UMETNO OPRAŠEVANJE in VIABILNOST PELODA ČRNEGA TELOHA (Helleborus Niger L.)

UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

Štefka GOLEC

UMETNO OPRAŠEVANJE IN VIABILNOST PELODA ČRNEGA TELOHA (Helleborus niger L.)

DIPLOMSKO DELO

Maribor, 2010

UNIVERZA V MARIBORU FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE POLJEDELSTVO IN VRTNARSTVO

Štefka GOLEC

UMETNO OPRAŠEVANJE IN VIABILNOST PELODA ČRNEGA TELOHA (Helleborus niger L.)

DIPLOMSKO DELO

Maribor, 2010

POPRAVKI

III

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

MENTORSTVO

Komisija za zagovor in oceno diplomskega dela:

Predsednik: red. prof. dr. Franc Bavec Mentor: doc. dr. Andrej Šušek Član: red. prof. dr. Anton Ivan čič

Lektoriranje: Karmen Zupanc, prof.

Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Datum zagovora: september, 2010

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha (Helleborus niger L.)

UDK: 582.6/.9:631.527.82:631.53.02(042.2)=863

Raziskava je bila narejena na črnem telohu ( Helleborus niger L.) v letih 2006 in 2007. V naravni populaciji v kraju Doblatina smo prou čevali možnost samooprašitve teloha in kaljivost semen samooprašenih rastlin. Analizirali smo semenitev samooprašenih in hibridiziranih rastlin. Z metodo barvanja z acetokarminom smo prou čevali vitalnosti peloda glede na dolžino skladiš čenja pri temperaturi -9 oC. Za analizo samooprašnosti smo v naravni populaciji izolirali 41 mati čnih rastlin. Rastline, ki smo jih ro čno samoopraševali, so semenile. Povpre čna kaljivost je bila 9,17 %. Najve čje število semen je bilo 105, najmanjše pa 2 semeni na posamezno obravnavano rastlino. Pri primerjavi semenitve rastlin je bilo ugotovljeno, da hibridizirane rastline tvorijo povpre čno težja semena kot samooprašene rastline. Z analizo je bilo ugotovljeno, da obstajajo statisti čno zna čilne razlike v viabilnosti peloda, ki smo ga razli čno dolgo skladiš čili.

Klju čne besede: opraševanje / semenitev / vznik / viabilnost peloda / črni teloh / Helleborus niger

OP: VIII, 40S., 6 Pregl., 1 Graf., 14 Slik, 35 Ref.

Artificial pollination on Christmas rose (Helleborus niger L.) and pollen viability

The research work involved Christmas rose ( Helleborus niger L.) plant material from naturally grown local population in Doblatina, during the years 2006 and 2007. We studied the possibilities of self-pollination and germination of seeds of self-pollinated plants. We compared seed development of self-pollinated and hybridized plants. With the method of colouring by aceto-carmine, we studied the pollen viability depending on the duration of storage at -9 oC. For the purposes of the self-pollination analysis, we isolated 41 parental plants in their natural populations. Plants that were manually self-pollinated frequently developed seeds. The average germination was 9.17 %. The highest number of seeds per individual plant, considered in the analysis, was 105, and the lowest number was 2. The comparison of seed development showed that, on average, hybridized plants formed heavier seeds than self-pollinated plants. The results of the analysis showed that there were statistically significant differences in viability of pollen with different duration of storage.

Key words: pollination / seed development / germination / pollen viability / Christmas rose / Helleborus niger

NO: VIII, 40P., 6 Tab., 1 Graph., 14 Pict., 35 Ref. V

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Kazalo vsebine 1 UVOD ...... 1

1.1 Pomembnost in pridelava telohov ...... 1

1.2 Namen in hipoteza ...... 2

2 PREGLED LITERATURE ...... 3

2.1 Botani čna klasifikacija ...... 3

2.2 Ekonomska pomembnost ...... 6

2.3 Tehnika pridelovanja ...... 7

2.3.1 Razmnoževanje ...... 8

2.4 Rast in razvoj ...... 11

2.4.1 Rast ...... 11

2.4.2 Cvetenje in oprašitev ...... 12

2.5 Dolo čanje viabilnosti zrelega peloda ...... 14

2.6 Dolo čanje viabilnosti peloda z barvilom acetokermin ...... 18

3 Material in metode dela ...... 19

3.1 Uporabljen rastlinski material ...... 19

3.1.1 Rastlinski material ...... 19

3.2 Metode dela ...... 24

3.2.1 Zasnova poizkusa ...... 24

3.2.2 Vrednotenje in analiza ...... 27 VI

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

4 REZULTATI Z RAZPRAVO ...... 29

4.1 Analiza opraševalnih odnosov ...... 29

4.2 Primerjava semenitve samooprašenih rastlin in hibridiziranih rastlin ...... 32

4.3 Analiza viabilnosti peloda črnega teloha ...... 35

5 SKLEPI ...... 37

6 VIRI IN LITERATURA ...... 38

VII

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Kazalo preglednic

Preglednica 1: Botani čna klasifikacija rodu Helleborus L. (Tamura, 1993) ...... 3

Preglednica 2: Klasifikacija rodu Helleborus po Mathew (1989), prilagojena pa Sunu in sod. (2001) ...... 4

Preglednica 3: Termini analize viabilnosti in starost peloda ...... 26

Preglednica 4: Prikazane statisti čne vrednost prou čevanih lastnosti pri samooprašenih rastlinah ...... 29

Preglednica 5: Število ter masa semena iz obravnavanih rastlin (samooprašenih ter hibridiziranih rastlin) ...... 33

Preglednica 6: Viabilnost peloda glede na termin obdelave ...... 36

Kazalo grafikonov

Grafikon 1: Prikazane povpre čne mase semen samooprašenih in hibridizaranih rastlin .... 34

Kazalo slik

Slika 1: Vegetativno razmnoževanje teloha (Rice, 2002) ...... 10

Slika 2: Razvoj pelodnega zrna (povzeto po www.bf.uni-lj.si/fileadmin/groups/2711) ..... 16

Slika 3: Neviabilno pelodno zrno črnega teloha ...... 17

Slika 4: Primer viabilnega pelodnega zrna črnega teloha obarvanega z acetokerminom ... 18 VIII

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Slika 5: Na zemljevidu ozna čen kraj Doblatina, kjer je bil izveden poizkus (zemljevid.najdi.si/search_maps.jsp?q=Doblatina&tab=maps) ...... 19

Slika 6: List črnega teloha ...... 21

Slika 7: Cveto či cvet črnega teloha ...... 21

Slika 8: Cveto či cvet z ozna čenimi deli cveta (a- čašni listi, b- prašnik, c- pesti č, ...... 22

Slika 9: A- Mikroskop Olimpus, B- Rastna komora, C- Zamrzovalnik in hladilnik ...... 23

Slika 10: Izolirana rastlina s kopreno ...... 24

Slika 11: Povpre čna masa semen ...... 30

Slika 12: Skupna masa semen ...... 31

Slika 13: Število pobranih semen ...... 31

Slika 14: Vznikla semena samooprašenih rastlin črnega teloha ...... 32

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

1 UVOD

1.1 Pomembnost in pridelava telohov

Sodobna tržna pridelava zahteva visoko konkuren čno pridelavo, tako okrasnih kot drugih kmetijskih rastlin. Zaradi vedno novejših tehnologij in na činov pridelave lahko na svetovnem trgu zasledimo vedno ve č novih rastlinskih vrst. Dosedanje raziskave so pokazale, da lahko črni teloh ( Helleborus niger L.) uvrš čamo med vedno bolj iskane okrasne rastline (Šušek, 2007).

Rod Helleborus sestavlja 15 do 20 vrst, je zelo raznolik in vključuje razli čne vrste z nenavadno rastjo in morfološkimi lastnostmi. Ta rod se s svojimi vrstami razširja od Kavkaza in Male Azije v Evropo in seže na sever do Nizozemske in severnonemških nižin. V Sloveniji raste 5 vrst telohov: črni teloh ( H. niger ), blagodiše či teloh ( H. oderus Waldest et. Kit.), hostni teloh ( H. dumetorum Waldest et. Kit.), temnoškrlatni teloh ( H. atrorubens Waldest et. Kit.) in deljenolistni teloh ( H. multifidus Vis.) (Martin čič in sod., 1992).

Črni teloh je zaradi svojega atraktivnega časa cvetenja zelo iskan na trgu z okrasnimi rastlinami (Armstrong 2002). V naravnih populacijah cveti od novembra do aprila. Za cvetenje ne potrebuje visokih temperatur, kar omogoča ekonomi čno pridelavo v obmo čjih z zmernim celinskim podnebjem (Šušek, Ivan čič, 2006).

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

1.2 Namen in hipoteza

Opraševanje je v naravi pomemben del življenjskega ciklusa rastlin. Poznamo razli čne na čine opraševanja kot tudi razli čne opraševalce, med katere spada tudi človek. Pri žlahtnjenju novih sort je za žlahtnitelje pomembno, katere sorte se bodo med seboj oprašile. Človeška pomo č pri opraševanju je potrebna v primerih, ko ni naravnih opraševalcev in abiotskih dejavnikov, ki bi opraševali rastline.

Črni teloh postaja vse zanimivejša cveto ča trajnica, ki cveti v zimskem in zgodnje spomladanskem času. V tem obdobju še ni prisotnih veliko opraševalcev. Opazovanja kažejo, da je črni teloh verjetno entomofilna (najpomembnejši opraševalci so insekti, predvsem čebele in muhe) in prevladujo če tujeprašna vrsta. Entomofilna narava je ozko povezana z botani čnimi lastnostmi cveta. Cvetovi so hermafroditni (imajo moške in ženske spolne organe) in protogini (razvoj ženskih organov pred moškimi z namenom, da se izognemo samooploditvi) (Salopek-Sondi s sod. 2002). Samooploditev je sicer možna, vendar predvsem v kasnejših fazah cvetenja (Mathew, 1989, Armstrong 2002). Med možne opraševalce spada tudi veter.

Namen raziskave je bil prou čiti stopnjo samooprašitve pri črnem telohu v naravni populaciji, in dolo čiti sposobnost kalitve pelodnih zrn v razli čnem časovnem obdobju.

Cilj diplomske naloge je bil prou čiti opraševalne odnose in dokazati možnost uporabe inbridinga (kontinuiranega samooplojevanja) pri žlahtnjenju črnega teloha.

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

2 PREGLED LITERATURE

2.1 Botani čna klasifikacija

Rod Helleborus L. spada k dvokali čnicam v družino Ranunculaceae (zlati čevke). V zadnjih klasifikacijah družine Ranunculaceae (Tamura, 1993) je rod Helleborus skupaj z rodovi Beesia I.B. Balfour & W. Smith, Calathodes Hook. f. & Thomson, Caltha L., Eranthis Salisb. Megaleranthis Ohwi in Trollius L. uverš čen v tribus Helleboreae in v poddružino Helleboroideae (preglednica 1).

Preglednica 1: Botani čna klasifikacija rodu Helleborus L. (Tamura, 1993)

Cesarstvo : Eularyota – evkarionti

Kraljestvo : Plantae – rastline

Podkraljestvo : Tracheobionta

Deblo : Spermatophyta – semenke

Poddeblo : Magnoliophytina ( Angiospermae) – kritosemenke

Razred : Magnolipsida ( Dicotyledoneae) – dvokali čnice

Podrazred : Magnoliidae

Red : Ranunculales

Družina : Ranunculaceae – zlati čevke

Podružina : Helleboroideae

Tribus : Helleboreae

Rod : Helleborus L. 4

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Rod Helleborus L. sestavlja 15 do 20 vrst, ki so pretežno zimzelene ter listnate trajnice. Znotraj rodu Helleborus so razli čni avtorji predlagali razli čne razvrstitve sorodnih vrst na osnovi razli čnih meril.

Mathew (1989) je razdelil rod, ki je temeljil na splošni strukturi rastlin (sposobnost vrst za križanje, morfologiji pelodnih zrn in zna čilnosti semena) v šest selekcij. Identificiral je 15 vrst, ki so prikazane v preglednici 2.

Preglednica 2: Klasifikacija rodu Helleborus po Mathew (1989), prilagojena pa Sunu in sod. (2001)

SEKCIJA VRSTE Syncarpus H. vesicaricus Aucher ex Boiss.

Griphopus H. fetodius L.

Chenopus H. argutifolius Viv.

Helleborus H. niger L.

Helleborastrum H. atrorubens Waldst. & Kit. H. cyclophyllus Boiss. H. dumetorum Waldst. & Kit. H. multifidus Vis. H. odorus Waldst. & Kit. H. orientalis Lam. H. purpurasencens Waldst. & Kit. H. torquatus Archer- Hind H. viridis Boiss.

Dicarpon H. thibethanus French.

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Mathew (1989) obravnava H. croaticus kot sinonim za H. torquatus, Sun in sod. (2001) pa zagovarjajo trditev, da sta to dve razli čni vrsti.

V literaturi se navaja, da obstajata dve podvrsti črnega teloha in sicer Helleborus niger sub . niger (črni teloh) ter Helleborus niger sub. macranthus (velecvetni črni teloh), ki pa se razlikujeta tako po morfoloških zna čilnostih kot tudi po razširjenosti.

Obe rastlini lahko prepoznamo po naslednjih znakih (Ravnik, 1969):

Helleborus niger subsp. niger :

• listnih segmentov 7, široki usnjati, temno zeleni, bleš čeči;

• listni segmenti rombasto kijasti, nad sredino najširši;

• zobci listnih segmentov obrnjeni naprej;

• premer cveta 6 –8 cm, sepala široko jaj časta, prekrivajo se čez sredino;

• sepala po odcvetu zelena ali slabo rdečkasta, redkeje škrlatno rde ča;

• čas cvetenja od februarja do marca.

Helleborus niger subsp . mocranthus :

• listnih segmentov 8, navadno 9 –11, modrikasto zeleni, niso bleš čeči;

• listni segmenti široko suli časti, v sredini ali v bližini sredine najširši;

• zobci listnih segmentov štrle či in bode či;

• premer cveta 8 –11 cm, sepala ožja, se ne prekrivajo ali pa le do sredine; 6

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

• sepala po odcvetu vijoli čna;

• čas cvetenja od februarja do maja.

Ravnikar (1969) ugotavlja, da zgoraj navedeni znaki, ki jasno nakazujejo dve razli čni rastlini, niso ustrezali za zanesljivo dolo čanje herbarijiskih in svežih rastlin, nabranih na razli čnih fitogeografskih območjih Slovenije (alpski svet, subpanonski svet, dinarski svet, preddinarski svet, predalpski svet) in na razli čnih lokacijah v Avstriji. Na podlagi analize herbarijiskih in svežih rastlin je ugotovljeno, da lahko v Sloveniji najdemo samo podvrsto Helleborus niger subs . niger , ki raste od nižine do subalpskega pasu.

2.2 Ekonomska pomembnost

Črni teloh, ki ga lahko v veliki meri ob čudujemo v naravi, je tako kot v svetu, tudi pri nas postal priljubljena okrasna rastlina. V Angliji in Ameriki je že nekaj let zelo moderno imeti črni teloh doma na vrtu. Črni teloh se ne uporablja samo kot okrasna trajnica, ki jo sadimo na vrtovih in gredah, temve č je priljubljen tudi kot lon čna rastlina ter kot rezano cvetje. Kot rezano cvetje lahko črni teloh prodajamo od novembra do aprila, lon čno rastlino pa skozi vse leto. Pridelava je v glavnem osredoto čena na oskrbo trga pred boži čem, z namenom izkoristiti ugodnost visokih cen (Šušek, 2007).

Dosedanje raziskave so pokazale, da postaja črni teloh na trgu z okrasnimi rastlinami vedno bolj priljubljena cveto ča trajnica. Njegova zmožnost cvetenja, da cveti v najhladnejših mesecih leta, ga naredi zelo dragocenega. Glede na naravni čas cvetenja ne potrebuje visokih temperatur za za četek cvetenja, kar je zelo pomembno za pridelovalce 7

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

teloha v zmerni kontinentalni klimi. Glede na nizke potrebe po toploti, je pridelovanje črnega teloha v rastlinjakih cenovno ugodno in prijazno do okolja (Šušek, 2007).

Črni teloh je tudi zdravilna rastlina z zdravilnim učinkom za duševne motnje, za bolezni živ čevja, odvajalo ter odganjalec črevesnih zajedavcev. V ta namen so uporabljali korenine (Mathew, 1989).

Uporabljali so ga še za krepitev opešanega srca ter pri izostali menstruaciji. Zaradi svoje strupenosti in ozke meje med zdravilnostjo in strupenostjo, danes teloha ne uvrš čamo med varna zeliš ča. Mo čno razred čene pripravke iz korenin črnega teloha uporabljajo v homeopatiji pri zdravljenju obolenj z akutnimi driskami, kr či, vnetji prebavil, ledvic, možganskih ovojnic in pri motnjah čustvovanja (Rode, 2007).

2.3 Tehnika pridelovanja

Čeprav je črni teloh že zelo dolgo poznan kot okrasna rastlina, je relativno nova rastlina v intenzivni pridelavi. Glavni problemi pri intenzivnem pridelovanju so nizek faktor razmnoževanja, malo informacij glede genetskih virov, slabo poznavanje ekologije in vpliva gnojil na rast rastlin in pojavu bolezni in škodljivcev (Ahlburg, 1993, Mclevin, 1996). Eden od glavnih razlogov za majhno število novih sort je omejena genetska variabilnost, ki je na voljo za dolo čeno lastnost. Pri žlahtnjenju novih sort je potrebno upoštevati zahteve pridelovalcev in trga. Moderni trg narekuje zdrave in uniformne (homogene) rastline, prilagoditev časa cvetenja (cena teloha je v času boži čnih praznikov dvojna v primerjavi s ceno v drugem letnem obdobju), zmanjševanja stroškov pridelovanja na raven podobno ostalim zimsko cveto čim okrasnim rastlinam, kot je na primer jegli č (Primula sp.). 8

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

2.3.1 Razmnoževanje

Obstajata dva na čina razmnoževanja telohov. Prvi na čin je razmnoževanje s semenom, drugi pa je razmnoževanje z delitvijo korenin. Razmnoževanje s semeni je enostavneje, saj lahko en sam cvet proizvede do 50 ali ve č semen, težava pa je, da mlade rastlinice, ki jih dobimo pri tem na činu razmnoževanja, niso popolnoma enake staršem. Pri vegetativnem na činu razmnoževanja oziroma z delitvijo je razmnoževanje po časnejše in dolgotrajnejše, vendar pa dobimo nove rastline identi čne izvorni mati čni rastlini (Mathew, 1989).

Generativno razmnoževanje

Razmnoževanje s semenom je najpogostejši na čin razmnoževanja rastlin v naravi in eden naju činkovitejših in najbolj razširjenih na činov razmnoževanja kultiviranih rastlin (Ivan čič, 2002).

Semena telohov dozorijo pozno spomladi ali zgodaj poleti, pogosto v maju ali juniju (Mathew, 1989). Semena lahko za čnemo pobirati, ko s prstom pritisnemo na zeleno rumen meši ček in ti za čno pokati ter nakazovati črna svetle ča semena (Ahlburg, 1993).

Mathew (1989), Rice in Strangman (1993) navajajo, da je najprimerneje, da cvetna stebla porežemo, ko vidimo, da so meši čki primerno zreli ter da bodo za čeli pokati. Cvetna stebla shranimo v papirnato vre čko in odrezane rastline obrnemo navzdol, da se lahko cvetni meši čki odprejo in semena popadajo ven. Vre čke morajo biti na suhem in zra čnem 9

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

prostoru, da porezani cvetovi ne splesnijo. Ko so meši čki odprti, jih stresemo na bel papir, da lahko lo čimo semena od ostalih primesi ter delov cveta.

Za dosego visokega odstotka kaljivosti je najprimerneje, da seme posejemo takoj (Mathew, 1989). Če seme skladiš čimo, pride v stanje mirovanja ali dormantnosti. Sveže seme, lahko kali že pred pozno jesenjo (Rice, 2002).

Kalitev se pri čne približno 20 tednov po setvi (prete či mora toplo in hladno obdobje, da je seme sposobno kalitve) in pri temperaturi okrog 20 oC.

Vegetativno razmnoževanje

Najpogostejši na čin vegetativnega razmnoževanja črnega teloha je deljenje rastlin. Slabost tega na čina se pokaže v tem, da rastlina potrebujete eno do dve leti, da si opomore in okrepi. Šele takrat je namre č sposobna cveteti (Rice, 2002).

Najprimernejši čas deljenja rastlin je, ko za čnejo korenine z rastjo. To je lahko že konec januarja ali v za četku februarja v letih s toplimi zimami (Rice, 2002). Že pred delitvijo je dobro, da si rastlino, ki jo imamo namen deliti, ogledamo, če je primerna za deljenje. Rastlina mora biti zdrava in dovolj mo čna.

Za samo delitev izberemo miren obla čen ter hladen dan. Rastlino, ki jo imamo namen deliti, moramo previdno in v celoti izkopati iz zemlje in nato skrbno oprati korenine. Ko je rastlina razdeljena, naj vsak del rastline vsebuje del korenike s koreninami in vsaj z enim 10

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

listom ter brsti (slika 1). Deljene rastline posadimo v zdrobljeno in vlažno šoto, da ne bi prišlo do izsušitve rastlin. Pomembno je, da si ozna čimo deljene rastline, če jih imamo ve č hkrati, da se nam ne pomešajo (posebej, če imamo specifi čne vrste teloha) (Rice, 2002).

Klasi čen na čin razmnoževanja z delitvijo je za tržno pridelavo preve č po časen (Rupprech in Meissuer, 1985).

Slika 1: Vegetativno razmnoževanje teloha (Rice, 2002)

Tkivne kulture

Rastlinska tkivna kultura je tehnika, kjer gojimo rastline, organe, tkiva in posamezne celice v sterilnem okolju na definiranih podlagah. S pomo čjo rastlinskih tkivnih kultur 11

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

vzgajamo zdrave rastline, opravljamo hitro razmnoževanje rastlin. V zadnjem času pa se vse ve č raziskav posve ča možnosti uvajanja v žlahtnjenje in v proizvodnjo naravnih substanc.

Klasi čna metoda in vivo vegetativnega razmnoževanja je pogosto prepo časna, prezapletena in nazadnje predraga metoda. Ruppercht in Meissner (1985) trdita, da se s kloniranjem lahko razmnoži 1000 rastlin iz ene mati čne rastline v obdobju 15 do 20 let. V zadnjh 15 letih se odkriva, da se lahko rastline hitreje razmnožujejo z in vitro metodo kot z in vivo . Springer (1995) govori o uspešnem poizkusu in vitro razmnoževanja znotraj rodu Helleborus . Lim in Kitto (1995) pravita, da sta metodo in vitro uporabila na H. orientalis. Seyring (2002) in Dhooghe in Van Labeke (2007) poročajo o uspešnem in vitro razmnoževanju črnega teloha.

2.4 Rast in razvoj

2.4.1 Rast

Za nemoteno rast in razvoj črnega teloha so pomembni številni dejavniki. Najpomembnejši so temperatura, svetloba, vlažnost, poleg ekoloških dejavnikov pa še prehrana rastline. S tem, ko rastlina odcveti, se tudi stari listi obarvajo rumeno in rjavo, nato celo odmrejo. Med odmiranjem listov za čne s svojo rastjo podzemna korenika. Nove korenine se pojavijo na kroni korenike med majem in junijem. Med poletjem se formirajo novi listi in vegetativni brsti, na koncu poletja pa se formirajo še cvetni brsti in koreninski razvoj se upo časni. 12

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Vsaka korenika tvori brste. Po razvitem drugem listu se v bazi drugega listnega peclja za čno razvijati cvetni brsti, ki so bolj odvisni od temperature kot pa od dolžine dneva. Za normalen razvoj cveta so potrebne nizke temperature ter krajši dnevi. Ob prehodu v jesen se kon ča rast korenin, ki se zopet nadaljuje v naslednji rastni dobi (Lemper, 1984, Werner in Ebel, 1994).

2.4.2 Cvetenje in oprašitev

Črni teloh zacveti v naravnem okolju že v pozni jeseni in v za četku zime, vendar je cvetenje odvisno od klimatskih pogojev. Nizke temperature ter snežna odeja lahko znatno preložijo cvetenje za en ali ve č mesecev. Za čas cvetenja teloha niso pomembni samo klimatski dejavniki, pomembno je tudi na kakšni podlagi rastlina raste, njena starost ter vitalnost rastline.

Črni teloh je ve činoma tujeprašna rastlina, pojavlja pa se tudi kot samooprašna rastlina. Cvetovi črnega teloha so dvospolni, saj so na enem cvetu tako moški in ženski spolni organi, ter protogeni, saj ženski organi dozorijo prej kot moški, da se izognemo samooploditvi. Samooploditev je možna v kasnejših fazah cvetenja (Armstrong, 2002, Mathew, 1989). Med najpomembnejše opraševalce spadajo žuželke, in sicer čebele, čmrlji ter nekatere druge žuželke. Kot je že bilo omenjeno, je ena izmed možnosti opraševanja tudi samoopraševanje, k opraševanju pa pripomorejo tudi abiotski dejavniki. Cvetovi so na steblu nameš čeni poševno ali vzporedno z njim, zato lahko cvetni prah pade iz prašnic na brazdo pesti ča in s tem povzro či samoopraševanje (Ravnik, 1969).

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Opraševanje

Opraševanje ali polinacija je prenos pelodnih zrn na brazdo pesti ča. Ta prenos je klju čen za spolno razmnoževanje rastlin, saj so potrebne tako moške kot ženske spolne celice. Njihovo združitev imenujemo oploditev. Glede na vrsto opraševanja lo čimo navzkrižno opraševanje in samoopraševanje.

• Navzkrižno opraševanje (alogamija)

Navzkrižno ali medsebojno opraševanje je na čin opraševanja, ko pelodno zrno iz cvetov druge rastline iste vrste pade na brazdo pestiča ali neposredno na semensko zasnovo cveta.

Za pospeševanje alogamije in prepre čitev avtogamije so rastline razvile avtosterilnost (spermalne celice avtosterilnih rastlin ne morejo oploditi jaj čeca iste sorte), dihogamijo (prašniki v cvetu dozorijo pred pesti čem), heterostilijo (raznovratnost pesti čev) in herkogamijo (prostorska lo čitev pesti čev in prašnikov).

Obstajata dva na čina navzkrižnega opraševanja: biotski in abiotski. Biotski na čin opraševanja vklju čuje žive vektorje opraševanja (žive organizme, ki prenašajo pelod). To so najpogosteje žuželke. Opraševanje s pomo čjo žuželk pa se imenuje entomofilija. Poleg biotskega na čina opraševanja poznamo tudi abiotskega, pri tem načinu pa so prisotni neživi dejavniki (veter, voda, gibanje peloda na osnovi sile teže) (Ivan čič, 2002).

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Medsebojno ali navzkrižno opraševanje je biološko koristnejše, ker se združijo genetsko razli čne spolne celice, zato ima potomstvo zaradi novih kombinacij razli čnih genov ve čjo sposobnost prilagajanja na razli čne pogoje okolja (Kranj čič, 1994).

• Samoopraševanje (avtogamija)

Samoopraševanje je oprašitev pesti ča s pelodom istega cveta iste rastline. K temu na činu opraševanja obi čajno prištevamo tudi sosedno opraševanje ali getionogamijo. To opraševanje vklju čuje pelodna zrna drugih cvetov iste rastline.

Pri nekaterih rastlinah lahko nastopi samoopraševanje zaradi mraza in pomanjkanja žuželk (son čnica).

Iz biološko – evolucijskega vidika samoopraševanje v ve čini primerov ni zaželeno, saj zmanjšuje biološko variabilnost. Ugodno pa samoopraševanje vpliva v primeru, ko je gostota na nekem obmo čju majhna in s tem tudi verjetnost za navzkrižno oprašitev (Kranj čič, 1994).

2.5 Dolo čanje živosti zrelega peloda

Pelod ali cvetni prah so rastlinske tvorbe, ki nastanejo v prašnikih in omogo čajo oprašitev in oploditev ženske zarodne celice v pesti ču. Pelodna zrna imajo nalogo, da prenašajo dedne zasnove iz ene rastline na drugo in s tem skrbijo za pestrost potomcev.

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

McCormick, Goldberg in sod., (1993) navajajo, da pelodni razvoj poteka v prašnicah in pri kalitvi peloda na pesti čni brazdi. Za čenja se z delitvijo diploidnih sporofitnih celic in nastankom pelodnih maternih celic, ki se delijo mejoti čno – nastanejo tetrade haploidnih celic. Tetrade se lo čijo in nastanejo enojederne mikrospore, ki se še naprej mitoti čno delijo, tako da se tvori celica z vegetativnim in generativnim jedrom (slika 2). To ozna čuje prehod v dvojedrno fazo razvoja.

V ve čini rastlinskih družin pelodno jedro izstopi iz antere, ko je še v dvojedeni fazi in se generativna jedra delijo šele ob kalitvi na brazdi pesti ča. V drugih rastlinskih družinah pa pride do delitve generativnega jedra v pelodnem zrnu, ko še ne iztopi iz antere.

Za žlahtnjenje je zelo pomembno preverjanje aktivnosti ali živost peloda, saj je velikokrat uporabljen za ugotavljanje interakcije med pelodom in pesti čem, pri dolo čanju fertilnosti staršev, pri shranjevanju peloda in številnih drugih raziskavah.

Na trajanje življenjske sposobnosti oziroma viabilnosti peloda vplivajo številni dejavniki, kot so fiziološka sposobnost kalitve samega peloda, na čin oprašitve rastline, rastlinska vrsta, morfologija cvetov ter številni abiotski dejavniki okolja (Lisci in sod., 1994). Na splošno velja, da pri vseh rastlinskih vrstah pride s časom do ve čjega ali manj strmega padca življenjske sposobnosti peloda. Na življenjsko sposobnost peloda vpliva dehidracija, saj je mo čno povezana z upadom živosti (Nepi in sod., 2001).

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Slika 2: Razvoj pelodnega zrna (povzeto po www.bf.uni-lj.si/fileadmin/groups/2711)

Za dolo čanje življenjske sposobnosti (viabilnosti) peloda sta znani dve vrsti testov ali tehnik. Prvi temeljijo na razli čnem obarvanju peloda, druga možnost za dokazovanje živosti peloda pa je in vitro kalitev peloda (Adhikari in Campbell, 1998 ter Zottini in sod., 1997).

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Metode barvanja imajo prednost v hitri dolo čitvi viabilnosti peloda. Medtem ko metoda in vitro kalitve poteka malo dalje, je u činkovitejša, saj nam daje direkten vpogled na resnično oprašitveno sposobnost zrelega peloda.

Rodriguez – Riano in Dafni (2000) sta primerjala in opisala novejše postopke obarvanja peloda za dolo čanje viabilnosti peloda na osnovi encimske aktivnosti. Poizkuse sta izvedla na pelodu razli čnih rastlinskih vrst in ugotovila, da se pelodna zrna obarvajo razli čno glede na rastlinsko vrsto.

Zaradi teh ugotovitev sta priporo čala poizkusno obarvanje na predhodno uni čenemu ali pelodu, ki nima sposobnosti kalitve (slika 3), da se ugotovi dejansko obarvanje pelodnega zrna.

Slika 3: Neviabilno pelodno zrno črnega teloha 18

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

2.6 Dolo čanje živosti peloda z barvilom acetokermin

Barvanje z acetokarminom se ve čkrat uporablja kot histološko barvanje v razli čne namene. Za četki uporabe barvanja z acetokarminom segajo že v leto 1921 in jih pripisujejo Bellingu. Preparat za barvanje se pripravi iz kermina, ki ga raztopimo v ocetni ali propinski kislini, nato skuhamo ter prefiltriramo. Tak preparat hranimo v hladilniku na hladnem in v temni stekleni embalaži. Acetokarmin se veže na jedrni DNK ter ga obarva vinskorde če (slika 4). Ugotavljanje viabilnosti peloda z metodo barvanja z acetokerminom je uspešno takrat, ko se pelodno zrno ter jedro obarvata vinsko rde če. V primeru da ostane neobarvano, s tem pa nakazuje neživost oziroma neviabilnost pelodnega zrna.

Slika 4: Primer viabilnega pelodnega zrna črnega teloha obarvanega z acetokerminom

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

3 MATERIAL IN METODE DELA

3.1 Uporabljen rastlinski material

3.1.1 Rastlinski material

Analiza opraševanih odnosov rastline črnega teloha je potekala v naravni populaciji pri kraju Doblatina (slika 5). Populacija je srednje velika in se razprostira na 6 arih površine. Nahaja se na nadmorski višini 600 m. Kraj Doblatina (s koordinatami 46 o11'4,78''N, 15o 16'13,72''E) se leži v ob čini Laško in v zmernem celinskem podnebju osrednje Slovenije.

Slika 5: Na zemljevidu ozna čen kraj Doblatina, kjer je bil izveden poizkus (zemljevid.najdi.si/search_maps.jsp?q=Doblatina&tab=maps)

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Opis rastline

Črni teloh je srednjeevropska gorska rastlina, ki raste v severovzhodnih in južnih Alpah, na Apeninskem ter Balkanskem polotoku (Ravnik, 1969). Teloh lahko gojimo v razli čnih geografskih obmo čjih ter podnebnih tipih.

V Sloveniji je že dolgo poznan, saj obstajajo poleg botani čnega imena črni teloh še številna druga imena. Naštejmo le nekatere: beli teloh, črnoglavec, kihavka, kurica, pastorka, slepice, smrtnica, talog, talovna trava, talovnik, tavh, zavla čni koren, kurja smrt, dragonja, topoglavka, idr. (Praprotnik 1997).

Kot smo že omenili, je črni teloh botani čno ime rastline, ki jo je dobil od barve svoje korenike. V zemlji ima kratko črno koreniko. Steblo rastline je golo in visoko do 30 cm. Listi rastline imajo 25 cm dolge peclje, ki so pogosto od polovice navzgor rde če pikasti in lisasti. Dlanasta listna ploskev je sestavljena iz 7 –9 široko kijastih listnih segmentov, ki so najširši nad sredino lista in se proti dnu zožijo v pecelj (slika 6). Robovi listnih segmentov kažejo nazob čanost le v zgornji tretjini. Nepravilni zobci so precej veliki in podaljšani v naprej obrnjene, le malo bode če konice. Skoraj usnjati listi so zgoraj temno zeleni in ne bleš čeči, spodaj svetlejši.

Cvetni peclji so obi čajnih oblik, ve činoma enako dolgi ali daljši od listnih pecljev, precej mo čni, gladki in spodaj rde če rjavo pikasti. Nosijo od 1 do 3 cvetove. Bledo rumenkasti ali zelenkasto beli krovni listi so ovalni in celorobi. Cvetno odevalo sestavlja pet velikih sepalnih listov, ki so široko jaj časti in se z robovi prekrivajo. Cvetovi so bele do rahlo rožnate barve, po odcvetu postanejo pri sen čnih legah zelenkasti, svetlobi in soncu izpostavljene rastline pa imajo sepalne liste različno intenzivne rde čkaste barve (slika 7). 21

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Slika 6: List črnega teloha

Nektarji so 11 –12 mm dolgi, rumeni, pecljati, cevasti in nekoliko upognjeni ter razlo čno dvousnjati (slika 8). Spodnja ustnja je majhna, pogosto nazob čana, zgoraj pa dolgo jezičasta. Številni prašniki so sprva nagnjeni k nekoliko daljšim vratovom in združeni v glavici. Pozneje se upognejo navzven.

Slika 7: Cveto či cvet črnega teloha 22

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Prašnice so majhne, skoraj okrogle in na vrhu nekoliko izrobljene ter citronsko zelene barve. Pesti čev je 7 –10, njihovi vratovi so nekoliko rde čkasti, brazde pa majhne in nejasno lo čene. Plodni listi so na nekoliko stož častem cvetiš ču ter s trebušastim delom zrasli skoraj do tretjine svoje dolžine. Semena so podolgovata, valjasta, črna in svetle ča (Ravnikar, 1969).

Slika 8: Cveto či cvet z ozna čenimi deli cveta (a- čašni listi, b- prašnik, c- pesti č, d- medovnik (povzeto po www.helleborus.de/engl/botany.htm )

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

3.1.2 Laboratorij

Analizo kalitve in viabilnosti peloda smo izvajali v laboratoriju za genetiko in žlahtnjenje na Fakulteti za kmetijstvo in biosistemske vede.

Za vrednotenje kalitve peloda smo uporabili svetlobni mikroskop DP 10 proizvajalca Olympus (slika 10 a). Pri pripravi semena za kalitev smo uporabljali rastno komoro (slika 10 b), za skladiš čenje peloda smo uporabili hladilnik z zamrzovalnikom (slika 10 c).

A B C

Slika 9: Uporabljena laboratorijska oprema: A-mikroskop Olimpus; B-rasna komora; C-zamrzovalnik in hladilnik

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

3.2 Metode dela

3.2.1 Zasnova poizkusa

3.2.1.1 Analiza oprašitve

V analizo je bilo vklju čenih 50 rastlin. Rastline smo izbirali naklju čno, vendar zelo mlade, zelo stare in necveto če individume nismo vklju čevali. Naklju čno izbrane rastline smo oštevil čili in izolirali (slika 9). Za izolacijo rastlin smo naredili kupole iz žice in folije iz polipropilenskih vlaken (covertan). Rastline smo opraševali v letih 2006 in 2007, v obdobju cvetenja rastlin.

V prvem letu smo analizirali stopnjo samooprašitve. Izbrane rastline smo izolirali v stadiju pojavljanja cvetov. V stadiju za četka cvetenja smo rastline samoopraševali.

Slika 10: Izolirana rastlina s kopreno 25

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Samoopraševanje smo izvajali tako, da smo s prsti pome čkali oziroma nežno med prsti povaljali prašnice ter brazdo pesti ča. Opraševanje smo izvajali štirikrat, in sicer v obdobju od 10. 2. do 20. 2. 2006. Na ta na čin smo omogo čili prenos pelodnih zrn na brazdo pesti ča in s tem povzro čili oploditev cveta. Z namenom, da ne bi prenašali pelodnih zrn iz enega izoliranega cveta na drug cvet, smo si pred vsako novo samooprašitvijo razkužili roke s 70 % etanolom.

Pobiranje semena smo opravili v času, ko so bili dozoreli meši čki tik pred odpiranjem. Cvetove z mnogosemenskimi meši čki smo porezali s cvetnim steblom, jih shranili v papirnate vre čke ter pustili na zra čnem prostoru dva tedna. Po preteklem obdobju smo semena, ki so popadala, očistili ter jih vrednotili. Pred setvijo smo seme stratificirali v navlaženem substratu in jih po pretekli stratifikaciji tudi posejali. Posejali smo jih v plasti čne posodice z luknjami, po posamezni obravnavni rastlini, da smo kasneje lahko vrednotili vznik posejanih semen.

V drugem letu smo tako kot prvo leto obravnavali iste rastline, s tem da so bile drugo leto oprašene z naklju čno nabranim pelodom črnega teloha, ki smo ga s čopi čem nanašali na brazdo pesti ča. Pred nanašanjem peloda smo opravili emaskulacijo, saj s tem prepre čimo samoopraševanje. Ker so bile obravnavane iste rastline tako prvo kot drugo leto, smo lahko primerjali maso in število semen, ki je nastalo kot plod samooprašenih rastlin ter hibridiziranih rastlin.

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Analiza viabilnosti peloda

Za prou čevanje živosti oziroma viabilnosti peloda smo uporabili pelod, ki smo ga nabrali na naklju čno izbranih cvetovih črnega teloha v naravni populaciji Doblatina. Nabran pelod smo raztehtali na 20 g in ga dali v centrifugirke in zavili z alufolijo, da smo prepre čili vstop svetlobe do peloda, ter shranili v zamrzovalnik pri temperaturi -9 oC. Shranjen teloh smo potem v 12-ih terminih (preglednica 3) obdelovali z metodo barvanja peloda z barvilom acetokemin.

Preglednica 3: Termini analize viabilnosti in starost peloda

Termini analize viabilnosti Starost peloda 1. 24. 04. 2006 Svež pelod 2. 03 .05. 2006 9 dni 3. 11. 05. 2006 17 dni 4. 16. 05. 2006 22 dni 5. 24. 05. 2006 30 dni 6. 07 .06. 2006 43 dni 7. 23. 06. 2006 60 dni 8. 05. 07. 2006 72 dni 9. 19. 07. 2006 86 dni 10. 16. 08. 2006 114 dni 11. 19. 09 .2006 148 dni 12. 19. 10. 2006 178 dni

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

3.2.2 Vrednotenje in analiza

Pri analizi opraševalnih odnosov smo ugotavljali stopnjo oploditve samooprašenih in hibridiziranih rastlin z vrednotenjem uspešnosti semenitve rastlin. Semena smo pobrali, preden so popolnoma dozorela.

V prvem letu, ko smo prou čevali stopnjo samooprašnosti rastlin, smo vrednotili število pobranih semen, skupno maso semen, povpre čno maso semen, število vzniklih semen in odstotek kaljivosti.

Pobrana semena smo stratificirali in jih posejali lo čeno po posameznih obravnavanih rastlinah. Po vzniku rastlin smo ugotavljali % kaljivosti semen.

V drugem letu smo pri hibridiziranih rastlinah vrednotili število semen na rastlino in njihovo skupno maso.

Pri analizi vitalnosti peloda smo obravnavali posamezna pelodna zrna v razli čnih časovnih obdobjih. Ko smo na izbranem vzorcu izvedli metodo barvanja z acetokerminom, smo rezultate opazovali pod mikroskopom Olympus. Prešteli smo vsa pelodna zrna, vklju čno s tistimi, ki se niso obarvala, neživa ali neviabilna pelodna zrna. Tako smo dobili delež viabilnih oziroma živih pelodnih zrn.

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Statisti čna analiza podatkov je bila narejena s pomo čjo programa Statgraphics. Za prou čevane lastnosti rastlin so bili izra čunani osnovni statisti čni parametri: mediana, aritmeti čna sredina, standardni odklon, maksimum, minimum, prvi ter tretji kvartil. Pri testiranju primerjav semenitve je bil uporabljen parni test primerjav (Paried semple T- test). Razli čno sposobnost kalitve oziroma živost pelodnih zrn smo analizirali z analizo variance. Razlike med posameznimi obravnavanji so bile testirane s pomo čjo Tukey-evega testa pri 0,05 % tveganju (P ≤ 0,05).

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

4 REZULTATI Z RAZPRAVO

4.1 Analiza samooprašenih rastlin

Pri analizi opraševalnih odnosov smo ugotavljali možnost samooprašitve teloha in semenitev rastlin glede na na čin oprašitve (samooprašnosti ter hibridizacije).

Pri analizi samooprašnosti rastlin je bilo ugotovljeno, da so rastline sposobne samooprašnosti, saj so tvorile semena. V preglednici 4 so prikazane statisti čne vrednosti: aritmeti čna sredina, standardni odklon, maksimalna in minimalna vrednost, prvi in tretji kvartil ter mediana.

Preglednica 4: Statisti čni parametri prou čevanih lastnosti pri samooprašenih rastlinah

Prou čevane Aritmeti čna Standardni Min. Maks. Prvi Mediana Tretji lastnosti sredina odklon kvartil kvartil Št. pobranih semen/ rastlino 46,49 24,38 2 105 30 48 65

Skupna masa semen/ rastlino (mg) 554,72 290,11 36,1 1254,3 321,35 556,9 726,5

Povpre čna masa enega semena (mg) 12,26 3,11 6,96 19,82 9,97 11,43 14,99

Št. vzniklih semen na rastlino 4,39 4,65 0 14 0 3 7,5

% kaljivosti 9,17 9,38 0 37,84 0 7,31 14,63

Min. – minimalna vrednost, Maks. – maksimalna vrednost, N=41

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Obravnavanih je bilo 41 rastlin, na katerih smo opazovali število pobranih semen, skupno maso semen, povpre čno maso enega semena, število vzniklih semen ter odstotek kaljivosti.

Maksimalna povpre čna masa enega semena je bila 19,8 mg, minimalna povpre čna masa pa 6,9 mg. Prvi kvartil je znašal 9,9 mg, tretji kvartil pa 14,9 mg, kar pomeni, da je imelo 25% semen povpre čno maso pod 9,9 mg, ter 75 % povpre čno maso enega semena pod 14,9 mg. Mediana pa je znašala 11,4 mg (slika 11).

20 ,00 0

17 ,50 0

15 ,00 0

12 ,50 0

10 ,00 0 Povprecna težasemen (mg)

7 ,50 0

Slika 11: Povpre čna masa semen

Najmanjša skupna masa semena na rastlino je znašala 36,1 mg, najve čja pa 1254,3 mg. Prvi kvartil je znašal 321,4 mg, kar pomeni da je 25% rastlin imelo skupno maso semen pod 36,1 mg. Tretji kvartil je znašal 726,5 mg, kar pomeni da je 75% rastlin imelo skupno maso semen pod 726,5 mg. Mediana pa je bila 556,9 mg (slika 12).

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

1.2 50 ,0 1 1

1.0 00 ,0

7 5 0,0

5 0 0,0 Skupna teža semen(mg)

2 5 0,0

0 , 0

Slika 12: Skupna masa semen

Število pobranih semen na posamezno rastlino se je gibalo od 2 do 105. Prvi kvartil je znašal 30, tretji kvartil 65, mediano pa predstavlja 48 semen. S slike 13 lahko vidimo, da je imelo 25 % rastlin število pobranih semen pod 30 semen na rastlino, 75 % rastlin pa pod 65 semen na rastlino.

1 2 0

1 0 0

8 0

6 0

Št. Pobranih semen 4 0

2 0

Slika 13: Število pobranih semen 32

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Število vzniklih semen se je gibalo od 0 do 14 semen na rastlino, oziroma najve čji odstotek kaljivosti je znašal 37,8. Prvi kvartil je predstavljal 0, tretji kvartil pa 14, ugotovimo lahko, da 25 % pobranih semen ni kalilo, 75 % pobranih semen pa je imelo kaljivost pod 14 %.

Slika 14: Vznikla semena samooprašenih rastlin črnega teloha

4.2 Primerjava semenitve samooprašenih rastlin in hibridiziranih rastlin

Primerjava semenitve rastlin je bila testirana s parnim testom (paired seample t –test). To je parametri čni statisti čni test, ki ga uporabimo, kadar imamo dva odvisna vzorca. Preizkušamo ni čelno hipotezo, ki pravi, da med aritmeti čnima sredinama skupin v populaciji ni statisti čno zna čilnih razlik.

Pri 1 % stopnji tveganja lahko trdimo, da se povprečna masa semen samooprašenih rastlin statisti čno zna čilno razlikuje od povpre čne mase semen hibridiziranih rastlin (preglednica 5). 33

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Na podlagi t–testa lahko trdimo, da je povpre čna masa enega semena hibridiziranih rastlin ( x = 14,2) statisti čno zna čilno ve čja v primerjavi z maso enega semena pri samooprašenih rastlinah ( x = 11,3).

Preglednica 5: Število, skupna masa semen na rastlino in povpre čna masa enega semena glede na na čin oprašitve

Samooprašene rastline (2006) Hibridizirane rastline (2007) Št. Skupna masa Povprečna Skupna masa Povpre čna Rastlina semen semena (mg) masa (mg) Št. semen semena (mg) masa (mg) 1. 54 638,7 11,8 56 995,0 17,8 2. 37 445,1 12,0 114 174,5 15,3 3. 49 556,9 11,4 88 131,3 14,9 4. 56 717,0 12,1 18 188,0 10,4 5. 8 59,7 7,0 81 919,0 11,3 6. 105 1254,3 12,0 14 272,0 19,4 7. 34 246,5 7,3 59 653,0 11,1 8. 17 186,4 11,0 29 502,0 17,3 9. 11 103,7 9,4 29 321,0 11,1 10. 14 183,2 13,1 18 218,0 12,1 11. 34 674,0 19,8 16 160,0 10,0 12. 66 658,1 10,0 15 215,0 14,3 13. 44 693,6 15,8 21 213,0 10,1 14. 85 100,1 1,2 116 130,5 11,2 15. 54 821,0 15,2 14 264,0 18,9 16. 64 552,6 8,6 45 949,0 21,1 17. 67 944,8 14,1 47 865,0 18,4 18. 16 242,7 15,2 35 321,0 9,1 19. 52 562,0 10,8 45 558,0 12,4 20. 44 396,2 9,0 53 763,0 14,4 21 85 971,6 11,4 57 584,0 10,2 22. 75 736,0 9,8 137 222,0 16,2 23. 14 223,2 15,9 68 103,1 15,2 24. 53 517,0 9,8 63 1214,0 19,3 25. 68 681,3 10,1 74 856,0 11,6 26. 96 956,3 10,0 72 118,8 13,1 27. 53 597,6 11,3 55 953,0 17,3 1 x 11,3a 14,2b 1 aritmeti čna sredina a,b – vrednosti ozna čene z razli čnimi črkami, se med seboj statisti čno zna čilno razlikujejo 34

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Pri posamezno obravnavanih rastlinah smo zabeležili razli čno povpre čno maso semen glede na na čin oprašitve (grafikon 1). Maksimalno število semen na rastlino pri samooprašenih rastlinah je 105, pri hibridiziranih rastlinah pa 137. Minimalno število semen na rastlino pri samooprašenih je 8, pri hibridiziranih rastlinah pa 15.

Pri samooprašenih rastlinah je 7 rastlin imelo višjo povpre čno maso kot pri hibridiziranih rastlinah, in sicer so bile to rastline pod zaporednimi številkami 4, 10, 11, 13, 18, 21, 23. Ostale pa so imele manjšo povpre čno maso semena kot hibridizirane rastline.

Maksimalna povpre čna masa enega ali posameznega semena na rastlino pri samooprašenih je znašala 19,8 mg, pri hibridiziranih rastlinah pa je bila 21,1 mg. Minimalna povpre čna masa enega semena na rastlino pri samooprašenih rastlinah je bila 1,2 mg, pri hibridiziranih rastlinah pa je znašala 9,2 mg.

10 na masa masa semena v na (mg) č 5 Povpre 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Rastlina

samooprašene rastline hibridizirane rastline

Grafikon 1: Povpre čne mase semena samooprašenih in hibridizaranih rastlin 35

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

4.3 Analiza viabilnosti peloda črnega teloha

Statisti čna analiza podatkov je bila narejena s pomo čjo analize variance. Z analizo variance smo ugotovili, da čas skladiš čenja vpliva na delež neživih pelodnih zrn. Razlike, ki so nastale med posameznimi obdobji skladiš čenja, smo testirali s testom mnogoternih primerjav. Vrednosti, ki so ozna čene z razli čnimi črkami, se statisti čno zna čilno razlikujejo pri stopnji tveganja 0,05 % (preglednica 6).

Svež pelod ter 148 in 178 dni skladiš čen pelod je statisti čno zna čilno bolje ohranil živost kot pelod, ki smo ga skladiš čili 9, 22, 30 in 86 dni. Prav tako je pelod, skladiš čen 17, 43, 60, 72 in 114 dni, statisti čno zna čilno bolje ohranil svojo viabilnost kot pelod, star 9 dni.

Iz analize je razvidno, da se viabilnost peloda zelo neenakomerno spreminja glede na čas skladiš čenja in poleg tega izkazuje nizek odstotek neživih pelodnih zrn.

Razloge za to statisti čno zna čilno raznolikost lahko iš čemo v nehomogenosti vzorca. V nabranem pelodu se nahajajo nezrela pelodna zrna, zrela pelodna zrna ali prezrela pelodna zrna. Vzrok za neenakomerno spreminjanje viabilnosti peloda glede na čas skladiš čenja je verjetno v nehomogenem nanosu razli čno zrelih pelodnih zrn na objektno steklo in s tem razli čno obarvanje pelodnih zrn.

Z metodo obarvanja, ki smo jo uporabili za dokazovanje viabilnosti črnega teloha, smo ugotovili, da ta metoda ni dovolj natan čna. Obarvano pelodno zrno ima še vitalnost, vendar še ne pomeni, da je sposobno kalitve. Slabost tehnike barvanja z acetokerminom je slabo razviden prehod med obarvanim in neobarvanim pelodom. 36

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Preglednica 6: Viabilnost peloda glede na termin obdelave

Čas skladiš čenja Št. živih Št. neživih Delež neživih pelodnih (dni) N pelodnih zrn pelodnih zrn zrn

svež 300 300 0 0 a (1) 9 312 296 16 0,058 c

17 247 244 3 0,012 ab

22 168 163 5 0,034 bc 30 320 309 11 0,034 bc

43 448 442 6 0,019 ab

60 220 215 5 0,016 ab

72 376 372 4 0,012 ab

86 293 283 10 0,034 bc 114 311 305 6 0,018 ab

148 372 370 2 0,006 a 178 365 364 1 0,003 a (1) a ,b ,c – vrednosti, ozna čene z razli čnimi črkami, se med seboj statisti čno zna čilno razlikujejo N- število skupno obravnavanih pelodnih zrn

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

5 SKLEPI

Pri prou čevanju na čina opraševanja črnega teloha smo ugotovili, da je črni teloh samooprašna rastlina. Rastline, ki smo jih samooprašili, so tvorile kaljiva semena. Tako smo potrdili navedbe Mathewa, (1989) in Armstronga (2002), da je samooploditev možna, vendar se pojavlja predvsem v kasnejših fazah cvetenja. Rezultati drugih raziskav (Šušek, in Ivan čič, 2006) namre č kažejo, da je črni teloh entomofilna (najpomembnejši opraševalci so insekti, predvsem čebele in muhe) in prevladujo če tujeprašna vrsta.

Pri prou čevanju semenitve samooprašenih in hibridiziranih rastlin smo ugotovili, da je povpre čna masa semena hibridiziranih rastlin ve čja kot povpre čna masa samooprašenih rastlin. Na podlagi ugotovljenega lahko trdimo, da hibridizirane rastline bolje semenijo kot samooprašene.

Preverjanje življenjske sposobnosti oziroma viabilnosti peloda je zelo pomembno za žlahtnjenje. Ugotovili smo, da tehnika barvanja z acetokarminom ni najboljša metoda za dokazovanje viabilnosti peloda črnega teloha. Pri tej metodi prihaja do zelo slabo razvidnega prehoda med obarvanim in neobarvanim pelodom. Izkazalo pa se je, da kljub obarvanosti pelodnega zrna to še ne pomeni, da bo kalilo oziroma, da je sposobno oploditve. Zaradi tega priporo čamo uporabo tehnike, ki temelji na kalitvi pelodnih zrn v in vitro pogojih.

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

6 VIRI IN LITERATURA

Adhikari K. N., Campbell C. G. 1998. In vitro germination and viability of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) pollen. Euphytica, 102: 87–92.

Ahlburg M. S. 1993. Hellebores. B. T. Batasford Ltd. London: 128 str.

Armstrong H. 2002. Patience with Helleborus pays off. Flower TECH, 5/3:8 –11

Bati č F. Razmnoževanje rastlin. Ljubljana

www.bf.uni-lj.si/fileadmin/groups/2711/Gradiva_Batic_Predavanja_Bolonja/ (4. 2. 2010).

Dhooghe E., Van Labeke M. 2007. In vitro propagation of Helleborus species. Plant Cell Tiss Organ Cult, 91: 175 –177.

Goldberg R. B., Beals T. P., Sanders P. M. 1993. Anther development: Basic principles and pratical applications. The Plant Cell, 5: 1217–1229.

Ivan čič A. 2002. Osnove rastlinske hibridizacije. Maribor, Fakulteta za kmetijstvo, 672 str.

Kranj čič B. 1994. Botanika: Razvojna in funkcionalna morfologijo z anatomijo. Maribor, Visoka kmetijska šola: 402 str.

Lemper J. 1985. Christrose: alte Pflanze mit sehr hohem Marktwert. Gartnerborse und Gartenwelt, 30: 1133 –1136.

Lemper J. 1984. Christrosen mit schnellerer Kultur erfologreich. Deutscher Gartenbau, 5: 186 –190.

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Lim,C.C., Kitto, S. L. 1995. Micropropagation of Helleborus orientalis Lam. and Aconitum uncinatum Linn. (Ranunculaceae). Hort seience, 30: 871.

Lisci M., Tanda C., Pacini E. 1994. Pollination ecophysiology of Merculiaris annua L. (Euphorbiaceae ), an anemophylous species flowering all year round. Annals of Botany, 74: 125 –135.

Martin čič A. in sod. 1999. Mala flora Slovenije. Klju č za dolo čanje Praprotnic in semenk. Ljubljana, Tehniška založba Slovenije: 845 str.

Mathew B. 1989. Hellebores. Royal Botanic Gardens Key. Alpine Garden Society, London: 179 str.

Mclewin W. 1996. Colour variations in Helleborus niger . Garden, January: 38 –39.

Mclewin W., Mathew B. 1995. Hellebores . New Plantsman, 2: 112 –122.

McCormick S. 1993. Male gametophyte development. The Plant Cell, 5: 1265–1275.

Nepi M., Franchi G.G., Pacini E. 2001. Pollen hydration status at dispersal: Cytophysiological features and strategies. Protoplasma, 216: 171-180.

Praprotnik N. 1997. Rastlina meseca Januarja. Črni teloh. Proteus, Januar: 229 –230.

Ravnikar V. 1969. Nekaj pripomb k morfologiji in sistematiki skupine Helleborus niger L. s lat. v Sloveniji. Biološki vestnik, 17: 43 –58.

Rice G. 2002. Hellebores.London. Cassell Illustrated Octopus Publishing Group: 96 str.

Rice G., Strangman E. 1993. The gardent's guide to growing Hellebores . Timber Press, Portland, Oregon: 157 str.

Rode J. 2007. Črni teloh rastlina z ve č obrazi. Moj mali svet, 39 (2): 43 –45.

Rodriguez-Riano T., Dafni A. 2000. A new procedure to asses pollen viability. Sex Plant Reproduction, 12: 241–244. 40

Golec Š.: Umetno opraševanje in viabilnost peloda črnega teloha ( Helleborus niger L.). Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2010

Ruppercht H., Miessner E. 1985. Zierpflanzenbau. VEB Deutscher Landwirtschaftsverlag, Berlin.

Seyring M. 2002. In vitro cloning of Helleborus niger . Plant Cell Reports, 20: 895 – 900.

Strgar- Satler B. 2007. Sto trajnic na Slovenskem. Ljubljana. Prešernova družba: 234 str.

Strgar V. 1974. Črni teloh. Naš vrt 9 (2). 14 –16 str.

Sun H., Mclewin W., Fay M.F. 2001. Molecular phylogeny of Helleborus (Ranunculaceae ), with an emphasis on the East Asian- Mediterranean disjunction. Taxon, 50: 1001 –1018.

Šušek A. 2007. Pomembnost in proizvodnja Črnega teloha. Kme čki glas, 64 (9): 10.

Šušek A. 2008. Morphological descriptors of Christmas rose ( Helleborus niger L.). Agricultura 5 (2). 27 –32.

Šušek A., Ivan čič A. 2006. Pollinators of Helleborus niger in Slovenija naturally occurring populations. Acta agriculture Slovenica, 87: 205 –211.

Tamura M. 1993. Ranunculaceae. V: Kubizki K., Rohwer J.G, Bittrich V. (eds.) The families and genera of vascular plants: flowering plants-dicotyledones, 2. Berlin, pp. 563 –583.

Werner K., Ebel F. 1994. Zur lebengeschichte der gattung Helleborus L. ( Ranunculaceae ) Flora, 198: 97 –130.

Zottini M., Mandolino G., Ranalli P. 1997. Effects of γ-ray treatment on Cannabis sativa pollen viability. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 47: 189–194.

ZAHVALA

Doc. dr. Andreju Šušku se iskreno zahvaljujem za vso pomo č, nasvete ter spodbudno besedo pri izdelavi diplomskega dela.

Zahvala velja tudi moji družini ter prijateljem, ki so mi na kakršen koli na čin pomagali uresni čiti eno izmed mojih želja.

Hvala!