ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS EN MICROSATÉLITES ALEATORIOS DE DNA DEL GERMOPLASMA DE BANANAS DE LA COLECCIÓN DE CORPOICA PALMIRA
LUIS ALONSO OSORIO GARCÍA
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Maestría en Biotecnología Medellín, Colombia Año 2015
ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS EN MICROSATÉLITES ALEATORIOS DE DNA DEL GERMOPLASMA DE BANANAS DE LA COLECCIÓN DE CORPOICA PALMIRA
LUIS ALONSO OSORIO GARCÍA
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Magister de Ciencia
Director: JAIME EDUARDO MUÑOZ FLÓREZ Ph.D. Codirector: JUAN GONZALO MORALES OSORIO Ph.D.
Maestría en Biotecnología: Biotecnología Vegetal
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Maestría en Biotecnología Medellín, Colombia Año 2015
Agradecimientos
El autor agradece a la Universidad Nacional de Colombia por financiar esta investigación durante tres meses de diciembre de 2014 a febrero de 2015 en el marco de la convocatoria de apoyo permanente a estudiantes de posgrado. Con el fin de brindar Apoyo económico a los estudiantes de posgrado de la Universidad Nacional de Colombia para el desarrollo de sus tesis. También agradece al Dr. Jaime Eduardo Muñoz Flórez Ph.D.y al Dr. Juan
Gonzalo Morales Osorio Ph.D., por la dirección y codirección de la tesis de Maestría, al igual que por la ayuda recibida en todos los procedimientos administrativos para la terminación existosa de mis estudios de Maestría. También agradece en su nombre y en nombre de la Universidad Nacional de Colombia a CORPOICA Palmira por la gestión y todo el apoyo recibido en el desarrollo de esta investigación y por facilitar el material vegetal de su colección in situ para la extracción de DNA, especialmente al Dr. Álvaro
Caicedo Arana Ph.D. director del área de frutales. También agradece muy especialmente a las Doctoras Yacenia Murillo Ph.D., Paula Rugeles M.Sc. del laboratorio de Biología
Molecular de la Universidad Nacional de Colombia Palmira y al Dr. Álvaro Caicedo
Arana Ph.D. de Corpoica por toda la ayuda reciba para el desarrollo de esta investigación.
Luis Alonso Osorio García
Resumen y Abstract VII
Resumen
En Colombia el cultivo de banano para exportación es muy importante en el Urabá
Antioqueño y en el Magdalena medio, por esta actividad el país percibe 757,3 millones de dólares los cuales representan el 0.4% PIB. Corpoica cuenta en total con 188 entradas de bananas en colección de campo y 164 accesiones en cultivo de tejidos in vitro. La relación genética entre las bananas se ha estudiado usando diferentes métodos moleculares entre ellos están RAPD, SRAP, AFLP y ISSR. Se han realizado estudios que comparan el uso de marcadores microsatélites y características morfológicas estimando la relación genética entre cultivares de banana. Se han realizado estudios importantes en bananas con el método de micros satélites Amplificados al Azar. En 1996 se describe el uso de los Randomly Amplified Microsatellites (RAMS) como un método universal para el estudio de la variación genética en especies de hongos y posteriormente han sido utilizados en el estudio de plantas. En esta técnica, un solo cebador 5´ de PCR degenerada "universal" se dirige a las repeticiones intrínsecas de los microsatélites y el DNA entre los extremos distales de las dos regiones de los microsatélites estrechamente posicionadas es amplificado, lo que resulta en patrón de ampliaciones específicas de la especie después de la separación electroforética del gel.
Los marcadores RAMS son muy importantes como resultado del elevado nivel de polimorfismo, carácter dominante, facilidad de aplicación, alta reproducibilidad y bajo costo. Con el avance de la ingeniería genética en el aislamiento, secuenciación y transferencia de genes, se hace necesario el establecimiento de grandes bancos de genes para su conservación. En Colombia el 70% de las accesiones vegetales en VIII Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira condiciones ex situ de los bancos nacionales se conservan en Corpoica. En este estudio se caracterizaron molecularmente 93 variedades de bananas pertenecientes al estado colombiano mantenida por Corpoica. Utilizando la técnica RAMS (Ramdomly Amplified
Microsatellites). El análisis se realizó sobre 72 loci polimórficos con cinco primers CA,
AG, CGA, CT y TG. La varianza molecular AMOVA muestra que no existen diferencias significativas entre 6 poblaciones de bananas analizando los genomas AA, AAB, AAA,
BB, AAAA y AAAB con un valor calculado de PhiTP de 0,06 con una probabilidad P>
0,006, se muestra una moderada diferenciación genética de las especies de bananas, utilizando los genomas, esta proximidad se debe posiblemente a que todas las bananas provienen del cruce de Musa acumunata y Musa balbisiana.
Palabras Clave: Musaceae, Marcadores moleculares RAMS, M. balbisiana y M. acuminata.
Abstract
In Colombia the cultivation of bananas is very important in the Urabá region and the
Middle Magdalena, for this activity, the country receives US $ 757.3 million which represents 0.4% of GDP. Corpoica has a total of 188 accessions of bananas in field collection and 164 accessions in vitro tissue culture. The genetic relationship between bananas has been studied using different molecular methods among them are the RAPD and SRAP, AFLP and ISSR using. There have been studies comparing the use of micro satellite markers and morphological characteristics estimating the genetic relationship between cultivars of banana. There have been major studies in bananas with the method of micro Randomly Amplified Satellites. In 1996 it was described the use of Randomly Contenido IX
Amplified Microsatellites (RAMS) as a universal method for studying genetic variation in fungal species and now is used in the study for plant. In this technique, a single 5’- degenerate ‘universal’ PCR primer targets the intrinsic microsatellite repeats and the DNA between the distal ends of two closely positioned microsatellite regions is amplified, resulting in species-specific amplicon patterns after gel electrophoretic separation. The
RAMS markers are very important as a result of the high level of polymorphism, dominant nature and ease of application and high reproducibility. With the advance of genetic engineering in the isolation, sequencing and gene transfer, the establishment of large gene banks for preservation is required. In Colombia 70% of plant accessions in ex situ conditions of domestic banks are preserved in Corpoica. In this study 93 varieties of bananas from the collection of Corpoica was molecularly characterized in the molecular laboratory of the Colombian National University. Using RAMS (Ramdomly Amplified
Microsatellites) technique. The analysis was performed over 72 polymorphic loci with five primers CA, AG, CGA, CT and TG. AMOVA molecular variance did not show significant differences between 6 populations of bananas using the genomes AA, AAB, AAA, BB,
AAAA, y AAAB, with a calculated value of 0.06 PhiTP with P> 0.006 probability, a moderate genetic differentiation of species of bananas shown using genomes, this proximity is may be because that all bananas come from crossing Musa balbisiana and
Musa acumunata.
Key Words: Musaceae, Molecular markers RAMS, M. balbisiana and M. acuminata.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ...... VII
Lista de figuras ...... XII
Lista de tablas ...... XV
Introducción ...... 1
Marco Teórico ...... 5 1.1. Biogeografía y Filogenia ...... 5 1.1.1. Diversidad, Clasificación, Distribución y Morfología Botánica...... 11
Justificación...... 39
2.1.1. Objetivos...... 41
3. Métodos...... 42
4. Resultados...... 51
5. Discusión...... 70
6. Bibliografía...... 94
Contenido XII
Lista de figuras
Pág.
Figura 1. Mapa de Antioquia municipios del Urabá antioqueño zona bananera.……...…...4 Figura 2. Distribución mundial de especies nativas de géneros de Musaceae...... ……….....8 Figura 3. Árbol filogenético de Musáceas con E. venticosum como outgroup.……...... 9 Figura 4. Dendrograma. Consenso estricto de Musásecas a inferirse de ITS….……….....10 Figura 5. Especie Ensete ventricosum...... 15 Figura 6. Morfología externa de la planta de banana………...…………………………....19 Figura 7. Estructuras reproductivas de Musapara coxinea…...……..…………………….20 Figura 8. Flores de Musa balbisiana...... …………...………………………...…………...21 Figura 9. Fruto de Musa balbisiana..…………………………...………………....………21 Figura 10. Fotografía de bananas silvestres en Indonesia...………...……………………..24 Figura 11. Centro de origen de las Musáceas……………...………………...…………....28 Figura 12. Relación de cruzamiento de la mayoría de las musáceas cultivables...………..30 Figura 13. Distribución mundial de bananas, usos y bancos de germoplasma………..…..34 Figura 14. Musa chunii Yunnan China (Häkkinen2009).……..…………………………..37 Figura 15. Bosques donde se encuentran las bananas en India…………………………....38 Figura 16. Mapa de ubicación de Corpoica Palmira.….………………………….…….....47 Figura 17. Fotografía de Musa laterita banco de germoplasma Corpoica………………..48 Figura 18. Fotografía de Musa textilis banco de germoplasma………..……………...….49 Figura 19. Banco de germoplasma Corpoica Palmira.……………………..……………..50 Figura 20. PrimerAG1.……………...…...………………………………………………..53 Contenido XIII
Figura 21. PrimerAG2..…………………………………………………………………...53 Figura 22. PrimerAG3..………………………………………………………………...…53 Figura 23. PrimerAG4..…………………………………………………………………...54 Figura 24. PrimerCA1..…....…….………………………………………………………...54 Figura 25. PrimerCA2………..………………………………………….………………...55 Figura 26. PrimerCA3...... ….…………………………………………………….……….55 Figura 27. .PrimerCA4…...….…………………………………………………………….56 Figura 28. PrimeCGA1…....……...……………………………………………………….56 Figura 29. Prime CGA2..…….…...……………………………………………………….57 Figura 30. Prime CGA3….….….…………..……………………………………………..57 Figura 31. PrimeCGA4.……..………..…………………………………………………...57 Figura 32. PrimerCT1…...………….……………………………………………………..58 Figura 33. PrimerCT2....…………………………………………………………………..58 Figura 34. PrimerCT3.……...……………………………………………………………..59 Figura 35. PrimerCT4.………...…………………………………………………………..59 Figura 36.Primer TG1……………………………………………………………………..59 Figura 37.Primer TG2……..………………………………………….…………………...60 Figura 38.Primer TG3…...………………………………………………………………...60 Figura 39Primer TG4.…..…………………………...…………………………………….61 Figura 40. Matriz binaria de 0 y 1 presencia ausencia de alelos....…..……………………62 Figura 41. Dendrograma UPGMA índice de similitud.…...…….………….....…………..63 Figura 42. Agrupamiento de variedades de bananas principales clados.....……………….64 Figura 43. Dendrograma de bananas utilizando el genoma..…………………….………..66 Figura 44.Porcentaje de varianza molecular…..…………...... ………………………….68 Figura 45. Fotografía de la variedad Red en el banco de germoplasma Palmira………….81 Figura 46. Fotografía de Musa ornata en el banco de germoplasma Palmira.…...……… 82 Figura 47. Fotografía de Pigmeo Cavendish en el banco de germoplasma Palmira……... 83 XIV Título de la tesis o trabajo de investigación
Figura 48. Fotografía del interior del cultivo en el banco de germoplasma Palmira...... 84 Figura 49. Fotografía de los rótulos de marcaje en el banco de germoplasma Palmira…..85 Figura 50. Fotografía sistema de sostén en el banco de germoplasma Palmira………….. 86 Figura 51. Fotografía de Cachaco enano en el banco de germoplasma Palmira....……… 87 Figura 52. Fotografía de rótulos en el banco de germoplasma Palmira.…………………..88 Figura 53. Fotografía de la separación de surcos en el banco de germoplasma Palmira.....89 Figura 54. Fotografía de los caminos de acceso en el banco de germoplasma Palmira…..90 Figura 55. Fotografía de Musa basjoo en el banco de germoplasma Palmira…………… 91 Figura 56. Fotografía de Musa velutina en el banco de germoplasma Palmira..………….92
Contenido XV
Lista de tablas
Pág.
Tabla. 1. Especímenes de banana y sus códigos de Id. En la muestra.....………………....45 Tabla. 2. Primers RAMS...……..……………………….….……….……………………..46 Tabla. 3. Índices de riqueza de variedades de bananas…………...……………………….52 Tabla. 4. Índice de similitud…..…...…………………….………………………………..65 Tabla. 5. Porcentaje de bandas polimórficas en la muestra..……...... …………………….66 Tabla. 6. Distancias genéticas de Nei´s 1978…..………...... …………………………..67 Tabla. 7. Análisis de varianza molecular…….…………………………………………....67 Tabla. 8. Calificación de la diferenciación genética de acuerdo al Fst Wright1978…...... 69
Introducción
Las bananas son plantas muy importantes en el ámbito económico, su cultivo constituye una gran riqueza en el aporte del PIB de varios países. Su gran utilidad como alimento, su versatilidad en su uso casi completo de toda la planta: Alimento humano, alimento animal, fibras naturales (Lacuna-
Richman 2002), biopolímeros, uso en agrofloristería como cultivo asociado, alimento y refugio de fauna silvestre, genoma utilizado en el estudio de virus, producción de azúcares y alcohol compuestos naturales entre algunas de sus utilidades más destacadas. Se han realizado estudios químicos de Musa acuminata encontrando un total de 49 compuestos aromáticos también se aislaron sus azúcares siendo la sacarosa la más abundante seguido de la glucosa y la fructosa
(Sönmezdag et al; 2012) En Colombia el cultivo de las bananas es uno de los principales cultivos agrícolas en ciertas regiones del país principalmente en el Urabá Antioqueño y Magdalena Medio
(Restrepo, 2009). Figura 1. La zona bananera del Magdalena medio está comprendida entre los 10°
50’ N, 10° 52’ S y 74° 07’ O, 74° 24’ O. Eje cafetero Quindío y Caldas en la zona rural de
Manizales con una producción de 15.9 Ton en 1200 Ha como cultivo asociado (Agatón & Mejía,
2002). Como cultivo asociado se encuentra en casi todo el territorio nacional, siendo especialmente importante en regiones como la costa Pacífica (CENICAFE, 1989) y el trapecio Amazónico. Los datos de las exportaciones de bananas son muy importantes, Colombia exportó a Bélgica-Lux,
USA, F. Rusa, China, Arabia Saudí, U.K., Italia, Alemania entre otros 1834.9. Ton. Para el año
2012 (FAO, 2014). Las empresas bananeras que históricamente han trabajado en Colombia son
Chiquita Brands (Caribbean shipping, 2006; Market Line, 2013), Dole y United Fruit Company.
Estas empresas exportan y manejan todo el volumen de la producción, compran el producto a otras empresas nacionales que se encargan de toda la cadena de producción de las bananas desde su 2 Introducción siembra hasta su manejo poscosecha. La producción y el comercio de bananas es manejado por cinco compañías –Chiquita, Dole, Del Monte, Noboa y Fyffes, las cuales controlan más del 80% del comercio global (FAIRTRADE, 2009). El mapeo de la cadena productiva de las bananas está bien detallado para la variedad Gros Michel en Costa Rica (Escobedo, 2012). Los predios donde siembran las bananas a gran escala son en su mayoría de terratenientes, que consiguieron los terrenos como beneficio de servicios prestados a la nación ó comprados con la ayuda de las mismas presiones establecidas por el mercado del monocultivo en una región determinada. Lo anterior es documentado en Kess, 2006; Viloria, 2009. La historia completa del cultivo de las bananas en América está bien estudiada en Hyatt, 1990. Lo importante para este estudio de las bananas como cultivo es su impacto en el producto interno bruto del país. En el año 2012 las exportaciones colombianas de bananas ascendieron a 90,6 millones de cajas de 18,14 Kg cada una, con un valor total de US$757,3 millones de dólares, lo cual representa el 0.4% del PIB del país
(Augura, 2013). Y su versatilidad como cultivo de alta prospección de exportación en Colombia e.g, las bananas orgánicas como renglón económico considerado apuesta regional para cultivadores de la Guajira, las cuales tienen la oportunidad de ser exportadas a Bélgica, Países Bajos, Reino
Unido, Irlanda, Austria, Portugal, España, Alemania, Francia, Italia, Eslovenia, Eslovaquia,
República Checa, Finlandia (Proexpor Colombia, 2011). En la Guajira existen 3000 Ha que corresponden a la producción de bananas orgánicas, es la única región del país que cultiva las plantas de bananas con estas característica (ASBAMA, 2015). Exportación que no tiene el gran impacto de las haciendas bananeras pero que para las comunidades locales de determinada región si es significativa en cuanto a la posibilidad de pequeños agricultores para posicionar un producto vendible en el exterior. La Unión Europea ha firmado tratados con Colombia y Perú y con seis países más de Centro América (Costa Rica, El Salvador, Honduras, Guatemala, Nicaragua y
Panamá) donde la provisión de bananas es considerada como un elemento clave en las perspectivas de acuerdos comerciales con los países Americanos (Anania, 2010). En los E.U.A. los cultivos de bananas se encuentran distribuidos en los estados de California, Arizona, Texas, Georgia y Florida Introducción 3
(Gilman & Watson, 1994, Crane & Balerdi, 1998, krewer et al; 2008). Para el tamaño de su territorio y población no son significativos pero constituyen un baluarte como colecciones vivas de bananas en parques naturales. La colección de accesiones de germoplasma de bananas del sistema de bancos de germoplasma del estado colombiano se encuentra en Palmira en CORPOICA 3° 51´
61´´ N y 76° 3´ 23´´ O, cuenta con un número total de 188 introducciones en la colección de campo y 164 accesiones en cultivo de tejidos in vitro, 172 cultivares en campo y 149 en cultivo de tejidos in vitro (MusaNet, 2014). Las bananas son el cuarto alimento más importante para la alimentación mundial después del arroz, el trigo y el maíz, se encuentran cultivos en más de 100 países y su área de cosecha es de 10 millones de Hectáreas con una producción anual de 88 millones de Toneladas (Frison & Sharrock, 1999). El productor más grande de bananas es la India con 19%, Brasil 15% y Ecuador 12%. China tiene una producción de 10%; otros países como
Colombia, Costa Rica, Filipinas y México, producen entre 6 y 4% seguido de un grupo de países grandes con menos de 3% individual y producen un 36% en total (Soto, 2011). América Latina es el único exportador de bananas orgánicas, las exportaciones para el año 2009, fueron de 24,2 millones, que representan un 3% de las exportaciones de bananas convencionales. El mayor exportador de bananas orgánicas es Ecuador con 9,9 millones de cajas de 18,14 Kg, que se producen en 10500 hectáreas de cultivo; el segundo exportador es Republica Dominicana, con 5,5 millones de cajas, producidas en 5100 hectáreas (Soto, 2011). Perú exporta 4.1 millones de cajas, en 5250 hectáreas, ubicadas en la zona desértica de Piura, en su mayoría. Colombia, con 3,22 millones de cajas, requiere de 2250 hectáreas. La diferencia de precios entre las bananas convencionales y las orgánicas es del 33% en el mercado de los Estados Unidos, es de $0,34 por
Kg lo que constituye un aliciente para el producto orgánico (Soto, 2011). En países como la India las bananas son unas plantas muy antiguas e interrelacionadas con la tradición y cultura debido a que son de continua reproducción, la planta de banana es considerada como un símbolo de fertilidad y prosperidad (Dayarani et al; 2011). 4 Introducción
Figura 1.
Mapa de Antioquia, municipios del Urabá Antioqueño zona bananera de Colombia. Departamento Nacional de Estadística (DANE). Medellín .https://www.google.com.co/search?q=mapa+de+antioquia/2015.
Marco Teórico
1.1. Biogeografía y Filogenia
Bananas es el término utilizado para referirse a especies e híbridos del género Musa, familia
Musaceae. El género Musa se encuentra dividido en cinco secciones, la banana más comestible usualmente sin semilla, es originada de tipos de bananas silvestres, y principalmente por M. acuminata y M. balbisiana y un hibrido M. paradisiaca. (Fakultät & Wilhelms, 2008). Musa acuminata y Musa balbisiana divergieron cerca de 4.6 millones de años atrás (Lescot et al; 2008.).
Las bananas comestibles son clasificadas de acuerdo a su genotipo dentro de grupos, subgrupos y clones (Silayoi, 2002). Una de las características más importantes de las bananas silvestres es su alta variabilidad genética, existiendo diploides, trípodes y tetraploides (Häkkinen, 2013). Y para entender mejor a qué se debe esta variabilidad genética es necesario conocer las relaciones filogenéticas de las bananas, producto de los cambios evolutivos relacionados con su biogeografía y dispersión. Las bananas pertenecen al orden Zingiberales, el cual comprende un grupo monofiletico de grandes monocotiledóneas herbáceas incluido el importante grupo económico
(Musa ssp. Linnaeus, 1753., Kress & Specht, 2006). En el periodo cretáceo perteneciente a la era
Mesozoica aparecen las primeras plantas con flor, las angiospermas y la gran diversidad de insectos polinizadores (Dixon et al; 1988, Fortey, 1997). Las monocotiledóneas comprenden el
único linaje filogenético con una cuarta parte de todas las especies de Angiospermas de las cuales se han nombrado 300.000 (Bremer et al; 2003). Las Liliopsidas se encuentran desde 130 millones de años atrás con mucha mayor radiación, las familias modernas se encuentran desde el cretáceo
(100 millones de años a tras). El género Musa, se originó 50 millones de años atrás (Kress &
Specht, 2006), se ha diversificado a través de la gran región del Suroriente de Asia (cf. WWF &
6 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
IUCN, 1995). Figura 2. El orden de los Zingiberales comprende Bananas (Musa, Ensete e híbridos) y las raíces de flechas (Maranta arundinacea, Canna indica) y muchas otras especias como
Zingiber officcinale, Curcuma spp, Elettaria cardamomun, Alpinia galanga, Amomun villosum,
Edychium y Estaliatus involucratus, Helconia, y Ischnosiphon. (Prince & Kress, 2002). El origen del orden Zingiberales datan del periodo Santoniano 90 millones de años atrás, y hace 110 millones de años ocurre la primera divergencia la de la familia Musaceae del tronco principal de las Zingiberales, las masas continentales sufrían un clima tropical sirviendo de puente con las tierras del norte durante el cretáceo medio y terciario medio. La migración continental seguida de aislamientos y dispersiones de largas distancias, parece ser la mayor causa de la dispersión geográfica pantrópical de los Zingiberales (Kress & Specht, 2006). Las Zingiberacias son encontradas principalmente en los trópicos de Asia, África, y de las Américas con pocos taxones
(especies de Roscoea, Cautleya, Alpinia, Canna, and Thaliana) (Kress & Specht, 2005). El género
Ensete en el Mesozoico posiblemente se dispersó en las masas terrestres que se encontraban en deriva continental desde el Ecuador hasta lo que hoy son las rocallosas. Del género Ensete; se tienen datos de fósiles encontrados en Oregón USA del terciario temprano (Kress & Spech, 2006) y de África (Mindzie et al; 2001). Los autores anteriores discuten que varias especies del género
Ensete son endémicas de África tropical i.e., Ensete gillettii & E. ventricosum ITC 1389 e ITC
1387 respectivamente. También se han encontrado fósiles del fruto de Striatornata Musaceae en
México del cretáceo, Musaceae y Heliconaceae en Texas e Inglaterra del eoceno (Prince & Kress,
2002). Análisis filogenéticos realizados usando secuencias EST seleccionadas de la colección de bananas depositadas en GenBanK fechados en Marzo 30 de 2009. Usando los ortólogos de arroz identificados por el análisis BLAST para mapear el genoma de las bananas y secuenciamiento de amplificación de fragmentos clonados depositados en GenBanK [GenBanK: HM118565-
HM118820]. Para hacer la reconstrucción filogenética, los datos sustentan una estrecha relación entre las especies de Rhodoclamys y Eumusa, y confirman el estatus genérico de Musella y Ensete Capítulo 1 7
(Christelova et al; 2011). Figura 3. Estudios recientes realizados con secuencias de DNA de 36 especies analizando los ITS ribosomales del núcleo y cloroplastos (atpB-rbcl, rps16 y trnl-F) para las Musáceas que se originan en Sur Oeste de Asia el género Musa (MLA, SOA, IN) Musella
(SOA) y Ensete (AF, SOA, IN) y sugieren que los géneros Musella y Ensete están emparentados,
Musella puede ser la hermana del monofiletico Ensete con cinco especies. Pero refutan la clasificación intragenerica del género Musa, según los resultados se fusionan Eumusa-
Rhodoclamys, al igual que a Callimusa-Australimusa (Lui et al; 2010), Figura 4. El género Musa se divide en cinco secciones de acuerdo a su número básico de cromosomas y caracteres morfológicos. Ellas son Australimusa, Callimusa, Eumusa; Rhodoclamys e Ingentimusa (Silayoi,
2002). A causa de que el género Musa no es originario de África se sabe que se encuentra separado del género Ensete. Al menos tres de las bananas domesticadas prehistóricamente provienen de del sur este de Asia de la región de Nueva Guinea dentro del oeste de Oceanía M. lolodensis, M. maclayi, M. peekelii y se resalta el aislamiento de esta región para el Holoceno tardío (Kennedy,
2008).
8 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Figura 2.
Distribución mundial de especies nativas de géneros de Musaceae. Familias del orden Zingiberales (Juss,
1789). http://botany.si.edu/zingiberales/families/familypage.cfm?myfamily=Musaceae. Departamento de
Botánica, Smithsonian Institution.
Capítulo 1 9
Figura 3.
Árbol filogenético basado en datos de la secuencia A, con E. ventricosum como grupo aparte. Los valores por encima de las ramas indican el apoyo de arranque para MP y ML, respectivamente. Clados I y II indican conocidas divisiones taxonómicas dentro de musáceas. Clado I: Eumusa (M. acuminata [Genoma A] y M. balbisiana [Genoma B]) más Rhodochlamys (M. mannii y M. ornata) entradas. Clado II: Australimusa (M. textilis, M. maclayi y Fe'i) y Callimusa (M. coccinea y M. beccarii) entradas. (Crhistelova et al, 2011).
10 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Figura 4.
Árbol de consenso estricto de Musáceas a inferirse de los ITS nucleares y cloroplastos combinados (atp B-
RBC L espaciador, trnL-F espaciador, rps16 intrón) conjunto de datos. Los números por encima de las ramas que unen los nodos son la máxima parsimonia de apoyo de arranque (BS), seguido de probabilidades
Bayesianas (PP) cuando P 50% (BS) o P 0.50 (PP) (indicado de otra manera como cuando <50% o <0,5).
Los dos clados principales de Musa y los números cromosómicos básicos sugeridos (x = 11, x = 10/9/7) se representan en los clados pertinentes (Li et al; 2010). Capítulo 1 11
1.1.1. Diversidad, Clasificación, Distribución y Morfología Botánica
En todo el mundo existen aproximadamente entre 50 a 70 especies de Musa y más de 500 cultivares (Psyquay et al; 2009, Häkkinen & Hong, 2007). Para la biología, las bananas son un grupo muy importante por su filogenia y biogeografía y además porque se describen especies que aún no habían sido conocidas para la ciencia año tras año e.g., Musa paracoccinea (Liu et al;
2002) en Yunnan China, Musa bauensis (Häkkinen & Meekiong, 2004), Musa barioensis
(Häkkinen, 2006), Musa nangensium var. hongii (Häkkinen, 2008) Yunnan China, Musa chunii
(Häkkinen, 2009) Yunnan China, Musa itinerans Taiwan (Chiu et al; 2011), Musa hakkinenii
(Samly et al; 2012) Norte de Vietnam, Musa indandamensis de India Bay Islands, (Singh et al;
2014), Musa mannii var namdangensis (Gogoi & Borah, 2014), India. Otras bananas económicamente importantes son las manilas Musa textilis de las cuales se usan las hojas ya que poseen fibras naturales (Lacuna-Richman, 2002). Las bananas pertenecen a las plantas monocotiledóneas, al orden Zingiberales, a la familia Musaceae y los géneros Musa, Musella y
Ensete. Los Zingiberales son un grupo de plantas de distribución pantropical, con flores usualmente muy coloridas que incluyen las económicamente importantes bananas, heliconias y gingers (Prince & kress, 2002). Las bananas son grandes plantas herbáceas cuyo pseudotallo tiene una altura de 2-8m en variedades cultivadas y de 10-15m en variedades silvestres. Según (Ploetz et al; 2007) las bananas se clasifican de la siguiente forma. Género Ensete su rango de distribución es a través de África y sur de Asia. Especies: Ensete gilletii De Wild. Cheesman, Ensete glaucum
Roxb. Cheesman, Ensete bomblei Bequaert. Cheesman, Ensete perrieri Claverie. Cheesman,
Ensete superbum Roxb. Cheesman, Ensete ventricosum Welw. Cheesman. Figura 5. Descripción:
Este es el género más importante en especies. Crece entre 5-7m de altura, su rango de distribución es a través del continente africano y produce un rizoma que es usado como alimento básico para aproximadamente 8 millones de personas en las tierras altas de Etiopía. La banana negra sinónimo 12 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira. de E. maurelii variedad maurellii fue introducida en Hawái donde es común verla. Sección
Ingentimusa Musa ingens es la planta herbácea silvestre más grande del mundo (Purseglove, 1972) tiene una altura de hasta 18 m, 2.5 m de diámetro a nivel del suelo, se encuentra en alturas entre
1000-2100 m, su fructificación ocurre hasta los 1600 m, no tolera la permanencia de temperaturas altas, su infrutescencia madura puede pesar de 30-60 Kg y crece en las tierras altas de Papua Neva
Guinea. La revisión completa de la Sección Musa donde se listan 33 especies del género Musa entre ellas M. cheesmanii Simmonds & Bull, 1957, M chunnii Häkkinen, 2009, M flaviflora
Simmonds & Bull, 1957, M. griersonni Noltie, 1994, M. lanceolata Warb ex K. Schum, 1900, M. sanguínea Hook 1872, M. thomsonii King ex Baker, A.M. Cowan & Cowan in J.M Cowan & A.M.
Cowan, 1929, M. yamiensis C.L. & J.H. 2008, M. yunnanensis Häkkinen & H. Wang, 2007 y M. zaifui Häkkinen & H. Wang, 2008, se encuentra en Häkkinen, 2013. El centro de origen del género
Musa es el sur y el sur oriente de Asia y un gran número de plantas importantes son encontradas en el género. Con pocas excepciones las bananas comestibles provienen de híbridos de varias subespecies de M. Acuminata e híbridos inter específicos entre M. acuminata (Colla, Genoma A) y
M. balbisiana (Colla, Genoma B), pertenecientes a la sección Eumusa. Basados en el número básico de cromosomas y el arreglo y orientación de las flores en la inflorescencia, Musa es agrupado en cinco secciones: Sección Australimusa número de cromosomas (x= 10): M. bukensis
Papua Nueva Guinea (Argent, 1976). M. jackeyi W. Hill. Australia Queesland (Ross, 1987). M. lolodensis Cheesman. Indonesia, Molucas, Nueva Guinea (Argent, 1976., Nasution, 1993). M. maclayi von Muell ex Miclouho-Maclay, Papua Nueva Guinea (Argent, 1976). M. peekelii
Lauterbach. (Papua Nueva Guinea (Argent, 1976). M. textilis Neé. Filipinas (Valmayor et al,
2002). Sección Callimusa número de cromosomas (x=10): Un listado de 37 especies de Musa pertenecientes a la Sección Callimusa se encuentra en (Häkkinnen, 2013). M. alinsanaya
(Valmayor et al, 2002). M. beccarii Simmonds. Borneo Oriente de Malasia (Wong et al, 2001b,
Häkkinen, 2004b, Häkkinen et al, 2005, 2007a, 2007b). M. borneensis Beccari. Borneo, Oriente de Capítulo 1 13
Malasia, Brunei y Kalimantan (Häkkinen & Meekiong, 2005). M. campestris Beccari Borneo,
Oriente de Malasia, Brunei y Kalimantan (Häkkinen, 2003a, 2004a, 2004c). M. coccinea Andrews.
China e Indochina (W u & Krees, 2000., Argent & Kiew, 2002., Liu et al, 2002b, Häkkinen &
Väre 2008c). M. exotica Valmayor, Vietnam (Dhan et al, 1998, Valmayor, 2001, Valmayor et al;
2004). M. gracilis Holttum ex Cheesman. Península de Malasia. (Kiew, 1987), M. salaccensis
Zollinger ex Backer. Indonesia, Sumatra, Java. (Meijer, 1961, Nasution, 1993., Häkkinen & Väre
2008c., 2009.) M. Lawitiensis Nasution & Supardiyono. Borneo Oriente de Malasia, Brunei,
Kalimantan. (Wong et al; 2001b, Häkkinen, 2006b.), M. violascens Ridley (1893). Península de
Malasia. (Kiew, 1987), M. hirta Beccari (1902), M. muluensis y M. tuberculata Hotta (1967), M. montícola Argent (2000), M. voonii Häkkinen (2004b), M. bauensis Häkkinen & Mekion (2004),
M. azizii Häkkinen (2005), M. barioensis Häkkinen (2006a). En la sección Musa el número de cromosomas es de (x=11): Musa acuminata Colla. India a China, Indochina, Malasia (i,e
Archipiélago de Malasia y Noroeste de Australia). (Cheesmam, 1948b, Delanghe & Devreux,
1960, Nasution, 1991, Silva 2000, Nasution & Yamada, 2001, Wong et al, 2001a,
Wattanachaiyingcharoen et al; 2004, Boonruangrod et al, 2008, 2009) subespecie banksii Muell.
Simmonds., subespecie burmannica Simmonds., subespecie burmannicoides De Langhe., subespecie errans Argent., subespecie malaccensis Ridley., subespecie microcarpa beccari
Simmonds., subespecie siamea Simmonds., subespecie truncata., suespecie zebrina Van Houtte.,
M. balbisiana Colla. India, Nepal, Myanmar, Tailandia, Indochina, China y Filipinas. (Argent,
1976., Sharrock, 1990., Silva, 2000., Sotto & Rabara, 2000., W u & Krees 2000, Ge et al, 2005,
Uma et al, 2005, 2006b Uma & Buddenhaguen, 2006, Wan et al, 2007, Boorundangrod et al,
2008, De Langhe, 2009, Väre & Hakkinen, 2009a, Häkkinen & Vären, 2008c, Fuller & Madella,
2009). M. basjoo Siebold ex Linuma. China. (Liu et al, 2002b., Turner et al, 2002., Hakkinen &
Väre, 2008c, 2009), nativa de las islas Ryukuy, (Baker, 1891; Cheesman, 1948, Li, 1981; Wu and
Kress, 2000), M. cheesmani Simmonds. Nororiente de India (Simmonds, 1956., Hakkinen, 2008.) 14 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
M. flaviflora Simmonds. Nororiente de India, Bhutan. (Noltie, 1994a. Häkkinen & Wang, 2007,
Häkkinen & Väre, 2008c). M. balabanensis Meijer., M. itinerans Cheesman. Noroeste de India,
Miyanmar, Tailandia, Indochina y China (W u & Krees, 2000, Liu et al; 2002b, Valmayor et al,
2005, Uma & Buddenhagen, 2006, Häkkinen et al, 2008), M. nagensium Prain. Noroeste de India,
Myanmar, Yunnan China y Tailandia. (Liu et al; 2002b, Uma & Buddenhaguen, 2006, Häkkinen et al, 2008.). M. ochracea Shepherd. India. (Shepherd, 1999, Häkkinen & Väre, 2008c) M. schizocarpa Simmonds. Nueva Guinea (Argent, 1976, Tezenas du Montcel, 1990). M. sikkimensis
Kruz Noroeste de India, Bhutan, Myanmar (Simonds, 1956., Noltie, 1994a, De Langhe et al;
2000). En la sección Rhodochlamys el número de cromosomas es de (x=11): M. aurantiaca Mann ex Baker. Noroeste de India, Myanmar, China Tibet. (Uma et al; 2006a, Hakkinen, 2007.,
Hakkinen & Väre, 2008a). M. laterita Cheesman. Noroeste de India, Myanmar, Tailandia.
(Häkkinen, 2001, 2003b, 2007, Uma et al; 2006a). M. mannii Wendland. ex Baker. India Assan.
Häkkinen, 2007, Häkkinen & Teo, 2008), M. ornata Roxburgh. India, Bangladesh. (Sundararaj &
Balasubramanyam, 1971., Argent, 1984., Alquini, 1987., 1988, Hore et al; 1992, Uma &
Bunddenhagen, 2006., Uma et al; 2006a, Häkkinen, 2007, Väre & Hakkinen 2009a). M. rosea
Baker. Camboya, Vietnam, (Häkkinen, 2006 & 2007), M. rubra Wallich. Ex Kurz. India Mizoram,
Miyanmar. (Häkkinen, 2003b, 2007, 2009b). M. sanguinea Hooker. Nororiente de India, China
Yunnan. (Lui et al; 2002b, Uma et al, 2006a, Häkkinen, 2007)., M. velutina Wendland & Drude.
Nororiente de India, Myanmar. (Uma et al; 2006a, Häkkinen, 2007, Häkkinen & Väre, 2008b,
Väre & Hakkinen 2009b). M. ingens Simmonds. Papua Nueva Guinea (Argent, 1976), número de cromosomas (x=7). M. boman y M. lasciocarpa (Daniells et al; 2001), las cuales tienen tres números básicos diferentes de cromosomas, por lo cual están catalogadas como indeterminadas.
Híbridos con números básicos diferentes son conocidos con nombres locales e.g., en las Filipinas el hibrido entre M. balbisiana y M. textilis tiene el nombre de ‘canton’ (Simmonds & Weatherup,
1990). Capítulo 1 15
Figura 5.
Ensete ventricosum http://www.zimbabweflora.co.zw/speciesdata/imagedisplay.php?species_id=116100&image_id=1.
16 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
1.1.2. Morfología
1.1.2.1. Las raíces juveniles muestran un color blanco y comienzan a colorease de café cuando
están maduras, muchas raíces se encuentran como pelos provenientes de la superficie de
otras raíces de mayor diámetro.
1.1.2.2. El tallo verdadero es formado cuando la planta comienza su desarrollo proveniente del
órgano reproductivo, está por debajo del denominado rizoma.
1.1.2.3. El pseudotallo es formado como una modificación de la parte baja de las venas centrales
de las hojas. Tiene colores rojos, amarillo verdoso y rojo verdoso. Y se encuentra sobre la
parte basal del tallo de la gran estructura llamada rizoma (Sumardi & Wulandari, 2010).
1.1.2.4. Las hojas de las bananas tienen una vena central bien desarrollada con muchas nervaduras
finas paralelas corriendo más o menos perpendicularmente desde el margen de la
nervadura central (Gentry, 1993), peciolo y hojas acuchilladas. La modificación de la parte
basal de la vena de la hoja es llamada pseudotallo. La cabeza del peciolo tiene forma de
medio círculo, y la parte adaxial anclada. La forma de la hoja acuchillada es oblonga como
una bandera punteada. La parte abaxial y adaxial de hoja se encuentran protegidas por una
capa de cutícula. La forma y estructura de las hojas son caracteres muy importantes a nivel
taxonómico que permiten diferenciar vegetativamente a la familia Musaceae de
Marantaceae, debido a que estas últimas carecen de un área cilíndrica carnosa, en el ápice
del pedicelo y nervaduras paralelas (Gentry, 1993). Las hojas en las bananas de desierto
tienen un área individual 1.27-2.80 m2 (Stover & Simmonds, 1987; Stover, 1988), otras
como las del plátano pueden ser menores de 0.68-0.92 m2 (Anojulu, 1992) y algunas hojas
de cultivares de Cavendish 1.69-2.5 m2 (Stover & Simmonds, 1987). En condiciones de
temperatura fresca (20-25 °C) el tallo y el pseudotallo son más voluminosos y las hojas son
más erectas en apariencia. A temperatura de 30-35°C la planta es más frondosa en Capítulo 1 17
apariencia con pseudotallo más esbelto, con un tallo más pequeño y hojas horizontalmente
más alineadas (Gowen, 1995).
1.1.2.5. La inflorescencia es una rama espádice. Las flores están protegidas por un arreglo de
brácteas en espiral grande, brillante y coloreada, con forma de bote llamado espata.
1.1.2.6. Las flores en las Musáceas tienen brácteas, sésiles, trímeras, unisexuales o bisexuales,
cuando son unisexuales las flores son hermafroditas. Las flores son zigomorfas y epiginas.
Los sépalos de los tres géneros Musa, Musella y Ensete pueden ser de dos tipos
interloculares. En las flores de las hembras los nectarios se encuentran limitados en la parte
superior del ovario sobre los lóculos, todas las flores en los machos se encuentran (con
ovarios abortados) los nectarios ocupan enteramente los ovarios abortados (Ren & Wang,
2007). La simetría bilateral de las flores probablemente constituya una plesiomorfia en el
clado de las zingiberales y el estambre adaxial suprimido una sinapomorfia entre las
musáceas y las familias que tienen de 5 a 6 estambres, Strelitziaceae y Lowiaceacae
(Rudall & Bateman, 2004). El gran tamaño de la inflorescencia, su conspicua
visualización, el olor floral y su conspicua producción de néctar en Musaceae ha sido
identificada como un clásico ejemplo de adaptación de polinización por aves y
murciélagos (Ren Z. & Wang H. 2007). La coevolución entre bananas y murciélagos
resulta de su adaptación para dispersar las semillas, murciélagos y monos comen los frutos,
dispersando las semillas (Bats, 2008, Kunz et al; 2011). La familia Musácea es en sensu
estricto una familia conspicua de distribución tropical y subtropical, que encierran los
géneros Musa, Ensete y Musella las cuales están restringidas al viejo mundo (Cronquist,
1981; Anderson, 1998). El uso de los géneros también incluye la producción de fibras
Musa textilis y numerosas especies ornamentales. Formula floral: Machos ♂ P (3+2)+1, A
3+3, G0; Hembras ♀ P (3+2) A0 Ḡ (3); Hermafroditas ♀♂ P (3+2), A 3+3, Ḡ (3). 18 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
1.1.2.7. Androceo, posee 6 estambres dentro de dos espirales de 3 cada uno, arreglados de forma
opuesta a los tépalos. Solo 5 estambres son fértiles e inmersos en el estambre posterior,
está cada uno ausente o representado por un estaminoide. Las anteras tienen dos tecas y
son dehiscentes por una hendidura vertical. Los filamentos y ovarios rudimentarios o
pistilos están frecuentemente en las flores de los machos.
1.1.2.8. Gineceo, el ovario inferior, tricarpelar, sincarpo, trilocular, numerosos óvulos en axilar
placentación. El estilo es simple y filiforme. El estigma es trilobulado.
1.1.2.9. El fruto es una baya carnosa y sus semillas no son producidas en las variedades cultivadas.
Este fruto es desarrollado por partenocarpia vegetativa, (i,e., sin polinización y sin
requerir ningún polinizador) y completamente sin semillas y estéril.
1.1.2.10. Las semillas para las especies silvestres no son endospérmicas. La morfología general de
la planta de bananas se detalla en las figuras 6, 7, 8 y 9.
Capítulo 1 19
Figura 6.
Planta de banana, M. acuminata: Raiz, Tallo, Pseudotallo, Hojas modificadas, Inflorescencia,
Hojas y Nervadura central. Imágenes de bananas /https://ferrebeekeeper.wordpress.com/tag/plant/
2015. 20 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Figura 7.
Estructuras reproductivas de Musa paracoccinea: a, infrutescencia e inflorescencia; b, Flor femenina; c,
Estigma de la flor femenina; d, Estambres de la flor femenina ; e, pétalos fusionados compuestos de la flor femenina; f, Pétalos libres de la flor femenina; g, Flores masculinas; h, Estigma de la flor masculina; i,
Estambres de la flor masculina; j, Pétalos fusionados compuestos de la flor masculina; k, Pétalos libres de la flor masculina ; m, semillas; n, fruto maduro. (Liu & Li, 2002).
Capítulo 1 21
Figura 8.
Flores de Musa balbisiana IBSD, Imphal. http://www.promusa.org/tiki-index.php?page=Musa+balbisiana,
2014.
Figura 9.
Fruto de Musa balbisiana IBSD, Imphal. http://www.promusa.org/tiki-index.php?page=Musa+balbisiana,
2014.
22 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
1.1.3. Ecología
Las bananas silvestres en el sur oriente asiático se encuentran en los niveles inferiores de la selva en donde penetra poca luz solar y su poder calórico está atenuado, debido aque la bóveda selvática es un continuo muy espeso y se filtra poca luz, reduciendose las corrientes de aire resultando en una temperatura elevada y poco cambiante, incrementandose el grado de humedad. Las hojas de las bananas son anchas y también delgadas de tamaño grande son plantas muy importantes en el ecosistema, como plantas que cumplen una función ecológica y también agroecológica. Son sembradas por pequeños cultivadores para darle sombrío al cultivo de café, a través de América
Latina, ocupando medio millón de hectáreas en Mesoamérica, el Caribe y Suramérica (Staver et al;
2010). En cuanto a las funciones que las plantas le prestan al ecosistema están las de servir de atrayentes para insectos, aves y mamíferos, los cuales polinizan las musáceas silvestres de forma natural. En las especies cultivadas el fruto es partenocarpico. Se han realizado estudios de visitantes de las flores (Kato et al; 1989) y para Musáceas como: Musa acuminata Coll (Pisan lidi) (Musaceae). Banana primitiva cultivada; sus caracteres florarales son similares a los de Musa acuminata subsp. Halabanensis, pero con brácteas color carmesí. Se presentan los siguientes visitantes de las flores: Hymenoptera, (Apide) Trigona (Tetrigona) apicalis Smith., T.
(Tetragonula) laeviceps. (Vespidae) Polybioides raphigastra (Saussure), Chiroptera (Mamalia)
Pteropide Macroglossus sobrinus (Andersen). Musa acuminata Coll. Subsp. halabanensis
(Mijer) M. Hotta (Musaceae). Gigante monoica herbácea que crece en espacios abiertos en bosques secundarios. Los caracteres florales son aproximadamente similares a los de M. salaccensis excluyendo la parte horizontal femenina y la parte colgante masculina de la inflorescencia y las brácteas purpuras oscuras. Las flores masculinas abren en la noche y caen por la mañana del próximo día mientras que las flores de las hembras esperan más de un día. Se encuentran los siguientes visitantes: Lepidoptera (Hesperiidae). Ancistroides nigrita Latreille. Capítulo 1 23
(Diptera) Drosophilidae. Drosophila sp. Hymenoptera. Formicidae. Crematogaster sp. Apidae.
Trigona (Tetragonula) laeviceps Smith. Rodentia. (Mamalia). Tupaiidae. Sundasciurus sp.
Chiroptera (Mamalia). Pteropoidae. Macroglossus sobrinus (Andersen). Musa balbisiana Colla
(Pisan batu). (Musaceae). Gigante monoica herbácea. Hymenoptera. Vespidae. Vespa sp. Apidae.
Trigona (Tetragonula) atripes Smith. T. (T.). melina Gribodo. T. (T.). fuscobalteata Cameron. T.
(T.). reepeni Friese. T. (T.) drescheri Schwarz. T. (T.) geissliri Cockerrell. T. (Homotrigona) fimbriata Smit, T. (Tetratrigona) collina Smith. T. (Lepidotrigona) nitidiventris Smith. Apis (Apis) cerana javana Enderlein. Chiroptera. (Mamalia) Pteropoidae. Macroglossus sobrinus (Andersen).
Musa salaccensis Zoll. (Musaceae). Gigante monoica herbácea de bosques sucesiones secundarias cerca a las corrientes de agua. Flores unisexuales son llevadas en una erecta inflorescencia; hembras en el clúster basal y machos terminando sobre la misma inflorescencia.
Brácteas cubriendo de 2-6 flores se muestra rosa purpura. Una flor tiene dos periantos laticíferos formando un tubo robusto y secreta abundante néctar en la parte baja del tubo. Los machos abren las flores en las primeras horas del día y caen al final del día, mientras las hembras esperan cerca de dos días. Se encuentran los siguientes visitantes: Battariae. (Blattellidae). 2 especies Sp.
Dermaptera. (Pygidicranidae). 1 especie Sp. Lepidoptera. (Hesperiidae). Ancistroides nigrita
(Latreille). Erionata thrax L. (Diptera). Bombyliidae 1 especie Sp. Hymenoptera (Formicidae).
Crematogaster sp. Vespidae. Polybioides raphigastra (Saussure). Apidae. Trigona (Tetragonula) drescheri Schwarz. T. (T.) minangkabau Sakagami. T. (T.). laeviceps Smith. Passeriformes (Aves).
Nectariniidae. Arachnothera longirostra. Aethopyga siparaja. Rodentia. (Mamalia). Tupaiide.
Sundasciurus sp. La polinización también es realizada por mamíferos nocturnos como el gran murciélago de nariz corta Cynopterus sphinx común en la India. Las bananas como frutas son también muy importantes para el gremio de los mamíferos frugívoros. Se han realizado estudios que confirman que las bananas Musa acuminata subp halabanensis y M. salaccensis ejemplifican el relativo síndrome de polinización ie., quiropterofilia y ornitofilia (Nur 1976, Itino et al; 1991). 24 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
También son polinizadas por otros mamíferos como el lémur (Prince & Kress, 2002). Las bananas silvestres producen gran cantidad de flores y semillas las cuales las hacen fáciles de dispersar. Esta característica es similar a la de otras especies pioneras (Swain & Whitmore, 1988). Una comunidad de bananas silvestres típica en Tailandia Sureste de Asia, en un bosque tropical está compuesta por
Musa acuminata, Bambusa tulda, Croton oblongifolius, Oroxylum indicum, Vitex canescens,
Stereospermum neuranthum, Anogeissus acuminate var. Lanceolata y Symplocos adenophilla
(Dokrak, 2010). Figura 10.
Figura 10.
Fotografía. Bananas silvestres en Indonesia, 2009. Parque nacional de Gede. Java. Región suroeste de Asia.
Resolución de tamaño 1200x1013px (1.18 MB). Autor Vézina, Anne Bioversity internacional. http://www.bioversityinternational.org/, 2014. Capítulo 1 25
1.1.4. Domesticación de las bananas
Uno de los aspectos importantes es su domesticación, por ser esta una planta utilizada culturalmente por toda la humanidad como alimento, desde su descubrimiento por la especie humana, la planta de la banana ha sido manipulada. Lo anterior ha ocurrido en los trópicos y sub trópicos, incluyendo en la actualidad las Américas, África, Sur Asia, China, las islas del sur de
Asia, Melanesia y el Pacífico. Su domesticación data de muchos años atrás, se conoce en la historia de domesticación de las bananas que en Camerún África, existieron puntos de cultivo de bananas hace más de dos milenios atrás (Mbida et al; 2001). Se estima que Musa llego a las costas de
África al menos hace 3000 años (De Langhe et al; 1996). La propagación vegetativa de Musa en muchas de las regiones tropicales es el resultado de las actividades humanas (Mbida et al; 2001).
La distribución natural del género Musa es estrecha en el Norte proveniente de Nepal y de las montañas del Sur de China (Simmonds, 1956). Y en el Sur de las Islas de Indonesia y Nueva
Guinea con un punto de distribución aislado en la selva muy lluviosa tropical de Queenslan
Australia. En el Oeste limitando con India, con un punto de distribución aislado en Isla Pemba próximo a la costa Oeste Africana. No se encuentran plantas del género Musa silvestres en el continente Africano o en las Américas (De Langhe, 2009). Se reconocen 7 áreas geográficas en las cuales existe una alta variedad de cultivares específicos (De Langhe, 2009). 1. AA y AAA en el triángulo entre indonesia, las filipinas y las melanesia, con una gran densidad de cultivares AA alrededor de Nueva Guinea. 2. Bananas de tierras altas AAA en la región de los grandes lagos del
Oeste de África. ABB en la zona de selva de África. 4. AAB Maia Maoli-Popoulu-Iholena cultivares en Oceanía. 5. Cultivares AB y AAB en el sur de India. 6. Cultivares orientales ABB en las Filipinas y Vietnam. 7. Cultivares occidentales en el Noroeste y Sur de India. Las islas del sur oriente de Asia y el sur de la China son las más fuertes candidatas para ser los sitios primarios de domesticación de las bananas (Al-Busaidi, 2013). Basados en evidencias arqueológicas de Nueva 26 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Guinea (Perrier et al; 2011), el cultivo y la domesticación de variedades de bananas comienzan
6500 años antes del presente. La migración y el contacto humano con las variedades silvestres jugaron un papel crucial en la domesticación de las variedades de bananas fuera de su hábitat natural (Mindzie et al; 2001; Vrydaghs et al; 2009; Perrier et al; 2011). Las bananas se originaron en los bosques húmedos tropicales y subtropicales que se extienden desde la India hasta Papúa
Nueva Guinea. Figura 11. Su domesticación se inició a través de la selección de frutos con pocas semillas. La evolución de las bananas silvestres a las bananas comestibles envuelve la supresión de las semillas y el desarrollo partenocárpico (Perrier et al; 2013). La diversidad genética y la existencia de múltiples niveles taxonómicos distinguen muchos linajes de bananas cultivables, los altos niveles de partenocarpia son los primeros pasos en la comestibilidad de las bananas
(Kennedy, 2008). Las bananas cultivables del pacífico del género Musa pertenecen a las secciones
Musa y Callimusa. En el siguiente nivel más bajo de hibridización entre especies, están probablemente los linajes de la sección Callimusa Fe’i bananas (Kennedy, 2008). Estudios basados en marcadores moleculares evidencian que Musa lolodensis es una especie silvestre estrechamente emparentada con el grupo de las Fe´i bananas (Jarret et al; 1992). Estudios más recientes de diversidad de la sección Australimusa sugieren que los posibles ancestros de las Fe’i bananas se encuentran entre las especies silvestres estrechamente emparentadas Msua maclayi, Musa peekelii y Musa lolodensis (Daniells et al; 2001). Las bananas llegaron a América traídas por los españoles en el siglo XVII vía Caribe y no ha resultado en una evolución importante de la diversidad
(Vézina, 2008). La razón es el aislamiento que estas especies han tenido de su centro de origen, donde se encuentra el pool genético contenido en la gran diversidad de especies silvestres.
También se debe a la no existencia de sus polinizadores específicos, la variabilidad genética de estas especies en América es causada por la intervención humana, que selecciona artificialmente variedades comestibles con frutos partenocárpicos sin semillas, este proceso es llamado superdomesticación (Vaughan et al; 2007). Utilizando herramientas genéticas de selección se Capítulo 1 27 busca crear el cultivar ideal. Es interesante puesto que el centro de origen donde ocurrió la radiación evolutiva y adaptativa de las especies silvestres de bananas es un territorio insular y estás islas están muy cercanas una de otras. Lo cual hizo posible la migración natural e hibridación natural de bananas silvestres, la partenocarpia fue la característica que le brindo a los seres humanos un alimento con una gran importancia económica y prospección de manipulación genética. El consorcio mundial de Musa fue establecido en el año 2001, para integrar el entendimiento de la genética y la genómica de Musa teniendo como objetivo la reproducción, trasformación y uso eficiente del pool genético de las especies de Musa silvestres (Heslop-Harrison
& Schwzaracher, 2007), que están representadas en la diversidad de cultivares que reúnen los cambios visibles seleccionados por los cultivadores. Para la obtención de variedades de bananas comestibles i.e, FHIA-03 (AABB) Rowe, P. & Rosales, F. fueron necesarios 14 cruzamientos de
11 tipos silvestres diferentes y dos variedades triploídes autóctonas (Vézina, 2008).
28 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Figura 11.
Distribución de las secciones de Musaceae: Eumusa, Rodochamys, Callimusa, Australimusa e Ingentimusa.
WWW.Preliminary analysis of the literature on the - Musalit (Pollefeys et al; 2004).
Capítulo 1 29
1.1.5. Genética
La poliploidía es el cambio en el número cromosómico, dotaciones completas de cromosomas denominada euploidía (Winkler, 1916). Es el incremento del número de cromosomas característicos del complemento diploide 3x o 6x, finalmente el número de cromosomas de poliploidía es la suma de números encontrados en dos formas relacionadas con diferente número como en las series 2n=10, 12, 22. Winge, 1917 propuso la hipótesis de la “fructificación de cromosomas” doblándose el número en especies hibridas. Los poliploides tienen una gran importancia evolutiva, algunos organismos poliploides permanecen aislados reproductivamente de la especie de origen, se trata del mecanismo más rápido conocido de especiación. Se utiliza en manipulación genética para mejorar características. Las poblaciones silvestres, aparentemente tienden a estar aisladas, manteniendo significativamente la diversidad genética (OECD, 2009). Los progenitores silvestres de bananas diploides son todavía recursos genéticos valiosos para fitomejoramiento (De Langhe, 2000b). En las bananas se presenta hibridación inter específica, la cual resulta de doblar sets de cromosomas desiguales estructuralmente en una especie híbrida lo que se denomina Alopoliploidia (Kihara & Ono, 1926). La ploidía y la configuración del genoma juegan un rol determinante en la clasificación de las bananas con los grupos mayores incluyendo diploides (AA, BB, AB). Triploide (AAA, AAB, ABB) y tetraploide (AAAA, AAAB, AABB,
ABBB). (Oselebe, et al 2006). Los cultivares existentes son usualmente clasificados dentro de tres grupos de genomas AAA, AAB y ABB. Figura 12. Las Musáceas tienen tres géneros Musa,
Musella y Ensete. Musa indicando la conformación cromosómica número y el estado diploide del núcleo. Género Musa. Musa acuminata (2n=22) con 7 sub especies, secc Rhodochlamys (2n=22) 9 subespecies, secc. II Musa (2n=22) 7 subespecies secc Astralimusa (2n=20) 3 sub especies, secc.
Callimusa (2n=18 y 2n=20) 9 sub especies, secc Ingentimusa (2n=14) una sub especie, secc. II
Callimusa (2n=20) 3 subespecies. (Li, 2010). El género Ensete tiene una conformación cromosómica número (2n=18). Se han realizado estudios identificando los genes que están 30 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira. involucrados en la maduración de las bananas (Manrique-Trujillo y Gómez-Lim, 2004) y también en los genes que están involucrados en la resistencia de Musa AAA la cual es muy resistente a patógenos como Mycosphaerella y Sigatoka negra (Ramírez-López y Gómez-Lim, 2004). Musa
Acuminata y Musa balbisiana han sido propuestos como los parentales de las bananas modernas, esta hipótesis ha sido subsecuentementemente confirmada por estudios genéticos del género Musa en los cuales se indica que las cuatro especies silvestres M. acuminata (aportó el genoma A), M. balbisina (donó el genoma B), M. schizocarpa (aportó el genoma S) y M. textilis (aportó el genoma
T) han contribuido al pool genético de las bananas domesticadas (Heslop-Harrison et al; 2007,
Carrel et al; 1994, Hont et al; 2000). En la actualidad se sabe que el genoma de Musa balbisiana es
79% más pequeño que el genoma de Musa acuminata, sin embargo tiene un número similar muy alto de secuencias de genes funcionales predilectas 36.638(Manzano-Sánchez et al, 2015).
Figura 12.
Musa acuminata Musa balbisiana
AA BB
Cultivares AA AB
AAA AAB ABB
Relación de cruzamiento de la mayoría de las musas cultivables comestibles. (OECD, 2009).
Capítulo 1 31
1.1.6. Análisis moleculares
La relación genética entre las bananas se ha estudiado usando diferentes métodos moleculares entre ellos están (Randomly Amplified Polimorphic DNA, RAPD y Sequence-reated Amplified
Polimorphism, SRAP) (Phothipan, 2005). También los (Amplified Fragment Length
Polimorphism, AFLP) (Wong et al; 2002), e (Inter Simple Secuences Repeats, ISSR) (Lu et al;
2011). Gawell & Jaret 1991b analizaron el genoma de los cloroplastos en Musa ssp, Jaret et al;
1994 aislaron los microsatélites en Musa, Crouch et al; 1999 analizaron AFLP sobre el germoplasma de Musa, Killian et al; 2007 utilizaron la técnica DArT y secuenciamiento en el genoma de bananas y Till et al; 2010 utilizaron la técnica Ecotilling en especies de Musa. Se han realizado estudios que comparan el uso de marcadores microsatélites y características morfológicas estimando la relación genética entre cultivares de banana (Changadeya, 2012), (Psyquay et al;
2009). Se han realizado estudios importantes en bananas con el método de Microsatélites
Amplificados al Azar (RAMS). Se han aislado y caracterizado micro satélites loci polimórficos para Musella lasiocarpa (Yang et al; 2009) y para Musa acuminata (Creste et al; 2005). Los micro satélites se utilizan para conocer la variación morfológica y tolerancia por parte de la planta a una enfermedad e.g. cultivares de bananas desertícolas con tolerancia al marchitamiento por Fusarium sp. (Pushpakumari, 2009). Se han estudiado las bananas Klauai Ngoen y Pisang Awak las cuales han sido reclasificadas y consideradas para tener el genoma AABB (Horry et al., 1998; Pillay et al., 2006). También se ha determinado la constitución de clones cultivados interespecificos
(D’Hont et al., 2000) y la caracterización molecular de genomas en Musa han sido revisadas por
(Pillay et al; 2004).
32 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
1.1.7. Randomly Amplified Microsatellites Markers (RAMS)
El uso de los Randomly Amplified Microsatellites (RAMS) se describió como un método universal para el estudio de la variación genética en especies de hongos (Hantula et al; 1996). En esta técnica, un solo primer 5´ de PCR degenerado "universal" se dirige a las repeticiones intrínsecas de los microsatélites y el DNA entre los extremos distales de las dos regiones de microsatélites estrechamente posicionado se amplifica, lo que resulta en patrón de ampliaciones específicas de la especie después del gel de separación electroforética. La técnica fue descrita originalmente por
(Zietkiewicz, et al; 1994). La técnica combina los mayores beneficios de los RAPD y los análisis de microsatelites, y por lo tanto es buena para estudios de variación genética (Hantula & Müller,
1997). Los Loci de los marcadores RAMS son de dos tipos (Hantula et al; 1996). El tipo de polimorfismo de encendido y apagado, el cual es similar al encontrado usando marcadores RAPD como la variación consistente de la existencia o no existencia (e.g. un alelo nulo y un marcador dominante respectivamente) de un marcador. El otro tipo es debido a la diferencia de longitud en los tamaños de los productos de amplificación (Hantula & Müller, 1997). Cuando esta situación existe dos o más marcadores dominantes pueden ser separados (Zietkiewicz et al; 1994). La longitud de los marcadores polimórficos ha sido bien mostrada en la forma de segregación mendeliana del pedigrí humano (Zietkiewicz et al., 1994). Esto soporta la idea que marcadores con ligeras diferencias en pesos moleculares representan diferentes alelos de un solo loci. (Hantula &
Müller, 1997). Los marcadores RAMS son muy importantes como resultado del elevado nivel de polimorfismo, carácter dominante y facilidad de aplicación, alta reproducibilidad y bajo costo
(Muñoz et al, 2008). De lo anterior se concluye que la importancia de los RAMS como técnica radica principalmente a la eficiencia relativa de la técnica con respecto a los resultados que se esperan obtener, es decir la optimización de la muestra en razón de la detectabilidad de las bandas de DNA por parte de los marcadores. Y su forma bien estandarizada y conocida que combina las Capítulo 1 33 ventajas de las técnica moleculares simples que integran la técnica, logrando la sinergia necesaria para que el método utilizado sea el de correcta elección para Musáceas (Oselebe et al, 2006).
1.1.8. Bancos de germoplasma
El establecimiento de los bancos de germoplasma es una práctica común, para conservar especies raras y amenazadas. En los bancos de germoplasma se conserva el material vegetal: semillas, polen, DNA, y cultivos in vitro (Iriondo, 2001). El germoplasma es caracterizado usando la diversidad genómica de sus cultivares. La diversidad fenotípica también es llamada variación morfológica o fenotípica, esta variación se refiere a las características físicas o fenotípicas del organismo, tales como diferencias, anatómicas, fisiológicas, bioquímicas o en características de comportamiento (Williams & Humpheries, 1996). Musa fue generalmente considera como recalcitrante a Agrobacterium tumefaciens mediante transformación (Hernández et al; 1999). En la actualidad se sabe que es compatible con Agrobacterium de acuerdo al protocolo desarrollado para mediación por Agrobacterium mediante la trasformación de células embriogénicas en suspensión de la variedad ‘Rasthali’ (Ganapathi, 2001). La se consiguió la expresión exitosa del péptido sintético MSI-99 y el potenciador de resistencia a enfermedades en tabaco transgénico y banana
(Chakrabarti, 2003). Con el avance de la ingeniería genética en el aislamiento, secuenciación y transferencia de genes para aprovechamiento biotecnológico como transformación genética para obtener resistencia de genes a problemas de enfermedades de las bananas como lo son el Fusarium oxysporum, BBTV, CMV y Moco (Elayabalan & Kalaimughilan, 2013), se hace necesario el establecimiento de grandes bancos de genes para su conservación e investigación. Figura 13. En general se organizan misiones de colecta de germoplasma enviando expertos que seleccionan el material vegetativo en los sitios de endemismo, que será depositado con posterioridad en los bancos de germoplasma; cómo se realiza una colecta de germoplasma para Musa se encuentra en 34 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Sharrock et al; 1988. En Colombia el 70% de las accesiones vegetales en condiciones ex situ de los bancos nacionales se conservan en Corpoica (Vallejo & Estrada, 2002).
Figura 13.
Distribución biológica mundial de bananas, usos, bancos de germoplasma y grupos investigación de bananas y sus países miembros: Los miembros de MUSALAC se distinguen con el color laurel, los miembros de la MUSACO con el color azul, los miembros de la BARNESA con el color sapote y los miembros de la BAPNET con el color verde (INIBAP-IPGRI, 2006). Capítulo 1 35
1.1.9.Conservación de especies de bananas
La conservación in situ de especies es una estrategia muy importante que permite el estudio ecológico, de las internaciones de las especies en su hábitat natural con otras especies de plantas, animales y factores abióticos como la temperatura, humedad, tipo de suelo etc,. Lo anterior es el nicho biológico de una especie. Se sabe que las especies silvestres de las Musáceas son fértiles y de naturaleza diploide y poliploide, con centro de origen en el suroriente asiático y África. Las condiciones en India, China y África, países y continente de grandes selvas y extensos territorios son mucho mejores para la preservación de estas especies de plantas silvestres que las condiciones de las pequeñas islas asiáticas igualmente pobladas. En Papúa Nueva Guinea que es una gran isla que tiene la tercera formación selvática continua más grande después del Amazonas y el Congo, presenta grandes problemas de deforestación por la siembra de la palma de aceite y el merbau
(Intsia spp.) la operación incluye Malasia, Singapur, Hong Kong y China (Corlett &
Primack, 2008). Sin embargo lo extenso de los territorios es paradójicamente solo un elemento a favor, cuando se sabe igualmente que el problema de sobre población de estos territorios es enorme en China, India y África. Las condiciones demográficas han obligado a estos países a expandir sus fronteras agrícolas y esta situación genera una gran presión antropogénica sobre las selvas indo asiáticas y las tierras altas de los grandes lagos de
África. El sur oeste de Asia tiene menos de la mitad de estos bosques remanentes y tiene una tasa anual de deforestación del 0.91%, calculada en porcentajes para el año 1990, en consecuencia pérdida de bosques y degradación en los trópicos, (Achard et al; 2002); de este panorama global actual no se escapa este territorio, centro de origen de las especies de
Musaceae de tanta importancia para la humanidad. La conservación in situ es una 36 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira. estrategia sostenible que incluye la conservación de áreas protegidas, hábitats manejados fuera de las áreas protegidas y granjas de cultivadores que contienen variedades cultivables de estas especies. Con relación a Musa no se conoce cuales especies silvestres son objeto de conservación en reservas, sin embargo para el Sur-Oriente de Asía y el Pacífico es bien conocida la conservación de Musa ingens y en China M. chunii. Figura 14. Indonesia es la región donde más sobreviven las selvas tropicales (Corlett & Primack, 2008). La conservación es una decisión necesaria y obligatoria, debido a que el nicho ecológico de especies tan antiguas depende de la decisión. La selección natural está garantizando la evolución continua del pool genético de las Musáceas. La conservación in situ es un imperativo biológico sin desestimar la conservación ex situ que preserva alelos, genotipos y poblaciones; la cual incluye diferentes tipos de conservación de semillas en campo y bancos de germoplasma, el almacenamiento de polen, DNA y criopreservación. El comportamiento de la germinación in vitro de las semillas de bananas silvestres en la India ha sido estudiado para saber cuáles son las mejores condiciones de germinación y cómo lo anterior contribuye en su conservación (Dayarani et al; 2011). El argumento es que no se puede pensar que la conservación ex situ evite la extinción de las especies silvestres de
Musaceae. En Indonesia que es la región donde se conservan aún remanentes de selva lluviosa, dos tercios de la tierra donde crecían estos bosques está ocupada por el monocultivo de la palma de aceite, lo cual cubría un estimado de 3 millones de Ha para el año 2000 (Glastra et al; 2002). La selección natural actúa sobre las especies y estas evolucionan y su pool genético es enriquecido, la ecuación anterior solo es posible en los hábitats naturales de las especies silvestres. Las especies silvestres de Musa se encuentran distribuidas en algunos bosques lluviosos tropicales desde los siempre verdes bosque Capítulo 1 37 lluviosos hasta los bosques deciduos de baja pluviosidad (Subbaraya, 2006). En la India los bosques donde las especies de Musa silvestres se pueden encontrar son el noroeste de los Himalayas incluyendo Assam, Arunachal Pradesh, Meghalaya, partes de Nagaland al suroeste de India exactamente, y también en Andaman e Islas Nicobar (Rubbaraya, 2006).
Figura 15. Algunos bosques tropicales todavía existen en Manipur, Mizoram, Tripurac de los estados del noroeste, y en el interior de las áreas del oeste de Ghats de Karnataka y
Kerala (Rao, 1996; Rao, 1999).
Figura 14.
Musa chunii Yunnan China. (Häkkinen, 2009)/ Fotografía WWF. 38 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Figura 15.
Bosques donde se encuentra Musas silvestres en India. FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION
OF THE UNITED NATIONS Rome, 2006.
Justificación
En el mundo existen varias instituciones que poseen colecciones de Musáceas entre ellas se encuentran la fundación Hondureña de investigación agrícola FHIA-Honduras
(http://www.fhia.org.hn/), el instituto internacional de agricultura tropical IITA-Nigeria
(http://www.iita.org/) y el EMBRAPA-Brasil (ttps://www.embrapa.br/embrapa-no-brasil), que tienen programas de hacer híbridos y crear nuevas líneas de bananas (Heslop-Harrison, 2011). Los estudios genéticos para la familia Musaceae se realizaban principalmente en el Imperial Institute for Tropical Agriculture en la isla de Trinidad Caribe Americano. Los resultados experiméntales para la siembra del germoplasma de variedades de Musáceas comestibles se replicaron en la
Estación Agrícola Experimental de Palmira, Colombia (Pérez, 1996). En el ámbito mundial en estas instituciones se encuentran en marcha muchos programas para el fitomejoramiento de las
Musáceas de importancia económica para hacerlas más resistentes a enfermedades, para mejorar su rendimiento agronómico o para mejorar sus características organolépticas e.g., la resistencia del
SH-3437 a la Sigatoka negra provino de la accesión IV-9 de M. acuminata burmanica, el SH-3726 posee excelentes características de racimo, el SH-3142 es resistente a nematodos, el SH-2095 fue el primer hibrido diploide con buenas características de racimo. Pérez, 1996 sugiere que el estudio genético de las musáceas en su conjunto es muy importante, por haber sido reproducidas vegetativamente durante siglos. Los estudios de la diversidad genética están enmarcados dentro de la promulgación del convenio sobre Diversidad Biológica. La formulación del Régimen Común para el Acceso a los Recursos Genéticos de los países de la Comunidad Andina de Naciones, decisión 391 de 1996. (Ruiz, 2003b). De esta forma el gobierno Colombiano facilitó la creación del Sistema de Bancos de Germoplasma de la Nación para la Alimentación y la Agricultura
40 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
(SBGNAA); conformando el sistema se encuentran el departamento colombiano de investigación agrícola (DIA), el instituto colombiano agropecuario (ICA) y la corporación colombiana para la investigación agropecuaria (CORPOICA). La Universidad Nacional de Colombia en Palmira cuenta con laboratorios donde se adelantan investigaciones por parte de investigadores docentes y estudiantes tesistas. Desarrolladas a través de convenios interinstitucionales para desarrollar investigaciones acordes con las necesidades científicas nacionales. El presente trabajo de tesis de maestría en ciencias surge ante la necesidad de caracterizar la diversidad genética de la colección de bananas del banco de germoplasma de Corpoica que hace parte del sistema nacional de bancos de germoplasma (SBGNAA) para saber si la colección que se encuentra insitu tiene una diversidad representativa de variedades de bananas existentes. Las principales coleciones de campo del germoplasma de Musa están en los centros CIRAD, FHIA, IITA y Papúa Nueva Guinea con un número total de acceciones de 236, 126, 115 y 278 respectivamente (Vézina et al; 2008). La coleccion del germoplasma de bananas de Corpoica utilizada en el estudio tiene un número de 93 variedades, las cuales no se habían estudiado genéticamente utilizando métodos de biología molecular. La diversidad genética puede estar asociada a variaciones morfológicas que permiten en el futuro evaluar las características de interés como la resistencia a enfermedades, adaptaciones a condiones desfavorables y mejoramiento de características organolecticas. El grupo de investigación en Biología Molecular liderado por el profesor Jaime Eduardo Muñoz es reconocido por su trabajo con marcadores moleculares y especialmente por el dominio de las técnicas moleculares de los marcadores RAMS que son importantes en estudios de diversidad genética vegetal (Muñoz et al; 2008, Rugeles-Silva et al; 2012, Marmolejo et al; 2012).
Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de 41 bananas de la colección de Corpoica Palmira
2.1.1. Objetivos
2.1.2. General: Caracterizar los polimorfismos en los microsatélites aleatorios de DNA
del germoplasma de las bananas de Corpoica Palmira.
2.1.3. Específicos:
2.1.4. Determinar la variabilidad genética de las accesiones de bananas del banco de
germoplasma del estado Colombiano.
2.1.5. Comparar variedades de bananas con composición genómica conocida para saber
cómo se agrupan y cuáles genomas están más relacionados entre sí.
2.1.6. Conformar grupos de variedades de bananas con base a los índices de similitud y
determinar su cercanía genética.
2.2. Hipótesis
Existe más de un 90% de polimorfismo en los individuos de bananas de la colección del banco de germoplasma del estado Colombiano Corpoica Palmira.
42 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
3. Métodos
Para la caracterización molecular se utilizaron 93 variedades mantenidas en la colección de germoplasma del estado Colombiano tabla 1. Las plantas de bananas se encuentran en
Palmira, sembradas en un terreno de media Ha, en condiciones de riego asistido por tubería. Las plantas están sembradas a una distancia de 100 cm y entre surco una distancia de 2m. Palmira se caracteriza por tener un clima cálido, es una zona plana, su temperatura media anual es de 23°C, la altura sobre el nivel del mar es de 1001 m y la precipitación media anual alcanza valores mínimos de 654 mm y máximos de 1289 mm
(BIOPALMIRA, 2008). El trabajo de laboratorio fue realizado siguiendo los lineamientos de un convenio de investigación entre el banco de germoplasma de Corpoica Palmira y el grupo de investigación de biología molecular de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, la extracción de DNA, marcadores RAMS, PCR, electroforesis en geles de poliacrilamida, tinción, revelación y fotografías fueron realizadas en este marco. Los genomas de las plantas fueron encontrados en (Daniells, 1995, Furllerton & Olsen, 1995 y
Pillay et al; 2006). Para la extracción de DNA se maceró en nitrógeno líquido 1g de tejido fresco de hojas sin nervadura, se añadieron 7ml de buffer compuesto por CTAB 0,0114 mM, NaCl 0,001 mM, EDTA 0,0035 mM, Tris-HC 1M, pH 8.0 0,0169 mM, PVP 1% y
0,2% B-mercaptoetano l 00 µL, 00035 mM. El buffer de extracción precalentado a 65 °C por 10 minutos. Se incubó por 20 minutos a 65°C mezclado por inversión después de cada
5 minutos, se añadió un volumen de 500 µL de cloroformo, se mezcló durante 5 minutos por inversión de tubos, se centrifugo 5 minutos a un Rcf= 10,36cm/s² se removió la fase acuosa para un tubo nuevo. Se Realizó un lavado con isopropanol 6/10 volumen 500µL Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de 43 bananas de la colección de Corpoica Palmira más acetato de amonio 5M 1/10 300µL mezclando por inversión de tubos incubando a -
20°C de un día para otro, se centrifugó a un Rfc=6.1cm/s² por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante. Se lavó el pellet con 250µL de etanol, se centrifugó a un Rfc= 6.1/s² por 5 minutos, descartando el sobrenadante, se secó el pellet, resuspendiéndolo en 150 µL de TE
1X, agregando 2 µL de RNASA (10 mg/ml) e incubando a 37°C por 20 minutos (Doyle &
Doyle 1990). Los primers fueron usados en amplificación estándar para reacción PCR,
25µL, cada uno conteniendo 200 ng de DNA, Bufer 1x, 2.0 mM MgCl2, 30 pmol primer,
0.2 mM dNTP, y 1.25 U Taq polimerasa Fermentas (#EP0402). Las condiciones de PCR fueron, 95°C por 5 minutos, 37 ciclos de 95°C por 30 segundos, X°C por 30 segundos y
72°C por 2 minutos. El ciclo final fue de 72°C por 10 minutos. ´X´ es la temperatura de alineamiento de cada par de primers evaluados. Las condiciones de PCR touchdown incluyeron: 95°C por 5 minutos, 10 ciclos de iniciación a Ta: X°C decreciendo por 0.6°C por cada ciclo seguido por 35 ciclos a 95°C por 30 segundos, X-6 °C por 30 segundos y
72°C por 2 minutos. El final del ciclo fue a 72°C por 10 minutos. X es la temperatura de alineamiento de cada par de primers. Además las condiciones de Expansión temperatura de fusión (melting) de DNA para Taq PCR fueron: 95°C por 5 minutos, 37 ciclos de 95°C por 30 segundos, X° por 30segundos y 68°C por 4 ó 5 minutos. El final del ciclo fue de
68°C por 15 minutos. Los primers para caracterizar la variabilidad genética de las bananas son CA, AG, CT, CGA y TG tabla 2. Luego se realizó el montaje de la cámara de electroforesis, la preparación de la solución de poliacrilamida y el llenado de la cámara, la pre-corrida del gel, la corrida de las muestras y la tinción del gel con bromuro de etidio. La tinción para ácidos nucleicos. 1. Fijación de geles de poliacrilamida al 7% (37:1 acrilamida y bisacrilamida) a 160 voltios, por 1 hora y 10 minutos y teñidos con bromuro de etidio. 44 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Metanol 60ml, Acido acético14.4ml, formaldehído 37% 60µL y 120 ml de agua destilada.
Se agita por 1h. 2. Lavado etanol 30ml, agua 30ml, tres lavados de 20 minutos cada uno. 3.
Precalentamiento tiosulfato de sodio 2g/L proteger de la luz, se agita suavemente 15 s. 4.
Lavado, tres lavados con agua destilada por 20s cada uno. 5. Impregnante nitrato de plata
0.24g, formaldehido 90µl, agua destilada 120m, agitar 20 minutos. 6. Dos lavados con agua de 20s cada uno. 7. Revelado. Carbonato de sodio 7.2g, formaldehído 90µL, tiosulfato de sodio (2g/L) 2400µl, agua 120ml, agitar hasta la aparición de bandas. 8.
Lavados con agua uno rápido y otro por dos minutos. 9. Fijador Metanol 60ml, Ácido
Acético 144ml, agua destilada 120ml, agitar diez minutos.10.Preservar metanol 60ml, agua 60ml. Para encontrar la riqueza de variedades en la muestra se utilizaron los índices de Margalef y Menhinick. Para el análisis de los datos se construyó una matriz binaria de 1 y 0, (1) indica la presencia de una banda de una movilidad particular comparada a una escala de DNA y (0) indica la ausencia de la banda; interpretado genéticamente presencia ausencia de alelos en los loci y para el estudio de la población se trabajó con el indicé de similaridad de Nei-Li (1979). El análisis de agrupamiento se realizó con el programa
SAHN- NTSYS versión 2.02, 1998, utilizando el método UPGMA. El dendrograma de agrupamiento fue construido con la aplicación TREE de NTSYS, al igual que el agrupamiento de los genomas. Se realizó un análisis de varianza molecular utilizando el programa Gen Alex versión 6.2. Se realizó igualmente una prueba Chi-cuadrado para examinar la hipótesis formulada.
Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de 45 bananas de la colección de Corpoica Palmira
Tabla 1. Especímenes de banana y su código de identificación en la muestra.
Código y Espécimen
75 Bocadillo común AA 95 FHIA 2 AAAB 114 Bocadillo AA 134 Calcutta 4 AA 163 SABO 01
76 Bocadillo alto AA 96 FHIA 23 115 Yangambi AAA 135 Dominicio AAB 164 SABO 02
77 Pisang mas AA 97 FHIA 346-9 116 Guineo AAA 142 La miel 165 SABO 03
78 Pisang tongat AA 98 FHIA 17 AAA 117 Nakitengwa AAA 143 Bocadillo 166 SABO 04
79 Pisang lilin AA 99 Mysore AAB 118 Igitsiri AAA 145 BS209 167 SABO 05
80 Palembang AA 100 Lacatan AA 119 Tafetan* AAA 146 Guayabo B AAA 168 SAPI 08
81 Tuu Gia AA 101 Seredow 120 Tafetan 150 ANVA 01 169 SAPI 09
82 Niyarma Yik AA 102 Gran enano AAA 121 Guayabo A AAA 151 ANVA 02 170 SARI 10
83 Zebrina AA 103 Pigneo AAA 122 M. textilis AA 152 ANVA 03 171 SAVE 06
84 Peciolos oscuros AA 104 Poyo AAA 123 H. Saba 2 ABB/BBB 153 NALLO 04 172 SAVE 07
VABU 85 Long Tavoy AA 105 Valery AAA 124 M. basjoo 154 NALLO 05 173 01
VABU 86 Annam AA 106 Banano sin 125 Maia Maoli AAB 155 NALLO 06 174 02
VABU 88 Pahang AAB 107 Dwarf Cavendish AAA 126 Pompo 156 NARI 01 175 03 VABU 89 Selangor 1 AAA 108 Gros Michel común AAA 127 IITA AAB 157 NARI 02 176 04
90 M. rosea AA 109 Gros Michel cocos AAA 128 M. laterita 158 NARI 03 177 VAPA 01
91 Senlangor 2 AAA 110 Gros Michel enano AAA 129 M. ornata 159 NATU 07 178 VAPA 02
92 Tani BB 111 Seda AAA 130 M. velutina 160 NATU 08 179 VAPA 03
93 M. balbisiana BB 112 Banano chico AAA 131 M. itinerans 161 NATU 09
94 IC2 113 Banano 2 133 Pisang AA 162 NATU 10 Nota: en los datos aparece con los números 119* y 120, la variedad Tafetan el asterisco es para diferenciar las dos variedades (existe un Tafetan morado pero no parece diferenciado del otro Tafetan).
46 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Tabla 2. Primers utilizados en la técnica RAMS
PRIMER SECUENCIA 5´→→→3´ TEMPERATURA TIEMPO DE DE HIBRIDACIÓN HIBRIDACIÓN °C EN SEGUNDOS
CA DBDACACACACACACACACA 50
AG HBHAGAGAGAGAGAGAGAG 50 ↑
CT DBDCTCTCTCTCTCTCTC 55 45
CGA DHBCGACGACGACGACGA 58 ↓
TG HVHTGTGTGTGTGTGTGT 55
Designación para sitios degenerados H (A ó T ó C), V (G ó A ó C), B (G ó T ó C) y D (G ó A ó T).
Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de 47 bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 16.
Mapa de ubicación del banco de germoplasma in situ en Corpoica Palmira circulo blanco.
Google Maps Satellite. https://www.google.es/maps/
48 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Figura 17.
Fotografía de Musa laterita código de colección IPAL-0619 especie perteneciente a la sección
Rhodochlamys especie laterita in situ banco de germoplasma del estado Colombiano Palmira.
Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de 49 bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 18.
Fotografía de Musa textilis código de colección IPAL-0613 perteneciente a la sección Australimusa especie textilis en el banco de germoplasma del estado Colombiano Palmira.
50 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira.
Figura 19.
Fotografía del banco de germoplasma del estado Colombiano Palmira.
4. Resultados
Se obtuvieron dos índices de riqueza para las variedades de bananas de la muestra, el
índice de Margalef con un valor de 9.5 y el índice de Menhinick con un valor de 5.0 tabla
3. De las 72 bandas (Locus) obtenidas en total, se observa que los alelos se distribuyeron entre los marcadores de peso de 300 a 1500 pares de bases en los Primers CA figuras 24,
25, 26 y 27. De 400 a 1500 pares de bases en los Primers CGA figuras 28, 29, 30, 31 y TG figuras 36, 37, 38 y 39. Entre los 500 a 1500 pares de bases para los Primers CT1 figura 32 y CT3 figura 34 y finalmente de 600 a 1500 pares de bases para CT2 figura 33y CT4 figura 35. Se obtuvo la matriz binaria de (0 y 1) con el criterio de presencia y ausencia de poliforfismos en las bandas que están entre los 400 y 500 pares de bases figura 40. Se obtuvo el dendrograma de agrupamiento de las bananas encontrado con el coeficiente de similitud UPGMA ubicándose las distancias genéticas entre 0.6 y 1.00, los índices de agrupamiento para las variedades de bananas que se agrupan en un nodo común se muestran en la tabla 4. Se observan dos grupos bien diferenciados bananas y Mini bananas figura 41. Se muestra el agrupamiento de las bananas y los principales clados que muestran similitud figura 42. Se obtuvo el dendrograma para poblaciones calculando distancias génicas utilizando los genomas de las bananas AA, AAB, AAA, BB, AAAA y
AAAB, las cuales se ubican entre 0,000 y 225.000 figura 43. Los porcentajes de varianza molecular entre poblaciones fueron de un 6% e intra poblaciones de un 94% figura 44. Se observaron 71 bandas polimórficas equivalentes a un 99% en la muestra. Las medias
52 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
matemáticas de las distancias genéticas de Nei´s 1978, y la heterocigosidad He son 0.86 y
0.14 respectivamente, los valores se muestran en la tabla 7. En el análisis de varianza molecular AMOVA se obtuvo un valor PhiPT de 0,06 con una probabilidad P>00,6, lo que indica que no hay diferencias significativas entre las distancias génicas utilizando los genomas AA, AAB, AAAA, BB, AAAA, y AAAB, el porcentaje de variación entre grupos es de 6% y dentro de grupos de 94%, la variación estándar entre grupos es 95,7 y de 15.0 dentro de los grupos, la media de cuadrados es de 21,8 entre grupos y 15.0 dentro de los grupos, la suma de cuadrados es de 87.2 entre grupos y de 572.2 dentro de los grupos y con 4 grados de libertad entre grupos y 38 grados de libertad dentro de grupos tabla 8. En la calificación de la diferenciación genética de acuerdo al Fst Wright 1978, las bananas muestran una moderada diferenciación tabla 9.
Tabla 3. Índices de riqueza de variedades de bananas con un número total de 40 y un número total de individuos de 63. Anexo 1.
Medida de la riqueza de variedades Valor del índice
S= Número de variedades reconocidas y N=número total de individuos sumando todas las variedades.
Índice de Margalef D= (s-1)/ln N 6 a 9 valores altos 9.5
Índice de Menhinick D=S/√N Valores entre 0 y 5 5.0 3 en adelante son Altos.
53
Figuara 20.
75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
Primer AG1 75-98. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 21
99 100 101 102 .103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
Primer AG2 99-121. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 22.
122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 133 134 135 142 143 145 146 150 151 152 153 154 155
Primer AG3 122-155. Universidad Nacional-Corpoica.
54 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 23.
156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179
Primer AG4 156-179. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 24.
75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
Primer CA1 75-98. Universidad Nacional-Corpoica.
55
Figura 25
99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
CA2 99-121. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 26
122 123 124 127 128 129 130 131 133 134 136 142 143 145 146 148 149 150 151 152 153 154 155
Primer CA3 122-155. Universidad Nacional-Corpoica.
56 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 27.
156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179
Primer CA4 156-179. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 28.
75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
Primer CGA1 75-98. Universidad Nacional-Corpoica.
57
Figura 29.
99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
Primer CGA2 99-121. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 30.
122 123 124 127 128 129 130 131 133 134 136 142 143 145 146 148 149 150 151 152 153 154 155
Primer CGA3 122-155. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 31.
156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179
Primer CGA4 156-179. Universidad Nacional-Corpoica. 58 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 32.
75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
Primer CT1 75-98. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 33.
99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
Primer CT2 99-121. Universidad Nacional-Corpoica.
59
Figura 34.
122 123 124 127 128 129 130 131 133 134 136 142 143 145 146 148 149 150 151 152 153 154 155
Primer CT3 122-155. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 35.
156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179
Primer CT4 156-179. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 36.
75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98
Primer TG1 75-98. Universidad Nacional-Corpoica.
60 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 37.
99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121
Primer TG2 99-121. Universidad Nacional-Corpoica.
Figura 38.
122 123 124 127 128 129 130 131 133 134 136 142 143 145 146 148 149 150 151 152 153 154 155
Primer TG3 122-155. Universidad Nacional-Corpoica.
61
Figura 39.
156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179
Primer TG4 156-179. Universidad Nacional-Corpoica.
62 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 40.
75 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 76 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 77 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 78 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 79 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 81 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 82 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 83 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 84 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 85 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 86 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 88 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 89 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 999 999 999 999 999 999 999 999 999 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1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 999 999 999 999 999 999 999 999 999 999 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 173 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 174 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 175 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 176 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 177 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 178 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 179 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
Matriz binaria de 0 y 1 presencia ausencia de alelos. 63
Figura 41.
Dendrograma generado usando el análisis UPGMA, muestra el índice de similitud entre cultivares de bananas.
64 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 42.
Agrupamiento de variedades de bananas principales clados que muestran similitud.
65
Tabla 4. Índice de similitud, nodos de unión entre variedades de bananas.
Nodo de unión entre variedades Índice de similitud
M. ornata & M. itineras 0.8
M. rosea & M. textilis 0.8
Guineo & Nakitengwa 0.83
Yambi & Tafetan* 0.85
Mysore & Lacatan 0.88
Gros Michel enano & Banano 2 0.89
Valery & Banano Sin 0.89
IITA & M. laterita 0.90
Seredow & Gran enano 0.90
Calcutta 4 & Dominicio 0.91
Pisang Tongat & Pisang lilin 0.93
FHIA 2 & FHIA 23 0.95
Tuu Gia & Niyarma yik 0.96
Bocadillo común & Bocadillo alto 0.96
66 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 43.
Dendrograma de bananas utilizando el genoma. 1 AA Diploide, 2 AAB Triploide, 3 AAA Triploide, 4 BB
Diploide, 5 AAAA Tetraploide, 6 AAA Triploide.
Tabla 5. Porcentaje de bandas polimórficas para el total de la muestra analizada.
Primers Bandas B. Polimorficas % B. Polimorficas CA 19 18 94 AG 11 11 100 CT 10 10 100 CGA 17 17 100 TG 15 15 100 Total 72 71 100 67
Tabla 6. Distancias genéticas de Nei’s 1978 para bananas de acuerdo a análisis del genoma.
Pop ID 1 2 3 4 5 6 1 ***** 0,9071 0,9394 0,8874 0,8722 0,7989 2 0,0975 ***** 0,8726 0,8405 0,8419 0,849 3 0,0625 0,1363 ***** 0,9075 0,8841 0,7954 4 0,1194 0,1737 0,0971 ***** 0,8472 0,7717 5 0,1367 0,1721 0,1232 0,1658 ***** 0,9013 6 0,2245 0,1637 0,229 0,2591 0,1039 ***** Identidad genética de Nei’s arriba diagonal y heterocigosidad genética abajo diagonal.
Tabla 7. Análisis de Varianza Molecular de bananas con genotipo conocido.
Fuente de Grados Suma de Media Variación Porcentaje Valor Probabilidad Variación de Cuadrados de Estándar de variación Calculado P(rand ≥ data) Libertad Cuadrados PhiPT Entre 4 87,201 21,8 0,957 6% 0,06 0,006 Grupos
Dentro de 38 572,264 15,06 15,06 94% Grupos
Total 42 659,465 16,016 100%
68 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 44.
Porcentaje de varianza molecular
Entre Poblaciones 6%
Intra Poblaciones 94%
Porcentajes de varianza molecular inter e intra poblacional, amova molecular con un PhiT de 0,06, con 4 y
38 G.L. Para las bananas con genotipo conocido.
69
Tabla 8. Calificación de la diferenciación genética para las especies de bananas que se les conoce el genotipo de acuerdo al Fst Wright 1978.
Valores de Fst de Valores de Fst Grado de diferenciación este estudio
0-0.05 Poca diferenciación Genética
Moderada diferenciación 0.06-0.15 0.1544 Bananas Genética
0.16-0.25 Alta diferenciación Genética
Mayor de 0.25 Gran diferenciación Genética
70 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
5. Discusión
En la muestra se tienen diferentes variedades de bananas los índices de riqueza de
Margalef y Menhinick muestran que existe alta riqueza de variedades en la muestra. Lo cual nos dice que en el banco de germoplasma existe una colección diversificada y representativa de cultivares de bananas. Las variedades de bananas han sido diferenciadas tradicionalmente utilizando una combinación de caracteres morfológicos, fenológicos y florales (Simmons & Shepherd, 1955). Haciendo difícil su identificación, por ser estas en su gran mayoría híbridos e.g., las variedades de M. acuminata son banksii, burmanica, burmanicoides, errans, malaccensis, microcarpa, siamea, truncata y zebrina y sus ploidías son AA para especies silvestres, AA para cultivares diploides, AAA para cultivares triploídes y AAAA para cultivares tetraploídes (Kennedy, 2008). La existencia de numerosos sinónimos, su larga fase vegetativa y ambigüedades en la cuantificación de sus características morfológicas, complica los procesos de identificación aún de las variedades conocidas (Chariya et al; 2013). La taxonomía de Musa es todavía bastante oscura (Häkkinnen & Väre, 2008) e.i, en el caso especifico de la dificultad que existe para lograr conseso entre la identificación de especies como M. dasycarpa, M. velutina, M. assamica y M. sanguinea pertenecientes a la sección Rhodochlamys. Un hibrido es un individuo que es diferente de dos poblaciones naturales y que es al menos diferente en un carácter heredable. Lo anterior hace que se utilicen diferentes técnicas de huellas digitales de DNA entre ellas los RAMS. El inter –SSR PCR provee una nueva huella digital aplicable para taxonomía y comparaciones filogenéticas y como una herramienta de mapeo en un amplio rango de organismos (Zietkiewicz et al; 1994). Usando estas técnicas un gran 71
número de bandas polimórficas pueden ser producidas en minutos provenientes de DNA genómico (Welsh & McClelland, 1990), analizando una selección de muchas accesiones.
Es importante resaltar que los RAMS son una técnica de marcadores moleculares usada con mucho éxito en el estudio de hongos y plantas. El poder de un marcador es determinado por el nivel del polimorfismo detectado lo cual está determinado por la rata de mutación de los sitios genómicos envueltos (Kumar et al, 2009). El análisis estadístico utilizado es el mismo utilizado para los estudio genéticos con microsatélites en bananas
(Lu et al, 2011, Psyquay, 2009, Changadeya, 2012) utilizando el programa NTSYS, la filogenia fue analizada utilizando el método UPGMA y las aplicaciones correspondientes de los árboles filogenéticos. La biología molecular da comprensión sobre el funcionamiento de las causas evolutivas en especial de la producción de la variación genética (Mayr, 1991). La poliploidía es generalizada en el Reino Plantae pero la frecuencia y el máximo de poliploides varía dependiendo de los diferentes grupos taxonómicos (Husband et al; 2013). El mismo autor argumenta que la alta variación en la frecuencia de poliploides sugiere diferentes propensiones para el establecimiento de la poliploidía en diferentes linajes. La poliploidia y la segregación juegan un papel muy importante en la clasificación de las bananas debido a que actúan directamente sobre la selección, en la clasificación se incluyen diploides (AA, BB, AB), triploides (AAA, AAB,
ABB) y tetraploides (AAAA; AAAB, ABBB) (Osebele et al; 2006). Datos de estudios recientes muestran que existe gran divergencia entre los genomas A y B, lo cual es útil en términos de incremento de la diversidad genética (Manzano-Sáchez et al, 2015). El dendrograma de agrupamiento muestra dos grupos bien diferenciados bananas y Mini bananas y se tienen variedades que muestran cercanía en el árbol filogenético, las 72 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
variedades agrupadas son: IITA y M. laterita, Calcutta 4 y Domicio, Musa textilis y M. rosea, Tuu Guia (M. acuminata AA) y Niyanmayik, Banano2 y Grossmichel, Tafetan* y
Yangambi, Guineo y Nakitengua, Mysore y Lacatan, Serendow y Gran enano, Valery y
Banano sin, Pisang tongat y Pisang lilin (M. acuminata malaccensis), Long Tavoy (M. acuminata burmannica) y Annam, M. balbisiana e IC2, FHIA 2, FHIA 23 y FHIA3436-
9. Figura 42. Se observan agrupaciones entre variedades como Pisang Tongat, Pisang lilin y FHIA 2, 23, 3436-9. Algunas variedades son muy difíciles de diferenciar esto podría explicar porque FHIA 17, se encuentra muy alejada de los otros FHIA que se agrupan como se esperaría i.e, la identificación de FHIA 17 basada en caracteres morfológicos es la siguiente: el canal del peciolo está abierto, con márgenes erectos y una línea de color purpura en los bordes, los lados internos y externos son rojizos (Álvarez et al, 2004), es posible que en la muestra no esté correctamente identificado ya que se aleja mucho de
FHIA 23 y FHIA 3436-9 que pertenecen al mismo grupo A.1.3. Es importante resaltar las plantas del género Musa de la Sección Rodochlamys son de uso ornamental Musa ornata es una especie silvestre en India sus brácteas son de color rosa purpura, Musa velutina es una especie silvestre de los bosques siempre verdes de Arunachal Pradehs India y se caracteriza por tener fruto dehiscente, esquizocarpo en la madurez. Musa laterita es nativa del Nororiente de India Myanmar y Norte de Tailandia su nombre deriva del color brillante de las brácteas las cuales son de color rojizo ladrillo como el suelo tropical laterita; Musa rosea es originaria de Bangladehs su inflorescencia es corta y erecta sus brácteas son de color rojo pálido. Las bananas son híbridos poliploides entre especies de genotipo AA y
BB (Simmonds, 1966). El análisis de las diferentes variedades utilizando su genoma muestra las siguientes agrupaciones el grupo AA conformado por Bocadillo común, 73
Bocadillo alto, Pisang mas, Pisang tongat, Pisang lilin, Palembang, Tuu Gia, Niyar mayik, Zebrina, Peciolos oscuros, Long tavoy, Annam, M. rosea, Lacatan, Bocadillo, M. textiles, Pisang y Calcutta 4. Grupo AAA conformado por Senlangor 1, Senlangor 2,
Gran enano, Pigmeo, Poyo, Valery (Hojas de color verde claro y el color del peciolo varia de verde a amarillo pálido), Dwarf Cavendish, Gros Michel común (Pseudotallo color verde-amarillo internamente color rosado morado), Gros Michel cocos, Gros Michel enano, Seda, Banano chico, Yangambi, Nakitengwa, Igitsiri, Tafetan, Guayabo A y
Guayabo B. El grupo AAB conformado por Pahang, Mysore, Mai Maoli, IITA y
Dominicio. El grupo BB conformado por Tani y M. balbisiana (es caracterizada por la presencia de manchas menos remarcables en el pseudotallo, brácteas con el borde bajo y frutos con dedos rectangulares). FHIA 17 AAAA perteneciente al grupo A.1.3, FHIA 2 perteneciente al grupo A.1.1.1 (pseudotallo color rojizo sin manchas o manchas muy pequeñas) AAAB y H. Saba 2 ABB/BBB. A nivel de cromosomas las variaciones en el cariotipo de las especies de bananas pueden estar ocurriendo sin cambios en el fenotipo, una especie de banana diploide con reproducción sexual y fértil debe tener buen apareamiento entre los cromosomas homólogos y buena formación de bivalentes, lo anterior determina que exista buena segregación y formación de gametos balanceados y fértiles. Si lo anterior ocurre en todos los híbridos de bananas se puede concluir que existe afinidad homológica entre los genomas parentales, la meiosis en semillas diploides de
Musa ha sido descrita por (Simmons & Dodds, 1949). Los híbridos diploides representan la variabilidad genética disponible para los seleccionadores de variedades comerciales, debido a que los híbridos triploides tienen características genéticas fijas. En los híbridos, para dos loci ligados puede ocurrir que los dos alelos dominantes estén en un cromosoma y 74 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
los dos alelos mutantes estén en el otro cromosoma configurando relaciones de enlace de acoplamiento y en el otro caso relaciones de enlace de repulsión. En este caso los gametos recombinantes y progenitores serán diferentes en cada caso. En poliploides existe afinidad relativa de distintos genomas con el mismo contenido genético. Durante el proceso de evolución ocurren cambios cuantitativos y cualitativos en el contenido de DNA total; los cuales pueden estar relacionados con la ploidía, aneuploidía, polimorfismo numérico, reordenamientos cromosómicos y variación el número de secuencias no codificantes. Todo lo anterior puede estar determinando que los híbridos de bananas diploides y poliploides compartan genes, que se expresan en características visibles que las agrupan en la forma que presenta el estudio. La partenocarpia es una característica deseada por los seleccionadores humanos, de acuerdo a los estudios de Simmonds en segregación de cultivares diploides de bananas (Simmonds, 1958), en las bananas silvestres existe una acumulación aleatoria de esta característica, pudiendo ocurrir mutaciones en los locus de encendido, dando como resultado bananas cultivables, la selección de la dominancia por humanos hace que las hembras tengan una moderada o alta esterilidad mientras los machos son fértiles, estos se entrecruzan con bananas silvestres ocurriendo la selección genética y citológica de la esterilidad, aumentando los productos partenocárpicos, dando como resultado cultivares avanzados clones estériles y diploides. Y que exista finalmente aislamiento reproductivo con las especies de Mini bananas, en su centro de origen para las silvestres, que tienen pocas diferencias bioquímicas y morfológicas pero presentan diferencias cromosómicas que las mantienen aisladas de las bananas siendo las Mini bananas especies críticas. Las medias matemáticas de las distancias genéticas de Nei´s
1978 y la heterocigosidad para la muestra son de 0.861 y de 0.141 respectivamente y con 75
un Fst de 0.154. Estudios similares realizados por Psyquay et al; 2009 para 44 variedades de musa muestran baja variabilidad en los genotipos con un valor para la heterocigosidad de 0.1661, el valor de la heterocigosidad de 0.141 muestra un grado inferior de variabilidad genética entre los grupos de bananas y no se encuentran genomas independientes o aislados, como mostrarían análisis realizados con especies como Ensete ventricosum, Musela lasiocarpa o M. boman (Daniells et al; 2001). Estudios realizados por Lu et al; 2011 para 30 variedades de bananas con un polimorfismo del 85.1% muestran evidencia de elevada variabilidad genética en la muestra. En este estudio el polimorfismo encontrado es del 99% mostrando evidencia de un alto grado de variabilidad genética en la muestra. En la muestra de material vegetal del banco de germoplasma se tienen muchos clones de una misma especie e.g, Musa acuminata Colla, tiene los siguientes clones
Senlangor A, Pisang lilin, Calcutta 4, Tavoy, Long Tavoy. Lo que no ocurre con Musa velutina especie ornamental que se diferencia bien y que está cerca de Pisang tongat y
Pisang. La variedad Palem bang AA, es la más alejada de las otras variedades en el árbol filogenético con un índice de similitud de 0.39 con respecto al valor del otro nodo más cercano de 0.44 que corresponde a Senlangor 2, indicando que está bien diferenciada por la separación que existe entre ellas teniendo en cuenta que estos índices representan distancias filogenéticas. Es interesante abordar el siguiente aspecto evolutivo de las bananas, claramente el género Musa se encuentra aislado geográficamente del género
Ensete y sus cinco especies restringidas al continente Africano, este aislamiento geográfico sin duda constituye especiación alopátrica de las especies ancestrales de Musa en su centro de origen. Sin embargo cuando dos poblaciones entran en contacto el aislamiento reproductivo puede estar incompleto y pueden ejercer presiones selectivas, uno sobre el 76 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
otro, sí los híbridos entre las dos poblaciones fueren desventajosos la selección podría incrementar el aislamiento reproductivo (Ridley, 1993). Este argumento es la piedra angular en el entendimiento de la gran variedad de híbridos de bananas ya que por el contrario la especiación puede ocurrir de forma muy rápida en simpatría (Ridley, 1993). Es posible que para las bananas la poliploidía esté generando especiación instantánea en simpatría, el entrecruzamiento termina el aislamiento inicial. En su centro de origen es posible que los híbridos de bananas no tengan reforzamiento de barreras reproductivas, entonces la zona de hibridación puede ser estable indefinidamente (Ridley, 1993). De esta forma puede explicarse la gran diversificación de las Musáceas, en su centro de origen, estando éstas tan emparentadas entre sí, a las poblaciones que tienen este comportamiento se les conoce como enjambres híbridos (Arnold, 1997). Una zona híbrida es un área geográfica donde las especies diferenciadas genéticamente se entrecruzan y forman descendencia. El archipiélago que está comprendido entre sudeste de Asia y Australia es la tierra de los bosques tropicales con estación seca del Oriente Asiático. Territorio insular separado por la línea de Wallace, afectado por periodos interglaciares. Los bosques que allí se encuentran están dominados por principalmente por Dipterocapus indicus, Hopea ponga y Vateria indica, la vegetación asociada muestra un alto grado de endemismo
(Vasantrhaj & Chandraschekar, 2006). La especiación alopátrica de plantas se observa claramente en los territorios de China e India. El surgimiento de los Himalayas se dio por la colisión de la placa tectónica de la India con la placa tectónica de Asia, lo cual ocurrió alrededor de 50-55 millones de años atrás (Wang et al, 2012). En China se encuentran distribuidas tras los Himalayas y la península de Malasia son: M. itinerans, M. paracoccinea, M. coccinea, M. sanguínea, M. basjoo y M. nagensium y en la India 77
también tras los Himalayas M. balbisiana, M. itinerans, M. nagensium, M. sikkimensis and M. cheesmani (Sarrock & Aranud, 2004). Para las especies de Musa silvestres la cadena montañosa si constituye una barrera que conduce a la especiación alopátrica y estás montañas también son un factor determinante para el clima del centro y oriente de Asia
(Wang et al; 2012). Para las Mini bananas no se tiene su nombre especifico, ni su genoma, son variedades, clones, diferentes, introducidas al azar en el territorio Colombiano. Se tiene un alto grado de polimorfismo cercano un 100% en todas las bandas obtenidas en la muestra. Lo cual implica la existencia de diferentes alelos de un mismo gen en las plantas de bananas. El polimorfismo genético está clásicamente definido como la existencia simultanea de un rasgo en la misma población o la presencia de dos o más variantes discontinuas de genotipos. En la caracterización molecular se observa en los geles de poliacrilamida teñidos con bromuro, algunos pozos donde no hubo amplificación de DNA.
Observamos que de las 72 bandas (Loci) obtenidos en total, los alelos se distribuyeron entre los marcadores de peso de 300 a 1500 pares de bases. Lo anterior corrobora que los
RAMS son un método universal para estudiar la variación genética de especies vegetales, para optimizar su uso es muy importante estandarizar el método siguiendo los métodos y protocolos de la técnica. Los RAMS son una herramienta muy potente para estudios de diversidad porque combina las ventajas del uso de los RAPD y los microsátelites (Vainio et al; 1998, Henríquez, 2003). Los bancos de germoplasma nacionales como el de
Corpoica son muy importantes entre otras razones porque preservan variedades vegetales que pueden ser sujetos de extinción masiva a causa de enfermedades como virus vegetales i.e, la variedad Cavendish no tiene otra variedad natural que pueda reemplazarla debido a que esta variedad es la más resistente a enfermedades al mal de Panamá a la sigatoka negra 78 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
y resistencia al nematodo barrenador. La información genómica difundida a la luz del polimorfismo, puede ser usada en programas de siembra de plantas, tales como el uso de nucleótidos individuales polimorficos (SNPS) donde hay un alto grado de heterocigosidad entre el genoma A y B de uno entre cada 55.9 pares de bases (Manzano-Sánchez et al;
2015). Es importante resaltar que el germoplasma de las bananas y su pool genético es de gran importancia para la alimentación y la agricultura del país, las variedades pueden ser sembradas en granjas agroforestales en áreas remotas, siendo útil para las comunidades vulnerables económicamente, donde la asistencia técnica es insuficiente y la disponibilidad de insumos es precaria. La siembra en granjas agroforestales en áreas remotas garantiza que la fuerza de selección natural actué sobre los genotipos, estudios realizados en Africa muestran que la conservación in situ de especies sivestres de Musa en sus hábitats naturales garantiza la continuación de los procesos de evolución natural (Pillay et al,
2004). El material genético de estas variedades sigue siendo el mismo, cambian las condiciones de los hábitats la fuerza selección natural es la que dinamiza el cambio evolutivo si bien la evolución no tiene un propósito determinado (dirección), sí condiciona el pool de genes de los individuos modificando sus características en las siguientes generaciones que heredan este material. La importancia del cambio radica en el establecimiento de poblaciones naturales con genes de tolerancia a condiciones extremas y de resistencia a enfermedades garantizando permanencia en el tiempo y en territorios a colonizar. En Uganda se han realizado estudios de biodiversidad y conservación de aves en cultivos combinados de bananas y café, encontrando una diversidad de 256 especies de aves en granjas con cultivos mezclados y se obtuvieron 31 registros en bosques (Hulme et al, 2013), lo anterior sugiere que las políticas de agricultura pueden ayudar en la 79
conservación de especies como las aves, realizando una planeación adecuada de cultivos, determinando el uso de la tierra y adicionando las estrategias de conservación de aves a la asistencia técnica a pequeños agricultores. La estrategia de sembrar bananas como cultivo agroforestal en áreas remotas contribuye al establecimiento de especies pioneras en áreas disturbadas por la población humana. En otra palabras las características de resistencia a enfermedades, resistencia a insectos herbívoros a condiciones extremas de humedad, precipitación ó sequía que buscan los seleccionadores. Serán favorecidas por la fuerza de selección natural, haciendo que la evolución continué sobre el pool genético de las
Musáceas comestibles y obteniendo por consiguiente germoplasma totalmente adaptado a las condiciones climáticas, hidrológicas, de resistencia a herbivoría por insectos y de suelo, en todo el territorio nacional. Sirviendo las bananas de alimento a la fauna local y de actividad económica de bajo impacto en zonas que amortiguan la biodiversidad objeto de conservación y que tienen presión antropogénica. Para lo cual recomiendo utilizar la guía de regeneración de banana publicada por Tomekpe y Fondi (2008). Está guía incluye información sobre las condiciones climáticas ideales para el cultivo, la temporada de siembra, preparación para la regeneración, condiciones de campo y preparación, siembra y trazado densidad y distancia de siembra, fuente para plantar el material, preparación y método para plantar el material, rotulado y fertilización, irrigación, control de pestes etc,.
80 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
5.1. Conclusión
Se encuentra un grado de cercanía genética muy estrecho en el material vegetal de las variedades de bananas de la colección del banco de germoplasma de Corpoica Palmira debido en gran medida a que estas variedades son hibridos de Musa acuminata, Musa balbisiana y Musa paradisiaca lo anterior indica un bajo grado de aislamiento genético reproductivo Se presenta un 99% de polimorfismo genético en la colección de bananas.
5.2. Prospecciones y perspectivas de investigación
En cuanto a los interrogantes, perspectivas y prospecciones investigativas que deja el presente estudio están: Las de hacer estudios citogenéticos y bioquímicos completos para correlacionar la información de los marcadores moleculares obtenida para las plantas de bananas y estudiar otras zingiberáceas que son especias bien diferenciadas con el fin de reconocer y aislar los genes del sabor y poderlos introducir en las bananas comestibles, como el cardamomo, cúrcuma, jengibre y ginger utilizando también la técnica RAMS teniendo encueta las mismas recomendaciones que se dan para las bananas. Entre las recomendaciones para el banco de germoplasma están las de obtener otras variedades e,g,
FHIA-06, FHIA-07 grupo Maia Maoli, Calcutta IR 124 silvestre, Pahang IR 296 silvestre,
Pisang Berlín comestible, variedades que enriquecen y complementan la colección y con mucha prospección para cruzamientos. También es necesario el establecimiento de programas de agricultura orgánica para bananas que les permitan a los pequeños agricultores exportar este producto con rentabilidad.
81
5.3. Fotografías del banco de germoplasma de bananas de Corpoica Palmira
Figura 45.
Fotografía de Red genoma AAA. En el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira. Luis A.
Osorio G.
82 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 46.
Fotografía de Musa ornata código de colección IPAL-0620 perteneciente a la sección Rhodochlamys especie ornata en el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira. Luis A. Osorio G.
83
Figura 47.
Fotografía de Pigmeo Cavendish código de colección IPAL- 0594 genoma AAA triploide subgrupo
Cavendish en el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira. Luis A. Osorio G.
84 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 48.
Fotografía del interior del cultivo de banano en el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira.
Luis A. Osorio G.
85
Figura 49.
Fotografías de rótulos de marcaje en el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira. Luis A.
Osorio G.
86 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 50.
Sistema de sostén a la planta de bananas en fruto en el banco de germoplasma del estado colombiano.
Palmira. Luis A. Osorio G.
87
Figura 51.
Fotografía del Cachaco enano código de colección IPAL-0500 Cooking banana genoma ABB Triploide sugrupo Bluggoe en el banco de germoplasma del estado Colombiano Palmira. Luis A. Osorio G.
88 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 52.
Fotografía rótulos de marcaje de las bananas 95 variedad FHIA 2 en el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira. Luis A. Osorio G.
89
Figura 53.
Fotografía de separación de surcos en el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira. Luis A.
Osorio G.
90 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 54
Fotografía de los caminos de acceso en el banco de germoplasma del estado Colombiano.
Plamira. Luis A. Osorio G.
91
Figura 55.
Fotografía de Musa basjoo perteneciente a la sección Eumusa en el banco de germoplasma del estado
Colombiano. Palmira. Luis A. Osorio G.
92 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
Figura 56.
Fotografía de Musa velutina perteneciente a la sección Rhodochlamys en el banco de germoplasma del estado Colombiano. Palmira. Luis A.
93
5.4. Anexo 1.
Tabla de riqueza de variedades, clones de bananas en la muestra.
Especies. Gen. Var. Clon Individuos Musa 8 Pisang 4 Bocadillo 4 FHIA 4 Michel Gros 3 Banano 3 Guayabo 2 Senlangor 2 Tafetan 2 Zebrina 1 Peciolos Oscuros 1 Long Tavoy 1 Annam 1 Pahang 1 Tuu Gia 1 Tani 1 Mysore 1 Lacatan 1 Seredow 1 Gran enano 1 Pigmeo 1 Poyo 1 Valery 1 Ddwarf Cavendish 1 Seda 1 Guineo 1 Nakitengwa 1 Igitsiri 1 H. Saba 2 1 Maia Maoli 1 Pompo 1 IITA 1 Calcutta 4 1 Dominicio 1 La miel 1 BS209 1 Palembang 1 Niyarma yik 1 Número total S= 40 Número total N=63 94 Análisis de polimorfismos en microsatélites aleatorios de DNA del germoplasma de bananas de la colección de Corpoica Palmira
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