REPUBLIQUE DE CÔTE D'IVOIRE

Union-Discipline-Travail · Année Universitaire 2016-2017 Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

L1NIVt-HSITH NANGUIABROGOUA

UFR des Sciences de la Nature

MEMOIRE DE MASTER 2 DE GENETIQUE ET AMELIORATION DES BIORESSOURCES

OPTION : VEGETALE

THEME: Structure génétique de cinq populations du genre () inventoriées en Côte d'Ivoire

Présenté par MOBIO Anouman Désirée Sandrine

Soutenu publiquement le _g ./03/2017 devant le jury composé de: Mme ADEPO GOURENE Béatrice, Professeur Titulaire, UNA : Président

M. SIE Raoul Sylvère, Maître de Conférences, UNA : Superviseur Scientifique

Mme BLEYERE Léonie Clémence, Maitre-Assistant, UNA : Encadreur

M. KO FFI Kouamé Kevin, Maitre-Assistant, UNA : Examinateur TABLE DES MATIERES

DEDICACE iii REMERCIEMENTS iv

LISTE DES FIGURES··············································································································· V LISTE DES TABLEAUX vi LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS vii RESUME viii ABSTRACT ix INTRODUCTION 1 CHAPITRE 1. REVUE BIBLIOGRAPIDQUE 3 1.1. Présentation du genre Lophira 3

1.1.1. Position systématique 3 1.1.2. Origine et aire de distribution 3 1.1.3. Botanique et morphologie 4 1.1.4. Distribution écologique 6 1.1.5. Importance socio-économique du genre Lophira 6 1.1.6. Ressources génétiques du genre Lophira 7 1.2. Diversité génétique 7

1.2.1. Diversité génétique intrapopulation 7 1.2.1.1. Indices de polymorphisme 7 1.2.2. Diversité génétique interpopulation 9 1.2.2.1. Distance génétique 10 1.2.2.2. Indice de diversité génétique de Nei 10 1.2.2.3. F-statistiques de Wright 11 1.22.4. Flux géniques 12 CHAPITRE 2. MATERIEL ET METHODES 14 2.1. Site d'étude 14

2.2. Matériel 16

2.2.1. Matériel végétal 16 2.2.2. Materiel technique 17 2.3. Méthodes 17

2.3.1. Extraction de l'ADN 17 2.3.2. Microsate11ites nucléaires testés 17 2.3.3. Analyse des données 18 Chapitre 3. RESULTATS ET DISCUSSION 20 3.1. Résultats 20

3.1.1. Diversité génétique intra population 20 3.1.1.1. Nombre d'allèles et nombre des individus analysés 20 3.1.1.3. Coefficient de consanguinité (Fis) et la diversité de shannon ( /) 22 3 .1.2. Diversité génétique interpopulation 24 3 .1.2.1. Structuration génétique 24 3.1.2.2. Répartition de la différenciation génétique 25 3 .1.2.2.1. Répartition de la différenciation au niveau des espèces 25 3 .1.2.2.2. Répartition de la différenciation au niveau des populations 26 3 .1.2.3. Isolement par la distance 27 3.2. Discussion 29

CONCLUSION ET PESPERTIVES 32 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 33 ANNEXES !

li DEDICACE

Je dédie ce mémoire : À mon père adoptif Feu AHOUO Danho et à mon géniteur Feu MOBIO Mathias trop tôt disparus ainsi qu'à ma mère DANHO Badjo qui a tout mis en œuvre pour mon éducation.

111 REMERCIEMENTS

Ce document qui est un mémoire en vue d'obtenir le diplôme de Master à l'Université Nangui Abrogoua m'offre l'occasion d'adresser un mot de remerciement à chacune des personnes qui ont contribué à la réalisation de ce document. Mes remerciements s'adressent, en premier lieu, Olivier J. HARDY Chercheur, de l'Université Libre de Bruxelles, aux autorités de l'Université Nangui Abrogoua, à l'UFR Sciences de la Nature, au pôle de recherche production végétale et à l'unité de phytotechnie et d'amélioration génétique, aux responsables de la filière Génétique et Amélioration des Bioressources pour m'avoir donné l'opportunité de faire ce Master. Ce mémoire a bénéficié d'un travail scientifique auprès du Professeur SIE Raoul Sylvére. Merci infiniment professeur de la supervision. Mes remerciements sont adressés egalement à mes encadreurs, que sont : Dr KOUONON Léonie Clémence, qui a accepté de m'encadrer et surtout pour la confiance qu'elle a placée en ma modeste personne; au Dr KOFFI Kouamé Guillaume, pour ses différents conseils et surtout son encouragement à la réussite de ce travail. Mes remerciements vont aussi à l'endroit des Docteurs BONNY Beket Séverin, KO FFI Kouamé Kevin pour leurs conseils avisés et leur disponibilité. Toute mes remerciement les plus distingués au membre du jury. Je tiens à remercier mes aînés Mme GOBA Alice, Mr AMANGOUA Ferdinand, Mlle AN GUI Michelle, Mlle GBOTIO Ahou Anique pour leurs conseils et leurs soutiens à la rédaction de ce mémoire. À ma famille, je voudrais traduire toute ma gratitude et remercier Aké Fidèle et Aké Michelle pour leur soutien lors des moments difficiles; mes frères et sœurs pour l'intérêt qu'ils ont accordé à ce travail. Je remercie particulairement mon fiancié, TOURE Sekou Domain dont la disponibilité et les efforts ont été pour moi une source de motivation. En outre, mes remerciements vont également à l'endroit de tous les étudiants de Génétique et d' Amélioration des Bioressources, en particulier KODAK.OU Marcellin, DIOMANDE Issoumaïla, ATCHI Yves Mathurin pour leur participation dans la réalisation de ce travail. J'exprime aussi ma reconnaissance à tous ceux qui de près ou de loin ont participé à la réalisation de mes travaux.

iv LISTE DES FIGURES

Figure 1. Aires naturelles de répartition de L. alata et de L. lanceolata 3 Figure 2. Fût cylindrique de L. alata et arbre entier de L. lanceolata 4 Figure 3. Jeunes avec feuilles rougeâtres au sommet de L. alata (A) et de L. lanceola .. 5 Figure 4 . Fleur de L. alata (A); Fleur de L. lanceolata (B) 5 Figure 5. Localisation des zones de collectes des individus échantillonnés 15 L'analyse de la structure de la population a permis de regrouper les individus en deux principaux groupes génétiques. Le groupe 1, en rouge, correspond à l'espèce L. alata. Le groupe 2, en vert, correspond à l'espèce L. lanceoata 24

V LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Liste des espèces, localités, coordonnés géographiques et le nombre d'individu par site 16 Tableau 2. Paramètres de diversité génétique: nombre d'allèles A, les nombres entre parenthèse indiquent respectivement le nombre d'allèles et la richesse allélique ÂR propres à chaque locus 21 Tableau 3. Paramètres d'hétérozygotie attendue (He), Hétérozygotie observée (Ho), Diversité allélique corrélée au nombre d'individus 22 Tableau 4. Paramètres de diversité de Shannon (1) et le coefficient de consanguinité Fis 23 Tableau 5. Analyse de la variance moléculaire (AMOV A) testant la différenciation génétique de 287 individus du genre Lophira 26 Tableau 6. Matrice de comparaison des Fst entre populations Lophira pour tous les locus .. 27 Tableau 7. Protocole d'extraction de l'ADN le kit NucleoSpin 96 II (Macherey-Nagel, Düren, Germany) I

vi LISTE DES SIGLES ET ABREVIATIONS SIGLES CNRA : Centre National de Recherche Agronomique IDEFOR : Institut de recherche agronomique en zone de Forêt IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources SODEFOR : Société de Développement des Forêts SOFRECO : Société Française dans le Conseil et l'assistance technique au développement économique et social durable

ABREVIATIONS ADN : Acide Désoyribonucléïque AMOVA : Analyse de la Variance Moléculaire PCR : Polymerase Chain Reaction SSR : Simple Sequence Repeats ANOVA : Analyse de la Variance Fst : Mesure le taux de différenciation génétique entre les sous populations HEW : Equilibre de Hardy UFR : Unité de Formation et de Recherche A : Nombre d'allèles AR : Richesse allélique Ho : Hétérozygoties observées He : Hétérozygoties attendues Fis : Coefficient de consanguinité I : Diversité de shannon

vu RESUME

Cette étude s'est intéressée à l'analyse de la structure génétique entre les deux espèces qui composent le genre à travers cinq populations (Parc National du Banco, forêt classée de Yapo Abbé, Djaha sakassou, Kongouanou, Foro-foro) issues de la Côte d'Ivoire. Dix marqueurs microsatellites ont été utilisés pour génotyper 287 individus. Au total, 92 allèles ont été détectés dans les dix locus par population. Le nombre d'allèles dans l'ensemble des populations varie de 2 à 10 avec une moyenne totale de 4,754 allèles. Le taux d'hétérozygotie observée par population est de 0,289 ± 0,222 pour Banco à 0,331 ± 0,200 pour Yapo-Abbé. Ces valeurs sont inférieures à celle de l'hétérozygotie attendue allant de 0,370 ± 0,249 pour Banco à 0,437 ± 0,190 pour Djaha Sakassou. La moyenne générale du coefficient de consanguinité est de 0,654. La valeur Fst issue de l'analyse de la variance moléculaire (AMOVA) entre espèces est de 0, 552. Ces valeurs sont significativement différentes de zéro (p < 0,05) et suggèrent une forte différentiation. Ces résultats montrent que les marqueurs microsatellites qui sont co-dominants et polymorphes sont un bon outil pour la caractérisation des deux espèces congénères. Cette étude a permis de comprendre la structure génétique des individus du genre Lophira utilisés pour la présente étude. Elle indique que les espèces étudiées ont une diversité génétique satisfaisante qui peut être utilisée comme base pour aménager des programmes de conservation in situ et pour la mise en place de stratégies d'échantillonnage utile à la régénération des individus et au développement durable des espèces. Mots-clés: diversité génétique, Lophira, microsatellites, population et structure génétique.

Vlll ABSTRACT

Our study is based on the analysis of genetic structure of two species that provided from Lophira genus through five areas (National Park of Banco, classified ofYapo Abbé, Djaha sakassou, Kongouanou and Foro-foro) of Côte d'Ivoire. To do the work ten microsatellite markers are used in to identify 287 . We got 92 alleles among ten locus per area. The number of alleles varies from 2 to 10 with an average of 4,764 alleles. The rate of observed heterozygoty per area extended from 0,289 ± 0,222 about Banco forest, from 0,331± 0,200 about Yapo-Abbé forest. These values are lower than the expected heterozygoty which going from 0,370 ± 0,249 about Banco forest to 0,437 ± 0, 190 about Djaha Sakassou forest. The general average of the inbreeding coefficient is 0,654. The value Fst exit of the analysis of the molecular variance (AMOV A) between species is 0, 552. These values are significantly different from zero (p < 0, 05) and suggest a differentiation. These preliminary results show that co-dominant and polymorphie microsatellites molecular markers are a promising tool for the characterization of the close species. This study made possible the understanding of Lophira's genetic structure which is composed of its individual's collection. It indicates that the studied species have a satisfactory genetic diversity which can be used as basis to arrange programs of conservation in situ and the installation of useful sampling strategies for the regeneration and the constant development of the species. Keyword: genetic diversity, genetic structure, Lophira, population, and microsatellites

IX INTRODUCTION

Les études floristiques en Côte d'Ivoire conduites par Aké Assi (1963, 1976, 1984, 2001, 2002) ont estimé qu'il existe près de 3853 espèces vasculaires reparties entre la forêt et la savane. Ce réservoir de ressources génétiques forestières est menacé par une série de facteurs humains et naturels (défrichement, feux de brousse, surpâturage, exploitation agricole, sécheresse, etc.) dont les effets restreignent de plus en plus le champ de possibilités pour les générations actuelles et futures (Eyog et al., 2006). En effet, la destruction des écosystèmes forestiers s'accélère sous l'effet conjugué de la pression démographique, l'augmentation de la pauvreté et de l'action prédatrice d'importants groupes industriels en quête permanente de bois (Eyog et al., 2006). Ainsi, la couverture forestière du pays est passée de] 6 millions d'hectares au début du xx.e siècle à 2.7 millions d'hectares en 2005 avec une accélération de la déforestation lors des 50 dernières années. Le taux annuel de déforestation a été évalué à 3,5% sur la période 1980 à 2008 (SOFRECO, 2009). Pour faire face à cette menace écologique et pour toujours répondre aux besoins socio• économiques liés à la forêt, certaines essences ont fait l'objet de recherches scientifiques par le Centre National de Recherche Agronomique (CNRA), la Société de Developement des Forêt (SODEFOR), et l'Institut de Recherche Agronomique en zone de Forêt (IDEFOR) en vue d'une meilleure connaissance et de l'amélioration de leurs ressources génétiques (Ouattara, 2001). C'est le cas pour le Teck (Tectona grandis) (Forest & Kim Star) (Maitre, 1983 ; Dupuy & Verhaegen. 1993; Dupuy et al., 1999), le Fraké (Terminalia superba) (Engl & Diels) (Dupuy, 1988), le Frarniré tTerminalia ivorensis) (hul A. Chev.) (Dupuy et al., 1989), l'acajou amer (Cedrela odorata L.) et le Samba (Triplochiton scleroxylon) (K. Schum.) (Dupuy et al., 1988). De la fa rnille des Ochnaceae, le genre Lophira, constitué de deux: espèces à savoir L. alata (azobé) qui a pour habitat les forêts tropicales et L. lanceo/ata (azobé de savane) qui pousse en zone de savane (Hutchinson et al., 1954) n'a pas fait partie des programmes de recherches en dépit de ses multiples usages. Ces arbres sont prisés de manière générale pour la résistance de leur bois (Doumenge & Séné, 2012; Mapongrnetsem, 2007; Biwolé et al., 2012) utilisé dans les installations et les travaux lourds tels que les ouvrages portuaires, les constructions hydrauliques, et les ponts. Ils sont aussi utilisés comme bois d'œuvre dans le domaine de l'habitat pour la fabrication de seuils, de cages d'escaliers, de maisons à ossature en bois et à la fabrication de parquets. Ils sont egalement utilisés en pharmacopée pour la guérison de divers maux. Par ailleurs, L. a/ata et L. Lanceolata fournissent del 'huile comestible (Nonviho, 2015). Mais L. Lanceo/ata se démarque par l'abondance de son huile appelée (huile

1 de Méné) qui est prisée dans le domaine de la cosmétique et de la médecine (Doumenge & Séné, 2012). Au regard de leurs divers usages, ces deux espèces revêtent une importance indéniable au plan socio-économique pour les populations et les industriels. Le manque d'information et de données génétiques sur leur population demeure un souci majeur pour la conservation des ressources génétiques de ces deux espèces. Néanmoins, des études préalables sur le genre Lophira ont porté sur la caractérisation morphologique et ont permis de révéler des différences morphologiques entre ces deux espèces (Chevalier, 1909; Biwolé et al., 2012 ; Goba, 2014). En outre des marqueurs microsatellites du genre Lophira ont été développés (Pifieiro et al., 2015). Les marqueurs morphologiques mettent en évidence l'aspect botanique des espèces et même si pour ce faire cela obéit à une démarche scientifique ils ne sont pas suffisants pour décrire de manière efficace la diversité des populations (Roux, 1987). Pour pallier cette insuffisance, les marqueurs moléculaires, plus précisément les marqueurs microsateUites se présentent comme d'excellents outils génétiques capables d'analyser avec précision des espèces du même genre (Santoni et al., 2000). De ce fait, l'étude de la caractérisation moléculaire des deux espèces du genre Lophira s'avère nécessaire. En effet, cette étude servira de bases pour la mise en place de stratégies de gestion des ressources phytogénétique qui prennent en compte la conservation et la régénération. La présente étude a pour objectif de caractériser la diversité génétique des espèces du genre Lophira par l'utilisation de marqueurs de type SSR afin d'évaluer la diversité génétique au sein de cinq populations de Lophira. De manière spécifique, il s'agira de : Déterminer la diversité génétique intra et inter population de L. alata et L. lanceolata Déterminer la structure génétique des deux espèces du genre Lophira présents en Côte d'Ivoire. Le travail est subdivisé en trois chapitres. Après l'introduction, le premier chapitre est consacré à la revue bibliographique. Au deuxième chapitre le matériel d'étude et la méthodologie de travail employée ont été décrits. Les résultats des expériences sont présentés et discutés dans le troisième chapitre. Le travail se termine par une conclusion suivie des perspectives et des références bibliographiques.

2 CHAPITRE 1. REVUE BIBLIOGRAPIDQUE

1.1. Présentation du genre Lophira 1.1.1. Position systématique Deux espèces sont distinguées dans le genre Lophira : , l'espèce de forêt et , l'espèce de savane (Chevalier, 1909). Le genre Lophira fait partie de la tribu des Ochneae, de la sous famille des Ochnoideae qui appartient à la famille des Ochnaceae et à l'ordre des selon la classification phylogénique. Cependant, pour Letouzey (1968), L. alata serait une adaptation écologique de L. Zanceolata en forêt dense humide qui s'est propagé par les activités anthropiques.

1.1.2. Origine et aire de distribution Les travaux menés par Biwolé et al. (2012) montrent que L. alata a une aire de distribution guinéo-congolaise. Sa répartition part de la forêt centrale du Congo au jusqu'en (Bamps, 1967; Anon, 1976; Doucet, 2003). Il se rencontre aussi sur Jes pentes de montagne et dans les terrains marécageux (Aubréville, 1959; Bamps, 1970; White & Abemethy, 1996). L. lanceolata (faux karité) est un arbre de savane. Il est largement réparti dans la zone de savane soudano-guinéenne depuis le Sénégal (Casamance), en passant par Ja Centrafrique et l'extrême nord de Ja République Démocratique du Congo, jusqu'à ]'Ouganda (Yonkeu et al,. 1998).

• Lophira alata • Lophira lanceolata

Figure 1. Aires naturelles de répartition de L. alata et de L. lanceolat (Chevillette et al., 2009).

3 1.1.3. Botanique et morphologie Le genre Lophira, qui se limite à l'Afrique tropicale, comprend deux espèces dont l'aire de répartition est distincte d'un point de vue écologique. L. alata est un grand arbre à port dressé (Figure 2A) caractéristique de la forêt pluviale sempervirente guinéo-congolaise (Doumenge & Séné, 2012) qui fournit un bois bien connu, l'azobé. L. lanceolata est quand à lui un petit arbre (Figure 2B) limité à la savane soudano-guinéenne, mais que l'on trouve aussi à des altitudes plus élevées de 1200-1600m. Dans la zone de transition entre la forêt et la savane; les deux espèces présentent des caractéristiques végétatives très similaires (Dournenge & Séné, 2012). Mais l'espèce L. lanceolata a souvent des feuilles relativement plus étroites avec un pétiole plus long et des fruits légèrement plus grands même au stade juvénile (Figure 3). Elles sont souvent confondues par les fleurs (Figure 4) et cette confusion est perceptible par leur port. L. lanceolata est parfois confondu avec Vitellaria paradoxa C/F. Gaertn qui est le karité lorsqu'il n'est pas en fleur. Les feuilles de ce dernier exsudent du latex quand elles sont blessées (Mapongmetsem, 2007). Le nombre chromosomique du L. alata est de 2n = 28 (Satabié, 1991) et celui du L. lanceolata est de 2n = 24 (Mapongmetsem, 2007).

Figure 2. Fût cylindrique de L. alata et arbre entier de L. lanceolata (Biwolé et al., 2012; Goba, 2014)

4 Figure 3. Jeunes plants avec feuilles rougeâtres au sommet de L. alata (A) et de L. lanceolata (B) (Goba, 2014)

Figure 4. Fleur de L. alata (A); Fleur de L. lanceolata (B) (Stévart, 2012; Goba, 2014)

5 1.1.4. Distribution écologique L. lanceolata est un arbre de la savane arborée, il se rencontre à 1500 m d'altitude. Il pousse souvent en peuplements grégaires sur les jachères en lisière de forêt. Il se trouve sur des sols moyennement lourds et sableux ou graveleux (Arbonnier, 2000). Une fois installé, il est tolérant au feu, mais sa régénération souffre de feux de brousse répétés (Mapongmetsem, 2007). L. alata est caractéristique de la forêt dense humide sempervirente de basse altitude mais il arrive qu'il se trouve jusqu'à 1000 m d'altitude, par exemple au Cameroun. Cette espèce est abondante dans les bassins versants sédimentaires en bordure de la côte africaine. Il se trouve aussi dans les mangroves ou en lisière de marais (Letouzey, 1957 et 1979). En Afrique de l'Ouest, l'abondance de L. alata est étroitement liée à la pluviométrie atteignant un chiffre optimum de 2600 mm par an. Il est adapté à plusieurs types de sols, entre autres les sols sableux, les sols sablo-argileux, les sols graveleux et ferralitique. Cependant L.alata semble préférer les sols sablo-argileux ayant une nappe phréatique relativement peu profonde (Anonyme, 1954 ; Aubréville, 1959; Letouzey, 1957 et 1979). Les jeunes individus sont très sensibles à la concurrence, même dans le recru forestier, où d'autres espèces telles que les grandes plantes herbacées, les arbustes, les lianes et les arbres comme Musanga cecropioides et pycnanthus angolensis sont souvent agressives. Il semblerait que la régénération de L. alata nécessite de la lumière et l'absence presque totale de concurrence au cours des stades de semis et de très jeunes plants (Letouzey, 1957). Les arbres résistent assez bien au feu pourvu que les dégâts se limitent à un seul côté.

1.1.5. Importance socio-économique du genre Lophira L. alata et L. lanceolata sont des arbres à usage multiple en Afrique et qui dans l'ensemble présentent des traits communs dans leurs utilisations. L alata, recherché pour la résistance de son bois, est apprécié en construction lourde pour des situations extrêmes. C'est par exemple le cas pour les travaux hydrauliques, les ponts, les traversées de chemin de fer. L. lanceolata est utilisé pour la fabrication de mortier et de charbon de bois (Biwolé et al.; 2012). Leur bois servant de bois d'œuvre dans plusieurs domaines, les feuilles, les écorces et les racines des deux espèces sont des excellents remèdes pour le traitement de la désintoxication, du diabète (Malgras, 1992; Diallo et al., 2012; Sanogo et al., 2013). Enfin les graines des deux espèces fournissent de l'huile comestible utilisée dans la fabrication de savon qui a des propriétés médicales (Miranda et al., 2012; Konan et al., 2003)

6 1.1.6. Ressources génétiques du genre Lophira L. lanceolata n'est pas menacé d'érosion génétique du fait de sa large répartition. Alors que le L. alata est un arbre qui connait une exploitation très importante dans son aire de répartition (Mapongmetsem, 2007). L'UlCN le classe comme étant vulnérable (Russell et al., 20 l 0). L'exemple des peuplements de presque toute la région côtière du Cameroun est édifiant. En effet, ils se sont considérablement dégradés ou ont disparu complètement sous l'effet des activités humaines (production de culture vivrières et industrielles, exploitation sylvicole, construction de routes, urbanisation). Désormais, si l'espèce est en partie protégée dans un certain nombre de zones de conservation, ces mesures ne suffisent pas à garantir que sa régénération dans les zones exploitées puisse répondre à la demande future. En outre, il n'y a pas d'estimation sur l'impact de l'exploitation systématique des meilleurs arbres sur la diversité génétique. li se peut qu'elle ait donné lieu à une contre sélection génétique, puisque parmi les arbres semenciers qui subsistent, il ne reste que les arbres les plus mal formés. 1.2. Diversité génétique La diversité génétique est la différenciation qui existe au niveau des gènes d'un individu, d'une population, d'une espèce ou d'une communauté (Ouminil, 2006). L'analyse de cette différenciation génétique est un préalable à tout programme de conservation et de gestion des ressources génétiques d'une espèce (Zorn Bi, 1999). Pour réussir cette analyse, Ouminil (2006) suggère la mesure des caractères morphologiques et métriques sur le terrain, ou l'étude des marqueurs moléculaires en laboratoire. Pour ce qui concerne les travaux sur le genre lophira en Côte d'Ivoire, il faut noter que ceux-ci se résument en des travaux préliminaires sur les caractères morphologiques de L. alata et de L. lanceolata. Ces travaux ont montré qu'il existe une différence morphologique entre les deux espèces. Ainsi donc, le couple d'espèces, L. alata et de L. lanceolata, n'a été soumis à aucune étude de caractérisation moléculaire en Côte d'Ivoire. 1.2.J. Diversité génétique intrapopulation Plusieurs paramètres servent à décrire les variations de la diversité génétique intra ou interpopulation. Ces paramètres sont généralement estimés à partir des fréquences alléliques et génotypiques qui sont, eux-mêmes, calculées sur la base des individus hétérozygotes et homozygotes (Nei, 1987). Pour les marqueurs co-dorninants qui permettent de faire la différence entre les homozygotes et les hétérozygotes, ces calculs paraissent moins complexes.

1.2.1.1. Indices de polymorphisme Selon Berg et Hamrick (1997), les fréquences alléliques ne sont pas des indices de diversité génétique en génétique des populations. En termes de variabilité génétique intra

7 population, la comparaison directe des fréquences alléliques n'est pas facile à réaliser. Toutefois, il existe des paramètres susceptibles de synthétiser, moyennant une valeur globale, les informations les plus importantes (Mohamed et al., 2010) pour la description de la constitution génétique des populations.

• Pourcentage de locus polymorphes (P)

C'est le pourcentage de loci polymorphes dans l'échantillon étudié. La probabilité d'observer au moins deux allèles à un même locus dépend des fréquences respectives des allèles et aussi de la taille de l'échantillon. Dans le présent travail, un locus est considéré polymorphe dans le cas où l'allèle Je plus fréquent a une fréquence inférieure ou égale à 0,95 (Mohamed et al., 2010).

• Nombre moyen d'allèles par locus ou richesse allélique (A).

La richesse allèlique d'une population est calculée selon la formule : l A=½ La (1) i=l où a représente le nombre d'allèles à un locus et l le nombre de locus étudiés.

• Hétérozygotie moyenne observée (Ho)

C'est la proportion d'individus hétérozygotes au locus K comme dans la formule:

ak Hok = L Pij (i * j) (2) i.j=L où Pij est l'estimation de la fréquence du génotype ij au locus k et ak le nombre d'allèles au locus k.

8 Si on considère un locus, le taux d'hétérozygote observé (Ho) est la moyenne de (HoK) suivant l'équation:

l Ho = i I Hok (3) k=1 • Hétérozygotie attendue ou diversité génique de Nei (He) Un taux d'hétérozygotie attendu (He) peut être calculé, sous l'hypothèse d'équilibre de Hardy• Weinberg, à partir des fréquences alléliques déterminées pour chaque locus à l'aide de la formule: HE=l-Ipf (4) où Pi est la fréquence du ième allèle à ce locus. Le taux moyen d'hétérozygotie est l'indice le plus satisfaisant de la diversité génétique. Sa valeur numérique dépend du nombre de loci polymorphes et de la structure génotypique de chacun d'eux.

• Indice de Fixation Fis. L'association de deux gamètes dans une population d'individus diploïdes pour former les individus se fait au hasard par rapport aux génotypes de ces gamètes. La structure génétique de cette population est appelée structure de Hardy-Weinberg. L'indice de fixation est l'écart à la structure de Hardy- Weinberg et varie de -1 à + 1. Il permet de connaitre le déficit en hétérozygotes par population, par locus et pour l'ensemble des locus. Fest positif quand la population présente un déficit en hétérozygotes par rapport à l'équilibre panmictique et négatif dans le cas contraire. Un certain nombre de facteurs contribuent à cet écart: consanguinité, dérive, sélection, différenciation,mutation. Ce paramètre mesure l'écart entre hétérozygote observé (Ho) et le taux d'hétérozygote attendu (He) de la population d'individus. TI est aussi appelé l'écart à la panmixie et se calcule comme mentionné dans la formule suivante:

F = 1- Ha (5) He

1.2.2. Diversité génétique interpopulation L'établissement de la structure génétique d'une population consiste à déterminer le nombre de groupes génétiques différents au sein de cette population, les individus composants chacun de ces groupes et éventuellement les individus ayant des origines dans plusieurs groupes (Adrien, 2013). Dans le cadre de cette étude les paramètres suivants seront analysés : les F• statistiques de wright et les flux géniques.

9 1.2.2.1. Distance génétique

Les distances génétiques entre paires de populations ont été calculées selon l'approche classique basée sur les fréquences alléliques dans chaque population en retenant la distance de Nei (1978). Cette distance présente des propriétés spécifiques et reste appropriée pour un modèle particulier d'évolution. Elle considère un modèle mutation-dérive et elle est destinée à mesurer le nombre moyen de différences de codons entre populations après leur divergence. Cette distance est la plus utilisée dans les recherches sur la diversité génétique

1.2.2.2. Indice de diversité génétique de Nei

Dans une population subdivisée, il existe trois niveaux de complexité : les individus (I), les sous-populations (S) et la population totale (T). Dans ce travail, les populations relatives aux régions représentent les sous-populations et l'ensemble des populations représente la population globale. Pour mesurer l'organisation de la diversité génétique dans une population, Wright (1978) a défini l'hétérozygotie de chacun de ces trois niveaux respectivement par les paramètres suivants : H1, Hs et HT. Le premier paramètre H1 correspond à l'hétérozygotie moyenne des individus sur l'ensemble des sous-populations. Il représente également l'hétérozygotie moyenne observée pour l'ensemble des gènes (ou locus) d'un individu. C'est aussi la probabilité d'hétérozygotie en un locus pris au hasard. Ainsi, si H1 est l'hétérozygotie observée dans la ième sous-population, on aura, pour X sous-populations, la formule :

H1 = }JHi (6) X Le second paramètre Hs indique l'hétérozygotie attendue par individu pour chaque sous- population en la supposant à l'équilibre Hardy Weinberg. Il représente aussi l'hétérozygotie attendue dans une sous-population supposée à l'équilibre Hardy-Weinberg où Pi est la fréquence du r= allèle. Soit pour la sème (14)

n, = 1- L~Pfs- (7)

10 On notera H s la moyenne des Hs sur les X sous-populations :

Hr = 1- f" } H5/X. (8)

Enfin, le dernier paramètre HT représente I'hétérozygotie attendue par individu, en supposant la population globale à l'équilibre Hardy- Weinberg. En d'autres termes, c'est l 'hétérozygotie attendue si toutes les sous-populations étaient regroupées en une seule unité panmictique. Si l'on note pi* la fréquence moyenne de l'allèle Ai sur l'ensemble des X sous• populations, on obtient : Hr = 1 L~ pi 2 (9)

1.2.2.3. F-statistiques de Wright Trois indices sont générés à partir des hétérozygoties : Fis, FsT et FIT. Ces derniers mesurent l'écart de l'hétérozygotie par rapport à l'équilibre Hardy-Weinberg (EHW) à différents niveaux. Le premier indice Frs est défini par la relation:

F = HS-Hi (10) JS HS Cet indice, appelé coefficient de consanguinité, mesure la réduction éventuelle de l'hétérozygotie des individus à l'intérieur de leur sous-population. En cas de consanguinité, cet indice est positif et indique un déficit en hétérozygotie. Évidemment, il prend la valeur zéro si les sous-populations sont à l'EHW. En revanche, s'il est négatif, les populations présentent un excès d'hétérozygotie. Entre les sous-populations et la population totale, l'effet de la subdivision est exprimé par un indice similaire :

Hr-HS Fsr=-;;:;- (11)

Ce paramètre, appelé indice de fixation, correspond à la réduction de l'hétérozygotie dans les sous-populations liée aux différences de fréquences alléliques moyennes. Cet indice renseigne sur la différenciation et l'effet de subdivision des populations. Il prend la valeur zéro lorsque toutes les sous-populations ont les mêmes fréquences alléliques et sont à l'EHW. Dans le cas contraire, l'effet Wahlund implique que HT soit plus grand que Hs* et donc FsT sera positif. Enfin, la réduction de l'bétérozygotie entre l'individu et la population globale théorique est donnée par la formule :

F1r = Hr-Hi (12) Hr Ces trois indices sont liés par la relation

11 Si toutes les sous-populations sont en EHW, on aura Fis= 0 et par conséquent FsT = FrT. Par ailleurs, si elles sont toutes en l'EHW et ont les mêmes fréquences alléliques, alors les trois indices seraient nuls. Dans ce cas, la division en sous-populations n'existe plus et la population globale est en l'EHW. Ainsi, l'indice de fixation FsT permet de mesurer le degré de diversification génétique entre les populations. Les paramètres FrT, Fis et FsT désignent respectivement les indices de fixation d'un individu de la population, d'un individu d'une sous• population. Les indices Frr et Fis déterminent la corrélation entre les gamètes d'un même individu tiré au hasard dans une sous-population et dans la population totale respectivement. Fis permet de mesurer le déficit local moyen d'hétérozygotes par rapport à la structure de Hardy-Weinberg. FrT permet de mesurer le déficit global d'hétérozygotes dans l'ensemble de la population. Alors que FsT représente la corrélation entre deux gamètes tirées au hasard dans deux sous-populations différentes et renseigne sur le niveau de différenciation ou sur l'individualisation des sous-populations. déficit connu sous le nom de « effet de Wahlund », 0 '.S FsT '.S 1 (Nei, 1973).

1.2.2.4. Flux géniques Les flux de gènes jouent un rôle majeur dans l'organisation de la diversité génétique à différentes échelles spatiales (individu, population, sous-espèce). Les flux de gènes représentent un facteur évolutif majeur, au même titre que la sélection, la dérive génétique ou la mutation (Ronfort et al., 2005). La différenciation génétique entre populations est favorisée par la dérive et limitée par les flux génétiques entre les populations (Ronfort et al., 2005). Le nombre de migrants effectifs par génération (Nœ) est lié à la différenciation génétique FsT par la relation :

N = (1-Fsr) (14) m 4Fsr La structuration génétique au sein d'un ensemble de population a d'abord été décrite par les statistiques F de wright (1960) au niveau allélique. EJJe a été généralisée au niveau d'un locus puis d'un ensemble de locus par Nei (1973, 1977). Le coefficient de différenciation génétique entre population (GsT) est défini de manière suivante au niveau d'un locus Hs GcsT) 1 - - (15) = HT où Hs est la moyenne (sur toutes les populations). La diversité génétique intrapopulation HT est la diversité génétique sur l'ensemble des populations considérées comme des populations uniques (diversité totale). Quand plusieurs loci

12 sont pris en compte, l'expression de la différenciation devient (GsT) = 1- Hs/ Hr ou Hs et Hr sont les moyennes (sur l'ensemble des loci) des diversités intrapopulation et totale.

13 CHAPITRE 2. MATERIEL ET METHODES

2.1. Site d'étude Les échantillonnages se sont déroulés au Sud et au Centre de Ja Côte d'Ivoire. Au sud, les échantillons ont été collectés sur deux sites : Parc National du Banco dans la ville d'Abidjan et la forêt classée de Yapo Abbé dans le département d'Agboville. La forêt classée de Yapo Abbé est située entre le 05°38'24"et 05°47'24"du latitude nord ainsi qu'entre 04°12'00" et 03°55'48"du longitude ouest. Ensuite, le Parc National du Banco est situé entre le 05°21 '36"et 05°25' 12"du latitude nord ainsi qu'entre 04°04'48" et 04°01' 12"du longitude ouest. Le climat des deux sites est de type tropical humide avec une forêt dense sempervirente. Les deux sites sont abondamment arrosés, avec environ 2000 mm de pluie par an (Avit et al., 1999). Le site se caractérise par des sols ferralitiques fortement dénaturés. Il a également une forêt dense humide sempervirente et une forêt dense humide semi décidue. Au Centre du pays, l'échantillonnage s'est déroulé sur trois sites : Djaha Sakassou et Kongouanou dans le district de Yamoussoukro et la forêt classée de Forro-Forro dans le département de Katiola (Figure 5). Djaha Sakassou est situé entre 07°03 '26,4" du latitude nord et 005°19'08,8" du longiude ouest. Ensuite Kongouanou est situé entre 06°59'39,35" du latitude nord et 005°19'34,8"du longiude ouest. Tandis que la forêt classée de Forro-Forro est située entre 07°59'3 l,3" du latitude nord et 005°03'59,6"du longiude ouest. Ce site présente une pluviométrie oscillant entre 1400 et 1600 mm de pluie par an. Le climat des trois sites est caractérisé par une température moyenne de 27°C par an et un sol de type ferralitique faiblement dénaturé. Dans ce site la végétation est une forêt claire du V baoulé.

14 0 200000 400000 A

§ § 0 0 0 0 0 0 0 0

joro Foro

00 00 0 0 0 0 0 0 0 .J)iama-Sakassou 0 0 0 a<.ongouanou

C1\ C1\ 0 0 0 J3anco 0 0 0 0 0 8

0 200000 400000 Légende 50 0 50 100 150 200 km

D Côte d'Ivoire • Lophira alata • Lophira lanceolata

Figure 5. Localisation des zones de collectes des individus échantillonnés

15 2.2. Matériel

2.2.1. Matériel végétal Nous désignons par le terme population, une localité ou un site tel que présenté sur le tableau 1. La taille de la population varie de 21 à 119 individus. Des arbres adultes ont été échantillonnés, la distance qui sépare deux arbres au sein d'une même population est de 50 km. Les différents sites échantillonnés correspondent principalement à des zones de forêts tropicales humides pour L. alata, de savanes arbustives pour L. lanceolata ou à des zones de contact entre ces deux écosystèmes. Le matériel végétal utilisé dans ces populations sont constituées de fragments déshydratés de feuilles ou de cambium de L. alata et L. lanceolata. Il est issu de cinq populations de Côte d'Ivoire. La liste des individus et le nombre d'individus échantillonnés (soit 287 individus). Parallèlement, l'espèce, les coordonnées géographiques (l'altitude et longitude) ont généralement été prélevé sur le terrain (tableau 1).

Tableau 1. Liste des espèces, localités, coordonnés géographiques et le nombre d'individu par site

Coordonnées Nombre N° de chaque géographiques( moyenne) d'individ Espèces Localités us individus Latitude Longitude analysés

N05°23'09,0' woo4°03'0,6" LA0001-LA0044 Alata Banco 44 '

N05°42'51,2' woo4°03'07,9 LA0065-LA0101 Alata Yapo-Abbé 37 "

Lanceola Djaha N07°03 '26,4' W005°19'08,8 LL0001-LL0069 66 ta sakassou ' "

Lanceola N06°59'39,3 woo5°19'34,8 LL0070-LL0090 Kongouanou 21 ta 5" "

Lanceola N07°59'3 l,3' woo5°03'59,6 LL0140-LL0261 Forro-Forro 119 ta ' "

16 2.2.2. Materiel technique Le matériel technique utilisé sur le terrain est composé de gants pour la non contamination du matériel végétal, un GPS (Garmin Map 64S) pour la détermination des coordonnées géographiques, une machette pour le défrichement, des enveloppes - étiquettes et des blocs notes pour marquer les individus. Le matériel utilisé au laboratoire est constitué de micro-tubes Eppendorfs, de bain marie (memmert), de centrifugeuse (eppendorfort 5417R), d'un vortex (Fisherband), d'un spectrophotomètre, Nanodrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc), un thermocycler : Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystèe, USA) et un séquenceur capillaire (ABI3730 pays bas), des micropipettes (Labnet), et embout a micropipette (Annexe 1).

2.3. Méthodes 2.3.1. Extraction de I' ADN Des fragments de cambium ou de feuilles récoltés sur chaque individu des deux espèces ont été mis dans une enveloppe contenant du gel de silice ; afin de déshydrater le materiel pour une conservation optimale de l 'ADN jusqu'à son extration. L' extration a été faite au laboratoire de Service Evolution Biologique et Ecologie de l'Université Libre De Bruxelle. L' ADN a été extrait avec le kit NucleoSpin 96 Plant II (Macherey-Nagel, Düren, Germany) suivant le protocole du fabricant (Annexe 2). L'extraction a consisté à broyer environ 10 mg de tissu végétal (feuilles ou cambium séchés) passés à l'azote liquide, pour chaque individu dans un tube Strips en utilisant un Tissuelyzer (QIAGEN) et une bille d'acier de 3 mm de diamètre par tube.

2.3.2. Microsateflites nucléaires testés Dix locus déjà isolés chez L. alata par Pifieiro (2015) ont été utilisés pour l'analyse des microsatellites nucléaires. Quatre queues universelles (Micheneau et al., 2011) marquées avec quatre fluorochromes différents (QI: 6FAM, Q2: NED, Q3: VIC, Q4: PET;) ont été utilisés de sorte que pour chacun des locus, on obtienne une queue universelle ajoutée en 5' de l'amorce forward. Les dix marqueurs ont été amplifiés en deux multiplex PCR (« Polymerase Chain Reaction ») (LMKI3 pour les locus Pl8-Q2, P34-Q2, P36-Ql, P40-Q4, P47-Ql, P51-Q3, P62- Q2; LMLl 1 pour les locus Pl2-Q4, P31-Q3, P44-Q2, P53-Ql, P66-Q2) conçus à l'aide du logiciel MULTIPLEX MANAGER (Holleley et al., 2009). Un mix d'amorces doit être en premier lieu préparé pour chaque multiplex PCR. La concentration de chaque amorce dans ce mix est la suivante : 0, 1 µM pour chaque queue universelle marquée et pour chaque amorce inverse, et 0,07 µM pour chaque amorce forward.

17 La réaction d'amplification PCR utilisant le kit de type Qiagen (Qiagen, Valencia, CA) contient dans 15 µl : 1 µl d'ADN ( environ 5-20 ng), 7. 5 µl de Mix Multiplex TYPE IT, 0, 1 µl de chaque amorce forward, 0,15 µl (10 µM) de chaque amorce reverse, 0,15 µI (10 µM) de chaque queue universelle marquée et le complément en H20. Les plaques PCR ont alors été placées dans un thermocycleur (BiometraTProfessionnel, Gottingen, Germany) avec le programme suivant: 5 minutes à 95°C suivies de 20 cycles de 30 secondes à 95°C, 3 minutes à 57°C pour LMK13 ou 90 secondes à 60°C pour LMLl 1, et 30 secondes à 72°C, et enfin 8 cycles de 30 secondes à 94°C, 45 secondes à 53°C et 45 secondes à 72°C. Le dernier cycle a été suivi par une extension finale de 30 minutes à 60°C.

Le génotypage des produits PCR a été effectué par un mélange de 12 µI de Hidi• formamide et 0,8 µl de produit PCR et un marqueur de taille (Liz500 ; Applied Biosystems, 0,3 µl par échantillon) servant de témoin pour évaluer la taille des fragments amplifiés. Les échantillons analysés par un séquenceur à capillaire ABI3730 xlDNA Analyzer, ont donné pour chaque individu un chromatogramme par multiplex.

2.3.3. Analyse des données Pour chaque population, nous avons estimé des paramètres de diversité allélique, coefficient de consanguinité et nous avons construit la matrice de comparaison des degrés de différenciation génétique (Fst) entre populations avec les logiciels FSTAT (Goudet, 2001), SPAGeDi (Hardy et al., 2002). Le logiciel GenAŒx, version 6 (Peakall & Smouse, 2001) a été utilisé pour déterminer la diversité de shannon. L'analyse de la variance à un facteur (ANOVA l) a été utilisée pour comparer la moyenne des paramètres à l'aide du logiciel Statistica 7.5. Ensuite le test de la plus petite différence significative (ppds) a été utilisé dans le cas de signification de ces paramètres. Nous avons aussi analysé la structure génétique spatiale en permutant les coordonnées spatiales des individus à l'aide du logiciel SPAGeDi. Le but de cette analyse est d'estimer Ja distance du flux de gènes au sein d'un réservoir génique et Je coefficient moyen de parenté entre individus et pour cinq populations. Le Fst mesurant le degré de différenciation génique entre les populations et entre morphoespèces. TI a été estime. TI a été teste par l' Analyse de la Variance Moléculaire ou AMOY A (Excoffier et al., l 992) en utilisant le logiciel GenAlEx, version 6 (Peakall & Smouse, 2001). Les dix loci nous ont permis d'établir la structure génétique des individus étudiés à partir du logiciel STRUCTURE version 2.3.4 (Pritchard et al., 2000). L'importance de ce logiciel

18 génétique permet d'établir les ressemblances et de grouper les individus. Un modèle basé sur un algorithme de classification pour rechercher le nombre le plus probable des individus échantillonnés a été utilisé. Cet algorithme assigne les individus et évalue aussi l'hétérogénéité des individus. Pour déterminer le nombre de réservoirs géniques, nous avons recherché le nombre minimum de groupes en faisant varier le nombre de populations (K) de 1 à 10 durant 100 000 Markov Chain Monte Carlo (MCMC) et 100 000 burn-in period pour rechercher la reproductibilité des résultats. La valeur la plus élevée pour L1K, le taux de variation de la probabilité entre des nombres potentiels successifs a été obtenu pour K=2. L'estimation de la probabilité des données était plus haute sous K = 2 (-4577.9) que sous K=l (-6305.8). Les résultats ont été réorganisés pour évaluer les relations géographiques des individus entre différents groupes génétiques. La cartographie présentée dans ce document est réalisés à l'aide du logiciel QGIS version 1.8.0 (Quantum, 2011). Cette cartographie représente la répartition géographique des deux groupes issus de l'analyse STRUCTURE.

19 Chapitre 3. RESULTATS ET DISCUSSION

3.1. Résultats 3.1.1. Diversité génétique intra population Dix locus ont été utilisés pour l'analyse des 287 individus du genre Lophira. Les paramètres de diversité génétique intrapopulation générés par ces dix marqueurs rnicrosatellites dans des populations d'arbres du Banco, Yapo Abbe, Djaha Sakassou, Kongouanou et Forro Forro sont présentés dans ce chapitre.

3.1.1.1. Nombre d'allèles et nombre des individus analysés Le tableau 2 présente les valeurs du nombre d'allèles et le nombre des individus analysés dans les cinq populations considérées. Dans la population du Banco, le nombre d'allèles par locus varie de 2 à 7 avec une moyenne de 3,900 ± 1,792. Le nombre individus analysés dans la population du banco est 44. Dans la Population de Yapo Abbé, la moyenne du nombre d'allèles est de 3,700 ± 1,337 et ce nombre varie de 2 à 6 pour les locus P66, P12 et P47. Avec le nombre d'individu égal a 37 Dans la population de Djaha Sakassou, le nombre d'allèles par locus varie de 4 à 7 avec une moyenne de 5,300 ± 1,252. Avec un nombre d'individu analysés égal a 66 Dans la Population de Kongouanou, la moyenne du nombre d'allèles est de 3,700 ± 1,252 et varie de 2 à 6 pour les locus P12 et P62 respectivement Avec un nombre d'individu analysés égal a 21 Dans la population de Forro Forro, le nombre d'allèles par locus varie de 3 à 10 avec une moyenne de 6,100 ± 2,132. Avec un nombre d'individu analysés égal a 119 L'analyse de la variance (ANOVA) montre une différence hautement significative (P = 0,002) entre les nombres d'alllèles revélés dans les cinq populations étudiées. Les populations de Djaha Sakassou (centre) et Forro Forro présentent les nombres d'allèles les plus élévés (respectiveent 5,3 et 6,1).

20 Tableau 2. Paramètres du nombre d'allèles A et nombre individus analysés

Populations Banco Yapo- Djaha Kongouanou F orro F orro Abbé Sakassou Locus A N A N A N A N A N P18 6 44 5 37 7 66 5 21 7 119 P34 3 44 3 37 4 66 3 21 4 119 P40 3 44 4 37 4 66 3 21 10 119 P47 4 44 6 37 6 66 4 21 4 119 P51 2 44 3 37 6 66 3 21 8 119 P62 5 44 4 37 7 66 6 21 6 119 P12 2 44 2 37 6 66 2 21 5 119 P31 7 44 5 37 4 66 3 21 3 119 P53 2 44 3 37 4 66 5 21 7 119 P66 5 44 2 37 5 66 3 21 7 119 MOYENNE 3,900bc 3,700c 5,300ab 3,700c 6,100a ECART 1,792 1,337 1,252 1,252 2,132 TYPE

3.1.1.2. Hétérozygoties observées et attendues

Les valeurs moyennes d'hétérozygotie observée et attendue sont présentées dans le tableau 3. L'hétérozygotie observée (Ho) dans la population du Banco par locus varie de 0,023 à 0,659 avec une moyenne de 0,289 ± 0,222. L'hétérozygotie attendue (He) dans cette population, varie de 0,047( PSI) à 0,757 (P62) avec une moyenne de 0,370 ± 0, 249. Pour ce qui est de Yapo Abbe, la moyenne de l'hétérozygotie observée (Ho) est de 0,331 ± 0,200 et varie de O,lll(P5I) à 0,667 (P31). L'hétérozygotie attendue (He) dans cette population, varie 0,108 à 0,712 avec une moyenne de 0,394 ± 0,119. A Djaha Sakassou, l'hétérozygotie observée (Ho) par locus varie de 0,044 à 0,591 avec une moyenne de 0,293 ± 0,164. La valeur maximale de l'hétérozygotie attendue (He) est de 0,687 au locu P47 et sa valeur minimale est de 0,184 alors que la moyenne pour tous les locus est de 0,43 7 ± 0, 190. Dans la population de Kongouanou, la moyenne de l'hétérozygotie observée (Ho) est de 0,306 ± 0,181 et varie de 0,095 à 0,571 respectivement pour les locus P66 et P34. L'hétérozygotie attendue (He) dans cette population, varie de 0,094 à 0,687 avec une moyenne de 0,385 ± 0,217. En ce qui concerne, la population de Forro Forro, l'hétérozygotie observée (Ho) par locus varie de 0,041 à 0,706 avec une moyenne de 0,330 ± 0,196. L'hétérozygotie attendue (He) dans cette population, varie de 0,263 (P51) à 0,735 (P53) avec une moyenne de 0,426 ± 0,184. 21 L'analyse de la variance (ANOVA) ne montre aucune différence significative au sein des populations étudiées en ce qui concerne l'hétérozygotie attendue (He). Cette analyse montre aussi que le taux hétérozygotie observé est le même dans toutes les populations.

Tableau 3. Paramètres d'hétérozygotie attendue (He), Hétérozygotie observée (Ho), Diversité allélique corrélée au nombre d'individus

Populations Banco Yapo-Abbé Djaha Kongouanou Forro Forro Sakassou Locus Ho He Ho He Ho He Ho He Ho He

P18 0,116 0,586 0,171 0,440 0,333 0,665 0,286 0,687 0,583 0,659

P34 0,233 0,210 0,457 0,400 0,354 0,532 0,571 0,492 0,278 0,328

P40 0,225 0,289 0,382 0,476 0,143 0,193 0,143 0,221 0,144 0,274

P47 0,150 0,269 0,143 0,334 0,391 0,687 0,368 0,632 0,283 0,619

PSI 0,023 0,047 0,111 0,108 0,044 0,454 0,111 0,109 0,041 0,263

P62 0,619 0,757 0,629 0,712 0,161 0,293 0,250 0,505 0,425 0,499

P12 0,136 0,128 0,250 0,221 0,182 0,184 0,190 0,176 0,319 0,300

P31 0,659 0,694 0,667 0,697 0,455 0,418 0,524 0,457 0,246 0,264

PS3 0,227 0,203 0,167 0,204 0,591 0,641 0,524 0,476 0,706 0,735

P66 0,500 0,521 0,333 0,351 0,273 0,308 0,095 0,094 0,274 0,320 MOYENNE 0,289 0,370 0,331 0,394 0,293 0,437 0,306 0,385 0,330 0,426 Ecart T!P,e o,22I_Q_,249 0,200 0,199 0,164 0~190 0,181 _Q,217 0, 12_6 _Q,_ 184

3.1.1.3. Coefficient de consanguinité (F,s) et la diversité de shannon ( /) Le tableau 4 présente les valeurs du Coefficient de consanguinité (F,s) et la diversité de shannon ( /) par locus et dans les cinq populations considérées. Au niveau de la population du Banco, le coefficient de consanguinité (F,s) par locus varie de -0, l 17 à 0,802 avec une moyenne de 0,245 ± 0,387. La diversité de shannon (/)dans cette population, varie de 0,063 à 0,552 repectivement pour les locus P5 l et P40 avec une moyenne de 0,708 ± 0, 489.

A Yapo Abbe, la moyenne du coefficient de consanguinité FIS est de 0, 138 ± 0,246 varie de -0,143 à 0,610 respectivement pour les locus P34 et Pl8. La valeur minimale de la

22 diversité de shannon ( I) est 0,253 et sa valeur maximale est 0,910 avec une moyenne de 0, 721 ± 0,363. Dans la population de Djaha Sakassou, le coefficient de consanguinité FIS par locus varie de --0,088 à 0,499 avec une moyenne de 0,308 ± 0,290. La diversité de shannon (1) dans cette population, varie de 0,356 à 1,319 pour les loci Pl2 et P18 repectivement avec une moyenne de 0,847 ± 0,327. En ce qui concerne la population de Kongoanou, la moyenne du coefficient de consanguinité FIS est de 0,124 ± 0,281 et varie de -0,162 à 0,584 respectivement pour les Locus P34 et P18. La diversité de shannon (I) dans cette population, varie 0,224 à 1,290 avec une moyenne de 0,703 ± 0,378. le coefficient de consanguinité FIS dans la population de Forro-Forro varie par locus de -0,066 à 0,794 avec une moyenne de 0,202 ± 0,260. La diversité de shannon ( I) dans cette population, varie de 0,480 à 1,440 pour les locus P31 et P53 respectivement avec une moyenne de 0,828 ± 0,321. L'analyse de la variance ne montre aucune différence significative (P > 0,05) entre les cinq poupulations, pour le coefficient de consanguinité et la diversité de shannon. Tableau 4. Paramètres de diversité de Shannon (1) et le coefficient de consanguinité F!s

Populations Banco Yapo-Abbé Djaha Kongouanou Forro Forro Sakassou Locus I FIS I FIS I FIS I FIS I FIS P18 1,177 0,802 0,910 0,610 1,319 0,499 1,290 0,584 1,202 0,099 - - P34 0,397 0,107 0,660 -0,143 0,952 0,335 0,810 0,162 0,677 0,151 P40 0,552 0,222 0,843 0,197 0,471 0,425 0,425 0,355 0,711 0,193 P47 0,531 0,442 0,664 0,486 1,196 0,409 1,116 0,417 1,058 0,528 - PSl 0,063 1,00 0,253 -0,029 0,980 0,902 0,253 0,015 0,575 0,794 P62 1,414 0,182 1,266 0,117 0,572 0,395 0,835 0,406 0,963 0,149 - - - P12 0,249 0,062 0,377 -0,129 0,356 0,011 0,314 0,081 0,648 0,066 - - P31 1,399 0,051 1,315 0,044 0,826 0,088 0,792 0,146 0,480 0,070 - - P53 0,354 0,117 0,391 0,181 1,156 0,078 0,972 0,100 1,440 0,039 - P66 0,943 0,041 0,530 0,050 0,647 0,113 0,224 0,013 0,529 0,065 MOYENNE 0,708 0,245 0,721 0,138 0,847 0,308 0,703 ,124 0,828 0,202 ECART TYPE 0,489 ,387 0,363 0,246 0,327 0,290 0,378 0,281 0,321 0,260

23 3.1.2. Diversité génétique interpopulation

3.1.2.1. Structuration génétique

L'analyse de la structure de la population a permis de regrouper les individus en deux principaux groupes génétiques. Le groupe 1, en rouge, correspond à l'espèce L. alata. Le groupe 2, en vert, correspond à l'espèce L. lanceoata (Figure 6). Le pool génétique (rouge) comprend 81 individus qui appartiennent tous au morphoespèce L. alata. Le second pool génétique (vert) est constitué de 206 individus appartenant au morphoespèce L. lanceolata. Les individs du Sud de la Côte d'Ivoire sont des membres du pool génétique rouge. Les individus du Centre de la Côte d'Ivoire sont exclusivement membre du pool vert. La présence des individus de L. alata (rouge) dans le pool génétique (vert) et celle de l'individu de L. lanceolata dans le pool génétique (rouge) n'ont pas atteint le seuil de 0,5. Il n'y a donc pas d'individus intermédiaires entre les deux groupes génétiques. La cartographie représente la répartition géographique des deux groupes issus de l'analyse STRUCTURE. La répartition géographique met en évidence ces groupes géniques en fonction des régions : la savane et la forêt (Figure 7).

'Q) .'1: C if ro ""O

C 0 .•,..._. 0 a. ,0._ a.. L. alata L. lanceolata

Figure 6 . Histogramme d'assignation des individus à différents groupes

•: L. alata • : L. lanceolata

24 0 450-000

..... 1... - i ~ ...Ji 0

Forro Forro •

Djaha Sakassou Légende Kongouanou •

0\ 0\ ....., e Forêt ....., 0 §0 ...... 8 0 e ~avane

50 0 50 100 150 200 km

0 450000

Figure7. Distribution géographique des deux groupes génétiques des 5 populations issues de la Côte d' Ivoire couleur rouge (région de savane, L. lanceolata); couleur verte (région de forêt, L. alata).

3.1.2.2. Répartition de la différenciation génétique 3.1.2.2.1. Répartition de la différenciation au niveau des espèces Une analyse moléculaire de variance (AMOVA) a été effectuée pour évaluer le degré de différenciation du genre Lophira en fonction des espèces (Tableau 5). Ces résultats indiquent qu'il y a une forte différenciation génique entre les espèces du genre Lophira (Fst = 0, 552 soit 52%; P = 0,010). Par ailleurs, en prenant l'espèce comme critère pour l'analyse effectuée, une très faible différenciation génique a été observée entre les populations (Fst = 0,059 soit 3 % ; P = 0,010). Cependant, les résultats au sein des individus d'une même espèce ont montré une différenciation génétique (Fst = 0,523 soit 45 % ; P = 0,010).

25 Tableau 5. Analyse de la variance moléculaire (AMOVA ) testant la différenciation génétique de 287 individus du genre Lophira

Niveau de Source de DL SCE CM %F Fst F p diversité différenciation Entre espèce 1 866,957 866,957 52% 0,552 7,218 0,010 Entre les 3 78,475 26,158 3% 0,059 0,389 0,010 populations Espèces Au sein des individus par 282 1743,780 6,184 45% 0,523 6,184 0,010 espèce dL : degré de liberté, CM : carré moyen, %F : pourcentage de variance moléculaire totale; Fst: différenciation génétique; P: probabilité a été estimée par 999 permutations; SCE : somme des carrés des écarts; F: variance moléculaire totale

3.1.2.2.2. Répartition de la différenciation au niveau des populations Les valeurs de la différenciation au niveau des populations sont présentées dans le tableau 6. En ce qui concerne, les populations d'une même zone geographique, les valeurs de Fst entre paires de populations est faible. Il est de 0,012 entre Banco et Yapo-Abbé, de 0,019 entre Kongouanou et Djaha Sakassou, de 0,053 entre Forro Forro et Djaha Sakassou et enfin de 0,083 entre Forro Forro et Kongouanou.

Pour deux zones geographiquement différentes, la Fst est très elevées. Elle est de 0,490 entre Forro Forro et Yapo-Abbé, de 0,492 entre Djaha sakasou et Yapo-Abbé, de 0,496 entre (Forro Forro et Banco), de 0,503 entre Djaha sakasou et Banco, de 0,544 entre Kongouanou et Yapo-Abbé, enfin de 0,559 entre Kongouanou et Banco.

26 Tableau 6. Matrice de comparaison des Fst entre populations Lophira pour tous les locus

Banco Yapo-Abbé Djaha sakasou Kongouanou Forro Forro Banco 1 Yapo-Abbé 0,012 Djaha sakasou 0,503 0,492 Kongouanou 0,559 0,544 0,019 Forro Forro 0,496 0,491 0,053 0,083

3.1.2.3. Isolement par la distance La figure 8 presente une courbe des distances en fonction de coefficient moyen de parenté pour cinq populations. Cette courbe montre que le coefficient moyen de parenté est positif (0,541 à 0) pour les intervalles de distance inférieurs à 140 km et négative ( 0 à -0,256) au-delà des 140 km. La pente de la courbe du coefficient moyen de parenté est négative et statistiquement différente de zéro pour chacun des deux groupes génétiques. Cela prouve qu'à courte distance les populations sont plus apparentées.

Fij = coefficient moyen de parenté

0,5 0,4 ~ 0,3 i::: ~ 0,2 o. 0,1 Q) "O 0 5 -0,1 300 400 ë3 t+:. -0,2 •Q) uo -0 / 3 -0,4 Distance (Km)

Figure 8. Courbe des distance en fonction de coefficient moyen de parenté pour cinq populations

La figure 8 indique le coefficient moyen de parenté entre les individus en fonction de la distance géographique. Cette courbe montre que le coefficient moyen de parenté est positif (0,444 à 0) pour les intervalles de distance inférieurs à 500 km et négatif de O à -0,263 au-delà de 500 km. II est à retenir que sur cette figure les individus sont plus apparentés à courte distance.

27 Fij = coefficient moyen de parenté 0,5 1 t 0,4 •.•Q.).. 0,3 ~ 0,2 C. Q) "'O 0,1 ~-G---1-\- @00 -0, 1 0 \ 500 1000 1500 2000 2500 -V 8 -0,2 -0,3 -0,4 Distance (Km)

Figure 9. Variation du coefficient moyen de parenté entre individus en fonction de la distance

28 3.2. Discussion Selon Santoni et al (2000), les microsatellites sont parmi les marqueurs moléculaire les plus importants pour révéler du polymorphisme. Les microsatellites ont des caractéristiques très adaptées à l'examen approfondi des structures génétiques des populations (neutralité, hypervariabilité, co-dominance ). Ils sont notamment des outils précieux pour estimer finement la ségrégation aux locus ( déficit ou excès d'hétérozygotes) ou la recombinaison entre les locus, processus fortement affecté par les systèmes de reproduction pratiqués dans les populations naturelles (Arnos, 1999). Dans cette étude 10 marqueurs microsatellites très polymorphes ont permis de mettre en évidence la diversité génétique et la structure de cinq populations du genre Lophira issus du centre et du sud de la Cote d'Ivoire.

La diversité génétique au sein des populations d'arbres a été évaluée à travers le nombre d'allèles, l'hétérozygotie observée, l'hétérozygotie attendue) le coefficient de consanguinité et la diversité de shannon. Les résultats de ces travaux ont montré que le nombre moyen d'allèles par locus dans les cinq populations varie de 3, 7 à 6, 1. Ces résultats sont nettement supérieurs à ceux observés chez 16 individus d'Eucalyptus et 14 individus Quercus où le nombre moyen d'allèles par locus varie entre 1,83 et 1,68 (Kremer, 1994). Parmi les cinq populations d'arbre de cette étude, les nombres d'allèles les plus élevés ont été observés dans les populations du centre (Foro-Foro et Djaha-Sakassou). Ces résultats pourraient s'expliquer par le fait que dans ces deux localités le nombre d'individus échantillonnés est plus élevé que dans les populations sud (banco et Yapo-Abé). En effet selon Foulley et al. (2006), les chances de découvrir un nouvel allèle augmente chaque fois qu'un nouvel individu est observé. Ainsi, le nombre d'allèles dans une population donnée est susceptible d'augmenter avec la taille de l'échantillon. Cette étude a révèlé une forte hétérozygotie à l'intérieur des cinq populations étudiées avec des valeurs d'hétérozygotie observée (Ho) allant de 0,29 (Banco) à 0,33 (Forro Forro). Ces données sont similaires à d'autres études de microsatellite des espèces d'arbres tropicales. Par exemple selon Dayanandan et al. (1999) Ho varie 0,13 et 0,93 pour l'espèce Carapa guianensis. Le taux hétérozygotie attendue (He) est statistiquement la même dans l'ensemble des populations de cette étude et varie de 0,37 à 0,426, pour Foro foro et Banco respectivement. Les résultats sont similaires à ceux obtenus chez les différentes espèces d' Acacia (He= 0,02 à

29 0,46) (Chevallier et al., 1998). Ces résultats pourraient s'expliquer par le fait que ces valeurs sont dues au même méthodologiques liés au nombre et au même locus utilisée, et à l'échantillonnage des populations (Chevallier et al., 1998). En ce qui concerne le coefficient de consanguinité, les resultats de cette étude ont montré que les valeurs moyennes par population sont strictement supérieures à O (0,124 à 0,308). Ceci indique un déficit d'bétérozygotie au sein des populations de notre étude. Ces resultats pourraient s'expliquer par le système de reproduction allogame de L. alata et L. lanceolata (Pascal, 2009). Chez ces espèces, la pollinisation est assurée par le vent et les insectes qui transportent le pollen d'une plante à l'autre (Doucet, 2003). Ceci favorise l'hybridation et par conséquent, une augmentation du taux d'hétérozygotie. En effet selon Reynier et al., (1978), dans les conditions naturelles, l'allopolJinisation permet d'entretenir une variabilité intrapopulation importante et donc d'obtenir des plantes sœurs ou demi-sœurs génétiquement différentes. Des résultats similaires ont été obtenus chez d'autres espèces d'arbres analysées avec des microsatelJites comme Santiria trimera (Burseraceae) (Koffi, 2010), Santalum austrocaledonicum (Bottin et al., 2005).

L'analyse de la structure de la population a permis de regrouper les individus en deux principaux groupes génétiques selon les espèces : L. alata et L. lanceolata. En plus il n'y a pas d'individus intermédiaires entre les deux groupes. Des résultats similaires ont été obtenus par Staquet (2013). A la suite de ses travaux portant sur le genre Lophira issu de différents pays d'Afrique, l'auteur a regroupé les populations en deux groupes que sont L. alata et L. lanceolata. Les résultats de cette étude suggèrent que les deux espèces bien qu'appartenant au même genre ne s'hybrident pas. Il aurait donc une barrière de reproduction chez le genre Lophira. Ces résultats pourraient être liés aussi à l'isolement des deux espèces par une barrière empêchant toute hybridation interspécifique. Ce résultat confirme bien l'existence de deux espèces. Une forte variabilité a été observée entre les espèces (Fst = 0, 552 soit 52 % ; P = 0,01) et une fable variabilité au sein des populations par espèces (Fst = 0,059 soit 3 % ; P = 0,01 ). Dans une étude similaire conduite par Staquet (2013), l'utilisation des marqueurs SSR chez le même genre Lophira a montré que Fst entre L. alata et L. lanceolata est de 0,41. La forte variabilité génétique entre espèces et au sein des populations s'expliquer par l'absence de flux de gènes entre les deux espèces. Au sein des espèces il existe une forte vaiabilité a l'interieur des populations et une faible variabilité entre les populations. Ceci est due au mode de reproduction allogame. Les résultats ont montré les Fis moyens positifs qui indiquent un déficit

30 d'heterozygotie au sein de chaue population. Ceci semble être en discordance avec le mode de reproduction allogame qui favorise les heterozygotes. Cet phénomème pourrait s'expliquer par l'effet wadlund du faite de la présence dans chaque sous population de plusieurs génératons d'individus.

31 CONCLUSION ET PESPERTIVES

Ces résultats se présentent comme un apport à la connaissance et à la caractérisation des deux espèces du genre Lophira en Côte d'Ivoire. Ils représentent également autant d'acquis pour la mise en œuvre d'un prograont montré lesmme de développement de ces espèces dans le pays. En outre, ce travail pourrait servir de base à des programmes plus conséquents d'études de la diversité génétique des différentes populations du genre Lophira en Côte d'Ivoire. Spécifiquement, cette étude a permis de montrer qu'il existe une différenciation plus accentuée au niveau des espèces que dans les populations. Afin d'éviter une érosion génétique de ces espèces classées parmi les arbres vulnérables, il serait urgent de mener des stratégies de collectes des échantillons pour la conservation in situ de L. alata et de L. lanceolata. Pour cela, des collections composées d'un maximum de populations devraient être mises en place dans chaque zone d'évolution de ces espèces en Côte d'Ivoire. Cette méthode sera un atout pour le maintien de l'authenticité génétique des individus par population et permettra d'avoir un échantillon représentatif de leur diversité.

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39 ANNEXES

Annexe 1. Protocole d'extraction de l'ADN

Tableau 7. Protocole d'extraction de l'ADN le kit NucleoSpin 96 Plant II (Macherey-Nagel, Düren, German y)

-10 mg de matériel sec -Ajouter 1 bille dans chaque tube 1-Broyage des échantillons -Plonger la boîte à tube dans de l'azote liquide. -Broyer à 24 tours/sec pendant 1 min 30 s. -Centrifuger à 5600 g pendant 2 min -Ajouter 500 µ.l de PLl + 10 µ.l de RNase à chaque tube -Secouer vigoureusement pendant 15-30 s 2a-Utilisation du tampon PLl -Centrifuger brièvement à 1500 g pendant 30 s. -Incuber les tubes à 65°C pendant 30 min. -Secouer vigoureusement pendant 15-30 s -Centrifuger brièvement à 1500 g pendant 30 s 2b-Ajouter 400 µ.l de tampon pI2 -Incuber les tubes à 65°C pendant 30 min + 10 µ.l de RNase a chaque tube. -Ajouter 100 µ.l de PL3 à chaque tube Secouerlégerment -Incuber pendant 5 min sur glace 3-Centrifugation -Centrifuger les échantillons à 5600 g (20 min). -Prédisposer de 450 µ.l de Binding Buffer PC dans chaque puits 4-Conditions de ligation Ajouter 400 µl du surnageant de chaque échantillon -Répipeter à 3 reprises au moins pour homogénéiser la solution. -Transférer le mélange sur la plaque Plant Il Binding. 5-Transfert du mélange buffer pc -Sceller les puits de la plaque Binding avec un film + surnageant perméables au gaz - Placer la plaque Nucleospin Plant II sur un bloc puits• 6-Ligation de l' ADN à la carré dans le bac du rotor. membrane - Centrifuger à 5600 g pendant 5 min. 1er lavage -Ajouter 400 µl de PWl à chaque puits -Sceller la plaque -Centrifuger à 5600 g pendant 2 mi 7-Lavage de la membrane 2mre lavage -Ajouter 700 ul de PW2 à chaque puits -Sceller à nouveau -Centrifuger à 5600 g pendant 2 min 3ème lavage

I -Ajouter 700 ul de PW2 à chaque puits -Sceller à nouveau -Centrifuger à 5600 g pendant 2 min -Incuber le filtre à 37°C. -Ajouter 100 µ.l de Bu.ffer PE (préchauffer à 70°C) directement sur la membrane 8-Elution de l' ADN -Incuber le tout à 70°C (2 min) -Centrifuger à 5600 g (2 min) -Répéter cette opération

Annexe 2. Matériel technique

Termocycleur Bain marie Centrifugeuse

Vortex Séquenceur à capillaire Micropipette II