber si la trazabilidad puede extenderse al origen geográfico preciso dentro de las especies, si bien en este trabajo se informa de una elevada divergencia regional entre el mejillón M. chilensis de la Región de Los Lagos y el de la Región de Magallanes, que puede ser aplicada a su trazabilidad con métodos de asignación, pero necesita un calibrado previo más extenso que el efectuado en este trabajo.

2. La existencia de alelos específicos de la proteína PAP de M. trossulus del HN en el Cono Sur, puede ser debida a hull biofouling en los grandes cargueros del HN que atracan en Punta Arenas y a Chiloé, razón argumentada recientemente para

153 Capítulo IV

explicar la presencia de M. galloprovincialis en Puerto Madryn (Argentina). Sin embargo, también podría tratarse de un polimorfismo natural del gen PAP en la especie M. chilensis.

3. Este trabajo contribuye con evidencias experimentales a reforzar el reconocimiento definitivo de Mytilus chilensis Hupé (1854) como especie válida para denominar al mejillón Mytilus de la costa chilena, lo que tiene interés taxonómico (distribución, clasificación y evolución), ecológico (hibridación, introgresión e interacción trófica) e industrial (regulación de etiquetado y denominación de origen).

4. Existe una fuerte estructura poblacional en el rango de M. chilensis, caracterizada por un grupo génico localizado en la zona híbrida magallánica y otro grupo génico mucho más heterogéneo en la Región de Los Lagos, caracterizado por alta riqueza alélica y una microestructura parcheada.

5. Existe una zona híbrida natural y estable M. chilensis x M. e. platensis en la Región de Magallanes, que incluye a la Patagonia chilena y argentina y abarca mucho más que lo apuntado en trabajos anteriores (al menos 300 km entre Estuario Fanny y Ushuaia). Esta zona híbrida es pues un ecotono ambiental amplio, situado entre dos regiones biogeográficas, que constituye un modelo natural para el estudio de la introgresión y la evolución de los genomas de estas especies tan próximas del género Mytilus.

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169

Capítulo V. Cálculo de heredabilidad y análisis de regresión conjunta de la evolución del crecimiento en familias de hermanos completos de Mytilus galloprovincialis

Capítulo V

V.1. Introducción

La producción de mejillón Mediterráneo (Mytilus galloprovincialis) ha crecido de forma extraordinaria a lo largo de los últimos setenta años, pues ha pasado de las 2.100 toneladas en 1950 (EUROSTAT, 2017) hasta las 271.842 t en 2017 (JACUMAR, 2017). En la actualidad la producción de mejillón en Galicia, región española situada en el noroeste de la Península Ibérica, alcanza el 98,19% de la producción española, siendo uno de los tres productores más importantes junto con China y Chile. En 2017 la producción de mejillón alcanzó un valor en primera venta de 128.407.276 €, lo que supone el mayor valor de producción de las últimas dos décadas, con un incremento del 28% (JACUMAR, 2017). Este valor puede estar subestimado puesto que existe una gran actividad industrial alrededor de la industria mejillonera, que genera beneficios a nivel local y estatal.

Este desarrollo exitoso de la industria mejillonera en Galicia ha sido posible gracias a la combinación de varios factores, como son la alta productividad primaria de las Rías Gallegas, la amplia industrialización del sector, las regulaciones administrativas adecuadas, que se han creado para el desarrollo de la acuicultura en la región, o el cultivo extensivo en bateas. Por ejemplo, la legislación autonómica regula el número de bateas por polígono, el tamaño superficial de las bateas o el número de cuerdas suspendidas por batea, controlando de esta manera la intensificación de la producción por unidad de área. Tras siete décadas de progreso, el número de concesiones de explotación de bateas de mejillón se ha mantenido constante. Actualmente existen 3.515 bateas, de las cuales 3.337 se dedican al cultivo de mejillón (Méndez-Martínez et al., 2011). Sin embargo, se ha observado un descenso de la producción en este bivalvo en Galicia desde las 301.865 t en 2007 hasta las 245.547 toneladas en 2017 (Figura V.1). Ese descenso puede asociarse a varios factores, tales como la disponibilidad de alimento, el reclutamiento larvario y la limitación del espacio de cultivo. Además, la aparición de otras problemáticas, como el aumento de los episodios de floraciones algales nocivas (FAN), debido en gran parte al cambio climático, o la puesta en marcha por parte de la Unión Europea (UE) de tratados económicos con terceros países productores de mejillón, no ayudan a la sostenibilidad de los volúmenes históricos de producción. Por otro lado, existen otras inquietudes relacionadas con el impacto colateral que tienen los cultivos de mejillón sobre las Rías Gallegas, como la creciente tasa de eutrofización del lecho marino (Smaal et al., 2001), el

173 Capítulo V acercamiento a la capacidad máxima de carga del ecosistema, o cambios de concentración en las poblaciones del seston/fitoplancton debido a la elevada tasa de filtración de los mejillones (Dame et al., 1991).

Figura V.1. Gráfico con los valores históricos de producción nacional (en toneladas, eje de ordenadas izquierdo), valor de la producción en primera venta (en euros, eje de ordenadas izquierdo) y la relación entre ambas (eje de ordenadas derecho).

Desde el punto de vista económico, el aumento del número de bateas satura los polígonos y limita y ralentiza la navegación industrial, lo que dificulta el desarrollo adecuado de otras actividades marinas relacionadas con el turismo. Desde un punto de vista biológico, el aumento de la densidad de cultivo disminuye la tasa de crecimiento del mejillón, dando lugar a una menor producción de peso fresco en cosecha y aumentando la mortalidad debido a la incidencia de enfermedades (Dijkema y van Stralen, 1989).

Este escenario ha propiciado que el Gobierno Regional (Xunta de Galicia) legisle al respecto, tanto a escala de polígono (Decreto 423/1993) como a escala de batea. Por ejemplo, a) ha establecido la longitud máxima de cuerda de engorde por batea en 6.000 metros, b) ha limitado el número máximo de cuerdas de engorde por batea a 500 unidades, c) ha limitado la longitud máxima de cada cuerda a 12 metros, d) ha limitado el periodo de colocación de cuerdas colectoras de semilla desde el 1 de abril hasta el 30 de septiembre, d) ha limitado el número de cuerdas colectoras de semilla a 100 cuerdas por batea (Decreto 174/2002), o e) ha regulado la concesión de licencias de explotación (Decreto 406/1996). En particular, la preocupación en los últimos años no ha dejado de crecer en torno al aumento de la perdurabilidad de las FAN, las cuales interrumpen el

174 Capítulo V proceso de comercialización durante meses, tanto en fresco como en enlatado, dado que la legislación actual (Decreto 28/2005) entró en vigor instaurando los cierres preventivos de los polígonos de bateas debido a la proliferaciones fitoplanctónicas tóxicas. Por último, si bien no menos importante, los acuerdos de libre comercio llevados a cabo en 2003 entre la Unión Europea (UE) y algunos terceros países (Decisión del Consejo 2002/979/EC) con los que se ponía fin a los aranceles en las importaciones de mejillón, provocaron un aumento de la competencia en los mercados de la UE. Es por ello que en 2014 las importaciones españolas de mejillón se estabilizaron en torno a las 20.000 toneladas, siendo Chile el mayor importador de mejillón en el mercado europeo, con un volumen del 60% sobre el total de importaciones de mejillón (FAO, 2015).

Los planes de selección artificial han jugado un papel muy importante en el incremento del rendimiento, la supervivencia y la mejora de la calidad del producto, tanto en el cultivo de plantas como en animales de ganadería (Dekkers y Hospital, 2002; Guiñez, 1988) y pueden también ayudar a paliar algunas de las problemáticas del cultivo del mejillón. Por ejemplo, mediante una selección artificial dirigida a obtener una mayor tasa de crecimiento, podría acortarse el ciclo productivo (Gui y Zhu, 2012), evitando así los episodios FAN y aumentando la productividad. El éxito de un programa de reproducción selectiva depende de la cantidad de variación fenotípica que el rasgo a mejorar tenga en la población base y de su naturaleza genéticamente aditiva (heredable) en lugar de no aditiva (epistática, dominante) o determinada ambientalmente (Falconer y Mackay, 1996). Por lo tanto, independientemente de la gran variación molecular del mejillón de las Rías Gallegas (Diz y Presa, 2009), es necesaria una evaluación preliminar de la variación genética aditiva que existe en un carácter en particular. Dicha evaluación se lleva a cabo a través del cálculo de la heredabilidad, una estima crucial para la toma de decisiones a la hora de implementar un programa de mejora mediante selección artificial (Lynch y Walsh, 1998; Mgaya, 2000).

Los estudios previos sobre los caracteres fenotípicos relacionados con el crecimiento, muestran unas estimas de heredabilidad muy dispersas para rasgos homólogos entre especies de mitílidos (Tabla V.1). En particular, la longitud de la concha y el peso corporal han sido los caracteres mas estudiados habitualmente, debido a la facilidad que presentan a la hora de tomar medidas de manera no invasiva y por tener influencia sobre

175 Capítulo V otros parámetros como la fecundidad, la supervivencia o la competencia (Signorelli et al., 2013).

Tabla V.1. Estimas de heredabilidad de rasgos fenotípicos relacionados con el crecimiento en moluscos bivalvos. Se han obtenido datos de diferentes estimas de h2, como: Heredabilidad realizada = (r); Heredabilidad estricta = (n); Heredabilidad amplia = (b).

Estimas de Heredabilidad Orden Especies Referencia Longitud de Peso corporal concha Venerida Mercenaria mercenaria Hadley et al., 1991 0,42(r) - 0,43(r) - Crenshaw et al., 1996 0,40(r) - Meretrix meretrix Wang et al., 2011 0,70(n) - 0,82(n) 0,83(n) - 0,85(n) Ruditapes philippinarum Zhao et al., 2012 0,16(r) - 0,26(r) - Yan et al., 2014 0,32(n) - 0,97(n) -

Ostreida Pinctada fucata martensii Wang et al., 2010 0,64(n), 0,78(b) 0,53(n), 0,68(b) Pinctada maxima Jones et al., 2014 0,33(n) 0,18(n) Ostrea chilensis Toro et al., 1995 0,27(r) - 0,70(r) 0,24(r) - 0,69(r) Ostrea edulis Toro y Newkirk, 1990 0,10(r) - 0,19(r) - Naciri-Graven et al., 2000 - 0,27(n) - 0,84(n)

Pectinida Argopecten irradians Zheng et al., 2004 0,04(r) - 0,52(r) - Chlamys nobilis Liu y Liu, 2012 0,34(r) - 0,96(r) - Patinopecten yessoensis Liang et al., 2010 0,23(r) - 0,29(r) -

Mytilida Mytilus chilensis Toro et al., 2004 0,32(r) - 0,49(r) 0,35(r) - 0,54(r) Alcapán et al., 2007 0,001(n) - 0,33(n) 0,03(n) Guiñez et al., 2016 0,73(n) - 0,93(n) - Mytilus edulis Mallet et al., 1986 0,22(n) - 0,92(n) - Stromgrem y Nielsen, 1989 0,50(n) - 0,90(n) - Mytilus galloprovincialis Brichette et al., 2001 0,02(n) - 0,23(n) - Nguyen et al., 2011, 2014 0,08(n) - 0,64(n) 0,05(n) - 0,35(n) Pino-Querido et al., 2015 0,23(n) 0,39(n)

La oscilación en las estimas de heredabilidad es común entre bivalvos, p. ej., la heredabilidad de la longitud de concha en la especie Ruditapes philippinarum varía entre 0,16 (Zhao et al., 2012) y 0,97 (Yan et al., 2014). También para ese carácter, las estimas de heredabilidad varían entre 0,70 - 0,82 en la almeja del pacifico Meretrix meretrix y entre 0,11 - 0,19 en la ostra común Ostrea edulis (Toro y Newkirk, 1990) y entre 0,64 - 0,78 en la ostra Pinctada fucata martensii (Wang et al., 2010). Por otro lado, la heredabilidad evaluada sobre el peso corporal en moluscos mostró también, como en el caso de la longitud de concha, grandes oscilaciones en función de la especie, p. ej., desde

176 Capítulo V estimas bajas en la ostra Pinctada maxima (0,18) (Jones et al., 2014) hasta estimas muy elevadas (0,84) en Ostrea edulis (Naciri-Graven et al., 2000) o en Meretrix meretrix (0,83 – 0,85) (Wang et al., 2011). Esa alta dispersión en las estimaciones sobre caracteres similares, puede estar influenciada experimentalmente (p. ej., por el tipo de cruzamientos y progenies experimentales), pero también matemáticamente, debido a que las estimaciones basadas en el modelo animal son estadísticamente más precisas y más robustas que los modelos tradicionales basados en la regresión padres-descendencia (Åkesson et al., 2008). También se sabe que la heredabilidad no es constante, ni temporal ni espacialmente, ni en una misma población, ya que puede variar con las condiciones ambientales, así como con los cambios de frecuencias génicas (Hoffmann y Merilä, 1999). Por lo tanto, dado que las estimaciones son específicas del momento, la población y el ambiente (Falconer y Mackay, 1996), una una evaluación precisa de los componentes de la varianza en caracteres productivos para una especie candidata, debe efectuarse sobre muestras de diferentes ambientes (Mallet et al., 1986).

Con la finalidad de evaluar la posible ganancia fenotípica en un carácter directamente relacionado con el crecimiento, como la longitud antero-posterior de la concha en Mytilus galloprovincialis, mediante el uso de un plan de selección direccional, en este trabajo hemos calculado su heredabilidad. Para ello hemos estimado la variación aditiva durante el crecimiento, así como los efectos de dominancia, maternales y comunes y las posibles interacciones entre genotipo y ambiente (GxE). Para ello se han cultivado nueve familias de hermanos completos, generadas a partir de mejillones clasificados en base a su tamaño, a lo largo de todo su ciclo vital y en dos ambientes diferentes. Una parte han sido cultivados en tanques de cultivo dentro del criadero, i.e., sin depredación, con menos estrés ambiental pero con una peor calidad de alimento, mientras que el resto de réplicas familiares se cultivaron en la Ría de Vigo fijados a cuerdas de cultivo suspendidas en el pantalán de la estación marina ECIMAT, donde los mejillones estaban sometidos a un mayor estrés ambiental y a una mayor presión por depredación, pero también con unas ingestas continuas de alimento y de mayor calidad que sus réplicas de criadero.

177 Capítulo V

V.2. Material y métodos

V.2.1. Población base

Los experimentos de cultivo se realizaron entre los años 2007 y 2010 en las instalaciones de la Estación de Investigación Marina de Toralla (ECIMAT), situada en la margen izquierda de la Ría de Vigo (Galicia, NO de España). El material biológico procedía de una cohorte natural de M. galloprovincialis reclutada el 1 de marzo de 2007, de manera aleatoria, en 4 cuerdas colectoras situadas en el pantalán de ECIMAT, por lo que la población base era salvaje de dicha Ría. Tras 70 días de crecimiento en los colectores, el 15 de mayo 2007 se trasplantaron los juveniles a otras cuerdas al objeto de minimizar el desprendimiento de los mejillones y de evitar la depredación. Para ello, se instaló en cada metro de cuerda una varilla de PVC de 15 cm de largo. Además, se cubrieron todas las cuerdas con una malla de nylon de 5 mm de luz de malla y de 15 cm de diámetro, cerrada por ambos extremos. En agosto de 2007 (juveniles de ≈160 días) se sustituyeron las mallas de nylon colocadas inicialmente, por redes de pesca flexibles de 10 mm de luz de malla, al objeto de permitir la entrada de alimento hacia los mejillones y evitar la proliferación de epifitos. De esta forma, los mejillones continuaron su crecimiento protegidos hasta octubre de 2007 (juveniles de ≈220 días), momento en el que se retiraron las protecciones de la cuerda. A partir de febrero de 2008 se tomaron muestras aleatorias de los colectores para verificar la maduración gonadal. Las gónadas se fijaron mediante líquido de Bouin, se deshidrataron y se embebideron en parafina para la obtención de cortes de 5 μm en microtomo, los cuales se tiñeron mediante la técnica de hematoxilina- eosina (Bancroft y Stevens, 1996) para su evaluación.

V.2.2. Inducción a la puesta y formación de familias

En marzo de 2008 (≈360 días de edad) las cuatro cuerdas colectoras se transferieron al laboratorio y se tomaron 233 individuos de forma aleatoria. Mediante un calibre electrónico Mitutoyo®, cuya resolución era de 0,01 mm, se midió la longitud anteroposterior de la concha en esa muestra de la población base. Los datos obtenidos sirvieron para clasificar a los individuos en tres clases de longitud de concha (Figura V.2): pequeños (S), individuos de tamaño inferior a 40,9 mm, con una talla media de 35,1 ±

178 Capítulo V

8,7 mm; medianos (I), individuos con un tamaño entre 41 mm y 68,9 mm, con una talla media de 55,9 ± 7,4 mm, y grandes (L), individuos de tamaño superior a 69 mm; con una talla media de 72,1 ± 7,4 mm.

Figura V.2. Distribución de frecuencias de longitud anteroposterior de la concha, construida con individuos procedentes de la población base natural.

Una vez segregados por grupos, los mejillones se guardaron durante una noche a 4ºC de temperatura en la oscuridad. Al día siguiente (1 de abril de 2008), se limpió y enjuagó cada individuo con agua de mar y se introdujeron individualmente en vasos de precipitado con agua de mar filtrada (1 μm) y esterilizada mediante luz ultravioleta (UV). La puesta de los mejillones se indujo mediante la introducción de los vasos de precipitados en un baño termostático con agua a 23ºC. Una vez que los mejillones completaron su desove, el contenido de cada vaso de precipitados (bien ovocitos, bien espermatozoides) se enjuagó y se filtró a través de un tamiz de 40 µm de luz de malla para eliminar impurezas y a continuación se introdujeron de nuevo en agua de mar previamente filtrada (1 μm) y esterilizada (UV). Se realizó el conteo de ovocitos y de espermatozoides así como la evaluación de su calidad en el microscopio, esto es, la redondez de los gametos femeninos y la motilidad de los masculinos. La fecundación se realizó a una densidad de 8 espermatozoides por cada ovocito. Para ello se utilizaron parejas formadas por individuos dentro de grupo fenotípico (pequeños, medianos o grandes) utilizando los individuos que tuvieron las puestas de mayor calidad. Para comprobar si los ovocitos se encontraban adecuadamente fecundados se inspeccionó el segundo corpúsculo polar. Cada una de las nueve progenies de hermanos completos se

179 Capítulo V introdujo en un tanque troncocónico de 30 L de fibra de vidrio a una densidad de 20 embriones por mililitro.

De todas las familias generadas in vitro, se generó un mínimo de dos familias por cada clase de tamaño. De esta forma, los mejillones seleccionados direccionalmente para tamaño pequeño (S) estuvieron representados por las familias S1 y S2, cuyos progenitores fueron seleccionados dentro del 12% de la cola inferior de la población base. Los mejillones seleccionados de manera estabilizadora (I) se encontraban representados por las progenies I3 e I4, formadas por parentales pertenecientes al 76% de la fracción intermedia de la población base. Los mejillones seleccionados direccionalmente para tamaño grande (S) estuvieron representados por las familias L5 y L6, cuyos progenitores se seleccionaron dentro del 12% de la cola superior de la población base. Por último se creó un grupo adicional, IL, representado por las familias IL7, IL8 y IL9, las cuales se fecundaron a partir de un parental perteneciente a la clase media (I) y otro parental de la clase grande (L).

V.2.3. Cultivo larvario y postlarvario

Cada uno de los tanques de 30 l en los cuales se introdujeron las 9 familias contenía alrededor de 150.000 larvas, con una densidad de 5.000 larvas por litro. Todos se cultivaron en condiciones equivalentes, con una bomba de aireación y un circuito de recirculación de agua semicerrado, con renovaciones de agua y limpieza del tanque cada 48 horas. La alimentación temprana de las larvas, i.e., durante los diez primeros días, consistió en el suministro de 200 ml de microalgas en días alternos, a una densidad de 13 x 103 células/μl, que contenía una mezcla al 50% de Isochrysis galbana (Clase Prymnesiophyceae; cepa celular #CCMP1323) y Pavlova luthery (Clase Prymnesiophyceae; cepa celular #CCMP1325) a una concentración final en los tanques de 30 l de 86,66 células/μl. A partir del décimo día y hasta la fase pediveliger (i. e. ≈ 28 días), momento en el cual las larvas son competentes para fijarse al sustrato (Widdows, 1991), las larvas se alimentaron con 300 ml de una dieta multialgal formada por un 30% de P. luthery, 30% de I. galbana, 20% de Chaetoceros gracilis (Clase Coscinodiscophyceae; cepa celular #CCMP1317) y un 20% de Tetraselmis suecica (Clase Prasinophyceae; cepa celular #CCMP904) a una densidad media de 8,27 x 103 células/μl y una concentración

180 Capítulo V final de 82,7 células/μl. Las tareas de mantenimiento de los tanques implicaron la colecta de las larvas mediante el uso progresivo de varios tamices de diferente luz de malla, a fin de ajustarlos al crecimiento larvario.

Aproximadamente 50.000 postlarvas de cada familia se transfirieron a un nuevo tanque cilíndrico de 30 l (≈ 1660 individuos/l) equipado con la aireación de una bomba de aire y una alimentación continua a través de un flujo de entrada de 40 ml/s (reemplazo completo del agua cada 12,5 minutos) procedente de un tanque de 500 l que contenía una dieta microalgal a una densidad de 9,76 x 103 células/μl. A fin de lograr un alimento equivalente al 20% del peso corporal medio de los mejillones, se bombearon 163 mg/día de microalgas vivas (peso húmedo) a cada tanque, con un flujo de 0,5-0,6 ml/s. La composición de la dieta multialgal se fue ajustando diariamente utilizando el peso orgánico celular establecido para Phaeodactylum tricornutum (23 μg por 106 células) (Helm et al., 2004) y la hoja de cálculo desarrollada por Miñambres et al. (2011). Las cepas de microalgas utilizadas durante la alimentación juvenil se cultivaron en matraces de 6 l a la temperatura de 20 ± 1ºC, a una intensidad lumínica de 6.000 lx, como se describe en Aghzar et al. (2013). Se permitió el asentamiento de las postlarvas en la superficie interna de los tanques, que se limpiaron, desinfectaron y enjaguaron semanalmente con agua corriente. La ausencia de pseudoheces y la presencia de heces bien definidas en el fondo del tanque, se utilizaron como indicadores de un consumo eficiente de la dieta suministrada.

V.2.4. Mediciones y toma de datos

Las mediciones de la longitud de concha anteroposterior se realizaron mensualmente sobre 50 individuos escogidos al azar en cada familia, comenzando los muestreos en julio de 2008 (~3 meses de edad). Para la realización de las mediciones se utilizó un sistema de análisis de imagen (Nis elements BR 3.0) conectado a un micrómetro ocular (Nikon SMZ 1500). En noviembre de 2008 las nueve familias se segregaron en dos réplicas de 6.000 individuos. En ese momento del experimento los mejillones tenían 7 meses de edad y una longitud media de concha de 13,46 ± 4,51 mm. Una réplica de cada familia permaneció en el criadero y su mantenimiento rutinario continuó de la misma forma que se ha explicado anteriormente. Otra réplica se fijó in vitro a una cuerda de cultivo de 6

181 Capítulo V m, a una densidad de 1.000 individuos/m. En cada cuerda (9 en total) se fijó una familia y se envolvió con una malla de nylon para evitar la depredación y el reclutamiento larvario externo. Una vez preparadas las 9 cuerdas, se suspendieron del pantalán de ECIMAT. En diciembre de 2008 los juveniles tenían 8 meses de edad y su longitud de concha era suficiente para medirla con un calibre electrónico de resolución 0,01 mm (Mitutoyo® IP67), en vez de utilizar el sistema óptico de medida empleado anteriormente. Los individuos crecieron en ambos ambientes hasta los 24 meses de edad (abril de 2010), momento en el que las cuerdas en suspensión alcanzaron su máxima capacidad de carga y el riesgo de desprendimiento de la cosecha era máximo. Una vez terminado el experimento se cosecharon todos los mejillones y se mantuvieron congelados a -20ºC. La mortalidad diaria en los tanques de cultivo ubicados en el criadero se registró mediante conteo del número de individuos muertos (conchas abiertas) en el fondo de cada tanque. En el caso de las cuerdas en suspensión, la mortalidad se estimó a partir del cálculo de la densidad de mejillón en 10 cm de cuerda a tres alturas diferentes.

V.2.5. Análisis estadísticos

La trayectoria del crecimiento de las nueve familias se comparó mediante un Análisis de Covarianza (ANCOVA) de dos vías (ambiente y familia), con la edad como covariable. Con el fin de modelizar las trayectorias del crecimiento, se ejecutó el modelo empleando términos cuadráticos y cúbicos para la edad. También se probó la homogeneidad de los coeficientes de regresión. Se eligió una modelización no lineal con transformación polinómica debido a su simplicidad a la hora de proporcionar la trazabilidad matemática de las funciones polinómicas, y por lo tanto, por su idoneidad para ajustarse a procedimiento sencillos como GLM o MIXED en el software SAS (Locascio y Atri, 2011). El sexo de la descendencia no se tuvo en cuenta a la hora de estimar la heredabilidad principalmente por dos motivos. En primer lugar, porque no se logró la maduración de los mejillones cultivados en criadero en ningún momento del cultivo y aquellos del pantalán no maduraron hasta los 14 meses de edad. En segundo lugar, porque no fue posible identificar el sexo de los mejillones sin tener que emplear una técnica invasiva o sin sacrificar a los individuos para realizar un análisis histológico.

182 Capítulo V

2 Las estimas de heredabilidad sobre hermanos completos (h FS) y con el modelo animal

2 (h AM), y el cálculo de los componentes de la varianza del crecimiento de la longitud de concha en cada ambiente, se llevaron a cabo mediante dos metodologías. La primera, empleó un Análisis de la Varianza (ANOVA) de una vía, mediante el procedimiento mixto (PROC MIXED) desarrollado en el programa estadístico SAS (SAS Institute Inc., 2004), según lo descrito por Garenc et al. (1998):

1 1 푉퐴 + 푉퐷 + 푉퐼 + 2푉퐸퐶 2 2 2 ℎ퐹푆 = 푉푃

Donde VP, VA, VD, VI y VEC, son respectivamente los componentes de la varianza fenotípica, aditiva, dominante, epistática y del error. El error estándar de cada estima de

2 heredabilidad (h FS) se calculó utilizando el método delta (Lynch y Walsh, 1998), siguiendo los procedimientos PROC IML y PROC MIXED (SAS Institute Inc., 2004). Los valores de probabilidad (p-valor) se obtuvieron mediante una prueba de máxima verosimilitud (LRT) de los valores Z (componente de la varianza dividido por el error estándar). La segunda metodología se basó en el algoritmo AIREML (Average information restricted maximum likelihood) y fue aplicado con el programa de análisis de modelos mixtos de uso libre WOMBAT (Meyer, 2007). El algoritmo AIREML se aplicó siguiendo el siguiente modelo animal:

yij = μ + aij + cj + eij

Donde y es el vector de observación (longitud de la concha); μ es la media total del carácter observado en cada ambiente; aij los efectos genotípicos individuales; cj los efectos maternos aleatorios de los individuos; y eij es el error residual. Los componentes de la varianza estimados fueron: la varianza del valor reproductivo o aditiva (Va), la varianza de los efectos maternos (Vc), la varianza residual (Ve) y la varianza fenotípica (Vp) entendida como,

Vp = Va + Vc + Ve

183 Capítulo V

Una vez calculados los componentes de la varianza mediante el modelo animal, la

2 heredabilidad en sentido estricto (h AM), fue estimada como:

2 h AM = Va / Vp

2 2 La comparación entre ambas estimas de heredabilidad (h AM vs. h FS) se realizó a través de un análisis de la varianza factorial de 3 vías, con el método de estimación de la heredabilidad y la localización de las familias como factores fijos y la edad de las familias como factor aleatorio. El análisis de la covarianza (ANCOVA) de una vía se empleó para

2 comprobar la heterogeneidad de la pendiente de la h AM entre los dos tratamientos ambientales a lo largo del ciclo de cultivo.

Las interacciones del crecimiento de la concha entre las familias y el ambiente a lo largo del cultivo, se analizaron mediante un análisis de varianza mixto de dos vías, con el procedimiento MIXED en el programa estadístico SAS, que contaba con un factor de efectos fijos (localización del cultivo) y otro factor de efectos aleatorios (familias de hermanos completos). La significatividad de los efectos aleatorios se calculó directamente de los valores Z, mientras que la significatividad de los efectos fijos se calculó a partir de las funciones estimables de tipo III, con los grados de libertad del denominador obtenidos a partir de la aproximación general de Satterthwaite (Satterthwaite, 1946).

La correlación genética entre tratamientos se obtuvo mediante la aplicación de dos métodos diferentes. En primer lugar se empleó la correlación de Pearson para calcular las correlaciones medias de cada familia (Astles et al., 2006; Windig, 1997). El segundo método utilizado fue un modelo mixto multivariado (Piepho y Möhring, 2011) basado en el método de máxima verosimilitud restringida (REML).

La ganancia esperada a la selección direccional de la longitud de concha fue calculada con la siguiente expresión:

2 GE = h AM · σP · i

2 Donde h AM es la heredabilidad media calculada mediante el modelo animal en el ambiente exterior, σP es la desviación estándar fenotípica a los 24 meses de cultivo, e i es la intensidad de selección (Falconer y Mackay, 1996) empleada en la población base, i.e.,

184 Capítulo V un umbral de selección del 12% implica una intensidad de selección de 1,667 (Falconer y Mackay, 1996). Las estimas de ganancia basadas en la heredabilidad estimada pueden ser comparadas con la respuesta observada al final del experimento (cosecha) en las familias de alto crecimiento, i.e., R = 69,83 mm (media de las líneas L5 y L6 del pantalán a los 24 meses) – 65,92 mm (media de la progenie total en cuerdas del pantalán a los 24 meses) = 3,94 mm de ganancia, aproximadamente.

Los análisis estadísticos llevados a cabo en este estudio, i.e., el análisis de la varianza (ANOVA) de una vía, de dos vías y de tres vías, así como los análisis de covarianza (ANCOVA) han sido calculados mediante el programa estadístico SAS versión 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Además, hemos aplicado el método de máxima verosimilitud restringido (REML) en lugar del método de mínimos cuadrados, en todos los modelos lineales mixtos, calculados mediante el procedimiento MIXED (SAS Institute Inc., 2004), debido a que el diseño experimental no se encontraba balanceado (Littell et al., 1996). La normalidad en los residuos de los modelos tras aplicar el procedimiento MIXED se comprobó usando el test Anderson-Darling mediante el procedimiento UNIVARIATE en SAS. Por último, se realizaron las transformaciones de Box-Cox cuando fue necesario normalizar los datos (Box y Cox, 1964).

185 Capítulo V

V.3. Resultados

V.3.1. Variación fenotípica

El coeficiente de variación fenotípica media del crecimiento en longitud de la concha en criadero (퐶푉̅̅̅̅ = 24,69) fue mayor que en el cultivo realizado en el cultivo marino (퐶푉̅̅̅̅ = 15,68). El porcentaje acumulado de supervivencia a los 24 meses de cultivo fue de 85,83 ± 9,47 en criadero y de 65,67 ± 15,58 en el cultivo marino. El crecimiento anteroposterior de la longitud de la concha a lo largo del experimento en las nueve progenies de mejillón cultivadas en dos ambientes, no fue lineal sino que presentó un crecimiento sigmoidal (Figura V.3).

Figura V.3. Representación gráfica del crecimiento de la longitud (length, mm) anteroposterior de la concha del mejillón en 9 progenies de hermanos completos cultivadas en criadero (H) y en la Ría de Vigo (W) durante 24 meses (age, months).

186 Capítulo V

Tras la finalización del experimento, los mejillones cultivados en el criadero de ECIMAT alcanzaron una talla media de 19,30 ± 0,25 mm, mientras que la réplica de las familias cultivadas en la Ría de Vigo alcanzó una talla media de 65,35 ± 0,30 mm.

Tabla V.2. Datos y estadísticos descriptivos del experimento en cada muestreo (edad): número de individuos medidos en cada muestreo (N), componentes de la varianza (Va; Vc; Ve; y Vp) y heredabilidad estimada mediante el modelo 2 2 animal (h AM) y el modelo lineal mixto (h FS), junto al error estándar (SE) de cada medida.

2 2 Edad N µ SE Va SE Vc SE Ve SE Vp SE h AM SE h FS SE Hatchery 8 512 13,33 0,20 0,15 0,00 0,00 0,04 0,26 0,02 0,41 0,05 0,37* 0,04 0,41** 0,18 9 702 15,11 0,17 0,00 0,00 0,22 0,18 0,28 0,02 0,50 0,18 0,00 0,00 0,42** 0,18 10 564 15,71 0,21 0,05 0,00 0,08 0,05 0,28 0,02 0,41 0,05 0,12* 0,02 0,54** 0,21 11 465 16,32 0,23 0,05 0,00 0,07 0,05 0,28 0,02 0,40 0,05 0,14* 0,02 0,55** 0,21 12 463 16,75 0,24 0,20 0,00 0,03 0,06 0,21 0,02 0,43 0,07 0,45* 0,07 0,64** 0,23 13 468 16,97 0,24 0,06 0,00 0,08 0,06 0,28 0,02 0,42 0,06 0,14* 0,02 0,57** 0,22 14 455 17,36 0,24 0,02 0,00 0,09 0,05 0,28 0,02 0,40 0,06 0,06* 0,01 0,57** 0,22 17 518 19,29 0,22 0,19 0,00 0,03 0,06 0,14 0,02 0,36 0,06 0,53* 0,09 0,75** 0,24 20 484 19,74 0,24 0,20 0,00 0,01 0,06 0,15 0,02 0,36 0,06 0,54* 0,09 0,66** 0,23 21 435 20,21 0,25 0,19 0,00 0,01 0,05 0,15 0,02 0,35 0,06 0,54* 0,08 0,65** 0,23 22 463 19,86 0,25 0,24 0,00 0,00 0,06 0,14 0,02 0,38 0,06 0,64* 0,11 0,70** 0,24 24 406 19,30 0,25 0,39 0,00 0,00 0,11 0,03 0,02 0,41 0,11 0,94* 0,25 0,86** 0,26 Outdoors 8 448 13,61 0,21 0,22 0,00 0,02 0,06 0,14 0,02 0,38 0,07 0,57* 0,10 0,72** 0,24 9 575 14,22 0,24 0,12 0,00 0,08 0,07 0,21 0,02 0,41 0,07 0,30* 0,05 0,73** 0,24 10 441 15,67 0,21 0,10 0,00 0,04 0,05 0,18 0,02 0,32 0,05 0,32* 0,05 0,62** 0,23 11 438 19,03 0,23 0,04 0,00 0,05 0,04 0,23 0,02 0,31 0,04 0,11* 0,01 0,50** 0,21 12 439 28,03 0,31 0,01 0,00 0,14 0,07 0,25 0,02 0,40 0,07 0,03* 0,01 0,75** 0,26 13 428 38,38 0,29 0,27 0,00 0,00 0,09 0,06 0,01 0,33 0,09 0,83* 0,22 0,64** 0,25 14 450 42,73 0,31 0,07 0,00 0,05 0,04 0,18 0,02 0,30 0,05 0,24* 0,04 0,60** 0,25 17 477 58,59 0,25 0,04 0,00 0,02 0,02 0,08 0,01 0,14 0,02 0,26* 0,04 0,61** 0,24 20 377 61,30 0,31 0,00 0,00 0,05 0,02 0,10 0,01 0,15 0,03 0,01* 0,00 0,70** 0,25 21 460 61,95 0,27 0,07 0,00 0,00 0,02 0,06 0,01 0,14 0,02 0,54* 0,08 0,60** 0,23 22 491 62,54 0,26 0,06 0,00 0,01 0,02 0,06 0,01 0,13 0,02 0,45* 0,08 0,68** 0,24 24 328 65,35 0,36 0,03 0,00 0,03 0,02 0,10 0,01 0,16 0,03 0,16* 0,03 0,62** 0,24

Las comparaciones de la longitud media por pares de familias (S1 – IL9) dentro de ambiente (criadero y exterior) por muestreo, evidenció diferencias significativas entre las progenies de padres con crecimiento bajo (S) o intermedio (I) y aquellas con algún padre en el 12% superior de la distribución (L e IL); la familia L6 mostró el mayor crecimiento respecto al resto de progenies cultivadas en criadero. Este patrón observado en el criadero no se replicó en el cultivo exterior a partir de los 14 meses de edad (Tabla V.3)

El modelo de regresión polinómica entre las variables edad y longitud de concha se ajustó cuadráticamente y cúbicamente, mostrando que el crecimiento de las familias tiene

187 Capítulo V distintos coeficientes de regresión entre los dos ambientes, i.e., para el ajuste cuadrático

(F [1,192] = 74,61; p < 0,0001; Figura V.4A); ajuste cubico (F [1,192] = 18,14; p < 0,0001; Figura V.4B). La interacción entre el efecto de la familia y el ambiente fue significativa, tanto en el ajuste cuadrático, F [8, 194] = 2,01; p = 0,047, como en el ajuste cúbico, F [8, 192] = 2,39; p < 0,018.

Figura V.4. Modelos de regresión polinómica obtenidos a partir del crecimiento de las familias a lo largo del cultivo ajustados de cuadráticamente (A) y cubicamente (B).

188

Tabla V.3. Comparación por pares (T2 de Tamhane) de la longitud de concha (mm) de las 9 familias (S1-IL9) entre ambientes (Criadero, C vs. Exterior, E) a lo largo del tiempo (8 a 24 meses). Las diferencias significativas entre medias por ambiente se indican con asteriscos (*p<0.001). Los valores negativos indican mayor crecimiento en la familia cultivada en el exterior.

Familias

Edad S1 S2 I3 I4 L5 L6 IL7 IL8 IL9 (Meses) C vs, E C vs, E C vs, E C vs, E C vs, E C vs, E C vs, E C vs, E C vs, E

Δ Δ Δ Δ Δ Δ Δ Δ Δ

8 -1,94 ± 0,73 -3,27 ± 0,73 -0,50 ± 0,89 0,59 ± 0,67 1,15 ± 0,69 -1,89 ± 1,12 0,00 ± 0,59 0,00 ± 0,81 0,00 ± 0,81

9 1,81 ± 0,75 -0,05 ± 0,81 0,62 ± 0,70 1,84 ± 0,68 2,19 ± 0,62 -1,26 ± 1,04 1,27 ± 0,52 0,70 ± 0,59 -0,27 ± 0,56

10 -0,88 ± 0,88 -2,08 ± 0,89 0,22 ± 0,77 -0,26 ± 0,91 0,83 ± 0,69 -0,51 ± 1,24 -0,10 ± 0,64 2,03 ± 0,60 1,08 ± 0,57

11 -1,18 ± 1,02 -3,13 ± 0,93 -5,75* ± 0,91 -5,55* ± 0,77 -1,83 ± 0,78 -3,68 ± 1,24 -3,14 ± 0,78 -0,66 ± 0,91 -1,18 ± 0,70

12 -10,03* ± 1,02 -10,68* ± 1,21 -9,42* ± 1,05 -18,38* ± 0,96 -17,51* ± 0,88 -18,11* ± 1,29 -12,00* ± 0,73 -10,14* ± 1,05 -14,32* ± 0,70

13 -17,93* ± 1,12 -21,45* ± 1,04 -23,93* ± 0,93 -23,77* ± 0,90 -25,62* ± 0,89 -26,56* ± 1,49 -21,59* ± 0,93 -20,40* ± 1,09 -21,59* ± 0,71

14 -23,75* ± 1,08 -24,82* ± 1,12 -27,22* ± 1,05 -25,86* ± 1,01 -29,19* ± 0,88 -32,41* ± 1,47 -26,46* ± 1,01 -24,39* ± 0,93 -25,06* ± 0,90

17 -40,72* ± 0,94 -38,64* ± 0,78 -43,08* ± 0,80 -43,02* ± 0,80 -38,56* ± 0,85 -40,85* ± 1,48 -42,39* ± 0,81 -37,81* ± 0,82 -32,77* ± 0,83

20 -42,60* ± 0,99 -42,39* ± 0,93 -43,05* ± 0,79 -46,05* ± 0,88 -45,21* ± 0,92 -42,66* ± 1,52 -43,23* ± 0,87 -38,95* ± 1,04 -33,86* ± 1,01

21 -44,98* ± 0,95 -41,59* ± 0,91 -42,69* ± 0,73 -45,96* ± 0,98 -44,78* ± 0,96 -43,17* ± 1,51 -44,15* ± 0,86 -40,11* ± 0,89 -35,07* ± 0,84

22 -44,98* ± 0,91 -43,176* ± 0,76 -42,83* ± 0,69 -47,81* ± 0,91 -44,71* ± 0,83 -43,67* ± 1,54 -48,43* ± 0,84 -41,34* ± 0,91 -35,08* ± 0,84

24 -48,77* ± 1,03 -44,97* ± 0,99 -46,21* ± 0,88 -50,97* ± 1,12 -49,037* ± 1,18 -44,25* ± 1,72 -49,56* ± 1,18 -43,15* ± 1,03 -36,38* ± 0,98

Capítulo V

V.3.2. Composición de la varianza fenotípica Vp

El promedio de los componentes de la varianza en cada ambiente fue significativamente diferente de cero (t de Student, p < 0,015) en ambas ubicaciones (Figura V.5).

Figura V.5. Gráfico de frecuencias del promedio entre familias de los componentes de la varianza estimados a partir del modelo animal en ambos ambientes.

En general, todos los componentes de la varianza (Va, Vc, Ve y Vp) fueron significativamente mayores en las progenies cultivadas en el criadero que en las cultivadas en el exterior (Tabla V.2). Si analizamos la evolución de los componentes de la varianza obtenidos para cada ambiente a lo largo de los muestreos mensuales, vemos que la varianza residual (Ve) y la varianza que incluye los efectos maternos, ambientales y dominantes (Vc) disminuyeron significativamente con el tiempo en las familias cultivadas en criadero, mientras que la varianza aditiva aumentó de 0,15 a 0,39 a lo largo del cultivo (Tabla V.2; Figura V.6A). Un patrón diferente se puede observar en las familias cultivadas en el exterior, donde Vc y Ve permanecieron constantes mientras que Va disminuyó de

0,22 a 0,03 (Figura V.6B). Por su parte, la varianza fenotípica (Vp) permaneció constante

190 Capítulo V a lo largo de los 24 meses en criadero, pero disminuyó en el cultivo exterior de 0,38 a 0,16 (Tabla V.2; Figura V.5).

Figura V.6. Evolución temporal en ambos ambientes (A, criadero; B, cultivo exterior) de los componentes de la varianza estimados a partir del modelo animal.

V.3.3. Heredabilidad

2 Las estimas de heredabilidad en sentido amplio (h FS), obtenidas mediante ANOVA de una vía, fueron sistemáticamente más altas que las estimas de heredabilidad en sentido

2 ̅̅2̅ estricto (h AM) a lo largo del cultivo. Por tanto, la media global de ℎ FS ± SE = 0,629 ± ̅̅2̅ 0,021 también fue mayor que la obtenida mediante el modelo animal (ℎ AM ± SE = 0,345 ± 0,053) (Tabla V.2). La heredabilidad se vio significativamente afectada por el método utilizado para su estimación (p < 0,0001) pero no por el ambiente en el que se cultivaron las familias o su interacción con el método de estimación (p > 0,239, ANOVA de 3 vías), ni por la varianza asociada con la edad o sus interacciones con la localización y el método de estimación (p > 0,05). En lo sucesivo solo emplearemos la estima de heredabilidad del modelo animal, dado que se ha demostrado su mayor precisión y robustez en presencia

2 de datos desequilibrados. La heredabilidad en sentido estricto (h AM) aumentó

2 2 significativamente con la edad en criadero (h AM = -0,2637 + 0,04218 x AGE; R = 0,67;

2 p < 0,0019) pero no mostró ese comportamiento en el cultivo exterior (h AM = 0,397 - 0,005푥 ∙ AGE; R2 = 0,01; p > 0,75). Es por esto que ambas pendientes difieren significativamente entre sí (ANCOVA; F (1,20) = 8,06; p = 0,0101) (Figura V.7).

191 Capítulo V

2 Figura V.7. Evolución temporal de la heredabilidad calculada a través del modelo animal (h AM) en cada uno de los 2 dos ambientes. También puede observarse la tendencia lineal de la h AM para cada ambiente.

V.3.4. Interacción familia-ambiente y correlación genética (rG) entre ambientes

Existió un efecto significativo del ambiente sobre la longitud de concha de las diferentes familias en todos los muestreos, con excepción del octavo y el décimo mes (Tabla V.4; p < 0,05), lo cual nos indica la existencia de una plasticidad fenotípica significativa en la tasa de crecimiento estimada por la longitud de la concha. Los mejillones cultivados en el exterior presentaron una tasa de crecimiento mayor que los mejillones del criadero (Figura V.3). También se observó que la interacción entre familia y ambiente tiene efectos significativos sobre el crecimiento de los mejillones a lo largo de todo el cultivo (Tabla V.4; p < 0,05).

192 Capítulo V

Tabla V.4. Resumen de los resultados del análisis linear mixto en el crecimiento de la longitud de concha en cada muestreo (Edad). Los efectos residuales, efectos de la familia así como los efectos de la interacción entre la familia y el ambiente fueron considerados como factores aleatorios, mientras que el ambiente fue considerado un efecto fijo. Los efectos aleatorios fueron estimados mediante “likelihood ratio test” (LRT). La longitud fue transformada mediante la raíz cuadrada. Los niveles de significación son los siguientes: * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001.

Componentes de la varianza F-Valor (1,8) Edad (meses) Familia Famila*Ambiente Residual Ambiente 8 0,100** 0,014*** 0,296*** 1,91 9 0,108*** 0,006* 0,275*** 5,35* 10 0,102*** 0,008* 0,273*** 0,00 11 0,077** 0,023*** 0,274*** 19,95** 12 0,089 0,063*** 0,285*** 126,66*** 13 0,083* 0,026*** 0,254*** 665,21*** 14 0,093** 0,014** 0,255*** 1382,35*** 17 0,043 0,051*** 0,171*** 906,96*** 20 0,038 0,052*** 0,189*** 935,36*** 21 0,035 0,047*** 0,172*** 1050,79*** 22 0,026 0,067*** 0,173*** 795,02*** 24 0,026 0,081*** 0,172*** 706,05***

Durante los 14 primeros meses de cultivo se observó una correlación genética significativa entre el cultivo interior y el cultivo exterior con ambos métodos de correlación (Pearson y REML) (Tabla V.5; p < 0,0183). A partir del muestreo del mes 14º no se obtuvo evidencia de correlación genética del crecimiento de las familias entre ambientes, con ninguno de los dos métodos (Tabla V.5; p > 0,0643).

Tabla V.5. Correlaciones genéticas (rG) entre ambientes en los muestreos realizados en los 24 meses de cultivo (Edad), estimados a partir de los métodos Pearson y REML. Los valores significativos para α ≤ 0,05 se muestran en negrilla.

Correlación de Pearson Correlación Multivariada REML Edad P-valor N. Confianza P-valor N. Confianza rG rG S.E. Z (rG=0) Inf. Sup. (rG=0) Inf Sup.

8 0,858 0,0010 0,451 0,970 0,902 0,083 10,82 0,0001 0,7385 1,0653

9 0,953 0,0001 0,787 0,990 0,992 0,022 44,11 0,0001 0,9481 1,0363

10 0,883 0,0004 0,531 0,975 0,930 0,064 14,49 0,0001 0,8046 1,0564

11 0,725 0,0181 0,117 0,938 0,782 0,159 4,91 0,0001 0,4695 1,0938

12 0,558 0,1030 -0,169 0,892 0,587 0,246 2,39 0,0169 0,1055 1,0692

13 0,724 0,0183 0,116 0,937 0,764 0,165 4,65 0,0001 0,4420 1,0870

14 0,821 0,0030 0,345 0,961 0,876 0,101 8,65 0,0001 0,6774 1,0741

17 0,494 0,1601 -0,253 0,872 0,513 0,277 1,85 0,0643 -0,0305 1,0558

20 0,427 0,2358 -0,331 0,850 0,453 0,300 1,51 0,1311 -0,1351 1,0415

21 0,452 0,2057 -0,303 0,858 0,472 0,294 1,60 0,1086 -0,1046 1,0484

22 0,309 0,4054 -0,447 0,807 0,312 0,337 0,93 0,3546 -0,3486 0,9725

24 0,264 0,4812 -0,485 0,790 0,269 0,352 0,76 0,4443 -0,4202 0,9583

193 Capítulo V

El umbral de selección aplicado del 12% indica la proporción de individuos seleccionados de la cola superior de la población base (n = 27/233), que se traduce en una intensidad de selección de 1,667 (Falconer y Mackay, 1996). La respuesta a la selección (R) obtenida en la cosecha sobre las líneas de selección para un mayor crecimiento ha sido de 14,78

2 mm, lo que implica una heredabilidad realizada (h r) de 0,85. Por tanto, la ganancia fenotípica que se esperaría por cada generación sería de 10,46 mm si aplicamos la heredabilidad realizada estimada y de 3,93 mm si aplicamos la heredabilidad estricta del modelo animal (Tabla V.6)

2 Tabla V.6. Estimas de ganancia GE calculadas sobre heredabilidad estimada con el modelo animal (h AM) y la 2 heredabilidad realizada (h r) en las líneas de selección superior (L5, L6 o ambas, L). XP es la media de la población base, XPS es la media de los parentales seleccionados en las líneas L, XF1 es la media de la progenie seleccionada, R es la respuesta observada, S es el diferencial de selección, h2r la heredabilidad calculada a partir de la respuesta 2 2 observada, GEr es la ganancia esperada a partir de h r. GEAM es la ganancia esperada a partir de h AM.

2 2 Línea XP XPS XF1 R S σp i (12%) h r GEr h AM GEAM

L5 55,05 74,5 67,55 12,50 19,45 6,41 1,667 0,64 6,87 0,318 3,40

L6 55,05 70,5 72,11 17,06 15,45 8,41 1,667 1,10 15,48 0,318 4,46

L 55,05 72,5 69.83 14,78 17,45 7,41 1,667 0,85 10,46 0,318 3,93

194 Capítulo V

V.4. Discusión

Este estudio experimental pone de manifiesto una gran variación aditiva en las familias de M. galloprovincialis seleccionadas en base a la longitud de la concha. Esto es debido probablemente a que no se realizaron maniobras de limpieza y desdoble en la población base al objetivo de retirar los reproductores más pequeños, como se ha hecho en trabajos anteriores. También puede deberse a que los cruzamientos entre reproductores fueron representativos de toda la distribución del carácter. Hemos evidenciado un mejor rendimiento a la hora de estimar las varianzas genéticas a través del modelo animal, que mediante la estimación basada en uno de los clásicos modelos lineales. Este hecho nos ayuda a evaluar posibles deficiencias metodológicas así como a establecer orientaciones futuras para realizar estudios cuantitativos en esta especie. El cálculo paralelo de los componentes de la varianza en dos ambientes nos permitió esclarecer la contribución y evolución de cada uno de ellos a lo largo del ciclo de cultivo. A pesar de las altas estimas de h2 encontradas en el cultivo interior (criadero), su fluctuación temporal y la elevada interacción entre genotipo y ambiente (GxE), hacen que cualquier predicción genética basada en éstas, sea cuanto menos dudosa. Por el contrario, la evaluación genética sobre el cultivo exterior es un enfoque más fidedigno a la hora de evaluar el margen potencial de mejora.

V.4.1. Variación fenotípica

El coeficiente de variación (CV) mayor en el criadero que en el ambiente externo es a priori contradictoria, aunque tiene su explicación tras el análisis temporal del CV en ambos ambientes. Si bien al inicio del cultivo el CV es similar en ambos ambientes, la variación fenotípica en el criadero se mantiene constante a lo largo del experimento, mientras que en el ambiente exterior desciende rápidamente a partir del 14º mes. Este descenso se cree debido a la mayor mortalidad externa (depredación, desprendimientos…) y a la intensa interacción GxE. Este hecho haría que el crecimiento de las familias se homogenizase en el mar, mientras que se mantendrían las diferencias entre las familias cultivadas en los tanques de interiores. Como era de esperar el crecimiento de las progenies fue más rápido en las cuerdas en suspensión situadas en el exterior que en los tanques de cultivo del criadero, debido principalmente a una mayor

195 Capítulo V variedad y volumen del alimento. Sin embargo, la significativa cantidad de Vp observada al final del cultivo en ambos ambientes, sugiere que podría existir una variación aditiva significativa para este carácter, haciéndolo por tanto idóneo para su explotación en programas de selección con el fin de obtener un acortamiento del ciclo productivo.

La supervivencia no tiene relevancia económica en esta especie debido a su alta fecundidad, ya que una sola hembra puede producir suficiente semilla aun con bajas tasas de supervivencia en los primeros estadios larvarios (p. ej., 1,5 - 5,0 x 106 ovocitos/hembra en M. edulis; Pronker et al., 2008). Sin embargo, sí que es relevante a la hora de calcular los componentes de la varianza, puesto que la alta supervivencia de las progenies en criadero, en comparación con su supervivencia en el mar, afecta directamente a Vp. Como se esperaba, Vp fue constante en los tanques del criadero, donde los parámetros ambientales, i.e., temperatura, nutrición, fotoperiodo, flujo de agua, manipulación, etc., fueron comunes para todas las progenies, y se registró una baja mortalidad en los 24 meses del cultivo. En las cuerdas del cultivo exterior la mortalidad fue más pronunciada (34%), especialmente a partir del 14º mes, cuando la densidad del cultivo aumentó y el espacio en las cuerdas comenzó a ser un factor limitante por el que competir dentro de cada familia (Brichette et al., 2001). En estas condiciones no sólo se espera un descenso de Vp, sino también de Va, tal y como hemos observado y discutiremos en subsecciones siguientes.

Las diferencias de crecimiento observadas entre las progenies de hermanos completos son esperables si alguno de los componentes de la varianza difiere entre las clases fenotípicas representadas. Cabe destacar que las diferencias de crecimiento esperadas entre las familias seleccionadas son patentes a lo largo de todo el experimento en los tanques de cultivo, pero no se observan diferencias en las cuerdas en suspensión del pantalán a partir del 14º mes, momento en el cual el crecimiento de todas las familias se aceleró drásticamente. Los modelos lineales realizados en función de la edad y de la longitud de la concha, muestran que el crecimiento de las familias tiene coeficientes de regresión heterogéneos entre ambientes, produciendo una interacción significativa entre familias y ambiente, lo cual tiene grandes implicaciones en la interpretación de la heredabilidad.

196 Capítulo V

V.4.2. Comparación de las estimas de heredabilidad

Varios estudios han estimado parámetros genéticos de caracteres relacionados con el crecimiento en moluscos bivalvos (Tabla V.1). La longitud de concha, así como el peso corporal son los caracteres más recurrentes a la hora de estimar heredabilidad, ya sea a

2 2 traves de la heredabilidad realizada (h r), heredabilidad en sentido estricto (h ) o heredabilidad en sentido amplio (H2). Dentro del género Mytilus se han obtenido altas estimas de heredabilidad en la longitud de concha en varios estudios, p. ej., en Mytilus edulis, 0,22 - 0,92 (Mallet et al., 1986) y 0,50 - 0,90 (Stromgrem y Nielsen, 1989). La heredabilidad de este mismo carácter también ha sido estudiada en la especie chilena del mismo género, Mytilus chilensis, tanto en larvas y juveniles, donde Toro et al. (2004) y Alcapán et al. (2007) obtuvieron unas estimas bastante similares entre sí, respectivamente de 0,32 - 0,49 y 0,33, como en individuos adultos cultivados en batea, donde las estimas fueron muy superiores (0,73 – 0,93; Guiñez et al., 2016). La heredabilidad de la tasa de crecimiento en Mytilus galloprovincialis, estimada sobre parámetros relacionados con la competencia intraespecífica, fue de 0,02 - 0,23 según Brichette et al. (2001), mientras que la h2 de la ratio longitud-anchura fluctuó entre 0,08 y 0,64 (Nguyen et al., 2011, 2014). Una estimación más reciente en M. galloprovincialis ha obtenido valores de h2 para la longitud de la concha (0,23) más bajos que los observados en este experimento (0,318 ± 0,243), probablemente debido a que se realizó una eliminación selectiva de los pequeños reproductores durante el proceso de desdoble de las cuerdas (Pino-Querido et al., 2015). Debido a que la estimación de la heredabilidad depende de muchos factores y es una propiedad específica de cada población tanto espacial como temporalmente (Visscher et al., 2008), se espera que las estimaciones de los estudios previos, que han utilizado diferentes diseños experimentales y métodos de análisis, sean diferentes para un mismo rasgo.

V.4.3. Comparación de los métodos de análisis

Uno de los mayores problemas en estudios de genética cuantitativa está relacionado con la obtención de amplios rangos de valores procedentes de diferentes métodos de análisis (Tabla V.1). De hecho, la heredabilidad en este estudio se vio significativamente influenciada por el método de análisis, según indica el ANOVA de 3 vías aplicado

197 Capítulo V

(método, ambiente y edad). Además, la heredabilidad estimada para la longitud de

2 concha con el modelo lineal mixto (h FS) fue sistemáticamente mayor a lo largo del cultivo

2 que aquella obtenida mediante el modelo animal (h AM). Ese hecho dio lugar a un rango de divergencia entre ambas estimas de 0,01 – 0,26, lo que supone una reducción de más

2 2 del 50% en el valor estimado de h AM (0,345 ± 0,053) con respecto a h FS (0,629 ± 0,021).

Varios autores sostienen que los enfoques clásicos que usan modelos lineales, como p. ej., regresión padres-descendientes, correlaciones entre medios hermanos-hermanos completos o mediante el método de mínimos cuadrados, normalmente presentan unas estimas de heredabilidad más altas, como es el caso de la talla corporal en bivalvos (Lannan, 1972; Longwell y Stiles, 1973; Mallet et al., 1986; Newkirk, 1977; Strömgren y Nielsen, 1989; Toro y Newkirk, 1990; Toro et al., 1995; Toro y Paredes, 1996). Esos valores corresponden con la heredabilidad en sentido amplio, que se define como la proporción de varianza fenotípica que puede ser atribuida a la varianza genotípica y que puede estar sobreestimada o inflada por la varianza genética no aditiva, compuesta por los componentes de la varianza epistática (Vi) y dominante (Vd) (Falconer y Mackay, 1996). Esta varianza genética no aditiva junto a la mayor sensibilidad de los métodos lineales o regresivos, sesgan los efectos de la selección y de la covarianza ambiental

2 (Akesson et al., 2008), justificando de esta forma la sobreestimación de h FS y sus notables

2 diferencias con respecto a h AM (Tabla V.2).

Por el contrario, los métodos probabilísticos tales como el modelo animal, aplicado a varias especies (Bolivar y Newkirk, 2002; Nespolo et al., 2003), así como también a mejillones (Alcapán et al., 2007), son menos sensibles a la falta de normalidad y a los diseños no balanceados, y son más precisos que los modelos lineales a la hora de detectar la cantidad de variación fenotípica no aditiva (Boldman et al., 1995). De hecho, el modelo animal proporcionó, de manera sistemática, un error inferior de muestreo mensual por ambiente, con una precisión media que se triplica en el criadero (71,77%) y se cuadriplica en el cultivo marino (75,49%) (Tabla V.2).

Se cree que son tres los factores adicionales que han contribuido a la reducción de la

2 2 h AM con respecto a la h FS. El primero es el incremento de la Vp debido a la varianza de medidas repetidas consideradas en el modelo animal (Lynch y Walsh, 1998) en 198 Capítulo V comparación con las medias individuales del análisis lineal. El segundo es la mayor precisión del modelo animal para corregir efectos de oscurecimiento en la estimación de la Va, i.e., la varianza aditiva está más pulida en el modelo animal. Y el tercer factor es la mayor solidez del modelo animal hacia datos no balanceados (Åkesson et al., 2008), mostrando estimas de Va y errores estándar (SE) más bajos que en otros enfoques (Kruuk, 2004).

V.4.4. Composición de la varianza fenotípica (Vp)

Ha sido común observar una gran proporción de varianza genética no aditiva

(dominante, Vd; epistática, Vi) así como de varianza maternal y de ambiente común (Vc), en varios estudios de heredabilidad y componentes de la varianza en M. chilensis (Alcapán et al., 2007; Mallet et al., 1986; Strömgren y Nielsen, 1989). El bajo valor absoluto que presenta la Vc (ambiente común y efectos maternos) en nuestros ambientes, unido a su leve descenso temporal en criadero y a su falta de variación en el ambiente marino, sugiere que la influencia de esta componente sobre la h2 es bajo. Además, se ha observado que la Vc es más alta en estadios larvarios iniciales, cuando la descendencia de las progenies crecen aisladas unas de otras (Alcapán et al., 2007). El descenso observado en la Vc con el tiempo se debe probablemente a la dilución de los efectos maternos (Carter et al, 2004), ya que las condiciones ambientales comunes se mantienen en todo el experimento.

En nuestro estudio la varianza genética aditiva Va parece haber contribuido más que la varianza genética no aditiva a las diferencias observadas en el crecimiento de los mejillones. Además se estima que los caracteres morfológicos muestran generalmente bajos niveles de varianza por dominancia (Vd) (Lynch y Walsh, 1998). Puesto que la varianza genética no aditiva (Vd + Vi) no se transmite a la descendencia (Gjedrem y

Baranski, 2009), sólo se utilizó la Va en el modelo animal para calcular la heredabilidad,

2 por lo que nuestra estima de h AM se acerca más a la estricta que a la genotípica.

V.4.5. Evolución de la heredabilidad en el ciclo vital

Los valores de heredabilidad obtenidos fueron significativamente diferentes de cero en todos los muestreos en ambos cultivos experimentales (Tabla V.2). El incremento 199 Capítulo V

2 significativo de la h AM con la edad en el criadero, de 0,15 a 0,39, también ha sido informado en otras especies de invertebrados marinos como ostras (0,24 - 0,50, Longwell, 1976; Losee, 1978; Newkirk et al., 1977), langostinos (Coman et al., 2010), orejas de mar (Brokordt et al., 2015) y en mejillón azul (0,12 - 0,43, Innes y Haley, 1977; Newkirk, 1980). Se han generado varias explicaciones en torno a este fenómeno. La primera es que se espera que las frecuencias alélicas cambien entre los diferentes estadios de crecimiento del mejillón, debido a la baja viabilidad de las larvas heterocigotas en comparación con las homocigotas (Mallet y Haley, 1983; Mallet et al., 1985). Otra explicación menos verosímil es que la h2 aumentaría en condiciones estresantes debido al aumento de la tasa de mutación/recombinación, o al incremento de las diferencias fenotípicas entre genotipos propiciado por los recursos limitantes (Hoffman y Parsons, 1991). Otros autores afirman que las bajas heredabilidades en estadios tempranos pueden estar causadas por una cantidad transitoria de efectos maternos/ambiente común (no aditivos), siempre que las progenies de hermanos completos se cultiven separadas antes de su transferencia a un tanque de cultivo común. Se ha observado en varios estudios que los efectos maternos y del ambiente común han ido disminuyendo con el tiempo tanto en peces (Refstie, 1989) como en moluscos (Brokordt et al., 2015). Por tal motivo, la Vc desciende con el tiempo a medida que los efectos maternos se diluyen y la Ve también disminuye a medida que los individuos crecen y se adaptan mejor al ambiente, i.e., en moluscos bivalvos no existe correlación entre el crecimiento de la concha en fases tempranas y en fases adultas (Hilbish et al., 1993; Strömgren y Nielsen 1989), por lo que no es imposible que la h2 aumente.

Un patrón distinto se observó en el ambiente marino, donde Vc y Ve permanecieron contantes mientras que la Va disminuyó de 0,22 en el 8º mes a 0,03 a los 24 meses de cultivo (Figura V.6B). Esta ligera tendencia negativa de la h2 en las familias cultivadas en el exterior se opone a lo observado en el criadero, pero es congruente con la tendencia observada en poblaciones naturales, i.e., los niveles altos de variación ambiental hacen que la Vp aumente mucho más que la varianza genética aditiva, reduciendo el valor de la heredabilidad (Ricklefs y Peters, 1981). En este sentido, Bull et al. (1982) expusieron la hipótesis de que la heredabilidad efectiva de un rasgo umbral se reduce en condiciones naturales a un valor insignificante. Por ejemplo, no es extraño ver que las estimas de h2 200 Capítulo V sean más pequeñas en fases tempranas de salmónidos que cuando alcanzan su talla comercial (Gjerde y Schaeffer, 1989).

En este estudio, el aumento de la heredabilidad en el criadero, al contrario que la mayor estabilidad observada en el cultivo exterior, requiere una explicación causal circunscrita a la ubicación, así como una correcta explicación de la heredabilidad efectiva para evaluar adecuadamente la ganancia genética potencial en programas de reproducción. En este sentido existe un amplio debate sobre cuál es el ambiente idóneo para realizar las estimaciones, las poblaciones naturales o el laboratorio (Lynch y Walsh, 1998). Varios autores han informado de que en algunas especies las estimaciones de h2 no difieren de manera significativa entre un ambiente controlado de criadero y un ambiente salvaje (Roff, 1997; Weigensberg y Roff, 1996). En nuestro caso, mientras que la h2 media en criadero difiera significativamente de la h2 de los cultivos externos, los estimadores en ambientes controlados no deberían ser empleados para extrapolar conclusiones a un crecimiento en ambiente externos.

V.4.6. Interacción familia-ambiente y correlación genética (rG) entre ambientes

Como era de esperar en el ambiente externo, los mejillones cultivados en cuerdas suspendidas crecieron más rápidamente que aquellos cultivados en el criadero, lo cual produjo una interacción significativa familia-ambiente. Esta interacción entre el ambiente y la familia se observó en casi todos los muestreos realizados, indicando que existe una alta plasticidad fenotípica de la tasa de crecimiento en M. galloprovincialis. Hay que destacar que en la especie chilena del mismo género, M. chilensis, no se han observado evidencias de interacción GxE entre individuos cultivados en diferentes ambientes (Alcapán et al., 2007; Toro et al., 2004). Sin embargo en M. galloprovincialis la correlación genética del crecimiento familiar entre ambos ambientes desapareció después de 14 meses en cultivo (aunque ya es patente a partir del 10º mes) para los dos métodos de correlación empleados. Una correlación genética con valor 1 nos indicaría que la selección en el criadero reflejará los resultados esperados en el cultivo externo, y por lo tanto, los planes reproductivos en el criadero tendrán un rendimiento similar al cultivo exterior, i.e., en ausencia de GXE sería necesario un re-ranking mínimo de genotypos entre estaciones de cultivo. 201 Capítulo V

Este resultado refleja una interacción Familia x Ambiente significativa y sugiere que habría una variación genética aditiva para la plasticidad de la tasa de crecimiento, i.e., una amplia norma de reacción. La baja correlación entre ambientes después del 10º mes implica que la longitud de concha en criadero es una estimación pobre de la longitud de concha en el ambiente externo, especialmente en el momento de la cosecha.

En vista de que la h2 de la longitud de concha se ve profundamente afectada por el ambiente de cría en M. galloprovincialis, los procesos de toma de decisiones deben distinguir qué estimaciones son las más pertinentes a la hora de emprender un programa de mejora, sobre las instalaciones y el carácter elegido. Por la misma razón, la interacción GxE no debería pasar desapercibida en un plan de reproducción artificial para esta especie. Dado que la selección para el crecimiento debe tomarse lo más cerca posible de la talla comercial, la evaluación del tamaño de la concha en las progenies debería medirse en la batea, su localización natural de engorde y cosecha.

V.4.7. Ganancia genética y estrategias de selección

La estima de heredabilidad media obtenida a partir de la longitud de la concha de las familias cultivadas en el ambiente marino fue de 0,318 ± 0,243. Esto nos indica que el potencial de mejora de la tasa de crecimiento a través de un programa de selección es bueno. Aplicando una intensidad de selección de 1,667 (Falconer y Mackay, 1996), equivalente a la proporción de individuos seleccionados para mayor crecimiento en la población base (12%), el cambio medio estimado en la longitud de concha por generación, para las familias de mayor tamaño (L) es de 3,93 mm, lo que supone una ganancia de 5,63% por generación. Por lo tanto, se podría lograr un cambio fenotípico sustancial en pocas generaciones mediante la aplicación de una selección combinada para el crecimiento individual y familiar (Falconer, 1996). Se han publicado resultados similares para otros mitílidos como M. edulis (Mallet et al., 1986; Srömgren y Nielsen, 1989) o M. chilensis (Toro et al., 2004) y como se espera, la ganancia fenotípica en el crecimiento de la concha podría reflejar el crecimiento paralelo al de su vianda interior (Nielsen, 1985).

202 Capítulo V

V.5. Conclusiones

Aunque el número de familias estudiadas ha sido limitado, este estudio proporciona estimaciones precisas de parámetros genéticos obtenidos a partir del crecimiento de la longitud de la concha en M. galloprovincialis mediante un modelo animal. Este modelo ha proporcionado estimas de heredabilidad más discretas que el lineal y con menor error.

Una elevada imprecisión a la hora de estimar los parámetros genéticos provoca un incremento esperado de la ganancia genética del carácter que estamos estudiando. La precisión de la selección aumenta con las h2 altas y con el número de individuos registrados en cada ambiente. Ésta también depende de la existencia de interacciones GxE cuando la producción y los reproductores están segregados. Hemos observado una heterogeneidad sustancial entre ambientes, tanto en la variación genética como en la variación residual. Sin embargo, dado que el 100% de la producción comercial se produce en bateas, la precisión de los parámeteros genéticos y su proyección tienen más credibilidad en el cultivo externo, mientras que la inducción de las puestas, la reproducción y la fijación temprana a cuerdas de cultivo pueden tener lugar en el criadero.

Nuestros resultados y otros en especies similares de mejillón, sugieren la viabilidad de obtener ganancias productivas en el cultivo a través de programas de selección, siempre y cuando exista la posibilidad de cosechar en suspensión a la semilla seleccionada, con baja introgresión de la semilla externa (Díaz-Puente et al., 2016). Se podría establecer un plan de mejora a través de la selección artificial para Mytilus galloprovincialis, que debería producir importantes ganancias desde el punto de vista comercial. La ganancia teórica calculada a partir de la heredabilidad estimada por el modelo animal, se traduciría en alcanzar el tamaño comercial en el mes 18º de cultivo, al tercer año del plan de selección (i.e., 4 mm/año = 2 meses de ganancia) en lugar de en el mes 24. Además esta reducción del ciclo de cultivo también podría permitir la modulación de los planes de extracción para esquivar los episodios de floraciones algales masivas, tal como se ha propuesto anteriormente, dada la inviabilidad de mejorar las tasas de filtración o detoxificación en miticultura aplicada (Díaz-Puente et al., 2016).

203 Capítulo V

La evaluación económica de las ganancias productivas del carácter objetivo, así como de otros caracteres asociados, debería ser una parte esencial del plan de mejora. Asimismo, la acumulación de la ganancia genética entre generaciones, requiere el desarrollo y mantenimiento de líneas de selección, donde los reproductores sean seleccionados en cada generación dentro de una línea parental basada en el rendimiento de su progenie. Obviamente, la aplicación de un diferencial de selección significativo en líneas seleccionadas al tiempo que se mantiene un tamaño efectivo suficiente para prevenir la endogamia, implicaría probablemente un pequeño incremento de los costes en las infraestructuras de cultivo disponibles actualmente en Galicia.

204 Capítulo V

V.6. Bibliografía

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212

Capítulo VI. Conclusiones generales

Capítulo VI

VI.1. Estimas de mezcla de stocks cultivados de Mytilus galloprovincialis con marcadores microsatélites.

 Los marcadores microsatélites en invertebrados suelen contener alelos nulos que modifican la señal genética en estudios de asignación, identificación y caracterización poblacional. Es este capítulo se estima por dos vías las frecuencias de alelos nulos, i.e., en familias y en poblaciones, y se compara su impacto en estudios aplicados. A escala poblacional no se observaron diferencias analíticas entre stocks con y sin corrección de las frecuencias génicas y genotípicas para alelos nulos. A escala individual de asignación e identificación es más ventajoso el uso de las frecuencias génicas brutas (alelos visibles) que aquellas derivadas de correcciones para compensar la frecuencia de alelos nulos.

 El stock de Alborán analizado puede contener hasta un 15% de composición génica mediterránea, por introducción de semilla exótica del Mar Adriático para cultivo. Esta introgresión representa una tasa muy elevada que podría alterar el ecosistema local y el rendimiento en cultivo de M. galloprovincialis de la subpoblación atlántica en el Mar de Alborán.

VI.2. Asignación genética de origen de la semilla desde el criadero hasta la cosecha del mejillón Mytilus galloprovincialis.

 Se desconoce la tasa de turnover o intercambio de semilla en las cuerdas de cultivo del mejillón M. galloprovincialis en suspensión. La siembra de semilla de criadero, trazable genéticamente, y su seguimiento hasta la cosecha en cuerdas de batea, ha permitido observar una tasa de reclutamiento externo muy baja. Esto indica que podría cosecharse en condiciones actuales de cultivo aquella semilla seleccionada en criadero para caracteres de interés.

 El cultivo de semilla seleccionada requiere de medidas de acompañamiento en el manejo de las progenies, tales como la protección de la semilla en fases tempranas del preengorde, la prevención del reclutamiento externo mediante la

215 Capítulo VI

optimización de la densidad de juveniles, y la siembra asincrónica con la época de desove natural para evitar la competencia intraespecífica por nicho.

VI.3. Mitílidos de la Región de Magallanes: identificación molecular y estructura genética poblacional de Mytilus chilensis.

 Se desconoce la identidad molecular de los mitílidos de interés comercial en el Cono Sur debido al complejo de especies que cohabitan en esa región biogeográfica del Estrecho de Magallanes. La identificación con claves moleculares de las cuatro especies de mitílidos comerciales de la Región de Magallanes, despeja las dudas sobre su estatus taxonómico. Esto tiene relevancia en materia de gestión de stocks y de biodiversidad así como en trazabilidad comercial.

 Por otra parte se desconoce la expansión potencial que el mejillón M. galloprovincialis ha tenido en el Cono Sur, tras la identificación de su introducción en Concepción (Chile) y en Chubut (Argentina). El análisis de la identidad del género Mytilus en la costa chilena y de su estructura genética poblacional pone de manifiesto la ausencia de M. galloprovincialis al sur de la Región de Los Lagos y la identidad genética específica de M. chilensis con status taxonómico diferencial en el género.

 Al contrario de lo observado en estudios precedentes, el mejillón Mytilus que habita el Estrecho de Magallanes no contiene alelos de M. galloprovincialis, pero sí alelos heteroespecíficos de M. trossulus y de M. edulis platensis. Se describe la primera zona híbrida que abarca al menos 300 km en el Cono Sur, de gran interés teórico por ser la confluencia de biota de tres regiones biogeográficas i.e., la Atlántica, la Pacífica y la Antártica.

VI.4. Cálculo de heredabilidad y análisis de regresión conjunta de la evolución del crecimiento en familias de hermanos completos de Mytilus galloprovincialis.

 Si bien existen estimas de heredabilidad de caracteres relacionados con el crecimiento en M. galloprovincialis, son estimas puntuales en ambientes

216 Capítulo VI

controlados, que podrían no responder a las registradas en las condiciones de cultivo. Se demuestra la superioridad del modelo animal para estimar heredabilidad estricta en familias de hermanos completos y la tendencia divergente de sus estimas en ambiente controlado y en batea.

 Dada la interacción GxE significativa, las conclusiones obtenidas sobre parámetros genéticos estimados en criadero son poco útiles, en el mejor de los casos, para estimar las potenciales ganancias en un programa de selección artificial para crecimiento del mejillón.

 La heredabilidad en sentido estricto es elevada para este carácter en condiciones

2 de cultivo h AM = 0,345 ± 0,053 y permite pronosticar ganancias significativas de al menos 4 mm por generación. Esto permitiría acortar el ciclo productivo y con ello mejorar la productividad, y posiblemente esquivar episodios de mareas tóxicas.

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Borja Díaz Puente, 2014 – 2018 Disertación de Tesis Doctoral de la Universidad de Vigo Evaluación de la dinámica poblacional y de la variabilidad genética del mejillón cultivado, Mytilus galloprovincialis. Universidad de Vigo, Vigo, Pontevedra, España. Octubre de 2018 Campus Universitario de Vigo. Lagoas, Marcosende. 36310 Vigo www.uvigo.es – [email protected] – Tfno. 986 812 000 Impreso en España / Printed in Spain