Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Vila Real, Junho 20-22, 2007

Univ. Trás-osMontes e Alto Douro

PATROCINADORES

Governo Civil de Vila Real

Câmara Municipal de Vila Real

PATROCINADORES

EXPOSITORES

II Congresso Ibérico do Castanheiro Vila Real, 20-22 Junho 2007

Livro de Resumos

Presidente José Gomes-Laranjo (UTAD, Vila Real)

Comissão Organizadora

Afonso Martins (UTAD, Vila Real) Alberto Santos (UTAD, Vila Real) Carlos Abreu (UTAD, Vila Real) Ester Portela (UTAD, Vila Real) Francisco Peixoto (UTAD, Vila Real) Jorge Ferreira Cardoso (UTAD, Vila Real) José Luís Louzada (UTAD, Vila Real) Maria Rosário Anjos (UTAD, Vila Real) Mário Pimentel Pereira (UTAD, Vila Real) Paula Oliveira (UTAD, Vila Real) Teresa Maria Pinto (UTAD, Vila Real)

Comissão Científica

Afonso Martins (UTAD, Vila Real) António Ballester (Univ. Santiago de Compostela) Carlos Abreu (UTAD, Vila Real) Juan Gallardo (Salamanca) Maria Loreto Monteiro (ESAB, Bragança) Rita Costa (EFN, Lisboa) Santiago Pereira Lorenzo (Univ. Santiago de Compostela)

ISBN: 978-972-669-817-3

Editores: Carlos Abreu, José Gomes-Laranjo e Francisco Peixoto

Webpage: http://www.utad.pt/IIibercast

Composição gráfica: Francisco Peixoto e José Gomes Laranjo

Programa Quarta-Feira, 20 Junho 2007 Local: Aula Magna 8.00 - 10.00 Recepção aos participantes Afixação de posters 10.00 – 10.30 Cerimónia de abertura

CONFERÊNCIAS PLENÁRIAS

Moderador: C.Gomes Abreu Local: Aula Magna 10.35 – 11.00 Marco Conedera Título: “History, present situation and future perspectives of the chestnut cultivation in Europe” 11.00 – 11.15 Debate

11.15 – 11.45 Café/Visita Posters/Visita Exposição

11.45 – 12.15 Henry Breisch Título: “ The chestnut industry in France” 12.15 – 12.30 Debate 12.30 – 13.00 Visita Posters/Visita Exposição 13.00 Almoço

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CONFERÊNCIAS PLENÁRIAS

Moderador: M. Cardoso Simões Local: Aula Magna 14.30 – 15.00 Álvaro Cotto Título: “Perspectivas do mercado da castanha e sua transformação” 15.00 – 15.30 Rui Silva Título: “Perspectivas futuras para o castanheiro, nos seus aspectos culturais e comerciais” 15.30 – 15.50 Debate

1ª SESSÃO Transformação da castanha/Transformación de la castaña Moderador: José Posada Local: Aula Magna 15.50 – 16.10 Nogueira, C., Correia, P. Título: “Contributo para o estudo da conservação de castanha” 16.10 – 16.30 De Vasconcelos M. C., Bennett R. N., Rosa E. A. S., Ferreira-Cardoso J. V. Título: ”Metabolites composition of fresh kernels from three cultivars of Portuguese chestnut” 16.30 – 16.50 Paulo Reis Mourão e Teresa Mourão Título: “Determinants of chestnuts demanded quantities: an empirical estimation using panel data” 16.50 – 17.10 Debate

17.10 – 17.40 Café/Visita Posters/Visita Exposição

2ª SESSÃO Biologia, Fisiologia, Genética/ Biología, Fisiología, Genética Moderador: Santiago Pereira Lorenzo Local: Aula Magna 17.40 – 18.00 Corredoira, E., San-José, M.C., Vieitez, A.M, Ballester, A. Título: “Genetic transformation of Castanea sativa Mill” 18.00-18.20 Faria, J., Pontes,T., Aguin-Pombo, D., Franquinho Aguiar, A.M., Horta Lopes, D., Cabrera, R. Título: “Non-harvest chestnut fruits as a resource for rodents and insects in Madeira” 18.20-18.40 Ribeiro, C., Silva, M., Batista, D. e Costa, R Título: “Estrutura genética das populações naturais de castanheiro (Castanea sativa Mill.) em Portugal” 18.40-19.00 Debate

20.30 Porto de honra

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Quinta-Feira, 21 Junho 2007

08.00 – Visita de Campo (Partida de autocarro da UTAD)

13.00 – Almoço

21.00 Jantar Típico

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Sexta-Feira, 22 Junho 2007

CONFERÊNCIAS PLENÁRIAS Moderador: Fernando Coucelho Local: Aula Magna 9.00 – 9.30 António Ballester Título: “El castaño: biología, fisiología, genética” 9.30-10.00 Maria Loreto Monteiro Título: “O Castanheiro na Estratégia Nacional para as Florestas” 10.00 – 10.20 Debate

3ª SESSÃO Biologia, Fisiologia, Genética/ Biología, Fisiología, Genética Moderador: A. Ballester Local: Aula Magna 10.20 – 10.40 Abreu, I., Ribeiro, H., Oliveira, M., Aira, M.J., Rodríguez-Rajo, F.J., Jato, V. Título: “Castanea airborne pollen at the northwest of the Iberian Peninsula” 10.40 – 11.00 Monteagudo, A.B., Fernández-López, J. Título: “Reference values of genetic parameter in Spanish chestnut conservation” 11.00 – 11.20 Barreira J.C.M., Ferreira I.C.F.R., Oliveira M.B.P.P., Pereira, J.A. Título: “Antioxidant activity of chestnut constituents: flowers, leaves, skins and fruits” 11.20 – 11.35 Debate

11.35 – 12.05 Café/Visita Posters/Visita Exposição

4ª SESSÃO Silvicultura/ Silvicultura Moderador: Luis Lopes Local: Aula Magna 12.05 – 12.25 García-López, J.M.G., Camacho, C.A. Título: “Relaciones de competencia interespecífica en los castañares españoles (Castanea sativa Mill.). Una aproximación fitoclimática” 12.25 – 12.45 Louzada, J.L., Silva, M.E., Castro, S.B., Oliveira, S.P., Morais, J. Título: “Estudo comparativo das características da madeira de castanheiro (Castanea sativa Mill.) conduzido em regime de alto fuste, de souto e importada” 12.45 – 12.55 Debate

13.10 Almoço

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CONFERÊNCIAS PLENÁRIAS

Moderador: Juan Gallardo Local: Aula Magna 14.30 – 15.00 Stephanos Diamandis Título: “Sweet chestnut (Castanea sativa): a nut tree with great potential still to be exploited”. 15.00 – 15.30 Agustin Rubio Título: “¿Castañar para fruto o para madera? Consideraciones sobre su autoecología.” 15.30-15.45 Debate

5ª SESSÃO Patologia/ Patología Moderador: C. Gomes Abreu Local: Aula Magna 15.50 – 16.10 Dinis, L-T., Gomes-Laranjo, J., Peixoto, F., Costa, R. e Abreu, C. Título: “Chestnut ink disease and photosynthetic productivity” 16.10 – 16.30 Zamora, P., Martín, A.B., Arrate, J., Rigling, D., Diez, J.J. Título: “Detection of the vegetative compatibility groups of Cryphonectria parasitica in Castilla y León region” 16.30 – 16.50 Pintos, C., Aguín, O., Mansilla, J.P., Montenegro, D., Rial, C Título: “Identificación de Phytophthora pseudosyringae en plantas de castaño” 16.50 – 17.05 Debate

17.05 – 17.15 Café/Visita Posters/Visita Exposição

6ª SESSÃO Gestão do Souto/Gestión del Castañar Moderador: Ester Portela Local: Aula Magna 17.15 – 17.35 Dias, R., Matos, M., Sousa, M.J., Baptista, P., Rodrigues, P.C., Martins, A. Título: “Macrofungos em ecossistemas de Castanea sativa Mill. do nordeste transmontano” 17.35-17.55 Martins, A., Coutinho, J.P., Raimundo, F., Borges, O., e Gomes-Laranjo, J. Título: “Limitações da rega na produtividade fotossintética em soutos do Norte de Portugal” 17.55-18.15 Gallardo, J.F., Gonzalez, M.I., y Alvarez, A. Título: “Capacidad de captura de carbono de suelos de castañares del centro- oeste español” 18.15-18-30 Debate

Local: Aula Magna 18.30 Sessão de encerramento

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PLENÁRIAS

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Sessão 1 Transformação da castanha / Transformación de la castaña

CP1.01 HISTORY, PRESENT SITUATION AND PERSPECTIVE OF THE CHESTNUT CULTIVATION IN EUROPE

1Marco Conedera, 1Patrik Krebs

1 WSL Swiss Federal Research Institute, Research Unit Ecosystem Boundaries, Insubric Ecosystem Group, via Belsoggiorno 22, 6500 Bellinzona, Switzerland

ABSTRACT This paper gives a short overview on the history of the chestnut cultivation in Europe: presumed quaternary refugia, origin of the chestnut cultivation, driving factors of its diffusion at continental scale, causes of the decline and future perspective of the European chestnut culture.

Key words: Castanea sativa, refugia, chestnut area, chestnut marketing

1. QUATERNARY REFUGIA OF THE EUROPEAN CHESTNUT

The Sweet chestnut (Castanea sativa Mill.) is the only native species of the genus in Europe. The broad diffusion and active management by man resulted in the establishment of the species at the limits of its potential ecological range, what make it nowadays difficult to trace its original range (Pitte 1986) and its autoecology (Rubio et al. 1999; Blanco et al. 2000). Krebs et al. (2004) mapping radiocarbon-dated pollen, anthracological and macrofossil records concluded that the most likely natural range of the chestnut is delimited by six macroregions (Fig. 1): the Transcaucasian region, north-western Anatolia, the hinterland of the Tyrrhenian coast from Liguria to Lazio along the Apennine range, the region around Lago di Monticchio (Monte Vulture) in southern Italy, the Cantabrian coast on the Iberian peninsula, and probably also the Greek peninsula (Peloponnese and Thessaly) and north-eastern Italy (Colli Euganei, Monti Berici, Emilia- Romagna). As a rule, the supposed chestnut refugia areas are connected to orographic systems and are located in areas where scattered micro-environmentally favourable habitats probably allowed limited chestnut populations to survive during the main glacial events.

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Figure 1. Main refugium areas of Castanea sativa Mill. according to their probability level (source: Krebs et al. 2004)

2. ORIGIN OF THE CHESTNUT CULTIVATION IN EUROPE

First unambiguous evidences of chestnut cultivation are reported in palynological data of several regions in the Anatolian Peninsula, northeastern Greece and southeastern Bulgaria and date back to around 3700 B.P. (2100-2050 cal. B.C.). The pollen assemblages representing this phase point to an advanced form of agriculture, including fruit-tree cultivation such as chestnut (Castanea sativa), olive (Olea europea), walnut (Juglans regia), and manna-ash (Fraxinus ornus), accompanied by an increase in non-arboreal pollen and Cerealia-type pollen (Bottema and Woldring 1990). Written references to the chestnut cultivation or to chestnut place names are relatively numerous also in the Ancient Greek and Latin literature (Fig. 2). Analysing both pollen data and literary citations Conedera et al. (2004a) concluded that Ancient Greeks played a fundamental role in developing the cultivation of chestnut (both for its wood and its fruit) and in transferring it to the Latin world (especially in the Italian Greek colonies, Fig. 2), even if in the ancient Greek civilization and in the pre-Christian Latin world the chestnut cultivation took only a subsidiary place.

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Figure 2. Place names and areas of chestnut cultivation cited in the pre-Christian Greek and Latin Literature (Source: Conedera et al. 2004a)

3. DIFFUSION OF THE CHESTNUT CULTIVATION AT EUROPEAN SCALE

The role of chestnut in the Italian territory may have changed at the beginning of the Christian era when people realized that the wood produced from chestnut coppices was so useful and versatile. Signs of this change are found first in the Post-Christian Latin literature. Authors such as Columella, Pliny the Elder, Gargilius Martialis and Palladius provide a striking amount of detail about the ecological needs of chestnut, nursery techniques, and coppice management, emphasizing the supremacy of the chestnut in the production of poles to support vines (Conedera et al. 2004a). Palynological evidences of first introduction of the species or increasing cultivation and use of chestnut timber exist starting in the first century AD, especially in the southern slope of the Alps. From this period on there is a generally increasing percentages of chestnut pollen also in the southern part of France and Germany, in northern Switzerland and, partially, in the Iberian Peninsula. In most of these regions chestnut appears in the profiles in the first centuries of the Christian period for the first time, probably in connection with the Roman conquest (Aira Rodriguez et al. 1992; Santos et al. 2000). This suggests that the use of chestnut was spread throughout the empire by the Romans, even if on the northern part of the Alps the pollen percentages remained low, rejecting the idea of a widespread cultivation of the chestnut tree. The Romans may thus have introduced the idea of cultivating the chestnut and in certain cases the tree itself, but no evidence of systematic tree planting exists (Conedera et al. 2004a).

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4. THE MEDIEVAL CHESTNUT GOLDEN AGE IN WESTERN EUROPE

Contrary to the area of origin of the chestnut cultivation in Eastern Europe, a proper chestnut civilization took place in Western Europe starting in the early Middle Age (e.g. Tuscany, Quirós Castillo 1998) and flourished further in the later Middle Age (XI to XVI centuries, Pitte 1986). The cultivation of chestnut in coppices for timber production and in orchards for staple food became a widespread component of the traditional farming system in most Mediterranean and in the southern parts of Central Europe. Chestnut became an essential source of food in many mountain regions, what resulted in a wide range of cultivated varieties with different ripening periods (early, mid-season, late), types of use (fresh consumption, long-term storage, drying, flour, animal feed) and ranges of distribution (higher altitudes, lower slopes, ubiquitous, etc.). The few regions where commercial transport routes already existed during the Middle Ages (e.g. Piedmont or Tuscany), where the only places where chestnut plantations with just one or few high-quality chestnut or marron-cultivars were started in this period. The fruits were then sold on the regional or even international markets (Pitte 1986). The marron varieties, then defined as elliptic-shaped fruits of medium to large size, with marked dark strips on the tegument, which are light to peel (no intrusion of the epispermatic pellicle in the cotyledons) and sweet in taste (Bassi 1993), have traditionally been cultivated only in Italy and a few areas in France. In some regions of the Iberian Peninsula (northern Portugal and Galicia), double- purpose varieties (fruit and timber production) are quite common. Here the chestnut trees are topped above the grafting point, usually 2 meters above ground level (Bourgeois et al. 2004). This complex historical background makes it impossible to reliably estimate the number of chestnut cultivars or ecotypes existing in Europe, even if the inventories so far performed at the national level suggest that there are thousands more varieties (Conedera et al. 2004b).

5. THE PROGRESSIVE DECLINE OF THE TRADITIONAL CHESTNUT CULTIVATION

The decline of the traditional European chestnut culture took place at different time in different countries, but some common driving factors may be cited (Pitte 1986). The general climatic cooling of the Little Ice Age caused frost damages on chestnut orchard trees at the exposed sites. The improvement of the agricultural cultivation techniques combined with the introduction of alternative crops from abroad (maize, potatoes) allowed a greater production of calories with shorter rotation times, causing the

5 progressive substitution of the chestnuts as staple food. The industrial revolution also contributed to the decline of the chestnut culture, causing the exodus of the people from the mountain countryside and locally the falling of chestnut trees for charcoal production. At the end of the XIX century, the development of the industrial procedure for tannin extraction from the wood caused in many chestnut areas a systematic cut of chestnut groves for tannin production. The decline of the chestnut cultivation locally accelerated because of the introduction and spread of the two major diseases of the species: the soil-born plant pathogen Phytophthora spp. (ink disease) and the wound-parasite Cryphonectria parasitica (chestnut blight).

6. PRESENT SITUATION

Despite the described decline and in certain cases the complete abandonment of the chestnut cultivation since the last post-war period, the European chestnut area still covers in total 2.53 million hectares, of which 2.22 million hectares are chestnut forests, i.e. forests where chestnut is the dominant tree species and the remaining 0.31 million hectares are mixed forests with chestnut. The distribution area ranges from southern Europe (e.g. Crete) to the North (southern England, Belgium). The European chestnut forests are concentrated in just a few countries with a long tradition of chestnut cultivation: France and Italy together account for 79.3% of the whole chestnut forest area; Spain, Portugal and Switzerland account for a further 9.7%. The remaining 11.0% are dispersed in the other countries (Conedera et al. 2004b). Most of the chestnut-growing area (1.75 million ha - 79.0%) is devoted to timber production both as coppice system (1.48 million ha) and high forests (0.29 million ha). The chestnut-growing area devoted to fruit production is nowadays reduced and accounts only for 0.43 million hectares (19.3% of the total chestnut-growing area). Many ancient orchards abandoned at the beginning of the last century have been in fact coppiced because of the high incidence of the chestnut blight and of the demand for chestnut wood for tannin, mining and - especially in Spain - for barrels (Pitte 1986).

7. FUTURE PERSPECTIVES

Since 1990s, people have become more aware of the value of chestnut orchards as a multifunctional landscape element. In many countries they have begun to revitalize chestnut orchards as they see them as having aesthetic and ecological value, acting as tourist attractions, and serving as fire-breaks (Bounous et al. 1992). Besides the revitalisation of traditional orchards in marginal chestnut-growing areas, new plantations

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(or even re-grafted old orchards) with high-quality varieties (marrons and similar) or large-size Euro-Japanese varieties have been cultivated in several countries (mostly in France, Spain and Italy). In addition, the increasing demand for natural and environmentally friendly products in Europe and the recognition of the aesthetic, cultural and ecological value of managed chestnut ecosystems have led to more interest in the chestnut. As a consequence, traditional chestnut products have now more opportunities on the market (poles for land consolidation work or playgrounds, logs for flooring, chestnut flour for pasta production, certification of local cultivars, etc.) and new products (chestnut parquet, chestnut-laminated veneer boards, chestnut pasta, chestnut beer, etc.) have been launched. Some of these new products and new applications, such as finger- jointed beams, and shingles from the wood, and pasta, biscuits, beer from the fruit are particularly interesting because it is possible to produce them from small-sized chestnut timber or fruit. Despite this historical background, chestnut cultivation is thus at a turning point, being confronted with changing needs of a society that has moved from being rural to becoming industrial and urban-oriented. The development of the chestnut market in recent decades confirms the potential of this resource for both traditional products and new services and goods related to organic food and environmentally friendly products, especially in marginal and mountain areas. This allow us to conclude with an optimistic statement about the future of the European chestnut cultivation.

8. REFERENCES

Aira Rodriguez, M.J., Saa, P., Lopez, P., 1992. Cambios del paisaje durante el Holoceno: Analisis de polen en Turberas (Galicia, España). Revue de Paléobiologie, 11, 243-254. Bassi, D., 1993. Castagno da frutto: valorizziamo la qualità. Riv. frutticoltura, 55, 12: 39- 41. Blanco, A., Rubio, A., Sánchez, O., Elena, R., Gómez, V., Graña, D., 2000. Autoecologia de los castañares de Galicia (España). Invest. Agr.: Sist. Recur. For., 9, 2: 337-361. Bottema, S., Woldring, H., 1990. Anthropogenic indicators in the pollen record of the Eastern Mediterranean. In: Bottema, S., Entjes-Nieborg, G., van Zeist, W. (eds): Man's role in the shaping of the eastern Mediterranean Landscape. Balkema, Rotterdam, 231- 265. Bounous, G., Bouchet, M., Gourdon, L., 1992. Ricostituzione del castagneto a frutto tradizionale: interventi in Piemonte e nel Sud della Francia. Informatore Agrario, 9: 155- 160. Bourgeois, C., Sevrin, E., Lemaire, J., 2004. Le châtaignier: un arbre, un bois. 2nd revised edition, Institut pour le Développement Forestier, Paris. Conedera, M., Krebs, P., Tinner, W., Pradella, M., Torrioni, D., 2004a. The cultivation of Castanea sativa (Mill.) in Europe: from its origin to its diffusion on a continental scale. Vegetation History and Archaeobotany, 13, 3: 161-179.

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Conedera, M., Manetti, M.C., Giudici, F., Amorini, E., 2004b. Distribution and economic potential of the Sweet chestnut (Castanea sativa Mill.) in Europe. Ecol. Med. 30, 179- 193. Krebs, P., Conedera, M., Pradella, M., Torrioni, D., Felber, M., Tinner, W., 2004. Quaternary refugia of the sweet chestnut (Castanea sativa Mill.): an extended palynological approach. Vegetation History and Archaeobotany, 13, 145-160. Pitte, J.R., 1986. Terres de castanide. Hommes et paysages du châtaignier de l'Antiquité à nos jours. Librairie Arthème Fayard, Paris. Quirós Castillo, J.A., 1998. Cambios y transformaciones en el paisaje del Apenino toscano entre la Antigüedad Tardía y la Edad Media. El castaño. Archeologia Medievale, 25, 177-197. Rubio, A., Elena, R., Sánchez, O., Blanco, A., Sanchez, F., Gómez, V., 1999. Autoecologia de los castañares catalanes. Invest. Agr.: Sist. Recur. For., 8, 2: 387-405. Santos, L., Vidal Romani, J.R., Jalut, G., 2000. History of vegetation during the Holocene in the Courel and Queixa Sierras, Galicia, northwest Iberian Peninsula. Journal of Quaternary Science, 15, 621-632.

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CP1.02 THE CHESTNUT INDUSTRY IN FRANCE

Breisch, H., 149 av. Leclerc, 33220 Pineuilh, France

1 – THE PRODUCTION Along with other European countries, France has shown a great decline in its chestnut production during the past century. The causes for this decline are well known: the Industrial Revolution which promoted the abandonment of farming; the spread of the ink disease; the intensive exploitation of the wood of mature chestnut trees for its tannin; the introduction of new cultures, especially that of the potato which competed with the chestnut tree on poor acidic soils; and finally, the “green revolution” in the South-West, and other fruit trees (peach, cherry) in the South-East. Finally, from the sixties on, the fire blight has dealt a severe blow to an already weakened production. The development of the food industry did not help either since chestnut processing is difficult to mechanise. This decline is still ongoing in the traditional chestnut groves of France, except for Ardèche which has set up a number of programs in an attempt to counteract this general movement, and where the decline is less noticeable. A 35 year long wave of new plantations, especially in the South-West, is yielding 1,500t of Euro-Japanese hybrid varieties. The CNICM* inquiry in 1983 gave a national yield of 15,600t, a survey made by Ctifl* in 1993 gave 11,500t. In 2006 we estimate this yield at 7,000t. marketed. The growing area is estimated at 5,000ha. One can see two opposite tendencies: on the one hand, the traditional chestnut groves which are continuing to decline, and on the other hand, new hybrid orchards (Castanea sativa x C. crenata) which are expending and are bringing significant amounts of fruit on the market. Each of these two areas has chosen radically different ways of development. The South-East, with 4,000t of fruit production, wants to save its traditional output through Government sponsored restoration works on the old trees and through quality signs. The departement of Ardèche obtained in 2006 an AOC* “Chestnut from Ardèche”; Corsica obtained also an AOC* “Chestnut flour from Corsica”. Other Government programs, such as the creation of the “Regional Park of the Ardèche Mountains”, benefit this policy.The Cevennes departements, Gard, Lozère and Hérault, are also trying to establish an AOC*. One exception is the departement of Drome, which does not have any traditional groves and has planted 85ha of the hybrid variety Bouche de Bétizac. The South-West, with an output of 3000t, banks on modern orchards with hybrid varieties (Marigoule and Bouche de Bétizac). These plantations were begun around

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1970, and went at an irregular rate, depending on the flow of Government subsidies (50ha per year on average during the last ten years, with a peak at 100ha per year around 2000). These plantations experienced many failures, the main reason being a bad choice of soil (not deep enough, or too clayed). Some other problems are caused by the climate (winter frost), and by poor management (lack of horticultural training on the part of the producers). The hybrid yield is going on 1,300t per year, and the majority comes from the departements of Dordogne and Corrèze and their neighbours. The South-West is also trying to obtain quality signs and hopes to get an IGP and a Red Label by 2009-2010. The conversion to organic agriculture is an important movement in the French chestnut production. In both zones this choice is promoted with Government subsidies and is facilitated by the fact that chestnut trees are already grown most of the time without chemical fertilizers or pesticides. This conversion could bring better prices for the producers, except that the marketing of organic chestnuts is not organized and this market, as it stands, cannot absorb large amounts of fruit.

2 – THE MARKETING 75% of the yield is marketed through private dealers and 25 % through producer groups. The number of private dealers is decreasing: from 80 in 1983 to about 20 today, but each one deals with a greater amount of chestnuts and is more specialized. The producer groups who remain stable number 5 in the South-West and 6 in the South- East. In the South-West a group was founded with both producer groups and dealers, the Interprofessional Chestnut Union Périgord-Limousin, with the goal to organize the market around signs of quality: IGP and Red Label. This Union is representing 80 % of the South-West yield (one-third of the national yield). The average prices for the big size nuts G0 and G1 are considered good at 2 to 3 €/kg, but for the small size nuts prices are 1.50 € for G2 and 0.80 € for G3 and less for smaller. The outlets for fresh chestnuts are - exportation : 40 %, - wholesalers and supermarkets : 40 %, - others, among which the industry of “purée” and cream spread for the small size nuts. This is the least lucrative outlet. The balance between imports and exports has curiously remained stable for more than 35 years in spite of some fluctuations linked to annual yield variations. There is a big deficit in volume tonnage but a little less in total revenues because France exports its best fresh chestnuts, 2,000 to 3,000 t of premium quality (G0, G1 and G2) to northern Europe at an average of 2,00 €/kg, and imports 8,000 to 12,000 t medium (G3) and small size fresh chestnuts, at an average of 0,90 €/kg, from Italy, Spain and Portugal. France imports also from these same countries about 5,000 t of peeled frozen chestnuts

10 which are used in the whole peeled chestnuts industry.

3 – INDUSTRY

The processing industry is not expanding. The peeling industry for the whole peeled chestnut is decreasing, there are less peeling factories and more importations of peeled frozen chestnuts. The volume tonnage has decreased from 7,000 t in the nineties to 5,000 t today. The chestnut “purée” and cream spread industry remains stable, it reached a record in the years 1994-1996 with 9,000 t but is stable today at around 7,000 t. The confectionery industry is also decreasing with less than 500 t made in France, entirely supplied by Italy in steam peeled frozen chestnuts ; marron glacé is a little old- fashioned, only bought at Christmas, and chocolates pose a serious threat to it. Except for the vacuum-packed whole peeled chestnuts, the French industry has progressed very little in 30 years. The more easily made products, like cream spreads, are decreasing less rapidly than the more elaborate ones (whole peeled and confectionery). That is not a good sign of economic health for this industry. In contrast, small businesses are progressing: the number of small enterprises is increasing slightly but above all, the number of producers who process a portion of their yield (small size chestnuts) is increasing. Their activity and creativity play a dynamic role in the production of processed chestnuts with new products such as chestnut beer, liquor, biscuits, cakes, vegetal patties, roasted chestnuts in jars to reheat… We note also a revival of processing of chestnut flour in Corsica where this traditional activity was never lost, and also in Ardèche, Gard, Lozère and Corrèze. This impulse is based on the wish to have better returns with the small but good tasting chestnuts which are poorly paid on the traditional market. The roasted chestnut activity in the streets of the major towns remains seasonal.

4 – THE CONSUMPTION

Estimated at around 21,000 t between 1983 and 1993, the French chestnut consumption seems to have decreased slightly down to around 20,000 t, that is to say, the average consumption per person today is 320 g. We observe two different attitudes depending on the age of the consumer : the older generation is very familiar with this fruit, it brings back memories of winter evenings by the fireplace, the odour of roasted chestnuts, the gathering in the woods in autumn; these people like chestnuts with a melting kernel and naturally sweet. In contrast, city

11 dwelling younger generations do not share this heritage; chestnut is a new product, a curiosity, some of them like it, others don’t; usually, this section of population prefers firm and crunchy chestnuts.

5 – TECHNICAL IMPROVEMENTS APPLIED TO THE PRODUCTION

5.1. Plant material INRA*has selected hybrid varieties from Japanese seedlings introduced in France during the first part of the 20th century: Marigoule, widely grown for 35 years, Précoce Migoule and Bournette, as varieties, and Marsol and Maraval, as rootstocks. Then INRA* created by breeding Bouche de Bétizac (C. sativa Bouche Rouge x C. crenata CA 04) which is now planted in the same ratio as Marigoule. Subsequent breeding programs were not successful, but some new varieties are today undergoing behaviour testings. Recently, a diallele breading program was set up to find resistant plants to both ink disease and blight canker. INRA is currently doing the characterisation of a wide panel of French chestnut varieties by molecular biology in the framework of the European INTERREG program. Pollinization has been much studied in France and the selection for good pollinizers resulted at first in pure C. sativa varieties such as Belle Epine, Marron de Goujounac, Verdale, Marron de Chevanceaux… However because of their great susceptibility to blight canker we are turning today to the less susceptible pollinizers C. mollissima such as Fertil CA 75. They are planted in a 15 % ratio when there are no other chestnut trees surrounding the orchard.

5.2. Propagation and scion certification The traditional vegetative propagation method is the stool-bed layering with girdling. Research into micro-propagation from INRA* Bordeaux and on herbaceous stem cuttings (INRA*, Ctifl*) has resulted in a first-propagation of varieties and rootstocks by Agri-Obtentions at Dijon and finally propagation in commercial nurseries. Grafting in nurseries has always been a difficult process, some progress have been made by herbaceous micro-grafting in greenhouses and also, more classically, with “Cadillac” grafting (a slope on the side of the rootstock). The fruit scion certification was applied to chestnut trees to remedy the problem of lack of quality. Marigoule and Marsol are certified, and Bouche de Bétizac will be in 2008. The guaranties of quality are given by: - Certification for the variety and the rootstock authenticity and for the absence of degenerative diseases (Chestnut Mosaïc Virus).

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- Inspections of SPV* for blight canker (quarantine disease which requires the European phytosanitary passport) ; - The choice of hybrid material and the general rules for product quality which bring a certain amount of guaranty against ink disease.

5.3. Pests and diseases management Ink disease (Phytophthora spp): the orchards are made exclusively with ink disease resistant hybrid material for rootstocks and direct varieties such as Marigoule. The experiences with C. sativa rootstocks in France were unsuccessful.

Chestnut blight canker (Cryphonectria parasitica): France has set up a biological control with hypovirulent strains and practices this control on a large scale. Currently Agri- Obtentions and Biorisa are processing the hypovirulent product. This product is difficult to register under the present rules (too expensive). In chemical control no strategy has been set up although an active ingredient, methyl-thiophanate, has shown interesting results when preventively applied on wounds.

Chestnut tree decline with bubbly bark: a study by Ctifl* clarifies this complex phenomenon to which several factors such as soil depth, soil water stress, and winter frost, contribute.

Chestnut gall wasp (Dryocosmus kuriphilus): this little hymenoptera is a huge threat for all the European chestnut tree; it is now present in several regions of Italy (Piemont, Campany, Tuscany, Abruzzi, Lazio) where its devastations are considerable, also in Slovenia, and in a little area in South-East France recently discovered just near the Italian border. A biological control is feasible but its set up is always long and a posteriori. Bouche de Bétizac is the only variety able to resist this pest. France is trying to protect itself with sanitary measures. A European measure was published in 2006.

Chestnut coddling moth (Cydia splendana): a recent biological study done by J. Delisle from Quebec University has clarified the cycle: emergence – egg laying - larvae hatching. P. Witzgall from Alnarp University (Sweden) has set up a sex pheromone “G3” and we are currently comparing it with the Italian one from Isagro. It seems that there are different strains of chestnut codling moths in the French areas with a different response each to the sex pheromones. In chemical control, each year CIREA* puts on product trials and it has obtained the registration for two products: one with the active ingredient tebufenozide, and the other

13 with diflubenzuron. In contrast the granulosis virus is considered ineffective. The hypothesis is that young larvae do not feed between hatching and penetration in the bur, so it’s necessary to use an ovicide or a contact insecticide, since ingestion insecticides alone do not work on chestnut codling moths. A biological control by entomopathogen nematods is being tested by the CIREA* but its application to orchards is not yet established.

Chestnut fruit rots: Black rot (Ciboria batschiana) was studied biologically by ULRAC* and SEFRA* and the contamination patterns should soon be anticipated mathematically. Brown rots (Phomopsis castaneae and Botrytis cinerea) are also being studied biologically and chemical tests were made in laboratory by Ctifl*. The results of the trials in orchards were poor, apparently due to bad timing. We think that fungicides have to be applied before flowering. This is a very delicate subject because French producers have suffered severe damage to the 2006 crop following weather conditions extremely favourable to the fungus: rains and warm weather before and during the whole harvest.

5.4. Storage Cold room storing is the main method, but we sometimes use slightly negative temperatures (-1°C to -3°C). The old methods of soaking in cold water have been widely tested and remain valid. Soaking in hot water is not used in France but we have tested it to kill insect larvae. Modified atmosphere and respiratory intensity were recently studied and the results show that 2 % oxygen and 15 to 20 % carbon dioxide are the best ratio for long term storage without taste modification. Fumigation to control chestnut pests will still be made with methyl-bromide up to 2007 or maybe 2008 (the last year). A new product with fluoride sulphur is in process of certification but this chemical is very toxic and it leaves fluoride residues. We wish to test a natural fumigant discovered in Australia and non dangerous: ethyl-formiate.

5.5. Mechanical harvesting After a period when we had seen a lot of prototypes built by producers or small artisans, we now see today on the market some self-propelled harvesters from major manufacturers. They are all coming from walnut and hazelnut harvesting: Rousset, Mecanicagri (US licence Flory) in France, FACMA, Monchiero in Italy. Ctifl* has built a new machine to mechanize the harvesting with nets. Our studies have shown that it is better to harvest very quickly without sorting the waste (burs, leaves, pieces of wood…) taking care not to let it fall back on the orchard soil so as not to pick up this waste again

14 at the following harvest some days later. These types of harvesters require for the chestnut producer to set up sorting and cleaning stations before delivery of the chestnuts to the cooperative or to the dealer.

6 – CONCLUSION

The decrease in production, in industrial manufacturing and in consumer demand has, consequently, diminished the economical vitality of the industry. The French chestnut industry is hiding its fragility behind a certain parallelism between decreasing yield and decreasing consumption, so that selling prices remain stable. The producers are showing signs of a revival of this ancestral production through new plantations and through heirloom saving works. The popular picture of a natural fruit, the concern for the protection of the environment, the technical improvements, are all to the great advantage of the producers. On the eve of the gall wasp invasion into the French chestnut groves, the chestnut’s entrance into a modern era remains difficult. Modernization could be characterized by a cleaning up of the production through the progressive elimination of the scattered parts of the traditional production, which is not able to progress and for which the sanitary state is impossible to control. The French chestnut industry has on its side several reasons to progress but the weakness of its economical media keeps it at risk.

*Abbreviations: CNICM: National and Interprofessional Committy for Chestnuts AOC: Mark guaranteeing the Quality IGP: Mark guaranteeing Geographical Origin INRA: National Institute for Agronomical Research Ctifl: Technical Institute for fruits and Vegetables SPV: Sanitary Service for Plants CIREA: Regional Centre for Horticulture in Aquitaine ULRAC: Union for Chestnuts in Languedoc-Roussillon SEFRA: Regional Centre for fruits in Rhône-Alpes.

Literature cited: BREISCH, H., 1995. Châtaignes et Marrons. Ctifl, Paris, 240 p. Douanes Françaises. Importations et exportations de châtaignes fraîches n° 08024000. MILLAN, C. and GAUTHIER, J.L., 1984. Production et commercialisation des châtaignes et marrons en France. CNICM. 109 p. Union Interprofessionnelle Châtaigne Périgord-Limousin. Compte rendu assemblée générale 2006.

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Acknowledgements to Odile and Mike PATRICK for the English version rereading.

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CP1.03 PERSPECTIVAS DO MERCADO DA CASTANHA E SUA TRANSFORMAÇÃO Álvaro Cotto

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CP1.04 PERSPECTIVAS FUTURAS PARA O CASTANHEIRO, NOS SEUS ASPECTOS CULTURAIS E COMERCIAIS

Rui Oliveira e Silva Director da Estação Florestal Nacional

O castanheiro europeu (Castanea sativa Mill) é uma espécie com grande importância para a economia da região de Trás-os-Montes onde ocupa a maior área da sua distribuição (83,4%) seguindo-se a região da Beira Litoral com 12.6%. A produção de castanha em Trás-os-Montes é cerca de 28 600 toneladas, com uma produção média de 1ton/ha. Contribuindo este produto com 9 373 000 euros para o Mercado Internacional de Exportação, no qual a castanha ocupa o 2º lugar nos produtos agrícolas exportados. (Estatísticas Regionais da Produção Vegetal e Animal 1999- 2000, INE, 2002 e Estatísticas agrícolas, 2001, INE, 2002), existindo, todavia, potencial para aumentar a produção para 3 toneladas/ha, assim como para aumentar a área de produção de 23000ha para 70000 (a área de castanheiro existente nos anos 50). Sendo o castanheiro (Castanea sativa Mill.) uma árvore ambiental e economicamente importante para a produção de fruto, madeira e protecção da paisagem, tem, no entanto,uma forte susceptibilidade a doenças graves, as quais têm sido responsáveis pela redução da sua área de distribuição em toda a Europa, uma vez que as suas raízes são muito sensíveis à doença da tinta, causada pela Phytophthora cinnamomi e P. cambivora. A Chryphonectria parasitica, responsável pelo cancro do castanheiro, é igualmente um patogénio que afecta os pomares enxertados, infectando as árvores numa grande variedade de condições ecológicas. Na Europa, os programas de melhoramento realizados após o aparecimento da doença da tinta, têm-se centrado na criação de híbridos inter-específicos, para a criação de genótipos resistentes, que têm sido usados como porta-enxertos resistentes para a produção de fruto. As primeiras hibridações efectuadas em Portugal foram iniciadas em 1947 por Bernardino Barros Gomes, trabalho este seguido por outros investigadores, como Columbano Fernandes. Os genótipos resultantes destes programas de melhoramento, não possuem, no entanto, registos conhecidos, nomeadamente não se conhecem os progenitores, que lhes deram origem. Os patogénios e os factores climáticos têm sido identificados como os maiores constrangimentos para a qualidade e produtividade das espécies lenhosas, assim como ameaças para a sustentabilidade da paisagem. Um conhecimento mais profundo da resposta das plantas a diferentes tipos de stresse, como são os provocados por pestes e doenças, a identificação de genótipos resistentes e o desenvolvimento de selecção assistida por marcadores moleculares é essencial na formulação de estratégias futuras de melhoramento, com o objectivo de aumentar a produtividade dos sistemas florestais. Actualmente é necessário utilizar a tecnologia disponível, nomeadamente abordagens genómicas, de modo a preservar os recursos genéticos do castanheiro na Europa, possibilitando o desenvolvimento de ferramentas para melhorar o conhecimento dos mecanismos de defesa contra os patogénios, numa família tão importante como é a das Fagáceas, Com o objectivo de criar genótipos resistentes aos patogéneos, responsáveis pelas doenças da tinta e do cancro, e ainda com o objectivo de iniciar estudos para a identificação dos genes de resistência à doença da tinta e do cancro, foi iniciado recentemente pela Estação Florestal Nacional um programa de melhoramento para castanheiro. Neste momento possuímos duas famílias híbridas, resultantes dos cruzamentos controlados, efectuados em 2006 no campo de germoplasma da UTAD, entre C. sativa e C.crenata, para a introdução de resistência à doença da tinta e C. sativa e C mollissima para a resistência ao cancro. Os cerca de 200 indivíduos resultantes, encontram-se já genotipados para 10 loci com microssatélites nucleares e este é um trabalho pioneiro a nível nacional. Estas populações serão agora utilizadas 18 para encontrar marcas moleculares relacionadas com a resistência à doença da tinta e ao cancro.

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Sessão 2 Biologia, Fisiologia, Genética / Biología, Fisiología, Genética

CP2.01 EL CASTAÑO: BIOLOGÍA, FISIOLOGÍA, GENÉTICA

António Ballester

Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia, CSIC, Apartado 122, 15080 Santiago de Compostela, España; e-mail: [email protected]

La investigación europea en castaño en las áreas de la biología, la fisiología y la genética, parece seguir, en los últimos años, una tendencia hacia la estabilización, sin haberse desarrollado una doctrina uniforme que permita definir claramente los objetivos que se persiguen. Quizá lo más significativo sea el empleo, en los últimos años, de marcadores moleculares que están permitiendo conocer la estructura genética de distintas poblaciones europeas, su evolución y adaptación a posibles cambios en las condiciones climáticas. Sin embargo, los estudios conducentes a la mejora de la especie, sobre todo en relación con la resistencia a enfermedades, y a la selección y adaptación de las variedades más productivas no han recibido un impulso significativo. En este trabajo se pretenden resumir los avances desarrollados en los últimos años en las disciplinas señaladas en el título, seleccionando sólo algunos aspectos bien porque existe un estudio prolongado en el tiempo o bien por su novedad y posibilidad de desarrollo futuro.

Biología, Fisiología, Ecofisiología

La propagación vegetativa es un aspecto fundamental para mantener las características genéticas de material a propagar y como una herramienta para utilizar en los programas de mejora, ya que la ganancia genética es siempre más rápida que por medio de la propagación sexual. Sin embargo, el castaño es una especie recalcitrante al enraizamiento, por lo que el estaquillado está limitado a material juvenil y sólo la producción de renuevos mediante el acodo permite la propagación clonal, aunque a un coste elevado por la superficie ocupada y por los gastos de personal. Los conocimientos a nivel fisiológico o bioquímico del proceso de enraizamiento en castaño son limitados, aunque algo se ha avanzado en los últimos años. Para ello ha sido necesario desarrollar sistemas experimentales que permitiesen estudiar material vegetal del mismo genotipo que mostrara una alta o baja capacidad de enraizamiento.

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En concreto, se han utilizado brotes de la copa (adultos, con bajo enraizamiento) y de la base (juveniles, con elevado enraizamiento) de árboles para establecer los cultivos y estudiar, a nivel histológico, fisiológico y bioquímico el proceso. Se ha determinado que la concentración endógena de reguladores de crecimiento en la base de las estaquillas no es el factor que limita la capacidad de enraizamiento de las mismas, ya que en material adulto se ha encontrado mayor concentración de ácido indol-acético libre que en material juvenil. Después de la inducción del enraizamiento, desde el punto de vista histológico se inician las divisiones celulares tanto en material juvenil como adulto, pero, al cabo de 3 días, sólo se observan células meristemáticas que se agrupan formando primordios de raíz en el material juvenil que tiene capacidad de enraizamiento. En el material adulto, sólo se forma callo indiferenciado. Parece claro que las células más juveniles tengan también más receptores del AIA que las células adultas, lo que les permitiría metabolizar mejor la auxina en las primeras que en las segundas. Se piensa, de cualquier forma, que el proceso de enraizamiento adventicio en especies recalcitrantes debe abordarse a nivel molecular, es decir, en la búsqueda de genes que, de alguna forma, estén relacionados con el proceso. Mediante la técnica del “differencial display” y mediante el uso de genes candidatos, se está estudiando el enraizamiento en castaño a nivel molecular. Se han encontrado también marcadores fenólicos que permiten discriminar entre clones de castaños que muestran un elevada capacidad morfogenética de aquéllos de baja capacidad. La biotecnología es una herramienta que se utiliza hoy para la propagación vegetativa de clones de castaño no sólo a nivel de investigación sino también a escala comercial, bien a partir del desarrollo de yemas axilares o bien a partir de la inducción de embriones somáticos. Los sistemas están perfectamente definidos y pueden ser de una gran ayuda en la propagación a gran escala de genotipos seleccionados. Esta propagación masiva se puede hacer en un espacio de tiempo relativamente corto y las plantas derivadas del proceso in vitro muestran unas características iguales a los parentales correspondientes, no sólo desde el punto de vista de la morfología sino también desde el punto de vista molecular. Asociado con este aspecto está la conservación del germoplasma mediante técnicas biotecnológicas que permite el almacenamiento de genotipos seleccionados por tiempo indefinido en nitrógeno líquido, pudiéndose desarrollar bancos de germoplasma que pueden complementar con los sistemas de conservación convencionales. En los últimos años se han desarrollado una serie de interesantes trabajos de ecofisiología para conocer la adaptación del castaño al posible aumento de temperaturas de los próximos años, si se cumpliesen las previsiones que predice la

21 teoría del cambio global. El grupo del Prof. Gomes-Laranjo ha estudiando la termotolerancia de 3 variedades de C. sativa durante el ciclo vegetativo así como la respuesta fotosintética de clones híbridos y variedades de C. sativa comprobando cómo se agrupan. Estos estudios están también relacionados con la posible susceptibilidad del castaño a la enfermedad de la tinta y su relación con el aumento de temperatura. En una línea de investigación parecida y utilizando el estudio de caracteres fenológicos y discriminación isotópica de carbono, otros autores demuestran la plasticidad del castaño y determinan el carácter genético de la posible adaptabilidad de la especie a sequía y aumento de la temperatura.

Biotecnología, Genética

Los programas de mejora genética en Europa han tenido un desarrollo completamente diferente a los desarrollados en Estados Unidos. En Europa, el mayor interés ha sido la producción de híbridos con mayor o menor grado de resistencia a la tinta, sin tener en cuenta el efecto de la integración de genes asiáticos en el genoma del castaño europeo. Estos híbridos de primera o segunda generación se han utilizado en plantaciones dificultando, si cabe, el conocimiento del origen y la evolución de poblaciones específicas y concretas. En cuanto a la enfermedad del chancro, la aparición del fenómeno de la hipovirulencia en Europa ha diluido el interés por la enfermedad y no se han desarrollado auténticos programas de mejora contra la misma. Las colecciones de híbridos resistentes no se han evaluado a lo largo del tiempo, con lo que el productor no tiene una información clara y precisa sobre si lo que va a adquirir en un momento determinado es un buen castaño para producir fruto o madera. Por otra parte, al menos en España, tampoco hay una buena información sobre las mejores variedades de fruto. Sólo en Galicia, se han descrito 143 cultivares diferentes y en Andalucía alrededor de 40. Pero esta diversidad, importante desde el punto de vista genético, es un problema también importante a la hora de comercializar e industrializar el producto: no hay estudios agronómicos que permitan aconsejar el cultivo de una variedad determinada en una zona geográfica específica y obtener con ello el máximo rendimiento económico posible. En nuestro conocimiento, sólo en el INRA de Burdeos y en el seno de la empresa española Tragsa (Maceda, Ourense) se están llevando a cabo programas de selección y mejora de material vegetal con cierto grado de resistencia a las enfermedades de la tinta y del chancro no sólo para la producción de fruto sino también de madera. Frente a estos programas clásicos de mejora, que por la propia naturaleza de la especie se alargan ineludiblemente en el tiempo, se ha propuesto en los últimos años el

22 uso de una herramienta biotecnológica, como es la de la transformación genética, como método de acortar el tiempo de estos programas mediante la inserción de genes que aumenten la tolerancia o resistencia a los patógenos. El rechazo al material transgénico parece evidente pero una discusión abierta y distendida puede aclarar el futuro investigador en este campo. En los últimos años y como complemento de los estudios isoenzimáticos llevados a cabo, se ha utilizado el uso de marcadores moleculares de forma genérica, entre otras cosas, para conocer el fondo genético del castaño en diferentes países europeos, el flujo génico, evolución, diversidad, caracterización de variedades, etc. Se han utilizado no sólo técnicas RAPDs, AFLP, QTLs, microsatélites, etc., sino también proteínas de reserva como globulinas y albuminas. Cuando los resultados obtenidos mediante estas técnicas se comparan con los obtenidos mediante otros métodos, por ejemplo, con medidas morfométricas, se llega, en muchos casos, a situaciones muy confusas. Esta confusión la hemos vivido nosotros mismos, al no ser capaces de diferenciar las distintas especies de castaño mediante el estudio de las regiones del ADN nuclear y ribosomal ITS-1 e ITS-2 de las diferentes especies nativas. La región ITS en el género Castanea, a diferencia de lo que ocurre en el 90% de otras familias, no es de utilidad para la identificación de las especies. Los datos mostraron la existencia de numerosas copias diferentes de la región y la ausencia de evolución concertada, característica de la región analizada. Se analizaron otras posibles regiones descritas en la bibliografía, entre los cuales se encontraban genes nucleares, como waxy y cyclodia y regiones codificadoras o espaciadoras de cloroplastos, como rps16, rp116, matK, rbcL. En los casos en que fue posible la amplificación y la secuenciación, el análisis de los datos mostró muy poca variación interespecífica. No sólo desde el punto de vista investigador sino también desde el punto de vista del sector productivo, sería muy interesante incentivar una discusión abierta y rigurosa sobre el uso de los marcadores moleculares aplicados a la mejora del castaño.

Agradecimientos Se agradece la ayuda económica del Ministerio de Educación y Ciencia (España) a través del proyecto AGL2005-00709.

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CP2.02 O CASTANHEIRO NA ESTRATÉGIA NACIONAL PARA AS FLORESTAS

Maria Loreto Monteiro 1 Eng. silvicultora, Prof. Coordenadora IPB-ESAB, Subdirectora da DGRF Direcção-Geral dos Recursos Florestais; Avª João Crisóstomo, 28, 4ºandar, 1069-040 Lisboa; Portugal

Durante o século XX, o sector florestal português teve um desempenho surpreendente, como se demonstra na Estratégia Nacional para as Florestas (ENF). Uma estimativa relativa a 2001 apontava o valor de 1,3 mil milhões de euros como sendo a produção económica total anual efectiva da floresta no Continente, não descontando as externalidades negativas (Mendes, 2005). Esta abordagem permite a comparação com estimativas equivalentes do valor por unidade de área efectuadas para os países do Mediterrâneo em estudos coordenados por Merlo e Croitoru (2005) e divulgados pelo Millenium Ecosystem Assessment (2005). Desses estudos conclui-se que o valor económico total das florestas do Continente ultrapassa em muito, por unidade de área, os valores encontrados para outros países mediterrâneos, tanto em produtos comerciais como em produtos ambientais. Portugal extrai mais riqueza de um hectare de terra florestal do Continente (344 euros/ha/ano) do que qualquer outro país do Mediterrâneo e esta comparação inclui países como a França (292 euros/ha/ano) e a Espanha (90 euros/ha/ano). Conclui-se, por isso, que a contribuição anual das florestas para o bem-estar público é muito superior em Portugal comparativamente a outros países do Mediterrâneo, o que demonstra uma taxa de utilização da terra florestal eficiente. Desta análise também se conclui que o elevado valor económico total da floresta não se refere apenas à sua realização comercial, mas também aos serviços ambientais e sociais que presta (DGRF, 2007). Por outro lado, a floresta tem sido a base de um sector da economia que gera cerca de 113 mil empregos directos ou seja 2% da população activa. Este número tem-se mantido mais ou menos constante durante as últimas duas décadas o que, com o nível de produção que se tem verificado, sugere um crescimento na produtividade do trabalho no sector. O sector representa também cerca de 10% das exportações e 3% do Valor Acrescentado Bruto, valor só ultrapassado na Europa dos 15 pela Finlândia e Suécia. A par da elevada produtividade e da integração vertical, o sector florestal é também positivamente atípico em relação ao de muitos outros países pela diversificação da

24 actividade económica que apresenta. Para além dos produtos madeireiros baseados nas duas espécies dominantes na produção lenhosa, pinheiro e eucalipto, e da actividade corticeira, o sector florestal tem outros pólos economicamente activos a uma escala local. É o caso da produção de frutos secos cuja produção tem aumentado de valor ao longo das últimas duas décadas, embora, no que diz respeito à castanha, os dados do INE, mostram, nos últimos quatros anos, uma redução na produção de castanha traduzida numa diminuição da sua importância económica de 35 062 milhares de euros, em 2003, para 18 854 milhares de euros, em 2005. A matriz estruturante do valor das florestas constante na ENF (DGRF, 2007) apresenta o valor 830 euros/ha associado ao ecossistema florestal do castanheiro, considerando neste valor a produção de madeira serrada, de biomassa para a energia, de castanha, de pastagem, de cogumelos e aromáticas, bem como os usos indirectos (regime hídrico, desertificação e biodiversidade). Este valor agrega riscos associados aos incêndios florestais, sendo necessário vir a calcular-se os riscos ligados às doenças que tanto têm afectado o castanheiro. Deste modo, de forma a manter os altos valores económicos associados à floresta e de lhe assegurar competitividade e sustentabilidade, há que garantir que a diminuição dos riscos, tanto reais como percebidos, constitua uma componente importante da estratégia florestal para a próxima década. Na actividade florestal sempre houve riscos, mas a magnitude que estes actualmente alcançaram é um fenómeno novo, interessando, por isso, rever os factores que contribuíram para tal mudança de contexto. É sabido que as alterações climáticas e a previsão dos impactos do efeito de estufa a uma escala regional, convergem nas projecções de aquecimento terrestre, acumulando-se evidência de que estes efeitos vão ser sentidos fortemente. Análises mais regionalizadas indicam uma vulnerabilidade especial para a região mediterrânica onde Portugal está integrado, conduzindo, necessariamente ao aumento das doenças. Em consequência das alterações climáticas, poderão verificar-se mudanças quanto ao domínio de algumas espécies e nas áreas de distribuição dos diversos tipos de floresta, assim como um aumento do risco de desertificação, podendo algumas espécies florestais sofrer mortalidade acentuada no limite mais seco da sua actual área de distribuição. De modo a maximizar o valor económico total da floresta num território diversificado devem utilizar-se as espécies e os sistemas que maior riqueza social possam extrair de um hectare de terra. A ENF especializa o território continental português em três tipos de áreas com base no conceito de função dominante: área de produção lenhosa; área

25 de gestão multifuncional; áreas costeiras e outras áreas classificadas. Como resultado da especialização do território e do reordenamento da ocupação florestal a ela associado, prevê-se que, em 2030, as áreas de ocupação com castanheiro, por Planos Regionais de Ordenamento Florestal (PROF), desenvolvidos na sequência da Lei de Bases da Política Florestal (Lei nº 33/96), sobretudo na área correspondente aos sistemas multifuncionais, mas, também, na área de Produção Lenhosa, deverão atingir 90 000 ha. Refira-se que os dados do IFN (2005-2006) indicam uma área de ocupação de 28 200 ha para esta espécie. Assim, haverá que operar esforços consideráveis para atingir a meta de 2030, incorporando e aprofundando o conhecimento científico existente, nomeadamente, ao nível da gestão sustentada dos espaços florestais com castanheiro, quer em alto fuste quer em talhadia. Para tal, dever-se-á gerir a regeneração natural e aplicar modelos silvícolas testados para produção de madeira de pequenas, médias e grandes dimensões, considerando: (i) a potencialidade produtiva do castanheiro (equações de predição de volume, biomassa e relações hipsométricas e definição de índices de qualidade da estação); (ii)a caracterização, quantificação e composição da biomassa, quer por via da avaliação da biomassa ao nível do solo e da parte aérea das árvores abatidas, quer da determinação do tipo e densidade aparente do solo, a fim de tornar sustentável este sistema; (iii) a aplicação de indicadores sócio-económicos das externalidades do ecossistema castanheiro. Bibliografia CESE – 1996. O Sector Florestal Português, Documento de Apoio ao Seminário do CESE. Póvoa do Varzim: Grupo de Trabalho sobre o Sector Florestal. Comissão das Alterações Climáticas – 2003. Programa Nacional para as Alterações Climáticas. Lisboa: Instituto do Ambiente. DGF – 1997. Actas do Workshop Regulamentação da Lei de Base da Política Florestal. Tróia: Direcção Geral das Florestas. DGF – 1998. Plano de Desenvolvimento Sustentável das Florestas Portuguesas. Lisboa: Direcção-Geral das Florestas. DGF – 2001. Inventário Florestal Nacional, Portugal Continental, 3ª Revisão 1995 – 1998. Lisboa: Direcção-Geral das Florestas. DGF – 2007. Inventário Florestal Nacional, 2005 – 2006. Lisboa: Direcção-Geral das Florestas (não publicado). DGRF – 2007. Estratégia Nacional para as Florestas. Lisboa: Imprensa Nacional-Casa da Moeda. INE – 2002. Contas Económicas da Silvicultura, 1990 – 2001, Quadros estatísticos. Lisboa: Instituto Nacional de Estatística. Destaque do INE. INE – 2005. Série de dados das Contas Nacionais para o Ramo Silvicultura (02) e VAB Nacional. Lisboa: Instituto Nacional de Estatística. Mendes, A. – 2005. Portugal.. Wallingford, Oxfordshire: CABI Publishing, CAB International, páginas 331-371 da publicação Valuing Mediterranean Forests, Towards Total Economic Value de Merlo e Croitoru. Mendes, A; [et al.]. – 2004. The Portuguese Forests. Country level report delivered to the EFFE Project, Evaluating Financing of Forestry in Europe. Porto: Portuguese catholic university, Porto Regional Center, Faculty of Economics and Management.

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Merlo, M; Croitoru, L. – 2005. Valuing Mediterranean Forests, Towards Total Economic Value. Wallingford, Oxfordshire: CABI Publishing, CAB International. Millennium Ecosystem Assessment – 2005. Living Beyond Our Means, Natural Assets and Human Well – Being, Statement from the Board. Publication Draft. Washington, DC: World Resources Institute, Millennium Ecosystem Assesment, Prepublication draft. Santos, F.; [et al.] – 2002. Climate Change In Portugal Scenarios, Impacts and Adaptation Mesures, Siam Project. Lisboa: Grávida. Santos, F; Miranda, P. (editores) – 2006. Alterações Climáticas em Portugal. Cenários, Impactos e Medidas de Adaptação - Projecto SIAM II. Lisboa: Grávida. SICOP – 2006. Sistema de Informação de Cotações de Produtos Florestais na Produção. http://cryptomeria.dgrf.min-agricultura.pt/.

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CP2.03 SWEET CHESTNUT (CASTANEA SATIVA): A NUT TREE WITH GREAT POTENTIAL STILL TO BE EXPLOITED

Stephanos Diamandis Stephanos Diamandis NAGREF – Forest Research Institute, Thessaloniki, Greece

INTRODUCTION History around chestnuts Almost 2500 years ago, Sweet chestnut (Castanea sativa) traveled a long way from the Balkans along the Southern European coast to reach the Iberian Peninsula and become one of its most important native trees. Palaeontological data show the presence of the chestnut tree in Europe, primarily in France, Italy, Austria, Hungary and the Balkan Peninsula, at least during the Tertiary Period. Vast chestnut forests existed in the Middle East during prehistoric years, particularly on the plateaux of Iran and Iraq. This evidence is supported by archaeological finds from the 2nd century BC. Pollen analyses shows that N. Greece had chestnut trees during the 10th Century BC (Athanasiadis 1975). The movement of populations seems to have been the major element which promoted the spread of chestnut into and throughout the Balkan Peninsula and constituted a crucial factor in the subsequent formation of vast chestnut forests. The countries of the Middle East were the most notable centres of chestnut cultivation during antiquity. They developed, spread and improved varieties that were of great economic value. During the 5th century BC, these improved varieties were carried from Asia Minor into Greece and then from Greece into Italy and Spain. Theophrastus, the father of botany, has likewise recorded that the chestnut tree was well known in ancient Greece by the name of “Dios balanos” (Zeus acorn). Vast forests existed all over the mainland of Greece. In fact, several villages existed from ancient times bearing the name of Kastania. The most prominent of these was the village of “Kasthanea” in the foothills of Mount Pelion where we learn from the historian Stravon (64 BC – 24 AD) that chestnuts were exported from its harbour. According to Dimoulas 1986, the chestnut tree or “castania” probably owes its name to this small village. The Romans systematically spread the tree over large areas. At the same time, they were interested in the genetic improvement of the chestnut trees in order to produce more valuable fruit and wood. Chestnut orchards with grafted trees were created in all the territories acquired by the Romans. Chestnut cultivation continued to thrive

28 throughout the Byzantine period. The Emperor Constantine the Porferogenetos (900 – 959 AD) ordered, Kassios Bassos, the well known naturalist of the time, to add chestnut cultivation to his writings on the subject of Agriculture.

Unique features Along with the English walnut (Juglans regia), sweet chestnut is indeed a unique tree because it produces nutritious nuts on an annual basis, it produces valuable timber, it is a fast growing species and it can grow on the poor, acidic soils of mountainous areas. In certain areas along the European Mediterranean coast, chestnut comprises the main crop that is grown. Chestnuts are deficient in the world market so there is great potential for further extension of its cultivation. The nuts can be processed into a large variety of products adding value to an already valuable product. Indeed, from the economic point of view there are many reasons why sweet chestnut is an important tree for the Mediterranean belt of Europe. Consumption of raw, roasted or boiled and also processed nuts in southern Europe is high. However, the prospects for improving the existing market or opening other new and dynamic markets in Central and Northern Europe, North and South America and elsewhere are promising. Main points to stress in order to advertise its value are its purity (wholesomeness) as a product for organic cultivation, its high nutritional value, its cultural history and its range of excellent processed products.

Nuts Long cultural history and gastronomic tradition surrounds chestnuts all over Southern Europe. During periods of poverty and hard times, entire nations survived on chestnuts. The nutritional value of chestnut is considered similar to that of wheat and rice (Burnett, 1988). Corsica has always relied on chestnuts as its single starch source. Similar cases are encountered in southern Switzerland, the Apenines in Italy, and further east in Greece and Turkey. In many mountainous areas of Greece, chestnuts have been considered a basic food source for many years. In the mountains of Arkadia in Central Peloponnese, there is a small public chestnut orchard of 200 ha along the valley of a little creek near the village of Ambelionas. This orchard is said to have been established by the Venetians in the 13th Century. In olden times, during the season when the chestnuts ripened, people came from far and wide to reap this delicious harvest. The mayor of the village, in order to be fair, found it necessary to put guards on the orchard and allow gathering of chestnuts only one day of each week. In this way he gave equal opportunity to all of the

29 people to gather chestnuts. The citizens of Ambelionas boiled the chestnuts in large kettles in the middle of the night. In the morning while the chestnuts were still warm, they sacked and loaded them onto mules and then transported them to the farmers’ markets of larger surrounding villages to be sold. Chestnuts were so popular that all the streets of the market place were said to be strewn with the hulls. In Kastanitsa, another mountainous village in Arkadia, local people dried their sweet chestnuts in the sun for a few days and then they were lightly roasted in ovens and shelled. After shelling they roasted them in the ovens again at a higher temperature and were able to keep them through the winter. Chestnut gathering in those days was a celebration. Workers were hired from the surrounding villages and were given chestnuts for their wages. The end of the chestnut harvest in Kastanitsa was commemorated with a large banquet with much food and wine. I guess other villages in all chestnut producing countries have similar stories to tell. Chestnuts are associated in the minds of most people with autumn and winter scenes. The memory of hot chestnuts taken from the fireplace on cold fall or winter nights and the sound of Grandma’s voice telling stories to the grandchildren is a picture that people of my generation will remember for all their lives. The Christmas turkey could not possibly go into the oven without chestnuts in the stuffing. It rests with us keep such traditions alive and to pass them on, unchanged, to future generations.

Wood Chestnut wood was highly appreciated in the old days for its resistance to decay. In the early years it provided timber for construction, furniture, fence posts, and later for railway ties and telephone poles. Barrel makers valued its wood for making excellent wine barrels. It was also used to produce charcoal which was preferred for use by blacksmiths as well as in jewellery and dental workshops. Nowadays, chestnut wood is used in high quality furniture, musical instruments, pulp and plywood, house construction and especially in outdoor construction because of its durability. Floors made of chestnut parquet, doors, window frames as well as furniture are particularly popular and appreciated. Today we can see wooden constructions which are hundreds of years and still in excellent condition because they were built with chestnut wood. Sweet chestnut should be used more widely in reforestation projects. Coppice forests produce satisfactory income to the owner while at the same time function and serve as natural, dense ecosystems. We should also bear in mind that as the voices all over the world become louder for the protection of the rain forests, increasingly less broadleaved timber will be available to the N. Hemisphere. The use of chestnut may

30 some day help to relieve this timber deficiency.

Other products Honey produced from chestnut flowers has a unique flavour which many people appreciate. Soil mixed with decayed, crumbled, chestnut wood taken from the inside of large rotten trees is much sought after today for gardening. Village gardens in Greece always have hydrangeas and pots of basil set in rows in this rich soil (castanochoma). During their flowering season, chestnut trees look like Christmas trees decorated with their bright yellow catkins. The Greek poet Krystallis writes: Tall scented cedars which reach the sky, The vine with its flowers and long braids, The gentle strawberry trees, the glistening chestnut trees…… Edible mushrooms which grow either as mycorrhizal with chestnut or on its wood should not be neglected as an additional income for the chestnut producers. According to data from several countries, such income may be nearly equal to or even higher than income acquired from the nuts.

Health problems This marvellous tree, so widely encountered and used in N. America and Europe, was destined, unfortunately, to meet Cryphonectria parasitica to which it had only little resistance. As we all know, the fungus devastated the American chestnut Castanea dentata in the 1st half of the 20th Century and then it was transported to Europe where it really caused great loss even to this day. The appearance of hypovirulence caused by viruses and its extensive study led us to the application of a biological control technique by using compatible inocula which contain the transmittable virus. France and Italy have applied such control in the 1980s and 1990s with satisfactory results. Greece has started applying the technique since 1998 to culminate with a nationwide project in 2007-2009 at the cost of 4 million Euro. Preliminary results have proved to be promising mainly because there are only 4 vc-types. My advice, derived from my experience, to countries which have not started biological control yet is to carry out all the basic work such as mapping the distribution of the disease, checking for vc- types and then to apply the control simultaneously all over the country. Do not provide the hypovirulent inoculum (paste) to the chestnut producers under any circumstances because you will be soon disappointed. Do it in such a way that you have full control of all stages of the application. Conclusively, in the way things are evolving in Europe, I have the feeling that in less than 10 years chestnut blight will be only a painful, historic

31 event. Ink Disease caused by the Phytophthora complex ranks second in destructiveness to chestnut. In the Eastern Mediterranean countries (Turkey, Greece, Balkans), disease severity is rather mild which is possibly due to the drier and warmer climate in comparison to Western Europe and to the presence of Phytophthora cambivora instead of the more aggressive P. cinnamomi. P. cinnamomi is dominant in the Iberian peninsula and France. Recent work has shown that it seeks particular climatic and soil conditions which probably are responsible for the distinct geographical distribution pattern (Vettraino et al., 2005). It was never isolated from areas with minimum temperatures below 1.4° C and maximum temperatures above 28° C, annual rainfall less than 1000 mm or soil pH below 5.4. Such conditions increase the probability of having soil moisture levels suitable for the production of zoospores and hense, the infection establishment on the root system of the trees (Erwin and Ribeiro, 1996). Symptomatic trees and necrotic tissue are characterized by the presence of either P. cambivora or P. cinnamomi followed by 5 satellite species. Ink Disease is difficult to control and manage. Active research on controlling the disease has been underway in several European countries with promising results, however, we will have to wait for their confirmation and practicality. Carpophagous insects cause significant loss in almost all chestnut producing counties. Although an annual yield of approximately 20% is lost to such insects, no specific and effective method is known. Producers apply insecticides in an effort to keep the loss low. The dry climate causes stress to the trees followed by infection or infestation by secondary parasites and pests respectively. Among the most frequent ones, which we now find in plantations and orchards which are not irrigated or have soil acidity lying outside of the suitable range, etc., is Xyleborus (Anisadrus) dispar. In some cases, especially in young orchards, it can cause serious damage. As long as the primary cause persists, even annual and frequent spraying with insecticides does not succeed in satisfactory control. It is also present in new orchards where the grafted plants suffer from base-graft incompatibility. Mycosphaerella maculiformis has not been considered a destructive parasite. It may cause defoliation late in the season but there is no impact either on quantity or on quality of nut production. In 2005 in N. Greece, however, a real epidemic burst out in mid-August because of the unusually wet summer causing severe defoliation and significant reduction in nut quantity and quality. Chestnut producers must bear in mind that when June and early July are wet, outbreaks of the disease are very likely. In such years spraying with fungicides at least twice with a 2-week interval is necessary.

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Coryneum modonium is found only sporadically in coppice forests, plantations and orchards and so far we have no reports of it being a major problem. Finally, “ring shake” is responsible for loss of timber in high chestnut forests. Suitable management and appropriate sylvicultural interventions is the only way to efficiently control the problem.

Potential still to exploit Chestnut culture and tradition in all Mediterranean countries is strong and more or less similar. However, Italy and France followed by Spain seem to be leaders in processed products based on chestnuts. Processing increases the market price of the nuts by added value, brings to the market-bench a good range of products and extends the period that the nuts are consumed. In the Turkish market a variety of oriental style products such as candied nuts and nuts preserved in syrup are quite popular. Should we be happy with what has been achieved? Is there any further prospect for increasing the nut consumption for the benefit of the chestnut producer? The answer to my experience is a big YES. While preservation of chestnuts is a delicate and difficult process, dry nuts, farina and lots of processed products can sell easily and safely without any strict time restriction. Furthermore, many processed products can be produced from inferior quality nuts which currently either are not picked or are sold extremely cheaply. Similar is the situation with chestnut wood. Although the available data is limited, I do not think that the Italian and Spanish furniture industry, probably the largest in Europe, are presently using much chestnut timber. Chestnut plantations can produce high quality timber in relatively short rotation. Mediterranean countries should encourage chestnut plantations in suitable sites now that chestnut blight is diminishing. My proposal is that the chestnut producing countries should build a campaign not only on the domestic level but to extend it to Central and Northern European countries, North and South America and even Australia, advertising raw and processed chestnuts and timber. The key advantages of the chestnuts are: a) Their high nutritional value including high fiber, mineral and vitamin content, b) They are products of organic farming, c) Chestnut orchards and forests, especially in mountainous areas, fulfill ecological demands to a great extent, and d) Chestnut wood produces beautiful furniture and, because of its natural durability, is unique for outdoor use. All the above features should be widely advertised. One of the principal strategic targets of the EU has been the development and promotion of agro-tourism. In

33 the EU states the LEADER programme has funded projects towards that target. Suitable infrastructure and lovely, little hotels and guest houses have been built in remote areas near forests and valleys where villagers promote their traditional customs and sell local products. Chestnuts with their long tradition can nicely fit into the scenario, either raw or processed. Chestnut festivals are organized in the autumn in many chestnut producing countries. There is still, however, prospects for much more. We should not underestimate the feature of chestnuts being a product of organic farming. We know well the desperate desire of the urban population for clean, healthy food and for more organic products. Let’s use this desire and increasing trend by advertising the chestnuts as such. As researchers, we can contribute to this effort by using suitable remedies against disease and insects.

Conclusion – Further Action Ladies and gentlemen, we have reached the point that we need to act jointly and systematically on the political level. And because most of us are University staff or researchers and we have no experience in politics and marketing, we need assistance from the market sector. We may wonder who might have the capacity to organize such a campaign. Individual chestnut producers, obviously cannot. Cooperatives of producers could, especially if they get the help of the industry, the local governments and even better- the Ministry of Agriculture on the national level. Such a wide, international campaign, however, can be effective only if international and coordinated cooperation can be established. A few years ago, a meeting of experts from 5 Mediterranean countries was held in Corsica in an effort to formulate a proposal for funding from the EU to promote and support chestnut cultivation. Could we not forward a similar international strategy with help from the marketing and advertising sectors? In closing my speech I would like to submit my proposal for the nomination of such an international committee which will consider possibilities for the promotion of chestnut marketing on the European and even on the continental level for the welfare of our chestnut producers.

REFERENCES Burnett, M.S, 1988. The grain that grows on a tree. “Chestnutworks”, Portland, OR: 12- 15. Dimoulas, I., 1985. The chestnut tree and its cultivation. Agricultural Bank of Greece, Athens, 262 pp. Erwin, DC. And Ribeiro, OK, 1996. Phytophthora disease worldwide. APS Press, St. Paul, Minnnesota. Vettraino, A.M., Morel, O., Perlerou, C., Robin, C., Diamandis, S. and Vannini, A. 2005. Occurrence

34 and distribution of Phytophthora species in European chestnut stands, and their association with Ink Disease and crown decline. European Journal of Plant Pathology 111:169-180.

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CP2.04 CASTAÑAR PARA FRUTO O PARA MADERA? CONSIDERACIONES SOBRE SU AUTOECOLOGÍA

Agustin Rubio Dpto. Silvopascicultura. Universidad Politécnica de Madrid. E-28040. Madrid

1. LA AUTOECOLOGÍA PARAMÉTRICA DE ESPECIES FORESTALES EN ESPAÑA

Habitualmente el castaño en España ha sido descrito como una especie que crece en suelos de ladera, profundos, frescos o húmedos, y preferentemente ácidos, con climas suaves sin sequía acusada. Características autoecológicas muy poco precisas que dificultaban de manera notable la tarea de los técnicos forestales, ya que no disponen de información precisa con la que poder valorar la idoneidad de un territorio para el crecimiento de esta especie. Por fortuna, los estudios autoecológicos iniciados en los años 60 por el profesor Gandullo en la E.T.S.I. de Montes de la Universidad Politécnica de Madrid y en el CIFOR del INIA que se centraron en las principales especies del género Pinus de España, a partir de los años 80 comienzan también a desarrollarse con otras especies forestales, especies de hoja caduca como robles, hayas, castaños. Arranca así una larga y fructífera serie de trabajos que aportan información precisa y cuantificada sobre los principales rasgos autoecológicos del castaño, primero en Asturias y Cantabria (Gandullo et al., 1983) y posteriormente en Extremadura (Rubio, 1993, 1997, Rubio y Gandullo, 1993, 1994, Rubio et al., 1997, 1998), en Navarra (Blanco y Rubio, 1996, Blanco et al., 1997, Rubio et al., 1997), en Galicia (Blanco et al., 2000, Rubio et al., 2001), Cataluña (Rubio et al., 1999, 2002a), Andalucía (Gómez et al., 2001, 2002) y zona centro de España (Rubio et al., 2002b). La atención que el profesor Gandullo siempre nos transmitió sobre la importancia de hacer llegar los resultados de estos trabajos a los posibles usuarios de los mismos, nos animó a culminar junto a él todos estos trabajos en una monografía publicada por el INIA titulada Las Estaciones Ecológicas de los Castañares Españoles (Gandullo et al., 2004). El estudio autoecológico desarrollado con el castaño, al igual que los demás estudios autoecológicos paramétricos de otras especies forestales, se han centrado en la consecución de los siguientes objetivos generales: 1º Definición y clasificación paramétrica de los hábitats de la especie en su área de distribución. 2º Elaboración de modelos de estimación de la calidad de la estación para la especie, en función de los parámetros ambientales más significativos. 3º Identificación y cartografía de las áreas potenciales de expansión de la especie. Estos objetivos se han complementado con

36 otros en los que se analizan y tipifican diferentes elementos de los ecosistemas estudiados como el análisis de la vegetación acompañante, la clasificación a partir de índices climáticos, o las clasificaciones edáficas.

2. METODOLOGÍA

La metodología empleada para la consecución de los objetivos reseñados anteriormente se puede sintetizar en las siguientes fases:

FASE 1.- Estratificación del territorio. Se pretendía conseguir un diseño objetivo del muestreo, que se realizó de forma independiente para cada estrato. El apoyo fundamental lo hemos encontrado en la clasificación territorial de España (Elena et al., 1997), obtenida a partir de distintos datos del medio físico. Los estratos se establecen fundamentalmente en base a las clases territoriales definidas en la clasificación junto con la información relativa a las diferentes densidades de las masas existentes y su situación espacial en el territorio.

FASE 2.- Muestreo y toma de datos de las parcelas. Fijados los estratos y diseñado el muestreo de campo, éste se efectuó estableciendo un conjunto de parcelas en cuya prospección se recogieron una serie de datos relacionados con los siguientes aspectos: -Datos fisiográficos, el posicionamiento de la parcela, la altitud del centro de la misma, su pendiente media, su orientación y la pedregosidad superficial existente. -Datos edáficos correspondientes a la descripción y muestreo de un perfil de suelo en el centro de la parcela. Para ello se procedió a la apertura de una calicata, diferenciando los distintos, horizontes edáficos existentes, anotando su espesor, color, grado de presencia de raíces, pedregosidad no muestreable, tránsito al horizonte subyacente, estructura, etc. Se tomaron muestras de tierra de cada horizonte y se enviaron al laboratorio para la realización de los correspondientes análisis edafológicos. -Datos florísticos correspondientes a la realización de inventarios botánicos en cada parcela. -Datos selvícolas que atienden a aquellas mediciones realizadas en las parcelas con vistas a la obtención de parámetros caracterizadores de la forma de masa, espesura, etc., así como para la búsqueda de índices de calidad de estación.

FASE 3.- Toma de datos climáticos. En relación con la necesidad de efectuar una asignación de valores climáticos a cada una de las parcelas de muestreo, conviene

37 señalar la dificultad que supone el escaso número de observatorios meteorológicos situados en áreas forestales. Por ello algunos miembros del grupo de investigación de autoecología de especies forestales ha desarrollado una serie de modelos de estimaciones termopluvométricas para la España peninsular (Sánchez Palomares et al., 1999), que son del tipo regresión múltiple en función de la altitud, de la posición geográfica (coordenadas x-utm e y-utm) y de la cuenca o subcuenca hidrográfica a que pertenece el punto considerado.

FASE 4.- Elaboración de parámetros ecológicos. La siguiente fase es la elaboración de parámetros ecológicos, entendiendo como tales aquellas relaciones numéricas que tratan de cuantificar la influencia que los distintos factores ecológicos del medio ejercen sobre la especie cuya autoecología se pretende estudiar, en este caso el castaño. Se elaboraron los siguientes parámetros (para detalles metodológicos consultar Gandullo et al., 2004): Parámetros fisiográficos: Cuantifican las condiciones fisiográficas de posición de cada parcela en su entorno geográfico, así como las propias características de las mismas. Se definieron los siguientes parámetros: altitud, pendiente, pedregosidad superficial, insolación, complejidad del entorno, coeficiente de resguardo de vientos. En algún otro estudio hemos ensayado con otros parámetros como insolación general, evaluado para el conjunto de la ladera sobre la que se asienta la parcela, o el parámetro termotopográfico. Parámetros climáticos: Su elaboración parte de los datos climáticos asignados previamente. Estos parámetros se pueden agrupar de la forma siguiente: (1) Evaluadores del régimen pluviométrico: precipitación total anual, precipitación de primavera, precipitación de verano, precipitación de otoño y precipitación de invierno. (2) Evaluadores del régimen térmico: temperatura media anual, temperatura media de las máximas del mes más cálido, temperatura media de la mínimas del mes más frío, oscilación térmica y suma de las doce evapotranspiraciones potenciales mensuales. (3) Evaluadores del régimen hídrico: suma de superávits, suma de déficits, índice hídrico anual, duración de la sequía e intensidad de la sequía. En algún otro estudio hemos manejado otros índices, evaluadores de la aridez estival, como el índice de Vernet. Parámetros edáficos: Elaborados a partir de los resultados analíticos obtenidos de las muestras de suelo tomadas en las parcelas, así como de los datos procedentes de la descripción de los perfiles estudiados. Agrupados en tres bloques, se consideran los siguientes: (1) Evaluadores de las propiedades físicas de los suelos: tierra fina, arena, limo, arcilla, coeficiente de capacidad de cementación, coeficiente de

38 impermeabilidad debida al limo, humedad equivalente, permeabilidad y capacidad de retención de agua. (2) Evaluadores de las propiedades químicas y de la fertilidad de los suelos: materia orgánica, acidez actual, acidez de cambio, nitrógeno, relación carbono/nitrógeno, carbonato cálcico activo, carbonato cálcico inactivo, fósforo y potasio. (3) Parámetros edafoclimáticos: evapotranspiración real máxima posible en el conjunto del año, sequía fisiológica y drenaje calculado del suelo. Parámetros de la fitocenosis: A fin de evaluar de manera cuantificada la respuesta biológica se han elaborado una serie de parámetros deducibles, por una parte, de las características morfológicas y selvícolas de las masas en cada parcela y por otra de la propia composición florística.

FASE 5.- Definición de hábitats. Una vez elaborados estos parámetros se examinó su variabilidad, a fin de establecer los posibles límites de aptitud ecológica de los biótopos que pueden servir de asiento a las masas de la especie estudiada, de acuerdo con el siguiente esquema metodológico: Con los valores de los parámetros establecimos los límites inferior y superior de variación (LI, LS) como el mínimo absoluto y el máximo absoluto para cada parámetro. Situamos los umbrales inferior y superior (UI, US) excluyendo el 10% de los puntos en los que el parámetro toma los valores menores y otro 10% excluyendo los valores mayores. A partir de ellos, para cada parámetro definimos el tramo central (intervalo entre UI y US) y los tramos marginales (intervalo entre LI y UI junto con el intervalo entre US y LS). Para el conjunto de todos los parámetros considerados establecimos como hábitats óptimos o centrales aquellos donde los parámetros se encuentran dentro de los tramos centrales. Cuando algunos parámetros se situaron en los tramos marginales se consideraron como hábitats marginales. Si alguno de los parámetros se situó fuera de los límites establecidos por los valores del intervalo (LI, LS), correspondía a hábitats extramarginales. Para no extendernos excesivamente nos vamos a detener aquí, sin llegar a comentar las siguientes fases donde los trabajos con otras especies forestales han encontrado gran aplicabilidad al desarrollar los Modelos predictivos de la calidad (Fase 6) y al haber realizado la Identificación y cartografía de áreas potenciales de expansión de la especie (Fase 7).

3. AUTOECOLOGÍA DEL CASTAÑO (FRUTERO Y MADERERO) EN ESPAÑA

Así, sin pretender ser demasiado exhaustivo, el estudio realizado con los castañares en España nos ha permitido observar que, desde el punto de vista fisiográfico éstos se

39 localizan desde los 50 m hasta casi los 1500 m de altitud, aunque principalmente se sitúan entre los 450 y los 1000 m. Atendiendo a los valores medios, el clima típico de los castañares españoles es: Mesotérmico, húmedo, nemoral, de inviernos, primaveras y otoños muy húmedos, veranos secos, templado con inviernos frescos y veranos calurosos, continental, con grandes superávits, pocos déficits y con una subsequía prácticamente nula. Desde un punto de vista edáfico podemos destacar por ejemplo que la gran mayoría de los castañares poseen suelos con textura franca, franco-limosa o franco-arenosa, faltando los suelos arcillosos, limosos y arenosos. Así mismo, la práctica totalidad de los castañares españoles viven sobre suelos con pH medio comprendido entre 4,0 y 6,5. El castaño, como especie gestionada desde tiempos inmemoriales por el hombre, se han explotado con dos finalidades bien distintas: para producir fruto -en masas de monte alto y, generalmente, con espesura defectiva-, o para producir madera -normalmente en monte bajo, a turno relativamente corto y en masas de mayor espesura-. Ante esta dualidad las preguntas surgen de manera inmediata: ¿las características autoecológicas del castaño productor de fruto son iguales a las del castaño productor de madera?, ¿es que el hombre, por experiencia secular, ha sabido encontrar las más adecuadas localidades para uno u otro tipo de explotación?, o por el contrario, ¿ el destino del castañar está ligado a la naturaleza de la propiedad (pública o privada), o a la mayor o menor demanda de un tipo u otro de productos? Para ello, vamos a intentar aclarar esta cuestión apoyándonos en la metodología anteriormente descrita, analizando si los parámetros estudiados presentan los mismos valores en aquellos castañares destinado a su aprovechamiento para fruto o para madera. El trabajo autoecológico planteado inicialmente no estaba orientado a tal efecto, pero el apoyo que para el diseño del muestreo se hizo en una estratificación territorial ajena al propio trabajo (Elena et al., 1997) es sin duda la responsable de que de las parcelas estudiadas el 49 % estuvieran dedicadas a la producción de fruto y el 51% a la de madera. La identificación de tales diferencias se ha realizado mediante un análisis de la varianza, con el que se ha comprobado si el valor de la medias de los parámetros en el grupo de parcelas de uso frutero y en el de uso maderero son o no significativamente diferentes. Así hemos podido comprobar que los castañares fruteros analizados en su conjunto español tienden a encontrarse a mayor cota y en sitios de menor pendiente que los madereros. Igualmente, hemos podido observar que los castañares fruteros se sitúan, con respecto a los madereros, de forma general, bajo clima de mayores precipitaciones invernales, menores precipitaciones estivales, mayor oscilación térmica, mayores suma de superávits hídricos, mayores suma de déficits hídricos y mayor duración e intensidad de la sequía meteorológica. Desde el punto de vista edáfico, los castañares fruteros se encuentran, con respecto a los madereros, en suelos menos arenosos y más limosos, de

40 mayor capacidad de retención de agua, menos ácidos y con menos porcentaje de nitrógeno superficial. Los castañares fruteros se definen sistemas con menor productividad potencial primaria neta y mayor sequía fisiológica para la vegetación En definitiva, parece ser que la localización de los castañares productores de fruto españoles tiende a concentrarse en terrenos ondulados de clima mediterráneo húmedo y no costero, con bastante oscilación térmica, fuertes precipitaciones invernales y clara sequía estival que se traduce en abundantes superávits hídricos y fuertes déficits, y, quizás para compensar parcialmente esto último, sobre suelos poco arenosos, bastante limosos, de buena capacidad de retención de agua y no demasiado ácidos. Recíprocamente, parece ser que la localización preferente de los castañares productores de madera son, dentro del hábitat general, los terrenos costeros de cotas bajas y pendientes fuertes con clima de oscilación térmica amortiguada y precipitaciones suficientes en verano para asegurar escasos déficits y casi nula sequía meteorológica aunque las lluvias invernales no sean muy abundantes, y suelos fuertemente ácidos y no excesivamente limosos, sino más bien arenosos, aunque ello implique baja capacidad de retención de agua. Estas tendencias, que pueden ser matizadas a nivel regional (Rubio y Gandullo, 1993), pueden ser una orientación para cuando se opte por emplear el castaño para reforestar una determinada parcela, se tengan también elementos de juicio sobre la utilización previsiblemente más adecuada bien como productor de fruto o bien de madera. Y para cuestionarse, en ciertos casos, sobre lo adecuado de las transformaciones de castañares de fruto en castañares madereros auspiciadas por algunas administraciones, y la de castañares explotados en monte bajo a monte alto propugnadas desde otros ámbitos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Blanco, A., Rubio, A. 1996. Caracterización del hábitat edáfico de los castañares de Navarra. Actas del IV Congreso Nacional de la Ciencia del Suelo. Lérida. España: 333- 338. Blanco, A., Rubio, A., Sánchez Palomares, O. 1997 Caracterización del biotopo de los castañares navarros. Actas I Congreso Forestal Hispano-Luso. Pamplona. España: 213-218 Blanco, A., Rubio, A., Sánchez Palomares, O., Elena, R., Gómez, V., Graña, D. 2000. Autoecología de los castañares de Galicia (España). Invest. Agrar.: Sist. Recur. For., 9(2):337-361 Elena, R. (dir) 1997. Clasificación biogeoclimática de España peninsular y balear, M.A.P.A., Madrid. Gandullo, J.M., Sánchez Palomares, O., González, S. 1983. Estudio ecológico de las tierras altas de Asturias y Cantabria, I.N.I.A., Madrid. Gandullo, J.M., Rubio, A., Sánchez Palomares, O., Blanco, A., Elena, R., Gómez, V. 2004. Las estaciones ecológicas de los castañares españoles. Monografías INIA: Serie Forestal. Nº 7. Ministerio de Educación y Ciencia. Madrid. Gómez, V., Sánchez Palomares, O., Blanco, A., Elena, Rubio, A., Graña, D. 2001. Los suelos de los castañares andaluces. Actas del III Congreso Forestal Español. Granada. 41

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COMUNICAÇÕES ORAIS

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Sessão 1 Transformação da castanha / Transformación de la castaña

S1.01. CONTRIBUTO PARA O ESTUDO DA CONSERVAÇÃO DE CASTANHA Nogueira, C.; Correia, P.

Departamento das Indústrias Agro-Alimentares. Escola Superior Agrária de Viseu. Quinta da Alagoa. Estrada de Nelas.3500-606 VISEU. PORTUGAL. [email protected]

RESUMO

No âmbito do projecto AGRO 448, foi realizado um estudo com o intuito de estimar o tempo de conservação de várias cultivares de castanha proveniente de várias regiões do país. Três cultivardes de castanha foram estudadas com maior profundidade: Enxerta (região do Marvão), Longal (região dos Soutos da Lapa e do campo experimental da Estação Agrária de Viseu) e Verdeal (campo experimental da DRBL, Sabugal). O ensaio de conservação consistiu no acondicionamento das mesmas em sacos de plástico perfurados e caixas de papel. As castanhas foram conservadas em condições normais e em ambiente controlado de temperatura (10ºC) e humidade (70%). Os parâmetros analisados para as três cultivares foram a humidade, a actividade da água, a cor (tegumento e miolo) e a textura, tendo sido efectuadas determinações mensais, de Novembro de 2005 a Março de 2006. A cultivar Enxerta foi aquela que apresentou maior percentagem de castanhas alteradas à chegada do lote a ser estudado, 8%. No fim da conservação, a cultivar Longal, proveniente da região dos Soutos da Lapa foi aquela que apresentou maior percentagem de frutos alterados, 28%. De um modo geral, foram as castanhas acondicionadas em sacos, tanto para condições controladas como para condições normais ambientais, que conservaram as características iniciais por mais tempo. Nas condições experimentais efectuadas verificou-se que o tempo de conservação depende da cultivar e das condições de armazenagem a que estavam sujeitas.

Palavras-chave: Conservação; Humidade; Actividade da água; textura; Cor

1. INTRODUÇÃO

A produção europeia de castanhas representa cerca de 16% da produção do mundo e a principal espécie é a Castanea sativa Mill. Portugal é o segundo produtor de castanha da Europa com 31051 Mt em 2005 (www.fao.org). A castanha é consumida maioritariamente em fresco, sendo uma pequena percentagem destinada para a indústria alimentar. O elevado consumo em fresco deve-se ao seu valor

44 nutricional e características organolepticas, bem como ao aumento da procura por parte do consumidor de produtos biológicos (Bellini, 2004; Santos e Correia, 2005). Este trabalho teve como intuito a valorização da castanha, a qual se apresenta, no nosso pais, como um importante recurso económico, nomeadamente aqueles que adquirem rendimentos da sua produção, comercialização e transformação.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

As cultivares estudadas foram: Amarelal, Aveleira, Bária, Colarinha, Enxerta ou Clarinha, FS1, FS2, Judia, Longal, Martaínha, Negral, Rebordã, e Verdeal. O Tabela 1 mostra a proveniência das mesmas bem como o número de frutos utilizado para o ensaio. O número de frutos variou entre 24 e 90 frutos. As castanhas foram colocadas em dois tipos de embalagem, sacos de plástico (Vileda Freshmate) e caixas de papel, separadas por cultivar. Foram colocadas em condições de temperatura e humidade relativa controladas, 10ºC e 70% humidade relativa, respectivamente, e em condições ambientais naturais, condições normais. O período de conservação decorreu de Novembro de 2005 a Março de 2006.

Tabela 1. Origem das cultivares estudadas Cultivar Campo Campo Marvão Campo Soutos da Experimental Experimental Experimental Lapa da DRABI da DRABL da DRAM (SL) Amarelal X Aveleira X Bária X X Colarinha X Enxerta X FS1 X FS2 X Judia X X X Longal X X Martaínha X X Negral X Rebordã X Verdeal X X DRABI – Direcção Regional de Agricultura da Beira Interior; DRABL – Direcção Regional de Agricultura da Beira Litoral; DRAM – Direcção Regional de Agricultura do Minho.

Para a determinação da actividade da água utilizou-se um higrómetro modelo BTsrl Selecta Unitronic. O teor de humidade foi determinado pelo método AOAC (2000). Foi determinado o

45 teor de humidade para o miolo, o pericarpo e o tegumento. Textura foi medida por um texturómetro modelo TA.XT. PLUS, com sonda P2. A experiência consistiu na penetração de 2 mm do fruto, com a função “return to start”. A força de medida foi a compressão, sendo realizada a medição por integração da área, expressa em Ns. A cor foi avaliada utilizando um colorímetro Chroma Meter CR-300 Minolta (Osaka, Japan), medindo-se os parâmetros L* a* b*. Foram avaliados o miolo, o pericarpo e o tegumento.

A determinação da aw e da humidade foram feitas em triplicado. A textura e a cor foram realizadas pelo menos 20 vezes.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Durante o período de conservação a percentagem total de castanhas alteradas encontra-se representado na Figura 1.

Figura 1. Percentagem de castanhas alteradas até ao final da conservação

60

50 (%) 40

30

20

Castanhas Alteradas Castanhas 10

0 FS1 FS1 FS2 Negral Bária BI Enxerta Judia BI Judia BL Judia SL Judia Amarelal Aveleira Rebordã Colarinha Longal BL Longal SL Longal Verdeal BI Verdeal Verdeal BL Martainha BL Martainha SL Bária Marvão Bária

As cultivares que obtiveram uma percentagem baixa de castanhas alteradas, nas cultivares Colarinha, FS1, Judia da Beira Litoral e Negral proveniente da Beira Interior. Verificou-se que para as castanhas presentes em sacos, quer em condições controladas, quer em condições normais, verifica-se a obtenção de uma percentagem mais elevada de castanhas alteradas, quando comparadas com as cultivares contidas em sacos.

Relativamente à actividade da água (aw), As cultivares Bária do Marvão e Colarinha são as que apresentam a actividade da água inicial mais elevada e as cultivares Aveleira e Amarelal são aquelas em que se verifica uma actividade da água inicial mais baixa. No geral, a actividade da água está compreendida entre os 0,973 e 0,996. Para permitir comparar os resultados obtidos em condições normais, com os resultados obtidos em condições controladas, nas cultivares contidas nos sacos e em caixas, foram

46 consideradas as cultivares Enxerta, Longal da Beira Litoral e dos Soutos da Lapa e a Verdeal da Beira Interior, por possuírem um maior número de frutos.

A Figura 2 é relativa à evolução da actividade da água durante a conservação das cultivares em sacos, em condições controladas e em condições normais. Verificou-se também que enquanto as cultivares presentes em caixas, em condições controladas, se conservaram até Janeiro, as cultivares conservadas em sacos tiveram um período de conservação superior – Março.

1,000 A

aw 0,975 0,950 0,925 0,900 0,875 0,850 0,825 Enxerta Marvão 0,800 Longal BL 0,775 Longal SL 0,750 Verdeal BI 0,725 0,700 Novembro Janeiro Março B 1,000 aw 0,975 0,950 0,925 0,900 0,875 0,850 0,825 0,800 0,775 0,750 0,725 0,700 Novembro Dezembro Janeiro Fevereiro Março

Figura 2. Valores médios obtidos para aw para as condições normais (A) e condições controlada (B) em sacos.

Para a actividade da água e humidade foi nas cultivares presentes em caixas, que se registou uma maior diminuição da actividade da água (miolo) e da humidade (miolo, pericarpo e tegumento) das castanhas durante a conservação, quando comparadas com as cultivares de castanha conservadas em sacos, quer em condições normais, quer em condições controladas. Verificou-se a obtenção de valores de humidade próximos entre o pericarpo e o tegumento das castanhas estudadas.

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Os parâmetros L, c e h da cor da casca mais elevados, registaram-se nas cultivares presentes em caixas, ou seja, foram estas que apresentaram a cor da casca mais clara, com mais brilho e mais amarela, ao contrário da casca das cultivares armazenadas em sacos, mais escuras, com menos brilho e avermelhadas. Relativamente à cor da polpa, obtiveram-se os valores mais elevados para o parâmetro L e h nas cultivares presentes em sacos, correspondendo a uma cor da polpa mais clara e amarela, ao contrário da polpa das cultivares presentes em caixas, que apresenta uma com mais escura e um amarelo menos intenso. Em relação à textura, são as cultivares presentes em sacos, principalmente em condições controladas, as que oferecem uma menor resistência à perfuração (Figura 3), indicando uma melhor conservação pois a desidratação favorecia o aumento desta característica.

160 Enxerta Marvão Longal BL 140 Longal SL 120 Verdeal BI 100

(N S) 80 60 Força 40 A 20 0 Novembro Dezembro Janeiro Fevereiro

160 140 120 100

(N S) (N 80 B 60 Força 40 20 0 Novembro Dezembro Janeiro Fevereiro Figura 3. Valores médios obtidos para a textura nas cultivares de castanha conservadas em sacos para condições controladas (A) e para condições normais (B).

Avaliando a evolução dos diferentes parâmetros analisados durante a conservação, para as 4 cultivares consideradas, observa-se que no geral, a cultivar Longal dos Soutos da Lapa é a que apresenta valores mais elevados, excepto para o parâmetro c da cor do miolo, para o qual obteve os valores mais baixos, ou seja, menor brilho.

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De uma forma geral, são as cultivares presentes em sacos, tanto em condições normais como em condições controladas, as que permitem manter as características com valores próximos aos iniciais, por mais tempo, conservando-se assim por um período mais longo.

Agradecimentos

Ao projecto AGRO 448 “Valorização e preservação da biodiversidade de variedades de castanha na Região Centro e Norte de Portugal”, no âmbito do Programa PRODEP III, a todos os parceiros deste projecto, pela recolha e cedência de material para estes estudos.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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S1.02. METABOLITES COMPOSITION OF FRESH KERNELS FROM THREE CULTIVARS OF PORTUGUESE CHESTNUT

1 De Vasconcelos M. C., 2 Bennett R. N., 2 Rosa E. A. S., 3 Ferreira-Cardoso J. V.

1 PhD student with a FCT scholarship; 2 Centre of Science and Agricultural Engineering (CECEA) - Dept. of Phytotechnology and Rural Engineering; 3 Centre of Technological Studies on Environment and Life (CETAV) - Dept. of Biologic and Environmental Engineering. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal.

ABSTRACT Chestnuts have become increasingly important with respect to human health, for example, as an alternative gluten-free flour source. In this study, we analyzed the proximate, free amino acids and phenolics composition of fresh raw shelled kernels from the three main Portuguese cultivars - Longal, Judia and Martaínha. All three cultivars had high moisture contents, were low in crude fat and crude protein contents and all had high starch contents. The free amino acid contents, including various essential amino acids, varied depending on the cultivar. All three cultivars also contained polyphenols with gallic acid and ellagic acid predominant among hydrolysable and condensed tannins. Many of these compounds are known to exert significant positive effects on human health. The one-way analysis of variance shows significant differences among the three cultivars for most of the studied parameters.

Keywords: Castanea sativa; composition; phytochemicals; health

INTRODUCTION Since early times chestnut has been an important economic resource in Europe and more recently in Asia and America, also playing an important environmental role in many agroforestry systems (Bounous, 2005). In former times, chestnuts were used as feedstuffs and as a substitute for potatoes and wheat flour. Nowadays, apart from boiling/baking and roasting, the utilization of chestnuts in several countries of Europe is for “marron glacé”. In Portugal, the most commonly cultivated chestnut species is Castanea sativa Mill. Previous studies on the chemical composition of chestnut kernels focused on starch, fiber, crude protein, lipids and fatty acid composition, ash and minerals contents (Ferreira-Cardoso, et al., 1993, 1999; Pereira-Lorenzo et al., 2005; Borges et al., 2007). There have been some published studies on the free amino acids content of chestnuts (Desmaison and Tixier, 1984; Desmaison et al., 1984). There have been several studies on the phenolic composition of chestnut wood and leaves but very few studies on kernels, and primarily for single components, e.g., the procyanidins (Lampire et al., 1998; Pascual-Teresa et al., 2000; Calliste et al., 2005).

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The aims of this work were to analyze the composition of health-related components of chestnut kernels, for both primary and secondary metabolites, optimizing health benefits of chestnuts.

MATERIALS AND METHODS

Plant Material The cultivars analyzed (Longal, Judia and Martaínha) were harvested in October/November 2005 from orchards around Bragança, North East Portugal. The samples were collected at Sortegel-Produtos Congelados S.A., an enterprise involved in commercialization of this fruit. After the collection of each sample of the three cultivars, six sub- samples were taken and stored in a refrigerator at ±2 ºC, for a maximum of 3 days until they were hand-peeled.

Processing Samples and Different Analyses The samples were processed either by air-drying (in an air-forced oven at 65 ºC until constant weight) and freeze-drying depending on the analyses to be performed (primary metabolites or amino acids and phenolic compounds, respectively). All dried samples were powdered using commercial food blenders. Sub-samples of the air-dried samples were analyzed (in duplicate for each sample) for ash, crude fat and total nitrogen using the previously validated methods (AOAC, 1990). The crude protein content was calculated by using Ntotal x 5.3 as the conversion factor (McCarthy and Meredith, 1988). The neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), acid detergent lignin (ADL) and cellulose were determined according to Robertson and Van Soest (1981). For starch analysis (in triplicate for each sample), the method used started with a conversion of the starch to glucose during two stages of an enzymatic treatment that was followed by a colorimetric determination of the glucose using a glucose-specific coupled enzyme reaction and chromogen system (Rasmussen and Henry, 1990). The freeze-dried samples were weighed in triplicate (0.2 g) for amino acids analysis into 15mL glass centrifuge tubes and sequentially extracted with 70% and then 90% v/v methanol with a 100 oC water-bath and ultra-turrax. After each extraction the samples were centrifuged and further purification was done using Dowex columns method (Gehrke et al., 1987). Identification and quantification was done using online derivatization coupled to reverse-phase HPLC. For quantification of total phenolics, sub-samples of freeze-dried chestnut kernels (3 x 40mg) were extracted with 1 mL of 70% methanol at 70 oC for 30 min in 2 mL screw-top microtubes, using a vortex mixer every 5 min to optimize extraction. The samples were centrifuged and sub-samples of the supernatant were used for total phenolics (Folin-Ciocalteau method) and HPLC quantification of free gallic and ellagic acids (Bennett et al., 2006).

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RESULTS AND DISCUSSION The one-way ANOVA shows significant differences among the three cultivars for most of the studied parameters. Only the levels of crude fat, starch, and each of the three fiber fractions had no significant differences in variation observed (Tables 1, 2 and 3). The results of the current research show that all three cultivars had high moisture but relatively low ash contents (Table 1). There was a significant variation in the dry matter and ash contents of the three cultivars, probably due either to genotype effect and differences in cultivation conditions.

Table 1. Proximate composition (g/100g DM) of fresh raw shelled chestnut kernels from three cultivars(a)

Parameters Judia Longal Martaínha Signif. Level

Dry Matter(1) 50.37±1.54 ab 53.87±3.83 b 48.73±3.09 a *

Crude Fat 1.72±0.39 1.56±0.31 1.89±0.51 ns Crude Protein 4.87±0.33 b 5.13±0.43 b 3.89±0.13 a *** Starch 64.86±1.63 64.15±3.50 64.82±1.33 ns

Fiber NDF 13.18±2.65 13.75±2.31 13.11±1.05 ns

ADF 2.68±0.27 2.54±0.22 2.54±0.37 ns ADL 0.29±0.21 0.22±0.17 0.21±0.10 ns Cellulose 2.40±0.27 2.32±0.29 2.33±0.42 ns

Total Ashes 2.34±0.20 b 1.91±0.05 a 1.87±0.20 a ***

(a) Tabulated values are sample means ± standard deviations (SD) of the mean. (1) Data are presented as means ± SD g/100 g FW. ns - not significant (P>0.05); *, **, *** - significant at P<0.05, P<0.01 and P<0.001, respectively. Within each row, means with a different letter are significantly different.

All three cultivars had low crude fat contents of 1.9%, 1.6% and 1.7% of dry matter in fresh kernels of Martaínha, Longal and Judia, respectively (Table 1). In a previous study (Pereira- Lorenzo et al., 2005), the cultivar Longal grown in Galicia had a value of 5.2% crude protein similar to the content that we founded for this cultivar (Table 1). There was a significant difference in crude protein levels of fresh kernels of the three cultivars, with Martaínha having the lowest content (3.9% DM). The results of the current research show that all three cultivars had high starch contents of 64.8%, 64.2% and 64.9% of dry matter in fresh kernels of Martaínha, Longal and Judia, respectively (Table 1). There was no significant difference in the total starch contents of the three cultivars. However, there may be more subtle changes in branching structure and physicochemical properties that cannot be determined from the total starch assay used that occur in the later processing stages (Pizzoferrato et al., 1999). It is known that the chestnut fruits store a reserve in the form of starch in cotyledons, and the

52 content is 3–4-fold higher than found in other nuts (Ensminger et al., 1995). The average value for starch content found in this study is slightly higher than those obtained by others researchers (Pereira-Lorenzo et al., 2005) who reported 57% starch relative to dry weight and higher than the value obtained by a previous work (Ferreira-Cardoso et al., 1993) for the Portuguese cultivar Longal (53-55% DM). The values for NDF and ADF contents found in previous chestnut kernel analyses were between 9.4-28.5% and 2.3-4.5% of dry matter, respectively (Pereira-Lorenzo et al., 2005). In this study, the cultivar Longal grown in Galicia had 12.1% DM for NDF and had the lowest value for ADF of 2.3% DM. The current results revealed that there were no significant differences for each fiber fraction among the three cultivars. The contents of NDF, ADF and ADL varied between 13.1-13.8%, 2.5-2.7% and 0.2-0.3% of dry matter, respectively (Table 1). In total, fifteen free amino acids were present in the chestnut cultivars studied; however, some of them (Tyr, Trp, Gly and Thr) were only present in trace amounts. There were significant differences in individual amino acids in the fresh kernels of the three cultivars including some of the essential amino acids; kernels of Martaínha had a low content of the essential amino acids Leu, Arg and Val as compared with the other two cultivars (Table 2).

Table 2. Free amino acids contents (mg/100 g FW) of fresh raw shelled chestnut kernels from three cultivars(a)

Amino Acids Judia Longal Martaínha Signif. Level Tyr T T T Trp T T T Phe 3.45 ± 0.80b 4.53 ± 1.03c 1.90 ± 0.62a *** Asp 76.40 ± 16.25b 60.32 ± 14.74a 52.63 ± 13.33a ** Glu 109.82 ± 22.59b 72. 38 ± 15.24a 96.55 ± 18.53b *** Asn 149. 45 ± 34.93b 140.54 ± 25.05b 62.02 ± 13.49a *** Gln 16.46 ± 2.80c 14.49 ± 2.32b 9.18 ± 1.53a *** Arg 30.01 ± 10.46b 25.42 ± 8.65b 4.54 ± 1.43a *** Ser 7.10 ± 1.99c 5.63 ± 1.39b 2.69 ± 0.56a *** Gly T T T Thr T T T Ala 13. 55 ± 3.46a 35.37 ± 8.54b 11.60 ± 1.92a *** Val 7.16 ± 1.35b 6.70 ± 1.23b 5.23 ± 1.22a ** Ile 5.19 ± 1.12a 4.40 ± 1.06a 14.84 ± 4.91b *** Leu 2.25 ± 0.52c 1.50 ± 0.43b 0.79 ± 0.37a ***

Total 420.84 371.28 261.97

(a) Tabulated values are sample means ± standard deviations (SD) of the mean. T = trace (detected in some samples, but levels too low to be accurately quantified). Essential amino acids are highlighted in bold text. ns - not significant (P>0.05); *, **, *** - significant at P<0.05, P<0.01 and P<0.001, respectively. Within each row, means with a different letter are significantly different. 53

The values of total phenolics were 22.7, 15.8, and 21.1 mg/g of fresh weight in kernels of Martaínha, Longal, and Judia, respectively (Table 3). Chestnut is known as a high tannin species and specifically in the wood and leaves of this species with both ellagitannins (Krisper et al., 1992) and procyanidins (Pascual-Teresa et al., 2000) detected in various tissues. In the present study, free gallic acid and ellagic acid were identified and quantified; other tannins were present, but these were not identified. The gallic acid and free ellagic acid contents were, respectively, 9.1, 3.5 and 4.3 mg/g FW and 9.6, 2.7 and 4.8 mg/g FW for Martaínha, Longal, and Judia (Table 3). There is good evidence for the positive health effects of gallic and ellagic acids, especially their antioxidant activities, positive effects on cardiovascular functions, anticarcinogenic activities and antiplasmodial activity (Okuda, 2005). The results of the current study show that chestnut kernels contain significant concentrations of primary and secondary metabolites that are known to have positive health effects in humans. Chestnuts are an increasingly popular food, as fresh, frozen, roasted, and in other processed form such as “marron glacé”. However, for determinations of total compounds (fat, protein, starch, and fiber), there may be more subtle qualitative changes that cannot be measured by using these general assays; that is, it is known that cooking chestnuts affects the physicochemical properties of starch but not total starch content (Pizzoferrato et al., 1999). Therefore, further studies need to be performed using more sensitive assays, e.g., (SDS) PAGE for proteins, LC-MS and GC-MS for lipids and fatty acids and enzymatic and NMR studies for starch and fiber. In addition, more qualitative and quantitative studies need to be done on the ellagitannins and procyanidins in chestnut kernels, especially since these compounds in other food plants have been shown to have positive health effects.

Table 3. Phenolics contents (mg/g FW) of fresh raw shelled chestnut kernels from three cultivars(a)

Parameters Judia Longal Martaínha Signif. Level

Total Phenolics (1) 21.10±5.11 b 15.80±5.69 a 22.69±8.39 b ** Gallic Acid (2) 4.30±1.52 a 3.46±1.72 a 9.07±3.43 b *** Free Ellagic Acid (2) 4.84±1.37 b 2.71±0.70 a 9.64±3.39 c ***

(a) Tabulated values are sample means ± standard deviations (SD) of the mean. (1) Data is presented as mean ± SD mg gallic acid equivalents / gram fresh weight. (2) Data is presented as mean ± SD mg phenolic / gram fresh weight. ns - not significant (P>0.05); *, **, *** - significant at P<0.05, P<0.01 and P<0.001, respectively. Within each row, means with a different letter are significantly different.

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S1.03 DETERMINANTS OF CHESTNUTS DEMANDED QUANTITIES: AN EMPIRICAL ESTIMATION USING PANEL DATA

Paulo Reis Mourão1 & Teresa Mourão2

ABSTRACT In this work, we studied the economic determinants of chestnuts demanded quantities. It concludes by stating that chestnuts are only demanded in countries with the tradition of their presence in people’s diets, receiving strong challenges from the globalisation process. We also have found a significant dependence on real income per capita of chestnuts demanded quantities. Price effects were concluded as not influencing CDQ in the panel estimations.

Key Words: Chestnuts; Demand; Determinants; panel data JEL Codes: Q11; D12; C33

1. INTRODUCTION

The role of own price and consumer income in the chestnuts demanded quantities (CDQ) have been often documented in national accounting frameworks, but there are fewer cross- country comparisons of CDQ determinants emphasizing the role of economic factors and the mix impact from the presence of Other Agropecuary Related Products (OARP). The most cited OARP are pig meat (whose gastronomic confections often include chestnuts), almonds, dry beans and wheat (as complimentary sources of hydrates of carbon), nuts and potatoes (as usual substitute commodities), and apples, oranges, peaches and strawberries (as seasonally consumed fruits, usually used to infer about the influence of the persistence of warm weather, i.e., who use to eat chestnuts during autumn and winter, also use to consume some of these pointed summer fruits during the remaining seasons, indicating a relation of seasons complimentarity)3. Therefore, if estimated, the impacts of these OARP on CDQ should be clearly positive for pig meat, clearly negative for nuts and potatoes, and not undoubtedly defined for the remaining commodities (mainly depending on national consumption habits). The (hypothesizable) non-significance of the influence of consumer income or own-price in CDQ is often linked with the assumptions of the inelasticity of chestnuts demand function induced by historical foodstuffs habits, especially in Mediterranean rural areas (Fidanza, 2002; Smith et al., 2004). Econometric studies of this hypothesis are however scarce.

1 Department of Economics of the University of Minho, Gualtar, 4700 Braga, Portugal; e-mail: [email protected]; 2 Instituto de Emprego e Formação Profissional (Vila Real, Portugal). 3 The rationale behind this choice is detailed in the reports from the “FOOD PROCESSING CENTER INSTITUTE OF AGRICULTURE AND NATURAL RESOURCES UNIVERSITY OF NEBRASKA – LINCOLN, 2002” and from Gold, Cernusca and Godsey (2005). 56

This articles builds on FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) cross-country data of potential CDQ determinants recurs to an extended panel of 13 countries4 (weighting 95,9% of the 2004 chestnuts market) and to the use of the generalized method of moments (GMM), which allows certain determinants to have a diffusion effect on CDQ. It concludes by stating that chestnuts are only demanded in countries with the tradition of their presence in people’s diets, receiving strong challenges from the globalisation process, with a significant dependence on real income per capita. Price effects were observed as not influencing CDQ in the panel estimations.

2. DETERMINANTS OF CHESTNUTS DEMANDED QUANTITIES – A DISCUSSION

This study5 is seeking to identify the main determinants of the CDQ. The baseline equation that is estimated takes the form:

ΔCDQi,t = α.ΔCDQi,t−1 + β.Deti,t + ui +ηt + ε i,t where i=1…N (where N is the number of countries, 13 as already stated) and t=1990,1991,…,2004. β is a raw-vector of l coefficients for the l determinants (the suggested

6 OARP plus real income per capita and the openness level of the economy ) and Deti,t is a column-vector taking the observation for each l determinant from the i-country at the t-year.

ΔCDQi,t−1 is the log difference of CDQ . All the variables are in logs. The usual country- specific effect, u, is included. η is a time dummy. ε is disturbance. Fixed effects regression is the model to use when a researcher wants to control for omitted variables that differ between cases but are constant over time. It lets him use the changes in the variables over time to estimate the effects of the independent variables on the dependent variable (and is the main technique used for analysis of panel data. The fixed-effects results appear in the first column of Table 1. According to these findings, we have to notice the positive influence of the nuts and orange demanded quantities (0,129 and 0,372). The real income per capita also has a positive impact on the CDQ (0,762) and the openness evidences a negative influence on CDQ (-0,786).

4 By alphabetical order, Bolivia [3%], China [71%], France [2%], Greece [1%], Hungary [0,3%], Italy [3%], Japan [4,1%], (South) Korea [3,5%], Portugal [2,3%], Russia [1,7%], Serbia and Montenegro [0,1%], Spain [0,3%] and Turkey [3,7%]. Between square brackets, the national proportion of aggregate CDQ, using FAOSTAT (2006), category ‘Food quantity – tons’. 5 Data used from FAOSTAT (2006), available from http://faostat.fao.org/site/336/default.aspx , and Penn World Table – PWT 6.2, developed by Heston, Summers and Aten (2006), available from http://pwt.econ.upenn.edu/php_site/pwt62/pwt62_form.php . 6 CDQ and OARP units are (the logs of) ‘Food quantity/day/capita – grams’. Real income per capita and the openness data were taken from the cited source Penn World Table – PWT 6.2. 57

If the research team has reason to believe that some omitted variables may be constant over time but vary between cases, and others may be fixed between cases but vary over time, then they can include both types by using random effects. The random-effects findings are shown in the second column of Table 1. Actually, they significantly differ from the fixed-effects ones. Firstly, they signal different and significant influences from dry beans (0,482) and openness (1,450). Secondly, they find significance in the estimated coefficients for peaches (0,396), pig meat (-2,712), and potatoes (0,612). Thirdly, they notice the loss of significance of wheat and real income per capita.

Table 1 – Estimations of CDQ determinants [n = 13; t = 1990,…,2004; N_obs = 83] Fixed-effects Random-effects GMM Autoregressive 0,505*** (0,059) term, ΔCDQi,t−1 Almonds -0,115 -0,079 -0,056 (0,095) (0,129) (0,059) Dry beans -0,249 0,482** -0,393*** (0,212) (0,162) (0,167) Nuts 0,129*** 0,049 0,084 (0,048) (0,085) (0,059) Oranges 0,372** -0,312 0,265** (0,145) (0,285) (0,123) Peaches 0,259 0,396** 0,103 (0,178) (0,189) (0,108) Pig meat -0,684 -2,712*** -0,051 (0,547) (0,289) (0,338) Potatoes 0,484 0,612** 0,075 (0,325) (0,208) (0,120) Strawberries 0,169 0,006 0,001 (0,113) (0,111) (0,078) Wheat 1,543*** 0,090 0,813** (0,504) (0,443) (0,339) Real Income per 0,762** 0,210 1,041** capita (0,311) (0,222) (0,309) Openness -0,786*** 1,450*** -0,523*** (0,205) (0,207) (0,108) Chestnuts (own- -0,045 0,028 0,028 price) (0,142) (0,246) (0,077) Sigma_u: 1,593 Sigma_u: 0,000 P-value (Arellano- Sigma_e: 0,226 Sigma_e: 0,226 Bond test, no Rho: 0,980 Rho: 0,000 autocorrelation, F(12,61)=5,53*** Wald(12)=276,3*** order 1): 0,0526 P-value (Arellano- Bond test, no autocorrelation, order 2): 0,9289

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However, the generally accepted way of choosing between fixed and random effects is running a Hausman test. Statistically, fixed effects are always a reasonable thing to do with panel data (they always give consistent results) but they may not be the most efficient model to run. Random effects will give better p-values (as noticed in this case) because they are a more efficient estimator. The Hausman test tests the null hypothesis that the coefficients estimated by the efficient random effects estimator are the same as the ones estimated by the consistent fixed effects estimator. In this case, they are not, because we get a significant p-value (chi- square of 250,24, with a null probability, prob>chi-quare=0.00). Therefore, we have to properly pay attention to fixed-effects results and not value the random-effects values. Finally, given the small n (n=13) and the small t (t=15), some characteristics of the fixed- effects estimator must be pointed. According to Arellano and Bond (1991), there are various sources of bias in the fixed effects model, especially due to the correlation of the lagged dependent variable and to the eventual small dimension of n and of t. Therefore, their final suggestion is to estimate using GMM technique because a more efficient estimator results from the use of additional instruments whose validity is based on orthogonality between lagged values of the dependent variable and the errors. The GMM findings, presented in the third column of Table 1, confirm the marked influence of some OARP on CDQ, namely dry beans (a significant consumption rival), oranges (a summer fruit particularly consumed in the Mediterranean and in the Asia, revealing again the relevance of cultural patterns) and wheat. Remarkably, the real income per capita has a positive impact on the CDQ. The estimated coefficient signifies that a rising of 1% in income per capita may induce an increasing of 1,04% of CDQ7. This result is very noticeable because it indicates that CDQ are now being highly influenced by the standard of life of modern populations: if, in most cases, chestnuts have been incorporated in rural diets, actually, today, we only can expect increasing CDQ if people income rises. Also very interestingly, the coefficient of own-price is not characterized by a significant value, which induces an inelastic demand through the panel. Therefore, the consumption of chestnuts tends to replicate the past patterns, strengthened by the magnitude (and the significance) of the autoregressive term (0,51) and the negative and significant coefficient of the openness of each country – CDQ are highly depending on traditional diet habits, if new imported nuts commodities arrive, they can easily been seen as chestnuts preferable substitutes.

7 Looking at the (non-significant) coefficient of chestnuts own-price (0,028), an interesting positive value, and combining with the strong influence of the income factor, we could be wrongly suggested that chestnuts are a giffen good . However, this relevant non-significance shows that the chestnuts demand is inelastic, quantities do not vary because of price changes. 59

3. CONCLUSION

In this work, we have studied the economic determinants of chestnuts demanded quantities. Our estimates suggest a possibility of positive influences from oranges and wheat, oranges (as a seasonally consumed fruits, usually used to infer about the influence of the persistence of warm weather), wheat (as a complimentary source of hydrates of carbon). The main consumption rival is identified with dry beans. The real income per capita has a positive impact, contrasting with the non-significance of price estimates, which promotes the final conclusion that, actually, facing modern urban consumption patterns, chestnuts are only demanded in countries with the tradition of their presence in people’s diets, receiving strong challenges from the globalisation process.

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Sessão 2 Biologia, Fisiologia, Genética / Biología, Fisiología, Genética

S2.01. GENETIC TRANSFORMATION OF Castanea sativa Mill.

E. Corredoira, M.C. San-José, A.M Vieitez, A. Ballester

Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia, CSIC, Avenida de Vigo, s/n, Apartado 122, 15080 Santiago de Compostela, Spain [email protected]

SUMMARY The aim of the present work was to study the effect of the type of explant and the genotype on the improvement of genetic transformation of embryogenic lines of European chestnut (Castanea sativa Mill.) as well as the cryostorage of transgenic lines. Somatic embryos isolated in the globular stage or clumps of 2-3 embryos in globular or early torpedo stages were more effective on transformation efficiency than embryos isolated at the cotyledonary stage. All the seven genotypes tested were transformed, but the transformation efficiency was clearly genotype dependent. Transgenic lines were successfully cryopreserved using the vitrification procedure. Genetic transformation experiments with the thaumatin-like protein CsTL1have been initiated to induce tolerance to ink disease.

Key words: Castanea sativa, cryopreservation, European chestnut, genetic transformation, Agrobacterium tumefaciens

1. INTRODUCTION

Castanea sativa Mill. (sweet chestnut, European chestnut) is a tree species with a wide distribution and an important economic role in Europe, covering an area of over 2 million hectares (Conedera et al., 2004). Among the chestnut species, C. sativa is considered the only native species of the genus in Europe. Considered a forest tree, chestnut is also used in agriculture as a cultivated crop, and in Europe three general forest management regimes are

61 found: high forest, coppice and orchard. The root-rot or ink disease (caused by Phytophthora spp.) and chestnut blight (caused by Cryphonectria parasitica) are the two most important diseases that affect European chestnut. The first breeding programme to develop tolerant/resistant Euro-Japanese hybrids was initiated in Spain as early as 1921 (Vieitez et al., 1996). Conventional breeding programmes in trees take a long time due to their biological cycle. Large backcross breeding programmes have not been (and probably will not be) carried out in Europe in order to obtain disease-resistant chestnut trees. On the contrary, by means of conventional breeding programmes, only first-generation hybrids have been spread in different European countries, indicating that a number of the specific characteristics of C. sativa may have been lost in many chestnut stands, as undesirable traits may have been introduced into the native species. Genetic transformation of the disease-prone Castanea species with antifungal or antimicrobial genes to increase disease resistance or tolerance could be the initial step towards a reliable and complementary biotechnological alternative to conventional breeding efforts. Tolerance to fungal pathogens through the expression of heterologous genes whose products have antifungal activity in vitro, such as pathogenesis-related (PR) proteins, would be an interesting approach (Van Loon 1997; Lorito et al., 1998). However, an optimized genetic transformation protocol with marker genes should be defined prior to any attempt at transformation with genes of interest. An initial genetic transformation protocol has been described for the first time (Corredoira et al., 2004a) in Castanea sativa by means of the co- culture of somatic embryos with different strains of Agrobacterium tumefaciens carrying marker genes, although this protocol needs to be improved. Cryopreservation may be a powerful tool during progeny testing as this technique is generally used for the long-term maintenance of specific genotypes or cell lines or to avoid the risk of possible somaclonal variation as consequence of prolonged tissue culture management. A great number of transgenic lines are usually generated in each transformation event and the use of cryopreservation techniques would be a suitable method for its save maintenance. The aims of the present work are: 1) to improve the genetic transformation efficiency of chestnut embryogenic cultures according to the type of explant and the genotypes used; 2) to study the factors influencing the cryopreservation of transformed embryogenic lines.

2. MATERIALS AND METHODS

Different developmental stages of chestnut somatic embryos, including isolated globular embryos, small embryo clumps (2-3 embryos at globular or heart stages) and isolated cotyledonary embryos, were used to assess the effect of the explant type used as target

62 material on transformation. Seven embryogenic lines, initiated from different sources (Vieitez et al. 1990; Corredoira et al. 2003, 2006), were used to evaluate the effect of genotype on transformation. Target explants were co-cultured for 4 days with Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring the binary plasmid pUbiGUSINT, according to the protocol described by Corredoira et al. (2004a). This plasmid contains a nptII marker gene driven by the nos promoter for kanamycin selection and the uidA reporter gene (GUS) driven by the maize ubiquitin (Ubi-1) promoter (Humara et al., 1999). The presence of marker genes was confirmed by histochemical GUS assay, PCR and Southern blot analysis. The transgenic embryogenic cultures obtained on different transformation experiments were routinely maintained by secondary embryogenesis with sequential subcultures at 6-week intervals according to the conditions previously defined (Corredoira et al., 2004a). For cryopreservation experiments, somatic embryos of C. sativa were collected from the C58C1-1 embryogenic transgenic line and the corresponding C12-H1 wild-type line. The transgenic line was obtained after transformation of the wild-type line with Agrobacterium strain C58C1 harboring the binary vector pBI121 which carries the nptII marker gene and the uidA gene driven by the CaMV35S promoter (Corredoira et al. 2004a). Explants for cryopreservation experiments consisted of small clumps (6–8 mg) of 2-3 somatic embryos in globular or early torpedo stages isolated from embryogenic cultures of wild-type and transgenic lines. Cryopreservation using the vitrification procedure was performed according to Corredoira et al. (2004b). The presence of marker genes on transformed somatic embryos after cryopreservation was confirmed by PCR and Southern blot analysis.

3. RESULTS AND DISCUSSION

Optimization of transformation

The developmental stage of somatic embryos and the genotype had a significant influence on chestnut transformation. The transformation frequency, defined as the percentage of initial explants that developed GUS positive somatic embryos, recorded with isolated globular embryos and embryo clumps (30% in both explants types) was significantly higher than that obtained with cotyledonary embryos. The low transformation frequency of cotyledonary explants might be due to the low proliferation capacity of this type of explants (3 SE per explant) in comparison to groups and globular embryos (9.2 and 9.0 SE per explant, respectively). Globular and early torpedo stages were more susceptible to Agrobacterium infection, as in these developmental stages, the somatic embryos have a higher number of actively embryogenic cells than in the cotyledonary stage (Yeung, 1999).

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Two lines out of the seven that have been evaluated produced higher transformation frequencies (21.7 and 33.8 %) than the other five (3.3, 5.0, 1.7, 1.7 and 10 %). Differences in the transformation efficiency related to the genotype were also reported for other species such as pine (Bergmann and Stomp, 1992), aspen (Fladung et al., 1997) and American chestnut (Polin et al., 2006). PCR analysis of uidA and nptII gene fragments was positive for all GUS-positive embryogenic lines analyzed (64 out of 195). Untransformed embryogenic lines were used as negative controls and did not result in any amplification. Southern blot analysis of genomic DNA isolated from two transgenic lines showed the presence of uidA gene which was not detected in the untransformed somatic embryos used as negative control. Transformed embryos were germinated according to Corredoira et al. (2003) with germination medium supplemented with 75 mg/l kanamycin. Although low plantlet conversion rates (6.3-11%) were recorded, shoots obtained from germinating embryos, were successfully multiplied by axillary shoot proliferation which allows the production of a large number of transgenic shoots derived from different transgenic embryogenic lines. Transgenic chestnut plants were acclimatized in the growth chamber. The presence of transferred genes in the leaves of these plants was also verified by the GUS assay and PCR analyses.

Cryopreservation of transgenic somatic embryos

Chestnut transformed embryogenic lines obtained from different transformation experiments are maintained by secondary embryogenesis. Cryopreservation may be a reliable alternative for facilitating the management of transgenic embryogenic lines and limits the risk of contamination, as well as reduces labour and supply costs. Chestnut transgenic embryogenic line C58C1-1 was successfully cryopreserved using the vitrification procedure, and the survival and embryo recovery rates (68.3 and 65.2 %, respectively) obtained were similar to those achieved with the wild-type line C12H1-1 (67.8 and 65.2 %, respectively). The presence of the uidA gene was confirmed by PCR and Southern blot analysis using DNA extracted from both uncooled and cryopreserved transgenic somatic embryos. These results show that the integrity of the transgene is not affected by the cryopreservation procedure.

Future prospects

A thaumatin-like protein (PR protein), termed CsTL1, has been purified from mature cotyledons of European chestnut (Garcia-Casado et al., 2000), also demonstrating that the isolated protein has antifungal activity in vitro. It seems possible to increase ink disease

64 tolerance by transferring this gene to European chestnut. In order to explore this possibility, the first step has been the construction of the CamMV-35S promoter- Thaumatin binary vector (p35SCsTL1). The 1kb CsTL1 cDNA, provided by Dr. Allona (ETSI Montes, UP Madrid, Spain), was used to perform a PCR reaction with specific CsTL1 primers (5’ GAGCTCGGGTAACC 3’ and 5’ GTGGATCCCCCGGGG3’). Each primer carried a restriction endonuclease site (BamHI and SacI, respectively) to allow directional cloning of the PCR product. In order to obtain the gene sequence of the CsTL1, the PCR product was digested with BamHI and SacI and the resulting fragment was purified on an agarose gel. This fragment was subcloned into the BamHI and SacI cloning sites of the binary vector pBI121 (Clontech, Palo Alto CA), replacing the pre- existing uidA gene. The resulting vector was denominated p35SCsTL1 and transferred into the Agrobacterium tumefaciens disarmed strain C58C1 using the freeze and thaw method (Holsters et al., 1978). The recombinant bacteria were selected on LB medium containing 50 mg/l kanamycin, 25 mg/l gentamicin and 20 mg/l rifampicin. We began the first genetic transformation experiments of European chestnut with p35SCsTL1, following the protocol defined by Corredoira et al (2004a) with the modifications reported in the present work.

Acknowledgements The study was funded by the Ministerio de Educación y Ciencia (Spain) through the project AGL2005-00709

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S2.02. NON-HARVEST CHESTNUT FRUITS AS A RESOURCE FOR RODENTS AND INSECTS IN MADEIRA

J. Faria1, T. Pontes2, D. Aguin-Pombo 1,3, A. M. Franquinho Aguiar 4, D. Horta Lopes 5, R. Cabrera 6

1 Department of Biology, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected] 2 Centre for Macaronesian Studies, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected] 3 Regional Secretary for the Environment and Natural Resources, Madeira, Portugal, [email protected] 4 Agricultural Quality Laboratory, Regional Secretary for the Environment and Natural Resources, Caminho Municipal dos Caboucos 61, 9135-372 Camacha, Madeira, Portugal, [email protected] 5 Section for Plant Protection, Department of Agricultural Sciences, Azores University, Largo da Igreja, 9701-851 Terra-Chã, Terceira, Azores, Portugal, [email protected], 6 U.D.I. Phytopathology, Faculty of Biology, Avda. Astrofísico Francisco Sánchez s/n, 38206 La Laguna, Tenerife, Spain, [email protected]

ABSTRACT

Chestnuts are an important resource for local populations in Madeira Island. Chestnut- trees have been naturalized and today represent a rather homogeneous forest which grows along very steep slopes in deep valleys mainly in the southern parts of the Island. The irregular topography of the areas where chestnuts grow makes the management of plantations very difficult and costly. On the other hand, in more accessible chestnuts areas, high infestation rates due to carpophagous tortricids, promote the abandonment of attacked fruits in the field. To address this problem and to help to outline a management program for chestnut plantations in Madeira, the objectives of this work are: (a) to estimate the number and condition of chestnuts fruits left on the ground after the harvest season and (b) to know whether these represent a resource for the development of natural populations of harmful vertebrates and/or arthropods.

Keywords: Madeira, chestnuts, non-harvest fruits, insects, rodents

1. INTRODUCTION

In Madeira chestnuts occupy rather homogenous areas of mountainous zones but due to the irregular topography, many plantations are isolated and of difficult access. In addition to this, plantations of chestnuts are irregular and small being frequently scattered which result in hard 67 conditions for appropriate cultural practices. Although in the last years there was no improvement of the chestnut culture in Madeira, this is socially and economically important to local populations. Besides, chestnut plantations occupy areas where other cultures are not possible contributing also to the reduction of erosion. The production of fruits which is about 700.000 Kg annually is one of the main objectives of this culture. Nevertheless, a significant part of the crop cannot be commercialized due to the frequently high infestation rates caused by carpophagous tortricids. The damage produced by these moths and the difficulties to implement adequate and effective phytosanitary measures together with the fact that most farmers are old, are main causes to the increasing farmers' indifference for the appropriate management of chestnut plantations. However, in the last years new economic incentives to the transformation of plantations with conventional chestnut cultures into biological ones have resulted in a renewing interest for this culture. To outline a management program to chestnut plantations, it is necessary to know whether fruits are non-harvest and the possible effects of these on the development of natural populations of harmful vertebrates and/or arthropods. These last two issues are the objectives of this work.

2. MATERIAL AND METHODS

Samples were collected in chestnut plantations located in accessible areas of the three largest chestnut areas of Madeira: Curral das Freiras, located at 800m; Serra de Água, at 400m and Jardim da Serra, at 1300m. Samples were collected in conventional plantations on the ground in January after the harvest season in the years 1998 and 2006. In 1998 chestnut fruits were sampled in two localities, Curral das Freiras ad Serra de Agua, while in 2006 were sampled in the three localities indicated above. In 1998 in each locality were collected 921 nuts in Curral das Freiras and 1047 in Serra de Agua. In 2006 were collected two sub samples of 200 nuts each in each of the three localities. In both years samples were kept on closed plastic bags and separated in the lab according to their condition in: good condition, rotten, gnawed or with tortricids-holes. To know whether chestnuts fruits were used as a resource by animals, samples from both years were kept in plastic rearing boxes between January and September 1998 and from January and beginning October 2006. Rearing boxes with 1998 samples were examined once per week and twice per week 2006 samples. Artropods, if present, were removed with an aspirator. Samples from 1998 were previously cleaned with a fungicide solution (4g nipagin, 1L water and 5% chlorine) and kept in rearing boxes with autoclaved sand beach. Samples from 2006 were not cleaned and kept under plastic rearing box placed on plastic pots with two types of substrate: half chestnut soil and half autoclaved sand beach or autoclaved sand beach. Rearing conditions differ for both years being warmer and drier for 2006 samples.

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3. RESULTS AND DISCUSSION

The results show that a high number of undamaged chestnut fruits were not harvested in 2006 in the three main chestnut plantations (Figure 1). The percentage of non-harvest chestnut fruits varied from 20 to 60% but these percentages can be greater since nuts including gnawed fruits could be in good condition in the harvest season. Since in Curral das Freiras and Serra de Agua samples were taken from areas of easy access and close to local resident’s houses, the large number of fruits left on the ground can be considered as abandoned and of no interest. In these localities chestnut fruits reach their highest values before popular chestnuts festivals. Later, the price of fruits becomes lower which could explain partially why last nuts are not harvested. In contrast to this Jardim da Serra is more isolated which may explain the highest percentage of undamaged nuts left in plantations.

120

100

80 Undamaged With holes 60 Rot t en/ Hollow Gnawed 40

20

0 SA CF JS

Figure 1. Percentage of undamaged and damaged chestnut fruits (rotten or hollow, with holes or gnawed) sampled in January 2006 in three sampling localities: Serra de Agua (SA), Curral das Freiras (CF) and Jardim da Serra (JS).

In addition to undamaged chestnut fruits, a large amount of nuts showed holes caused by carpophagous tortricids. Thus, the removal of chestnuts during the harvest season, many still with larvae inside, will help to reduce infestation rates due to these species. These fruits in 2006 represented 21 to 26% of all nuts left in chestnut plantations. In addition to this, non-harvest fruits represent an energy resource for maintaining local populations of rodents similar as occurs with oak acorns (Gurnell, 1993). The percentage of gnawed fruits was not very large (below 7%) but in some years may be very large (Figure 2). In 1998 in Curral das Freiras 42% of chestnuts were attacked by rodents which may be related to the reduction of other food resources available.

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SA CF

1998 2006 1998 2006 100% 90% 80% 70%

60% Hol ed 50% Rotten/Hollow 40% Gnawed 30% 20% 10% 0%

Figure 2. Percentage of damaged chestnut fruits (rotten or hollow, with holes or gnawed) sampled in January 1998 and 2006 in two sampling localities: Serra de Agua (SA) and Curral das Freiras (CF).

Non-harvest chestnuts seem also to be a valuable resource for food, shelter and/or reproduction for many insect species. Although a reduced number of species have been obtained, they represent 10 insect orders with different feeding habits. Those groups with more specimens were Diptera, Lepidoptera and Coleoptera. Of these, Coleoptera was the group most diverse with at least six families: Staphylinidae, Curculionidae, Nitidulidae, Mycetophagidae, Cryptophagidae and Silvanidae. However, of all families the greatest interest due to the large number of individuals and the damage caused was Tineidae (32.5%) with two species Opogona omoscopa and Opogona saccari. The first is associated to decaying vegetation and was the most common. O. saccari is a serious pest on bananas in Spain (Islas Canaries) since 1920s and has a wide host range being found mainly in the tropics on banana, pineapple, bamboos, maize and sugarcane in the field and on various stored tubers (Billen, 1987). It is present in Madeira, Canary Islands and Azores. The larvae of the other month species, Oinophila v-flava feeds on fungus and wine corks. In contrast other species as Lyctocoris campestris (F.) are predacious and very effective as biological control agents (Parajulee & Phillips, 1995).

Table 1. Some of the species found associated to chestnut fruits. Order Family Species

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Blastobasidae Blastobasis sp LEPIDOPTERA Opogona omoscopa (Meyrick, 1893) Tineidae Opogona sacchari (Bojer, 1856) Oinophila v-flava (Haworth, 1828) Staphylinidae Phloeonomus pusillus (Gravenhorst, 1806) COLEOPTERA Silvanidae Cryptamorpha desjardinsi (Guerin, 1844) Perirrhytus edentulus (Wollaston, 1858) DERMAPTERA Forficulidae Forficula auricularia Linnaeus, 1758 Lyctocoris campestris (Fabricius 1794) / L. HETEROPTERA Anthocoridae dimidiatus (Spinola 1837)

The number of species and groups differed among localities which suggest that most species do not represent true associations but probably a place for shelter for eggs or larvae. These results clearly support the removal of fruits along the harvest season both to control carpophagous tortricids and also to reduced populations or rodents and other harmful species of insects.

Acknowlegments

We wish to thank the owners of chestnut plantations for allowing us to perform the trials. Part of this study was financed by an INTERREG IIIB project (INTERFRUTA nº. 05/MAC/3.1/A4).

REFERENCES

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S2.03. ESTRUTURA GENÉTICA DAS POPULAÇÕES NATURAIS DE CASTANHEIRO (Castanea sativa Mill.) EM PORTUGAL

Ribeiro, C., Silva, M., Batista, D. e Costa, R.

Estação Florestal Nacional, Quinta do Marquês – Av. da República, 2780 – 159 Oeiras (e-mail: [email protected])

O castanheiro Europeu (Castanea sativa Mill.) é considerado uma espécie de grande importância ecológica e económica, com uma longa tradição cultural na Europa. A sua área de distribuição vai desde o Mar Cáspio ao Oceano Atlântico, incluindo Madeira, Açores e ilhas Canárias, desde o Sudoeste da Alemanha e Sul da Inglaterra até à Tunísia (Montes Tlecem), com incidência especial em Portugal, Espanha, França, Itália, Grécia, Turquia e ex-Jugoslávia (Bergougnoux e Verlhac, 1978; Oliveira e Alves, 1988). Na Península Ibéria pode encontrar-se do Norte ao Centro de Portugal, Norte de Espanha, pequenas áreas no Sul de Espanha e de Portugal e ainda nos arquipélagos das Canárias, Açores e Madeira. Em Portugal o castanheiro Europeu é explorado principalmente, para produção de fruto e para produção de madeira, em regime de alto fuste ou talhadia, sendo estes últimos provenientes de populações naturais ou naturalizadas. O objectivo deste estudo foi analisar a diversidade genética das populações naturais de castanheiro em Portugal, tentar avaliar o grau de domesticação da espécie e possíveis introgressões de material genético de espécies exóticas nas nossas populações. Neste trabalho, foram genotipados 239 indivíduos, pertencentes a 8 populações naturais (Manteigas, Gardunha, Alcongosta, Serra de Bornes, Donai, Marvão, Madeira e Açores) utilizando 10 microssatélites nucleares desenvolvidos para Castanea sativa, Quercus robur e Quercus petraea (Buck et al., 2003, Marinoni et al., 2003, Steinkellner et al., 1997 e Kampfer et al., 1998). Foram estimados vários parâmetros de análise, como: índices de diversidade genética, o número de alelos por população (A), número privado de alelos, a riqueza alélica (Ar), heterozigocidade observada (Ho), heterozigocidade esperada (He), distância/similaridade genética e índices de fixação (FIS, FIT, FST), que serão apresentados neste trabalho.

Este trabalho foi financiado pelo Projecto Castanea REG do Programa INTERREG IIIB.

Palavras-chave: Castanheiro Europeu, Castanea sativa, microssatélites, populações naturais, diversidade genética

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Sessão 3 Biologia, Fisiologia, Genética / Biología, Fisiología, Genética

S3.01. CASTANEA AIRBORNE POLLEN AT THE NORTHWEST OF THE IBERIAN PENINSULA

Abreu, I.1, Ribeiro, H.1,2, Oliveira, M.1, Aira, M.J.3, Rodríguez-Rajo, F.J.4, Jato, V.4

1Departamento de Botânica, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, Rua do Campo Alegre 1911, 4150-181 Porto, Portugal and IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Rua do Campo Alegre 823, 4150-180 Porto, Portugal; e-mail: [email protected] 2Secção Autónoma das Ciências Agrárias, FC-UP. 3Departamento de Botánica, Facultad de Farmacia, Campus Sur, Universidad de Santiago, 15706-Santiago de Compostela (Spain). 4Departamento de Biología Vegetal y Ciencias del Suelo, Universidad de Vigo, Facultad de Ciencias, Campus Universitario As Lagoas, 32004-Ourense, Spain.

ABSTRACT The airborne concentration of Castanea pollen was studied at five stations in different parts of the NW Iberian Peninsula, using Hirst-type spore-traps, during 2003-2006. The spatial distribution of Castanea pollen, the start of the main pollination period and airborne concentrations varied among the different sampling places. Porto, Santiago and Lugo registered the highest concentrations in the first two years while Vigo and Ourense in the last two years of the study. The correlation analysis performed between airborne pollen concentration and the meteorological parameters suggests positive relationships with the thermal parameters and negative relationships with rainfall and relative humidity.

Key-words: Aerobiology; airborne pollen; Castanea; Iberian Peninsula

1. INTRODUCTION

The sweet chestnut (Castanea sativa Mill.) is a tree species that has attracted particular human attention because its great economic interest for wood and fruit production In bioclimatological terms, chestnuts are found at an altitude below 1200 m, and grow well in wet Atlantic and Mediterranean areas. In Spain, chestnuts can be found on the Cantabrian coast, in high and milder valleys in Galician, Asturian and Cantabrian mountains (Iglesias et al, 1999; Jato et al, 2001). In Portugal, chestnuts are autochthones species frequently found in the northeast and central landscape.

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Aerobiological studies are of a great interest for ecological and agricultural purposes but they also present a particular interest to clinicians and allergy patients to establish correlations between airborne pollen flows and respiratory allergic diseases symptoms in order to help in the treatment these atopic reactions and in the prevention of allergic diseases and control of environmental allergens. Castanea sativa pollen allergy has generally been considered to be uncommon and clinically insignificant. However, studies in Switzerland (Frei et al., 1995), France (Sutra, 1987) and Spain (Arenas et al., 1996; Cosmes et al, 2005) indicate that this pollen type can trigger allergic reactions in patients with asthma or with polysensitization. The aim of this study was to determine the seasonal variation in the airborne concentration of chestnut pollen at four monitoring stations situated in several cities in Galicia (NW Spain) and one in Porto (NW Portugal) during 2003-2006. The principal pollination period is compared among all sampling sites and the relationship between the airborne pollen concentrations and the meteorological parameters was studied.

2. MATERIAL AND METHODS

The airborne pollen concentration was sampled at five monitoring stations, in the cities of Vigo (42º14’N; 8º43’W), Santiago de Compostela (42º53’N; 8º32’W), Lugo (43º0’N; 7º53’W), Ourense (42º21’N; 7º51’W) and Porto (41º11’N; 8º39’W) during four years (2003-2006). Vigo and Porto have a temperate maritime climate, the annual mean temperature is 14.8oC and 14.4ºC and the total annual precipitation is 1412 mm and 1236 mm respectively. Santiago de Compostela and Ourense have an oceanic climate with an annual mean temperature of 13.7oC and 14.1oC and the total annual precipitation is 1288 mm and 772 mm respectively. Lugo has a cool, dry ombro-thermal regime, with the annual mean temperature of 11oC and the total annual precipitation of 963 mm. Airborne pollen was sampled using Hirst-type volumetric pollen traps positioned about 15- 25m above ground. This sampler was calibrated to handle a flow of 10l/minute and pollen grains impact on a Melinex film coated with silicon oil. This tape was changed weekly and after exposed was cut into seven pieces, which were mounted on separate glass slides. Pollen grains quantification was performed with an optic microscope (X400), using the model proposed by the Spanish Aerobiology Network, consisting of four continuous longitudinal traverses along the slide (Dominguez et al. 1991). Daily values of pollen counts are transformed in number of pollen grains per cubic meter of air. The main pollination period (MPP) of the chestnuts was analyzed in terms of start and end dates of the pollen season, its duration and the maximum pollen count and date recorded. The pollination period was calculated as 90% of the annual total pollen-production season, the first days, producing up to 5% of total production, were removed from the calculations as well as

74 the final days (from 95% to 100% of total production) (Nilsson and Persson, 1981). The airborne pollen concentration was expressed as a Pollen Index (PI = total pollen of one year/sum of pollen during sampling period, in percentage) (Ribeiro et al., 2005) in order to compare the results from the different sampling sites. Spearman’s correlation coefficient was used to identify possible relationships between meteorological parameters such as rainfall, humidity and temperature (maximum, mean and minimum), and the daily mean pollen concentrations. This analysis was conducted firstly between the pollen concentration registered during the whole main pollination period and the meteorological parameters and secondly only during the pre-peak period which corresponds to the days from the beginning of the main pollination period until the day of the maximum pollen concentration. Descriptive statistical analysis was performed using a SPSS 14 software version for windows. Meteorological data of Vigo, Santiago, Lugo and Ourense were obtained from the Spanish National Meteorological Institute. Meteorological data from Porto were obtained from the Instituto Geofísico da Universidade do Porto.

3. RESULTS AND DISCUSSION

Castanea pollen was generally present in the atmosphere of the Northwest of the Iberian Peninsula from early June until the middle-to-end of July, lasting on average 40 days. The day of maximum pollen concentration was recorded between late June and early July. Its concentration represented between 2% and 6% of the total pollen spectrum. The spatial distribution of Castanea pollen, the start of the main pollination period and airborne concentrations varied among the different sampling places. The lowest Castanea airborne pollen concentration was recorded in 2006 for Porto, Santiago and Lugo, in 2005 for Vigo and in 2003 for Ourense. Porto, Santiago and Lugo registered the highest concentrations in the first two years of the study while Vigo and Ourense in the last two years of the studied period (Figure 1). No constant pattern in the annual pollen concentrations between the different sampling sites was observed. The lowest concentrations recorded at Porto are mainly due to the non existence of extensive Castanea groves, with high pollen production. Intra and inter-annual variations of the beginning, peak and ending dates of Castanea main pollination season, for all the studied regions, were observed (Table 1). The earliest start was observed in Porto (except for the year 2004), followed by Vigo, Ourense, Santiago and the latest in Lugo. Porto was also the sampling place registering the latest end of the main pollination season. The highest inter-annual variations in the start and end dates of the main pollination season was registered in Porto followed by Vigo, Ourense, Lugo and Santiago, as showed by the statistic coefficient of variation [CV (%)] values in Table 1. These inter-annual variations are probably due to the topography of the sampling stations and to the distribution of

75 the chestnut woods. These characteristics cause important phenological differences with heterogeneous flowering, being the release of pollen discontinuous. Spore traps also collect pollen not only from nearby trees but also pollen traveling from different distances and directions (Comtois 1997, Palacios et al. 2000). The results of the correlation analysis between airborne pollen concentration and the meteorological parameters suggest positive relationships with the thermal parameters and negative relationships with rainfall and relative humidity (Table 2). From the correlation analysis is also possible to observe that rainfall and relative humidity maybe close related with pollen dispersion and the temperature with pollen emission because the correlation coefficients for this last parameter increased when only the pre-peak period was accounted while for the other parameters the same was not observed. Annual pollen emission is highly dependent on rainfall and on temperature conditions during the blooming season. The occurrence of dispersal rainfall affected the continuity of Castanea pollen concentration as was observed in our study where this parameter was the one significant correlated with airborne pollen concentration for all studied localities, except for Lugo. This last local was the only sampling place where no significant correlation was found with the meteorological parameters.

Acknowledgements This work was partialy supported by Fundação Calouste Gulbenkian, Project "Bioaerossol, Poluentes não biológicos e Saúde pública” (ref. 77161). Sincere thanks to Prof. Dr. Manuel de Barros Director of the “Observatório da Serra do Pilar” who provided the meteorological data from Porto. The meteorological data from Galicia are part of the Galician Aerobiological Network under the supervision of the Consellería de Medio Ambiente (Xunta de Galicia)

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50 Castanea pollen 45 Porto Vigo Santiago 40 Lugo Ourense 35 % 30 25 20

Pollen Index Index Pollen 15 10 5 0 2003 2004 2005 2006 Year

Figure 1 - Yearly Castanea pollen index variation of the studied locations.

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Table 1 – Characteristics of the Castanea pollination period in Porto, Vigo, Santiago Lugo and Ourense.

MPPTotal Maximum Local Year Start End Duration Value* Value** Date 2003 08-Jun 06-Ago 59 183 19 17-Jun 2004 01-Jul 19-Set 80 192 30 05-Jul Porto 2005 06-Jun 21-Ago 76 106 11 14-Jun 2006 31-Mai 06-Ago 67 69 8 11-Jul CV (%) 9 9 13 8 2003 20-Jun 10-Jul 20 642 70 04-Jul 2004 10-Jun 23-Jul 43 159 22 29-Jun Vigo 2005 20-Jun 26-Jul 36 1139 128 07-Jul 2006 06-Jun 27-Jul 51 1461 172 11-Jul CV (%) 4 4 35 2 2003 19-Jun 14-Jul 25 1237 123 27-Jun 2004 22-Jun 25-Jul 33 884 79 28-Jun Santiago 2005 21-Jun 18-Jul 27 789 90 27-Jun 2006 19-Jun 22-Jul 33 620 64 11-Jul CV (%) 1 3 14 4 2003 21-Jun 26-Jul 35 732 77 28-Jun 2004 27-Jun 29-Jul 32 703 76 14-Jul Lugo 2005 24-Jun 17-Jul 23 652 64 02-Jul 2006 23-Jun 18-Jul 25 615 105 02-Jul CV (%) 2 3 20 4 2003 18-Jun 11-Jul 23 543 86 23-Jun 2004 13-Jun 16-Jul 33 662 69 05-Jul Ourense 2005 20-Jun 20-Jul 30 1636 318 07-Jul 2006 09-Jun 26-Jul 47 1792 138 11-Jul CV (%) 3 3 30 4 Legend: MPP = main pollination period; CV = coefficient of variation;* total annual value; ** pollen grains/m3.

Table 2 - Spearman’s correlation coefficients and significance levels between the airborne pollen concentration and the meteorological parameters registered during the all main pollen period (MPP) and the pre-peak period.

Spearman's Rank Porto Vigo Santiago Lugo Ourense R Pre-Peak -0.164 -0.359 ** -0.131 0.205 -0.385 ** MPP -0.156 * -0.215 ** -0.292 ** 0.039 -0.304 ** RH Pre-Peak -0.247 * -0.368 ** -0.230 -0.185 -0.052 MPP -0.115 -0.385 ** -0.194 * -0.043 -0.182 * Tmax Pre-Peak 0.295 * 0.222 0.314 * 0.262 0.266 * MPP 0.107 0.252 ** 0.231 * -0.045 0.086 Tmin Pre-Peak 0.208 -0.019 0.210 -0.118 0.133 MPP -0.007 0.140 -0.053 -0.083 -0.023 Tmean Pre-Peak 0.241 0.163 0.421 ** 0.132 0.326 ** MPP 0.041 0.212 * 0.171 -0.050 0.067 *p<0.05; **p<0.01 Legend: R = rainfall; RH = mean relative humidity; Tmax = maximum temperature; Tmin = minimum temperature; Tmean = mean temperature.

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S3.02. REFERENCE VALUES OF GENETIC PARAMETER IN SPANISH CHESTNUT CONSERVATION

Monteagudo, A.B., Fernández-López, J.

Department of Forest Production - Centro de Investigaciones Ambientales de Lourizán-CINAM, P.O. Box 127, 36080 Pontevedra. Spain. E-mail, [email protected]

ABSTRACT

Genetic parameters such as effective number of alleles, expected heterozygosity and percentage of polymorphic loci were calculated to Spanish chestnut stands. These parameters were calculated with forest conservation and management purposes as reference values of the existing genetic diversity of Spanish chestnut.

Keywords: Castanea sativa, genetic diversity, isozymes, conservation, regions of provenance

1. INTRODUCTION

The high human influence on the genetic structures of tree populations and the coming climatic changes are threatening the existing richness of forest genetic resources. Therefore, a good management and conservation is needed to maintain the genetic diversity of forest species. A good forest management and conservation of genetic resources depend on the use of high quality reproductive materials with a good adaptation to environmental conditions. Hence, the Council of the European Union had promulgated the Directive 1999/105/CE of 22 December 1999 (Anonymous, 2000) on the marketing of forest reproductive material with quality rules of forest reproductive materials and to regulate their production and commercialisation. In Spain, this Directive are reflected in the RD 289/2003 of 7 March 2003, that fit the European Directive to situation and peculiarities of Spanish forests (Anonymous, 2003). Then Spanish area were subdivided in Regions of provenance that have presented sufficiently uniform ecological conditions in which stands and seed sources showed similar phenotypic or genetic characters. This subdivision provided a highly fragmented map common to many species. On the other hand, forest reproductive material was divided into four categories, two of that (source-identified and selected) made reference to natural or naturalized stands selected as basic material intended for the production of reproductive material. To include a reproductive material in one of these groups must have determined requirements established in Annexes of RD 289/2003 (Anonymous, 2003). Levels of genetic variation were established as one of the indicators that are necessary for sustainability (Namkoong et al. 2002). Good level of genetic diversity predicts high adaptative potential so its maintenance is very important in terms of adaptability and continued

79 evolution (Gregorius et al. 1985; Müller-Starck et al., 1992; Namkoong, 1992). Genetic markers as isozymes allow inference of the genotype of individuals and estimate measures of genetic diversity. Different authors pointed out parameter as the numbers of alleles and expected heterozygosity as genetic verifiers of level of genetic variation within a population (Namkoong et al. 2002). Chestnut (Castanea sativa Mill.) is an important multipurpose specie in Spanish forest. It is one of the candidate specie to make front to climatic change. Therefore it is necessary the study of its levels of genetic diversity (Monteagudo and Fernández-López, 2006) and the conservation of the greater possible variability to establish good reproductive materials. The aim of this study is to propose genetic parameters and their values, obtained from chestnut wild stands of different regions of provenance, as reference to apply in conservation of the genetic resources of Spanish chestnut, specially in the evaluation of genetic diversity of stands selected as basic material for the production of seed (seed sources).

2. MATERIAL AND METHODS

A total of 17 chestnut wild stands of the Regions of provenance 1, 2, 3, 4, 7, 18, 19, 32 and 42 (Fig. 1) were studied using 10 isozyme systems encoding by 13 loci: ADH, E.C.1.1.1.1; PGM, E.C.2.7.5.1; PGI, E.C.5.3.1.9; MDH, E.C.1.1.1.37; SKDH, E.C.1.1.1.25; IDH, E.C.1.1.1.42; PRX, E.C.1.11.1.7; 6PGDH, E.C.1.1.1.44; DIA, E.C.1.6.4.3 and UGP, E.C.2.7.7.9 (Malvotti and Fineschi, 1987; Viilani et al., 1991; Fernández-López, 1996). The genetic parameters calculated were: allelic frequencies, number of observed alleles (na), effective number of alleles (ne) (Hartl and Clark 1989), observed and expected heterozygosity (Ho, He) (Levene 1949; Nei 1973) and percentage of polymorphic loci (P) calculated on the basis of a 5% criterion. The effective population size (Ne) were calculated from data of linkage disequilibrium (Hill 1981) and corrected by the sample size. NE-estimator (Peel et al., 2004) and POPGENE (Yeh and Boyle, 1997) programmes were used for calculation of these genetic parameters.

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Figure 1. Map of Spanish Regions of provenance and distribution of chestnut wild stands studied

3. RESULTS AND DISCUSSION

Among genetic parameters calculated by means of isozyme analysis, we proposed effective number of alleles (ne), expected heterozygosity (He) and percentage of polymorphic loci (P) as indicators of genetic diversity as well as the effective population size (Ne). Ne is an important parameter to take into account to ensure an adequate inter-pollinization and avoid effects of inbreeding. A high Ne might be indicator of a good level of genetic diversity due to a major contribution of different genotypes to the next generation. Individual stand genetic parameters values were calculated by Region of provenance (Table 1).

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Table 1. Values of genetic parameters of chestnut wild stands by Region of provenance (RP) Wild

RP stands Ne ne He P 1 CR4 1.61 1.50 0.29 84.62 1 CR5 0.54 1.50 0.27 76.92 1 CR6 0.38 1.64 0.35 84.62 1 CR13 0.29 1.56 0.33 84.62 2 CR7 0.11 1.53 0.30 76.92 2 CR15 5.44 1.56 0.30 84.62 3 CR9 0.56 1.61 0.34 76.92 3 CR12 0.88 1.56 0.30 76.92 4 CR8 0.31 1.42 0.25 84.62 4 CR14 0.18 1.36 0.23 76.92 7 CR10 0.17 1.49 0.27 69.23 7 CR11 0.26 1.50 0.28 76.92 18 CR2 0.59 1.47 0.27 76.92 18 CR2B 0.38 1.45 0.27 84.62 19 CR1 0.38 1.38 0.23 69.23 32 CR16 3.79 1.52 0.30 84.62 42 CR3 0.35 1.38 0.22 61.54

Isozyme analysis revealed a geographical genetic structure as had been pointed by Monteagudo and Fernández-López (2006) in a previous study of chestnut stands. High and moderate levels of genetic diversity were located principally on the North of Spain at Regions of provenance (RP) 1, 2, 3, 4 and 7 where stands CR6, CR9, CR13 and CR15 had presented the highest values of studied parameters. The genetic diversity had a tendency to a reduction cline to south, with the lowest values of the CR1 (RP 19) and the most southern stand CR3 (RP 42) with the exception of RP 32 which presented a good levels of diversity. These values represented the genetic diversity at these Regions of Provenance and could be applied as a reference with chestnut conservation and management purposes. Values of different Regions of provenance should not be compared and should be used as regional level using de values of nearest Region of provenance. Therefore to select stand at south Region of provenance values of Region 42 must be applied but not values of the North Regions of provenance.

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Acknowledgements This study was financially supported by research project 92-CastaneaREG INTERREG III B Espacio Atlantico. The authors thank Taciana Rial for laboratory support and Miguel Jamardo for prospecting of genetic material support.

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S3.03. ANTIOXIDANT ACTIVITY OF CHESTNUT CONSTITUENTS: FLOWERS, LEAVES, SKINS AND FRUITS

1João C.M. Barreira, 1,*Isabel C.F.R. Ferreira, 2M. Beatriz P.P. Oliveira, 1José Alberto Pereira

1 CIMO/Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Campus de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal. 2 REQUIMTE/Serviço de Bromatologia, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Rua Aníbal Cunha, 164, 4099-030 Porto, Portugal. *Tel +351-273 303219; Fax +351-273 325 405; e-mail: [email protected]

ABSTRACT

In this study, the antioxidant properties of different chestnut constituents (flowers, leaves, skins and fruits) were evaluated through several biochemical assays: DPPH (2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl) radical scavenging activity, reducing power, inhibition of β-carotene bleaching, inhibition of oxidative hemolysis in erythrocytes, induced by 2,2’-azobis(2- amidinopropane)dihydrochloride (AAPH), and inhibition of lipid peroxidation in pig brain tissue through formation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). These assays have been extensively studied as models for the peroxidative damage in biomembranes. For all the methods EC50 values were calculated in order to evaluate the antioxidant efficiency of each product. The phenol and flavonoid contents were also obtained and correlated to antioxidant activity. Chestnut skins revealed much better antioxidant properties, presenting much lower

EC50 values, particularly for lipid peroxidation inhibition in TBARS assay. Also, the highest antioxidant contents (phenols and flavonoids) were found for this constituent.

Key-words: Chestnut constituents; Antioxidants; Scavenging effects; Peroxidation and Hemolysis inhibition

1. INTRODUCTION

Free radicals were a major interest for early physicists and radiologists and much later found to be a product of normal metabolism. Today, we know well that radicals cause molecular transformations and gene mutations in many types of organisms. Although oxygen is essential for aerobic forms of life, oxygen metabolites are highly toxic. In healthy individuals, free radical production is continuously balanced by natural antioxidative defence systems. Disruption of the balance between reactive oxygen species (ROS) production and elimination, due to, among other things, aging, leads to the process called oxidative stress. As a consequence, ROS are known to be implicated in many cell disorders and in the development of many diseases

84 including cardiovascular diseases, atherosclerosis, cataracts, chronic inflammation, or neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s or Parkinson’s disease (Gutteridge, 1993; Knight, 1995). Antioxidants, which can inhibit or delay the oxidation of an oxidizable substrate in a chain reaction, therefore, appear to be very important in the prevention of many diseases (Halliwell et al., 1992). The number of antioxidant compounds synthesized by plants as secondary products, mainly phenolics, serving in plant defence mechanisms to counteract reactive oxygen species (ROS) in order to survive, is currently estimated to be between 4000 and 6000 (Robards et al., 1999;Wollgast & Anklam, 2000; Havsteen, 2002). The antioxidant activities of phenolics are related to a number of different mechanisms, such as free radical-scavenging, hydrogen- donation, singlet oxygen quenching, metal ion chelation, and acting as a substrate for radicals such as superoxide and hydroxyl. A direct relationship has been found between the phenolic content and antioxidant capacity of plants (Robards et al., 1999; Ferreira et al., 2007a). In fact, to counteract deleterious effects of ROS, phenolic compounds, naturally distributed in plants, are effective (Pereira et al. 2006; Ferreira et al., 2007b). To find new natural sources of active compounds, we studied the antioxidant potential of different constituents of Castanea sativa Miller. Among the 12 world chestnuts species, this one is the most consumed being predominant in Portugal, with a relevant place at the socioeconomic level, reaching an annual fruit production of 20000 tons. The best development conditions are found at altitudes higher than 500 m and winter low temperatures, as in the Bragança region (Northeast of Portugal) in which 12,500 ha are used for chestnuts cultivation (Ribeiro et al., 2007). Although it has already been demonstrated that chestnut fruits (Ribeiro et al., 2007) and leaves (Calliste et al., 2005) contain phenolic compounds, little is known about their antioxidant potential and also about other chestnut constituents such as skins and flowers.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Samples and sample preparation

Chestnut fruits, leaves and flowers from Cv. Longal, were collected in August 2006 in a chestnut tree orchard located in Trás-os-Montes, Northeast Portugal. The samples were lyophilized until further use. A fine dried powder (20 mesh) of sample (5g) was extracted with 50 mL of boiling water for 30 min and filtered through Whatman nº 4 paper. The aqueous extract was frozen, lyophilized, and then redissolved in water at a concentration of 20 mg/mL and stored at 4 ºC for further use.

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2.2. Determination of antioxidant contents

Phenolic concentration in the extracts was estimated by a colorimetric assay based on procedures described by Singleton and Rossi (1965) with some modifications. Gallic acid was used for constructing the standard curve (0.01-0.4 mM). Flavonoids were determined following the procedure described by Jia et al. (1999), using (+)-catechin to obtain the standard curve (0.022-0,34 mM).

2.3. Antioxidant activity evaluation assays

The biochemical assays used to screen antioxidant properties were performed according to procedures described by us in previous works (Barros et al., 2007). DPPH radical scavenging activity was evaluated measuring the absorption at 517 nm due to the reduction of the DPPH radical (% RSA = [(ADPPH-AS)/ADPPH] × 100, where AS is the absorbance of the solution when the sample extract has been added at a particular level, and

ADPPH is the absorbance of the DPPH solution). Reducing power was evaluated measuring absorbance at 700 nm after mixing ferric compounds to the samples; a higher absorbance indicates higher reducing power. The inhibition of β-carotene bleaching was evaluated using the β-carotene-linoleate model system. Lipid peroxidation (β-carotene bleaching in the presence of linoleic acid) inhibition (LPO) was achieved spectrofotometrically at 470 nm and calculated by: LPO inhibition = (β-carotene content after 2h of assay/initial β-carotene content) × 100. The inhibition of erythrocyte hemolysis mediated by peroxyl free radicals was performed determining the protective effect of the extracts on erythrocyte hemolysis induced by AAPH

((2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride); % hemolysis inhibition = [(AAAPH-AS)/AAAPH] ×

100, where AS is the absorbance of the sample containing the extract, and AAAPH is the absorbance of the control sample containing no extract. The inhibition of lipid peroxidation using brain tissue was measured by the colour intensity of MDA-TBA (malondialdehyde-thiobarbituric acid) complex. MDA, formed from the breakdown of polyunsaturated fatty acid, serves as a convenient index for determining the extent of lipid peroxidation. The inhibition ratio (%) was calculated using the following formula: Inhibition ratio (%) = [(A – B)/A] x 100%, where A and B were the absorbance of the control and the compound solution, respectively.

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3. RESULTS AND DISCUSSION

Table 1 presents extraction yields (expressed as w/w percentages), phenol and flavonoids contents obtained for all the chestnut constituents. Despite the low values obtained for the extraction yields, the antioxidants contents found were very good, indicating that the extraction was efficient. Nevertheless, it was not observed a relation between the extracted mass and the corresponding phenols and flavonoids. Probably, fruits and leaves contain higher amounts of other polar compounds, besides the antioxidants quantified in this study, than chestnut flowers and skins. Phenols and flavonoids were found in all the samples and in the order: Outer skin > Inner skin > Flower > Leave >> Fruit.

Table 1. Extraction yields, phenols and flavonoids contents of different chestnut constituents. In each row different letters mean significant differences (p<0.05)

Sample Extraction yield (%) Phenols (mg/g) Flavonoids (mg/g) Flower 16.25 298.18±5.73 c 159.56±5.32 c Leave 20.91 102.79±2.98 d 54.49±3.74 d Outer skin 4.98 509.63±18.70 a 502.70±11.21 a Inner skin 21.57 474.58±27.04 b 329.51±6.13 b Fruit 19.60 3.73±0.11 e 2.30±0.16 e

Table 2 shows antioxidant activity EC50 values of chestnut flowers, leaves, outer and inner skins, and fruits measured by different biochemical assays. Overall, chestnut skins revealed better antioxidant properties (significantly lower EC50 values; p<0.05). The EC50 values obtained for these constituents were excellent (less than 165 µg/mL), particularly for LPO inhibition (less than 12 µg/mL). Chestnut flowers and leaves also revealed very good antioxidant activity, while chestnut fruits presented the higher EC50 values in all the tested methods. The obtained results are in agreement with the phenol and flavonoid contents determined for each sample and showed in table 1. The EC50 values obtained for lipid peroxidation inhibition were better than for reducing power, scavenging effects on DPPH radicals, β-carotene bleaching inhibition caused by linoleate free radical and for hemolysis inhibition mediated by peroxyl free radicals.

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Table 2. EC50 values obtained in the antioxidant activity assays of different chestnut constituents. In each line different letters mean significant differences (p<0.05)

EC50 (µg/mL) Flower Leave Outer skin Inner skin Fruit

Scavenging Effect 74.92±0.60 c 169.92±2.49 b 39.66±1.11 d 32.65±0.38 e > 10000 a

Reducing power 87.29±0.03 c 313.30±0.03 b 55.14±0.05 e 68.66±0.01 d 9043.87±1.48 a

Bleaching inhibition 160.60±17.54 c 1450.22±100.59 b 132.92±10.97 c 163.59±13.84 c 3631.51±283.89 a Hemolysis inhibition 196.18±6.88 b 169.06±8.99 b 91.35±1.52 c 47.54±0.43 d 3486.48±70.95 a LPO inhibition 9.93±2.05 c 310.36±11.97 b 7.87±0.15 c 11.54±4.57 c 1116.91±41.04 a

Over two-thirds of cancer-related death could be prevented through lifestyle modification, particularly through dietary means and, chestnut products could contribute to minimize cancer risks trough antioxidants input. Chestnut seems to be a natural provider of antioxidants, increasing its value, since it offers effective protection against oxidative damage, which occurs both in our body and several foods. In conclusion, the results obtained in this study demonstrate that not only chestnut fruits but also other chestnut constituents may be a good candidate for employment as antioxidants sources. For example, flowers and skins are a good source of healthy compounds, namely phenols and flavonoids, suggesting that they could be useful in the prevention of diseases in which free radicals are implicated. C. sativa leaves are already used in folk medicine as a tea to treat hacking cough and diarrhea, and proved to have antibacterial and allelopathic activity (Basile et al., 2000). Nevertheless, to our best knowledge, the present study was the first report to demonstrate that chestnut flowers, skins and fruits have interesting antioxidant potential.

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Sessão 4 Silvicultura / Silvicultura

S4.01. RELACIONES DE COMPETENCIA INTERESPECÍFICA EN LOS CASTAÑARES ESPAÑOLES (Castanea sativa Mill.). UNA APROXIMACIÓN FITOCLIMÁTICA

Javier María García López (1); Carmen Allué Camacho (2)

(1) Área de Medio Natural. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Junta de Castilla y León. C/ Juan de Padilla s/n. 09071-Burgos. [email protected] (2) Área de Medio Natural. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Junta de Castilla y León. C/ Juan de Padilla s/n. 09071-Burgos. [email protected]

RESUMEN

Se estudian aspectos relativos a la competencia interespecífica de los castañares españoles con otras formaciones arbóreas forestales desde un punto de vista fitoclimático. El castañar comparte condiciones fitoclimáticas con un amplio espectro de 11 formaciones forestales. No se ha encontrado ninguna estación de castañar exclusivo. La especie que con más frecuencia encabeza el espectro de diagnosis fitoclimático es Quercus robur, en 327 de las 898 estaciones estudiadas. La segunda especie más frecuente que encabeza espectros de castañar es el propio castaño, con 230 estaciones. Las idoneidades fitoclimáticas más bajas se localizan en espectros encabezados por especies nemorales no sublauroides, como Fagus sylvatica y Quercus petraea. Los espectros de especies encabezados por 2 especies esclerófilas como Quercus ilex ballota y Quercus suber son los de mayor idoneidad media, aunque en general compatibles con formaciones marcescentes como Quercus pyrenaica.

Palabras clave: Fitoclimatología, castaño, Castanea, idoneidad, competencia

INTRODUCCIÓN

Los castañares son formaciones propias de la región mediterránea septentrional, con algunas manifestaciones menores en centroeuropa, en el norte de África y en el Cáucaso. En España existen cerca de 84.000 ha atribuibles a esta especie, según datos del II Inventario Forestal Nacional. Pueden destacarse 4 núcleos principales de distribución (Ruiz de la Torre, 2006): El primero centrado en el noroeste y litoral cantábrico, desde Galicia a Navarra, el segundo en Cataluña (Barcelona y Gerona), el tercero en el centro-oeste (Valle del Tiétar,

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Gredos, Peña de Francia, suroeste de Madrid, etc…) y el cuarto en Andalucía (Sierras de Ronda, Aracena, Sierra Nevada y Sierra Morena). A pesar de ser relativamente abundantes los trabajos en los que se mencionan aspectos ecológicos sobre Castanea sativa, la faceta fitoclimática ha sido tradicionalmente muy poco estudiada. Los estudios más completos existentes hasta el momento para todo el territorio nacional son los de Gandullo et al. (2004), basados en 182 parcelas. La importancia del factor competencia en la distribución de las especies vegetales es de tal magnitud que según algunos autores los límites naturales de distribución de una especie se producirían donde unas condiciones ambientales variables disminuyen hasta tal punto su capacidad de competencia que se ve desplazada por otras especies, de tal forma que en general los factores ecológicos sólo tendrían capacidad determinante en los límites absolutos de distribución (Walter, 1977). En el presente estudio se pretende avanzar en el conocimiento fitoclimático de las relaciones de competencia los castañares españoles con otras formaciones forestales desde un enfoque fitoclimático.

MATERIAL Y MÉTODOS

A partir de la base de datos de parcelas de muestreo correspondientes al II Inventario Forestal Nacional (DGCONA, 1986-1995), se seleccionaron los 898 puntos con presencia natural de Castanea sativa como especie principal de la formación forestal. La selección de parcelas se hizo mediante la utilidad informática BASIFOR (Del Río et al.; 2001) segregando aquellos registros con presencia natural de castaño como primera especie dominante de la formación (figura 1).

Figura 1. Situación de los 898 puntos del II IFN con presencia de Castanea sativa Mill. como especie principal de la formación vegetal

El sistema fitoclimático utilizado es el basado en los modelos de Allué-Andrade (1990 y 1997) modificados por García-López & Allué Camacho (2003). Los 898 puntos de castañar

91 fueron identificados por sus coordenadas UTM (Huso 30) y su altitud, y se trataron con el programa informático FITOCLIMOAL’2000 (García-López & Allué Camacho, 2000) para la obtención de los datos mensuales brutos de temperatura y precipitación conforme a los modelos de Sánchez Palomares et al. (1999). Posteriormente, con el mismo programa fueron hallados los factores fitoclimáticos de la tabla 1.

Tabla 1. Factores fitoclimáticos utilizados

ABREVIATURA FACTOR UNIDAD Intensidad de la aridez. Se calcula por el cociente As/Ah, siendo Ah el área húmeda de climodiagrama

K (curva de Pi por encima de la de Ti, es decir 2TiPi). Duración de la aridez, en el sentido de GAUSSEN, es A decir, el número de meses en que la curva de Ti se meses sitúa por encima de la de Pi, es decir cuando 2Ti>Pi. P Precipitación anual total mm. Precipitación estival mínima (Junio, Julio, Agosto o PE mm. Septiembre) TMF Temperatura media mensual más baja ºC T Temperatura media anual ºC TMC Temperatura media mensual más alta ºC Temperatura media de las mínimas del mes de TMMF ºC temperatura media más baja Temperatura media de las máximas del mes de TMMC ºC temperatura media más alta Helada segura. Calculada como nº de meses en que HS meses Ti>=4ºC Periodo de actividad vegetal libre, calculada como el PV número de meses en que Ti>=7,5ºC excluidos los meses periodos con A>0 OSC Oscilación térmica. Se calcula como TMC-TMF ºC Sobre la base de los modelos anteriores, se construyó un sistema fitoclimático de carácter autoecológico a partir de 36.496 parcelas del II IFN correspondientes a 17 especies

92 arbóreas forestales, entre ellas Castanea sativa, asignándose un ámbito factorial propio a cada especie, formado por las parcelas en que ésta figurase como especie principal de la formación forestal. A los efectos de este trabajo se entiende por “idoneidad fitoclimática” (Allué Camacho, 1996) el grado de adecuación de un lugar para acoger a determinados taxones o sintaxones, todo ello desde el punto de vista mixto de su perdurabilidad (capacidad de autoregeneración), de su competitividad con otras especies y resistencia a enfermedades.

RESULTADOS

El resultado de diagnosticar mediante el sistema fitoclimático autoecológico los 898 puntos de castañar se expone en la tabla 2. En esta tabla cada terna (A; B; C; D; E; F; G) incluye los códigos abreviados de las especies en el interior de cuyos ámbitos fitoclimáticos definidos por una envolvente convexa se incluye el punto analizado, en orden de escalar de adecuación descendente. Se considera una anotación abreviada del espectro de diagnosis

(ea.A; eb.B; ec.C; ed.D; ee.E; ef.F; eg.G) en donde ei es el escalar de adecuación de la estación estudiada al ámbito fitoclimático de la especie i, con ea>eb>ec>ed>ee>ef>eg (García-López & Allué Camacho, 2006). Para que los escalares de adecuación a cada ámbito sean comparables entre sí, su cálculo se realiza en cada caso respecto del ámbito intersección de las especies presentes en el espectro. Por ejemplo, una estación cuya diagnosis completa sea (0,51.Qba; 0,73.Csa; 0,32.Qpy) tendrá una anotación abreviada (Qba; Csa; Qpy) y sus escalares de adecuación 0,51; 0,73 y 0,32 se habrán calculado respecto del ámbito factorial intersección de las 3 especies, siendo Qba: Quercus ballota, Csa: Castanea sativa y Qpy: Quercus pyrenaica.

Tabla 2. Espectros fitoclimáticos de especies procedentes de la diagnosis de los 898 puntos de castañar estudiados, formados con el sistema fitoclimático confeccionado a partir de las titulares forestales competencia con Castanea sativa. Pni: Pinus nigra; Psy: Pinus sylvestris;

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Qba: Quercus ilex ballota; Qil: Quercus ilex ilex; Qfa: Quercus faginea; Qpy: Quercus pyrenaica; Fsy: Fagus sylvatica; Qpe: Quercus petraea; Qro: Quercus robur; Csa: Castanea sativa; Qsu: Quercus suber; Qpu: Quercus pubescens; Qca: Quercus canariensis. La columna “Media” indica el valor del índice de idoneidad fitoclimática (x100) y “Dst.” su desviación estándar Medi Medi Dst Espectro de Especies Nº Dst. Espectro de Especies Nº a a . (Pni;Qfa;Qpy;Qba;Csa;) 2 56,5 0,7 (Qro;Qil;Csa;) 1 57 0 (Pni;Qpy;Qfa;Qba;Csa;) 3 52,3 0,6 (Qro;Qil;Csa;Qfa;Qpu;Qpe;) 1 48 0 (Pni;Csa;) 1 40 0 (Qro;Csa;) 87 57,3 4,5 Total Pni 6 51,7 6,1 (Qro;Csa;Qpy;) 128 53,7 3,9 (Qsu;Qil;Csa;) 4 66,8 5,6 (Qro;Csa;Qpy;Qfa;) 1 53 0 (Qsu;Csa;) 2 72 1,4 (Qro;Csa;Qpy;Qil;) 1 52 0 (Qsu;Csa;Qba;) 3 69 0 (Qro;Csa;Qpy;Fsy;) 1 51 0 (Qsu;Csa;Qba;Qpy;) 1 68 0 (Qro;Csa;Qpy;Qpe;) 2 50 0 (Qsu;Csa;Qba;Qpy;Qfa;) 4 66,3 1 (Qro;Csa;Qpy;Qpe;Qil;Qfa;) 1 52 0 (Qsu;Qba;Csa;) 81 63,1 7,7 (Qro;Csa;Qpy;Qba;) 1 52 0 (Qsu;Qba;Csa;Qfa;) 1 66 0 (Qro;Csa;Qpy;Qba;Qfa;) 1 52 0 (Qsu;Qba;Csa;Qpy;) 6 66,3 2,6 (Qro;Csa;Qil;) 24 55,1 2,5 (Qsu;Qba;Csa;Qpy;Qfa;) 11 66,9 1,2 (Qro;Csa;Qil;Qfa;Qpu;Qpe;) 1 49 0 Total Qsu 113 64,3 6,9 (Qro;Csa;Qil;Qfa;Qpe;Qpu;) 1 48 0 (Qca;Qsu;Qba;Csa;) 6 54,8 7,3 (Qro;Csa;Qil;Qpy;) 1 52 0 Total Qca 6 54,8 7,3 (Qro;Csa;Qil;Qpe;Qfa;Qpu;) 2 49 0 (Qfa;Pni;Qpy;Qba;Csa;) 1 58 0 (Qro;Csa;Fsy;) 1 50 0 (Qfa;Qpy;Pni;Qba;Csa;) 1 60 0 (Qro;Csa;Qpe;) 1 50 0 (Qfa;Qpy;Csa;Qba;) 2 61,5 2,1 (Qro;Csa;Qpe;Qpy;) 15 49,3 1,6 (Qfa;Qpy;Qba;Pni;Csa;) 1 61 0 (Qro;Csa;Qpe;Qpy;Qil;) 2 50,5 0,7 (Qfa;Qpy;Qba;Csa;) 3 59,3 5 (Qro;Csa;Qpe;Qil;Qfa;Qpu;) 4 48,3 0,5 (Qfa;Csa;Qpy;Qba;) 1 64 0 (Qro;Csa;Qba;Qpy;) 6 53,3 0,5 (Qfa;Qba;Qpy;Csa;) 3 60 5,6 (Qro;Csa;Qba;Qpy;Qfa;) 3 53 0 (Qpy;Qfa;Pni;Qba;Csa;) 1 58 0 (Qro;Qpe;Csa;) 1 49 0 (Qpy;Qfa;Csa;Qba;) 1 55 0 (Qro;Qpe;Csa;Qpy;) 19 47,5 1,4 (Qpy;Qfa;Qba;Csa;) 10 53,5 8,4 (Qro;Qpe;Csa;Qpy;Fsy;) 11 46,8 0,9 (Qpy;Csa;) 4 56 0 (Qro;Qpe;Csa;Fsy;) 3 48 1 (Qpy;Csa;Qba;Qfa;) 1 55 0 (Qro;Qpe;Csa;Fsy;Qpy;) 2 46,5 0,7 (Qro;Qpe;Csa;Fsy;Qba;Qpy;Qf (Qpy;Qpe;Qfa;Csa;Qba;) 1 55 0 1 48 0 a;) (Qro;Qpe;Csa;Qba;Qpy;Fsy;Qf (Qpy;Qba;Csa;) 2 53 0 2 47 0 a;) Total Qpy o Qfa 32 56,6 5,9 (Qro;Qpe;Csa;Qba;Fsy;) 1 48 0 (Qil;Qsu;Csa;) 6 66,5 3,9 (Qro;Qba;Csa;Qpe;Qil;Qfa;Qpu 1 46 0

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;) (Qil;Csa;) 9 62,9 4,2 Total Qro 327 53,5 4,8 (Qil;Csa;Qsu;Qfa;Qpu;) 8 51,9 0,6 (Qpe;Qpy;Csa;Qfa;Qba;) 3 53,7 0,6 (Qil;Csa;Qsu;Qpu;) 16 52,3 1,3 (Qpe;Csa;Qpy;) 1 45 0 (Qil;Csa;Qfa;Qpu;) 7 51,1 1,8 (Qpe;Csa;Qpy;Qba;Qfa;) 1 55 0 (Qil;Csa;Qfa;Qpu;Qpe;) 1 50 0 (Qpe;Fsy;Qpy;Qfa;Csa;Qba;) 3 52,3 0,6 (Qil;Csa;Qpu;) 4 53,8 1 (Qpe;Fsy;Qpy;Qfa;Qba;Csa;) 7 47,6 2,2 (Qpe;Fsy;Qpy;Qpu;Qfa;Qba;Cs (Qil;Csa;Qro;Qfa;Qpu;Qpe;) 2 49,5 0,7 2 49,5 0,7 a;) (Qil;Csa;Qro;Qfa;Qpe;) 1 52 0 (Qpe;Fsy;Qpy;Csa;) 12 45,8 1,5 Total Qil 54 55,4 6,2 (Qpe;Fsy;Qpy;Csa;Qfa;Qba;) 4 51,5 1 (Csa;Qsu;Qpy;) 1 65 0 (Qpe;Fsy;Qpy;Csa;Qba;) 4 46,8 1,3 (Csa;Qsu;Qba;Qpy;Qfa;) 2 65 0 (Qpe;Fsy;Qpy;Csa;Qba;Qfa;) 6 49,8 1,5 (Qpe;Fsy;Qpy;Csa;Qba;Qro;Qf (Csa;Qpy;) 7 63,4 2,4 1 50 0 a;) (Csa;Qpy;Qro;) 3 60 1,7 (Qpe;Fsy;Qpy;Qba;Qfa;Csa;) 2 44,5 0,7 (Csa;Qil;) 1 49 0 (Qpe;Fsy;Qpy;Qba;Csa;) 5 45,8 1,9 (Csa;Qil;Qfa;Qpu;Qpe;) 1 50 0 (Qpe;Fsy;Qpy;Qba;Csa;Qfa;) 5 45,2 1,6 (Csa;Qil;Qpu;Qpe;) 2 50 0 (Qpe;Fsy;Csa;Qpy;) 3 46,7 2,1 (Qpe;Fsy;Csa;Qro;Qpy;Qba;Qf (Csa;Qil;Qro;Qfa;Qpu;Qpe;) 4 49 0 2 50 0 a;) (Csa;Qil;Qpe;Qpu;) 1 49 0 (Qpe;Fsy;Csa;Qba;Qpy;Qfa;) 1 50 0 (Csa;Qro;) 2 67 1,4 (Qpe;Fsy;Qro;Csa;Qpy;) 5 47,2 0,8 (Csa;Qro;Qsu;Qpy;) 1 68 0 (Qpe;Fsy;Qba;Qfa;Csa;) 1 48 0 (Csa;Qro;Qpy;) 12 58,5 2 (Qpe;Fsy;Qba;Csa;Qfa;) 2 48,5 0,7 (Csa;Qro;Qpy;Qsu;) 1 67 0 (Qpe;Fsy;Qba;Csa;Qpy;Qfa;) 1 48 0 (Csa;Qro;Qba;Qpy;) 6 55 1,5 (Qpe;Qro;Csa;Qpy;) 1 49 0 (Csa;Qro;Qba;Qpy;Qfa;) 1 53 0 (Qpe;Qro;Csa;Qba;Qpy;Qfa;) 1 49 0 (Qpe;Qro;Csa;Qba;Fsy;Qpy;Qf (Csa;Qpe;Qil;Qpu;Qfa;) 1 48 0 1 52 0 a;) (Csa;Qba;Qsu;Qpy;Qfa;) 16 64,4 0,7 (Qpe;Qro;Fsy;Csa;Qpy;) 11 47,2 1 (Csa;Qba;Qfa;) 2 67 0 (Qpe;Qro;Fsy;Csa;Qba;Qpy;) 2 47 0 (Csa;Qba;Qfa;Qpy;) 13 65,8 1,4 (Qpe;Qba;Csa;Qfa;) 11 47,4 0,7 (Csa;Qba;Qpy;) 28 59,4 2,9 (Qpe;Qba;Csa;Qfa;Fsy;) 2 48 0 (Csa;Qba;Qpy;Qfa;) 57 58,4 4,6 (Qpe;Qba;Csa;Qpu;Qfa;) 3 46 0 (Csa;Qba;Qpy;Qfa;Qsu;) 1 65 0 (Qpe;Qba;Csa;Qpu;Qfa;Qil;) 5 46,2 0,4 (Csa;Qba;Qpy;Qfa;Qro;) 7 55,7 1,3 (Qpe;Qba;Csa;Fsy;Qfa;) 3 49 0 (Csa;Qba;Qpy;Qro;) 32 57 0,9 Total Qpe 111 47,8 2,4 (Csa;Qba;Qpy;Qro;Qfa;) 13 54,8 0,7 (Qba;Qsu;Csa;) 2 61,5 3,5 (Csa;Qba;Qro;Qpy;) 9 56,3 1,6 (Qba;Qsu;Csa;Qfa;Qpy;) 1 66 0

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(Csa;Qba;Qro;Qpy;Qfa;) 6 54,7 0,8 (Qba;Qsu;Csa;Qpy;) 2 66,5 0,7 Total Csa 230 58,7 4,7 (Qba;Qsu;Csa;Qpy;Qfa;) 8 65,8 0,5 (Fsy;Qpy;Csa;) 1 50 0 (Qba;Qfa;Csa;Qpy;) 4 59 0 (Fsy;Qpy;Csa;Qro;) 1 50 0 (Qba;Csa;) 8 57 1,3 (Fsy;Qpy;Qpe;Qfa;Csa;Qba;) 1 55 0 (Qba;Csa;Qsu;Qfa;Qpy;) 5 64 0 (Fsy;Csa;Qba;Qro;Qpy;) 4 52 0 (Qba;Csa;Qsu;Qpy;Qfa;) 3 63,7 3,2 (Fsy;Psy;Qpe;Qpy;Csa;) 1 37 0 (Qba;Csa;Qfa;Qpy;) 5 64 5,2 (Fsy;Qpe;Qpy;Qba;Qfa;Csa;) 6 40,8 3,1 (Qba;Csa;Qpy;) 7 59,1 2,6 (Fsy;Qpe;Qpy;Qba;Csa;) 3 35,3 4 (Qba;Csa;Qpy;Qfa;) 3 60 2 (Fsy;Qpe;Psy;Qpy;Qfa;Qba;Cs 2 37 2,8 Total Qba 48 61,8 3,9 a;) (Fsy;Qpe;Psy;Qpy;Csa;) 1 40 0 (Fsy;Qpe;Psy;Qpy;Qba;Qfa;Cs 2 35 5,7 a;) Total Fsy 22 42,5 7,3

Como puede comprobarse en la tabla 2, todas las estaciones de castañar analizadas comparten condiciones fitoclimáticas con otras especies arbóreas forestales. De hecho, no se ha encontrado ninguna estación de castañar exclusivo, esto es, con espectro fitoclimático formado únicamente por Castanea sativa. El castañar comparte condiciones fitoclimáticas con un amplio espectro de 11 formaciones forestales: Pinus nigra, Pinus sylvestris, Quercus ilex ballota, Quercus ilex ilex, Quercus faginea, Quercus pyrenaica, Fagus sylvatica, Quercus petraea, Quercus robur, Quercus suber, Quercus canariensis y Quercus pubescens. La especie que con más frecuencia encabeza el espectro de diagnosis fitoclimático es Quercus robur, en 327 de las 898 estaciones estudiadas. La segunda especie más frecuente que encabeza espectros de castañar es el propio castaño, con 230 estaciones. A pesar de ser los espectros encabezados por Quercus robur los más abundantes, su idoneidad fitoclimática es baja. En general las idoneidades más bajas se localizan en espectros encabezados por especies nemorales no sublauroides, como Fagus sylvatica y Quercus petraea. Los espectros de especies encabezados por 2 especies esclerófilas como Quercus ilex ballota y Quercus suber son los de mayor idoneidad media, aunque en general compatibles con formaciones marcescentes.

DISCUSION

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La metodología aplicada en el presente estudio ha permitido avanzar en algunas facetas concretas del conocimiento fitoclimático de los castañares españoles desde una perspectiva nueva, como es la relativa a la competencia fitoclimática entre especies forestales. El que todas las estaciones estudiadas de castañar sean compatibles con ámbitos factoriales y tipos fitoclimáticos también propios de otras especies arbóreas forestales parece confirmar que no existen unas condiciones fitoclimáticas originales, propias y exclusivas de Castanea sativa y parece confirmarse desde el punto de vista experimental las impresiones repetidamente recogidas en la bibliografía sobre la importancia que la competencia con otras especies forestales y de la mano del hombre en la distribución de los castañares. La baja idoneidad fitoclimática hallada en los espectros encabezados por Quercus robur parece sugerir una posible extensión artificial del castaño por el hombre en la mayor parte de la cornisa norte y noroeste de España. El óptimo del castañar parece situarse en situaciones intermedias entre formaciones esclerófilas y marcescentes, no continentales y térmicas.

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S4.01. ESTUDO COMPARATIVO DAS CARACTERÍSTICAS DA MADEIRA DE CASTANHEIRO (CASTANEA SATIVA MILL.) CONDUZIDO EM REGIME DE ALTO FUSTE, DE SOUTO E IMPORTADA

1Louzada, J.L., 1Silva, M.E., 1Castro, S.B., 1Oliveira, S.P., Morais, J.

1 UTAD, Dep. Florestal, 5001-801 Vila Real, Portugal

RESUMO Foi avaliada a qualidade da madeira de Castanheiro produzida em regime de alto fuste, souto e importada. Não se verificaram diferenças no comprimento das fibras, extractivos e densidade. Porém, a madeira de souto revelou-se de pior qualidade (maior retracção axial, anisotropia, humidade saturação fibras e menor resistência mecânica) e a de alto fuste como a melhor.

Palavras-chave: Qualidade, Madeira, Castanheiro, Castanea sativa

1. INTRODUÇÃO Em Portugal o Castanheiro (Castanea sativa Mill.) apresenta-se como uma espécie florestal muito interessante. Não obstante o problema das doenças que a tem afectado e que estão na origem de uma assinalável redução da sua área (Portela et al, 1999; Fonseca et al, 2004; Bragança et al, 2004; Portela e Pinto, 2005), esta ainda é uma espécie com uma inegável importância económica. Sendo suporte a populações rurais que se fixaram em muitas regiões carenciadas do interior de Portugal, desempenha um papel fulcral na economia dessas regiões. No entanto, o interesse da cultura do Castanheiro não se limita apenas ao factor económico resultante da venda do fruto, mas também à qualidade da sua madeira. De facto, a madeira de Castanheiro é considerada como de excelente qualidade para variadas aplicações, tais como carpintaria, mobiliário, soalhos e “parquets”, painéis, tanoaria e cestaria (Ferrand, 1980; Chanson, 1988; Carvalho, 1997). Devido à sua durabilidade é também utilizada em exteriores (Carvalho, 1997). No passado, a cultura desta espécie em Portugal tanto era feita em regime de souto (enxertado para produção de fruto) como de castinçal (“bravo” para produção de madeira). Todavia, em consequência de uma excessiva exploração dos castinçais (alto fuste para produção de peças de maior dimensão e talhadia para tanoaria e cestaria) estes praticamente desapareceram, restando, actualmente, quase apenas os povoamentos de souto conduzidos para produção de fruto. Com a crescente redução da madeira proveniente dos castinçais, às indústrias de transformação de madeira de castanheiro não restaram alternativas ao seu abastecimento de matéria-prima que não fosse recorrer à importação

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(nomeadamente de França), ou à utilização da madeira proveniente de soutos dizimados pelas doenças da tinta e do cancro. Porém, uma questão que subsiste é saber em que medida a madeira importada de França e a proveniente de soutos apresenta, ou não, características idênticas à produzida nos castinçais, sendo este o objectivo principal deste trabalho.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

O material utilizado neste trabalho teve como base 30 amostras de Castanea sativa Mill, sendo 10 provenientes de madeira produzida em regime de alto fuste, 10 de madeira importada de França e 10 de madeira produzida em regime de souto. As amostras relativas a alto fuste foram obtidas 1 por árvore e colhidas a 45% da altura total da árvore. As amostras provenientes de souto foram também obtidas 1 por árvore, extraídas da porção do tronco comercializável (normalmente com aproximadamente 2.5m de comprimento): 5 colhidas da extremidade de maior diâmetro e as outras 5 da de menor diâmetro. Já o material representativo da madeira importado de França foi obtido a partir de 10 tábuas cortadas com orientação radial e contendo a medula. Deste conjunto de 30 amostras foram então obtidos os provetes de ensaio para a estimativa das seguintes propriedades da madeira: - Comprimento das fibras - Teor de Extractivos - Densidade básica - Densidade a 12% Humidade - Retracções (Total, Coef. de retracção e de Estabilidade ao ar e Diferenciais de secagem) - Humidade de saturação das fibras - Características Mecânicas (Módulo de Elasticidade e Tensão de Rotura à Compressão) Os ensaios mecânicos de compressão foram realizados segundo a norma NP/618 (1973) e as restantes características de acordo com os procedimentos descritos por Fonseca e Louzada (2000).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 são apresentados os valores médios das diferentes características da madeira de Castanea sativa produzida em regime de alto fuste, souto e importada de França. Com base nestes resultados podemos verificar que, em termos médios, não há diferenças significativas entre o comprimento das fibras produzidas em regime de alto fuste (1.11mm), souto (1.12mm) ou importado de França (1.15mm), os quais são ligeiramente

100 superiores aos obtidos por Sousa (1984) para a mesma espécie (0.9 mm). Assim sendo, não será de esperar qualquer alteração do desempenho da madeira proveniente de qualquer destas 3 modalidades para a produção de produtos fibrosos, como sejam o fabrico de pasta para papel e aglomerados de fibras, embora esta não seja muito utilizada para estes fins.

Tabela 1. Valores médios das características biométricas, químicas, físicas e mecânicas da madeira de Castanheiro, por modalidade. As médias da mesma linha com letra comum não são significativamente diferentes pelo Teste de Duncan Característica Alto fuste Imp. Souto França Comp. Fibras (mm) 1.11 a 1.15 a 1.12 a Teor extractivos (%) 15.9 a 15.3 a 18.2 a Densidade básica 0.443 a 0.438 a 0.468 a Densidade 12%Hum. 0.575 a 0.539 a 0.558 a Retracção total Tang. (%) 8.95 a 9.28 a 9.37 a Retracção total Rad. (%) 5.18 b 4.20 a 3.70 a Retracção total Axial (%) 0.41 a 0.50 a 0.97 b Retracção tot. Vol. (%) 14.98 a 14.04 a 14.94 a Anisotropia Retracç. (T/R) 1.73 a 2.21 b 2.53 c Coef. retracção Tang. 0.283 b 0.289 b 0.245 a Coef. retracção Rad. 0.198 c 0.163 b 0.123 a Coef. retracção Axial 0.008 a 0.016 a 0.052 b Coef. retracção Vol. 0.491 a 0.468 a 0.420 a Coef. estabilidade ar Tang. 0.020 a 0.022 a 0.036 b Coef. estabilidade ar Rad. 0.015 a 0.012 a 0.018 b Diferencial Secagem Tang. 6.21 a 5.98 a 5.90 a Diferencial Secagem Rad. 3.05 c 2.66 b 2.26 a Humid. Sat. Fib. Tang. (%) 31.95 a 32.43 a 39.33 b Humid. Sat. Fibras Rad. (%) 26.33 a 26.50 a 30.92 b Humid. Sat. Fibras Vol. (%) 31.06 ab 30.14 a 34.97 b Anisotropia Hum. Sat. Fib. 5.60 a 5.94 a 8.41 b Módulo Elasticidade (Mpa) 4655.4c 3832.6b 3405.2a Tensão Rotura Comp. (Mpa) 52.08 c 45.07 b 39.81 a

Relativamente ao teor de extractivos (fracção em água + fracção em solventes orgânicos) os valores obtidos para a madeira de Castanho são relativamente elevados (entre 15% e 18%), inclusivamente um pouco mais elevados que os referidos por Rowell (1984) para

101 a C. crenata (13%) e C. sativa (11%) e Fengel e Wegener (1989) para a C. crenata (9.8%). Comparativa-mente a outras espécies, estes são muito superiores aos referidos por exemplo por Fengel e Wegener (1989) para a madeira de Fagus crenata (4.3%), Robinia pseudoacacia (4.9%), ou por Rowell (1984) para a madeira de Acer saccharum (6%), Fagus grandifolia (4%), Quercus rubra (11%), Q. alba (9%) e Ulmus americana (6%), e idênticos a madeiras normalmente consideradas como ricas em extractivis, como sejam a Ceiba pentandra (17%), Terminalia amazónica (18%), Tectona grandis (18%) e Dalbergia melanoxylan (16%), ou mesmo a Hymenaea courbaril (14%), Fraxinus americana (12%) e Quercus rubra (11%), (Rowell, 1984). Estes elevados teores de extractivos revelados pela madeira de Castanho serão, em princípio, garante de uma elevada resistência à biodegradação, confirmando assim a boa aptidão deste tipo de madeira para aplicações de exterior. Para além disso, é também de sublinhar o facto de embora as diferenças do teor de extractivos entre as 3 modalidades não serem estatisticamente significativas, é notório um ligeiro acréscimo do teor no souto (18.2%) relativamente às restantes modalidades (15.9% e 15.3%), devendo este acréscimo ser devido ao facto das árvores conduzidas em regime de souto sofrerem um muito maior nº de tratamentos culturais (nomeadamente podas, desramas e mobilizações de solo) que induzem uma maior necessidade de formação de extractivos necessários à cicatrização dos tecidos. Quanto à densidade, não só os valores são muito idênticos entre as 3 modalidades

(0.438

102 evidenciou o maior valor de anisitropia e de humidade de saturação das fibras, o que constitui também um indício de maior propensão a empenos e outras deformações durante a secagem, daí resultando também inúmeras desvantagens para um vasto leque de aplicações mais nobres. Em princípio esta anormal elevada anisotropia e instabilidade dimensional na direcção axial deverá ter origem numa elevada inclinação não só das microfibrilas na S2 da parede celular, como inclusivamente das próprias fibras (fio inclinado), características estas que surgem associadas ao lenho juvenil, consequência duma forte influência da copa ao longo de praticamente toda a vida da árvore e que irá retardar, ou mesmo inibir a formação de lenho adulto (Zobel e Buijtenen, 1989; Zobel e Sprague, 1998). Em situação oposta surge a madeira de alto fuste. Não só apresenta os mais baixos valores de Ret. total e Coef. ret. na direcção axial, como a mais baixa anisotropia e humidade sat. Fibras. Neste caso como as árvores são conduzidas por forma a fomentar o crescimento em altura em detrimento do crescimento em diâmetro, a copa ao acompanhar o crescimento do tronco liberta os níveis inferiores da sua influência permitindo, assim, o desenvolvimento do lenho adulto caracterizado por apresentar menor inclinação do fio e das microfibrilas e, desta forma, com maior estabilidade dimensional e menor anisotropia. Esta elevada inclinação do fio e das microfibrilas não só condiciona as retracções axiais e a anisotropia, como inclusivamente lhe retira muita da sua consistência estrutural, reflectida numa diminuição da sua resistência mecânica. Este aspecto pode ser verificado nos ensaios de compressão axial, nos quais a madeira de souto foi sempre significativamente menos resistente (Mod. Elast.=3405.2Mpa e Tens. Rot.=39.81Mpa) e a de alto fuste mais resistente (Mod. Elast.=4655.4Mpa e Tens. Rot.=52.08Mpa), enquanto que a importada de França revelou um comportamento intermédio (Mod. Elast.=3832.6Mpa e Tens. Rot.=45.07Mpa). Comparativamente a outros trabalhos, Carvalho (1997) apresenta para a madeira de C. sativa um valor médio de Tens. Rot.=44.14Mpa, Chanson (1988) um valor de 45.13Mpa e Rousodemos e Paraskoupoulou (1996) um valor de 47.6Mpa.

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Sessão 5 Patologia / Patología

S5.01. CHESTNUT INK DISEASE AND PHOTOSYNTHETIC PRODUCTIVITY

1Dinis, L-T., 1Gomes-Laranjo, J., 2Peixoto, F., 4Costa, R. e 3Abreu, C.

1CETAV, 2CECAV, 3CEGE Universidade Trás-os-Montes e Alto Douro, 5000 Vila Real 4Estação Florestal Nacional, 2780-159 Oeiras. Autor correspondente: [email protected]

ABSTRACT Photosynthetic relations changes associated with infection by Phytophthora cinnamomi were studied in inoculated plants of Castanea sativa, COLUTAD and clones (C. crenata x C. sativa). The aim of this work is to analyse the effects on photosynthesis post-inoculation with the ink disease soil pathogen Phytophthora cinnamomi, in chestnut trees at the level of gas exchange parameters. Results indicate an increase (11 to 35%) in the photosynthetic rate in hybrid plants (Castanea crenata x Castanea sativa), in contrast to the C. sativa plants (decrease of 19%).

Keywords: Castanea sativa Mill., gas exchange, hybrid chestnuts, Phytophthora cinnamomi, water relations.

1. INTRODUCTION In certain areas of the agrarian landscape of the interior of Northern Portugal many of the predisposition factors to ink disease (caused by Phytophthora cinnamomi) are observed in the European chestnut tree: soil compaction, rupture of roots by the passage of farm machinery, low available organic matter, shortage of Ca and Mg, poor soils with high exchangeable acidity and loss of biological diversity inside the orchard (Abreu, 1992). The severity of these symptoms has been related to the climatic and soil characteristics, which were shown to be more stressful on south-facing stands (Martins et al., 1999). According to Gomes et al. (1987), the orchard is actually an ecosystem with low resilience capacity. When non-susceptible plants are infected, they show an increase in leaf yellowing characteristics but do not wither or fall, and in the following year a number of shoots wither and do not bear many leaves. The dieback of branches, defoliation and the gradual decline in health condition continue progressively over several years, sometimes for as long as 10 years, until the death of the tree (Crawford, 1995). Water limitations which influence gas exchanges and in consequence a reduction in photosynthesis rate were also observed, leading to increased photo-oxidative damage specifically affecting photosystem I (PSI) and PSII; this damage being particularly high during hot and dry weather (Gomes-Laranjo et al., 2004).

105

The aim of this work was to perform a comparative analysis of gas exchange characteristics post-inoculation with P. cinnamomi in hybrid clones (Castanea crenata x Castanea sativa) and in C. sativa plants.

2. MATERIALS AND METHODS

The field work was performed between June and August 2006. Field measurements were made between 10.00 and 13.00 hours (local time) on 21 June (Tmax 34ºC), 13 July (Tmax 36,4ºC) and 2 August (29,4ºC). Three year old hybrid chestnut (C. crenata x C. sativa) clones (FBRO 057, FBRO 224,

FSRD 079 and Ca90) and C. sativa plants (cv. Judia and S12) were studied. Plants of ink- resistant COLUTAD clone were also included. All of them were placed in 15L pots to prevent water stress. Plants were inoculated by stem-incision and with an axenically prepared mycelium suspension of P. cinnamomi (isolate UTAD 107 = IMI 340340) directly into the soil, 1 week after the first inoculation. Instantaneous leaf measurements of gas exchanges were made with an IRGA mod. LCA- 2 (Analytical Development CO., Hoddesdon, UK) 22 and 42 days after the inoculation, between 10.00 and 13.00 hours. In the same leaves, water potential was determined in a pressure type Scholander chamber (mod. Elle International) and in the laboratory osmotic potential was also measured in an osmometer (mod. 3w, Advanced Instruments, Needham Heights, Massachussets, USES). Photosynthetic pigments were extracted from six 8 mm diameter leaf disks with 80% v/v acetone, in sealed test tubes for 48 hours. Absorbance was measured in a spectrophotometer model Jasco V-530 (UV/VIS) and data analyses were done according to a previously described method (Lichtenthaler, 1987). PSII fluorescence analyses with a fluorimeter (PSM, Biomonitor) were also done, using pulses of actinic light 400 μmol.m2.s-1 with a duration of 1 second (“with the help of springs”).

3. RESULTS AND DISCUSSION

The inoculation of chestnut tree plants with the oomycete induced variation in the photosynthetic rate (Figure 1). The majority of clones showed an increase in photosynthesis 42 days after inoculation: COLUTAD (11%), FBRO057 (18%), FBRO224 (35%), FSRD079 (13%) and S12 (11%). The exceptions were Ca90 with a significant increased rate in control and inoculated plants, and a significant decrease in photosynthetic rate was observed in Judia plants (19%). The increase in the photosynthetic rates, which promotes increased sugar

106 translocation from photosynthetic tissues, through the phloem, into the non-photosynthetic tissues (Taiz and Zeiger, 2002).

a 7

6 )

-1 5 .s -2

4

3 A (µmol.m 2

1

0

21 June 2 August Time (days)

Figure 1- Study of the effect of Phytophthora cinnamomi inoculation in photosynthetic rate in chestnut plants in control day (21st June) and 42 days (2nd August) after the inoculation. Bars represent the difference between control and infected plants.

Changes in water potential (Ψw) as a symptom indictor are supported by the data showing that after inoculation plants with reduced photosynthetic rate also showed reduced ψw, and vice-versa (Figure 2). In the cultivar Judia significant differences were noted after 21 days, and after 42 days ψw was -0,94 and -1,05 MPa for control plants and inoculated plants respectively. With respect to the osmotic potential (Ψπ) (Figure 3) no differences were observed after 21 days, but 42 days after inoculation, values showed a significant decrease, in plants which showed an increase in their photosynthetic rate, due to higher solute content in osmotically-active substances such as the photo-assimilates. In contrast, for the resistant cultivar COLUTAD, the Ψπ measured was -1,4 and -1,8 MPa for control and inoculated plants respectively. In susceptible plants, such as Judia, the Ψπ measured was -1,8 and -1,5 MPa for control and inoculated plant respectively. Overall distribution of clones is shown in Figure 3, where more negative values were observed in Ψπ for FBRO224, FBRO057, FSRD079 and COLUTAD, in contrast to the susceptible Judia plants and the unexpected result for Ca90, in which an increased Ψπ was measured, and S12 which did showed no difference in Ψπ for control and inoculated plants.

107

6,0

Ca90 5,5 Ca90 5,0 ) 4,5 -1 .s -2

4,0 .m FBRO 224 2 S12 Colutad Colutad 3,5 Judia S12 3,0 molCO

Judia A ( FSRD 079 2,5 FBRO 224 FBRO 057 2,0 FBRO 057 FSRD 079 1,5 1,0 -1,5 -1,4 -1,3 -1,2 -1,1 -1,0 -0,9 -0,8 Ψw (MPa)

Figure 2- Water potential (Ψw) of the clones and C. sativa (Judia) after 42 days, determined at the rate of maximum photosynthesis in control (black squares) and inoculated (white squares) plants.

Ψw (MPa) -1,5 -1,4 -1,3 -1,2 -1,1 -1,0 -0,9 -0,8 -1,0

-1,2 Colutad -1,4 Judia C90 -1,6 S12 S12 Judia -1,8

Colutad Ca90 (MPa) -2,0 FBRO 224 FSRD 079 -2,2

-2,4 FSRD 079 FBRO 057 FBRO 057 -2,6 FBRO 224 -2,8 Figure 3- Osmotic potential (Ψπ) in the clones and C.sativa (Judia) after 42 days, in relation to the water potential (Ψw), in control (black squares) and inoculated (white squares) plants.

Concerning maximal efficiency of PSII photochemistry (Fv/Fm) the results presented in Figure 2 also suggest that the inoculation might induce a differential behaviour i.e. increases in clones FBRO224 and FBRO057. In contrast in plants of Ca90, S12 and Judia a decrease was observed, and in plants of FBRO079 and COLUTAD there was no significant difference. Also at the level of the composition in photosynthetic pigments the lack of resistance capacity promoted a more accelerated degradation of the chlorophyll pigments than of the carotenoids (demonstrated by the decrease in the ratio Chl/Car), but concerning Chla/b ration there was an observed increase, suggesting a larger rate of degradation of Chlb relative to Chla; as previously reported by Gomes-Laranjo et al (2004). It is known that Chlb is almost exclusively organized in PSII which is also the photosystem with larger antenna and where the 108 photolysis of water occurs. The subsequent interruption in photosynthetic electron transfer chain, as the data suggests for susceptible plants, might require an increase in chlorophyll fluorescence in order to dissipate the absorbed radiation in an attempt to limit chlorophyll photo- oxidation, mainly of Chlb, a factor that may contribute to the visible symptom of leaf canopies turning light-green in infected trees.

0,8

0,7

0,6

0,5

Fv/Fm 0,4

0,3

0,2 FBRO 224 FBRO 057 FSRD 079 Colutad Ca90 S12 Judia Plants

Figure 4- Analysis of the PSII photochemistry efficiency (Fv/Fm) 22 days after the inoculation in plants control (black bars) and inoculated plants (white bars) (n=4).

In addition to the preliminary results, further observation of the plants nine months later generated important information. As was expected almost (75%) of the Judia plants were dead, but unexpectedly, also plants from 50% of S12 and 25% of Ca90 were dead. These results should be considered as initial studies and further, and more detailed studies, need to be performed to further understand the relationships between Phytophthora cinnamomi infection and changes in photosynthetic rate, water relations, and localised biochemical and physiological reactions of chestnut to this infection.

Acknowledgments The accomplishment of this work was possible thanks to the financial support of the Project INTERREG IIIA - Castaña and to the collaboration of the National Center of Forest Seeds in Amarante for the plants of the hybrid clones for the accomplishment of the rehearsals as well as to the Viveiros RibaDouro that kindly gave up the plants Colutad and Ca 90 and S12.

REFERENCES

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110

S5.02. DETECTION OF THE VEGETATIVE COMPATIBILITY GROUPS OF CRYPHONECTRIA PARASITICA IN CASTILLA Y LEÓN REGION

Zamora, P.1, Martín, A.B.2; Arrate, J.3; Rigling, D.4 Diez, J.J.5

1 Centro de Sanidad Forestal de Calabazanos. Consejería de Medio Ambiente.JCyL. Polígono de Villamuriel.34190 Villamuriel de Cerrato. Palencia. España. [email protected] 2 Centro de Sanidad Forestal de Calabazanos, Junta de Castilla y León. Polígono Industrial de Villamuriel del Cerrato, 34190 Palencia. España. [email protected] 3 Departamento de Producción Vegetal y Recursos Forestales. ETSIIAA Palencia. U. De Valladolid. Avda. Madrid,57.34004 Palencia. España. [email protected] 4 Swiss Federal Research Institute WSL. Ecological Genetics & Evolution. CH-8903 Birmensdorf, Switzerland Phone: ++41-44-739-2415 Fax: ++41-44-739-2215. [email protected] 5 Departamento de Producción Vegetal y Recursos Forestales. ETSIIAA Palencia. U. De Valladolid. Avda. Madrid,57.34004 Palencia. España. [email protected]

ABSTRACT Cryphonectria parasitica, the causal agent of chestnut blight, was first observed in Spain in Vizcaya in 1947 (Elorrieta, 1949). In the Autonomy of Castilla y León it was detected in 1978 in Bembibre (León) (De-Ana-Magán, 1984) causing damages on chestnut groves. Actually the chestnut blight can be found in many chestnut stands in León and Zamora, and in some stands in Salamanca and Ávila where Cryphonectria parasitica has been recently found. To determine the number of vegetative compatibility groups in Castilla y León and the distribution of these groups across the region, a total of 516 isolates of C. parasitica were studied. Six vegetative compatibility (vc) types were identified among the isolates. Three vc types were compatible with vc types from the European collection (EU1, EU12, EU11) whereas three were new (CL4, CL5 and CL6). The most widespread isolates were EU11 (50,6%) and EU1 (39,9%). The number and diversity of vc types in each population was low.

Key words: Cryphonectria parasitica, canker, chestnut, vc type.

1. INTRODUCTION

Chestnut blight was first observed in the 1904 in New York City on American chestnut (Castanea dentata Borkh.) affecting waste areas of this country thereafter (Milgroom and Cortesi, 2004). In Europe, this pathogen was first observed in Italy in 1938 on European chestnut trees (Castanea sativa Mill.). Since then, Cryphonectria parasitica has spread through most of the chestnut stand areas in Europe (Robin and Heiniger, 2001). Although the susceptibility of Castanea sativa and Castanea dentata is similar, the chestnut blight affected with more intensity the US chestnut than the European one. This was probably due to the existence of a viral double-stranded (ds) RNA that converted the European virulent Cryphonectria strains to hypovirulence by the transfer of dsRNA via hyphal anastomosis (Heiniger and Rigling, 1994). This phenomenon has been used for biocontrol in various European countries with positive effects (e.g. Italy, France, and Switzerland) (Heiniger and Rigling, 1994; Bissegger et al., 1997). However, the dissemination of the hypovirulence is

111 limited in two ways. First, the hypovirus can be transmitted in variable frequencies into asexually produced conidia but not into sexual ascospores (Anagnostakis, 1988; Homs et al., 2001; Prospero et al., 2006). One other reason is that the rate of transmission of the hypovirus is negatively correlated with the number of vegetative incompatibility (vic) genes that differ between the isolates that anastomose (Liu and Milgroom, 1996; Robin et al., 2000). After the fist report of C. parasitica in Spain (Elorrieta, 1949) this pathogen has spread through the north of the Iberic Peninsula. In Castilla y León, the first detection of chestnut blight was in 1978 in Bembibre (León) (De-Ana-Magán, 1984) and currently the chestnut blight can be found in many chestnut stands in León and Zamora, and in some stands in Salamanca and Ávila where Cryphonectria parasitica has been recently found. The aim of the present work was to determine the number of vegetative compatibility groups in Castilla y León and their distribution across the region.

2. MATERIAL AND METHODS

Sampling and isolation The provinces of León, Zamora, Salamanca and Ávila were surveyed for chestnut blight and C. parasitica was isolated from 21 locations. The isolation was made from bark samples taken from the cankers with a knife (one isolate per canker and tree). Small pieces from the bark samples were cut out (approx. 4-4 mm) after superficial disinfection with Sodium hypochlorite (0.5%) for 30 s and with sterile water for one min, and placed on PDA (potato dextrose agar, Difco, 39g/l). The resulting plates were incubated for 7 days at 25ºC in dark. After that, the C. parasitica cultures obtained were transferred to new PDA plates using one isolate per canker for further analysis.

Vegetative compatibility test The method used to determine the vc type of the isolates was according to the barrage/merging response (Anagnostakis, 1986) and the cultivation medium was PDAg (Powell, 1995): 24 g Difco potato dextrose broth, 2 g yeast extract, 7 g malt extract, 0.8g tannic acid, 2mg biotin, 2mg thiamine, 100mg methionine, and 20 g agar l-1ading bromocresol green (50 mg l-1) to enhance the visualization of incompatible reactions (Cortesi et al., 1998). The first confrontations were made in all combinations with the isolates in each province to get a first collection of vc type testers in the four provinces. After that, the resulting collections from the four provinces were tested in all combinations with each other to identify the similarities and differences in the four provinces. The resulting vc types from Castilla y León were then paired with the European vc type testers EU1- EU74. (Cortesi and Milgroom, 1998; Robin et al. 2000)

112

3. RESULTS AND DISCUSION

A total of 516 isolates of C. parasitica were analysed from Castilla y León identifying 6 vc types. Three vc types were compatible with vc types from the European collection CL1=EU1, CL2=EU12, CL3=EU11) whereas three vc types were new (CL4, CL5 and CL6) (Table 1). The most widespread isolates were EU11 (50,6% of all isolates) and EU1 (39,9%). EU11 was distributed in all four provinces but EU1 was absent in Ávila. The other four vc types were isolated with low frequency, and with the exception of CL4 who was isolated from samples in León and Zamora, the other three vc types were found exclusive in one province (CL2=EU12 in Zamora, CL5 in Avila and CL6 in Salamanca) (Table 1).

Table 1. Richness and diversity of vc types of Cryphonectria parasitica in Castilla y León. VC TYPES LOCATION EU1 EU12 EU11 CL4 CL5 CL6 1N 2S 3H'

LEÓN Corullón 31 5 36 2 0,403 Carucedo 16 40 56 2 0,598 Borrenes 25 40 65 2 0,667 Vega de Espinareda 6 1 7 2 0,41 Puente de Domingo Flórez 23 25 48 2 0,693 Priaranza 24 50 74 2 0,63

ZAMORA Hermisende 23 23 1 0 Trabazos 31 2 15 48 3 0,758 Puebla de Sanabria 4 8 12 2 0,636 Arrabalde 27 27 1 0 Ayoó de Vidriales 1 1 1 0 Fuente Encalada 4 4 1 0 Ferreras de Abajo 8 8 1 0 Ferreras de Arriba 7 7 1 0 San Vitero 1 9 10 2 0,315 Rábano de Aliste 9 1 1 11 3 0,6

SALAMANCA Linares de Riofrío 23 23 1 0 Lagunilla 1 12 13 2 0,271 Montemayor del Río 1 3 4 2 0,563

ÁVILA El Arenal 28 28 1 0 El Hornillo 11 11 1 0 1N = Number of isolates; 2S= Richness (number of vc types observed); 3H’=Shannon & Wiener Index of Diversity calculated with the expresion: H’=–Σpi Ln pi. Where pi is the frequency of the ith vc type in each population.

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The number and diversity of vc types in each population was low as revealed by the Shannon-Wiener index (Table1). The total number of vc types in Castilla y León was lower than in other Spanish regions like Cataluña with 10 vc types (Homs et al., 2001) or Galicia with 8 vc types (Aguín and Romero, 2004).

Acknowledments This research was supported by grants provided by the Regional Government of Castilla y León. We thank Dr. P. Cortesi and Dr. M. Milgroom for providing the EU vc type testers EU1 to EU64 and Dr. C. Robin for EU65 to EU74.

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S5.03. IDENTIFICACIÓN DE PHYTOPHTHORA PSEUDOSYRINGAE EN PLANTAS DE CASTAÑO

1 Pintos, C., 1Aguín, O.,1,2Mansilla, J.P., 1Montenegro, D., 1Rial, C.

1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la robleda s/n, 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

RESUMEN

En el presente trabajo se identifica morfológica, fisiológica y molecularmente, por primera vez sobre castaño, Phytophthora pseudosyringae T. Jung & Delatour.

Palabras-clave: Phytophthora nemorosa, P. kernoviae, ITS-RFLP, ADN mitocondrial

1. INTRODUCCIÓN

En noviembre de 2006 se reciben en el laboratorio de la Estación Fitopatolóxica do Areeiro muestras de plantones de castaño, a raíz desnuda, procedentes de un vivero. Las plantas presentaban, a lo largo del tallo, zonas necróticas de color negro violáceo, ligeramente deprimidas que, en algunos casos, confluían dando lugar a una necrosis más extensa. Levantando la corteza en estas zonas se apreciaba el tejido afectado. Algunas yemas estaban secas. Las raíces presentaban buen aspecto aunque se observaban pequeñas necrosis en alguna de ellas.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

Aislamiento y caracterización morfológica

Fragmentos de la zonas necrosadas observadas en la base del tallo y porciones de raíces fueron sembrados en medio CMA y V8 agar suplementado con: pimaricina 5 mg/l, rifampicina 25 mg/l, hymexazol 5mg/l y benomilo10 mg/l. Las placas se incubaron en estufa en oscuridad a 22 ºC durante cinco días, transcurridos los cuales se observaba un crecimiento micelial típico de Phytophthora sp. El micelio era nuevamente repicado a medio PDA y V8 agar (16 g de agar,

3 g CaCO3, 200 ml de zumo de vegetales y 800 ml de agua destilada) para estudiar las características culturales del mismo.

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Las temperaturas cardinales mínimas, óptimas y máximas de crecimiento, así como, el crecimiento radial diario al óptimo de temperatura fueron establecidos incubando los aislados durante 24 horas a 24 ºC y trasfiriéndolos, transcurrido ese tiempo, a 2, 5,10, 15, 18, 20, 22, 25, y 28 ºC determinándose el crecimiento radial en 24 horas a cada una de las temperaturas. La caracterización morfológica del aislado se basó en tres premisas: tipo de micelio, forma, tamaño y desarrollo de los esporangios y producción y tipo de órganos sexuales. Las características miceliales y la presencia y tipo de hiphal swelling eran estudiadas en CMA, V8 y PDA crecido durante siete días en oscuridad a 20 ºC. El tamaño de los esporangios y su ratio fue estudiado sumergiendo discos cortados de micelio, procedentes del borde de la colonia, en extractos filtrados de suelo no estéril e incubándolos a 18 ºC bajo luz día. Transcurridas 48 horas se realizan las medidas de 50 esporangios maduros y se estudian sus características. Cincuenta oogonios, anteridios y oosporas se observaban y medían partiendo de cultivos en V8 crecidos a 20 ºC en oscuridad durante 21 días.

Caracterización molecular

Los análisis moleculares se realizaron a partir de micelio aislado en el medio de cultivo V8 sobre celofán. Para la extracción del ADN genómico se utilizó el EZNA Fungal DNA Miniprep kit (Omega Biotek), siguiendo las instrucciones del fabricante sin añadir RNasa ni mercaptoetanol. En un tubo Eppendorf estéril, se pesaron entre 10-40 mg de la muestra fúngica correspondiente y se centrifugaron sucesivamente con los diferentes tampones del kit. El ADN se diluyó en 100 μL de agua ultrapura estéril. El ADN fúngico se conservó a –20 ºC hasta su uso. La amplificación del ADN extraído se llevó a cabo mediante dos procedimientos: - Amplificación de la región ITS del ADN ribosomal según el protocolo descrito por Cooke et al. (2000) con algunas modificaciones. Con el ADN extraído se hizo una Nested-PCR; una PCR con la pareja de primers ITS4/DC6 y otra con los primers universales ITS4/ITS6. Los primers DC6 e ITS4, amplifican las regiones ITS1, ITS2 y el gen 5,8S y son específicos para los órdenes Peronosporales y Pythiales, al que pertenece el género Phytophthora (Bonants et al., 1997). Para la reacción de amplificación se utilizaron las PuReTaq Ready-To-Go™ PCR Beads. La reacción con los primers DC6/ITS4 se realizó con 1 μL de DNA, 0,3 μL de primer ITS4 (10 μM), y 0,3 μL de primer DC6 (10 μM) en un volumen de 25 μL. En el caso de la PCR con los primers ITS4/ITS6 a cada tubo se añadió 1 μL de DNA, 0,3 μL de primer ITS4 (10 μM), 0,3 μL de primer ITS6 (10 μM) y agua hasta completar un volumen de 25 μL. La reacción de amplificación se llevó a cabo siguiendo un programa de 94 ºC 3 minutos, 30 ciclos de 94 ºC 30 segundos, 55 ºC 30 segundos, 72 ºC 1 minuto, seguidos de una extensión final a 72 ºC durante

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10 minutos. En cada experimento de amplificación se incluyó un control negativo (ausencia de ADN) y un control positivo que consistió en un aislado de Phytophthora sp. Una alícuota del producto de PCR se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, 0,5 X TBE, 120 V durante aproximadamente 1 hora. El ADN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. El tamaño del producto de PCR obtenido se estimó comparándolo con un marcador de peso molecular de 100 pares de bases (pb). Para el análisis RFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción), 7 μL del producto de PCR se digirieron con 0,7 μL (10 U/μL) de las endonucleasas de restricción AluI, MspI y TaqI durante al menos una hora a la temperatura indicada por el fabricante. El producto de la digestión se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 3%, 0,5 X TBE, 100 V. El ADN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. El tamaño de los fragmentos obtenidos se estimó comparándolos con un marcador de peso molecular de 100 pb y se analizaron empleando el programa 1D-manager (TDI, Madrid). Los patrones de restricción obtenidos se compararon con los propuestos por Cooke y Smith (2000) mediante aplicación telemática (www.phytid.org-CAB Bioscience). La región ITS de Phytophthora se secuenció utilizando los primers ITS4 e ITS6. El producto de PCR de 900 pb obtenido con estos primers, según se describió en el apartado anterior, se purificó utilizando las columnas High Pure PCR Product Purification. Una alícuota del producto de PCR purificado se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, 0,5 X TBE, 120 V durante aproximadamente 1 hora. El ADN se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio. La concentración de la muestra se estimó visualmente comparándola con un marcador de peso molecular de 100 pb. La reacción de secuenciación se llevó a cabo utilizando el Big Dye terminator V3.1 Cycle sequencing (Applied Biosystems) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Una vez finalizada la reacción las muestras se precipitaron y se desnaturalizaron según las instrucciones del Kit y se corrieron en un secuenciador ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Las secuencias obtenidas se analizaron con el programa Sequencing Analysis 5.1 (AP Biotech) y se compararon con las disponibles en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) utilizando la aplicación Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., 1997). - Amplificación de regiones mitocondriales derivadas del gen coxII y coxI mediante Nested- PCR utilizando las parejas de primers FMPh-8b/FMPh-10b y FMPps-1/FMPps-2 según el protocolo descrito por Martin et al. (2004).

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Pruebas de patogenicidad

Para la inoculación se utilizan hojas jóvenes de castaño. Las hojas, unas con la punta cortada y otras enteras, eran sumergidas es una suspensión de zoosporas durante diez segundos e incubadas, durante cinco días, en cámara húmeda a 18 ºC, transcurrido ese periodo se determinaba la presencia y extensión de las manchas obtenidas y se procedía al reaislamiento del patógeno en los medios adecuados. En el momento actual se están realizando inoculaciones de brotes y del sistema radicular.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Aislamiento y caracterización morfológica de los aislados

De los fragmentos sembrados, procedentes del tallo, se obtiene una colonia cuyo crecimiento es de tipo estelado en V8 agar, algodonoso sin modelo definido de crecimiento en PDA y sumergido estelado-rosáceo en CMA. Las hifas primarias sin ramificar, en V8 agar, presentan, a los diez días, un diámetro de entre 4 y 8.5 µm. También se aprecian hifas irregulares y coraloides. No se observan clamidosporas. Las hyphal swellings son muy características, desarrollándose esféricas en cadena y con abundantes hifas irradiantes digitiformes, siendo mucho más abundantes en agua o en medio CMA. El óptimo de crecimiento se produce a 20 ºC con un crecimiento radial diario medio, en V8 agar, de 4.4 mm/día y muy lento en PDA. La temperatura mínima de crecimiento se encuentra en torno a 4 ºC y la máxima a 25 ºC no apreciándose crecimiento a 28 ºC. Esporangios: Los esporangios son semipapilados, algunos bipapilados, limoniformes, elipsoides u ovoides, algunos con formas distorsionadas, nacen terminales en esporangioforos sin ramificar o más comúnmente en simpodios más o menos laxos. Se aprecian fundamentalmente en agua aunque se observaron algunos en medio sólido. Su tamaño oscila entre 37-63 X 25-38 µm con una ratio media longitud/ anchura de 1,55 µm. Las zoosporas se descargan a través de un poro cuyo ancho medio es de 7,5 µm. Algunos esporangios germinan directamente, sobre todo en cultivos viejos. Aparecen esporangios caducos en una pequeña proporción con pedicelos de longitud variable. Oogonios: Se observan rápidamente en cultivo son esféricos terminales con un diámetro medio de 29,5µm. Las oosporas son pleróticas y se vuelven de color amarillento con el paso del tiempo. Se aprecian oosporas abortadas. Anteridios: los anteridios son paraginos aunque se observa alguno anfigino. De las raíces sembradas no se obtuvo este crecimiento

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Caracterización molecular

- Amplificación de la región ITS del ADN ribosomal

Los primers ITS4 y DC6 amplificaron una única banda de 1300 pb que concuerda con el tamaño esperado para Phytophthora (Cooke et al., 2000). Con los primers universales ITS4 e ITS6 se obtuvo un fragmento con un tamaño aproximado de 900 pb que está dentro del rango de tamaño esperado para la región ITS del género Phytophthora (Cooke et al., 2000). En ningún caso se observó amplificación en el control negativo. La digestión del fragmento de ADN de 900 pb, resultante de la amplificación de la región ITS con las endonucleasas AluI, MspI y TaqI presentó tres patrones de restricción diferentes. Al comparar el tamaño de los fragmentos con la aplicación telemática ("species identification"- www.phytid.org-CAB Bioscience) no se obtuvo homología significativa con ninguna de las especies descritas en la aplicación (hay que indicar que los RFLPs de P. pseudosyringae no se encuentran en dicha página). La secuencia obtenida se analizó utilizando la aplicación BLAST del NCBI mostrando una homología del 99-100% con las secuencias disponibles en la base de datos del NCBI para Phytophthora pseudosyringae

- Amplificación de regiones mitocondriales derivadas del gen coxII y coxI

Los primers FMPh-8b y FMPh-10b amplificaron un fragmento de aproximadamente 457 pb y en la segunda reacción de PCR con la pareja FMPps-1 y FMPps-2 se obtuvo una banda de ADN de 160 pb, tamaño esperado para P. pseudosyringae (Martin et al., 2004).

Pruebas de patogenicidad

A los tres días de la inoculación se observan manchas difusas que miden desde 2-3 mm hasta 1 cm y que terminan por confluir. Se aprecia una necrosis del peciolo de la hoja que a los cinco días alcanza una longitud entre 1 y 2 cm y que en algunos casos se transmite por el nervio central hasta la parte superior de la hoja. En otras solo se observan manchas difusas. No se aprecian diferencias en los daños entre las hojas cortadas y las que no lo están solo que en las hojas cortadas se aprecia una entrada por toda la zona de corte. Se siembran en medio V8, a los cinco días de la inoculación, reaislándose el patógeno en todas ellas. Todavía no existen datos de las inoculaciones de brotes y de raíz. La combinación de las características morfológicas, fisiológicas y moleculares, expuestas anteriormente, nos permite concluir que el aislado procedente de las necrosis presentes a lo largo del tallo del castaño se corresponde con Phytophthora pseudosyringae (Jung et al.,

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2003). P. pseudosyringae ha sido recientemente aislada en especies forestales junto con P. ramorum (Werres et al., 2001), P.kernoviae (Brasier et al., 2005) y P.nemorosa (Hansen et al., 2003). En Europa, P. pseudosyringae, fue primeramente descrita en suelos forestales donde crecían diferentes especies de Quercus, así mismo, también se aisló en las raíces necróticas y en la base del tallo de Fagus silvatica y Alnus glutinosa identificándose, hasta la fecha, en Italia, Francia y Alemania. En USA se aisló en Umbellularia californica y Quercus agrifolia (EPPO Report 2005/162). Desde nuestro conocimiento se trataría de la primera identificación de esta especie de Phytophthora causando los síntomas descritos en castaño.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Sessão 6 Gestão do Souto / Gestión del Castañar

S6.01. MACROFUNGOS EM ECOSSISTEMAS DE CASTANEA SATIVA MILL. DO NORDESTE TRANSMONTANO

Dias R3, Matos M1, Sousa MJ1, Baptista P.1,2; Rodrigues PC1,2; Martins A.1

1 - Escola Superior Agrária de Bragança, Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal – [email protected]; 2 – CIMO - Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal. 3 – PNM – Parque Natural de Montesinho

RESUMO Em Portugal, a biodiversidade de macrofungos nos principais habitats é pouco conhecida, pelo que pretendemos contribuir para o conhecimento da biodiversidade de macrofungos associados aos ecossistemas de castanheiro (Castanea sativa) no nordeste transmontano. O estudo da abundância relativa de espécies micorrízicas vs não micorrízicas e comestíveis vs não comestíveis constituem aspectos relevantes do trabalho em curso. O trabalho de campo teve lugar de Outubro de 2004 a Dezembro de 2006, abrangendo 5 épocas de produção/colheita, Outono de 2004, Primavera e Outono de 2005 e Primavera e Outono de 2006. Foram marcadas 5 parcelas de 100m2 cada em cada um dos habitats, tendo- se colhidos todos os carpóforos das parcelas, semanalmente no Outono e Primavera e mensalmente durante os restantes períodos do ano. Procedeu-se à identificação e quantificação dos carpóforos colhidos. Durante o período em estudo, no ecossistema de C. sativa foram colhidas 53 espécies de macrofungos (20 em 2004, 10 em 2005 e 27 em 2006), pertencentes a 23 géneros (11 em 2004, 8 em 2005 e 18 em 2006). As condições climáticas dos três anos de inventário explicam a reduzida biodiversidade de macrofungos exibida por este habitate nos dois primeiros anos e o aumento verificado no terceiro ano. Discute-se a biodiversidade observada ao longo do desenvolvimento do Projecto..

1. INTRODUÇÃO Os fungos são componentes essenciais dos ecossistemas terrestres representando, sobretudo nos espaços florestais, um inestimável papel de equilíbrio. É nestes espaços que os fungos encontram as condições que melhor garantem as suas necessidades fisiológicas, tendo igualmente um papel essencial no equilíbrio dos espaços florestais, através das diferentes relações tróficas que estabelecem com as outras espécies e que são, essencialmente, simbiótica, saprofítica ou parasítica, desempenhando ainda um papel importante nas cadeias tróficas como alimento de alguns animais.

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Estimativas do número de espécies de fungos existentes na Terra apontam para valores na ordem 1.500.000 (Hawksworth et al., 1995). Os macrofungos, fungos com “grandes” estruturas reprodutoras, os esporocarpos, carpóforos ou cogumelos têm períodos de frutificação muito aleatórios, havendo mesmo espécies que não ocorrem todos os anos. O Outono e a Primavera são as épocas preferenciais de ocorrência de destas frutificações. Se alguns carpóforos persistem alguns anos, a maior parte desaparece em menos de uma semana. As espécies mais pequenas são ainda mais efémeras, como é o caso dos carpóforos dos géneros Coprinus e Mycenas. O aspecto morfológico do cogumelo varia não só com a espécie, mas também com a idade, o que frequentemente complica o processo de identificação se não existirem exemplares em diferentes estágios de desenvolvimento. O principal factor a ter em conta quando se tenta estimar a diversidade macrofúngica é a sua sazonalidade. O aparecimento dos carpóforos depende de factores como a temperatura, precipitação, pH do solo, disponibilidade de nutrientes e padrão de sucessão da vegetação no habitate. A biodiversidade de macrofungos é pouco conhecida na maioria dos países, entre os quais se inclui Portugal. A inventariação das espécies fúngicas é um passo essencial que falta concretizar nos principais habitats do território português. É necessário efectuar inventários, mapeamento e criar listas vermelhas. A avaliação da diversidade de macrofungos exige alguns anos de inventário, uma vez que é necessário observar-se a estabilização da curva de espécies/área. A conservação dos habitats é, segundo Courtecuisse (2001), fundamental como estratégia de conservação dos macrofungos. “Desde há alguns anos que a necessidade de fornecer protecção adicional às espécies fúngicas foi reconhecida dentro do grupo da Convenção de Conservação da Vida Selvagem e Habitats Naturais da Europa (Convenção de Berna). Até ao momento, não existem espécies fúngicas representadas nos Apêndices da Convenção.” Uma das razões reside no facto do “estado de conservação de muitas espécies ser desconhecido (...) ” (in Swedish proposal to include fungi species in Appendix 1 of the Bern Convention, 2002). O Projecto AGRO 689 “Demonstração do papel dos macrofungos na vertente agronómica, económica e ambiental no Nordeste Transmontano. Aplicação à produção de plantas de castanheiro (Castanea sativa), pinheiro (Pinus pinaster) e carvalho (Quercus pyrenaica)” pretende contribuir para o conhecimento da biodiversidade de macrofungos associados a estes três ecossistemas do nordeste transmontano. Neste trabalho pretendemos apresentar alguns resultados relativos ao estudo da abundância relativa de espécies micorrízicas vs não micorrízicas e comestíveis vs não comestíveis em ecossistemas de castanheiro do Nordeste transmontano.

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Pensa-se que o Nordeste Transmontano, pelas suas características edafo-climáticas e pela sua diversidade de flora, possa ser uma das regiões com maiores recursos em cogumelos silvestres, muitos dos quais de grande importância gastronómica. Os trabalhos realizados nesta área, revelaram que esta região apresenta, de facto, elevadas potencialidades micológicas e uma grande biodiversidade (Meireles, 1997; Barrote, 1998, Estevinho, 1998; Baptista et al., 2003). Em plantações de castanheiro foram registadas espécies de elevado valor comercial e em quantidades não desprezáveis (Baptista et al., 2003). O mesmo se verificou em povoamentos de carvalhal. De entre as espécies comestíveis, registadas destacam-se a Amanita caesarea, Amanita rubescens, Hydnum rufescens e Cantharellus cibarius, por serem as espécies de maior valor económico nos mercados internacionais. Por outro lado, e devido essencialmente às condições climáticas existentes nesta região, algumas espécies de macrofungos comestíveis frutificam em épocas do ano em estas mesmas espécies são escassas noutros países da Europa. Este facto associado à existência de consideráveis quantidades de cogumelos comestíveis, incentivaram compradores, sobretudo empresários de Espanha e França, a procurar este recurso natural junto das populações transmontanas, tornando-se uma fonte de rendimento não negligenciável. Assim sendo, a colheita de cogumelos silvestres que era, até há poucos anos, efectuada apenas para auto - consumo, actualmente, devido à crescente procura, tem-se tornado um importante recurso complementar. Este apresenta um valor, frequentemente, não quantificado, quer ao nível económico, quer ao nível do impacto produzido nas culturas uma vez que a maioria dos macrofungos de maior interesse gastronómico são micorrízicos. Importa contribuir para o conhecimento da biodiversidade de macrofungos como forma de contribuir também para a sua conservação.

2. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho de campo teve lugar de Outubro de 2004 a Dezembro de 2006, abrangendo 5 épocas de produção/colheita: Outono de 2004, Primavera e Outono de 2005 e Primavera e Outono de 2006. Foram marcadas 5 parcelas de 100m2 em soutos da área do Parque Natural de Montesinho, tendo-se colhidos todos os carpóforos das parcelas, semanalmente no Outono e Primavera e mensalmente durante os restantes períodos do ano. Procedeu-se à identificação e quantificação dos carpóforos colhidos, de acordo com as características morfológicas e a observação macroscópica e microscópica de estruturas relevantes para a identificação. Após etiquetagem, com o nome da espécie, data e local da colheita, os carpóforos foram fotografados e postos a desidratar numa estufa ventilada a 30ºC durante 72 horas. Os

123 carpóforos desidratados foram guardados em sacos de plástico com a respectiva etiqueta e foram armazenados no Herbário Micológico da Escola Superior Agrária de Bragança.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Durante o período de estudo, no ecossistema de C. sativa foram colhidas 53 espécies de macrofungos (Tab. 1, Fig. 1) (20 em 2004, 10 em 2005 e 27 em 2006), pertencentes a 23 géneros (Fig. 2) (11 em 2004, 8 em 2005 e 18 em 2006). Russula foi o género mais representado (8 espécies), seguido dos géneros Inocybe (7 espécies) e Amanita e Cortinarius (4 espécies) (Fig. 2). Os géneros com maior número de carpóforos colhidos foram Collybia (88 carpóforos), Inocybe (81 carpóforos) e Russula (65 carpóforos) (Fig. 2). O número de espécies inventariadas foi mais baixo em 2004 e 2005, do que em 2006, tendo-se verificado neste período uma baixa pluviosidade nas épocas de produção (Primavera e Outono), que condicionam a produtividade de carpóforos. O ano de 2006 apresentou, sobretudo no período de Outono, um significativo acréscimo de pluviosidade, com concomitante aumento de produtividade de carpóforos.

Tabela 1 – Número de espécies saprófitas, parasitas e micorrízicas, comestíveis, não comestíveis ou de edibilidade desconhecida, inventariadas em habitats de C. sativa de 2004 a 2006. Comestíveis Não comestíveis Desconhecido Total Saprófitas 4 2 4 10 Parasitas 1 0 0 1 Micorrízicos 10 24 8 42

15 26 12 53

A distribuição de espécies por grupos funcionais mostra a dominância de espécies micorrízicas, 75,5%, ou seja 40 das 53 espécies (Tab. 1, Fig. 2). Esta predominância de espécies micorrízicas está de acordo com o facto de se tratarem de ecossistemas altamente humanizados, em que C sativa é a espécie predominante ou mesmo única. Tratando-se de uma espécie micorrízica, o castanheiro apresenta associadas ao seu habitate, espécies fúngicas maioritariamente micorrízicas, presumivelmente associadas às suas raízes. Os baixos teores de matéria orgânica deixados nestes habitats, explica o menor número de espécies não micorrízicas decompositoras.

124

Macrofungos de ecossistemas de Castanea sativa

Desconhecido 40 Não comestíveis 35 Comes tív eis 30 25 20 15 Nº deespécies 10 5 0 Saprófitas Parasitas Micorrízicos

Figura 1 – Distribuição das espécies de macrofungos de castanheiro inventariadas de 2004 a 2006 por grupos funcionais

Das espécies colhidas, 28,3% são comestíveis, 49,1% são não comestíveis e 22,6% são de edibilidade desconhecida (Tab. 1, Figs. 1 e 2). Verificou-se que o número de espécies comestíveis é, no geral, minoritário, mas este número é ainda mais baixo se analisarmos somente o grupo dos fungos micorrízicos (Tab. 1). Aqui, o número de espécies comestíveis inventariadas é de 23,8% vs. 57,1% de espécies não comestíveis (Fig. 2). Posto que se trata do grupo de fungos maioritários, essa circunstância tem uma importância acrescida e corresponde em valores absolutos, à ocorrência de 10 espécies de fungos micorrízicos comestíveis vs. 5 espécies de não micorrízicos comestíveis (4 saprófitas e 1 parasita) (Tab.1). Realçamos ainda o facto de se tratarem de espécies de grande importância económica (Amanita caesarea, Amanita rubescens, Cantharelus cibarius, Hydnum rufescens). O tratamento dos resultados do presente inventário, tendo em conta outros parâmetros de quantificação, está em curso. Pretende-se entender a sazonalidade de ocorrência de espécies e quantificar as produtividades por área de produção entre outros aspectos a esclarecer no final do Projecto. O conjunto de dados dos três anos de inventário realizados no âmbito do presente Projecto, combinados com os resultados tirar algumas conclusões relativamente à validade deste período de dados, para a avaliação da estabilização da curva de espécies/área. O trabalho de inventário prosseguirá nos próximos períodos de produção no sentido de tornar mais válidos e consistentes os dados disponíveis para o ecossistema de C. sativa.

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Géneros micorrízicos e não micorrízicos em ecossistemas de Castanea sativa

Mycena Fungos não micorrízicos Macrolepiota Lycoperdon Comes tív eis Leotia Não comestíveis Fistulina Collybia Desconhecido Clitocybe

Tricholoma Russula sp. Paxillus Lepiota Lactarius Laccaria Inocybe Hydnum Fungos micorrízicos

MicorrízicosHebeloma Não micorrízicos Entoloma Cortinarius Comes tív eis Cantharelus Não comestíveis Boletus Desconhecido Amanita 012345678

Figura 2 – Principais géneros de macrofungos micorrízicos e não micorrízicos de castanheiro inventariados de 2004 a 2006

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S6.02. LIMITAÇÕES DA REGA NA PRODUTIVIDADE FOTOSSINTÉTICA EM SOUTOS DO NORTE DE PORTUGAL

A. Martins1, J. P. Coutinho2, F. Raimundo 1, O. Borges 3 e J. Gomes-Laranjo2 1Dep. Edafologia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Apart. 1013, 5001-801 Vila Real. Portugal; Tel. 259 350209; e-mail: [email protected] 2Centro de Estudos Tecnológicos, do Ambiente e da Vida, UTAD 3DRAPN, Qta do Valongo, 5370 Mirandela, Portugal

RESUMO

Apresentam-se os resultados obtidos de 2003 a 2006 sobre a influência da temperatura ambiente e da água do solo nas relações hídricas solo-árvore e na resposta fisiológica das árvores, com base no potencial hídrico foliar de base e na taxa de fotossíntese. O estudo decorreu num campo experimental com um souto adulto, 42 anos, variedade Longal, tendo-se quantificado aqueles parâmetros em parcelas cobertas com pastagem em regime de sequeiro e em regime de regadio. Os resultados obtidos mostraram nos dois tratamentos, valores elevados de potencial hídrico foliar de base (0,6 MPa) ao longo de toda a época estival em 2003, 2004 e 2006, o que expressa a existência de condições hídricas favoráveis à espécie e suficiente água no solo para a recarga hídrica das árvores, independentemente da rega. No ano de 2005, com elevado défice hídrico estival e condições extremas de secura, aqueles valores decresceram para -0,80 MPa em Agosto e -1,5 MPa em Setembro, evidenciando condições de vegetação muito desfavoráveis. A taxa de fotossíntese mostrou valores máximos -2 -1 entre 8,5 a 9 μmol CO2 m s para temperatura ambiente entre 25 e 30 ºC, os quais -2 -1 decresceram para 6-7 cmol CO2 m s quando a temperatura ultrapassou os 30 ºC, em ambos os tratamentos. Estes resultados expressam que, no caso de árvores adultas a C. sativa não deu resposta à rega, tendo a temperatura da atmosfera restringido fortemente a actividade da espécie e corroboram resultados anteriormente obtidos. Novos estudos estão a ser conduzidos no sentido de confirmar este efeito com árvores jovens e novas modalidades de rega.

Palavras-chave: relações hídricas solo-planta; sistemas agro-florestais

1. INTRODUÇÃO

O castanheiro para produção de fruto, com a designação tradicional de souto, tem no NE de Portugal uma elevada importância económica cultural e paisagística, ocupando actualmente uma área próxima de 25 000 ha, com uma produção da ordem das 30 000 t de fruto, representando 84 % da produção nacional (INE, 2005). Como um dos mais importantes sistemas produtivos das regiões de montanha, tem aumentado o interesse à volta desta cultura, bem evidenciado pela intensificação cultural na procura de acréscimos de produtividade. Mobilizações do solo, fertilizações, podas e, nos últimos anos, utilização de rega, 128 são as práticas culturais que têm sido intensificadas com esse objectivo (Portela et al. 1999, Martins et al. 2005). A disponibilidade de água constitui preocupação dominante dos produtores daquela região, face à sua escassez na estação de crescimento, (INMG, 1991; SNIRH, 2006), o que motivou a utilização da rega, procurando minimizar esse défice e aumentar a produção. Porém, a água é um bem escasso, a sua procura tem aumentado intensamente por um número crescente de actividades, desde a utilização doméstica, a agricultura, o lazer e a indústria. Por outro lado, os impactes da rega na qualidade ambiental são uma preocupação na ordem do dia, o que exige uma utilização cada vez mais racional e eficaz deste recurso (Hill e Tollefson, 1996; Pereira et al. 1996; Fereres and Evans, 2006; Stigter et al 2006). No caso particular da Castanea sativa, resultados anteriores (Gomes-Laranjo et al., 2006a), alertam para a sua sensibilidade à temperatura ambiente, podendo esta comprometer o desenvolvimento da espécie. Assim, procurando esclarecer os dois aspectos enunciados, estabeleceu-se um ensaio em que se observa o efeito da água e da temperatura no comportamento de árvores adultas de C. sativa no tocante às relações hídricas solo-planta e resposta fisiológicas das árvores, sendo reportados os resultados obtidos nos anos de 2003 a 2006.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O estudo foi desenvolvido num campo experimental instalado em 2001 numa propriedade privada em Lamas de Podence, concelho de Macedo de Cavaleiros, (41o 35´N e 6o 57´W, 700 m altitude). O clima é de tipo mediterrânico, com invernos frios e chuvosos e verões quentes e secos e um défice hídrico anual de 233 mm. Os solos são derivados de xistos, classificam-se como Regossolos Dístricos (FAO, 2006), com espessura variável entre 50 e 90 cm, classe de textura geralmente franco arenosa a franca, ácidos (valor médio de pH em H2O 5,1), concentração média de matéria orgânica, 2,6 %, baixa concentração em bases de troca e elevadas concentrações de fósforo e potássio extraíveis (respectivamente 185 e 205 mg kg-1 de P e de K). O ensaio foi instalado num souto, actualmente com 42 anos, variedade Longal, compasso de 10 x 10 m, parcelas com cerca de 600 m2, 9 árvores cada, três repetições por tratamento, considerando-se neste estudo dois tratamentos, ambos com solo coberto por pastagem, um em regime de sequeiro (S) e o outro em regime de regadio (R). A precipitação ocorrida entre Junho e Setembro foi de 133,7, 93,5, 47,3 e 93,5 mm, respectivamente para 2003, 2004, 2005 e 2006 e os volumes de rega aplicados foram nos mesmos anos respectivamente de 217, 78, 190 e 70 mm. Utilizou-se a rega por aspersão, com dois aspersores por árvore e nove árvores regadas no total, tendo as datas e dotações de rega seguido nos três primeiros anos o ritmo adoptado pelos produtores e, no último,

129 calendarizadas de acordo com a perda de água diária por evapotranspiração (Hargreaves, 1975) e tomando como limite o valor mínimo de -0,6 MPa para o potencial hídrico foliar de base, a partir do qual se iniciou a rega. O potencial hídrico foliar de base foi medido por câmara de pressão tipo Scholander, a taxa de fotossíntese estimada com IRGA modelo LCA-2 (analisador de gases por infravermelhos), ambas as determinações em folhas situadas a cerca de 3m de altura, na periferia da copa com exposição sul, sendo efectuadas quatro leituras em cada árvore e doze por tratamento, às 7, 9, 11 e 13 horas nos meses de Agosto e Setembro. A análise estatística dos resultados foi feita por análise de variância ANOVA (Tukey Kramer HSD 0,05).

3. RESULTADOS

O valor do potencial hídrico foliar de base (Ψwpd) é geralmente aceite como um dos melhores indicadores do estado hídrico da planta e da sua relação com o estado da água no solo. Nessa situação, dado não haver transpiração, o Ψwpd pode assumir-se como representando o potencial hídrico do solo na zona radicular (Améglio et al. 1999). Os resultados obtidos, correspondentes aos tratamentos S e R, apresentados na Figura 1, permitem concluir: (i) Nos anos de 2003, 2004 e 2006 e independentemente do tratamento, os valores de Ψwpd situaram-se em geral próximos de -0,60 MPa durante todo o período e mantêm-se próximos do valor do início da época, mostrando a possibilidade de as árvores recuperarem o seu nível hídrico durante a noite e a existência de água disponível no solo para satisfazer as necessidades das plantas nos dois tratamentos; (ii) Em 2005, um ano anormalmente seco, os valores desceram a partir do início de Agosto abaixo de -1,0 MPa, quase sempre com diferenças significativas entre tratamentos, mostrando neste ano um efeito favorável da rega. Contrariamente, no caso da amendoeira (Amygdulus communis L.), resultados obtidos em árvores com 5 anos, no interior de Trás-os-Montes, mostraram uma clara resposta à rega Com efeito, cultivares regadas (3 regas semanais com microaspersão, durante uma hora e cerca de 100 mm total), apresentaram em Agosto valores de Ψwpd entre – 0,64 e -0,89 MPa, enquanto as mesmas variedades não regadas apresentam valores entre -1,87 e -2,81 MPa, que se aproximaram dos obtidos na situação com rega para o meio dia (Gomes-Laranjo et al., 2006b). No tocante à taxa de fotossíntese, os resultados são apresentados na Figura 2 para três dias padrão, no período estival dos anos 2003, 2005 e 2006. Conforme ilustrado, somente em 2003 foram encontradas diferenças significativas entre os dois tratamentos, com valores mais elevados no tratamento com rega.

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Em ambos os tratamentos ocorre um decréscimo acentuado da taxa de fotossíntese após as 9 ou 11:00 AM, com o aumento da temperatura da atmosfera. Os valores mais -2 -1 elevados da taxa de fotossíntese foram de 8,5 a 9 µmol CO2 m s para temperaturas da -2 -1 ordem dos 25 a 30ºC (2003 e 2006), e decrescem para 5-7 µmol CO2 m s quando a temperatura sobe acima de cerca de 30ºC (2003 e 2006). Em 2005, mesmo para temperaturas da ordem dos 25 ºC, os valores foram consideravelmente mais baixos, o que se atribui ao elevado défice hídrico estival deste ano. Os resultados mostram que, independentemente da rega, a fotossíntese decresce abruptamente quando a temperatura do ar ultrapassa valores da ordem dos 30 ºC, o que corrobora as observações feitas anteriormente por Gomes-Laranjo et al. (2006 a), salientando o papel da temperatura na limitação da taxa fotossíntese de C. sativa, mesmo na presença de condições hídricas favoráveis. Porém, para a espécie A. communis, em estudo efectuado nas condições atrás referidas (Gomes-Laranjo et al, 2005), as cultivares regadas apresentaram um máximo de taxa -2 -1 fotossintética entre 10 e 12 µmol CO2 m s , geralmente às 11:00 AM, com temperatura ambiente da ordem dos 32 oC, enquanto as mesmas variedades não regadas apresentarem -2 -1 valores máximos consideravelmente mais baixos (5 a 6 µmol CO2 m s ), geralmente às 9:00 AM e temperatura ambiente menor, manifestando uma resposta favorável à rega para temperaturas da mesma ordem das observadas no ensaio de C. sativa. Esta diferença de comportamento entre as duas espécies no que respeita à sua resposta à rega, poderá atribuir-se a duas razões: (i) às características intrínsecas das duas espécies e à dificuldade de adaptação da C. sativa a condições de secura; (ii) ao facto de se tratar, no caso de C. sativa, de árvores adultas, com sistemas radicais profundos muito responsáveis pela alimentação hídrica das plantas, que trabalhos anteriores confirmaram (Martins et al, 2005), enquanto no caso de A. communis, se trata de árvores jovens, mais dependentes da actividade do sistema radical superficial.. Novos estudos estão a ser efectuados para confirmar estas hipóteses.

datas datas 12-Jun 18-Jul 8-Ago 26-Ago 10-Set 6-Jun 30-Jul 27-Ago 16-Set -0,30 -0,30 -0,50 -0,50 a a a -0,70 a -0,70 a a a a a -0,90 b -0,90 -1,10 -1,10 w (MPa)

Ψ -1,30 -1,30 -1,50 S R 2003 -1,50 2004 -1,70 -1,70

131

datas datas 3-Ago 5-Ago 20-Set 28-Set 13 Jul 03 Ago 14 Ago 30 Ago 21 Set -0,30 -0,30 -0,50 a -0,50 a -0,70 a a -0,70 a a -0,90 -0,90 b a -1,10 -1,10 w (MPa) a Ψ -1,30 -1,30 a b -1,50 -1,50 -1,70 -1,70 2005 2006

Figura 1 – Potencial hídrico foliar de base (Ψwpd) no período estival e nos anos 2003 a 2006 para os dois tratamentos (n=12).

10 S R T 40

35 Figura 2 – Valores diários 9 médios da taxa 30 fotossintética (A) às 9, 11 e Temperatura (ºC) ) -1 25 .s 13 horas, nos tratamentos

-2 8 .m 2 pastagem com rega (R) e 20 pastagem em regime de molCO

μ 7

A( 15 sequeiro (S) e temperatura da atmosfera (T) em 2003, 10 6 2005 e 2006

5 correspondentes a três dias padrão do período estival 5 0 (n=36). 9h 11h 13h 9h 11h 13h 9h 11h 13h 2003 2005 2006

4. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos sugerem que a rega em árvores adultas de C. sativa não consegue melhorar a eficiência da espécie assumindo-se a temperatura como factor mais limitante. A partir de valores da ordem dos 30 ºC decresceu fortemente a taxa de fotossíntese, inclusive nas parcelas regadas, o que, por um lado, desmotiva a utilização da rega em soutos adultos como solução para aumento da produção de fruto e, por outro, poderá comprometer a sua continuidade em áreas de menor altitude, mais quentes, num cenário de aumento generalizado da temperatura da atmosfera. Novos estudos em soutos jovens e com diferentes modalidades de rega estão a ser conduzidos para confirmação do efeito observado.

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S6.03. CAPACIDAD DE CAPTURA DE CARBONO DE SUELOS DE CASTAÑARES DEL CENTRO-OESTE ESPAÑOL

1Juan F. GALLARDO, 2M. Isabel GONZALEZ y 3Amaya ALVAREZ

1 C.S.I.C., Aptado. 257, Salamanca 37071 (España). [email protected]. 2 Area de Edafología, Universidad de Salamanca Salamanca 37080 (España). [email protected]. 3 Universidad de León, León 24080 (España).

RESUMEN El objetivo del trabajo fue conocer la variabilidad y potencialidad de captura de C por suelos españoles de castañares, manejados como Monte bajos o como productores de fruto. Los resultados indican que el manejo incide fuertemente sobre los contenidos de C edáfico (más que la ubicación), pudiéndose capturar por el suelo hasta 430 Mg C ha-1.

Palabras clave: Manejos de castañares, Extremadura, Castilla y León

1. INTRODUCCION

Existe consenso mundial acerca de que las tasas actuales de consumo de combustibles fósiles, que reflejan en cierta manera el nivel de bienestar y desarrollo de las sociedades, conducirán a consecuencias inaceptables para el ser humano (Jandl, R. 2001). De acuerdo con el protocolo de Kioto (Hagedorn et al., 2001) es prioritario e imprescindible reducir las emisiones de CO2 a la atmósfera para evitar un cambio climático que amenaza la conservación de los ecosistemas actuales y la biodiversidad biológica, con consecuencias dramáticas para la vida en nuestro Planeta. En este contexto, los ecosistemas forestales juegan un papel fundamental en la consecución de tales objetivos, favoreciendo la reducción de emisiones de gases invernadero, bien a través de la biomasa vegetal, o, también, por la captura de C realizada por la materia orgánica humificada del suelo (MOS). Hay que tener en cuenta que la MOS almacena casi tres veces el equivalente al C contenido en la biomasa vegetal y, además, de forma más estable, controlando así el contenido de CO2 de la atmósfera (Gallardo & González, 2004). Los bosques son los mayores ecosistemas terrestres con capacidad para secuestrar C, pero hay diversos factores que influyen sobre el mismo. Por ejemplo, no todas las especies forestales tienen la misma capacidad de captura, influyendo notoriamente el manejo de los mismos (v. g.: a través de la densidad del arbolado; Jandl, 2001). Es interesante conocer la potencialidad de secuestro de C de los bosques caducifolios para planificar su manejo y defender sus conservación. Gallardo y González (2004) midieron la capacidad de captura de un Monte bajo de castaños (Castanea sativa) característico del Oeste español, comprobando (mediante el cálculo del balance total de C en el ecosistema); que a 134 pesar del manejo como monte se apreció una acumulación edáfica neta de 4,72 Mg C ha-1. Siendo más estable el C edáfico que el de biomasa aérea (sujeto a entresacas y talas) se consideró de interés conocer la variabilidad de los castañares del Centro-Oeste español, completando lo ya reseñado por otros estudios (Rubio y Gandullo 1994; Gallardo, 2001). El objetivo, por tanto, es conocer la variabilidad de la potencialidad de captura de C por suelos de castañares españoles, principalmente dedicados o a Monte bajos, o a castañares de fruto (sotos, actualmente en recesión), estimando si las variaciones entre Comarcas son significativas (indicando un valor de máxima capacidad de captura.) o, si no lo fueran, proponer un valor medio de capacidad de captura de C.

2. MATERIALES Y METODOS

Los castañares (Castanea sativa) seleccionados para el estudio se localizan principalmente en Castilla y León y Extremadura (Centro-Oeste de España). Según el II Inventario Forestal Nacional (ICONA 1994) los castañares de Castilla León ocupan 17.126 ha. En León se concentran en El Bierzo y estribaciones meridionales de la Sierra de los Ancares, siendo el fruto su principal aprovechamiento (sotos). Las masas de la provincia de Zamora son pequeñas, fundamentalmente con manejos de sotos, situándose al E y SE del Lago de Sanabria (donde se sitúa el soto de San Cebrián de Castro aquí considerado), más algunas manchas discontinuas (sotos) en las Comarcas de Alba y Aliste. La parte más meridional que corresponde con los límites entre las provincias de Salamanca y Cáceres. Se han considerado dos áreas diferentes: Una occidental con la Sierra de Gata (montes bajos de Puerto de Sta. Clara y San Martín de Trebejo) y Las Hurdes (sotos de Cadalso y Pinofranqueado)); y otra oriental con las Sierras de Béjar (sotos de Candelario) y Hervás (cuenca del río Ambroz, manejados fundamentalmente como montes bajos). Además, se ha considerado un Monte bajo de la Sierra de Guadalupe (Al Oeste de los Montes de Toledo). Las características ecológicas de las zonas han sido precedentemente publicadas (Rubio et al., 1997; Gallardo et al., 2000; Rubio et al., 2002), por lo que sólo se ofrece un resumen de las mismas en la Tabla 1.

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Tabla 1. Características generales de los sitios seleccionados.

Sitio Altitud (m snm) Clima Geolog’a Suelos

Cuarcitas, pizarras y 756 Mediterr‡neo subhmedo Cambisol —rtico El Bierzo areniscas

Esquistos y granitos Candelario 1050 Supra-mediterr‡neo Cambisoles arenizados

Granitos, pizarras y Umbrisol cambico y Herv‡s 688 Mediterr‡neo templado grauvacas Acrisol —rtico

Villamiel 950 Mediterr‡neo subhmedo Granitos Leptosol umbrico

S. Mart’n Trebejo 850 Mediterr‡neo templado Granito calcoalcalino Umbrisol cambico

Litológicamente predominan los sustratos ácidos (materiales metamórficos e ígneos; Rubio et al., 2002). La altitud de los sitios oscilan entre 600 y 1100 m s.n.m., en laderas con pendientes acusadas (entre 10 a 40 %), en orografías onduladas y orientación de umbría. Presentan bastante variabilidad pluviométrica (Rubio et al., 2002), mostrándose los mínimos de lluvias anuales en la provincia de Zamora (693 mm a-1) y los máximos en la Sierra de Gata (1200 mm a-1). Los suelos presentan un evidente horizonte húmico (Ah) en los montes bajos; en los sotos es muy variable, dependiendo del cultivo o la carga ganadera (epipedones Ap). Son suelos ácidos (pH entre 4,5 y 5,6). Las unidades cartográficas se corresponden con Leptosoles úmbricos o Umbrisoles cámbicos (o sus asociaciones), dependiendo de la profundidad del horizonte Ah. Para determinar las posibles relaciones existentes entre los distintos perfiles considerados se realizaron comparaciones de medias (t de Student) o análisis de la varianza (ANOVA). Igualmente se ensayó un análisis de componentes principales, utilizando el programa SPSS 14.0.

3. RESULTADOS Y DISCUSION

Los datos se exponen en las Tablas 2 y 3. La Tabla 2 exponen los suelos extremeños en los que se conoce la densidad aparente (Da) para calcular el contenido de COS en Mg ha-1 y de esa manera realizar mejor las comparaciones. En la Tabla 3 se expone los datos de perfiles edáficos de distintas provincias del Centro-Oeste español (sin Da) para estimar las diferencias que se establecen por los manejos (montes bajos o sotos). En la Tabla 2 se observa que la variación en Extremadura oscila desde una acumulación de COS de 40 Mg C ha-1 en un soto de Hervás, hasta más de 430 Mg C ha-1 en un monte bajo de Pinofranqueado. En general, los valores más frecuentes ocurren entre 150 y 300 Mg C ha-1.

136

Obviamente, esta variación depende fundamentalmente de la pluviometría (Gallardo et al., 2004), pero también del manejo (esto es, del soto o del monte bajo). Para aplicar análisis estadísticos se agruparon los perfiles edáficos seleccionados en 4 Comarcas con similares características ecológicas: 1) Sierras de Hervás y Guadalupe (montes bajos y sotos); b) Sierra de Béjar (montes bajos y sotos); c) El Bierzo y San Cipriano (en general, sotos); y d) Las Hurdes (sotos de Pinofranqueado y Cadalso) y Sierra de Gata (montes bajos de San Martín de Trebejo y Puerto de Santa Clara). El ANOVA aplicado al contenido de COS en los grupos considerados encontró diferencias significativas entre grupos (F = 0,03). La prueba de Tukey indica que existen diferencias significativas entre el COS de los castañares de El Bierzo y Sierra de Gata (probablemente por el manejo). Sin embargo, cuando se aplica la prueba de Games Howell (más potente) no se encuentran diferencias significativas. El análisis factorial de componentes principales mostró que el Eje I se alínea con el manejo (siendo inverso al contenido de C, N y razón C/N) y el Eje II indica altitud o comarcas. Se observa, en general, una mayor variación para el N que para el C. En la Tabla 3 se observa que la razón C/N edáfica refleja si el suelo es soto (y ha sido roturado y/o cultivado) o es monte bajo, de acuerdo a si el valor no sobrepasa o supera el valor de 15, respectivamente. Tampoco la prueba de la t para el contenido de COS frente a usos (F = 0,17 y valor crítico de 0,68; contraste de Levene) indica diferencias significativas entre vomarcas.

4. CONCLUSIONES

Se puede concluir que, a pesar de que los contenidos de COS son inferiores en los manejos de fruto (sotos), las diferencias encontradas entre comarcas no son significativas, dado que son absorbidas por las diferentes pluviometrías (altitud) y manejos. La relación C/N es un buen índice para discriminar si los manejos se orientaron a sotos o a montes bajos.

Agradecimentos

A D. Jesús Hernández por su ayuda en la obtención de datos y a la U. E. por su apoyo.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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m sn m m g c m-3 mg g-1 Mg ha-1 mg g-1 Mg ha-1 ︵ ︶ ︵ ︶ ︵ ︶ ︵ ︶ ︵ ︶ ︵ ︶ ︵ ︶ Hervás I 690 Ah1 0, 15 0, 76 52, 8 60, 2 3, 16 3, 6 16, 6 Perfil 28 Ah2 0, 45 0, 98 20, 8 91, 7 1, 38 6, 1 15, 0 B 0, 40 Nd 2, 3 Nd 0, 03 Nd 7, 9 Pª. Cácer es BC1 0, 30 Nd 1, 5 Nd 0, 02 Nd 6, 8 Tot al 152 9, 7 15, 7 Hervás II 690 Ah 0, 10 0, 76 19, 8 15, 1 1, 32 1, 0 15, 0 Perfil 29 Bw 0, 15 0, 98 5, 5 8, 1 0, 50 0, 7 11, 0 Pª Cácer es C1 0, 45 1, 30 2, 9 17, 0 0, 29 1, 7 10, 0 Tot al 40, 1 3, 4 11, 8 Pi nofranqueado 760 Ah1 0, 15 0, 92 60, 5 83, 5 3, 14 4, 3 22, 4 Hurdes 72 Ah2 0, 10 1, 30 50, 3 65, 4 2, 32 3, 0 25, 1 Pª. Cácer es AC 0, 55 1, 30 39, 4 281, 7 2, 24 16, 0 17, 5 Tot al 431 23, 4 18, 4 Pº. St a Cl ara 950 Ah1 0, 15 0, 49 93, 1 68, 4 5, 90 4, 3 18, 3 Gat a 47 Ah2 0, 45 0, 61 72, 5 199, 0 4, 88 13, 4 17, 2 Tot al 267 17, 7 15, 1 S M. Trevej o III 850 Ah1 0, 60 0, 59 39, 3 139, 1 2, 96 10, 5 13, 3 Gat a 48 Ah2 0, 20 0, 86 35, 0 60, 2 2, 20 3, 8 15, 9 ABw Nd Nd 21, 6 Nd 1, 40 Nd 15, 4 Pª. Cácer es C1 Nd Nd 3, 8 Nd 0, 39 Nd 9, 7 Tot al 199 14, 3 13, 9 S M Trevej o I 850 Ah1 0, 20 0, 95 45, 1 85, 7 2, 53 4, 8 18, 0 CAST P1 Ah2 0, 30 0, 97 33, 9 98, 7 1, 85 5, 4 18, 3 ABw 0, 20 1, 15 18, 1 72, 9 1, 08 4, 4 17, 0 Pª. Cácer es Bw 0, 30 1, 24 6, 8 25, 3 0, 57 2, 1 12, 0 Tot al 282 16, 7 16, 9 S M Trevej o II 830 Ah1 0, 25 0, 88 31, 0 68, 2 1, 66 3, 7 19, 0 CAST P2 Ah2 0, 10 0, 91 24, 9 22, 7 1, 46 1, 3 17, 0 ABw 0, 25 1, 15 13, 2 38, 0 0, 85 2, 4 15, 0 Bw 0, 20 1, 20 7, 1 17, 0 0, 59 1, 4 12, 0 Pª. Cácer es BC 0, 30 1, 26 2, 6 9, 8 0, 30 1, 1 8, 7 Tot al 156 9, 9 15, 7 Tabla 2. Contenidos de C y N de suelos de castañares extremeños (España).

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Suelos Altitud Horizonte Profundidad COS N C/N

Manejo (m snm) (m) (mg g-1) (mg g-1) Berlanga 800 Ap 0.10 18.9 1.65 11.5 Bierzo I(4) Bw 0.20 16.6 1.65 10.1 Pª. León BC 0.30 11.8 1.37 8.6 Soto El Espino 800 Ap 0.15 32.7 2.24 14.6 Bierzo II(3) Bw 0.35 14.5 1.17 12.4 Pª. León C 0.30 12.1 1.29 9.4 Soto Burbia 550 ABw 0.30 58.1 3.53 16.5 Burbia III(5) Bw 0.20 30.5 2.10 14.5 Soto Espanillo 550 Ap 0.12 47.1 2.53 18.6 Espanillo IV (2) BC 0.38 5.9 0.82 7.2 Soto Palacios Compludo 550 ABw 0.20 18.0 1.54 11.7 Bierzo V (7) Bw 0.30 9.0 0.91 9.9 Pª. León BC 0.40 6.4 0.95 6.7 Soto asilvestrado M. de Leitosa 900 Ah 0.08 22.6 1.33 17.0 Médulas VI (1) Bw1 0.20 6.3 0.59 10.7 Pª. León Bw2 0.22 2.9 0.29 10.0 Monte bajo Médulas 900 Ap 0.18 27.0 1.70 15.9 Médulas VII (6) Bw 0.12 5.0 0.80 6.3 Soto cultivado San Cebrián 690 Ap 0.20 3.6 0.40 8.9 Sanabria B1 0.35 5.3 0.85 6.2 B2 0.35 2.5 0.58 4.3 Pª. Zamora BC 0.40 1.2 0.46 2.6 Soto cultivado Navacarros 1120 Ah 0.10 34.0 2.71 12.6 Béjar 21 Bg 0.30 10.0 1.18 8.5 BC 0.15 4.0 0.44 9.3 Pª. Salamanca CR 0.25 1.0 0.23 5.2 Soto Candelario I 1250 Ah 0.20 53.0 3.51 15.1 Béjar 28 B 0.20 15.0 1.32 11.4 Pª. Salamanca C 0.30 10.0 0.89 11.2 Soto Candelario II 1150 Ah 0.20 43.0 2.82 15.3 Béjar 36 B1 0.25 5.0 0.54 9.3 B2 0.20 3.0 0.34 8.9 Pª. Salamanca BC 0.30 3.2 0.44 7.3 Soto Candelario III 1170 Ah1 0.20 35.4 2.28 15.5 Béjar 37 Ah2 0.20 27.0 1.78 16.0 A3 0.20 19.4 1.34 14.5 Pª. Salamanca C 0.30 7.8 0.68 11.3 Soto asilvestrado Palomares 1100 Ah 0.20 19.7 1.14 17.2 Béjar 38 BC 0.20 1.8 0.33 5.5 Monte bajo Monte Mario 1100 Ah 0.10 46.8 1.85 25.3 Béjar 39 ABw 0.15 15.8 0.89 17.8 B2 0.25 13.0 0.75 17.3 Pª. Salamanca BC 0.30 7.5 0.62 12.1 Monte bajo Las Cuadrillas 1000 Ah 0.40 22.0 1.41 15.6 Béjar 40 B2 0.30 2.4 0.41 6.1 Pª. Salamanca B3 0.50 2.6 0.38 6.6 Soto Pº. Honduras 950 Ah1 0.20 31.5 1.90 16.6 Hervás Ah2 0.20 21.2 1.42 14.9 Pª. Cáceres Bwg 0.40 8.5 0.71 11.9 Monte bajo Cadalso 450 Ap 0.20 18.3 1.30 14.1 Cáceres LVIII Abw 0.30 10.6 0.96 11.0 Pª. Cáceres Bw 0.30 6.4 0.60 10.6 Soto con olivar Guadalupe 640 Ap 0.15 26.4 3.00 8.8 Cáceres VIII Bw 0.35 5.0 0.70 7.2 Soto con vid

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PAINÉIS

140

Transformação da castanha / Transformación de la castaña

P1.01. CINÉTICAS DE REHIDRATACIÓN DE CASTAÑAS PROCESADAS EN CÁMARA DE SECADO

1R. Moreira, F. Chenlo, L. Chaguri, C. Fernandes

1 Departamento de Enxeñaría Química, Escola Técnica Superior de Enxeñaría (ETSE), Universidade de Santiago de Compostela, Rúa Lope Gómez de Marzoa, s/n 15782 Santiago de Compostela, España. Email: [email protected]

RESUMEN Castañas secadas con aire caliente (65 ºC y 30 % humedad relativa) hasta diferentes contenidos de humedad se sometieron, posteriormente, a rehidratación en agua (25, 45, 70 y 100 ºC) hasta 180 min. La cinética de rehidratación fue analizada con el modelo de Peleg cuyas constantes fueron correlacionadas satisfactoriamente con las variables de operación.

Palabras-clave: Contenido de humedad, peleg, humedad de equilibrio

1. INTRODUCCIÓN

La castaña (Castanea sativa Miller) es un producto que presenta una significada tradición e importante aspecto económico. Se caracteriza por el tamaño, sabor y textura. Se considera una buena opción de dieta alimentaria, principalmente para los celiacos, debido a su bajo contenido en gluten y colesterol. El fruto fresco es rico en carbohidratos (49 %), proteínas (3 %), celulosa (1 %) y minerales (1 %) (De la Montaña et al., 2004). La deshidratación, en general, es un método clásico de conservación de alimentos, teniendo por principio la reducción de la actividad de agua del producto hasta niveles que garanticen la estabilidad fisico-quimica y microbiológica de los mismos (Lewicki y Jakubczyk, 2004). Concretamente, el secado por aire caliente es uno de los métodos más antiguos de conservación de alimentos, pero puede provocar modificaciones no deseadas al producto deshidratado, como encogimiento y oscurecimiento. El proceso de secado convectivo de castañas ha sido estudiado por diferentes autores, caracterizando la cinética de secado, así como su modelización (Brucato et al., 2004; Guiné y Fernandes, 2006; Moreira et al., 2005). Una vez secos, la mayoría de los alimentos pueden ser rehidratados por inmersión en agua antes de su consumo. La rehidratación es un proceso complejo que tiene como objetivo restaurar las propiedades de un producto deshidratado después del contacto con agua (Krokida

141 et al., 1999). Las características del proceso de rehidratación se evalúan a través de parámetros que indican las modificaciones físicas y químicas durante el secado, así como la influencia de las condiciones de operación, tratamientos utilizados y la composición de la muestras (Funebo y Ohlsson, 1998). Peleg (1988) propuso un modelo empírico para la absorción del agua en productos rehidratados dado por la ecuación: t (1) X = X 0 + (K1 + K 2t) donde X es el contenido de humedad (kg agua/kg solido seco) en el tiempo t (s), X0 es el contenido de humedad inicial (kg agua/kg solido seco), K1 es un parámetro cinético dependiente de la temperatura y K2 define el contenido en humedad de equilibrio. Cuando t → ∞ el contenido de humedad en equilibrio (X*) es definido por la expresión:

* 1 X = X 0 + (2) K 2 Reordenando la ecuación 2, se obtiene la forma lineal:

t (3) = K1 + K 2 t (X − X 0 ) La ecuación (3) permite calcular las constantes de Peleg a partir de una recta y así obtener la capacidad de absorción de agua de un producto seco. El objetivo de este trabajo es estudiar el comportamiento de las cinéticas de rehidratación en función de las distintas temperaturas de proceso y contenidos de humedad de las castañas. El proceso de rehidratación será analizado por el modelo empírico de Peleg cuyas constantes serán evaluadas.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Castañas de la variedad Famosa procedentes de la cosecha de Octubre – Noviembre de 2005 fueron almacenadas en bolsas cerradas a vacío conservándose en cámara fría a 4 ºC hasta el momento de los ensayos. El contenido de humedad inicial fue 55,4 ± 1.8 % (base húmeda). Las probetas de castañas, con geometría prismática (10x10x15 mm), fueron preparadas utilizando un cuchillo. Para cada ensayo de temperatura de rehidratación fueron necesarias 60 probetas (12 para cada tiempo). Las probetas fueron pesadas al inicio y al final del proceso de secado en una balanza Scaltec SBA 41 (± 0,001 g). El secado se llevó a cabo a la temperatura de 65ºC, humedad relativa del aire 30 % y velocidad del aire de 2,7 m/s durante diferentes tiempos (0,5; 2; 3,5; y 5 h) lo que proporcionó distintos contenidos de humedad (0,66; 0,33; 0,24 y 0,15, referido a base seca). Las cinéticas de la etapa de secado de la castaña fueron determinadas en un trabajo anterior (Chenlo, et al., 2006). El secadero utilizado consistió en

142 una cámara de secado, a escala de planta piloto, con circuito cerrado de aire caliente, asistida energéticamente por una bomba de calor. Una vez secadas, las probetas fueron introducidas en botes de vidrio y cerrados herméticamente de manera que quedasen inmersas en agua destilada, calentada previamente a distintas temperaturas (25, 45, 70 e 100 ºC). En cada bote fueron introducidas 12 probetas, soportadas en una cesta perforada y cerrada, para asegurase que las muestras quedasen sumergidas. Para el seguimiento del proceso de rehidratación, los botes (5 por cada temperatura de rehidratación) fueron colocados en una placa con sistema de calentamiento (Selecta Rotaterm). El control de la temperatura del agua fue efectuado con un termómetro digital (Checktemp). Transcurrido el tiempo programado (10, 30, 60, 120 e 180 minutos) para los ensayos a las temperaturas de 25 y 45 ºC y (2,5; 5; 10; 30 y 60 minutos) para los ensayos a las temperaturas de 70 y 100 ºC, las probetas fueron retiradas del agua (el exceso de agua ha sido eliminado con papel absorbente) y posteriormente pesadas. Con la finalidad de determinar el contenido de humedad, 2 muestras fueron identificadas por separado; trascurrido el tiempo de rehidratación se introdujeron en la estufa a vacío (Heraeus Vacutherm VT 6025, a 70 ºC, p < 100 mmHg), con la finalidad de hallar el contenido de humedad en base seca, según sugiere AOAC, 1995.

3. RESULTADOS Y DISCUSSIÓN

Las cinéticas de rehidratación de castañas parcialmente secadas por aire caliente a 65 ºC pueden estudiarse a través de las Figuras 1 y 2, a modo de ejemplo, para las muestras con contenido de humedad inicial de 0,66 y 0,15 (base seca), respectivamente. Se observa que la cantidad total de agua absorbida aumenta a medida que aumenta el tiempo de rehidratación. La temperatura de agua ejerce una gran influencia en las cinéticas de rehidratación, así, cuanto mayor es la temperatura, mayor es la cantidad de agua absorbida así como la velocidad de absorción de agua. El efecto del tiempo y de la temperatura de rehidratación, son mayores en el inicio del proceso, primeros 60 minutos para las temperaturas de 25 y 45 ºC y 30 primeros minutos para las temperaturas de 70 y 100 ºC. Comparando las Figuras 1 y 2, se observa que las castañas que fueron secadas durante menos tiempo presentan mayores contenidos de humedad a lo largo del proceso de rehidratación, independientemente de la temperatura empleada.

143

2.5 25 ºC 45 ºC 2 70 ºC 100 ºC Simulación 1.5

1

0.5 X (kgX agua/ kg sólido seco)

0 0 50 100 150 200 t (min)

Figura 1. Cinéticas de rehidratación de castañas previamente secas durante 0,5 h a 65 ºC (X0 = 0,66 base seca)

2.5 25 ºC 45 ºC 2 70 ºC 100 ºC 1.5 Simulación

1

0.5 X (kgX agua/kg sólido seco)

0 0 50 100 150 200 t (min)

Figura 2. Cinéticas de rehidratación de castañas previamente secas durante 5 h a 65 ºC (X0 = 0,15 base seca)

En la Tabla 1 se presentan los valores de los parámetros K1 y K2 y de la humedad de equilibrio de rehidratación, obtenidos por la aplicación de las ecuaciones (2) y (3), para cada temperatura y contenido de humedad inicial ensayados. Se observa que los coeficientes de regresión R2 presentados, tienen en su mayoría valores superiores a 0,97, indicando un buen

144 ajuste de los datos experimentales, sugiriendo que esta ecuación puede ser utilizada para describir las cinéticas de absorción de agua por las castañas dentro de los intervalos experimentales ensayados. Los valores de K1 y K2 disminuyen con el aumento de la temperatura. Cuanto más bajo es el valor de K1, mayor es la velocidad de absorción de agua.

En cuanto al parámetro K2, los valores obtenidos también dependen de la temperatura, disminuyendo con el aumento de esta variable. El contenido de humedad de equilibrio X* se comporta a la inversa que el parámetro K2, aumentando con la temperatura de rehidratación. Así, modificaciones en la estructura física o química del material puede proporcionar variaciones en X* en relación a la temperatura de rehidratación.

Tabla 1. Parámetros K1, K2 y humedades de equilibrio de castañas con diferentes contenidos de humedades iniciales rehidratadas a distintas temperaturas.

X0 (b.s.) = 0,66 ± 0,07 2 K1 K2 R X* -1 -1 T (ºC) (kg H2O/kg s.s.) ·s (kg H2O/kg s.s.) (kg H2O/kg s.s.) 25 2733,1 1,57 0,99 1,24 45 2257,3 1,44 0,95 1,37 70 1571,7 0,95 0,99 1,66 100 635,0 0,54 0,99 2,59

X0 (b.s.) = 0,33 ± 0,00 25 2990,9 1,07 0,98 1,26 45 1690,1 1,02 0,99 1,32 70 837,1 1,04 0,99 1,30 100 892,9 0,70 0,98 1,76

X0 (b.s.) = 0,24 ± 0,03 25 5233,7 1,38 0,99 0,95 45 1878,3 1,16 0,99 1,12 70 972,6 0,97 0,99 1,22 100 467,9 0,91 0,98 1,35

X0 (b.s.) = 0,15 ± 0,02 25 3264,3 1,39 0,99 0,88 45 2053,1 1,09 0,98 1,08 70 1272,7 1,01 0,99 1,11 100 243,2 0,83 0,99 1,38

Agradecimientos

Los autores agradecen la parcial financiación de este trabajo a la Xunta de Galicia por el proyecto PGIDIT04TAL265004PR.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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P1.02. CARACTERIZACIÓN DEL FRUTO EN LAS PRINCIPALES VARIEDADES TRADICIONALES DE CASTAÑO DE ANDALUCÍA

Martín, M.A; Alvarez, J.B; Martín, L.M.

Departamento de Genética, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes, Edificio Gregor Mendel, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba, ES-14071 Córdoba, España.

RESUMEN

El castaño es una especie monoica ampliamente distribuida en la Península Ibérica. En Andalucía, existen dos áreas dedicadas a la producción de fruto en las provincias de Huelva y Málaga, con variedades tradicionales injertadas sobre patrones procedentes de semilla. Este estudio está centrado en la caracterización de estas variedades tradicionales. Para ello, se han analizado 103 árboles, que incluyen casi la totalidad de las denominaciones encontradas para dichas variedades tradicionales. Para el análisis se han seleccionado diez caracteres cuantitativos de fruto. Los resultados del trabajo han mostrado diferencias significativas entre las principales variedades de Huelva y Málaga. En ambas regiones, se han encontrado un grupo de variedades en claro estado de regresión, que constituyen una parte muy importante de la diversidad genética.

Palabras clave: castaño, caracteres morfológicos, diversidad genética..

1. INTRODUCCIÓN

El castaño (Castanea sativa Miller) está ampliamente distribuido en la Península Ibérica y es cultivado para la obtención de madera y fruto desde la antigüedad. En Andalucía, hay dos áreas dedicadas a la producción de fruto en las provincias de Huelva y Málaga. En ambos casos, la producción se basa en variedades tradicionales injertadas sobre patrones procedentes de semilla. La información disponible sobre la identificación genética de variedades tradicionales de castaño es, en general, escasa y confusa, ya que la mayoría de las veces éstas son descritas y clasificadas sólo de acuerdo a su origen geográfico (Fineschi, 1988). Lo mismo ocurre en Andalucía, donde se ha constatado la existencia de denominaciones varietales no recogidas en la literatura hasta el momento sin que se tenga constancia de descripciones contrastadas del resto (Álvarez et al. 2003). Recientemente, se ha llevado a cabo una recolección en los castañares andaluces en la que se han detectado hasta 43 denominaciones varietales locales (Martín, 2006; Martín et al. 2007). También se ha detectado que la presión de las principales variedades locales y algunas exóticas está erosionando esta diversidad genética.

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Si bien la información proporcionada por los agricultores ha sido la base para la recolección, se fue extremadamente prudente antes de asignar un árbol a una variedad o denominación local, y sólo se ha dado por correcto aquellas que han sido confirmadas experimentalmente.. Se ha realizado una identificación de las variedades de castaño en Andalucía (Martín, 2006; Martín et al. 2007) que ha permitido identificar al menos, 41 genotipos distintos, algunos de los cuales pudieron ser asignados a las denominaciones varietales recopiladas y otros no. Estos resultados concuerdan con los obtenidos mediante análisis de microsatélites de un grupo de árboles distintos de estos mismos materiales (Martín et al. 2005). Una vez identificadas las variedades, el siguiente paso para su puesta en valor ha sido su caracterización. Esta caracterización no ha tenido la finalidad de seleccionar las mejores variedades o determinar si una zona es mejor que otra, sino evaluar cómo son las variedades. Además, dada la longevidad de la especie y el carácter tradicional de su cultivo, la caracterización se ha realizado en sus zonas de origen, a pesar de las limitaciones que esto supone para el tratamiento estadístico de los datos y se ha basado en caracteres con una alta relevancia agronómica y económica como el tamaño y la forma del fruto. El objetivo de este trabajo ha sido, pues, la caracterización morfológica de los tipos varietales encontrados en Andalucía, con la finalidad de que esta información pueda ser de utilidad a los agricultores y ayude al establecimiento de un sistema de conservación in situ de este material.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

2.1. Material vegetal Se han considerado 103 castaños correspondientes a los 41 tipos varietales identificados en un trabajo previo (Martín, 2006; Martín et al. 2007). Se han analizado 6 frutos por árbol, localizados en las posiciones exteriores del erizo.. Los 41 tipos varietales se han dividido en dos subgrupos: variedades mayores y menores. El primero incluyó aquellas variedades más frecuentes en cada zona, que se clasifican en 8 variedades, representadas en este estudio por un mínimo de 5 árboles por variedad. En dicho trabajo previo, en seis de los ocho casos fue posible asignar un tipo varietal a una única denominación (Planta Alájar, Temprana I y Temprana II, en Huelva; y Pilonga, Pilonga de Igualeja y Tomasa en Málaga), mientras que los dos casos restantes incluyen árboles de diferentes denominaciones. Uno de los tipos varietales incluyó las denominaciones Helechal, Comisaria y Comisaria Rubia; mientras que el otro grupo incluyó las denominaciones Corriente, Pilonga de Jubrique y Temprana de Jubrique. El resto del material de ambas zonas constituyen las variedades menores.

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2.2. Caracterización morfológica Para el estudio se seleccionaron siete caracteres de fruto (una vez desecado) de entre los descriptores propuestos por Goldsbrough (1990): peso (g), longitud (mm), anchura (mm), grosor (mm), área de la castaña (mm2), longitud del hilum (mm), anchura del hilum (mm) y área del hilum (mm2). Además se calcularon una serie de índices como combinación de los caracteres anteriores: Índice 1 = anchura fruto/longitud fruto; Índice 2 = grosor fruto/longitud fruto; Índice 3 = anchura hilum/longitud hilum; Índice 4 = área hilum/área fruto, Índice 5 = anchura hilum/grosor fruto e Índice 6 = longitud hilum/anchura fruto.

2.3. Análisis estadístico Los datos correspondientes a las variedades mayores se analizaron comparando los valores medios mediante la mínima diferencia significativa (Steel y Torrie, 1980); mientras que aquellas variedades locales representadas por un bajo número de árboles solamente se describieron.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Variedades mayores Los resultados obtenidos para las variedades mayores se resumen en la Tabla 1. Los ocho caracteres morfológicos medidos han permitido establecer diferencias significativas entre todas las variedades mayores, excepto entre Pilonga de Igualeja y el tipo varietal que englobó a las denominaciones Helechal, Comisaria y Comisaria Rubia. Independientemente de que ambos se cultivan en zonas diferentes, y sólo en esas en esas zonas, la diferencia entre ambos tipos varietales fue previamente determinada por el tipo de inflorescencia masculina (Martín, 2006; Martín et al. 2007). Así la variedad Pilonga de Igualeja presentó amentos longistaminados (con polen fértil), mientras que el otro tipo varietal tuvo amentos astaminados (con polen estéril). Para el peso de fruto, que es el principal carácter que determinará el posterior uso de la castaña, la variedad Tomasa fue la que mostró el valor más alto, siendo significativamente distinto al de las variedades de Huelva, pero no a las de Málaga. Las variedades de Málaga presentaron también valores mayores para la longitud y anchura de fruto, siendo, por lo general, menos gruesas. Además, el área del fruto fue también mayor en las variedades de Málaga. El conjunto de índices obtenidos mediante la combinación de los caracteres morfológicos, permitió detectar diferencias entre variedades, iguales o mayores que las detectadas con los caracteres morfológicos.

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3.2. Variedades menores Entre las provincias de Huelva y Málaga, se han detectado un total de catorce y veintidós tipos varietales de esta naturaleza respectivamente (Martín, 2006; Martín et al. 2007). Por lo general, estas variedades están representadas en nuestro estudio por uno o dos árboles, ya que la difusión de las mismas es muy escasa y, según los agricultores consultados, están en franca recesión. Comparando los resultados obtenidos en ambas regiones para estas variedades menores, los valores mínimos obtenidos para los caracteres medidos fueron similares en ambas regiones; sin embargo, en Málaga, se han encontrado valores mayores para los datos máximos en todos los caracteres, lo que indica que la variabilidad encontrada en esta zona es mayor.

4. CONCLUSIONES

La caracterización de fruto de los ocho tipos varietales mayores identificados en un trabajo previo (Martín, 2006), ha permitido confirmar las diferencias genéticas, ya que se han detectado diferencias significativas entre ellas. Los tipos varietales de Málaga han mostrado unos valores superiores para los caracteres de peso y fruto; sin embargo, los índices analizados han detectado diferencias entre estos ocho tipos varietales no específicamente relacionados con la región de origen. Por otra parte, aunque los tipos varietales menores representan una pequeña proporción de los árboles de cada zona, han mostrado una alta diversidad para estos caracteres, lo que confirma el interés de su conservación como recursos genéticos. Todo lo anteriormente señalado, así como los trabajos previos, indican la urgente necesidad de establecer medidas para la conservación de las variedades tradicionales de castaño en Andalucía.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido realizado en el marco del convenio CONV-2000-63 entre la Consejería de Medio Ambiente de la Junta de Andalucía y la Universidad de Córdoba y el proyecto CO3-083 del Ministerio de Agricultura y Pesca de la Junta de Andalucía.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Tabla 1.- Valores medios de las variedades mayores para 8 caracteres morfológicos de fruto y 6 índices. Fruto Hilum Peso Longitud Anchura Grosor Área Longitud Anchura Área Nº de 2 2 árboles (g) (mm) (mm) (mm) (mm ) (mm) (mm) (mm ) Helechal, Comisaria, 9 7.06bc 31.54bcd 31.38bc 20.21ab 636.34b 24.90bc 15.05bc 378.85bcd Comisaria Rubia Planta Alajar 13 6.77bc 32.44bc 29.95bc 17.09c 517.18c 26.20bc 12.64d 337.21cd Temprana I 6 7.00bc 31.42cd 31.71b 18.79bc 598.27bc 26.43b 13.08cd 348.37cd Temprana II 5 5.62c 29.20d 28.50c 17.60c 507.83c 23.02c 12.08d 282.58d Corriente, Pilonga de Jubrique, Temprana de 5 9.26a 34.22a 35.03a 20.33ab 713.67ab 26.08bc 13.22cd 345.90cd Jubrique Pilonga 6 9.68a 34.04abc 34.86a 21.85a 763.45a 30.26a 17.71a 541.47a Pilonga de Igualeja 7 7.98ab 33.49bc 32.17ab 20.32ab 654.17ab 27.41ab 16.42ab 454.52ab Tomasa 8 9.89a 36.74a 35.12a 20.08ab 710.00ab 26.66b 14.25bcd 387.05bc

Nº de Índice 1 Índice 2 Índice 3 Índice 4 Índice 5 Índice 6

árboles (ratio) (ratio) (ratio) (ratio) (ratio) (ratio) Helechal, Comisaria, 9 99.76abc 64.01a 62.99a 58.82bc 73.05b 79.86cd Comisaria Rubia Planta Alajar 13 92.39d 52.81c 48.66d 64.86ab 73.98ab 87.41a Temprana I 6 101.12ab 59.75a 50.43d 58.14bc 69.47bc 83.43abc Temprana II 5 97.44bc 60.29a 53.25cd 56.55c 68.84bc 81.19bc Corriente, Pilonga de Jubrique, Temprana de 5 102.37a 59.54ab 51.18d 48.26d 64.90c 74.48e Jubrique Pilonga 6 102.61a 64.21a 58.58abc 70.20a 80.68a 86.73a Pilonga de Igualeja 7 96.24bcd 60.63a 60.50ab 69.07a 80.68a 85.04ab Tomasa 8 95.78cd 54.49bc 53.78bcd 54.14cd 71.09bc 75.59de a Clasificación de acuerdo a Martín et al. (2006; 2007). Índice 1 = anchura fruto/longitud fruto; Índice 2 = grosor fruto/longitud fruto; Índice 3 = anchura hilum/longitud hilum; Índice 4 = área hilum/área fruto; Índice 5 = anchura hilum/grosor fruto; Índice 6 = longitud hilum/anchura fruto. Medias con la misma letra no son significativamente diferentes a un nivel de 0.05.

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P1.03. EFEITO DO PROCESSAMENTO NA COMPOSIÇÃO EM ÁCIDOS ORGÂNICOS EM CASTANHAS DAS CULTIVARES JUDIA E LONGAL

1Pereira, J.A.; 2Ribeiro, B.; 2Rangel, J.; 2Valentão, P.; 2Andrade, P.B.; 1Bento, A.; 2Seabra, R.M.

1 CIMO/Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Campus de Sta. Apolónia, Apt. 1172, 5301-855 Bragança, Portugal. [email protected] 2 REQUIMTE/Serviço de Farmacognosia, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Rua Aníbal Cunha, 164, 4050-047 Porto, Portugal. [email protected]

RESUMO Com o presente trabalho pretendeu-se, por um lado, proceder à quantificação dos ácidos orgânicos das cultivares de castanha, Judia e Longal, e por outro verificar o efeito das formas mais comuns de processamento (castanhas assadas, cozidas e fritas) na variação destes ácidos, por HPLC/UV. Os resultados mostraram que em ambas as cultivares foram identificados sete ácidos orgânicos, nomeadamente: ácido oxálico, ácido cis-aconitico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido málico, ácido quinico e ácido fumárico. O maior teor em ácidos orgânicos foi observado em frutos não processados da Cv. Longal, com 251,2±80,7 mg/kg de matéria seca. O ácido ascórbico foi o ácido orgânico mais abundante. Todos os processos de processamento levaram a uma redução superior a 46% no teor destes compostos.

Palavras-chave: Castanha, processamento, composição, ácidos orgânicos

1. INTRODUÇÃO

De acordo com a FAO (www.fao.org) Portugal é o segundo produtor europeu de castanha com 31051 Mt em 2005. Trás-os-Montes é a principal região produtora a nível nacional, sendo as cultivares Judia e Longal as mais comuns. As castanhas são maioritariamente constituídas por amido (mais de 70%) com teores reduzidos de proteínas (2-4%) e gordura (2-5%) (Vaughan & Geissler, 1997). Apresentam vários minerais e vitaminas e teores apreciáveis de fibra (Vaughan & Geissler, 1997). O efeito do processamento na composição em açúcares e ácidos gordos (Künsch et al., 2001) foi anteriormente referido. Contudo, a composição em ácidos orgânicos, compostos com influência nas características organolépticas (Vaughan & Geissler, 1997) e na actividade antioxidante (Silva et al., 2004), bem como o efeito do processamento não se encontravam anteriormente estudados. O objectivo deste trabalho, foi por um lado proceder à determinação da composição em ácidos orgânicos de duas das cultivares de castanha, Judia e Longal, mais abundantes a nível regional e nacional, e por outro verificar o efeito das formas mais comuns de processamento (assadura, cozedura e fritura) na sua composição.

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2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Amostras Castanhas das Cvs. Judia e Longal, foram recolhidas num souto adulto da região de Bragança em Novembro de 2004. De cada cultivar foram constituídos quatro lotes de 40 castanhas, que por sua vez foram subdivididos em amostras de 15 frutos, sendo cada amostra sujeita a tratamento diferente, nomeadamente: - castanhas cruas; - castanhas assadas, num forno eléctrico (Balay, Mod. 508) a 200ºC durante 40 min.; - castanhas cozidas, em 300 ml de água a ferver durante 20 min.; - castanhas fritas, em óleo alimentar, numa fritadeira eléctrica (Electric CO.FR.1060) a 150ºC durante 7 min.. Após processamento, todas as amostras foram descascadas e congeladas a -20ºC até análise.

2.2 Extracção e análise dos ácidos orgânicos

A extracção foi baseada no procedimento descrito por Silva et al. (2002). A análise foi efectuada por HPLC/UV nas condições referidas por Silva et al. (2002) com algumas modificações como referido em Ribeiro et al. (2007). A quantificação dos ácidos orgânicos foi efectuada por comparação da absorvância a 214 nm registada nos cromatogramas em relação a padrões externos. Os ácidos oxálico e cis-aconitico foram quantificados em conjunto como ácido oxálico. Os ácidos málico e quínico foram quantificados como ácido málico.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise dos ácidos orgânicos de ambas as cultivares (Judia e Longal) permitiu a identificação e quantificação de 7 compostos orgânicos, nomeadamente: ácido oxálico, ácido cis- aconitico, ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido málico, ácido quinico e ácido fumárico (Figura 1).

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Figura 1. Cromatograma HPLC/UV: a) solução padrão; b) amostra de frutos crus. Detecção a 214 nm. (MP) fase móvel; 1) ácido oxálico; 2) ácido cis-aconitico; 3) ácido cítrico; 4) ácido ascórbico; 5) ácido málico; 6) ácido quinico; 7) ácido fumárico; ●) ácido trans-aconítico.

Os resultados obtidos indicam uma forte perda de ácidos orgânicos com o processamento em ambas as cultivares em estudo. Assim, na Cv. Judia, as castanhas cruas apresentaram um teor de 205,0±44,6 mg/kg de matéria seca, enquanto que as assadas apresentaram 99,3±32,2 mg/kg, as cozidas 108,8±36,7 mg/kg, e as fritas 77,7±62,8 mg/kg, o que representa uma perda de 51,6%, 46,9% e 62,1% respectivamente. Por sua vez na Cv. Longal, os frutos não sujeitos a processamento tiveram um teor em ácidos orgânicos de 251,2±80,7 mg/kg de matéria seca, as assadas 136,0±44,1 mg/kg, as cozidas 99,9±22,7 mg/kg, e as fritas 95,7±44,8 mg/kg, o que representa uma redução com o processamento de 45,9%, 60,2% e 61,9% respectivamente. Na Figura 2 apresenta-se o efeito do processamento nos ácidos orgânicos maioritários.

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Cv. Judia Cv. Longal 100 100 Ácido citrico Ácido citrico

80 80

60 60

40 40

mg/kg dematéria seca 20 mg/kg dematéria seca 20

0 0 Cruas Assadas Cozidas Fritas Cruas Assadas Cozidas Fritas

125 125 ácido ascórbico ácido ascórbico

100 100

75 75

50 50 mg/kg de matériaseca

25 mg/kg de matériaseca 25

0 0 Cruas Assadas Cozidas Fritas Cruas Assadas Cozidas Fritas

100 100 ácido málico + ácido quinico ácido málico + ácido quinico

80 80

60 60

40 40 mg/kg de matéria secamg/kg matéria de

20 secamg/kg matéria de 20

0 0 Cruas Assadas Cozidas Fritas Cruas Assadas Cozidas Fritas

Figura 2. Composição em ácidos orgânicos de castanhas das Cv. Judia e Longal, sujeitas a diferentes processamentos.

A soma dos ácidos oxálico e cis-aconitico foi inferior a 2,45 mg/kg de matéria seca na Cv. Judia e a 3,65 mg/kg na Cv. Longal. Por sua vez os teores observados de ácido fumárico foram menores que 0,83 mg/kg em ambas as cultivares, tendo sido praticamente apenas quantificado nas castanhas cruas.

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O trabalho desenvolvido permitiu a identificação de sete ácidos orgânicos em duas importantes cultivares de castanha portuguesas, indicando que o teor destes compostos varia com a cultivar em estudo, podendo servir como parâmetro de autenticidade, e dentro desta com o processamento que o fruto sofre.

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto INTERREG III A - Identificación de los agentes patógenos y beneficiosos de los principales cultivos de las regiones fronterizas Tras-os- Montes y Castilla y León para la realización de estrategias de control razonadas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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P1.04. VARIAÇÃO DA COR DURANTE A SECAGEM CONVECTIVA DE CASTANHAS PRÉ- TRATADAS COM DISSOLUÇÕES OSMÓTICAS DE CLORETO DE SÓDIO

1R. Moreira, F. Chenlo, L. Chaguri

1 Departamento de Enxeñaría Química, Escola Técnica Superior de Enxeñaría (ETSE), Universidade de Santiago de Compostela, Rúa Lope Gómez de Marzoa, s/n 15782 Santiago de Compostela, España. E-mail: [email protected]

RESUMO Avaliou-se a mudança de cor em castanhas, previamente desidratadas por osmose com cloreto de sódio, durante a secagem com ar a diferentes temperaturas e formas de descascar. Os valores dos parâmetros L* e b* diminuem com o tempo de secagem ao passo que os de a* aumentam. A forma de descascar conduziu a diferentes comportamentos na evolução da cor.

Palavras-chave: Conteúdo de umidade, escala CIElab, cinética de secagem, método combinado.

1. INTRODUÇÃO

A castanha (Castanea sativa Mill) é um produto tradicional dos países mediterrâneos (Míguez, 2000). Na Peninsula Ibérica, tem uma grande importância na Comunidade Autônoma de Galicia e no norte de Portugal. A castanha tradicionalmente chegava fresca ao consumidor, mas hoje em dia observa-se uma maior introdução dos seus produtos manufaturados no mercado, como por exemplo o marróm glacé, cremes, farinhas para confeitaria, etc (Pinnavaia et al., 1995). O processo de secagem como método combinado de consevação aplicado a castanha é de sumo interesse, porque possibilita obter um produto disponível durante todo o ano, para esta fianlidade, é imprescindível que o produto final apresente uma alta qualidade. Na secagem convectiva o calor sensível do ar é cedido por convecção ao material a secar. O agente de secagem passa sobre ou através do produto elevando a temperatura para favorecer a evaporação de água contida no mesmo. Este aumento térmico é um dos problemas associados ao processo de secagem uma vez que, em muitas ocasiões, favorece reações e processos que afetam de forma negativa a qualidade do produto desidratado. A secagem convectiva com ar quente precedida de um tratamento osmótico é uma técnica utilizada em diferentes indústrias de alimentos processados com o propósito de reduzir a água disponível para o desenvolvimento de microorganismos e reações químicas, evitando assim os processos de descomposição e putrefação. É considerado por diversos autores ( Fito et al., 1996; Torreggiani, 1993; Sereno et al., 2001) uma alternativa econômica e segura para a conservação dos produtos alimentícios, além de melhorar as características sensoriais e

158 nutritivas. O processo de desidratação osmótica consiste na eliminação parcial de água pela ação da pressão osmótica quando o produto entra em contato com uma dissolução concentrada de solutos (Panagiotou, 1998). Este pré-tratamento, em função das características do alimento e condições de operação, pode promover uma redução do tempo total de desidratação. Um dos parâmetros de qualidade de um produto desidratado (particularmente a castanha) é a cor, a qual indica uma série de propriedades como o grau de maturação ou diferentes alterações do produto (Chiralt, 2002). Em relação aos alimentos em geral, o consumidor apresenta maior flexibilidade em aceitar distintas formas e tamanhos do produto do que para a aceitação da cor, o que faz com que esta variável esteja dentro de um intervalo mais estreito. A bibiografia em relação a cor de castanhas durante a secagem é escassa, não obstante, destacam-se estudos sobre a cor orginado da aplicação de métodos combinados de secagem, como o osmótico-convectivo, quando empregam-se dissoluções de sacarose e glucose (Moreira et al., 2007). O presente estudo tem como objetivo avaliar a mudança de cor da castanha pré-tratada em etapas de osmose com cloreto de sódio em função de diferentes temperaturas, tempos de secagem e forma de descascar (apresentação da superfície).

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Castanhas da varidedade Famosa procedentes da região de Galicia foram selecionadas em função do peso (aprox. 12,0 g), tamanho e grau de maturação uniformes. As castanhas foram armazenadas em câmara fria a 4 ºC antes de serem utilizadas nos ensaios. Os conteúdos médios de umidade inicial, X0, das mostras para estes ensaios foram de 55, 0 % (em base úmeda). Em relação a forma de descascar, as mostras foram dispostas de dois tipos diferentes, com ausência de pericarpo e endocarpo (denominadas “peladas”) e ademais, eliminando a superfície rugosa externa (parênquima) (denomidadas “cortadas”). Uma vez pesadas, as amostras foram submergidas em uma dissolução aquosa de coreto de sódio 22 % em peso a temperatura de 25 ºC, e extraídas depois de 8 h (condições determinadas em um trabalho anterior (Chenlo et al., 2005)). Em seguida, retirou-se o excesso de disolução aderida utilizando um papel absorvente e novamente foram pesadas e introduzidas na câmara de secagem. A secagem convectiva com ar quente foi realizada em uma planta piloto com circuito fechado auxiliada por uma bomba de calor a 3 temperaturas ( 45, 55 e 65 ºC) e umidade relativa do ar 30 %. O conteúdo de umidade final, determinou-se com a base seca de cada amostra obtida depois da secagem em estufa a vácuo (Heraeus Vacutherm VT650) a 100 mm Hg e 70 ºC. Para as análises de cor, as amostras foram medidas antes e durante a secagem, em intervalos de temop determinados previamente, usando um colorímetro Minolta CR400.

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Realizaram-se três medidas de cada amostra em distintos lugares de sua superfície e o valor médio foi calculado. Os valores da cor, são expressados através do espaço de cor CIElab, cujos parâmetros característicos são: L* (luminosidade), a* (coordenada vermelho-verde) e b* (coordenada amarelo-azul). As variações dos parâmetros da cor com o tempo em relação aos valores das amostras frescas permitem o cálculo da diferença da cor total, ∆E*, mediante (CIE, 1986):

∆E*= (ΔL*)2 + (Δa*)2 + (Δb*) 2

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A influência da temperatura do ar nas cinéticas de secagem apresenta-se na Figura 1, para castanhas cortadas, nas três temperaturas ensaiadas.

1.2 Temperatura (ºC) 1 45 55 65 0.8

0.6

(X-Xe)/(Xo-Xe) 0.4

0.2

0 0246810 tempo (h)

Figura 1. Influência da temperatura do ar nas cinéticas de secagem, para castanhas cortadas

Como pode-se observar, ocorre uma importante aceleração no processo da secagem com a temperatura. Particularmente, a velocidade de desidratação aumenta de forma não linear de modo que a 65ºC a cinética de desidratação é consideravelmente mais rápida. As mudanças dos valores globais dos parâmetros da cor ao final de 8 horas de secagem para castanhas cortadas e peladas com pré-tratamento osmótico com dissolução de cloreto de sódio 22 % a diferentes temperaturas estão recolhidas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. De forma geral independentemente da forma de apresentação da amostra, verifica-se que os valores dos parâmetros L* e b* decrescem e os correspondentes ao parâmetro a* aumentam durante a secagem.

160

Como pode-se observar na Tabela 1 os valores da mudança global da cor (∆E*) para castañas cortadas, são próximos independente da temperatura, principalmente a 55 e 65 ºC, sendo assim, pode-se concluir que nestas temperaturas, o pré-tratamento osmótico melhorou ligeiramente a cor, em relação a 45 ºC. Os valores de ∆E* encontrados são menores do que no caso da secagem das castanhas cortadas sem pré-tratamento (Moreira et al., 2007) portanto, neste caso, o tratamento osmótico com sal melhora a qualidade da cor no produto final.

Tabela 1. Mudanças das coordenadas de cor a distintas temperaturas, depois de 8 horas de secagem para castanhas cortadas Cortadas Sal 22,0 % 8 horas secagem T(ºC) ∆L* ∆a* ∆b* ∆E* 45 -8,35±0,6 2,70±0,2 -8,16±0,9 12,07±0,2 55 -7,96±0,1 2,24±0,3 -2,85±0,1 8,76±0,1 65 -2,93±0,6 1,20±0,2 -7,14±0,8 8,17±1,1

Analisando a Tabela 2, verifica-se que as castanhas peladas apresentam mudanças de cor notavelmente mais altas que as castanhas cortadas, principalmente no caso dos parãmetros L* e a*. Estas variações proporcionam valores de ∆E* altos a cada uma das temperaturas, além disso, são apreciavelmente mais altos do que no caso da secagem das amostras peladas sem pré-tratamento (Moreira et al., 2007) permitindo concluir que o tratamento osmótico com sal não melhora a qualidade da cor no produto final.

Tabela 2. Mudanças das coordenadas de cor a distintas temperaturas, depois de 8 horas de secagem para castanhas peladas Peladas Sal 22,0 % 8 horas secagem T(ºC) ∆L* ∆a* ∆b* ∆E* 45 -20,09±0,3 6,93±0,3 -9,05±0,9 23,10±2,1 55 -35,07±0,3 7,97±0,2 -29,64±0,7 46,69±1,7 65 -17,22±0,7 7,65±0,9 -3,69±0,4 19,22±1,0

Na Figura 2, representa-se o comportamento da variável da cor L* frente ao conteúdo de umidade para castanhas cortadas e peladas secas pelo método combinado nas 3 temperaturas de estudo. Observa-se que as amostras cortadas apresentam maiores valores durante todo o processo (menores mudanças da cor), além de obter uma dependência linear com o conteúdo de umidade, independente da temperatura. No caso das castanhas peladas observa-se que essa dependência linear ocorre a cada temperatura, mas não é independentente da mesma. As mudanças são claramente maiores, indicando um maior escurecimento da amostra. Similares comportamentos cinéticos foram observados para o resto dos parâmetros.

161

Tendo em conta os valores de mudanças dos parâmetros da cor apresentados, parece mais adequado o uso de castanhas cortadas para preservar a cor do produto fresco quando o pré-tratamento com dissoluções de cloreto sódico é empregado, porque obtém-se melhores caracteríticas da cor e, particularmente, uma maior claridade.

100

90

80

70 45 ºC Peladas 60 L* 55 ºC 50 65 ºC

40 45 ºC Cortadas 55 ºC 30 65 ºC 20 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 X (kg água/ kg sólido seco)

Figura 2. Parâmetro L* em função da umidade, para castañas cortadas e peladas

Agradecimentos

Os autores agradecem a parcial financiação deste trabalho a Xunta de Galicia pelo projeto PGIDIT04TAL265004PR.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Chenlo, F., Moreira, R., Fernandez-Herrero, C., Vázquez, G., 2005. Mass transfer during osmotic dehydration of chestnut using sodium chloride solutions. J. Food Engineering, 73: 164-173. CIE, 1986. Colorimetrie, (2ª Ed). Publication C.I.E. nº 15, 2. (Central Bureau of the Comisión Internacional de L` Eclairage, Viena). Chiralt, A., 2002. II Congreso Español de Ingeniería de Alimentos, Lleida, Espanha. Cambios en las propiedades ópticas durante el procesado de vegetales. Fito, P., Andrés, A., Chiralt, A., Pardo, A., 1996. Coupling of hydrodynamic mechanism and deformation-relaxation phenomena during vacuum treatments in solid porous food-liquid systems. J. Food Engineering, 27: 229-240. Hutchings, J.B., 1999. Food Color and Appearance, Aspen publishers, Inc., Maryland. Míguez, M., 2000. Tese Doutorado. Facultade de Ciências de Ourense. Universidade de Vigo. Moreira, M., Chenlo, F., Chaguri, L., Oliveira, H., 2007. Drying of Chestnuts (Castanea sativa Mill.) after Osmotic Dehydration with Sucrose and Glucose Solutions. Drying Technology (aceito). Panagiotou, N. M., Karathanos, V.T., Maroulis, Z.B., 1998. Mass transfer modelling of the osmotic dehydration of some fruits. Int. Food Science Technology, 33: 267-284. Pinnavaia, G.G, Pizzirani, S., Papotto, E.G., 1995. Studio sulla fattibilitá produttiva di un estruso a base di farina di castagne. Industrie Alimentari. 34(341): 977-987.

162

Sereno, A. M., Moreira, R., Martinez, E., 2001. Mass transfer coefficients during osmotic dehydration of apple in single and combined aqueous solutions of sugar and salt. J. Food Engineering, 47: 43-49. Torreggiani, D., 1993. Osmotic dehydration in fruit and vegetable processing. Food Research International, 26: 59-68.

163

P1.05. ROTA DA CASTANHA – PORTAL DE PROMOÇÃO E DE DIVULGAÇÃO

1Catarina Coelho, 2Rui Nunes, 3Taciana Veríssimo, 4Verónica Alves

1 UTAD, [email protected]; 2 UTAD, [email protected]; 3UTAD, [email protected]; 4 UTAD, [email protected]

RESUMO É em Portugal, mais propriamente em Trás-os-Montes, que se encontra grande quantidade de castanheiros. Este tipo de espécie é um supervivente da crise agrícola dos dias de hoje. Neste artigo é apresentada a metodologia seguida para a criação do portal da rota da castanha. São apresentados alguns portais de rotas existentes sendo efectuada uma análise no que diz respeito às principais funcionalidades de sucesso. Com base nesta análise e nos conteúdos, é apresentada a estrutura do Portal da Rota da Castanha. Finalmente, são apresentados alguns resultados de implementação deste portal de promoção e de divulgação da castanha e do castanheiro.

Palavras-chave: portal web; rota da castanha; conteúdos multimédia; design.

1. INTRODUÇÃO

A internet é um meio que se expandiu de forma prodigiosa, tanto a nível tecnológico, como a nível de utilizadores. Assim, cada vez mais as pessoas quando precisam de qualquer informação, o primeiro sítio que procuram são a internet, sendo esta a razão pela qual é importante criar um portal para divulgar a Rota da Castanha. Mais de 85% da área de castanheiro em Portugal está hoje localizada em Trás-os- Montes, sendo a espécie base de um importante sistema agro-florestal na Europa Mediterrânica, e a principal fonte de rendimento em muitas localidades do Interior Norte e Centro de Portugal e Espanha, onde pode ser considerado uma cultura sobrevivente à actual crise do sector agrícola. A Rota da Castanha é um projecto que tem como objectivos essenciais a promoção, a valorização da castanha, do castanheiro e da castanhicultura. O portal da Rota da Castanha insere-se neste projecto, e tem como objectivo principal a divulgação de toda a informação susceptível de despertar interesse e curiosidade aos turistas que possam visitar as regiões abrangidas. Pretende-se que a informação seja a mais atractiva convidando o visitante a descobrir as bem feitorias da castanha e levando a satisfazer os seus cinco sentidos. Desta forma, neste artigo são apresentados alguns portais de rotas já existentes sendo retiradas algumas conclusões da análise desses mesmos portais. Finalmente, é apresentado o design e estrutura do portal da Rota da Castanha.

164

2. METODOLOGIA

De forma a definir a estrutura do portal da Rota da Castanha e uma vez que este possui características comuns a portais existentes na Web, foi efectuado um levantamento de alguns portais de rotas, assim como das suas características. Seguidamente com base na analise efectuada foram definidos alguns critérios de sucesso que levaram à definição da estrutura do portal da Rota da Castanha.

2.1. Alguns Portais Existentes Nesta secção, apresentamos um levantamento de Portais de Rotas de diversos temas, onde identificamos as suas semelhanças, diferenças e até o que consideramos relevante para a construção de um Portal deste nível. Os Portais seleccionados foram os seguintes: [1] Rota da Luz – Apresenta proposta de visitas turísticas, rotas gastronómicas, castanheiros, artesanato, notícias da região, etc. Existe uma galeria com os vários monumentos, castanheiros acompanhada de um texto descritivo (localização geográfica etc.) dos mesmos conteúdos. [2] Rota da Água – Apresenta vários tipos de rotas no rio Douro, de um ou mais dias, sugere alguns locais para alojamento, tem um mapa da região abrangida por esta rota. [3] Rota do Porto – Apresenta quatro circuitos que se podem fazer, cada um dos circuitos tem todos os locais de interesse, tendo a possibilidade de personalizar cada um dos circuitos. [4] Rota do Vinho do Ribatejo – Apresenta uma descrição do Ribatejo e do vinho com uma sequência de fotos. Mostra um percurso em que podemos escolher várias rotas predefinidas e um mapa onde vemos a região, permite também ao utilizador criar a sua própria rota e os locais a visitar. Há a possibilidade de seleccionar a língua em que o site se apresenta, ou inglês ou português. Estes Portais foram escolhidos por serem simples, concisos, de design simples, atractivo e agradável à vista do utilizador, possuem várias rotas predefinidas e o utilizador pode escolher o idioma em que toda a informação será apresentada.

2.2. Critérios de Sucesso Numa primeira abordagem para a análise de cada um dos portais pesquisados, verificamos a sua apresentação geral, ou seja, analisamos se o portal é multilingue para que

165 possa atingir um maior número de pessoas, se tem um grafismo agradável e se é suficientemente interactivo para o utilizador se dedicar à exploração do portal. Nesta fase verificamos: (i) Se os portais permitem que as pessoas com necessidades especiais usufruam de todas as funcionalidades; (ii) Se a navegabilidade é intuitiva; (iii) Se existe uniformidade no portal, no que respeita à apresentação; Finalmente, foram analisados os conteúdos de cada portal verificando o nível de interesse do tema e a qualidade da informação. Para uma avaliação mais concisa dos portais consultados, foi elaborada uma escala numérica, esta está compreendida entre zero e cinco, com as seguintes correspondências:

1- Insatisfatório; 2- Satisfatório; 3- Bom; 4- Muito Bom; 5- Excelente.

Critérios Apresentação Geral Estrutura Conteúdos Ranking Portais Rota do Porto 5 4 5 14 Rota da Luz 4 4 5 13 Rota do Vinho do Ribatejo 4 4 4 12 Rota da Agua 4 3 3 10

Tabela 1 – classificação dos critérios nos diferentes portais

Após a análise dos portais estudados, destacaram-se as seguintes características que segundo a nossa opinião garantem o sucesso do Portal: - organização dos conteúdos, ou seja, se estão contextualizados no tema e se têm interesse; - simplicidade do design, uniformidade das páginas, apresentação no geral no que respeita a cores, à informação e disposição da mesma de modo a que haja uma navegabilidade intuitiva. - detalhes dos percursos das rotas de modo a que o utilizador esteja sempre situado geograficamente; - informação sobre alojamento, contactos e locais de compra dos produtos regionais; - contextualização histórica do local da rota e uma breve apresentação de alguns produtos regionais, sempre acompanhado de uma boa imagem; - opção para multi-idiomas, em que a sua ordem de prioridade deve ser: português, inglês, espanhol, italiano e francês; - um motor de pesquisa para se poder encontrar conteúdos mais facilmente; - dar a possibilidade de definir rotas personalizadas (ex. portal rota da água[2]). - mapa do site, permitindo ao utilizador conhecer a estrutura do portal; - possibilidade do utilizador colocar/enviar a sua opinião para o melhoramento do portal e até dos seus conteúdos;

166

2.3. Definição da estrutura

Neste projecto pretendemos promover a castanha, tanto nos aspectos da sua produção como dos seus fins turísticos, promovendo uma imagem que transmita junto dos consumidores e turistas a ideia de uma antiga tradição popular, cultural e gastronómica. Desta forma, o Portal desfruta de um formato de um roteiro (mapa), que incluirá diferentes pontos geográficos de interesse turístico tais como aldeias, museus, pontos de venda etc. Para uma melhor organização da informação disponibilizada aos utilizadores, o portal está estruturado em 6 principais temas: • Rota – diz respeito a rotas gastronómicas, rota dos Castanheiros Monumentais e rotas paisagísticas; • Castanheiro - inclui fotos de Castanheiros Monumentais, uma breve história dos Castanheiros dos seus derivados e possíveis aproveitamentos; • Castanha - possui conteúdos relativos à história, dos seus derivados e possíveis aproveitamentos; • Culinária – inclui uma série de receitas típicas, desde entradas, sopas, pratos de carne, etc.; • Feiras/Festas – contém um calendário anual de feiras e festas da região; • Parceiros – possui informação de todos os parceiros do projecto e respectivos links.

4. RESULTADOS

Quando um visitante acede ao portal é-lhe apresentada uma animação que simboliza a passagem do ouriço fechado para o ouriço aberto (figura 1), indicando a entrada no portal.

Figura 1 – Animação de abertura do portal da Rota da Castanha

O logótipo, que podemos observar na figura 2, foi criado para simbolizar a Rota da Castanha, o mesmo foi integrado no portal servindo de base para uma animação situada no cabeçalho da página principal do portal. (figura 3). Esta página é caracterizada pela existência do mapa da região, onde se insere a Rota da Castanha. As castanhas simbolizam os principais pontos de interesse a partir das quais são

167 desenhadas as rotas. Permitindo ainda aceder à informação de interesse turístico como alojamento, monumentos etc.

Figura 2 – Logótipo da Rota da Castanha Figura 3 – Página principal do portal da Rota da Castanha

Do lado esquerdo do mapa é facultado um texto explicativo sobre o conteúdo do portal. Como podemos observar na figura 3 foram utilizados ouriços como botões de menu, que se encontram abertos quando a página temática está a ser visitada. A titulo de exemplo, são apresentadas nas figuras 4 e 5 duas páginas temáticas, alusivas à culinária e a Feiras/Festas. Estas são concebidas dissociando a forma de apresentação do conteúdo, garantindo desta forma a uniformidade da apresentação visual e as futuras actualizações e/ou evoluções.

Figura 4 – Exemplo de páginas temáticas- receitas Figura 5 – Exemplo de páginas temáticas- feiras/festas

As tecnologias utilizadas no desenvolvimento deste projecto foram o Macromedia Flash 8, Adobe Photoshop CS2, Macromedia Dreamweaver 8.

Agradecimentos

Agradecemos o apoio e a ajuda que nos foi prestada pela Profª. Paula Oliveira e Prof. João Paulo Moura, que nos acompanharam e criticaram, de modo a atingirmos os objectivos

168 propostos, para realização do artigo. Igualmente agradece-mos ao Prof. José Carlos Laranjo, por nos ter incentivado a participar no II Congresso Ibérico do Castanheiro.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] Rota da Luz região de turismo – http://www.rotadaluz.pt/index.php?ID=20 [2] Rotas de água – http://www.rotasdeagua.com/ [3] Rotas – http://www.cm-porto.pt [4] Rotas do Vinho do Ribatejo – www.rotavinhoribatejo.pt [5] Slevin, J. (2000), Internet e Sociedade, Temas e Debates

169

P1.06. INORDE (INSTITUTO OURENSÁN DE DESENVOLVEMENTO ECONÓMICO)

González, J. M. R.

INORDE, R. Progreso nº 28; CP.: 32003 – Ourense; [email protected].

O inorde, é un organismo autónomo dependente da deputación de ourense. dende a súa creación en 1987 por acordo do pleno da deputación, procura o desenvolvemento económico desta provincia en tódolos ámbitos.

O obxectivo deste organismo é ofrecer ós protagonistas da aventura empresarial, asistencia e información sobre todos aqueles temas que lle poidan interesar, información de axudas e subvencións e a posibilidade de utilizar unha base documental propia, así como a conexión coas bases temáticas máis importantes, de forma que se lle ofrece ó empresario a información necesaria para canalizar inversións e axudas ós seus proxectos inversores da mellor maneira posible.

Ademais o inorde, xunto co patronato provincial de turismo, colabora coas empresas ourensás na promoción e divulgación dos seus productos, a través da participación en feiras, a organizando viaxes técnicas, e a elaboración de material promocional propio.

Amáis do tecido industrial, o inorde tamén informa de todas aquelas axudas, tanto da administración central como da autonómica e da súa tramitación.

O inorde posúe unha oficina técnica de cooperación transfronteriza, dende a que se coordinan as relacións cos socios de proxectos, e se establecen novas liñas de cooperación. tamén se elaboran proxectos para novas candidaturas e se coordinan e gestionan os proxectos xa aprovados.

O inorde posúe tamén unha liña propia de axudas: para a compra de solo empresarial.

O instituto do campo, é un servicio do inorde para prestar axuda técnica de calidad aos agricultores que permita o deselvolvemento do sector primario. actualmente, conta con fincas de ensaio nas que se realizan estudios sobre cultivos máis representativos da provincia de ourense; un laboratorio no que se fan análisis xerais e específicos da terra; unha biblioteca especializada en temas agrarios; ademáis de contar con proxectos propios de investigación. outras das súas funcións é a participación en feiras especilizadas, cun stand propio no que se mostra unha selección de novos e tradicionais cultivos.

O proxecto europeo castaña, seta e olivo, encádrase dentro da inicitiva comunitaria interreg iii a, e parte da valorización do territorio en base ós recursos endóxenos como é a castaña.

170

Neste “proxecto castaña, seta e olivo” participan os concellos da mancomunidade conso- frieiras: vilariño de conso, a gudiña, a mezquita, riós; e vilardevós.

Os obxectivos que se pretenden son:

- a xestión integral e multisectorial do cultivo do castiñeiro. creación de bancales de olivo.

- impulsar a investigación e a transferencia tecnolóxica.

- xenerar un importante valor engadido a través de procesos de transformación e comercialización.

- favorecer un desenvolvemento rural sostible, respetuoso co medio ambiente.

Con estas actuacións combateuse ó minifundismo, dando como resultado a agrupación de 578 parcelas de diferentes propietarios, que se traducen en 14 parcelas de entre 12 e 30 héctareas que suman un total de 218 hectáreas, con 26.000 árbores prantados no ano 2006.

Para o ano 2007 tense previsto a plantación de 100 hectáreas máis, sendo fundamental a implicación deste gran número de agricultores, dado a viabilidade do proxecto.

Asi, si se consegue unha producción importante de castaña cuns parámetros uniformes, esta será máis competitiva nos diferentes mercados, o que xenerará máis riqueza, que repercutirá directamente no incremento da investigación e no mantemento das brigadas encargadas de cuidalos soutos.

O proxecto castaña está levando a cabo as seguintes construccións:

- centro de interpretación da oliveira en vilardevós.

- centro da interpretación da seta en vilariño de conso.

- base das brigadas en a gudiña.

- centro tecnolóxico da castaña en riós

12 fincas de ensaio

171

Biologia, Fisiologia, Genética / Biología, Fisiología, Genética

P2.01. GENOTIPAGEM DE HÍBRIDOS F1 ENTRE C. sativa x C. crenata E C. sativa x C. mollissima ATRAVÉS DE MICROSSATÉLITES NUCLEARES

Batista, D.1*, Valdiviesso, T.1, Santos, L.1, Paulo, O.2, Gomes-Laranjo, J.3, Costa, R.1

1 Laboratório de Biologia Molecular, Estação Florestal Nacional, Quinta do Marquês, Av. República. 2780-159 Oeiras – PORTUGAL; 2 Departamento de Biologia Animal, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Campo Grande, 1749-016 Lisboa, PORTUGAL; 3 CETAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apt 1013. 5001-801 Vila Real, PORTUGAL * [email protected]

Apesar das medidas tomadas nos últimos anos, a doença da tinta e do cancro continuam a constituir uma grave ameaça à sustentabilidade da cultura do castanheiro em Portugal. Os programas de melhoramento contribuem de forma determinante para o delineamento de estratégias de produção efectivas, não só com o desenvolvimento de genótipos de elevada qualidade, resistentes a doenças, mas também com directrizes para a plantação e o emprego de técnicas culturais adequadas. Estes são ganhos que se repercutem naturalmente num aumento significativo de produção com grandes benefícios para a economia das regiões produtoras. O presente trabalho descreve os primeiros passos para o estabelecimento de um programa de melhoramento centrado na criação de genótipos de castanheiro resistentes à doença da tinta e ao cancro, pela introgressão de genes de resistência de espécies asiáticas (Castanea crenata e C. mollissima) no castanheiro europeu (Castanea sativa). Como resultado de polinizações controladas entre C. sativa x C. crenata e C. sativa x C. mollissima, realizadas no campo de germoplasma da UTAD, em 2006, foram obtidas com sucesso duas populações híbridas (F1) exibindo taxas de germinação significativamente elevadas (90% e 50%, respectivamente). Germinantes com 4 meses de idade, perfazendo um total de 59 e 41 indivíduos de cada cruzamento foram genotipados para 10 SSR loci, com microssatélites nucleares desenvolvidos para Castanea sativa, Quercus robur e Quercus petraea (Buck et al., 2003, Marinoni et al., 2003, Steinkellner et al., 1997 e Kampfer et al., 1998). Em conjunto com os dados dos progenitores e de clones de castanheiro, conhecidos como tolerantes ou sensíveis, avaliou-se a taxa de segregação de alelos e a estrutura genética da família, cujos resultados serão apresentados e discutidos nesta comunicação.

Este trabalho está a ser financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (BPD/20972/2004)

172

Palavras chave: Cruzamentos controlados, híbridos, segregação de alelos, microssatélites, Castanea sativa

173

P2.02. ÁMBITOS FACTORIALES DE ALTA VIABILIDAD FITOCLIMÁTICA DEL CASTAÑO (Castanea sativa Mill.) EN ESPAÑA

J.M. García-López1& C. Allué Camacho2

1.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected] 2.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected]

RESUMEN

Se establecen ámbitos factoriales de alta viabilidad fitoclimática para Castanea sativa Mill. en España. El sistema fitoclimático utilizado fue el de Allué-Andrade modificado, aplicado a la base de información factorial y fitoclimática extraída de 898 puntos de muestreo, procedentes del II Inventario Forestal Nacional con presencia de Castanea sativa como especie dominante de la formación forestal. Mediante la exigencia de valores crecientes del índice de idoneidad fitoclimática se obtuvieron varios ámbitos factoriales de creciente viabilidad fitoclimática para los castañares españoles. Se destaca que las idoneidades fitoclimáticas crecientes van seleccionando, dentro del ámbito autoecológico de la especie, aquellas estaciones de castañar con aridez presente (preferentemente entre 1,5 y 3,5 meses de duración), menores precipitaciones tanto anuales como estivales y mayores termicidades (HS prácticamente inexistente y valores de TMF altos).

Palabras clave: Fitoclimatología, castaño, Castanea, envolvente convexa, idoneidad,

1. INTRODUCCIÓN

Los castañares son formaciones propias de la región mediterránea septentrional, con algunas manifestaciones menores en centroeuropa, en el norte de África y en el Cáucaso. En España existen cerca de 84.000 ha atribuibles a esta especie, según datos del II Inventario Forestal Nacional. Pueden destacarse 4 núcleos principales de distribución (Ruiz de la Torre, 2006): El primero centrado en el noroeste y litoral cantábrico, desde Galicia a Navarra, el segundo en Cataluña (Barcelona y Gerona), el tercero en el centro-oeste (Valle del Tiétar, Gredos, Peña de Francia, suroeste de Madrid, etc…) y el cuarto en Andalucía (Sierras de Ronda, Aracena, Sierra Nevada y Sierra Morena).

174

A pesar de ser relativamente abundantes los trabajos en los que se mencionan aspectos ecológicos sobre Castanea sativa, la faceta fitoclimática ha sido tradicionalmente muy poco estudiada. Los estudios más completos existentes hasta el momento para todo el territorio nacional son los de Gandullo et al. (2004), basados en 182 parcelas. En el presente trabajo se pretende avanzar en el conocimiento fitoclimático de los castañares españoles mediante el establecimiento de ámbitos fitoclimáticos de alta viabilidad.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

A partir de la base de datos de parcelas de muestreo correspondientes al II Inventario Forestal Nacional (DGCONA, 1986-1995), se seleccionaron 898 puntos con presencia natural de Castanea sativa como especie principal de la formación forestal. La selección de parcelas se hizo mediante la utilidad informática BASIFOR (Del Río et al., 2001) segregando aquellos registros con presencia natural del castaño como primera especie dominante de la formación. En la figura 1 puede observarse la distribución de los 898 puntos de muestreo utilizados.

Figura 1. Situación de los 898 puntos del II IFN con presencia de Castanea sativa Mill. como especie principal de la formación vegetal

El sistema fitoclimático utilizado es el basado en los modelos de Allué-Andrade (1990 y 1997) modificado por García-López & Allué Camacho (2003). Este sistema fitoclimático fue el elegido para la realización del presente estudio al ser en la actualidad el único sistema fitoclimático de carácter cuantitativo, es decir, que no sólo permite la adscripción meramente cualitativa de una estación a una categoría fitoclimática previamente definida, sino que permite además una cuantificación del nivel de adecuación de la estación a dicha categoría o tipo fitoclimático y también al resto de tipos del sistema, mediante la utilización de “coordenadas de posición” y de “distancias fitoclimáticas” relativas entre sí y referidas a ámbitos fitoclimáticos

175 factoriales correspondientes a las principales estrategias de vida vegetal de las cubiertas forestales dominantes basadas en los tipos vitales de Walter & Lieth (1960). Todo ello permite algo importante en este estudio, como es la cuantificación numérica del grado de potencialidad fitoclimática de un territorio para albergar castañares. Los 898 puntos de castañar fueron identificados por sus coordenadas UTM (Huso 30) y su altitud, y se trataron con el programa informático FITOCLIMOAL’2000 (García-López & Allué Camacho, 2000) para la obtención de los datos mensuales brutos de temperatura y precipitación conforme a los modelos de Sánchez Palomares et al. (1999). Posteriormente, con el mismo programa fueron hallados los factores fitoclimáticos de la tabla 1

Tabla 1. Factores fitoclimáticos utilizados ABREVIATURA FACTOR UNIDAD Intensidad de la aridez. Se calcula por el cociente As/Ah, siendo Ah el área húmeda de climodiagrama (curva de Pi K por encima de la de Ti, es decir 2TiPi). Duración de la aridez, en el sentido de GAUSSEN, es A decir, el número de meses en que la curva de Ti se sitúa meses por encima de la de Pi, es decir cuando 2Ti>Pi. P Precipitación anual total mm. Precipitación estival mínima (Junio, Julio, Agosto o PE mm. Septiembre) TMF Temperatura media mensual más baja ºC T Temperatura media anual ºC TMC Temperatura media mensual más alta ºC Temperatura media de las mínimas del mes de TMMF ºC temperatura media más baja Temperatura media de las máximas del mes de TMMC ºC temperatura media más alta Helada segura. Calculada como nº de meses en que HS meses Ti>=4ºC Periodo de actividad vegetal libre, calculada como el PV número de meses en que Ti>=7,5ºC excluidos los periodos meses con A>0 OSC Oscilación térmica. Se calcula como TMC-TMF ºC

La metodología aplicada en este estudio se basó en la selección de valores máximos y mínimos de los factores fitoclimáticos de las estaciones estudiadas que cumplieran la restricción

176 de tener un índice de idoneidad superior a un límite establecido. A los efectos de este trabajo se entiende por “idoneidad fitoclimática” (Allué Camacho, 1996) el grado de adecuación de un lugar para acoger a determinados taxones o sintaxones, todo ello desde el punto de vista mixto de su perdurabilidad (capacidad de autoregeneración), de su competitividad con otras especies y resistencia a enfermedades. Esta metodología ha sido ya empleada por nosotros para la determinación de ámbitos de alta viabilidad fitroclimática para otras especies forestales, como es el caso de Fagus sylvatica en la Península Ibérica (García-López et al., 2005).

3. RESULTADOS

En la tabla 3 se exponen los resultados obtenidos después de aplicar un filtrado de idoneidades para los puntos de corte 0,50 y 0,65.

Tabla 2. Ámbitos fitoclimáticos factoriales de alta viabilidad del castañar en España en función del Índice de Idoneidad Fitoclimática Idoneidad Estaciones K A P PE T TMF 0,254 3,82 2403 111 16,6 10,2 Total 898 0 0 632 2 8,8 1,5 0,254 3,82 2403 111 16,6 10,2 Id<=50) 244 0 0 720 2 8,8 1,5 0,244 3,77 2110 106 16,3 9,9 Id>0,50 654 0 0 632 2 9,3 2,3 0,212 3,59 1465 44 15,8 9,3 >0,65 90 0 0,14 666 2 11,9 3,8 Idoneidad Estaciones TMC TMMF TMMC HS PV OSC 26,7 6 32,2 3,5 12 20,3 Total 898 15,9 -2,1 20,2 0 4,2 8,9 26,7 6 32,2 3,5 12 18,7 <=50 244 15,9 -2,1 20,2 0 4,2 8,9 25,8 5,8 31,5 2,8 12 20,3 >0,50 654 16,5 -1,4 20,7 0 4,4 9,2 25,3 5,2 30,8 0,3 11,6 19,2 >0,65 90 18,2 0 22,7 0 5,7 10,9

Como puede comprobarse en la tabla 3, las idoneidades fitoclimáticas crecientes van seleccionando aquellas estaciones de castañar con aridez presente, menores precipitaciones

177 tanto anuales como estivales y mayores termicidades (HS prácticamente inexistente y valores de TMF altos).

4. DISCUSION

La consideración de factores fitoclimáticos territorializados, correspondientes a un número muy importante de estaciones de castañar, combinado con un criterio de filtrado de carácter integrado como el Índice de Idoneidad ha permitido el establecimiento de ámbitos factoriales de existencia más completos y matizados que los hasta ahora existentes.

Si se estudian las correlaciones bivariadas de ID con los factores fitoclimáticos utilizados, cuantificadas mediante el coeficiente de correlación de Pearson, resultan ser los factores A y T los más correlacionados con ID. Todos las correlaciones son significativas al nivel 0,01.

Tabla 3. Análisis de correlaciones bivariadas entre el Índice de Idoneidad Fitoclimática y los factores fitoclimáticos utilizados para las 898 parcelas de castañar estudiados. Se incluye el coeficiente de correlación de Pearson y los correspondientes niveles de significación K A P PE T TMF Correlación Pearson 0,462586 0,646350 -0,200827 -0,547594 0,654284 0,500090 Sig. (bilateral) 1,03E-48 4,0E-107 1,32E-09 3,04E-71 9,6E-125 7,15E-58 TMC TMMF TMMC HS PV OSC Correlación Pearson 0,622861 0,498445 0,62709 -0,334887 0,111310 0,390891 Sig. (bilateral) 5,8E-110 1,90E-57 4,2E-99 6,38E-25 0,0008 4,38E-34

La identificación de las máximas idoneidades del castañar con situaciones con aridez presente parece corroborarse mediante la consideración de las idoneidades medias en intervalos de amplitud 0,25 meses del factor A. Como puede comprobarse en la tabla 4 y su correspondiente representación gráfica de la figura 3, la idoneidad fitoclimática media del castañar aumenta gradualmente conforme aumentan los valores de A desde los límites mínimos de su ámbito de existencia (A=0), alcanzando el máximo en valores de A entre 3 y 3,5 meses, experimentando una abrupta caída por debajo de 3,5 meses de duración aproximadamente.

178

Tabla 4. Idoneidades medias (ID) correspondientes a las distintos intervalos de valores correspondientes al factor A para los 898 puntos de castañar analizados. Dst: Desviación estandar de ID A (meses) 0 0-0,25 0,25-0,50 0,50-0,75 0,75-1 1-1,25 1,25-1,50 1,50-1,75 ID 50,3 52,3 56,1 56,8 55,6 55,9 56,8 59,5 Dst 3,9 4,9 4,7 4,6 4,7 3,7 3,8 2,9 A (meses) 1,75-2 2-2,25 2,25-2,5 2,5-2,75 2,75-3 3-3,25 3,25-3,50 >3,50 ID 64,1 65,1 65,3 65,8 62,1 64,9 66,7 56,5 Dst 2,7 1,4 1,3 2,3 3,3 3,6 2,4 8,9

80

70

60

50

40

30

20

10

0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Figura 3. Idoneidad Fitoclimática media (x10) del castañar en función de la duración de la Aridez (A, meses)

Para las estaciones de castañar estudiadas puede estimarse el Índice de Idoneidad Fitoclimática de forma aproximada y para los límites factoriales de la tabla 2 mediante la expresión:

ID= -0,61133+0,08522*A-0,0202*A2+0,15847*T-0,00532*T2 R=0,87

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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179 bases de datos del Segundo Inventario Forestal Nacional. III Congreso Forestal Español, Granada. 3: 49-54. DGCONA (1986-1995): Segundo Inventario Forestal Nacional. Ministerio de Medio Ambiente. Madrid. Gandullo, J.M., Blanco, A., Sánchez, O., Rubio, A., Elena, R. & Gómez, V., 2004. Las estaciones ecológicas de los castañares españoles. Monografías INIA. Serie Forestal nº 7. 224 pp. INIA. Madrid. García-López, J.M. & Allué Camacho, C., 2000. FITOCLIMOAL’2000, un programa para la diagnosis, homologación y estudio de dinámicas e idoneidades fitoclimáticas. Montes 67: 9-18. García-López, J.M. & Allué Camacho, C., 2003. Aplicación de la teoría de la envolvente convexa a la mejora del sistema fitoclimático Allué-Andrade. Ecología 17: 329-343. García-López, J.M.; Allué Camacho, C. & Gonzalo Jiménez, J., 2005. Caracterización y potencialidades de los hayedos (Fagus sylvatica L.) en la Península Ibérica. Actas IV Congreso Forestal Español. Zaragoza, 26-30 de septiembre de 2005. Ruiz de la Torre, J., 2006. Flora Mayor. Organismo Autónomo Parques Nacionales. Dirección General para la Biodiversidad. Ministerio de Medio Ambiente. 1756 pp. Madrid. Sánchez Palomares, O., Sánchez Serrano, F. & Carretero Carrero, M.P. , 1999. Modelos y cartografía de estimaciones climáticas termopluviométricas para la España peninsular. Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Madrid. 192 pp. Walter, H. & Lieth, H., 1960. Klimadiagramm Welt atlas. Fisher. Viena.

180

P2.03. ENSAYO DE CARTOGRAFÍA DE ÁREAS POTENCIALES FITOCLIMÁTICAS PARA LOS CASTAÑARES (Castanea sativa Mill.) EN ESPAÑA

J.M. García-López1; & C. Allué Camacho2

1.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected] 2.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected]

RESUMEN

Se establece un avance de cartografía de áreas fitoclimáticas de alta viabilidad para los castañares españoles. La caracterización fitoclimática se efectuó a partir del estudio de 898 parcelas de muestreo procedentes del II Inventario Forestal Nacional con presencia de Castanea sativa como especie dominante de la formación forestal. El sistema fitoclimático utilizado fue el de Allué-Andrade modificado, que se aplicó a un modelo factorial previo construido mediante variables regionalizadas sobre un modelo digital de elevaciones. Se aplicaron 4 niveles de filtrado de exigencia creciente a la base de datos territorial, las dos primeras aproximaciones de carácter factorial, de las que destaca la utilización del método de la envolvente convexa, y las dos últimas de carácter fitoclimático basadas en comparación de ternas de subtipos fitoclimáticos e índice de idoneidad. El área potencial de máxima adecuación fitoclimática después de aplicada la restricción más exigente engloba 49.228 cuadrículas UTM de 1x1 km.

Palabras clave: Fitoclimatología, castaño, Castanea, potencialidad, cartografía

1. INTRODUCCIÓN

Los castañares son formaciones propias de la región mediterránea septentrional, con algunas manifestaciones menores en centroeuropa, en el norte de África y en el Cáucaso. En España existen cerca de 84.000 ha atribuibles a esta especie, según datos del II Inventario Forestal Nacional. Pueden destacarse 4 núcleos principales de distribución (Ruiz de la Torre, 2006): El primero centrado en el noroeste y litoral cantábrico, desde Galicia a Navarra, el segundo en Cataluña (Barcelona y Gerona), el tercero en el centro-oeste (Valle del Tiétar, Gredos, Peña de Francia, suroeste de Madrid, etc…) y el cuarto en Andalucía (Sierras de Ronda, Aracena, Sierra Nevada y Sierra Morena). A pesar de ser relativamente abundantes los trabajos en los que se mencionan aspectos ecológicos sobre Castanea sativa, la faceta fitoclimática ha sido tradicionalmente muy poco estudiada. Los estudios más completos existentes hasta el momento para todo el territorio nacional son los de Gandullo et al. (2004), basados en 182 parcelas. En el presente trabajo se

181 pretende avanzar en el conocimiento fitoclimático de los castañares españoles mediante la aplicación de una metodología que permita una extensión territorial de los resultados más amplia posible en forma de cartografía de áreas fitoclimáticas potenciales y de alta viabilidad.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

A partir de la base de datos de parcelas de muestreo correspondientes al II Inventario Forestal Nacional (DGCONA, 1986-1995), se seleccionaron 898 puntos con presencia natural de Castanea sativa como especie principal de la formación forestal. La selección de parcelas se hizo mediante la utilidad informática BASIFOR (Del Río et al., 2001) segregando aquellos registros con presencia natural del castaño como primera especie dominante de la formación. En la figura 1 puede observarse la distribución de los 898 puntos de muestreo utilizados.

Figura 1. Situación de los 898 puntos del II IFN con presencia de Castanea sativa Mill. como especie principal de la formación vegetal

El sistema fitoclimático utilizado es el basado en los modelos de Allué-Andrade (1990 y 1997) modificado por García-López & Allué Camacho (2003). Este sistema fitoclimático fue el elegido para la realización del presente estudio al ser en la actualidad el único sistema fitoclimático de carácter cuantitativo, es decir, que no sólo permite la adscripción meramente cualitativa de una estación a una categoría fitoclimática previamente definida, sino que permite además una cuantificación del nivel de adecuación de la estación a dicha categoría o tipo fitoclimático y también al resto de tipos del sistema, mediante la utilización de “coordenadas de posición” y de “distancias fitoclimáticas” relativas entre sí y referidas a ámbitos fitoclimáticos factoriales correspondientes a las principales estrategias de vida vegetal de las cubiertas forestales dominantes basadas en los tipos vitales de Walter & Lieth (1960). Todo ello permite algo importante en este estudio, como es la cuantificación numérica del grado de potencialidad fitoclimática de un territorio para albergar castañares.

182

Los 898 puntos de castañar fueron identificados por sus coordenadas UTM (Huso 30) y su altitud, y se trataron con el programa informático FITOCLIMOAL’2000 (García-López & Allué Camacho, 2000) para la obtención de los datos mensuales brutos de temperatura y precipitación conforme a los modelos de Sánchez Palomares et al. (1999). Posteriormente, con el mismo programa fueron hallados los factores fitoclimáticos de la tabla 1.

Tabla 1. Factores fitoclimáticos utilizados ABREVIATURA FACTOR UNIDAD Intensidad de la aridez. Se calcula por el cociente As/Ah, siendo Ah el área húmeda de climodiagrama (curva de Pi por encima de la de Ti, K es decir 2TiPi). Duración de la aridez, en el sentido de GAUSSEN, es decir, el A número de meses en que la curva de Ti se sitúa por encima de la de meses Pi, es decir cuando 2Ti>Pi. P Precipitación anual total mm. PE Precipitación estival mínima (Junio, Julio, Agosto o Septiembre) mm. TMF Temperatura media mensual más baja ºC T Temperatura media anual ºC TMC Temperatura media mensual más alta ºC Temperatura media de las mínimas del mes de temperatura media TMMF ºC más baja Temperatura media de las máximas del mes de temperatura media TMMC ºC más alta HS Helada segura. Nº de meses en que Ti>=4ºC meses Periodo de actividad vegetal libre, calculada como el número de PV meses meses en que Ti>=7,5ºC excluidos los periodos con A>0 OSC Oscilación térmica. Se calcula como TMC-TMF ºC

La metodología aplicada en este estudio se basó en 4 fases o niveles de filtrado consecutivas y de exigencia creciente. Las primeras 2 fases son de carácter factorial, se desarrollan por tanto en hiperespacios factoriales y consisten en la aplicación de un primer filtrado factorial basado en la consideración de situaciones internas o externas al paralepípedo en que se inscribe la nube de puntos o estaciones de castañar de partida, excluyéndose los puntos externos. La segunda fase actúa sobre la base de datos resultante de la fase anterior, y como nivel de exigencia añadida, considera situaciones factoriales internas o externas a una envolvente convexa ceñida a la nube de puntos, excluyéndose los puntos externos. Las 2 fases siguientes son de carácter fitoclimático en lugar de factorial, es decir que se desarrollan en el seno de un hiperespacio fitoclimático en lugar de factorial. La fase 3 consiste en

183 exigir a la base de datos procedente de la fase 2 la coincidencia de ternas de diagnosis fitoclimática con las ternas de la base de datos original de los 898 puntos de muestreo del II IFN, desechándose los puntos con ternas no coincidentes. Las ternas de diagnosis fitoclimáticas basadas en los subtipos de la tabla 2 permiten una aproximación de carácter politético, es decir, de forma conjunta y comparada respecto a todos los subtipos considerados en el sistema fitoclimático. De esta forma, una anotación abreviada del tipo (G; A1; A2; A3; D1; D2) permite definir suficientemente a nuestros efectos un fitoclima mediante la consideración conjunta del subtipo Genuino (G), de sus subtipos análogos (A1, A2 y A3) en orden de escalar de adecuación decreciente y de sus subtipos dispares de escalar de adecuación positivo decreciente D1 y D2. Por último, la fase 4 actúa sobre la base de datos procedente de la fase 3 y desecha aquellos puntos con Índices de Idoneidad Fitoclimática inferiores a 0,50. A los efectos de este trabajo se entiende por “idoneidad fitoclimática” (Allué Camacho, 1996) el grado de adecuación de un lugar para acoger a determinados taxones o sintaxones, todo ello desde el punto de vista mixto de su perdurabilidad (capacidad de autoregeneración), de su competitividad con otras especies y resistencia a enfermedades. Previamente se eliminaron las cuadrículas con sustratos calizos, a excepción de aquellas con P>1000 mm, por estimar que a partir de esta cifra la intensidad del lavado de las bases es tal que permite la existencia del castañar (Ruiz de la Torre, 2006). Los 4 niveles de filtrado anteriores fueron aplicados a una base de datos procedente del modelo digital de elevaciones de la Península Ibérica GTOPO30 del U.S. Geological Survey con una resolución de aproximadamente 1 km de lado, previamente tratado mediante FITOCLIMOAL’2000 para hallar el valor de los factores fitoclimáticos para cada uno de sus puntos. Este modelo consta aproximadamente de 500.000 de puntos geográficos identificados por sus coordenadas y su altitud. Esta metodología ya ha sido utilizada con éxito para otras especies como Juniperus thurifera (García-López & Allué Camacho, 2005), Quercus robur y Quercus petraea (García-López & Allué Camacho, 2006).

3. RESULTADOS

Aplicados los 4 niveles de filtrado factoriales y fitoclimáticos de exigencia creciente explicados anteriormente a la base de datos factorial de aproximadamente 500.000 puntos procedente del MDE GTOPO30, quedaron seleccionadas 59.582 cuadrículas de 1x1 km que representan el área fitoclimática potencial para Castanea sativa en España, cuya representación geográfica se expone en la figura 2. El área potencial se dividió en el cuarto nivel de filtrado en 3 categorías en función del Índice de Idoneidad Fitoclimática (Id): Baja para Id<0,50, Media para 0,50=0,60. El área de alta viabilidad fitoclimática abarca 49.228 cuadrículas.

184

Figura 2. Área fitoclimática potencial del castañar en la Península Ibérica. En negro las 49.228 cuadrículas 1x1km el área de alta viabilidad (Id>=0,60), en gris el área de idoneidad media (0,50

4. DISCUSIÓN

La metodología aplicada en el presente estudio ha permitido avanzar en algunas facetas concretas del conocimiento fitoclimático de los castañares españoles. En concreto, se ha establecido por primera vez un mapa de alta viabilidad fitoclimática potencial de Castanea sativa para todo el territorio nacional, asociado a una base de datos geográfica. La metodología aplicada, basada en sucesivos niveles de creciente exigencia factorial y fitoclimática ha permitido asimismo el establecimiento de una cartografía polivalente, en la que cada estación presenta un nivel de viabilidad propio medida por el índice de idoneidad y por tanto de incertidumbre en la valoración que permite integrarse en procesos de toma de decisiones en materia de gestión forestal de estas formaciones. La importante presencia de áreas de alta idoneidad en los núcleos de distribución catalán, centro-occidental y andaluz parecen confirmar el carácter netamente mediterráneo de estas formaciones, que en el núcleo noroeste obtienen alta viabilidad fitoclimática únicamente en la zonas con aridez presente o bien en aquellas áreas con menor precipitación.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Allué Andrade, J.L., 1990. Atlas fitoclimático de España. Taxonomías. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Instituto Nacional de Investigaciones Agrarias. Madrid. 221 pp. Allué Andrade, J.L., 1997. Tres nuevos modelos para la fitoclimatología forestal: Diagnosis, Idoneidad y Dinámica de fitoclimas. Actas I Congreso Forestal Hispano-Luso. Irati’97. 31-40. Pamplona.

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Allué Camacho, C., 1996. Un modelo para la caracterización fitoclimática de individuos, comunidades y fitologías. El modelo idoneidad y su aplicación a las comunidades pascícolas. Ecología 10: 209-230. Madrid. Del Río, M., Rivas, J., Condes, S., Martínez-Millán, J., Montero, G., Cañellas, I., Ordóñez, C., Pando, V., San Martín, R. & Bravo, F., 2001. BASIFOR: Aplicación Informática para el manejo de bases de datos del Segundo Inventario Forestal Nacional. III Congreso Forestal Español, Granada. 3: 49-54. DGCONA, 1986-1995. Segundo Inventario Forestal Nacional. Ministerio de Medio Ambiente. Madrid. Gandullo, J.M., Blanco, A., Sánchez, O., Rubio, A., Elena, R. & Gómez, V., 2004. Las estaciones ecológicas de los castañares españoles. Monografías INIA. Serie Forestal nº 7. 224 pp. INIA. Madrid. García-López, J.M. & Allué Camacho, C., 2000. FITOCLIMOAL’2000, un programa para la diagnosis, homologación y estudio de dinámicas e idoneidades fitoclimáticas. Montes 67: 9-18. García-López, J.M. & Allué Camacho, C., 2003. Aplicación de la teoría de la envolvente convexa a la mejora del sistema fitoclimático Allué-Andrade. Ecología 17: 329-343. García-López, J.M. & Allué Camacho, C. 2005. Caracterización y potencialidades fitoclimáticas de la sabina albar (Juniperus thurifera L.) en la Península Ibérica. Sistemas y Recursos Forestales 14(1): 98-109. García-López, J.M. & Allué Camacho, C. 2006. Characterization and phytoclimatic potentialities of Quercus petraea (Matt.) Liebl. and Quercus robur L. forests in Spain. Sistemas y Recursos Forestales 15(3): 277-295. Ruiz de la Torre, J., 2006. Flora Mayor. Organismo Autónomo Parques Nacionales. Dirección General para la Biodiversidad. Ministerio de Medio Ambiente. 1756 pp. Madrid. Sánchez Palomares, O., Sánchez Serrano, F. & Carretero Carrero, M.P. , 1999. Modelos y cartografía de estimaciones climáticas termopluviométricas para la España peninsular. Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria. Madrid. 192 pp.

186

P2.04. CARACTERES DE SELECCIÓN DE CLONES DE CASTAÑO HÍBRIDO (Castanea crenata x C. sativa) PARA LA PRODUCCIÓN DE MADERA

1 J. Fernández-López, 1 M.E. Miranda-Fontaiña, 1 P. Furones

1 Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán. Xunta de Galicia.

RESUMEN

Los caracteres a utilizar para realizar selección de materiales de reproducción deben estar sujetos a un control genético significativo y, para la obtención de ganancia simultánea en varios caracteres la correlación genética entre ellos debe ser importante. Además, la selección temprana en un carácter se puede realizar si se ha demostrado previamente la existencia de una correlación juvenil-adulto elevada. Variables relacionadas con el vigor, dominancia apical, rectitud de fustes, supervivencia y brotación se estudiaron en una serie de ensayos clonales con edades comprendidas entre 1 y 13 años. Los valores de heredabilidad de los diferentes caracteres en orden decreciente fue: Fechas de brotación > Altura total > Rectitud > dominancia apical > Supervivencia. La correlación del vigor con calidad de fuste es significativa pero en algunos casos el valor de la correlación es moderada o baja, indicando que es aconsejable realizar selección para cada uno de los caracteres. La correlación juvenil-adulto para crecimiento en altura es muy elevada y se mantiene estable a partir de los 3 o 4 años de edad, por lo que se puede realizar selección temprana por vigor.

Palabras clave: Chestnut, clone, heritability, genetic correlation

1. INTRODUCCION

El castaño crece muy bien en suelos ácidos de áreas del Sur de Europa con escasa sequía estival. Se utiliza en plantaciones orientadas a la producción de madera, de castaña o de doble aptitud madera-castaña. El castaño europeo, Castanea sativa, es muy sensible a Phytophthora sp. por lo que la hibridación inter-especifica de Castanea sativa y C. crenata se ha utilizado entre 1945 y 1960 para la obtención de materiales resistentes a este patógeno (Urquijo, 1957; Vieitez, 1966). Un total de 177 clones procedentes de esas selecciones, conservados en el Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán fueron organizados en un núcleo de propagación , se desarrollaron protocolos de identificación (Fernández-López, Miranda-Fontaiña, Pereira-Lorenzo 1993 y 1995) y de propagación clonal (Miranda-Fontaiña y Fernández-López, 1992 y 2001; Fernández-López, Pereira-Lorenzo y Miranda-Fontiña, 1992). Un cierto número de estos clones se propagan en viveros comerciales para su utilización en repoblaciones forestales en Galicia. El Real Decreto 289/2003 (Anonimous, 2003) que desarrolla en España la aplicación de la Directiva 1999/105/CE, regula la comercialización de los materiales forestales de reproducción de castaño híbrido y establece que los materiales de reproducción, cuando se multipliquen

187 vegetativamente a partir de material de base clonal procedente de selección individual, solo podrán comercializarse si han sido autorizados como materiales de base de las categorías cualificado o controlados. En consecuencia debe demostrarse la superioridad fenotípica o genética en plantaciones o ensayos con el objetivo de seleccionar clones por caracteres relevantes para la producción de madera, adaptación y caracteres de la castaña si se considera la doble aptitud como finalidad. Los caracteres de selección de materiales de reproducción de castaño para la producción de madera tienen como objetivo mejorar vigor, rectitud de los troncos y dominancia apical, ramosidad, formación de duramen, presencia de acebolladura y valor estético de la madera. Los caracteres a utilizar en selección deben ser relevantes para la finalidad de la selección y estar sujetos a un control genético significativo. Además, en el caso de utilizar selecciones tempranas, debe demostrarse la correlación juvenil-adulto en los caracteres de selección. La red de ensayos clonales establecida por el Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán en Galicia ha sido utilizada para describir: i) el control genético del vigor, de caracteres relacionados con la calidad de los fustes y de caracteres adaptativos como supervivencia y fenología de la brotación, ii) la correlación entre diferentes caracteres de selección y iii) la correlación juvenil adulto en caracteres de vigor.

2. MATERIALES Y METODOS

Los clones incluidos en la red de ensayos son híbridos de C. crenata x C. sativa de diferentes clases genealógicas (F1 a F3). Se analizaron 21 ensayos clonales, de los cuales seis fueron propagados por acodo, siete fueron propagados por micropropagación y diez por estaquillado semileñoso. Gran parte de los ensayos están situados en la Galicia Atlántica en condiciones de elevada pluviometria y escasa o nula sequía estival, así como reducido peligro de heladas de primavera. Solo dos ensayos situados en el interior de Galicia, están en condiciones de sequía estival de hasta 3 meses. Los ensayos tienen un diseño de bloques completos al azar, con un número de clones que varía entre 9 y 80 clones por parcela, siendo el número medio de clones por parcela 35. El tamaño de la parcela elemental y el número de bloques en cada ensayo varían: 16 parcelas son parcelas mono-arbol con un número de bloques que varía entre 10 y 40, mientras que cuatro parcelas tienen entre 5 y 10 árboles por parcela elemental y tres bloques. Las variables registradas fueron la altura total y el diámetro normal o bien el diámetro en el cuello de la raíz, la dominancia apical (es el número de ramas que compiten con el fuste), la rectitud del fuste, registrada como variable categórica (1=recto, 2=arqueado con un curva, 3= sinuoso con dos o mas curvas), la supervivencia registrada como variable binaria (0=muerta, 1= viva) y las fechas de brotación, variable categórica registrada utilizando una escala de ocho estadios.

188

Para estudiar el control genético de cada uno de los caracteres se analizó cada uno de los ensayos con el modelo siguiente:

Xijk = μ + Ci + Bj + εk(ij)

Donde C es el factor Clon (i es el número de clones incluidos en un ensayo), B es el factor Bloque (j es el número de bloques) y ε es el error experimental que incluye la variación entre ramet del mismo clon. Para el análisis de varianza y cálculo de componentes de la varianza se aplicó la opción RANDOM de GLM de SAS y se consideró aleatorio el factor clon. Si los resultados del ANOVA indican que hay diferencias significativas entre clones se calculan los componentes de 2 la varianza y se estima la heredabilidad clonal (H C) como:

2 2 σ C H C = 2 ⎛ 2 σ e ⎞ ⎜ σ C + ⎟ ⎝ k1 ⎠

2 2 Donde σ C, es la varianza entre clones y σ e es la varianza dentro de clones. Las correlaciones fenotípicas de Pearson se calcularon para estudiar el grado de relación entre diferentes variables dentro del mismo ensayo y para estudiar el grado de relación entre diferentes ensayos.Las correlaciones genéticas tipo A fueron estimadas para estudiar la correlación de diferentes variables medidas en el mismo ensayo y en la misma planta. La correlación genética entre dos caracteres (x e y) (rgAxy) se obtiene dividiendo la covarianza genética (Cov gxy) por el producto de las desviaciones genéticas estándar:

Covg xy r = gAxy 2 2 1/ 2 ()σ gx σ g y Un caso concreto de la correlación genética es la correlación juvenil-adulto muy importante para realizar selección temprana y obtener resultados fiables con ensayos jóvenes. Los valores elevados de correlación genética juvenil-adulto, por ejemplo los valores superiores a 0,70 indican que los errores cometidos en la selección temprana para obtener ganancias a la edad del turno son reducidas. En el caso de los ensayos clonales se han estudiado las correlaciones entre la variable evaluada a la edad mas avanzada y la misma variable a la edad 1, 3, etc. años.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Entre las variables analizadas la sujeta a mayor control genético es la brotación seguida de la altura total, rectitud, dominancia apical y finalmente la supervivencia. La clasificación de las variables por su control genético para el conjunto de los ANOVAS de todas las parcelas a diferentes edades es (entre paréntesis el valor medio de la heredabilidad clonal de los 20 ensayos): Brotación (0,73) > Altura(0,65)> Rectitud (0,54) > Dominancia apical (0,45) >

189

Supervivencia (0,39). Las evaluaciones de altura en los ensayos juveniles realizados en vivero presentaron heredabilidades superiores a las de los ensayos en campo, por lo que la evaluación temprana en vivero del vigor podría ser eficaz para aumentar la ganancia por unidad de tiempo. Conviene estudiar la correlación juvenil-adulto entre vivero y ensayos en campo a edad adulta. El menor valor de la heredabilidad de la supervivencia se podría deber a que es una variable resultado de varios caracteres diferentes entre los que se podrían encontrar la resistencia a Phytophthora sp., la calidad exterior de la planta o la adaptación a condiciones ambientales diversas. En programas de selvicultura clonal la aptitud al enraizamiento juega un papel importante en el comportamiento de los genotipos. En este caso se han estado utilizando tres métodos de propagación que influyen de forma diferente en la calidad exterior de las plantas, no solo en el sistema radical sino también en la ramosidad. El aclarar estas cuestiones se deja para análisis posteriores. Otro factor que influye mucho en el comportamiento de los clones es la calidad del material de partida utilizado para la instalación del clon. Es decir, la juvenilidad o maduración del propágalo inicial, puede modificar completamente el comportamiento del clon. Algunos de los clones incluidos en la presente evaluación eran árboles híbridos seleccionados por su vigor, conformación de fustes y competitividad en espesura, en una plantación de híbridos de 25 años. Fueron instalados en el NP1 a partir de púas recogidas de sus copas, injertados en cepas y posteriormente clonados por acodo. Ninguno de ellos resultó seleccionado. Los valores de las correlaciones genéticas entre altura y diámetro y altura volumen son muy elevadas con valores cercanos a 1, salvo en contadas ocasiones. Considerando que la altura es una variable con mayor heredabilidad que el diámetro y el volumen (datos no aportados) desde edades mas tempranas, hemos elegido la altura como variable de selección para el carácter vigor. Las correlaciones genéticas entre la altura con los caracteres de calidad de fuste, rectitud y dominancia apical son significativas pero con valores muy variables. En gran parte de los ensayos estas correlaciones son muy elevadas (>0,7) y en otros son de moderadas a bajas (-0,30 a -0,20). Esto indica que en general al seleccionar por crecimiento en altura seleccionamos por mayor dominancia apical y rectitud, pero hay ensayos en los que se conseguirían pocas ganancias por este método. En consecuencia para realizar mejora por calidad de fuste debe hacerse selección directa en ensayos de edad superior a los 5 años. La evolución de la heredabilidad de la variable altura muestra en general una tendencia decreciente, especialmente en las parcelas de mayor edad. En estas parcelas se dan dos condiciones que podrían explicar la decreciente correlación. Son parcelas instaladas con plantas obtenidas por acodo bajo, plantadas con un sistema radical en general deficiente. La altura inicial está determinada fundamentalmente por el vigor de las cepas y el incremento de altura al principio debe estar condicionada por la capacidad de enraizamiento con el sistema de acodo. Por otro lado estas parcelas han alcanzado la espesura completa hace tiempo y es posible que en estas condiciones tiendan a igualarse las alturas totales. Las líneas de tendencia de la evolución de las correlaciones genéticas juvenil-adulto, indican que la correlación se estabiliza a partir de los 2 a 4

190 años de edad. Se puede concluir que se puede realizar selección por altura en ensayos jóvenes de menos de cuatro años pero considerando que en algunos ensayos la correlación fue moderada, las selecciones tempranas, realizadas antes de los cuatro años se pueden considerar provisionales. La resistencia a Phytophthora sp. se ha estudiado en otros ensayos de inoculación (Miranda-Fontaiña et al. 2006). El estudio de la correlación entre supervivencia en los ensayos en campo y la resistencia a Phytophthora en ensayos de inoculación en la etapa juvenil merece un análisis adicional. Los caracteres de vigor, conformación de fuste y supervivencia se utilizaron, junto a las evaluaciones de resistencia a Phytophthora sp. para evaluar las características de la colección de clones híbridos del Centro de Lourizán y solicitar la aprobación de 32 clones para la producción de madera como materiales de base de las categorías cualificado o controlado.

Agradecimientos

La evaluación de ensayos se realizó dentro de los objetivos del proyecto RTA04-152 del programa nacional de investigación agraria, titulado “Selección clonal de castaño, cerezo y nogal para la producción de madera”.

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P2.05. Cloning of CsCPE cDNA from chestnut somatic embryos: comparative expression analysis with zygotic embryos.

Jesús M. Vielba, Silvia Valladares, Elena Corredoira, Ana M. Vieitez and Conchi Sánchez

Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia, CSIC, Apartado 122, 15780, Santiago de Compostela, Spain

SUMMARY

We have isolated a full-length cDNA (CsCPE) from chesnut somatic embryos and analyzed its expression in zygotic and somatic embryos at different developmental stages. The highest accumulation of CsCPE mRNA was detected at the globular stage of somatic embryos and also at early developmental stages of zygotic embryos, being detected the lowest levels at the early cotyledonary stage. Abundant levels of mRNA were also detected in roots in comparison to seedlings shoots. These results indicate that CsCPE gene is involved in somatic embryogenesis and seems to be developmentally regulated.

1. INTRODUCTION

Somatic embryogenesis (SE) involves the development of somatic cells into embryos through a sequence of several development stages resembling zygotic embryogenesis (Dong and Dunstan, 1999). Chestnut SE is an useful tool for cloning superior trees, genetic transformation and germplasm cryopreservation (Corredoira et al., 2003). In addition, the somatic embryo system can be used for the analysis of genes related to SE and for understanding the molecular mechanisms associated with plant embryo development. It is well known that the developmental switching of somatic cells toward the embryogenesis pathway and plant development involves the activation and differential expression of specific genes (Zeng et al., 2006). Several genes associated to different categories - housekeeping genes, auxin-inducible genes, SE receptor kinases (SERK) genes, and late embryogenesis abundant (LEA) or ABA- regulated genes among others- have been cloned, and they are differentially expressed during SE (Rojas-Herrera et al, 2002; Chugh and Khurana, 2002). Recently, Carney et al. (2006) generated a collection of ESTs from pine embryogenic tissues at different stages (somatic and zygotic embryos) and they demonstrated that this collection contains similar genes to those involved in embryogenesis in angiosperms. They also found that one of these ESTs shows homology with a glycine-rich protein gene (AtGRP-5) which was isolated from Arabidopsis thaliana and was found to be preferentially expressed in immature seeds in comparison to stems and leaves (de Oliveira et al., 1990). In previous work in our laboratory we described the isolation and characterization of the QrCPE gene from Quercus robur which is rich in glycine and histidine residues (Gil et al., 2003). The expression analysis of this gene showed that QrCPE mRNA was abundant in oak zygotic and somatic embryos, but almost no QrCPE transcripts were detected in nodular callus cells.

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Different embryogenic lines of chestnut were induced in our laboratory from immature zygotic embryos and from leaf explants of chestnut shoot cultures (Corredoira 2002, Corredoira et al., 2006). These embryogenic lines are maintained by secondary embryogenesis, and the protocols for maturation and germination were also developed (Corredoira et al. 2005). Here we describe the identification of the chestnut ortholog of QrCPE, called CsCPE, and the expression analysis of this gene in different stages of somatic embryos as well as in zygotic embryos harvested at different maturation stages.

2. MATHERIALS AND METHODS

Plant materials

Two embryogenic lines of chestnut (HV-Z2 and CI3) were initiated from immature zygotic embryos (Vieitez, 1995; Corredoira et al, 2006), these having been maintained for more than two years by secondary embryogenesis, and somatic embryo-derived plants (somatic seedlings) were also obtained as described by Corredoira et al. (2006). Samples consisting of 1 mg of globular, early cotyledonar and late cotyledonar embryos were isolated from proliferating cultures and used for RNA isolation. Plant material, hypocotyl, shoots and roots, were excided separately and harvested from somatic seedlings. Proliferating calli arose from the base of chestnut in vitro shoot cultures, and roots originated from these shoots treated with IBA were also used in this study. In order to compare the developmental expression of CsCPE between somatic and zygotic embryos, immature chestnut seeds were harvested from the 3 August to 21 September 2006, at intervals of about one week. From week 1 to 3 the immature ovules containing the embryo at early development stage and the endosperm were sampled; at the week 4 was isolated the apical part of the immature seed containig the embryo at early cotyledonary stage, and from week 4 to 8, the embryonic axis (without cotyledons) of embryos at the cotyledonary stage were sampled.

RNA extraction, quantification and Northern analysis

Total RNA from somatic and zygotic embryos was isolated using the Plant Concert RNA Reagent (Invitrogen Corporation, Carslabad, CA, USA), and the RNA from other matrials was extracted as described by Dong and Dungstan (1996). RNA was digested with RQ1 RNase-free DNase (Promega, Madison, WI) for 15 min at 37 ºC, and then purified by phenol:cloroform extraction and ethanol precipitation. RNA concentration was quantified in spectrophotometer, and RNA quality was checked in a 1.2% agarose gel. For Northern blot analysis, total RNA (10 or 15 µg) was denatured and subjected to electrophoresis in 1.2% agarose gels containing formaldehyde and transferred to Nylon membranes. Probes were directly labelled by PCR with 25 µCi of [α-32P]-dCTP using previously cloned cDNA (see below). Hybridization conditions were as described in Gil et al. (2003).

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CsCPE gene isolation and cloning

The full-length CsCPE cDNA was obtained using the Rapid amplification of cDNA ends (RACE) strategy. The 5´- and 3´- cDNA amplification was performed using QrCPE reverse- specific primer (5´-GCTTATACACCTACTGTGGTTGAGAGTT-3´), previously designed for the isolation of QrCPE gene and CsCPE forward-specific primer (5´- ACCAGGTCATGGTGCTGCTGGAGAG-3´) designed based on the sequence obtained with 5´- cDNA amplification. RACE reactions were performed with the SMART-RACE cDNA amplification Kit (Clontech, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). cDNA synthesis was performed using 1 µg of RNA isolated from chestnut somatic embryos, a modified oligo-(dT) and PowerScript Reverse transcriptase (Clontech, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) following the manufacturer´s instructions. For 3´-RACE, reverse transcription was performed in presence of a modified oligo-(dT) primer and, for the 5´-RACE the reaction was performed with the modified oligo-(dT) primer and the SMART II primer (provided in the kit). Double-stranded cDNA was synthesized by PCR amplification using the Advantage Taq Polymerase (Clontech) in the presence of the UPM primer (provided in the kit) and forward or reverse specific primers. The PCR amplifications were performed at 94 ºC for 8 s, 66 ºC for 12 s and 72 ºC for 2 min. The reaction products were cloned using the TA Cloning kit from Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA). DNA was sequenced using the ABI-PRISM® 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystems). At least two different clones per cDNA fragment were sequenced. Database searches were performed with the National Center for Biotechnology Information Network version BLAST2.2.16 (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

3. RESULTS AND DISCUSSION

Identification and sequence analysis of CsCPE cDNA

To identify the chestnut ortholog of QrCPE cDNA, 3´- and 5´- cDNA amplification were carried out on RNA isolated from chestnut somatic embryos. A full-length cDNA of 582 bp, including the poly (A) tail was identified. The p the first ATG initiation codon in the sequence was found at position 76, surrounded by the sequence AAAATGGC, which is highly homologous to the dicot plant consensus translation initiation site (Caverner and Ray, 1991). The 264 bp 3´- untranslated region contains a variant polyadenylation signal (ATTAAA). It has been suggested that variant signals are not proccessed as efficiently as the AATAAA signal, and could be selected for regulatory purposes (Beaudoing et al., 2007). The first ATG starts an open reading frame ending at nucleotide 318, and encodes a polypeptide of 81 amino acids with a calculated molecular mass of 8.7kDa and a pI of 6.08. In general, the biological features of the CsCPE- encoded protein are very similar to the putative QrCPE protein (Gil et al., 2003). Both proteins have a signal peptide of 26 amino acids and, according to the k-NN algorithm (Horton and Nakay,

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1997) used in the PSORT program were predicted, with a probability of 77.8%, to be extracellular proteins. The mature CsCPE protein also has a domain moderately rich in glycine and histidine residues (between amino acids 44 and 68), as well as a protein Kinase C and a casein Kinase II phosphorylation sites that start at amino acid 25. The comparison of the amino acid sequence of QrCPE and CsCPE showed a 94% of identity between the two predicted proteins. Significant amino acid identity was also found between CsCPE and two glycine-rich proteins: DC7.1 (37%, Accession P37704) and DC9.1 (38%, Accession P37703), encoded by two cDNAs that were isolated from cell suspensions of Daucus carota L. during the induction of somatic embryogenesis (Aleith and Ritcher, 1990). The levels of DC7.1 mRNA began to increase 72 h after the induction of embryogenesis, reaching the highest mRNA accumulation 8d after induction, which coincided with the globular stage of embryonic development.

Expression analysis of CsCPE cDNA during somatic and zygotic embryogenesis

To determine the expression of CsCPE during the somatic and zygotic embryogenesis, RNAs isolated from embryos at different development stages were analyzed. In both embryogenic lines of somatic embryos, CsCPE mRNA was more abundant in embryos at the globular stage than in those at the cotyledonary stage, with the lowest amount being detected at the early cotyledonary stage. The expression pattern of CsCPE in different tissues from somatic seedlings showed that the highest amount of mRNA transcript was detected in roots of somatic seedlings, with similar levels of those detected in embryos at the late cotyledonary stage. We also found that the lowest expression of CsCPE was detected in callus tissue. A possible role of QRCPE gene in embryonic development was also suggested by Gil et al. (2003). We also analyzed gene expression during zygotic embryo development using the material previously described. As was found for somatic embryos, CsCPE transcrips were highly abundant in immature ovules harvested at the first and the second week of August, which coincides with early stages of zygotic embryo development, as well as in embryonic axis of late cotyledonary embryos. However, CsCPE expression was lower or indetectable in the material collected from the during the intervening period. Although histological analysis of zygotic embryos was not carried out, seems that CsCPE exhibit a similar expression pattern during somatic and zygotic embryo development. The similarity of CsCPE-deduced protein to DC7.1- and DC9.1-putative proteins encoded by cDNAs that were activated at the onset of somatic embryogenesis in carrot suspension cells (Aleith and Ritcher, 1990), coupled with the the highest CsCPE expression at the early stages of embryo development, suggest an important role of CsCPE gene in embryo development. In situ hybridization experiments are being carried out to localize the mRNA at the cellular level during the embryogenic process.

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Acknowledgements

This work has been supported by grants of Xunta de Galicia (PGIDIT06PXIB400003PR ) and Spanish Ministry of Education and Science (AGL 2006-01387/FOR).

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P2.06. FLUXOS POLÍNICOS ANEMÓFILOS E ENTOMÓFILOS DE CASTANEA SATIVA NO NOROESTE DE PORTUGAL.

Sabugosa-Madeira Bernardo1,2; Abreu Ilda2, 3*; Ribeiro Helena1,2; Cunha Mário1,4

1Secção Autónoma de Ciências Agrárias, FC-UP, 2Departamento de Botânica, FC-UP, 3IBMC, Rua do Campo Alegre 823, 4150 – 180 Porto, Portugal 4CECA-ICETA, Rua Padre Armando Quintas, 4485-661 Vairão, Portugal. [email protected].

RESUMO Uma das formas de avaliar os eventuais efeitos de alterações climáticas é acompanhar as etapas fenológicas das plantas. A monitorização da fracção polínica atmosférica através de captadores aeropolínicos ou o estudo das cargas polínicas das abelhas (Apis mellifera L.) são duas metodologias que podem ser utilizadas neste tipo de observações. Este trabalho teve como objectivo comparar os fluxos polínicos anemófilos e entomófilos para o Castanheiro em duas localidades do Minho e Beira Litoral. Observou-se o sincronismo entre as amostragens aerobiológica e das abelhas confirmado pela significafiva correlação entre elas. As variações interanuais nas datas de início e máximo de emissão polínica foram muito semelhantes embora com uma pequena antecipação temporal no caso da amostragem nas abelhas.

1. INTRODUÇÃO

Durante os últimos anos têm sido amplamente discutidas as consequências do “aquecimento global” na alteração da fenologia das plantas, nomeadamente a antecipação das datas de abrolhamento, floração e antese. O estudo fenologico das plantas tem vindo a assumir relevância em diversas disciplinas como a agronomia, medicina, ecologia, geografia e climatologia. A data de ocorrência da deiscência das anteras, pela facilidade de observação e caracterização, tem sido dos estados fenológicos mais utilizados. As observações fenológicas em parques, pelos custos que acarretam são escassas pelo que tem vindo a ser substituídas ou completadas pela monitorização da fracção polínica atmosférica. Os fluxos entomófilos veiculados por insectos, pela estreita relação que estabelecem com as plantas têm um comportamento bastante sensível às datas de ocorrência dos estados fenológicos (Sabugosa- Madeira et al., 2007). O estudo do estudo dos fluxos polínicos através de insectos, podem constituir uma metodologia complementar à amostragem aeropolínica e à observação fenológica. O castanheiro é classificado por alguns autores como sendo uma espécie de polinização anfífila, uma vez que o vento e os insectos intervêm no processo de dispersão do pólen (Hyde, 1950; Jato et al., 2001). Considerando apenas a flora indígena, o castanheiro é uma das mais importantes fontes de néctar e pólen e de entre a ordem das Fagales é a espécie mais visitada

198 pelas abelhas, possivelmente porque o seu pólen apresenta um espectro completo de lipidos (Saa-Otero et al., 2000). O castanheiro é uma planta com interesse para o estudo remoto dos fluxos polínicos pois floresce numa época de pouca instabilidade meteorológica, produz grandes quantidades de pólen, constitui uma população e em Portugal é apenas representado por uma espécie. Por este motivo, o castanheiro é considerado um bioindicador eficiente para avaliar a tendência que se vem assistindo da antecipação da floração de diversas árvores, em que se inclui o castanheiro (Penel et al., 2002; Peternel et al., 2004). Neste estudo comparamos os fluxos polínicos anemófilos obtidos através do estudo das cargas polínicas de Castanea transportadas por abelhas (Apis mellifera L.), com os fluxos polínicos atmosféricos da mesma espécie amostrados em captadores aeropolínicos. O estudo foi realizado durante um período de 3 anos (2002 a 2004), em que para além da informação polínica procedemos ao registo da informação meteorológica.

2. MATERIAL E MÉTODOS

A amostragem dos fluxos polinicos anemófilos e entemófilos foi realizada no Noroeste de Portugal de 2002 a 2004 em duas áreas rurais, Cesar (concelho de Oliveira de Azeméis, 40º55’N, 8º25’W, 300 m altitude) e Vairão (concelho de Vila do Conde, 41º20’N, 8º40’W, 100 m altitude). Para estudo dos fluxos polínicos atmosféricos recorremos a captadores aeropolínicos tipo “Cour” (Cour, 1974), constituído por duas unidades filtrantes verticais (400 cm2) de gaze impregnada com óleo de silicone colocadas numa estrutura aerodireccionada (figura 1A). As unidades filtrantes foram substituídas uma vez por semana sendo a gaze exposta destruída por acção do ácido sulfúrico, ácidos fluorídrico e clorídrico para extracção dos pólens impregnados no filtro (Cour, 1974). O sedimento resultante foi acetolisado (Erdtman, 1960) e diluído em glicerina para observação ao microscópio óptico (630x). A quantificação do conteúdo polínico atmosférico foi efectuada ao longo de cinco linhas transversais resultando uma medida do fluxo polínico atmosférico (FPA) expresso como o nº de grãos de pólen/m2 secção/por dia. Para análise dos fluxos polinicos entomófilos recorremos a colónias de abelhas equipadas com “armadilhas capta pólen” instaladas no topo da colmeia de acordo com o modelo desenvolvido por Lavie & Fresnaye (1963)(figura 1B). Para análise da relação entre o pólen colhido pelas colónias de abelhas e a quantidade de pólen presente na atmosfera recorreu-se ao coeficiente de correlação de Spearman, e a normalidade das emissões temporais de pólen foi confirmada pelo teste de Shapiro-Wilk.

199

A B

Figura 1 – Captador tipo Cour (A) e armadilha capta pólen (B)

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A figura 2 ilustra as curvas polínicas respeitantes aos fluxos polínicos anemófilos e entomófilos do castanheiro. Observou-se que a ocorrência deste tipo de pólen se encontra concentrada numa época bem definida do ano. As curvas polínicas obtidas pelas abelhas e pelos captadores apresentam uma distribuição normal visto a significância do teste de Shapiro- Wilk ser <0,01. Chuine & Belmonte (2004) estudando a floração de várias espécies, durante 20 anos em 17 estações aerobiológicas de vários pontos da Europa, verificaram que o castanheiro apresentou uma curva de floração com uma distribuição normal. Dada a escassez de anos estudados não é possível fazer inferência estatística sobre a antecipação das datas de floração em função do clima. No entanto, no ano 2003, com temperaturas médias anuais um pouco acima da média, ocorreu, no final de Setembro a presença de pólen de castanheiro quer nas colmeias quer nos captadores. Neste período do ano observou-se no campo que várias árvores possuíam simultaneamente amentilhos e ouriços com castanhas, o que também ocorreu em França para o castanheiro e a aveleira (Roby, 2003). Nos 3 anos em estudo observámos uma variação interanual inferior a uma semana e uma elevada correlação entre as datas quer de início (primeira semana com registo de pólen de castanheiro) quer do pico de floração (semana em que o registo polínico foi superior a qualquer outra semana) determinados através dos captadores aeropolínicos e pelas abelhas (Erro! A origem da referência não foi encontrada.). Constatou-se uma pequena antecipação na recolha de pólen de castanheiro pelas abelhas, no entanto o pólen foi amostrado até mais tarde pelos captadores aeropolínicos. Estas capturas mais tardias podem ser explicadas pela reflutuação de pólen depositado sobre o solo e outras estruturas durante o período de floração, e que após um período seco voltam a resuspender até atingir os captadores. De acordo com estes resultados podemos constatar que as abelhas por serem mais sensíveis à presença de baixas concentrações polinicas e pela menor influência dos factores climáticos, permitem definir um período de polinização mais rigoroso. A dispersão eólica do pólen é ainda afectada pela ocorrência de precipitação que provoca o efeito de lavagem da atmosfera. Este efeito foi observado em Vairão 2002 e Cesar 2002 e

200

2003 verificando-se a diminuição da quantidade de pólen de castanheiro amostrada pelo captador aeropolinico quando ocorreu precipitação, o que não foi observado na recolha de pólen pelas abelhas. Assim, pode-se justificar em algumas situações a monitorização das cargas polínicas das abelhas no sentido de completar os estudos de fenologia e dinâmica de floração desta espécie arbórea, visto as curvas polínicas determinadas pelos insectos serem menos sensíveis a fenómenos climáticos que têm impacto junto dos captadores aeropolinicos.

Tabela 1: Coeficientes de correlação de Spearman entre a quantidade de Pólen de Castanea obtido das abelhas e com captadores atmosféricos em Cesar e Vairão para os anos em estudo

Fluxo polínico atmosférico Cesar Vairão 2002 0,927** 0,700* 2003 0,858** 0,796** Pólen apícola apícola 2004 0,902** 0,856** ** p< 0,01 e *p< 0,05.

Agradecimentos

O primeiro autor foi patrocinado pela bolsa BD/7049 concedida pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia. Agradece-se o apoio técnico dado pelas Drª Isabel Paradela e Engª Luísa Damas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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201

Castanea Castanea 2002 Vairão 2002 Cesar 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 100 2,0 100 2,0 /dia m 90 1,8

m 90 1,8 /dia 2 2 80 1,6 80 1,6 70 Pólen apícola 1,4 70 1,4 60 1,2 60 1,2 50 Precipitação 1,0 50 1,0 40 CPA 0,8 40 0,8 30 0,6 30 0,6 Temperatura 20 média 0,4 20 0,4 % Polen apícola ºC m ºC apícola % Polen 10 0,2 % Polen apícola m ºC 10 0,2 milhões grãos de polen /m de polen milhões grãos 0 0,0 0 0,0 milhões grãos de polen /m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Ab il Mi JhCastaneaJlh A Sb Castanea 2003 Vairão 2003 Cesar 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 100 2,0 100 2,0 m 90 1,8 m

/dia 90 1,8 /dia 2 2 80 1,6 80 1,6 70 1,4 70 1,4 60 1,2 60 1,2 50 1,0 50 1,0 40 0,8 40 0,8 30 0,6 30 0,6 20 0,4 20 0,4 % Polen apícola ºC apícola m ºC % Polen 10 0,2 % Polen apícola ºC m 10 0,2 milhões grãos de polen milhões de /m polen grãos 0 0,0 0 0,0 milhões grãos de polen /m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Ab il Mi JhCastanea Jlh AtSt b Castanea 2004 Vairão

1 3 5 7 9 11 200413 Cesar15 17 19 21 23 25 27 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 100 2,0 100 2,0 m m 90 1,8 90 1,8 /dia /dia 2 2 80 1,6 80 1,6 70 1,4 70 1,4 60 1,2 60 1,2 50 1,0 50 1,0 40 0,8 40 0,8 30 0,6 30 0,6 20 0,4 20 0,4 % Polen apícola m ºC 10 0,2 % Polen apícola m ºC 10 0,2 milhões grãos de polen /m 0 0,0 0 0,0 /m de polen grãos milhões 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Abr Mai Jun Jul Ago Set Abr Mai Jun Jul Ago Set S Figura 2: Fluxo polínico de Castanea sativa em Vairão e em César durante os 3 anos de estudo

202

P2.07. THE EFFECT OF TEMPERATURE AND RADIATION ON PHOTOSYNTHESIS PRODUCTIVITY IN JUDIA POPULATIONS (CASTANEA SATIVA MILL.)

P. Almeida*, L-T. Dinis*, J. Coutinho*, T. Pinto**, R. Anjos**, J. Ferreira-Cardoso**, M. Pimentel-Pereira**, F. Peixoto***, J. Gomes-Laranjo**

* Department of Biological and Environmental Engineering, **Centre for Technological Studies on Environment and Life, *** Centre for Animal Science and Veterinary, University of Trás-os-Montes and Alto Douro, 5000-911 Vila Real

ABSTRACT

Studies of gas exchange parameters at different temperatures and radiation were made in seven seedling populations of Judia’s cultivar. Differences were found at the level of optimal temperature being 31ºC for JD7, 31.5ºC for JD5, 32ºC for JD2, 32.5ºC for JD4 and the Spanish De Pablo, 33ºC for JD3 and JD6 and 33.5ºC for JD1 and the hybrid ink tolerant BRO310.

Key-words: Gas exchanges, heat stress, temperature.

1. INTRODUCTION

Chestnut production in Portugal is mainly centred in the Northeast, in the region of Trás-os-Montes e Alto Douro, in which Judia is growing in almost 80% of the orchards. Although this cultivar is not the most resistant to heat stress (Gomes-Laranjo et al., 2005) and to the ink disease (Gomes-Laranjo et al., 2004; Portela, 2005), its use is still very important. However, very few is known about the thermotolerance of the chestnut cultivars for the vegetative cycle, particularly during the summer period where in Trás-os-Montes the temperatures often reach over 32ºC. The adverse conditions throughout this period, low soil water availability, high temperature and high irradiance are referred to as the destabilising factors for normal chestnut growth, inducing a loss of plant vigour and, consequently, inducing the susceptibility of the trees to the ink pathogen (Gomes-Laranjo et al., 2004; Dinis et al., 2006). The overall process of photosynthesis is temperature dependent. Another external influence that affects the overall process of photosynthesis, especially in summer, is excess light. The purpose of this study is to characterise the effect of temperature in chestnut cultivar Judia, using parameters related to gas exchange.

2. MATERIAL AND METHODS

The study was carried out in seedlings from seven genotypes of Judia’s cultivar (C. sativa Mill.), from many regions of Trás-os-Montes: Bragança (JD1, JD2, JD3 and JD4), Vila Real (JD5), Carrazedo de Montenegro (JD6) and Vinhais (JD7). Additionally, seedlings from the European chestnut Bebim (Vila Real) and from the spanish variety De Pablo and thre CENASEF’s hybrid clone BRO310 (C. crenata x C. sativa) were also studied. Fruits were collected in October 2005, presenting the populations a caliber corresponding to 71, 49, 46, 67, 109, 44, 470, 80, 121 and 90 fruits per kilo, for JD1, JD2, JD3, JD4, JD5, JD6, JD7, Bebim, De Pablo and BRO 310, respectively.

203

Thirty seeds were sowed in 50x30x15 cm trays filled with a mixture of sandy-loam soil and peat (2:1, v/v) in a greenhouse. Gas exchanges were determined with an infrared gas analyser (IRGA, mod. LCipro+, from ADC BioScientific Ltd) equipped with the microclimatic configuration. Concerning temperature sequence, PPFD was stabilized at 1300 µmol m-2 s -1. Analysis of variance (ANOVA) and the regression models were carried out using the Microsoft Excel and StatView 4.0 programs (Abacus concepts, Inc.).

3. RESULTS AND DISCUSSION

High temperatures are usually regarded as one of the most important external influences affecting both the overall photosynthetic capacity of intact photosynthesising tissues, and the specific functions of various points of the photosynthetic apparatus (Bukhov and Mohanty, 1999). Concerning temperature, Figure 1 shows typical variation of photosynthesis in relation to it.

y = -0,0641x2 + 4,2769x - 61,582 12 JD3 R2 = 0 ,4 3 17

10

8

6

μ 4

2 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 TEMP (ºC)

Figure 1- Effect of temperature (T) on photosynthesis in the genotype of Judia designated JD1. The 2nd degree polynomial equation was made from a sextuplicate assay and T100, T90 and T50 were then determined (Table 1).

In relation to the JD genotypes, as higher was the optimal temperature (T100), as lower was the respective photosynthesis rate (A). Such type of variation was already reported by Gomes-Laranjo et.al., this congress), for adult plants of many chestnut varieties. According results (Table 1), a shift of 2.5 ºC in T100 was observed. Minimal T100 was 31 ºC (JD7) and maximal value was 33.5 ºC (JD3). In these 2 -1 genotypes, values of photosynthesis rate varied between 8.6 (JD3) and 13.4 µmol CO2.m .s (JD3). These results suggest that differences can be found at the level of gas exchange parameters between JD populations from different regions of Trás-os-Montes. These results are similar to those from the Spanish variety De Pablo and the hybrid clone BRO310. Nevertheless, optimal T for Bebim was 36.5ºC, but needing this value a more carefully observation.

204

Table 1- Values of maximal photosynthesis (A), temperature (T) and water potential (Ψw) in seven genotypes from the European chestnut cv. Judia (JD1 to JD7), Bebim (BB) and De Pablo and from the hybrid (C.sativa x C. crenata) BRO310. T100, T90 and T50 were determined from the 2nd degree polynomial equations for maximal photosynthesis and correspond to the values where photosynthesis was maximal (T100), 90% (T90) and 50% (T50). Local Genotype A T (ºC) Ψw -2 -1 (μmolCO2.m .s ) T100 T90 T50 (MPa) JD1 10.5 33.0 37.4 43.1 -0.53 JD2 11.6 32.5 36.3 41.1 -0.48 Bragança (Pt) JD3 9.8 33.5 37.3 42.1 -0.36 JD4 9.8 32.0 36.5 41.9 -0.45

Vila Real (Pt) JD5 12.3 31.5 36.4 42.3 -0.66 Valpaços (Pt) JD6 8.6 33.0 36.8 41.4 -0.67 Vinhais (Pt) JD7 13.4 31.0 34.4 38.7 -0.67

Vila Real (Pt) Bebim 8.0 36.5 42.0 48.8 -0.45 Cáceres (Sp) De Pablo 13.9 32.5 36.5 41.3 -0.52 Amarante (Pt) BRO 310 10.4 33.5 37.4 42.6 -0.61

Leaf water potential (Ψw) was also determined (Table 1). Among the JD’s genotypes, values varied from -0.36 MPa in JD3 to -0.67 MPa in JD6, JD7. Analysing the variation of photosynthesis in the range of temperatures corresponding to theT100 values determined for all JD genotypes, JD7 shows the best photosynthetic rates until 34.5 ºC, after what, JD5 looks like the best. JD4 also changed position whit JD3, being the last one better than the first over 33 ºC.

JD7 JD6 JD5 JD4 JD3 JD2 JD1

14

13

) 12 -1 .s -2 11 .m 2 10

molCO 9 A ( 8

7 29 30 31 32 33 34 35 36 37 T (º C)

Figure 2- Variation of photosynthesis in the range of optimal temperature which was calculated for each JD genotype.

The stomatal conductance (gs) and transpiration rates were also studied. Stomatal conductance shows a similar variation than that observed for photosynthesis, instead transpiration rate seems not to be negatively influenced by elevated temperatures (even those which are higher than T100). Figure 3 shows a typical variation of such parameters for JD3, the genotype with highest T100.

205

0.16 JD3 JD3 y = -0.0042x2 + 0.4585x - 7.7756 2 6 0.14 y = -0.0007x + 0.0432x - 0.6153 R2 = 0.5887 R2 = 0.2403 0.12 5 0.10 4 0.08 3 0.06 μ 2 0.04 0.02 1

0.00 0 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 TEMP (ºC) TEMP (ºC) Figure 3- Influence of temperature in stomatal conductance and transpiration rates in the JD genotype JD3. Arrows indicates de optimal temperature determined after Figure 1.

The cluster analysis relatively to gas exchange parameters (A, gs, E, WUE) at optimal temperature

(T100), T90 and T50 (Figure 4) suggest the formation of two groups of JD genotypes including the first one JD1, JD2, JD3, JD6 and BRO310. The second group includes JD4, JD5 and JD7. At the end, there are still Bebim and De Pablo which, according this distribution, are quite different than the others.

Figure 4- Cluster analysis for JD populations, Bebim, De Pablo and the hybrid BRO310 obtained from the two principal components extracted from the factorial analysis including T100, T90, T50, A, gs, E and WUE.

In conclusion, variations in photosynthetic characteristics related to high temperature tolerance in Judia genotypes, confirm the existing variability among this cultivar. Attending the aim of this work, there was found JD genotypes with different temperature tolerance, but it must see very carefully since as the highest was the T100 values the lowest was the photosynthetic rate. By this way, the genotypes were ordered in function of their product between temperature (T100, T90 and T50) and the respective photosynthesis values, from the well to the worst adapted: JD7, JD5, JD4, JD3, JD1, JD2 and JD6.

REFERENCES

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P2.08. LEVANTAMENTO, DESENVOLVIMENTO FENOLÓGICO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE VARIEDADES TRADICIONAIS DE CASTANHEIROS DA ILHA TERCEIRA NO ÂMBITO DO PROJECTO GERMOBANCO III.

Lopes, D. J. H.1; Monjardino, P.1; Mendonça, D.1; Lopes, M. S.1; Monteiro, L.1; Carvalho, C.2; Baptista, C.1; Domingues, A.2; Melo, M.2 & da Câmara Machado, A.1

1 Centro de Biotecnologia dos Açores, Departamento de Ciências Agrárias da Universidade dos Açores, 9701-851 Terra Chã, [email protected] 2 FRUTER, Associação de produtores de fruta, produtos hortícolas e florícolas da Ilha Terceira.

RESUMO

Dada a importância do castanheiro nos Açores em diversas ilhas desde o século XIX, onde este é cultivado e subespontâneo, iniciou-se um trabalho que teve como principal objectivo o estudo do estado actual da cultura, através da identificação das potenciais variedades regionais de castanheiros, quer através de uma caracterização fenotípica e fenológica, quer através de uma caracterização molecular das mesmas. Este trabalho incidiu sobre a identificação de possíveis cultivares regionais de Castanea sativa e iniciou-se com a identificação e localização das variedades locais de castanheiros, recorrendo à utilização de um GPS, e à realização de inquéritos aos produtores destas. O tratamento destes dados em ambiente ArcView usando a fotografia digital do terreno permitiu construir um mapa, baseado nos sistemas de informação geográfica (SIG), da localização das amostras recolhidas na Ilha Terceira. Deste trabalho de recolha resultaram 92 entradas de castanheiro na base de dados do projecto germobancoII. Uma vez que se trata de uma espécie que se propaga vegetativamente, o material vegetal foi recolhido e propagado “in vivo” recorrendo a campos de colecção criados no âmbito deste projecto. No âmbito da caracterização das cultivares tradicionais de castanheiro foi feita uma caracterização morfológica, baseada num acompanhamento destas através de descritores fenotípicos e fenológicos. Foi também realizada a caracterização molecular de 46 amostras, utilizando cinco microssatélites de forma a discriminá-las geneticamente, tendo-se identificado 31 genótipos distintos. Quarenta e duas destas amostras são originais da Ilha Terceira e quatro da Ilha de S. Miguel. Na totalidade, foram detectados 51 alelos com um número médio de 10,2 alelos por locus.

1. INTRODUÇÃO

A cultura do castanheiro (Castanea sativa Mill.) nos Açores parece remontar ao início do século XIX. Esta cultura apesar de nunca ter sido muito significativa na Região, teve uma grande importância económica e social para algumas localidades. O castanheiro é cultivado nos Açores numa faixa costeira, entre 100 e 200 m de altitude, em locais abrigados do vento, de solo profundo e permeável. Em algumas zonas dos Açores, esta cultura era o sustento de muitas famílias, possuindo uma grande variedade de utilizações, sendo ainda aproveitado o refugo para a alimentação animal. Devido à grande importância desta árvore na alimentação, ela simbolizava riqueza, e por ser uma árvore que ocupa grandes espaços, apenas abundava nas propriedades dos agricultores mais abastados (Ormonde, 1994).

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Na ilha Terceira, a avaliar pelos exemplares de castanheiros existentes, a sua introdução com intuitos frutícolas, deve-se ter dado por volta da segunda e terceira décadas do século XIX (Ormonde, 1994). A importância económica e social desta cultura parece ter atingido proporções significativas na ilha Terceira, à semelhança do que acontecia em algumas regiões de Portugal e até da Europa, onde a cultura era mais expressiva. Na Terceira, o local de maior área desta cultura foi sem dúvida, e ainda continua a ser, a freguesia da Terra-Chã e as suas freguesias limítrofes. Este trabalho teve como principal objectivo, fazer um levantamento de castanheiros antigos (com cerca de 100 anos ou mais) na Ilha Terceira, procedendo-se à sua caracterização fenológica e molecular, de forma a facilitar a gestão da propagação do material vegetal e o estabelecimento de campos de colecção. Os marcadores moleculares utilizados neste estudo foram os microssatélites, que são uma ferramenta apropriada para a caracterização de cultivares (Lopes et al., 2006). A combinação da análise de vários microssatélites altamente polimórficos, resulta num perfil alélico individual para os diferentes genótipos existentes. Neste estudo quarenta e seis castanheiros foram genotipados, utilizando 5 microssatélites, de forma a discriminá-los geneticamente.

2. MATERIAL E MÉTODOS

O material vegetal analisado foi recolhido de 46 amostras de castanheiros, sendo 42 destas amostras da Ilha Terceira e quatro da Ilha de S. Miguel (Tabela 1). O ADN foi extraído das folhas seguindo o protocolo descrito por Doyle & Doyle (1990). As amostras foram genotipadas para 5 SSR loci: CsCAT1, CsCAT2, CsCAT3, CsCAT16, CsCAT17 e CsCAT34 (Marinoni et al., 2003).

Tabela 1: Amostras de castanheiros analisados neste estudo. Os números entre parêntesis correspondem ao número de entrada na base de dados do germobanco (www.germobanco.eu).

Castanha Desconhecida (427/05) Castanha Mulata Grada (046/04) Castanha de Fora Castanha São Martinho (029/04) Castanha Bicuda (025/04) Castanha Bicuda Pequena (044/04) Castanha Desconhecida (088/05) Castanha Viana (077/05) Castanha Viana (052/04) Castanha Brava (040/04) Castanha Mulata (055/05) Castanha Viana (028/04) Castanha Viana (085/05) Castanha Viana (050/04) Castanha Bicuda (086/05) Castanha Bicuda (090/05) Castanha “Uma Só” (024/04) Castanha Viana (026/04) Castanha Desconhecida (100/05) Castanha Viana Grada (032/04) Castanha São Martinho (036/04) Castanha Viana (417/05) Castanha São Martinho (035/04) Castanha Viana (416/05) Castanha Viana (034/04) Castanha Desconhecida (425/05) Castanha Viana (022/04) Castanha Viana Miúda (056/04) Castanha Mulata (087/05) Castanha Viana Miúda (065/04) Castanha Brava (099/05) Castanha Viana Miúda (070/04) Castanha Desconhecida (038/04) Castanha Viana Miúda (079/04) Castanha Desconhecida (098/05) Castanha Viana Grada (066/04) Castanha Viana (027/04) Castanha Brava (101/05) Castanha Desconhecida (418/05) Castanha Nocturna Castanha Brava (363/05) Castanha da Maia Castanha Brava “Uma Só”(049/04) Castanha Desconhecida Castanha Desconhecida (030/04) Castanha Gorreana

209

As reacções de amplificação foram realizadas num volume total de 20 μl contendo 50ng de

ADN, 1.5mM MgCl2, 200μM de cada dNTP, 0.5 μM de cada primer e 0.5U de Taq DNA polymerase em tampão de reacção, num termociclador UNO II Biometra com o seguinte regime de temperaturas: desnaturação inicial a 95 ºC durante 5min, seguida de 35 ciclos que compreendem 45seg de desnaturação, 45seg a 50 ºC para os pares de primers CsCAT1, CsCAT3 e CsCAT16 e a 58 ºC para os pares de primers CsCAT2 CsCAT17 e 1min de extensão a 72 ºC, seguidos de 7min de extensão final a 72 ºC. Os produtos de PCR foram analisados num sequenciador automático (ABI Prism 310 genetic analyser, PE Applied Biosystems) e o tamanho dos fragmentos foi determinado com a ajuda de um marcador interno (Genescan 350 TAMRA size standart, PE Applied Biosystems). A diversidade genética (HE-Nei, 1973), heterozigocidade observada (HO), probabilidade de identidade (PI-Paetkau et al., 1995) e a estimativa da ocorrência de alelos nulos por deficiência de heterozigóticos (r-Brookfield, 1996) foram calculados usando o programa IDENTITY 4.0 (Wagner e Sefc, 1999). Este programa também foi utilizado para detectar genótipos idênticos. As distâncias genéticas entre cultivares foram calculadas usando o programa MICROSAT (Minch, 1997) como 1-a proporção de alelos partilhados, tendo sido desenhado um dendograma utilizando o algoritmo UPGMA no programa PHILIP (Felsenstein, 1989) que foi visualizado com a ajuda do programa TREEVIEW (Page, 1996).

3. RESULTADOS

Das 46 amostras de castanheiros analisadas utilizando os cinco microssatélites foram discriminados 31 perfis alélicos diferentes. Foi detectado um total de 51 alelos (Tabela 2), com um número médio de 10,2 alelos por locus. Dos microssatélites analisados o mais informativo foi o locus CsCAT3, com 16 alelos obtidos, um valor de probabilidade de identidade de 0,09 e uma heterozigocidade esperada de 0,82. Contrariamente o locus menos informativo foi o locus CsCAT1, com 9 alelos observados, um valor de probabilidade de identidade de 0,37 e uma heterozigocidade esperada de 0,52. Apesar do número reduzido de loci analisados a probabilidade de identidade combinada de todos os loci é de 5,01x10-6, o que corresponde ao potencial estatístico de distinguir cerca de 650 amostras independentes. Das 46 amostras analisadas as denominações correspondem a 17 ‘Castanha Viana’ (estando incluídas nestas as ‘Viana’, ‘Viana Grada’ e ‘Viana Miúda’); 9 ‘Castanha Desconhecida’; 5 ‘Castanha Brava’ (na qual se inclui uma amostra denominada de ‘Brava Uma Só’); 4 ‘Castanha Bicuda’; 3 ‘Castanha São Martinho’; 3 ‘Castanha Mulata’; 1 ‘Castanha Uma Só’; 1 ‘Castanha Nocturna’; 1 ‘Castanha da Maia’; 1 ‘Castanha Gorreana’ e 1 ‘Castanha de Fora’. Após a análise dos dados foram identificados 5 genótipos que reuniam todas as amostras da variedade ‘Viana’, sendo que 13 destas tinham todas o mesmo perfil alélico, idêntico ao perfil obtido para uma amostra de ‘Castanha Brava’ e uma de ‘Castanha Mulata’. Em relação às 5 amostras de

210

‘Castanha Brava’ foram identificados 5 genótipos diferentes, dos quais 1 é o mesmo que um dos genótipos de ‘Castanha Viana’. É de salientar que a ‘Castanha Brava Uma Só’ é geneticamente diferente quer das restantes ‘Castanha Brava’ quer da ‘Castanha Uma Só’. Para as amostras com a denominação ‘Castanha Mulata’ foram identificadas 3 combinações alélicas diferentes, das quais uma é comum ao grupo das ‘Castanha Viana’ e à ‘Castanha Brava’. Todas as restantes amostras revelaram padrões genéticos diferentes. Pela análise do dendograma (Fig. 1) é facilmente perceptível que as amostras com maior distância genética em relação a todas as outras amostras são a ‘Castanha Maia’, a ‘Castanha Gorrena’ e quatro ‘Castanha Desconhecida’. Destas é de salientar a amostra ‘Castanha Desconhecida (418/05)’ com um elevado número de alelos diferentes (7 a 10). Estes dados apoiam os descritores fenológicos, pois trata-se da única amostra de castanheiro existente na Ilha Terceira que produz castanhas duas vezes no ano.

Tabela 2: Parâmetros genéticos obtidos com os 5 marcadores moleculares (SSR).

Locus Alelos Intervalo de Probabilidade Heterozigocidade Heterozigocidade Probabilidade (no.) alelos de identidade esperada (HE) observada (Ho) de alelos observados (PI) nulos CsCAT1 9 176-220 0.37 0.52 0.61 -0.06 CsCAT2 11 188-232 0.15 0.73 0.65 0.04 CsCAT3 16 195-279 0.09 0.82 0.89 -0.04 CsCAT16 6 129-153 0.22 0.73 0.80 -0.05 CsCAT17 9 129-182 0.16 0.73 0.63 0.06

4. DISCUSSÃO

Este estudo descreve pela primeira vez a elevada variabilidade genética da espécie Castanea sativa existente no arquipélago dos Açores. Esta poderá ser resultado de uma propagação seminal e não vegetativa, por parte dos produtores, o que conduz à recombinação genética e a um errado denominar das diferentes plantas. Apesar da elevada variabilidade encontrada foram identificadas apenas 8 amostras que poderão ser descendentes do cruzamento de outras. Isto não é de surpreender, uma vez que a recolha das amostras foi realizada com base em informação dos diferentes produtores, tendo-se colhido apenas aquelas que apresentavam variabilidade fenológica acentuada. Considerando a elevada homonímia encontrada é necessário aumentar o número de loci a analisar de modo a esclarecer estas incertezas. Adicionalmente, após uma caracterização genética das amostras, julgamos ser indispensável o repensar das denominações, baseado nas suas características fenológicas.

Agradecimentos

Ao Governo dos Açores através do programa INTERREG III-B que apoiou financeiramente através do projecto Germobanco II e III todo este trabalho de investigação. Aos produtores, cuja colaboração foi indispensável à realização deste trabalho.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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212

P2.09. STUDY OF BIOMETRIC CHARACTERISTICS IN JUDIA (CASTANEA SATIVA MILL.) IN EIGHT DIFFERENT AREAS OF TRÁS-OS-MONTES AND ALTO DOURO

1Dinis, L-T. J.,1Ferreira-Cardoso.,1J., 1Pimentel-Pereira, M., 2Peixoto, F.,3Costa, R. and 1Gomes-Laranjo,J. 1CETAV, 2CECAV – University of Trás-os-Montes and Alto Douro, 5000-911 Vila Real 3 Forest National Station, 2780-159 Oeiras

ABSTRACT The cultivar Judia corresponds currently in Trás-os-Montes and Alto Douro region, to the highest production of chestnut. For this reason we studied eight different areas occupied with chestnut in this region with the aim to find out which is the best Judia genotype trying to associate the caliber to the quality. The study began in October and all the samples were weighed. All the good chestnuts (without rotten, wormy and doddering) were counted. Several parameters were only measured for the good chestnuts and for all of them all the leaves were picked up at the same height. In spite of the study was focused in the same cultivar the results demonstrate significant differences among the several areas under study.

Keywords: Biometry, Chestnut, Clonal selection, Judia

1. INTRODUCTION

The chestnut has been widely used for centuries as a basis for a formidable nutritional mono- culture for many mountain populations, which consumed about 150 kg/person during the 4 to 6 months of the year where fruits are available (Fernandes 1954; Natividade, 1947; Bounous, 2002). Nowadays the situation is extremely different: this fruit, long ago called “the bread of the poor”, is now a valuable food and widely demanded abroad. The chestnut is no longer restricted to providing sustenance to the mountain’s population, and Portugal currently figures among the largest world-wide producers of chestnuts. The chestnuts are rich in carbohydrates and proteins and have low content in fat. Additionally, chestnuts are rich in minerals and vitamins. In spite of its strong decrease during the second half of Twenty Century, caused by ink disease, chestnut culture still remains in the North Portugal with significant socioeconomic importance, due to its wide dispersion, high quality of fruits, which are very well appreciated in the European market as a fresh food or as a material for industry transformation (Gomes-da-Costa, et al., 1993). New market technological imperatives and diversification of chestnut fruit utilization pointed out that it is urgent to initiate actions aiming to improve fruit production with good quality, caliber and technological aptitude, in order to increase internal consumption, exportation and, most of all, increase the value of Portuguese production (Pimentel-Pereira, 1990; Torres-Pereira et al., 1992). Judia is one of the most important chestnut cultivars growing in Trás-os-Montes. Nevertheless, previous works (Gomes-Laranjo et al., 2006) have reported some difficulty of this cultivar in tolerating the summer’s high temperatures as it is happening frequently nowadays as a consequence of climatic alterations. According to these authors, the optimal temperature for photosynthesis in Judia is about 24ºC being its production strongly reduced (above 50%) when temperature goes up 32ºC.

213

The aim of this work is to select a Judia’s population with good caliber and better tolerance to high temperatures among the Trás-os-Montes populations. Some preliminary comparative results between regions are presented.

2. MATERIAL AND METHODS

The study was done in 2006 in Judia cultivar. Eight different areas were selected, and local farmers contacted for indication of the good trees. The selected orchards are located in Alfândega da Fé – A; Bragança – B; Carrazedo de Montenegro – C.M.; Macedo de Cavaleiros – Ma; Murça – M; Tortomil – T; Vinhais – V and Vila Real – V.R. A total of 130 trees were sampled. For each one, twenty burrs and 25 leaves were randomly collected. The fruit samples were weighed for determination of the total caliber and the corrected caliber (without aborted, rotten and wormy fruits). Afterwards each fruit was weighed and the length, height and thickness were measured as well as the length, height and area of each leaf.

B C

A

Figure 1. Diagrammatic explanation of some of the fruit traits measured. A = Length, B = height, C = thickness

3. RESULTS AND DISCUSSION

Table 1 shows the number of trees and the coordinates of each local. We can observe that the areas under study are located between altitudes 420 and 813 m. These altitude differences provide different edophoclimatic conditions that are related with the chestnut quality. The Figure 2 shows the location of the eight areas in Trás-os- Montes and Alto Douro.

Table 2. Number of the total chestnut trees and location per local. Local Abbreviation Altitude(m) Coordinates Nº trees Alfândega da Fé A 544 41º20’66’’N 6º57’39’’W 20 Bragança B 813 41º41’48’’N 6º43’26’’W 20 C. Montenegro C.M. 749 41º33’55’’N 7º25’22’’W 20 Macedo Ma 565 41º32’17’’N 6º57’29’’W 12 Murça M 473 41º24’21’’N 7º27’03’’W 6 Tortomil T 541 41º44’13’’N 7º12’17’’W 20 Vila Real V.R. 420 41º17’12’’N 7º44’43’’W 23 Vinhais V 628 41º50’03’’N 6º59’55’’W 9 Information based in the Googleearth (Geographic Coordinates)

214

Figure 2. Location of the eight areas under study in Trás-os-Montes and Alto Douro.

After analysing the Figure 3 stands out clear three groups has being the best (best total caliber and healthy calibre) located respectively in two areas: Carrazedo de Montenegro and Alfândega. Bragança, Tortomil, Vinhais, Macedo and Vila Real follow the first two sites, with intermediate calibers. Murça is the worse area with the largest (or smallest????) calibers. The second group has two areas with geographic proximity (Tortomil and Vinhais) which can be a decisive factor because the edaphoclimatic conditions are identical. However other areas are geographically close (Carrazedo and Murça) they are not in the same group.

170 M

150

130

110 V V.R. A T 90 B Ma Caliber

Corrected 70 C.M . 50 110 130 150 170 190 Total Caliber

Figure 3. Groups formed by the proximity of the total calibers and corrected calibers in the whole samples

Relatively to the calibers we calculated the index of good chestnuts caliber (Corrected caliber/Total caliber) that indicates us which has smaller or larger amount of good chestnuts of the areas. As larger the index value biggest is the number of good chestnuts For growing order the value of the index is: Carrazedo, 0.524; Macedo, 0.581; Bragança, 0.636; Vila Real, 0.646; Tortomil, 0.663; Vinhais, 0.686; Alfândega, 0.814 and Murça, 0.857. Relatively to the size of the chestnut, four parameters were analysed: length, height, thickness and shape index (Table 3). Due to their highest calibre, the samples from Carrazedo Montenegro

215 showed the lengthiest, highest and thickness tall, being in the opposite side populations from Murça which have the worse caliber. Once again Tortomil and Vinhais have a similar length but relatively to the height and the thickness they have significant differences. Alfândega and Macedo have significant differences in length and thickness but are similar in height. The samples of the Vila Real are only identical to the one of Alfândega relatively to the length. For the remaining parameters these samples are different from the others. Shape Index relation (length/height) is important since it gives information about the level of fruit’s flattened degree. Since the genetic component accounts most for this parameter, its variation was the smallest. Global shape index for Judia is approximately 1, varying in this study, between 0.987 (the most flattened fruits; Alfândega) and 1.112 (the most elongated; Vinhais). Nevertheless, until now, it was not possible to make any relation between the flattened degree and calibre.

Table 3. Chestnut size (mm) and shape obtained for eight different areas in Trás-os-Montes and Alto Douro in 2006 LocalLength Width Thickness Shape Index Good Fruit Index Alfândega 30,98 ef 31,56 c 18,28 cd 0,990 d 0,814 Bragança 33,86 b 33,75 a 20,16 b 1,061 abc 0,636 C.Montenegro 34,54 a 34,17 a 21,32 a 1,020 bcd 0,524 Murça 27,24 g 25,65 f 14,51 e 1,079 abc 0,581 Macedo 30,53 f 30,19 d 18,53 c 1,019 bcd 0,857 Tortomil 32,16 c 32,36 b 19,88 b 1,002 cd 0,663 Vinhais 31,83 cd 30,46 d 18,70 c 1,094 a 0,646 Vila Real 31,28 de 28,28 e 17,67 d 1,109 a 0,686 Comparisons were made inside each parameter, between origins of chestnuts. The values with a common letter are not significantly different, according to the Fisher test, 5%.

Relatively to the biometry of leaves, four parameters were studied: length, width, area and shape index (Table 4). Biggest leaves were found in Alfândega, being the smallest ones from Murça, as it happened with the caliber. Concerning leaf shape index (length/width), any significant difference was found, suggesting once more the impact of edaphoclimatic conditions in the differential growth of Judia trees.

Table 4. Leaf size (mm) and shape for eight different areas in Trás-os-Montes and Alto Douro in 2006. Local Length Width Area Shape Index Alfândega 17.50 a 5.59 a 81.53 a 3.00 a Bragança 14.42 c 5.07 b 54.98 c 2.86 a C.Montenegro 14.33 c 5.14 b 56.99 c 2.81 a Murça 14.09 c 4.52 c 48.32 d 3.14 a Macedo 11.92 d 4.26 c 45.36 d 2.86 a Tortomil 15.60 b 5.64 a 66.72 b 2.86 a Vinhais 13.93 c 4.97 b 53.88 c 2.83 a Vila Real 14.18 c 5.71 a 62.27 bc 3.50 a Comparisons were made inside each parameter, between origins of chestnuts. The values with a common letter are not significantly different, according to the Fisher test, 5%.

In conclusion the most similar samples in all of the analyzed parameters are Carrazedo and Bragança in spite of the edophoclimatic conditions are not similar.

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It is important to verify that, in spite of the study has been performed in the same cultivar, great differences were found among some areas being interesting to complement this study with other parameters. Carrazedo is the area with better fruits however it is the one that has minor number of good chestnuts per tree. This result is in contradiction with the one obtained in Murça, where the worse calibers were obtained together with a larger number of good chestnuts. These results show that the Carrazedo chestnuts are the biggest and the Murça the smallest.

Acknowledgments This research was funded by a scholarship from the FCT (“Selecção clonal em castanheiro”; Programme POCI/V.5/A0044/2005.).

REFERENCES

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P2.10. CAPACIDADE ANTI-RADICALAR DE MÉIS DA SERRA DA ESTRELA RICOS EM PÓLEN DE CASTANHEIRO

Medroa, D. V., Tavares, M. R., Rebelo, J. S., Saraiva, S. M.; Neves, A. S. e Soares, J. R.

Escola Secundária de Seia - Centro Experimental de Ciência, Rua Alexandre Herculano, 6270-428 Seia

RESUMO

Sete amostras de mel originárias da região sudoeste da Serra da Estrela foram analisadas de forma a determinar a sua origem floral, o seu conteúdo em fenóis e as suas capacidades anti-radicalares. Os tipos polínicos mais comuns são os de Castanea sativa, Papilionaceae, Echium sp. e Erica sp. O teor em fenóis totais, expresso em equivalentes de ácido gálico, variou entre 61,41 e 110,75 mg/100g, com uma média de 77,13 mg. Todas as amostras revelaram possuir actividade anti-radicalar, sendo que a mesma demonstrou estar relacionada com o conteúdo em pólen de C. sativa.

Palavras-chave: Mel; Actividade anti-radicalar; Fenóis; C. sativa

1. INTRODUÇÃO

O mel de origem floral é fabricado a partir do néctar produzido nas flores, após recolha e transformação pelas abelhas (Apis mellifera). A composição do mel é variável, o que resulta das diferenças que se registam entre as diversas plantas visitadas pelas abelhas, do clima, das condições ambientais e da contribuição do apicultor. O mel contém mais de 100 substâncias diferentes, sendo utilizado na medicina tradicional. Os radicais livres são substâncias altamente reactivas produzidas durante os processos metabólicos. Actualmente, é conhecido que os radicais causam transformações moleculares e mutações em diversos organismos vivos. O stress oxidativo contribui para o desenvolvimento de muitas doenças e os cientistas estão cada vez mais interessados em fontes naturais que possam fornecer compostos com a capacidade de prevenir o impacto dos radicais livres nas células. Os compostos antioxidantes são substâncias químicas capazes de inibir a oxidação de muitas moléculas presentes no organismo humano. Desta forma, acredita-se que possam ser usados na prevenção de muitas doenças. As plantas sintetizam moléculas denominadas metabolitos secundários, sobretudo compostos fenólicos, que são conhecidas por ter uma acção preventiva em relação aos efeitos prejudiciais dos radicais livres. O teor em fenóis totais dos produtos naturais, como extractos de plantas e mel, reflecte, em larga medida, a sua actividade antioxidante (Bertoncelj et al., 2007; Soares et al., 1997). O mel contém uma grande variedade de compostos fenólicos e é uma fonte natural de substâncias antioxidantes, o que justifica a sua utilização na medicina tradicional (Küçük et al., 2007). A cor do mel é uma característica física que se encontra relacionada com a sua origem floral. Este parâmetro varia entre um amarelo pálido, um âmbar mais ou menos escuro, até uma cor próxima do preto. Diversos autores referem uma forte correlação entre a cor e a actividade antioxidante, indicando os

218 mais escuros como sendo os mais activos (Beretta et al., 2005; Bertoncelj et al., 2007; Frankel et al., 1998). Estudos recentes demonstram que a actividade antioxidante dos méis varia significativamente, dependendo da sua origem floral (Bertoncelj et al., 2007; Küçük et al., 2007). Em Portugal são produzidos diversos tipos de mel, mas não existem investigações detalhadas sobre as suas propriedades biológicas. Por outro lado, não existem parâmetros específicos dedicados à avaliação das potencialidades farmacológicas do mel. Certos testes químicos de rotina, como a determinação da actividade da diastase ou do conteúdo em hidroximetilfulfutal (HMF), são utilizados frequentemente como reveladores da qualidade do mel, mas não fornecem qualquer informação sobre a sua possível acção benéfica para a saúde. O estudo que desenvolvemos e que aqui apresentamos, teve como objectivos determinar a composição polínica, a intensidade da cor, o teor em fenóis totais e a actividade antioxidante de sete amostras de mel originárias da Serra da Estrela e procurar relações entre os vários parâmetros considerados.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Amostras de mel e análise polínica

Neste estudo foram utilizadas sete amostras de mel, todas originárias da região sudoeste da “Serra da Estrela”. A maioria dos méis analisados eram provenientes de explorações localizadas no concelho de Gouveia. A única excepção foi a amostra nº 2, originária de Vila Cova à Coelheira, concelho de Seia. Todas as amostras analisadas pertenciam ao ano de 2005. A análise microscópica qualitativa das amostras de pólen presentes no mel foi realizada com base no processo descrito por Louveaux et al. (1978). Amostras de 10 g de mel foram diluídas em 50 ml de água (20 - 40°C), seguindo-se uma centrifugação durante 10 min, a 2500 rpm numa centrífuga P Selecta Cencom. O sedimento foi ressuspendido em 5 ml de ácido acético, após a qual foi feita nova centrifugação. Para a ressuspensão do precipitado, foram usados 10 ml de uma mistura de acetólise (90% de anidrido acético a 99/99,5% e 10% de ácido sulfúrico a 95-97%), colocando-se em banho-maria a 100ºC durante 3 min. De seguida submeteram-se a uma terceira centrifugação, após a qual o precipitado foi ressuspendido com 10 ml de uma solução de glicerol a 50%, tendo-se feito nova centrifugação. O sedimento foi então deixado em estufa a 40 ºC, durante dois dias, para depois ser colocado em lâmina conjuntamente com uma gota de gelatina glicerinada, aquecida a 40ºC. A determinação da frequência de classes foi realizada de acordo com Louveaux et al. (1978) em microscópio óptico (1000x) de forma a fazer a observação dos grãos de pólen. A comparação dos grãos foi feita com base em Carretero (1989).

2.2. Intensidade da cor

Foi utilizado o método descrito por Beretta et al. (2005), com algumas modificações. O mel foi diluído a 50% (p/v) em água (45-50ºC). A absorvância das soluções assim preparadas foi determinada a

219

450 e a 720 nm num espectrofotómetro ZUZI 4210. O valor apresentado para a intensidade da cor foi calculado fazendo a subtracção da absorvância a 720 nm à absorvância registada a 450 nm. Os resultados são expressos em mAU.

2.3. Determinação do teor em fenóis totais

A determinação do teor em fenóis totais foi realizada segundo Singleton e Rossi (1965), com ligeiras modificações. Cada amostra de mel (5g) foi diluída em água de forma a perfazer uma solução de 50 ml. Após filtração, fracções destas mesmas soluções (0,5ml) foram adicionadas a 2,5 ml de reagente

Folin-Ciocalteu 0,2 N. Aguardaram-se 5 min e foram adicionados 2 ml de Na2CO3 0,71 M. Após 2h, foi determinada a absorvância a 760nm. O ácido gálico foi utilizado como padrão, para construir a curva de calibração. O teor em fenóis totais encontra-se expresso em mg de equivalentes de ácido gálico (EAG)/100g de mel.

2.4. Determinação da actividade anti-radicalar

A actividade anti-radicalar das amostras de mel foi determinada com recurso ao radical 2,2-difenil- 1-picrilhidrazil (DPPH) (Blois, 1952). Cada amostra de mel foi dissolvida em metanol, de forma a obter soluções com diferentes concentrações e 0,75 ml de cada uma delas foram adicionados a 1,5 ml de solução metanólica de DPPH (0,02 mg/ml). Após 15 min, as absorvâncias foram determinadas a 517 nm, contra metanol. De forma a avaliar a precisão do procedimento usado, determinou-se também a actividade anti-radicalar da quercetina. A actividade antioxidante foi calculada da seguinte forma: % Inibição = [(Absorvância do branco – Absorvância da amostra)/ Absorvância do branco] x 100. Como se fizeram ensaios com diferentes concentrações, foi possível determinar graficamente a concentração de mel que reduz a absorvância do branco (0,75 ml de metanol + 1,5 ml de solução de DPPH) a metade

(CI50 - quantidade de amostra necessária para fazer decrescer a concentração inicial do DPPH em 50%). Todos os ensaios foram triplicados, tendo a análise estatística sido feita com recurso à determinação dos valores médios e do respectivo desvio padrão para cada parâmetro.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os principais objectivos deste estudo eram avaliar o potencial anti-radicalar do mel originário da região sudoeste da Serra da Estrela e procurar relações entre o conteúdo polínico, a intensidade da cor, o teor em fenóis totais e a actividade anti-radicalar (Tabela 1). A análise polínica realizada permitiu concluir que os méis estudados apresentam uma certa variabilidade em relação a este parâmetro. Foram encontradas, na maioria das amostras, diferentes percentagens de pólen de Castanea sativa, Papilionaceae, Echium sp. e Erica sp.

220

TABELA 1. Resultados médios (mais desvio padrão) obtidos para as 7 amostras de mel originárias da região sudoeste da “Serra da Estrela” (n=3).

Análise polínica Teor em fenóis Origem Cor AA: CI Amostra (tipos polínicos + totais (mg EAG/ 50 Geográfica (mAU) (mg/ml) nº frequentes->16%) 100 g)

1 Castanea sativa, Gouveia 920 85,88 ± 1,04 10,57 ± 1,00 Papilionaceae

2 Castanea sativa, Seia >1.762 110,19 ± 0,60 11,00 ± 0,90 Erica sp.

3 Castanea sativa, Gouveia 889 66,40 ± 0,65 12,32 ± 0,46 Papilionaceae

4 Echium sp. Gouveia 1.104 75,34 ± 1,15 14,34 ± 1,09

5 Papilionaceae, Erica sp. Gouveia 1.065 75,68 ± 0,66 18,29 ± 0,74

6 Papilionaceae Gouveia 884 65,02 ± 1,85 18,33 ± 0,20

7 Papilionaceae Gouveia 888 61,41 ± 0,91 18,62 ± 0,69

EAG, equivalentes em ácido gálico; CI50, Concentração inibitória de 50%; AA, actividade antioxidante.

Diversos investigadores têm feito determinações do teor em fenóis totais em méis (Beretta et al., 2005; Bertoncelj et al., 2007; Küçük et al., 2007; Meda et al., 2005; Pérez et al., 2007). A média dos valores por nós obtidos é semelhante àquela que foi determinada para méis originários do Burkina Faso (Meda et al., 2005) e um pouco mais alta do que a determinada para um conjunto de méis florais Espanhóis (Pérez et al., 2007). O mel colhido em Seia apresentou o maior teor de fenóis, enquanto o mel mais pobre foi a amostra nº 7 de Gouveia. Relativamente à determinação da actividade anti-radicalar, os resultados mostram que todas as amostras analisadas apresentam actividade anti-radicalar, tendo-se verificado que os méis mais activos são aqueles que têm percentagens superiores a 16% de pólen de castanheiro. Desta forma, concluímos que a presença de quantidades significativas deste tipo polínico podem ser importantes para o potencial anti-radicalar dos méis originários da Serra da Estrela. Algumas investigações recentes reforçam as nossas conclusões: Küçük et al. (2007) investigaram a actividade anti-radicalar contra o anião superóxido de três méis (castanheiro, Ericaceae e multifloral rico em Papilionaceae), tendo verificado que o mel de castanheiro é significativamente mais eficaz na captação desse radical do que os outros; Bertoncelj et al. (2007) também concluíram ser o mel de castanheiro bastante eficaz na redução do DPPH, revelando um potencial claramente superior aos de acácia e de tília. Não verificámos qualquer relação consistente entre a intensidade da cor e a actividade anti- radicalar revelada, conforme foi encontrada por outros investigadores (Beretta et al., 2005; Bertoncelj et al., 2007; Frankel et al., 1998). Este facto também não nos surpreende, na medida em que os méis mais escuros da região da Serra da Estrela devem essa cor à sua origem floral, que neste caso é de Ericaceae, cuja actividade anti-radicalar é baixa, conforme outros estudos também o demonstram para as plantas desta família (Küçük et al., 2007). No entanto, a presença de outras espécies vegetais, nomeadamente Castanea, induz a constituição de um mel com maior poder anti-radicalar, mas ao mesmo tempo muito escuro. Foi encontrada uma correlação moderada (R=0,45) entre os resultados de determinação da actividade anti-radicalar e o teor em fenóis totais, o que sugere que este tipo de substâncias, tal como

221 previsto, contribui para o potencial anti-radicalar dos méis. No entanto, também se conclui, pelos resultados obtidos, que a actividade anti-radicalar de uma amostra de mel não pode ser prevista tendo como base, apenas, o seu conteúdo em fenóis.

Agradecimentos

Agradece-se à Ciência Viva – Agência Nacional para a Cultura Científica e Tecnológica pela atribuição do financiamento solicitado (Concurso Ciência Viva VI – ID 238, projecto co-financiado pelo FEDER e pelo POCI). Apresentamos também os nossos agradecimentos ao Eng. António Costa pelo facto de nos ter fornecido as amostras de mel e ao Parque Natural da Serra da Estrela e à Associação de Apicultores do Parque Natural da Serra da Estrela por todo o apoio que nos deram.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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222

P2.11. INFLUENCIA DE LA VARIEDAD DE CASTANEA SATIVA MILL. Y DEL PORTAINJERTO HÍBRIDO EN LA SUPERVIVENCIA Y EL VIGOR DE PLANTAS DE CASTAÑO

Miranda-Fontaíña, M.E. , Fernández-López, J., Furones-Pérez, P. 1Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán. Departamento de Producción Forestal. Xunta de Galicia. Apdo 127, 36080. Pontevedra, Spain. E-mail: [email protected]

RESUMEN Se evalúa la influencia de 14 portainjertos clonales híbridos resistentes a la tinta y 5 variedades de Castanea sativa, sobre la compatibilidad de los injertos. Las variedades influyen significativamente en la compatibilidad inicial de los injertos, destacando los buenos resultados e las variedades Ventura y Rapada. Los portainjertos influyen sobre el crecimiento en altura y diámetro, siendo los mejores los clones 111 y 700.

Palabras clave: castaño, injerto, portainjertos clonales, fechas brotación, resistencia a Phytophthora.

1. INTRODUCCIÓN

Las variedades de Castaño destinados a la producción de fruto han sido propagadas tradicionalmente sobre portainjerto franco de Castanea sativa. Durante las últimas décadas se han utilizado portainjertos clonales híbridos de C. crenata x C. sativa con el objetivo de aportar resistencia a Phytophthora cinnamomi, patógeno importante en las áreas de utilización del castaño, especialmente en altitudes bajas, clima suave o suelos con encharcamiento periódico. Durante los últimos años se han estudiado las técnicas y épocas de injerto más favorables y han sido recomendados como portainjertos algunos clones híbridos (Fernández, 1991; Pereira- Lorenzo & Fernández-López, 1997). Uno de los problemas que afectan a la compatibilidad entre portainjertos y variedad es la diferencia de taxones, en este caso el portainjertos híbrido C. crenata x C. sativa y la variedad C. sativa y algunos de los factores que pueden afectar a la compatibilidad pueden ser las diferencias en resistencia a P. cinnamomi y diferencias en fenología de la brotación entre portainjerto y variedad. El objetivo es realizar un estudio exhaustivo de compatibilidad entre un grupo amplio de portainjertos con diferentes niveles de resistencia a la tinta y de variedades con diferentes fechas de brotación.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

Material vegetal Como portainjertos fueron evaluados un total de 14 clones, de los que 10 clones son híbridos españoles de Castanea crenata x C. sativa (111, 16, 2073, 2522, 592, 700, 760, 7810, 88 y HS), un clon híbrido de Castanea mollissima x C. sativa (7521) (Urquijo, 1956; Vieitez, 1960) y dos clones perteneciente a Castanea sativa (130 y 90.042), todos ellos fueron seleccionados previamente por su elevada resistencia a la enfermedad de la tinta (Phytophthora cinnamomi) (Fernández-López et al.,

223

2001; Miranda-Fontaíña & Fernández-López, 2005; Miranda-Fontaíña et al., 2007). Además se utilizó el clon CA-15, híbrido de Castanea crenata por C. sativa, este clon procede del programa de selección por resistencia a Phytophthora sp. desarrollado en Francia por el INRA (Salesses et al., 1993a, 1993b). Las plantas, fueron propagadas por estaquillado (Fernández et al., 1992) durante el verano del 2002, fueron trasplantadas a principios del 2003 a envases de 3 litros, con un sustrato formado por turba, corteza de pino y perlita (1:1:1) y fueron abonadas con abono de liberación gradual (Osmocot). Durante la primavera del 2004 fueron transplantadas a envases de 15 litros, con el sustrato y abono descritos previamente. Las variedades de Castanea sativa Mill. evaluadas fueron cinco: Famosa, Negral, Rapada, Raigona y Ventura (Fernández-López, 1991; Pereira Lorenza, 1994; Pereira Lorenzo et al., 1995, 1996a, 1996b; Pereira Lorenzo & Fernández López, 1997a, 1997b, 1997c). Estas variedades fueron seleccionadas por sus diferencias en fechas de brotación, con el fin de evaluar si estas diferencias repercuten el la viabilidad de los injertos. Para ello, se tuvo en cuenta la “cantidad de calor acumulado por encima de 7ºC a partir del 15 de febrero” (datos de brotación del año 2003): las cinco variedades guardan entre si una distancia equivalente. Como material de injerto se emplearon púas que fueron extraídas el mismo día en que se realizó el injerto, a partir de la colección de cultivares disponible en el Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán. La técnica de injerto de yema empleada fue la de parche y fue realizada a principios de agosto del año 2004. Las plantas injertadas se mantuvieron durante el año 2005 y 2006 en un invernadero de plástico, con riego. En marzo del año 2007 fueron situadas en plantación con el fin de evaluar posibles incompatibilidades tardías, conformaciones y crecimientos.

Diseño Experimental El ensayo consistió en cuatro bloques completos aleatorizados. En cada bloque los factores principales fueron el portainjertos y la variedad, de manera que cada bloque presentaba dos plantas por combinación portainjerto-variedad. En algunas combinaciones portainjertos-variedad no fue posible realizar todos los injertos. El número total de plantas injertadas y evaluadas fue de 399. Variables evaluadas: Se evaluó el porcentaje de compatibilidad (C) de las plantas injertadas 5 meses después del realizar el injerto (febrero del 2005) y la supervivencia de este injerto en abril (SA), en octubre (SO) de 2005 y en la primavera del 2006. La altura en centímetros (Alt) fue evaluada en el portainjertos previo al momento de realizar el injerto en el año 2004 (Alt0), en la variedad después de más de un año de la realización del injerto, octubre del 2005, (Alt1) y en la primavera del 2006. El diámetro (D) en milímetros fue evaluado en el portainjertos justa antes de realizar el injerto (D0) y en la variedad al final del periodo vegetativo del año siguiente (octubre de 2005) (D1) y en la primavera del 2006.

Análisis de datos:

Para estudiar la influencia del portainjertos y de la variedad sobre la supervivencia y crecimiento en altura, se aplicó un modelo de análisis factorial con portainjerto (P) y variedad (V) como factores principales:

224

Xijk = μ + Pi + Vj + P*Vij + εk(ij) Modelo 1 P: Portainjerto (i=14); V: variedad (j=4); P*V: Interacción entre portainjerto y variedad; ε: Efecto residual o error. Para el análisis de varianza, se aplicó la opción RANDOM de GLM de SAS (1990) en el que consideró aleatorio el factor portainjerto y variedad. Para la clasificación de clones en grupos similares se aplicó el test de comparación de medias Student-Newman-Keuls. El coeficiente de correlación de Pearson fue calculado para estimar la posible relación entre diferentes variables.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Influencia del portainjertos y la variedad sobre la compatibilidad y supervivencia: Los análisis de varianza (Tabla 1) indican que existen diferencias significativas en la compatibilidad, al nivel del 1%, entre variedades de Castanea sativa, así las variedades Ventura y Rapada presentan valores próximos al 50%, mientras que las otras tres variedades poseen valores comprendidos entre el 23 y 30 % (Tabla 2). Los portainjertos evaluados presentan diferencias en los resultados de compatibilidad pero estas diferencias no son estadísticamente significativas (Tabla 1), estos resultados coinciden con los obtenidos por Pereira-Lorenzo y Fernández-López (1997b), en su estudio con nueve portainjertos clonales. La supervivencia de las plantas injertadas, durante los meses posteriores, no presenta diferencias significativas entre portainjertos, variedades, ni para la interacción de ambos factores (Tabla 1). La evolución de la supervivencia de las plantas, clasificadas según los portainjertos y las variedades se puede observar en las figuras 1 y 2 respectivamente.

Influencia del portainjertos y de la variedad sobre el crecimiento en altura y diámetro de las plantas injertadas: Los análisis de varianza (Tabla 1) indican que existen diferencias altamente significativas entre portainjertos híbridos, al nivel del 1‰, sobre el crecimiento en altura y diámetro de las plantas injertadas, Pereira-Lorenzo y Fernández-López (1997b) mencionaron diferencias en vigor entre portainjertos. No existen diferencias significativas ni entre variedades ni para la interacción portainjertos-variedad. En la tablas 2 y 3 se observan los valores medios clasificados respectivamente según las variedades y los portainjertos. Las plantas en las que se utilizaron como portainjertos los clones 111 y 700 presentan alturas medias próximas a 150 centímetros, al final del primar año de crecimiento. Por el contrario, las plantas en las que se utilizaron portainjertos de los clones HS y 7810 presentan alturas medias comprendidas entre los 40 y 47 centímetros. En la figura 3 se observan las diferentas en altura de tres repeticiones de los clones HS, 592 y 111. La correlación entre diferentes variables: Se han obtenido correlaciones elevadas y significativas entre la compatibilidad inicial y la supervivencia en abril y en octubre posterior (respectivamente 0,78 y 0,74). Asimismo se han obtenido correlaciones significativas entre alturas y diámetros, después de un año de crecimiento.

225

Tabla 1. Valores de F y niveles de significación del Análisis de Varianza para las variables compatibilidad (C), supervivencia en abril (SA), octubre (SO), altura (Alt1) y diámetro (D1) de las plantas después de un año de crecimiento.

Fuente de Variación gl C SA SO Alt1 D1 Portainjerto 13 1,54ns 1,58 ns 0,92ns 3,65 ** 5,16 *** Variedad 4 4,85** 1,64 ns 0,71ns 0,80 ns 0,22 ns Portainjerto*Varieda 3 0,94ns 1,36 ns 1,39 ns 1,23 ns 0,90 ns d Error 32 9 Media ± Desv. 36,34±48, 71,03±45, 66,20±47, 123,42±48 16,06±2, Estándar 15 51 46 ,52 88

Tabla 2. Valores medios de porcentaje de compatibilidad (c)y supervivencia posterior (S) de las plantas injertadas, clasificadas según la variedad. Valores obtenidos tras aplicar el test Student-Newman-Keuls.

Variedad N C SA SO Alt1 D1 Ventura 82 51,20 a 71,43 a 69,05 a 113,97 a 15,99 a Rapada 78 47,61 a 75,00 a 67,50 a 116,11 a 16,15 a Famosa 84 30,48 b 76,00 a 68,00 a 136,15 a 16,49 a Raigona 73 27,39 b 60,00 a 60,00 a 141,58 a 16,13 a Negral 82 23,07 b 66,67 a 61,00 a 126,82 a 15,28 a

Tabla 3. Valores medios de compatibilidad (C) altura (Alt 1 )en centímetros y diámetro (D1) en milímetros de las plantas injertadas después de un año de crecimiento, clasificadas según el portainjertos. Valores obtenidos tras aplicar el test Student-Newman-Keuls.

Portainjer C Alt 1 (cm) D1 (mm) to 111 63,33 a 149,43 a 17,33 a 700 31,82 ab 149,14 a 17,02 a 760 30,00 ab 137,73 a 17,25 a 2522 30,00 ab 135,75 a 17,32 a 7521 37,50 ab 135,11 a 16,52 a 90.042 40,00 ab 130,75 ab 15,17 abc 592 46,67 ab 128,56 ab 15,78 ab CA-15 35,00 ab 125,40 ab 17,74 a 130 40,74 ab 125,00 ab 16,83 a 16 38,46 ab 120,40 ab 16,23 a 88 23,08 ab 92,33 14,45 abc abc 2073 37,50 ab 70,00 14,35 abc abc 7810 40,91 ab 47,00 bc 11,29 bc HS 20,00 b 40,50 c 10,66 c

226

Supervivencia por portainjertos 111 592

7810

1,0 130 0,9 90042 0,8 0,7 16 0,6 7521 0,5 0,4 2073 Frecuencia 0,3 CA15 0,2 0,1 700 0,0 760 01-02-05 23-03-05 12-05-05 01-07-05 20-08-05 09-10-05 2522 Fecha toma dato 88 HS Figura 1. Evolución de la supervivencia de las plantas injertadas clasificadas según el portainjertos.

Supervivencia por variedad

1,0 0,9 0,8 VE-9-GU 0,7 0,6 RA-11-VI 0,5 FA-34-GU 0,4 0,3 RA-21-RU Frecuencia 0,2 NE-1-CA 0,1 0,0

01-02-05 23-03-05 12-05-05 01-07-05 20-08-05 09-10-05 Fecha toma dato

Figura 2. Evolución de la supervivencia de las plantas injertadas clasificadas según las variedades.

Figura 3. Diferencias en altura de tres repeticiones de tres clones (de izquierda a derecha: HS, 592 y 111), después de un año de crecimiento.

Agradecimientos

Este estudio ha sido desarrollado en el Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán. Los autoras quieren expresar su agradecimiento a las personas que trabajan en el vivero del Departamento de Producción Forestal por su ayuda en desarrollo y mantenimiento de este ensayo.

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BIBLIOGRAFÍA

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P2.12. CARACTERIZAÇÃO ECOFISIOLÓGICA DE C.SATIVA MILL.

1José Gomes-Laranjo, 1João Paulo Coutinho, 2Francisco Peixoto3

1 CETAV, 2CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 202, 5000-911 Vila Real, Portugal Autor correspondente: [email protected]

RESUMO Neste trabalho é feita uma caracterização ecofisiológica de C. sativa Mill., tendo como objectivo conhecer a relações com o meio ambiente, mormente relativamente a factores como radiação, temperatura e água. É uma espécie de meia-luz, atingindo 75% da taxa máxima de fotossíntese a 1000 μmol.m-2.s-1, desde que a temperaturas seja da ordem dos 24 ºC, o que condiciona igualmente a produtividade ao longo do ciclo vegetativo, dependendo este valor da variedade.

Palavras-chave: Castanea sativa Mill., trocas gasosas, relações hídricas, stress térmico, radiação

1. INTRODUÇÃO

Desde longa data, que a cultura do castanheiro desempenha importantes funções na economia e etnografia das regiões onde é ou foi cultura principal. Tendo em tempos sido uma importante cultura no Minho (clima temperado marítimo) com o aparecimento de das “novas” culturas, foi sendo deslocado para zonas mais marginais, de montanha, sendo hoje uma cultura de grande expressão na Terra Fria Transmontana (clima temperado continental) cujas características climáticas são bastante diferentes das do Minho. O clima da Terra Fria é caracterizado por maiores amplitudes térmicas, Invernos mais frios e Verões mais quentes e uma má distribuição pluviométrica, com quase ausência de precipitação no Verão. É neste contexto, com tendência para agravar os seus valores extremos, que se desenvolve o castanheiro. Tido como uma espécie de meia-luz e mesófila quer quanto à temperatura quer quanto à humidade (Loureiro, 1991), o castanheiro enfrenta actualmente alguns desafios, derivados das alterações climáticas, e dos quais não se podem prever os resultados. No entanto, não se podem separar as menores produções obtidas em anos recentes (ex. 2003 e 2006) das ondas de calor, assim como a possível maior incidência de doenças quando as árvores se encontram mais fragilizadas. A doença da tinta provocada pela Phythophthora sp. é, de acordo com Martins mais frequente nas encostas voltadas a Sul que nas voltadas a Norte, obviamente mais frescas. Com este trabalho pretende-se conhecer a resposta do castanheiro à luz, à temperatura e à água em termos de trocas gasosas.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Os resultados aqui apresentados referem-se a 6 anos de recolha de informação, entre os meses de Julho e Outubro. Os trabalhos realizaram-se em castanheiros adultos, com cerca de 40

229 anos, no vale da Campeã (concelho Vila Real – 730 m altitude), Carrazedo de Montenegro (concelho Valpaços – 760 m altitude) e Candedo (concelho de Vinhais – 790 m altitude).

As trocas gasosas foram determinadas com recurso a um analisador de CO2 por infravermelhos (IRGA) mod. LCA-2 (Analytical Development CO., Hoddesdon, UK). A determinação do potencial hídrico foliar foi feito com uma câmara de pressão tipo Scholander (mod. Elle International).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na região da Terra Fria Transmontana, onde o castanheiro está fortemente implantado, (representando cerca de 80% da área total nacional) as temperaturas médias anuais variam entre os 9 e os 13ºC (INM, 2005), situando-se as temperaturas máximas no período de Verão entre os 27 ºC os 31 ºC. Nesta zona, 32% da precipitação anual ocorre no Inverno (Dezembro a Fevereiro) e apenas 9 % no Verão (Junho a Agosto) para uma precipitação média anual de cerca de 800 a 1000 mm. De acordo com Bounous e Beccaro (2002), o castanheiro europeu necessita de 800 a 900 mm/ano, enquanto que no caso dos híbridos euro-japoneses estas necessidades são de 1200 a 1300 mm/ano. Relativamente à insolação média, nesta zona varia entre 2400 e 2600 horas. O castanheiro não é exigente em níveis muito elevados de radiação. Conforme se pode observar na Figura 1, atinge 50% da taxa máxima de fotossíntese a 400 μmol.m-2.s-1 e 75% da produtividade máxima é obtida com 1000 μmol.m-2.s-1. Em termos comparativos, num dia de sol a radiação directamente incidente numa árvore pode atingir 1800 a 2000 μmol.m-2.s-1. Estes dados são inteiramente concordantes com o conceito de que o castanheiro é, acima de tudo, uma espécie de ambientes mais sombrios e frescos, como os das encostas voltadas a norte, evitando assim a exposição Sul que apresentam igualmente maiores índices térmicos, o que favorece um maior evapotranspiração, induzem antecipação de abrolhamento o que aumenta os riscos de danos causados pelas geadas tardias. É nos soutos localizados em terrenos voltados a Sul que a incidência da doença da tinta é maior (Martins et al., 1998).

20 18 16 14 A100 )

-1 12 .s -2 10 .m

2 A75 8

molCO 6

A ( 4 A50 2 PAR75 0 -2 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 -4 PAR50 Radiação (μmol.m-2.s-1)

Figura 1- Influência da intensidade da radiação solar na taxa de fotossíntese (A) em castanheiro europeu. Equação do tipo logarítmica (n=8852).

230

Quanto à temperatura óptima de crescimento para o castanheiro europeu, de acordo com os estudos aqui apresentados, esta é de 24 ºC (Figura 2) correspondendo a um valor médio de -2 -1 fotossíntese (A100) de 10 μmolCO2.m .s . Relativamente à temperatura máxima e mínima na qual a fotossíntese é reduzida 50% (A50), foram encontrados os valores mínimo de 8,5 ºC e máximo de 36 ºC. Em consequência do exposto, serão de esperar maiores valores médios de A nos meses cuja temperatura média mais se aproxime. Assim de acordo com os registos efectuados, a maior A foi -2 -1 medida em Setembro (A = 7,2 μmolCO2.m .s ; T = 26,5 ºC), aparecendo depois Julho e Outubro com taxas de A semelhantes mas com condições de T muito diferentes, sendo de 30,3 ºC e 19,7 ºC, respectivamente. Em trabalhos realizados por Gomes-Laranjo et al. (2006), observou-se uma estreita correlação entre a tolerância ao calor e o grau de insaturação dos ácidos gordos das membranas tilacóides. Entretanto, Gonçalo et al. (2006) observaram um funcionamento adequado do complexo de evolução do O2 até cerca de 44 ºC.

20 9 35 18 8 30,3 26,5 30 16 7 ) -1 14 19,7 25 .s 6 -2 12 A10 0

.m 5 20 2 10 4 15 8 A50 molCO μ 3 μ 6 10

A ( 4 2 ≈T50 T100 5 2 T50 1 0 0 0 8 10121416182022242628303234363840 Julho Setembro Outubro Temperatura (ºC) Tempo (meses)

Figura 2- Estudo da variação da taxa fotossintética em função da temperatura (esquerda) e desta conjugada com o mês (direita) (n=8852).

Durante o dia, devido ao facto de os estomas estarem abertos para permitirem as trocas gasosas, o grau de hidratação das árvores diminui. No castanheiro, assim sucede, embora a redução observada na fotossíntese durante as horas de maior calor, leve a árvore a fechar os estomas e assim a não perder tanta água, levando a que não sejam atingidos níveis tão baixos de desidratação quanto seria de esperar. Em castanheiros a crescerem em solos dotados de nível adequado de humidade, o seu potencial hídrico matinal varia entre -0,6 e -0,8 MPa (cf. Martins et al., este congresso), enquanto que em pleno Verão, com solos mais secos o seu valor geralmente não desce abaixo de -2,0 MPa. A Figura 3, mostra a variação da taxa de A em função do potencial hídrico. De acordo com estes resultados, poder-se-á admitir como nível adequado de potencial hídrico até -1,6 MPa, altura em que a fotossíntese estará reduzida em cerca de 10% relativamente à taxa máxima obtida com potencial hídrico de cerca de -1,1 MPa. Para valores mais baixos, por exemplo -2,0 MPa, a fotossíntese é reduzida em cerca de 25%.

231

18 16 14 12 ) 10 -1 .s -2

8 .m 2 6

4 molCO

2 A ( Ψw50 Ψw100 0 -2.6 -2.4 -2.2 -2.0 -1.8 -1.6 -1.4 -1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 Potencial Hídrico (MPa)

Figura 3- Influência do potencial hídrico (Ψw) do castanheiro na taxa de fotossíntese. O símbolo Ψw100 representa o valor do Ψw determinado em condições de plena radiação e temperatura inferior a 34ºC.

As variações de A, Ψw e T durante um dia-luz podem ser observadas na Figura 4. Assim, a fotossíntese e a temperatura apresentam variações semelhantes mas de sinal sentido oposto. Em termos médios, a taxa decresce a partir das 11 h até às 15 h, altura em que representa apenas 60% do valor máximo, permanecendo no valor mínimo até cerca de 16 h, altura em que se observa uma recuperação, que corresponde a uma diminuição da temperatura ambiente. Neste período do dia, o

Ψw diminuiu de -1,4 MPa para -1,9 MPa. A partir desta hora observa-se uma recuperação hídrica Atendendo ao forte impacto que a temperatura, dentro dos valores fisiológicos, impõe na taxa fotossintética (cf. Figuras 3 e 4 apresenta-se de seguida uma análise do efeito desta em diversas variedades (Figura 5). Dentro das variedades estudadas, T100 variou entre 22 e 29 ºC, correspondendo estes valores à Lada e Boaventura, respectivamente. Relativamente ao T50, este variou entre 35 ºC (Judia e Negral provenientes de Valpaços) e 38 ºC (Aveleira, Rebolão e Judia, todos os genótipos provenientes de Vinhais).

A = 0,075x3 - 2,9084x2 + 36,214x - 135,15 Yw = 0,0214x2 - 0,644x + 2,9602 R2 = 0,3447 R2 = 0,2879 32 -0,2 28 T -0,6 24 -1,0 20 -1,4

16 Ψw -1,8 Ψ μ 12 -2,2 A 8 -2,6 4 -3,0 910111213141516171819 Tempo (horas)

Figura 4- Variação da fotossíntese (A), potencial hídrico (Ψw) e temperatura (T) durante um dia-luz no mês de Setembro na Terra Fria Transmontana.

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39,0 38,5 Aveleira 38,0 Judia 37,5 Rebolão Lo ngal B enf eit a 37,0 Lad a Bebim 36,5 Lo ngal 36,0 B oavent ura Lamela 35,5 Trig ueira Lamela 35,0 34,5 Negral Judia 34,0 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

T100 (ºC)

Figura 5- Distribuição de variedades portuguesas em função de T100 e T50. Os valores foram calculados a partir dos polinómios de 2º grau obtidas para cada variedade proveniente dos concelhos de Valpaços (losangos), Vinhais (quadrados) e Vila Real (triângulos).

Agradecimentos Os autores agradecem aos Projectos PIDR 1, PIDR8, PAMAF 2091 e AGRO 499 o financiamento concedido para a realizarem dos trabalhos conducentes à publicação deste trabalho no II Congresso Ibérico do Castanheiro.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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233

P2.13. ESTUDO COMPARATIVO DA ANATOMIA FOLIAR INTERNA DE TRÊS VARIEDADES DE CASTANHEIRO (Castanea sativa MillM .)

Silva, A.; Silva, M.; Cunha, S.; Martins, N(2).; Anjos, M.R.A.F(1).; Pinto T.M.S.(1).

(1) CETAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Departamento Engenharia Biológica e Ambiental, Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal, FAX: +351259350266; E-MAIL (1): [email protected] (2) Unidade de Microscopia Electrónica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

A estrutura e função foliar é muito variável. Contudo, a maioria das folhas evidencia uma especialização como estrutura fotossintética (Esau, 1986). O mesofilo das folhas de castanheiro, é heterogéneo e assimétrico, pela presença de parênquima clorofilino em paliçada associado à página adaxial e, parênquima clorofilino lacunoso adjacente à página abaxial. Os feixes vasculares da folha são normalmente denominados por nervuras, e o padrão de disposição destas, recebe o nome de nervação. As folhas de castanheiro, apresentam o feixe de tamanho maior na região do eixo longitudinal mediano do limbo, constituindo a nervura principal ligada a nervuras menores ditas secundárias. Devido à existência de inúmeras variedades da espécie Castanea sativa, realizou-se um estudo comparativo de três variedades: Longal, Judia e Martainha, na perspectiva de contribuir para o esclarecimento das diferenças histológicas ao nível da folha. Para a realização do presente estudo, foi recolhido material foliar do banco de germoplasma de castanheiro da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD). Neste estudo registaram-se medições em microscopia óptica (MO) e electrónica de varrimento (SEM), dos diferentes tecidos foliares recorrendo a cortes histológicos transversais. Assim, efectuaram-se medições dos parâmetros: nervura central, xilema e floema da nervura central, mesófilo, epiderme e parênquima clorofilino. Procedeu-se ainda ao registo fotográfico das lâminas em MO e SEM. Relativamente ao mesofilo, observou-se que as células de parênquima em paliçada são alongadas, com grande quantidade de cloroplastos, ficando os espaços intercelulares muito reduzidos. O parênquima lacunoso, apresenta células isodiamétricas de contorno irregular, sendo o seu conteúdo citoplasmático marcadamente vacuolar e pobre em cloroplastos. Neste parênquima, os espaços intercelulates são bastante maiores e em maior número, comparativamente ao parênquima em paliçada. Os feixes vasculares da folha desta espécie, são duplos colaterais, em que o xilema se localiza numa posição mais interior relativamente ao floema. Concluiu-se que a variedade Martainha é a que, em todos os parâmetros avaliados, apresenta as maiores dimensões, em oposição à Judia (Vinhais). Para além disso, concluiu-se também que a Judia (Vinhais) e a Judia (Carrazedo de Montenegro) apesar de classificadas como sendo a mesma variedade apresentam dimensões foliares estatisticamente diferentes. Pode observar-se ainda que só a variedade Judia não possuía tricomas na página abaxial. Foi também nesta variedade que se verificou a menor quantidade de cristais de oxalato de cálcio no mésófilo.

234

P2.14. IN VITRO CLONAL MULTIPLICATION OF PORTUGUESE CHESTNUT CULTIVARS WITH PROTECTED DESIGNATION OF ORIGIN

Dulce Silva1, Clarisse Carmona2, Teresa Valdiviesso2.

1 ESTAÇÃO NACIONAL DE FRUTICULTURA VIEIRA NATIVIDADE, RUA DE LEIRIA 2460-059 ALCOBAÇA, PORTUGAL, FAX: +351 262596221 2 ESTAÇÃO FLORESTAL NACIONAL, AV. DA REPÚBLICA, QUINTA DO MARQUÊS, 2780-159 OEIRAS, PORTUGAL, FAX: +351 214463702

E-MAIL: [email protected]

ABSTRACT Chestnut is a woody species, which is difficult to propagate either generatively by seed or vegetatively by grafting or cuttings subsequently a clonal propagation through tissue culture offers an alternative to conventional practices and has the potential to provide high multiplication rates of uniform genotypes, resulting in short-term gains. The general experiment and references of in vitro propagation in Castanea, is usually with interspecific hybrids such as C. sativa Miller x C. crenata Siebold e Zucc. The present work aims at establishing efficient propagation systems for all the varieties of C. sativa, with was described as more difficult to establish than hybrids, classified with a protected origin designation (PDO), such as "Castanha da Terra Fria", "Castanha dos Soutos da Lapa" and "Castanha da Padrela" is in Trás-os- Montes in order to contribute to the preservation of Portuguese genetic germplasm. Primary cultures were established with terminal and axillary buds from juvenile shoots of eleven chestnut cultivars by four basal nutrient media: MS (Murashige and Skoog 1962), GD 74 (Gresshoff and Doy 1974), DKW-C (Driver and Tulecke 1987) and QL (Quoirin and Lepoivre 1977). Establishment rates were assessed for the different genotypes considering the influence of in vitro medium, in order to determine the best medium for each cultivar of C. sativa. These results indicate that this propagation system may provide an efficient and useful alternative for chestnut multiplication and conservation.

235

Silvicultura / Silvicultura

P3.01. EVOLUÇÃO DO CASTANHEIRO EM PORTUGAL CONTINENTAL E NO PATRIMÓNIO FLORESTAL PÚBLICO E COMUNITÁRIO GERIDO PELA DIRECÇÃO-GERAL DOS RECURSOS FLORESTAIS (DGRF).

Reis, L. Divisão de Estudos e Informação; Direcção-Geral dos Recursos Florestais, Av. João Crisóstomo 26-28 1069 Lisboa; [email protected]

Num primeiro capítulo, far-se-á uma análise da evolução do castanheiro em Portugal no decorrer do século XX: analisar-se-á até à actualidade a evolução da sua área em termos nacionais, comparando com a evolução verificada ao nível do património público e comunitário sob gestão do Ministério da Agricultura, Desenvolvimento Rural e das Pescas (MADRP). Com base na informação produzida pelo projecto “Rede Nacional de dados de Matas Nacionais e Perímetros Florestais”, esta análise culmina com uma caracterização do que é hoje o património de cerca de 3259 hectares de manchas de povoamentos puros e mistos de castanheiro sob gestão do MADRP, no que respeita à sua localização, idades, composição, regime de condução, entre outros aspectos. Num segundo capítulo, far-se-á uma análise das estimativas já produzidas pelo Inventário Florestal Nacional de 2005 (IFN2005): o IFN 2005 aponta para que a área total de povoamentos puros e dominantes de castanheiro seja de cerca de 29200 hectares. De acordo com a referida estimativa, a área de castanheiro em Portugal teria diminuído em torno de 11000 hectares no período entre a 3ª revisão do Inventário Florestal Nacional (1995-98) e a 4ª revisão (a actual IFN2005). Apresentam-se dados com base em apuramentos de áreas recém arborizadas, que apontam no sentido de, no período em causa (1995-2005), a área de castanheiro em Portugal ter crescido de forma sistemática, sendo provável que se situe actualmente em torno dos 43500 hectares. Analisam-se as causas prováveis para aparente contradição no apuramento da área total em Portugal. Propõem-se metodologias tendentes a uma melhoria da precisão das estimativas já avançadas no âmbito da 4ª revisão IFN2005. Finalmente analisam-se as perspectivas de evolução desta espécie num futuro próximo, nomeadamente face à valorização económica que a castanha tem actualmente.

236

P3.02. POSICIÓN FITOCLIMÁTICA DE LOS CASTAÑARES (Castanea sativa Mill.) EN ESPAÑA

J.M. García-López1; & C. Allué Camacho2

1.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected] 2.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected]

RESUMEN

Se realizan diversas aportaciones al conocimiento fitoclimático de los castañares españoles. La caracterización fitoclimática se efectuó a partir del estudio de 898 puntos de muestreo procedentes del II Inventario Forestal Nacional con presencia de Castanea sativa Mill. como especie dominante de la formación forestal. Los castañares españoles se sitúan en 9 subtipos fitoclimáticos: IV4; IV(VI)1;

IV(VI)2; VI(IV)1; VI(IV)2, VI(IV)3; VI(IV)4, VI(V), VI y VI(VII). Los mayores Índices de Idoneidad del castañar se hallan globalmente en subtipos nemoromediterráneos o mediterráneos: IV(VI)2, VI(IV)3,

IV4, y VI(IV)2. Los subtipos nemorales (VI) o nemoroesteparios (VI(VII)) son los menos idóneos. En el caso de las estaciones correspondientes a fitoclimas mediterráneos genuinos (IV4), los mayores

índices de idoneidad se dan en aquellas ternas en las que entra el subtipo VI(IV)2 como primer análogo.

Palabras clave: Fitoclimatología, castaño, Castanea, envolvente convexa, idoneidad,

1. INTRODUCCIÓN

Los castañares son formaciones propias de la región mediterránea septentrional, con algunas manifestaciones menores en centroeuropa, en el norte de África y en el Cáucaso. En España existen cerca de 84.000 ha atribuibles a esta especie, según datos del II Inventario Forestal Nacional. Pueden destacarse 4 núcleos principales de distribución (Ruiz de la Torre, 2006): El primero centrado en el noroeste y litoral cantábrico, desde Galicia a Navarra, el segundo en Cataluña (Barcelona y Gerona), el tercero en el centro-oeste (Valle del Tiétar, Gredos, Peña de Francia, suroeste de Madrid, etc…) y el cuarto en Andalucía (Sierras de Ronda, Aracena, Sierra Nevada y Sierra Morena). Como consecuencia de la prolongada intervención y extensión por el hombre, es hoy muy difícil precisar su área de distribución natural. A pesar de ser relativamente abundantes los trabajos en los que se mencionan aspectos ecológicos sobre Castanea sativa, la faceta fitoclimática ha sido tradicionalmente muy poco estudiada. Los estudios más completos existentes hasta el momento para todo el territorio nacional son los de Gandullo et al. (2004), basados en 182 parcelas. En el presente trabajo se pretende avanzar en el conocimiento fitoclimático de los castañares españoles mediante la aplicación de una

237 metodología que permita una visión fitoclimática más completa que la hasta ahora existente para estas formaciones y permita formular hipótesis sobre sus áreas fitoclimáticas naturales.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

A partir de la base de datos de parcelas de muestreo correspondientes al II Inventario Forestal Nacional (DGCONA, 1986-1995), se seleccionaron 898 puntos con presencia natural de Castanea sativa como especie principal de la formación forestal. La selección de parcelas se hizo mediante la utilidad informática BASIFOR (Del Río et al., 2001) segregando aquellos registros con presencia natural del castaño como primera especie dominante de la formación. En la figura 1 puede observarse la distribución de los 898 puntos de muestreo utilizados. El sistema fitoclimático utilizado es el basado en los modelos de Allué-Andrade (1990 y 1997) modificado por García-López & Allué Camacho (2003). Este sistema fitoclimático fue el elegido para la realización del presente estudio al ser en la actualidad el único sistema fitoclimático de carácter cuantitativo, es decir, que no sólo permite la adscripción meramente cualitativa de una estación a una categoría fitoclimática previamente definida, sino que permite además una cuantificación del nivel de adecuación de la estación a dicha categoría o tipo fitoclimático y también al resto de tipos del sistema, mediante la utilización de “coordenadas de posición” y de “distancias fitoclimáticas” relativas entre sí y referidas a ámbitos fitoclimáticos factoriales correspondientes a las principales estrategias de vida vegetal de las cubiertas forestales dominantes basadas en los tipos vitales de Walter & Lieth (1960). Todo ello permite algo importante en este estudio, como es la cuantificación numérica del grado de potencialidad fitoclimática de un territorio para albergar castañares.

Figura 1. Situación de los 898 puntos del II IFN con presencia de Castanea sativa Mill. como especie principal de la formación vegetal

238

Los 898 puntos de castañar fueron identificados por sus coordenadas UTM (Huso 30) y su altitud, y se trataron con el programa informático FITOCLIMOAL’2000 (García-López & Allué Camacho, 2000) para la obtención de los datos mensuales brutos de temperatura y precipitación conforme a los modelos de Sánchez Palomares et al. (1999). Posteriormente, con el mismo programa fueron hallados los factores fitoclimáticos de la tabla 1.

Tabla 1. Factores fitoclimáticos utilizados ABREVIATURA FACTOR UNIDAD Intensidad de la aridez. Se calcula por el cociente As/Ah, siendo Ah el área húmeda de climodiagrama (curva de Pi por encima de la de Ti, es K decir 2TiPi). Duración de la aridez, en el sentido de GAUSSEN, es decir, el número de A meses en que la curva de Ti se sitúa por encima de la de Pi, es decir meses cuando 2Ti>Pi. P Precipitación anual total mm. PE Precipitación estival mínima (Junio, Julio, Agosto o Septiembre) mm. TMF Temperatura media mensual más baja ºC T Temperatura media anual ºC TMC Temperatura media mensual más alta ºC Temperatura media de las mínimas del mes de temperatura media más TMMF ºC baja Temperatura media de las máximas del mes de temperatura media más TMMC ºC alta HS Helada segura. Nº de meses en que Ti>=4ºC meses Periodo de actividad vegetal libre, calculada como el número de meses PV meses en que Ti>=7,5ºC excluidos los periodos con A>0 OSC Oscilación térmica. Se calcula como TMC-TMF ºC

Mediante el mismo programa informático se hallaron los espectros de diagnosis fitoclimática abreviada de las 898 estaciones analizadas y los Índices de Idoneidad Fitoclimática de carácter autoecológico para el castañar. Las ternas de diagnosis fitoclimáticas basadas en los subtipos de la tabla 2 permiten una aproximación de carácter politético, es decir, de forma conjunta y comparada respecto a todos los subtipos considerados en el sistema fitoclimático. De esta forma, una anotación abreviada del tipo (G; A1; A2; A3; D1; D2) permite definir suficientemente a nuestros efectos un fitoclima mediante la consideración conjunta del subtipo Genuino (G), de sus subtipos análogos (A1, A2 y A3) en orden de escalar de adecuación decreciente y de sus subtipos dispares de escalar de adecuación positivo decreciente D1 y D2. A los efectos de este trabajo se entiende por “idoneidad fitoclimática” (ALLUÉ CAMACHO, 1996) el grado de adecuación de un lugar para acoger a determinados taxones o sintaxones, todo ello desde el punto de vista mixto de su perdurabilidad (capacidad de autoregeneración), de su competitividad con otras especies y resistencia a enfermedades.

239

3. RESULTADOS

En la tabla 2 se expone las ternas de diagnosis fitoclimática abreviada (G; A1; A2; A3; D1; D2) y sus correspondientes Índices de Idoneidad Fitoclimática de carácter autoecológico para Castanea sativa:

Tabla 2. Espectros de diagnosis fitoclimática abreviada (G; A1; A2; A3; D1; D2), Número de estaciones correspondientes (Nº), Idoneidad Media (ID) y desviación estándar de la Idoneidad (Dst) de los 898 puntos de muestreo analizados. Los códigos de las ternas corresponden a los siguientes subtipos: 6: IV4; 7: IV(VI)1; 8: IV(VI)2; 9: VI(IV)1, 10: VI(IV)2; 11: VI(IV)3 12: VI(IV)4; 13: VI(VII); 14: VI(V); 15: VI Espectro Fitoclimático Nº Idx100 media Id Dst. Espectro Fitoclimático Nº Idx100 media Id Dst. ( 6 ; — ; — ; — ; — ; — ) 13 58,5 7 ( 10 ; 6 ; 7 ; — ; — ; — ) 7 66,6 1,8 ( 6 ; 10 ; — ; — ; — ; — ) 3 68,3 2,3 ( 10 ; 6 ; 9 ; — ; — ; — ) 1 60 0 ( 6 ; 10 ; 11 ; — ; — ; — ) 2 69 0 ( 10 ; 7 ; — ; — ; — ; — ) 5 56,8 1,8 ( 6 ; 10 ; 11 ; — ; 4 ; — ) 1 69 0 ( 10 ; 7 ; — ; — ; 9 ; — ) 1 58 0 ( 6 ; 10 ; 11 ; 4 ; — ; — ) 3 69,7 0,6 ( 10 ; 7 ; 6 ; — ; — ; — ) 9 65 1,9 ( 6 ; 10 ; 11 ; 9 ; 4 ; — ) 1 67 0 ( 10 ; 7 ; 9 ; — ; — ; — ) 1 63 0 ( 6 ; 10 ; 4 ; — ; — ; — ) 1 70 0 ( 10 ; 8 ; — ; — ; — ; — ) 11 65 1,1 ( 6 ; 10 ; 9 ; — ; 4 ; — ) 1 67 0 ( 10 ; 9 ; — ; — ; — ; — ) 23 62,5 3,8 ( 6 ; 4 ; — ; — ; — ; — ) 8 49,1 14,2 ( 10 ; 9 ; — ; — ; 8 ; — ) 2 65,5 0,7 ( 6 ; 4 ; 10 ; — ; — ; — ) 2 69,5 0,7 ( 10 ; 9 ; 6 ; — ; — ; — ) 5 65 3,1 ( 6 ; 4 ; 9 ; — ; — ; — ) 4 58,8 8,1 ( 10 ; 9 ; 8 ; — ; — ; — ) 14 65,6 1,8

( 6 ; 4 ; 9 ; 10 ; — ; — ) 1 47 0 Total VI(IV)2 294 60,6 4,8 ( 6 ; 9 ; — ; — ; — ; — ) 5 58 6,1 ( 11 ; 10 ; — ; — ; — ; — ) 3 67,3 1,2 ( 6 ; 9 ; 10 ; — ; 4 ; — ) 2 68,5 0,7 ( 11 ; 10 ; — ; — ; 4 ; 9 ) 1 68 0

( 6 ; 9 ; 10 ; — ; 4 ; 7 ) 1 64 0 Total VI(IV)3 4 67,5 1 ( 6 ; 9 ; 10 ; 4 ; 7 ; — ) 2 65 0 ( 12 ; 10 ; 9 ; — ; — ; — ) 1 69 0 ( 6 ; 9 ; 10 ; 8 ; 4 ; — ) 7 67,9 0,4 ( 12 ; 14 ; — ; — ; 13 ; — ) 14 53,7 3,3 ( 6 ; 9 ; 10 ; 8 ; 4 ; 7 ) 2 68 0 ( 12 ; 14 ; 10 ; — ; — ; — ) 12 63,8 2 ( 12 ; 14 ; 10 ; — ; 13 ; — ( 6 ; 9 ; 10 ; 8 ; 7 ; 4 ) 1 67 0 ) 28 51,7 1,4 ( 6 ; 9 ; 4 ; — ; 7 ; — ) 4 63,3 0,5 ( 12 ; 14 ; 10 ; 9 ; — ; — ) 1 62 0 ( 6 ; 9 ; 7 ; — ; 4 ; — ) 1 66 0 ( 12 ; 14 ; 13 ; — ; — ; — ) 35 47,8 1,3 ( 12 ; 14 ; 13 ; 10 ; — ; — ( 6 ; 9 ; 7 ; — ; 5 ; 4 ) 1 59 0 ) 3 48,7 0,6 ( 12 ; 14 ; 13 ; 15 ; — ; — ( 6 ; 9 ; 7 ; 10 ; 4 ; — ) 1 63 0 ) 3 47,7 1,2

Total IV4 67 61,8 9 ( 12 ; 14 ; 9 ; — ; 13 ; — ) 1 61 0 ( 7 ; 9 ; 10 ; — ; — ; — ) 3 59,7 3,1 ( 12 ; 8 ; 10 ; — ; — ; — ) 1 67 0

Total IV(VI)1 3 59,7 3,1 ( 12 ; 8 ; 9 ; — ; — ; — ) 1 67 0 ( 8 ; 11 ; 9 ; 10 ; — ; — ) 1 73 0 ( 12 ; 9 ; 10 ; — ; — ; — ) 1 72 0

( 8 ; 12 ; 9 ; — ; 11 ; — ) 1 72 0 Total VI(IV)4 101 52,7 6,3 ( 8 ; 12 ; 9 ; 10 ; 11 ; — ) 1 71 0 ( 13 ; 14 ; — ; — ; — ; — ) 2 48,5 0,7 ( 8 ; 9 ; — ; — ; 11 ; — ) 1 71 0 ( 13 ; 14 ; — ; — ; 10 ; — ) 1 48 0

240

Total IV(VI)2 4 71,8 1 ( 13 ; 15 ; — ; — ; — ; — ) 1 48 0 ( 13 ; 15 ; 12 ; — ; 10 ; — ( 9 ; 10 ; — ; — ; — ; — ) 5 56,2 0,4 ) 1 46 0 ( 9 ; 10 ; — ; — ; 5 ; 8 ) 1 64 0 ( 13 ; 9 ; 15 ; — ; — ; — ) 1 55 0 ( 9 ; 8 ; 10 ; — ; — ; — ) 1 66 0 Total VI(VII) 6 49 3,1

Total VI(IV)1 7 58,7 4,3 ( 14 ; — ; — ; — ; — ; — ) 69 54,4 3,9 ( 10 ; — ; — ; — ; — ; — ) 80 61,5 4,3 ( 14 ; — ; — ; — ; 10 ; — ) 1 53 0 ( 10 ; — ; — ; — ; 11 ; — ) 2 62,5 2,1 ( 14 ; — ; — ; — ; 12 ; — ) 11 53,8 5 ( 10 ; — ; — ; — ; 12 ; — ) 1 58 0 ( 14 ; — ; — ; — ; 12 ; 15 ) 1 54 0 ( 10 ; — ; — ; — ; 13 ; — ) 1 53 0 ( 14 ; — ; — ; — ; 15 ; — ) 15 54,3 2,2 ( 10 ; — ; — ; — ; 15 ; — ) 2 58 0 ( 14 ; — ; — ; — ; 15 ; 12 ) 1 54 0 ( 10 ; — ; — ; — ; 6 ; — ) 4 64 0,8 ( 14 ; 10 ; — ; — ; — ; — ) 30 55,8 5,8 ( 10 ; — ; — ; — ; 7 ; 6 ) 2 63,5 3,5 ( 14 ; 10 ; — ; — ; 12 ; — ) 20 57,1 4,1 ( 10 ; 11 ; — ; — ; — ; — ) 9 63,9 2,5 ( 14 ; 10 ; — ; — ; 15 ; — ) 1 50 0 ( 14 ; 10 ; 12 ; — ; 13 ; — ( 10 ; 12 ; — ; — ; — ; — ) 2 58 0 ) 2 51,5 0,7 ( 10 ; 12 ; — ; — ; 13 ; — ) 8 57,9 0,4 ( 14 ; 10 ; 15 ; — ; — ; — ) 6 47,5 1 ( 10 ; 12 ; 13 ; — ; — ; — ) 2 58 0 ( 14 ; 12 ; — ; — ; — ; — ) 13 53,4 3,7 ( 10 ; 13 ; — ; — ; — ; — ) 1 52 0 ( 14 ; 12 ; — ; — ; 13 ; — ) 17 53,4 1,9 ( 14 ; 12 ; — ; — ; 15 ; 13 ( 10 ; 13 ; 7 ; — ; 9 ; — ) 1 52 0 ) 1 53 0 ( 10 ; 14 ; — ; — ; — ; — ) 14 55,8 1,7 ( 14 ; 12 ; 10 ; — ; — ; — ) 32 58,8 4,3 ( 10 ; 14 ; — ; — ; 12 ; — ( 14 ; 12 ; 10 ; — ; 13 ; — ) 5 55,6 0,9 ) 4 53,8 2,1 ( 10 ; 14 ; — ; — ; 12 ; 13 ) 1 55 0 ( 14 ; 12 ; 13 ; — ; — ; — ) 1 52 0 ( 10 ; 14 ; — ; — ; 15 ; — ( 14 ; 12 ; 13 ; — ; 15 ; — ) 3 57 1 ) 1 52 0 ( 10 ; 14 ; 15 ; — ; — ; — ) 11 53,5 3,5 ( 14 ; 13 ; 15 ; — ; — ; — ) 1 49 0 ( 10 ; 14 ; 15 ; — ; 12 ; — ) 6 54,8 0,8 ( 14 ; 15 ; — ; — ; — ; — ) 104 49,6 3,2 ( 10 ; 15 ; — ; — ; — ; — ) 21 56,1 1,5 ( 14 ; 15 ; — ; — ; 10 ; — ) 2 47,5 0,7 ( 10 ; 15 ; — ; — ; 12 ; — ) 5 57,4 0,5 ( 14 ; 15 ; — ; — ; 12 ; — ) 33 50,7 2,8 ( 10 ; 15 ; — ; — ; 13 ; — ) 1 43 0 ( 14 ; 15 ; 10 ; — ; — ; — ) 1 48 0 ( 10 ; 15 ; 14 ; — ; — ; — ) 10 56,3 0,5 Total VI(V) 367 53 4,8 ( 10 ; 15 ; 14 ; — ; 12 ; — ) 1 56 0 ( 15 ; — ; — ; — ; — ; — ) 70 47,6 5,9 ( 10 ; 6 ; — ; — ; — ; — ) 15 64,7 1,8 ( 15 ; — ; — ; — ; 10 ; — ) 2 51 1,4

241

( 10 ; 6 ; — ; — ; 7 ; — ) 6 65,3 1,9 ( 15 ; 10 ; — ; — ; — ; — ) 13 42,7 4,9 ( 10 ; 6 ; — ; — ; 9 ; — ) 1 63 0 ( 15 ; 14 ; — ; — ; — ; — ) 10 50,7 4 Total VI 95 47,3 5,9

Tal como se expone en la tabla 2, los castañares españoles se sitúan en 9 subtipos fitoclimáticos: IV4; IV(VI)1; IV(VI)2; VI(IV)1; VI(IV)2, VI(IV)3; VI(IV)4, VI(V), VI y VI(VII). A pesar de que la mayor parte de las estaciones estudiadas (367 sobre 898) corresponden al subtipo nemorolauroide VI(V), su Índice de Idoneidad Fitoclimática medio es bajo (0,53). Los mayores Índices de Idoneidad del castañar se hallan globalmente en los subtipos, IV(VI)2 con 0,72, VI(IV)3 con 0,67, IV4 con 0,62 y

VI(IV)2 con 0,61. Los subtipos nemorales (VI) o nemoroesteparios (VI(VII)) son los menos idóneos. Desde un punto de vista politético, esto es, considerando la posición de las estaciones respecto del resto de subtipos que componen el sistema, los castañares se sitúan en 117 tipos de espectros fitoclimáticos.

En el caso de las estaciones correspondientes a fitoclimas mediterráneos genuinos (IV4), los mayores índices de idoneidad se dan en aquellas ternas en las que entra el subtipo VI(IV)2 como primer o segundo análogo y algo parecido puede decirse de los espectros encabezados por VI(IV)2, en que las mayores idoneidades se obtienen cuando IV4 entra como primer o segundo análogo.

4. DISCUSIÓN

La metodología aplicada en el presente estudio parece sugerir con claridad algunos aspectos fitoclimáticos de interés de los castañares españoles. Por una parte parece confirmarse el carácter netamente mediterráneo en lugar de nemoral de estos castañares, que obtienen globalmente sus mayores idoneidades fitoclimáticas en subtipos nemoromediterráneos o mediterráneos transicionales y las menores en subtipos nemorales, ya sea genuinos, lauroides o subesteparios, por lo que sus manifestaciones naturales se encuadrarían más bien en el ámbito de frondosas marcescentes como sugiere la propia marcescencia foliar de los castañares jóvenes, principalmente en sus variantes más térmicas y cercanas a la esclerofilia. En particular, las elevadas idoneidades detectadas en el subtipo

IV(VI)2 del litoral noreste peninsular parece confirmar una distribución natural del castañar propia de la región mediterránea septentrional y es consecuente con las afirmaciones de varios autores que ven en esta zona las mejores masas de castaño (Ruiz de la Torre, 2006). Parece confirmarse también el posible origen artificial de buena parte de las masas de castaño norteñas y noroccidentales, que por otra parte, en consonancia con los bajos Índices de Idoneidad hallados, se encuentran en general en mal estado sanitario frente a las áreas nemoromediterráneas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Patologia / Patología

P4.01. PRIMEROS ESTUDIOS DE LA DIVERSIDAD Y PERSISTENCIA DE NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS EN SUELOS DE CASTAÑO EN GALICIA

1Picoaga, A., 1Abelleira, A., 1,2Mansilla, J. P.

1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la Robleda s/n 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

RESUMEN

Se ha realizado un estudio en suelos de castaño de Galicia para registrar la presencia de nematodos entomopatógenos (NEP’s) adaptados a nuestras condiciones climáticas y edáficas, y un ensayo de persistencia en campo, para conocer el comportamiento de diversas cepas de NEP’s y su posibilidad para la lucha contra las plagas que afectan al fruto del castaño.

Palabras clave: Control biológico, castaño, Cydia spp., Curculio elephas, nematodos entomopatógenos.

1. INTRODUCCIÓN

En Galicia, el castaño (Castanea sativa Mill.) ha sido desde siempre un árbol con un gran valor, tanto productor (por su fruto y madera) como paisajístico. De la producción de castaño actual, la mayor parte está destinada a fruto, produciéndose en Galicia entre el 40 y 60% del total que se obtiene en España, siendo la provincia de Ourense la primera a nivel nacional, en número de empresas dedicadas a la comercialización y transformación de castañas. Esta producción se ve afectada por plagas de insectos que dañan al fruto, disminuyendo su calidad y valor comercial. Los que causan mayores daños en el castaño en Galicia son Cydia splendana Hb., Curculio elephas Gyll y Cydia fagiglandana Zel. (Mansilla et al., 2000). Cydia splendana (Lepidoptera, Tortricidae) o tortícido tardío de la castaña es el causante de las mayores pérdidas. La larvas recién eclosionadas penetran en el fruto y se desarrollan en él durante uno o dos meses, excavando galerías y provocando su caída prematura. Las larvas realizan un orificio de salida y pasan al suelo donde pupan y permanecen durante todo el invierno y la primavera. Curculio elephas (Coleoptera, Curculionidae) o gorgojo de las castañas pasa también su estadio larval en el interior de frutos ya formados. La hembra adulta pone un solo huevo en el interior de la castaña, donde la larva eclosiona y se desarrolla durante 40 días, tras los cuales realiza un orificio para pasar al suelo e invernar. La mayoría de estas larvas pupan al año siguiente. Cydia fagiglandana (Lepidoptera, Tortricidae) o tortrícido intermedio de la castaña ataca al fruto pero su daño en Galicia no es tan acusado debido a que su densidad poblacional es muy baja (Mansilla et al., 2003). Al igual que las especies anteriores, las larvas forman galerías en el interior de las castañas y las abandonan para enterrarse en el suelo y pupar.

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En España no hay, hasta el momento, ningún producto fitosanitario registrado para el castaño con el que realizar un control químico de estas plagas. Además, la política actual de la Unión Europea en relación a estos productos es reducir el uso de materias activas, por lo que es necesaria la búsqueda de tratamientos o estrategias de lucha alternativas con el fin de reducir la incidencia de estas plagas. Un posible método de control es la utilización de nematodos entomopatógenos (NEP’s). Los nematodos entomopatógenos son parásitos obligados de insectos que se caracterizan por estar asociados simbióticamente con una bacteria que les confiere un gran potencial como insecticidas. Estos nematodos, que pertenecen a los géneros Steinernema y Heterorhabditis, presentan un tercer estadio juvenil resistente de vida libre que permanece en el suelo, en una especie de letargo, a la espera del hospedador. Cuando este estadio juvenil infectivo entra en contacto con la larva del insecto a hospedar, penetra en ella y libera la bacteria que porta en su intestino. Esta bacteria secreta toxinas y exoenzimas que inhiben el crecimiento de otros microorganismos y matan al insecto en 24-48 h., además de descomponer los tejidos de la larva hospedada. A partir de ahí, el nematodo continúa su desarrollo alimentándose de la bacteria y del insecto en descomposición, completando varias generaciones, hasta que consumen todo el interior de la larva. En ese momento, los juveniles resistentes recuperan la bacteria y regresan al suelo en busca de un nuevo huésped. Su eficacia contra las plagas que afectan al fruto del castaño ha sido ensayada en campo y laboratorio en varios países europeos (Clausi y Vinciguerra, 2005; Kepenekci et al., 2004; Kuske, 2005), obteniendo buenos resultados. Clausi y Vinciguerra (2005) observaron que los nematodos del género Heterorhabditis presentan mayor afinidad por larvas de curculiónidos, mientras que los juveniles infectivos del género Steinernema son más eficaces parasitando larvas de tortrícidos. Aunque esta efectividad no depende sólo del grado de afinidad nematodo-plaga, sino también de la adaptación de las distintas cepas a las condiciones ambientales y edáficas del área de aplicación. Diversos autores coinciden (Stock, 1999; Hazir, 2003) en la importancia de aplicar cepas adaptadas a las condiciones de una determinada zona con el fin de aumentar su eficacia y evitar introducir especies exóticas que puedan causar un impacto negativo en el medio. En nuestro laboratorio de la Estación Fitopatolóxica do Areeiro se están llevando a cabo estudios para conocer la diversidad de nematodos entomopatógenos presentes en distintos cultivos de Galicia, identificando, hasta el momento, la presencia de especies de los géneros Steinernema y Heterorhabditis en zonas de viña y pradera. Este trabajo se ha realizado con el fin de adquirir un mayor conocimiento del comportamiento de los NEP’s en los sotos gallegos para su posible utilización en la lucha contra las principales plagas antes citadas. Para ello, se ha comenzado muestreando la zona sur de Galicia para verificar la presencia de NEP’s adaptados a nuestras condiciones climáticas y edáficas, y se ha estudiado la capacidad de varias especies de estos nematodos para permanecer en el suelo en dichas condiciones.

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2. MATERIAL Y MÉTODOS

Muestreo de NEP’s en suelos de castaño en Galicia Los muestreos para la obtención de nematodos entomopatógenos autóctonos se realizaron en 4 sotos de la provincia de Pontevedra (Pontecaldelas, Soutomaior, Lourizán y Areeiro) y 4 de Ourense, en el mes de diciembre de 2006. Se tomaron muestras de suelo, de aproximadamente 2 Kg., a una profundidad de 0-30 cm. y se trasladaron al laboratorio para su posterior tratamiento. La técnica de extracción utilizada es la descrita por Beeding y Akhurst (1975) que se basa en la utilización de trampas cebo con larvas de Galleria mellonella (L.)(Lepidoptera, Pyralidae) en su último estadio larvario. Posteriormente las larvas con síntomas de ataque de nematodos se pasaron a trampas White modificadas (Kaya y Stock, 1997) y se incubaron a 24 ºC, recogiendo del agua, al cabo de 6 días aproximadamente, los juveniles infectivos. La identificación de los nematodos aislados se realizó por análisis morfológicos y morfométricos del estadio juvenil resistente y del adulto, y por técnicas moleculares mediante secuenciación del ADN.

Ensayos de persistencia de NEP’s Para el estudio de la persistencia de los NEP en campo se realizaron 2 ensayos en dos sotos de la provincia de Pontevedra (Soutomaior y Areeiro).Se delimitaron parcelas de 1 m2 cada una y se aplicaron, mediante pulverizadores, 500 ml. de agua con una concentración de 1000 juveniles infectivos/ml por parcela. Después de la aplicación se regaron las parcelas con el fin de facilitar la entrada de los nematodos en el suelo. Las especies de nematodos inoculadas fueron dos cepas de Steinernema feltiae Filipjev, 1934 aisladas de suelos de pradera de las provincias de Coruña (Arteixo) y Lugo (Friol) (Picoaga, 2005) y dos cepas de Heterorhabditis bacteriophora Poinar, 1976, una aislada de suelo de viña de la provincia de Pontevedra (Castrelo) (resultados no publicados) y otra comercial (Larvanem®, Koppert). Se muestrearon ambos ensayos mensualmente con el fin de evaluar la permanencia de dichas cepas en el suelo, tomando muestras a una profundidad de 0-30 cm., de cada una de las parcelas y del borde como control. Para la extracción de los nematodos se prepararon cuatro trampas-cebo de cada muestra, con 10 larvas de G. mellonella cada una, analizando un total de 40 larvas de G. mellonella por parcela. Se registró el número de larvas muertas por el ataque de nematodos en cada trampa-cebo para conocer la densidad de los juveniles infectivos en el suelo.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Muestreo de NEP’s en suelos de castaño en Galicia En este estudio de los sotos gallegos se ha detectado presencia de juveniles infectivos, que han sido identificados morfológica y molecularmente como Heterorhabditis bacteriophora, siendo la primera vez que esta especie se encuentra asociada a suelos de castaño en España.

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H. bacteriophora es una especie de NEP ampliamente distribuida por todo el mundo. Fue citada por primera vez en Brecon (Australia)(Poinar, 1976) parasitando una larva de Heliothis punctigera, y a partir de ahí citada en numerosos países de Africa, Asia, América y Europa. En España ha sido descrita en Cataluña (García del Pino, 1994), aislada de suelos hortícolas. De las áreas muestreadas hasta el momento, solamente se han registrado juveniles resistentes en Areeiro. Los nematodos de la especie H. bacteriophora prefieren hábitats de suelos arenosos de pHs ácidos, próximos al mar y con temperaturas suaves (García del Pino, 1994; Stock et al., 1999; Hazir et al., 2003). Areeiro es una zona próxima al mar, de suelos arenosos con pH de 5.8 y temperatura media anual de 22 ºC, lo que la hace idónea para la supervivencia de estas formas infectivas en el suelo.

Ensayos de persistencia de NEP’s Los resultados obtenidos, hasta el momento, en relación a la persistencia de los juveniles resistentes, demuestran que las cepas inoculadas permanecieron durante aproximadamente 60 días en el suelo, en los dos ensayos realizados. Tanto S. feltiae como H. bacteriophora han permanecido viables en el suelo durante este tiempo, pudiendo afectar, respectivamente, a larvas de tortrícidos y curculionidos, ambas plagas del fruto del castaño en Galicia. En la Tabla 1 se refleja el porcentaje de larvas de G. mellonella muertas por el ataque de nematodos entomopatógenos, considerando este resultado como el porcentaje de abundancia de juveniles infectivos en el suelo, por parcela y ensayo. La cepa S. feltiae (Friol) se inoculó un mes después del inicio de la prueba debido a la falta de juveniles resistentes, por lo que no hay registrados resultados en el primer muestreo.

Tabla 1. Porcentaje de abundancia de juveniles infectivos, en ambos ensayos, en cada uno de los muestreos realizados Cepas inoculadas (20.01.07) Areeiro Soutomaior 20.02.07 20.03.07 20.02.03 20.03.07 Heterorhabditis bacteriophora 67,5% 42,5% 55% 15% (Castrelo) Heterorhabditis bacteriophora 40% 27,5% 27,5% 2,5% (Larvanem®) Steinernema feltiae (Arteixo) 47,5% 35% 22,5% 15% Steinernema feltiae (Friol) - 27,5% - 12,5% Borde parcela (sin tratamiento) 0% 5% 0% 0% -: sin datos. Juveniles infectivos de S. feltiae (Friol) inoculados el 20.02.07

Como se puede observar en la tabla, existen diferencias en el porcentaje de juveniles recuperados, no solo entre zonas sino también dentro del mismo área. La cepa de H. bacteriophora (Castrelo) es la más abundante en todos los muestreos realizados, recuperándose, aproximadamente, dos tercios de la población inoculada en Areeiro, en el primer muestreo. La cepa comercial de la misma especie, por el contrario, no supera en porcentaje la mitad de los juveniles inoculados, en ningún caso, y se puede observar un descenso en el número de nematodos en el segundo muestreo, sobre todo en el ensayo de Soutomaior. Esta diferencia puede ser debida a que la cepa de Castrelo se trata de una cepa aislada de suelos gallegos y adaptada a nuestras condiciones climáticas y edáficas. La cepa de S. feltiae (Arteixo), hasta el momento, ha presentado unos

247 resultados bastante homogéneos, ya que sin mostrar unos porcentajes muy elevados, es en la que se observa menor variabilidad en la densidad de juveniles a lo largo del tiempo. Esto puede ser debido a que, al igual que la cepa de H. bacteriophora (Castrelo), se trata de una cepa aislada y adaptada a nuestros suelos. En las muestras analizadas del borde de las parcelas no se detectó presencia de NEP’s en el primer muestreo pero si se registraron juveniles infectivos de S. feltiae en el segundo. La movilidad horizontal de los nematodos del género Steinernema ha sido estudiada por varios autores (Poinar y Hom, 1986; Schroeder y Beavers, 1987) observando que pueden llegar a recorrer hasta 4,35 cm/día, lo que aumenta notablemente la eficacia de estos nematodos en la búsqueda de larvas de insectos a los que hospedar. La menor densidad de juveniles infectivos en el ensayo de Soutomaior podría deberse al tipo de suelo. Factores físicos como la granulometría, pH, aireación, humedad o temperatura, pueden afectar en la supervivencia de los juveniles (Barbercheck, 1992), por lo que serían necesarios estudios más exhaustivos para explicar el por qué de esta baja densidad. Los resultados de esta prueba de persistencia, aunque los dos ensayos todavía continúan en estudio, demuestran que los juveniles infectivos sobreviven en el suelo, en nuestras condiciones edáficas, de temperatura y humedad, un tiempo suficiente como para entrar en contacto con la plaga a combatir. Clausi y Vinciguerra (2005) observaron, en campo, como juveniles infectivos de H. bacteriophora y S. feltiae sobrevivieron 268 y 181 días, respectivamente. Estos resultados demuestran, que en condiciones adecuadas, los nematodos entomopatógenos pueden permanecer en el terreno por periodos elevados de tiempo, durante los cuales los juveniles infectivos pueden afectar a las diferentes plagas que atacan al fruto del castaño.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Barbercheck, M.E. 1992. Effects of soil physical factors on biological control agents of soil insect pest. Florida Entomologist, 75(4):539-548. Bedding, R.A., Akhurst, R.J. 1975. A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil. Nematologica, 21: 109-116. Clausi, M., Vinciguerra, M.T. 2005. I nematodo entomopatogeni in un progetto per lo sviluppo sostenible dei castagneti. Nematologia Mediterranea, 33:91-94. García del Pino, F. 1994. Los nematodos entomopatógenos (Rhabditida: Steinernematidae y Heterorhabditidae) presentes en Cataluña y su utilización para el control biológico de insectos. Tesis doctoral. Universidad Autónoma de Barcelona. Hazir, S., Keskin, N., Stock, S.P., Kaya, H.K., Özcan, S. 2003. Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey. Biodiversity and Conservation, 12: 375-386. Kaya, H.K., Stock, S.P. 1997. Manual of techniques in insects pathology. L.A. Lacey. Academic Press. USA. Kepenekci, I., Gokce, A., Gaugler, R. 2004. Virulence of three species of entomopathogenic nematodes to the chestnut weevil, Curculio elephas (Coleoptera: Curculionidae). Nematropica, 34: 199-204. Kuske, S. 2005. Control of chestnut weevils with entomopathogenic nematodes: first experiences. Second International Symposium on Biological Control of Arthropods. Davos, Switzerland. September 12-16, 2005. Mansilla, J.P., Pérez, R., Pintos, C., Salinero, C., Iglesias, C. 2000. Plagas y enfermedades del castaño en Galicia. Xunta de Galicia.

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P4.02. EVALUATION OF COMMERCIAL PHEROMONE LURES FOR MONITORING CYDIA SPLENDANA MALES (LEPIDOPTERA: TORTRICIDAE) IN CHESTNUTS OF MADEIRA ISLAND

A. Arraiol1,2, D. Aguin-Pombo 1,2, A. M. Franquinho Aguiar 3, E. Freitas 1,2, G. Angeli4

1Centre for Macaronesian Studies, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected]; [email protected]; [email protected] 2Departament of Biology, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected]; [email protected]; [email protected] 3Regional Secretary for the Environment and Natural Resources - Agricultural Quality Laboratory, Caminho Municipal dos Caboucos, 61, 9135-372 Camacha, Madeira, Portugal, [email protected] 4IASMA Research Center, Plant Protection Department, Via E. March 1. I-38010 – San Michele all'Adige (TN), Italia, [email protected]

ABSTRACT

Chestnut fruits in Madeira Island are heavily attacked by an unknown number of carpophagous tortricid species. Pheromone lures for most common carpophagous species Pammene fasciana, Cydia splendana and C. fagiglandana were used to know which species were attacking chestnut fruits. The results showed that Cydia splendana, was responsible for the damages observed and the only species associated to chestnuts. To find the most suitable commercial pheromone lures to control this species, six different commercial pheromones have been tested: Agrisense, Tomagro, Isca Technologies, Oecos, Isagro and Pheronet. Trials were performed during a three-year period (2004- 2006) in three different localities using three pheromones per year. The results showed that this species was present from end of July until November being the period of greatest flight activity from the end of August to beginning of September. Of the six lures, Pheronet lures were the most efficient and are recommended for future control programs.

Keywords: Madeira, chestnuts, pheromone lures, Cydia splendana, monitoring

1. INTRODUÇÃO

Three species of Tortricids are responsible for great damage in chestnut production in Europe. The use of sexual pheromones in specific control programs like mating disruption or sexual confusion in conjunction with cultural techniques is the most efficient measures of control for these species. In Madeira Island chestnuts are heavily attacked but, because they are scattered on very steep slopes, efficient phytosanitary measures cannot be undertaken. Under these conditions control programs through pheromone applications seem to be the most important control measure. However, before implementing any control program based on pheromones, it is necessary to test which is the most suitable pheromone for each particular area (Angeli et al., 1998, 2001). The aim of this study was to identify how many species of carpophagous lepidoptera are feeding on chestnuts in Madeira and to select the most suitable pheromone for Cydia splendana, suspected to be the main responsible for the damages observed.

2. MATERIAL & METHODS

Trials were performed from 2004 to 2006 in the three largest chestnut areas of Madeira: Curral das Freiras, located at 800m; Jardim da Serra, at 1300m and Serra de Água, at 400m. To check

250 whether C. splendana, C. fagiglandana and/or P. fasciana were present in chestnut forests, pheromone lures of Isagro and Oecos were used for the first two species while for Pammene fasciana were used Oecos lures. These trials were performed in 2005 from mid July until mid November. For C. splendana monitoring, six different commercial lures were used to select the most suitable pheromones: Oecos, Isagro, Agrisense, Pheronet, Isca Technologies and Tomagro. For these last trials, three different pheromone lures were used in the first year, of these, the lure with the best results was used in the following year together with other two new pheromones. The similar process was used to select the pheromones of the third year. In each locality, trials were performed in three different plots during the three years of study. Lures were placed in delta traps resulting in 3 replicates per locality for each lure. Traps were settled from middle to end of July and dispensers were placed on the trees between 5 to 6m from the ground separated above other dispensers by at least 20m. Dispensers were replaced by new ones every three weeks and traps were inspected weekly. All males sampled in pheromone traps for C. fagiglandana and P. fasciana and about 1/3 of all male specimens sampled in pheromones for Cydia splendana were identified according to male genitalia following Razowski (1991).

3. RESULTS AND DISCUSSION

Population Dynamics

The results of trials showed that Cydia splendana is the only species associated to chestnuts in Madeira Island. In the three localities, specimens of C. splendana were found from the end of July to beginning of August being registered the maximum flight activity in September. The end of the flight activity period differed among localities. In Serra de Água the flight period was longer than the other two. Although in this locality the flight activity started at similar dates, the end flight activity was between the first and the third week of November being 3-6 weeks later than in Jardim da Serra and Curral das Freiras (Figure 1). Most activity was observed from the end of August to beginning of October and there was a peak of activity which corresponds to mid September. In continental areas most specimens are found from mid of August to beginning of September (Angeli et al., 1997). Thus, in Madeira the flight activity of this species from mid or end July to mid November is greater than in continental areas which may be related to the mild climatic conditions of this Island. Therefore, pheromone control in Madeira is expected to be holding also over longer period than in continental becoming also more costly.

251

900 CF 800 JS SA 700

600

500

400

Nº of specimens of Nº 300

200

100

0

4 4 4 5 5 5 5 6 6 6 6 0 0 0 0 0 0 0 0 06 t.04 t.05 .0 t.06 06 p. p. ct.05 p p. ct.06 ug. e Oc Oct.04ov.0 ug. e Oc O ov.0 ug. ug.06ug. e e O Oc A Sep.04S Sep.04 N Jul. Aug.05A Aug.05S Sep.05 N A A A S S Nov. Nov. Months

Figure 1 – Flight activity of Cydia splendana in 2004, 2005 and 2006 in three different localities: Curral das Freiras (CF), Jardim da Serra (JS) and Serra de Água (SA)

Trials with pheromones

The number of specimens per trap differed greatly among the six commercial lures. As a whole in the three years were collected 12 881 specimens of C. splendana in pheromone traps with six different lures for this species. In 2004 the number of specimens of C. splendana was highest in traps with Oecos lures (57.08%) than in traps with Isca Technologies and Tomagro lures. In 2005 the best results were obtain with Pheronet lures (42.03%) and Oecos (29.90%). Nevertheless, in some cases the same pheromone was not the best one in all localities which suggests that other factors in addition to pheromone composition may be also responsible for this. In 2006 it was used again Pheronet and Oecos lures, which gave better results in 2005, and IscaTechnologies lures. Of these, Pheronet lures gave the best results. The sites were located on steep slopes of deep valleys and pheromones within the same site often differ by several meters in altitude and have also different exposition to wind trades which makes extremely difficult to place traps in similar conditions. Despite of this, as a whole the results are promising to implement future control methods as sexual mating disruption (Angeli et al., 1997; 2001).

252

70 Agrisense

Tomagro 60 Oecos

50 Pheronet

Isagro 40 Isca Technologies 30 Specimens/trap 20

10

0

6 6 04 04 05 05 06 06 06 . 04 . 04 . t.05 . . . . .06 g. t c v O Oct. ep Oct.0 Oct.0 Au Aug Aug Sep. 04Sep. 04Oc Nov. 04 Aug.05Aug.05Sep.05 Nov Aug Aug S No Months Figure 2 – Total number of specimens of C. splendana per pheromone trap sampled in three localities with the same pheromone lure. The curves represent the results for the six pheromone lures obtained in the three years of study: 2004, 2005 and 2006

Acknowledgements

We wish to thank the owners of chestnut plantations for allowing us to perform the trials and to C. Frescata for his advice. This study is the result of a PAR project (nº 2003. 80. 001065. 8) which was financed by the European Social Found and the Regional Government of Madeira through POPRAM.

REFERENCES

Angeli, G., Antonaroli, R., Nanni, C., Rama, F., 1997. Prime esperienze di contenimento delle due tortrici del castagno Cydia fagiglandana e C. splendana com la tecnica della confussione sessuale. Informatore fitopatologico, 65-70. Angeli, G., Rama F., Ioriatti, C., Witzgall, P., 1998. Valutazione di trappole e feromoni sessuali per il monitoraggio delle tre cidie del castagno Pammene fasciana L., Cydia fagiglandana Zel. e Cydia splendana Hb. Atti Giornate Fitopatologiche, 287-292. Angeli G., Berti M., Rama F., Witzgall, P., 2001. Dannosita’delle tre cidie del castagno nell’ambiente trentino e valutazioni delle miscele feromonali di monitoraggio. In: (a cura di E. Bellini) Atti del Convegno Nazionale Castagno 2001: Marradi (Fienze), 25-27 Ottobre 2001.Firenze: Società orticola italiana, 217-223. Razowski, J., 1991. Motyle (Lepidoptera) Polski. Monografie Fauny Polski. Tom 19. Panstwowe Wydawnictwo Naukowe Warszawa Kraków.

253

P4.03. PRAGAS ASSOCIADAS À CASTANHA EM TRÁS-OS-MONTES: BIOLOGIA E ESTRAGOS

1Albino Bento, 1Susana Pereira, 1José Alberto Pereira

1 Instituto Politécnico de Bragança, CIMO/Escola Superior Agrária, Campus Santa Apolónia, Apt. 1172, 5301-855 Bragança. Portugal. [email protected]

RESUMO A castanha é uma das principais produções frutícolas de Trás-os-Montes, representando um peso na economia regional, em especial na Terra Fria. O fruto é atacado por algumas pragas e doenças que depreciam o seu valor comercial e causando perdas no rendimento dos agricultores. Este trabalho, teve por objectivo proceder a uma estimativa dos estragos provocados por pragas e doenças da castanha e por outro obter dados acerca da biologia do bichado da castanha, Laspeyresia (= Cydia) splendana (Hübner), a principal praga deste fruto na região, como primeiro passo para o delineamento de estratégias adequadas na protecção da castanha. Os estragos foram variáveis de acordo com o souto e ano, atingindo o máximo de 67,6% de frutos num dos soutos em 2004, sendo na sua maioria originados por pragas. Foram registadas capturas do bichado da castanha entre início de Julho e Outubro com um pico marcado em finais de Agosto/início de Setembro.

Palavras-chave: Castanha, estragos, Cydia splendana Hubner, biologia

1. INTRODUÇÃO

O castanheiro é uma das culturas mais antigas e representativas da região de Trás-os-Montes, sendo, em algumas regiões como a Terra Fria Transmontana, uma das principais fontes de rendimento das explorações agrícolas. Nos últimos anos, a castanha tem sido um fruto muito valorizado nos mercados nacional e internacional, sendo considerado, em alguns mercados, um fruto de luxo. A elevada exigência dos mercados não é compatível com a existência de frutos danificados por pragas ou doenças. As pragas associadas ao castanheiro assumem com alguma regularidade importância elevada. O bichado da castanha, provocado pelo complexo de pragas Laspeyresia (= Cydia) splendana (Hübner) Cydia fagiglandana Zel. Pammene fasciana L., e o gorgulho, Curculio (= Balaninus) elephas Gyll. são apontadas como as espécies que maiores estragos podem provocar (Bento et al., 2005). Este trabalho teve por objectivos estudar aspectos relativos à biologia de L. splendana, principal praga da castanha em Trás-os-Montes, e proceder à avaliação da importância dos estragos provocados em soutos da região, como primeiro passo para o delineamento de estratégias adequadas na protecção da castanha.

254

2. MATERIAIS E MÉTODOS

A parte experimental do presente estudo decorreu em diferentes localidades do distrito de Bragança. Para o acompanhamento da curva de voo do bichado da castanha, foram seleccionados três soutos, considerados representativos dos soutos da região, dois no concelho de Bragança (Rossas e Samil) e um no concelho de Macedo de Cavaleiros (Arcas). Em todas as parcelas seleccionadas as árvores são adultas e o solo é mobilizado pelo menos uma vez por ano em Samil e Arcas enquanto em Rossas o solo tem coberto vegetal permanente. Em cada uma das parcelas foram instaladas três armadilhas tipo Delta com feromona sexual, a altura superior a 3 metros. As feromonas foram substituídas mensalmente, e os registos de capturas semanalmente de início de Junho a início de Novembro de 2005 e 2006. Paralelamente foram efectuadas amostragens de folhas localizadas próximas dos ouriços de maneira a avaliar o número de posturas e acompanhar o desenvolvimento da praga. Os estragos provocados por pragas/doenças da castanha foram avaliados em frutos recolhidos de 10 soutos da região, nos anos de 2004, 2005 e 2006. Nos soutos seleccionados, na altura da colheita procedeu-se à recolha aleatória de 250 castanhas. No laboratório, para cada souto foram constituídas cinco amostras de 50 onde foi avaliado o número de frutos atacados por pragas e o número de frutos atacados por fungos.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Durante a realização do trabalho, observaram-se capturas de L. splendana entre início de Julho e Outubro, com os valores mais elevados, em ambos os anos, a serem registados em fins de Agosto/início de Setembro, período em que foi detectado um pico de voo marcado (Figura 1). O comportamento das curvas foi semelhante em ambos os anos apesar de em 2006 o número de capturas registadas ser praticamente o dobro. O maior número de capturas ocorreu no souto de Rossas, o que provavelmente estará relacionado com a não mobilização do solo da parcela uma vez que as larvas do bichado, de uma maneira geral, pupam no solo do solo.

255

16 2005 Rossas - Br. 2006 32 Rossas - Br.

12 24

8 16

4 8

Nº de indivíduos/armadilha/semana 0 Nº indivíduos/armadilha/semana de 7-Jul 21-Jul 4-Ago 19-Ago 1-Set 15-Set 29-Set 20-Out 0 21-Jul 3-Ago 17-Ago 4-Set 22-Set 6-Out

Data Data 16 Samil - Br. 32 Samil - Br.

12 24

8 16

4 8 Nº de indivíduos/armadilha/semana

0 Nº de indivíduos/armadilha/semana

7-Jul 21-Jul 4-Ago 19-Ago 1-Set 15-Set 29-Set 20-Out 0 21-Jul 3-Ago 17-Ago 4-Set 22-Set 6-Out

Data Data

16 Arcas - M.C. 32 Arcas - M.C.

12 24

8 16

4 8 Nº de indivíduos/armadilha/semana 0 Nºindivíduos/armadilha/semana de 0 21-Jul 3-Ago 17-Ago 4-Set 22-Set 6-Out 7-Jul 21-Jul 4-Ago 19-Ago 1-Set 15-Set 29-Set 20-Out

Data Data

Figura 1 – Curva de voo do bichado da castanha, Rossas (Bragança), Samil (Bragança) e Arcas (Macedo de Cavaleiros) em 2005 e 2006.

Na quantificação dos estragos provocados por doenças e pragas observou-se uma variação assinalável entre soutos no mesmo ano e entre os três anos em estudo (Quadro 1). Em 2004 foi onde os estragos foram em maior volume, variando entre 24,0% no souto de Vinhais e 67,6% na amostra proveniente do souto de Valpaços – C. Montenegro. Em 2005, os estragos foram mais moderados, não se registando qualquer fruto danificado na amostra proveniente de Bragança – Carragosa enquanto que na amostra Bragança – Vale de Nogueira, com 32,0% de frutos com estragos, foi registado o valor mais elevado. Por sua vez em 2006, obtiveram-se percentagens de frutos estragados entre 3,5, na amostra de Bragança – Vilarinho, e o máximo de 42,5%, na amostra de Bragança – Oleiros (Quadro 1). Os estragos verificados nos frutos foram originados maioritariamente por pragas, que em muitos casos representam mais de 80% dos frutos estragados. De maneira geral, o número de frutos atacados pelo bichado foi superior ao atacado pelo gorgulho da castanha (dados não apresentados).

256

Quadro 1 – Estragos causados por doenças fúngicas e pragas da castanha em soutos de Trás-os-Montes (2004- 2006) Local Estragos Estragos Total de estragos provocados por provocados por (%) fungos (%) pragas (%) 2004 Bragança - Donai 5,2±1,1 22,4±9,5 27,6±10,5 Bragança - Samil 6,8±4,8 22,8±6,9 29,6±8,2 Bragança - Terroso 8,4±2,2 16,4±6,5 24,8±4,6 Bragança - Sortes 1,6±3,6 22,8±7,6 24,4±7,1 C. Ansiães – C.A. 23,6±5,9 24,8±1,8 48,4±5,9 C. Ansiães - Zedes 13,6±5,4 20,0±4,4 33,6±6,23 M. Cavaleiros - Arcas 2,8±2,3 34,8±3,4 37,6±4,3 M. Cavaleiros – M.C. 3,6±3,9 51,2±3,0 54,8±4,2 Valpaços - C. Montenegro 4,0±3,2 63,6±9,0 67,6±6,7 Vinhais 9,6±3,9 14,4±5,0 24,0±7,6 2005 Bragança - Carragosa 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 Bragança - Donai 0,5±1,1 13,5±4,2 14,0±5,2 Bragança – Paradinha Nova 2,5±3,5 13,5±5,8 16,0±4,5 Bragança - Rossas 2,5±1,8 7,0±2,1 9,5±1,1 Bragança - Terroso 1,5±2,2 3,5±1,4 5,0±2,5 Bragança – Vale de Nogueira 1,5±1,4 30,5±6,9 32,0±6,9 Bragança - Vilarinho 4,0±1,4 7,0±5,1 11,0±5,8 C. Ansiães - Zedes 4,0±1,4 7,0±5,1 11,0±5,8 M. Cavaleiros - Arcas 3,0±2,1 18,0±4,8 21,0±4,9 M. Cavaleiros – Lamas 1,5±1,4 7,0±3,3 8,5±3,8 2006 Bragança - Donai 0,0±0,0 4,0±2,9 4,0±2,9 Bragança - Oleiros 17,0±3,3 25,5±7,2 42,5±9,0 Bragança – Paradinha Nova 0,0±0,0 22,5±5,3 22,5±5,3 Bragança - Rossas 0,0±0,0 13,0±2,7 13,0±2,7 Bragança - Samil 0,0±0,0 11,5±4,5 11,5±4,5 Bragança - Terroso 0,0±0,0 6,5±2,9 6,5±2,9 Bragança - Vilarinho 0,0±0,0 3,5±4,9 3,5±4,9 C. Ansiães - Zedes 1,0±1,4 25,5±12,4 26,5±13,6 M. Cavaleiros - Arcas 0,0±0,0 20,5±10,5 20,5±10,5 Vinhais 0,5±1,1 6,0±2,9 6,5±2,2

Os resultados indicam a existência de uma grande quantidade de frutos com estragos evidentes, que pode comprometer ou reduzir em grande parte o rendimento dos agricultores. Esta situação é de particular interesse na região da Terra Fria, onde a castanha é uma das principais fontes de rendimento da maioria das explorações agrícolas. A situação exposta justifica o delineamento e adopção de medidas tendentes a eliminar, ou minimizar os estragos provocados quer por pragas quer pelas doenças. Dentro das pragas especial atenção deverá ser dada ao bichado da castanha, pela quantidade de estragos que origina e uma vez que os seus níveis populacionais na região são consideráveis.

257

Agradecimentos

Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto INTERREG III A - Identificación de los agentes patógenos y beneficiosos de los principales cultivos de las regiones fronterizas Tras-os-Montes y Castilla y León para la realización de estrategias de control razonadas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Bento, A.; Cabanas, J.E.; Rodrigues, M.A.; Pereira, J.A., 2005. Avaliação dos estragos provocados por pragas da castanha em Trás-os-Montes. IV Congreso Nacional de Entomologia Aplicada, X Jornadas Científicas de la S.E.E.A., I Jornadas Portuguesas de Entomologia Aplicada, 17 – 21 de Outubro de 2005. Bragança, Portugal. 188p..

258

P4.04. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE AISLADOS HIPOVIRULENTOS DE CRYPHONECTRIA PARASITICA EN EL NOROESTE DE ESPAÑA

1Montenegro, D., 1Aguín,O., 2Sainz, M. J., 1,2Mansilla, J. P.

1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la robleda s/n, 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

RESUMEN

Durante 2003-2005, se llevó a cabo un muestreo de castaños con síntomas de cancro en Galicia y Castilla y León. Se obtuvieron 303 aislados de C. parasitica, quince de los cuales fueron hipovirulentos. El análisis y la caracterización del dsRNA determinaron que los hipovirus de los aislados hipovirulentos pertenecían a la especie CHV1 y, dentro de ésta, al subgrupo F1.

Palabras clave: Cryphonectria parasitica, cancro, hipovirus, CHV1

1. INTRODUCCIÓN

Cryphonectria parasitica es el ascomiceto responsable del cancro, una de las enfermedades más graves que afectan a los castaños del noroeste peninsular. Las cepas virulentas de C. parasitica son muy agresivas e invaden al huésped de forma rápida, impidiéndole formar un callo de cicatrización. El cancro se caracteriza por la aparición de lesiones, enrojecimiento y ligero hinchamiento de la corteza que posteriormente se resquebraja longitudinalmente. Como consecuencia, se produce una interrupción en el transporte de savia, provocando la muerte de toda la parte del árbol que crece por encima del cancro. Se han ensayado numerosos métodos de lucha contra la enfermedad (químicos, culturales y genéticos), en su mayoría ineficaces. Sólo el control biológico con cepas hipovirulentas del propio hongo ha proporcionado resultados satisfactorios (Heiniger y Rigling, 1994). La hipovirulencia de C. parasitica se produce por la infección del hongo por un virus de RNA de doble cadena (dsRNA) perteneciente al género Hypovirus (Hillman y Suzuki, 2004). Las cepas hipovirulentas muestran baja patogenicidad y un fenotipo en cultivo diferente al de las cepas virulentas (Elliston, 1985). Producen además cancros de crecimiento lento que se desarrollan superficialmente y que acaban cicatrizando sin producir la muerte del árbol (Heiniger y Rigling, 1994). El dsRNA puede ser transmitido de una cepa a otra mediante uniones de las hifas denominadas anastomosis, confiriéndole al individuo receptor el fenotipo hipovirulento, en un fenómeno denominado conversión (Anagnostakis et al., 1979). Las anastomosis son posibles si los individuos pertenecen al mismo tipo de compatibilidad vegetativa (vc) y además la conversión resulta más eficaz si la cepa hipovirulenta procede de la población de estudio (Mansilla et al., 2000). Un factor crítico para favorecer la diseminación del hipovirus es que la diversidad de grupos de compatibilidad vegetativa sea baja (Milgroom y Cortesi, 1999). El género Hypovirus comprende cuatro especies. En Europa sólo se ha encontrado la especie CHV1, cuya cepa tipo es la CHV1-EP713, de origen francés (Hillman y Suzuki, 2004). Esta especie presenta en Europa una gran variabilidad. Mediante marcadores RFLPs y secuenciación, se han

259 establecido 5 subtipos del virus CHV1 (Allemann et al., 1999; Gobbin et al., 2003): un subtipo italiano (CHV1-I), que está ampliamente distribuido, dos subtipos franceses (CHV1-F1 y CHV1-F2), un subtipo español (CHV1-E) y un subtipo alemán (CHV1-D). En España se han descrito cuatro cepas hipovirulentas: una en Navarra (Alleman et al., 1999) perteneciente al subtipo español, otra en Cataluña (Homs et al., 2002) del subtipo italiano, y dos en Galicia (Aguín et al., 2005a). En el noroeste de España, parecen existir condiciones adecuadas para la aplicación con éxito de programas de control biológico con cepas hipovirulentas, ya que estudios recientes sobre las poblaciones de C. parasitica en Galicia y Castilla y León muestran una baja diversidad de grupos de compatibilidad vegetativa y sugieren que el tipo de reproducción predominante es la asexual (Aguín et al., 2005a; Aguín et al., 2005b; Montenegro et al., 2006). En este trabajo, se ha realizado un extenso estudio de poblaciones de C. parasitica del noroeste peninsular para la detección de nuevos aislados hipovirulentos compatibles y la caracterización molecular del dsRNA, como paso previo para la puesta a punto de un programa de control biológico.

2. MATERIAL Y MÉTODOS

Durante 2003-2005, se llevó a cabo un muestreo de castaños afectados por cancro en las comunidades de Galicia y Castilla y León. Se buscaron árboles con características externas de la enfermedad: hinchamiento de corteza, hendiduras longitudinales, presencia de cuerpos de fructificación, micelio debajo de la corteza, etc. Se localizó la zona de avance de la enfermedad, delimitando los bordes de la lesión, y se cortaron tiras de la corteza lesionada que incluían la zona subcortical. En total se recogieron 352 muestras: 189 procedentes de Galicia y 163 de Castilla y León. Se recogió una sola muestra por cancro y por árbol. Para el aislamiento de C. parasitica, cada muestra de corteza se troceó en pequeños fragmentos (3 x 2 cm), que se sometieron a una desinfección superficial con hipoclorito sódico y etanol. Los fragmentos se sembraron en placas Petri con medio nutritivo PDA suplementado con metionina (100 mg/L) y biotina (1 mg/L) (PDAmb). Las placas se mantuvieron a 24ºC en oscuridad en estufa de cultivo. A los 4-7 días de incubación, se transfirió un fragmento del micelio crecido a una nueva placa de PDA cubierto con celofán, incubándose en las mismas condiciones. La determinación de la virulencia de los aislados de C. parasitica se basó en los criterios morfológicos descritos por Elliston (1985): color de las colonias, presencia o ausencia de picnidios, textura y grado de crecimiento en el medio de cultivo. En los casos necesarios, para confirmar la virulencia de los aislados y la presencia y especie del hipovirus, se llevó a cabo la extracción del dsRNA utilizando el protocolo descrito por Morris et al. (1983). El tamaño del dsRNA aislado se determinó utilizando el programa de densitometría 1-D Manager (TDI, Madrid). La caracterización de los subtipos de los hipovirus aislados se realizó mediante RT-PCR/RFLP y secuenciación. El cDNA se sintetizó utilizando el kit comercial Omniscript® Reverse Transcription Kit (Qiagen) a partir de 100 ng de dsRNA y siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción de PCR se llevó a cabo con las parejas de primers EP713-5/R2280 y EP713-6/EP713-7, que amplifican

260 fragmentos de 1400 pb de la región ORFA y de 1700 pb de la región ORFB, respectivamente (Allemann et al., 1999). El resultado de la amplificación se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% utilizando un marcador de peso molecular de 100 pb. A continuación, los productos de PCR se digirieron con las endonucleasas de restricción BsuRI, CfoI, HinfI y MboI. Los patrones RFLP se visualizaron tras electroforesis en gel de agarosa al 3%. Los productos de PCR correspondientes a las regiones ORFA y ORFB se purificaron utilizando el kit comercial Nucleo Spin Extract II (Macherey-Nagel), siguiendo las instrucciones del fabricante. Una alícuota del producto de purificación se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2% para estimar la concentración del DNA purificado. El DNA purificado se secuenció con el kit Big Dye Terminator V3.1 Cycle sequencing (Applied Biosystems), utilizando los primers R2280, EP713-5, EP713-6, EP713-7, hvep1 y hvep2 (Alleman et al., 1999; Gobbin et al., 2003). Los productos de la secuenciación se precipitaron con etanol y se desnaturalizaron con formamida siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los productos desnaturalizados se cargaron en un secuenciador ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Las secuencias de ADN obtenidas se analizaron con el programa Sequencing Analysis 5.1 (AP Biotech) y se compararon con las disponibles en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) mediante la aplicación BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Las secuencias obtenidas con los primers hvep y hvep2 se alinearon mediante el programa ClustalX v1.83, incluyendo la secuencia de la especie tipo CHV1-EP713 (Shapira et al., 1991b) y las utilizadas por Gobbin et al. (2003). Tras el alineamiento, se realizó un análisis filogenético mediante parsimonia utilizando el programa PHYLIP v3.66. La robustez de cada filogenia se determinó mediante el análisis bootstrap de 100 replicados, a partir de los cuales se elaboró un árbol consenso.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A partir de los castaños sintomáticos muestreados, se obtuvieron 303 aislados de Cryphonectria parasitica. La mayor parte mostró en cultivo las características establecidas para el fenotipo virulento: presencia de picnidios, crecimiento rápido en medio de cultivo y micelio de coloración anaranjada. Solamente 15 aislados presentaron un fenotipo diferente, con micelio de color blanco, crecimiento lento y ausencia de picnidios. Estos aislados fueron clasificados como hipovirulentos, lo cual se confirmó mediante la extracción del dsRNA. Los 15 aislados presentaron un dsRNA de un tamaño aproximado de 11,4 kb (figura 1), coincidente con el establecido por Shapira et al. (1991b) para el L-dsRNA de la cepa tipo CHV1-EP713. Esta especie de hipovirus es la que se localiza en Europa, aunque también se ha encontrado en China y Japón (Peever et al., 1998). Además de la banda de 11,4 kb, también se observaron bandas con pesos moleculares de aproximadamente 8,2 y 0,6 kb, que se corresponden a las formas M-dsRNA (entre 8 y 10 kb) y S-dsRNA (entre 0.6 y 1 kb), respectivamente. Estas moléculas de menor tamaño son formas truncadas del L-dsRNA que permanecen durante la replicación (Shapira et al., 1991a). Las formas M y S variaron en

261 concentración y número durante el subcultivo de los aislados, mientras que la forma L permaneció estable. En los aislados virulentos no se detectó la presencia de dsRNA. El porcentaje de cepas hipovirulentas de C. parasitica encontradas en el noroeste de España constituye el 5% del total de aislados.

M V H H H H M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 2. Gel de agarosa del producto de RT-PCR de cuatro aislados Figura 1. Gel de agarosa al 1% mostrando hipovirulentos de Cryphonectria parasitica. M: marcardor de peso la extraccion de dsRNA. M: marcador λ- molecular de 100 pb (MWM XIV Roche). Calles 1 a 4. fragmento de DNA Hind III (Fermentas). V: cepa virulenta, 1400 pb correspondiente al ORFA. Calles 6 a 9: fragmento de 1700 pb control negativo. H: cepas hipovirulentas correspondiente al ORFB. Calles 5 y 10. controles negativos de PCR

Los productos de la RT-PCR realizada a partir del dsRNA de los aislados fueron fragmentos de 1400 y 1700 pb, indicando que pertenecían a la especie CHV1 (figura 2). Esto se confirmó adicionalmente mediante secuenciación, ya que los fragmentos mostraron una homología del 98- 100% con las secuencias correspondientes al CHV1. El análisis RFLP mostró un patrón de bandas único en todas las cepas hipovirulentas analizadas. Los tamaños de bandas obtenidos coincidieron exactamente con los de la cepa CHV1- EP713 (Rigling, comunicación personal), incluida dentro del subgrupo francés F1 establecido por Alleman et al. (1999), indicando que nuestros aislados pertenecen al mismo subtipo de CHV1, el francés F1. Estos resultados se confirmaron mediante secuenciación con los primers hvep1 y hvep2 y análisis filogenético. Los hipovirus del noroeste español se agruparon en un único cluster, el correspondiente al CHV1-EP713. Las secuencias presentaron una homología del 100% y sólo un aislado mostró una sustitución nucleotídica. Éste es, para nuestro conocimiento, el primer caso de detección de cepas hipovirulentas del subtipo F1 en España. Este subtipo, al que pertenece la cepa EP713, presenta una virulencia menor que el italiano encontrado en Cataluña (Homs et al., 2002) y ha sido utilizado en programas de control biológico (Dawe y Nuss, 2001). La existencia de al menos tres subtipos de CHV1 en España apoya la hipótesis de múltiples introducciones de la hipovirulencia en nuestro país, como sucede en otros países europeos como Francia (Alleman et al., 1999). Estos datos unidos, a la baja diversidad de grupos de compatibilidad encontrados por Aguín et al. (2005a; 2005b), y a la predominancia del tipo de reproducción asexual dentro de la población de estudio (Montenegro et al., 2006), incrementa las expectativas de éxito de un programa de control biológico con cepas hipovirulentas compatibles.

262

Agradecimientos

Este trabajo ha sido financiado a través de un convenio de colaboración entre la Junta de Castilla y León y la Excma. Diputación Provincial de Pontevedra. Queremos agradecer al Dr. Daniel Rigling (Swiss Federal Researc Institute of Forest, Snow and Landscape, Birmensdorf, Suiza), al Dr. Paolo Cortesi (Istituto di Patologia Vegetale, Università degli Studi di Milano, Milán, Italia), a Dña. Paula Zamora (Centro de Sanidad Forestal de Calabazanos, Palencia, España)y a Dña. Susana Rodríguez (Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Pontevedra, España) la participación en la realización del presente proyecto.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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263

P4.05. EFEITO DE TRATAMENTOS PREVENTIVOS COM FUNGICIDAS NO CONTROLO DO CANCRO DO CASTANHEIRO

Maria Dulce Anastácio1, Maria Manuel Mesquita1, Luís Sá1, Sofia Simões2, Nuno Onofre2, Helena Bragança2

1Dir. Reg. de Agricultura de Trás-os-Montes [email protected] 2Estação Florestal Nacional Helena.Braganç[email protected]

RESUMO

O “cancro do castanheiro” doença cujo agente é o fungo Cryphonectria parasitica (Murill) Barr) foi detectado na região de Trás-os-Montes no final da década de 80. Integrado no Projecto da Medida 8.1 do Programa Agro, nº 219 que incluiu estudos base para a utilização de luta biológica e genética no combate a esta doença, este trabalho teve como objectivo testar o efeito de tratamentos químicos preventivos. Seleccionaram-se três fungicidas - Oxicloreto de cobre, Difenoconazol e Carbendazime – para aplicação em dois ensaios em Trás-os-Montes. Os resultados revelam algum efeito retardador do avanço da doença no entanto esse efeito não é significativamente relevante.

Palavras-chave: Cryphonectria parasitica, controlo, fungicidas

1. INTRODUÇÃO

A cultura do castanheiro é uma das mais antigas da região de Trás-os-Montes e constitui a base de subsistência das populações das zonas frias de média altitude até meados do século passado. O incremento das plantações de castanheiro a partir dos anos 80, conduziu ao aumento de circulação e importação de material vegetal e provavelmente a efeitos perversos como a introdução de doenças e intensificação da actividade dos já existentes. O “cancro do castanheiro” cujo agente é o fungo Cryphonectria parasitica (Murill) Barr) foi detectado em Portugal na região de Trás-os-Montes no final da década de 80 e os resultados de vários estudos entretanto efectuados revelaram que se trata de uma doença amplamente disseminada no país, com particular incidência em Trás-os-Montes

(ABREU 1992, ANASTÁCIO 2001, BRAGANÇA et al 2005) Até agora não foi possível desenvolver um método de luta eficaz contra a doença embora a luta biológica e o melhoramento possam ser ferramentas importantes. Apesar do uso de substâncias químicas apresentar muitas restrições este trabalho procurou dar uma contribuição no combate à doença através do uso de tratamentos químicos de prevenção. Com base no conhecimento que existia relativamente a fungos pertencentes ao mesmo grupo de C. parasitica e que provocavam os mesmos sintomas e mortalidade noutras espécies lenhosas, foram seleccionados três fungicidas para testar no castanheiro.

264

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Para a aplicação dos tratamentos químicos de prevenção foram instaladas dois ensaios na região de Trás-os-Montes, um na Serra da Padrela(Valpaços), em Corveira (variedade Judia, a 850 m de altitude num planalto, com idade média de 18 anos) e outro em Bragança, S.ta Comba de Rossas (variedade Longal a uma altitude de 800m, encosta virada a Norte com idade média de 14 anos). A selecção dos fungicidas teve como base a utilização do cobre para controlo do cancro da macieira (Nectria galligena) -DGPC-2000, o Carbendazime a sua utilização num ensaio de protecção das enxertias em Itália e o Difenoconazol um ensaio em laboratório no SRPV de Bordéus (Baudry,1998).Foi efectuada a marcação das árvores no ensaio de Corveira em quatro modalidades de 30 árvores cada: testemunha (T) sem qualquer tratamento, tratamento de Inverno (C) com oxicloreto de cobre (Cuprocaffaro, dose de 0,5Kg /100 L); tratamentos em vegetação com Difenoconazol(S) (Score - dose de 50gr/100 L) e com Carbendazima(D) (Derosal -dose de 60gr/100 L) quando as condições climáticas foram propícias à infecção – chuvas, trovoadas. No ensaio de Rossas foi feita marcação idêntica mas apenas com 25 árvores por modalidade, devido ao fraco desenvolvimento do souto. O ensaio decorreu com um elevado potencial de inoculo presente, porque decidimos não efectuar a extirpação dos cancros, prevista inicialmente como modalidade, pois essa experiência constava do Projecto AGRO nº 151. Os tratamentos foram efectuados com pulverizador acoplado em tractor. A contagem dos cancros foi efectuada durante o repouso vegetativo, época em que é mais fácil a sua visualização.

Quadro 1 - Datas dos tratamentos fitossanitários 2002 2003 2004 Oxicloreto de Final de Março 14/01® e 17/01© 02/03® e 03/03© cobre(C) 10/03© e 11/03® Score (S)/ Derosal(D) 07/10 © e 08/10® 14/01® e17/01© 02/06® e 08/06© 08/10( R) e 13/11© 11/08® e 14/08© 14/09© e 21/09® ©-Corveira ; ®-Rossas

Para estudo dos efeitos dos diferentes tratamentos fitossanitários aplicados aos castanheiros, analisou-se por meio de regressão linear a evolução do nº de cancros nas árvores existentes nas parcelas instaladas, incluindo a parcela testemunha, onde não se aplicou qualquer tratamento sanitário. Os dados foram previamente estudados quanto ao pressuposto da normalidade e entendeu-se como necessário transformá-los por meio do arcoseno das respectivas proporções, ou mais concretamente “o arcoseno da raiz quadrada das proporções” (Zar 1984). Num primeiro passo, o objectivo da análise de regressão linear foi verificar se os tratamentos sanitários, cada um per si, tinham ou não efeito sobre o número de cancros nas árvores. Apesar do interesse da experimentação da aplicação do tratamento ser a diminuição do número de cancros relativamente à testemunha, o teste que realizámos apenas verifica se existe diferença (aumento ou diminuição, consoante o sinal do declive da regressão). Assim, neste primeiro passo, testámos, para um nível de significância α = 0,05, a hipótese H0 de não se verificar diminuição (ou aumento) do número de cancros após o tratamento (ou seja, que o declive (coeficiente β), de cada uma das

265 regressões não é diferente de zero), versus a hipótese H1 de haver diminuição (ou aumento) do número de cancros (i.e. o declive ser estatisticamente diferente de zero). Num segundo passo, o objectivo foi o de testar se existiam diferenças entre cada um dos tratamentos. Ou seja, aqui pretendia-se estudar se os declives (ou os respectivos coeficientes β) das regressões de cada um dos tratamentos eram diferentes entre si, comparando-os dois a dois. Para o efeito alteramos o nível de significância de acordo com a correcção de Bonferroni (Sokal & Rohlf 1998), uma vez que se fazem comparações múltiplas, então α’ = α /k, em que α = 0,05 e k é igual ao número de comparações, que no caso são no máximo de 3 (T vs. C, T vs. S, T vs. D, C vs. S, C vs. D e S vs. D).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Ao analisar os resultados globalmente constatamos uma evolução muito acentuada da doença. Em três anos houve um aumento de cerca de 30%, em Corveira e cerca de 60% em Rossas. Constatou-se que o aumento do número de cancros na testemunha, em percentagem, foi superior ao verificado nas outras modalidades, como se pode ver no exemplo do gráfico referente à parcela Aldeia.

LOCALIDADE:- CORVEIRA PARCELA:- ALDEIA MODALIDADE:- TODAS(exc.T) E T EVOLUÇÃO PERCENTUAL DO Nº DE CANCROS 2002 - 2004

35

30 29

25 24

TESTEMUNHA 20 % TODAS(exc. T) Linear (TESTEMUNHA) 15 Linear (TODAS(exc. T))

10

5

0 0 2002 2004 TESTEMUNHA 029 TODAS(exc. T) 024 anos

Na Figura A apresentamos a evolução do número de cancros para cada um dos tratamentos (incluindo a testemunha), relativos à proporção do número de cancros (não o seu arcoseno), ao longo dos três anos de estudo, bem como as rectas de regressão ajustadas e os seus parâmetros.

266

Fig A - Evolução da proporção no n.º de cancros (parcelas combinadas)

0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 T 0,30 0,20 C 0,10 S 0,00 2001 2002 2003 2004 D Proporção do nº de cancros Anos

T – testemunha, C – (Cuprocaffaro) Oxicloreto de cobre, S – (Score) Difenoconazol, D – (Derosal) Carbendazime

Quadro 2 – resultados da análise de regressão

Variável Erro Padrão Erro Padrão Beta B tpR2 R2 adjustado dependente de Beta de B Intercepção -131,530 62,798 -2,095 0,284 arcsen T 0,818 0,633 anos 0,903513 0,428561 0,066 0,031 2,108 0,282 Intercepção -138,814 58,730 -2,364 0,255 arcsen C 0,858 0,700 anos 0,921940 0,387332 0,070 0,029 2,380 0,253 Intercepção -39,854 23,327 -1,708 0,337 arcsen S 0,750 0,500 anos 0,866025 0,500000 0,020 0,012 1,732 0,333 Intercepção -72,7868 21,63025 -3,36505 0,183895 arcsen D 0.9231 0,842 anos 0,959547 0,281550 0,0368 0,01080 3,40809 0,181697

De acordo com a Figura A, o aumento de cancro ao longo dos anos parece ser maior na parcela Testemunha (T) e na parcela do tratamento C (declives maiores), e menor nas parcelas em que se usaram os tratamentos D e S. Com o tratamento D o declive (ou também a taxa de aumento de cancro se assim quisermos chamar), é igual a 0,0368, enquanto que a do tratamento S é menor e igual a 0,020. Apesar destes valores não serem estandardizados (correspondem no Quadro 2 aos valores da coluna “B”), o mesmo padrão repete-se com os valores estandardizados – Beta (ver mesmo quadro). Ou seja, os tratamentos D e S parecem ser mais eficazes que o C, no entanto neste caso (cobre) houve chuvas intensas logo após os tratamentos o que poderá justiçar este comportamento. No caso do tratamento S, aquele que parecia ter melhor efeito, a proporção inicial de cancros era menor, o que torna menos robusta uma conclusão definitiva. Contudo, do ponto de vista estatístico, a análise de regressão linear (cujos resultados são mostrados no Quadro 2), revela que em nenhum caso os declives são significativos, ou seja não se rejeitou H0, para qualquer tratamento, hipótese que pressupunha os declives não serem diferentes de zero. “p”, ou a probabilidade dos declives das rectas de regressão serem diferentes de zero, é sempre maior que α = 0,05. Com os dados actuais, não existe evidência estatística suficiente para afirmar que qualquer tratamento tem efeito inibidor no aumento do número de cancros e tão pouco é possível dizer, do ponto de vista estatístico, que existem diferenças significativas entre tratamentos. Podemos no

267 entanto referir que parece haver uma tendência para algum efeito retardador do avanço da doença por parte do Carbendazime (D). No caso do Difenoconazol (S), apesar de num dos ensaios (Corveira) ter revelado uma influência positiva na diminuição da proporção dos cancros, as suas características bioquímicas - fungicida do grupo dos triazóis, que apresentam risco de induzir resistência nos fungos, obrigariam à realização de mais ensaios para confirmação da eficácia.

4. CONCLUSÕES

No final do ensaio considerámos que este tipo de intervenção - pulverização com fungicida com efeito preventivo de novas infecções – poderia ser mais uma alternativa para o controlo do cancro, podendo ser solicitada a sua aplicação para uso menor. Posteriormente, após a constatação da retirada do mercado do Carbendazime e do Triadimefão e outros, por razões ambientais pela União Europeia e por razões económicas pelas empresas de pesticidas, parece-nos ser extremamente arriscado realizar ensaios com produtos cujo futuro comercial desconhecemos. Assim, consideramos importante a continuação das medidas preventivas como a protecção dos enxertos e a desinfecção dos instrumentos de corte e das práticas curativas de remoção ou extirpação dos cancros existentes e/ou o corte de ramos infectados assim como uma aposta na implementação da luta biológica.

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268

P4.06. ANTIFUNGAL EVALUATION OF SUBSTITUTED PYRAZOLO[3,4-d]PYRIMIDINES

1 Francisco Peixoto, 2 Aravind Sivasubramanian, 3 Abreu CG, 2 Ana M.F. Oliveira-Campos and 2 Lígia M. Rodrigues

1 Chemistry Department (CECAV) University of Trás-os-Montes and Alto Douro, Vila Real Portugal 2 Chemistry Center, University of Minho, 4710-057, Braga, Portugal 3 Plant Protection Department of University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal

ABSTRACT

Chestnut ink disease caused by the oomycete Phytophthora cinnamomi, a soil-borne pathogen of world-wide distribution, is the major responsible for disease problems on chestnuts in Portugal. Substituted pyrazolo[3,4-d]pyrimidines were synthesized and their antifungal activity was tested against Phytophthora cinnamomi. All compounds of the series have been screened for their antifungal (antioomycete) activity. The results are summarized in Table 1.

Keywords: Phytophthora cinnamomi, antifungal activity, pyrazolo[3,4-d]pyrimidines

1. INTRODUCTION

Portugal is the third largest producer of chestnut fruits in Europe, being this culture one of the most old and representative of the Trás-os-Montes region. However, the chestnut ink disease induced by the soil-borne pathogen Phytophthora cinnamomi Rands and, occasionally, by P. cambivora Petri (Buisman) is the main cause for the large reduction in the chestnut tree area in Portugal (Abreu et al., 1999). Portela et al. (1999) also report that several interacting factors predispose the trees to the attack by this organism such as restrictions to root expansion, poor soil fertility, low aeration, and soil disturbance by tillage. The disease is a major threat to the sustainability of chestnut ecosystems in the northern part of Portugal (Abreu 1996), where many stands contain clusters of dead and dying trees interspersed with healthy ones. There have been many attempts to control ink disease, through biological control using ectomycorrhizal fungi (Branzanti et al. 1998), and implanting C. sativa onto ink-disease resistant rootstocks (Craddock and Bassi 1999). However, such control measures are expensive and difficult to apply. The purpose of this study was to evaluate the inhibitory growth activity of some novel synthesized compounds on Phytophthora cinnamomi.

269

2. MATERIALS AND METHODS

The pyrazolopyrimidines and related fused heterocycles are of interest as potential bioactive molecules. They are known to exhibit pharmacological activities such as CNS depressant (Kirkpatrick et al., 1977), KDR kinase inhibitors (Fraley et al., 2002), and anti-microbial (Ghorab et al., 2004). Twenty one new compounds were synthesized according to the method previously described by Sivasubramanian (Sivasubramanian et al., 2006) and the activity was tested against Phytophthora cinnamomi isolate from chestnut trees (UTAD 107 and IMI nº340340).

R R N R' N NH2 Microwave N N N + R'CN N K t-BuO CN NH2

R = C6H5(H), p-Cl C6H4(Cl), p-Br C6H4(Br) R’ = phenyl, benzyl, 3-cyanophenyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 2-thiophenyl, 2-furanyl

The activity was tested according to the method described by Rodríguez and co-workers (Rodríguez J. et al., 2005). Phytophthora cinnamomi was transferred from UTAD stock cultures to establish fresh PDA agar cultures in petri dishes. The test plates were incubated at 25ºC after placing a 8 mm agar disc containing the mycelium. When the mycelium reached the edges of the control plate (with DMSO only), the antifungal index was calculated as follows:

Antifungal index (%) = (1-Da/Db) x 100

Where Da is the diameter of the growth zone in the test plates and Db is the diameter of growth zone in the control plate. Each experiment was performed three times, and the data were averaged.

3. RESULTS AND DISCUSSION

The antifungal data showed that the compounds synthesized have low to good activity against the Phytophthora cinnamomi (Table 1). The H-3-cyanophenyl exhibited very good antifungal activity, and is the only compound whose inhibitory effect is already highly significant at a concentration of 50 ppm and it was the only one inducing and inhibition higher the 60% of the control. Figure 1 shows different inhibitory stages depending on the compound used. The results clearly show that the inhibitory effect is dependent on the two substituents groups; moreover, the introduction of halogen atoms does not increase the antifungal activity. Compounds H-2-thiophenyl, Cl-3-cyanophenyl and Cl-4-pyridyl show a good activity against Phytophthora cinnamomi. The remaining compounds were found to have slight or moderate activity against Phytophthora cinnamomi and some of them were inactive at 50 ppm (indicated — sign).

270

Table 5. Growth inhibition due to the treatment with different compounds

Compound 50 ppm 100 ppm 200 ppm

H- phenyl - + ++

H- benzyl - - ++

H- 3-cyanophenyl ++ ++++ ++++

H- 3-pyridyl - - +

H- 4-pyridyl - - +

H- 2-thiophenyl - ++ +++

H - 2-furanyl - + ++

Cl- phenyl - - +

Cl- benzyl - + ++

Cl- 3-cyanophenyl - ++ +++ Cl- 3-pyridyl - - ++

Cl- 4-pyridyl - ++ +++ Cl- 2-thiophenyl - ++ ++

Cl - 2-furanyl - ++ ++ Br- phenyl - - ++

Br- benzyl - - + Br- 3-cyanophenyl - - ++

Br- 3-pyridyl - + ++ Br- 4-pyridyl - ++ ++

Br- 2-thiophenyl - - + Br - 2-furanyl - + ++

Antifungal index: no-inhibition (-), <20 % (+), >20-40% (++), >40-60% (+++), >60-80% (++++), >80% (+++++)

Figure 1. Images of Phytophthora cinnamomi with different growths due to the treatment with different compounds. The first figure (top, left) shows a control (growth without xenobiotic).

271

Acknowledgements

We thank Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) for Post-Doctoral Grant for AS

(SFRH/BPD/20816/2004) and FEDER.

REFERENCES

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272

P4.07. ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS EM CLONES DE CASTANHEIRO INDUZIDAS PELA INFECÇÃO POR PHYTOPHTHORA CINNAMOMI

Lopes S. 1, Peixoto F.1*, Gomes-Laranjo J.2 and Abreu, C.3

1 Departamento de Química, CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 5001 Vila Real, PORTUGAL 2 Departmento de Engenharia Biológica e ambiental, CETAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 5001 Vila Real, PORTUGAL 3 Departmento de Protecção de Plantas, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, 5001 Vila Real, PORTUGAL

*[email protected]

RESUMO

A doença da tinta, causada pela Phytophthora cinnamomi, é uma das doenças que mais afectam o castanheiro (Castanea sativa Mill.) na Europa. Os prejuízos Dai resultantes representam perdas económicas significantes, em especial para as regiões mais desfavorecidas de Trás-os-Montes. No presente trabalho são estudados alguns aspectos relatives à interacção da Phytophthora cinnamomi com plantas de castanheiro (susceptíveis e resistentes à doença da tinta). O objectivo foi analisar possíves alterações bioquímicas nos castanheiros induzidas pela infecção com Phytophthora cinnamomi. O estudo foi realizado em plantas de 3 anos. As plantas foram divididas em dois grupos (não inóculada e inoculada). Analisaram-se os conteúdos em proteína, clorofila, açúcares totais, açúcares redutores, fenóis e proantocianidinas antes da inoculação e decorridos 42 dias.

Keywords: Castanheiro, doença da tinta, Phytophthora cinnamomi, inoculação

1. INTRODUÇÃO

O castanheiro é uma das espécies arbóreas e frutícolas mais importantes de vastas áreas do norte e centro de Portugal, encontrando nas terras altas de Trás-os-Montes as melhores condições ecológicas e climáticas para a sua sobrevivência e desenvolvimento. A partir dos meados do século XX começou a assistir-se a um acentuado declínio do castanheiro, sendo este devido a ataques de agentes patogénicos, nomeadamente Phytophthora cinnamomi Rands, agente causal responsável pela doença da tinta (Fernandes, 1966). Os danos causados são relevantes, resultando em perdas económicas significativas. Na tentativa de salvar o que nos resta e de reconstituir o que já se perdeu, numerosos esforços têm-se desenvolvido ao longo de muitas décadas, sendo a procura da resistência ao patogéneo um dos atributos mais desejados, senão o mais importante. Aspectos relacionados com a interacção planta-patogéneo têm sido pouco investigados e, consequentemente, são escassas as informações sobre alterações fisiológicas e bioquímicas que ocorrem ao nível do hospedeiro.

273

Com o presente estudo pretende-se contribuir para o conhecimento das alterações bioquímicas e fisiológicas que ocorrem em clones de castanheiro resistentes à doença da tinta, experimentalmente inoculados com Phytophthora cinnamomi.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Para este estudo foram utilizadas plantas de castanheiros híbridos (C. crenata x C. sativa), pertencentes a uma colecção de clones resistentes à doença da tinta, do Centro Nacional de Sementes Florestais de Amarante, bem como plantas de castanheiro europeu (C. sativa), da cultivar Judia, provenientes dos viveiros da UTAD. As plantas de 3 anos foram envasadas em vasos de 15 L e foram regadas regularmente, evitando-se desta forma o stresse hídrico. Neste ensaio foram utilizadas as populações de castanheiros: FBRO 057, FBRO 224, FSRD 079, COLUTAD, Ca 90 (CxS), S 14, C. sativa (da cultivar Judia) A inoculação por ferida em plantas intactas foi a metodologia adoptada na primeira parte do trabalho experimental. Como inóculo foi utilizado o micélio do oomiceta Phytophthora cinnamomi obtido por crescimento em PDA (Potato Dextrose Agar), durante cinco dias na micoteca da Protecção de Plantas da UTAD. A inoculação sólida de Phytophthora cinnamomi foi realizada no local onde as plantas se encontravam distribuídas, e somente em cerca de metade do número total de indivíduos pertencentes às sete populações em estudo, ficando os restantes a funcionar como termo de comparação. Nestas últimas, foi utilizada a mesma metodologia, à excepção da administração de PDA contendo micélio de Phytophthora cinnamomi. Decorridos 7 dias, e de forma a garantir a infecção por Phytophthora cinnamomi, procedeu-se a uma nova inoculação mas desta vez no estado líquido, proporcionando um mecanismo mais semelhante ao que ocorre na natureza. As amostras de tecido foliar das plantas inoculadas e não inoculadas foram avaliadas para os diferentes parâmetros bioquímicos (açúcares redutores, açúcares totais, fenóis totais, proteína total, clorofila total e proantocianidinas) no dia em que se procedeu à inoculação e 42 dias após a mesma.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

. Agradecimentos

The accomplishment of this work was possible thanks to the financial support of the Project INTERREG

IIIA - Castaña and to the collaboration of the National Center of Forest Seeds in Amarante.

REFERÊNCIAS

274

P4.08. PREPARACIÓN DE INÓCULO HIPOVIRULENTO DE CRYPHONECTRIA PARASITICA PARA SU APLICACIÓN EN CAMPO

1Aguín,O., 1Montenegro, D., 2Sainz, M. J., 1,2Mansilla, J. P.

1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la robleda s/n, 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

RESUMEN

Se llevaron a cabo ensayos, en laboratorio, para la obtención de un sistema práctico de inoculación en campo de micelio hipovirulento de Cryphonectria parasitica para el control del cancro en castaños. Con el producto desarrollado el micelio del hongo se mantiene viable en un soporte semisólido durante 30 días en tubos de aluminio conservados a 4ºC.

Palabras clave: Biocontrol, cancro, CHV1, gel, hipovirulencia

1. INTRODUCCIÓN

En Europa el cancro del castaño, causado por Cryphonectria parasitica, está considerado una enfermedad de cuarentena incluida en la lista A2 de la EPPO (EPPO/OEPP, 1982). Este hongo tiene la particularidad de presentar dos tipos de aislados; los denominados virulentos que producen cancros muy agresivos, que producen la muerte de las ramas y troncos afectados (Milgroom y Cortesi, 2004) y los hipovirulentos que causan cancros superficiales que provocan muy poco o ningún daño al árbol. La reducción en la virulencia (hipovirulencia) de estos aislados se asocia con la presencia de virus, que contienen moléculas de RNA de doble cadena (dsRNA), localizados en el citoplasma del hongo (Milgroom y Cortesi, 2004). La transmisión del virus de aislados hipovirulentos a virulentos es considerado un importante mecanismo para el control biológico del cancro. El éxito de este proceso va a depender de la reproducción sexual y de la diversidad de los grupos de compatibilidad (vc) de las poblaciones de C. parasitica. El hipovirus es transmitido principalmente por anastomosis de hifas y por conidias. Virus pertenecientes a las familias Hypoviridae, Reoviridae, Narnaviridae, Partitiviridae y Chrysoviridae han sido detectados en C. parasitica (Hillman y Suzuki, 2004), pero sólo tres especies de la familia Hypoviridae (CHV-1, ampliamente distribuido por Europa, CHV-2 y CHV-3, principalmente encontrado en América) son considerados los más significativos para el control biológico del castaño (Milgroom y Cortesi, 2004). A pesar de que se han utilizado diferentes estrategias para el control de este patógeno parece que el basado en la hipovirulencia es el método más eficaz.Tradicionalmente la aplicación de la hipovirulencia en campo se ha llevado a cabo mediante la inoculación, en agujeros realizados alrededor de la lesión, de fragmentos de micelio aislado en medios de cultivo agarizados. Sin embargo este sistema presenta limitaciones e inconvenientes de cara a una aplicación a gran escala, por eso se han desarrollado diferentes formatos de inóculo para mejorar el proceso de inoculación

275

(Hobbins et al., 1992; MacDonald y Double, 1979). Así, Juhásová et al. (1997, 2004) utilizaron en sus inoculaciones en campo, pellets (gránulos) con micelio hipovirulento elaborados en la empresa Fytofarm (Bratislava, Slovakia). En Francia y en Italia también se han desarrollado productos biológicos hipovirulentos para su distribución en castaños afectados. Estudios preliminares en el noroeste de España han mostrado una alta incidencia de cancro en Castanea sativa, una baja diversidad de los vc y presencia de cepas hipovirulentas del hipovirus CHV1, condiciones que facilitarían el éxito del control biológico mediante la incorporación de la hipovirulencia. Por eso, el objetivo del presente trabajo fue desarrollar una tecnología que permitiese el mantenimiento de aislados hipovirulentos (CHV1) detectados en el noroeste de España en un soporte práctico para su incorporación en árboles afectados.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron tres aislados hipovirulentos de Cryphonectria parasitica, caracterizados fenotípica y molecularmente por la presencia del hipovirus CHV1 subtipo F1 (figura 1). Los cultivos se obtuvieron a partir de muestras de castaño recogidas en el noroeste de España. Se comprobó, mediante el test de compatibilidad en medio PDAg (Patata-dextrosa-agar, suplementado con el colorante verde bromocresol) que los tres aislados eran compatibles con el grupo de compatiblidad más ampliamente distribuido en la zona de muestreo.

Figura 1. Aislado hipovirulento de Cryphonectria parasitica

Para la elaboración del inóculo se llevaron a cabo diferentes estrategias. Previamente todo el material de laboratorio a utilizar se esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 121ºC. Para la preparación del soporte sólido se utilizó una resina de la familia de los polímeros hidrosolubles derivados del ácido acrílico al 0,5, 1 y 2%. Para cada concentración de la resina se establecieron tres pH diferentes: 5, 7 y 9. La incorporación al gel del inóculo hipovirulento de C. parasitica se llevó a cabo, en las máximas condiciones de asepsia posibles, en dos formatos: micelio creciendo en medio líquido en agitación durante 7 días y micelio en medio agarizado PDA (patata-dextrosa-agar) sobre celofán en condiciones de oscuridad a 24ºC.

276

En ambos casos, una vez añadido el inóculo se agitó con una varilla de vidrio estéril para que la mezcla fuese lo más homogénea posible. Se elaboraron geles con cepas hipovirulentas por separado y en combinación, ya que según autores a menudo se obtienen mejores resultados en el control biológico con la aplicación de una mezcla de diferentes cepas hipovirulentas que mediante la aplicación de una sola cepa (Turchetti y Maresi, 1988). A continuación el producto se dispensó en tubos de aluminio de 100 mL de capacidad con la ayuda de una llenadora semiautomática con capacidad para 5L (figura 2). Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente o a 4ºC.

Figura 2. Llenado de los tubos de aluminio con el gel

La viabilidad del producto desarrollado se comprobó cada 5 días hasta un total de 35. Una pequeña cantidad de gel (aproximadamente 1 mL) se colocó en el centro de una placa Petri, de 55 mm de diámetro en el medio de cultivo PDA, extendiéndolo con ayuda de una espátula. Las placas se sellaron con Parafilm® y se mantuvieron en oscuridad a 24ºC. Se hizo un seguimiento diario para comprobar si se producía crecimiento del hongo en las placas. El análisis de la presencia y especie del hipovirus en el micelio obtenido, se llevó a cabo mediante la extracción del dsRNA utilizando el protocolo descrito por Morris et al. (1983). El tamaño del dsRNA aislado se determinó utilizando el programa de densitometría 1-D Manager (TDI, Madrid). La caracterización del subtipo se realizó mediante RT-PCR/RFLP y secuenciación (Alleman et al., 1999; Gobbin et al., 2003). Para el estudio de la eficacia del inóculo se aplicó el protocolo de Lee et al. (1992) en fragmentos de Castanea sativa de 15 cm de longitud x 5 cm de ancho. En el centro del material vegetal se realizó un agujero de aproximadamente 1 cm que se rellenó con el gel hipovirulento. Se hizo un seguimiento diario de comprobación del crecimiento del micelio en los fragmentos de castaño.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Del total de tratamientos efectuados sólo fueron efectivos los geles que se habían elaborado con un pH 7. Los geles realizados a pH 5 y 9 mostraron una gran dificultad en el crecimiento del hongo. La concentración del espesante no fue limitante a la hora del desarrollo del micelio pero, sin embargo, en la inoculación sobre material vegetal se comprobó que la concentración al 2% era la que

277 presentaba una mayor adherencia a la madera. La aplicación del micelio a partir de medio líquido o sólido no influyó en la viabilidad del producto, en ambos casos la fórmula fue efectiva. La mayor duración de la mezcla fue de 30 días manteniendo el gel a 4ºC. Los estudios de reaislamiento y caracterización tanto morfológica como molecular (RT-PCR y secuenciación) del micelio obtenido a partir de la siembra de los geles en el medio de cultivo PDA, confirmaron la presencia de Cryphonectria parasitica hypovirus (CHV1) subtipo F1 (figura 3). En los fragmentos de castaño donde se aplicaron los geles a pH 7 se observó a los siete días de inoculación la presencia de un micelio blanco característico de C. parasitica (figura 4).

Figura 3. Reaislamiento de una cepa hipovirulenta de Cryphonectria parasitica a partir de gel Figura 4. Inoculación del gel sobre muestras de castaño

Por lo tanto, el producto elaborado permite mantener los aislados hipovirulentos de C. parasitica en un sistema sencillo y de fácil aplicación en árboles afectados. En estos momentos se continúan los estudios con la finalidad de prolongar la viabilidad del inóculo mediante la incorporación de conservantes.

Agradecimientos

Los autores queremos agradecer la aportación a este trabajo al Dr. Ángel J. Concheiro Nine y a su equipo del Departamento de Farmacia y Tecnología Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Santiago de Compostela; a Dña. Susana Rodríguez (técnico de laboratorio, Estación Fitopatolóxica do Areeiro) y a Dña. María López (empresa Fauna Útil S.L.).

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279

P4.09. CONTRIBUTO DO PROJECTO INTERFRUTA II PARA O CONHECIMENTO DA DISPERSÃO E INFESTAÇÃO DO BICHADO DA CASTANHA NA ILHA TERCEIRA

Lopes, D.J.H. 1; Macedo, N. 1;Figueiredo, A.1; Martins, J.T.2; Pimentel. R. 1; Pombo, D.A. 3.

1 Universidade dos Açores, Centro de Biotecnologia dos Açores, Departamento de Ciências Agrárias, Secção de Protecção de Plantas, 9701-851 Terra chã, [email protected] 2 Divisão de Protecção das Culturas, Serviço de Desenvolvimento Agrário da Terceira, Vinha Brava - 9700-236 Angra do Heroísmo, [email protected] 3 Universidade da Madeira, Departamento de Biologia, Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, [email protected]

RESUMO

O bichado da castanha é actualmente uma das principais pragas que afectam a produção com qualidade de castanhas na Ilha Terceira. Com base nos trabalhos desenvolvidos pelo Projecto INTERFRUTA II, que resulta da cooperação inter-regional entre três regiões insulares (Açores, Madeira e Canárias), destinado a contribuir para a promoção da fruticultura e viticultura nas três regiões parceiras, foi possível identificar a Cydia splendana como sendo a única espécie causadora dos estragos a nível de qualidade e produção de castanhas. Com base na monitorização deste tipo de praga constata-se que o período de maior actividade está compreendido entre os meses de Setembro de Outubro, coincidindo com a época de maior colheita de castanhas. Recorrendo ao software ArcGis 8.0 foi possível elaborar dois mapas, um relacionado com a dispersão total da praga. A nível de prejuízos nos pomares analisados, verifica-se um máximo de infestação na ordem dos 38% num pomar na freguesia da Terra Chã a uma cota de 218 m de altitude, e uma infestação de 0% num pomar na freguesia dos Biscoitos a uma cota de 213 m de altitude. Em ambos os casos, as percentagens referidas foram obtidas a partir de uma amostragem de 2500 castanhas por pomar.

Palavras-chave: Bichado-da-castanha, Cydiaspendana, monitorização percentagem de infestação, curva de vôo,

2. MATERIAL E MÉTODOS

Nos pomares de castanheiro estudados e para determinar quais das três espécies de bichado-da-castanha (Cydia splendana, Pammene fasciana e Cydia fagiglandana) está presente na lha Terceira, foram utilizadas armadilhas Delta com feromona sexual especifica de cada espécie, de duas casas comerciais (Econex e Biosani), uma por cada pomar (6 pomares de castanheiros) (3 pomares na zona da Terra-chã, 1 pomar na zona do Posto santo, e 2 pomares na zona dos Biscoitos) num período de 4 meses (Julho a Outubro).

280

Outro objectivo passou pela avaliação dos prejuízos causados pelo bichado-da-castanha no estado larvar através da recolha de 50 castanhas do chão por árvore com recolha de 50 por parcela prescrevendo um total de 2.500 castanhas por zona de estudo, e sua a observação no seu interior para determinação das percentagens de afectação de frutos em cada uma das três zonas estudadas.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo com os resultados obtidos das capturas das armadilhas do bichado-da-castanha e em parceria com a Universidade da Madeira (Departamento de Biologia), à qual foram enviadas as capturas para identificação da espécie dos lepidópteros, foi-nos possível averiguar que todos adultos encontrados pertencem à espécie C.splendana.

90 80 70 60 50 40

Capturas 30 20 10 0 Alta Média Baixa

Terra Chã Biscoitos Zonas

Figura. Total de capturas do bichado-da-castanha nos quatro meses de estudo nas armadilhas Delta nas duas zonas estudadas de pomares de castanheiros

281

Curva de vôo do Bichado da castanha em 2006

60

50

40

30

20

N.º de indivíduos por armadilha por indivíduos de N.º 10

0 Junho Julho Agosto Setembro Outubro Meses

Curva de Vôo

Relativamente à avaliação dos prejuízos da castanha causados pelas larvas do bichado nas duas zonas de estudo

Prejuizos nas castanhas 2006

100% 90% 80% 70% 60% 50% Infestadas 40% Não infestadas 30% 20% 10% 0% C1 C2 C5 C6

Terra Chã Biscoitos

Figura. Percentagem de infestação de frutos por bichado-da-castanha nas duas zonas estudadas da Ilha Terceira

BIBLIOGRAFIA

282

P4.10. DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE CEPAS HIPOVIRULENTAS DEL HONGO “Cryphonectria Parasítica” (Murr) Barr. PARA EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA ENFERMEDADE QUE PROVOCA EN “Castanea sativa Mill”. EL BIERZO (LEÓN, ESPAÑA)

Berrocal, M., Turchetti, T., Villamediana, J.A.

Escuela Técnica Superior de Ingenieria Agrárias, Palencia Departamento Ingenieria Agrícola y Florestal Universisdad de Vallodolid. Avda de Madrid nº44 34004 Palencia (España) Tfno: 979.10.83.62 Fax: 979.10.84.40

RESUMEN

El Castaño Europeo es una espécie de gran importância, tanto económica, como ecológica en la comarca del Bierzo (León) España. El hongo Cryphonectria Parasítica (Murr) Barr, es el causante de la enfermedad del “chancro” del castaño. En la actualidad la elevada presencia y virulencia de dicho hongo, está provocando en muchos sotos de la comarca berciana, una situación fitosanitaria alarmante. En base al trabajo de campo, se han podido delimitar las asas principales de castaño afectadas por la enfermedad, asi como las zonas que por el momento se mantienen sanas. La “Hipovirulencia” es una atenuación del carácter virulento del hongo C. Parasítica, causada por la presencia de un vírus de doble cadena (dsRNA). Las cepas hipovirulentas del hongo provocan chancros no letales cicatrizantes. Una característica singular de estas cepas es la capacidad de transmitir dicha propriedad atenuante, a partir del dsRNA, a las cepas virulentas (letales), transformándolas en cepas hipovirulentas (no letales). El control biológico, mediante inoculaciones artificiales con cepas hipovirulentas seleccionadas, se presenta actualmente como la mejor herramienta en la lucha contra esta enfermedad. En base a los ensayos realizados para caracterizar las dieciséis cepas hipovirulentas estables obtenidas, se han seleccionado las 4 cepas hipovirulentas com mejores resultados para realizar un primer avance en el control biológico, primero en España, mediante inoculaciones combinadas en un castañaro del Bierzo (León). El resultado de dichas inoculaciones combinadas há sido esperanzador.

1. INTRODUCCIÓN

En la comarca del Bierzo (León) se encuentra el mayor número de castaños de fruto de la Comunidad de Castilla y León, obteniéndose anualmente la segunda mayor producción de castañas de toda España, después de Galicia. La situación del castaño en el Bierzo, es muy preocupante, debido a la presencia e intensa virulencia de la enfermedad del chancro, que provoca la muerte de muchos castaños jóvenes y ramas de pies adultos. Por ello, es vital que se investigue en la línea del control biológico del chancro,

283 siguiendo la trayectoria de los investigadores italianos que están resolviendo muy satisfactoriamente la problemática generada por esta misma enfermedad en los castaños de Itália (La Toscana, etc.). Los objetivos de las investigaciones realizadas son:

a) Evaluar el nivel general de afección de la enfermedad en los castaños del Bierzo, y delimitar su área de incidencia. b) Analizar el estado de cultivo y prácticas culturales. c) Estudiar y caracterizar el comportamiento y la varibilidad en las distintas cepas del hongo mediante ensayo en el laboratorio. d) Obtener una colección de aislados hipovirulentos del Bierzo, que una vez testados, se puedan emplear en el control biológico del hongo C.Parasítica. e) Realización de la primera experiencia en España com el control biológico mediante inoculaciones combinadas de cepas hipovirulentas autóctonas seleccionadas, com el fin de aumentar artificialmente los focos de difusión de la hipovirulencia. f) Llevar a cabo un seguimiento minucioso y periódico de la evolución de los vástagos inoculadas.

2. MATERIALES Y METODOS

a) TRABAJO DE CAMPO Localización y caracterización: Parcelas de estudio, P1 Corullón, P2 Albores de la Ribera, P3 Rozuelo, P4 Nocela, P5 Cobrana, P6 Santa Marina del Sil, P7 San Pedro Castañero, P8 San Juan de Paluelos, P9 Orellan y P10 Médulas. Recogida de muestras.

b) TRABAJO DE LABORATORIO Se divide en las siguientes fases: - Aisada y clasificación fenotípica de las muestras del hongo C.Parasítica, para identificar definitivamente las cepas hipovirulentas estables. - Ensayos en el laboratorio, para caracterizar las cepas hipovirulentas obtenidas. - Inoculaciones en el campo, simples, com todas las cepas hipovirulentas obtenidas y combinadas, com cuatro cepas hipovirulentas seleccionadas a posteriori.

3. RESULTADOS Y DISFUNCIÓN

a) TRABAJO DE CAMPO: - Valoración del cultivo de los sotos: Se há estudiado las características del terreno, las características de la masa (tratamientos culturales, podas e injertos).

284

- Valoración fitosanitaria de los sotos: estado fitosanitario. Incidencias del chancro. Presencia de distintos tipos de chancros. Otros daños, la “Tinta”. b) TRABAJO DE LABORATORIO De los ensayos llevados a cabo permitieron obtener 50 muestras aisladas en el laboratorio, com el siguiente resultado: - 16 cepas blancas o hipovirulentas (H1.3, H1.5, etc.) - 30 cepas mixtas o intermédias (I1.1, I1.2, etc.) - 4 cepas sin evolución (2.2, 5.1.) - Extracción de dsRNA. Test de Bavendamm - Inoculación en el laboratório

c) INOCULACIONES EN EL CAMPO - Inoculación simple com las 16 cepas hipovirulentas obtenidas: Han tenido un comportamiento semejante al obtenido en laboratorio. Algunas generaron chancros cicatrizantes menores de 30cm2. Otras, como las H6.5, H9.3 y H10.4 produjeron infecciones hinchadas cicatrizantes que a partir del segundo mes tuvieron un crecimiento muy reducido, no habiendo producido picnidios. Ninguno de las 16 aisadas hipovirulentos produjo picnidios después de 1 año, y todos sus chancros fueron cicatrizados (curados) por entonces.

- Inoculación combinada-control biológico, com 4 cepas hipovirulentas seleccionadas. (H1.5, H3.3, H9.2 y H10.1): Se han seleccionado estas cuatro porque han mostrado los mejores resultados en todos los test realizados. Resultado de 2 inoculaciones combinadas (C1 y C2), ha sido la formación de sendos chancros cicatrizantes, que se han desarrollado progresivamente en 12 meses, y com persencia de picnidios y callos de cicatrización. Los dos han provocado la evolución de la infección artificial sin detener su actividad vegetativa y ahora son un neuvo foco de infección hipovirulenta dentro del castaño.

285

Fig I. Chancro Inicial Fig II. Chancro Cicatrizante

Fig III. Chancro com c.Hipovirulentas Fig VI. Injerto com protector y mastic antichancro

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Berrocal, M., Gallardo, J.F.,1998. El Castaño: Productor de fruto y madera, creador de paisaje y protector. E. Mundi-Prensa, Madrid. Berrocal, M., Villamediana, J.A., 2002. El Castaño en las Mádulas: Proyecto integral de recuperación del castaño. Junta de Castilla y León, España. Turchetti, T., Maresi, G., 1988. Mixed inoculun for the biological controlo f chestnut blight. Bulletin OEPP 18: 67-72. Turchetti, T., Maresi, G., 1990. Indagini sulla diffisine naturale degli isolate ipovirulenti di C.parsítica in alcuni cedui di castagni. Tai. Giornate Fitopatologiche 2: 89-98.

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Gestão de Souto / Gestión del Castañar

P5.01. INFLUÊNCIA DA PODA NA EXPORTAÇÃO DE NUTRIENTES DOS SOUTOS

Pires, A. L. e Portela; E.

Dep. Edafologia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real

RESUMO Os resultados obtidos em sete soutos de Trás-os-Montes, entre 1991 e 2000, permitiram quantificar os macro e os micronutrientes nos vários componentes da biomassa podada. Com estes dados, foi possível estimar as quantidades médias de nutrientes exportadas por hectare, tendo-se verificado que cerca de 50 % dos nutrientes estão contidos nas folhas, ouriços, inflorescências e raminhos (ø<1mm), que representam apenas 26% do total podado. Assim, se pelo menos este material for deixado no solo a exportação de nutrientes poderá ser minimizada. As podas severas retiram quantidades elevadas de nutrientes dos soutos, pelo que a sua reposição através da fertilização deve ser ponderada.

1. INTRODUÇÃO

As podas, para além de serem consideradas cruciais no rejuvenescimento de castanheiros senescentes, são também uma forma de aumentar a produtividade dos soutos e melhorar o calibre da castanha (Araki e Nakaoka, 1982; Araki et al., 1988; Pires et al., 2005). Porém, esta prática pode também ser responsável pela exportação de quantidades consideráveis de nutrientes dado que usualmente se remove todo o material podado dos soutos para ser utilizado como combustível (Portela e Portela, 1996). Nos últimos anos, com o aparecimento da doença do cancro intensificaram- se as podas fitossanitárias. Parte do material é queimado no local mas um número considerável de agricultores retira a biomassa podada dos soutos. Torna-se, pois, importante avaliar (a) quais os componentes responsáveis pelas maiores exportações de nutrientes e (b) qual a importância da severidade das podas na saída de nutrientes dos soutos, com vista a uma gestão mais racional dos nutrientes e das recomendações a propôr no sentido duma preservação dos elementos nutritivos no sistema.

2. MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo, que decorreu de 1991 a 2000, foi realizado em sete soutos da região de Trás-os- Montes. Quatro dos soutos localizam-se no concelho de Valpaços, dois no de Macedo de Cavaleiros e um no concelho de Vinhais. As variedades de castanha encontradas foram a Lada, Judia e Longal. Algumas características destes povoamentos estão indicadas Quadro 1. Os soutos estão instalados em terrenos bem drenados, suavemente ondulados, com declives entre 0 e 8%. Os solos são derivados de xisto, e um, apenas, proveniente de granito. Apresentam

287 textura franco-arenosa a franca. Os soutos foram mobilizados 2-4 vezes por ano. A 1ª mobilização efectuava-se geralmente em Nov.-Dez., a 2ª em Fev., a 3ª em Abril-Maio e a 4ª em Junho-Julho. Cinco destes sete soutos foram adubados com alguma regularidade e, a partir de 1995/1996, foram também aplicados correctivos orgânicos. Aplicaram-se correctivos minerais apenas em dois dos soutos, tendo-se adicionado num souto 3 kg/árvore de cal viva (1999) e no outro 6 kg /árvore de calcário calcítico (1997 e 1998). As podas foram efectuadas com periodicidade irregular, sendo cada castanheiro podado em intervalos de 2-5 anos. Das 13 podas observadas, sete ocorreram na Primavera-Verão e as restantes no Inverno. Em todos os casos a biomassa resultante da poda foi retirada dos soutos.

Quadro 1. Características médias dos soutos no início do estudo. Média Mínimo Máximo Árvores/ha 81 58 116 Compasso (m) 11,9X11,2 13,8X13,7 8,9X9,6 Idade dominante (anos) 47 32 65 Altura (m) 9,1 7,9 11,3 d (cm) 37,8 29,8 43,8 Área de projecção da copa (%) 60,5 42,1 80,3 Área de projecção da clareira (%) 39,5 57,9 19,7

O material podado foi seco a 60º C e depois de separado em folhas, inflorescências, ouriços, raminhos e ramos, foi pesado, moído (<1 mm) e analisado. Efectuaram-se determinações de N, P, K, Ca Mg, S, Fe, Cu, Zn e Mn com base nos métodos analíticos utilizados no Laboratório de Solos e Plantas da UTAD. Os ramos foram moídos só após a sua separação por diâmetros (1-3 cm, 3-5 cm, 5-7 cm e >7 cm) e depois da casca ser destacada da madeira. No Quadro 2 apresentam-se as percentagens de casca e madeira nos ramos e os respectivos teores de matéria seca. No Quadro 3 indica-se o contributo dos vários componentes do material podado para o seu total.

Quadro 2. Percentagem médio de casca e de madeira nos ramos podados e teor de matéria seca. Ramos Ø < 1 cm* Ø 1-3 cm** Ø 3-5 cm** Ø 5-7 cm** Ø > 7 cm** Madeira (%) 64,0±2,5 72,0±2,0 78,9±2,4 79,9±2,9 80,9±3,0 Casca (%) 36,0±2,5 28,0±2,0 21,1±2,4 20,1±2,9 19,2±3,0 Matéria seca (%) 70,1± 61,8± 60,3± 58,3± 56,8± * média de seis podas; ** média de 10 podas.

Quadro 3. Contributo dos diferentes componentes para o total podado (matéria seca). Folhas Inflorescências Ouriços Ramos Ø < 1 cm Ø 1-3 cm Ø 3-5 cm Ø 5-7 cm Ø > 7 cm ------% ------3,9 0,1 0,9 21,4 19,8 12,6 9,7 31,6

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

As folhas são, em geral, o componente com maiores concentrações de N, P, K, Mg, S, Fe, Mn e Cu, enquanto que a casca apresenta os teores mais elevados de Ca e Zn (Quadros 4 e 5). Se considerarmos apenas a casca e a madeira, verifica-se que, com excepção do P e S, a casca apresenta maiores concentrações em nutrientes que a madeira. O Ca, juntamente com o K, Fe e Zn

288 tendem a aumentar na casca com o diâmetro dos ramos. Na madeira as concentrações dos nutrientes diminuem tendencialmente com o aumento do diâmetro dos ramos, com excepção do S. Na casca este padrão apenas se observa de forma clara com o N. Dada a diferente concentração de nutrientes nos vários componentes do material podado, a quantidade de nutrientes nesta biomassa está dependente da periodicidade das podas, da sua intensidade e da época em que se realiza. Assim, e tendo em consideração que as folhas apresentam as concentrações mais elevadas de nutrientes, as podas realizadas durante o período activo de crescimento podem dar origem a exportações mais elevadas de nutrientes do que se realizadas no período de repouso vegetativo. Sete das 13 podas observadas foram realizadas durante a Primavera e o Verão. Podas frequentes, efectuadas geralmente todos os anos, podem não dar origem a perdas de nutrientes visto que usualmente se dá preferência a ramos de menores diâmetros (Portela e Pinto, 2004), tendendo a deixar-se no souto todo o material. No entanto, o mais usual em Trás-os-Montes é podar-se cada castanheiro em intervalos de 3-5 anos e a retirar-se todo o material podado do souto (Portela e Portela, 1996) que foi, aliás, o que aconteceu nos casos estudados. A intensidade da poda varia consideravelmente. Pode consistir apenas no corte de alguns ramos até à remoção quase completa da copa. Das 13 podas estudadas, a quantidade de matéria seca retirada por hectare foi de 0,6 t a quase 10 t (média de 3,8 t ± 3,0 t).

Quadro 4. Concentração média de nutrientes na matéria seca da biomassa podada e exportação por tonelada de matéria seca. Componente N P K Ca Mg S ------g kg-1 ------Folhas 1 14,0±4,2 2,0±0,6 8,0±4,3 4,8±1,5 1,8±0,5 1,1±0,2 Ouriços 2 8,0±1,3 1,1±0,3 8,3±0,16 3,2±0,6 1,1±0,1 0,5±0,1 Inflorescências3 6,2 0,9 8,7 3,3 1,6 0,7 Casca de ramos com ø < 1 cm 4 7,2±1,8 0,7±0,3 3,4±1,3 10,7±1,8 1,4±0,1 0,3±0,2 ø 1 - 3 cm 5 6,1±0,8 0,6±0,2 3,7±1,0 11,6±2,9 1,3±0,3 0,4±0,2 ø 3 - 5 cm 5 5,4±0,7 0,6±0,1 4,0±0,9 14,1±1,7 1,5±0,1 0,4±0,2 ø 5 - 7 cm 5 4,7±0,8 0,5±0,1 3,9±1,0 12,2±1,7 1,2±0,2 0,3±0,1 ø > 7 cm 5 4,1±0,9 0,5±0,1 4,0±1,1 15,1±1,3 1,4±0,2 0,5±0,3 Madeira de ramos com ø < 1 cm 4 4,6±2,2 0,8±0,3 2,6±0,8 2,5±2,0 0,7±0,2 0,3±0,2 ø 1 - 3 cm 5 2,3±0,5 0,4±0,1 2,3±0,4 1,3±1,0 0,6±0,1 0,4±0,3 ø 3 - 5 cm 5 1,7±0,3 0,3±0,1 1,1±0,3 1,2±0,6 0,5±0,1 0,4±0,3 ø 5 - 7 cm 5 1,4±0,4 0,4±0,2 0,7±0,2 0,8±0,5 0,3±0,0 0,5±0,2 ø > 7 cm 5 1,2±0,3 0,3±0,1 0,5±0,2 0,6±0,3 0,2±0,1 0,2±0,1 Ramos inteiros com ø < 1 cm 45 5,5±2,0 0,8±0,3 2,9±0,9 5,4±1,3 0,9±0,1 0,3±0,2 ø 1 - 3 cm 5 3,3±0,5 0,5±0,1 2,6±0,6 4,4±0,9 0,8±0,1 0,4±0,2 ø 3 - 5 cm 5 2,5±0,3 0,4±0,1 1,7±0,3 3,9±0,5 0,7±0,1 0,4±0,2 ø 5 - 7 cm 5 2,1±0,3 0,4±0,2 1,3±0,2 3,1±0,5 0,5±0,0 0,3±0,2 ø > 7 cm 5 1,8±0,4 0,3±0,1 1,2±0,2 3,4±0,3 0,4±0,1 0,3±0,1 ------kg/t ------Exportação 3,6±0,8 0,6±0,1 2,3±0,7 4,6±0,7 0,7±0,2 0,4±0,2 1- média de 4 podas; 2- média de 2 podas; 3- 1 poda; 4- média de 4 podas; 5- média de 8 podas.

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Com base nas concentrações de nutrientes dos vários componentes da biomassa podada, teor de casca e madeira (Quadro 2) e contributo de cada componente para o total podado (Quadro 3), estimou-se a exportação média de macro e de micronutrientes por tonelada de peso seco, que se apresenta nos Quadros 4 e 5, respectivamente. Em média, por tonelada de matéria seca, o Ca foi o nutriente mais exportado, seguindo-se o N, K, Mg, P, S, Mn, Fe, Zn e Cu. Apesar das folhas, inflorescências e ouriços representarem somente 4,9 % do total podado, contribuíram para a exportação de cerca de 30% dos nutrientes, com excepção do Ca. Como este nutriente se concentra principalmente na casca, aqueles componentes contribuíram apenas para a remoção de cerca de 10% do Ca. Se considerarmos os raminhos, 21% do total podado, estes juntamente com as folhas, inflorescências e ouriços são responsáveis pela saída de 40 % de Ca e 50% dos restantes nutrientes. Assim, se pelo menos este material não for removido dos soutos a exportação de nutrientes poderá ser minimizada. Tendo em conta que nos soutos afectados pelo cancro as medidas profiláticas de controlo da doença recomendam a queima ou a remoção do material podado do souto, a reposição dos nutrientes exportados, principalmente se as podas forem severas (mais de 40-50% da copa removida), deve ser considerada nas fertilizações a efectuar.

Quadro 5.Concentração média de micronutrientes na matéria seca da biomassa podada e exportação por tonelada de matéria seca Componente Fe Mn Zn Cu ------mg kg-1 ------Folhas 1 141 935 26 13,8 Casca de ramos com ø < 1 cm 2 82±36 636±258 54±26 5,5±2,1 ø 1 - 3 cm 3 110±48 591±228 66±28 4,1±1,2 ø 3 - 5 cm 3 130±52 622±287 87±57 3,6±1,4 ø 5 - 7 cm 3 134±61 666±507 80±45 3,3±1,3 ø > 7 cm 3 144±44 504±305 85±49 3,5±0,7 Madeira de ramos com ø < 1 cm 2 41±27 110±55 12,9±5,2 3,1±1,1 ø 1 - 3 cm 3 25±17 90±70 7,4±4,1 1,7±0,7 ø 3 - 5 cm 3 22±18 72±55 6,7±3,3 1,3±0,5 ø 5 - 7 cm 3 23±17 55±46 5,3±3,0 1,3±0,7 ø > 7 cm 3 30±24 65±29 3,4±1,8 1,5±1,1 Ramos inteiros com ø < 1 cm 2 56±22 285±118 27±10,1 3,9±1,2 ø 1 - 3 cm 3 54±12 233±97 24±7,3 2,4±0,6 ø 3 - 5 cm 3 46±15 194±103 25±8,0 1,8±0,6 ø 5 - 7 cm 47±16 185±150 21±9,4 1,7±0,7 ø > 7 cm 3 54±29 156±87 20±7,4 1,9±0,7 ------g/t ------Exportação 54±26 237±104 23±12 2,9±0,3 1- 1 poda; 2- média de 4 podas; 3- média de 5 podas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Araki, H. and Nakaoka, T. 1982. Effects of severity of renovation pruning on tree growth and nut yield and size in chestnut tree (Castanea crenata Sieb. et Zucc.). Journal of the Japonese Soc. of Hort. Science, 51(3): 278-285.

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P5.02. ESTADO NUTRITIVO DOS SOUTOS EM TRÁS-OS-MONTES. I- PARÂMETROS DA FERTILIDADE DO SOLO

Ester Portela

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Ap 1013, 501-811 Vila Real

RESUMO Tendo em conta que a análise de terra é um instrumento essencial à gestão da fertilidade do solo, agregaram-se os dados da análise de terra de 211 soutos de Trás-os-Montes, obtidos entre 1991 e 2006. Assim, com vista à avaliação do estado de fertilidade dos solos, apresentam-se os valores de ocorrência para os diversos parâmetros da fertilidade do solo, os quais foram agrupados em diversas classes de fertilidade.

Palavras-chave: Castanea sativa, análise de terras, acidez do solo, Ca, Mg

1. INTRODUÇÃO

Em Trás-os-Montes, Castanea sativa vegeta em condições edáficas muito variadas. O vigor do castanheiro e a produtividade dos soutos estão, acima de tudo, dependentes de factores locais relacionados com a topografia, material litológico, espessura efectiva de solo, disponibilidade de água e de oxigénio. Dependem ainda de parâmetros da fertilidade dos solos, que influenciam em larga medida o estado nutricional das árvores. Sem dúvida que uma nutrição equilibrada do castanheiro é indispensável não só à manutenção da produtividade dos soutos, mas também ao estabelecimento de condições de crescimento saudáveis. Com efeito, a menor incidência das doenças da tinta e do cancro do castanheiro tem vindo a ser associada a parâmetros da fertilidade do solo, nomedamente a matéria orgânica, catiões de troca e saturação em bases (Portela et al., 1999; Portela e Louzada, 2005). A análise de terra e a análise foliar são, como se sabe, duas ferramentas essenciais à gestão da fertilidade do solo e à elaboração de recomendações de fertilização, particularmente quando utilizadas de modo conjugado. Neste artigo focam-se os aspectos relativos à análise da terra e no artigo “Estado nutritivo dos soutos em Trás-os-Montes. II- Análise foliar” desta publicação focam-se os aspectos relativos à análise foliar. Com vista à avaliação do estado de fertilidade dos solos nos soutos de Trás-os-Montes, agregou-se a informação obtida entre 1991 e 2006. Os diversos parâmetros da fertilidade do solos foram agrupados em diversas classes de fertilidade consoante os valores de ocorrência.

2. MATERIAL E MÉTODOS

As colheitas de solos foram realizadas em soutos localizados em duas regiões naturais, Padrela e Bragança, tendo sido abrangidos os concelhos de Chaves, Valpaços, Murça, Macedo de Cavaleiros,

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Vinhais e Bragança. Colheram-se 3-5 amostras de solo compósitas por souto, em duas profundidades (0- 20 cm e 20-40 cm), debaixo da projecção das copas. A análise textural foi processada em apenas algumas amostras de solo; determinaram-se o valor de pH (H2O), o teor de matéria orgânica e o teor de catiões de troca em amostras de 211 soutos e, ainda, o teor dos micronutrientes Cu e Mn em 125 soutos. As respectivas metodologias analíticas utilizadas foram as adoptadas nos Laboratórios de Química e de Solos e Plantas da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os soutos objecto de estudo estão assentes em materiais litológicos diversos, desde os granitos, diferentes tipos de xistos, até aos materiais quartzíticos (Portela e Pinto, 2004). Os granitos estão sobretudo representados na região natural da Padrela e são maioritariamente de grão médio de tendência porfiróide (Ribeiro, 1998). A composição dos xistos é variável, dependendo das formações geológicas:

Pelito-grauváquica (SPX), Xistos superiores (SPS), Filito-quarzítica (OFQ); formações de Macedo de

Cavaleiros (DMC) e de Santos e Curros (DSA); o complexo Vulcano-silicioso (SVS) (Carta Geológica 1: 200 000 folha 2 de Pereira, 1992; 1:50 000 folha 7D de Pereira et al., 2000 e Carta Geológica 1:50 000 folha 6D de Ribeiro, 1998). No agrupamento dos xistos dominam as seguintes rochas: quartzofilitos feldspáticos, filitos, micaxistos, xistos grafitosos (cinzentos ou negros), ampelitos, liditos, psamitos, grauvaques, siltitos, xistos verdes (clorito-sericíticos) e metadiabases. Os xistos clorito-sericíticos e metadiabases (que pertencem a SVS) apenas se observaram em algumas manchas na região de Bragança. Embora ocupem uma pequena área nas regiões da Padrela e de Bragança, há soutos cujo material originário é muito abundante em materiais siliciosos, pertencentes à formação Quartzítica (SPQ), onde dominam os quarzitos xistóides, quartzofilitos e quartzitos. Os terrenos onde os soutos estão instalados também variam bastante no que respeita ao suporte radicular, desde os mais profundos, com espessura efectiva superior a 100 cm (Martins e Coutinho, 1991; Portela et al., 1998) até aos solos muito delgados e pedregosos (Portela et al., 1998; Portela e Pinto, 2004). Os substratos que deram origem aos solos vão desde os muito ácidos (granitos de duas micas e os xistos grafitosos), até aos menos ácidos (xistos clorito-sericíticos e metadiabases); dos muito pobres em nutrientes, tais como os materiais quartzíticos, até aos solos onde se identificaram metadiabases entre os elementos grosseiros. As unidades-solo mais representativas foram: os Cambissolos e Leptossolos úmbricos derivados de granito, de xistos e rochas afins, e os Cambissolos e Leptossolos dístricos derivados de xistos e rochas afins. Apenas se identificaram Luvissolos crómicos na região de Bragança, nas freguesias de Salsas e S. Pedro de Serracenos (Agroconsultores-Coba, 1991). No geral, os solos apresentam teores baixos de argila, raramente atingindo os 15%, predominando as texturas franco-arenosas e francas e raramente franco-limosas. A presença de quantidade elevada de elementos grosseiros é uma constante em certos terrenos. Os de maior dimensão, blocos e calhaus, surgem em proporção elevada (superiores a 50%) nos solos derivados dos xistos mais siliciosos e dos materiais quarzíticos. Na Figura 1 apresentam-se os valores de ocorrência de diversos parâmetros do solo registados em 211 soutos (valores médios de amostras da camada 0-20 cm), que foram agrupados em classes de

293 fertilidade do solo. Os resultados relativos à camada 20-40 cm seguem o mesmo padrão da camada superficial, todavia, com teores mais baixos. Um dos factores que maior influência exerce nos parâmetros da fertilidade do solo é, sem dúvida, o material originário. Assim, para uma melhor explicação das variações observadas nos solos, agruparam-se os soutos de acordo com a rocha que originou o solo (Tabela 1).

Tabela 1. Parâmetros da fertilidade do solo em 211 soutos agrupados consoante o material litológico Material litológico xistos granitos materiais quartzíticos Nº de soutos 148 36 27 MO, g kg-1 35 a 30 a 27 a

pH H2O 4,9 b 4,8 a 5,2 b P extraível, g kg-1 109 b 142 b 59 a Catiões de troca, cmolc kg-1 Ca 1,19 b 1,07 b 0,70 a Mg 0,35 b 0,30 ab 0,19 a K 0,38 b 0,34 b 0,23 a Na 0,04 a 0,05 a 0,05 a H+Al 1,09 a 1,09 a 1,25 a CTC efectiva, cmolc kg-1 3,04 b 2,84 b 2,43 a Saturação de bases, % 60 b 58 b 45 a Mn extraível, mg kg-1 87 a 31 a 9 a Cu extraível, mg kg-1 1,56 a 1,23 a 0,97 a MO - matéria orgânica; CTC – capacidade de troca catiónica As médias que se encontram na mesma linha com uma letra comum não são significativamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Duncan.

Tendo em conta a agregação dos soutos apresentada na Tabela 1, verifica-se não existirem diferenças significativas entre os xistos e os granitos, mas é bem patente que os solos provenientes de materiais quarzíticos possuem os teores mais baixos de MO, de CTC efectiva e de nutrientes. Apesar do nível de Mn extraível nos solos derivados de materiais quarzíticos ser quase 10 vezes inferior aos dos xistos e da análise de variância revelar um valor p=0,0293, a diferença entre as médias não foi significativa, o que ficou a dever-se à grande variação registada nos teores de Mn nos solos provenientes de xistos das diferentes formações geológicas. É de salientar que os solos derivados de xistos das -1 formações SVS e OFQ atingem teores de Mn extraíveis superiores a 100 mg kg . Com efeito, nestes solos é possível identificar-se a piroluzite (mineral rico em Mn) nos elementos rochosos da fracção grosseira dos solos.

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Regiões naturais -1 -1 Matéria orgânica, g kg P2O5 extraível, mg kg

160 140 100 140 120 80 120 100 60 100 80 60 40

80 Soutos Soutos

Soutos 60 40 20 20 40 0 20 0 <50 50-100 >100 <20 20-50 >50 0 baixo-muito baixo médio alto-muito alto Padrela Bragança baixo médio alto-m uito alta

Ca de troca, cmolc kg-1 K de troca, cmolc kg-1 Mg de troca, cmolc kg-1

160 120 100 140 100 80 120 100 80 60 80 60 40 Soutos Soutos

60 Soutos 40 40 20 20 20 0 0 0 <0,25 0,25-,40 >0,40 <1,2 1,2-3,0 >3,0 <0,25 0,25-0,40 >0,40 baixo-muito baixo médio alto-muito alto muito baixo baixo médio-alto muito baixo baixo médio-alto

Capacidade de troca catiónica efectiva, pH H2O cmolc kg-1 Acidez de troca, %

200 200 200 150 150 150 100 100 100 Soutos Soutos Soutos 50 50 50

0 0 0 <2,0 2,0-4,0 >4,0 <20 20-40 >40 <4,5 4,5-5,5 >5,5 muito baixa baixa média baixa média alta-muito alta muito ácido ácido pouco ácido

Cu extraível, mg kg-1 Mn extraível, mg kg-1 Material originário

100 50 180 160 80 40 140 120 60 30 100 40 20 80 Soutos Soutos Soutos 60 20 10 40 20 0 0 0 <0,8 0,8-7,0 >7,0 <15 15-45 46-100 >100 xistos granitos materiais muito baixo-baixo médio alto baixo médio alto muito alto quartzíticos

Figura 1- Distribuição dos soutos pelas duas regiões naturais, material litológico e parâmetros da fertilidade do solo de 211 soutos agrupados em classes de fertilidade do solo

-1 Como se observa na Figura 1, os solos apresentam baixa CTC efectiva (<4,0 cmolc kg ), o que é revelador, em certa medida, da reduzida percentagem de argila registada na maioria dos solos. É notória a elevada acidez dos solos, traduzida pelos baixos valores do pH-H2O (<5,5) e pela elevada percentagem de catiões acídicos (>40%) e os baixos teores de Ca e Mg de troca do solo. Os teores reduzidos de Mg são mesmo susceptíveis de causar carências no castanheiro. Dados de Portela et al. (2003) e de estudos nossos mais recentes, mostram que a probabilidade da ocorrência da carência é elevada quando o Mg de -1 troca for inferior a 0,25 cmolc kg . Somente os solos provenientes de xistos da formação SVS, que surgem nos concelhos de Vinhais e Bragança, eram menos ácidos e apresentavam teores mais elevados de Ca e

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Mg. A necessidade de correcção da acidez de muitos dos soutos de Trás-os-Montes com a utilização de calcário magnesiano é, pois, crucial. Não obstante uma elevada percentagem de soutos apresentar teores aceitáveis de matéria orgânica (Figura 1), há ainda um grupo numeroso com valores inferiores a 20 g kg-1, o que se tem revelado ser demasiado baixo para o crescimento saudável do castanheiro (Portela et al., 1998). Com efeito, teores de matéria orgânica inferiores a 20 g kg-1 estavam associados a uma maior incidência da doença da tinta do castanheiro. Constata-se, também, que nesta área de estudo os teores de P e de K são bastante elevados, o que não será alheio ao facto de, na maioria dos soutos, se aplicar anualmente adubos N-P-K e/ou estrumes com regularidade, em particular na região da Padrela (Portela e Pinto, 2004). Já na região de Bragança, onde a adubação e a estrumação são menos frequentes, os teores P do solo são bastante mais baixos. Em mais de 25% dos soutos registaram-se baixos teores de Cu extraível nos solos. Estes solos estão associados a materiais quarzíticos e a granitos. Os soutos sujeitos a tratamentos fitossanitários com caldas cúpricas apresentaram valores de Cu extraível quase duplos dos anteriores. Chama-se a atenção para a importância que este nutriente poderá ter na saúde do castanheiro. Os estudos de Portela e Louzada (2005) revelaram haver teores mais elevados de Cu extraível no solo em soutos saudáveis, comparativamente aos afectados pelo cancro. Infelizmente, a análise de terras não é uma prática comum entre os produtores de castanha. De entre mais de uma centena de produtores, apenas três tinham efectuado análises de terra aos seus soutos. Ora, sendo a análise de terra um instrumento necessário à avaliação da fertilidade do solo, torna- se indispensável à gestão de nutrientes e à recomendação da fertilização.

Agradecimentos

É devida uma palavra de gratidão ao Engenheiro Rui Pinto pelo contributo prestado na colheita e preparação das amostras de solos. Este trabalho foi elaborado no âmbito do CEGE – Centro de Estudos em Gestão de Ecossistemas.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Agroconsultores-Coba, 1991. Carta de Solos, Carta do Uso Actual da Terra e Carta de Aptidão da Terra do Nordeste de Portugal. UTAD/PDRITM, Vila Real. Martins, A., Coutinho, J. 1991. General properties of soils under chestnut stands in Trás-os-Montes region, Portugal. In: Teller, A., Mathy, P., Jeffers, J.N.R., eds. Responses of Forest Ecosystems to Environmental Changes, London, Elsevier Applied Science, 773-775. Pereira, E. (Coord.) 1992. Carta Geológica de Portugal na escala 1:200 000, Folha 2. Lisboa Serviços Geológicos de Portugal. Pereira, E., Ribeiro, A., Castro, P. 2000. Carta Geológica de Portugal na escala 1:50 000 e Notícia Explicativa da Folha 7D. Lisboa, Instituto Geológico e Mineiro. Portela, E., Louzada, J. 2005. Nutrient status of chestnuts orchards. I- Relationship with incidence of blight. Acta Horticulturae 693: 557-563. Portela, E., Pinto, R. 2004. Práticas culturais em soutos de Trás-os-Montes e relação com a incidência do cancro. Relatório Técnico do Projecto AGRO 151, Vila Real, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Portela, E., Aranha, J., Martins, A., Pires, A.L. 1999. Soil factors, farmer’s practices and chestnut ink disease: some interactions. Acta Horticulturae 494: 433-441.

296

Portela, E., Martins, A., Pires, A.L. 1998. Práticas culturais de limitação da tinta do castanheiro. UTAD- NATO-DRATM, Vila Real, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro. Portela, E., Roboredo, M., Louzada, J. 2003. Assessment and description of magnesium deficiencies in chestnut groves. J. of Plant Nutrition 26:503-523. Ribeiro, M.A.M. 1998. Estudo litogeoquímico das formações metassedimentares encaixantes de mineralizações em Trás-os-Montes Ocidental. Implicações Metalogénicas. Folha 6D da Carta Geológica de Portugal 1:50 000. Tese de Doutoramento. Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, Porto.

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P5.03. ESTADO NUTRITIVO DOS SOUTOS EM TRÁS-OS-MONTES. II- ANÁLISE FOLIAR

E. Portela,

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Ap 1013, 501-811 Vila Real

RESUMO A análise foliar é uma ferramenta necessária à gestão dos nutrientes nos soutos e à elaboração de recomendações de fertilização. Com vista à avaliação do estado de nutrição do castanheiro em Trás- os-Montes, agregou-se a informação relativa à análise foliar entre 1991 e 2006. Procurou-se estabelecer valores de referência para o castanheiro, com vista ao diagnóstico foliar e, ainda, alertar para a ocorrência de carências de magnésio e de boro.

PALAVRAS-CHAVE: Castanheiro, análise foliar, Ca, Mg, B

1. INTRODUÇÃO

A nutrição equilibrada do castanheiro é indispensável não só à manutenção da produtividade dos soutos, mas também ao estabelecimento de condições de crescimento saudáveis e à diminuição da susceptibilidade das árvores às doenças. Com efeito, é aceite, desde há muito tempo, o papel da nutrição mineral sobre a capacidade das plantas para resistirem às doenças ou para criarem mecanismos de defesa, nomeadamente em espécies arbóreas (Graham e Webb, 1991; van den Driessche, 1984; Baule e Fricker, 1970). A análise foliar é uma ferramenta essencial à gestão da fertilidade do solo e à elaboração de recomendações de fertilização, particularmente quando utilizadas de modo conjugado com a análise da terra. Há muito que aquela se tornou uma técnica de diagnóstico do estado nutritivo de fruteiras para elaboração de recomendações de fertilização, com vista à melhoria da quantidade e qualidade da produção. Todavia, relativamente ao castanheiro não existem estudos sistemáticos com vista ao estabelecimento dos valores de referência e dos teores críticos para a maioria dos nutrientes. Assim, com base em dados da análise foliar, agregou-se a informação disponível, recolhida entre 1991 e 2006, e procurou-se estabelecer os valores de ocorrência e os valores de referência para o castanheiro em Trás-os-Montes. Alerta-se também para a existência de carências de magnésio e de boro e para a necessidade da sua correcção.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

A colheita de folhas foi efectuada entre 15 de Agosto e 15 de Setembro (1991-2006) em soutos localizados em duas regiões naturais de Trás-os-Montes, Padrela e Bragança, tendo sido abrangidos os concelhos de Chaves, Valpaços, Murça, Macedo de Cavaleiros, Vinhais e Bragança. O método utilizado na amostragem das folhas foi descrito em Portela et al. (2003) e as respectivas metodologias analíticas para

298 determinação das concentrações de nutrientes são as adoptadas no Laboratório de Química e no Laboratório de Solos e Plantas da UTAD. A variedade maioritariamente amostrada foi a Judia e num reduzido número de soutos foram amostradas folhas de Longal e Lada. Foram obtidos dados junto dos agricultores relativos à história dos soutos, à produtividade da castanha, às práticas de fertilização e foram, ainda, feitos registos acerca do vigor das árvores e do seu estado de saúde. Estas informações serviram de base à eleição de 24 soutos saudáveis e em bom estado sanitário, com árvores de qualidade superior, com produtividades superiores à média, isto é, árvores vigorosas com copas regulares e bem preenchidas. Nestas árvores recolheram se amostras de folhas para determinação das concentrações foliares, afim de se estabelecer os valores ditos normais ou adequados para o castanheiro em Trás-os-Montes.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com base nas concentrações foliares de nutrientes em castanheiros foi elaborada a Figura 1, onde são apresentados os valores de ocorrência em 160 soutos. Nesta figura, o intervalo intermédio corresponde aos valores normais ou adequados. No estabelecimento deste intervalo teve-se em conta alguns valores de referência utilizados noutros países e também se consideraram as concentrações de nutrientes obtidas nos 24 soutos de características superiores amostrados nas regiões da Padrela e de Bragança (Tabela 1). Na obtenção destes valores para o castanheiro entendeu-se que havia necessidade de dispor de índices interpretativos ajustados às condições edafo-climáticas de Trás-os-Montes. Assim, na ausência de estudos sistemáticos para obtenção dos valores de referência para o castanheiro, poderão tomar-se os valores indicados na Figura 1. Pela análise da figura verifica-se que a grande maioria dos soutos se encontra dentro das concentrações normais para os nutrientes P, K, Fe, Mn, Zn e Cu, enquanto que para os nutrientes N, Ca, Mg, S, e B a maioria dos soutos apresenta valores baixos. Quanto ao Mn, os castanheiros de Trás-os-Montes atingem teores foliares elevados. Porém, tal como se observa na Tabela 1, isso não parece ser surpreendente, já que o intervalo é bastante amplo, havendo registos similares doutros autores.

Tabela 1 – Valores normais para as concentrações foliares em castanheiro Nutrientes Normal Normal, Weir Normal, Normal, Normal, Trás-os-Montes Cresswell (1993) Clark (1987)a Olsen Breisch (2001)b (1995)c N, g kg-1 19,0-28,4 24-29 22,8-29,2 22,1-25,0 18-25 P, g kg-1 1,1-3,4 1,4-3,0 0,7-1,8 1,4-4,5 1,3-1,7 K, g kg-1 7,6-19,3 8,0-16,0 4,7-7,3 8,1-20,0 6-10 Ca, g kg-1 4,3-14,5 6,0-14,0 6,6-22,0 10,1-25,0 8-12 Mg, g kg-1 1,3-5,9 2,5-7,0 2,3-4,3 2,5-5,0 2-4 S, g kg-1 - - 1,5-2,5 1,3-2,0 - Fe, mg kg-1 15-333 - 9-68 51-400 60-100 Mn, mg kg-1 179-2210 50-700 1120-3700 26-650 300-1000 Zn, mg kg-1 11-66 17-100 51-65 16-60 25-35 Cu, mg kg-1 4-53 4-20 5-11 5-15 10-15 B, mg kg-1 13-133 - 33-90 31-75 40-50 a- valores preliminares na Austrália (cit. por Ridley et al.,1999); b- valores preliminares nos EUA; c- valores de referência em França.

299

Observa-se também que há um número considerável de soutos com baixas concentrações de K, Zn e de Cu. Os teores mais baixos de K e Zn surgem em solos derivados de materiais quartzíticos. A natureza do material originário pode ser, em grande parte, responsável pelos baixos níveis destes nutrientes. Assim, na Tabela 2 apresentam-se as concentrações foliares no castanheiro agrupadas de acordo com a rocha subjacente que deu origem aos solos.

Tabela 2 - Concentrações foliares médias nos castanheiros de soutos assentes sobre diferentes materiais litológicos Macronutrientes xistos granitos materiais quartzíticos Nº de soutos 109 15 19 N, g kg-1 20,4 a 20,3 a 18,2 a P, g kg-1 2,00 b 2,19 b 1,39 a K, g kg-1 10,8 b 11,4 b 9,0 a Ca, g kg-1 6,0 a 5,9 a 6,6 a Mg, g kg-1 1,61 a 1,79 a 1,71 a Micronutrientes xistos granitos materiais quartzíticos Nº de soutos 85 13 17 Fe, mg kg-1 113 a 99 a 91 a Mn, mg kg-1 898 b 693 b 385 a Zn, mg kg-1 25 b 22 ab 14 a Cu, mg kg-1 11 a 10 a 9 a B, mg kg-1 31 a 58 a 44 a As médias que se encontram na mesma linha e com uma letra comum não são significativamente diferentes (P<0,05) pelo teste de Duncan.

Dum modo geral, constata-se que os teores foliares dos castanheiros que vegetam sobre materiais quartzíticos tendem a ser mais reduzidos em P, K, Mn e Zn. Não se registaram diferenças significativas entre os teores foliares nos soutos assentes sobre granitos e xistos (de diversas formações geológicas).

300

Regiões naturais N P

10 0 90 16 0

80 14 0 80 70 12 0 60 10 0 60 50 80 40 60 40 30 nº de soutos de nº soutos de nº

nº de soutos de nº 40 20

20 10 20

0 0 0 <20 20-28 >28 <1,2 1,2-3,5 >3,5 Padrela Bragança N, g k g -1 P, g kg-1

K Ca Mg

14 0 12 0 14 0

12 0 12 0 10 0

10 0 10 0 80 80 80 60 60 60 40 nº de soutos de nº nº de soutos de nº 40 soutos de nº 40

20 20 20

0 0 0 <8 8 -2 0 >2 0 <6 6 - 12 >12 <2,0 2,0-6,0 >6,0 K, g k g -1 Ca, g kg-1 Mg, g kg-1

S Fe Mn

20 12 0 12 0

10 0 10 0 15 80 80

10 60 60

40 40 nº de soutos de nº soutos de nº soutos de nº 5 20 20

0 0 0 <1,3 1,3-2,5 >2,5 <50 50 -3 50 >3 50 <200 200-2200 >2200 S, g kg-1 Fe, mg kg-1 Mn, mg kg-1

Zn Cu B

90 90 40

80 80

70 70 30 60 60

50 50 20 40 40

30 30 nº de soutos de nº soutos de nº nº de soutos de nº 10 20 20

10 10

0 0 0 <15 15-6 5 >6 5 <5 5- 2 0 >2 0 <20 20-90 >90 Zn, mg kg-1 Cu, mg kg-1 B, m g k g -1

Figura 1. Valores de ocorrência em 160 soutos agrupados de acordo com a região natural e com a análise foliar. A classe intermédia refere-se aos valores normais ou adequados

Como se observa na Tabela 2, os nutrientes N, Ca e Zn encontram-se, por vezes, em concentrações marginais e o Mg encontra-se em concentrações susceptíveis de ocasionar carência

301 deste nutriente. Em certos casos, os castanheiros manifestaram mesmo sintomas óbvios de carência de Mg. Em Trás-os-Montes, os sintomas da carência de Mg são bastante comuns no castanheiro, sobretudo em árvores jovens, e a produção e calibre da castanha podem ser muito afectados (Portela et al., 2003). Num levantamento efectuado ao estado nutritivo de 26 soutos, os autores constataram que a probabilidade da ocorrência de sintomas visíveis é elevada para concentrações foliares de Mg inferiores a 1,2 g kg-1, no entanto, esses sintomas podem registar-se até valores de 1,7 g kg-1 de Mg. Além da concentração foliar de Mg, as razões N/Mg e K/Mg revelaram ser, também, um meio de diagnóstico útil para confirmar os sintomas da carência de Mg e a nutrição desequilibrada do castanheiro. A separação entre árvores normais e árvores com sintomas da carência de Mg surgiu mais clara quando se consideraram as razões K/Mg ou N/Mg, do que quando se tomarem as concentrações foliares de Mg. Sempre que a razão K/Mg foi superior a 10, ou a razão N/Mg foi superior a 24, observaram-se sintomas visíveis da carência de Mg (Portela et al., 2003). O excesso + + no solo de catiões como o K e o NH4 , frequentemente veiculados através de fertilização desequilibrada, podem potenciar carências de Mg no castanheiro, sobretudo quando a carência é latente. Como se observa na Figura 1, há uma elevada percentagem de soutos com concentrações de B (<20 mg kg-1) susceptíveis de causar carência de boro. Apesar desta carência ser observada amiúde em Trás-os-Montes, ela nunca foi estudada no castanheiro. Com efeito, a carência de B no castanheiro tem sido detectada em vários soutos e análise foliar parece confirmar a deficiência de B. De entre os 13 soutos de Trás-os-Montes onde se identificaram os sintomas da carência, a concentração foliar de B variou entre 8 e 16 mg kg-1. Os sintomas têm sido observados nas folhas jovens dos rebentos terminais e também nos ouriços e frutos. As folhas são mais pequenas e, frequentemente, com a nervura principal descentrada e com os limbos apresentando-se deformados e com descontinuidades. Por vezes, podem exibir as margens necrosadas, quebradiças e enroladas para a página superior. Os ouriços apresentam pequenas dimensões e muitos não chegam a abrir, as castanhas abortam e não contêm o tegumento. No caso mais grave, o castanheiro exibia folhagem verde-escuro, os ramos apresentavam entrenós curtos e as folhas agrupadas de forma envassourada. Muitos ouriços exibiam os frutos abortados. Saliente-se que, dum modo geral, quando os sintomas de carências se declaram de forma perceptível, já os desequilíbrios nutritivos são marcados e a produção-qualidade terão sido afectados. O levantamento do estado nutritivo do castanheiro, efectuado regularmente, é de grande utilidade, pois poderá servir de alerta, de modo a antecipar-se a correcção da fertilização.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Baule, D.H., Fricker, C. 1970. The fertilizer treatment of forest trees. München, BLV-Verlagsges. Breisch, H. 1995. Châtaignes et Marrons. CTIFL, Paris, Ed. INRA. Graham, R.D., Webb, M.J. 1991. Micronutrients and disease resistance and tolerance in plants. In: Micronutrients in Agriculture, Madison, 2nd ed. Soil Sci. Soc. Am. 329-370. Olsen, J. 2001. Leaf analysis important in managing nutrition in the chestnut orchard. The Western Chestnut 3: 9-10. Portela, E., Roboredo, M., Louzada, J. 2003. Assessment and description of magnesium deficiencies in chestnut groves. J. of Plant Nutrition 26:503-523.

302

Ridley, A., Ridley, D., Carmichael, S., Schneider, H. 1999. The Australian chestnut growers’ manual: review of word literature, major issues and best practices. Australia, Ridley, D. and Beaumont, J. eds. Department of Natural Resources and Environment. Slovik, S. 1997. Tree Physiology. In R.F. Hüttl and W. Schaaf (eds) Magnesium Deficiency in Forest Ecosystems. Kluwer Academic Publ., London, 101-214 van den Driessche, R. 1984. Nutrient storage, retranslocation and relationship of stress to nutrition. In: Bowen, G.D and Nambiar, E.K.S. eds. Nutrition of Plantation Forests. London, Academic Press, 181- 209.

303

P5.04. MACROFUNGOS MICORRÍZICOS EM ECOSSISTEMAS DE CASTANEA SATIVA MILL. DO NORDESTE TRANSMONTANO – PROJECTO AGRO 689

1 1 3 1,2 1,2 3 4 1 Sousa MJ , Matos M , Dias R , Baptista P. ; Rodrigues PC , Rodrigues AP , Borges A ; Martins A.

1 - Escola Superior Agrária de Bragança, Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal – [email protected]; 2 – CIMO - Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal. 3 – PNM – Parque 4– Natural de Montesinho; ARBOREA- ASSOCIAÇÃO FLORESTAL DA TERRA FRIA TRANSMONTANA.

RESUMO

A biodiversidade de macrofungos associados aos ecossistemas de castanheiro (Castanea sativa) no nordeste transmontano foi realizada no âmbito do Projecto AGRO 689 “Demonstração do papel dos macrofungos na vertente agronómica, económica e ambiental no Nordeste Transmontano. Aplicação à produção de plantas de castanheiro (Castanea sativa), pinheiro (Pinus pinaster) e carvalho (Quercus pyrenaica)”. O estudo da abundância relativa de espécies micorrízicas comestíveis vs não comestíveis constituíram o objecto deste estudo, que será aqui apresentado através de fotografias realizadas ao longo do trabalho de campo, que teve lugar de Outubro de 2004 a Dezembro de 2006, abrangendo 5 épocas de produção/colheita, Outono de 2004, Primavera e Outono de 2005 e Primavera e Outono de 2006. A identificação dos carpóforos foi realizada de acordo com as características morfológicas e a observação macroscópica e microscópica de estruturas relevantes para a identificação. Apresentam-se as espécies micorrízicas comestíveis e não comestíveis inventariadas ao longo dos três anos de desenvolvimento do projecto, organizadas numa sequência de fotografias, com o objectivo de divulgar e tornar conhecidas e perceptíveis as principais espécies micorrízicas (comestíveis vs. não comestíveis) do ecossistema de castanheiro no Nordeste Transmontano.

304

P5.05. MACROFUNGOS NÃO MICORRÍZICOS EM ECOSSISTEMAS DE CASTANEA SATIVA MILL. DO NORDESTE TRANSMONTANO – PROJECTO AGRO 689

1 3 1,2 1 1,2 3 4 Matos M , Dias R , Baptista P. ; Sousa MJ , Rodrigues PC ; , Rodrigues AP , Borges A ; Martins A.1

1 - Escola Superior Agrária de Bragança, Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal – [email protected]; 2 – CIMO - Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal. 3 – PNM – Parque Natural de Montesinho

RESUMO

A biodiversidade de macrofungos associados aos ecossistemas de castanheiro (Castanea sativa) no nordeste transmontano foi realizada no âmbito do Projecto AGRO 689 “Demonstração do papel dos macrofungos na vertente agronómica, económica e ambiental no Nordeste Transmontano. Aplicação à produção de plantas de castanheiro (Castanea sativa), pinheiro (Pinus pinaster) e carvalho (Quercus pyrenaica)”. O estudo da abundância relativa de espécies não micorrízicas comestíveis vs não comestíveis constituíram o objecto deste estudo, que será aqui apresentado através de fotografias realizadas ao longo do trabalho de campo, que teve lugar de Outubro de 2004 a Dezembro de 2006, abrangendo 5 épocas de produção/colheita, Outono de 2004, Primavera e Outono de 2005 e Primavera e Outono de 2006. A identificação dos carpóforos foi realizada de acordo com as características morfológicas e a observação macroscópica e microscópica de estruturas relevantes para a identificação. Apresentam-se as espécies não micorrízicas (saprófitas e parasitas) comestíveis e não comestíveis inventariadas ao longo dos três anos de desenvolvimento do projecto, organizadas numa sequência de fotografias, com o objectivo de divulgar e tornar conhecidas e perceptíveis as principais espécies saprófitas e parasitas (comestíveis vs. não comestíveis) do ecossistema de castanheiro no Nordeste Transmontano.

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P5.06. EFEITO DE EXTRACTOS DE RAÍZES ELICIADAS DE CASTANEA SATIVA NO CRESCIMENTO DO FUNGO ECTOMICORRÍZICO PISOLITHUS TINCTORIUS

1Baptista, P.; 1Martins, A.; 2Tavares, R.M.; 2Lino-Neto, T.

1 CIMO- Escola Superior Agrária, Campus de Sta. Apolónia, Apt. 1172, 5301-855 Bragança, Portugal 2 Departamento de Biologia/Centro de Biologia, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal

RESUMO O castanheiro (Castanea sativa Mill.) estabelece associação com numerosas espécies de fungos ectomicorrízicos, estando descritos os efeitos benéficos para a planta após micorrização com Pisolithus tinctorius. Neste processo é essencial que ocorra a troca de sinais entre os simbiontes, para que seja reconhecida a sua compatibilidade e para que ocorra a formação dos órgãos ectomicorrízicos. Neste trabalho são fornecidas evidências que sugerem a capacidade de extractos de raízes de castanheiro, nos estádios iniciais de contacto com P. tinctorius regularem o crescimento do fungo micorrízico.

Palavras-chave: Castanea sativa, Pisolithus tinctorius, simbiose ectomicorrízica, sinais rizosféricos

1. INTRODUÇÃO

A associação de fungos ectomicorrízicos com as raízes de muitas espécies arbóreas, incluindo o castanheiro (Castanea sativa Mill.), constitui uma das interacções mais importantes que ocorrem ao nível da rizosfera. O estabelecimento da micorrização com o fungo ectomicorrízico Pisolithus tinctorius (Pers.) Coker & Couch origina modificações fisiológicas no castanheiro, resultando numa melhoria para o seu crescimento, desenvolvimento e resistência/tolerância ao fungo Phytophthora cinnamomi, causador da doença da “tinta” (Martins et al., 1997; Martins, 2004). Apesar da reconhecida importância da micorrização, a natureza molecular dos sinais emitidos bem como os mecanismos de reconhecimento e interacção dos parceiros simbióticos, essenciais para a iniciação, o desenvolvimento e a manutenção de uma simbiose ectomicorrízica funcional encontram-se por esclarecer. Alguns compostos identificados em exsudados e/ou extractos de raiz têm sido referidos como desempenhando um papel importante no estabelecimento da comunicação raiz-microrganismos (revisto por Hirsch et al., 2003; Bais et al., 2004). No presente trabalho foi estudado o efeito de extractos proteicos, obtidos de raízes de castanheiro nas fases iniciais de micorrização com o fungo P. tinctorius. Foi avaliada a capacidade estimuladora/inibidora de extractos proteicos de raízes eliciadas, com diferentes tempos de contacto (0-48 horas) com o fungo P. tinctorius, no crescimento deste fungo ectomicorrízico em condições “in vitro”.

306

2. MATERIAIS E MÉTODOS

Após germinação de sementes desinfectadas de Castanea sativa, efectuou-se a poda radicular e promoveu-se o crescimento de plântulas num sistema hidropónico. A inoculação das plântulas foi efectuada por transferência do micélio de P. tinctorius (crescido em meio Melin-Norkans) para os frascos de cultura contendo as plântulas com 4 meses. Como controlo, foram utilizadas plântulas não inoculadas, crescidas nas mesmas condições. Ao fim de 0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 24 e 48 horas de contacto raiz-fungo foram recolhidas aleatoriamente quinze plantas que se subdividiram em três grupos, de cinco plantas cada. Idêntico procedimento foi efectuado para as plantas controlo. Após colheita, as raízes foram imediatamente maceradas em azoto líquido e armazenadas a -80ºC. Os extractos proteicos foram preparados utilizando tampão de extracção (1g pf/4mL tampão de extracção). Após quantificação e esterilização por filtração, 24 µg de proteína extraída foram espalhadas uniformemente para a superfície de 10 mL de meio MMN. No controlo foi aplicado idêntico volume de tampão utilizado no processo de extracção de proteínas. Após inoculação com P. tinctorius, o crescimento radial das colónias fúngicas e as características macroscópicas foram avaliadas durante 30 dias após inoculação. Foram efectuados 5 ensaios para cada tempo de inoculação.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O efeito de extractos proteicos de raízes de castanheiro sujeitas a diferentes tempos de contacto com o fungo, no crescimento radial de colónias de P. tinctorius, foi analisado ao fim de 8 e de 17 dias de crescimento (Figura 1). Os resultados indicam que a presença de extractos radiculares de C. sativa estimulavam o crescimento de P. tinctorius, a partir dos 17 dias de cultura (Figura 1A). A promoção do crescimento de fungos ectomicorrízicos e arbusculares, por exsudados e/ou extractos radiculares, tem sido referida em algumas interacções micorrízicas (revisto por Giovannetti & Sbrana, 1998; Lum & Hirsch, 2003). De entre os compostos secretados em exsudados radiculares, a rutina (Lagrange et al., 2001), a zeatina (Barker & Tagu, 2000; Martin et al., 2001), os flavonóides e isoflavonóides (Kapulnik et al., 1996; Weiss et al., 1997; Harrison, 1999; Lum & Hirsch, 2003) têm sido apontados como tendo um efeito indutor no crescimento micelial. O efeito estimulador dos extractos radiculares de C. sativa eliciados por P. tinctorius no crescimento do fungo não foi evidente nos primeiros 8 dias de cultura, verificando-se inclusivamente para alguns extractos um efeito inibidor (Figura 1B). De facto, logo após a inoculação verificou-se existir uma inibição significativa do crescimento quando eram utilizados os extractos preparados com raízes postas em contacto com o fungo durante 2 a 9 horas e também às 15 horas. Este efeito inibitório pode ser o resultado da produção de alguns compostos em consequência da inoculação com P. tinctorius, deixando de ser observado a partir dos 17 dias de ensaio provavelmente devido à sua degradação e/ou à sua inactivação por parte do fungo cultivado. O decréscimo verificado na estimulação do crescimento de P. tinctorius por parte de extractos proteicos de raízes poderá ser relevante durante o processo de ectomicorrização. A restrição no crescimento e, consequentemente, da invasão dos tecidos da planta hospedeira por fungos diferentes daquele que iniciou o processo de

307 micorrização (inclusivamente da mesma espécie) poderá promover o estabelecimento da associação simbiótica. Esta hipótese necessita, no entanto, de confirmação mediante a realização de ensaios semelhantes utilizando espécies fúngicas diferentes. Os resultados indicam ainda que o aumento do crescimento radial de P. tinctorius foi variável em função do tempo de contacto raiz-fungo do extracto radicular utilizado (Figura 1A). O extracto de raiz de C. sativa não eliciada (0 horas) promoveu significativamente o crescimento radial de P. tinctorius, comparativamente ao controlo. De igual modo, os extractos proteicos de raízes eliciadas sujeitas a 2, 11 e após 24 horas de contacto com o fungo, estimularam o crescimento do P. tinctorius, observando-se valores significativamente superiores aos observados no controlo. Quando foram utilizados extractos proteicos obtidos de raízes eliciadas, no intervalo 3 a 9 horas de contacto com o fungo e ao fim de 15 horas de contacto, verificou-se uma diminuição do estímulo verificado no crescimento do fungo. Estes resultados sugerem que as primeiras 3 horas de eliciação poderão corresponder ao tempo necessário para a percepção, transdução de sinal e expressão de genes envolvidos na regulação do crescimento do fungo. Analisando a capacidade estimuladora/inibidora de crescimento do fungo ao longo do tempo de eliciação dos extractos radiculares, verifica-se um padrão muito semelhante ao observado para a quantificação dos níveis de H2O2 determinado no mesmo sistema micorrízico (Baptista et al., 2007).

Apesar do H2O2 produzido pelas raízes de castanheiro, durante a primeiras 48 horas de contacto raiz- fungo, não explicar directamente a redução do estímulo verificado no crescimento fúngico (até porque possivelmente esta ROS seria completamente degradada no decurso dos 30 dias em que demorou o ensaio), poderá desempenhar funções ao nível da sinalização.

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A 1,40 a 1,35a a ) a a -1 1,30 ab ab 1,25 bc 1,20 c c c c 1,15 c tampão 1,10

1,05 Crescimento radial (mm dia radial Crescimento 1,00 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Tempo de contacto raiz-fungo (horas)

B 1,25 a

) 1,20 a a -1 a tampão 1,15 a a ab a 1,10 ab ab 1,05 ab ab 1,00

0,95 b 0,90

Crescimento radial (mm dia radial Crescimento 0,85 0,80 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Tempo de contacto raiz-fungo (horas)

Figura 1. Crescimento radial de Pisolithus tinctorius, determinado ao fim de 8 (B) e 17 (A) dias de incubação em meio MMN complementado com extractos proteicos radiculares de plântulas de Castanea sativa eliciadas com P. tinctorius (0-48 horas). Como controlo foi utilizado meio MMN contendo tampão de extracção (linha a tracejado). A barra indica média ± erro padrão (n=5). Valores com a mesma letra não diferem significativamente entre si ao nível de p<0,05

A análise macroscópica de P. tinctorius, crescido na presença de extractos radiculares de plântulas de castanheiro eliciadas por P. tinctorius ou tampão de extracção (controlo), não evidenciaram diferenças significativas (Figura 2). A presença de extractos radiculares eliciados não induziram alterações morfológicas no fungo, nem a síntese de pigmentos que pudessem alterar a coloração da cultura. Este aspecto é relevante uma vez que muitas micotoxinas, como as naftoquinonas de Penicillium e Aspergillus são pigmentadas (Loguercio-Leite et al., 2006) . Adicionalmente, alguns pigmentos têm função antioxidativa, como por exemplo os β-carotenos e a torularodina (Loguercio-Leite et al., 2006).

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0h 9h 11h 48h Figura 2. Aspecto macroscópico de Pisolithus tinctorius, 23 dias após inoculação, em meio de cultura MMN contendo extractos proteicos radiculares de plântulas de Castanea sativa. Cada placa corresponde ao ensaio de um extracto proteico de raízes de castanheiro eliciadas, sendo indicado o período de tempo de interacção com P. tinctorius a que se refere

Agradecimentos Este trabalho foi realizado no âmbito dos projectos AGRO 689 e FCT (POCTI/BSE/38059/ 2001)

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Bais, H., Park, S.-W., Weir, T., Callaway, R., Vivanco, J. (2004). How plants coommunicate using the underground information superhighway. Trends Plant Sci 9, 26-32. Baptista, P.; Martins, A.; Pais, M.S.; Tavares, R., Lino-Neto, T. (2007). Involvement of reactive oxygen species during early stages of ectomycorrhiza establishment between Castanea sativa and Pisolithus tinctorius. Mycorrhiza (DOI 10.1007/s00572-006-0091-4). Barker, S.J., Tagu, D. (2000). The roles of auxins and cytokinins in mycorrhizal symbioses. Journal of Plant Growth Regulation 19, 144-154. Giovannetti, M., Sbrana, C. (1998). Meeting a non-host: the behaviour of AM fungi. Mycorrhiza 8, 123- 130. Harrison, M.J. (1999). Molecular and cellular aspects of the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 50, 361-389. Hirsch, A.M., Bauer, W.D., Bird, D.M., Cullimore, J., Tyler, B., J., Y. (2003). Molecular signals and receptors: controlling rhizosphere interacting between plants and other organisms. Ecology 84, 858- 868. Kapulnik, Y., Volpin, H., Itzhaki, H., Ganon, D., Galili, S., David, R., Shaul, O., Elad, Y., Chet, I., Okon, Y. (1996). Suppression of defence responses in mycorrhizal alfalfa tobacco roots. New Phytologist 133, 59-64. Lagrange, H., Jay-Allgmand, C., Lapeyrie, F. (2001). Rutin, the phenolglycoside from eucalyptus root exudates, stimulates Pisolithus hyphal growth at picomolar concentrations. New Phytol. 149, 349-355. Loguercio-Leite, C., Groposo, C., Dreschler-Santos, E.R., Figueiredo, N.F., Godinho, P.S., Abrão, R.L. (2006). A particularidade de ser um fungo –I. Constituintes celulares. Biotemas 19, 17-27. Lum, M.R., Hirsch, A.M. (2003). Roots and their symbiotic microbes: strategies to obtain nitrogen and phosphorus in a nutrient-limiting environment. Journal of Plant Growth Regulation 21, 368-382. Martin, F., Duplessis, S., Ditengou, F., Lagrange, H., Voiblet, C., Lapeyrie, F. (2001). Developmental cross talking in the ectomycorrhizal simbiosis: signals and communication genes. New Phytologist 151, 145-154. Martins, A. (2004). Micorrização controlada de Castanea sativa Mill.: aspectos fisiológicos da micorrização in vitro e ex vitro. In Biotecnologia Vegetal (Lisboa: Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa), pp. 566. Martins, A., Casimiro, A., Pais, M.M.S. (1997). Influence of mycorrhization on physiological parameters of micropropagated Castanea sativa Mill. plants. Mycorrhiza 7, 161-165. Weiss, M., Mikolajewski, S., Peipp, H., Schmitt, U., Schmidt, J., Wray, V., Strack, D. (1997). Tissue- specific and development-dependent accumulation of phenylpropanoids in Larch Mycorrhizas. Plant Physiology 114, 15-27.

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Lista de Participantes / Lista de Participantes

1 De Vasconcelos M. C., 2 Bennett R. N., 2 Rosa E. A. S., 3 Ferreira-Cardoso J. V. 1 PhD student with a FCT scholarship; 2 Centre of Science and Agricultural Engineering (CECEA) - Dept. of Phytotechnology and Rural Engineering; 3 Centre of Technological Studies on Environment and Life (CETAV) - Dept. of Biologic and Environmental Engineering. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Apartado 1013, 5001-801 Vila Real, Portugal.

1Dinis, L-T. J.,1Ferreira-Cardoso.,1J., 1Pimentel-Pereira, M., 2Peixoto, F.,3Costa, R. and 1Gomes- Laranjo,J. 1CETAV, 2CECAV – University of Trás-os-Montes and Alto Douro, 5000-911 Vila Real 3 Forest National Station, 2780-159 Oeiras

Abreu, I.1, Ribeiro, H.1,2, Oliveira, M.1, Aira, M.J.3, Rodríguez-Rajo, F.J.4, Jato, V.4 1Departamento de Botânica, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, Rua do Campo Alegre 1911, 4150-181 Porto, Portugal and IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Rua do Campo Alegre 823, 4150-180 Porto, Portugal; e-mail: [email protected] 2Secção Autónoma das Ciências Agrárias, FC-UP. 3Departamento de Botánica, Facultad de Farmacia, Campus Sur, Universidad de Santiago, 15706-Santiago de Compostela (Spain). 4Departamento de Biología Vegetal y Ciencias del Suelo, Universidad de Vigo, Facultad de Ciencias, Campus Universitario As Lagoas, 32004-Ourense, Spain.

Aguín,O. 1, 1Montenegro, D., 2Sainz, M. J., 1,2Mansilla, J. P. 1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la robleda s/n, 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

Albino Bento1, 1Susana Pereira, 1José Alberto Pereira 1 Instituto Politécnico de Bragança, CIMO/Escola Superior Agrária, Campus Santa Apolónia, Apt. 1172, 5301-855 Bragança. Portugal. [email protected]

Almeida P. *, L-T. Dinis*, J. Coutinho*, T. Pinto**, R. Anjos**, J. Ferreira-Cardoso**, M. Pimentel- Pereira**, F. Peixoto***, J. Gomes-Laranjo** * Department of Biological and Environmental Engineering, **Centre for Technological Studies on Environment and Life, *** Centre for Animal Science and Veterinary, University of Trás-os-Montes and Alto Douro, 5000-911 Vila Real

Arraiol, A.1,2, D. Aguin-Pombo 1,2, A. M. Franquinho Aguiar 3, E. Freitas 1,2, G. Angeli4 1Centre for Macaronesian Studies, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected]; [email protected]; [email protected] 2Departament of Biology, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected]; [email protected]; [email protected] 3Regional Secretary for the Environment and Natural Resources - Agricultural Quality Laboratory, Caminho Municipal dos Caboucos, 61, 9135-372 Camacha, Madeira, Portugal, [email protected] 4IASMA Research Center, Plant Protection Department, Via E. March 1. I-38010 – San Michele all'Adige (TN), Italia, [email protected]

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Barreira João C.M. 1, 1,*Isabel C.F.R. Ferreira, 2M. Beatriz P.P. Oliveira, 1José Alberto Pereira 1 CIMO/Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Campus de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301-855 Bragança, Portugal. 2 REQUIMTE/Serviço de Bromatologia, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Rua Aníbal Cunha, 164, 4099-030 Porto, Portugal. *Tel +351-273 303219; Fax +351-273 325 405; e-mail: [email protected]

Baptista, P. 1; 1Martins, A.; 2Tavares, R.M.; 2Lino-Neto, T. 1 CIMO- Escola Superior Agrária, Campus de Sta. Apolónia, Apt. 1172, 5301-855 Bragança, Portugal 2 Departamento de Biologia/Centro de Biologia, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057 Braga, Portugal

Batista, D.1*, Valdiviesso, T.1, Santos, L.1, Paulo, O.2, Gomes-Laranjo, J.3, Costa, R.1 1 Laboratório de Biologia Molecular, Estação Florestal Nacional, Quinta do Marquês, Av. República. 2780-159 Oeiras – PORTUGAL; 2 Departamento de Biologia Animal, Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, Campo Grande, 1749-016 Lisboa, PORTUGAL; 3 CETAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apt 1013. 5001-801 Vila Real, PORTUGAL* [email protected]

Berrocal, M., Turchetti, T., Villamediana, J.A. Escuela Técnica Superior de Ingenieria Agrárias, Palencia; Departamento Ingenieria Agrícola y Florestal Universisdad de Vallodolid. Avda de Madrid nº44; 34004 Palencia (España); Tfno: 979.10.83.62 Fax: 979.10.84.40

Catarina Coelho1, 2Rui Nunes, 3Taciana Veríssimo, 4Verónica Alves 1 UTAD, [email protected]; 2 UTAD, [email protected]; 3UTAD, [email protected]; 4 UTAD, [email protected]

Corredoira, E., M.C. San-José, A.M Vieitez, A. Ballester Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia, CSIC, Avenida de Vigo, s/n, Apartado 122, 15080 Santiago de Compostela, Spain [email protected]

Dias R3, Matos M1, Sousa MJ1, Baptista P.1,2; Rodrigues PC1,2; Martins A.1 1 - Escola Superior Agrária de Bragança, Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal – [email protected]; 2 – CIMO - Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal. 3 – PNM – Parque Natural de Montesinho

Dinis, L-T. 1, 1Gomes-Laranjo, J., 2Peixoto, F., 4Costa, R. e 3Abreu, C. 1CETAV, 2CECAV, 3CEGE Universidade Trás-os-Montes e Alto Douro, 5000 Vila Real 4Estação Florestal Nacional, 2780-159 Oeiras. Autor correspondente: [email protected]

Dulce Silva1, Clarisse Carmona2, Teresa Valdiviesso2, 1 Estação Nacional de Fruticultura Vieira Natividade, Rua de Leiria 2460-059 Alcobaça, Portugal, Fax: +351 262596221 2 Estação Florestal Nacional, Av. da República, Quinta do Marquês, 2780-159 Oeiras, Portugal, Fax: +351 214463702; [email protected]

Ester Portela Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Ap 1013, 501-811 Vila Real

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Faria J. 1, T. Pontes2, D. Aguin-Pombo 1,3, A. M. Franquinho Aguiar 4, D. Horta Lopes 5, R. Cabrera 6 1 Department of Biology, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected] 2 Centre for Macaronesian Studies, University of Madeira, Campus da Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, Portugal, [email protected] 3 Regional Secretary for the Environment and Natural Resources, Madeira, Portugal, [email protected] 4 Agricultural Quality Laboratory, Regional Secretary for the Environment and Natural Resources, Caminho Municipal dos Caboucos 61, 9135-372 Camacha, Madeira, Portugal, [email protected] 5 Section for Plant Protection, Department of Agricultural Sciences, Azores University, Largo da Igreja, 9701-851 Terra-Chã, Terceira, Azores, Portugal, [email protected], 6 U.D.I. Phytopathology, Faculty of Biology, Avda. Astrofísico Francisco Sánchez s/n, 38206 La Laguna, Tenerife, Spain, [email protected]

Francisco Peixoto1, 2 Aravind Sivasubramanian, 3 Abreu CG, 2 Ana M.F. Oliveira-Campos and 2 Lígia M. Rodrigues 1 Chemistry Department (CECAV) University of Trás-os-Montes and Alto Douro, Vila Real Portugal 2 Chemistry Center, University of Minho, 4710-057, Braga, Portugal 3 Plant Protection Department of University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real, Portugal

García-López J.M. 1 & C. Allué Camacho2 1.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected] 2.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected]

García-López J.M. 1; & C. Allué Camacho2 1.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected] 2.Junta de Castilla y León. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Área de Medio Natural. Juan de Padilla s/n. 09071 Burgos. [email protected] Fernández-López J.1, 1 M.E. Miranda-Fontaiña, 1 P. Furones 1 Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán. Xunta de Galicia.

Gomes-Laranjo, J. 1, 1João Paulo Coutinho, 2Francisco Peixoto3 1 CETAV, 2CECAV, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 202, 5000-911 Vila Real, Portugal Autor correspondente: [email protected]

Javier María García López 1, Carmen Allué Camacho 2 1Área de Medio Natural. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Junta de Castilla y León. C/ Juan de Padilla s/n. 09071-Burgos. [email protected] 2Área de Medio Natural. Servicio Territorial de Medio Ambiente. Junta de Castilla y León. C/ Juan de Padilla s/n. 09071-Burgos. [email protected]

Jesús M. Vielba, Silvia Valladares, Elena Corredoira, Ana M. Vieitez and Conchi Sánchez Instituto de Investigaciones Agrobiológicas de Galicia, CSIC, Apartado 122, 15780, Santiago de Compostela, Spain

Juan F.1, GALLARDO, 2M. Isabel GONZALEZ y 3Amaya ALVAREZ 1 C.S.I.C., Aptado. 257, Salamanca 37071 (España). [email protected]. 2 Area de Edafología, Universidad de Salamanca Salamanca 37080 (España). [email protected]. 3 Universidad de León, León 24080 (España).

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Lopes, D. J. H.1; Monjardino, P.1; Mendonça, D.1; Lopes, M. S.1; Monteiro, L.1; Carvalho, C.2; Baptista, C.1; Domingues, A.2; Melo, M.2 & da Câmara Machado, A.1 1 Centro de Biotecnologia dos Açores, Departamento de Ciências Agrárias da Universidade dos Açores, 9701-851 Terra Chã, [email protected] 2 FRUTER, Associação de produtores de fruta, produtos hortícolas e florícolas da Ilha Terceira.

Lopes S. 1, Peixoto F.1Gomes-Laranjo J.2 and Abreu, C.3 1 Chemistry Department, CECAV, University of Trás-os-Montes and Alto Douro, 5001 Vila Real, PORTUGAL 2 Department of Biology and Environmental Engineering CETAV, University of Trás-os-Montes and Alto Douro, 5001 Vila Real, PORTUGAL 3 Department of Plant Protection, University of Trás-os-Montes and Alto Douro, 5001 Vila Real, PORTUGAL; [email protected]

Lopes, D.J.H. 1; Macedo, N. 1;Figueiredo, A.1; Martins, J.T.2; Pimentel. R. 1; Pombo, D.A. 3. 1 Universidade dos Açores, Centro de Biotecnologia dos Açores, Departamento de Ciências Agrárias, Secção de Protecção de Plantas, 9701-851 Terra chã, [email protected] 2 Divisão de Protecção das Culturas, Serviço de Desenvolvimento Agrário da Terceira, Vinha Brava - 9700-236 Angra do Heroísmo, [email protected] 3 Universidade da Madeira, Departamento de Biologia, Penteada, 9000-390 Funchal, Madeira, [email protected]

Louzada, J.L. 1, 1Silva, M.E., 1Castro, S.B., 1Oliveira, S.P., Morais, J. 1 UTAD, Dep. Florestal, 5001-801 Vila Real, Portugal

Maria Dulce Anastácio1, Maria Manuel Mesquita1, Luís Sá1, Sofia Simões2, Nuno Onofre2, Helena Bragança2 1Dir. Reg. de Agricultura de Trás-os-Montes [email protected] 2Estação Florestal Nacional Helena.Braganç[email protected]

Martín, M.A; Alvarez, J.B; Martín, L.M. Departamento de Genética, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes, Edificio Gregor Mendel, Campus de Rabanales, Universidad de Córdoba, ES-14071 Córdoba, España.

Martins, A. 1, J. P. Coutinho2, F. Raimundo 1, O. Borges 3 e J. Gomes-Laranjo2 1Dep. Edafologia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Apart. 1013, 5001-801 Vila Real. Portugal; Tel. 259 350209; e-mail: [email protected] 2Centro de Estudos Tecnológicos, do Ambiente e da Vida, UTAD 3DRAPN, Qta do Valongo, 5370 Mirandela, Portugal

1 3 1,2 1 1,2 3 4 Matos M , Dias R , Baptista P. ; Sousa MJ , Rodrigues PC ; , Rodrigues AP , Borges A ; Martins A.1 1 - Escola Superior Agrária de Bragança, Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal – [email protected]; 2 – CIMO - Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal. 3 – PNM – Parque Natural de Montesinho

Medroa, D. V., Tavares, M. R., Rebelo, J. S., Saraiva, S. M.; Neves, A. S. e Soares, J. R. Escola Secundária de Seia - Centro Experimental de Ciência, Rua Alexandre Herculano, 6270- 428 Seia

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Miranda-Fontaíña, M.E. , Fernández-López, J., Furones-Pérez, P. 1Centro de Investigacións Ambientais de Lourizán. Departamento de Producción Forestal. Xunta de Galicia. Apdo 127, 36080. Pontevedra, Spain. E-mail: [email protected]

Monteagudo, A.B., Fernández-López, J. Department of Forest Production - Centro de Investigaciones Ambientales de Lourizán-CINAM, P.O. Box 127, 36080 Pontevedra. Spain. E-mail, [email protected]

Montenegro, D. 1, 1Aguín,O., 2Sainz, M. J., 1,2Mansilla, J. P. 1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la robleda s/n, 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

Moreira R.1, F. Chenlo, L. Chaguri, C. Fernandes 1 Departamento de Enxeñaría Química, Escola Técnica Superior de Enxeñaría (ETSE), Universidade de Santiago de Compostela, Rúa Lope Gómez de Marzoa, s/n 15782 Santiago de Compostela, España. Email: [email protected]

Moreira, R. 1, F. Chenlo, L. Chaguri 1 Departamento de Enxeñaría Química, Escola Técnica Superior de Enxeñaría (ETSE), Universidade de Santiago de Compostela, Rúa Lope Gómez de Marzoa, s/n 15782 Santiago de Compostela, España. E-mail: [email protected]

Nogueira, C.; Correia, P. Departamento das Indústrias Agro-Alimentares. Escola Superior Agrária de Viseu. Quinta da Alagoa. Estrada de Nelas.3500-606 VISEU. PORTUGAL. [email protected]

Paulo Reis Mourão1 & Teresa Mourão2 1 Department of Economics of the University of Minho, Gualtar, 4700 Braga, Portugal; e-mail: [email protected]; 2 Instituto de Emprego e Formação Profissional (Vila Real, Portugal).

Pereira, J.A. 1; 2Ribeiro, B.; 2Rangel, J.; 2Valentão, P.; 2Andrade, P.B.; 1Bento, A.; 2Seabra, R.M. 1 CIMO/Escola Superior Agrária, Instituto Politécnico de Bragança, Campus de Sta. Apolónia, Apt. 1172, 5301-855 Bragança, Portugal. [email protected] 2 REQUIMTE/Serviço de Farmacognosia, Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, Rua Aníbal Cunha, 164, 4050-047 Porto, Portugal. [email protected]

Picoaga, A. 1, 1Abelleira, A., 1,2Mansilla, J. P. 1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la Robleda s/n 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

Pintos, C. 1, 1Aguín, O.,1,2Mansilla, J.P., 1Montenegro, D., 1Rial, C. 1 Estación Fitopatolóxica do Areeiro, Subida a la robleda s/n, 36153 Pontevedra, España 2 Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario, 27002 Lugo, España

Pires, A. L. e Portela; E. Dep. Edafologia, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real

Reis, L. [email protected]; Divisão de Estudos e Informação, Direcção-Geral dos Recursos Florestais, Av. João Crisóstomo 26-28 1069 Lisboa

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Ribeiro, C., Silva, M., Batista, D. e Costa, R. Estação Florestal Nacional, Quinta do Marquês – Av. da República, 2780 – 159 Oeiras (e-mail: [email protected])

Sabugosa-Madeira Bernardo1,2; Abreu Ilda2, 3*; Ribeiro Helena1,2; Cunha Mário1,4 1Secção Autónoma de Ciências Agrárias, FC-UP, 2Departamento de Botânica, FC-UP, 3IBMC, Rua do Campo Alegre 823, 4150 – 180 Porto, Portugal 4CECA-ICETA, Rua Padre Armando Quintas, 4485-661 Vairão, Portugal. [email protected].

1 1 3 1,2 1,2 3 4 Sousa MJ , Matos M , Dias R , Baptista P. ; Rodrigues PC , Rodrigues AP , Borges A ; Martins A.1 1 - Escola Superior Agrária de Bragança, Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 5301- 855 Bragança, Portugal – [email protected]; 2 – CIMO - Quinta de Santa Apolónia, Apartado 1172, 3 – 4– 5301- 855 Bragança, Portugal. PNM – Parque Natural de Montesinho; ARBOREA- ASSOCIAÇÃO FLORESTAL DA TERRA FRIA TRANSMONTANA.

Zamora, P.1, Martín, A.B.2; Arrate, J.3; Rigling, D.4 Diez, J.J.5 1 Centro de Sanidad Forestal de Calabazanos. Consejería de Medio Ambiente.JCyL. Polígono de Villamuriel.34190 Villamuriel de Cerrato. Palencia. España. [email protected] 2 Centro de Sanidad Forestal de Calabazanos, Junta de Castilla y León. Polígono Industrial de Villamuriel del Cerrato, 34190 Palencia. España. [email protected] 3 Departamento de Producción Vegetal y Recursos Forestales. ETSIIAA Palencia. U. De Valladolid. Avda. Madrid,57.34004 Palencia. España. [email protected] 4 Swiss Federal Research Institute WSL. Ecological Genetics & Evolution. CH-8903 Birmensdorf, Switzerland Phone: ++41-44-739-2415 Fax: ++41-44-739-2215. [email protected] 5 Departamento de Producción Vegetal y Recursos Forestales. ETSIIAA Palencia. U. De Valladolid. Avda. Madrid,57.34004 Palencia. España. [email protected]

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