Universidade Federal Do Espírito Santo

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

FRANCINE ALVES NOGUEIRA DE ALMEIDA

AUTENTICAÇÃO DE GINSENG BRASILEIRO UTILIZANDO A TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)

VITÓRIA, ES

2018

FRANCINE ALVES NOGUEIRA DE ALMEIDA

AUTENTICAÇÃO DE GINSENG BRASILEIRO UTILIZANDO A TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.

Orientadora: Profª. Drª. Greiciane Gaburro Paneto

VITÓRIA, ES

2018

(Folha de Rosto Verso)

Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e Classificação da Biblioteca Central da UFES, após a conclusão das correções sugeridas pela banca examinadora

FRANCINE ALVES NOGUEIRA DE ALMEIDA

AUTENTICAÇÃO DE GINSENG BRASILEIRO UTILIZANDO A TÉCNICA DE HIGH RESOLUTION MELTING (HRM)

Apresentada em 20 de fevereiro de 2018.

Profª. Drª. Greiciane Gaburro Paneto Universidade Federal do Espírito Santo Orientadora

Profª.Drª. Marcia Flores da Silva Ferreira Universidade Federal do Espírito Santo

Prof. Dr. Rodrigo Moura Neto Universidade Federal do Rio de Janeiro

VITÓRIA, ES

2018

AGRADECIMENTOS

Agradeço a minha orientadora Drª. Greiciane, pela paciência e a disponibilidade para orientar este trabalho.

À Drª. Maria Salete Marchioretto e ao Dr. Ilio Montanari Jr por fornecerem as amostras referências, possibilitando o desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus amigos do mestrado, Ana Carolina, Josselyn, Mariana e Pablo pelo apoio nos momentos difíceis e pelas risadas proporcionadas.

Ao Dr. Iuri Drummond Louro e todos do laboratório NGHM – Núcleo de Genética Humana e Molecular da UFES, assim como à Dr Marcia Flores e seus orientados, por permitirem trabalhos em seus laboratórios e utilização de equipamentos essenciais para a realização deste.

Agradeço aos colegas e técnicas do laboratório de Bioquímica do Campus de Alegre da UFES, pelas contribuições e bons momentos.

Agradeço a FAPES pelo financiamento deste projeto, a CAPES pela bolsa concedida e ao programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da UFES.

RESUMO

DE ALMEIDA, F. A. N. Autenticação de Ginseng brasileiro utilizando a técnica de High Resolution Melting (HRM). 2018. 72f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFES, Espírito Santo. Brasil.

À medida que a indústria de plantas medicinais cresce, a autenticidade de seus produtos é uma questão de segurança do consumidor e não pode ser negligenciada. O Ginseng brasileiro, por exemplo, se refere a duas espécies distintas, Pfaffia glomerata e Hebanthe eriantha. Apesar da similaridade entre essas duas espécies, o que dificulta a identificação morfológica, elas possuem propriedades químicas e farmacológicas distintas. Foi proposto que a técnica de High Resolution Melting (HRM) como uma ferramenta para discriminar e identificar as espécies P. glomerata e H. eriantha utilizando uma região do gene matK e rbcL. Para tal, foram adquiridas seis amostras referência, três de cada uma das espécies citadas, e 60 amostras comerciais, vendidas como Ginseng brasileiro, por meio de compra física ou online. O DNA foi extraído pelos métodos CTAB e por Kit. Os primers desenhados foram testados através da amplificação por PCR convencional e confirmado em gel de poliacrilamida antes da padronização da amplificação por PCR-HRM e por fim os resultados foram comparados aos de sequenciamento. Foram desenvolvidos três primers dois para o gene matK, HRM-matKD e HRM-matK, e um para o gene rbcL, HRM-rbcL. Durante a padronização notou-se a influência da temperatura de anelamento e concentração do primer no resultado da corrida, entretanto o método de extração não alterou os resultados. A análise de HRM mostrou que o primer HRM-matKD foi o que atendeu ao objetivo proposto apresentando alta sensibilidade (92-93%) e especificidade (100%) comparado ao método de sequenciamento. Foi possível validar a técnica de HRM utilizando amostras comerciais previamente sequenciadas, o que nos permite afirmar que a técnica de HRM pode ser utilizada para discriminar H. eriantha e P. glomerata. HRM é um método rápido e de baixo custo, sendo uma ferramenta confiável para identificação de espécies de Ginseng brasileiro.

Palavras-chave: Pfaffia. Identificação. Planta medicinal. Adulteração. Hebanthe. 7

AUTHENTICATION OF BRAZILIAN GINSENG USING THE HIGH RESOLUTION MELTING TECHNIQUE (HRM)

ABSTRACT

DE ALMEIDA, F. A. N. Authentication of Brazilian Ginseng using the High Resolution Melting technique (HRM). 2018. 72f. Master in Biotechnology) - Postgraduation Biotechnological Programme, UFES, Espírito Santo. Brazil.

As the herbal industry grows, the authenticity of its products is a matter of consumer safety and cannot be neglected. Brazilian Ginseng, for example, refers to two distinct species, Pfaffia glomerata and Hebanthe eriantha. Despite the similarity between these two species, which hinders morphological identification, they have different chemical and pharmacological properties. In this project we proposed a High Resolution Melting technique (HRM) as a tool to discriminate and identify P. glomerata and H. eriantha species using a matK and rbcL gene region. For this purpose, six reference samples were obtained, three of each of the aforementioned species, and 60 (sixty) commercial samples, sold as Brazilian Ginseng, through physical or online purchase. The DNA is extracted by the CTAB method and kit. The primer designed were tested through amplification by conventional PCR and confirmed in polyacrylamide gel before standardization of the PCR amplification- HRM and finally the results were compared to sequencing. Three primers were developed for the matK gene, two for the HRM-matKD and HRM-matK, and one for the rbcL gene , HRM-rbcL . During the standardization, the influence of the annealing temperature and the concentration of the primer on the race result was noticed, however, the extraction method did not change the results. The analysis of HRM showed that the first HRM-matKD was the one that met the proposed objective presenting high sensitivity (92-93%) and specificity (100%) compared to the sequencing method. It was possible to validate the HRM technique using previously sequenced commercial samples, which allows us to state that the HRM technique can be used to discriminate H. eriantha and P. glomerata. HRM is a fast and low cost method, being a reliable tool for identification of Brazilian Ginseng species.

Key words: Pfaffia. Identification. Medicinal plant. Adulteration. Hebanthe. 8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ilustração sistema subterrâneo e inflorescência Hebanthe eriantha ...... 20 Figura 2. Ilustração sistema subterrâneo e inflorescência Pfaffia glomerata ...... 21 Figura 3. Ilustração representando a Temperatura de Melting (Tm) atingida no momento em que as fitas de DNA estão 50% com dupla fita e 50% fita simples...... 26 Figura 4. Ilustração de gráfico de curvas de pico de melting, demonstrando a razão do derivado negativo da curva de fluorescência (F) sobre temperatura (T) (dF/dT), diferenciando três amostras pela temperatura de melting...... 26 Figura 5. Ilustração de amostras comerciais de Ginseng brasileiro já aliquotadas e utilizadas neste trabalho ...... 28 Figura 6. Ilustração do programa BioEdit mostrando o alinhamento das amostras P. glomerata, H. eiantha e Panax ginseng (Ginseng coreano) para construção do primer utilizando o gene matK. Em preto região selecionada para o amplicom ...... 30 Figura 7. Ilustração programa uMelt™. Após adicionar a sequência de DNA da região do gene a ser amplificada, o software indica o valor da Tm da mesma ...... 31 Figura 8. Gráficos de curva de amplificação da análise por HRM das amostras referências em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando primer HRM- matKD. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC...... 39 Figura 9. Gráficos de pico de melting normalizado por HRM das amostras referências em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando primer HRM- matKD. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC...... 39 Figura 10. Gráficos de curva de amplificação da análise por HRM em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando amostras referências e primer HRM-rbcL. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC. *Curvas verde e amarela correspondem a amostras não identificadas corretamente...... 40 Figura 11. Gráficos de pico de melting normalizado por HRM em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando amostras referências e primer HRM-rbcl. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC. *Curvas verde e amarela correspondem a amostras não identificadas corretamente...... 40

Figura 12. Gráficos de curva de amplificação de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), com diferentes concentrações do primer HRM-matKD. A) 0,1µM. B) 0,3µM. C) 0,5µM. D) 0,7µM. Curva verde amostra não identificada corretamente e curvas cinza referente a amostras que não amplificaram consideravelmente para ser identificada ...... 41 Figura 13. Gráficos de curva de amplificação de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), com diferentes concentrações de primers, utilizando o primer HRM-rbcL. A) 0,1µM. B) 0,3µM. C) 0,5µM. D) 0,7µM. *Curva amarela amostra não identificada corretamente...... 42 Figura 14. Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha, P. glomerata. A) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers degenerados HRM- matKD. B) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers não-degenerados HRM-matK ...... 43 Figura 15. Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando primer degenerado (HRM-matKD) comparando os dois métodos de extração. A) Extração com Kit. B) Extração com CTAB...... 44 Figura 16. Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando primer não degenerado (HRM-matK) comparando os dois métodos de extração. A) Extração com Kit. B) Extração com CTAB...... 44 Figura 17. Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando primer HRM-rbcL comparando os dois métodos de extração. A) Extração com Kit. B) Extração com CTAB...... 45 Figura 18. Gráficos de pico de melting normalizados por HRM e curva de amplificação demostrando a faixa linear de trabalho, em diferentes concentrações de DNA 14ng, 1,4ng e 0,14ng. A) P. glomerata. B) H. eriantha...... 45 Figura 19. Gráfico de pico de melting normalizados por HRM e curva de amplificação demonstrando a faixa linear de trabalho, em diferentes concentrações de DNA 14ng, 1,4ng e 0,14ng. A) P. glomerata. B) H. eriantha...... 46

Figura 20. Curvas de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha, P. glomerata e Panax ginseng. A) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers HRM-matKD. B) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers HRM-matK...... 477 Figura 21. Curvas de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha, P. glomerata e Panax ginseng. A) Curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers HRM-rbcL. B) Curvas de pico de melting normalizadas...... 47 Figura 22. Gráficos de High Resolution Melting das amostras comerciais confrontadas com amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando o par de primers HRM-matKD (A, B e C) e utilizando o par de primers HRM-matK (D, E e F). A e D) Curvas de amplificação. B e E) Curvas de melting normalizadas. C e F) Picos de melting normalizadas. *Demais cores são amostras não identificadas...... 48 Figura 23. Gráficos de High Resolution Melting das 60 amostras comerciais confrontadas com amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando o par de primers HRM-rbcL. A) Curva de pico de melting normalizada. B) Curva de melting normalizada. C) Curva de amplificação. * Curvas correspondentes a amostras não identificadas...... 499

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Amostras vendidas como Ginseng brasileiro de diversos locais do país...... 64 Tabela 2. Sequências de DNA Pfaffia glomerata, Hebanthe eriantha e Panax ginseng amplificadas pelos primers desenhados na região do gene matK e suas respectivas temperaturas de melting obtidas no software uMelt-DNA Melting, v2.0.2...... 36 Tabela 3. Primers desenhados para o gene matK para análise e identificação por HRM...... 36 Tabela 4. Sequências de DNA de Pfaffia glomerata, Hebanthe eriantha e Panax ginseng na região do gene rbcL e suas respectivas temperaturas obtidas no software uMelt-DNA Melting, v2.0.2...... 37 Tabela 5. Primers desenhados para o gene rbcL para análise e identificação por HRM...... 37 Tabela 6. Programa de ciclagem PCR-HR M para distinguir e identificar Pfaffia glomerata e Hebanthe eriantha...... 67 Tabela 7. Comparação da identificação das amostras comerciais entre as técnicas de Sequenciamento e HRM, utilizando os conjuntos de primers HRM-matKD e HRM- matK...... 68 Tabela 8. Resultado de identificação, em número absoluto, de espécies usando o método HRM com o primer HRM-matKD nas amostras comerciais previamente sequenciadas e identificadas...... 49 Tabela 9. Resultado de identificação de espécies usando o método HRM com o primer HRM-matK nas amostras comerciais previamente sequenciadas e identificadas...... 50 Tabela 10. Resultado de identificação de espécies usando o método HRM com o primer rbcL nas amostras comerciais previamente sequenciadas e identificadas...... 50 Tabela 11. Tabela com resultados de sensibilidade, especificidade precisão e razão de probabilidade, em porcentagem, para cada espécie, utilizando cada um dos primers desenvolvidos...... 51 . 12

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

BOLD Barcode of life Data Systems

ºC Celsius

CBOL Consortium for the Barcoding of life

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês desoxyribonucleic acid)

EDTA Àcido etilenodiamino tetra acético (do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid)

HRM High Resolution Melting matK maturase K

NaCL Cloreto de sódio ng Nanogramas

PCR Reação em cadeia da polimerase (do inglês Polymerase Chain Reaction) pM picomolar rbcL ribuloxy-bisphosphate carboxylase s segundos

SNP Polimorfismo de única base (do inglês Single Nucleotide Polymorphisms)

Tris-HCL Tris(hidroximetil)aminometano (do inglês Tris hydrochloride)

UFMT Universidade Federal do Mato Grosso

µl microlitro

UNICAMP Universidade Estadual de Campinas 13

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 15 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 17 2.1 USO DE PLANTAS MEDICINAIS NO BRASIL ...... 17 2.2 FAMÍLIA AMARANTHACEA ...... 18 2.2.1 Hebanthe eriantha (Poir.) Pedersen ...... 19 2.2.2 Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen ...... 20 2.3 Identificação de espécies ...... 22 2.4 Genes matK e rbcL ...... 24 2.5 High Resolution Melting ...... 24 3 OBJETIVOS ...... 27 3.1 Geral: ...... 27 3.2 Específico: ...... 27 4 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 27 4.1 Aquisição e processamento das amostras referências ...... 27 4.2 Aquisição das amostras comercias ...... 28 4.3 Extração e quantificação de DNA ...... 28 4.4 Desenho dos Primers ...... 30 4.5 Amplificação por PCR convencional ...... 31 4.5.1 Confirmação da PCR em gel poliacrilamida ...... 32 4.6 Padronização da amplificação de DNA por PCR-HRM ...... 32 4.6.1 Amplificação do DNA por PCR-HRM ...... 33 5. Análise estatística ...... 33 5.1 Validação da técnica de HRM em amostras comerciais ...... 34 5.1.2 Sensibilidade (S)...... 34 5.1.3 Especificidade (E)...... 34 5.1.4 Precisão (P) ...... 35 5.1.5 Razão de probabilidade (RP) ...... 35 6 RESULTADOS ...... 35 6.1 Desenho do primer ...... 35 6.2 Amplificação da PCR convencional e gel poliacrilamida ...... 37 6.3 Padronização PCR-HRM ...... 38 14

6.3.1 Gradiente de temperatura de anelamento ...... 38 6.3.2 Concentração de Primer ...... 41 6.3.3 Comparação entre primer degenerado (HRM-matKD) e não degenerado (HRM-matK) ...... 42 6.3. 5 Comparação de metodologias de extrações de DNA: Kit e CTAB ...... 43 6.3.3 Diluição do DNA ...... 45 6.4 Amplificação do DNA por PCR-HRM...... 46 6.5 Análise estatística ...... 47 6.5. 1 Validação da técnica de HRM em amostras comerciais ...... 47 6.5.2 Sensibilidade (S), especificidade (E), precisão (P) e razão de probabilidade (RP) ...... 49 7 DISCUSSÃO ...... 51 8 CONCLUSÃO ...... 54 REFERÊNCIAS ...... 56 APÊNDICE I ...... 64 APÊNDICE II ...... 67 APÊNDICE III ...... 68 ANEXO I...... 70

1 INTRODUÇÃO

Desde muitos anos, no Brasil e no mundo, as plantas vêm sendo utilizadas com fins terapêuticos. As plantas medicinais têm desempenhado um papel significativo para tratamentos e prevenção de diversas enfermidades e são muito exploradas pela indústria farmacêutica (NETO; CAETANO,2005). Entre 70% e 95% das populações dos países em desenvolvimento dependem da medicina tradicional para complementar suas necessidades básicas de saúde (ROBINSON; ZHANG, 2011).

Tendo em vista o grande consumo mundial de plantas medicinais, a segurança da correta utilização da espécie vegetal é uma questão que não pode ser negligenciada. A variedade de plantas medicinais encontradas no comércio, concomitante com as várias formas que são vendidas, como por exemplo, material seco, comprimidos, pós e cápsulas, apresentam uma dificuldade para distinguir e identificar, com precisão, quais espécies são, visto que podem ser substituídas por outras parecidas, tornando a identificação imprecisa (SUN et al., 2016; VELDM vvAN et al., 2014; IZE-LUDLOW et al., 2004).

O Ginseng Brasileiro, por exemplo, se refere a duas espécies distintas, Hebanthe eriantha (sendo Pfaffia paniculata a denominação antiga) e Pfaffia glomerata pertencentes à família Amaranthaceae. Descoberto pela busca por espécies semelhantes ao Ginseng coreano (Panax ginseng) são muitas vezes vendidas como tal (CRISTINA et al., 2010; OLIVEIRA, 1986). O Ginseng brasileiro também conhecido como “Para tudo” ou “Suma”, é utilizados há tempos por índios como tônico, afrodisíaco, no tratamento para diabetes, doenças reumáticas, esgotamento físico e mental, estresse e lapsos de memória (NEVES, 2013; OLIVEIRA, 1986). Alguns estudos sobre o uso medicinal das espécies Hebanthe eriantha e Pfaffia glomerata não fazem distinção entre elas, apesar da diferença de alguns constituintes químicos que podem gerar perfis farmacológicos diferenciados (VILELA, 2004).

Um estudo farmacológico observou que o extrato de raízes de P. glomerata possuía atividades depressoras do sistema nervoso, contrariando a utilização popular desta 16

espécie como estimulante (DE-PARIS et al., 2000). Além disso, segundo Gosmann et al. (2003), P. glomerata não apresenta atividades antiproliferativas sobre células tumorais, antiviral sobre o vírus herpes humano e nem efeitos antifúngicos. Já os extratos brutos de P. paniculata apresentavam atividades anti-inflamatórias, analgésicas testados em ratos (CARNEIRO et al., 2007; NETO et al., 2005; PINELLO et al., 2006).

Segundo Junior (2003) por muito tempo acreditava-se que os produtos encontrados nos mercados eram predominantemente P. paniculata, mas após alguns estudos observou-se que a maioria é da espécie P. glomerata. A identificação morfológica e diferenciação entre essas duas espécies é laboriosa. Além disso, esse material é adquirido processado e sem rotulo ou embalagem, dificultando ainda mais sua autenticação.

O DNA Barcoding ou “código de barras do DNA” é uma ferramenta para identificação de espécies utilizando sequências do DNA. Essas sequências podem ser utilizadas na distinção e identificação de organismos a partir da variação nucleotídica existente entre eles, dentro de regiões espécificas do DNA (IBOL; CBOL, 2015). A determinação da ordem de nucleotideos é realizada através do processo de sequencimento, uma técnica de alto custo (RUGMAN-JONES; STOUTHAMER, 2017).

Várias regiões de DNA no genoma do cloroplasto mostraram variação suficiente para serem úteis para a identificação das espécies vegetais (CBOL, 2009; OSATHANUNKUL; MADESIS; BOER, 2015). Ao testar sete regiões de DNA como ferramenta para identificação de espécies de planta, a CBOL Plant Working (2009) indicou a combinação entre as regiões dos genes rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) e matK (maturase K) como bons discriminadores de espécies de plantas (ÁLVAREZ; WENDEL, 2003; KRESS et al., 2005; YAO et al., 2010).

A técnica de High Resolution Melting (HRM) é proposta como um método alternativo ao sequenciamento, fornecendo um resultado confiável para identificar espécies de plantas e animais. A análise HRM é um sistema pós-PCR, rápido e automatizado, 17

que se baseia na diferença de temperatura de melting (Tm) utilizando um corante fluorescente (RUGMAN-JONES; STOUTHAMER, 2017).

HRM é um método mais rápido e barato e que, por essas vantagens vem sendo muito utilizado em pesquisas para propor novas metodologias de identificação de espécies.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 USO DE PLANTAS MEDICINAIS NO BRASIL

O Brasil tem descritas mais de 40.000 espécies de plantas e fungos, das quais 46,2% são endêmicas, mas poucas foram estudadas e tiveram suas propriedades químicas avaliadas (FORZZA et al., 2010; GUERRA; NODARI, 2001). Toda essa riqueza biológica aliada à diversidade de conhecimento empírico está intrinsecamente ligada ao uso de plantas para fins terapêuticos (GUERRA; NODARI, 2001; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

O conhecimento popular sobre o uso de plantas medicinais no Brasil tem influência em várias culturas principalmente na indígena, europeia e africana, tornando-se uma prática generalizada, sendo possível encontrar os produtos em feira livres, mercados populares e quintais residenciais (TREZENZOL et al., 2006). Diante do fácil acesso e amplo consumo desses produtos, viu-se a necessidade de regulamentar o uso das plantas medicinais e fitoterápicos, integrando a medicina tradicional ao sistema de saúde (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

No Brasil, além de seguir as recomendações da OMS, tem-se sua própria agência de regulamentação, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). A ANVISA define como planta medicinal todo e qualquer vegetal, que possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam 18

percursores de fármacos semissintéticos, destacando a diferença para um produto fitoterápico, o qual se baseia na elaboração da planta para uma formulação específica e controlada (ANVISA, 2010).

Intensificou-se a iniciativa de integração da fitoterapia no Sistema único de Saúde (SUS) em 2006 com a elaboração da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, regulamentada pelo Decreto nº 5.813, de 22 de junho de 2006, promovendo o uso sustentável dos componentes da biodiversidade brasileira, garantindo acesso seguro ao uso de plantas medicinais e fitoterápicos, não abstendo da relevância dos conhecimentos populares (BRASIL, 2006).

2.2 FAMÍLIA AMARANTHACEA

A família Amaranthaceae pertence à ordem Caryophyllales, formada por 170 gêneros com cerca de 2000 espécies (SIQUEIRA, 2002). No Brasil ocorrem 17 gêneros: Achyranthes L, Achyranthes Fork, Amaranthus L., Blutaparon Raf., Celosia H. B. K., Cyathula Lour., Froelichia Moench, Froelichiella R. e. Fries, Gomphrena L., Hebanthe Mart., Herbestia Sohner., Iresine P. Br., Lecosia Pedersen, Pfaffia Mart., Pseudoplantago Susseg. e Quatenella Pedersen, e cerca de 100 espécies (MARCHIORETTO; WINDISCH; SIQUEIRA, 2002).

Os membros da família Amaranthaceae são encontrados em regiões tropical e subtropical, podendo sobreviver em diferentes ambientes, encontradas em zonas áridas, ambientes arenosos, sendo muito poucas aquáticas (BORSCH; CLEMANTS; MOSYAKIN, 2001). Ervas ou trepadeiras, anuais ou perenes, eretos ou decumbentes, sistemas subterrâneos geralmente lenhosos e suculentos, com folhas opostas, alternas ou rosuladas, sem estípulas, glabra ou pilosa. A inflorescência é espiciforma, capituliforme, panícula, corimbiforme ou glomérulo axilar. Presença de flores monoclamídeas, sépalas hialinas, livres, e fruto seco, cápsula monospérmica ou polispérmica (SIQUEIRA, 2002).

Embora a família inclua espécies de interesse agrícola e ornamentais, algumas espécies como Pfaffia glomerata (Spreng) Pedersen e Hebanthe eriantha (Poir) 19

Pedersen são utilizadas para fins terapêuticos (LAMBDON et al., 2008). Mesmo com o estudo de vários pesquisadores sobre Amaranthaceae existem poucos trabalhos, no Brasil, a respeito dessas duas espécies, principalmente relatando a diferença dos princípios ativos entre as duas, as quais até pouco tempo eram incluídas no mesmo gênero (MARCHIORETTO, 2008).

2.2.1 Hebanthe eriantha (Poir.) Pedersen

Após revisão taxonômica, a espécie antes denominada Pfaffia paniculata (Mart.) Kuntze passou a ser denominada Hebanthe eriantha (Poir.) Pedersen (MARCHIORETTO, 2008). Espécie originária da Mata Atlântica apresenta extensa distribuição no Brasil podendo ser encontrada em todas as regiões em orla de matas, matas ciliares, bordas de rios, em diferentes formações florestais, em altitudes que variam de 100-1000m, com ocorrência também na Argentina, Paraguai e Peru (MARCHIORETTO, 2008).

Hebanthe eriantha é uma espécie de porte subarbustivo ou arbustivo, semi- escandente a escandente, medindo 0,9 a 1,80 metros de altura, com caule ramoso e lenhoso na base. Raiz com a presença de sucessivos arcos fibrovasculares predominantemente contínuos. Apresentam folhas ovaladas ou ovalado-oblonga, pecíolos curtos, glabros, ápice acuminado, base aguda, face adaxial glabra, face abaxial glabra a pilosa, com tricomas pluricelulares uniseriados de ápice agudo, com ornamentações tipo espícula. A inflorescência é uma espiga, produzindo flores pequenas e esbranquiçadas, medindo de 2 a 2,5mm (GOSMANN et al., 2003; MARCHIORETTO, 2008; SIQUEIRA, 2002) (Figura 1). 20

Figura 1: Ilustração sistema subterrâneo e inflorescência Hebanthe eriantha. (Fonte: MARCHIORETTO, 2008, JUNIOR, I. M.).

Os primeiros trabalhos sobre a composição química da Pfaffia paniculata, citam a presença de nortriterpenóide, denominados ácido fáfico, saponinas do tipo triterpênicos denominadas fafosídeos A, C, D, E e F, alantolina, sitosterol e estigmasterol (NISHIMOTO, 1984; TAKEMOTO; NISHIMOTO, 1983).

Em estudo com ratos, COSTA et al. (2015) revelou atividade anti-inflamatória intestinal do extrato de P. paniculata, relacionando o efeito protetor dessa espécie a redução do estresse oxidativo. O extrato de P. paniculata atua beneficamente na deformabilidade de glóbulos vermelhos em células sanguíneas de pacientes falciformes (MOZAR et al., 2016). Efeito inibidor em hepatocarcinogênese utilizando extrato de raízes de P. paniculata foram verificados por DA SILVA et al. (2005). O extrato metanolíco da raiz de P. paniculata reduziu o efeito do tumor de Ehrlich em sua forma ascética, por promover aumento de macrófagos, em estudos com ratos realizados por MATSUZAKI et al. (2003) e (PINELLO et al., 2006). CARNEIRO et al. (2007) demostraram o efeito da P. paniculata na angiogênese da córnea em camundongos.

2.2.2 Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen

A Pfaffia glomerata tem ocorrência desde o México até a Argentina e no Brasil está presente em vários estados ocupando condições climáticas diferentes, é típica de 21

campus de inundações de rios e frequentemente no cerrado e matas do estado de Mato Grosso do Sul, comumente encontrada na beira de rios e orla das matas (SIQUEIRA, 2002).

Constitui-se como uma espécie herbácea, perene, chegando a aproximadamente 2metros de altura, caule com nós engrossados, ocos, nas partes superiores, glabros ou pubescentes. Com a presença de folhas brevepecioladas, oval ou linear-oblonga, ápice acuminado ou mucronado, base pilosa. A inflorescência é capituliforme, com pedúnculo ramificado, ráquis lanosa, bráctea mediana oval, uninervada, brácteas laterais obtusas, glabras, pilosas no dorso. Flores amareladas ou alvascentes, sépala vilosas na base, trinervada, tubo estaminal com ápice dos filamentos laterais pouco desenvolvidos, anteras oblongas, ápice apiculado (SIQUEIRA, 2002) (Figura 2).

Figura 2: Ilustração sistema subterrâneo e inflorescência Pfaffia glomerata. (Fonte: MARCHIORETTO, 2008; JUNIOR, I. M.).

Nos estudos de SHIOBARA et al. (1993) e NISHIMOTO et al. (1896) analisando a composição química da Pfaffia glomerata detectaram a presença de ácido glomérico, ácido pfamérico, ecdisterona, rubrosterona e ácido oleanóico. A ecdisterona ou β-ecdisona é o composto medicinal, ausente na Hebanthe eriantha, mais estudado e com as seguintes propriedades comprovadas: protetora gástrica; cicatrizante em úlcera gástrica pré-formadas e principalmente com ação anabolizante (FERNANDES et al., 2015; SHIOBARA et al., 1993).

Em testes com ratos de idade avançada os resultados sugeriram que a P. glomerata promoveu um aumento na aprendizagem e memória (MARQUES et al., 2004). Segundo CALEFFI et al. (2015) o composto inulina, polímero de frutose, extraído das raízes de P. glomerata é uma fonte promissora de prebióticos, que são ingredientes alimentícios não digeríveis com efeito benéfico para o consumidor. Foi avaliada atividade antimutagênica da utilização dos extratos de P. glomerata em ratos e sem presença de citotóxica, o que contribui de forma eficiente para melhorar a qualidade de vida e a recuperação de pessoas submetidas a tratamento quimioterápicos (ALMEIDA et al., 2017).

2.3 Identificação de espécies

A identificação vegetal é relevante não só para a área da botânica e ecologia, mas também para outros campos como, por exemplo, a farmacologia. O método de identificação descrito por Linnaeus é o mais tradicional, feito por taxonomistas, bem capacitados e treinados, observando características anatômicas e morfológicas da espécie, e se trata de um trabalho complexo. Entretanto, a ação do meio pode variar alguns padrões, como cor, tamanho, simetria, entre outros, no desenvolvimento do órgão em estudo de uma mesma espécie, porém de diferentes indivíduos (CASANOVA, 2008; KEATING, 2009).

Quando a análise taxonômica não é determinante, e devido à preocupação da composição de medicamentos à base de plantas, outra técnica utilizada para identificação vegetal é o teste químico (LI et al., 2008). Utilizando marcadores químicos através da cromatografia, na qual são comparados perfis químicos do produto na literatura ou em amostras referências permitindo a discriminação entre as espécies (LI et al., 2008; TECHEN et al., 2004). Em muitos casos não existem dados químicos suficientes para marcadores químicos, como para a Hebanthe eriantha que não possui um marcador específico, ao contrário da Pfaffia glomerata, dificultando a utilização desta técnica (LI et al., 2008).

Diante das limitações apresentadas para as duas técnicas citadas acima, o desenvolvimento de outros métodos para identificação de espécies faz-se necessário. Sendo assim, métodos baseados na análise do DNA, tanto para identificação quanto para autenticação de vegetal, se tornaram relevantes e podem ser usados como uma garantia de qualidade de produtos medicinais (SGAMMA et al., 2017).

O DNA Barcoding ou “código de barras do DNA” é uma ferramenta para identificação de organismos em nível de espécie, criado em 2003 por pesquisadores canadenses que propuseram que uma pequena sequência de gene mitocondrial poderia identificar várias espécies (IBOL; CBOL, 2015). Nesse procedimento, o gene é amplificado por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) a partir de uma pequena amostra referência de DNA de um organismo e posteriormente sequenciado. A sequência resultante desse processo corresponde ao código de identificação do organismo em estudo e pode ser disponibilizada através de um banco de dados para ser confrontada posteriormente em novos estudos (AZEREDO, 2005).

Promovido pelo Consortium for the Barcoding of Life (CBOL), responsável por auxiliar no desenvolvimento de um sistema capaz de identificar todas as espécies a partir do código de barras do DNA, foi criado um banco de dados mundial Barcode of Life Data Systems (BOLD, Barcode of Life Data Systems - http://www.barcodinglife.org), que consiste em uma plataforma de bioinformática que contém sequências das mais diversas espécies, animais, vegetais, fungos e outros (AZEREDO, 2005; RATNASINGHAM; HEBERT, 2007).

A região padrão estabelecida como código de barras para os animais foi de um gene mitocondrial denominado Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI). Já para as plantas não se definiu definitivamente uma região (AZEREDO, 2005; CBOL, 2009). Portanto, sequências de cloroplastos são utilizadas para identificação de espécies e reconstrução filogenética de plantas. Essas sequências evoluem lentamente e não possuem muitas substituições entre as espécies (DONG et al., 2014). Testando regiões do cloroplasto para identificar código de barras de plantas a CBOL recomenda a combinação entre os genes rbcL (ribulose-bisphosphate carboxylase) e matK (maturase K) com base em nível de discriminação de espécies vegetais 24

(CBOL, 2009). No entanto outros genes também podem ser utilizados, como os espaçadores não codificantes atpF – atpH, trnH- psbA, trnL-F e o gene ribossomal ITS, ainda não havendo um consenso no uso de uma região padrão (CBOL, 2009; HOLLINGSWORTH, 2011).

2.4 Genes matK e rbcL

O gene matK possui duas características únicas que enfatizam sua importância na biologia molecular. Caracteriza-se pela sua taxa evolutiva rápida e função putativa como uma maturase de íntron de grupo II (KAR; GOYAL; SEN, 2015).

A região cloroplastidial do gene matK é uma das regiões que mais apresenta polimorfismos de única base, SNPs (do inglês Single Nucleotide Polymorphisms) e tem divergência interespecífica elevada e bom poder discriminatório. Mas devido à alta taxa de substituição nos sítios primários, pode ser difícil amplificar com primers universais (CBOL, 2009; HOLLINGSWORTH, 2011).

Entre as regiões plasticidas, rbcL é o gene mais bem caracterizado e de alta universalidade(CBOL, 2009). O gene ribulose-bisphosphatase carboxylase, é codificante da proteína ribulose-1,5-bisfosfato, conhecida como Rubisco, responsável por duas reações: a carboxilação de D-ribulose 1,5-bisphosphate, o principal evento na fixação de dióxido de carbono, bem como a fragmentação oxidativa do substrato de pentose no processo de fotorespiração. Ambas as reações ocorrem simultaneamente e em competição no mesmo local ativo (UNIPROT, 2016).

2.5 High Resolution Melting

Desenvolvida a partir do método de PCR em Tempo Real, a qual possibilita detecção de variações nas sequências pela temperatura em que o produto se dissocia, a técnica High Resolution Melting (HRM) tem sido bem sucedida para 25

identificar espécies se tratando de uma análise com menor custo comparada ao sequenciamento (DONG et al., 2014; SANTA, 2013).

A técnica de HRM permite detectar mutações genéticas, realizar genotipagem de SNPs e discriminar espécies (KAPABIOSYSTEMS, 2013; REED; KENT; WITTWER, 2007). Os múltiplos benefícios deste método resultaram em suas muitas aplicações na análise genética, incluindo aplicações microbiológicas (CHENG et al., 2006; MEINHARDT et al., 2015; SHIMOMURA et al., 2012), e também é usado na identificação de plantas (MISHRA et al., 2016; OSATHANUNKUL et al., 2015; SONG et al., 2016; SUN et al., 2016; XANTHOPOULOU et al., 2016) ou mesmo na análise de alimentos (LÓPEZ-ROJAS et al., 2017).

Os estudos iniciais foram em 1997, WITTWER et al. sugeriram que a análise de melting pode ser realizada usando corantes de ligação de DNA de cadeia dupla (dsDNA). No mesmo ano, RIRIE et al., relata a diferenciação de produtos de PCR por análise de curva de melting, monitorando a fluorescência do corante específico de dsDNA SYBER Green I. Eles demonstraram que a forma da curva de melting do DNA depende do conteúdo GC, do comprimento da sequência e que os produtos de PCR podem ser diferenciados em menos de 2ºC de diferença de Tm.

O primeiro passo do protocolo HRM é a amplificação da região de interesse, utilizando técnicas de PCR padrão, na presença de um corante de ligação de dsDNA. Este corante especializado é altamente fluorescente quando ligado a dsDNA e pouco fluorescente quando as fitas se dissociam. Esta alteração permite monitorar a amplificação do DNA durante a PCR. Com o aumento da temperatura, o corante é progressivamente liberado e a fluorescência diminui, formando a curva de melting (KAPABIOSYSTEMS, 2013; RIRIE; RASMUSSEN; WITTWER, 1997).

O padrão da fluorescência captada forma uma curva de melting obtendo-se a temperatura de melting (Tm). A Tm é definida como a temperatura à qual 50% das fitas de DNA são duplas e 50% são de cadeia simples, já se dissociaram (Figura 3).

Figura 3: Ilustração representando a Temperatura de Melting (Tm) atingida no momento em que as fitas de DNA estão 50% com dupla fita e 50% fita simples. (Fonte: https://www.dna.utah.edu/Hi- Res/TOP_Hi-Res%20Melting.html)

Cada espécie possui uma sequência de DNA especifica e cada uma resulta em uma temperatura de melting (Tm). Sendo assim, mediante a análise HRM se podem detectar variações de uma só base, como nos SNPs (KAPABIOSYSTEMS, 2013; TIMMERS et al., 2017). A Tm é tipicamente mais alta para fragmentos de DNA que são mais longos ou têm um elevado teor de GC, a forma e o pico da curva são característicos de cada amostra permitindo comparação e discriminação entre elas (Figura 4) (OSATHANUNKUL et al., 2015; WITTWER et al., 2003). Segundo CHENG et al. (2006) é possível realizar a diferenciação até ao nível de gênero ou espécie a partir da temperatura de melting.

Figura 4: Ilustração de gráfico de curvas de pico de melting, demonstrando a razão do derivado negativo da curva de fluorescência (F) sobre temperatura (T) (dF/dT), diferenciando três amostras pela temperatura de melting. (Fonte: ROCHE APPLIED SCIENCE, 2008).

A técnica de HRM pode ser promissora para a identificação de espécies de plantas, obtendo-se um resultado útil e confiável por ser uma analise rápida de alto rendimento, não requerendo processamentos pós-PCR diminuindo a possibilidade de contaminação. 27

3 OBJETIVOS

3.1 Geral:

Desenvolver protocolos de análise HRM para a discriminação das espécies Hebanthe eriantha e Pfaffia glomerata.

3.2 Específico:

- Desenhar primer específicos para identificar e discriminar Hebanthe eriantha e Pfaffia glomerata;

- Comparar a eficiência de primers degenerados e não degenerados na reação de HRM;

- Avaliar a influência do protocolo de extração de DNA na reação de HRM;

- Validar a técnica HRM utilizando amostras comerciais previamente sequenciadas;

- Verificar qual a especificidade e sensibilidade da técnica de HRM utilizando os primers desenvolvidos no referido trabalho.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Aquisição e processamento das amostras referências

As amostras referência de Pfaffia glomerata e Hebanthe eriantha neste projeto foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Ilio Montanari Jr (Unicamp/SP) (n = 3) e pela Dra. Maria do Carmo Vieira (UFGD/MS) (n = 3) (Figura 5), colaboradores deste projeto. 28

As plantas de H. eriantha foram identificadas morfologicamente pela Dra. Maria Salete Marchioretto, curadora do Herbarium Anchieta - PACA do Instituto Anchietano de Pesquisas em São Leopoldo – RS e as espécies de P. glomerata foram identificadas pelo Dr. Josafá Siqueira, do Instituto de Botânica do Rio de Janeiro. Amostras de Panax ginseng foram adquiridas em farmácias na China, sequenciadas e identificadas utilizando o banco de dados BOLD, para serem utilizadas como controles. Esta espécie foi considerada para confirmar a padronização da técnica tendo em vista a similaridade do nome comercial das mesmas, “ginseng coreano”, com o nome “ginseng brasileira”, o que poderia favorecer a troca no mercado.

4.2 Aquisição das amostras comercias

Amostras vendidas como ginseng brasileiro (n = 60) de diversos locais do país foram adquiridas por meio de compra física ou online, conforme Tabela 1 (APÊNDICE 1). Na Figura 5 estão representadas algumas das amostras comerciais adquiridas.

Figura 5: Ilustração de amostras comerciais de Ginseng brasileiro já aliquotadas e utilizadas neste trabalho (Imagem do autor).

4.3 Extração e quantificação de DNA

Dois métodos de extração de DNA foram testados para verificar sua influência na reação de HRM e estão descritos a seguir: 29

- Extração com kit Nucleo Spin® Plant II (Machereley-Nagel, Duren, Germany), seguindo seu protocolo, utilizando 30mg de amostra. Previamente, foi necessário macerar algumas amostras com auxílio de nitrogênio líquido para transformá-las em pó fino, pois muitas se encontravam em forma de raiz ou pequenos pedaços.

- Protocolo CTAB (DOYLE, 1991):

Para o isolamento do DNA das amostras, foi transferido 30mg para um tubo de 2 mL contendo 700 μL de tampão de extração (Anexo 1) a 65º C. O conteúdo dos tubos foi bem misturado para homogeneizar a solução e, logo em seguida, incubado por 60 minutos a 65º C, sendo agitado no vortex a cada 10 minutos. A seguir foram adicionados 900 μL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), invertendo o tubo para homogeinizar a mistura. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 15.000 rpm por 5 minutos. Após a centrifugação a fase aquosa superior foi transferida para um tubo de 1,5 mL, no qual foi acrescentado 1/10 volume da solução de extração e 1 volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Depois de misturadas, novamente por inversão, as amostras foram submetidas a mais uma etapa de centrifugação. O sobrenadante foi então transferido para um novo tubo onde recebeu 1 volume da solução de precipitação (Anexo 1) e logo, em seguida, foi incubado a 65º C por 30 minutos. Após a incubação, os tubos foram centrifugados a 2.700 rpm por 5 minutos a 4º C. O sobrenadante foi descartado, e o pellet foi ressuspendido em 900 μL de TE - alto sal (Anexo 1) e incubado a 65º C por 30 minutos. O volume de cada tubo foi dividido igualmente em dois outros tubos. O DNA foi então precipitado em 2,5 volumes de etanol gelado, e as amostras centrifugadas a 14.000 rpm por 15 minutos a 4º C. O sobrenadante foi cuidadosamente descartado, e o pellet lavado com 200 μL de etanol 80%. A etapa de centrifugação foi repetida por 5 minutos, e a fase aquosa superior descartada. O precipitado foi então dissolvido em 50 μL de LoTE (Anexo 1) e armazenado em freezer -30ºC.

Posteriormente às extrações, as amostras foram submetidas à quantificação em NanoDrop 2000c (Thermo Scientific).

4.4 Desenho dos Primers

As sequências de DNA (dos genes matK e rbcL) das duas espécies referências foram alinhadas utilizando o programa BioEdit Sequence Aligment Editor versão 7.2. 5 (HALL, 1999) (Figura 6) e utilizadas para o desenho dos primers. As mesmas não estavam disponíveis em nenhum banco de dados e foram assim obtidas a partir de um projeto anterior de nosso grupo de pesquisa (FIALHO, 2017). Além das amostras referências, foram selecionadas do banco dados BOLD Systems (http://www.boldsystems.org) sequências de Panax ginseng (Ginseng coreano).

Figura 6: Ilustração do programa BioEdit mostrando o alinhamento das amostras P. glomerata, H. eiantha e Panax ginseng (Ginseng coreano) para construção do primer utilizando o gene matK. Em preto região selecionada para o amplicom (Imagem do autor).

Após o alinhamento das sequências, a região na qual encontramos maior variação entre as espécies foi escolhida para o desenho dos primers. Os mesmos foram desenhados manualmente obedecendo aos padrões sugeridos para desenhos de primers para reação de HRM com amplicon variando de 70 – 120pb e com diferença de 0,5ºC nessa região entre as espécies (SŁOMKA et al., 2017; TAYLOR et al., 2011). Para analisar a diferença de temperatura entre as sequências, as mesmas foram testadas em software uMelt-DNA Melting, versão 2.0.2, o qual prediz a temperatura de melting (disponível em: https://www.dna.utah.edu/umelt/um.php) (Figura 7).

Valor Tm

Sequência DNA Figura 7: Ilustração programa uMelt™. Após adicionar a sequência de DNA da região do gene a ser amplificada, o software indica o valor da Tm da mesma. (Imagem do autor)

Os primers desenhados manualmente foram conferidos no software PerlPrimer, versão 1. 1. 21 (MARSHALL, 2004), para que obedecessem aos padrões gerais de desenho de primers (diferença máxima de 2ºC entre a temperatura de anelamento de forward e reverse, baixa energia de interação entre as ligações dos primers, temperatura de melting entre 55-60ºC e 30-80% de GC).

Foram desenhados primers degenerados e não degenerados para o gene matK. A utilização de bases degeneradas foi introduzida deliberadamente para garantir a especificidade do primer, devido à presença de SNP na região na qual foi desenhado. Para a região do gene rbcL, foi desenhado apenas um primer não degenerado, devido a ausência de SNPs nessa região.

4.5 Amplificação por PCR convencional

Com o intuito de testar a funcionalidade dos primers desenvolvidos, foi realizada primeiramente uma amplificação por PCR convencional. Para a região do cloroplasto matK foram realizadas duas amplificações, uma utilizando o conjunto primers não degenerados, e outra utilizando o conjunto de primers degenerados.

Foi utilizado um volume total para PCR de 12,25ul, e o mix de reação consistiu em 1,25ul de Buffer (10X Invitrogem 200mM Tris-HCL; ph 8,4; 500mM KCl), 0,625ul de 32

MgCl2 (50mM Invitrogem), 0,125ul de cada primer (na concentração de 0,5pM), 6,25 x 10-4mM de dNTP mixture (Promega), Taq DNA Polimerase (Invitrogen) 0,3U, 8ul de água ultrapura. Depois de distribuído 10,25ul do mix em cada tubo, foi adicionado DNA na concentração de 14ng. As amplificações foram realizadas usando 1 ciclo de 94ºC por 2min, seguido de 35 ciclos de 94ºC por 30s, depois 30s de gradiente de temperatura de anelamento, seguido de 72ºC por 30s, finalizando com um ciclo de 72ºC por 7min e resfriado a 4ºC. Foi utilizado PCR gradiente para otimização dos primer variando de 55ºC a 60º, usando o termociclador Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler.

Em cada reação de PCR foram utilizadas amostras referências e controle negativo para garantir a qualidade da reação de PCR.

4.5.1 Confirmação da PCR em gel poliacrilamida

A confirmação da amplificação por PCR foi realizada após eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, baseada na metodologia descrita por LAEMMLI (1970), utilizando o corante GelRedTM (BIotium) e visualização em fotodocumentador Gel- DocTM XR+ (BIO-RAD).

4.6 Padronização da amplificação de DNA por PCR-HRM

Para se estabelecer um protocolo de PCR-HRM, o qual faria a discriminação entre H. eriantha e P. glomerata, foram realizados cinco testes: gradiente de temperatura de anelamento, comparação entre primer degenerado e não degenerado, concentração de primer, comparação entre os métodos de extração e diluição DNA.

4.6.1 Amplificação do DNA por PCR-HRM

As amplificações dos genes matK e rbcL, foram realizadas separadamente seguindo as especificações do kit de PCR SsoFast™ EvaGreen® Supermix (BIO-RAD), em um volume total de 5uL, contendo 2,5uL do supermix, 1ul de DNA para concentração de 14ng/uL, 0,25uL (500nM) de cada iniciador, forward e reverse, e mais 1uL de água para completar o volume.

A análise de HRM foi realizada em uma placa de 96 poços usando LightCycler® 96 (ROCHE), sistema de PCR em tempo real. O programa de PCR consistiu em preincubação inicial de 2 minutos a 95°C, seguido do processo de amplificação com de 40 ciclos de 30s a 95°C, 30s a 56°C e 30s a 72°C. O HRM foi realizado a 95°C por 1min e depois para 40°C durante 1min, depois 65°C 1s finalizando com 97°C 1s. Aumentando a 2,2°C/s com 15 aquisições por grau de corante. As análises foram realizadas em triplicata para cada amostra, incluindo o controle negativo.

A análise da corrida foi gerada pelo software LightCycler® 96 (ROCHE). A razão do derivado negativo da curva de fluorescência (F) sobre temperatura (T) (dF/dT), e a curva bruta normalizada descreve a diminuição da fluorescência em relação ao aumento de temperatura. As espécies foram identificadas, observando o padrão obtido pelas amostras referência.

5. Análise estatística

Foram avaliadas a sensibilidade, especificidade, precisão e razão de probabilidade da técnica de HRM padronizada. Para as análises foram utilizadas somente amostras corretamente identificadas pela técnica de sequenciamento e que não apresentaram mistura (n=38 para o gene matK, e n=33 para o gene rbcL).

5.1 Validação da técnica de HRM em amostras comerciais

O resultado das 60 amostras analisadas e identificadas pelo método HRM foram tabuladas em Excel comparando com os resultados da análise pelo método de sequenciamento, este último realizado em um projeto anterior do nosso grupo de pesquisa.

5.1.2 Sensibilidade (S)

A sensibilidade foi calculada pelo número de indivíduos em que o método HRM identificou corretamente a espécie, os verdadeiros positivos (VP), dividido pelo número total de indivíduos amostrados dessa espécie, verdadeiros positivos mais falsos negativos (FN). A sensibilidade reflete o quanto esse método identifica corretamente indivíduos com certa caracterísctica dentre todo conjunto amostral (ALTMAN; BLAND, 1994).

S = VP/ (VP + FN)

5.1.3 Especificidade (E)

A especificidade foi calculada pelo número de indivíduos que foram identificados corretamente como não pertecentes a espécie determinada, verdadeiros negativos (VN), dividido pelo número de individuos que não pertenciam a essa espécie, verdadeiros negativos mais falsos positivos (FP). A especificidade reflete o quanto o teste detecta a ausência de uma caracterídtica, excluindo o individuo que não pertence a uma determinada espécie (JILBERTO; ARANEDA; LARRAÍN, 2017).

E = VN/ (VN + FP)

5.1.4 Precisão (P)

Também conhecido como valor preditivo, a precisão foi calculada pelo número de indivíduos corretamente identificados com ambos os métodos (VP), dividido pelo núero total de indivíduos identificados pelo método de sequenciamento (VP + FP). A precisão reflete a proporção de indivíduos que foram identificados como pertencentes a uma determinada espécie que verdadeiramente pertenciam à espécie (LEVER; KRZYWINSKI; ALTMAN, 2016).

P = VP/ (VP + FP)

5.1.5 Razão de probabilidade (RP)

Esta análise resume quantas vezes mais (RP+) ou menos (RP-) o indivíduo de uma determinada espécie foi identificado como pertencentes a essa espécies, em comparação com indivíduos de outra espécie. RP- foi calculado como (1-S)/E. Somente essa métrica foi calculada, porque RP+, calculada como S/ (1-E), gera resultado indefinido.

6 RESULTADOS

6.1 Desenho do primer

Os primers desenhados para amplificar uma pequena região do gene matK resultaram em um amplicon de 109pb flanqueando os polimorfismos (Tabela 2).

Tabela 2. Sequências de DNA Pfaffia glomerata, Hebanthe eriantha e Panax ginseng amplificadas pelos primers desenhados na região do gene matK e suas respectivas temperaturas de melting obtidas no software uMelt-DNA Melting, v2.0.2. ESPÉCIE SEQUENCIA GENE matK Tm (ºC) Pfaffia glomerata TTTCTTGAACGAATCCATTTCTACGTAAAGTTAAAATATCTAGTTAAAG 75,0 TTAAGGCTTTTGGGGTTATCCTATGGTTTTTCAAAGAACCTTTCCCGC ATTATGTTAGGT Hebanthe CTTCTTGAACGAATCCATTTCTACGGAAAGTTAAAATATCTAGTTAAA 75,5 eriantha GTTAAGGCTTTTGCGGTTATCCTATGGTTTTTCAAAGAACCTTTCCCG CATTATGTTAGGT Panax ginseng CTTCTTGAACGAATCTATTTCTATGGAAAAATAAAATATCTTGTCTTTG 72,5 TTAAGGCTTTTCAAGTCAATCTATTGTTGTTGAAGGATCCTTTCATGC ATTATGTTAGGT Nota: Polimorfismos destacado em negrito, itálico e sublinhado.

Foram desenvolvidos dois pares de primers na mesma região, um par com bases degeneradas (HRM-matKD) e outro não degenerado (HRM-matK), devido à presença de SNPs na região escolhida (Tabela 3).

Tabela 3. Primers desenhados para o gene matK para análise e identificação por HRM.

Primer HRM 5’ 3’ Ta(ºC) HRM-matKD-Foward YTTCTTGAACGAATMYATTTCTAY 58,00 HRM-matKD-Reverse ACCTAACATAATGCRKGAAAG 58,50 HRM-matK-Foward TTTCTTGAACGAATCCATTTCTAC 58,02 HRM-matK-Reverse ACCTAACATAATGCGGGAAAG 58,56 Nota: Ta se refere à temperatura de anelamento.

A região do gene rbcL analisada para desenhar o primer permitiu a diferenciação pela Tm entre P. glomerata e H. eriantha com base em um único SNP (Tabela 4).

Tabela 4. Sequências de DNA de Pfaffia glomerata, Hebanthe eriantha e Panax ginseng na região do gene rbcL e suas respectivas temperaturas obtidas no software uMelt-DNA Melting, v2.0.2. Tm ESPÉCIE SEQUENCIA GENE rbcL (ºC) Pfaffia glomerata GATTTGCGAATCCCTGTTGCTTATATAAAAACTTTCCCAAGCCCGCCT 77,5 CACGGTATCCAAGTTGAAAGAGATAAATTGAACATGTACGGTC Hebanthe GATTTGCGAATCCCTGTTGCTTATATAAAAACTTTCCCAAGCCCGCCT 78,0 eriantha CACGGTATCCAAGTTGAAAGAGACAAATTGAACATGTACGGTC Panax ginseng GATCTGCGAATCCCTGTTGCTTATGTTAAAACTTTCCAAGGCCCGCC 78,5 TCATGGCATCCAAGTTGAGAGAGATAAATTGAACAAGTATGGTC Nota: Polimorfismos destacado em negrito, itálico e sublinhado.

Para o gene rbcL foi desenvolvido apenas um par de primers, produzindo um amplicon de 91pb. Por não apresentar SNPs, entre as espécies alvo, no local de anelamento do primes, não foi necessário desenhar um primer degenerado (Tabela 5).

Tabela 5. Primers desenhados para o gene rbcL para análise e identificação por HRM.

Primer HRM 5’ 3’ Ta(ºC) HRM-rbcL-Foward TGCGAATCCCTGTTGCTTA 59,79 HRM-rbcL-Reverse GGACGACCGTACATGTTCAA 60,51

6.2 Amplificação da PCR convencional e gel poliacrilamida

O conjunto de primers desenhados para os genes matK e rbcL produziram amplicons aproximadamente do tamanho esperado, 109pb e 91pb respectivamente, quando analisados por eletroforese de gel poliacrilamida, e amplificaram uma única banda para as espécies em estudo.

6.3 Padronização PCR-HRM

O poder de discriminação de conjuntos de primers do gene matK e rbcL desenhados nessa pesquisa foi avaliado em duas espécies, Pfaffia glomerata e Hebanthe eriantha usando a análise HRM. A princípio utilizou-se como base o programa de ciclagem sugerido pelo fabricante LightCycler® 96 (ROCHE), com algumas adaptações apresentadas na Tabela 6 (APÊNDICE 2).

6.3.1 Gradiente de temperatura de anelamento

Para avaliar a temperatura de anelamento adequada dos primers desenhados para os genes matK e rbcL, foi realizada uma corrida utilizando gradiente de temperatura variando entre 56ºC, 57ºC, 58ºC e 60ºC.

Os gráficos de amplificação gerados para as reações em diferentes temperaturas de anelamento foram semelhantes para os primers HRM-matKD e HRM-matK, permitindo observar que as temperaturas de anelamento iguais a 56ºC e 57ºC apresentaram resultado mais satisfatório, com uma alta quantidade de produto formado, e atingindo o platô à 57ºC (Figura 8). Além disso, apresentaram um crossing point menor que 30 ciclos, o que é importante para uma boa análise de HRM (ROCHE APPLIED SCIENCE, 2008).

A H. eriantha B H. eriantha P. glomerata P. glomerata platô crossing point

C H. eriantha D H. eriantha P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata H. eriantha

Figura 8: Gráficos de curva de amplificação da análise por HRM das amostras referências em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando primer HRM-matKD. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC.

Analisando os gráficos de picos de melting normalizados, os resultados do teste de temperatura de anelamento para o gene matK confirmaram a análise dos gráficos de amplificação, estabelecendo como temperatura de anelamento ideal 56ºC, pois as curvas das amostras referências encontram-se mais agrupadas (Figura 9). Determinamos assim que a melhor diferenciação entre os dois genótipos foi obtida quando usou-se a temperatura de anelamento igual a 56ºC para os primers. Acima desse alcance o gráfico resultou em menos agrupamentos das amostras referências.

A B H. eriantha H. eriantha P. glomerata P. glomerata

D C H. eriantha P. glomerata P. glomerata H. eriantha P. glomerata

H. eriantha

Figura 9: Gráficos de pico de melting normalizado por HRM das amostras referências em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando primer HRM-matKD. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC.

Para o primer HRM-rbcL os gráficos de amplificação permitiram observar que as temperaturas de anelamento iguais a 56ºC e 58ºC apresentaram resultados mais satisfatórios, com uma alta quantidade de produto formado (Figura 10).

A H. eriantha B H. eriantha P. glomerata P. glomerata

C H. eriantha D H. eriantha P. glomerata P. glomerata

Figura 10: Gráficos de curva de amplificação da análise por HRM em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando amostras referências e primer HRM-rbcL. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC. *Curvas verde e amarela correspondem a amostras não identificadas corretamente.

A partir da análise dos gráficos de pico melting (Figura 11), complementando o resultado do gráfico anterior, optamos pela temperatura de 56ºC como temperatura de anelamento ideal, diante do resultado da amplificação e pelo notável agrupamento das amostras referências diferenciando as duas espécies alvo.

A H. eriantha B H. eriantha P. glomerata P. glomerata

H. eriantha C D H. eriantha P. glomerata P. glomerata

Figura 11: Gráficos de pico de melting normalizado por HRM em diferentes temperaturas de anelamento, utilizando amostras referências e primer HRM-rbcl. A) 56ºC. B) 57ºC. C) 58ºC. D) 60ºC. *Curvas verde e amarela correspondem a amostras não identificadas corretamente.

6.3.2 Concentração de Primer

Foram testadas diferentes concentrações dos primers desenvolvidos, variando para mais e para menos da concentração padrão indicada pelo fabricante do kit (0,5µM). Foi verificado o comportamento das curvas de amplificação nas concentrações de 0,1µM, 0,3µM e 0,7µM (Figura 12 e 13).

A B

C D

Figura 12: Gráficos de curva de amplificação de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), com diferentes concentrações do primer HRM-matKD. A) 0,1µM. B) 0,3µM. C) 0,5µM. D) 0,7µM. Curva verde amostra não identificada corretamente e curvas cinza referente a amostras que não amplificaram consideravelmente para ser identificada.

A análise do teste de concentração dos primers HRM-matKD e HRM-matK apresentaram o mesmo resultado. As concentrações que melhor se adequaram em relação à amplificação foram às de 0,3µM e 0,5µM (Figura 12). Na concentração de 0,3µM as amostras se agruparam melhor, entretanto na concentração de 0,5µM a amplificação atingiu um platô e a quantidade de produto formado foi maior. Ao final, as duas atenderam ao principal objetivo de fazer discriminação entre as espécies referência. Optamos por utilizar a concentração padrão de 0,5µM.

Em relação ao primer HRM-rbcL, exceto na concentração de 0,7µM, todas as demais concentrações distinguiram corretamente as espécies H. eriantha e P. glomerata (Figura 13). Estabelecendo a utilização da concentração indicada pelo fabricante de 0,5µM, visto que gerou uma quantidade de produto satisfatória em relação às outras e também atingiu um platô. 42

A B

C D *

Figura 13: Gráficos de curva de amplificação de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), com diferentes concentrações de primers, utilizando o primer HRM- rbcL. A) 0,1µM. B) 0,3µM. C) 0,5µM. D) 0,7µM. *Curva amarela amostra não identificada corretamente.

6.3.3 Comparação entre primer degenerado (HRM-matKD) e não degenerado (HRM-matK)

Analisando os gráficos de curva de melting normalizada e de pico de melting normalizado observa-se que o resultado do conjunto de primers degenerados, apresentou aproximadamente, Tm referentes às sequências das duas espécies (P. glomerata = 75ºC e H. eriantha = 75,5ºC) analisadas no programa uMelt-DNA Melting. Mas os dois primers, tanto o degenerado quanto o não degenerado diferenciaram e identificaram as espécies alvos. (Figura 14).

A H. eriantha H. eriantha P. glomerata P. glomerata

B H. eriantha H. eriantha P. glomerata P. glomerata

Figura 14: Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha, P. glomerata. A) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers degenerados HRM-matKD. B) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers não-degenerados HRM-matK.

6.3. 5 Comparação de metodologias de extrações de DNA: Kit e CTAB

O kit comercial de colunas de sílica utilizado neste trabalho resultou em menor quantidade de DNA extraído (média de 16,8 ng/ul), porém o DNA obtido por essa técnica obteve alta pureza, e foi suficiente para amplificar e discriminar as espécies em estudo. O método de extração com CTAB produziu maior quantidade de DNA (média de 80,6 ng/ul), e com qualidade semelhante ao kit.

Apesar de apresentarem rendimentos diferentes na quantificação, as amostras geraram moldes que foram amplificados de modo similar, sem apresentarem diferenças significativas na eficácia da PCR-HRM (Figura 15 e 16). 44

Figura 15: Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando primer degenerado (HRM-matKD) comparando os dois métodos de extração. A) Extração com Kit. B) Extração com CTAB.

Figura 16: Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando primer não degenerado (HRM-matK) comparando os dois métodos de extração. A) Extração com Kit. B) Extração com CTAB.

Também não houve diferença significativa na eficácia da PCR-HRM comparando os dois métodos de extração de DNA com o primer HRM-rbcL, podendo ser utilizado tanto um como o outro. Assim, neste trabalho escolhemos utilizar o CTAB por ser um método mais barato (Figura 17).

Figura 17: Gráficos de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando primer HRM-rbcL comparando os dois métodos de extração. A) Extração com Kit. B) Extração com CTAB.

6.3.3 Diluição do DNA

A confirmação da padronização foi determinada usando uma diluição em série de DNA com concentrações de 14ng, 1,4ng e 0,14ng para cada uma das espécies referências (Figura 18). O perfil do pico de melting não foi alterado para as diferentes concentrações e foi possível verificar a faixa linear da reação pela curva de amplificação (Figura 18).

A 14ng 0,14ng P. glomerata 14n 1,4ng 1,4ng g

0,14ng Faixa linear

B 14ng H. eriantha 1,4ng 14ng 1,4ng 0,14ng 0,14ng Faixa linear

Figura 18: Gráficos de pico de melting normalizados por HRM e curva de amplificação demostrando a faixa linear de trabalho, em diferentes concentrações de DNA 14ng, 1,4ng e 0,14ng. A) P. glomerata. B) H. eriantha.

Assim como na padronização com o gene matK, a confirmação da padronização foi determinada usando uma diluição em série de DNA com concentrações de 14ng, 1,4ng e 0,14ng para cada uma das espécies referências. Não houve alteração do pico de melting (Figura 19).

14ng A P. glomerata 1,4ng 14ng 1,4ng 0,14ng Faixa linear

14ng B H. eriantha 14ng 1,4ng 0,14ng 1,4ng Faixa linear 0,14ng

Figura 19: Gráfico de pico de melting normalizados por HRM e curva de amplificação demonstrando a faixa linear de trabalho, em diferentes concentrações de DNA 14ng, 1,4ng e 0,14ng. A) P. glomerata. B) H. eriantha.

6.4 Amplificação do DNA por PCR-HRM

Após a padronização foi realizada uma corrida com as amostras referências das espécies alvo, H.eriantha e P.glomerata, e de Panax ginseng confirmando a eficiência do protocolo padronizado para distinguir as três espécies, utilizando os primers HRM-matKD e HRM-matK (Figura 20) e primers HRM-rbcL (Figura 21).

A H. eriantha H. eriantha P. glomerata P. glomerata P. ginseng P. ginseng

B H. eriantha H. eriantha P. glomerata P. glomerata P. ginseng P. ginseng

Figura 20: Curvas de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha, P. glomerata e Panax ginseng. A) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers HRM-matKD. B) Curvas de pico de melting normalizadas e curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers HRM-matK.

A H. eriantha B H. eriantha P. glomerata P. glomerata P. ginseng P. ginseng

Figura 21:Curvas de High Resolution Melting de amostras referências das espécies H. eriantha, P. glomerata e Panax ginseng. A) Curvas de melting normalizadas utilizando o conjunto de primers HRM-rbcL. B) Curvas de pico de melting normalizadas.

6.6 Análise estatística

6.6. 1 Validação da técnica de HRM em amostras comerciais

O resultado da corrida confrontando amostras referências com as 60 amostras comerciais utilizando os três primers: HRM-matKD e HRM-matK (Figura 22) e HRM- rbcL (Figura 23) foram comparados aos do sequenciamento, descritos na Tabela 7 (APÊNDICE 3), e analisados estatisticamente.

O número de amostras amplificadas pelo sequenciamento (92%) foi superior aos primers testados neste trabalho por HRM (73% HRM-matKD; 80% HRM-matK; 87% HRM-rbcL). No entanto, comparando as técnicas de sequenciamento e HRM para a identificação entre as espécies de H. eriantha e P. glomerata das amostras comerciais, podemos afirmar que o método HRM utilizando o primer HRM-matKD equiparou-se aos resultados do sequenciamento (não havendo identificação discrepante ao sequenciamento).

A D

B E

C F *

* *

Figura 22: Gráficos de High Resolution Melting das amostras comerciais confrontadas com amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando o par de primers HRM-matKD (A, B e C) e utilizando o par de primers HRM-matK (D, E e F). A e D) Curvas de amplificação. B e E) Curvas de melting normalizadas. C e F) Picos de melting normalizadas. *demais cores são amostras não identificadas.

* * * *

B C * * * * *

Figura 23: Gráficos de High Resolution Melting das 60 amostras comerciais confrontadas com amostras referências das espécies H. eriantha (vermelha) e P. glomerata (azul), utilizando o par de primers HRM-rbcL. A) Curva de pico de melting normalizada. B) Curva de melting normalizada. C) Curva de amplificação. * Curvas correspondentes a amostras não identificadas. 6.6.2 Sensibilidade (S), especificidade (E), precisão (P) e razão de probabilidade (RP)

O método HRM para identificação das espécies H. eriantha e P. glomerata usando o primer HRM-matKD foi o que mais se aproximou aos resultados do sequenciamento. Das amostras identificadas pelo sequenciamento como H. eriantha (14) e P. glomerata (24), o HRM identificou 13 sendo H. eriantha e 22 como P. glomerata. As amostras que não foram identificadas mostraram curvas de melting não especificas (1), que não podia ser associada a nenhuma espécie controle, ou não amplificaram (2), mas nenhuma foi identificada erroneamente (Tabela 8).

Tabela 8: Resultado de identificação, em número absoluto, de espécies usando o método HRM com o primer HRM-matKD nas amostras comerciais previamente sequenciadas e identificadas. Sequenciamento HRM-matKD H. eriantha P. glomerata Total H. eriantha 13 0 13 P. glomerata 0 22 22 Não identificada 1 0 1 Não amplificou 0 2 2 Identificação discrepante 0 0 0 Total 14 24 38 50

Utilizado o primer HRM-matK o método HRM, comparando ao sequenciamento, identificou apenas 11 espécies como H. eriantha e 16 como P. glomerata. Além disso, uma amostra de P. glomerata foi identificada como sendo H. eriantha, uma não amplificou e nove não puderam ser identificadas (Tabela 9).

Tabela 9: Resultado de identificação de espécies usando o método HRM com o primer HRM-matK nas amostras comerciais previamente sequenciadas e identificadas. Sequenciamento HRM- matKND H. eriantha P. glomerata Total H. eriantha 11 0 11 P. glomerata 0 16 16 Não identificada 3 6 9 Não amplificou 0 1 1 Identificação discrepante 0 1 1 Total 14 24 38

O primer HRM-rbcL identificou 10 das 12 espécies identificadas pelo sequenciamento como sendo H. eriantha e somente 13 das 21 espécies sendo P. glomerata. Não identificando nove amostras, e uma P. glomerata sendo identificada incorretamente como H. eriantha (Tabela 10). O HRM-rbcL também não obteve resultado satisfatório neste estudo.

Tabela 10: Resultado de identificação de espécies usando o método HRM com o primer rbcL nas amostras comerciais previamente sequenciadas e identificadas. Sequenciamento HRM-rbcL H. eriantha P. glomerata Total H. eriantha 10 0 10 P. glomerata 0 13 13 Não identificada 2 7 9 Não amplificou 0 0 0 Identificação discrepante 0 1 1 Total 12 21 33

Os resultados obtidos com PCR-HRM foram consistentes utilizando o primer HRM- matKD quando comparados ao sequenciamento. A sensibilidade desse primer variou de 92-93%, indicando uma alta taxa de indivíduos identificados pelo método. 51

O primer também mostrou uma especificidade de 100% para as duas espécies, indicando que o teste tem um desempenho máximo para excluir corretamente os indivíduos de uma espécie (Tabela 11).

Devido ao alto valor de especificidade encontrado para as espécies, RP+ foi indefinida, indicando que, quando o método HRM identifica positivamente uma espécie específica, existe uma alta probabilidade que o indivíduo pertença a essa espécie. Os valores da RP- variaram de 7-8%, indicando que, quando o método HRM fornece valor negativo para uma espécie específica, existe uma grande probabilidade de que o indivíduo não pertence a essa espécie (Tabela 11). A precisão foi de 100% para o primer HRM-matKD, indicando que o método não apresentou falsos positivos.

Tabela 11: Tabela com resultados de sensibilidade, especificidade precisão e razão de probabilidade, em porcentagem, para cada espécie, utilizando cada um dos primers desenvolvidos. S E P RP- H. P. H. P. H. P. H. P. erianth glomerata eriantha glomerata eriantha glomerata eriantha glomerata Primer a HRM-matKD 93% 92% 100% 100% 100% 100% 7% 8% HRM-matK 79 % 67 % 94% 100% 92% 100% 22% 33% HRM-rbcL 83 % 65 % 100% 91% 100% 93% 17% 38%

7 DISCUSSÃO

Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de um protocolo utilizando o método HRM com o intuito de identificar as espécies em amostras de plantas vendidas como Ginseng brasileiro. Duas espécies são conhecidas com este mesmo nome comercial, H. eriantha e P. glomerata, e semelhanças morfológicas entre elas dificultam sua correta identificação. O método desenvolvido aqui demonstrou ser eficaz na distinção das duas espécies.

O DNA extraído das amostras, tanto pelo método de CTAB quanto pelo Kit, produziram um produto de amplificação específico e similar com os iniciadores desenvolvidos para os genes matK e rbcL. Assim, a escolha do método de extração pode ser feita de acordo com a disponibilidade do mesmo no laboratório. A principal vantagem da escolha do kit de extração é a praticidade e a otimização do tempo de processo. Por outro lado, o protocolo de CTAB é mais barato e mais acessível aos laboratórios.

Vários fatores são importantes para aperfeiçoar o método de HRM, principalmente em relação aos primers desenvolvidos, como a temperatura de anelamento e a concentração utilizada (SANTA, 2013; SŁOMKA et al., 2017; WAHYUNINGSIH et al., 2017; YU; XUE; ZHOU, 2011). Dos três primers desenvolvidos neste projeto (HRAM-matKD, HRM-matK e HRM-rbcL), o primer HRM-matKD foi o que apresentou melhor resultado de identificação quando comparado ao método de sequenciamento, sendo perfeitamente possível a discriminação entre as espécies H. eriantha e P. glomerata.

A técnica de HRM, utilizando o primer HRM-matKD, apresentou uma alta especificidade, sensibilidade e precisão em comparação ao sequenciamento. No trabalho de JILBERTO et al. (2017) utilizando a técnica de HRM como uma ferramenta para identificar espécies de mexilhões comestíveis, também foi demonstrado que a técnica apresentou alta sensibilidade, especificidade e precisão em comparação a PCR-RFLP convencional. Já na área médica, analisando a presença de mutações no gene JAK2 por HRM para o diagnóstico de neoplasias mieloproliferativas, RAPADO et al. (2009) alcançaram resultados correspondentes ao do sequenciamento, com alta taxa de sensibilidade e especificidade.

No presente trabalho o primer degenerado desenvolvido para o gene matK, HRM- matKD, apresentou o melhor resultado para identificar as espécies P. glomerata e H. eriantha utilizando a técnica HRM. No estudo de SADY et al. (2015) no qual desenvolveram um método para a detecção e diferenciação de Schistosoma mansoni e Schistosoma haematobium, em amostras fecais e de urinas, utilizando HRM, os autores atingiram o objetivo também utilizando primer degenerado. Os 53

picos de melting obtidos foram distintivos para as duas espécies de Schistosoma, demostrando o potencial do HRM como ferramenta molecular de triagem entre elas.

Detectar substituições e adulterações em ervas medicinais usando a técnicas HRM têm se provado um método bem-sucedido. Por exemplo, através dessa técnica foi possível distinguir e autenticar nove espécies de ervas consumidas para fazer chá (XANTHOPOULOU et al., 2016), e OSATHANUNKUL et al. (2015) puderam autenticar três espécies de Acantáceas ao testar produtos a base de planta compradas em mercados na Tailândia. O resultado da análise revelou que três dos quinze produtos estavam identificados incorretamente.

GANOPOULOS et al. (2012) desenvolveram um método de HRM juntamente com regiões do código de barras de DNA do cloroplasto distinguindo espécies leguminosas para detectar adulteração em produtos comerciais de ‘‘Fava Santorinis’’ (Lathyrus clymenum). O método forneceu resultado confiável, sendo considerado uma ferramenta de diagnóstico para detecção e quantificação simultânea de adulterantes em produtos comerciais alimentares dessa espécie.

No estudo de caso com cinco espécies de Artemisia usando HRM para analisá-lo quanto a sua precisão na identificação, SONG et al. (2016) indicaram que o método pôde ser usado para determinar a identidade dessa espécie. Essa descoberta promoveu a autenticação de espécies de Artemisia em infusões de ervas, encontrando adulteração em 75% das amostras testadas.

SINGTONAT; OSATHANUNKUL (2015) utilizando HRM para autenticar espécies de Thunbergia laurifólia e Crotalaria spectabilis, conhecidas pelo mesmo nome popular “Rang chuet”, mostraram que as duas espécies poderiam ser facilmente distinguidas uma da outra pelas curvas de melting de HRM, podendo assim autenticar os produtos em pó.

SCHMIDERER et al. (2015) também obtiveram resultado positivo utilizando a técnica de HRM. No referido trabalho foi comparado o sequenciamento e o HRM para identificar espécies de Calendula officinales e diferenciá-las de outras espécies do gênero e das Asteraceae, além de detectá-las como adulterante de amostras de 54

açafrão (Corcuma). O autor relatou que o HRM teve alto poder discriminatório entre as espécies de C. officinales, além de detectar até 0,01% de adulteração dessa espécie em açafrão.

Além da alta precisão de detecção, o método HRM destaca-se também por ser um processo rápido. Após apenas 2h de PCR e subseqüente dissociação (cerca de 2 minutos) os resultados já estão disponíveis. Promovendo a amplificação de uma curta sequência de DNA, a técnica ainda facilita a análise diante da frequente degradação de material vegetal adquirido em pó (KOOL et al., 2012; SÄRKINEN et al., 2012; SCHMIDERER et al., 2015).

Assim, o método de HRM pode ser utilizado como método alternativo ao sequenciamento na identificação das espécies, desde que o laboratório disponha de amostras referência sequenciadas para comparação. Sendo o ensaio HRM muito mais rápido e barato quando comparado ao sequenciamento torna-se possível sua aplicação em uma ampla variedade de amostras. O mesmo poderá até ser incluído no protocolo de controle de qualidade de matérias primas vegetais e animais, promovendo a confiança do consumidor, o que, no entanto, ainda necessitaria de regulamentação.

8 CONCLUSÃO

- Neste trabalho foi possível desenhar e testar três primers para identificar e discriminar as espécies de H. eriantha e P. glomerata;

- O primer degenerado apresentou melhor resultado nas análises de HRM do que o primer não degenerado (gene matK);

- Dentre os primers testados, os resultados de HRM gerados pelo primer HRM- matKD, quando comparados ao sequenciamento, foram altamente sensíveis e específicos (92%-93% e 100%, respectivamente) na identificação das espécies;

- Os protocolos de extração de DNA testados, kit de extração e protocolo de CTAB, não influenciaram na curva de melting, podendo ambos ser utilizados na técnica de HRM;

- Foi possível validar a técnica de HRM utilizando amostras comerciais previamente sequenciadas, o que nos permite afirmar que a técnica de HRM pode ser utilizada para discriminar H. eriantha e P. glomerata.

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APÊNDICE I

Tabela 1. Amostras vendidas como Ginseng brasileiro de diversos locais do país. Nº Nome comercial na embalagem Lote Local compra Tipo Orgão

1 Pfaffia (ginseng brasileiro) 12015 internet Pó X

2 Ginseng (Pfafia paniculata) 52468 internet Pó X

3 Ginseng Brasileiro 110/14 internet Pó X 5 Ginseng X Casa das Ervas - Capsúla Vila Rubim X 6 Ginseng X Natura Minas – Vila Fragmentado Folhas Velha e flor 7 Ginseng (Pfafia paniculata) 2 Mundo Verde – Vila Pó Velha Raiz 8 Ginseng X Peuqena Sela – Pó Vila Rubim X 10 Ginseng X Mercearia Pó Rodrigues – Vila Rubim X 11 Ginseng (Pfafia paniculata) FAFI001 Natura Minas – Vila Pó Velha Raiz 12 Ginseng X Pharma Ervas – Pó Vila Rubim X 13 Panax X Guarapari Pó X 14 Ginseng X Araraquara-SP Pó X 15 Ginseng X Manaus-AM Pó X 16 Ginseng (Pfaffia ssp) 32 Rio de Janeiro-RJ Fragmento Raiz 17 Ginseng X Rio de Janeiro-RJ Fragmento Raiz 18 Ginseng (Pfafia paniculata) X Rio de Janeiro-RJ Pó X 19 Ginseng em pó X Barra da Tijuca-RJ Pó X 20 Ginseng Pó Varejo X Rio de Janeiro-RJ Pó X 21 Ginseng Chinês (Panax 1220 Ribeirão Preto-SP Pó ginseng) X 22 Ginseng X Ribeirão Preto-SP Fragento Raiz 23 Ginseng nacional (Pfaffia 1224 Ribeirão Preto-SP Pó paniculata) X 24 Ginseng Ribeirão Preto-SP Pó X 25 Pfaffia (Pfaffia glomerata) 2581 Ribeirão Preto-SP Pó X 26 Ginseng X Belo Horizonte-MG Cápsula X 65

Tabela 2. Amostras vendidas como Ginseng brasileiro de diversos locais do país. 27 Ginseng X Belo Horizonte-MG Cápsula X 28 Ginseng X Belo Horizonte-MG Cápsula X 30 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 31 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 32 Ginseng Brasileiro (Pfaffia X Belo Horizonte-MG Pó paniculata) X 33 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 34 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 35 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 36 Ginseng Brasileiro (Pfaffia Belo Horizonte-MG Pó paniculata Mart.) Raiz 37 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 38 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 39 Ginseng (Pfaffia) X Belo Horizonte-MG Pó X 40 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 41 Ginseng Brasileiro (Pfaffia X Belo Horizonte-MG Pó paniculata) X 42 Korean Ginseng Tea gold X Belo Horizonte-MG Pó X 43 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 44 Ginseng X Belo Horizonte-MG Fragmento Folha e talos 45 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 46 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 47 Ginseng X Casas das Ervas – Pó Vila Rubim X 48 Ginseng X Belo Horizonte-MG Pó X 49 Ginseng X Guaçuí-ES Pó X 50 Ginseng (Pfaffia paniculata) X Guarapari-ES Pó X 51 Ginseng em pó X São Paulo Pó X 52 Ginseng em pó X São Paulo Pó X 53 Ginseng em pó X São Paulo Pó X 54 Diversos X São Paulo Pó X 55 Ginseng em pó KG X São Paulo Pó X 55 Ginseng em pó X São Paulo Pó X 57 Ging Seng X São Paulo Pó X 58 Ginseng raiz X São Paulo Pó X 59 Ginseng em pó 12 X São Paulo Pó X 60 Ginseng pó X São Paulo Pó X 66

Tabela 3. Amostras vendidas como Ginseng brasileiro de diversos locais do país. 61 Ginseng pó X São Paulo Pó X 62 Ginseng - 209 X São Pauolo Pó X 65 Ginseng granel X São Paulo Pó X

APÊNDICE II

Tabela 6. Programa de ciclagem PCR-HR M para distinguir e identificar Pfaffia glomerata e Hebanthe eriantha. Programa Descrição Ciclo Preincubação 95ºC - 120s 1x Amplificação 95ºC - 30s 40x 56ºC - 30s 72ºC - 30s High Resolution Melting 95ºC - 60s 1x 40ºC - 60s 65ºC - 1s 97ºC - 1s

APÊNDICE III

Tabela 7. Comparação da identificação das amostras comerciais entre as técnicas de Sequenciamento e HRM, utilizando os conjuntos de primers HRM-matKD e HRM-matK. Nº AMOSTRA SEQUENCIA HRM-matKD HRM-matK SEQUENCIA HRM-rbcL MENTO MENTO rbcL matK

1 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata

2 Não amplificou Não amplificou Não amplificou P. glomerata Não amplificou

3 Não amplificou Não amplificou Não amplificou Não amplificou Não amplificou 5 H. eriantha H. eriantha Não identificou Não amplificou Não identificou 6 P. glomerata P. glomerata P. glomerata Não amplificou P. glomerata 7 P. glomerata P. glomerata P. glomerata Não identificou P. glomerata 8 H. eriantha * Não identificou Não identificou H. eriantha * Não identificou 10 H. eriantha H. eriantha Não identificou H. eriantha H. eriantha 11 Não identificou Não amplificou Não amplificou Não identificou Não amplificou 12 P. glomerata P.glomerata P. glomerata P. glomerata Não identificou 13 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha 14 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha 15 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha 16 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 17 P. glomerata* Não amplificou Não identificou P. glomerata* P. glomerata 18 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata H. eriantha 19 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 20 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata Não identificou 21 Não identificou Não amplificou Não amplificou Não identificou Não amplificou 22 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 23 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha 24 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha 25 P. glomerata P. glomerata H. eriantha P. glomerata P. glomerata 26 H. eriantha H. eriantha Não identificou P. H. eriantha H. eriantha 27 H. eriantha * H. eriantha H. eriantha H. eriantha * H. eriantha 28 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata Não identificou 30 P. glomerata* Não identificou Não identificou P. glomerata* Não identificou 31 P. glomerata P. glomerata Não identificou P. glomerata P. glomerata 32 P. glomerata P. glomerata Não identificou P. glomerata Não identificou 33 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 69

Tabela 7. Comparação da identificação das amostras comerciais entre as técnicas de Sequenciamento e HRM, utilizando os conjuntos de primers HRM-matKD e HRM-matK. 34 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 35 P. glomerata* Não identificou Não identificou P. glomerata* Não identificou 36 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 37 Não identificou Não amplificou Não amplificou Não identificou Não amplificou 38 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 39 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata Não identificou 40 P. glomerata Não amplificou Não identificou P. glomerata Não identificou 41 P. glomerata P. glomerata Não identificou P. glomerata Não identificou 42 Não amplificou H. eriantha H. eriantha Não amplificou P. glomerata 43 P. glomerata P. glomerata Não identificou P. glomerata P. glomerata 44 P. glomerata P. glomerata Não identificou P. glomerata P. glomerata 45 Não identificou Não amplificou Não amplificou Não identificou Não identificou 46 H. eriantha H. eriantha H. eriantha Não amplificou Não amplificou 47 Não amplificou Não amplificou Não amplificou Não amplificou Não identificou 48 Não amplificou Não amplificou Não amplificou Não amplificou P. glomerata 49 H. eriantha * Não identificou H. eriantha * H. eriantha * H. eriantha 50 Não identificou Não amplificou Não amplificou Não identificou Não amplificou 51 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha Não identificou 52 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha Não identificou 53 P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata P. glomerata 54 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha 55 Não identificou Não amplificou Não amplificou Não identificou Não amplificou 56 H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha H. eriantha 57 Não identificou Não identificou H. eriantha Não identificou Não identificou 58 Não identificou H. eriantha H. eriantha Não identificou P. glomerata 59 Não identificou Não amplificou Não identificou Não identificou H. eriantha 60 Não identificou Não amplificou Não identificou Não identificou P. glomerata 61 Não identificou Não amplificou Não amplificou P.glomerata P. glomerata 62 P.glomerata Não amplificou Não amplificou H. eriantha H. eriantha 65 H. eriantha H. eriantha H. eriantha Não identificou H. eriantha Nota: *amostra com mistura.

ANEXO I Composição química das soluções utilizadas na extração do DNA

Tampão de extração

Substância Concentração CTAB 2 % Tris-HCl (pH 8,0) 100 mM EDTA (pH 8,0) 20 mM NaCl 1,4 M

Solução de precipitação

Substância Concentração CTAB 1 % Tris-HCl (pH 8,0) 50 mM EDTA (pH 8,0) 10 mM

TE – alto sal

Substância Concentração Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM EDTA (pH 8,0) 0,1mM NaCl 1M

LoTE

Substância Concentração Tris-HCl (pH 7,5) 3 mM EDTA (pH 8,0) 0,2mM