Možnosti Studia a Využití Genetické Diverzity Jírovce (Aesculus L.)

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie

Možnosti studia a využití genetické diverzity jírovce (Aesculus L.)

Bakalářská práce

Barbora Hladíková

VEDOUCÍ PRÁCE: Ing. Tomáš Vyhnánek Ph.D. Brno 2015 Bibliografický záznam

Autor: Barbora Hladíková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce: Možnosti studia a využití genetické diverzity jírovce (Aesculus L.)

Studijní program: Experimentální biologie

Studijní obor: Molekulární biologie a genetika

Vedoucí práce: Ing. Tomáš Vyhnánek Ph.D.

Akademický rok: 2015

Počet stran: 36

Klíčová slova: genetická diverzita; jírovec maďal; klíněnka jírovcová; SSR; RAPD; ISSR; SRAP; AFLP

Bibliographic Entry

Author: Barbora Hladíková Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis: Options of study and use of genetic diversity in chestnut (Aesculus L.)

Degree Programme: Experimental biology

Field of Study: Molecular biology and genetics

Supervisor: Ing. Tomáš Vyhnánek Ph.D.

Academic Year: 2015

Number of Pages: 36

Keywords: genetic diversity; horse chestnut; Cameraria ohridella; SSR; RAPD; ISSR; SRAP; AFLP

Abstrakt

Jírovec maďal (Aesculus hippocastanum) je v posledních desetiletích v Evropě napadán škůdcem klíněnkou jírovcovou (Cameraria ohridella). Z tohoto důvodu je třeba studovat jeho genetickou diverzitu a vyhledávat donory rezistence. Tato práce obsahuje stručný popis problematiky napadání jírovců klíněnkou a popisuje význam jírovce maďalu. Především ale shrnuje metody studia genetické diverzity (variability) použité pro studium rodu Aesculus a popisuje jejich výhody a nevýhody.

Abstract

Horse chestnut (Aesculus hippocastanum) has suffered from attack by leaf miner Cameraria ohridella in Europe over the past decades. For this reason, it is important to examine its genetic diversity and search donors of resistance. This thesis describes infestation of horse chestnut with leaf miner and covers the importance of horse chestnut. Mainly, it summarizes methods for studying genetic diversity (variability) used for genus Aesculus, and depicts their advantages and disadvantages.

Poděkování

Na tomto místě bych velmi ráda poděkovala svému školiteli Ing. Tomáši Vyhnánkovi Ph.D. za cenné rady a ochotu. Další dík patří také mé rodině a Vojtovi za podporu a schopnost naslouchat. Úplně nakonec připojuji trochu vděku všem kaštanovým zvířátkům mého dětství, která ve mně zasela chuť k této práci. Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 11. května 2015 Barbora Hladíková Obsah

1. Úvod...... 9 2. Jírovec maďal – Aesculus hippocastanum...... 10 2.1 Mechanismus poškození klíněnkou jírovcovou a mechanismus rezistence...... 11 2.2 Význam rodu Aesculus...... 13 3. Význam studia genetické diverzity...... 15 4. Metody studia genetické diverzity a variability...... 17 4.1 Hodnocení dle morfologických odlišností...... 17 4.2 Metody využívající PCR...... 17 4.2.1 Hodnocení dle polymorfismu délky jednoduchých repetitivních sekvencí (SSR).17 4.2.2 Hodnocení za pomoci náhodné amplifikace DNA (RAPD)...... 19 4.2.3 Hodnocení za pomoci amplifikace mezi jednoduchými repetitivními sekvencemi (ISSR)...... 21 4.2.4 Hodnocení za pomoci SRAP (sequence-related amplified polymorphism)...... 21 4.2.5 Hodnocení dle polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů (AFLP)...... 23 4.2.6 Hodnocení využívající sekvenování...... 24 5. Závěr...... 27 6. Literatura...... 29 1. Úvod

Jírovec maďal (Aesculus hippocastanum) je okrasný strom, který se hojně vyskytuje v České republice. Nejde o původní druh – byl uměle rozšířen působením člověka, přičemž jde převážně o parkovou dřevinu, případně tvoří aleje podél cest. V Evropě se původně nacházel především na Balkánském poloostrově a až během 16. století byl rozšířen po celém kontinentě (Prada et al., 2011). I přesto, že jde o nepůvodní druh, jírovec maďal v Evropě odolával dlouhou dobu velmi dobře jak škůdcům, tak environmentálním vlivům. V posledních dvou desetiletích se ale potýká s hojně rozšířeným škůdcem klíněnkou jírovcovou (Cameraria ohridella). Kromě Aesculus hippocastanum napadá klíněnka jírovcová také japonský druh Aesculus turbinata. Obecně lze tvrdit, že druhy ze skupiny Aesculus jsou náchylné vůči klíněnce, v severoamerickém taxonu Pavia je citlivost vůči klíněnce znatelně nižší a jedinci z taxonů Calothyrsus a Macrothyrsus jsou přirozeně rezistentní (D'Costa et al., 2013). Nejúčinnějším opatřením proti klíněnce jírovcové se jeví vysazování rezistentních jedinců. Mertelík a Kloudová (2009) identifikovali rezistentního jedince jírovce maďalu, kultivar M06. Rezistence jedince spočívá ve skutečnosti, že larva klíněnky odumírá v raných stádiích v důsledku požírání pletiva hostitelského stromu, čímž dochází k výraznému zmenšení poškozené plochy listu (Mertelík a Kloudová, 2009). Tato práce má zmapovat metody studia genetické variability (diverzity), jejich výhody, nevýhody a vhodnost pro různé účely. Především se zaměří na aplikaci těchto metod na rod Aesculus, ověřování pravosti jeho rezistentních kultivarů a na metody molekulární biologie vedoucí k rozpoznání míst v genomu, která by mohla mít souvislost s rezistencí vůči klíněnce jírovcové.

9 2. Jírovec maďal – Aesculus hippocastanum

Jírovec maďal je až 25 m vysoký strom. Mladší jedinec má hladkou šedohnědou kůru, která se při stárnutí mění v černavě šedou odlupující se borku. Jeho listy jsou 15–25 cm veliké, dlanitě složené a to 5–9četné. Pupeny má vstřícné, červenohnědé a silně lepkavé. Pupen na konci větve je výrazně větší. Květy jírovce jsou oboupohlavné a složené do vstřícných lat. V České republice rozkvétá obvykle počátkem května. Plody jírovce jsou ostnité tobolky s 1-3 leskle hnědými bochníkovitými semeny (Kříž et al., 1971). Dospělosti a tedy i schopnosti rozmnožování dosahuje jírovec zhruba v 7 letech (Verdú, 2002). Skovsted A. (1929) stanovil, že Aesculus hippocastanum má 20 párů chromozomů. Rod Aesculus patří do čeledi jírovcovité (Hippocastanaceae), řádu mýdelníkovité (Sapindales) a spolu s rodem Billia a Handeliodendron tvoří monofyletickou skupinu (Harrington et al., 2005). Již od 60. let 20. století je rod rozdělován do pěti skupin – Aesculus, Calothyrsus, Macrothyrsus, Parryana a Pavia. Harris et al. (2009) prováděli důkladnou fylogenetickou studii, ve které se zabývali i šířením rodu Aesculus po světě. Výsledkem je fylogenetický strom (viz obr. 1) zahrnující i fosilní druhy vytvořený na základě zhodnocení morfologie jedinců a sekvenčních analýz jaderné i chloroplastové DNA.

Obr. 1: Fylogenetický strom rodu Aesculus (Harris et al., 2009 – upraveno), CSA = střední a jižní Amerika, EA = východní Asie, eNA = východ Severní Ameriky, Eu = Evropa, Gr = Grónsko, wNA = západ Severní Ameriky.

10 Xiang a Soltis (2001) uvádí, že původ rodu Aesculus je ve východní Asii. Rod se záhy rozdělil na dvě hlavní linie. Jedna z linií se rozšířila z Asie na západ Severní Ameriky a následně i do východní části Severní Ameriky, což vedlo k rozdělení této linie na dva taxony. Druhá hlavní linie se rozšířila směrem na západ do Evropy a vedla k vytvoření sesterských druhů ve východní Asii a Evropě (viz obr. 2).

Obr 2.: Schéma ilustrující historické šíření rodu Aesculus (Xiang a Soltis, 2001); Outgroup1 = Handeliodendron, Outrgroup2 = Billia, A = východní Asie, B = východ Severní Ameriky, C = Západ Severní Ameriky, E = Evropa, F = Jižní Amerika

Největšího rozšíření dosáhl jírovec v Evropě během Miocénu a Pliocénu. Existují důkazy, že se vyskytoval ve Středomoří, střední a severní Evropě a dokonce i v severní Africe. Během glaciálů ve čtvrtohorách došlo k vyhynutí většiny jírovců v Evropě, zůstaly pouze na Balkánském a Pyrenejském poloostrově (Mijarra et al., 2008). Toto uspořádání přetrvalo až do poloviny 16. století, kdy se rozšířily do Evropy a byly vysazovány jakožto oblíbené okrasné stromy. Již na konci 16. století byly jírovce rozšířeny až do Anglie. Od této doby má nejvýraznější vliv na šíření rodu Aesculus v Evropě člověk (Prada et al., 2011). K samovolnému šíření jírovce dochází minimálně, a tudíž u něj v malé míře dochází i k rekombinaci a křížení – jeho genofond se tedy od 16. století příliš nezměnil.

2.1 Mechanismus poškození klíněnkou jírovcovou a mechanismus rezistence

Klíněnka jírovcová je denní motýl, škůdce Aesculus hippocastanum a Aesculus turbinata, který byl popsán v 80. letech v Makedonii. Následně se šířil Evropou, až byl v roce 2000

11 zachycen i na Britských ostrovech. Valade et al. (2009) se kloní k hypotéze původu klíněnky na Balkánském poloostrově, protože v tamějších populacích pozorovali její nejvyšší genetickou diverzitu, ovšem o původu klíněnky se stále spekuluje. Samičky klíněnky jírovcové kladou vajíčka na epidermis na horní straně listu. Vylíhlá larva se prokouše do vnitřní části listu a vyžírá houbový a palisádový parenchym – tvoří tzv. miny (viz obr. 3). Vývoj larvy trvá asi 4 týdny (D'Costa et al., 2013). V České republice vytváří klíněnka až 3 generace larev ročně (Mertelík a Kloudová, 2009).

Obr. 3: List Aesculus hippocastanum napadený Cameraria ohridella – typické miny (Mertelík a Kloudová, 2009)

Napadení klíněnkou způsobuje časné seschnutí a opad listů u jírovce. Nardini et al. (2004) pozorovali během jednoho roku index listové plochy pro stromy napadené klíněnkou proti kontrole. Hodnota indexu napadených stromů byla v srpnu oproti kontrole o 25 % nižší a v říjnu o 60 % nižší. Percival et al. (2011) uvádí, že napadení klíněnkou má vliv na aktivitu fotosyntézy jedince, v průběhu roku šlo o rozdíl až 37,2 %. K poklesu aktivity fotosyntézy dochází až od června/počátku července. Autoři se také zaměřili na míru vlivu klíněnky na reprodukci stromů. Plody napadených stromů měly průměrnou hmotnost 4,2 g proti 8,0 g pro plody kontrolních jedinců. Klíněnka jírovcová má podle nich prokazatelný negativní vliv na velikost plodů u druhu Aesculus hippocastanum, dokonce ovlivňuje i kvalitu semen. Po napadení klíněnkou se jedinec stává také citlivějším k dalšímu parazitovi Pseudomonas syringae pv. aesculi, který způsobuje slizotokovou nekrózu jírovce, chorobu vedoucí až

12 k uhynutí stromu (Percival a Banks, 2014). Při napadení klíněnkou je průběh choroby mnohem rychlejší a závažnější. Byli již popsáni jedinci rezistentní vůči tomuto parazitovi. Mertelík a Kloudová (2009) popsali chování rezistentního kultivaru M06. Rezistentní chování jedince spočívá v časném odumírání larev klíněnky v důsledku žíru listového pletiva. Minování je tedy zastaveno v počáteční fázi a dochází k minimálnímu poškození listu a po larvách zůstávají miny o průměru asi 1 mm (viz obr. 4). Jen v ojedinělých případech larva klíněnky na rezistentním jedinci přežívá a vytváří kuklu a následně životaschopného dospělce, obvykle k tomuto dochází na špatně vyvinutých listech.

Obr. 4: List Aesculus hippocastanum, rezistentní kultivar – malé miny o průměru asi 1 mm (Mertelík a Kloudová, 2009)

2.2 Význam rodu Aesculus

Mimo zřejmého významu pro krajinu, jakožto okrasné stromy, mají jedinci rodu Aesculus i další využití, kvůli kterým má význam zabývat se jejich ochranou proti škůdcům. Kimura et al. (2006) popsali pozitivní vliv escinů, saponinů ze semen Aesculus turbinata, na hladinu krevního cukru. Podání escinů myším 30 minut po konzumaci glukózy prokazatelně zastavovalo zvyšování krevního cukru. Jako pravděpodobný mechanismus účinku bylo vyhodnoceno zastavení vstřebávání glukózy v tenkém střevě. Dalším účinkem escinů byla i inhibice pankreatické lipázy. Tyto jejich vlastnosti dávají rodu Aesculus potenciál k využití

13 ve farmacii, obzvlášť ve využití preparátů proti obezitě (Kimura et al., 2006). Esciny mají dále protizánětlivé účinky (Wei et al., 2004) a vliv na prostupnost a pružnost žilních stěn, používají se tudíž v preparátech pomáhajících proti chronické žilní nedostatečnosti a dalším žilním potížím (Yu a Su, 2013). Niu et al. (2008) pozorovali, že β-escin negativně působí na proliferaci K562 buněk chronické myeloidní leukémie in vitro. Esciny také supresivně působí na aberrant crypt foci – prekancerózy rakoviny tlustého střeva, které byly působením azoxymetanu vyvolány u myší, negativně působí na proliferaci rakovinných buněk v těchto nádorech a dokonce indukují apoptózu v HT-29 buňkách lidského karcinomu tlustého střeva in vitro (Patlolla et al., 2005). Mimo to jsou také plody Aesculus hippocastanum hojně využívaným krmivem spárkaté zvěře, stromy bývají tudíž vysazovány v oborách s chovem jelenů, daňků a muflonů (Mertelík et al., 2010). Redukce velikosti semen z důvodu napadení klíněnkou jírovcovou je tedy komplikací při využívání plodů jírovce jako krmiva.

14 3. Význam studia genetické diverzity

Abychom si uvědomili důležitost studia genetické diverzity, je třeba pochopit význam genetické diverzity samotné. Jedinci ve svém genomu nesou určité znaky, které je nemusí nijak zvýhodňovat při optimálních podmínkách životního prostředí. Ovšem při ekologickém stresu mohou tyto znaky jedince zvýhodnit v reprodukci a do další generace se přenese více alel nesoucích schopnost zvládnout tento stres. Čím variabilnější je populace, tím vyšší je pravděpodobnost, že se vyrovná s náhlou změnou životního prostředí. Většina metod stanovujících genetickou diverzitu využívá k analýze nekódující části genomu. Je tedy otázkou, zda nám analýzy těchto částí umožní udělat si dostatečně dobrý přehled, abychom mohli stanovit i genetickou diverzitu, která je následně organismům prospěšná z hlediska ekologického. Reed a Frankham (2001) vyhodnotili závislost mezi variabilitou molekulárních markerů, které jsou obvyklým nástrojem ke studiu genetické diverzity, a schopností adaptivního chování druhů při změnách v životním prostředí, jako slabou, nicméně uznávají jejich vhodnost pro studium příbuznosti, struktur populací, genového toku atd. Studium genetické diverzity nám tedy dnes dává především přehled o historii druhu, jeho fylogenezi a o příbuzenských vztazích mezi jedinci, stanovení schopnosti populace k přežití je věc komplikovanější. Genetická variabilita populace může být vyjadřována v různých jednotkách. Oblíbený je průměrný počet alel na lokus, počet haplotypů (stejných genotypů – tedy jedinci se stejnými alelami v analyzované části genomu) v populaci nebo heterozygotnost, která vyjadřuje podíl heterozygotů v populaci. Pro poslední jmenované jsou kladené vyšší nároky na využitou metodu, protože zdaleka ne všechny využívané techniky jsou schopné detekovat heterozygoty. Leimu et al. (2006) sledovali všechny studie vzájemné závislosti genetické diverzity, velikosti populací a fitness provedené na rostlinách mezi lety 1987–2005, přičemž u většiny z nich byla prokázána pozitivní korelace mezi fitness, genetickou variabilitou a velikostí populací. Z toho důvodu autoři doporučují brát na zřetel vztah mezi těmito faktory při studiu fitness či genetické variability více populací najednou. Vliv velikosti populací na genetickou variabilitu také poukazuje na skutečnost, že fragmentace krajiny a s ní spojená fragmentace habitatu jednoho druhu má negativní vliv na genetickou variabilitu druhů.

15 Šíření Aesculus hippocastanum je v Evropě nyní především v režii člověka, dalo by se tudíž předpokládat, že jeho genetická diverzita bude vyšší v místě jeho původu na Balkánském poloostrově, kde docházelo k samovolnému křížení. Prada et al. (2011) nicméně uvádí, že genetická diverzita populací v Evropě je srovnatelná. Důsledky člověkem ovládaného šíření jírovce na různorodosti druhu tedy nebyly pozorovány. Přesto je vhodné genetickou diverzitu uchovávat. Kromě zabezpečení existence dostatečně velkých přirozených biotopů, ve kterých se bude genetický fond udržovat samovolně (tzv. ochrana biodiverzity in situ), se rostliny uchovávají i ex situ prostřednictvím genových bank, kde se nejčastěji uchovávají vysušená semena (Chloupek, 2008).

16 4. Metody studia genetické diverzity a variability

4.1 Hodnocení dle morfologických odlišností

V případě jírovce bylo hodnocení jeho variability na základě morfologických znaků využito při charakterizaci populací druhu Aesculus hippocastanum L. ve vzájemně vzdálených lokalitách v Srbsku (Ockoljić et al., 2013), kdy bylo vypozorováno, že se populace průkazně odlišují z důvodu genetické rozdílnosti a také kvůli odlišným podmínkám životního prostředí. Díky analýze množství taninu v listech byla také sledována souvislost mezi množstvím sekundárních metabolitů v listu a mírou infestace Cameraria ohridella. Morfologických rozdílů bylo také využito v případě rozsáhlé fylogenetické studie Foresta et al. (2001), ve které byl konstruován fylogenetický strom rodů Aesculus a Billia. Tato metoda má ve studiu genetické variability a diverzity své místo díky nástrojové nenáročnosti a slouží jako kvalitní podklad pro další výzkumy. Je vhodná pro fylogenetické studie a pro hodnocení vlivů životního prostředí. Ovšem pro srovnávání rozdílů mezi konkrétními jedinci je nevhodná například kvůli dlouhé době růstu charakteristické pro stromy a potažmo tedy i pro rod Aesculus a omezení se pouze na fenotypové projevy. To je důvodem, proč se využívají přístupy, které nám umožní pozorovat rozdíly okamžitě za využití PCR (polymerázové řetězové reakce) a dalších metod současné molekulární biologie.

4.2 Metody využívající PCR

PCR je významnou technikou využívanou při mnoha metodách k hodnocení genetické variability. Za použití specifických primerů zmnožíme části genomů sledovaných jedinců. Tato místa se mohou vzájemně odlišovat z důvodu změn v oblastech, kam nasedají primery, což značí genetickou variabilitu. Rozdíly v délce a počtu zmnožených fragmentů pozorujeme za využití gelové elektroforézy.

4.2.1 Hodnocení dle polymorfismu délky jednoduchých repetitivních sekvencí (SSR)

Využíváme jednoduchých repetitivních sekvencí (SSR), což jsou v genomu přirozeně se vyskytující tandemové repetice o délce 2–10 bp. Jejich četnost je mezi jedinci variabilní, protože se mění v důsledku mutací a rekombinací.

17 SSR jsou ohraničeny specifickými sekvencemi, pro něž jsou vytvořeny odpovídající primery. Tyto je třeba vytvořit nově pro každý druh, u kterého genetickou variabilitu zkoumáme, protože ohraničení repetic je mezidruhově odlišné. Nevýhodou je náročná a zdlouhavá příprava primerů (Li a Quiros, 2001). V případě jírovce se ale nemusíme nechávat touto komplikací svazovat, protože SSR primery pro tento druh již existují. Primery pro 10 SSR markerů Aesculus turbinata byly popsány v práci Minami et al. (1998). Jsou to primery pro lokusy AT3D6, AT5D2, AT5D10, AT6D2, AT6D8, AT6D11, AT6D12, AT7D1 a AT7D8. Byly testovány na vzorcích ze 43 stromů a byly rozpoznány jako velmi variabilní. Pro každý z nich bylo pozorováno od 4 do 18 alel na lokus a sledovaná heterozygotnost se pohybovala od 0,49 do 0,98. Primery lze použít i pro další druhy rodu Aesculus, měly by fungovat obdobně. Potíže s primery bývají až u druhů taxonomicky vzdálenějších. Tyto primery byly úspěšně využity v dalších studiích. Isagi et al. (2007) použili 6 z těchto markerů při studiu rozšíření pylu Aesculus turbinata, když s jejich pomocí určovali, z kterých stromů pyl pochází. Pro jednotlivé primery bylo pozorováno 15–26 alel na lokus (průměr 19,3 alel na lokus), heterozygotnost se pohybovala od 0,68 do 0,89. Analýza byla prováděna na 221 jedincích. Thomas et al. (2008) využili 8 markerů ke studiu hybridní zóny Aesculus flava, Aesculus pavia a Aesculus sylvatica, když se snažili určit, čím je dána genetická struktura hybridní zóny. Zvažovala se varianta, dle které se měl areál druhu Aesculus pavia překrývat s oblastí, kde se vyskytuje Aesculus sylvatica, čímž došlo ke genovému toku. Aesculus pavia posléze z této oblasti vymizel. Druhou možností byl přenos pylu na dlouhé vzdálenosti prostřednictvím kolibříků, přičemž se díky studiu genetické variability dalo za pravdu spíše této možnosti. Studie byla realizována na 391 jedincích z 24 populací v dané hybridní zóně a jejím výsledkem bylo pozorování 187 alel. V neposlední řadě Vyhnánek et al.(2013) využili 8 SSR markerů k porovnání 13 vzorků jírovce, jehož cílem bylo určit pravost klonového potomstva kultivaru rezistentního vůči klíněnce jírovcové. V jejich studii bylo pozorováno pouze 3,5 alely na lokus. Tento rozdíl oproti ostatním studiím je dán odlišnou velikostí analyzovaného souboru. I v případě takto omezeného souboru bylo možno prohlásit shodu původního kultivaru a jeho klonů, čímž se tato metoda prokázala jako úspěšná a vhodná pro srovnávání variability jedinců a určování jejich podobnosti. Další variantou využití repetitivních sekvencí ve studiu genetické diverzity je metoda VNTR (variabilní počet tandemových repetic), která je zaměřená na delší repetitivní sekvence. Lim et al. (2002) ji využili při studiu populace Aesculus flava a tří populací Aesculus glabra. Za

18 pomoci metody se podařilo získat v průměru 2,83 alel na lokus, přičemž podíl polymorfních lokusů byl 0,697. Autoři zhodnotili výsledek jako uspokojivý s možností snadno opakovat experiment. Genetická diverzita mezi populacemi byla posouzena jako nízká v porovnání s ostatními rostlinnými druhy, které byly hodnoceny touto metodou. Mimo výše zmíněných využití SSR markerů na jírovci se tato metoda využívá k identifikaci markerů asociovaných s konkrétním fenotypovým projevem. Například Shoba et al. (2012) identifikovali několik míst asociovaných s rezistencí vůči škůdci napadajícímu podzemnici olejnou Arachis hypogaea L. K této identifikaci potřebovali vysoký počet SSR primerů a také analýzu uměle vytvořené F2 generace. Tento postup by tedy nebylo možné v současné době využít pro Aesculus hippocastanum, poněvadž je známo pouze 10 SSR primerů a umělé křížení je komplikované s ohledem na skutečnost, že strom je schopen vytvářet květy až po delší době růstu. Vidíme, že využití SSR markerů je vhodné jak při studiu velkých populací, tedy pro využití v populační genetice, tak při pozorování menších skupin jedinců – například pro určování pravosti/příbuznosti klonového potomstva. Velikou výhodou SSR markerů je kodominantní charakter (zcela jedinečný znak mezi metodami, které se ke studiu genetické diverzity vážou), vysoká míra polymorfismu, potřeba pouze malého množství DNA k analýze a rychlé vyhodnocení výzkumu. Jones et al. (1997) sledovali reprodukovatelnost metod založených na DNA markerech. SSR markery se ukázaly být přesné a vykazující stejné výsledky při jednotlivých opakováních experimentu. Nevýhodou je již zmiňovaná vysoká náročnost stanovení markerů (Li a Quiros, 2001). Přestože je SSR velmi přesná a široce využívaná, existuje i oblast výzkumů, pro kterou se nehodí. Rossetto et al. (2002) uvádí, že metoda není vhodná pro fylogenetické studie na úrovni vyšších taxonů, protože jsou SSR příliš variabilní. Ve své práci se pokusili stanovit fylogenezi révovitých Vitaceae a uvádí, že na úrovni velmi blízce příbuzných druhů je SSR velmi vhodným nástrojem, ovšem pro vyšší fylogenetické úrovně je vhodné použít jiné metody.

4.2.2 Hodnocení za pomoci náhodné amplifikace DNA (RAPD)

RAPD je rychlá a jednoduchá technika, která využívá jeden primer o délce 8–12 náhodných nukleotidů, o němž nevíme, ke kterým částem genomu je homologní. Dochází k amplifikaci míst, kde nasednou primery na protilehlých řetězcích 3'-konci směřujícími k sobě.

19 Irzykowska et al. (2013) využili této metody v kombinaci se SRAP analýzou k výzkumu vnitrodruhových a mezidruhových genetických odlišností mezi Aesculus hippocastanum a Aesculus × carnea se zaměřením na korelaci genetické variability s odolností vůči Cameraria ohridella a Erysiphe flexuosa. 73% pozorované genetické variability A. hippocastanum a A. x carnea odpovídalo rozdílům mezi druhy, 27% připadlo vnitrodruhové rozmanitosti. U 17 fragmentů DNA byla pozorována souvislost s mírou napadení Cameraria ohridella. Za pomoci RAPD bylo získáno 6–9 polymorfních fragmentů na primer. RAPD byla hojně využívaná při šlechtění rostlin (Ragot a Hoisington, 1993; Virk et al., 1995) a při studiích populací rostlin (Lynch a Milligan, 1994). Výhodou této metody je její poměrně nízká cena (Ragot a Hoisington, 1993) a také nespecifické primery, jejichž tvorba je výrazně snadnější, než u výše zmíněného využití SSR markerů. S nespecifitou markerů se pojí nejvýraznější negativa této metody. Využití RAPD vede k obtížné opakovatelnosti studie. Jones et al. (1997) prováděli experiment, ve kterém několik evropských laboratoří provádělo stejné testování za pomoci RAPD. Opakovatelnost této metody byla vyhodnocena jako neuspokojivá a mnohem horší, než při použití SSR markerů nebo při využití metody AFLP (polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů). Rozdíly ve výsledcích experimentů jsou dané kompetitivním chováním nespecifických primerů, které mohou vést k tvorbě odlišných fragmentů a tvorbě umělých fragmentů vytvořených v průběhu PCR (Rabouam et al., 1999). Nejvýraznější nevýhodou RAPD je skutečnost, že můžeme pozorovat pouze existenci, či absenci fragmentu. Genotypy dominantního homozygota a heterozygota se nám tedy při využití této metody jeví jako stejné. Primery, které nám dávají tyto výsledky, jsou nazývány dominantní a oproti kodominantním (časté například u výše zmíněných SSR markerů) jejich prostřednictvím získáváme méně informací o vzorku a ztěžuje se nám interpretace, obzvlášť v populačních studiích, kde je heterozygotnost významným faktorem. Ve vztahu ke studiu genetické variability rodu Aesculus je metoda již překonána s ohledem k tomu, že máme přístupné přesnější techniky. Je vhodná v kombinaci s přesnějšími metodami anebo pro druhy, o jejichž genetické variabilitě není mnoho informací – v tom případě můžeme využívat výhod RAPD – je rychlá, levná a jednoduchá a lze díky ní získat první informace, na kterých je možné dále stavět.

20 4.2.3 Hodnocení za pomoci amplifikace mezi jednoduchými repetitivními sekvencemi (ISSR)

ISSR je modifikací náhodné amplifikace polymorfní DNA (RAPD), při které využíváme primerů homologických k SSR. Dochází zde k amplifikaci úseků DNA mezi jednotlivými SSR. Maximální délka fragmentů, které jsou amplifikovány je 2000 bp. Thomas et al. (2007) této metody využili při analýze hybridní zóny rodu Aesculus. Zde bylo při sledování dvou možných vlivů ovlivňujících hybridní zónu, pozorováno 391 jedinců a sledováno 34 druhově specifických proužků na gelu. Spolu s ISSR využili i polymorfismů SSR, oběma metodami autoři došli podobných výsledků, což ukazuje spolehlivost ISSR. Výhodou ISSR je, že nejsou potřebné znalosti sekvence, abychom ji mohli využívat což ji dělá mnohem přístupnější, nežli SSR. Oproti dříve zmíněným RAPD markerům dosahuje metoda opakovatelnosti na úrovni SSR markerů díky delším primerům (Bornet a Branchard, 2001). Navíc je odolná vůči změnám koncentrace primeru. Bornet a Branchard (2001) uvádějí, že při koncentraci primeru od 50 do 200 pmol na reakci pozorovali intenzivní a pro všechny vzorky stejné proužky na gelu. Tímto se metoda lišila od RAPD, která je na obdobné změny velmi citlivá. Využitím ISSR bylo sledováno při elektoroforéze více proužků, než při využití RAPD a RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů), ovšem ne tolik, jako při analýzách AFLP (Godwin et al., 1997). Nevýhodou je nízký počet kodominantních markerů, které jsou spíše výjimkou. Většina markerů nám však neumožňuje vidět rozdíl mezi dominantním homozygotem a heterozygotem. V tomto ohledu tedy metoda zaostává za využitím SSR (Gupta et al., 1994). Metoda ISSR má široké spektrum využití. Od pomoci při mapování genomu, přes fylogenetické analýzy a stanovování genetické diverzity druhů (Godwin et al., 1997) až po DNA fingerprinting, například pro odlišení jednotlivých kultivarů brambor (Prevost a Wilkinson, 1999). Pro rod Aesculus nebyla široce využívána, což je nejspíš dáno existencí SSR markerů, které poskytují více informací.

4.2.4 Hodnocení za pomoci SRAP (sequence-related amplified polymorphism)

SRAP popsali Li a Quiros (2001) jakožto metodu využívající pro PCR 2 primerů o délce 17– 18 nukleotidů tvořených tak, aby docházelo k amplifikaci fragmentů z ORF (otevřený čtecí

21 rámec). První z primerů obsahuje sekvenci CCGG za účelem navázání do oblasti exonu (tato oblast je bohatá na báze G a C). Kódující oblasti jsou poměrně konzervativní, druhý primer tudíž obsahuje poblíž 3'-konce sekvenci AATT za účelem vazby do oblasti promotorů či intronů, aby docházelo také k amplifikaci variabilnějších oblastí genomu. Z amplifikace v ORF vyplývá nejzásadnější výhoda této metody – amplifikované oblasti DNA mohou být úzce spojeny s kódujícími sekvencemi. To nám umožňuje velmi dobře interpretovat výsledky a hledat souvislost mezi markery a fenotypovými projevy. Autoři také uvádějí, že až 20% primerů jsou primery kodominantní. Jako kodominantní se chovají ta místa, kde došlo ke změně velikosti delecí či inzercí. Opakovatelnost této metody byla také shledána jako velmi dobrá. Tuto metodu na jedincích Aesculus hippocastanum a Aesculus × carnea využili poprvé Irzykowska et al. (2013) a shledali ji jako velmi účinnou, když ji v kombinaci s RAPD upotřebili při hledání markerů souvisejících s citlivostí jedinců vůči Cameraria ohridella, které mohou být základem pro hledání genetické podstaty odolnosti některých stromů. Celkem popsali 17 těchto markerů získaných kombinací SRAP a RAPD. Kromě identifikace markerů s vazbou na důležitý znak má SRAP široké využití. Je využívána k tvorbě genetických map. Jednou kombinací markerů získáme okolo 10 polymorfních míst a markery jsou libovolně kombinovatelné – i při použití nemnoha markerů se můžeme dostávat k vysokým počtům polymorfních lokusů, které nám umožní konstruovat genetické mapy s vysokou hustotou markerů (Li et al., 2011). Takto byla konstruována mimo jiné genetická mapa Brassica rapa L. (Li et al., 2011). Dále je SRAP využívána ke stanovení genetické diverzity, například Feng et al. (2009) ji použili k porovnání genetické odlišnosti geograficky vzdálených jedinců druhu Pinus koraiensis. V neposlední řadě se SRAP využívá k porovnávání kultivarů, například Ahmad et al. (2004) zkoušeli odlišit i geneticky velmi blízké kultivary nektarinek a broskví, přičemž zhodnotili SRAP jako efektivnější a levnější nástroj, nežli zároveň použitá SSR. Můžeme vidět, že SRAP má široké využití a je tedy překvapivé, že byla ke studiu rodu Aesculus využita pouze v jednom případě. Zvlášť vezmeme-li v potaz její jednoduchou proveditelnost, nepříliš vysokou finanční náročnost a spolehlivost, co se opakovatelnosti studií týká. Může to být dané tím, že oproti ostatním výše zmíněným metodám je SRAP mnohem mladší technikou. Abychom se nedrželi pouze výhod, je třeba si uvědomit, že prostřednictvím SRAP získáváme především dominantní markery, čímž je její použití částečně omezeno. Nemůžeme je použít například ke stanovení heterozygotnosti, jakožto

22 ukazatele genetické diverzity.

4.2.5 Hodnocení dle polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů (AFLP)

AFLP je metoda, kterou uvedli Vos et al. (1995). Podstatou metody je porovnávání restrikčních fragmenů na polyakrylamidovém gelu. Ty získáme rozštěpením malého množství studované DNA obvykle dvěma restrikčními endonukleázami a amplifikací s využitím PCR a dvou primerů. Huang a Su (1999) AFLP modifikovali využitím fluorescenčně značených primerů, což usnadnilo její využití a eliminovalo využívání radioizotopů. Dle jejich výsledků je možné využitím fluorescenčně značených primerů dosáhnout přesnějších výsledků mimo jiné díky snadnější rozlišitelnosti proužků. Metoda je využívána jak v původní formě, tak ve formě fluorescenční. AFLP je jednoduchá, levná a spolehlivá metoda. Jones et al. (1997) zkoušeli její opakovatelnost a spolehlivost, když stejnou analýzu prováděli v devíti evropských laboratořích a porovnávali jejich výsledky. Ty byly shodné v osmi laboratořích, devátá se odlišovala jedním proužkem na gelu ze 172. Můžeme tedy říci, že opakovatelnost metody je více než uspokojivá. Prostřednictvím AFLP získáváme většinou dominantní markery, což je zřejmou nevýhodou oproti SSR analýzám. Například Boivin et al. (1999) na 168 získaných proužcích na gelu vyhodnotili 29 kodominantních, určité procento kodominance tedy metoda vykazuje, v tomto směru je tedy AFLP srovnatelná s již zmíněnou SRAP. Ku prospěchu AFLP je jednoduchost provedení a nízká časová náročnost i díky využití nespecifických primerů. Oproti RAPD je AFLP mnohem spolehlivější a jejím výsledkem je až 10x více proužků na primer. (Maughan et al., 1996). AFLP byla vyhodnocena jako velmi vhodná při rozlišování jedinců velmi blízce příbuzných díky tomu, že je schopná ukázat více než 50 odlišných míst v genomu na jednu PCR. Toho využili Maughan et al. (1996) v analýze dvou druhů sóji – Glycine max a Glycine soja, ze které byl první uvedený druh vyšlechtěn. Autoři doporučují AFLP pro srovnání velmi blízce příbuzných rostlin. Například ve studii Beismanna et al. (1997) byla AFLP použita k odlišení tří druhů vrby. AFLP je také velmi vhodná pro tvorbu genetických map díky velkému množství proužků na jednu PCR. Cho et al. (1998) tuto metodu využili spolu s RFLP (polymorfismus délky restrikčních fragmentů) a SSR při konstrukci genetické mapy rýže (Oryza sativa L.). Díky AFLP se podařilo zkrátit intervaly mezi jednotlivými markery a vyplnit množství mezer.

23 K tvorbě genetických map se AFLP využívá i v novějších studiích, např. Muys et al. (2013) využili AFLP spolu s minisatelity (SSLP) k vytvoření genetické mapy čekanky obecné Chicorium intybus L. var. sativum za účelem porovnání s locikou setou Lactuca sativa a zhodnocení fylogenetických souvislostí. Zajímavým využitím AFLP je interpretace genotoxicity některých látek např. Labra et al. (2003). AFLP bývá také využita k hledání markerů asociovaných s fenotypovým projevem. Jin et al. (1998) za pomoci AFLP a tvorby near-isogenic lines (NILs) identifikovali markery ovsa asociované s rezistencí vůči žluté zakrslosti ječmene. Nabízí se otázka, zda by bylo možné jejich postupu využít k hledání markerů asociovaných s rezistencí Aesculus hippocastanum vůči Cameraria ohridella – bohužel nemůžeme využít k hledání asociovaných markerů NILs, protože nás omezuje dlouhá doba růstu jírovce. Při NILs totiž provádíme opakovaně zpětné křížení, což nám rostlina, která zatím nekvete, neumožňuje. AFLP byla v jednom případě využita i při studiu jírovce. AFLP použili Prada et al. (2011) při studiu vlivu člověkem způsobeného rozšíření jedinců Aesculus hippocastanum po Evropě na genetickou diverzitu. Vybrali si tuto metodu z důvodu citlivosti k malým genetickým odlišnostem. Počet pozorovaných proužků pro jednu populaci byl brán jako měřítko genetické diverzity. Dále bylo spočítáno procento polymorfních míst. Každý zkoumaný jedinec se svým profilem lišil, z hlediska populační genetiky autoři pozorovali podobnou genetickou diverzitu ve všech čtyřech zkoumaných populacích. Dále také díky využití výsledků studie vyslovili předpoklad, že druh Aesculus hippocastanum není samosprašný. Závěrem autoři podotýkají, že mnohem větší vliv na genetickou diverzitu má vzájemná vzdálenost jednotlivých populací, než zeměpisná šířka.

4.2.6 Hodnocení využívající sekvenování

Ke stanovení genetické diverzity lze využít i sekvenování. Techniky založené na tomto principu se využívají především pro taxonomické studie. Porovnávají se konzervativní sekvence jednotlivých druhů a na základě jejich srovnání se tvoří kladogramy. Velmi často se pro tyto typy výzkumů používá plastidová DNA, která je oproti jaderné DNA konzervativní. Vykazuje totiž většinou maternální dědičnost, pouze výjimečně dědičnost biparentální. (Corriveau a Coleman, 1988) Obvykle se neporovnávají celé genomy, nýbrž pouze vybraná místa, která jsou za použití specifických primerů amplifikována, následně sekvenována a porovnána mnohonásobným přiložením. Pro přesnější výsledky je vhodné zahrnout i jadernou DNA, proto se často pro jednu fylogenetickou studii spolu s informacemi

24 o plastidové DNA využívá i mnohonásobných přiložení ITS (vnitřních přepisovaných mezerníků) (Baldwin, 1992). ITS jsou nekódující sekvence mezi jednotlivými geny pro funkční molekuly RNA, jejich délky se mezi jedinci/druhy často odlišují a jsou snadno amplifikovatelné, protože primery cílíme na konzervativní kódující sekvence. Xiang et al. (1998) vytvářeli fylogenetický strom rodu Aesculus za využití mnohonásobných přiložení oblastí genu matK a ITS. matK je gen v chloroplastové DNA, který se podílí na sestřihu intronu, ve kterém se nachází (Ems et al., 1995). Na poměry plastidové DNA jde o neobyčejně variabilní gen. Pro svou výjimečnost se hojně využívá ve fylogenetických studiích. Hilu et al. (2003) na základě jeho variability vytvořili kladogram krytosemenných a vyhodnotili ho jako nejpřesnější ze všech kladogramů založených na srovnání variability jedné genové oblasti. Harris et al. (2009) opakovali postup Xianga et al. (1998) a využili další genové oblasti, čímž chtěli docílit tvorby přesnějšího fylogenetického stromu. Kromě matK a ITS použili oblasti LEAFY, trnHK a rps16. Navíc zahrnuli do studie i fosilní druhy. Gen LEAFY je jaderný gen figurující v tvorbě květu známý u Arabidopsis thaliana (Weigel et al., 1992). Homologní gen se vyskytuje i u rodu Aesculus. Harris et al. (2009) vytvořili na základě existujících primerů pro Aesculus californica další specifické primery, které využívali k tvorbě fylogenetického stromu rodu Aesculus. Nejde zdaleka o jedinou studii využívající k tvorbě kladogramů toto místo v genomu, využili ho v kombinaci s ITS a dalším genovým místem například i Hoot a Taylor (2001) pro rod Isoetes. Oblast trnHK byla zpracována podle Modliszewski et al. (2006) a jde o nekódující oblast v chloroplastové DNA, pro kterou Demesure et al. (1995) navrhli primery pro fylogenetické studie rostlin. Poslední použitá oblast je intron genu rps16, který využili jako první Oxelman et al. (1997) k tvorbě fylogenetického stromu Sileneae. Ve studii Harrise et al. (2009) se jako oblast s nejvíce informacemi ukázaly být ITS, naopak nejnižší variabilitu vykazovala oblast trnHK. Rod Aesculus byl přesvědčivě vyhodnocen jako monofyletický a byly potvrzeny skupiny Aesculus, Pavia a Parryana jakožto sesterské taxony. Modliszewski et al. (2006) a Sugahara et al. (2011) využili sekvenování částí chloroplastové DNA k populačním studiím. Nástrojem k tomu jim bylo stanovení haplotypů, tedy oblastí genomu, které se dědí společně. Modliszewski et al. (2006) potvrdili předpoklad, že se plastidová DNA u rodu Aesculus dědí maternálně a pozorovali 21 haplotypů u 248 jedinců z 29 populací, když se snažili

25 specifikovat historický vývoj populací v hybridní zóně ve střední a severní Georgii. Stejnou metodu využili i Sugahara et al. (2011), když analyzovali vývoj populací a jejich rozložení na souostroví Japonska. Na 337 jedincích z 55 populací pozorovali 10 haplotypů, přičemž velká část jedinců (156) měla shodný haplotyp. To poukazuje na nižší genetickou variabilitu a provázaný vývoj jednotlivých populací. Sekvenování se využívá především ve studiích fylogenetických a někdy také populačních. Je třeba si uvědomit, že oproti výše zmíněným metodám se tato zaměřuje na konzervativní části genomu, protože pro systematiku potřebujeme hledat společné jmenovatele například pro stanovení společného předka. Hodkinson et al. (2000) porovnávali úspěšnost studia fylogeneze prostřednictvím sekvenování ITS a AFLP u Phyllostachys (listoklasec). Vyslovili závěr, že ITS a další metody, ve kterých sekvenujeme konzervativní části genomu jsou vhodné pro tvorby fylogenetických stromů na vyšších úrovních. Pro velmi příbuzné druhy je vhodnější AFLP, protože dává více informací, které se pro malý stupeň odlišnosti nemusely projevit v konzervativních oblastech. Doporučují AFLP pro studium fylogeneze u druhů, pro které nebylo možné získat uspokojivé výsledky prostřednictvím sekvenování. Protože se sekvenční hodnocení genetické diverzity zaměřuje na konzervativní sekvence, je vhodné pro taxonomické a populační studie, nikoliv pro odlišování jedinců a prokazování pravosti kultivarů.

26 5. Závěr

S ohledem k rychlosti a intenzitě rozšíření Cameraria ohridella po Evropě, je dobře, že se zkoumají mechanismy, jak tomuto škůdci zabránit v napadání stromů rodu Aesculus. Jde o hodnotnou dřevinu, která si pozornost a péči zaslouží. V současné chvíli jsou známi rezistentní jedinci a víme, jak ověřit pravost jejich klonů (Vyhnánek et al., 2013). Mertelík et al. (2010) vytvořili metodiku roubování rezistentních klonů, bude tedy zajímavé pozorovat, jak úspěšní budou tito jedinci v porovnání s donorovými rostlinami. Tohoto srovnání se dočkáme až za delší dobu, protože takovéto srovnání vyžaduje pozorování v řádu let. Tato práce shrnuje metody studia genetické diverzity, které byly použity na rodu Aesculus. Konkrétně jde o hojně využívané SSR, AFLP a sekvenční analýzy, nepříliš přesnou ale jednoduchou a rychlou RAPD, a méně časté ISSR a SRAP. Mimo metod využívajících PCR byly k fylogenetickým studiím využity i metody srovnávající morfologické odlišnosti jednotlivých druhů. Využití SSR je vhodné pro ověřování pravosti klonů a určování příbuznosti i u malých souborů analyzovaných jedinců a také k využití pro porovnání populací. Pro fylogenetické studie jsou repetitivní sekvence příliš variabilní a pro podrobnější studie genetické diverzity, například pro tvorbu genetické mapy, známe málo SSR primerů, jejichž tvorba je velmi náročná. Pro tvorbu genetické mapy a jiné analýzy diverzity se zdá být nejvhodnější AFLP díky vysokému počtu proužků na gel, ovšem účinné jsou v těchto případech i kombinace více metod. Využívání více technik za účelem dosažení stejného cíle kombinuje výhody jednotlivých metod a navíc funguje jako ověřovací mechanismus, pokud autoři rozdílnými postupy dochází k obdobným závěrům. Pro fylogenetické studie se jeví být nejvýhodnějšími metody využívající sekvenování, jak je vidět na práci Harrise et al. (2009). Pro přehled o fylogenezi se hodí také pozorování morfologických odlišností mezi druhy. Za povšimnutí podle mého názoru stojí metoda SRAP, která není tak široce využívaná, jako ostatní metody zmiňované v této práci. Je to jistě z toho důvodu, že jde o metodu mladou. Irzykowska et al. (2013) ukázali, že potenciál v této metodě je, když s její pomocí a také za využití RAPD identifikovali markery asociované s rezistencí vůči Cameraria ohridella.

27 Genetická diverzita (variabilita) rodu Aesculus není zcela prozkoumána a měla by být podrobena dalším studiím. Směr výzkumu v této oblasti bude záviset na úspěšnosti klonů rezistentních jedinců.

28 6. Literatura

Ahmad R., Potter D., Southwick S. M. 2004. Genotyping of peach and nectarine cultivars with SSR and SRAP molecular markers. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 129(2): 204–210.

Baldwin B. G. 1992. Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: An example from the Compositae. Mol. Phylogenet. Evol. 1(1): 3– 16.

Beismann H., Barker J. H. A., Karp A., Speck T. 1997. AFLP analysis sheds light on distribution of two Salix species and their hybrid along a natural gradient. Mol. Ecol. 6: 989– 993.

Boivin K., Deu M., Rami J.–F., Trouche G., Hamon P. 1999. Towards a saturated sorghum map using RFLP and AFLP markers. Theor. Appl. Genet. 98: 320–328.

Bornet B., Branchard M. 2001. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Mol. Biol. Rep. 19: 209–215.

Corriveau J. L., Coleman A. W. 1988. Rapid screening method to detect potential biparental inheritance of plastid DNA and results for over 200 angiosperm species. Amer. J. Bot. 75(10): 1443–1458.

D'Costa L., Koricheva J., Straw N., Simmonds M. S. J. 2013. Oviposition patterns and larval damage by the invasive horse-chestnut leaf miner Cameraria ohridella on different species of Aesculus. Ecol. Entomol. 38: 456–462.

Demesure B., Sodzi N., Petit R. J. 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Mol. Ecol. 4: 129–131.

29 Ems S. C., Morden C. W., Dixon C. K., Wolfe K. H., dePamphilis C. W., Palmer J. D. 1995. Transcription, splicing and editing of plastid RNAs in the nonphotosynthetic plant Epifagus virginiana. Plant Mol. Biol. 29: 721–733.

Feng F., Chen M., Zhang D., Sui X., Han S. 2009. Application of SRAP in the genetic diversity of Pinus koraiensis of different provenances. Afr. J. Biotechnol. 8 (6): 1000–1008.

Forest F., Drouin J. N., Charest R., Brouillet L., Bruneau A. 2001. A morphologic phylogenetic analysis of Aesculus L. and Billia Peyr. (Sapindaceae). Can. J. Botany. 79: 154– 169.

Godwin I. D., Aitken E. A. B., Smith L. W. 1997. Application of inter simple sequence repeat (ISSR) markers to plant genetics. Electrophoresis. 18: 1524–1528.

Gupta M., Chyi Y.-S., Romero-Severson J., Owen J. L. 1994. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats. Theor. Appl. Genet. 89: 998–1006.

Harrington M. G., Edwards K. J., Johnson S. A., Chase M. W., Gadek P. A. 2005. Phylogenetic inference in Sapindaceae sensu lato using plastid matK and rbcL sequences. Syst. Bot. 30(2): 366–382.

Harris A., Xiang Q., Thomas D. 2009. Phylogeny, origin and biogeographic history of Aesculus L. (Sapindales) – an update from combined analysis of DNA sequences, morphology and fossils. Taxon. 58 (1): 108–126.

Hilu K. W., Borsch T., Müller K., Soltis D. E., Soltis P. S., Savolainen V., Chase M W., Powell M. P., Alice L. A., Evans R., Saquet H., Neinhuis C. Slotta T. A. B., Rohwer J. G. 2003. Angiosperm phylogeny based on matK sequence information. Am. J. Bot. 90(12): 1758–1776.

Hoot S. B., Taylor C. T. 2001. The utility of nuclear ITS, a LEAFY homolog intron, and chloroplast atpB-rbcL spacer region data in phylogenetic analyses and species delimitation in

30 Isoëtes. Am. Fern J. 91(3): 166–177.

Hodkinson T. R., Renvoize S. A., Chonghaile G. N., Stapleton C. M. A., Chase M. W. 2000. A comparison of ITS nuclear rDNA sequence data and AFLP markers for phylogenetic studies in Phyllostachys (Bambusoideae, Poaceae). J. Plant Res. 113: 259–269.

Huang J., Sun M. 1999. A modified AFLP with fluorescence-labelled primers and automated DNA sequencer detection for efficient fingerprinting analysis in plants. Biotechnol. Tech. 6: 989–993.

Chloupek O. 2008. Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Praha, Academia.

Cho Y. G., McCouch S. R., Kuiper M., Kang M.-R., Pot J., Groenen J. T. M., Eun M. Y. 1998. Integrated map of AFLP, SSLP and RFLP markers using a recombinant inbred population of rice (Oryza sativa L.). Theor. Appl. Genet. 97: 370–380.

Irzykowska L., Werner M., Bocianowski J., Karolewski Z., Fruzyńska-Jóźwiak D. 2013. Genetic variation of horse chestnuts and red horse chestnut and trees susceptibility to Erysiphe flexuosa and Cameraria ohridella. Biologia. 68/5: 851–860.

Isagi Y., Saito D., Kawaguchi H., Tateno R., Watanabe S. 2007. Effective pollen dispersal is enhanced by the genetic structure of an Aesculus turbinata population. J. Ecol. 95: 983– 990.

Jin H., Domier L. L., Kolb F. L., Brown C. B. 1998. Identification of quantitative loci for tolerance to barley yellow dwarf virus in oat. Phytopathology. 88 (5): 410–415.

Jones C. J., Edwards K. J., Castaglione S., Winfield M. O., Sala F., van de Wiel C., Bredemeijer G., Vosman B., Matthes M., Daly A., Brettschneider R., Bettini P., Buiatti M., Maestri E., Malcevschi A., Marmiroli N., Aert R., Volckaert G., Rueda J., Linacero R., Vazquez A., Karp A. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breeding. 3: 381–390.

31 Kimura H., Ogawa S., Jisaka M., Kimura Y., Katsube T., Yokota K. 2006. Identification if novel saponins from edible seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME) after treatment with wooden ashes and their nutraceutical activity. J. Pharmaceut. Biomed. 41: 1657–1665.

Kříž Z., Králik J., Michálek J., Richtár V. 1971. Lesnická botanika. Praha, Státní zemědělské nakladatelství.

Labra M., Di Fabio T., Grassi FR., Regondi S. M. G., Bracale M., Vannini C., Agradi E. 2003. AFLP analysis as biomarker of exposure to organic an inorganic genotoxic substances in plants. Chemosphere. 52: 1183–1188.

Leimu R., Mutikainen P., Koricheva J., Fischer M. 2006. How general are positive relationships between plant population size, fitness and genetic variation? J. Ecol. 94: 942– 952.

Li G., Quiros C. F. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: it's application to mapping a gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 103: 455–461.

Li W., Zhang J., Mou Y., Geng J., McVetty P., Hu S., Li G. 2011. Integration of Solexa sequences on an ultradense genetic map in Brassica rapa L. BMC Genomics. 12 (242) [online]. DOI:10.1186/1471-2164-12-249.

Lim H. W., Pelikan S., Rogstad S. H. 2002. Genetic diversity among populations and size classes of buckeyes (Aesculus: Hippocastanaceae) examined with multilocus VNTR probes. Plant Syst. Evol. 230: 125–141.

Lynch M., Milligan B. G. 1994. Analysis of population genetic structure with RAPD markers. Mol. Ecol. 3: 91–99.

Maughan P. J., Saghai Maroof M. A., Buss G. R., Huestis G. M. 1996. Amplified fragment lenght polymorphism (AFLP) in soybean: species diversity, inheritance, and near-isogenic

32 line analysis. Theor. Appl. Genet. 93: 392–401.

Mertelík J., Kloudová K. 2009. Výsledky sledování rezistentních projevů Aesculus hippocastanum (klon M06) ve vztahu k infestaci klíněnkou jírovcovou (Cameraria ohridella) v období 2001–2008. Acta Pruhoniciana. 93: 11–14.

Mertelík J., Kloudová K., Stejskal J. 2010. Problematika uplatnění klonu jírovce maďalu M06 s rezistentním chováním ke klíněnce jírovcové jako plodonosného stromu v oborách s intenzivním chovem spárkaté zvěře. Acta Pruhoniciana. 94: 9–12.

Mijarra J. M. P., Manzaneque F. G., Morla C. 2008. Survival and long-term maintenance of tertiary trees in the Iberian Peninsula during the Pleistocene: first record of Aesculus L. (Hippocastanaceae) in Spain. Veg. Hist. Archaeobot. 17(4): 351–364.

Minami E., Isagi Y., Kaneko Y., Kawaguchi H. 1998. Polymorphic microsatellite markers in Japanese horse chestnut Aesculus turbinata Blume. Mol. Ecol. 7: 1613–1621.

Modliszewski J. L., Thomas D. T., Fan Ch., Crawford D. J., dePamphilis C., Xiang Q. 2006. Ancestral chloroplast polymorphism and historical secondary contact in a broad hybrid zone of Aesculus (Sapindaceae). Am. J. Bot. 93: 377–388.

Muys C., Thienpont C.-N., Dauchot N., Maudoux O., Draye X., Van Cutsem P. 2013. Integration of AFLPs, SSRs and SNPs markers into a new genetic map of industrial chicory (Cichorium intybus L var. sativum) Plant Breeding. 133: 130–137.

Nardini A., Raimondo F., Scimone M. Salleo S. 2004. Impact of the leaf miner Cameraria ohridella on whole-plant photosynthetic productivity of Aesculus hippocastanum: insights from a model. Trees. 18: 714–721.

Niu Y., Li L., Wu L. 2008. Beta-aescin: A potent natural inhibitor of proliferation and inducer of apoptosis in human chroni myeloid leukemia K526 cells in vitro. Leukemia Lymphoma. 49(7): 1384–1391.

33 Ocokoljić M., Vilotić D., Šijačić-Nikolić M. 2013. Population genetic characteristics of horse chestnut in Serbia. Arch. Biol. Sci. 65 (1): 1–7.

Oxelman B., Lidén M., Berglund D. 1997. Chloroplast rps16 intron phylogeny of the tribe Sileneae (Caryophyllaceae). Pl. Syst. Evol. 206: 393–410.

Patlolla J. M. R., Raju J. Swamy M. V., Rao C. 2006. β-Escin inhibits colonic aberrant crypt foci formation in rats and regulates the cell cycle growth by inducing p21 waf1/cip1 in colon cancer cells. Mol. Cancer Ther. 5(6): 1459–1466.

Percival G. C., Barrow I., Noviss K., Keary I., Pennington P. 2011. The impact of horse chestnut leaf miner (Cameraria ohridella Deschka and Dimic; HCLM) on vitality, growth and reproduction of Aesculus hippocastanum L. Urban For. Urban Gree. 10: 11–17.

Percival G. C., Banks J. M. 2014. Studies of the interaction between horse chestnut leaf miner (Cameraria ohridella) and bacterial bleeing canker (Pseudomonas syringae pv. Aesculi). Urban For. Urban Gree. 13: 403–409.

Prada D., Velloza T. M., Toorop P. E., Pritchard H. W. 2011. Genetic population structure in horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.): effects of human-mediated expansion across Europe. Plant Spec. Biol. 26: 43–50.

Prevost A., Wilkinson M. J. 1999. A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theor. Appl. Genet. 98: 107–112.

Rabouam C., Comes A. M., Bretagnolle V, Humbert J. F., Periquet G., Bigot Y. 1999. Features of DNA fragments obtained by random amplified polymorphic DNA (RAPD) assays. Mol. Ecol. 8: 493–503.

Ragot M., Hoisington D. A. 1993. Molecular markers for plant breeding: comparisons of RFLP and RAPD genotyping costs. Theor. Appl. Genet. 86: 975–984.

Reed D. H., Frankham R. 2001. How closely correlated are molecular and quantitative

34 measures of genetic variation? A meta-analysis. Evolution. 55(6): 1095–1103.

Rossetto M., McNally J., Henry R. J. 2002. Evaluating the potential of SSR flanking regions for examining taxonomic relationships in the Vitaceae. Theor. Appl. Genet. 104: 61– 66.

Shoba D., Manivannan N., Vindhiyavarman P., Nigam S. N. 2012. SSR markers associated for late leaf spot disease resistance by bulked segregant analysis in groundnut. Euphytica. 188: 265–272.

Skovsted A. 1929. Cytological investigations of the genus Aesculus L. Hereditas. 12: 64–70.

Sugahara K., Kaneko Y., Ito S., Yamanaka K., Sakio H., Hoshizaki K., Suzuki W., Yamanaka N., Setoguchi H. 2011. Phylogeography of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata) in the Japanese Archipelago based on chloroplast DNA haplotypes. J. Plant Res. 124: 75–83.

Thomas D. T., Ahedor A. R., Williams Ch. F., dePamphilis C., Crawford D. J., Xiang Q. 2007. Genetic analysis of a broad hybrid zone in Aesculus (Sapindaceae): Is there evidence of long-distance pollen dispersal? Int. J. Plant Sci. 169: 647–657.

Valade R., Kenis M., Hernandez-Lopez A., Augustin S., Mari Mena N., Magnoux E., Rougerie R., Lakatos F., Roques A., Lopez-Vaamonde C. 2009. Mitochondrial and microsetellite DNA markers reveal a Balkan origin for the highly invasive hrose-chestnus leaf miner Cameraria ohridella (Lepidoptera, Gracillariidae). Mol. Ecol. 18: 3458–3470.

Verdú M. 2002. Age at maturity and diversification in woody angiosperms. Evolution. 56(7): 1352–1361.

Virk P. S., Ford-Lloyd B. V., Jackson M. T., Newbury H. J. 1995. Use of RAPD for the study of diversity within plant germplasm collections. Heredity. 74: 170–179.

Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M., van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J.,

35 Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. 1995. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23 /21: 4407–4414.

Vyhnánek T., Bačovský V., Vlašínová H., Havel L., Šedivá J., Mertelík J. 2013. Studium genetické variability u zástupců rodu Aesculus L. pomocí SSR markerů. ZLV. 58: 244–249.

Wei F., Ma L., Jin W., Ma S., Han G., Khan I. A., Lin R. 2004. Antiinflammatory triterpenoid saponins from the seeds of Aesculus chinensis. Chem. Pharm. Bull. 52(10): 1246– 1248.

Weigel D., Alvarez J., Smyth D. R., Yanofsky M. F., Meyerowitz E. M. 1992. LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis. Cell. 69: 843–859.

Xiang Q., Crawford D. J., Wolfe A., Tang Y., DePamphilis C. W. 1998. Origin and biogeography of Aesculus L. (Hippocastanaceae): A molecular phylogenetic perspective. Evolution. 54 (2): 988–997.

Xiang Q., Soltis D. E. 2001. Dispersal-vicariance analyses of intercontinental disjuncts: historical biogeographical implications for angiosperms in the northern hemisphere. Int. J. Plant Sci. 162 (6): S29–S39.

Yu Z., Su P. 2013. Effect of β-aescin extract from Chinese Buckeye seed on chronic venous insufficiency. Pharmazie. 68: 428–430.