UFSM Tese De Doutorado PURIFICAÇÃO

UFSM

Tese de Doutorado

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS

Noelita Melo de Sousa

PPGMV

Santa Maria, RS, Brasil

2002

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS por Noelita Melo de Sousa

Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Fisiopatologia da Reprodução, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Medicina Veterinária

PPGMV

Santa Maria, RS, Brasil 2002

Universidade Federal de Santa Maria Centro de Ciências Rurais Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária

A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de Doutorado

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPOTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS

elaborada por Noelita Melo de Sousa

Como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Medicina Veterinária

COMISSÃO EXAMINADORA:

______Dr. José Ricardo de Figueiredo (Presidente/Orientador)

______Dr. Paulo Bayard Dias Gonçalves Dr. João Francisco C. de Oliveira

______Dr. José Carlos Ferrugem Moraes Dr. Carlos Fernando de Mello

Santa Maria, 26 de março de 2002

XXXX Sousa, Noelita Melo. Purificação, caracterização e dosagem radioimunológica de glicoproteínas associadas à gestação em zebuínos. Santa Maria: UFSM, 2002.

376 p. il.; 290 cm. Tese (Doutorado) UFSM. CCR 1. Zebu – Reprodução. I. Título CDD: XXX.XXXXX

© 2002 Todos os direitos autorais reservados a Noelita Melo de Sousa. A reprodução de partes ou do todo deste trabalho só poderá ser feita com autorização por escrito do autor. Endereço. Rua Guilherme Rocha, n. 1015, Bairro Centro, Fortaleza, CE, Brasil, CEP 60030-141. Fone/Fax (0xx) 85 2262138; End. Eletr. [email protected]

Não tireis de vosso aprendizado a conclusão de que sabeis tudo, mas sim de que vos resta infinitamente a saber. (Pascal)

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A Deus, A minha mãe, irmão e amigos A Jean-Pierre A Georgette Dedico

AGRADECIMENTOS

Ao Professor José Ricardo de Figueiredo, pelo apoio incondicional, pelos inestimáveis conselhos e pela confiança em mim depositada ao longo dos últimos anos. Ao Professor Jean-François Beckers, co-promotor deste trabalho, pela hospitalidade no Serviço de Fisiologia da Reprodução da Universidade de Liège, Bélgica, e sem o qual não teria sido possível a execução deste trabalho. A ele, minha mais profunda gratidão pelas críticas sempre construtivas, pela sua paciência inesgotável e pelos valiosos conselhos bioquímicos que revelaram em mim o interesse pelo estudo das proteínas placentárias de ruminantes. Ao Médico Veterinário Benoît Remy, inestimável amigo, pelos ensinamentos das técnicas de cromatografia e eletroforese e pelos valiosos conselhos durante a execução do presente trabalho. Ao Dr. Jean Closset, do Serviço de Bioquímica do Centro Hospitalar da Universidade de Liège, pela incansável participação nos seminários que nos ajudaram a construir o presente projeto de tese. Ao Dr. Paulo Bayard Dias Gonçalves, co-promotor deste trabalho, pela sua amável acolhida na Universidade Federal de Santa Maria e pelos conselhos judiciosos ao longo do doutorado. A ele, minha sincera gratidão pelo constante encorajamento à realização da tese, em colaboração com a Universidade de Liège. Ao Dr. Jairo Pereira Neves, pelos valiosos conselhos em obstetrícia de ruminantes e pela acolhida na Universidade Federal de Santa Maria. Ao Dr. Rudi Weiblen, Coordenador do Programa de Pós-Graduação

em Medicina Veterinária, pelos constantes e valiosos conselhos que em muito asseguraram minha estadia na Universidade de Liège. À Dra. Margot Alves Nunes Dode, pela sua acolhida no Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Corte (CNPGC) de Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e pelo seu inestimável auxílio nas fases iniciais de execução do presente trabalho. Ao Doutor Moussa Zongo, da Universidade de Ouagadogou (Burkina- Faso), pelos valiosa colaboração ao estudo da endocrinologia placentária em zebuínos. Aos Doutores Zladislaw Gajewski (Universidade de Agricultura de Varsovia, Polônia), Alessandro Debenedetti (Universidade de Perúgia, Itália), Hamidou Hamadou Tamboura (Centro de Pesquisas Agrárias e Ambientais, Burkina-Faso), Fernando Moreira da Silva (Universidade dos Açores, Portugal) e Luc Liégeois (Genes Difusion, Douai, França) pela preciosa colaboração científica e ensinamentos a mim transmitidos. A todos os amigos, funcionários, estudantes e estagiários do Serviço de Fisiologia da Reprodução da Universidade de Liège, e em especial a Bouchra El Amiri, Raja Fares, Nicole Gerardin-Otthiers, Bianca Carstanjen, Aude-Marie Bestel, Astrid Rutten, Petry Calero, Salima Charallah, Christine Poullet, Isabelle Moers, Henri Desbuleux, José Sulon, Jean-Luc Pirson, Claude Ernotte, Zsolt Pérènyi, Aly Karen e Rogélio Ledezma pela preciosa colaboração durante minha estadia em Liège e pelo espírito de grupo com que sempre fui acolhida. Aos colegas, professores e funcionários do Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria, e em especial a Aura Chaves Rosauro, Silvia Ferreira Carâmbula,

Nilzane Beltrão, Marta Pasin, Patrícia Salla, Daniela dos Santos Brum, Patrícia Feruzzi e Roselene Ecco, pela amizade e companheirismo que sempre foram para mim um estímulo à continuação deste trabalho. Aos colegas, pesquisadores e funcionários do Centro Nacional de Pesquisa do Gado de Corte, e em especial a Norma Cléa Rodovalho, Vanessa Gomes Ueno e Paulo Roberto Adona, pela valiosa colaboração na coleta de placentas e de amostras sangüíneas. À Coordenação do Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudo ao longo do curso. Ao Fundo Nacional para a Pesquisa Científica e ao Ministério da Agricultura (Bélgica) pelo suporte financeiro dado à realização do presente trabalho experimental. A todos que de uma maneira ou de outra, contribuíram para a realização deste trabalho. É para mim um dever, mas sobretudo, uma honra poder agradecer-lhes sinceramente.

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SUMÁRIO

Lista de Tabelas ...... …………………………………..… 01 Lista de Figuras …………...…………………………….……..….. 04 Lista de Siglas, Símbolos e Abreviaturas ……………………..…. 11 Lista de Anexos .………………………………………………..…. 16 Lista de Apêndices ……………………………………………..…. 17 Resumo ..……………………………………...………………..…... 19 Abstract ..………………………………….…………………..…... 20 Résumé ...... 21 1. Introdução …….……………………………………….…..…… 22 2. Revisão de L iteratura ……………………………………..…… 27 2.1. O gado zebu………………………………...... 27 2.1.1. Origem e diferenças entre gado zebuíno e taurino...... 27 2.1.2. As raças zebuínas...... 30 2.2. Aspectos gerais da fisiologia reprodutiva de vacas de origem zebuína...... 32 2.2.1. Origem e desenvolvimento dos folículos ovarianos...... 32 2.2.2. Aspectos gerais relacionados ao ciclo estral...... 34 2.2.3. Perfis hormonais durante a gestação...... 38 2.3. Proteases aspárticas...... 40 2.3.1. Terminologia...... 40 2.3.2. Classificação das proteases...... 41 2.3.3. Estrutura das proteases aspárticas……………………...……. 45 2.3.4. Inibição das proteases aspárticas…………...... 47

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2.4. As proteínas placentárias...... 48 2.4.1. A placenta…………………………….…………..…………. 48 2.4.1.1. Tipos de placenta…………………………...... …………... 49 2.4.1.2. O placentoma………………………………..…………….. 53 2.4.1.3. As células binucleadas………………………..…………… 54 2.4.2. Proteínas placentárias………………………..……..……….. 57 2.4.2.1. Gonadotrofinas coriônicas (CG)….……….………..……... 59 2.4.2.2. Interferons tau (IFN τ).……………………..…..…...……... 62 2.4.2.3. Fator precoce da gestação (EPF).………....…….…..…...... 66 2.4.2.4. Hormônios lactogênios placentários (PL)....………..…….. 67 2.4.2.5. Proteínas específicas ou associadas gestação (PAGs)...... 71 a) Família das PAGs bovinas..…..……………………..…..…...... 72 b) Família das PAGs ovinas………………………………..…...... 84 c) Família das PAGs caprinas…………………………..…...... 85 d) Outras PAGs…………….….………………………..…...... 86 e) Dosagens de PAG..…………..…………………………...... 87 f) Aspectos gerais relativos aos protocolos utilizados para o isolamento bioquímico e identificação sorológica das PAGs...... 94 3. Material e Metodologia ...... 101 3.1. Experimento 1 – Isolamento de glicoproteínas associadas à gestação...... ……… 101 3.1.1. Protocolo 1……………………………………………..……. 102 3.1.1.1. Determinação da imunorreatividade e da proteína total…... 102 3.1.1.2. Coleta de placentas………….…………...……..…………. 102 3.1.1.3. Isolamento da PAG………….…….…………...…..……… 103

a) Extração de proteínas solúveis………….…………...…..……… 103 b) Precipitação ácida…….……………………….……...……...... 104 c) Precipitações ao sulfato de amônia…….…….…….....…………. 105 d) Cromatografia de troca de ânions………….………...... ………... 106 e) Cromatografia de troca de cátions……………….…..…...….….. 107 3.1.1.4. Caracterização da PAG……………………………..…...… 108 a) Eletroforeses monodimensionais em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D SDS-PAGE)…..… 108 b) Western Blot……………………………………………..…..….. 109 c) Focalização isoelétrica e eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (2-D SDS-PAGE)……….………………………………..……... 110 d) Análise da seqüência N-terminal…………...... 111 3.1.2. Protocolo 2…...………….………………………………..…. 112 3.1.2.1. Coleta de placentas…….…………………...………...... …. 112 3.1.2.2. Extração de proteínas solúveis….….………..……..……… 113 3.1.2.3. Cromatografia de afinidade…….…………...……..……… 114 3.1.2.4. Caracterização da PAG…………………………....………. 114 3.2. Experimento 2 – Dosagens radioimunológicas da PAG durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebu………………………..…. 115 3.2.1. Animais……………………………………………..……….. 115 3.2.2. Amostras de sangue…………………………………..……... 115 3.2.3. Reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA…………..…... 116 3.2.4. Metodologia utilizada para as dosagens PAG-RIA...... 118 3.2.5. Características das dosagens PAG-RIA...... 120

3.2.6. Análise estatística...... 120 4. Resultados ...... 122 4.1. Experimento 1 – Purificação de glicoproteínas associadas à gestação...... ……...….. 122 4.1.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de íons (Protocolo 1)…………………………..…… 122 4.1.2. Análise da sequência N-terminal das proteínas imunoreativas isoladas com o auxílio de cromatografias de troca de íons (Protocolo 1)...... 129 4.1.3. Caracterização da PAG identificada após a realização de cromatografias de afinidade em gel de pepstatina A-agarose (Protocolo 2)……...... 131 4.2. Experimento 2 – Dosagens rádio-imunológicas da PAG (PAG-RIA) durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebu…………..……. 135 4.2.1. Características das dosagens PAG-RIA…...... …..…….. 135 4.2.2. Perfis de PAG em vacas Azawak…..…………………..…… 137 4.2.3. Perfil atípico de PAG...... ……………………..…… 138 5. Discussão ...... 141 5.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de íons...... 141 5.2. Caracterização da PAG identificada após a realização de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose...... 145 5.3. Dosagens radioimunológicas da PAG durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebu...... 148

6. Conclusão ...... 154 7. Referências Bib liográficas ...... 155

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio catalítico de diversas proteases aspárticas. Estão indicados (inclusos em retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal encontrada nos pepsinogênios A e C. Informações sobre as seqüências de aminoácidos foram obtidas no banco de dados GenBank...... 45

TABELA 2 - Classificação das placentas em diferentes espécies mamíferas...... 50

TABELA 3 - Identificação de proteínas específicas ou associadas à gestação em mamíferos euterianos...... 73

TABELA 4 - Alinhamento dos aminoácidos presentes no sítio catalítico de diversas PAGs. Estão indicados (inclusos em retângulos) os aminoácidos que diferem da seqüência normal encontrada em proteases enzimaticamente ativas tais como o pepsinogênio. Informações sobre as seqüências de aminoácidos foram obtidas do banco de dados GenBank...... 78

TABELA 5 - Seqüência N-terminal das principais formas de PAG identificadas até o presente. Com exceção da boPAG-1, todas as seqüências foram deduzidas a partir do ARN mensageiro ou do ADN codificante obtidos por biologia molecular...... 81

TABELA 6 - Recuperação de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após diferentes etapas de extração e precipitação...... 122

TABELA 7 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) mensuradas após eluição na coluna de Sephadex A25...... 123

TABELA 8 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0 M e 0,02 M NaCl...... 124

TABELA 9 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0,04 M e 0,08 M NaCl...... 125

TABELA 10 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0,16 M e 0,32 M NaCl...... 126

TABELA 11 - Características eletroforéticas e identidade ao nível de seqüência N-terminal das proteínas mais imunoreativas isoladas pela cromatografia em resina CM cerâmica...... 129

TABELA 12 - Características dos sistemas RIA com e sem etapa de pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI) utilizados para mensurar as

concentrações de PAG presentes em amostras de plasma de fêmeas zebu gestantes...... 135

TABELA 13 - Coeficientes de variação (CV) intra-ensaio e inter- ensaio dos sistemas de dosagem com e sem etapa de pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI)...... 136

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Árvore filogenética das principais espécies de Bovidae identificadas até o presente. Entre parênteses constam o nome dado à espécie domesticada. ✝Espécie extinta. Adaptado de PAYNE (1991)...... 28

FIGURA 2 - Representação esquemática das alterações das concentrações hormonais durante o ciclo estral de bovinos. Adaptado de PETERS & LAMMING (1983)...... 36

FIGURA 3 - Concentração de 17-β-estradiol plasmático durante a gestação em vacas zebuínas com gestações simples (-▼-▼-) e gemelares (-▲-▲-). Adaptado de SHELTON & SUMMERS (1983).... 39

FIGURA 4 – Concentração plasmática de progesterona durante a gestação em vacas zebuínas. Adaptado de MUKASA-MUGERWA & TEGEGNE (1989)...... 40

hidrófobos, assim como os resíduos Ser, Tre, Asn e Gln estão representados pela cor cinza escura. Os resíduos situados fora do centro catalítico estão representados pela cor cinza clara. Adaptado de DUNN et al. (1995)...... 46

FIGURA 6 - Placenta cotiledonária de bovinos no segundo trimestre de gestação. Notar os cotilédones fetais em toda a extensão da placenta...... 52

FIGURA 7 - Diagrama esquemático da migração das células binucleadas em bovinos. 1) Células binucleadas no lado fetal; 2) Contato com a junção microvilositária; 3) Fusão com células fetais, dando origem a células trinucleadas de vida curta; 4) Exocitose dos grânulos; 5) Células após exocitose, com citoplasma reduzido e núcleo denso e 6) Células reabsorvidas pelo trofectoderme. Adaptado de WOODING & WATHES (1980)...... 56

FIGURA 8 - Micrografia eletrônica do placentoma de vacas no 150 o dia de gestação fixadas em araldite. Os grânulos secretórios foram corados pelo ácido fosfotungstico. A interrupção da junção microvilositária entre o trofoectoderma (T) e o epitélio uterino (U) é indicada por flechas. A) Migração das células trofoblásticas binucleadas em direção à junção microvilositária; B) Célula binucleada logo após sua fusão com uma célula epitelial uterina (indicada por asterisco); C) Célula trinucleada no epitélio uterino. Adaptado de WOODING & BECKERS (1987)...... 58

FIGURA 9 - Perfil das concentrações plasmáticas do hormônio lactogênio placentário bovino dosado na circulação materna e fetal.

Adaptado de BECKERS et al. (1982)...... 70

FIGURA 10 - Seqüência de aminoácidos da boPAG-1 deduzida a partir da seqüência em ADN por XIE et al. (1991). Estão indicados as seqüências sinal, o propeptídeo, a extremidade N-terminal (20 aminoácidos) assim como a cadeia madura. As flechas indicam o final do segmento sinal e do propeptídeo. Os sítios catalíticos encontram-se circundados. Sítios potenciais de glicosilação são indicados por asteriscos...... 76

FIGURA 11 - A) Representação da estrutura cristalizada da boPAG- 1. B) Estrutura tridimensional atribuída à PAG acoplada à pepstatina A (situada entre P3’ e P4’). Adaptado de GREEN et al. (1998)...... 77

FIGURA 12 - Filograma baseado na seqüência de aminoácidos mostrando o relacionamento entre todas as PAGs clonadas até o momento, assim como o de algumas proteinases aspárticas presentes em mamíferos. Adaptado de GREEN et al. (2000)...... 82

FIGURA 13 - Variação cronológica do ADN complementar das PAGs em bovinos (boPAGs) e ovinos (ovPAGs) ao longo da gestação. Adaptado de GREEN et al. (2000)...... 83

FIGURA 14 - Expressão do ADN codificante para as PAGs bovinas e ovinas identificadas até o presente. As PAGs expressas predominantemente em células binucleadas correspondem a proteínas estreitamente relacionadas. As PAGs expressas de modo difuso no trofectoderme representam os mais antigos membros desta família de proteases aspárticas. Adaptado de GREEN et al.

(2000)...... 84

FIGURA 15 - Perfil das concentrações de PAG (média ± DP) calculados no soro de 20 vacas coletadas do 20 o dia de gestação ao 100 o dia após o parto. Utilizou-se escala aritmética das concentrações de PAG do 20 o ao 220 o dia de gestação (A) e escala logarítmica do 40 o dia antes do parto ao 80 o dia após o parto (B). Adaptado de ZOLI et al. (1992a)...... 89

FIGURA 16 - A) Schistosomus reflexus bovino; B) Concentrações de boPAG-1 observadas no caso de Schistosomus reflexus (-▲-▲-) e de gestações normais (-×-×-). Adaptado de ECTORS et al. (1996a)...... 91

FIGURA 17 - Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-●-●-) e P4 (-▲-▲-) em 4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação inicialmente positivo (P) por ultrasonografia foi seguido de um diagnóstico negativo (N) por ultrasonografia ou pela observação direta da morte fetal (MF). Adaptado de SZENCI et al. (1998a)...... 93

FIGURA 18 - Características da matriz associada à pepstatina A, utilizada para a purificação de proteases aspárticas...... 97

FIGURA 19 - Esquema de purificação (fracionamento) da PAG extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de trocas de íons...... 103

FIGURA 20 - Esquema de purificação da PAG extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de afinidade...... 113

FIGURA 21 - Perfis cromatográficos das frações DEAE 0 M a 0,32

M NaCl submetidas a FPLC em coluna CM cerâmica. A coluna (1 x 3 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de amônia a 10 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. As áreas hachuradas indicam as frações mais imunoreativas de cada cromatografia. As percentagens indicam a proporção entre PAG e proteína total (PT)...... 127

FIGURA 22 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12%) após coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio de Western Blot com o uso do AS497 (anti- boPAG 67 ). As pistas 1, 2, 3, 4 and 5 correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após cromatografia em resina CM cerâmica das frações DEAE 0, 0,02, 0,04, 0,08 e 0,16 M NaCl. Vinte microgramas de proteínas de cada pique foram carregadas. As massas moleculares (x 10 -3) estão indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 22A e 22B, respectivamente...... 128

FIGURA 23 - 2-D SDS-PAGE do pique mais imunoreativo obtido após cromatografia em resina CM Cerâmica da fração DEAE 0,32 M NaCl. As massas moleculares (x 10 -3) estão indicadas no lado direito da figura. A escala de pH está indicada na parte superior do gel. As setas indicam as diferentes isoformas (6,4, 6,3, 6,1 e 5,8) da alfa-N-acetilgalactosaminidase...... 130

50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT)...... 131

FIGURE 25 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12%) após coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio de Western Blot com o uso dos anti-soros anti-boPAG 67 (AS497), anti-caPAG 55+62 (R706) and caPAG 55+59 (R708). As pistas 1 e 2 correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após cromatografia em pepstatina A-agarose após extração em pH ácido e alcalino, respectivamente. Sessenta microgramas das proteínas imunoreativas de cada pique foram carregadas. As massas moleculares (x 10 -3) estão indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 25A e 25B, respectivamente...... 132

FIGURA 26 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A- agarose. A extração das placentas coletadas entre 10 e 11 semanas de gestação foi feita em pH alcalino (tampão bicarbonato de amônia a 0,05 M, pH 8,5). A coluna (1 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT)...... 134

FIGURA 27 - Curvas padrão (média ± DP) da dosagem de PAG nos sistemas de dosagem com etapa de pré-incubação (-▼-▼-) e sem

etapa de pré-incubação (-▲-▲-). Função B/B0 do logaritmo das concentrações de PAG...... 136

FIGURA 28 - Concentrações plasmáticas de PAG (média ± DP) durante a gestação e período pós-parto em 10 fêmeas zebu da raça Azawak. A 40 a semana de gestação corresponde à semana do parto (0pp). Diferenças significantes entre as semanas de gestação estão indicadas por asteriscos (*P<0,0001, **P<0,05)...... 138

FIGURA 29 - Curvas de regressão das concentrações plasmáticas de PAG mensuradas entre a parturição e a 10 a semana pós-parto. As concentrações de PAG nas vacas Azawak que apresentaram concentrações normais de PAG (n = 10) foram representadas por círculos ( ●). As amostras da vaca zebu a qual apresentou altas concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final da gestação foram representadas por quadrados ( ■)...... 139

FIGURA 30 - Comparação dos perfis de PAG entre vacas Azawak apresentando gestações normais (população homogênea) e a vaca que apresentou altas concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final da gestação...... 140

LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

aa : aminoácido ADN : ácido desoxirribonucléico Ag° : antígeno frio ou não-marcado Ag* : antígeno quente ou marcado APP : amyloid protein precursor ou proteína precursora de amilóide AS : anti-soro α-GalNAc : alfa n-acetilgalactosaminidase b ou bo : bovino(a) B : binding ou ligação BACE : beta-secretase BCS : escore de condição corporal

B0 : tubo branco ou sem PAG BSA : albumina sérica bovina c ou ca : caprino(a) °C : graus Celsius CATD : catepsina D CATE : catepsina E cf : conferir

CG : chorionic gonadotrophin, gonadotrofina coriônica ou hormônio coriônico somatomamotrófico CHYM : quimosina cm : centímetro CM : carboximetil CS : chorionic somatomammotrophin ou somatomamotrofina coriônica CV : coeficiente de variação d : dia, exceto quando se refere a dalton DEAE : dietilaminoetano DP : desvio padrão DTT : ditiotreitol e ou eq : equino(a) EDTA : ácido etilenodiaminotetracético EPF : early pregnancy factor ou fator precoce da gestação fe : felino FPLC : fast flow liquid chromatography FSH : hormônio folículo estimulante g : grama, exceto quando se refere à aceleração GLM : General Linear Model GH : hormônio do crescimento ou hormônio somatotrófico h : hora, exceto quando se refere à humano 125 I : isótopo radioativo iodo 125 IA : inseminação artificial IFN τ : interferon tau Ig : imunoglobulina l : litro kDa : quilodalton LH : hormônio luteinizante M : molar mA : miliampéres

MAF : fator ativador de macrófagos MF : mortalidade fetal mg : miligrama min : minuto ml : mililitro mm : milímetro mM : milimolar MM : massa molecular mt : mitocondrial µg : micrograma µl : microlitro µm : micrômetro n : número ng : nanograma NSB : non-specific binding ou atividade não-específica N-terminal : aminoterminal o ou ov : ovino(a) p ou po : porcino(a) PAG : pregnancy-associated glycoprotein ou glicoproteína associada à gestação PAS : ácido periódico de Schiff PAGE : eletroforese sobre gel de poliacrilamida PEP : pepsinogênio PEPC : pepsinogênio C ou progastricsina pg : picograma PGE : prostaglantina E

PGF 2α : prostaglandina F 2α pH : potencial hidrogeniônico pI : ponto isoelétrico PI : pré-incubação PL : placental lactogen ou hormônio lactogênio placentário

PMSF : fenil-metilsulfonilfluoridro PMSG : pregnant mare’s serum gonadotrophin ou gonadotrofina sérica da égua prenhe PRL : prolactina PSPA : pregnancy-associated protein A ou alfa-fetoproteína PSPB : pregnancy-associated protein B ou proteína específica da gestação B PSP-60 : pregnancy serum protein 60 ou proteína sérica da gestação 60 PT : proteína total PVDF : polivinilideno difluoridro P4 : progesterona RENI : renina RIA : radioimunoensaio S.A. : sulfato de amônia SAS : Statistical Analysis System SBU-3 : antígeno SBU-3 SBI : soy bean trypsin SDS : dodecil sulfato de sódio SF : serum free ou soro em PAG SPI : sem pré-incubação TBS : tampão tris salino Tc : total counting ou atividade total Tris : tris-hidroximetil aminometano ze : zebra

Abreviação dos aminoácidos:

Código 1 letra Código 3 letras Aminoácido correspondente A Ala : alanina B Asx : aspartato ou asparagina C Cis : cisteína D Asp : aspartato ou ácido aspártico E Glu : ácido glutâmico F Fen : fenilalanina G Gli : glicina H His : histidina I Ile : isoleucina K Lis : lisina L Leu : leucina M Met : metionina N Asn : asparagina P Pro : prolina Q Gln : glutamina ou glutamida R Arg : arginina S Ser : serina T Tre : treonina V Val : valina W Trp : triptofano Y Tir : tirosina Z Glx : glutamato ou glutamina

LISTA DE ANEXOS

ANEXO A – Dosagem da PAG por radioimunoensaio (RIA)...... 201

ANEXO B - Método Lowry para a dosagem de proteínas...... 208

ANEXO C - Eletroforese monodimensional em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D PAGE SDS)………………………….……………………...... 210

ANEXO D – Técnica de Western Blot……………..…...…...... 214

ANEXO E – Isofocalização e eletroforese bidimendional (2-D PAGE-SDS)…………………………………...... …………….... 218

LISTA DE APÊNDICES

Apêndice 1 - Capítulo de Livro Publicado SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. (2001) Placental Proteins of Ruminants: biochemical, physiological and zootechnical aspects. In: Renaville, R. e Burny, A. (eds.), Biotechnology in Animal Husbandry , Ed. Kluwer Academic Publishers, Hardbound, Netherlands, pp. 179-208. (Capítulo de Livro )………………………………………….…………………. 222

Apêndice 2 - Artigo Completo em Anais SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R.; EL AMIRI, B.; BANGA- MBOKO, H.; SZENCI, O. & BECKERS J.F. (2001) Chorioví gonadotropin a specifický glykoprotein u b řezích p řežvýkavc ŭ (Chorionic gonadotropins and pregnancy-associated glycoproteins in ruminants). 3rd Central European Buiatric Congress , 24 e 25 de Maio, Moravian Highlands, República Tcheca, p. 430-432. (Conferência )…………………..…………... 277

Apêndice 3 - Artigo de Revisão (submetido) MOREIRA DA SILVA, F.; SOUSA, N.M.; FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. Proteínas placentais secretadas na circulação materna: auxílio ao diagnóstico de gestação e ao estudo da mortalidade embrionária em bovinos (Placental proteins secreted in maternal circulation: useful indicators for both pregnancy diagnosis and embryonic mortality in bovine species). (artigo de revisão submetido à Revista Portuguesa de Zootecnia )……….. 285

Apêndice 4 - Artigo Aceito SOUSA, N.M.; REMY, B.; EL AMIRI, B.; BANGA-MBOKO, H.; FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. Characterization of Pregnancy-Associated Glycoproteins extracted from zebu ( Bos indicus ) placentas removed at different gestational ages. (aceito por Reproduction, Nutrition, Development )……...... …... 318

Apêndice 5 - Artigo Submetido SOUSA, N.M.; ZONGO, M.; PITALA, W.; BOLY, H.; SAWADOGO, L.; SANON, M.G.; FIGUEIREDO, J.R.; GONÇALVES, P.B.D.; EL AMIRI, B.; PERÈNYI, Z. & BECKERS, J.F. Pregnancy-Associated Glycoprotein concentrations during pregnancy and postpartum period in Azawak zebu cattle. (submetido à Theriogenology )……………. 348

Apêndice 6 - Resumos e Outros ………………..…………….... 370

RESUMO Tese de Doutorado Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃOEM ZEBUÍNOS Autora: Noelita Melo de Sousa Orientador: José Ricardo de Figueiredo Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de março de 2002.

As glicoproteínas associadas à gestação (PAGs) constituem uma extensa família de proteases aspárticas expressas na camada celular externa da placenta de artiodáctilos. Na primeira parte do presente trabalho, dois procedimentos bioquímicos foram usados para caracterizar as PAGs isoladas a partir de cotilédones fetais zebuínos ( Bos indicus ). O primeiro protocolo, usado para isolar as PAGs de placentas coletadas no último trimestre de gestação, incluiu a extração de proteínas em pH neutro, precipitação ácida, precipitações em sulfato de amônia, cromatografias de troca de ânions e de cátions. O segundo protocolo, usado para isolar a PAG a partir de placentas coletadas ao primeiro e segundo trimestres de gestação, incluiu a extração de proteínas em pH ácido e alcalino, seguida por cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose. O radioimunoensaio utilizado para a dosagem da PAG taurina foi empregado para monitorar a imunoreatividade ao longo do procedimento de isolamento. As frações resultantes das cromatografias de troca de cátions e de afinidade foram analisadas por eletroforese e Western Blot, antes de serem transferidas à membranas de polivinilideno difluoridro para a determinação da seqüência de aminoácidos N-terminal. Diferentes isoformas de PAG, com massas moleculares de 51 a 69 kDa e pIs de 3,1 a 6,7, foram identificadas em placentas de zebuínos. As proteínas imunoreativas resultantes da cromatografia de troca de cátions das frações DEAE 0 M a 0,16 M NaCl revelaram a existência de uma única seqüência N-terminal (entre 10 a 25 aminoácidos de comprimento), a qual é idêntica à seqüência da boPAG-1. A mesma seqüência (14 aminoácidos) foi encontrada após cromatografia de afinidade. Estes resultados indicaram a expressão de uma única seqüência N-terminal de PAG em placentas de zebuínos coletadas em diferentes estádios gestacionais. Na segunda parte do presente trabalho, dois sistemas radioimunológicos foram usados para determinar as concentrações plasmáticas de PAG durante a gestação e período pós-parto em vacas zebus da raça Azawak. Doze fêmeas diagnosticadas como gestantes por palpação retal tiveram amostras de sangue coletadas a intervalos de 5 a 10 dias. As coletas foram feitas aproximadamente entre a 8 a semana de gestação e a 10 a semana pós-parto. Uma vaca inicialmente diagnosticada como gestante mostrou concentrações de PAG inferiores à sensibilidade do teste (<0,20 ng/ml) e não pariu. Outra vaca mostrou concentrações de PAG anormalmente elevadas durante a gestação, sendo excluída do perfil normal de PAG. As outras 10 vacas diagnosticadas como gestantes apresentaram perfis de PAG bastante homogêneos. Nestes animais, as concentrações aumentaram progressivamente da 8 a à 35 a semanas de gestação (de 6,0 ±4,2 ng/ml a 196,0 ±34,8 ng/ml), permanecendo relativamente constantes até a 39 a semana (210,8 ±74,8 ng/ml). Durante a última semana de gestação, as concentrações de PAG aumentaram significativamente (P<0,0001), sendo alcançadas os mais altos níveis (1.095,6 ±607,2 ng/ml). Após o parto, as concentrações de PAG diminuíram significativamente (P<0,05) até a 2 a semana pós-parto (384,4 ±85,6 ng/ml) e após lentamente até a 10 a semana. Estes resultados demonstraram que as concentrações plasmáticas de PAG em zebuínos foram inferiores às previamente observadas em raças taurinas entre a 35 a e a 39 a semanas de gestação.

ABSTRACT Tese de Doutorado Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS (Purification, Characterization and Radioimmunoassay of Pregnancy-Associated Glycoproteins Isolated from Zebu Cattle) Autora: Noelita Melo de Sousa Orientador: José Ricardo de Figueiredo Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de março de 2002.

The pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) constitute a large family of aspartic proteinases expressed in the outer epithelial cell layer of the Artyodactyla placenta. In the first part of the present work, two biochemical approaches were used to characterize PAGs isolated from zebu ( Bos indicus ) fetal cotyledons. The first procedure, used to isolate PAG from zebu placenta removed late in pregnancy, included extraction of proteins at neutral pH, acidic and ammonium sulfate precipitations, anion and cation exchange chromatographies. The second procedure, used to investigate PAG in placentas removed at early and mid gestational periods, included protein extractions at acid or alkaline pH followed by pepstatin-A agarose affinity chromatography. A bovine PAG radioimmunoassay was used to monitor the immunoreactivity throughout the isolation procedures. The most immunoreactive fractions issued from cation exchange and affinity chromatographies were analyzed by SDS-PAGE and Western Blot, before transfer to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane for NH 2-microsequence determination. By use of SDS-PAGE and Western Blot, different isoforms of PAG with apparent molecular masses from 51 to 69 kDa and isoeletric points varying from 3.1 to 6.7 were identified in placentas from different gestational ages. After CM ceramic chromatography of all except 0.32 M NaCl DEAE fraction, the most immunoreactive proteins revealed N-terminal amino acid sequences (10 to 25 aa long) which were 100% identical to bovine PAG-1. The same sequence (14 aa long) was found after pepstatin-agarose affinity chromatography of proteins extracted from placentas removed earlier in pregnancy. These results converged towards the expression of one major N-terminal PAG amino acid sequence in zebu placentas at different gestational ages. In the second part of this study, two specific RIA systems were developed then used to measure plasmatic PAG concentrations during gestation and postpartum period in Azawak zebu cows. Twelve females palpated per rectum and diagnosed as pregnant were bled at 5-10 days interval approximately from Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). One zebu cow initially diagnosed as pregnant showed PAG concentrations lower than the assay sensitivity (<0.20 ng/ml) and did not calve. Another cow showed abnormally high PAG concentrations during gestation, being excluded from the general PAG profile. The 10 other zebu cows gave a very homogeneous PAG profile. In these animals, concentrations increased progressively from Week 8 to Week 35 of gestation (from 6.0 ±4.2 to 196.0 ±34.8 ng/ml), remaining relatively constant until Week 39 (210.8 ±74.8 ng/ml), when they increased sharply to reach their highest level (1,095.6 ±607.2 ng/ml) at parturition. After delivery, PAG concentrations declined significantly (P<0.05) till the Week 2 postpartum (348.4 ± 85.6 ng/ml) and slowly till the Week 10 postpartum. These results revealed that PAG concentrations in zebu cattle were lower than those previously described in taurine breeds between week 35 and 39 of gestation.

RESUME Tese de Doutorado Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria, RS, Brasil

PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E DOSAGEM RADIOIMUNOLÓGICA DE GLICOPROTEÍNAS ASSOCIADAS À GESTAÇÃO EM ZEBUÍNOS (Purification, Caractérisation et Dosage Radioimmunologique des Protéines Associées à la Gestation du Bétail Zébu) Autora: Noelita Melo de Sousa Orientador: José Ricardo de Figueiredo Data e Local da Defesa: Santa Maria, 26 de março de 2002.

Les protéines associées à la gestation (PAGs) constituent une grande famille de protéinases aspartiques exprimées dans les cellules épithéliales de la couche superficielle du placenta des artiodactyles. Dans la première partie du présent travail, deux approches biochimiques ont été utilisées pour caractériser les PAGs isolées à partir de cotylédons fœtaux recueillis à différents stades gestationnels chez le zébu ( Bos indicus ). Le premier procédé impliquait des précipitations acides et au sulfate d’ammonium et des chromatographies par échange d’anion et de cation tandis que le second reposait sur l’utilisation d’une chromatographie d’affinité de pepstatine-A agarose. Un dosage radioimmunologique était utilisé pour suivre l’immunoréactivité des fractions au cours des différentes étapes de purification. Les fractions les plus immunoréactives issues des chromatographies par échange d’ion et affinité ont été analysées par électrophorèse en SDS et Western Blot avant transfert sur membrane de polyvinylidene difluoride (PVDF) pour micro séquençage de la partie N-terminale. Différentes isoformes de PAG avec masses moléculaires apparentes allant de 51 à 69 kDa et de points isoélectriques compris entre 3,1 et 6,7 ont été identifiées à partir des placentas recueillis aux différentes époques gestationnelles. Après cromatographie par échange de cations, (fractions DEAE 0 M à 0,16 M NaCl) le microséquençage de la partie N-terminale (10 à 25 acides aminés) a indiqué l’expression d’une seule séquence N-terminale correspondant à celle décrite pour la PAG-1 de Bos taurus . La même séquence (14 acides aminés) a été obtenue après microséquençage de la partie N- terminale des protéines issues de cromatographies d’affinité. Dans la seconde partie de cette étude, deux systèmes de dosages radioimmunologiques spécifiques ont été développés et utilisés pour mesurer les concentrations plasmatiques de protéines associées à la gestation durant la gravidité et la période post partum chez les vaches Zébu Azawak. Douze femelles testées par palpation rectale et diagnostiquées comme gestantes ont subi des saignées à intervalles de 5 à 10 jours approximativement à partir de la 8 e semaine de gestation jusqu’à la 10 e semaine post partum . Une vache zébu diagnostiquée au départ comme gestante a montré des concentrations inférieures à la sensibilité du dosage (<0,20 ng/ml) et n’a pas vêlé. Une autre vache a montré des concentrations de PAG anormalement élevées durant la gestation, étant de ce fait statistiquement exclue du profil général de la concentration de PAG au cours de la gestation. Les dix autres vaches ont donné un profil très homogène. Chez ces animaux, les concentrations augmentaient progressivement à partir de la 8 e semaine jusqu’à la 35 e semaine (de 6,0 ±4,2 à 196,0 ±34,8 ng/ml), restaient ensuite relativement constantes jusqu’à la 39 e semaine (210,8 ±74,8 ng/ml) époque à laquelle elles augmentaient rapidement pour atteindre leur valeur la plus élevée (1.095,6 ±607,2 ng/ml) au moment de la parturition. Après la délivrance, les concentrations de PAG déclinaient significativement (P<0,05) jusqu’à la 2 e semaine post partum . Globalement, nos résultats ont montré que les concentrations de PAG chez les zébus étaient inférieurs à celles des races taurines entre la 35 e et 39 e semaines de gestation.

1. INTRODUÇÃO

O gado zebu ( Bos indicus ) é uma importante fonte de proteína animal em países em vias de desenvolvimento situados nos continentes africano e americano (CUNNINGHAM, 1992). Quando comparado ao gado taurino (Bos taurus ), ele apresenta uma notável adaptação ao clima árido ou semi- árido, sendo mais eficaz quanto à extração de nutrientes de forragens de qualidade inferior (BARTLE et al. , 1994) e mostrando uma notável habilidade para suportar altas temperaturas (CARVALHO et al. , 1995; GAUGHAN et al. , 1999). Algumas diferenças genéticas, bioquímicas e reprodutivas entre gado zebuíno (identidade taxonômica 9915) e taurino (identidade taxonômica 9913) já foram relatadas (QUEVAL et al. , 1998; BAKER & MANWELL, 1980; PINHEIRO et al. , 1998). Entretanto, devido à escassez de estudos realizados em zebuínos, a maior parte de suas particularidades reprodutivas continua ainda por ser esclarecida. Durante as últimas décadas, diversas equipes vêm realizando trabalhos relacionados ao isolamento e à caracterização de hormônios e proteínas sintetizados pela placenta de espécies ruminantes, o que resultou na descoberta de numerosas famílias de proteínas, dentre as quais merecem ser citados os interferons tau (IFN τ), os hormônios lactogênios placentários (PL) e, mais recentemente, as glicoproteínas associadas à gestação (PAGs). As PAGs, também conhecidas por diversos outros nomes como proteína específica da gestação B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), antígeno SBU-3 (GOGOLIN-EWENS et al. , 1986) e proteína sérica da gestação 60 kDa (PSP-60) (MIALON et al. , 1993) foram inicialmente descritas como antígenos placentários, detectáveis no sangue materno de bovinos logo

após o início da implantação (BUTLER et al. , 1982). Elas foram inicialmente purificadas a partir da placenta de raças taurinas (BUTLER et al. , 1982; CAMOUS et al. , 1988; ZOLI et al. , 1991), tendo sido posteriormente isoladas a partir de placentas de ovinos (ZOLI et al. , 1995; XIE et al. , 1997a), caprinos (GARBAYO et al. , 1998) e cervídeos (HUANG et al. , 1999). Até o presente, como resultado do uso de técnicas de biologia molecular, foram identificados 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs em bovinos (XIE et al. , 1991; XIE et al. , 1994; XIE et al. , 1997b; GREEN et al. , 2000). Entretanto, apesar desta multiplicidade de genes, somente foram identificadas por procedimentos bioquímicos duas formas principais de PAG: a PAG-1 bovina (boPAG-1 ou boPAG 67 ) (BUTLER et al. , 1982; CAMOUS et al. , 1988; ZOLI et al. , 1991) e a PAG-2 bovina (boPAG-2). A boPAG-1 foi purificada e inicialmente caracterizada em sua seqüência N- terminal por ZOLI et al. (1991). Ela foi identificada por XIE et al. (1991) como um membro enzimaticamente inativo pertencente à família das proteases aspárticas. A boPAG-2 não foi purificada até a homogeneidade, tendo sido apenas identificada em tentativas de se purificar uma gonadotrofina coriônica (CG), a partir de placentas de bovinos (BECKERS et al. , 1988). No que se refere especificamente à boPAG-1, as metodologias empregadas por BUTLER et al. (1982) e ZOLI et al. (1991) para a sua purificação foram bastante similares, baseando-se inicialmente na produção de anti-soros de primeira geração produzidos contra extratos placentários de raças taurinas. Após a eliminação de proteínas já conhecidas, tais como a albumina sérica (BSA), a hemoglobina, o hormônio lactogênio

placentário e as imunoglobulinas, estes anti-soros foram absorvidos contra extratos de tecidos presentes em vacas não-gestantes, sendo usados para o monitoramento das frações mais imunoreativas obtidas ao longo dos protocolos de purificação. O uso dos anti-soros de primeira geração produzidos por BUTLER et al. (1982) em técnicas de imuno-eletroforese permitiu a identificação de duas proteínas imunoreativas: a primeira correspondendo à alfa- fetoproteína e a segunda à uma proteína até então desconhecida, denominada proteína específica da gestação (BUTLER et al. , 1982). Posteriormente, o uso de um anti-soro produzido de maneira semelhante por ZOLI et al. (1991) permitiu o monitoramento das frações mais imunoreativas obtidas ao longo do protocolo de purificação, tendo, neste caso, sido caracterizada apenas a fração mais imunoreativa obtida ao final do fracionamento de proteínas, a qual foi denominada de glicoproteína associada à gestação ou PAG. Mais recentemente, a análise de um maior número de frações imunoreativas mostrou a existência de diferentes formas de PAGs em extratos cotiledonários de ovinos e caprinos (XIE et al. , 1997a; GARBAYO et al. , 1998). Entretanto, até o presente, não foi feita uma análise detalhada das frações imunoreativas presentes na placenta de bovinos. O isolamento de diferentes formas de PAGs em bovinos, ovinos e caprinos têm possibilitado o desenvolvimento de dosagens radioimunológicas, as quais têm permitido a caracterização do perfil desta proteína durante a gestação em diversas espécies de ruminantes. Durante gestações normais, as concentrações de PAG podem diferir consideravelmente entre as espécies e os períodos de gestação (ZOLI et al. ,

1992a; RANILLA et al. , 1994; SOUSA et al. , 1999). Em uma mesma espécie, elas podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre os quais podem ser citados a raça da fêmea (MIALON et al. , 1993; RANILLA et al. , 1994) e o estado nutricional materno (WALLACE et al. , 1997a). As concentrações de PAG parecem também diferir de acordo com o sistema radioimunológico utilizado, diferença esta resultando provavelmente da especificidade do anti-soro (GONZALEZ et al. , 1999,2000). Perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG já foram descritos em taurinos (ZOLI et al. , 1992a; DOBSON et al. , 1993), em caprinos (SOUSA et al. , 1999; GONZÁLEZ et al. , 2000) e em ovinos (RANILLA et al. , 1994; GAJEWSKI et al. , 1999). Entretanto, ao nosso conhecimento, perfis de PAG nunca foram descritos em fêmeas de origem zebuína. Levando em consideração a ausência de informações sobre as características bioquímicas da(s) PAG(s) existente(s) na placenta de raças zebuínas, bem como a inexistência de dados sobre os perfis plasmáticos desta proteína ao longo da gestação e período pós-parto neste taxa, tornaram-se objetivos principais do presente trabalho: 1) Isolar e caracterizar, em termos de massa molecular, ponto isoelétrico e seqüência N-terminal, as proteínas apresentando imunoreatividade à PAG, extraídas a partir de cotilédones fetais de fêmeas zebuínas. Para tal, foi utilizado um protocolo dito ‘clássico’ por ser baseado nos protocolos previamente utilizados em outras espécies ruminantes (ZOLI et al. , 1991; GARBAYO et al. , 1998); 2) Testar um novo protocolo bioquímico, baseado no uso de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose, para o isolamento da(s) PAG(s) presentes em extratos placentários

coletados em diferentes estados gestacionais (primeiro e segundo trimestres de gestação); 3) Desenvolver um protocolo de dosagem RIA homólogo para a mensuração das concentrações de PAG em raças zebuínas e 4) Traçar os perfis plasmáticos de PAG durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebuínas da raça Azawak.

Antes de iniciar a descrição da parte experimental do presente estudo, julgamos oportuno apresentar uma breve revisão de literatura sobre o gado zebu, as proteases aspárticas e finalmente sobre as proteínas placentárias, com enfoque especial às PAGs.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. O Gado zebu A domesticação do gado bovino pode ser considerada como uma etapa de grande importância para a evolução da sociedade tal como a conhecemos. Diversas funções foram atribuídas aos bovinos domésticos após sua domesticação, tendo os mesmos exercido, direta ou indiretamente, um importante papel econômico, cultural e mesmo religioso, além de ter se constituído em uma importante força de tração para as primeiras comunidades agropastoris existentes durante o período Neolítico (PAYNE, 1991). Existem dois tipos principais de gado doméstico: o gado zebu ( Bos indicus , classificado por alguns autores como Bos taurus indicus ) e o gado taurino ( Bos taurus , também classificado como Bos taurus taurus ). O gado doméstico pertence à Tribo (grupo) Bovini , Família Bovidae , Ordem Artyodactyla , a qual também inclui o bisão americano ( Bison bison ), o bisão europeu ( Bison bonasus ), o bantengue ( Bibos banteng ), o gauro (Bibos gaurus ) e o iaque ( Phoëphagus mutus ) (FIGURA 1). Os gêneros pertencentes à Tribo Bovini são estreitamente relacionados. Quando cruzados entre si, eles podem produzir híbridos férteis, ou, em alguns casos, machos híbridos estéreis.

2.1.1. Origem e diferenças entre gado zebuíno e taurino Quanto à suas origens, praticamente todas as raças de gado doméstico são consideradas como originárias do gado selvagem Ure-ox ou Auroque, espécie Bos primigenius (GRIGSON, 1980), a qual evoluiu separadamente

nos continentes asiático, europeu e africano, dando origem às sub-espécies Bos primigenius namadicus (Ásia), Bos primigenius primigenius (Europa) e Bos primigenius opisthonomus (África do Norte). Ambas as sub-espécies asiática e africana foram extintas há aproximadamente 2.000 anos, enquanto que a espécie européia sobreviveu até o início do século XVII, período no qual desapareceram os últimos exemplares de Ure-ox, mantidos em condições naturais no centro da Polônia (SZAFER, 1968).

Classe Mammalia

Subclasse Ungulata

Ordem Artiodactyla

Subordem Ruminantia

Família Bovidae

Subfamília Bovinae Subfamília Caprinae

Grupo Bo vini Grupo Bubalina Grupo Syncerina Grupo Caprina Grupo Ovina

Gênero Gênero Gênero Gênero Gênero Gênero Gênero Gênero Bos Bibos Peöphagus Bison Bubalus Syncerus Capra Ovies

Espécie Espécie Espécie Espécie Espécie Espécie Espécie Espécie Espécie Espécie Espécie B. primigenius B. javanicus B. gaurus B. sauveli P. mutus B. bonasus B. bison B. bubalis S. caffer C. hircus O. aries (búfalo asiáticoi) (búfalo africano) (ovelha) (auroque) (bantín) (gauro) (couprei) (bisão europeu) (bisão americano) (cabra)

B. taurus B. indicus B. banteng B. frontalis P. gruniens (gado taurino) (gado zebu) (vaca de Bali) (mitan ou gaial) (iaque )

Interférteis, podendo ser considerados como sub-gêneros de Bos

FIGURA 1 - Árvore filogenética das principais espécies de Bovidae identificadas até o presente. Entre parênteses constam o nome da espécie em sua forma selvagem e entre colchetes o nome dado à espécie domesticada. ✝Espécie extinta. Adaptado de PAYNE (1991).

Conforme calculado por LOFTUS et al. (1994a,b) pelo uso de marcadores genéticos, os taxas Bos indicus e Bos taurus divergiram entre si de aproximadamente 200.000 a 1 milhão de anos (LOFTUS et al. , 1994a). Durante este longo período evolutivo, diversas mutações parecem ter ocorrido, resultando na acumulação de diferenças protéicas e genéticas entre ambos os tipos de gado. As diferenças existentes quanto à freqüência alélica de proteínas séricas ou de alozimas foram as primeiras a permitir a construção de árvores filogenéticas nas quais foram comparadas diferentes raças de gado de origem zebuína e taurina (BAKER & MANWELL, 1980). A partir da década de 50, diversos trabalhos demonstraram uma alta freqüência alélica da α-lactoalbumina A (BLUMBERG & TOMBS, 1958) e da αs1 -caseína C (BAKER & MANWELL, 1980) em raças zebuínas e sua baixa freqüência ou inexistência em raças taurinas, assim como a ausência das variantes zebuínas da hemoglobina C (BRAEND, 1972), albumina sérica B (BAKER & MANWELL, 1980) e transferrinas B e F (QUEVAL et al. , 1998) em gado taurino. Estudos genéticos sucederam os estudos bioquímicos realizados em gado zebuíno. Uma das primeiras evidências da existência de diferenças genéticas entre Bos indicus e Bos taurus foi obtida em 1968 por KIEFFER & CARTWRIGHT através da cariotipagem e análise morfológica do cromossomo Y. Conforme observado por estes autores, gado zebuíno é caracterizado por possuir cromossomo Y acrocêntrico, enquanto que gado taurino caracteriza-se por apresentá-lo com uma conformação sub- metacêntrica. Uma análise mais detalhada dos cromossomo Y demostrou a existência de polimorfismos ao nível de fragmentos de seqüências de ADN

obtidas pelo uso de enzimas de restrição (BRADLEY et al. , 1994), confirmando a hipótese de que ambos os tipos de gado evoluíram independentemente a partir de ancestrais distintos. Recentemente, a comparação de seqüências correspondentes às regiões variáveis do ADN mitocondrial (mtADN loop ) (LOFTUS et al. , 1994a), assim como análise de fragmentos de mtADN obtidos pelo uso ribonucleases demonstrou a existência de diferenças notáveis entre os grupos de gado Indiano e Afro-Europeu, permitindo a distinção entre os mesmos (LOFTUS et al. , 1994b; BRADLEY et al. , 1996). Paralelamente, a realização de estudos populacionais que visavam a determinação da origem de raças bovinas existentes nos continentes Europeu, Asiático e Africano permitiu a demonstração de divergências na distribuição de diversos microsatélites encontrados em ambos os gados zebuíno e taurino (BRADLEY et al. , 1994, 1996; MacHUGH et al. , 1997). A observação de polimorfismos ao nível de microsatélites também foi observada em experimentos que visavam a caracterização específica de genes tais como a prolactina (DIETZ et al. , 1992), a capa-caseína (LEVEZIEL et al. , 1994), o hormônio do crescimento (LAGZIEL et al. , 1996) e o fator inibidor de leucemia (PIEDRAHITA et al. , 1997).

2.1.2. As raças zebuínas O continente Asiático contava, já em 1953, com aproximadamente 300 milhões de cabeças de gado, dos quais praticamente metade são pertencentes às raças zebuínas Hariana, Sahiwal, Thaparker, Red Sindhin, Ongole, Gyr e Kankrej, originárias da Índia e Paquistão (JOSHI & PHILIPS, 1953). Um efetivo zebuíno de aproximadamente 20 milhões de

cabeças encontra-se localizado na África do Norte e Central, sendo as principais raças “nativas” denominadas Fulani, Afrikander, Azawak, Sokoto, Boran e Bororo (ABOGAYE, 1998). No Brasil, importações realizadas entre 1813 e 1964 deram origem ao gado Nelore, Gir e Guzerá, originários das raças asiáticas Ongole, Gyr e Kankrej. Essas mesmas raças foram utilizadas para a formação do gado Brahman, a principal raça zebuína existente nos Estados Unidos (BREEDS OF CATTLE, 2001). Fêmeas Nelore têm uma vida reprodutiva bastante longa, apresentando uma boa habilidade maternal e uma baixa incidência de distócia devido ao seu porte (450 a 550 kg) e à sua grande abertura pélvica (BREEDS OF CATTLE, 2001). Por apresentar uma grande rusticidade, uma excelente taxa de conversão alimentar e um temperamento extremamente dócil, eles se adaptam facilmente ao sistema de criação encontrados nas regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil. Ao contrário do gado zebu trazido às Américas, no qual tem sido feitos investimentos em termos de melhoramento genético e de caracterização dos índices produtivos e reprodutivos, o gado zebu criado no continente Africano encontra-se pouco caracterizado, tanto em termos produtivos quanto de performance reprodutiva, sendo o mesmo tradicionalmente criado em pequenos rebanhos de propriedade familiar (ABOGAYE, 1998). A raça Azawak é uma das principais raças existentes no Burkina-Faso. As fêmeas possuem uma notável rusticidade e resistência à altas temperaturas e à carência alimentar, possuindo pesos médios de 250 a 300 kg na estação seca e de 300 a 400 kg na estação chuvosa (ZONGO, M. comunicação pessoal). Apesar da importância econômica e social deste

gado para as pequenas comunidades agropastoris locais, dados sobre sua fisiologia reprodutiva ao longo da gestação, especialmente em condições de estresse térmico e de carência alimentar nunca foram investigados.

2.2. Aspectos gerais da fisiologia reprodutiva de vacas de origem zebuína 2.2.1. Origem e desenvolvimento dos folículos ovarianos Na fêmea, a produção de gametas é o resultado da associação de dois fenômenos que ocorrem no interior do ovário: a oogênese e a foliculogênese. A oogênese pode ser definida como o conjunto de processos que compreende o desenvolvimento e a diferenciação das células germinativas primordiais da fêmea até a formação do oócito haplóide fecundado. A foliculogênese corresponde ao processo de formação, crescimento e maturação folicular. Ela inicia-se com a formação do folículo primordial, culminando com o estádio de folículo pré-ovulatório, também conhecido como folículo de De Graaf ou dominante (SAUMANDE, 1991). A etapa final do desenvolvimento folicular é a ovulação. A ovulação consiste na liberação do oócito pelo folículo ovariano. Nesta fase, as células da granulosa do folículo pré-ovulatório hipertrofiam-se e separam- se, perdendo seu arranjo colunar, enquanto que as células da teca tornam-se vacuoladas e muito vascularizadas, dando ao folículo uma aparência hiperêmica. Em zebuínos, a ovulação ocorre entre 26,2 e 30 horas após o início do estro (PINHEIRO et al. , 1998) resultando, assim como descrito em taurinos, de uma série de alterações na estrutura da parede folicular causadas pelo aumento na secreção do hormônio do hormônio luteinizante (LH) pela hipófise (EVANS et al. , 1994). Essas alterações consistem

basicamente na desintegração das células do ápice do folículo, o que conduz à ruptura de sua parede (LEMAIRE, 1989). A grande maioria dos folículos ovarianos não chega até a ovulação, mas, ao contrário, degenera-se por meio de um processo denominado atresia. A atresia reduz de maneira significativa o número de ovócitos potencialmente ovuláveis, reduzindo consequentemente, a produção de ovócitos viáveis durante a vida útil de um animal. Em bovinos, a ovulação pode ser considerada como um evento raro uma vez que somente 1 folículo em 1.000 chega ao estado pré-ovulatório (IRELAND, 1987). Após a ovulação, é formado o corpo lúteo, estrutura responsável pela síntese de diversos hormônios esteróides, dentre os quais merece ser ressaltada a progesterona (P4). O corpo lúteo é formado pela continuidade da maturação e desenvolvimento das células da granulosa e da teca (SMITH, 1986). As células da teca interna e da granulosa remanescentes no folículo após a ovulação darão origem a grandes e pequenas células esteroidogênicas luteínicas (FIELDS & FIELDS, 1996). Durante a luteinização, além de um aumento no diâmetro celular, são observadas também diversas modificações na síntese de esteróides (WILTBANK & NISWENDER, 1992). A produção de progesterona pode aumentar em até 10 vezes, devido ao aumento na quantidade das enzimas que participam nas primeiras etapas da síntese de esteróides, enquanto que a síntese de andrógenos e estrógenos diminui, devido à redução das enzimas que participam das etapas finais da síntese de esteróides (RODGERS et al. , 1986). Logo após a ovulação, o corpo lúteo formado é denominado cíclico, podendo o mesmo sofrer regressão (luteólise), ou ser preservado ao longo

da gestação, formando assim o corpo lúteo da gestação ou “corpus luteum verum”. Na maioria das espécies, a duração do corpo lúteo cíclico é breve, variando de 12 a 21 dias. No caso do não estabelecimento de uma gestação viável, o corpo lúteo regride por ação da luteolisina prostaglandina F 2α

(PGF 2α), iniciando-se um novo ciclo estral. Caso seja estabelecida a gestação, um mecanismo de reconhecimento materno leva ao bloqueio da luteólise, com a manutenção de um ou de vários corpos lúteos funcionais ao longo do período gestacional. Em diversas espécies, logo após a fecundação, o embrião produz alguns “sinais”, os quais induzem a transformação do corpo lúteo cíclico em gestacional. Dentre estes sinais associados ao reconhecimento materno da gestação, podem ser citados as gonadotrofinas coriônicas, a substância luteotrópica sintetizada pelas placentas das espécies humana e eqüina, e o interferon tau, a proteína anti-luteolítica de ação parácrina produzida pelo embrião de espécies ruminantes, o qual age no epitélio uterino para inibir a liberação de PFG 2α, assegurando, desta forma, a manutenção de um corpo lúteo funcional. As principais características dos hormônios e proteínas envolvidos no reconhecimento materno da gestação, assim como de outras proteínas sintetizadas pela placenta de mamíferos domésticos serão descritas no seção sobre proteínas placentárias.

2.2.2. Aspectos gerais relacionados ao ciclo estral O ciclo estral dos ruminantes pode ser caracterizado como um conjunto de alterações comportamentais e de modificações morfológicas e fisiológicas do aparelho genital, que se produzem com um ritmo regular e

contínuo, na ausência da gestação. Estas modificações estão diretamente relacionadas ao funcionamento cíclico do ovário, sendo reguladas por mecanismos endócrinos e neuro-endócrinos, principalmente pelos hormônios hipotalâmicos, gonadotrofinas e esteróides ovarianos. O início da atividade cíclica ovariana em fêmeas zebuínas parece ser influenciado por diversos fatores, dentre os quais o principal parece ser o peso corporal (DOBSON & KAMONPATANA, 1986). Conforme observado por PLASSE et al. (1968a), fêmeas zebuínas alcançam a puberdade com uma maior percentagem de peso corporal, sendo mais tardias do que fêmeas taurinas (14 a 24 meses versus 11 a 14 meses). Uma alta incidência de estros silenciosos quando do primeiro ciclo estral também foi reportada por PLASSE et al. (1968a) em novilhas da raça Brahman. Anatomicamente, o sistema reprodutivo de vacas de raças zebuínas é menor do que o sistema reprodutivo de raças taurinas (MUKASA- MUGERWA, 1989), sendo observado um menor volume ovariano (ADEYEMO & HEATH, 1980) além de menores diâmetros tanto do folículo dominante (FIGUEIREDO et al. , 1997) quanto do corpo lúteo (GALINA et al. , 1987; FIGUEIREDO et al. , 1997). Entretanto, apesar destas diferenças, a dinâmica folicular de raças zebuínas parece ser semelhante à observada em raças taurinas, sendo observadas de 2 a 3 ondas foliculares durante o ciclo estral (FIGUEREDO et al. , 1997). A duração do ciclo estral em fêmeas zebuínas é comparável à duração observada em fêmeas taurinas (21,5 ± 1,5 dias) (REKWOT et al. , 2000) (FIGURA 2), sendo a duração dos sinais de estro de aproximadamente 12,5 a 28 horas (DOBSON & KAMONPATANA, 1986). A ocorrência de ciclos

estrais curtos (11 a 17 dias) e longos (26 a 32 dias) foi relatada em 12,8 % e 38,5 % de fêmeas zebuínas pertencentes à raça Bunaji (REKWOT et al. , 2000). Uma maior proporção de ciclos longos (52 %) foi observada por MUKASA-MUGERWA et al. (1991) em vacas Arsi utilizadas em programas de inseminação artificial, sendo a mesma provavelmente devida à uma inadequada detecção de estros nesta raça.

FIGURA 2 - Representação esquemática das alterações das concentrações hormonais durante o ciclo estral de bovinos. Adaptado de PETERS & LAMMING (1983).

Conforme descrito por PINHEIRO et al. (1998) em fêmeas Nelore, a ovulação ocorre aproximadamente 26 horas após o início do estro. Segundo

estes autores, nesta raça, o comportamento de estro é mais curto comparativamente ao observado em fêmeas taurinas, havendo uma maior incidência de estros durante a noite, o que dificulta sua detecção em condições de campo. Em fêmeas Brahman, o pique ovulatório de LH parece ocorrer mais precocemente após o início dos sintomas de estro do que em raças mistas ou em raças taurinas (2,1 ± 1,3, 3,0 ± 1,0 e 6,5 ± 1,8 horas nas raças Brahman, 1/2 Brahman e 1/2 Hereford e Hereford, respectivamente) (RANDEL & MOSELEY, 1977). Estudos realizados por RANDEL (1976) demonstraram ainda intervalos de 18,5 ± 3,1 e 23,3 ± 2,1 horas entre o pique ovulatório de LH e a ovulação, respectivamente, em vacas das raças Brahman e Hereford. Durante o período próximo ao estro, as concentrações de estrógenos séricos totais são aproximadamente semelhantes em vacas Brahman, Hereford e mistas (1/2 Brahman e 1/2 Hereford), sendo as mais altas concentrações observadas respectivamente 24 horas, 8 horas e 16 horas antes do estro (RANDEL, 1980). O aumento das concentrações de 17-β- estradiol coincide com o declínio das concentrações de progesterona ocorridas após a regressão do corpo lúteo. Em fêmeas da raça Nelore, a luteólise ocorre aproximadamente entre os dias 15 e 18 pós-ovulação por ação da PGF 2α (FIGUEIREDO et al. , 1997). Apesar da inexistência de dados em zebuínos, tem sido suposto que, assim como em outras espécies ruminantes, o estradiol secretado pelos folículos em crescimento estimularia a síntese de receptores para a ocitocina no endométrio uterino (MacCRACKEN et al. , 1984). A ocitocina produzida pelas células luteínicas ligar-se-ia então a receptores

endometriais, desencadeando a secreção de PGF 2α pelo endométrio uterino (COOKE & HOMEIDA, 1983). Entretanto, o modo exato pelo qual a ocitocina mediaria a síntese de PGF 2α pelo endométrio uterino ainda não foi completamente elucidado.

2.2.3. Perfis hormonais durante a gestação Conforme descrito por PLASSE et al. (1968b), raças zebuínas tendem a apresentar gestações mais longas (291 a 295 dias) do que raças taurinas (282 a 289 dias). Entretanto, conforme descrito pelos mesmos autores, erros referentes à consideração de montas não-férteis como férteis poderiam explicar o período gestacional mais longo observado neste taxa. As concentrações de sulfato de estrona no leite de fêmeas zebuínas permanecem indetectáveis durante os primeiros meses de gestação, assim como observado em raças taurinas, aumentando exponencialmente durante o 4 o mês de gestação para atingir valores máximos (1.380,9 ± 164,7 pg/ml) ao 8 o mês de gestação (PRAKASH & MADAN, 1993). Existem poucos relatos sobre os perfis de estradiol e de progesterona ao longo da gestação de fêmeas de raças zebuínas. Segundo descrito por SHELTON & SUMMERS (1983) em fêmeas Brahman, os níveis plasmáticos de 17-β-estradiol em gestações simples são inferiores aos observados em gestações múltiplas durante o último mês de gestação (FIGURA 3). No que diz respeito à progesterona (FIGURA 4), suas concentrações permanecem elevadas a partir da 3 a semana de gestação (SHELTON & SUMMERS, 1983), sendo observada uma tendência ao aumento das mesmas durante o último trimestre de gestação (MUKASA-MUGERWA &

TEGEGNE, 1989).

17-beta estradiol (pg/ml) 500 parto

400

300

200

100

0 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 0 Semanas antes do parto

FIGURA 3 - Concentração de 17 β-estradiol plasmático durante a gestação em vacas zebuínas com gestações simples (-▼-▼-) e gemelares (-▲-▲-). Adaptado de SHELTON & SUMMERS (1983).

Perfis sorológicos ou plasmáticos de hormônios ou proteínas associadas à gestação têm sido descritos em diversas raças taurinas, auxiliando a uma melhor compreensão da função placentária neste taxa. Entretanto, ao nosso conhecimento, ainda não foram realizados estudos que visavam sua descrição em vacas de raças zebuínas.

FIGURA 4 – Concentração plasmática de progesterona durante a gestação em vacas zebuínas. Adaptado de MUKASA-MUGERWA & TEGEGNE (1989).

2.3. Proteases Aspárticas As proteínas associadas à gestação (PAGs), objeto de estudo do presente trabalho, são membros da família das proteases aspárticas, apresentando uma grande identidade entre sua seqüência de aminoácidos e a seqüência do pepsinogênio (XIE et al. , 1991). Será apresentada a seguir uma breve descrição das principais características do grupo das proteases aspárticas, ao qual pertencem as PAGs.

2.3.1. Terminologia Os termos proteinase e protease são sinônimos. As proteases são hidrolases que agem em ligações peptídicas de proteínas, diferenciado-se

das peptidases as quais agem apenas em cadeias peptídicas apresentando um número limitado de aminoácidos. Este grupo de enzimas são de fundamental importância para o remodelamento dos tecidos, em especial daqueles que apresentam uma alta taxa de transformação, tais como a placenta.

2.3.2. Classificação das Proteases As proteases são classificadas de acordo com os grupos químicos responsáveis por sua atividade catalítica. Elas agem por meio de quatro mecanismos distintos, sendo por conseqüência divididas em quatro principais classes: as serina proteases, as metaloproteases, as cisteína proteases e as proteases aspárticas (IUPAC-IUB, 2002). Do ponto de vista evolutivo, pode-se afirmar que cada uma das quatro classes de proteases evoluiu a partir de uma molécula distinta, originando sub-famílias de enzimas estreitamente relacionadas tanto do ponto de vista de mecanismo catalítico quanto estrutural. Os membros de uma mesma família podem ser facilmente reconhecidos pelas similaridades em suas seqüências de aminoácidos, especialmente na região próxima ao seu centro catalítico.

2.3.2.1. Serina proteases Em mamíferos, a maioria das serina proteases são membros da superfamília das quimotripsinas. Elas incluem enzimas digestivas (ex.: quimotripsina e tripsina), lisossomais, fibrinolíticas (ex.: fator ativador do plasminogênio e plasmina) assim como enzimas secretadas pelas células do sistema imunológico (IUPAC-IUB, 2002).

2.3.2.2. Metaloproteases As metaloproteases constituem a mais diversificada classe de proteases. Elas incluem enzimas tais como as colagenases e as gelatinases, estando envolvidas na degradação da matriz extracelular que ocorre durante a morfogênese e a involução tissula Abreviação dos aminoácidos (IUPAC- IUB, 2002).

2.3.2.3. Cisteína proteases Em mamíferos, existem dois principais grupos de cisteína proteases: as enzimas lisossomais catepsinas B, C, H, L e S, e as calpaínas citoplasmáticas. As catepsinas estão diretamente envolvidas na degradação final das proteínas intra-celulares, enquanto que as calpaínas parecem estar envolvidas tanto na ativação de fostatases e proteases intracelulares, quanto no remodelamento do citoesqueleto, o que possibilita o transporte intracelular de vesículas e a estabilização estrutural da estrutura celular (IUPAC-IUB, 2002).

2.3.2.4. Proteases aspárticas As proteases aspárticas foram as primeiras enzimas proteolíticas identificadas em mamíferos. Elas possuem, em sua maioria, uma única cadeia de aminoácidos, sendo dependentes da existência de dois ácidos aspárticos em seu sítio catalítico (TABELA 1) para a realização de sua atividade catalítica (DAVIES, 1990). Apesar de bastante estudado, o mecanismo catalítico exato das proteases aspárticas ainda não foi completamente elucidado (SZECSI, 1992). Dentre as principais proteases aspárticas enzimaticamente ativas

existentes em mamíferos, podem ser citadas as catepsinas D e E, a renina, a beta-secretase, a quimosina, a gastricsina e as pepsinas. As principais características das proteases aspárticas serão descritas a seguir. A catepsina D (CATD) é a principal protease presente nos lisossomos de mamíferos. Ela possui uma cadeia madura de 345 a 358 aminoácidos de comprimento, sendo constituída de uma cadeia leve e de uma pesada. Na espécie Gallus gallus , a catepsina D é a principal enzima envolvida na degradação de proteínas durante a formação do saco vitelino (SWISS- PROT, 2002). A catepsina (CATE) é uma protease aspártica intracelular com atividade catalítica bastante semelhante à da CATD. Ela encontra-se distribuída em células associadas ao sistema linfóide, possuindo uma única cadeia de 338 a 343 aminoácidos de comprimento dependendo da espécie (SWISS-PROT, 2002). A renina (RENI) é uma protease altamente específica, cuja única atividade catalítica consiste em clivar a ponte Leu-Leu do angiotensinogênio, presente na circulação periférica. Essa clivagem dá origem à angiotensina I, a qual, uma vez liberada, inicia a cascata de reações que produzem uma elevação da pressão sangüínea e uma maior retenção renal de sódio. A renina é sintetizada principalmente pelas células justaglomerulares dos rins e pelas glândulas submandibulares, possuindo, de acordo com a espécie, entre 331 e 361 aminoácidos de comprimento (SWISS-PROT, 2002). A beta-secretase (BACE) é a enzima responsável pela degradação da proteína precursora de amilóide (APP). Ela é a única protease aspártica associada a membranas conhecida até o momento, sendo expressa

exclusivamente no tecido cerebra (SWISS-PROT, 2002)l. A quimosina, a pepsina e a gastrina são sintetizadas sob a forma de zimogênios (proquimosina, pepsinogênio e progastricsina), os quais possuem pro-peptídeos N-terminais de aproximadamente 50 aminoácidos de comprimento. Estes pro-peptídeos são clivados quando da ativação dos zimogênios em pH ácido. A proquimosina (CHYM) é sintetizada pela mucosa do abomaso de ruminantes lactantes. Após ativada, ela hidrolisa a caseína para formar a paracaseína. Existem diversas variantes de proquimosina, sendo as mesmas compostas de formas de aproximadamente 323 aminoácidos. O pepsinogênio (PEP) é a principal protease produzida pela região fúndica do estômago de mamíferos adultos. Ele é ativado pelo ácido clorídrico presente no estômago do homem e de todas as espécies conhecidas de mamíferos, sendo composta, dependendo da espécie, por uma cadeia de 320 a 330 aminoácidos. A progastricsina, também conhecida como pepsinogênio C (PEPC), é produzida em todas as regiões da mucosa gástrica de mamíferos. Ela é mais específica do que a pepsina para a clivagem de proteínas, tendo como principal substrato a hemoglobina (SZECSI, 1992). Mais recentemente, uma nova família de proteases aspárticas foi identificada na placenta de mamíferos euterianos, sendo esta nova família denominada de glicoproteína associada à gestação (PAG). Os membros da família das PAGs podem ser considerados como cataliticamente inativos em sua maioria, tendo sido identificadas algumas formas cuja seqüência de aminoácidos ao nível de sítio catalítico poderia indicar uma possível atividade enzimática. As principais características das PAGs serão discutidas em detalhes na seção sobre proteínas de origem placentária.

2.3.3. Estrutura das proteases aspárticas A análise cristalográfica de proteases aspárticas mostrou que estas enzimas apresentam uma estrutura bilobulada, relativamente simétrica (FIGURA 5), possuindo duas regiões aproximadamente similares em torno de seus ácidos aspárticos situados no sítio catalítico (TANG et al. , 1978; GURUPRASAD et al. , 1996). Conforme sugerido por TANG et al. (1978), a existência de regiões topograficamente semelhantes no sítio catalítico resultaria de uma duplicação de um gene ancestral, o qual fusionou-se posteriormente originando cada um dos lobos desta proteína.

Protease Origem Catalí- Extremidade Extremidade Aspártica tica? Amino-terminal carboxi-terminal Pepsinogênio A Macaco Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser Progastricsina Homem Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser Pepsinogênio F Coelho Sim Leu Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser Pepsinogênio F Camundongo Sim Leu Asp T Gli Ser Ser Met Asp Tre Gli Tre Ser Proquimosina Bovino Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Leu Asp Tre Gli Tre Ser Renina Rato Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser

Catepsina D Homem Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser Catepsina E Homem Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser Beta-secretase Homem Sim Val Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Ser Gli Tre Tre

O sítio catalítico das proteases aspárticas possui entre 20 e 30 angstrons de comprimento, podendo acomodar peptídeos de até 7 resíduos.

A interação entre o sítio catalítico das proteases aspárticas e o substrato é favorecida pela formação de pontes de hidrogênio, sendo a especificidade o resultado da ação das forças de atração ou de repulsão entre os aminoácidos presentes no sítio catalítico e aqueles presentes nas cadeias laterais do substrato (DUNN et al. , 1995).

Resíduos hidrófobos

Cadeias laterais Asp e Glu

FIGURA 5 - Representação da distribuição de resíduos hidrófobos ao nível do sítio catalítico do pepsinogênio suíno. As cadeias laterais Asp e Glu estão representadas pela cor preta. Os resíduos hidrófobos, assim como os resíduos Ser, Tre, Asn e Gln estão representados pela cor cinza escura. Os resíduos situados fora do centro catalítico estão representados pela cor cinza clara. Adaptado de DUNN et al. (1995).

Diversas modificações pós-traducionais, tais como fosforilação e glicosilação, já foram descritas para as proteases aspárticas (SZECSI, 1992). A pepsina porcina, por exemplo, é fosforilada no resíduo de Serina 68 (Ser68), enquanto que a pepsina bovina e a e a catepsina D porcina são glicosiladas em resíduos de asparagina (Asp). Os mecanismos que

controlam as modificações pós-traducionais de uma dada proteína em uma determinada espécie ainda não foram completamente elucidados.

2.3.4. Inibição das proteases aspárticas As proteases aspárticas podem ser inibidas por substâncias normalmente existentes na natureza (UMEZAWA et al. , 1970), ou por inibidores sintetizados pelo homem (SZEWCZUK et al. , 1992). A pepstatina A consiste em um inibidor de proteases aspárticas. Ela foi inicialmente isolada como sendo uma substância produzida por microorganismos do gênero Streptomyces spp. , capaz de retardar o crescimento de seus competidores diretos por fontes nutritivas (UMEZAWA et al. , 1970). Posteriormente, a pepstatina A mostrou ser um eficiente inibidor de proteases aspárticas como a pepsina, denominando-se, por similaridade, pepstatina. Ela consiste em uma molécula de massa molecular 686 daltons, possuindo em sua estrutura um aminoácido raro chamado estatina, o qual corresponde ao ácido (3S,4S)-4-amino-3-hidroxi- 6-metilheptanóico (MORISHIMA et al. , 1972). A pepstatina A pode ser isolada no filtrado de culturas de Streptomyces testaceus, Streptomyces argenteolus e Streoptomyces parvisporogenes através do uso de solventes orgânicos ou pela absorção por carbono ativado UMEZAWA et al. (1970). Ela polimeriza-se espontaneamente formando filamentos cristalinos (MOTHES et al. , 1994) cujo ponto de fusão situa-se entre 228° e 229°C (MORISHIMA et al. , 1970). Diversos estudos demonstraram que a pepstatina inibe especificamente, além da pepsina, outras proteases aspárticas tais como as catepsinas D e E, a renina (MARCINISZYN et al. , 1977), bem como

proteases presentes nos vírus da leucemia bovino e humano (KATOH et al. , 1987). A interação entre a pepstatina A e a pepsina caracteriza-se pela alteração da conformação da pepsina, resultante do posicionamento de um dos oxigênios presentes na estatina entre os grupos carboxil situados entre os ácidos aspárticos 32 e 215 (Asp32 e Asp215), posição normalmente ocupada por uma molécula de água (FUJINAGA et al. , 1995). Por ser um inibidor reversível, a pepstatina pode ser considerada como o substrato de escolha para a purificação de proteases aspárticas por meio do uso de cromatografias de afinidade. Colunas de afinidade pepstatina A agarose já foram usadas para o isolamento da renina (DZAU et al. , 1979) e da catepsina D (AFTING & BECKER, 1981), não existindo informações precisas sobre seu uso para o isolamento de proteínas placentárias de ruminantes.

2.4. As Proteínas Placentárias 2.4.1. A placenta A placenta é um órgão transitório próprio aos mamíferos euterianos. Ela é uma estrutura única e especializada, podendo ser definida como a justaposição, ou fusão, das membranas fetais ao endométrio, permitindo a realização das trocas fisiológicas necessárias entre mãe e feto. Sua formação inicia-se no período embrionário, sendo observado, entretanto, um processo contínuo de remodelação ao longo da gestação, o que assegura uma perfeita adaptação das estruturas materna e fetal (BEACONSFIELD et al. , 1980). O desenvolvimento fetal está relacionado com o desenvolvimento da

placenta dos pontos de vista anatômico, endocrinológico e metabólico. No que diz respeito à função endócrina da placenta, esta inclui a síntese e secreção de vários hormônios e proteínas tais como a progesterona, os estrogêneos, as gonadotrofinas coriônicas, os hormônios lactogênios placentários (também designados por somatomamotrofinas coriônicas), as prolactinas, hormônios e fatores de crescimento, além de proteínas e glicoproteínas específicas ou associadas à gestação. Estas substâncias podem estar relacionadas ao estabelecimento da gestação, a manutenção do corpo lúteo, a tolerância imunitária do embrião/feto pela mãe, o metabolismo materno intermediário, o crescimento fetal e o desenvolvimento da glândula mamária.

2.4.1.1. Tipos de placenta As placentas podem ser classificadas de acordo com diferentes critérios, dentre os quais, os mais importantes relacionam-se com as características da barreira materno-fetal (estrutura histológica), com o padrão das vilosidades coriônicas (estrutura anatômica) e com o grau de perda de tecido por ocasião do parto (TABELA 2). a) Estrutura histológica Apesar de algumas imperfeições, a classificação dos diferentes tipos de placentas baseada na estrutura histológica ou, mais precisamente no número de camadas histológicas que separam a circulação fetal da circulação materna parece-nos ser a mais precisa. De acordo com este tipo de classificação, as placentas podem ser divididas em quatro tipos, a saber: epiteliocorial, sindesmocorial, endoteliocorial e hemocorial.

A placenta epiteliocorial é o tipo de placenta encontrada nos equídeos, suínos e em alguns ruminantes. Este tipo caracteriza-se pela presença de 6 camadas histológicas interpostas entre as circulações materna e fetal. Os componentes fetais encontrados neste tipo de placenta são o endotélio dos capilares coriônicos, o tecido conjuntivo fetal e o trofoblasto. Os componentes maternos consistem basicamente em três camadas: epitélio uterino, tecido conjuntivo uterino e endotélio dos capilares maternos (BJORKMAN, 1982). A placenta sinepiteliocorial é considerada por diversos autores como o tipo de placenta característico de ovinos e de algumas espécies de ruminantes selvagens. Ela caracteriza-se pela formação de um sincício materno-fetal resultante da migração e fusão das células coriônicas fetais com células do epitélio uterino (WOODING, 1992). Existem ainda dois tipos de placenta: endoteliocorial e hemocorial.

TABELA 2 - Classificação das placentas em diferentes espécies mamíferas.

Classificação

Espécies Barreiras Padrão das vilosidades Perda de tecido materno materno-fetais coriônicas à parturição

Porca Epiteliocorial Difusa Nenhuma (Não-deciduada)

Égua Epiteliocorial Microcotiledonária difusa Nenhuma (Não-deciduada)

Vaca, cabra Epiteliocorial Cotiledonária Nenhuma (Não-deciduada)

Ovelha Sinepiteliocorial Cotiledonária Nenhuma (Não-deciduada)

Gata, cadela Endoteliocorial Zonária Moderada (Deciduada)

Primatas Hemocorial Discóide Extensa (Deciduada)

A placenta endoteliocorial é o tipo de placenta encontrada nos carnívoros. Ela caracteriza-se pela exposição direta dos capilares maternos ao trofoblasto. A placenta hemocorial é o tipo de placenta característico da mulher, primatas e roedores. Ela caracteriza-se pelo contato direto entre o sangue materno e o trofoblasto (BJORKMAN, 1982). Conforme descrito por WOODING (1992), em bovinos, a placenta situa-se entre os tipos epiteliocorial e sinepiteliocorial. Nesta espécie, ao nível de microvilosidades, podem-se observar tanto a presença do epitélio uterino intacto, quanto a formação de um híbrido feto-materno formado pela migração e pela fusão das células binucleadas coriônicas com as células do epitélio uterino. b) Estrutura anatômica Anatomicamente as placentas são classificadas de acordo com a distribuição de vilosidades coriônicas na superfície do córion. De acordo com essa classificação, as placentas podem ser difusas ou localizadas. A placenta difusa é caracterizada pela distribuição uniforme de vilosidades na superfície do córion. As placentas localizadas podem ser cotiledonárias (ruminantes), zonárias (carnívoros) ou discóides (primatas e roedores). A placenta dos ruminantes é do tipo cotiledonário (FIGURA 6). Neste tipo de placenta, a fixação do embrião ocorre ao nível de um restrito número de regiões arredondadas ou ovais, chamadas carúnculas. O número de carúnculas varia segundo a espécie. Na vaca, são observados entre 70 e 150; na ovelha, entre 80 e 100 e, na cabra entre 160 e 180 (BJORKMAN, 1982). Apesar de pouco visíveis, as carúnculas podem ser identificadas em fêmeas nulíparas por ocasião da puberdade, sendo entretanto muito mais

visíveis em multíparas. As áreas intercarunculares (áreas de aposição) permanecem glandulares durante toda a gestação, sendo também chamadas paraplacenta (BJORKMAN, 1982).

FIGURA 6 - Placenta cotiledonária de bovinos no segundo trimestre de gestação. Notar os cotilédones fetais em toda a extensão da placenta.

c) Perda de tecido por ocasião do parto O tecido uterino encontra-se modificado em espécies que possuem placentas endoteliocorial e hemocorial, ocorrendo o descolamento de tecidos e hemorragia durante a parturição. As regiões uterinas desprendidas durante este processo são chamadas decídua, sendo as espécies que possuem estes tipos de placenta chamadas deciduadas. Em espécies que possuem placenta epiteliocorial, ao contrário, a parturição é facilmente

completada devido à estrutura histológica envolvida. Nestas espécies, a parturição envolve simplesmente a separação das duas partes apostas da placenta, não havendo, portanto, perda de tecido materno. Como o tecido uterino é preservado, as espécies que possuem este tipo de placenta denomina-se adeciduadas (BJORKMAN, 1982).

2.4.1.2. O placentoma O placentoma, estrutura de ligação materno-fetal de ruminantes, é formado pela inserção das vilosidades coriônicas nas criptas das carúnculas maternas. As carúnculas, verdadeiras projeções da mucosa uterina, constituem-se em pedículos centrais de tecido conjuntivo uterino, os quais ramificam-se progressivamente, formando uma extensa cadeia de criptas que se expandem em toda a espessura da massa caruncular, dando ao tecido uma aparência areolar (BJORKMAN, 1982). As vilosidades coriônicas consistem em cones mesenquimatosos vasculares, circundados por células trofoblásticas cubóides (KING et al., 1980) e por células gigantes binucleadas (WOODING & WATHES, 1980). Elas aumentam a área da junção materno-fetal ao penetrar profundamente nas criptas carunculares (KING et al. , 1980). Na fase inicial de formação dos placentomas, a membrana coriônica em expansão aproxima-se das regiões carunculares (KING et al. , 1981). Em seguida, as vilosidades coriônicas penetram nos canais pré-formados das criptas carunculares, expandindo-se em toda a sua extensão até que suas extremidades alcancem a base das carúnculas, onde uma densa camada separa a massa caruncular do endométrio glandular ruminantes (HRADECKY et al., 1988). São formadas assim as interdigitações

características dos placentomas de ruminantes. O tamanho, formato e estrutura dos placentomas sofre uma série de modificações no decorrer da gestação, sendo seu desenvolvimento normalmente caracterizado pelo aumento em seu comprimento, diâmetro e grau de ramificação das vilosidades coriônicas (KING et al. , 1979). O desenvolvimento dos primeiros placentomas no útero de fêmeas gestantes ocorre na curvatura dorsal uterina, próximo à fixação ao mesométrio. Estes placentomas são os maiores observados durante todo o decorrer da gestação. Os menores e mais jovens placentomas situam-se nas extremidades dos cornos uterinos (HRADECKY et al. , 1988).

2.4.1.3. As células binucleadas O elemento mais característico da placenta dos ruminantes é a presença de células binucleadas no trofoblasto (WIMSATT, 1951). Estas células inicialmente descritas por ASSHETON em 1906, têm sido objeto de inúmeras investigações nas últimas cinco décadas (DRIEUX & THIERY, 1951; AMOROSO, 1952; WOODING & WHATHES, 1980; KLISCH et al., 1999). As células binucleadas derivam das células coriônicas mononucleadas por cariocinese sem subsequente citocinese. As células mais jovens são localizadas profundamente na trofoderme e a sua maturação é feita progressivamente quando de sua migração em direção à superfície materna (WOODING, 1983). As primeiras células binucleadas aparecem imediatamente antes da implantação (WANGO et al., 1990a), podendo ser reconhecidas a partir de 14 dias após a fertilização nos ovinos (WOODING, 1984) e a partir do dia 17-18 nos bovinos (KING et al. , 1980; WATHES & WOODING, 1980).

As células binucleadas representam 15-20 % do total da população celular placentária (WOODING, 1983; WOODING et al. , 1986; WANGO et al. , 1990b). Cerca de uma em sete migram em direção ao epitélio uterino, fenômeno este observado ao longo de todo o período gestacional (WOODING et al., 1996). A migração das células binucleadas representa um papel importante na remodelação da estrutura da placenta, podendo resultar na formação de células trinucleadas de vida curta em bovinos (WOODING & BECKERS, 1987) (FIGURA 7) ou na formação de extensas placas sinciciais em ovinos (WOODING, 1992).

No que diz respeito à sua função endócrina, no início da década de 40 suspeitou-se que a presença de células especiais da placenta dos ruminantes estaria relacionada à produção de hormônios essenciais à manutenção da gestação. Nesta década foi provada pela primeira vez que vacas permaneciam gestantes mesmo com atividade hipofisária reduzida, tendo sido sugerido que as gonadotrofinas sintetizadas pela hipófise fossem substituídas por hormônios produzidos num outro órgão qualquer. Em 1952 e 1954, respectivamente WEETH & HERMAN e BJÖRKMAN usando micro-seções de cotilédones coradas com o ácido periódico de Schiff (PAS), descreveram a presença de numerosas células trofoblásticas contendo glicoproteínas. Cerca de 10 anos mais tarde, FOOTE & KAUSHIK (1963) demonstraram a presença de atividade do tipo LH em cotilédones bovinos. Estes estudos foram pioneiros neste campo, abrindo o caminho para a futura identificação e caracterização de hormônios e proteínas sintetizadas pela placenta dos ruminantes. Atualmente é bem conhecido que as células binucleadas estão diretamente envolvidas na produção de progesterona (WANGO et al. , 1991; WANGO et al., 1992; WOODING et al., 1996), prostaglandinas (REIMERS et al. , 1985a), hormônios lactogênios placentários (VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al. , 1992) e proteínas específicas ou associadas à gestação (REIMERS et al., 1985b; GOGOLIN- EWENS et al. , 1986; MORGAN et al. , 1989; ZOLI et al. , 1992b; ATKINSON et al., 1993). Estas substâncias, antes de ser secretadas, são armazenadas em grânulos densos (FIGURA 8), os quais podem ocupar mais de 50 % do citoplasma das células binucleadas (LEE et al. , 1986).

2.4.2. Proteínas Placentárias Como órgão endócrino, a placenta sintetiza uma grande variedade de substâncias biologicamente ativas, das quais a maior parte é de origem protéica (BOHN, 1985). As substâncias produzidas pela placenta, na maioria dos casos, são idênticas a produtos sintetizados pelos tecidos normais de indivíduos adultos. Em outros casos, entretanto, estes compostos são considerados como substâncias específicas à gestação, não possuindo similares detectáveis em indivíduos não-gestantes (GORDON & CHARD, 1979). No que diz respeito à realização de pesquisas fundamentais sobre as proteínas placentárias, diversas equipes têm investigado suas características físico-químicas assim como suas funções no organismo materno. No que diz respeito às suas funções, é sabido, por exemplo, que nos primatas e na égua, uma gonadotrofina coriônica permite a manutenção do corpo lúteo (ASCHHEIM, 1927), enquanto que nas espécies ruminantes, essa manutenção é assegurada por um fator anti-luteolítico chamado interferon tau (MARTAL et al. , 1979). Além de fator anti-luteolítico, o interferon tau funciona ainda como um fator estimulante da síntese da progesterona. Em adição a estas ações, esta proteína parece também exercer uma função importante, principalmente nas primeiras etapas da gestação, na tolerância imunológica do embrião/feto pela mãe (FILLION et al. , 1991; MARTAL et al. , 1997). Num estado mais avançado da gestação, a placenta sintetiza as proteínas associadas à gestação (ZOLI et al. , 1992a), assim como hormônios lactogênios placentários, os quais são responsáveis pela estimulação da atividade mamogênica (FORSYTH, 1986), estando também

envolvidos, ao menos parcialmente, no crescimento fetal (CHENE et al. , 1988) e no metabolismo materno (FREEMARK et al. , 1992).

Na prática, a partir do momento em que podem ser detectadas na circulação materna, as proteínas placentárias constituem-se em um excelente indicador do bem-estar da unidade feto-placentária, sendo utilizadas correntemente em testes de diagnóstico de gestação e de estudo da mortalidade embrionária.

2.4.2.1. Gonadotrofinas coriônicas (CG)

As espécies humana e eqüina, há muito tempo, são conhecidas como produtoras, ao nível placentário, de hormônios gonadotróficos. Já em 1927, ASCHHEIM relatou a presença de um fator gonadotrófico na urina da mulher grávida, baseando neste fato o seu famoso método de detecção de gravidez (ASCHHEIM & ZONDEK, 1928a,b). Dois anos mais tarde, COLE & HART (1930) demonstraram a existência de uma atividade gonadotrófica no soro de éguas gestantes. Devido à suas propriedades gonadotróficas, a estas substâncias foram dados os nomes de gonadotrofina coriônica humana (hCG) e gonadotrofina coriônica eqüina (eCG), também conhecida por gonadotrofina sérica da égua prenhe (PMSG). a) Gonadotrofina coriônica humana O hCG é uma glicoproteína com uma massa molecular aparente de 38,4 kDa e pI situado entre 3,8 e 5,1. Ele é composto de duas subunidades não-covalentemente ligadas ( α e β). A subunidade α compreende uma cadeia peptídica de 92 aminoácidos (BELLISARIO et al. , 1973), possuindo duas cadeias laterais de oligossacarídeos ligados aos resíduos 52 e 78 (Asn- 52 e Asn-78). Esta subunidade é similar às subunidades α do LH porcino, ovino e humano. A subunidade β do hCG possui 145 aminoácidos

(CARLSEN et al. , 1973), dos quais 115 são idênticos à subunidade β do LH humano, possuindo ainda 30 aminoácidos adicionais localizados na extremidade carboxiterminal da seqüência (LENTZ et al. , 1984). A subunidade β do hCG contém diversas cadeias laterais de carboidratos ligadas tanto à serinas (Ser-118 ou Ser-119 e Ser-131) quanto à asparaginas (Asn-13 e Asn-30) (RAMABHADRAN et al. , 1984). Na mulher, a síntese de hCG inicia-se aproximadamente no 8 o dia após o pique pré-ovulatório de LH (MISHELL et al ., 1974), aumentando continuamente durante os três primeiros meses de gestação, para em seguida, decrescer e manter-se em baixos níveis até o parto. A meia-vida do hCG, estimada em 8 horas, é consideravelmente superior àquela estimada para o LH (12 a 50 minutos), o que se deve provavelmente à seu alto conteúdo em ácido siálico (BOHN, 1985). b) Gonadotrofina coriônica eqüina O eCG ou PMSG é a gonadotrofina coriônica específica da égua. Ele consiste em uma glicoproteína de massa molecular aparente de 45 kDa (COMBARNOUS et al. , 1981). Assim como o hCG, o eCG é composto por duas subunidades ( α e β), sendo a associação destas subunidades essencial para a sua atividade biológica. Ele é secretado pelas células trofoblásticas presentes nos cálices endometriais (ALLEN & MOOR, 1972) a partir do 32 o dia de gestação (WOODING et al. , 2001), sendo seu pique alcançado entre o 50 o e 70 o dias (MARTINUK et al. , 1990). Ao contrário do observado para o hCG, a secreção de eCG ocorre somente durante o primeiro trimestre de gestação, não sendo o mesmo detectável próximo à parturição.

c) Gonadotrofina coriônica em ruminantes A existência de uma atividade do tipo LH em extratos cotiledonários fetais de espécies ruminantes foi descrita durante anos por diversos grupos de pesquisa (FOSTER, 1956; FOOTE & KAUSHIK, 1963; AILENBERG & SHEMESH, 1983; BECKERS et al. , 1988). Entretanto, apesar de inúmeras tentativas, não foi possível isolar-se e caracterizar a seqüência de aminoácidos N-terminal da(s) molécula(s) teoricamente responsável(is) pela atividade gonadotrófica observada nestas espécies. A questão da existência ou não de uma substância gonadotrófica na placenta de bovinos somente foi parcialmente elucidada em 1994 por XIE et al. , os quais demonstraram que o ADN complementar correspondente à «gonadotrofina coriônica» isolada em bovinos por BECKERS et al. (1988) correspondia, na verdade, a uma nova forma de proteína associada à gestação, pertencente à superfamília das proteases aspárticas, sendo a mesma distinta das seqüências descritas para o hCG e eCG. Uma outra resposta a esta questão foi dada por NILSON et al. (1991), os quais demostraram que a expressão do gene codificante da subunidade α, essencial à atividade luteotrópica do LH e das CGs, seria possível no tecido hipofisário de todas as espécies de mamíferos, mas restrita às placentas de eqüinos e primatas. Com base em ambos argumentos, foi sugerido recentemente que a atividade coriônica detectada previamente em extratos placentários de bovinos pelo uso de radioreceptores do tipo LH, seria devida a uma ativação não-específica dos receptores, e não à existência de gonadotrofinas coriônicas nesta espécie (BECKERS et al. , 1994). Uma ativação inespecífica de receptores do tipo LH/hCG foi previamente demonstrada

para a quimotripsina, uma serina protease expressa no intestino de mamíferos (WILLEY & LEINDENBERGER, 1989)

2.4.2.2. Interferons tau (IFN τττ) Nas espécies bovina, ovina e caprina, a transformação do corpo lúteo cíclico em gestacional é induzida pela ação de um fator protéico sintetizado pelo concepto próximo à sua implantação. Este fator, o qual foi inicialmente denominado trofoblastina (MARTAL et al., 1979) ou proteína trofoblástica (GODKIN et al. , 1984), foi recentemente caracterizado como pertencente a uma subclasse distinta da família do interferon alfa, ao qual se designou interferon tau (IFN τ) (CHARPIGNY et al. , 1988; ROBERTS et al. , 1992). Os primeiros estudos que demonstraram a presença de um fator anti- luteolítico produzido pelo concepto de ruminantes foram realizados por MOOR & ROWSON (1966), os quais transferiram embriões ovinos de 14 a 16 dias a fêmeas não-gestantes antes do 12 o dia do ciclo estral, observando a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual. No ano seguinte, os mesmos autores homogeneizaram embriões ovinos de 14 a 16 dias e injetaram o homogenato no útero de ovelhas receptoras antes do 12 o dia do ciclo sexual, obtendo-se resultados idênticos, ou seja, a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual. Este fenômeno não foi contudo observado quando os embriões usados tinham entre 21-23 dias de idade (ROWSON & MOOR, 1967). O IFN τ, sinal de reconhecimento da gestação em espécies ruminantes, consiste em um hormônio anti-luteolítico parácrino que age no epitélio uterino para inibir a liberação de PGF 2α, assegurando desta forma a

manutenção de um corpo lúteo funcional.

a) Interferon tau bovino A existência de uma proteína produzida pelo trofoblasto de conceptos bovinos capaz de prolongar a vida do corpo lúteo, foi descrita pela primeira vez por NORTHEY & FRENCH em 1980. Eles injetaram o homogeneizado de extratos de embriões bovinos de 17 a 19 dias à fêmeas receptoras durante os primeiros 16 dias do ciclo estral, impedindo assim a regressão do corpo lúteo. O interferon tau bovino (bIFN τ) demonstrou ter atividade luteotrófica, sendo capaz de estimular a síntese de progesterona em células luteínicas (BEAL et al. , 1981; HICKEY & HANSEL, 1987). Conforme revisado por HANSEN et al. (1999), o IFN τ interage com receptores endometriais provavelmente através dos receptores para o interferon do tipo I, inibindo a expressão dos receptores para estradiol e prevenindo assim o aumento da expressão de receptores para ocitocina estrógeno-dependentes. Esta inibição, associada à ativação do inibidor da ciclo-oxigenase, resulta na supressão da liberação pulsátil de PGF 2α pelo útero assim como no favorecimento da síntese de PGE (ASSELIN et al. , 1997; XIAO et al.; 1999). Duas formas de IFN τ bovino (bIFN τ-1 e bIFN τ-2) foram isoladas por HELMER et al. (1987, 1988) a partir do cultivo de células trofoblásticas provenientes de conceptos bovinos de 17 a 18 dias. Essas proteínas possuíam massas moleculares de 22 e 24 kDa e pontos isoelétricos de 6,5 e 6,7, respectivamente. Conforme descrito por HELMER et al. (1988), a forma de 24 kDa constitui-se em uma glicoproteína complexa, enquanto

que a forma de 22 kDa constitui-se em uma glicoproteína simples, rica em manose. Recentemente, uma terceira classe de IFN τ bovino foi descrita em conceptos de bovinos (bIFN τ-3), sendo a mesma expressa sob a forma de 5 variantes (LARSON et al. , 2001). Os interferons tau bovinos são exclusivamente expressos em células mononucleadas do trofoblasto (MORGAN et al. , 1993). Eles são os principais produtos secretados pelo concepto bovino entre os dias 16 e 25 após a fecundação (HELMER et al. , 1987), sendo constituídos de cadeias de aminoácidos glicosiladas de 172 a 195 resíduos (IMAKAWA et al. , 1989; LARSON et al. , 1999). Quando comparadas entre si, a seqüência de aminoácidos do boIFN τ-1 apresenta uma identidade de 98,26 % com o bIFN τ-2 e de 97,67 % com o bIFN τ-3. Apesar de serem um importante produto de secreção, o interferon τ bovino é liberado localmente no lúmen uterino, não podendo ser detectado na circulação periférica materna.

b) Interferon tau ovino O interferon tau ovino (oIFN τ) foi purificado inicialmente por GODKIN et al. (1982) a partir de blastocistos ovinos de 13 a 21 dias. Ele possui uma massa molecular de 17 kDa e um ponto isoelétrico de 5,5, sendo produzido pelas células trofoblásticas entre o 12 o e o 21 o dias de gestação (MARTAL et al. , 1979). Sua secreção máxima ocorre entre o 15 o e 16 o dias de gestação, período que corresponde à implantação (ROBERTS et al. , 1992). A administração de oIFN τ no útero de ovelhas entre o 10 o e o 12 o dias do ciclo estral prolonga a vida do corpo lúteo em dias e até meses (MARTAL et al. , 1979; ELLINWOOD et al. , 1979; HEYMAN et al. ,

1984; HARIDON et al. , 1995), sendo seu mecanismo de ação provavelmente relacionado ao mecanismo previamente descrito em bovinos. Até o presente, foram identificados 11 genes codificantes para diferentes IFN τ ovinos (oIFN τ-1 a oIFN τ-11) (IMAKAWA et al. , 1987; STEWART et al. , 1989; KLEMANN et al. , 1990; LEAMAN & ROBERTS, 1992; NEPHEW et al. , 1993), os quais codificam proteínas com seqüências bastante similares, mas com diferentes atividades biológicas e padrões de expressão (WINKELMAN et al. , 1999).

c) Interferon tau caprino A existência de uma proteína de massa molecular de 17 kDa, capaz de prolongar a vida do corpo lúteo caprino foi verificada inicialmente por GNATEK et al. (1989). Recentemente, uma outra forma de IFN τ caprino (cIFN τ) de massa molecular 22-24 kDa foi purificada e sequenciada em sua extremidade N-terminal, sendo ambas as formas correspondentes a uma mesma seqüência de aminoácidos (GUILLOMOT et al. , 1998). Segundo descrito por LEAMAN & ROBERTS (1992), o caIFN τ é constituído por uma seqüência de 195 aminoácidos, possuindo uma seqüência sinal de 23 aminoácidos e uma cadeia madura de 172 aminoácidos. Conforme sugerido por GUILLOMOT et al. (1998), o cIFN τ é expresso no 17 o dia de gestação, não sendo entretanto detectado a partir do 18 o dia de gestação, o que indicaria a existência de outros fatores luteotróficos responsáveis pela manutenção do corpo lúteo nesta espécie.

2.4.2.3. Factor Precoce de Gestação (EPF) Apesar da existência de um fator precoce produzido pelo embrião logo após a fecundação ser contestada por alguns especialistas em endocrinologia placentária, julgamos necessária sua menção na presente revisão sobre proteínas placentárias devido ao caráter histórico deste estudo. Os primeiro artigo descrevendo a existência de um fator precoce de gestação (Early Pregnancy Factor ou EPF) foi publicado por MORTON et al. em 1974. Este ‘fator’ foi descrito como uma substância detectável no soro de camundongas prenhas durante as primeiras horas após a fecundação. A detecção do EPF somente foi possível pela utilização do teste da inibição de rosetas, uma técnica imunológica baseada na capacidade de algumas substâncias em inibir o ataque de hemácias provenientes de um animal, pelos linfócitos provenientes de um outro indivíduo. Apesar de ser usado ainda hoje para a detecção do EPF (CRUZ et al. , 2001), este teste é bastante inespecífico, podendo ter seus resultados alterados por outros fatores tais como a presença de substâncias imuno- supressoras nas amostras a serem testadas. Pelo uso do teste de inibição de roseta, foi possível a identificação do EPF na circulação periférica materna das espécies murina ( Mus musculus ), humana ( Homo sapiens ), ovina ( Ovis aries ), bovina ( Bos taurus ), porcina (Sus scrofa ), leporina ( Oryctogalus cuniculus ), eqüina ( Equus caballus ), assim como em camundongos marsupiais ( Sminthopsus macroura ) (MORTON et al. , 1974,1977,1979; NANCARROW & WALLACE, 1980; MORTON et al. , 1983; SUEOKA et al. , 1989; TAKAGI et al. , 1998; CRUZ et al. , 2001).

Apesar da precocidade atribuída à detecção do EPF pelo teste de inibição da roseta, a dificuldade na execução deste teste (KOCH et al. , 1983) e as relativamente baixas sensibilidade e especificidade obtidas pelo uso deste método colocou em dúvida sua fiabilidade como método de diagnóstico de gestação (CHAOUAT & MENU, 1993). A questão da existência ou não de um fator precoce de gestação produzido pelo embrião somente foi parcialmente esclarecida recentemente por CAVAGNAGH & MORTON (1994) os quais caracterizaram o EPF como sendo uma chaperonina 10. Segundo esses autores, a chaperonina 10 poderia ser a molécula responsável pela inibição da formação de rosetas, e por conseqüência, possuidora de uma forte ação imunosupressora local (MORTON et al., 1992; MORTON, 1998).

2.4.2.4. Hormônios lactogênios placentários (PL) Os hormônios lactogênios placentários (PL), também conhecidos por somatomamotrofinas coriônicas (CS), são hormônios protéicos possuidores de uma conformação estrutural e funcional bastante semelhante à do hormônio de crescimento e da prolactina. A função dos hormônios lactogênios placentários varia de acordo com a espécie. Em geral foi sugerido que estes hormônios influenciam a mamogênese e a lactogênese (FORSYTH, 1986; BUTTLE et al. , 1972), a esteroidogênese ovariana (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al., 1998) e placentária (DEAYTON et al., 1993), o crescimento fetal (CHENE et al., 1988), alterando ainda o metabolismo materno para se adaptar ao do feto, contribuindo desta forma para o crescimento e desenvolvimento fetal (FREEMARK et al. , 1992).

a) Hormônio lactogênio placentário bovino Estudos relacionados aos hormônios lactogênios placentários precederam os trabalhos envolvendo as proteínas específicas ou associadas à gestação em ruminantes domésticos. Em bovinos, a atividade lactogênica dos cotilédones foi primeiramente demonstrada por BUTTLE & FORSYTH (1976). Este estudo pioneiro foi efetuado recorrendo ao uso de uma co-cultura de células do tecido mamário de rata e de tecido cotiledonário de vaca em diferentes estádios de gestação, durante um período de 5 dias. Com este trabalho, foi obtida uma substância lactogênica com atividade equivalente a cerca de 300 ng de prolactina bovina. Purificações realizadas ao mesmo tempo a partir do uso de placentas bovinas por várias equipes de investigação (BOLANDER & FELLOWS, 1976; BECKERS et al. , 1980; MURTHY et al. , 1982) permitiram a identificação de uma proteína com atividade somatomamotrópica, denominada mais tarde de somatomamotrofina coriônica bovina (bCS). O hormônio lactogênio placentário bovino (bPL) existe em várias isoformas com diferentes massas moleculares (32 a 34 kDa) e pontos isoelétricos (4,0 a 6,0) (MURTHY et al. , 1982). Ele possui aproximadamente 48 % de identidade com a prolactina (PRL) e 26 a 28 % com o hormônio do crescimento (GH). Entretanto, como sugerido por BECKERS (1983), nenhuma reação cruzada pôde ser observada entre esses 3 hormônios por radioimunoensaio. O bPL é produzido pelas células coriônicas binucleadas (VERSTEGEN et al. , 1985; KAPES et al. , 1992), as quais secretam o conteúdo de seus grânulos na circulação materna após sua migração e fusão com células do epitélio endometrial (BECKERS, 1983). Em contraste com

outros hormônios lactogênios placentários, o PL é uma glicoproteína que contém sítios cadeias laterais de carboidratos ligadas à asparagina (SHIMOMURA & BREMEL, 1988; BYATT et al. , 1987). Esta composição glicoprotéica, característica também de outras proteínas placentárias tais como a PAG pode resultar de um mecanismo pós- traducional altamente desenvolvido existente nas células gigantes do trofoblasto de bovinos. O bPL é detectado na circulação materna a partir do quarto mês de gestação (BECKERS, 1983) mas a sua concentração permanece inferior a 2 ng/ml durante a gestação (FIGURA 9). Na circulação periférica do feto a concentração de bPL é mais elevada (5-25 ng/ml) e apresenta um declínio com o avanço da gestação (BECKERS et al. , 1982; BYATT et al., 1987). Estas concentrações fetais superiores às maternas são bastante diferentes das observadas para a PAG bovina, apesar da co-localização de ambas as proteínas placentárias nas mesmas células. b) Hormônio lactogênio placentário ovino O hormônio lactogênio placentário ovino (oPL) é uma holoproteína de massa molecular 22 kDa e pontos isoelétricos entre 6,8 e 8,8 (CHAN et al. , 1976), secretada pelas células binucleadas de ovelhas gestantes (WOODING, 1981). Ele é sintetizado a partir do 16 o dia de gestação (REDDY & WATKINS, 1978), somente sendo detectado na circulação periférica materna a partir do 48 o dia de gestação. Seus níveis séricos aumentam gradativamente para alcançar um pique entre o 131 o e 141 o dias de gestação (CHAN et al. , 1978).

FIGURA 9 - Perfil das concentrações plasmáticas do hormônio lactogênio placentário bovino dosado na circulação materna e fetal. Adaptado de BECKERS et al. (1982).

O oPL possui uma cadeia de 198 aminoácidos, apresentando uma identidade de 69 % com o bPL, de 52 % com o oPRL e de 28 % com o oGH (COLOSI et al. , 1989). Ele parece estar envolvido no metabolismo intermediário materno e no desenvolvimento mamário e fetal (FREEMARK et al. , 1992). c) Hormônio lactogênio placentário caprino O hormônio lactogênio placentário caprino (cPL) foi o primeiro hormônio lactogênio placentário identificado em ruminantes (BUTTLE et

al. , 1972), tendo sido purificado até a homogeneidade por CURRIE et al. (1990). Ele é uma proteína de massa molecular 22,5 kDa e ponto isoelétrico 8,35, sendo detectável na circulação periférica materna a partir do 44 o dia de gestação. As concentrações de cPL aumentam continuamente durante a gestação até uma semana antes do parto (CARD et al. , 1988). Uma correlação positiva entre o número de fetos e a concentração plasmática de cPL foi observada no terço final da gestação (HAYDEN et al. , 1979; HAYDEN et al. , 1980; CARD et al. , 1988).

2.4.2.5. Proteínas específicas ou associadas à gestação (PAGs) Caracterizadas nos últimos 20 anos, as PAGs constituem uma grande família de glicoproteínas expressas por células mononucleadas ou binucleadas da placenta de espécies unguladas (GREEN et al. , 2000; GARBAYO et al. , 2000). Elas apresentam um grau de identidade variável entre suas seqüências de aminoácidos, possuindo uma identidade superior a 50 % com a seqüência da pepsina, catepsinas D e E e renina (XIE et al. , 1991), o que as classifica como pertencentes à superfamília das proteases aspárticas (GURUPRASAD et al. , 1996; HUGHES et al. , 2000). Apesar da forte identidade observada com enzimas cataliticamente ativas, a maior parte das PAGs identificadas até o presente constituem-se em formas enzimaticamente inativas. Isto se deve, provavelmente, à substituição de alguns aminoácidos em regiões críticas de seus sítios catalíticos (GURUPRASAD et al. , 1996). Diversas formas de PAG foram purificadas a partir da placenta das taurinos (BUTLER et al. , 1982; CAMOUS et al. , 1988; ZOLI et al. , 1991), ovinos (ZOLI et al. , 1995; XIE et al. , 1997a), caprinos (GARBAYO et al. ,

1998), e de cervídeos (HUANG et al. , 1999), sendo possível verificar a expressão de ADN codificantes para novos membros da família das PAGs em placentas de suínos (SZAFRANSKA et al. , 1995), zebras (GAN et al. , 1997), eqüinos (GREEN et al. , 1998), felinos (GREEN et al. , 1998) e camundongos (CHEN et al. , 2001). Após terem sido isoladas, algumas proteínas da família das PAGs foram usadas para imunizar coelhos e o anti- soro obtido permitiu o desenvolvimento de ensaios radioimunológicos homólogos (ZOLI et al. , 1992a) e heterólogos (RANILLA et al., 1994; GONZALEZ et al., 1999) para a detecção de PAG no soro sangüíneo (ZOLI et al. , 1992a), plasma (PATEL et al. , 1997) ou leite (GONZALEZ et al., 2001) de diferentes espécies de mamíferos euterianos (TABELA 3). A dosagem radioimunológica da PAG representa atualmente um ótimo método de diagnóstico de gestação bem como de estudo da função do trofoblasto, podendo auxiliar no manejo da reprodução bem como na investigação dos diferentes aspectos patológicos que possam afetar a gestação (ZARROUK et al., 1999a,b; DOBSON et al. , 1993). a) Família das PAGs bovinas (boPAGs) As PAGs, também conhecidas por diversos outros nomes como proteína específica da gestação B (PSPB) (BUTLER et al., 1982), antígeno SBU-3 (GOGOLIN-EWENS et al. , 1986) e proteína sérica da gestação 60 kDa (PSP-60) (MIALON et al. , 1993) foram inicialmente descritas como antígenos placentários, detectáveis no sangue materno do bovinos logo após o início da implantação (BUTLER et al. , 1982). A metodologia empregada por ZOLI et al. (1991) para a purificação da PAG foi bastante similar à metodologia previamente empregada por

TABELA 3 - Identificação de proteínas específicas ou associadas à gestação em mamíferos euterianos.

Espécie Detecção na circulação Caracterização bioquímica Identificação por biologia materna ou no leite molecular Bovina ( Bos taurus ) SASSER et al. , 1986, 1989 BUTLER et al. 1982 XIE et al. , 1991, 1994, HUMBLOT et al. , 1988a,b CAMOUS et al. , 1988 1997b ZOLI et al. , 1992a ZOLI et al. , 1991 GREEN et al. , 2000 DOBSON et al. , 1993 MIALON et al. , 1993 PATEL et al. , 1997 Ovina ( Ovis aries ) RANILLA et al. , 1994, 1997 ATKINSON et al. , 1993 XIE et al. , 1991, 1997a,b GAJEWSKI et al. , 1999 ZOLI et al. , 1995 WILLARD et al. , 1995 XIE et al. , 1997a Caprina ( Capra hircus ) HUMBLOT et al. , 1990 GARBAYO et al. , 1998 GARBAYO et al. , 2000 FOLCH et al. , 1993 SOUSA et al. , 1999 GONZÁLEZ et al. , 2000, 2001

Bovidae BATALHA et al. , 2001 Ibex espanhola FERNÁNDEZ-ARIAS et al. , - - (Capra pyrenaica) 1999 Cabrito montês HOUSTON et al. , 1986 - - (Oreamnos americanus ) Boi almiscarado ROWELL et al. , 1989 - - (Ovibus moschatus ) Bisão americano HAIGH et al. , 1991 - - (Bison bison ) Búfalo asiático DEBENEDETTI et al. , 2001 - - (Bubalus bubalis ) Alce ( Alces alces ) HAIGH et al. , 1993 HUANG et al. , 1999 - HUANG et al. , 2000 Veado nobre HAIGH et al. , 1988 HUANG et al. , 1999 - (Cervus elephus ) WILLARD et al. , 1994b HUANG et al. , 2000 Veado orelhudo WOOD et al. , 1986 - - (Odocoileus hemionus ) Veado da cauda branca WOOD et al. , 1986 - -

Cervidae (Odocoileus OSBORN et al. , 1996 virginianus ) Sika ( Cervus nippon ) WILLARD et al. , 1994a - - Gamo ( Dama dama ) WILLARD et al. , 1994c - - Rena RUSSEL et al. , 1998 - - (Rangifer tarandus ) ROPSTAD et al. , 1999 Eqüina ( Equus - - GAN et al. , 1997 caballus ) GREEN et al. , 1999 Zebra ( Equus zebra ) - - GAN et al. , 1997

Equidae GREEN et al. , 1998 Felina ( Felis - - GAN et al. , 1997 domestica ) Felidae Porcina ( Sus scrofa ) - BAUMBACH et al. , 1988 SZAFRANSKA et al. , DORÉ et al. , 1996 1995, 2001 Suidaee

BUTLER et al. em 1982. Resumidamente, após a produção de anti-soros de primeira geração, obtidos pela imunização de coelhos contra extratos placentários bovinos, estes foram imuno-adsorvidos contra as proteínas majoritárias presentes em fêmeas não gestantes. O antisoro clarificado assim obtido foi em seguida utilizado para o monitoramento das frações mais imunoreativas ao longo do protocolo de purificação, o qual incluiu a extração de proteínas solúveis, seguida de precipitações ácida e por sulfato de amônia, gel filtrações e cromatografia de troca de íons. O antisoro obtido por BUTLER et al. (1982) permitiu a purificação parcial de dois antígenos: a proteína específica da gestação A (PSPA) e a proteína específica da gestação B (PSPB). A PSPA foi identificada como sendo uma alfa-fetoproteína, a qual é encontrada na circulação de fêmeas não-gestantes, enquanto que a PSPB foi identificada como uma proteína específica da placenta, expressa sob a forma de diferentes massas moleculares (47 a 53 kDa) e pontos isoelétricos (4,0 a 4,4). Contrariamente à diversidade de massas moleculares obtidas por BUTLER et al. (1982), uma única proteína majoritária de massa molecular 67 kDa foi obtida por ZOLI et al. (1991), apresentando a mesma 4 pontos isoelétricos. Diferentes moléculas da família das PAGs foram identificadas e denominadas de modo arbitrário até a presente data. As principais formas isoladas por procedimentos bioquímicos ou por técnicas de biologia molecular serão descritas a seguir.

➾➾➾ boPAG-1

A boPAG 67 , também conhecida como boPAG-1, foi purificada por ZOLI et al. em 1991 e caracterizada em toda a sua seqüência de

aminoácidos por XIE et al. em 1991 (FIGURA 10). Ela demonstrou ser uma proteína ácida de 380 aminoácidos, de massa molecular 67 kDa, e com quatro isoformas (I, II, III e IV) as quais diferem em pontos isoelétricos (4,4; 4,6; 5,2 e 5,4). A quantidade de ácido siálico (2,12 %, 0,83 %, 0,64 % e 0,29 %) de cada uma das isoformas está diretamente relacionada com seus pontos isoelétricos e com sua imunoreatividade (ZOLI et al. , 1991). Estudos imunocitoquímicos permitiram detectar a boPAG-1 predominantemente no citoplasma de células binucleadas presentes nos tecidos dos cotilédones (ZOLI et al., 1992b). A presença de antígenos imunologicamente idênticos à boPAG-1 foram também encontrados em extratos de ovários e testículos (ZOLI et al., 1990), o que justifica o adjetivo associadas e não específicas atribuídas à PAG. O fato mais surpreendente da boPAG-1 após a sua purificação foi a descoberta de que esta proteína pertence à uma família de enzimas proteolíticas (XIE et al. , 1995), as quais são conhecidas como proteases aspárticas, possuindo uma grande identidade em aminoácidos com as seqüências da pepsina, da catepsina D e da catepsina E (XIE et al. , 1991). A boPAG-1 conservou a estrutura bilobulada característica de todas as proteases aspárticas caracterizadas até o presente em eucariotas (FIGURA 11). Ela possui uma fenda entre os lobos capaz de acomodar peptídeos de até 7 aminoácidos de comprimento (GURUPRASAD et al. , 1996). Contudo, apesar de sua similaridade estrutural com outras proteases aspárticas (GURUPRASAD et al. , 1996), a maioria das PAGs são consideradas como moléculas cataliticalmente inativas devido às mutações em seu sítio ativo XIE et al. (1991) (TABELA 4).

1 11 Met Lis Trp Leu Val Leu Leu Gli Leu Val Ala Fen Ser Glu Cis Ile Val Lis Ile Pro Sinal Propeptídeo 21 31 Leu Arg Arg Leu Lis Tre Met Arg Asn Val Val Ser Gli Lis Asn Met Leu Asn Asn Fen Propeptídeo 41 51 * Leu Lis Glu His Ala Tir Ser Leu Ser Gln Ile Ser Fen Arg Gli Ser Asn Leu Tre Tre Propeptídeo Sequência N-terminal 61 71 * His Pro Leu Arg Asn Ile Lis Asp Leu Val Tir Met Gli Asn Ile Tre Ile Gli Tre Pro Sequência N-terminal 81 91 Pro Gln Glu Fen Gln Val Val Fen Asp Tre Ala Ser Ser Asp Leu Trp Val Pro Ser Asp Sítio catalítico 101 111 Fen Cis Tre Ser Pro Ala Cis Ser Tre His Val Arg Fen Arg His Leu Gln Ser Ser Tre

121 * 131 Fen Arg Leu Tre Asn Lis Tre Fen Arg Ile Tre Tir Gli Ser Gli Arg Met Lis Gli Val

141 151 Val Val His Asp Tre Val Arg Ile Gli Asn Leu Val Ser Tre Asp Gln Pro Fen Gli Leu

161 171 Ser Ile Glu Glu Tir Gli Fen Glu Gli Arg Ile Tir Asp Gli Val Leu Gli Leu Asn Tir

181 * 191 Pro Asn Ile Ser Fen Ser Gli Ala Ile Pro Ile Fen Asp Lis Leu Lis Asn Gln Arg Ala

201 211 Ile Ser Glu Pro Val Fen Ala Fen Tir Leu Ser Lis Asp Glu Arg Glu Gli Ser Val Val

221 231 Met Fen Gli Gli Val Asp His Arg Tir Tir Glu Gli Glu Leu Asn Trp Val Pro Leu Ile

241 251 Gln Ala Gli Asp Trp Ser Val His Met Asp Arg Ile Ser Ile Glu Arg Lis Ile Ile Ala

261 271 Cis Ser Asp Gli Cis Lis Ala Leu Val Asp Tre Gli Tre Ser Asp Ile Val Gli Pro Arg Sítio catalítico 281 291 Arg Leu Val Asn Asn Ile His Arg Leu Ile Gli Ala Ile Pro Arg Gli Ser Glu His Tir

301 311 Val Pro Cis Ser Glu Val Asn Tre Leu Pro Ser Ile Val Fen Tre Ile Asn Gli Ile Asn

321 331 Tir Pro Val Pro Gli Arg Ala Tir Ile Leu Lis Asp Asp Arg Gli Arg Cis Tir Tre Tre

341 351 Fen Gln Glu Asn Arg Val Ser Ser Ser Tre Glu Tre Trp Tir Leu Gli Asp Val Fen Leu

361 371 Arg Leu Tir Fen Ser Val Fen Asp Arg Gli Asn Asp Arg Ile Gli Leu Ala Arg Ala Val

A) B)

FIGURA 11 - A) Representação da estrutura cristalizada da boPAG-1. B) Estrutura tridimensional atribuída à PAG acoplada à pepstatina A (situada entre P3’ e P4’). Adaptado de GREEN et al. (1998).

Conforme discutido no seção sobre proteases aspárticas, a atividade catalítica das proteases aspárticas é dependente da existência de dois resíduos de ácido aspártico (Asp) os quais, apesar de situarem-se em lobos opostos da proteína, encontram-se bastante próximos no interior do sítio catalítico. Cada um destes resíduos é precedido de um aminoácido hidrófobo (usualmente a fenilalalina – Fen) sendo seguido invariavelmente de uma treonina (Tre) e de uma glicina (Gli) (DAVIES, 1990). A conformação secundária, na qual uma segunda região altamente conservada encontra-se em torno de cada Asp, também é requerida para a polarização das pontes de hidrogênio da molécula de água que hidrolisa o substrato (JAMES & SIELECKI, 1986). Como demonstrado por XIE et al. (1991), a aparente ausência de atividade proteolítica da boPAG-1 é devida à presença de alanina (Ala-76) no local onde normalmente existe glicina (Gli-76). Esta mutação tem como

conseqüência o deslocamento da molécula catalítica da água da sua posição simétrica normal, originando a inatividade desta proteína (DAVIES, 1990).

Protease Origem Atividade Extremidade N-terminal Extremidade C-terminal Aspártica Proteolítica? Pepsinogênio Macaco Sim Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser boPAG-1 Bovino Provavel/ não Fen Asp Tre Ala Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser boPAG-2 Bovino Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Leu Asp Tre Gli Tre Ser boPAG-8 Bovino Desconhecido Val Asp Tre Gli Trer Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser ovPAG-1 Ovino Provavel. não Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Gli Tre Gli Tre Ser poPAG-1 Suíno Provavel. não Fen Asp Tre Leu Ser Ser Leu Asp Ser Gli Ser Ala poPAG-2 Suíno Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ser Val Asp Tre Gli Tre Ser eqPAG-1 Eqüino Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser zePAG Zebra Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ala Val Asp Tre Gli Tre Ser fePAG Gato Desconhecido Fen Asp Tre Gli Ser Ser Ile Asp Tre Gli Tre Ser

➾➾➾ boPAG-2 Em 1994, XIE et al. caracterizaram a proteína coriônica anteriormente isolada por BECKERS et al. (1988) como sendo um novo membro da família das proteases aspárticas, ao qual foi dado o nome de boPAG-2 (BECKERS et al. , 1994). Esta glicoproteína foi caracterizada como sendo um polipeptídeo de 372 aminoácidos estruturalmente semelhante à boPAG-

1, à ovPAG-1 e à pepsina (com uma seqüência de 58 %, 58 % e 51 % dos aminoácidos idênticos, respectivamente). A classificação da suposta gonadotrofina coriônica de bovinos como sendo uma protease foi surpreendente mas não a primeira observação de similaridades entre hormônios placentários e proteases. De fato, WILLEY & LEIDENBERGER (1989) foram os primeiros a demonstrar uma grande identidade entre as seqüências de aminoácidos do hCG e da serina protease quimotripsina. No mesmo estudo, eles também descreveram a redução da ligação do hCG a seu receptor quando da adição de inibidores de proteases tais como a ‘soy bean trypsin’ (SBI). O ADN codificante para a boPAG-2 é detectado a partir do 17 o dia de gestação, coincidindo com o inicio da implantação (GREEN et al. , 2000). Entretanto, diferente da boPAG-1, a boPAG-2 ainda não foi purificada até a homogeneidade, não podendo ser usada para o desenvolvimento de dosagens radioimunológicas que permitam sua detecção na circulação sangüínea materna. Contrariamente ao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 tem um centro catalítico com uma seqüência de aminoácidos idêntica a outras proteases aspárticas ativas. Uma possível atividade proteolítica da boPAG- 2 necessita ser comprovada em futuros estudos.

➾➾➾ boPAG-3 a boPAG-21 Até o presente, como resultado do uso de técnicas de biologia molecular, foram identificados 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs em bovinos (XIE et al. , 1991; XIE et al. , 1994; XIE et al. , 1997b; GREEN et al. , 2000). O primeiro ADN corresponde à boPAG 67 previamente

purificada por ZOLI et al. (1991) e o segundo à proteína previamente identificada por BECKERS et al. , 1988 como sendo uma gonadotrofina coriônica. Os demais ADNs foram identificados em tecidos placentários apenas por técnicas de biologia molecular, não tendo os mesmos sido encontrados sob a forma de proteínas maduras. Os diferentes ADNs complementares identificados até o presente diferem em pelo menos 5 % em sua seqüência de nucleotídeos, codificando, em sua maioria, proteínas que diferem em ao menos um dos 20 aminoácidos de sua seqüência N-terminal (TABELA 5). Conforme descrito por HUANG et al. (2000) e GREEN et al. (2000), as diferentes PAGs identificadas em taurinos podem ser agrupadas em 3 principais categorias: a categoria das PAGs do tipo 1 (boPAG-1, -3, -15, -19, -21, etc.), a categoria das PAGs do tipo 2 (boPAG-2, -12 e –13) e categoria intermediária entre as PAGs e as enzimas proteolíticas (boPAG-8) (FIGURA 12). Conforme descrito por GREEN et al. (2000), a expressão dos diferentes clones de boPAG parece variar temporal e espacialmente, sendo algumas formas expressas ao longo de toda a gestação (FIGURA 13), tal como as boPAGs –8, -10 e -11, ou limitadas durante um determinado período, tal como a boPAG-9. Evolutivamente, as PAGs expressas em células binucleadas (FIGURA 14) parecem ser as formas mais recentes resultantes da duplicação dos genes desta família de proteases aspárticas, sendo estas formas as únicas passíveis de secreção na circulação periférica materna. Quando calculadas por curvas de calibração baseadas nas divergências de seqüências de nucleotídeos, pode ser estimado que o grupo de PAGs expressas por células binucleadas diverge das expressas

difusamente no trofectoderme em aproximadamente 56 ± 6 milhões de anos (HUGHES et al. , 2000).

Proteína Códido de Seqüência N-terminal Acesso 1 11 boPAG-1 Q29432 R G S N L T T H P L R N I K D L V Y M G boPAG-2 Q28057 N D S K I T I H P L R N Y L D T A Y V G boPAG-4 O46492 R G S N L T I H P L R N I R D F F Y M G boPAG-5 O46493 R G S N I T I H P L R N I M D M V Y M G boPAG-6 O46494 R G S N L T H P L R N I R D L F Y M G boPAG-7 O46495 R G S N L T I H P L R N I R D I F Y M G boPAG-8 O46496 P D K K F S S H Q L K N F Q N A V Y F G boPAG-9 O46497 R G S N L T I H P L R N I M N L V Y M G boPAG-10 O46498 D Q N I I Y H H P L R S Y K D F S Y I G boPAG-11 O46499 S D P K L S T H P L R N A L D M A Y V G boPAG-12 O46500 K D S K I T I H P L K N Y L D M A Y M G boPAG-13 Q9TTW1 N D S K I T I H P L R N Y L D T A Y V G boPAG-14 Q9TTW0 R G S N L T T H P L M N I W D L L Y L G boPAG-15 Q9TTV9 H G S N L T I H P L R N I R D L F Y M G boPAG-16 Q9TTV8 R G S N L T T L P L R N I R D M L Y V G boPAG-17 Q9TTV7 R G S N L T I H P L R N I M D M L Y V G boPAG-18 Q9TTV6 C G S N L T F H P L R N I K D R L Y V G boPAG-19 Q9TTV5 R G S N L T S H P L R N I K D L V Y L A boPAG-20 Q9TTV4 R G S N L T T H P L R N I W D I F Y I G boPAG-21 Q9TTV3 R G S N L T T L P L R N I E D L M Y V G

Apesar do imenso interesse econômico que poderia resultar do isolamento de formas de PAG expressas unicamente no início da gestação,

FIGURA 12 - Filograma baseado na seqüência de aminoácidos mostrando o relacionamento entre todas as PAGs clonadas até o momento, assim como o de algumas proteases aspárticas presentes em mamíferos. Adaptado de GREEN et al. (2000).

FIGURA 13 - Variação cronológica do ADN codificante para as PAGs em bovinos (boPAGs) e ovinos (ovPAGs) ao longo da gestação. Adaptado de GREEN et al. (2000).

com exceção das boPAG–1, ainda não foi possível purificar-se até a homogeneidade as proteínas correspondente à estas novas moléculas, não sendo as mesmas disponíveis para o desenvolvimento de novos testes radioimunológicos.

FIGURA 14 - Expressão dos ADNs codificantes para PAGs bovinas e ovinas identificadas até o presente. As PAGs expressas predominantemente em células binucleadas correspondem a proteínas estreitamente relacionadas. As PAGs expressas de modo difuso no trofectoderme representam os mais antigos membros desta família de proteases aspárticas. Adaptado de GREEN et al. (2000).

b) Família das PAGs ovinas (ovPAGs) A ovPAG-1 foi a primeira forma de PAG descrita na espécie ovina. Ela foi isolada e parcialmente caracterizada por ZOLI et al. (1995), sendo constituída por uma seqüência de 382 aminoácidos. A ovPAG-1 caracteriza-se por possuir massas moleculares variando de 43 a 67 kDa (XIE et al. , 1996), constituindo-se em uma forma enzimaticamente inativa, tal como a boPAG-1 (XIE et al. , 1991). Ela possui aproximadamente 73 % de sua seqüência de aminoácidos semelhante à da boPAG-1 (XIE et al. , 1991), localizando-se ao nível de células binucleadas do trofoblasto (XIE et al. , 1991). Uma outra forma de ovPAG, altamente presente em células mononucleadas da placenta de ovelhas, foi descrita por NAGEL et al. (1993), sendo esta forma denominada de ovPAG-2. Aparentemente a

ovPAG-2 é constituída por uma seqüência de 376 aminoácidos, apresentando 60 % de sua seqüência semelhante à da ovPAG-1 (NAGEL et al. , 1993). Posteriormente, estudos desenvolvidos por XIE et al. (1997a) em placentas de ovelhas ao 100 o dia de gestação demonstraram a existência de novas proteínas as quais diferem em massas moleculares (55 kDa, 60 kDa, 61 kDa e 65 kDa) e em seqüências N-terminais, sendo denominadas respectivamente ovPAG 55 , ovPAG 60 , ovPAG 61 e ovPAG 65 . Um número superior de clones de ADN foram identificados em tecidos placentários, sendo os mesmos denominados de ovPAG-3 a ovPAG-9 de acordo com a ordem pela qual foram identificados (XIE et al. , 1997a,b). Apenas 2 dos 7 novos clones (ovPAG-3 e ovPAG-7) mostraram ser capazes de codificar polipeptídeos, sendo ambos expressos nos mesmos tipos de células binucleadas. c) Família das PAGs caprinas (caPAGs) Recentemente, GARBAYO et al. (1998) descreveram mais três formas de PAG em ruminantes, com diferentes seqüências de aminoácidos e massas moleculares distintas (62 kDa, 59 kDa e 52 kDa). Estas novas formas de PAG, purificadas na espécie caprina, foram denominadas respectivamente de caPAG 62 , caPAG 59 e caPAG 55 . Cada forma de caPAG caracterizou-se por possuir diversas isoformas com pontos isoelétricos distintos. Assim como observado em bovinos, em caprinos, a diferença observada entre os pontos isoelétricos parece representar diferentes padrões de glicosilação e/ou fosforilação da PAG. Diversos clones de PAG diferindo em ao menos 5 % em sua seqüência nucleotídica, são expressos nas placentas caprinas (caPAG-1 a caPAG-11).

Assim como o observado em taurinos e caprinos, a expressão desses clones é regulada temporal (expressão ao longo de toda a gestação ou restrita a um determinado período) e espacialmente (expressão em células mononucleadas, binucleadas ou ambas) (GARBAYO et al. , 2000). d) Outras PAGs Em suínos foram inicialmente descritas duas formas de PAGs: a poPAG-1 e a poPAG-2. A poPAG-1 e a poPAG-2 são constituídas por seqüências de 382 e 387 aminoácidos, respectivamente, sendo ambas expressas difusamente ao nível de trofectoderma durante o período inicial da gestação. As poPAGs possuem 63,9 % de identidade entre suas seqüências de aminoácidos, apresentando, entretanto, apenas 50 % de identidade com relação às PAGs purificadas em ruminantes (SZAFRANSKA et al. , 1995). Novas formas de PAGs porcina foram recentemente descritas por SZAFRANSKA et al. (2001), sendo as mesmas denominadas poPAG-4, -5 e –6. A existência de um único gene codificante para PAGs nas espécies eqüina e felina (GREEN et al. , 1998, 1999), em zebras (GAN et al. , 1997) e em camundongos (CHEN et al. , 2001), em contraste com a existência de uma grande diversidade dos mesmos nas espécies ruminantes, parece sugerir que a duplicação de genes responsável pela diversidade de ADNs codificantes nas espécies pertencentes à ordem Artyodactyla ocorreu relativamente recentemente, após a especialização da células binucleadas presentes na placenta de ruminantes (HUGHES et al. , 2000). Segundo os mesmos autores, uma seleção Darwiniana positiva ao nível dos aminoácidos presentes nas regiões variáveis destas proteínas poderia

contribuir para uma diversidade na capacidade de ligação destas proteínas à diferentes substratos, indicando diferentes especificidades funcionais das PAGs. e) Dosagens de PAG Na prática, a produção de anticorpos específicos contra frações altamente purificadas de PAG, PSPB ou PSP-60 bovinas tem permitido o desenvolvimento de dosagens radioimunológicas homólogas altamente sensíveis e específicas para taurinos (ZOLI et al. , 1992a; PERENYI et al. , 2000). Neste tipo de dosagem, todos os reagentes são preparados a partir da boPAG-1 purificada, não sendo observadas reações cruzadas com outras proteínas plasmáticas ou com outras proteases aspárticas (PERENYI et al. , 2001). Posteriormente, a obtenção de proteínas semi-purificadas nas espécies ovina (ZOLI et al. , 1995; WILLARD et al. , 1995) e caprina (GARBAYO et al. , 1998) possibilitaram a produção de anticorpos mais específicos visando o desenvolvimento de dosagens em pequenos ruminantes. Nestes tipos de dosagens (heterólogas), parte dos reagentes são provenientes da espécie de origem (ovina ou caprina), enquanto que o antígeno marcado é proveniente de taurinos (RANILLA et al. , 1994; SOUSA et al. , 1999; GONZALEZ et al. , 1999).

➾➾➾ Dosagem da PAG durante gestações normais Os perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG durante toda a gestação foram descritos em taurinos (ZOLI et al. , 1992a; DOBSON et al. , 1993; PATEL et al. , 1997), em caprinos das raças Blanca-Celtibérica (BENITEZ ORTIZ, 1992; FOLCH et al., 1993), Canindé (SOUSA et al. , 1999),

Moxotó (SOUSA et al. , 1999), Canária (GONZÁLEZ et al. , 2000), Alpina (BATALHA et al. , 2001) e em ovinos das raças Assaf (RANILLA et al. , 1997), Churra (RANILLA et al. , 1994), Merino (RANILLA et al. , 1994) e Berrichon (GAJEWSKI et al. , 1999). Durante a gestação, as concentrações de PAG diferem consideravelmente entre as espécies e períodos de gestação (ZOLI et al. , 1992a; RANILLA et al. , 1994; SOUSA et al. , 1999). Em uma mesma espécie, elas podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre os quais podem ser citados a raça da fêmea (MIALON et al. , 1993; RANILLA et al. , 1994), o número de fetos (DOBSON et al. , 1993; PATEL et al. , 1997), o genótipo fetal (GUILBAULT et al. , 1991; WILLARD et al. , 1995) e no caso de transferência de embriões, a duração de cultivo in vitro dos embriões (ECTORS et al. , 1996a,b). As concentrações de PAG parecem também diferir de acordo com o sistema radioimunológico utilizado, diferença esta resultando provavelmente da especificidade do antisoro (GONZALEZ et al. , 1999,2000). Em raças taurinas, a boPAG-1 (única forma de PAG bovina dosável na circulação periférica materna) pode ser detectada na circulação materna tão cedo quanto durante a implantação do trofoblasto nas paredes do útero. Do princípio da gestação até a 35 a semana, as concentrações de PAG aumentam devagar e gradualmente, permanecendo inferiores a 250 ng/ml (FIGURA 15). Entre a 35 a semana e a última semana de gestação, as concentrações aumentam rapidamente atingindo valores de 1 a 5 µg/ml (ZOLI et al., 1992a; PATEL et al. , 1997). Após o parto, os níveis de PAG decrescem regularmente, sendo indetectáveis somente aos 100 dias pós- parto (ZOLI et al. , 1992a). O relativo longo tempo necessário para que a

boPAG-1 desapareça da circulação sangüínea materna pode ser explicado pela elevada concentração presente no sangue materno no momento do parto (ZOLI et al. , 1992a), bem como a meia-vida desta glicoproteína a qual foi estimada em 7,4 a 9 dias (KIRACOFE et al. , 1993; ALI et al., 1997).

Em caprinos (BENITEZ ORTIZ, 1992; SOUSA et al. , 1999; GONZALEZ et al. , 2000) e em ovinos (BENITEZ ORTIZ, 1992; RANILLA et al. , 1994), não foi observada tendência a um aumento

contínuo das concentrações de PAG ao longo da gestação. No que diz respeito ao período pós-parto, em ambas as espécies foi verificado um rápido decréscimo nas concentrações de PAG durante o primeiro mês pós- parto (BENITEZ ORTIZ, 1992; RANILLA et al. , 1994, 1997; SOUSA et al. , 1999). Concentrações de PAG foram detectadas na circulação periférica de 15 a 20 % de touros e novilhas não prenhes (ZOLI et al. , 1992a). Concentrações de PAG também foram detectadas no soro de fetos bovinos, tendo sido observada uma acentuada influência da idade sobre estas concentrações (fetos jovens apresentam concentrações superiores a de fetos mais velhos). Essas concentrações mais elevadas nos fetos jovens podem ser devidas à uma maior concentração desta proteína em um menor volume sangüíneo ou a uma migração mais intensa de células binucleadas no início da gestação (ZOLI et al. , 1992b).

➾➾➾ Dosagem da PAG durante gestações anormais Recentemente, DOBSON et al. (1993) assim como ECTORS et al. (1996a) demonstraram que em programas de transferência nuclear, mesmo se a maior parte dos bezerros apresentam pesos e tamanhos normais, alguns deles podem apresentar anomalias morfológicas tais como edemas do cordão umbilical com hipertrofia da placenta, as quais são responsáveis por elevadas concentrações de boPAG-1 na circulação materna. A presença de mal-formações fetais tais como Schistosomus reflexus (FIGURA 16A) também parece estar associada com a utilização de técnicas de fecundação in vitro e clonagem, sendo esta patologia igualmente responsável por concentrações extremamente elevadas de proteínas placentárias (FIGURA

16B), as quais, em alguns casos, podem ultrapassar 10 µg/ml (ECTORS et al. , 1996b). Ao contrário, a verificação de um acentuado decréscimo nas concentrações de PAG após monta natural, inseminação artificial, fecundação in vitro ou clonagem podem constituir-se em um forte indicativo de disfunção placentária ou de sofrimento fetal.

PAG (ng/ml) A) 14000 B) 12000

10000

8000

6000

4000

2000

0 12 -10 -8 -6 -4 -2 0 Semanas antes do parto FIGURA 16 - A) Schistosomus reflexus bovino; B) Concentrações de boPAG-1 observadas no caso de Schistosomus reflexus (-▲-▲-) e de gestações normais (-×-×-). Adaptado de ECTORS et al. (1996a).

Em um estudo pioneiro realizado por ECTORS et al. (1996a), a realização de dosagens de PAG em amostras coletadas semanalmente após transferência de embriões produzidos in vitro permitiu o monitoramento de mortes embrionárias e fetais em taurinos (ECTORS et al. , 1996a). O mesmo fenômeno de redução nas concentrações de PAG em caso de aborto foi descrito por SEMAMBO et al. (1992) em vacas experimentalmente infectadas por Actynomyces pyogenes , assim como em cabras de origem

norueguesa apresentando abortos de origem infecciosa ou de causa desconhecida (ZARROUK et al ., 1999a,b). Contudo, dadas às elevadas variações nas concentrações da PAG no sangue materno, somente um acentuado abaixamento ou desaparecimento total da PAG pode ser um sinal efetivo da morte embrionária ou fetal no caso de gestações múltiplas e simples, respectivamente. Foi demonstrado ainda que a utilização paralela da ultrasonografia (US) e da dosagem de hormônios tais como a P4 e a PAG pode revelar a ocorrência de diversos problemas freqüentemente observados em condições de campo, tais como a re-inseminação de fêmeas já prenhes ou a administração de prostaglandina F 2α no início de uma gestação viável causando a morte do embrião ou do feto. Em ambos os casos, os quais constituem-se em erros no manejo da reprodução, a identificação de mortalidade embrionária ou fetal passaria despercebida sem o uso destas técnicas, sendo considerada simplesmente como um retorno tardio ao ciclo estral. Em experimentos a campo, SZENCI et al. (1998a) descreveram diversas situações (FIGURAS 17A, 17B, 17C e 17D) nas quais a dosagem de proteínas específicas ou associadas à gestação e progesterona demonstraram ser extremamente úteis quando associadas à técnica de ultrasonografia. Merece ser citado particularmente o quadro no qual as concentrações de PAG diminuem enquanto que as concentrações de progesterona permanecem elevadas mesmo após a ocorrência de mortalidade embrionária devido à persistência do corpo lúteo (FIGURA 17A); a situação na qual as concentrações de PAG mostram claramente que a vaca tinha sido fecundada quando da primeira inseminação e que a

realização de uma segunda inseminação 21 dias mais tarde provocou provavelmente uma contaminação do útero, resultando em mortalidade fetal (FIGURA 17B); o quadro no qual a dosagem de PAG confirma a ocorrência de mortalidade embrionária precoce indicada pela ultrasonografia (FIGURA 17C), e por fim, a situação na qual as concentrações de PAG demonstram uma vaca teria sido inseminada em um curto período após o parto (concentrações decrescentes de PAG), e que neste caso, provavelmente o ambiente uterino não estaria preparado para o estabelecimento de uma nova gestação (FIGURA 17D).

A) B)

C) D)

FIGURA 17 - Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-●-●-) e P4 (-▲-▲-) em 4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação inicialmente positivo ( P) por ultrasonografia foi seguido de um diagnóstico negativo ( N) por ultrasonografia ou pela observação direta da morte fetal ( MF ). Adaptado de SZENCI et al. (1998a).

➾➾➾ Dosagem da PAG para fins de diagnóstico de gestação A detecção da PAG em amostras de soro ou de plasma é correntemente usada como método de diagnóstico de gestação a partir dos 29-30 dias após a fecundação em raças taurinas (SASSER et al., 1986; HUMBLOT et al., 1988a; SZENCI et al. , 1998a,b, 2000a,b) e dos dias 21- 22 dias em ovinos (KAREN et al. , 2001) e caprinos (GONZALEZ et al. , 1999). Em bovinos, os valores preditivos positivos da dosagem de PAG para fins de diagnóstico de gestação variam de 72 % (dia 29 após inseminação artificial) (SZENCI et al. , 1998b) a 93 % (dia 45 após inseminação artificial) (ZOLI et al. , 1992a), enquanto que os valores preditivos negativos variam de 95 % a 100 % (respectivamente aos dias 29 e 45 após inseminação artificial) (SZENCI et al. , 1998b). Além da alta precisão obtida, uma outra vantagem da utilização da dosagem de PAG como método de diagnóstico de gestação diz respeito à capacidade da PAG em poder conservar-se em níveis detectáveis por até 10 dias após a coleta de sangue (temperatura ambiente), o que abre excelentes perspectivas em termos de sua utilização em condições de campo (BISSON, 1992). f) Aspectos gerais relativos aos protocolos utilizados para o isolamento bioquímico e identificação sorológica das PAGs Até o presente, os procedimentos bioquímicos foram os únicos a fornecer os reagentes necessários ao desenvolvimento de dosagens RIA para a PAG. Estas dosagens têm permitido a determinação dos perfis sorológicos ou plasmáticos desta proteína ao longo da gestação e período pós-parto, constituindo-se em uma importante ferramenta de

monitoramento da viabilidade placentária. Alguns dos principais aspectos relativos aos procedimentos de purificação e dosagem da PAG utilizados até o presente serão descritos a seguir.

➾➾➾ Procedimento bioquímico correntemente utilizado para o isolamento da PAG Em geral, os protocolos bioquímicos utilizados em espécies ruminantes foram baseados no mesmo princípio: a extração das proteínas placentárias em tampão com pH neutro, seguida de seu fracionamento pelo uso de diferentes técnicas, tais como precipitações por sulfato de amônia e cromatografias de troca de íons. Etapas adicionais de precipitação ácida, de cromatografia em gel de Sephadex G-75 ou de cromatografia em gel de Blue-Sefarose têm sido realizadas em alguns dos protocolos (ZOLI et al. , 1991; XIE et al. , 1997a; GARBAYO et al. , 1998) com vistas a aumentar a pureza final das proteínas a serem utilizadas para o desenvolvimento de dosagens RIA. Uma vez isoladas, as PAGs foram caracterizadas por diversos autores quanto a suas massas moleculares, pontos isoelétricos e seqüências N- terminais (ZOLI et al. , 1991; XIE et al. , 1997a; GARBAYO et al. , 1998). Conforme ressaltado por HUGHES et al. (2000), a comparação das diferentes seqüências de aminoácidos das PAG identificadas até o presente é de fundamental importância por fornecer o grau de identidade entre as proteínas isoladas em diferentes espécies. Em taurinos, primeira espécie na qual a PAG foi purificada, ao final dos procedimentos de purificação, somente foi seqüenciada uma única proteína, a qual correspondia a fração mais imunoreativa obtida (ZOLI et

al. , 1991). O seqüenciamento desta proteína revelou a existência de uma

única seqüência, a qual é atualmente identificada como boPAG 67 ou boPAG-1. Em trabalhos mais recentes XIE et al. (1997a) e GARBAYO et al. (1998) demonstraram que nas espécies ovina e caprina, quando diversas frações imunoreativas são analisadas, é possível identificar-se diversas formas de PAG, heterogêneas tanto no que diz respeito a suas massas moleculares e pontos isoelétricos, quanto no que diz respeito a suas seqüências N-terminais (XIE et al. , 1997a; GARBAYO et al. , 1998). Entretanto, até o presente, ainda não se sabe se a análise detalhada de um maior número de frações imunoreativas extraídas a partir da placenta de bovídeos confirmaria a expressão de uma única proteína ou resultaria na caracterização de novas seqüências N-terminais de PAG.

➾➾➾ Uso de cromatografias de afinidade para o isolamento da PAG Conforme descrito na seção sobre as proteases aspárticas, diversos membros pertencentes a esta família puderam ser isolados por meio do uso de cromatografias de afinidade, com o uso da pepstatina-A como substrato (FIGURA 18). Segundo GURUPRASAD et al. (1996), apesar de cataliticamente inativa, a PAG conservaria uma fenda capaz de acomodar peptídeos de até 7 resíduos de comprimento, podendo ligar-se reversivelmente à pepstatina A, assim como os demais membros de sua família. Entretanto, apesar de sugerido por diversos autores (GURUPRASAD et al. , 1996; HUGUES et al. , 2000; GARBAYO et al., 2000), ao nosso conhecimento, nenhuma publicação descreveu com precisão o isolamento de moléculas da família

da PAG pelo uso de cromatografia de afinidade empregando a pepstatina-A como ligante.

FIGURA 18 - Características da matriz associada à pepstatina A, utilizada para a purificação de proteases aspárticas.

➾➾➾ Mensuração das concentrações periféricas maternas de PAG por meio de dosagem RIA O método radioimunológico, também conhecido como dosagem RIA, foi inicialmente desenvolvido por YALLOW & BERSON (1960) para a dosagem da insulina no plasma humano. Atualmente, este método é comumente usado para a dosagem plasmática ou sorológica de diversos hormônios e proteínas, dentre os quais a PAG. Dentre os principais componentes de uma dosagem RIA para a PAG (dosagem PAG-RIA) podemos citar o antígeno marcado com o isótopo radioativo iodo 125 (PAG-I125 ), o antígeno frio ou não marcado (PAG não marcada), e o anticorpo, também conhecido como anti-soro (AS), o qual

contém imunoglobulinas de coelhos produzidos contra a forma de PAG que se deseja dosar. Participam ainda como reagentes da dosagem PAG-RIA o soro de novilhas impúberes (serum-free) e o sistema de precipitação pelo uso do segundo anticorpo, o qual contem imunoglobulinas de ovelha anti- imunoglobulina de coelhos. A dosagem PAG-RIA, assim como as demais dosagens radioimunológicas (CHARD, 1989), baseia-se em um mesmo princípio: a competição entre ambos os antígenos marcado e não marcado por uma determinada quantidade de anticorpos. Entretanto, apesar de aparentemente simples, esta reação não se resume a uma simples diluição isotópica, obedecendo a lei de ação de massas cujo detalhamento foge aos objetivos da presente revisão de literatura. Quanto à origem dos reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA, podemos classificar os sistemas atualmente utilizados como homólogos ou heterólogos. Em cervídeos (HUANG et al., 2000), assim como em caprinos (GONZALEZ et al. , 1999) e taurinos (ZOLI et al. , 1992a), utiliza-se sistemas de dosagens homólogos, nos quais os principais reagentes são produzidos a partir da PAG purificada em uma mesma espécie. Entretanto, na maioria das espécies, recorre-se ao uso de sistemas de dosagem heterólogos, nos quais a PAG marcada é normalmente de origem taurina, sendo o antígeno frio e/ou o antisoro produzidos a partir de PAGs semi- purificadas em diferentes espécies (RANILLA et al. , 1994; SOUSA et al. , 1999; GONZALEZ et al. , 1999). Dentre os principais parâmetros analisados das dosagens de PAG-RIA podemos citar a especificidade, a sensibilidade e a precisão. A especificidade da dosagem de PAG taurina foi investigada inicialmente por

ZOLI et al. (1991), os quais demonstraram a inexistência de reações cruzadas entre a boPAG 67 e o bPL, o bLH, o FSH de origem porcina e a alfa-fetoproteína. Mais recentemente, PERENYI et al. (2001) demonstraram ainda a inexistência de reações cruzadas entre a boPAG 67 e outros membros da família das proteases aspárticas, tais como a pepsina porcina, a catepsina D, a quimosina e a renina. No que se refere à sensibilidade, também conhecida como limite mínimo de detecção, os sistemas de dosagem PAG-RIA taurino e caprino demonstraram ser altamente sensíveis, detectando concentrações de PAG tão baixas quanto 0,2 ng/ml (PERENYI et al. , 2000). As melhores sensibilidades são alcançadas quando é feita uma etapa de pré-incubação de 16 horas antes da adição do antígeno marcado (SOUSA et al. , 1999; GONZALEZ et al. , 1999). A precisão de um sistema de dosagens é determinada como o coeficiente de variação (CV) das concentrações de PAG contidas em uma mesma amostra quando esta é mensurada repetidamente em uma mesma série de dosagens (CV intra-ensaio) ou sucessivamente em séries de dosagens diferentes (CV inter-ensaio). A precisão da dosagem PAG-RIA já foi calculada por diversos autores, variando de 6,9 a 11,6 % para o sistema RIA homólogo de taurinos (ZOLI et al. , 1992a) e de 3,3 a 13 % para os sistemas heterólogos caprino e ovino (GONZALEZ et al. , 1999; SOUSA et al. , 1999). Conforme descrito por BATALHA et al. (2001), concentrações de PAG mensuradas por RIA homólogos são inferiores às dosadas por sistemas heterólogos, o que poderia indicar uma menor especificidade das dosagens heterólogas. Entretanto, investigações complementares são

necessárias para confirmar esta hipótese. Uma vez citados alguns dos principais aspectos relacionados ao estudo das PAGs em ruminantes domésticos, serão apresentadas as metodologias por nós adotadas para o estudo da PAG em raças zebuínas.

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3. MATERIAL E METODOLOGIA

3.1. Experimento 1 – Isolamento de glicoproteínas associadas à gestação: Dois protocolos foram utilizados para o isolamento de proteínas associadas à gestação a partir da placenta de fêmeas zebuínas. O primeiro protocolo baseou-se na extração das proteínas placentárias em tampão com pH neutro, seguida de seu fracionamento pelo uso de diferentes técnicas, tais como as precipitações ácida e por sulfato de amônia e cromatografias de troca de ânions e de cátions. O segundo protocolo baseou-se na utilização de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose para o enriquecimento dos extratos placentários em PAG. Em ambos os protocolos, as proteínas resultantes do fracionamento foram caracterizadas quando à sua massa molecular por meio de eletroforeses monodimensionais, quanto à imunoreatividade por meio de

Western Blot com o uso dos anti-soros anti-boPAG 67 (AS497) e anti- caPAG 55+62 (AS706) e anti-caPAG 55+59 (AS708), e quanto ao ponto isoelétrico por meio de eletroforeses bidimensionais. As proteínas consideradas como imunoreativas foram então sequenciadas em sua extremidade N-terminal (entre 10 e 25 aminoácidos), tendo suas seqüências comparadas com as seqüências já existentes nos bancos de dados por meio do uso do programa Fasta 3 do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI, 2001). Os procedimentos metodológicos utilizados nos protocolos de isolamento da PAG serão descritos a seguir.

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3.1.1. Protocolo 1 3.1.1.1. Determinação da imunoreatividade e da proteína total O radioimunoensaio (RIA) desenvolvido por ZOLI et al. (1992a) para dosagem da PAG de origem taurina foi utilizado para detectar a imunoreatividade do tipo PAG ao longo deste protocolo de purificação (cf. Anexo A). Este RIA constituiu-se em um sistema semi-quantitativo de mensuração das quantidades relativas de PAG presentes nas amostras obtidas nas diferentes etapas de fracionamento protéico. A determinação da quantidade total de proteína (TP) obtida nas diferentes etapas foi feita pelo método previamente descrito por LOWRY et al. (1951) (cf. Anexo B) com o uso da albumina séria bovina (BSA; ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) como proteína de referência.

3.1.1.2. Coleta de placentas Os úteros de 3 fêmeas zebuínas gestantes foram coletados em abatedouro aproximadamente 10 a 30 minutos após o abate. O estágio de gestação foi estimado com base no comprimento entre o côndilo occipital e a última vértebra coccígea fetais. De acordo com o comprimento obtido (69 cm, 70 cm e 77 cm), foram estimados estágios gestacionais entre 30 e 31 semanas de gestação (último trimestre de gestação) (REXROAD et al. , 1974). Logo após o abate, os cotilédones fetais foram imediatamente dissecados e lavados com solução fisiológica de cloreto de sódio (NaCl) a uma concentração de 0,9 %. Após transportados ao laboratório a uma temperatura de aproximadamente 4°C, os cotilédones foram pesados e identificados, sendo armazenados a –20°C até seu processamento A

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FIGURA 19 esquematiza o fracionamento de proteínas realizado no Protocolo 1.

Cotilédones fetais

Extração de proteínas em pH neutro

Precipitação ácida

Precipitação a 40-80 % de sulfato de amônia

Cromatografia de troca de ânions (Coluna DEAE Sephadex A25) Isolamento Cromatografia de troca de cations de todas as frações DEAE (Coluna CM Cerâmica)

Eletroforese monodimensional Coloração Coomassie Blue (1-D SDS-PAGE) Western blot

Eletroforese bidimensional Sequenciamento N-terminal Caracterização (2-D SDS-PAGE)

FIGURA 19 - Esquema de purificação (fracionamento) da PAG extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de trocas de íons.

3.1.1.3. Isolamento da PAG a) Extração de proteínas solúveis Aproximadamente 2.145,4 gramas de cotilédones fetais foram descongelados e utilizados no presente protocolo. O descongelamento foi feito a 4°C durante 24 horas. Após descongelados, os cotilédones foram novamente lavados com solução fisiológica (5 litros de NaCl a 0,9 %, 4°C) e pesados. Foi obtido um total de 1.921,5 gramas de cotilédones fetais. Os cotilédones fetais foram inicialmente moídos com o auxílio de um triturador de carne. Em seguida, o extrato cotiledonário foi finamente

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homogeneizado em tampão fosfato de potássio a 0,01 M (KH 2PO 4; Merck) contendo 0,10 M de cloreto de potássio (KCl, pH 7,6; Merck) tendo para tal sido utilizado um mixer industrial Multipulver (Dusseldorf, Alemanha). Foi utilizada uma proporção entre tampão e tecido de 3,5 : 1 (volume : peso). No momento da homogeneização foram adicionados 0,001 mM de leupeptina (Sigma, St. Louis, USA), 0,2 mM de fenil-metilsulfonilfluoreto (PMSF; Sigma), 0,2 % de EDTA sódico (peso : volume; Sigma) e 0,02 % de azida sódica (NaN 3; peso : volume; Vel Inc., Leuven, Bélgica). A primeira extração consistiu na homogeneização do extrato placentário durante 2 horas a 4°C. A homogeneização foi feita pelo uso de um agitador industrial do tipo vortex (Modelo 50 MHz; Kargh GMBH, Hannover, Alemanha). Após centrifugação deste extrato a 27.000 g durante 1 hora, o sobrenadante foi mensurado e armazenado em um recipiente à parte, tendo o sedimento sido novamente triturado em 4 litros do mesmo tampão pelo uso de um mixer industrial. No momento da segunda trituração, foram igualmente adicionados 0,001 mM de leupeptina, 0,2 mM de PMSF, 0,2 % de EDTA sódico e 0,02 % de NaN 3. Após uma segunda homogeneização durante aproximadamente 16 horas, o segundo extrato placentário foi centrifugado a 27.000 g por 1 hora, tendo o precipitado sido eliminado. O segundo sobrenadante, assim como o primeiro, foi mensurado quanto ao volume. Ambos os sobrenadantes foram misturados, tendo seu pH sido ajustado a 7,6 pelo uso de 0,5 M de hidróxido de potássio (KOH; Merck). b) Precipitação ácida Os sobrenadantes resultantes de primeira (7.940 ml) e da segunda

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(3.890 ml) extrações foram misturados. O pH da solução final (11.830 ml) foi ajustado a 4,5 pelo uso de ácido fosfórico a 0,5 N (H 3PO 4; Fluka). A solução foi então deixada em repouso a 4°C durante 2 horas. Após este período, a solução foi centrifugada a 27.000 g por 1 hora para a eliminação do precipitado. O sobrenadante teve seu pH novamente ajustado para 7,6 pelo uso de hidróxido de potássio a 0,5 N (KOH; Merck). c) Precipitações ao sulfato de amônia Após a precipitação ácida, foram adicionadas 243,0 gramas de sulfato de amônia (S.A.; Merck) por litro de sobrenadante (11,83 l), tendo sido obtida uma taxa de saturação de 40 %. Após a dissolução completa do S.A., a solução foi deixada em repouso por 16 horas, tendo sido em seguida centrifugada a 27.000 g por 1 hora para a separação entre as proteínas precipitadas e não precipitadas. Ao sobrenadante foi novamente adicionado S.A. até obter-se uma taxa de saturação de 80 % (adição de 285,0 gramas de S.A. por litro de solução). Após 16 horas de repouso, a solução foi novamente centrifugada a 27.000 g durante 1 hora, tendo o sobrenadante sido descartado. As proteínas precipitadas pela saturação 40-80 % de S.A., foram ressuspendidas em 500 ml de tampão Tris-HCl 0,01 M (pH 7,6). Esta suspensão foi exaustivamente dialisada contra um grande volume do mesmo tampão (4 banhos de 20 litros trocados a 12 horas de intervalo). Após o último banho de diálise, a solução contendo a fração 40-80 % de S.A. foi centrifugada a 36.000 g durante 20 minutos, tendo o precipitado sido eliminado e o sobrenadante mensurado e imediatamente depositado sobre uma coluna contendo gel DEAE-Sephadex para a realização de

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cromatografia de troca de ânions. d) Cromatografia de troca de ânions A quantidade de gel utilizada nesta cromatografia foi calculada a partir da estimativa da quantidade total de proteínas presente na fração 40- 80 % de S.A.. Foi utilizada uma proporção de 4 mg de proteína por mililitro de gel DEAE Sephadex A-25 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) hidratado. A coluna de DEAE Sephadex A-25 (14 cm x 18cm) foi previamente equilibrada em tampão Tris-HCl 0,01 M (pH 7,6). A fração 40-80 % S.A. foi depositada sobre a coluna de DEAE Sephadex a um fluxo de 2,5 ml por minuto. As proteínas não adsorvidas foram eluídas pela lavagem com 10 litros de tampão Tris-HCl 0,01 M (pH 7,6). As proteínas adsorvidas ao gel foram fracionadas pelo uso de forças iônicas crescentes, obtidas pela adição de concentrações crescentes (0,02 M, 0,04 M, 0,08 M, 0,16 M e 0,32 M) de cloreto de sódio (NaCl) ao tampão Tris-HCl 0,01 M. A coluna foi lavada sucessivamente com 10 litros de tampão contendo cada uma das concentrações em NaCl (0,02 M a 0,32 M NaCl). Cada fração (0 M a 0,32 M NaCl) foi concentrada em cassetes de concentração (Millipore, Dusseldorf, Alemanha) até um volume de aproximadamente 1 litro, sendo em seguida concentrada até um volume de 200 ml em células de concentração Amicon (Amicon Ultrafiltraton System; Danvers, MA). Após concentradas, cada uma das frações foi dialisada contra um volume total de 80 litros de tampão bicarbonato de amônia a 5 mM (4 banhos de 20 litros trocados a 12 horas de intervalo, pH 8,0). A

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cromatografia em gel DEAE-Sephadex, assim como as diálises, foram feitas a uma temperatura de 4°C. Após o final da diálise de cada uma das frações, as mesmas foram centrifugadas a 36.000 g durante 30 minutos. Os precipitados foram eliminados e o sobrenadante correspondente a cada fração foi identificado e liofilisado. e) Cromatografia de troca de cátions Cada uma das frações da DEAE (doravante chamadas DEAE 0 M, DEAE 0,02 M, DEAE 0,04 M, DEAE 0,08 M, DEAE 0,16 M e DEAE 0,32 M NaCl) foi submetida separadamente a uma cromatografia de troca de cátions em um Sistema Avançado de Purificação de Proteínas Waters 650 (Millipore Corp., Bedford, MA). A coluna utilizada (coluna CM Cerâmica HyperD F; 1 cm x 3 cm; BioSepra, Cergy-Saint Christophe, França) foi previamente equilibrada com tampão acetato de amônia 0,01 M (pH 5,0). A cada cromatografia, 200 mg de proteína proveniente de uma das diferentes frações de DEAE foram solubilisadas em 20 ml de tampão de equilíbrio, sendo em seguida centrifugadas a 1.500 g durante 5 minutos para a eliminação dos resíduos insolúveis. Cada fração da DEAE foi injetada sobre a coluna CM cerâmica a um fluxo constante de 0,5 ml por minuto. Após a diluição da fração não adsorvida, um gradiente linear de NaCl (0 a 1,0 M) foi aplicado a um fluxo constante de 2 ml/min. Frações de 1 ml foram coletadas separadamente. As frações correspondentes a um mesmo pique de proteína (conforme observado pela densidade óptica a 280 nm), foram misturadas, sendo identificadas e dialisadas contra tampão bicarbonato de amônia 5 mM (pH

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8,0). Após o final das diálises, as proteínas de cada pique foram centrifugadas e o sobrenadante liofilizado. Cada fração da CM cerâmica (doneravante denominadas pique CM pique I, CM pique II, ... CM pique n) foram analisadas quanto à quantidade total de proteína e quanto à quantidade estimada de PAG.

3.1.1.4. Caracterização da PAG a) Eletroforeses monodimensionais em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D SDS-PAGE) Eletroforeses monodimensionais foram utilizadas para analisar as proteínas fracionadas durante o protocolo de purificação. As eletroforeses monodimensionais foram realizadas de acordo com o método descrito por LAEMMLI (1970) na presença e na ausência do agente redutor mercaptoetanol (5 %). As proteínas contidas em cada pique da coluna CM cerâmica foram diluídas na proporção de 1 µg para cada 1 µl de Laemmli (cf. Anexo C), tendo sido desnaturadas pelo aquecimento a uma temperatura de aproximadamente 100°C durante 5 minutos. Amostras padrão com massas moleculares de 94 kDa, 66 kDa, 45 kDa, 30 kDa, 20,1 kDa e 14,4 kDa (Kits de Calibração para Eletroforese LMW; Pharmacia) foram corridas simultaneamente com as proteínas obtidas após as cromatografias de troca de íons. A análise das proteínas foi feita em sistemas verticais de eletroforese, com capacidade de um gel cada. Os géis de poliacrilamida utilizados (20 x 10 x 0,25 cm) foram preparados de acordo com a fórmula descrita no Anexo C. Amperagens de 20 mA foram aplicadas durante a migração das

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proteínas no gel de compressão, sendo o tempo de migração de aproximadamente 1 hora e 30 minutos. Durante a migração no gel de separação, foram aplicadas amperagens constantes de 40 mA. O tempo de migração no gel de separação foi de aproximadamente 6 horas. Após o final da migração, as proteínas presentes em cada gel foram coradas pela solução de Azul de Coomassie R 250 durante um mínimo de 1 hora, sendo descoloradas durante 6 a 12 horas. Os pesos moleculares das bandas mais visíveis presentes nos géis foram estimados com base em uma curva calculada a partir das massas moleculares das diferentes proteínas padrão corridas simultaneamente com as amostras. b) Western Blot Uma vez caracterizadas quanto à suas massas moleculares aparentes, as proteínas presentes em cada pique da coluna CM Cerâmica foram analisadas quanto às suas imunoreatividades pelo uso da técnica de

Western Blot com o uso de 3 diferentes anti-soros: anti-boPAG 67 (AS 497), anti-caPAG 55+62 (AS706) e anti-caPAG 55+59 (AS708). Detalhes sobre os reagentes e a técnica de Western Blot utilizada encontram-se descritos no Anexo D. Resumidamente, após o final da migração das proteínas em um gel de poliacrilamida a 12 %, cada gel teve suas proteínas transferidas sobre uma membrana de nitrocelulose (Hybond ECL, Pharmacia). A transferência foi feita em um aparelho Multiphor II (Pharmacia) pela aplicação de uma tensão constante de 24 volts durante uma hora, e de 36 volts durante aproximadamente 12 horas. Após a transferência, as proteínas foram visualizadas pela coloração

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com a solução Vermelho de Ponceau S (Merck). Em seguida, as membranas foram lavadas 3 vezes durante 10 minutos com o tampão Tris salino (TBS) contendo 3 % de BSA (37°C). Após lavagem, as membranas foram incubadas durante 3 horas a 37°C em uma solução contendo um dos anti-soros anti-PAG (diluição a 1 : 200 em Tris contendo 1 % de BSA), sendo posteriormente lavadas com tampão TBS contendo 1 % de BSA (3 lavagens de 10 minutos a 37°C). Uma incubação com imunoglobulina de ovelha anti-imunoglobulina de coelho acoplada à peroxidase (diluição a 1 : 2.000 em TBS contendo 1 % de BSA; HPR-POD, Chemicon International Inc., Temecula, CA) foi feita durante 2 horas a 37°C e sob agitação. Após esta segunda incubação, a membrana de nitrocelulose foi lavada em TBS sem BSA (4 lavagens de 10 minutos a 20°C). A identificação das proteínas imunoreativas às PAGs foi feita após a incubação com as soluções de revelação durante um período de aproximadamente 10 minutos. c) Focalização isoelétrica e eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (2-D SDS- PAGE) As proteínas presentes nos piques CM contendo bandas imunoreativas à PAG foram submetidas a eletroforeses bidimensionais. A primeira dimensão (isofocalização) foi feita em géis Immobiline DryStrip com pH variando entre 3 e 10 (11 cm; Pharmacia). Os géis usados para isofocalização foram hidratados com o tampão de reidratação (cf. Anexo E) contendo 200 a 250 µg de proteínas a serem analisadas. A hidratação foi feita durante 16 horas em um Immobiline DryStrip Reswelling Tray

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(Pharmacia). A focalização foi feita em um aparelho FlatBed (FBE-3000; Pharmacia) pela aplicação de tensões de 300 volts por 30 minutos, de 1.000 volts por 30 minutos, de 1.550 volts por 16 horas e de 1.850 volts por 1 hora. Como segunda dimensão foram feitas eletroforeses verticais em SDS- PAGE, conforme anteriormente descrito para as eletroforeses monodimensionais. Após o final da migração no gel de separação, as proteínas foram transferidas para membranas de polivinilideno difluoridro (PVDF; BioRad, Richmond, CA) com o auxílio do Aparelho Multiphor II (Pharmacia). A transferência foi feita pela aplicação de uma corrente constante de 12 volts durante 45 minutos e de 36 volts durante 45 minutos. A visualização das proteínas foi feita após a coloração das membranas em solução Azul de Coomassie para PVDF durante 10 minutos, seguida pela descoloração durante 20 a 30 minutos. d) Análise da seqüência N-terminal A análise da seqüência N-terminal de aminoácidos das proteínas correspondentes às bandas imunoreativas identificadas pela técnica de Western Blot foi feita pelo método da degradação automatizada de Edman em sequenciador protéico de fase líquida (Procise 492 Applied Biosystems, Foster City, CA). As seqüências obtidas foram comparadas com as seqüências existentes nos bancos de dados SWISS-PROT, EMBL e TrEMBL através do programa Fasta 3 (PEARSON && LIPMAN, 1988) do Instituto Europeu de Bioinformática (EBI, 2001).

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3.1.2. Protocolo 2 3.1.2.1. Coleta de placentas Os úteros de 10 fêmeas zebuínas gestantes foram coletados em abatedouro aproximadamente 10 a 30 minutos após o abate. Os estágios de gestação foram estimados com base no comprimento entre o côndilo occipital e a última vértebra coccígea de cada feto. De acordo com os comprimentos obtidos, 7 placentas foram consideradas como pertencentes ao primeiro trimestre de gestação (entre 10 e 11 semanas) e 3 placentas foram consideradas como pertencentes ao segundo trimestre de gestação (entre 20 e 21 semanas). Assim como descrito no Protocolo 1, logo após o abate, os cotilédones fetais foram imediatamente dissecados e lavados em solução de NaCl a 0,9 %, sendo em seguida transportados ao laboratório, pesados, identificados e armazenados a –20°C até seu processamento A FIGURA 20 esquematiza a metodologia utilizada no Protocolo 2.

3.1.2.2. Extração de proteínas solúveis Aproximadamente 890 gramas e 553 gramas de cotilédones fetais pertencentes ao segundo e primeiro trimestres de gestação foram moídos separadamente com o auxílio de um triturador de carne. Em seguida, os extratos cotiledonários foram finamente triturados com auxílio de um mixer industrial respectivamente em solução de KCl a 0,3 M (pH 5,0; Merck) e tampão bicarbonato de amônia a 0,05 M (pH 8,5; Vel). Foi utilizada uma proporção entre tampão e tecido de 3,5:1 (volume : peso). No momento da homogeneização foram adicionados 0,001 mM de leupeptina, 0,2 mM de PMSF, 0,2 % de EDTA sódico e 0,02 % de azida sódica. A extração das

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proteínas solúveis foi feita durante 4 horas, tendo para tal sido utilizado um agitador industrial do tipo vortex. Após centrifugação destes extratos a 27.000 g durante 1 hora, os precipitados foram descartados e os sobrenadantes foram concentrados até volumes de aproximadamente 250 a 500 ml. Ambos os sobrenadantes resultantes das extrações de proteínas em meio alcalino e ácido foram carregados sobre colunas de Sephadex G-25 previamente calibradas e equilibradas com tampão acetato de sódio a 0,005 M (pH 5,2). As frações obtidas foram monitoradas por espectrometria óptica a um comprimento de onda de 280 nm. As frações ricas em proteína de cada uma das extrações ácida e alcalina foram novamente misturadas e concentradas, tendo desta vez seus volumes ajustados a respectivamente 1.000 e 60 ml.

Cotilédones fetais

Extração de proteínas em pH ácido Extração de proteínas em pH alcalino (placentas de 20-21 semanas de gestação) (placentas de 10-11 semanas de gestação)

Cromatografia de afinidade Cromatografia de afinidade (gel de pepstatina A-agarose) (gel de pepstatina A-agarose) Isolamento

Eletroforese monodimensional Coloração Coomassie Blue (1-D SDS-PAGE) Western blot

Eletroforese bidimensional Sequenciamento N-terminal Caracterização (2-D SDS-PAGE)

FIGURA 20 - Esquema de purificação da PAG extraída a partir de placentas zebuínas com o auxílio de cromatografias de afinidade.

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3.1.2.3. Cromatografia de afinidade Aproximadamente 40 e 20 ml (500 e 800 mg) dos extratos brutos contendo as proteínas extraídas em meio ácido e alcalino foram depositadas sobre colunas de pepstatina-A agarose (1 cm x 4 cm; Sigma, St Louis, USA) previamente equilibradas com tampão acetato de sódio a 0,05 M (pH 5,2) em um Sistema Avançado de Purificação de Proteínas Waters 650 (Millipore Corp., Bedford, MA). Após a eliminação das proteínas adsorvidas pela lavagem com o tampão inicial, um gradiente linear (0-1 M NaCl) foi aplicado a um fluxo constante de 0,5 ml/min. Em seguida, um gradiente de pH de 5 a 10 foi aplicado a fim de liberar proteínas fortemente retidas pela afinidade à pepstatina A. Frações de 1 ml foram coletadas e monitoradas por espectrometria a 280 nm. Todas as frações pertencentes a um mesmo pique de proteína foram misturadas, dialisadas contra tampão bicarbonato de amônia a 5 mM (pH 8), centrifugadas a 36.000 g por 30 minutos e finalmente liofilizadas.

3.1.2.4. Caracterização da PAG Assim como descrito no protocolo anterior, as proteínas presentes nos diferentes piques das colunas de pepstatina A-agarose foram caracterizadas quanto à massa molecular (1-D SDS-PAGE), quanto à imunoreatividade (Western Blot) e quanto ao ponto isoelétrico (2-D SDS-PAGE). As proteínas imunoreativas após Western Blot foram seqüenciadas em sua extremidade N-terminal.

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3.2. Experimento 2 – Dosagens radioimunológicas da PAG (PAG-RIA) durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebu 3.2.1. Animais Os animais utilizados no presente estudo foram provenientes da zona Sub-Saheliana do Burkina Faso (12°22’ de latitude Norte e 1°31’ e de longitude Oeste). Esta região caracteriza-se por apresentar uma precipitação anual média de 894 mm, com temperaturas mínimas variando entre 8 e 20°C na estação chuvosa (Junho a Outubro) e de 26 a 39°C na estação seca (Novembro a Maio). Doze vacas zebu da raça Azawak, com idades variadas e, em sua maioria múltiparas, foram diagnosticadas como gestantes por palpação retal, sendo usadas no presente estudo. Todos os animais apresentavam aparência clínica normal e escores de condição corporal (BCS) entre 4 e 5 no início do experimento. A condição corporal foi estimada de acordo com uma escala a qual varia de 1 a 9 pontos (EVERSOLE et al. , 2000). As vacas Azawak foram criadas em um sistema semi-intensivo, alimentando-se de pastagem nativa (savana, com predominância de espécies arbustivas) e tendo livre acesso à água e à suplementação mineral. Os animais pastavam aproximadamente durante 6 horas por dia, sendo liberadas pela manhã e presas no curral a tarde

3.2.2. Amostras de sangue As amostras de sangue foram coletadas em tubos heparinizados a 5-10 dias de intervalo. As coletas foram feitas por punção da veia jugular, aproximadamente da 8 a semana de gestação até a 10 a semana pós-parto

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(pp). O plasma foi obtido por centrifugação imediata das amostras de sangue (1.500 g durante 15 min), tendo sido estocado a –20°C até o momento das dosagens.

3.2.3. Reagentes utilizados nas dosagens PAG-RIA Os principais reagentes utilizados foram preparados com o uso de PAG purificada a partir da placenta de zebuínos. Esta PAG foi utilizada tanto como solução padrão (antígeno frio ou não marcado) quanto como marcador (antígeno quente ou marcado).

3.2.3.1. Tampão da dosagem RIA A solução estoque do tampão de dosagem (tampão Tris) foi constituída de Tris a 25 mM, contendo MgCl 2 a 10 mM e 0,1 mg/ml de sulfato de neomicina. Esta solução teve seu pH ajustado a 7,5 pelo uso de HCl (0,5 N). Pouco antes da realização das dosagens, foi adicionada uma proporção de 1,0 grama de BSA por litro de tampão.

3.2.3.2. Antígeno marcado

A boPAG 67 de origem zebuína obtida no Experimento 1 (DEAE 0,08 M, CM pique IX) foi marcada com o isótopo radioativo I 125 pelo método da cloramina T (GREENWOOD et al. , 1963). Maiores detalhes sobre esta técnica são fornecidas no Anexo A.

3.2.3.3. Curvas padrão Dois sistemas de dosagem foram usados para medir as concentrações periféricas maternas de PAG ao longo da gestação e período pós-parto em

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fêmeas zebuínas. O primeiro sistema, chamado sem pré-incubação (RIA-SPI), foi utilizado para mensurar as mais altas concentrações de PAG observadas ao longo da gestação e período pós-parto. Neste caso, a curva padrão possuía pontos de diluição variando entre 0,8 e 100 ng/ml. O segundo sistema de dosagem, denominado dosagem com etapa de pré-incubação (RIA-PI) foi utilizado para mensurar as mais baixas concentrações observadas durante o início da gestação e o final do período pós-parto. Neste caso a curva padrão variava de 0,2 a 25 ng/ml. A preparação purificada de PAG de origem zebuína foi inicialmente diluída em tampão fosfato na proporção de 10 µg de proteína/100 ml de tampão. Essa solução foi aliquotada, constituindo-se no primeiro ponto de diluição da curva padrão usada no RIA-SPI.

3.2.3.4. Soro sem PAG O soro ou plasma de novilhas impúberes foi coletado e testado diversas vezes para comprovar a ausência de PAG nestas amostras. Estas amostras de soro ou plasma comprovadamente sem PAG (serum free ou SF) foram aliquotadas, sendo adicionadas às curvas padrão para diminuir a influência das proteínas do plasma sangüíneo sobre as concentrações de PAG obtidas pelas dosagens RIA.

3.2.3.5. Anti-soro O anti-soro (AS), também conhecido como primeiro anticorpo, foi produzido em coelhos segundo o protocolo descrito por VAITUKAITIS et al. (1971) com algumas modificações (cf. Anexo A). Três diferentes

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preparações de PAG (DEAE 0,08 M, CM pique IX; pique imunoreativo reativo da pepstatina-A agarose obtido de extratos cotiledonários extraídos em KCl e DEAE 0,04 M, CM pique XI) foram utilizadas para imunizar coelhos (782, 785 e 786). Os anti-soros foram testados quanto ao título de anticorpos presentes e quanto à ligação não-específica do mesmo (non-specific binding ou NSB). A diluição ideal de cada anti-soro foi considerada como sendo aquela na qual 30 % da PAG marcada foi ligada ao anticorpos presentes na ausência da PAG não marcada (tubo branco contendo 0 ng de PAG/ml ou B 0). Para a realização das dosagens ao longo da gestação e período pós-parto foi escolhido o AS782, o qual mostrou ter títulos de anticorpos ideais a uma diluição de 1:150.000, com NSB inferiores a 1 %.

3.2.3.6. Sistema de precipitação A separação entre as frações radioativas livre e conjugada foi feita pela adição de um sistema precipitante o qual contém um segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas de coelhos. Este sistema precipitante é composto basicamente por uma mistura de imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho (0,83 % volume : volume), de soro normal de coelho (0,17 % volume : volume), de polietileno glicol 6000 (20 mg/ml; Vel), de celulose microcristalina (0,05 mg/ml; Merck) e de BSA (2 mg/ml; ICN Biochemicals) diluídos em tampão Tris-HCl (pH 7,5).

3.2.4. Metodologia utilizada para as dosagens PAG-RIA As amostras de sangue foram primeiramente dosadas no sistema RIA- SPI. Resumidamente, 0,1 ml de cada amostra a ser dosada ou de cada ponto

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de diluição da curva padrão foram aliquotadas em duplicata em tubos de poliestireno, tendo essas amostras sido diluídas respectivamente com 0,1 e

0,2 ml de tampão Tris-BSA. Nos tubos correspondentes ao branco (B 0) e ao NSB, a amostra da curva padrão é substituída por 0,1 ml de tampão. Para diminuir a interferência das proteínas do plasma, 0,1 ml de plasma sem PAG (SF) foram adicionados a todos os pontos de diluição da 125 curva padrão, aos tubos NSB e B 0. Em seguida, 0,1 ml de I-PAG (aproximadamente 28.000 cpm) e 0,1 ml de AS782 foram adicionados a todos os tubos exceto os tubos NSB, nos quais o anti-soro foi substituído por 0,1 ml de tampão Tris-BSA. Os tubos correspondentes à radioatividade total (Tc) receberam 0,1 ml de 125 I-PAG cada. Uma vez adicionados, todos os reagentes foram incubados durante aproximadamente 16 horas a uma temperatura de 20°C. No dia seguinte, 1,0 ml do sistema de precipitação foi adicionado a todos os tubos exceto os Tc, tendo sido feita uma curta incubação de 30 minutos à temperatura ambiente. As frações contendo as PAGs marcadas livre e ligada ao anticorpo foram separadas por centrifugação (1.500 g x 20 min) após a lavagem com 2 ml de Tris-BSA. O sobrenadante foi aspirado e o precipitado foi lavado uma segunda vez com 2 ml de Tris-BSA. Após aspiração do segundo sobrenadante, foi feita a contagem da radioatividade dos precipitados dos tubos da curva padrão e das amostras de plasma. A contagem foi feita durante 2 minutos em um contador de radioatividade MultiGamma (LKB Wallac 1261; Turku, Finlândia). A taxa de ligação entre a PAG-I125 e o AS782 foi considerada como

100 % no tubo considerado como branco (B 0), o qual contém 0 ng PAG/ml. As amostras de plasma contendo concentrações de PAG inferiores à

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80 % de ligação entre a amostra padrão mais diluída e o ponto correspondente a B 0 (B/B 0 < 80 %) foram dosadas em um sistema RIA-PI. Neste sistema, uma etapa adicional de 16 horas de incubação foi feita antes da adição da PAG marcada. No dia seguinte, a PAG marcada foi adicionada e uma segunda etapa de incubação de 4 horas foi feita antes da adição do sistema precipitante. As amostras de plasma contendo concentrações de PAG superiores a 20 % de ligação entre a amostra padrão mais concentrada e o ponto correspondente a B 0 (B/B 0 > 20 %) foram diluídas na proporção 1/10 e 1/50, sendo novamente dosadas no RIA-SPI.

3.2.5. Características das dosagens PAG-RIA Os limites mínimos de detecção (LMD) de ambos os RIA foram determinados como sendo a média subtraída de duas vezes o desvio padrão de 20 replicatas do amostra B 0. Quatro amostras contendo concentrações diferentes de PAG foram usadas para calcular os coeficientes de variação intra-ensaio e inter-ensaio de ambos os sistemas (RODBARD et al. , 1974).

3.2.6. Análise estatística As concentrações de PAG durante a gestação e período pós-parto foram apresentadas como média ± desvio padrão (média ± DP). As concentrações de PAG obtidas em uma fêmea Azawak (ZSand) foram consideradas como anormais pelo teste de comparação de médias (DAGNIELE, 1975), tendo sido excluídas da análise estatística. O efeito da semana sobre as concentrações de PAG foi testado contra

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os erros residuais usando-se para tal as opções STDERR e PDIFF do Procedimento GLM do SAS (User´s Guide, 2002). A meia vida da PAG foi calculada conforme previamente descrito por KLINDT et al. (1979).

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4. RESULTADOS

4.1. Experimento 1 – Purificação e caracterização de glicoproteínas associadas à gestação 4.1.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de íons (Protocolo 1) Conforme mostrado na TABELA 6, as proteínas imunoreativas à PAG representaram 0,93 % do total de proteínas solúveis extraídas de placentas de vacas zebu coletadas entre a 30 a e 31 a semanas de gestação. Aproximadamente 87,89 % das proteínas imunoreativas presentes no extrato inicial (extrato bruto) permaneceram no sobrenadante após sua acidificação a pH 4,5. Após precipitações em sulfato de amônia a 0-40 % de saturação e a 40-80 % de saturação, as proteínas imunoreativas representavam respectivamente 0,23 % e 91,15 % das proteínas imunoreativas inicialmente presentes no extrato bruto.

TABELA 6 - Recuperação de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após diferentes etapas de extração e precipitação.

a b Proporção Etapa analisada PAG (mg) PT (mg) PAG:PT Extração bruta 334,5 35.924 0,93 % Precipitação ácida 294,0 20.236 1,45 % Fração 0-40 % S.A. 0,76 173 0,44 % Fração 40-80 % S.A. 304,9 3.855 7,91 % aQuantidade de PAG estimada por RIA. bProteína total (PT) calculada pelo método de Lowry.

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Como pode ser visto na TABELA 7, as proteínas contidas na fração 40-80 % S.A. foram eluídas da coluna DEAE equilibrada em tampão Tris- HCl (pH 7,6) principalmente quando foram atingidas as concentrações correspondentes a 0,04 M, 0,08M e 0,16 M de NaCl (17,64 %, 45,96 % e 20,56 % do total de proteínas imunoreativas obtidas após a cromatografia). Estas frações, assim como as frações DEAE menos imunoreativas foram em seguida submetidas a cromatografia de troca de cátions em resina CM cerâmica.

TABELA 7 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) mensuradas após eluição na coluna de Sephadex A25.

a b Proporção Fração DEAE PAG (mg) TP (mg) PAG:PT 0 M NaCl 8,33 282,7 2,95 % 0,02 M NaCl 5,63 114,6 4,91 % 0,04 M NaCl 30,74 176,3 17,44 % 0,08 M NaCl 80,07 292,9 27, 34% 0,16 M NaCl 35,78 666,0 5,37 % 0,32 M NaCl 7,49 292,4 2,56 % aQuantidade de PAG estimada por RIA. bProteína total (PT) calculada pelo peso após liofilização.

Como pode ser visto nas TABELAS 8, 9 e 10, após cada cromatografia em coluna CM, foram observados entre 10 e 20 piques de proteínas. Os perfis cromatográficos destas cromatografias encontram-se descritos em maiores detalhes na FIGURA 21.

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TABELA 8 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0 M e 0,02 M NaCl.

DEAE 0 M DEAE 0,02 M Pique Concen- Concen- PAG a PT b Propor- Concen- Concen- PAG a PT b Propor- tração tração (mg) (mg) ção tração tração (mg) (mg) ção inicial de final de PAG:PT inicial de final de PAG:PT NaCl NaCl (%) NaCl NaCl (%) (M) (M) (M) (M) I 0 0,04 0,1995 87,9 0,23 0 0 0 5,5 0 II 0,04 0,08 0,0002 0,1 0,20 0 0 0 2,4 0 III 0,08 0,09 0 0,1 0 0 0 0 2,4 0 IV 0,09 0,12 0,0183 1,0 1,83 0 0,08 0 2,5 0 V 0,12 0,14 0,0494 0,5 9,88 0,08 0,13 0 1,0 0 VI 0,14 0,17 0,1588 1,0 15,88 0,13 0,26 0 4,0 0 VII 0,17 0,18 0,1944 1,0 19,44 0,26 0,33 0 5,6 0 VIII 0,18 0,22 0,3876 1,8 21,53 0,33 0,36 0,0184 10,4 0,18 IX 0,22 0,27 0,6677 2,8 23,85 0,36 0,38 0,1879 4,8 3,91 X 0,27 0,33 1,1947 2,9 41,20 0,38 0,39 0,7552 3,8 19,87 XI 0,33 0,38 0,9876 3,7 26,69 0,39 0,41 0,8932 3,9 22,90 XII 0,38 0,46 0,1017 17,7 0,57 0,41 0,42 0,6386 15,2 4,20 XIII 0,46 0,65 0,0118 15,6 0,08 0,42 0,46 0,0143 5,8 0,25 XIV - - - - - 0,46 0,48 0,0034 3,1 0,11 aCalculado por PAG-RIA. bCalculado pelo peso após liofilização.

Quando calculada a proporção entre a quantidade estimada de PAG obtida por RIA e a quantidade de proteína total (PT) presentes em cada pique das diferentes cromatografias em resina CM cerâmica, foram observados piques únicos de PAG. Os piques CM mais imunoreativos foram obtidos após cromatografia das frações DEAE 0,04 e 0,08 M de NaCl, tendo sido eluídos por concentrações de NaCl situadas entre 0,14 e 0,18 M. Os piques CM apresentando menor imunoreatividade foram obtidos após cromatografia

124

das frações DEAE 0 M, 0,02 M, 0,16 M e 0,32 M de NaCl, tendo sido eluídos por concentrações de NaCl situadas entre 0,21 e 0,41 M.

TABELA 9 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0,04 M e 0,08 M NaCl.

DEAE 0,04 M DEAE 0,08 M Pique Concen- Concen- PAG a PT b Propor- Concen- Concen- PAG a PT b Propor- tração tração (mg) (mg) ção tração tração (mg) (mg) ção inicial de final de PAG:PT inicial de final de PAG:PT NaCl NaCl (%) NaCl NaCl (%) (M) (M) (M) (M) I 0 0 0 0 0 0 0 0,0033 16,5 0,02 II 0 0 0 7,9 0 0 0 0,0012 1,6 0,08 III 0 0 0 2,5 0 0 0,02 0,0190 4,4 0,43 IV 0 0,02 0 1,2 0 0,02 0,04 0,0045 0,7 0,64 V 0,02 0,04 0 1,8 0 0,04 0,06 0,0026 2,2 0,12 VI 0,04 0,06 0 4,4 0 0,06 0,08 0,0016 1,5 0,11 VII 0,06 0,08 0 1,9 0 0,08 0,11 0,0483 1,6 3,02 VIII 0,08 0,10 0 2,8 0 0,11 0,14 7,9478 13,6 58,44 IX 0,10 0,14 0,0017 6,8 0,03 0,14 0,17 20,9184 19,5 > 100 X 0,14 0,16 2,5081 8,6 29,16 0,17 0,19 3,0624 8,0 38,28 XI 0,16 0,18 12,7215 10,7 > 100 0,19 0,22 0,7722 5,2 14,85 XII 0,18 0,24 5,0146 15,3 32,78 0,22 0,24 0,7226 5,9 12,25 XIII 0,24 0,26 0,2799 3,2 8,75 0,24 0,27 0,3240 5,3 6,11 XIV 0,26 0,35 0,2967 16,6 1,79 0,27 0,32 0,2288 14,9 1,54 XV 0,35 0,37 0,0201 1,5 1,34 0,32 0,37 0,0970 9,6 1,01 XVI 0,37 0,44 0,0338 7,6 0,45 0,37 0,56 0,1009 8,9 1,13 XVII 0,44 0,46 0,0060 0,8 0,75 0,56 0,67 0,0108 1,3 0,83 XVIII 0,46 0,48 0,0058 0,7 0,82 - - - - - XIX 0,48 0,51 0,0058 0,6 0,97 - - - - - XX 0,51 0,58 0,0038 0,5 0,76 - - - - - aCalculado por PAG-RIA. bCalculado pelo peso após liofilização.

125

TABELA 10 - Quantidade de proteínas imunoreativas à PAG e de proteínas totais (PT) obtidas após cromatografia em coluna CM Cerâmica das frações DEAE 0,16 M e 0,32 M NaCl.

DEAE 0,16 M DEAE 0,32 M Pique Concen- Concen- PAG a PT b Propor- Concen- Concen- PAG a PT b Propor- tração tração (mg) (mg) ção tração tração (mg) (mg) ção inicial de final de PAG:PT inicial de final de PAG:PT NaCl NaCl (%) NaCl NaCl (%) (M) (M) (M) (M) I 0 0 0,0052 29,0 0,02 0 0 0,7821 126,1 0,62 II 0 0,02 0,0067 6,1 0,11 0 0,21 0,2736 0,7 39,08 III 0,02 0,04 0,0029 2,4 0,12 0,21 0,27 0,1936 0,3 64,55 IV 0,04 0,08 0,0024 1,7 0,14 0,27 0,30 0,0398 0,2 19,90 V 0,08 0,12 0,0064 4,0 0,16 0,30 0,35 0,0358 0,6 5,97 VI 0,12 0,19 0,0035 2,9 0,12 0,35 0,40 0,0081 1,0 0,81 VII 0,19 0,23 0,0026 1,6 0,16 0,40 0,44 0,0031 1,2 0,26 VIII 0,23 0,30 2,825 9,6 29,43 0,44 0,49 0,0032 1,2 0,27 IX 0,30 0,32 1,3308 18,8 7,08 0,49 0,60 0,0017 0,5 0,34 X 0,32 0,36 0,2567 38,7 0,66 0,60 0,85 0,0022 0 0 XI 0,36 0,39 0,0443 13,1 0,34 - - - - - XII 0,39 0,44 0,0336 4,4 0,76 - - - - - XIII 0,44 0,52 0,0115 1,7 0,68 - - - - - aCalculado por PAG-RIA. bCalculado pelo peso após liofilização.

Após cromatografia em resina CM cerâmica, as proteínas existentes no pique mais imunoreativo de cada cromatografia foram analisadas quanto a suas massas moleculares, a suas imunoreatividades com o uso de 3 anti- soros de origens distintas e quanto a seus pontos isoelétricos. A FIGURA 22 mostra a análise eletroforética (1-D SDS-PAGE e Western Blot) das proteínas presentes no pique mais imunoreativo de diferentes CM cerâmicas realizadas. As massas moleculares calculadas para as bandas mais imunoreativas, assim como seus respectivos pontos isoelétricos calculados por 2-D SDS-PAGE estão descritos na TABELA 11.

126

22,9 %

41,2 %

> 100 % > 100 %

29,4 %

64,6 %

FIGURA 21 - Perfis cromatográficos das frações DEAE 0 M a 0,32 M NaCl submetidas a FPLC em coluna CM cerâmica. A coluna (1 x 3 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de amônia a 10 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. As áreas hachuradas indicam as frações mais imunoreativas de cada cromatografia. As percentagens indicam a proporção entre PAG e proteína total (PT).

127

FIGURA 22 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12 %) após coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio de Western Blot com o uso do AS497 (anti-boPAG 67 ). As pistas 1, 2, 3, 4 and 5 correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após cromatografia em resina CM cerâmica das frações DEAE 0, 0,02, 0,04, 0,08 e 0,16 M NaCl. Vinte microgramas de proteínas de cada pique foram carregadas. As massas moleculares (x 10-3) estão indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 22A e 22B, respectivamente.

A banda mais intensamente corada de cada pique CM revelou-se imunoreativa após Western Blot com o uso de anti-soro anti-boPAG 67 (AS497). Uma imunoreatividade semelhante foi observada após Western

Blot com o uso dos anti-soros anti-caPAG 55+62 (AS706) e anti-caPAG 55+59 (AS708). A redução com o agente redutor mercaptoetanol não afetou a massa molecular das proteínas imunoreativas.

128

4.1.2. Análise da seqüência N-terminal das proteínas imunoreativas isoladas com o auxílio de cromatografias de troca de íons (Protocolo 2) Após transferidos sob membrana de PVDF, os spots correspondentes às bandas imunoreativas detectadas por Western Blot foram seqüenciados em sua porção N-terminal. Os quatro spots correspondentes à fração DEAE 0,08 M NaCl, CM pique IX foram seqüenciadas, revelando a seqüência Arg-Gli-Ser-A?n-Leu-Tre-Tre-His-Pro-Leu-Arg-Asn-Ile-Lis-A?n-Leu-Val- Tir-Met-Gli-Asn-Ile-Tre -Ile-Gli, a qual corresponde à extremidade N- terminal da boPAG-1 (código de acesso SWISS-PROT Q29432). A mesma seqüência foi verificada em um dos spots da fração DEAE 0,04 M NaCl, CM pique XI. Esta seqüência foi depositada no banco de dados SWISS- PROT, tendo recebido o código de acesso P83126.

TABELA 11 - Características eletroforéticas e identidade ao nível de seqüência N- terminal das proteínas mais imunoreativas isoladas pela cromatografia em resina CM cerâmica.

a Fração MM das principais bandas coradas pIs das proteínas Identidade ao nível DEAE de imunoreativas b de seqüência de aa origem Coomassie Blue Western Blot N-terminal 0 M NaCl 51 kDa 50 kDa 6,4, 6,6, 6,7 boPAG-1 (10 aa) 0,02 M NaCl 62 kDa 56 kDa 5,2, 5,5 boPAG-1 (10 aa) 0,04 M NaCl 66 kDa 67 kDa 5,1, 5,2, 5,4 boPAG-1 (25 aa) 0,08 M NaCl 67 kDa 71 kDa 5,0, 5,1, 5,2, 5,3 boPAG-1 (25 aa) 0,16 M NaCl 67 kDa 67 kDa 4,4, 5,0, 5,5, 6,0 boPAG-1 (10 aa) 60 kDa - - - 0,32 M NaCl 62 kDa 62 kDa 5,8, 6,1, 6,3, 6,4 α-N-acetil-galactosaminidase (12 aa) aMassas moleculares (MM) foram estimadas por 1-D PAGE-SDS. bPontos isoelétricos (pIs) foram estimados por 2-D PAGE-SDS.

129

O microseqüenciamento N-terminal (10 aa) das proteínas imunoreativas provenientes dos piques CM das frações DEAE 0 M, 0,02 M e 0,16 M NaCl também revelaram 100 % de identidade com a seqüência N- terminal da boPAG-1. Apesar da alta imunoreatividade detectada após RIA de um dos piques CM da fração DEAE 0,32 M NaCl (62,55 %), o microseqüenciamento da proteína mais imunoreativa (FIGURA 23) revelou a seqüência Leu-Glu- Asp-Gli-Leu-Leu-Arg-Lis-Pro-Pro-Met-Gli, a qual apresenta uma alta identidade (91,65 %) com a alfa-N-acetilgalactosaminidase de camundongos (código de acesso SWISS-PROT O88620). A seqüência da proteína correspondente à galactosaminidase, isolada a partir da placenta de zebuínos, foi depositada no banco de dados SWISS-PROT, tendo recebido o código de acesso P83127.

130

4.1.3. Caracterização da PAG identificada após a realização de cromatografias de afinidade em gel de pepstatina A-agarose (Protocolo 2) 4.1.3.1. Extração ácida Conforme estimado por RIA, as proteínas reativas à PAG representavam 0,61 % (73,73 mg) das proteínas extraídas em pH ácido. O pique imunoreativo obtido após cromatografia em gel de pepstatina A- agarose foi eluído a concentrações de NaCl situadas entre 0,14 e 0,43 (FIGURA 24). Este pique apresentou uma proporção de 15,74 % entre a quantidade estimada de PAG (mensurada por RIA) e a quantidade de PT (mensurada pelo método de Lowry). Conforme observado por espectrometria (comprimento de onda de 280 nm), após a aplicação do gradiente de pH, nenhum pique protéico foi observado.

15,7 %

FIGURA 24 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-agarose. A extração das placentas coletadas entre 20 e 21 semanas de gestação foi feita em pH ácido (KCl a 0,3 M, pH 5,0). A coluna (1,6 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT).

131

Uma única banda protéica foi observada após 1-D SDS-PAGE do pique imunoreativo (FIGURA 25A, pista 1). A realização de 2-D SDS- PAGE com uma maior quantidade de proteínas provenientes deste pique (200 µg) revelou a existência de três spots, o primeiro correspondendo a uma massa molecular de 67 kDa, e os dois outros correspondendo a uma massa molecular de 84 kDa (pI 4,4 e 5,4).

FIGURA 25 - A) Proteínas visíveis em 1-D SDS-PAGE (12 %) após coloração por Azul de Coomassie; B) Análise das proteínas imunoreativas por meio de Western Blot com o uso dos anti-soros anti-boPAG67 (AS497), anti- caPAG 55+62 (AS706) and caPAG 55+59 (AS708). As pistas 1 e 2 correspondem aos piques mais imunoreativos obtidos após cromatografia em pepstatina A-agarose após extração em pH ácido e alcalino, respectivamente. Sessenta microgramas das proteínas imunoreativas de cada pique foram carregadas. As massas moleculares (x 10 -3) estão indicadas nos lados esquerdo e direito das Figuras 25A e 25B, respectivamente.

132

O microseqüenciamento da extremidade N-terminal (14 aa) do spot de 67 kDa revelou 100 % de identidade com a seqüência da boPAG-1. Os spots de 84 kDa tiveram o seqüenciamento bloqueado ao 1 o e 6 o ciclos (pI de 4,4 e 5,4, respectivamente). O seqüenciamento do spot correspondente ao pI 4,4 revelou a seqüência Ala-Val-Asp-Gli-Gli-His, a qual não corresponde a nenhum membro da família das PAGs.

4.1.3.2. Extração alcalina Conforme estimado por RIA, as proteínas imunoreativas à PAG representavam 1,81 % (43,57 mg) das proteínas extraídas em pH alcalino. Após cromatografia em coluna de pepstatina A-agarose, as proteínas extraídas em pH alcalino foram fracionadas em diversos piques (FIGURA 26), o mais reativo deles tendo sido eluído a concentrações de NaCl situadas entre 0,19 e 0,42 M. Nenhuma proteína foi eluída após a aplicação do gradiente de pH. A análise eletroforética (1-D SDS-PAGE) do pique imunoreativo revelou a existência de uma banda protéica mais fortemente corada com uma massa molecular aparente de 69 kDa, e de diversas bandas mais fracamente coradas, cujas massas moleculares variaram entre 20 kDa e 84 kDa (FIGURA 25A, pista 2). Após Western Blot, duas bandas imunoreativas foram reveladas. Essas bandas apresentavam massas moleculares aparentes de 69 e 84 kDa (FIGURA 25B, pistas 2). Após análise por 2-D SDS-PAGE, foram visualizadas três variantes isoelétricas correspondentes à massa molecular de 69 kDa (pI 3,1, 3,3 e 6,18). O microseqüenciamento N-terminal de um destes spots (14 aa) revelou 100 % de identidade com a seqüência da boPAG-1.

133

3,3 %

FIGURA 26 - Perfil cromatográfico em coluna de pepstatina A-agarose. A extração das placentas coletadas entre 10 e 11 semanas de gestação foi feita em pH alcalino (tampão bicarbonato de amônia a 0,05 M, pH 8,5). A coluna (1,6 x 4 cm) foi previamente equilibrada em tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5,2). A linha negra indica o gradiente de NaCl. A área hachurada indica a fração mais imunoreativa. A percentagem indica a proporção entre PAG e proteína total (PT), conforme determinado por RIA (PAG) e pelo método de Lowry (PT).

Apesar de altamente reativa após Western Blot com o uso de anti- soros de origem bovina e caprina, a proteína 84 kDa revelou a seqüência Asp-Lis-Asn-Ala-Tir-Gli-Ile-Asp-Leu-Ile-Leu, a qual apresenta 77,78 % de identidade com a metaloproteinase alcalina (código de acesso GenBank AAK22731) identificada no genoma do Caulobacter crescentus . A seqüência da proteína correspondente à metaloproteinase, isolada a partir da placenta de zebuínos, foi depositada no banco de dados SWISS-PROT, tendo recebido o código de acesso P83128.

134

4.2. Experimento 2 - Dosagens radioimunológicas da PAG (PAG-RIA) durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebu 4.2.1. Características das dosagens PAG-RIA As TABELAS 12 e 13 resumem algumas das principais características dos sistemas RIA homólogos usados para mensurar as concentrações plasmáticas de PAG no plasma de fêmeas zebuínas.

TABELA 12 - Características dos sistemas RIA com e sem etapa de pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI) utilizados para mensurar as concentrações de PAG presentes em amostras de plasma de fêmeas zebu gestantes.

b Dose estimada (ng/ml) a B/B 0 Sistema Limite mínimo de Ligação não- B0/T detecção (ng/ml) específica (%) (%) a 20 % 50 % 80 %

RIA-PI 0,20 < 1,0 23 7,83 2,47 0,76

RIA-SPI 1,11 < 1,0 28 114,34 26,67 6,24 a B0/T = Quantidade de PAG marcada no tubo B 0 Quantidade total de PAG marcada adicionada. b B/B 0 = Quantidade de PAG marcada na curva padrão Quantidade de PAG marcada no tubo B 0.

Na presença de excesso de anticorpos, 83,6 % da PAG marcada foi ligada. O deslocamento das curvas padrão foi altamente reproduzível, variando de 90,7 ± 2,0 % a 12,5 ± 1,1 % (n = 10) de ligação no sistema RIA-PI, e de 92,2 ± 1,2 % a 6,4 ± 1,0 % (n = 10) no sistema RIA-PI (FIGURA 27).

135

TABELA 13 - Coeficientes de variação (CV) intra-ensaio e inter-ensaio dos sistemas de dosagem com e sem etapa de pré-incubação (RIA-PI e RIA-SPI).

Intra-ensaio Inter-ensaio

Concentração de CV (%) Concentração de CV (%) PAG a (ng/ml) PAG a (ng/ml) RIA-PI Amostra 1 1,49 ± 0,11 7,4 1,62 ± 0,15 9,4 Amostra 2 3,24 ± 0,11 3,5 3,37 ± 0,05 1,6 Amostra 3 12,73 ± 0,63 4,9 12,01 ± 0,57 4,8

RIA-SPI Amostra 2 3,09 ± 0,34 11,1 3,11 ± 0,43 13,8 Amostra 3 11,73 ± 0,76 6,5 11,99 ± 0,74 6,1 Amostra 4 60,22 ± 4,81 8,0 53,04 ± 6,06 11,4 a(média ± DP)

B/BoB/Bo xx 100100 100

0 0,1 1 10 100 PAGPAG (ng/mL)ng/ml

FIGURA 27 - Curvas padrão (média ± DP) da dosagem de PAG nos sistemas de dosagem com etapa de pré-incubação (-▼-▼-) e sem etapa de pré- incubação (-▲-▲-). Função B/B0 do logaritmo das concentrações de PAG.

136

4.2.2. Perfis de PAG em vacas Azawak Uma das 12 vacas Azawak inicialmente diagnosticadas como gestantes por palpação retal mostrou concentrações de PAG inferiores ao limite mínimo de detecção (< 0,2 ng/ml) e não pariu. Dez vacas Azawak tiveram gestações simples, parindo um total de 3 bezerros machos e 7 fêmeas. Uma outra fêmea zebu deu cria a uma fêmea emaciada. Esta fêmea apresentou concentrações de PAG extremamente elevadas ao longo da gestação, tendo suas concentrações excluídas do perfil geral. Clinicamente, esta vaca caracterizou-se por apresentar um declínio de sua condição corporal, a qual passou de 4-5 no início da gestação, à 1-2 no terço final. A FIGURA 28 mostra o perfil de PAG durante a gestação e período pós-parto em 10 vacas zebuínas da raça Azawak. As concentrações médias semanais de PAG variaram significativamente entre os animais (P<0,0001) e períodos de gestação (P<0,0005). Entretanto, diferenças significativas entre as diferentes semanas de gestação somente foram verificadas uma semana antes do parto. As concentrações médias de PAG aumentaram progressivamente da 8 a à 35 a semanas de gestação (de 6,0 ± 4,2 ng/ml a 196,0 ± 34,8 ng/ml). Em seguida, as concentrações permaneceram relativamente constantes até a 39 a semana (210,8 ± 74,8 ng/ml), alcançando seus mais altos níveis (1.095,6 ± 607,8 ng/ml) na semana do parto (40 a semana). Após o parto, as concentrações de PAG decresceram significativamente (P<0,05), sendo os mais baixos níveis (5,1 ± 5,2 ng/ml) alcançados na 10 a semana pós-parto.

137

PAG (ng/ml) 2000 parto ↓

1500

1000 *

* ** 500

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp10pp15pp Semanas de gestaçao e pos-parto

Após o parto foi calculada uma meia-vida de 10,1 dias para a PAG. Quando estimado pela equação de regressão (FIGURA 29), seria necessário um período de aproximadamente 14 semanas para que as concentrações de PAG se tornassem indetectáveis (< 0,2 ng/ml).

4.2.3. Perfil atípico de PAG A FIGURA 30 mostra o perfil de PAG durante a gestação e período pós-parto em uma fêmea zebu Azawak apresentando concentrações de PAG aproximadamente 3,5 vezes superior a média obtida para a raça. Da 10 a semana da gestação até o parto, foi obtida uma média semanal de 227,6

138

ng de PAG/ml, enquanto que a média semanal obtida nas outras 10 fêmeas gestantes foi de aproximadamente 64,1 ng de PAG/ml.

Ln PAG (ng/ml) 8 Vaca apresentando concentrações elevadas de PAG 7 Y = -0,5165x + 7,67758 6 5 4 População homogênea 3 Y = -0,5095x + 7,42951 2 1

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Semanas apos o parto FIGURA 29 - Curvas de regressão das concentrações plasmáticas de PAG mensuradas entre a parturição e a 10 a semana pós-parto. As concentrações de PAG nas vacas Azawak que apresentaram concentrações normais de PAG (n = 10) foram representadas por círculos ( ●). As amostras da vaca zebu a qual apresentou altas concentrações de PAG durante a gestação e um baixo BCS ao final da gestação foram representadas por quadrados ( ■).

A meia-vida da PAG estimada para esta vaca foi de aproximadamente 9,2 dias. Assim como o calculado para o restante da raça, seria necessário um período de 14 semanas para que as concentrações de PAG se tornassem indetectáveis (< 0,2 ng/ml).

139

PAG (ng/ml)

1000 População homogênea 800

Vaca apresentando concentrações 600 elevadas de PAG

400

200

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp 10pp15pp

Semanas antes e apos a gestaçao

140

5. DISCUSSÃO

5.1. Isolamento da PAG com o auxílio de cromatografias de troca de íons

O uso de protocolos de purificação com diversas etapas de fracionamento já permitiu o isolamento de diversas formas de PAG a partir da placenta de vacas de raças taurinas (BUTLER et al. , 1982; CAMOUS et al. , 1988; ZOLI et al. , 1991), de cabras (GARBAYO et al., 1998), de ovelhas (WILLARD et al. , 1995; XIE et al. , 1997a) e de cervídeos (HUANG et al. , 1999). Estas formas de PAG foram caracterizadas principalmente quanto à suas massas moleculares e pontos isoelétricos, tendo algumas delas sido caracterizadas também quanto a suas seqüências N-terminais.

Na primeira parte do presente estudo, um protocolo de purificação incluindo precipitação ácida, precipitações em sulfato de amônia e cromatografias de troca de íons foi utilizado para purificar glicoproteínas associadas à gestação extraídas a partir de placentas de fêmeas zebuínas. Considerada por alguns autores como desnecessária (HUANG et al. , 1999), a realização da precipitação mostrou ser uma etapa de grande utilidade ao isolamento da PAG. Ela permitiu a eliminação de mais de 40 % (16 g) das proteínas solúveis presentes no extrato placentário bruto, com uma perda mínima de proteínas imunoreativas à PAG (recuperação de 88 % da imunoreatividade inicial). Não se sabe ao certo se a precipitação ácida seria responsável pela eliminação de algumas formas de PAG. Entretanto, a utilização desta etapa no protocolo de purificação utilizado na espécie caprina não interferiu no

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isolamento de 3 novas formas de PAG, as quais possuíam diferentes massas moleculares, cada qual constituída por diversas isoformas (GARBAYO et al., 1998). Como demonstrado por diversos autores, a realização de cromatografias de troca de íons tem demonstrado ser bastante efetiva para a separação de diferentes formas de PAG extraídas a partir de placentas de cabras (GARBAYO et al., 1998), de ovelhas (WILLARD et al. , 1995; XIE et al. , 1997a) e de cervídeos (HUANG et al. , 1999). Na espécie caprina, por exemplo, após cromatografia em coluna DEAE Celulose, as proteínas imunoreativas foram igualmente eluídas pelas concentrações de 0,04 e 0,08 M de NaCl. O fracionamento posterior de ambas as frações demonstrou a existência de uma PAG de massa molecular 55 kDa (caPAG 55 ) nas duas frações DEAE, assim como a existência de PAGs distintas com massas moleculares 59 kDa (caPAG 59 ) e 62 kDa (caPAG 62 ), respectivamente nas frações 0,04 e 0,08 M NaCl. Na espécie ovina, a associação entre as cromatografias de troca de

ânions e de cátions levou à caracterização de 4 PAGs: a ovPAG 55 , a ovPAG 60 , a ovPAG 61 e a ovPAG 65 (XIE et al. , 1997a). Cada uma destas proteínas demonstrou ser possuidora de uma seqüência N-terminal distinta, apresentando, entretanto, uma alta identidade com os demais membros da família das proteases aspárticas. Em vistas de se investigar a possível existência de diferentes formas de PAG na placenta de zebuínos, todas as frações DEAE foram sistematicamente submetidas a cromatografia de troca de cátions em coluna CM cerâmica, sendo as proteínas presentes nos piques mais imunoreativos analisadas por SDS-PAGE e Western Blot com o uso de anti-soros

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produzidos contra diferentes formas de PAGs. Se levarmos em consideração as diferentes massas moleculares (51 a 67 kDa) e pontos isoelétricos (3,1 a 6,7) encontrados no presente trabalho, nossos resultados confirmam uma grande heterogeneidade de formas de PAGs presentes nos extratos placentários de zebuínos. Considerando-se especificamente as seqüências N-terminais obtidas, nosso primeiro protocolo não revelou a existência de diferentes formas de PAG eluídas em diferentes condições iônicas. De fato, todas as proteínas da família das PAGs bovinas purificadas até o presente (boPAG 67 , bPSPB, PSP-60) apresentaram a mesma seqüência N-terminal, tendo estas seqüências sido obtidas por meio de microseqüenciamento (CAMOUS et al. , 1988) ou deduzidas a partir da seqüência de DNA (XIE et al. , 1991; LYNCH et al. , 1992). Existem ao menos três possíveis explicações para a aparente discrepância entre os resultados obtidos por técnicas bioquímicas e de biologia molecular, a qual permitiu a identificação de 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs em bovinos (XIE et al. , 1991; XIE et al. , 1994; XIE et al. , 1997a,b; GREEN et al. , 2000). A primeira seria a de que, apesar dos ADNs codificantes para diferentes PAGs poderem ser transcritos e traduzidos sob a forma de proteínas, estas poderiam ser rapidamente degradadas, não acumulando em quantidades suficientes, de forma a poder ser identificadas por técnicas bioquímicas. A segunda explicação seria a de que, em bovinos, algumas formas de PAG teriam o seqüenciamento N-terminal bloqueado. Neste caso, apenas proteínas majoritárias não bloqueadas poderiam ser identificadas pela degradação de Edman. A terceira explicação seria a de que algumas das PAGs identificadas por biologia molecular poderiam ser ligadas à membranas via

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ácidos graxos, sendo consequentemente dificilmente extraíveis pelos procedimentos utilizados no Protocolo 1. Entretanto esta hipótese parece ser bastante improvável devido ao fato de que os ADNs codificantes para PAGs identificados até o presente parecem codificar proteínas com uma estrutura bastante próxima à do pepsinogênio (GURUPRASAD et al. , 1996), o qual não é originalmente ligado à membranas. De acordo com XIE et al. (1991), a presença de cadeias laterais de carboidratos seria responsável, ao menos parcialmente, pelas diferenças observadas nas massas moleculares das PAGs. Um outro fator que poderia estar implicado na diferença de suas massas moleculares seria a existência de fragmentos de PAG os quais poderiam constituir-se nas formas de menor massa molecular observadas por eletroforese. Segundo sugerido por ZOLI et al. (1991), os diferentes graus de glicosilação parecem estar também implicados na heterogeneidade dos pontos isoelétricos observados para a boPAG67. No que concerne à seqüência N-terminal, de forma semelhante ao observado em taurinos (ZOLI et al. , 1991), ovinos (XIE et al. , 1997a) e caprinos (GARBAYO et al. , 1998), a PAG extraída da placenta de raças zebuínas falhou em dar sinais no 4 o ciclo o que indica a presença de uma cadeia de carboidratos ligada às Asp 4. Apesar da alta imunoreatividade observada na fração DEAE 0,32 M CM pique III, o seqüenciamento de sua proteína majoritária (62 kDa) mostrou mais de 75 % de identidade com a seqüência N-terminal da alfa- N-acetilgalactosaminidase (α-GalNAc), uma exoglicosidase lisossomal sintetizada em diversos tecidos das espécies humana (WANG et al. , 1990), murina (HERRMANN et al. , 1998) e de galináceos (DAVIS et al. , 1993).

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A α-GalNAc não é estruturalmente, nem enzimaticamente, relacionada às proteinases aspárticas lisossomais tais como a catepsina D. Entretanto, uma expressão anormal de ambas parece estar diretamente relacionada a condições patológicas tais como o câncer (YAMAMOTO et al. , 1997; VIGNESWARAN et al. , 2000) e doenças neurológicas distróficas ou degenerativas (LADROR et al. , 1994; WOLFE et al. , 1995). A forma humana da α-GalNAc também foi acidentalmente identificada como sendo uma das cinco bandas protéicas majoritárias resultantes de procedimentos de purificação das sialidases placentárias (TSUJI et al. , 1989). Conforme descrito por SWEELEY et al. (1983), na espécie humana, α-GalNAc parece ser sintetizada como um precursor glicosilado de 65 kDa, o qual é processado a uma forma madura de 48 kDa. Devido ao fato de ser diretamente responsável pela imunosupressão por um mecanismo que envolve a deglicosilação do precursor do fator ativador de macrófagos (MAF) em pacientes cancerosos (YAMAMOTO et al. , 1997), poderia ser sugerido que a forma placentária da α-GalNAc poderia estar, de alguma forma, envolvida com o mecanismo de imunoregulação ao nível de interface materno-fetal. Entretanto, estudos complementares são necessários para comprovar esta hipótese.

5.2. Caracterização da PAG identificada após a realização de cromatografia de afinidade em gel de pepstatina A-agarose O estudo comparativo entre as estruturas tridimensionais das PAGs bovinas e do pepsinogênio porcino demonstrou que as PAGs teriam conservado a estrutura bilobulada característica das proteases aspárticas, possuindo uma fenda entre os dois lobos capaz de acomodar peptídeos de

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até sete aminoácidos de comprimento (GURUPRASAD et al. , 1996). Como conseqüência, tem sido sugerido que proteínas da família das PAGs poderiam ser purificadas pelo uso de cromatografia de afinidade com o uso de gel de pepstatina A-agarose (GURUPRASAD et al. , 1996; GARBAYO et al. , 2000). A pepstatina A é um inibidor extremamente potente das proteases aspárticas (MARCINISZYN et al. , 1977). Ela se liga reversivelmente a pepsina, a renina e a catepsina D, tendo por isso sido usado como ligante para a realização de cromatografias de afinidade para purificação destas enzimas (DZAU et al. , 1979; AFTING & BECKER, 1981). Na segunda parte do presente estudo, um protocolo de purificação baseado na utilização da coluna de afinidade com gel de pepstatina agarose foi testada para o isolamento da PAG a partir de placentas de fêmeas zebuínas coletadas durante o primeiro e segundo trimestres de gestação. Algumas formas de PAG, diferentes quanto a suas massas moleculares e pontos isoelétricos, puderam ser identificadas após cromatografia de afinidade com o uso de gel de pepstatina A agarose. Quando extratos de placentas coletadas no segundo trimestre de gestação foram extraídas em pH ácido, o uso de gel de pepstatina A-agarose permitiu o enriquecimento do mesmo por um fator de 25,8 (proporção PAG : PT de 15,74 % após a cromatografia versus 0,61 % antes da cromatografia). Uma menor eficácia foi observada após cromatografia de afinidade dos extratos placentários coletados durante o primeiro trimestre de gestação e extraídos em pH alcalino (proporção PAG:PT de 3,26 % após a cromatografia versus 1,81 % antes da cromatografia). Esta baixa eficiência obtida com o isolamento da PAG a partir de extratos placentários coletados durante o primeiro trimestre

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de gestação parece ser devida principalmente à alta viscosidade do mesmo, o que poderia ter tornado difícil uma adequada interação entre a pepstatina A e a PAG. Em ambas as cromatografias de afinidade, a fração contendo a PAG foi eluída antes que fosse atingida uma alta concentração em NaCl, indicando uma fraca interação entre a PAG e a pepstatina A. Este achado é consistente com a teoria de que a substituição de uma Tir89 e de uma Leu220 (numeração de acordo com a seqüência do pepsinogênio porcino) por resíduos de Asp resultaria em uma fraca interação entre a boPAG 67 e o inibidor pepstatina (GURUPRASAD et al. , 1996). Após cromatografia de afinidade, o extrato de placentas coletadas nos dois primeiros trimestres de gestação revelaram a existência de uma única proteína imunoreativa de 67 a 69 kDa de massa molecular aparente. Esta proteínas possuíam, assim como as proteínas isoladas no primeiro protocolo, seqüências N-terminais 100 % idênticas às da proteína previamente isolada e partir da placenta de raças taurinas. Como pôde ser observado na FIGURA 25 (pista 2), uma outra proteína com massa molecular de 84 kDa altamente imunoreativa a anti- soros anti-PAG bovina e caprina foi identificada após a cromatografia de afinidade. O seqüenciamento desta proteína revelou 77,78 % de identidade com a seqüência N-terminal de uma metaloproteinase alcalina previamente identificada no genoma do Caulobacter crescentus (NIERMAN et al. , 2001). Três principais possibilidades poderiam ser sugeridas para a identificação desta proteína em extratos placentários de raças zebuínas. A primeira seria a ocorrência de proliferação bacteriana durante o procedimento de purificação. A segunda possibilidade seria a de que ambas

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as classes de proteínas possuiriam alguns epitopes em comum, podendo ser reconhecidas como resultado de reações cruzadas dos anti-soros policlonais utilizados. A terceira possibilidade seria a expressão natural desta metaloproteinase em extratos placentários de zebuínos. Investigações complementares estão sendo realizadas no sentido de investigar a possibilidade da ocorrência de reações cruzadas entre ambas as classes de proteínas.

5.3. Dosagens radioimunológicas da PAG durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebu

Durante gestações normais, as concentrações de PAG podem diferir consideravelmente entre as espécies e os períodos de gestação (ZOLI et al. , 1992a; RANILLA et al. , 1994; SOUSA et al. , 1999). Em uma mesma espécie, elas podem ser influenciadas por diversos fatores, dentre os quais podem ser citados a raça da fêmea (MIALON et al. , 1993; RANILLA et al. , 1994), o número de fetos (DOBSON et al. , 1993; PATEL et al. , 1997), o genótipo fetal (GUILBAULT et al. , 1991; WILLARD et al. , 1995), o estado nutricional da fêmea (WALLACE et al. , 1997a) e no caso de transferência de embriões, a duração de cultivo in vitro dos embriões (ECTORS et al. , 1996a,b). As concentrações de PAG parecem também diferir de acordo com o sistema radioimunológico utilizado, diferença esta resultando provavelmente da especificidade do antisoro (GONZALEZ et al. , 1999,2000).

Perfis plasmáticos ou sorológicos de PAG já foram descritos em taurinos (ZOLI et al. , 1992a; DOBSON et al. , 1993; PATEL et al. , 1997), em caprinos das raças Blanca-Celtibérica (BENITEZ ORTIZ, 1992;

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FOLCH et al. , 1993), Canindé (SOUSA et al. , 1999), Moxotó (SOUSA et al. , 1999), Canária (GONZÁLEZ et al. , 2000), Alpina (BATALHA et al. , 2001) e em ovinos das raças Assaf (RANILLA et al. , 1997), Churra (RANILLA et al. , 1994), Merino (RANILLA et al. , 1994) e Berrichon (GAJEWSKI et al. , 1999). Entretanto, ao nosso conhecimento, perfis de PAG nunca foram descritos em fêmeas de origem zebuína. Na última parte do presente trabalho, foi descrito o perfil plasmático de PAG durante a gestação e período pós-parto em fêmeas zebuínas gestantes pertencentes à raça Azawak. Algumas das principais características dos sistemas homólogos desenvolvidos para a dosagem da PAG em raças zebuínas também foram descritos. Os sistemas radioimunológicos desenvolvidos a partir do uso da PAG purificada a partir da placenta de fêmeas zebuínas mostraram ser bastante precisos para a mensuração da PAG na circulação periférica materna. Os coeficientes de variação obtidos tanto para o sistema RIA com pré- incubação (RIA-PI) quanto para o sistema de dosagem sem etapa de pré- incubação (RIA-SPI) foram bastante baixos (1,6 a 13,8 %). Eles foram comparáveis aos resultados obtidos por ZOLI et al. (1992a) para a dosagem da PAG de origem taurina (6,9 a 11,6 %) e por GONZALEZ et al . (1999) para a dosagem da PAG caprina (6,9 a 11,6 %). Um outro importante aspecto observado foi o de que quando uma mesma amostra foi dosada por ambos os sistemas (PI e SPI), as concentrações de PAG permaneceram constantes, mesmo se dosadas nas regiões menos sensíveis das curvas padrão (B/B 0 inferior a 80 % de ligação ou superior a 20 % de ligação). No que se refere à aplicação prática dos sistemas RIA aqui descritos, enquanto que o sistema RIA-PI mostrou ser adequado à dosagem da PAG

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durante o início da gestação (concentrações entre 0,8 e 7,8 ng/ml), o sistema RIA-SPI mostrou ser capaz de detectar concentrações tão altas quanto 100 ng/ml, sendo mais adequado ao monitoramento das concentrações de PAG ao longo da gestação e reduzindo a necessidade da diluição das amostras durante a maior parte da gestação. No que diz respeito à comparação dos perfis de PAG em animais de raças zebuína e taurina (ZOLI et al. , 1992a; PATEL et al. , 1997), em ambos os taxas foi observado um lento aumento destas concentrações entre a 8 a e a 35 a semanas de gestação, período durante o qual as concentrações de PAG permaneceram inferiores a 200 ng/ml. Entretanto, enquanto que em zebuínos as concentrações de PAG permaneceram em níveis relativamente constantes da 35 a à 39 a semanas de gestação (196,0 ± 34,8 ng/ml a 210,8 ± 74,8 ng/ml), em raças taurinas este período correspondeu a um rápido aumento das concentrações de PAG (158,9 ± 60,2 a 1.551,9 ± 589,7 ng/ml) (ZOLI et al. , 1992a). Ainda não se sabe se as concentrações relativamente constantes de PAG observadas na raça Azawak resultam do uso de uma PAG purificada a partir da placenta de zebuínos ou a diferenças inerentes à própria raça. Entretanto, a primeira hipótese parece menos provável devido ao fato de que quando diferentes amostras plasmáticas foram dosadas em ambos os sistemas taurino e zebuíno, nenhuma diferença foi observada nas concentrações de PAG. As concentrações de PAG observadas no período próximo ao parto foram inferiores em fêmeas zebuínas (1.095 ng/ml) do que o observado previamente por ZOLI et al. (1992a) e PATEL et al. (1997) em fêmeas de raças taurinas (1.352,8 a 2.462,4 ng/ml). Essas concentrações de PAG aparentemente mais baixas em zebuínos podem ser devidas a diversos

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fatores, dentre os quais podemos citar o fluxo sangüíneo placentário e a massa da placenta. Existem poucas informações sobre o efeito do fluxo sangüíneo placentário sobre as concentrações de hormônios e/ou proteínas de origem placentária (NEWNHAM et al. , 1986). Entretanto, devido ao fato de que os fluxos sangüíneos uterino e placentário parecem ser menores em raças zebuínas do que em raças taurinas (FERREL, 1991), esta hipótese deve ser levada em consideração como uma das possíveis causas dos níveis inferiores de PAG observados no presente estudo. Diversos autores reportaram o efeito da massa placentária sobre as concentrações de PAG (DOBSON et al. , 1993; MIALON et al. , 1993; PATEL et al. , 1997). Conforme descrito por MIALON et al. (1993), próximo ao parto, as concentrações de PSP-60 são significativamente inferiores em raças taurinas que portam bezerros de menor porte (ex.: raça Holandesa e Normanda) do que naquelas que portam bezerros maiores (ex.: raça Charolesa). Segundo esses autores, estas diferenças de concentração são provavelmente devidas à diferenças de massa placentária, o que refletiria indiretamente o número total de células binucleadas produtoras de hormônios e proteínas placentárias. No presente estudo, a massa placentária e o peso dos bezerros não puderem ser obtidos logo após o parto. Entretanto, devido ao fato de que vacas Azawak possuem pesos médios situados entre 300 e 410 kg (PAYNE, 1970), pode-se supor que a massa placentária nesta raça seria inferior àquela estipulada para raças taurinas, explicando parcialmente os menores níveis plasmáticos de PAG observados ao final da gestação. No que diz respeito ao período pós-parto, o período estimado para que as concentrações plasmáticas de PAG se tornem inferiores ao limite

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mínimo de detecção do sistema RIA-PI (< 0,2 ng/ml) foi de aproximadamente 14 semanas. Este período foi comparável aos períodos estimados por ZOLI et al. (1992a) e por MIALON et al. (1993) em raças taurinas (11 a 17 semanas), sendo entretanto, bastante superior ao tempo estimado por KIRAKOFE et al. (1993) em raças taurinas de corte histerectomizadas (10 semanas) ou não (12 semanas). O tempo relativamente longo necessário para que sejam alcançados níveis indetectáveis de PAG parece ser devido principalmente à longa meia-vida desta glicoproteína. A meia vida da PAG calculada no presente trabalho (9,2 a 10,1 dias) foi maior do que a previamente descrita em taurinos (7,0 a 8,8 dias) (SASSER et al ., 1986; SEMAMBO et al. , 1992; ALI et al. , 1997). Uma vez que a meia-vida das glicoproteínas é diretamente influenciada pela presença de cadeias laterais de carboidratos e de ácido siálico (RAFFERTY et al. , 1995), pode-se supor que um padrão diferente de glicosilação poderia estar envolvido com as diferenças de meia-vida observadas. Durante o presente estudo, uma vaca zebu Azawak apresentou um baixo escore de condição corporal (BCS 1 a 2) associado a altas concentrações de PAG durante o final da gestação. Esta vaca foi fecundada no início da estação de chuvas (Julho), parindo no final da estação seca (Abril), momento no qual a vegetação da savana apresentava-se escassa e de má qualidade. A associação entre uma grave carência protéica e/ou energética e a massa placentária total já foram descritas tanto na espécie humana (LUMEY, 1998) quanto na espécie ovina (WALLACE et al. , 1997b). Uma associação entre altos níveis energéticos na dieta, redução da massa placentária e baixas concentrações de PSPB durante a gestação foi

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recentemente descrita por WALLACE et al. (1997a) na espécie ovina. Estes achados parecem indicar conjuntamente que, em alguns casos, um consumo insuficiente de alimentos poderia estar associado com um aumento compensatório da massa placentária com o objetivo de que seja assegurado suporte nutricional necessário ao desenvolvimento do feto. Um outro fator que poderia contribuir para as altas concentrações de PAG observadas ao final da gestação da vaca ZSand seria uma reduzida taxa de clearance desta proteína na circulação materna. Entretanto, devido ao fato de que a meia-vida da PAG foi menor neste animal (9,2 dias) do que nos demais (10,1 dias), esta explicação parece improvável.

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6. CONCLUSÃO

− Diferentes formas de PAG, com massas moleculares variando de 51 a 69 kDa e pontos isoelétricos variando de 3,1 a 6,7 podem ser identificadas na placenta de zebuínos pelo uso de técnicas como cromatografia de troca de íons ou cromatografia de afinidade, associadas ao uso das técnicas de eletroforese monodimensional (1-D SDS PAGE), eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE) e de Western Blot.

− O microsequenciamento da extremidade N-terminal de diversas proteínas identificadas na placenta de zebuínos (10 a 25 aminoácidos) revelou a existência de uma única seqüência de PAG, a qual é idêntica à seqüência previamente descrita no taxa Bos taurus .

− Além da PAG, outras proteínas imunoreativas à PAG podem ser identificadas na placenta de zebuínos. Dentre estas, podem ser citadas alfa-N-acetilgalactosaminidases e metaloproteinases alcalinas.

− As concentrações plasmáticas de PAG em gado zebu aumentam lentamente até a 39 a semana de gestação, permanecendo inferiores a 250 ng/ml. Uma semana antes do parto, elas aumentam significativamente, ultrapassando 1.000 ng/ml.

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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199

ANEXOS

200

ANEXO A – Dosagem da PAG por radioimunoensaio (RIA)

1. Reagentes

- Tubos de poliestireno de dimensões 13 x 70 mm; - Reagentes de qualidade analítica.

1.1. Tampão utilizado 1.1.1. Tampão Tris (solução estoque)

3,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano, C 4H11 NO 3 (Merck)

2,0 g de Cloreto de magnésio, MgCl 2 (Merck)

0,1 g de Nitrato de sódio, NaN 3 (Vel)

- Todos os reagentes são misturados em 800 ml de H 2O deionizada. - Após dissolução completa dos reagentes, o pH da solução é ajustado à 7,5 com o uso de HCl 1,0 N (Merck). - Uma vez ajustado o pH, o volume da solução é completado a 1.000 ml, e a solução pode ser armazenada a 4°C.

1.1.2. Tampão Tris-BSA (solução pronta para uso) - Antes de iniciar-se uma dosagem radioimunológica, é adicionada 1 g de BSA (ICN Biochemicals) por litro de solução estoque de Tris, sendo este tampão conservado a 4°C.

1.2. Antígeno frio ou não marcado (Ag°) - A PAG purificada e liofilizada é dissolvida em tampão fosfato 0,5 M (pH 7,5) na proporção de 10 µg/100 ml, sendo feitas alíquotas de 1

201

ml/tubo. Essa solução estoque contitui-se no primeiro ponto de diluição da curva padrão no sistema de dosagem sem pré-incubação (SPI), ou seja, corresponde ao ponto 100 ng/ml. A partir deste ponto, são feitas diluições na proporção de 500 µl da diluição precedente + 500 µl de tampão, da maneira a obter-se os seguintes pontos de diluição:

Sistema radioimunológico Sem pré-incubação (SPI) Com pré-incubação (PI) Diluição 1 → 100 ng/ml Diluição 1 → 25 ng/ml Diluição 2 → 50 ng/ml Diluição 2 → 12,5 ng/ml Diluição 3 → 25 ng/ml Diluição 3 → 6,25 ng/ml Diluição 4 → 12,5 ng/ml Diluição 4 → 3,13 ng/ml Diluição 5 → 6,25 ng/ml Diluição 5 → 1,56 ng/ml Diluição 6 → 3,13 ng/ml Diluição 6 → 0,78 ng/ml Diluição 7 → 1,56 ng/ml Diluição 7 → 0,39 ng/ml Diluição 8 → 0,78 ng/ml Diluição 8 → 0,20 ng/ml

1.3. Antígeno quente ou marcado (Ag* ou 125 I-PAG) - A PAG utilizada no presente trabalho foi marcada pela técnica da Cloramina T (GREENWOOD et al. , 1963). Resumidamente, em um tubo de poliestireno (8 x 40 mm) contendo 10 µg de PAG liofilizada diluída em 10 µg de tampão fosfato 0,5 M (pH 7,5), são adicionados 10 µl de 125 I- Na (correspondente a 1 mCu; Pharmacia) e 10 µl de uma solução de

Cloramina T (Sigma) diluída a 1 mg/ml em H 2O destilada. O tubo é agitado durante 50 a 60 segundos, sendo adicionados logo em seguida 10 µl de uma solução de 30 mg/ml de metabisulfito de sódio (Sigma)

202

diluído em de H 2O destilada. - Após uma última agitação, a solução é depositada sobre uma coluna de Sephadex G-75 (1 x 35 cm; Pharmacia) previamente equilibrada com tampão Tris-HCl contendo 1 % de BSA. A coluna é lavada com 30 ml do mesmo tampão, sendo coletadas frações de 1 ml cada. - Para a escolha da fração radioativa a ser utilizada, 50 µl de cada fração são diluidos em 950 µl de tampão de dosagens, sendo mensurada a radioatividade de 50 µl de cada diluição.

- A fração radioativa apresentando a maior percentagem de B 0/T associada à menor radioatividade não específica (NSB) é diluída de formas a obter-se entre 28.000 e 30.000 cpm/100 µl de Ag*.

1.4. Soro sem PAG - O soro sem PAG (serum free ou SF) é obtido de novilhas impúberes, por meio de punção da veia jugular. Uma vez coletado, o soro é deixado em repouso por aproximadamente 12 horas, sendo em seguida separado do coágulo sanguíneo, centrifugado e testado em RIA. Se comprovadamente negativo em duas dosagens consecutivas de PAG, o soro é alíquotado a 2,5 ml/tubo, sendo congelado e armazenado como solução estoque.

1.5. Primeiro anticorpo - Para a produção do primeiro anticorpo, utiliza-se o protocolo de VAITUKAITIS et al. (1971) com algumas modificações. - As frações liofilizadas de PAG são inicialmente diluídas em tampão fosfato na proporção de 250 µg de proteína diluída para cada 500 µl de

203

tampão. Aproximadamente 500 µl de adjuvante completo de Freund (GibCo BRL; Grand Island, NY, USA) são utilizados na primeira imunização, sendo o mesmo substituído pelo adjuvante incompleto de Freund (GibCo) a partir da segunda imunização. - Ao total, são feitas 8 imunizações a intervalos de duas semanas. A coleta de sangue é feita a intervalos regulares de 10 dias, sendo a primeira coleta feita 30 dias após a primeira imunização. - O soro sanguíneo (anti-soro) é obtido após a retração do coágulo sanguíneo (por aproximadamente 12 horas), sendo centrifugado, identificado e aliquotado na proporção de 1 ml/tubo. - O nível de anticorpos de cada coleta é então mensurado por meio de diluições seriadas do anti-soro, como mostrado a seguir:

100 µl de soro puro + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/10 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/100 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/1.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/10.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/100.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA 100 µl de soro diluído a 1/1.000.000 + 100 µl de Ag* + 300 µl de Tris-BSA

- A diluição ideal é considerada como aquela na qual são obtidos 30 % de ligação entre o antígeno marcado e o anticorpo.

1.6. Segundo anticorpo - Imunoglobulinas anti-IgG de coelhos, produzidas em ovinos são utilizadas para precipitar o primeiro anti-soro, constituindo-se no segundo anti-soro. O sistema de precipitação pelo uso do segundo anti-soro é composto por

204

uma mistura de imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho (0,83 % volume/volume), de soro normal de coelho (0,17 % volume/volume), de polietileno glicol 6000 (20 mg/ml; Vel), de celulose microcristalina (0,05 mg/ml; Merck) e de BSA (2 mg/ml; ICN Biochemicals) diluídos em tampão Tris-HCl, pH 7.5.

2. Metodologia - Todos os tubos são dosados em duplicata. - As incubações são feitas à temperatura ambiente (20°C).

2.1. Sistema sem pré-incubação - No primeiro dia da dosagem RIA-SPI, são adicionados 100 µl de tampão Tris-BSA a todos os tubos da curva padrão ou aos tubos correspondentes às amostras a serem dosadas, assim como 200 µl de

tampão ao tubo ‘zero PAG’ (B 0) e 300 µl ao tubo NSB (atividade não- específica). - Em seguida, são adicionados 100 µl de cada ponto de diluição da curva padrão e 100 µl de amostra a ser dosada. No caso de dosagens de amostras sanguíneas, são adicionados 100 µl de soro testado sem PAG (SF) a todos os pontos de diluição da curva padrão. No caso de dosagens de amostras resultantes de protocolos de purificação, esses 100 µl são substituídos por 100 µl de tampão. - Em seguida, são adicionados a todos os tubos 100 µl de Ag* contendo 28.000 a 30.000 cpm. - Por fim, são adicionados 100 µl de anti-soro diluídos de forma a obter-

se 25 a 30 % de ligação entre o Ag* e o anti-soro (B 0/T).

205

- Uma vez adicionados todos os reagentes (conferir tabela abaixo), os tubos são agitados no vortex e deixados em repouso durante aproximadamente 16 horas.

Tubos Reagentes Atividade Atividade não- Amostra Ponto de diluição Amostra a total (Tc) específica padrão sem da curva padrão ser dosada (NSB) Ag° (B0) (STD) (UKN) Tampão - 300 µl 200 µl 100 µl 100 µl Ag° - - - 100 µl 100 µl Soro sem PAG (a) - 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Anti-soro - - 100 µl 100 µl 100 µl Ag* (b) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Total 100 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl (a) Substituído por 100 µl de tampão no caso de dosagens ao longo dos protocolos de purificação de proteínas. (b) Adicionado no segundo dia no caso de dosagens com pré-incubação

- No dia seguinte, são adicionados a todos os tubos (exceto Tc) 1 ml do sistema de precipitação contendo o segundo anticorpo. Após uma incubação adicional de 30 minutos, são adicionados 2 ml de tampão Tris-BSA por tubo, sendo as frações de Ag° e Ag* separadas por meio de centrifugação a 1.500 g durante 20 minutos. O sobrenadante é então aspirado, e uma segunda lavagem e centrifugação são feitas. Após a aspiração do segundo sobrenadante, é feita a contagem da radioatividade do precipitado por meio de um contador de radioatividade gama (Multigamma Counter LKB Wallac 1261; Turku, Finlândia).

206

2.2. Sistema com pré-incubação - No primeiro dia da dosagem RIA-PI, com exceção do Ag*, são adicionados todos os reagentes previamente detalhados no sistema SPI. - No segundo dia, após aproximadamente 16 horas de pré-incubação, são adicionados 100 µl de Ag* a todos os tubos. Uma segunda incubação com duração mínima de 4 horas é então realizada antes da adição de 1 ml do sistema de precipitação contendo o segundo anticorpo. O restante do procedimento é similar ao descrito previamente para o sistema sem pré-incubação.

207

ANEXO B - Método LOWRY para a dosagem de proteínas

1. Reagentes

- Solução A: Solução de 0,1 N de NaOH contendo 2 % de Na 2CO 3 (Merck). - Solução B: Solução de Tartrato de Sódio (Merck) a 1 %.

- Solução C: Adicionar 50 mg de Sulfato de Cobre (CuSO 4; Sigma) à 10 ml da Solução B. Preparar imediatamente antes do uso. - Solução D: Solução final para a dosagem de proteínas: 50 ml da Solução A + 1 ml da solução B. - Reagente de Folin-Ciocalteu (Merck).

- Solução padrão de 1 mg de BSA/ml de H 2O destilada.

2. Metodologia A estimativa da concentração de proteínas presentes nas frações obtidas ao longo do processo de purificação da PAG foi feita pelo método de LOWRY et al. (1951). - Curva padrão: preparar em duplicata as seguintes diluições: 1/1 = 1000 µg de BSA/ml 1/2 = 500 µg de BSA/ml 1/4 = 250 µg de BSA/ml 1/8 = 125 µg de BSA/ml

- B0: preparar em quadruplicata os tubos considerados como ‘zero BSA’ da curva padrão. - Amostras: diluir as amostras a serem dosadas de acordo com a quantidade estimada de proteína (ex.: 1/1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32).

208

- Adicionar em cada tubo: - 200 µl de cada diluição da curva padrão ou da amostra a ser dosada.

- Nos pontos zero da curva padrão (pontos B 0) devem ser adicionados

200 µl de H 2O destilada ou do tampão nos quais as amostras encontram-se diluídas.

- 200 µl de H 2O destilada. - 2 ml da solução D. - Agitar no vortex e deixar incubar durante 10 minutos. - Adicionar 200 µl de Folin. - Vortexar e deixar incubar a abrigo da luz durante 30 minutos. - Ler em cuvetas de vidro a 550 nm de densidade óptica ou em cuvetas de quartz a 260 ou 280 nm de densidade óptica.

209

ANEXO C - Eletroforese monodimendional em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (1-D PAGE SDS) 1. Reagentes 1.1. Preparação das soluções estoque - Tampão Tris 0,5 M (pH 6,8) (Conservar a 4°C) 6,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano (Pharmacia)

60,0 ml de H 2O destilada Ajustar a pH 6,8 com HCl (Merck) e após ajustar o volume a 100 ml com H2O destilada.

- Tampão Tris 1,5 M (pH 8,8) (Conservar a 4°C) 27,23 g de Tris

80 ml de H2O destilada

Ajustar a pH 8,8 com HCl e após ajustar o volume a 150 ml com H2O destilada.

- Solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) (Merck) (Conservar a T° ambiente.) 20,0 g de SDS (Merck)

200,0 ml de H 2O destilada.

- Solução de acrilamida (30 %T, 2.67 % C) (Conservar a 4°C) 29,2 g de acrilamida (Pharmacia) 0,8 g de Metileno-bisacrilamida (Pharmacia)

Ajustar a 100 ml com H2O destilada.

210

- Solução azul de bromofenol a 0,8 % (Conservar a T° ambiente) 32,0 mg de azul de bromofenol (Bromophenol blue; Sigma)

4,0 ml de H 2O destilada

- Solução de Laemmli (Conservar a –20°C) 1,0 ml de tampão Tris 0,5 M (pH 6,8) 0,8 ml de glicerol 2,0 ml de solução de SDS a 10 % 0,4 ml de mercaptoetanol (Sigma)* 0,4 ml de azul de bromofenol a 0,8 %

3,4 ml de H 2O destilada

*Substituir por 0,4 ml de H2O destilada quando não for necessária a ação do agente redutor mercaptoetanol.

- Tampão de eletroforese (10 vezes concentrado) (Conservar a 4°C) 60,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano 288,0 g de glicina 20,0 g de SDS

1.000 ml de H 2O destilada

Agitar e ajustar a 2.000 ml com H 2O destilada.

Antes do uso, diluir 200 ml de tampão em 1.800 ml de H2O destilada.

- Solução descolorante para azul de Coomassie (T° ambiente) 100,0 ml de ácido acético 400,0 ml de metanol

500,0 ml de H 2O destilada

211

- Colorante azul de Coomasie (Conservar a T° ambiente) 250,0 ml de metanol (Merck) 1,0 g de Azul de Coomassie (Merck) 39,0 ml de ácido acético (Merck)

500,0 ml de H 2O destilada

1.2. Preparação dos géis - Gel de agarose 500,0 mg de agarose (Bio-Rad)

50,0 ml de H 2O deionizada

- Gel de separação a 12 % Reagente Quantidade/volume H2O destilada 16,75 ml Tampão Tris 1,5 M (pH 8,8) 12,5 ml Solução de SDS a 10 % 500 µl Acrilamida (30 % T, 2.67 % C) 20 ml Persulfato* a 12,5 % 250 µl Temed 25 µl Volume total 50 ml Preparar imediatamente antes do uso. *Produto Pharmacia

- Gel de compressão Reagente Quantidade/volume H2O destilada 6,1 ml Tampão Tris 0,5 M (pH 6,8) 2,5 ml Solução de SDS a 10 % 100 µl Acrilamida (30 % T, 2.67 % C) 1,3 ml Persulfato 12,5 % 100 µl Temed 20 µl Volume total 10 ml Preparar imediatamente antes do uso.

212

2. Metodologia - Os dois primeiros géis (gel de agarose e gel de separação) são preparados no mesmo dia sendo versados entre as duas paredes da cuva em um sistema de eletroforese vertical. - No segundo dia, após a polimerização do terceiro gel (gel de compressão), as pistas a serem utilizadas são identificadas, sendo adicionado logo em seguida o tampão de eletroforese. - Em cada pista, são depositados 6 µl de proteínas de calibração ou 20 a 30 µl de proteínas a serem analisadas, segundo protocolo pré- estabelecido. - Uma vez conectadas ao sistema de resfriamento, as cuvas são inicialmente submetidas a uma amperagem de 20 mA (migração no gel de compressão) e em seguida a uma amperagem de 40 mA (migração do gel de separação). - Após o final da migração, o gel poder ser corado pelo Azul de Coomassie (mínimo de 1 hora) e descolorado (mínimo de 4 horas), para a visualização de proteínas, ou utilizado para a realização da técnica de Western Blot, a qual permite a visualização de proteínas imuno-reativas pelo uso de diferentes anti-soros.

213

ANEXO D – Técnica de Western Blot

1. Reagentes 1.1. Soluções estoque - TBS a 0 % de BSA (Conservar a 4°C) 12,1 g de Tris (hidroximetil)-aminometano 45,0 g de NaCl

Ajustar a 5.000 ml com H 2O destilada - Ajustar o pH a 7,6 com o uso de HCl antes da adição do NaCl. - Conservar a 4°C.

- TBS contendo 1 % de BSA (solução de lavagem) Adicionar 10,0 g de BSA por litro de TBS a 0 % BSA (conservar a 4°C).

- TBS contendo 3 % de BSA (solução de saturação) Adicionar 30,0 g de BSA por litro de TBS a 0 % BSA (conservar a 4°C).

- Tampão anodo (Conservar a 4°C) 3,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano 14,0 g de glicina

500,0 ml de H 2O destilada

Agitar e ajustar a 900 ml com H 2O destilada. 100,0 ml de metanol

214

- Tampão catodo (Conservar a 4°C) 3,0 g de Tris (hidroximetil)-aminometano 14,0 g de glicina 1,0 g de SDS

Agitar e ajustar a 1.000 ml com H 2O destilada.

- Preparação do primeiro anti-soro 200 µl de anti-soro puro 15,0 ml de TBS contendo 1 % de BSA 4,8 ml de soro normal sem PAG (SF)

- Preparação do segundo anti-soro 50 µl de imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho acoplada à peroxidase (POD-HR; Merck) 100 ml de TBS contendo 1 % de BSA

- Solução corante Rouge Ponceau 0,2 g de Rouge Ponceau S (Sigma) 10 ml de ácido acético

190 ml de H 2O2 destilada

- Soluções de revelação (a serem preparadas imediatamente antes do uso) Solution A (Mantida a 4°C) 100 ml de TBS a 0 % BSA

100 µl de H 2O2 (Sigma)

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Solution B (Mantida a 4°C) 20 ml de Metanol 60 mg de Cloronaftol

2. Metodologia 2.1. Transferência das proteínas sobre membrana de nitrocelulose - Cerca de 15 folhas de papel eletrodo Novablot (Pharmacia) são embebidas em tampão catodo durante um mínimo de 30 minutos. - Cerca de 15 folhas de papel eletrodo Novablot (Pharmacia), assim como uma membrana de nitrocelulose, são embebidas em tampão anodo durante um mínimo de 30 minutos. - Após o final da migração da 1-D SDS-PAGE (conferir Anexo C), os papeis eletrodo, assim como a membrana de celulose e o gel, são colocados delicadamente entre as duas placas do aparelho de transferência Multiphor II (Pharmacia), conforme indicado na figura a seguir:

Eletrodo (-) Papéis eletrodo embebidos em tampão catodo Gel Membrana de nitrocelulose Papéis eletrodo embebidos em tampão anodo Eletrodo (+)

- A transferência das proteínas sobre a membrana de nitrocelulose é feita pela aplicação de uma tensão elétrica de 24 volts durante 1 hora seguida de 36 volts durante 16 horas. - Após o final da transferência, a membrana é corada durante 10 minutos com a solução de Rouge Ponceau S. As bandas correspondentes à cada

216

proteína são marcadas com o auxílio de um objeto perfurante.

2.2. Revelação das protéinas imunoreativas - A membrana de nitrocelulose é inicialmente incubada (sob agitação) em uma solução de TBS contendo 3 % de BSA (a 37°C). - Em seguida, é feita uma incubação durante 3 horas em 20 ml de anti- soro saturado (a 37°C, sob agitação). - A membrana de nitrocelulose é lavada por 3 banhos de TBS contendo 1 % de BSA (10 minutos cada, a 37°C). - Uma segunda incubação de 2 horas é feita com o segundo anti-soro (imunoglobulina de ovelha anti-IgG de coelho acoplada à peroxidase) (a 37°C, sob agitação). - Finalmente, 4 lavagens (10 minutos, a 20°C) são feitas com TBS sem BSA. - A proteínas imuno-reativas contidas na membrana são reveladas pelo uso das Soluções A e B, as quais são misturadas imediatamente antes da revelação.

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ANEXO E – Isofocalização e eletroforese bidimendional (2-D PAGE- SDS)

1. Soluções estoque - Tampão de reidratação dos strips contendo o gel de isofocalização 9,9 g de uréia (Pharmacia) 3,8 g de tio-uréia (Pharmacia) 125 µl de triton X 100 (Pharmacia) 500 µl de tampão IPG 3-10 (Bio-Rad)

20 ml de H 2O destilada Alguns grânulos de bromofenol

- Agitar e ajustar a 25 ml com H 2O destilada

- Adicionar 2,8 mg de DTT/ml de solução imediatamente antes do uso. - Assim como o DTT, as amostras de proteína devem ser adicionadas imediatamente antes do uso. Para um strip de 11 cm com uma gama de pH variando de 3 a 10 é recomendado um volume final (amostra + tampão de reidratação) de 200 µl. - Conservar a –20°C.

- Tampão de lavagem dos strips após a isofocalização: 26,8 ml de tampão Tris 1,5 M (pH 8,8) 288,3 g de uréia 276,0 ml de glicerol (Merck) 16,0 g de SDS Alguns grânulos de bromofenol

600 ml de H 2O destilada

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- Agitar e ajustar a 800 ml com H 2O destilada - Adicionar 100,0 mg de DTT/10 ml de solução imediatamente antes do uso. - Conservar a –20°C.

- Solução de seladora de agarose

450 ml de H 2O destilada 50 ml de tampão de eletroforese (10 x concentrado) 2,5 g de agarose Alguns grânulos de bromofenol - Esquentar sob agitação após a adição de todos os ingredientes e estocar em alíquotas de 30 ml. - Conservar a T° ambiente.

- Corante para PVDF (Conservar a T° ambiente) 2 g de Azul de Coomassie 100 ml de Metanol

100 ml de H 2O destilada Alguns grânulos de DTT

- Solução descolorante para PVDF (Conservar a T° ambiente) 600 ml de Metanol

400 ml de H 2O destilada Alguns grânulos de DTT

2. Metodologia - A primeira dimensão é feita em Immobiline Drystrips de 11 cm com pH

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variando de 3 a 10 (Pharmacia) ou de 3 a 6 (Bio-Rad), sendo seguida por uma SDS-PAGE a 12 %, conforme descrito no Anexo C.

- A hidratação dos strips é feita durante 16 horas em um Immobiline DryStrip Reswelling Tray (Pharmacia), sendo a mesma seguida pela eletro-focalisação das proteínas.

- A eletro-focalisação (separação das proteínas de acordo com o ponto isoelétrico) é feita pela aplicação de uma corrente de 300 V por 30 minutos, de 1.000 V por 30 minutos, de 1.550 V por 16 horas e de 1.850 V por 1 hora em um aparelho Flat Bed (FBE-3000, Pharmacia).

- A fim de evitar-se a oxidação das proteínas transferidas, são adicionadas pequenas quantidades de DTT em todos os tampões.

- Após a eletro-focalização, aplica-se o strip sobre o gel de separação de uma eletroforese monodimensional clássica, obtendo-se desta forma a separação das proteínas de acordo com sua massa molecular.

- A preparação dos papéis eletrodo para a transferência das proteínas sobre a membrana de 0,2 µm de polivinilideno difluoridro (PVDF; Bio- Rad, Richmond, CA) é semelhante à preparação descrita na técnica de Western blot (Anexo C). Entretanto, devido à natureza hidrófoba da membrana PVDF, faz-se necessária a utilização de um banho de metanol antes que a mesma seja embebida no tampão anodo. A disposição dos papéis eletrodo, do gel e da membrana são mostradas a seguir:

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Eletrodo (-) Papéis eletrodo embebidos em tampão catodo + DTT Gel Membrana de PVDF Papéis eletrodo embebidos em tampão anodo + DTT Eletrodo (+)

- A transferência das proteínas sobre a membrana de PVDF é feita pela aplicação de uma tensão elétrica de 12 volts durante 45 minutos seguida de 36 volts durante igualmente 45 minutos.

- Após o final da migração, a membrana é lavada 3 vezes em H 2O destilada contendo DTT, corada durante 15 minutos com a solução corante para PVDF, descolorada durante 30 minutos, e finalmente

lavada 2 vezes com H 2O destilada sem DTT. Por fim, cada membrana é secada pelo uso de gás nitrogênio sendo identificada e enviada ao microsequenciamento de proteínas.

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Apêndice 1

SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. (2001) Placental Proteins of Ruminants: biochemical, physiological and zootechnical aspects. In: Renaville, R. e Burny, A. (eds.), Biotechnology in Animal Husbandry , Ed. Kluwer Academic Publishers, Hardbound, Netherlands, pp. 179-208.

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Placental Proteins in Ruminants.

Biochemical, physiological and zootechnical aspects

SOUSA, N.M 1., FIGUEIREDO, J.R. 1 & BECKERS, J.-F. 2

1Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil 2Physiology of Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liège, Belgium

Abstract

During the last decade, investigations were carried out by several research groups in order to characterize proteins or glycoproteins synthesized in the ruminant placenta. Recently, as results of this research, a large family of pregnancy-associated glycoproteins (PAGs) was discovered. Using molecular biology techniques, they were found to be members of the superfamily of the aspartic proteinases which also contains pepsinogen, chymosin, renin, beta-secretase, cathepsin D and E etc. Synthesized in the mono and/or binucleate cells of the trophoblast, some forms of PAG seem lacking of proteinase activity. It is likely they are synthesized together with molecules involved in the tissue remodeling of the placenta. Their release in large quantities into the maternal blood circulation results in measurable plasma concentrations.

Thanks to international collaborative studies, we have shown that PAG levels are a good indicator of feto-placental weel-being and that sharp

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decreases in PAG levels occur just before pregnancy failure in cows and in goats. In some countries, the PAG assay is available for Doctors in Veterinary Medicine in the regional laboratories responsible for animal health including immunodiagnosis for brucellosis, IBR, BVD, CAEV, VISNA-MEDI etc.

1. Introduction

Placenta is a polyvalent organic system with a vital biological role for the perpetuation of the eutherian mammals. Fetal development is related to that of the placenta from the anatomical, genetic and metabolic points of view. As far as metabolism is concerned, endocrine function is particularly important. The endocrine function of the mammalian placenta includes various hormones: progesterone, oestrogens, chorionic gonadotropins, placental lactogens, also designed “chorionic somatomammotropins”, prolactins, growth hormones and a series of growth factors, proteins and glycoproteins interfering with the establishment of pregnancy, corpus luteum maintenance, immunotolerance of the conceptus by the mother, intermediate maternal metabolism, fetal growth and mammary growth.

The study of the endocrine function of the ruminant placenta will be discussed below. Emphasis will be given to pregnancy-associated (specific) proteins, but information related to other polypeptide hormones will be freely utilized in order to develop our comparative understanding of the structure, function and release in maternal circulation of the placental proteins.

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2. The Placenta

The placenta plays an essential role in both establishment and maintenance of pregnancy as well as in fetal development, working as a respiratory, nutritional, epurative, endocrine and immunological organ. The placenta is not only barrier, as it was thought before, but it has a real active and selective exchanger role which is developed in harmony with other systems.

The topography and structure of the placenta vary according to the species and depend on the behavior of the egg which, at the time of its attachment, either remains in the uterine lumen or implants interstially in the uterine mucosa.

Various classifications have been proposed though the most widely used, despite some imperfections, is the classification based on the histological structure, or, more precisely, the number of histological layers separating the maternal and fetal blood. Four types of placenta may be distinguished histologically: the epitheliochorial placenta (Equidae, Suidae), the synepitheliochorial placenta (ruminants), the endotheliochorial placenta (carnivores) and the haemochorial placenta (human, primates and rodents).

The uterine connective tissue is modified in both endothelial and haemochorial placentas and tearing of the uterine tissues accompanied by bleeding occurs during parturition. The uterine regions shed in this way are said to be deciduous and the species with these types of placenta are called deciduates.

The mature ruminant placenta is neither entirely syndesmochorial with

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no uterine epithelium, nor epitheliochorial with two apposed cell layers whose the only anatomical interaction observed is the presence of interdigitated microvilli. The uterine epithelium persists but is modified to a variable degree into a hybrid fetomaternal syncytium formed by the migration and fusion of the fetal chorionic binucleate cells with those of the uterine epithelium (WOODING, 1992).

2.1. Binucleate cells

The most characteristic element of the ruminant placenta is the presence of binucleate cells or diplokaryocytes in the trophectoderm (WIMSATT, 1951). First described by ASSHETON in 1906, these cells have been the subject of numerous investigations over the last 5 decades (DRIEUX and THIERY, 1951; AMOROSO, 1952; WOODING and WATHES, 1980; KLISCH et al. , 1999).

Binucleate cells derive from chorionic mononucleate cells by karyokinesis without subsequent cytokinesis. The youngest cells are located deep in the trophectoderm and maturation takes place progressively as they rise to the maternal surface (WOODING, 1983).

Young binucleate cells have a small volume of dense ribosome-filled cytoplasm, which, after cytoplasmic re-organization to a spherical or oval cell, has no contact with either the basement membrane or the atypical trophectodermal tight junction. As the binucleate cells increase in size it develops an extensive array of rough endoplasmic reticulum and a large Golgi body. The latter produces a considerable number of characteristic granules that contain numerous protein and glycoprotein constituents

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(WOODING, 1992).

The first binucleate cells appear just before implantation (WANGO et al. , 1990a). They can be recognized from day 14 after fertilization in the ovine trophectoderm (WOODING, 1984) and from day 16-17 in the bovine.

The binucleate cells represent 15-20% of the total population within the mature placenta (WOODING, 1983; WANGO et al. , 1990b). Of these, about one in seven are migrating towards the uterine epithelium at any time of gestation (WOODING et al. , 1986). The migration of binucleate cells plays an important role in the remodeling of placental structure and leads to a reaction with the uterine cells: the formation of a hybrid fetomaternal tissue in the ewe and goat (the syncytium plaques) and the maternal giant cells in the cow (the trinucleate cells) (WOODING, 1984; WOODING and BECKERS, 1987).

Trinucleate cells are short-lived structures, which, after exocitosis, are resorbed by the trophectoderm (WOODING and WATHES, 1980). Contrary to the ewe, in which binucleate cell migration is essential to support the enormous growth in area of the fetomaternal interface layer as the placentome develops (WOODING et al. , 1981), in cow placentomes the binucleate cell migration has no barrier or structural role (WOODING and WATHES, 1980).

Special cells of the ruminant placenta were suspected as responsible for an important endocrine function during gestation as early as 1940. In this decade, it was observed for the fist time a reduction in the pituitary gonadotropic activity in the pregnant cow and suggested that the corpus

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luteum was replaced by additional luteotropic substances produced elsewhere. Using microsections of cotyledons and staining for carbohydrates like periodic acid-Schiff (PAS), WEETH and HERMAN (1952) and BJÖRKMAN (1954) described the presence of numerous trophoblastic cells containing glycoproteins. About 10 years later, FOOTE and KAUSHIK (1963) demonstrated the presence of a LH-like activity in the cotyledons. They used the bioassay of PARLOW (1961) in order to identify this LH-like activity. These studies were pioneers in this field: they opened the way for further identification and characterization of placental hormones and proteins in the ruminant species.

Binucleate cells are directly involved in the production of progesterone (WANGO et al. , 1991; WANGO et al. , 1992; WOODING et al. , 1996), prostaglandins (REIMERS et al. , 1985b), placental lactogen hormones (VERSTEGEN et al. , 1985; WOODING et al. , 1992) and pregnancy-associated (specific) glycoproteins (REIMERS et al. , 1985a; GOGOLIN-EWENS et al. , 1986; MORGAN et al. , 1989; ZOLI et al. , 1992a; ATKINSON et al. , 1993). These secretory products are stored in dense granules which occupy more than 50% of the cytoplasm (LEE et al. , 1986) and deliver their content directly in the maternal system after binucleate cell migration (WOODING, 1984).

3. Placental Proteins

Proteins secreted by the placenta, when detected in the peripheral circulation of the mother, can be useful indicators of both pregnancy and feto-trophoblast well-being. Despite many attempts to investigate the

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physiological functions of the placental proteins, the exact biofunction of most of them (e.g. pregnancy-associated glycoprotein) are still not known.

In ruminant species, interferon tau allows the maintenance of the corpus luteum aging as an antiluteolytic factor (MARTAL et al. , 1979). In primates this role in corpus luteum maintenance is played by the chorionic gonadotropin (ASCHHEIM, 1927). This glycoprotein acts as a luteotropine-like hormone having also an important role in progesterone synthesis stimulation. The interferon tau, in addition to its antiluteolytic function also has an important role in the first steps of immunotolerance of the conceptus by the mother (FILLION et al. , 1991; MARTAL et al. , 1997).

Later in pregnancy placenta produces a placental lactogen hormone, responsible for the stimulation of the mammogenic activity (FORSYTH, 1986). This hormone is also involved, at least partially, in the fetal growth (CHENE et al. , 1988) and in the long term changes of the maternal metabolism (FREEMARK et al. , 1992).

The main groups of polypeptide placental proteins and their relevant aspects are discussed below.

3.1. Pregnancy-Associated Glycoproteins (PAGs)

Characterized in the last 20 years (BUTLER et al. , 1982; BECKERS et al. , 1988a,b; ZOLI et al. , 1991, XIE et al. , 1991), the pregnancy- associated glycoproteins (PAGs) constitute a large family of glycoproteins expressed specifically in the outer epithelial cell layer (chorion/trophectoderm) of the placenta of ungulate species

229

(GURUPRASAD et al. , 1996; XIE et al. , 1997b). They are members of the aspartic proteinase gene family having greatest sequence identity with pepsinogens (GREEN et al. , 1998a).

By using biochemical procedures, some molecules of the PAG family were isolated from cotyledons of cow (ZOLI et al. , 1991), ewe (ZOLI et al. , 1995; XIE et al. , 1997a) and goat (GARBAYO et al. , 1998). These molecules were used to immunize rabbits and the antisera obtained allowed the development of homologous and heterologous radioimmunoassay systems (ZOLI et al. , 1992b; RANILLA et al. , 1994; GONZÁLEZ et al. , 1999).

In veterinary practice, the measurement of the PAG concentrations in maternal blood is useful for both pregnancy confirmation and follow-up of the trophoblastic function. The first aspect can help breeders in the management of reproduction, while the second concerns more specifically clinicians and researchers in their investigation to establish differential diagnosis of pathologies affecting pregnancy (ZARROUK et al. , 1999a,b).

Screening of placental libraries with nucleic acid probes has identified additional cDNA that are very abundant and code for polypeptides related but structurally (amino acid sequence) distinct from PAGs isolated by biochemical procedures. Some of these molecules have sequences of amino acids that are consistent with their being potentially functional proteinases (ROBERTS et al. , 1995). It remains to be determined whether the PAGs expressed in the ungulate placenta are catalytically active and, even if they are, whether their physiological function is that of proteinases.

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3.1.1. Historical Overview of PAGs and Related Proteins Isolated by Biochemical Procedures

The PAGs, also known under a variety of other names including pregnancy-specific protein B (BUTLER et al. , 1982; LYNCH et al. , 1992) and pregnancy-specific protein 60 (MIALON et al. , 1993), were first described as placental antigens of cattle placenta that were also present in the blood serum of the mother soon after implantation.

The methodology employed for bovine PAG purification by ZOLI et al. (1991) was similar to that previously described by BUTLER et al. (1982). Briefly, an antiserum was first generated against placental extracts from which antibodies against common maternal antigens had been removed (or neutralized) by immunoadsorption. This reagent was then used to follow the immunoreactive fractions throughout the isolation procedure (a series of extractions of soluble proteins, acid and ammonium sulfate precipitations, gel filtration and ion exchange chromatographies).

The cleared antisera obtained by Sasser and coworkers (BUTLER et al. , 1982) allowed the partial purification of two antigens; pregnancy- specific protein A (PSP-A) and pregnancy-specific protein B (PSP-B). PSP-A was identified as α-fetoprotein, which is not strictly limited to pregnancy; PSP-B represented a novel antigen. Subsequent biochemical analysis indicated that PSP-B probably represented a mixture of related proteins since multiple molecular weight forms (47 000-90 000) and isoeletric variants (pI 3.7-4.4) were reported (BUTLER et al. , 1982).

Alternatively to the results obtained by BUTLER et al. (1982), the use of antisera raised against specific antigens of fetal cotyledons by ZOLI et

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al. (1991) resulted in the purification of one major placental protein: the bovine pregnancy-associated glycoprotein 1 (boPAG-1).

3.1.1.1. The bovine PAG family: after the isolation of ZOLI et al. (1991) and the first characterization of XIE et al. (1991), different PAG molecules were identified justifying an arbitrary numbered nomenclature adopted till now.

3.1.1.1.1. boPAG-1: The bovine PAG (bPAG) purified by ZOLI et al. (1991), later designed boPAG-1 (XIE et al. , 1994; XIE et al. , 1995), was shown to be an acidic glycoprotein with 67 000 molecular weight. Four isoforms (I, II, II and IV) with different isoeletric points (4.4, 4.6, 5.2 and 5.4) were detected in this initial preparation. The pI were closely related to the amount of sialic acid of each isoform (2.12%; 0.83%, 0.64% and 0.29%, respectively). Moreover, pI, sialic acid content and immunoreactivity were closely related, with the most basic form being the most immunoreactive (ZOLI et al. , 1991). Immunocytochemical investigations allowed the localization of boPAG-1 predominantly in the cytoplasm of large binucleate cells present in the fetal cotyledonary tissue (ZOLI et al. , 1992a). The presence of antigens immunologically similar to boPAG-1 has also been demonstrated in testicular and ovarian extracts (ZOLI et al. , 1990b,c), justifying the adjective “associated” and not “specific” given to this glycoprotein.

The most surprising feature of boPAG-1, revealed by Roberts and coworkers soon after its purification (XIE et al. , 1991), was the fact that this protein belongs to a family of proteolytic enzymes known as aspartic

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proteinases, with more than 50% amino acid sequence identity to pepsin, cathepsin D and cathepsin E.

The boPAG-1 has the bilobed structure typical of all known eukaryotic aspartic proteinases and possesses a cleft between the two lobes capable of accommodating peptides up to 7 amino acid long (XIE et al. , 1997b). However, despite its structural similarity with other active aspartic proteinases, this molecule is considered as catalytically inactive because of key mutations close to the active site (Table 1) (XIE et al. , 1991).

Catalytic activity of aspartic proteinases is dependent upon two conserved aspartic acid residues (Asp) that are in close contiguity in the center of the substract-binding cleft, even if they are localized in opposite lobes of the molecule. Each of these residues is preceded by a hydrophobic amino acid (usually phenylalanine - Phe) and followed by invariant threonine (Thr) and glycine (Gly) (DAVIES, 1990). A twofold symmetry, with a second conserved region centering around each aspartic acid is also required to polarize the bound water molecule which hydrolyses the scissile bond of the substract (JAMES and SIELECKI, 1986).

As demonstrated by XIE et al. (1991), the apparent lack of proteolytic activity of boPAG-1 is due to the presence of an alanin (Ala-76) in place of a normally invariant glycine (Gly-76) residue in the Phe-Asp-Thr-Gly-Ser- Ser sequence (N-terminal lobe). This mutation has as consequence a subtle change in the placement of the catalytic water molecule from its normal symmetric position (DAVIES, 1990), rendering this protein catalytically inactive.

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TABLE 1 - Alignment at the active site residues found in a variety of aspartic proteinases. The open boxes denote amino acid substitutions. Data for aspartic proteinase sequences are obtained in the GenBank database.

Proteolytic Aspartic Specie NH 2-terminus COOH-terminus Proteinase Activity ? Pepsinogen A Monkey Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser Progastricsin Human Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser Pepsinogen F Rabbit Yes Leu Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser Chymosin Bovine Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Leu Asp Thr Gly Thr Ser Renin Rat Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser

Cathepsin D Human Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser Cathepsin E Human Yes Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser Beta-secretase Human Yes Val Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Ser Gly Thr Thr boPAG-1 Bovine Probably no Phe Asp Thr Ala Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser boPAG-2 Bovine Unknown Phe Asp Thr Gly Ser Ala Leu Asp Thr Gly Thr Ser ovPAG-1 Ovine Probably no Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Gly Thr Gly Thr Ser poPAG-1 Porcine Probably no Phe Asp Thr Leu Ser Ser Leu Asp Ser Gly Ser Ala poPAG-2 Porcine Unknown Phe Asp Thr Gly Ser Ser Val Asp Thr Gly Thr Ser eqPAG-1 Equine Unknown Phe Asp Thr Gly Ser Ala Val Asp Thr Gly Thr Ser

➡➡➡ PAG and PSPB radioimmunoassays

In practice, antisera raised in rabbits against pregnancy-associated (specific) proteins have allowed the development of specific radioimmunoassays for bovine PAG and PSP-B (SASSER et al. , 1986; HUMBLOT et al. , 1988a,b; SASSER et al. , 1989; ZOLI et al. , 1992b). Higher PAG concentrations are observed in maternal than in fetal serum, suggesting that this glycoprotein is delivered preferentially in the maternal

234

system (ZOLI et al. , 1992b).

PAG can be detected in maternal circulation at around the time when the trophoblast forms definitive attachment to the uterine walls. In early and mid gestation, concentrations increase slowly and gradually (Figure 1). Around parturition concentrations increase rapidly to reach peak values of 1 to 5 µg/ml only few days before delivery (Figure 2) (ZOLI et al. , 1992b; PATEL et al. , 1997). Concentrations decrease steadily in the postpartum period reaching undetectable levels only by day 100 postpartum (ZOLI et al. , 1992b). Detectable levels of boPAG-1 have been also found in about 20% of unbred heifers and non-pregnant cows and 15% of bull sera (ZOLI et al. , 1992b). The relatively long time needed for boPAG-1 to be cleared from maternal circulation can be explained by the very high concentrations present in maternal blood at parturition and by a long half-life of this glycoprotein, estimated to be 7.4 to 9 days (KIRACOFE et al. , 1993; ALI et al. , 1997).

PAG (ng/ml) 3535

3030 2525 2020

1515

1010

00 3 4 5 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 Weeks FIGURA 1 - PAG profiles (mean ± S.E.M) during early pregnancy in heifers embryo transferred with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲-▲-) gestations. Adapted from ECTORS et al. (1996a).

235

PAG (ng/ml) 30003000

25002500

20002000

15001500

10001000

500500 00 -1126 -10 27 28-9 29-8 30-7 31-6 32-5 33-4 34-3 -235 -136 0 Weeks bef ore parturition FIGURA 2 - PAG profiles (mean ± S.E.M) in heifers embryo transferred with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲-▲-) gestations during the last 11 weeks before parturition. Adapted from ECTORS et al. (1996a).

PAG detection in serum or plasma samples is currently used as a specific serological method for pregnancy diagnosis in cattle from days 28 (SZENCI et al. , 1998a,b) to 30 (SASSER et al. , 1986; HUMBLOT et al. , 1988a) after breeding.

Investigations realized in peripartum clearly demonstrated the positive influence of both maternal environment and fetal genotype (sex and race) on peripheral blood concentrations of boPAG-1. In fact, PAG concentrations were found to be more elevated in maternal circulation of the intra-species crossbreeds than in inter-species ones (GUILBAULT et al. , 1991). Moreover, ECTORS and coworkers (1996) showed that in nuclear transfer programs, even if the majority of calves are of normal size, some of them can present morphological abnormalities like edema of the umbilical cord with placental hypertrophy, responsible for higher concentrations of PAG in maternal blood. In the same way, abnormally

236

high PAG concentrations in maternal circulation can indicate the presence of a abnormal amount of trophoblast tissues, as observed in hydatiform molar pregnancy (Figures 3A and 3B) (ECTORS et al. , 1996b).

After IVF or cloning, the PAG follow-up in plasma samples collected weekly was able to monitor embryonic and fetal deaths (ECTORS et al. , 1996a). However, due to the large variations of PAG concentrations in maternal blood, only a marked decrease (or disappearance) in plasma concentrations of this protein can be a no controversial predictive sign of embryonic or fetal death (SZENCI et al. , 1999).

3.1.1.1.2. boPAG-2: in 1994, Xie et al. identified the poorly characterized bovine chorionic gonadotropin isolated by BECKERS et al. (1988a) as a new member of the aspartic proteinase family: the boPAG-2 (BECKERS et al ., 1994).

The classification of the LH-like factor of the bovine placenta as a proteinase was surprising but not the first observation on similarities between placental hormones and proteinases. In fact, previous studies developed by WILLEY and LEINDENBERGER (1989) had already demonstrated a high analogy between primary sequences of human chorionic gonadotropin (hCG) and the serine proteinase chymotrypsin. In that study it was also observed that proteinaceous proteinase inhibitors like soy bean trypsin (SBI) are capable to neutralize the agonistic activity of hCG and to reduce the binding of hCG to its receptor and to its specific antisera.

The boPAG-2 was characterized by XIE et al. (1994) as a polypeptide

237

of 372 amino acids long, structurally related to boPAG-1, ovPAG-1 and pepsin (58%, 58% and 51% amino acid sequence identity, respectively). Unlike boPAG-1, boPAG-2 has a catalytic center with the amino acid consensus sequence of other active aspartic proteinases. However, it remains unclear whether boPAG-2 has a proteolytic activity.

Expression of boPAG-2 mRNA is detected as early as 17-19 days of pregnancy, coinciding with the beginning of implantation. Its mRNA is expressed in fetal placenta but not in other fetal organs, and is localized in both mononucleate and binucleate cells. Interestingly, boPAG-2 is synthesized by placental explants as a 70 000 molecular weight isoform that is processed to smaller molecules (XIE et al., 1996).

A) PAG (ng/ml) 14000 B) 12000 10000 8000 6000

4000

2000

0 -11-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 W eeks before parturition

FIGURE 3 - A) Hydatiform molar pregnancy; B) Abnormally high PAG concentrations observed in hydatiform molar pregnancy (-▲-▲-) versus normal gestations (-×-×-). Adapted from ECTORS et al. , 1996(a).

3.1.1.2. The ovine PAG family : the identification of antigen(s) immunologically related to boPAG-1 (bPSP-B) in the peripheral circulation

238

of pregnant ewes (RUDER et al. , 1988) has led to the isolation and partial purification of pregnancy-associated glycoproteins in ewes (ZOLI et al. , 1990a; ZOLI et al. , 1995; WILLARD et al. , 1995).

3.1.1.2.1. ovPAG-1: The ovine PAG, later designated ovPAG-1, was initially identified as a molecule close to the boPAG-1, containing 382 amino acids (XIE et al. , 1991). Parallel to the cDNA characterization, several attempts were developed in order to purify the ovine PAG starting from fetal cotyledons. In comparison to bovine PAG, the ovine PAG was more difficult to purify and only semi-purified preparations were made available (ZOLI et al. , 1990a, ZOLI et al. , 1995; WILLARD et al. , 1995). The ovPAG-1 showed multiple molecular weight isoforms (43 000-67 000) with different pI ranging from 4.06 to 4.65 (WILLARD et al. , 1995). Molecular cloning studies have shown the ovPAG-1, like boPAG-1, belongs to the aspartic proteinase family showing 73% amino acid sequence identity with this protein (XIE et al. , 1991). As observed for boPAG-1, it seems that ovPAG-1 is a catalytically inactive form of aspartic proteinase secreted by binucleate cells of the trophoblast (XIE et al. , 1991). In this case, the lack of enzymatic activity results from the mutation of the catalytically essential aspartic acid within the C-terminal lobe (Asp-257) to one glycine (Gly-257) (XIE et al. , 1991). A comparable change in pepsin, where the active site Asp-32 of the first lobe is replaced by alanine (a Asp- 32-Ala mutation) abolishes all activity, even though the molecule is still capable of binding pepstatin A (a potent inhibitor of aspartic proteinases) with high affinity (LIN et al. , 1989).

Time-course studies of placental explants recently showed that ovPAG-1 is first detectable as a precursor with high molecular weight (67

239

000-70 000), which is gradually processed to smaller products (XIE et al. , 1996). The basis of the variety of molecular weight forms remains to be elucidated, but the differences seem likely to be due to some unusual form of posttranslational modification introduced in the binucleate cells (XIE et al. , 1996; GREEN et al. , 1998a).

➡➡➡ PAG and PSPB radioimmunoassays

The development of heterologous radioimmunoassays for ovPAG-1 and oPSP-B has allowed its detection in maternal blood 3 weeks (WILLARD et al. , 1995) to 4 weeks (RANILLA et al. , 1994) after breeding. The PAG-RIA is based on the utilization of boPAG-1 as tracer and standard, and antisera raised in rabbits immunized against a preparation of ovine PAGs (ZOLI et al. , 1995; WILLARD et al. , 1995).

PAG profiles in pregnant ewes (Figure 4) (RANILLA et al. , 1994; RANILLA et al. , 1997a; GAJEWSKI et al. , 1999) appeared to be quite different than those obtained in cattle (ZOLI et al. , 1992b). In Churra and Merino ewes, for example, after a first period of high concentrations around day 60, the concentrations decrease until day 90 and increase again to remain elevated and stable until parturition (RANILLA et al. , 1994).

After parturition, the rate of decline in PAG concentrations is faster in ewes (4 weeks) than in cows (about 14 weeks), with no correlation being observed between this rate and the interval to first ovulation (RANILLA et al. , 1997b).

3.1.1.2.2. Others ovPAGs: an additional member of PAG family (ovPAG-2) was isolated from cDNA library prepared from day 13 whole conceptuses (NAGEL et al. , 1993; GURUPRASAD et al. , 1996). This

240

protein is expressed in both mononucleate and binucleate cells of the placenta (NAGEL et al. , 1993).

PAG (ng/ml) 700 600 500 Parturition 400 300

200

100

0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 Weeks

FIGURE 4 - PAG profiles during gestation and postpartum periods in Berrichon ewes. Adapted from GAJEWSKI et al. , 1999.

Several other different PAGs have been recently purified from ovine placental conditioned media by using a series of chromatography precedures (XIE et al. , 1997a). Amino-terminal sequencing of four of the purified products revealed that three of them were novel and that each of them had been processed by removal of the pro-peptide within what appeared to be a consensus sequence between the pro-peptide and the mature molecule. None of these purified molecules demonstrated any enzymatic activity in a standard proteinase assay with denatured haemoglobin (XIE et al. , 1997a).

Another subset of PAGs was identified in extracts of sheep placenta by ATKINSON et al. (1993) who used the monoclonal antibody against

241

SBU-3 developed by GOGOLIN-EWENS et al. (1986). The three proteins affinity-purified with the SBU-3 antibody had molecular weights of 57 000, 62 000 and 69 000, showing partial amino acid sequence homology to the ovPAG-1, boPAG-1 and rabbit pepsinogen F (ATKINSON et al. , 1993).

3.1.1.3. The caprine PAG family: three different PAGs were isolated and partially characterized from goat placenta (GARBAYO et al. , 1998). These proteins differed in amino acid sequence and apparent molecular weight (55 000, 59 000 and 62 000) showing several isoforms with different pI: caPAG 55 (pI: 5.3, 5.1, 4.9), caPAG 59 (pI: 6.2, 5.9, 5.6) and caPAG 62 (pI: 5.1, 4.8).

Caprine PAGs showed high sequence homology to each other (60% to 73% residues identical) and a high sequence identity (from 30% to 81% between the first 27 amino acids sequenced) with proteins of the aspartic proteinase family like boPAG-1, ovPAG-1, boPAG-2, SBU-3 and rabbit pepsinogen F (GARBAYO et al. , 1998).

➡➡➡ PAG and PSPB radioimmunoassays

The use of two semi-purified preparations (one containing the caPAG 55 and caPAG 59 forms, and the other containing the caPAG 55 and caPAG 62 ) allowed the development of an accurate system for pregnancy diagnosis in goats (GONZÁLEZ et al. , 1999). PAG concentrations are significantly higher in pregnant than in non-pregnant females as early as 21 days after artificial insemination (GONZÁLEZ et al. , 1999).

During gestation, PAG concentrations reach maximal levels in week 8, decrease between weeks 12 and 14 and remain relatively constant until

242

parturition (Figure 5) (FOLCH et al. , 1993; GONZÁLEZ et al. , 2000a). After parturition, concentrations decrease rapidly reaching lower levels at the 4 th week postpartum (SOUSA et al. , 1999).

PAG (ng/ml) 500500

400400 Parturition 300300 200200

100100

00 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 Weeks

FIGURE 5 - PAG profiles (mean ± S.E.M) during gestation and postpartum periods in Blanca-Celtiberica goats with either single (-▼-▼-) or multiple (-▲- ▲-) gestations. Adapted from Folch et al. , 1993.

As observed in cattle (GUILBAULT et al. , 1991; PATEL et al. , 1997), both number and genotype of fetus can influence PAG concentrations over gestation. From days 21-24 and throughout gestation, twin bearing goats have higher PAG (or PSP-B) concentrations than goats bearing one fetus (HUMBLOT et al. , 1990; SOUSA et al. , 1999; GONZÁLEZ et al. , 2000a,b). PAG levels in maternal circulation of inter- specific pregnancies (spanish ibex embryos transferred to domestic goats) are also higher (about ten times) when compared to that found in normal intra-specific gestations (FERNÁNDEZ-ARIAS et al. , 1999).

Sequential measurement of PAG in goats also allows for the determination of the onset of the disturbance of trophoblastic activity

243

associated with the death of a fetus (ZARROUK et al. , 1999a,b). As demonstrated by ZARROUK et al. (1999a), in goats carrying a single fetus, PAG levels fall under the positive pregnancy threshold when the trophoblast died, while in goats carrying 2 or 3 fetuses, analysis of the profiles clearly shows marked drops in concentration that could indicate placental distress at different times. Therefore, systematic application of this test in herds with a high rate of pregnancy failure could help to pinpoint phenomena which might be implicated in triggering these events.

3.1.2. Molecular Studies of New PAG Related Molecules

By cloning expressed genes from ovine and bovine placental cDNA libraries, by Southern genomic blotting, by screening genomic libraries, and by using PCR to amplify portions of PAG genes from genomic DNA, it was recently estimated that cattle, sheep and most probably all ruminant Artiodactyla possesses many, possibly 100 or more, PAG genes, many of them being placentally expressed (XIE et al. , 1997b; GREEN et al. , 1998a; GARBAYO et al. , 1999; GREEN et al. , 2000). New members of the PAG family gene family have also been found to be expressed in the porcine (BAUMBACH et al. , 1988; BAUMBACH et al. , 1990a; SZAFRANSKA et al. , 1995; DORÉ et al. , 1996), equine (GREEN, et al. , 1998b; GREEN et al. , 1999), carnivora (GAN et al. , 1997) and zebra (GREEN et al. , 1994; GREEN et al. , 1999) placentas, showing that PAGs are not restricted to ruminant species.

The equine PAG (eqPAG-1) is expressed in the placenta of the horse and zebra and secreted from cultured placental tissues as both a processed

244

(mature) and unprocessed (zymogen) form (GREEN et al. , 1999). The processed form is an active proteinase and may, therefore, be the horse homologue of pepsinogen F (XIE et al. , 1997b).

In porcine species, two different PAG cDNAs have been found: the poPAG-1 and poPAG-2. They share 64% homology sequence to each other, and about 50% amino acid sequence identity with the PAGs of ruminants. Interestingly, poPAG-1 has amino acid substitutions within its catalytic center that together were likely to render it enzymatically inactive, whereas poPAG-1 retained sequences identical to pepsin in these regions (SZAFRANSKA et al. , 1995). They seem occupy an intermediate position between the enzymatically functional aspartic proteinases and the PAGs from cattle and sheep (XIE et al. , 1997b).

3.1.3. Identification of Pregnancy-Associated (Specific) Proteins in Wild Ruminants

Serologically similar antigens to PAG or PSP-B (Table 2) have been found in maternal circulation of wild ruminants like mule deer (WOOD de et al. , 1986), white-tailed deer (WOOD et al. , 1986; OSBORN et al. , 1996), mountain goats (HOUSTON et al. , 1986), red deer (HAIGH et al. , 1988), musk-oxen (ROWELL et al. , 1989), bison (HAIGH et al. , 1991), moose (HAIGH et al. , 1993), sika deer (WILLARD et al. , 1994a; WILLARD et al. , 1996), elk (WILLARD et al. , 1994b), fallow deer (WILLARD et al. , 1994c; WILLARD et al. , 1998; WILLARD et al. , 1999) and reindeer (RUSSEL et al. , 1998; ROPSTAT et al. , 1999).

245

TABLE 2 - Pregnancy-associated glycoproteins and related molecules belonging to the aspartic proteinases family.

Family Specie Detection in maternal Proteic Biochemical cDNA clonage blood or milk* Characterization Bovidae Bovine SASSER et al. , 1986,1989 BUTLER et al. 1982 XIE et al. , 1991,1994 (Bos taurus ) HUMBLOT et al. , ZOLI et al. , 1991 1988a,b ZOLI et al. , 1992 Ovine RANILLA et al. , ATKINSON et al. , 1993 XIE et al. , 1991,1997b (Ovis aries ) 1994,1997a ZOLI et al. , 1995 GAJEWSKI et al. , 1999 WILLARD et al. , 1995 XIE et al. , 1997a,b Caprine HUMBLOT et al. , 1990 GARBAYO et al. , 1998 GARBAYO et al. , 1999 (Capra hircus ) FOLCH et al. , 1993 SOUSA et al. , 1999 GONZALEZ et al. , 2000a,b* Spanish ibex FERNANDEZ-ARIAS et - - (Capra pyrenaica) al. , 1999 Montain goat HOUSTON et al. , 1986 - - (Oreamnos americanus ) Musk oxen ROWELL et al. , 1989 - - (Ovibus moschatus ) Bison HAIGH et al. , 1991 - - (Bison bison ) Cervidae Moose HAIGH et al. , 1993 HUANG et al. , 1999, - (Alces alces ) 2000 Elk HAIGH et al. , 1988 HUANG et al. , 1999, - (Cervus elephus ) WILLARD et al. , 1994b 2000 Mule deer WOOD et al. , 1986 - - (Odocoileus hemionus ) White-tailed deer WOOD et al. , 1986 - - (Odocoileus OSBORN et al. , 1996 virginianus ) Sika deer WILLARD et al. , 1994a - - (Cervus nippon ) Fallow deer WILLARD et al. , 1994c - - (Dama dama ) Rein deer RUSSEL et al. , 1998 - - (Rangifer tarandus ) ROPSTAT et al. , 1999 Equidae Horse - - GREEN et al. , 1994, (Equus caballus ) 1998b Zebra - - GAN et al. , 1997 (Equus zebra ) GREEN et al. , 1998 Felidae Cat - - GAN et al. , 1997 (Felis domestica ) Suidae Pig - BAUMBACH et al. , 1988 SZAFRANSKA et al. , (Sus scrofa ) DORE et al. , 1996 1995

246

The recent isolation and characterization of new forms of pregnancy- associated (specific) proteins from elk and moose placenta (HUANG et al. , 1999) allowed the development of a more specific radioimmunoassay to quantify this protein in maternal serum of wild species (HUANG et al. , 2000).

3.2. Placental Lactogens (PL)

Placental lactogens (PL), also known as chorionic somatomammotropins (CS), are proteinaceous hormones of placental origin that share structural and functional homology to growth hormone (GH) and prolactin (PRL).

The function of PL varies according the species. In general it has been suggested that PL influences mammogenesis and lactogenesis (FORSYTH, 1986), ovarian (GLASER et al. , 1984; TELLERIA et al. , 1998) and placental steroidogenesis (DEAYTON et al. , 1993), fetal growth (CHENE et al. , 1988) and that it alters the maternal metabolism to accommodate the growth and development of the fetus (FREEMARK et al. , 1992).

3.2.1 . Human Placental Lactogen (hPL) or Human Chorionic somatomammotropins (hCS) (see MARTAL and CÉDART, 1993 for review)

The human placental lactogen (hPL), later called human chorionic somatomammotropin (hCS), is a non glycosylated single chain protein that contains 191 amino acids and two intra disulfide bonds. Its molecular weight is about 22 300, but polymeric forms with higher molecular weights

247

have also been described. hPL is secreted by the syncytiotrophoblast cells of the placenta, however the mechanisms by which this hormone is released in the maternal circulation have not been totally elucidated.

Quantitatively, hPL is one of the most important soluble proteins of the human placenta, corresponding to approximately 10% of the total proteins. Its production rate is very high varying between 0.3 and 1 g/day at term. Human PL is detected in the placenta 5 to 10 days after implantation and in peripheral blood 3 to 4 weeks later. The level increases in the maternal serum as pregnancy progresses and the rate of secretion is related to the placental weight. As the half-life of hPL is very short (10-30 min), its assay gives an estimation of the placental activity at the time of collection.

Human PL is a regulator of lipids, carbohydrates and proteins metabolism. It increases the general metabolism of the adipose tissue provoking either lipolysis or lipogenesis depending on the circumstances. In pregnant women, it acts as an insulin antagonist and may be responsible for the diabetic acidosis observed during pregnancy.

3.2.2. Bovine Placental Lactogen (bPL) or Bovine Chorionic Somatomammotropin (bCS)

Studies on placental lactogens hormones preceded those of PAG in domestic ruminants. In bovine species, for example, the lactogenic activity of cotyledons was first demonstrated by BUTTLE and FORSYTH in 1976 by use of a 5 day co-culture of mouse mammary tissue and cow cotyledonary tissue at different stages of pregnancy. These authors obtained a lactogenic substance with about 300 ng of equivalent bovine

248

PRL (bPRL). In parallel studies, starting from bovine placenta, several research groups (BOLANDER and FELLOWS, 1976; BECKERS et al. , 1980) identified and purified a protein with a somatomammotropic activity.

The purified bPL exists in multiple isoforms (Mr 32 000 to 34 000) with at least five isoeletric variants ranging from 4 to 6 (MURTHY et al. , 1982). Bovine PL shares 48 to 50% sequence homology with PRL and 26 to 28% with GH. However, by use of radioimmunoassay (BECKERS, 1983) it was demonstrated that there is no cross reaction between bPL, PRL or GH.

Bovine PL is produced by chorionic binucleate cells (DUELLO et al. , 1985; MILOSAVLJENIC et al. , 1989; KAPPES et al ; 1992) which seem to deliver their product to the maternal circulation by migrating to and fusing with endometrial epithelium. It co-localizes in the same cells with other proteins like SBU-3 antigen and boPAG-1 (WOODING, 1992). In contrast to other placental lactogens, bPL is a glycoprotein containing both N-linked and O-linked oligosaccharides (SHIMOMURA and BREMEL, 1988; BYATT et al. , 1990). This glycoproteic composition characteristic of placental proteins like bPL, boPAG-1 and SBU-3 can result of a highly developed posttranslational mechanism expressed in bovine giant trophoblastic cells (GOGOLIN-EWENS et al. , 1986).

Bovine PL is detectable in maternal circulation by the 4 th month of gestation, but its concentration remains lower than 1-2 ng/ml through gestation. In the peripheral circulation of the fetus, bPL concentrations are higher (about 5 to 25 ng/ml) and shows a decline with advancing gestational age (BECKERS et al. , 1982; BYATT et al. , 1987). These ratios of fetal and maternal bPL concentrations are quite different of those

249

observed for boPAG-1, despite the co-localization of both placental proteins in the same cells.

In cattle, the mammary growth seems to be, at least partially, controlled by hormones of placental origin like bPL. Both calf birth weight and placental mass are positively correlated with milk production during subsequent lactation (ERB et al. , 1980; COLLIER et al. , 1982).

Interestingly, endometrium, corpus luteum as well as maternal and fetal liver contain mRNA encoding the bGH and bPRL receptors (bGHR and bPRLR) (SCOTT et al. , 1992). Specific binding sites for bPL, with little affinity for bGH and bPRL, have also been identified in endometrium (GALOSY et al. , 1991; KESSLER et al. , 1991).

Recent evidence (SCOTT et al. , 1992) indicates that bPL competes with equal affinity with bPRL for a recombinant bPRLR (rbPRLR). Diversely, bPL seems to bind the bGHR in a 1:1 stoichiometry rather than 1:2 stoichiometry reported for bGH (STATEN et al. , 1993).

It is possible that, in some adult tissues (e.g. liver and corpus luteum), bPL may exert its actions through either the bGH or bPRL receptors. This action was supposed to be exerted either by a heterodimer of bPRLR and bGHR monomers, or through a heterodimer of either one monomer of the bPRLR of bGHR and a unique receptor monomer (ANTHONY et al. , 1995).

3.2.3. Ovine Placental Lactogen (oPL) or Ovine Chorionic Somatomammotropin (oCS)

Ovine placental lactogen (oPL) was studied and purified by

250

HANDWERGER et al. (1974), MARTAL and DJIANE (1975) and CHAN et al. (1976). However, due to the fact that the amino terminal residue of oPL was blocked, the full sequence of ovine PL was not elucidated until quite recently (COLOSI et al. , 1989; WARREN et al. 1990). Although the primary structure of oPL and bPL are similar in 67%, oPL has a molecular weight of 22 000 and no potential N-linked glycosylation sites (CHAN et al. , 1976). The degree of amino acid sequence homology between of oPL and PRL is higher than that to GH (49% and 28%, respectively). So, it is not surprising to observe that oPL can demonstrate a higher lactogenic than somatogenic activity.

Binding sites for oPL have been identified in fetal ovine liver approximately at day 70 of gestation and increase in number through pregnancy to reach a peak 3 to 7 days before parturition (FREEMARK et al. , 1986). These sites are also found in maternal liver during gestation as well as in neonatal liver for more than 1 week postpartum. FREEMARK and coworkers (1990) demonstrated a decreased binding of oPL to fetal liver during maternal fasting, and later (FREEMARK et al. , 1992) they suggest that oPL receptor may be either a variant or a shortened form of somatotropin receptor.

In trophoblastic tissue oPL is detectable at day 16-17 of gestation (Reddy and Watkins, 1978). In maternal blood, oPL can be detected at day 40 to 50 of gestation and peaks during the last trimester of pregnancy (CHAN et al. , 1978). These values are positively correlated to fetal number, milk yield and placental mass. Ovine PL fetal concentrations decline from mid gestation until 1 to 2 weeks before parturition. Although fetal sera concentration and total fetal weight were not correlated (KAPPES

251

et al. , 1992), the entry rate of oPL into fetal vasculature increases with advancing gestation age (SCHOKNECHT et al. , 1992).

Biological activities of oPL have been observed in ovarian steroidogenesis, maternal intermediary metabolism, mammary and fetal growth. ANTHONY et al. (1995) suggest that oPL acts through a structurally distinct receptor within fetus, influencing the fetal production of one or more insulin growth factors (IGFs) and playing an important role in fetal growth regulation.

The factors that regulate secretion of oPL are still poorly understood but it is clear that oPL is not regulated by the same way in the fetal and maternal compartments, and nutritional factors seem to be involved (BYATT et al. , 1992). A better knowledge about PL hormones probably will help to understand the metabolic way of trouble occurring in late pregnancy, in postnatal development and milk production.

3.2.4. Caprine Placental Lactogen (cPL) or Caprine Chorionic Somatomammotropin (cCS)

Caprine placental lactogen (cPL) was the first placental lactogen described in ruminants (BUTTLE et al. , 1972). Several studies described the presence of prolactin-like and growth hormone-like activities in the blood of pregnant goats and several research groups (BECKA et al. , 1977; NUGENT and HAYDEN, 1987) tried to purify this protein. Early nineties, cPL has been purified to homogeneity (CURRIE et al. , 1990).

Caprine PL has a molecular weight of 22 000 and an isoeletric point of 8.35. Despite its purification, the primary amino acid sequence of cPL

252

was not determined. Based on the close phylogenic relationship between caprine and ovine species, it is likely that oPL and cPL have a high percentage of amino acid sequence similarity to each other. Also by similarity, it seems that cPL, like oPL, is a non-glycosylated form of placental lactogen (BYATT et al. , 1992).

Caprine PL is detected from day 44 of pregnancy in jugular plasma (CURRIE et al. , 1990) and can be used as a late pregnancy diagnosis from the day 60 th (SARDAJANA et al. , 1988). The level of cPL increases during pregnancy. Maximal concentrations are observed from mid to late pregnancy, followed by a gradual decline through the last week of gestation (CARD et al. , 1988). Caprine PL concentrations are undetectable as early as 18 h postpartum (CURRIE et al. , 1990). As observed for PAG, cPL concentrations are higher in multiple than in single gestations (CURRIE et al. , 1990) and are directly related with the total weight of placentomes and with the total fetal weight.

Placental lactogen seems to have a significant role in the control of normal mammary development and function in goats. Milk yield is related with the weekly mean of PL between week 11 and term (HAYDEN et al. , 1979). The increase in secretion of PL coincides with the onset of rapid lobule alveolar development of the mammary gland.

3.3. Proteins Associated with the Embryonic Signal

In some species, even before implantation, the embryo produces some “signals” which are recognized by the mother and induce an inhibition of luteolysis and the transformation of a cyclic corpus luteum into a

253

pregnancy corpus luteum. Among these signals, it can be mentioned the chorionic gonadotropin (CG), a luteotropic factor produced by the human and equine placentas, and the interferon tau (IFN τ), the antiluteolytic factor responsible for the rescue of the corpus luteum in ruminant species, and probably, at least partially in porcine and equine species.

3.3.1. The Chorionic Gonadotropins (CG) (see LEYMARIE and MARTAL, 1993 and DERIVAUX et al., 1988 for review)

Human and equine species have long been known to display a placental gonadotropic activity. As early as 1927, ASCHHEIM reported the presence of a gonadotropic factor in the urine of pregnant woman and during the following year they based their famous method for the early diagnosis of pregnancy on this finding (ASCHHEIM and ZONDEK, 1928a,b). Due to its properties, this gonadotropic factor was later called human chorionic gonadotropin (hCG). Three years later, COLE and HART (1930) showed the existence of a gonadotropic activity in the serum of pregnant mares. This pregnant mare serum gonadotropin (PMSG), after a better characterization, was called equine chorionic gonadotropin (eCG).

3.3.1.1. Human Chorionic Gonadotropin (hCG): the human chorionic gonadotropin (hCG) is a glycoprotein with a molecular weight of 38 400 and isoeletric points varying from 3.8 to 5.1. In early gestation, the synthesis of hCG increased in parallel with the trophoblastic activity.

The hCG is secreted by the trophoblast as soon as the blastocyst leaves its zona pellucida. It is first found in the maternal blood from day 8-

254

12 after fertilization, to achieve maximal concentrations during the first trimester of pregnancy. Afterwards, the levels decrease, but are still detectable till parturition.

Structurally, the hCG is composed by two subunits: alpha and beta. The alpha subunit comprises a peptide chain of 92 amino acids with 2 oligosaccharide chains attached at residues 52 and 78 (Asn-52 and Asn-78). This alpha subunit is similar to the alpha subunits of human, ovine and porcine LH. The beta hCG subunit is very similar to the beta subunit of human LH. It comprises 145 amino acids long, of those, 115 identical to the beta subunit of LH, with an additional fragment (30 amino acids) in the carboxy terminal side. The beta subunit contains several additional carbohydrate chains linked to the serines (Ser-118 or Ser-119 and Ser-131) and to the asparagines (Asn-13 and Asn-30). Due to its high content in sialic acid, the half life of hCG (about 8 hours) is much longer then that of LH, estimated to be only 12 to 50 min. The biological activity of hCG is rapidly abolished by hydrolysis with trypsin or chymotrypsin.

Human CG produces an effect on luteal cells of LH type which involves the same receptors as the hypophyseal gonadotropin. However, its action is more sustained since the hCG receptor complex is internalized 50 times more slowly than the LH receptor complex.

3.3.1.2. Equine Chorionic Gonadotropin (eCG): the equine chorionic gonadotropin (eCG), also known as PMSG, is specific to the mare. It represents the main luteotropic factor responsible for progesterone ovarian secretion until the placenta becomes able to carry out this progestagens

255

secretion.

The eCG is synthesized by the endometrial cups which are composed by typical trophoblastic cells with one or two nuclei. These cells release the eCG only during the first trimester of pregnancy (between 45 and 130 days of gestation). Initial eCG secretion coincides with the formation of the secondary corpus luteum in the ovaries.

Equine CG is a glycoprotein with an apparent molecular weight between 45 000 and 64 000. Like hCG, eCG is composed by subunits alpha and beta. Its plasmatic half-life (about 6 days) is due to its high sialic acid content (10 to 13.5%) and to the length of its carbohydrate chains. Contrary to the hCG, eCG was not detected in urine of pregnant females.

The activity of this hormone presents analogies with that of the hypophyseal gonadotropin FSH. It can be therefore used in hormonal control programs when a FSH-like activity is required.

3.3.2. Interferon Tau (IFN τ)

In domestic ruminants, ovarian production of progesterone is required for about 55 days in ewes, for at least 165-180 days in cattle (ESTERGREEN et al. , 1967) and till the end of pregnancy in goats. In these species, rescue of the corpus luteum occurs before implantation (around day 15 to 22 after fertilization) and appears to be initiated by the release of a proteinaceous factor present in the pre-implantation conceptus. This factor, initially called trophoblastin (MARTAL et al. , 1979) or ovine trophoblast protein-1 (GODKIN et al. , 1984), was recently officially designated as a distinct subclass of the interferon alpha (IFN α) family: the

256

IFN tau (IFN τ) (CHARPIGNY et al. , 1988).

The first studies that demonstrated the presence of an antiluteolytic factor produced by the conceptus were realized by MOOR and ROWSON (1966), who transferred 14-16 days old ovine embryos to ewes during the estrus cycle, before the 12 th day, and observed the maintenance of the corpus luteum and the interruption of the cycle. The following year, the same authors homogenized 14-16 day ovine embryos and injected the homogenate into the uterus before the 12 th day of the cycle. The same results were obtained: maintenance of the corpus luteum and interruption of the estrous cycle. This phenomenon was not observed if the homogenates were obtained from 21-23 day embryos.

NORTHEY and FRENCH (1980) and Humblot and DALLA PORTA (1984) carried out similar experiments in the cow. They transferred 15-17 days old embryos or their homogenates to recipients during the first 16 days of the estrous cycle obtaining the maintenance of the corpus luteum.

3.3.2.1. Bovine interferon tau (boIFN τ): the boIFN τ is a glycoprotein with approximately 172 amino acids, produced by mononucleate cells of the trophectoderm (MORGAN et al., 1993). It is the major secretory product produced by day 16-25 cow conceptus. When analyzed by two-dimensional gel electrophoresis, the boIFN τ fells into two major molecular weight classes (22 000 and 24 000) with isoeletric points between 6.5 and 6.7 (HELMER et al. , 1988a,b). The 24 000 molecular weight form is complex in nature whereas the 22 000 form is a single high-mannose type glycoprotein, indicating that these products undergoes differential

257

posttranslational glycosylations (HELMER et al. , 1988b). The entire cDNA sequence of the boIFN τ shared 79% identity with bovine interferon alpha II (IFN α II) (IMAKAWA et al. , 1989).

IFN τ is produced by the trophectoderm during the phase of trophoblast elongation. It alters uterine release of PGF 2α which results in rescue of the corpus luteum and continued release of progesterone. The mechanism of action of IFN τ includes inhibition of oestradiol receptors, consequent reduction in oxytocin receptors, activation of a cyclooxygenase inhibitor, and a shift in the prostaglandins to favour PGE2 over PGF 2α which also induces several endometrial proteins that may be critical for surviving of the developing embryo (HANSEN et al. , 1999).

3.3.2.2. Ovine interferon tau (ovIFN τ): in ewes, ovIFN τ is produced transiently and when introduced into the non-pregnant female uterus, extends corpus luteum life only for a short period of few days in most ewes, although a functional corpus luteum can persists much longer in others (MARTAL et al. , 1979; GODKIN et al. , 1982).

MARTAL et al. (1979) were the first to suggest that the antiluteolytic factor produced by the ovine conceptus was a termolabile protein of trophoblastic origin. This protein contains 172 amino acids (IMAKAWA et al. , 1987; ROBERTS et al. , 1991) and presents a molecular weight of 20 000 (GODKIN et al. , 1982). Its mRNA is expressed during a relatively short period (11 to 22 days) (CHARLIER et al. , 1989) that corresponds closely to the time at which the embryo acts to extend luteal lifespan. The highest level of mRNA expression was observed on the 22 nd of pregnancy

258

(HANSEN et al. , 1988). There is a greater structural identity between ovine and bovine IFN τ (85%) than between this protein and the closest homologous IFN omega (70%) (CHARLIER et al. , 1991).

Like boIFN τ, the ovIFN τ bind receptors on the uterine endometrim (Bazer, 1989) and seems to suppress transcription of the estrogen and oxytocin receptors genes to block pulsatile release of PGF 2α (GODKIN et al. , 1997).

3.3.2.3. Caprine interferon tau (caIFN τ): IFN τ molecules has also been identified in caprine species (GNATEK et al. , 1989). Two classes of protein (17 000 and 22 000-24 000) (GUILLOMOT et al. , 1998), each with different isoeletric points, were identified from goat conceptus culture medium (BAUMBACH et al. , 1990b). The goat IFN τ is present in the trophoblastic cells as early as day 14 and until day 17. However, by day 18, as implantation proceeded, goat IFN τ is no longer detected suggesting that, in this specie, other factors need to be present by day 18 to take over a role in the maintenance of luteal function (GUILLOMOT et al. , 1998).

3.3.3. Early Pregnancy Factor (EPF)

Early-pregnancy factor was first discovered in the early stages of gestation by use of the rosette inhibition test (MORTON et al. , 1979). Despite several attemps, the use of this assay is not yet reliable as a current pregnancy diagnosis test in animal species (TAKAGI et al. , 1998).

Recently, it was observed that approximately 70% of the amino acid

259

sequence of EPF are identical to that of rat chaperonin 10, a member of the highly conserved heat-shock family. Investigations with the latter confirmed that chaperonin 10 is the moiety in pregnancy serum which initiates response in the EPF bioassay (CAVANAGH and MORTON, 1994). As well as being a monitor of the presence of a viable embryo (SHU-XIN and ZHEN-QUN, 1993), it is necessary for embryonic survival. In this capacity it acts as both an immunosuppresant and growth factor (MORTON et al. , 1992; MORTON, 1998).

4. Acknowledgements

This review is part of a study supported by the following grants. The investigations realized in Belgium were funded by FNRS and IRSIA grants to J.-F. Beckers. N.M. Sousa is supported by a grant from CAPES. We also thank the NIH Bettesda USA for gift of hormones.

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276

Apêndice 2

SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R., EL AMIRI, B., BANGA-MBOKO, H., SZENCI, O. & BECKERS J.F. (2001) Chorioví gonadotropin a specifický glykoprotein u b řezích p řežvýkavc ŭ (Chorionic gonadotropins and pregnancy-associated glycoproteins in ruminants). 3rd Central European Buiatric Congress, 24 et 25 Mai, Moravian Highlands, Czech Republic, p.430-432.

277

Chorionic Gonadotropins and Pregnancy-Associated Glycoproteins in Ruminants

SOUSA, N.M. 1, FIGUEIREDO, J.R. 1, EL AMIRI, B. 2, BANGA-MBOKO, H. 2, SZENCI, O. 3 & BECKERS, J.F. 2

1Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil 2Physiology of Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liège, Belgium 3Department of Obstetrics and Reproduction, University of Veterinary Science, Hungary

1. Introduction

In the genital tract of the female, a developing embryo induces the transformation of the cyclic corpus luteum into a pregnancy corpus luteum. In ruminants, the mechanism of maternal recognition of pregnancy involves an interferon tau synthesized in the external layers of the trophoblast. This molecule interacts with the endometrium to inhibit the

PGF 2α synthesis and/or release.

In almost all mammalian species, the progesterone secretion by the corpus luteum is rescued by the placenta. In ewes, for example, progesterone synthesis is assumed by the placenta around day 50 after fertilization. If an early embryonic mortality occurs, a return to estrus can be observed around days 40 to 50 after fertilization.

278

In the bovine species, the corpus luteum is necessary for pregnancy maintenance till day 200 after fertilization. Afterwards, the production of progesterone by the placenta is sufficient to maintain the pregnancy. In cow suffering of embryonic or fetal mortality, the return of estrus occurs in an unpredictable delay varying largely between different individuals.

In goat, the corpus luteum is necessary for the whole pregnancy and after embryonic mortality, it survives often for a long period, approximately the length of a normal gestation (150 to 155 days). This characteristic explains the syndrome known as pseudopregnancy and/or hydrometra.

The maternal recognition of pregnancy in non-ruminant species involves another mechanism. In primates and in horses, the placenta synthesizes a two-subunit glycoprotein closely related to the pituitary follitropin (FSH) and lutropin (LH). These chorionic gonadotropins were discovered in 1927 (ASCHHEIM) in human and in 1930 (COLE and HART) in mare, being named hCG and eCG, respectively. hCG and eCG could be demonstrated by various biological, immunological, immuno- electrophoretic and radio-immunological techniques, as well as by inhibition of latex agglutination and hemagglutination.

After this discovery, there were many attempts in order to identify an equivalent of the choriogonadotropin in other animal species (FOSTER, 1956). However, after the elucidation of the principal molecular mechanisms of interferon tau in the maintenance of the corpus luteum in ovine and bovine species, the scientific interest of the question on the existence of a chorionic gonadotropin in ruminants was decreased.

279

2. Does the Ruminant Placenta Secrete Gonadotrophic Substances ?

As early as 1940, NALBANDOV and CASIDA observed a reduction in the pituitary gonadotrophic activity in the pregnant cow and suggested that the corpus luteum was replaced by additional luteotrophic substances produced elsewhere. Approximately 10 years later, WEETH and HERMAN (1952) and BJÖRKMAN (1954) found that bovine trophoblastic cells contain glycoproteins.

In the sixties, using extracts of fetal and maternal cotyledons and Parlow’s test (depletion of ascorbic acid), FOOTE and KAUSHIK (1963) demonstrated the presence of a LH-like activity. In 1967, testing extracts of fetal cotyledons, Lunen and Foote obtained a significant response with the ventral prostate test and Parlow’s test (PARLOW, 1961) and suggested that a LH-like substance was present in the bovine placenta (bovine chorionic gonadotropin or bCG).

More recently, AILENBERG and SHEMESH (1983) working on cotyledons collected during the first three months of pregnancy (20 to 100 days) looked for a gonadotrophic-like substance capable to stimulate the progesterone production in bovine granulosa cells culture. For this purpose, they used a radio-receptor method on Leydic cells according to the technique previously described by RAMACHANDRAN and SAIRAM (1975). They isolated a thermolabile substance with an apparent molecular mass of 60 000 daltons and with a biological activity related to that of bLH, that they considered to be a true bovine chorionic hormone. This hormone could have a special importance in the cow, as in this species, the corpus luteum is required for the maintenance of gestation throughout most of this process (at least for 200 days).

280

BECKERS et al. (1987) continued to study this question by using the radioreceptor assay method with membrane receptors and by looking for a luteotrophic activity in fetal cotyledonary extracts and in all the fractions obtained during biochemical purification procedures. The membrane receptors were prepared from corpora lutea after tissue homogenization followed by centrifugation. After several successive purification steps (90 000 times purification), in 1987 they isolated a substance with an activity 400 times greater than that isolated by AILENBERG and SHEMESH (1983). The molecular mass was 30 000 daltons. This hormone could not be confounded with hypophyseal LH as there was no arc of precipitation between purified bCG and anti-bLH antiserum following radial immunodiffusion in agar gel. However, this purified hormone was closely related to pituitary LH as the anti-bCG serum tested presented a cross- reaction with this substance.

Similarly to previous observations in the bovine species, it was observed that homogenates of 13 to 15 days old sheep embryos prolonged the life of the corpus luteum. GODKIN et al. (1978) showed that these homogenates stimulate progesterone production by cultured luteal cells, and one year later, LACROIX and MARTAL (1979) were able to demonstrate a luteotrophic factor of placental origin by use of a radiocompetitive binding method with corpus luteum membrane receptors. The secretion of this ‘luteotrophic factor’ seemed to be very low in early pregnancy. As the non-regression of the cyclic corpus luteum and its transformation into a pregnancy corpus luteum did not appear to increase its concentration, another anti-luteolytic substance was suspected to be involved in this mechanism. This factor was later described as

281

trophoblastin or interferon tau.

3. bCG as an Aspartic Protease Family Member: the PAG-2

The question on the existence of a gonadotrophic substance in ruminant placenta was partly solved by the study of XIE et al. (1994), who showed that the cDNA sequence corresponding to the bCG molecule was closely related to those of the aspartic proteinase family.

This finding was highly surprising however, previous investigations have shown that chymotrypsinogen, a serine proteinase, can bind to the LH/hCG receptor and activate it (WILLEY and LEINDENBERGER, 1989).

4. The Lack of Expression of the Gonadotropin ααα-Subunit in Ruminant Placenta

One other answer to this important question could be given by the investigation described by NILSON et al. (1991). These authors showed that the expression of the glycoprotein hormone α-subunit gene occurs in the pituitary of all mammals, but exclusively in placenta from primates and horses.

In humans, two different elements, termed upstream regulatory element (URE) and cAMP response element (CRE), are required for placenta-specific expression of the α-subunit gene. The URE binds a protein unique to placenta whereas the CRE binds a ubiquitous protein.

Comparative analysis of the promoter-regulatory region of the α-

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subunit gene in some mammalian species indicates that a functional URE has been retained and suggests a potential for its specific expression in ruminant placenta. Indirect evidence also indicates that the URE binding protein has been conserved, even in placenta from mammals that fail to express the α-subunit gene. The lack of expression of the α-subunit gene in placenta of rodents and cattle can be traced as a single nucleotide mutation that renders the CRE-like sequence of these genes incapable of binding the protein that confers responsiveness to cAMP.

Indirectly, this study comforts the hypothesis of a certain luteotropin- like activity of the ruminant pregnancy-associated glycoprotein II (boPAG- 2). However, the biochemical difficulty to isolate this molecule from placenta extracts did not allow the development of physiological studies and keep this question unsolved.

In conclusion, the endocrine activity of the ruminant placenta and the reciprocal relationships between the sources of hormones during gestation remain to be described in details. The discovery of prostaglandins, interferons tau and more recently of the pregnancy-associated glycoproteins family gave probably main parts of this puzzle.

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284

Apêndice 3

MOREIRA DA SILVA, F., SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R. & BECKERS, J.F. Proteínas placentais secretadas na circulação materna: auxílio ao diagnóstico de gestação e ao estudo da mortalidade embrionária em bovinos. (Submetido à Revista Portuguesa de Zootecnia )

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Proteínas placentais secretadas na circulação materna: auxílio ao diagnóstico de gestação e ao estudo da mortalidade embrionária em bovinos

MOREIRA DA SILVA, F. 1, SOUSA, N.M. 2, FIGUEIREDO, J.R. 2 & BECKERS, J.F. 3

1Departamento de Ciências Agrárias, Universidade dos Açores, Portugal 2Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria, Brasil 3Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade de Liège, Bélgica

Resumo

Durante as últimas décadas, várias equipas de investigação têm envidado esforços para caracterizar proteínas ou glicoproteínas produzidas pela placenta dos ruminantes, a qual resultou na descoberta de uma grande família de glicoproteínas associadas à gestação (PAGs) expressas na placenta de bovinos, ovinos e caprinos. Recorrendo a técnicas de biologia molecular, as PAGs foram identificadas como pertencendo à superfamília das proteinases asparticas, da qual também fazem parte os pepsinogênios, a renina, as catepsinas D e E, entre outras. Um vez que as PAGs são produzidas em largas quantidades pelas células binucleadas do trofoblasto, os seus níveis são facilmente detectáveis na circulação materna a partir do início da gestação. No presente trabalho, além de serem caracterizados os principais aspectos fisiológicos e bioquímicos das PAGs bovinas, será

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demonstrada que a determinação dos níveis de PAGs são um óptimo instrumento de trabalho para o diagnóstico da gestação, servindo ainda como indicador do bem estar do feto e do estado sanitário da placenta. Informações relativas a outras proteínas placentais serão discutidas comparativamente às informações disponíveis sobre as PAGs.

Placental proteins secreted in maternal circulation: useful indicators for both pregnancy diagnosis and embryonic mortality in bovine species

Summary During the last decades, several research groups developed investigations in order to characterize proteins or glycoproteins synthesized by ruminant placenta. As result of these investigations, a large family of pregnancy-associated glycoproteins was identified in bovine ovine and caprine placenta. By using molecular biology techniques, it was demonstrated that they are members of the aspartic proteinase superfamily, in which they co-exist with pepsinogens, renin, cathepsin D and E, etc. Due to their secretion in large amounts by the trophoblastic binucleated cells, bovine PAGs are detectable in maternal circulation soon after implantation. In the present work, in addition to the physiological and biochemical characterization of bovine PAGs, it will be showed how the measurement of PAG concentrations in maternal blood is useful for both pregnancy confirmation and follow-up of the fetus-placental well-being. Available information related to other placental proteins will be also discussed.

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1. Introdução A placenta é um sistema orgânico polivalente com uma função fisiológica vital na perpetuidade da mamíferos euterianos: o desenvolvimento fetal está relacionado com o desenvolvimento da placenta do ponto de vista anatómico, genético e metabólico. No que diz respeito à função endócrina dos mamíferos, esta inclui várias hormonas tais como a progesterona, estrogéneos, gonadotrofinas coriónicas, lactogénes placentais (também designados por somatomamotrofinas), prolactinas, hormonas e factores de crescimento, além de proteínas e glicoproteínas específicas ou associadas à gestação, as quais interferem com o estabelecimento da gestação a manutenção do corpo lúteo, a tolerância imunitária do embrião/feto pela mãe, o metabolismo materno intermédio, o crescimento fetal e o desenvolvimento da glândula mamária. O estudo da função endócrina da placenta dos bovinos será discutida no presente trabalho. As proteínas associadas à gestação, bem como o seu relacionamento com outras hormonas peptídicas serão usadas como termos de comparação para compreensão da sua estrutura, função e produção das proteínas placentais.

2. A Placenta A placenta desempenha um papel essencial no estabelecimento e manutenção da gravidez bem como no desenvolvimento fetal, funcionando como um órgão respiratório, nutricional, endócrino e imunológico. Contrariamente ao que se acreditou durante muitos anos, a placenta não representa somente uma barreira mãe/filho, possuindo efectivamente um papel activo e selectivo de trocas entre a mãe e o feto, o qual evolui em

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harmonia com outros sistemas. A estrutura da placenta varia de acordo com as espécies, e dela depende o comportamento do embrião na altura da nidação, quer esta seja nos tecidos de lúmen uterino ou então apenas na mucosa uterina. Apesar de algumas imperfeições, a classificação dos diferentes tipos de placentas baseada na estrutura histológica ou, mais precisamente no número de camadas histológicas que separam o feto do sangue materno parece-nos ser a mais precisa. Neste tipo de classificação, os diferentes tipos de placentas são divididos em quatro grupos: placentas epitéliocoriais (ex. equinos e suínos), placentas sindesmocoriais (ex. ruminantes), placentas endotéliocoriais (ex. carnívoros) e finalmente placentas hemacoriais (ex. primatas e roedores). O grau de ligação entre o epitélio uterino e a placenta é praticamente nulo nas placentas epitéliocoriais, sendo máximo nas placentas hemacoriais, onde o tecido uterino é modificado e rompido pelos tecidos da placenta, sendo este fenómeno responsável pelo sangramento que ocorre durante o parto. Quanto aos bovinos, a placenta situa-se entre dois tipos, não sendo completamente sindesmocorial nem epitéliocorial. Nesta espécie existe a presença de microvilosidades nas quais o epitélio uterino persiste mas é modificado num híbrido feto- materno formado pela migração e pela fusão das células binucleadas do corion fetal com as do epitélio uterino (WOODING, 1992).

2.1. Células binucleadas O elemento mais característico da placenta dos ruminantes é a presença de células binucleadas no trofoblasto (WIMSATT, 1951). Estas células primordialmente descritas por ASSHETON em 1906, têm sido

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objecto de inúmeras investigações através das últimas cinco décadas (DRIEUX e THIERY, 1951; AMOROSO, 1952; WOODING e WHATHES, 1980; KLISCH et al., 1999). As células binucleadas derivam das células coriónicas mononucleadas por cariocinese sem subsequente citocinese. As células mais jovens são localizadas profundamente na trofoderme e a sua maturação é feita progressivamente quando do seu aparecimento na superfície materna (WOODING, 1983). As primeiras células binucleadas aparecem imediatamente antes da implantação (WANGO et al., 1990a), podendo ser reconhecidas a partir de 14 dias após a fertilização nos ovinos (WOODING, 1984) e a partir do dia 17-18 nos bovinos (WATHES e WOODING, 1980). Após o desenvolvimento da placenta, as células binucleadas representam 15-20% do total da população celular placentária (WOODING, 1983; WOODING et al. , 1986; WANGO et al. , 1990b) das quais cerca de uma em sete migram em direcção ao epitélio uterino, em qualquer altura de gestação (WOODING et al., 1996). A migração das células binucleadas representa um papel importante na remodelação da estrutura da placenta, induzindo uma reacção com as células uterinas o que pode resultar na formação de células trinucleadas de vida curta em bovinos (WOODING e BECKERS, 1987) ou na formação de extensas placas sinciciais em ovinos (WOODING, 1992). No que diz respeito à sua função endócrina, na década de 40 suspeitou-se que a presença de células especiais da placenta dos ruminantes estaria relacionada com a produção de hormonas essenciais à manutenção da gestação. Nesta década foi provada pela primeira vez a redução da actividade gonadotrófica da pituitária na vaca gestante, sugerindo-se que o

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corpo lúteo fosse substituído por substâncias luteotróficas produzidas num outro órgão qualquer. Em 1952 e 1954, respectivamente WEETH e HERMAN e BJÖRKMAN usando micro-secções de cotilédones corados com “periodic acid Schiff (PAS)”, descreveram a presença de numerosas células trofoblásticas contendo glicoproteínas. Cerca de 10 anos mais tarde, FOOTE e KAUSHIK (1963) demonstraram a presença de actividade LH nos cotilédones. Estes estudos foram pioneiros neste campo, abrindo o caminho para a futura identificação e caracterização de hormonas e proteínas sintetizadas pela placenta dos ruminantes. Actualmente é bem conhecido que as células binucleadas estão directamente envolvidas na produção de progesterona (WANGO et al., 1991; WANGO et aI., 1992; WOODING et al., 1996), prostaglandinas (REIMERS et al. , 1985b), hormonas placentárias lactogénicas (VERSTEGEN et al., 1985; WOODING et al. , 1992) e glicoproteínas específicas ou associadas à gestação (REIMERS et al., 1985a; GOGOLIN- EWENS e t al. , 1986; MORGAN et al. , 1989; ZOLI et al. , 1992a; ATKINSON et al., 1993). Estes produtos antes de serem secretados são armazenados em grânulos densos, os quais ocupam mais de 50% do citoplasma (LEE et al. , 1986) e os quais libertam o seu conteúdo directamente no sistema materno após a migração das células binucleadas (WOODING, 1984).

3. Proteínas placentais As proteínas secretadas pela placenta, após o momento em que podem ser doseadas na circulação sanguínea materna, apresentam-se como um óptimo indicador de gestação bem como do estado sanitário da unidade

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feto-placentária. Contudo, apesar de muita investigação ter sida desenvolvida sobre as funções fisiológicas destas proteínas placentais, a exacta função da maior parte delas contínua ainda desconhecida. É sabido, por exemplo, que nas espécies ruminantes, o interferon tau permite a manutenção do corpo lúteo funcionando como um agente anti- luteolítico (MARTAL et al. , 1979), enquanto que nos primatas, esta manutenção é assegurada pela gonadotrofina coriônica (ASCHHEIM, 1927). Além de factor anti-luteolítico, o interferon tau funciona ainda como um factor estimulante na síntese da progesterona. Em adição a estas acções, esta glicoproteína parece também exercer uma função importante, principalmente nas primeiras etapas da gestação, na tolerância imunitária do embrião/feto pela mãe (FILLION et al. , 1991; MARTAL et al. , 1997). Num estado mais avançado da gestação, a placenta produz a hormona lactogéne placental, a qual é responsável pela estimulação da actividade mamogénica (FORSYTH, 1986), estando também envolvida, pelo menos parcialmente, no crescimento fetal (Chene et al. , 1988) e no metabolismo materno (Freemark et al. , 1992). Os maiores grupos das proteínas placentais e os seus aspectos mais relevantes, são discutidos a seguir.

3.1. Proteínas associadas à gestação (PAGs) As PAGs, conhecidas com uma enorme variedade de nomes os quais incluem “Pregnancy-Specific Protein B” (PSPB) (BUTLER et al., 1982; LYNCH et al., 1992) e “Pregnancy-Specific Protein 60” (CAMOUS et al. , 1988; MIALON et al., 1993) foram primeiramente descritas como antígenes placentais da placenta de bovinos, os quais estavam presentes no

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soro sanguíneo da mãe a partir do primeiro mês de gestação. Nos últimos 20 anos, Butler, Beckers, Zoli e Xie e colaboradores (BUTLER et al. 1982; BECKERS et al. , 1988b; ZOLI et al., 1991; XIE et al., 1991) identificaram uma longa variedade desta família de glicoproteínas produzidas especificamente pela camada celular externa da placenta das espécies unguladas (ZOLI et al. , 1992a; GREEN et al. , 2000). Usando procedimentos bioquímicos, algumas moléculas da família das PAGs foram isoladas a partir de cotilédones de vaca (ZOLI et al., 1991), da ovelha (ZOLI et al., 1995, XIE et al., 1997a) e da cabra (GARBAYO et al., 1998). Após terem sido isoladas, estas moléculas foram usadas para imunizar coelhos e o anti-soro obtido permitiu o desenvolvimento de ensaios radio-imunológicos para a detecção de PAG no soro sanguíneo das diferentes espécies (ZOLI et al. , 1992b; RANILLA et al., 1994; GONZALEZ et al., 1999). O doseamento das concentrações de PAG representa actualmente um óptimo método de diagnóstico de gestação bem como de estudo da função do trofoblasto, podendo ajudar no maneio da reprodução bem como nos aspectos clínicos e de investigação para determinar diferentes aspectos patológicos que possam afectar a gestação (ZARROUK et al., 1999a,b).

3.1.1. Família das PAGs bovinas (boPAGs) a) A boPAG-1 Após terem sido isoladas por ZOLI e colaboradores em 1991, e após a primeira caracterização por XIE e colaboradores em 1991, diferentes moléculas da família das PAGs foram identificadas e denominadas dum modo arbitrário até à presente data.

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A boPAG purificada por ZOLI et al. em 1991 e que posteriormente passou e designar-se de boPAG-1 (XIE et al., 1995) demonstrou ser uma proteína acídica com um peso molecular de 67 000, existindo quatro isoformas (I, II, III e IV) com diferentes pontos isoeléctricos (4,4; 4,6; 5,2 e 5,4). O ponto isoeléctrico está directamente relacionado com a quantidade de ácido siálico existente em cada isoforma (2,12%, 0,83%, 0,64% e 0,29%, respectivamente). Estudos imunoquímicos permitiram detectar a boPAG-1 predominantemente no citoplasma de células binucleadas presentes nos tecidos dos cotilédones (ZOLI et al., 1992a). A presença de antígenes imunologicalmente idênticos à boPAG-1 foram também encontrados em extractos de ovários e testículos (ZOLI et al., 1990), o que justifica o adjectivo “associadas” e não “específicas” que são dadas a esta glicoproteína. O facto mais surpreendente da boPAG-1 após a sua purificação foi a descoberta de que esta proteína pertence à uma família de enzimas proteolíticas, as quais são conhecidas como proteinases aspárticas, possuindo uma grande identidade em aminoácidos com as sequências da pepsina, da quimosina, da catepsina D e E, da renina, da napsina e da memapsina. Contudo, apesar de sua similaridade estrutural com outras proteinases aspárticas (GURUPRASAD et al. , 1996; XIE et al. , 1997b), esta molécula é considerada como cataliticalmente inactiva. XIE e colaboradores (1991) demonstraram que a falta aparente da actividade proteolítica da boPAG-1 é devida à presença de alanina (Ala-76) no local onde normalmente existe glicina (Gly-76). Esta mutação tem como consequência uma mudança do local da molécula catalítica da água da sua posição simétrica normal, originando a inactividade catalítica desta

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proteína (DAVIES, 1990). b) A boPAG-2 Em 1994, XIE e colaboradores identificaram uma proteína coriônica anteriormente isolada por BECKERS e a sua equipa (1988a) como sendo um novo membro da família das proteinases aspárticas, à quaI foi dado o nome de boPAG-2 (BECKERS et al. , 1994). Esta glicoproteína foi caracterizada como sendo um polipéptido de 372 aminoácidos estruturalmente semelhante à boPAG-1, à ovPAG-1 e à pepsina (com uma sequência de 58%, 58% e 51% dos aminoácidos idênticos, respectivamente). O ADN complementar da boPAG-2 é detectado a partir dos 17 dias de gestação, coincidindo com o inicio da implantação. Contudo, contrariamenteao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 ainda não foi purificada até à homogeneidade, não podendo ser usada para o desenvolvimento de dosagens radio-imunológicas que permitam a sua detecção na circulação sanguínea materna. Contrariamente ao que acontece com a boPAG-1, a boPAG-2 tem um centro catalítico com uma sequência de aminoácidos idêntica a outras proteinases aspárticas activas. Uma possível actividade proteolítica da boPAG-2 continua, contudo, ainda por esclarecer. c) Outras boPAGs Até ao presente, como resultado do uso de técnicas de biologia molecular, foram identificados 21 ADNs codificantes para diferentes PAGs na espécie bovina (XIE et al. , 1991; XIE et al. , 1994; XIE et al. , 1997b;

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GREEN et al. , 2000). Estas moléculas diferem em ao menos 5% em sua sequência de nucleotídeos, sendo expressas em células mononucleadas, binucleadas ou mesmo em ambas. Entretanto, com excepção das boPAGs – 1 e –2, ainda não foi possível isolar a maioria destas proteínas a partir de placentas, não sendo as mesmas identificáveis na circulação periférica sanguínea.

3.1.2. Ensaios radio-imunológicos para dosear a boPAG-1 a) Doseamento de PAG durante a gestação normal Na prática, o anti-soro produzido em coelhos contra a boPAG-1, PSPB ou PSP-60 tem permitido o desenvolvimento de ensaios radio- imunológicos específicos para dosear estas proteínas no sangue de vacas (SASSER et al. , 1986; HUMBLOT et al ., 1988ab; SASSER et al ., 1989; ZOLI et al., 1992b; MIALON et al. , 1993; SKINNER et al. , 1996). Uma vez que as concentrações de PAG são mais elevadas no soro da mãe que no do feto (ZOLI et al. , 1992b), pode concluir-se que esta glicoproteína é libertada preferencialmente no sistema materno em detrimento do do feto. Na circulação materna, a PAG pode ser detectada ao mesmo tempo que o trofoblasto estabelece ligações definitivas com as paredes do útero. Desde o início da gestação até uma semana antes do parto, as concentrações aumentam devagar e gradualmente (Figura 1). Durante o período do parto as concentrações aumentam rapidamente atingindo valores de 1 à 5 µg/ml alguns dias antes do parto (ZOLI et al., 1992b; PATEL et al. , 1997) (Figura 1),. As concentrações baixam após o parto, atingindo níveis basais, indetectáveis cerca de 100 dias pós-parto (ZOLI et aI., 1992b). O relativo longo tempo necessitado pela boPAG-1 para

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desaparecer da circulação sanguínea materna pode ser explicada pela elevada concentração presente no sangue matemo na altura do parto, bem como a longa vida-média desta glicoproteína a qual está estimada em 7,4 a 9 dias (KIRACOFE et al. , 1993; ALI et al., 1997). Investigações realizadas durante o periparto demonstraram ainda a influência do ambiente maternal e do genótipo fetal (sexo e raça) nas concentrações periféricas de boPAG-1. De facto, as concentrações de PAG são mais elevadas na circulação materna em cruzamentos de raças que em raças puras (GUIBAULT et al., 1991).

Figura 1. Perfil das concentrações de PAG (média ± desvio padrão) calculados no soro de 20 vacas coletadas do dia 20 de gestação ao dia 100 pós-parto. A remarcar a escala aritmética das concentrações de PAG do dia 20 ao dia 220 de gestação e a escala logarítmica do dia –40 antes do parto ao dia 80 pós-parto. Adaptado de ZOLI et al. , 1992b.

A detecção da PAG em amostras de soro ou de plasma é correntemente usada como método para diagnósticos de gestação em bovinos a partir dos 29-30 dias após a fecundação (SASSER et al., 1986;

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HUMBLOT et al., 1988a; SZENCI et al. , 1998a,b, 2000a,b). Os valores preditivos positivos do doseamento de PAG para fins de diagnóstico de gestação variam de 72% (dia 29 após inseminação artificial; SZENCI et al. , 1998b) a 93% (dia 45 após inseminação artificial; ZOLI et al. , 1992b), enquanto que os valores preditivos negativos variam de 95% a 100% (respectivamente aos dias 29 e 45 após inseminação artificial; SZENCI et al. , 1998b). b) Doseamento de PAG durante gestações anormais Recentemente, ECTORS e colaboradores (1996a) demonstraram que em programas de transferência nuclear, mesmo se a maior parte dos bezerros apresentam pesos e tamanhos normais. Em 1999 Horta demonstrou existir um maior crescimento do feto durante a gestação, quando os vitelos resultam a partir de embriões produzidos in vitro. Além do aumento do peso alguns bezerros podem apresentar anomalias morfológicas tais como edemas do cordão umbilical com hipertrofia da placenta, as quais são responsáveis por elevadas concentrações de boPAG- 1 na circulação materna. Em alguns casos, estas concentrações podem atingir entre 9 µg a 12,35 µg/ml (ECTORS et al. , 1996b). Consequentemente, concentrações anormalmente elevadas de boPAG-1 na circulação materna podem poderão ser um importante indício da presença de quantidades anormais de tecidos do trofoblasto. No caso contrário, a observação de um acentuado decréscimo nas concentrações de boPAG-1 após monta natural, inseminação artificial, fecundação in vitro ou clonagem podem são um forte indicativo de disfunção placentária ou sofrimento fetal. Num estudo pioneiro, o

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doseamento de concentrações de boPAG-1 em amostras colectadas semanalmente após transferência de embriões produzidos in vitro permitiu a detecção de mortes embrionárias e fetais na espécie bovina (ECTORS et al. , 1996a). O mesmo fenómeno de redução nas concentrações de PAG em caso de abortamentos de origem infecciosa e não infecciosa foi descrito por ZARROUK et al . (1999a,b) em cabras de origem norueguesa. Contudo, dadas as elevadas variações nas concentrações da PAG no sangue materno, somente uma acentuado decréscimo ou desaparecimento total da PAG pode ser um sinal efectivo da morte embrionária ou fetal no caso de gestações múltiplas e simples, respectivamente. Foi demonstrada ainda que a utilização paralela da ultrasonografia (US) e do doseamento de hormonas como a progesterona (P4) e a boPAG-1 pode revelar a ocorrência de diversos problemas frequentemente observados em condições de campo, tais como a re-inseminação de fêmeas já grávidas ou a administração de prostaglandina F2α no início de uma gestação viável causando a morte do embrião ou do feto. Em ambos os casos, os quais se traduzem em erros no maneio da reprodução, a identificação de mortalidade embrionária ou fetal passaria despercebida sem o uso destas técnicas, sendo considerada simplesmente como um retorno tardio em cio. SZENCI e colaboradores (1998a) descreveram diversas situações nas quais o doseamento de proteínas associadas à gestação e progesterona demonstraram ser extremamente úteis quando associadas a técnica de US. Merecem ser citados particularmente o caso da vaca n o 3129 (Figura 2), no qual as concentrações de PAG diminuem enquanto que as concentrações de progesterona permanecem elevadas mesmo após a ocorrência de

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mortalidade embrionária devido à persistência do corpo lúteo; a vaca n o 3369, no qual as concentrações de PAG mostram claramente que a vaca tinha sido fecundada quando da primeira fecundação e que a realização de uma segunda inseminação 21 dias mais tarde provocou provavelmente uma contaminação do útero, resultando em mortalidade fetal; a vaca n o 3570, na qual o doseamento de PAG confirma a ocorrência de mortalidade embrionária precoce indicada pela US, e por fim, o caso da vaca n o 3004, no qual as concentrações de PAG demonstram que esta vaca teria sido inseminada num curto período após o parto (concentrações decrescentes de PAG), e que neste caso, provavelmente o ambiente uterino não estaria preparado para o estabelecimento de uma nova gestação.

Figura 2. Concentrações plasmáticas de boPAG-1 (-•-•-) e progesterona (-▲-▲-) em 4 vacas nas quais o diagnóstico de gestação inicialmente positivo (P) por ultrasonografia foi seguido de um diagnóstico negativo (N) por ultrasonografia ou pela observação direta da morte fetal (MF). A vaca n o 3369 foi re-inseminada (I.A.) no 20 o dia após a primeira inseminação. Adaptado de SZENCI et al. , 1998a.

300

3.2. Lactogénes placentais As lactogénes placentais, também conhecidas por somatomamotrofinas coriónicas, são hormonas proteinaceas de origem placental com uma parte estrutural e funcional idênticas às hormonas de crescimento e à prolactina. A função das hormonas lactogénes placentais varia de acordo com as diferentes espécies. Em geral foi sugerido que estas hormonas influenciam a mamogénese e a lactogénese (FORSYTH, 1986; BUTTLE et al. , 1972), as esteroidogéneses ovariana (GLASER et al., 1984; TELLERIA et al., 1998) e placentária (Deayton et al., 1993), o crescimento fetal (CHENE et al., 1988), alterando ainda o metabolismo maternal para acomodar o do feto, contribuindo para o seu crescimento e desenvolvimento (FREEMARK et aI. , 1992).

3.2.1. Lactogéne placental bovina ou somatomamotrofina coniónica bovina (bCS) Estudos efectuados em hormonas placentais precederam os estudos feitos sobre as PAGs nos ruminantes domésticos. Na espécie bovina, a actividade lactogénica dos cotilédones foi primeiramente demonstrada por BUTTLE e FORSYTH (1976). Este estudo pioneiro foi efectuado recorrendo ao uso de uma co-cultura de células do tecido mamário de rata e de tecido cotiledonar de vaca em diferentes estágios de gestação, durante um período de 5 dias. Com este trabalho, foi obtida uma substância lactogénica com actividade equivalente à cerca de 300 ng da actividade da prolactina bovina. Purificações realizadas ao mesmo tempo a partir do uso de placentas bovinas por várias equipas de investigação (BOLANDER e

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FELLOWS, 1976; BECKERS et al. , 1980; MURTHY et al. , 1982) permitiram a identificação de uma proteína com actividade somatomamotrópica, denominada mais tarde de hormona lactogène placental (bPL) ou somatomamotrofina coniónica bovina (bCS). A bPL é produzida pelas células coriónicas binucleadas (VERSTEGEN et al. , 1985; KAPES et al. , 1992), as quais libertam os seus productos para a circulação materna após sua migração e fusionamento com células do epitélio endometrial (BECKERS, 1983). Em contraste com outras lactogénes placentais, a PL bovina é uma glicoproteína que contém n-ligandos e o-ligandos oligosacarídeos (SHIMOMURA e BREMEL, 1988; BYATT et al. , 1987). Esta composição glicoproteica, característica também de outras proteínas placentais tais como a boPAG pode resultar dum mecanismo post translacional altamente desenvolvido o qual foi identificado existir nas células gigantes do trofoblasto de bovinos (GOGOLIN-EWENS et al., 1986). A PL bovina é detectada na circulação materna a partir do quarto mês de gestação (BECKERS, 1983) mas a sua concentração permanece inferior a 2 ng/ml durante a gestação (Figura 3). Na circulação periférica do feto a concentração de bPL é mais elevada (5-25 ng/mI) apresentando um declínio com o avanço da gestação (BECKERS et al. , 1982; BYATT et al., 1987). Estas concentrações fetais vs maternais de bPL são bastante diferentes das observadas para a boPAG-1, apesar da co-localização de ambas as proteínas placentais nas mesmas células. Nos bovinos o crescimento da glândula mamária parece ser, pelo menos parcialmente controlada por hormonas de origem placental, tais como a bPL. O crescimento do bezerro e o peso da placenta estão

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positivamente relacionados com a produção de leite na Iactação seguinte (ERB et aI., 1980; COLLIER et al. , 1982).

Figura 3. Perfil das concentrações plasmáticas da hormona lactogéne placental bovina doseada em vacas e em fetos. Adaptado de BECKERS et al. , 1982.

3.3. Proteínas associadas ao sinal embrionário Em algumas espécies, mesmo antes da implantação, o embrião produz alguns “sinais” os quais são reconhecidos pela mãe inibindo a luteolise e induzindo a transformação do corpo lúteo cíclico num corpo lúteo gravídico. Dentro destes sinais, pode ser referida a gonadotrofina coriónica (GC), um factor luteotrófico produzido pelas placentas dos humanos e dos equinos, e o interferon tau, bem como o factor anti-luteolítico responsável pela permanência do corpo lúteo nas espécies ruminantes.

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3.3.1. Gonadotrofina coriónica (GC) As espécies humana e equina são conhecidas, desde há muito tempo, como produtoras, ao nível placentário, de hormonas gonadotróficas. Já em 1927, ASCHHEIM relatou a presença dum factor gonadotrófico na urina da mulher grávida, baseando neste facto o seu famoso método de detecção de gravidez (ASCHHEIM e ZONDEK, 1928a,b). Dadas as suas propriedades, este factor gonadotrófico foi mais tarde chamado de gonadotrofina coriónica humana (hCG). Dois anos mais tarde, COLE e HART (1930) demonstraram existir actividade gonadotrófica no soro de éguas gestantes. Esta gonadotrofina, vulgarmente conhecida por PMSG, após uma melhor caracterização passou a ser denominada de gonadotrofina coriónica equina (eCG). Uma substância possuidora de uma actividade do tipo LH foi isolada pela primeira vez a partir de extractos cotiledonários fetais bovinos por FOOTE e KAUSHIK (1963). A partir desta época, numerosas equipas (AILENBERG e SHEMESH, 1983; BECKERS et al. , 1988a) tentaram purificar e caracterizar um equivalente da gonadototrofina coriônica na espécie bovina. Em especial, foi parcialmente purificada uma substância com grande actividade LH, e a qual não apresentou reacções cruzadas com anti-soro anti-LH bovino (BECKERS et al ., 1988a). Entretanto, apesar das numerosas tentativas feitas durante várias décadas, não foi possível isolar e caracterizar (sequência de aminoácidos) a molécula teoricamente responsável pela actividade gonadotrópica observada na placenta de fêmeas bovinas. A questão da existência ou não de uma substância gonadotrófica na placenta de bovinos somente foi parcialmente elucidada em 1994 por XIE e

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colaboradores, os quais demonstraram que o ADN complementar correspondente à “gonadotrofina coriônica” isolada em bovinos por BECKERS e colaboradores (1988a) correspondia, na verdade, a uma nova forma de protease aspártica pertencente a família das PAGs (boPAG-2). Uma outra resposta a esta questão foi dada por NILSON e colaboradores (1991), os quais mostraram que a expressão de genes codantes para a subunidade alfa, essencial à atividade luteotrópica do LH e das GCs, seria possível no tecido hipofisário de todas as espécies de mamíferos, mas restrita às placentas de equinos e primatas. Com base em ambos argumentos, pode ser deduzido que actividade coriónica previamente detectada em extractos placentários de bovinos pelo uso de dosagens baseadas em radio-receptores (LH) seria devida a uma activação não- específica de receptores LH, e não à existência de gonadotrofinas coriônicas nesta espécie.

3.3.2. Interferon tau Nos ruminantes domésticos, a produção ovárica de progesterona é requerida durante cerca de 55 dias nas ovelhas sendo este período pelo menos 165-180 dias nos bovinos (ESTERGREEN et al., 1967). Nos caprinos a progesterona ovárica é produzida até ao final da gestação. Nestas espécies, a transformação do corpo lúteo ciclico em gravídico parece ser induzida pela acção de um factor proteináceo sintetizado pelo concepto próximo à sua implantação. Este factor a que primeiramente se denominou trofoblastina (MARTAL et al., 1979) ou proteína trofoblástica (GODKIN et al. , 1984) foi recentemente designado como uma subclasse distinta da família do interferon alfa ao qual se designou interferon tau (CHARPIGNY

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et al., 1988). Os primeiros estudos que demonstraram a presença dum factor anti- luteolítico produzido pelo concepto de ruminantes foram realizados por MOOR e ROWSON (1966), os quais transferiram embriões de ovino com 14-16 dias a fêmeas não-gestantes antes do 12 o dia do ciclo sexual, observando a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual. No ano seguinte, os mesmos autores homogeneizaram embriões de ovinos com 14-16 dias e injectaram o homogeneizado no útero antes do 12° dia do ciclo sexual, obtendo-se resultados idênticos: a manutenção do corpo lúteo e a interrupção do ciclo sexual. Este fenómeno não foi contudo observado quando os embriões usados tinham entre 21-23 dias de idade. NORTHEY e FRENCH (1980) bem como HUMBLOT e DALLA PORTA (1984) fizeram experiências idênticas na vaca. Transferiram embriões entre 15-17 dias de idade ou os seus homogeneizados para recipientes durante os primeiros 16 dias do ciclo sexual obtendo a manutenção do corpo lúteo. O interferon tau é o principal produto secretado pelo concepto bovino entre os dias 16 e 25 pós-fecundação, alterando a libertação uterina de

PGF 2α, o que resulta na manutenção do corpo lúteo responsável pela síntese de progesterona no início da gestação. O mecanismo de ação do interferon tau inclui a inibição dos receptores para estradiol com uma consequente redução dos receptores para oxitocina, a activação do inibidor da ciclo- oxigenase e o favorecimento da síntese de PGE em detrimento da síntese de PGF 2α (HANSEN et al. , 1999). Apesar de ser um importante produto de secreção, esta molécula é libertada localmente no lúmen uterino, não podendo ser detectada na circulação periférica materna.

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3.3.3. Factor precoce de gestação (EPF) O factor precoce de gestação foi primeiramente descoberto nos primeiros estágios de gestação por Morton e colaboradores em 1974. Colocado em evidência pelo teste de inibição da roseta, o EPF foi considerado como sendo um importante factor imunosupressor responsável pela tolerância imunológica do concepto pelo sistema imunológico materno. Recentemente CAVAGNAGH e MORTON (1994) caracterizaram o EPF como sendo na verdade uma chaperonina 10, a qual poderia ser a molécula responsável pela inibição da formação de rosetas, e por consequência, possuidora de uma forte acção imunosupressora local (MORTON et al., 1992; MORTON, 1998). Apesar da precocidade atribuída ao aparecimento do EPF, a utilização do teste de inibição da roseta para fins de diagnóstico de gestação em diversas espécies não tem sido considerada como fiável (CHAOUAT e MENU, 1993).

4. Agradecimentos Este trabalho representa parte de estudos financiados pela FNRS e IRSIA belgas (J.F. Beckers). A fundação Luso-Americana para o desenvolvimento (Projecto 858/2000) financiam parcialmente os trabalhos de F. Moreira da Silva (Portugal) desenvolvidos neste domínio. A autora N.M. Sousa é financiada pela CAPES brasileira.

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Apêndice 4

SOUSA, N.M., REMY, B., EL AMIRI, B., FIGUEIREDO, J.R., BANGA- MBOKO, H., GONÇALVES, P.B.D. & BECKERS, J.F. Characterization of Pregnancy-Associated Glycoproteins extracted from zebu ( Bos indicus ) placentas removed at different gestational ages. (submetido à Reproduction, Nutrition, Development)

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Characterization of Pregnancy-Associated Glycoproteins Extracted from Zebu ( Bos indicus) Placentas Removed at Different Gestational Periods

SOUSA, N.M. 1, REMY, B. 2, EL AMIRI, B. 2, FIGUEIREDO, J.R. 1, BANGA-MBOKO, H. 2 GONÇALVES, P.B.D. 1 & BECKERS, J.F. 2

1Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil 2Physiology of Reproduction, Faculty of Veterinary Medicine, University of Liège, Belgium

Abstract

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chromatographies were analyzed by SDS-PAGE and Western blot, before transfer to polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane for NH 2- microsequence determination. In the first protocol, PAG was mainly eluted at NaCl concentrations of 0.04, 0.08 and 0.16 M in DEAE-Sephadex column. After CM ceramic chromatography of all except 0.32 M NaCl DEAE fraction, the most immunoreactive proteins revealed N-terminal amino acid sequences (10 to 25 aa long) which were 100% identical to bovine PAG-1. The same sequence (14 aa long) was found after pepstatin- agarose affinity chromatography of proteins extracted from placentas removed earlier in pregnancy. These results converged towards the expression of one major N-terminal PAG amino acid sequence in zebu placentas at different gestational ages.

Key words: pregnancy, trophoblast, placenta, reproductive technology

Caractérisation des protéines associées à la gestation extraites du placenta de zébu recueilli à différentes périodes gestationnelles

Résumé - Dans le présent travail, deux approches biochimiques ont été utilisées pour caractériser les PAGs isolées à partir de cotylédons fœtaux recueillis à différents stades gestationnels chez le zébu ( Bos indicus ). Le premier procédé impliquait des précipitations acides et au sulfate d’ammonium et des chromatographies par échange d’anion et de cation tandis que le second reposait sur l’utilisation d’une chromatographie d’affinité de pepstatine-agarose. Un dosage radioimmunolgique était utilisé pour suivre l’immunoréactivité des fractions au cours des différentes étapes de purification. Les fractions les plus immunoréactives issues des

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chromatographies par échange d’ion et affinité ont été analysés par électrophorèse en SDS et Western Blot avant transfert sur membrane de polyvinylidene difluoride (PVDF) pour micro séquençage de la partie N- terminale. Par comparaison des électrophorèse en SDS et Western Blot, différents isoformes de masses moléculaires apparentes allant de 51 à 69 kDa et de points isoélectriques compris entre 4,4 et 6,7 ont été identifiées à partir des placentas recueillis aux différentes époques gestationnelles. Le micro séquençage de la partie N-terminal (10 à 25 acides aminés) indique l’expression d’une seule séquence N terminal correspondant à celle décrite pour la PAG-1 de Bos taurus . protéines associées à la gestation / purification / zébu / placenta / micro séquençage N-terminal

1. Introduction

Recently, a polymorphic family of placenta-expressed proteins has been discovered in ruminant species. These pregnancy-associated glycoproteins (PAGs), also known as pregnancy-specific protein B (PSPB) (BUTLER et al. , 1982) and pregnancy serum protein (PSP-60) (CAMOUS et al. , 1988), constitute a large family of aspartic proteinases, showing a greatest sequence identity with pepsinogens (XIE et al. , 1991). PAGs are synthesized by mono and/or binucleate trophoblastic cells, some of them being released in maternal circulation during almost the whole pregnancy period (SASSER et al. , 1986; ZOLI et al. , 1992; MIALON et al. , 1993). In veterinary practice, the measurement of the PAG concentrations in maternal blood is useful for both pregnancy confirmation and follow-up of

321

the trophoblastic function. The first aspect can help breeders in the management of reproduction, while the second concerns more specifically clinicians and researchers in their investigation to establish differential diagnosis of pathologies affecting pregnancy (SOUSA et al. , 2001).

Two approaches have been used for PAG characterization in ruminant placentas: biochemistry and molecular biology. Biochemical procedures allowed the isolation of different PAG molecules, heterogeneous in molecular weight and charge (BUTLER et al. , 1982; XIE et al. , 1997a; GARBAYO et al. , 1998). Further characterization of these molecules by means of NH 2-terminal amino acid sequencing revealed the existence of one PAG in cows (boPAG 67 ), four in ewes (ovPAG 55 , ovPAG 60 , ovPAG 61 and ovPAG 65 ) and three in goats (caPAG 55, caPAG 59 and caPAG 62 ) (ZOLI et al. , 1991; XIE et al. , 1997a; GARBAYO et al. , 1998). By use of molecular biology techniques, a larger variety of PAG cDNAs has been identified in bovine (boPAG-1 to –21), ovine (ovPAG-1 to –9) and caprine placental libraries (caPAG-1 to –11) (XIE et al. , 1997a,b; GREEN et al. , 2000; GARBAYO et al. , 2000). As described by GREEN et al. (2000), these PAG cDNAs appear to be differentially expressed in early, mid and late gestational periods. However, in spite of several attempts in order to purify the different PAG molecules identified by nucleotidic sequencing, only two PAGs (boPAG 67 and ovPAG 65 ) could be successfully shown by both approaches (ZOLI et al. , 1991; XIE et al. , 1997a).

In this paper we describe the isolation, characterization and N- terminal microsequencing of PAG molecules extracted from zebu placenta removed at different gestational ages. The biochemical protocol previously described for PAG isolation in ruminant species was used to purify and

322

characterize PAG extracted from placentas removed late in pregnancy. In placentas removed earlier in pregnancy, a pepstatin affinity chromatography was used for the first time in order to enrich the preparations in PAG molecules before N-terminal microsequencing of immunoreactive proteins.

2. Materials and Methods

2.1. Assays for total protein and PAG-immunoreactivity

Total protein (TP) concentrations of all the fractions were determined by using the method of LOWRY et al. (1951) with bovine serum albumin (BSA; ICN Biochemicals Inc., Aurora, OH) as standard. The estimation of PAG concentrations in each purification step was determined by a bovine PAG-1 radioimmunoassay (boPAG-1 RIA; ZOLI et al. , 1992). Pure boPAG-1 (ZOLI et al. , 1991) was used as tracer and standard, and antibody (R497) against boPAG-1 was used for binding at a final dilution of 1:300 000.

2.2. Collection of cotyledons

Uteri were collected from pregnant zebu ( Bos indicus ) females within 5-30 min of slaughter. Fetal cotyledons were immediately dissected away from caruncular tissue, washed with 0.9% NaCl, and stored at –20°C until use. The stage of pregnancy was estimated by measurement of fetal crown- rump length. According to gestational age, placentas were classified as early (10-11 wk), middle (20-21 wk) or late placentas (30-31 wk). Figure 1 shows schematically the protocols of fractionation of proteins extracted

323

from zebu placentas.

2.3. Protocol 1

2.3.1. Protein Extraction

Approximately 1 920 g of fetal cotyledons from late placentas were thawed, finely minced, and homogenized (7 X 2 min) with a hand mixer in

10 mM potassium phosphate buffer (KH 2PO 4 + KCl, 100 mmol, pH 7.6) with a ratio of buffer to tissue of 3.5:1 (v/w). Leupeptin (0.001 mmol),

PMSF (0.2 mmol), sodium EDTA (0.2% w/v) and NaN 3 (0.02% w/v) were added at the time of homogenization. The homogenate was stirred at 4°C for 2 hours, then it was centrifuged at 27 000 X g for 1 h. The pellet obtained after the first centrifugation was homogenized in 4 liters of the same buffer (10 mM potassium phosphate), gently stirred overnight, and centrifuged at 27 000 X g for 1 h. The second supernatant, as the first, was retained and the pellet was discarded.

2.3.2. Acid Precipitation

Supernatants from the first and second extractions were collected together. The supernatant solution (35 924 mg of protein) was adjusted to pH 4.5 with 1 M H 3PO 4, stirred for 5 min and then allowed to precipitate at 4°C for 2 hours. Afterwards, the sample was centrifuged at 27 000 X g for 1 h, and the pellet was discarded. Its pH was readjusted to 7.6 with 1 M KOH.

324

Fetal cotyledons

Protocol 1 Protocol 2

Protein extraction at neutral pH Protein extraction at acid or alkaline pH

Acid precipitation

40-80% AS precipitation

Isolation DEAE Sephadex A25 Pepstatin-agarose affinity chromatography CM Ceramic of all DEAE fractions

Coomassie Blue staining One-dimensional SDS-PAGE Western blot

Two-dimensional SDS-PAGE N-terminal amino acid Characterization sequencing

FIGURE 1- Schematic outline of PAG purification from zebu placentas removed in late (Protocol 1), middle or early (Protocol 2) gestational periods.

2.3.3. Ammonium Sulfate Precipitations

The proteins (20 236 mg) were precipitated by ammonium sulfate (AS) at 40% saturation for 16 h. After centrifugation (27 000 X g for 1 h), ammonium sulfate was added to the supernatant to achieve 80% saturation. After an overnight precipitation, the solution was centrifuged at 27 000 X g for 1 h 30 min. The pellet (3 855 mg of protein) was resuspended in 500 ml of Tris-HCl buffer (10 mmol, pH 7.6), extensively dialyzed against the same buffer (48 h) and centrifuged (36 000 X g for 30 min) to eliminate

325

insoluble proteins.

2.3.4. Anion-Exchange Chromatography

The fraction isolated by 40-80%-saturated ammonium sulfate was loaded on a 14 X 18-cm diethylaminoethyl (DEAE) Sephadex A25 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) column which had previously been equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6). Five steps of increasing ionic-strength buffer (0.02, 0.04, 0.08, 0.16 and 0.32 M NaCl) were used for the elution of the column. All the fractions from DEAE-Sephadex chromatography were concentrated (Amicon Ultrafiltraton System; Danvers, MA) to a final volume of 200 ml, extensively dialyzed against 5 mM ammonium bicarbonate (pH 8) and lyophilized.

2.3.5. Cation-Exchange FPLC

Approximately 200 mg from each DEAE step was chromatographed separately on a 1 X 3-cm CM Ceramic HyperD F column (BioSepra, Cergy-Saint Christophe, France) previously equilibrated in 10 mM ammonium acetate (pH 5.2). After elution of the unbound proteins, a linear salt gradient (0-0.5 M NaCl) was applied at a flow rate of 1.5 ml/min. Fractions of 3 ml were collected and monitored by UV absorption at 280 nm. Fractions of each peak were pooled, extensively dialyzed (36-48 h) against 5 mM ammonium bicarbonate (pH 8), centrifuged at 36 000 X g for 30 min and lyophilized.

326

2.4. Protocol 2

2.4.1. Protein Extraction

Fetal cotyledons from early (553 g) and middle (890 g) gestational ages were thawed, finely minced, and homogenized (7 X 2 min) with a hand mixer in 50 mM ammonium bicarbonate buffer (pH 8.5) or 300 mM KCl solution (pH 5), respectively. The ratio of buffer to tissue was 3.5:1 (v/w). Leupeptin (0.001 mmol), PMSF (0.2 mmol), sodium EDTA (0.2% w/v) and NaN 3 (0.02% w/v) were added at the time of homogenization. The homogenates were stirred at 4°C for 4 hours, then they were centrifuged at 27 000 X g for 1 h and the pellets were discarded. The supernatant solutions containing soluble proteins (2 405 and 12 096 mg, respectively) were exchanged into 5 mM sodium acetate buffer (pH 5.2) by means of Sephadex G-25 filtration (Pharmacia) and concentrated by ultrafiltration to 60 and 1 000 ml, respectively.

2.4.2. Affinity Column Chromatography

Approximately 800 and 500 mg (20 and 40 ml) of crude extract placental proteins from early and middle gestational ages were loaded separately on a 1 x 4-cm pepstatin-agarose column (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) previously equilibrated with 50 mM sodium acetate (pH 5.2). After loading, the column was washed with the equilibration buffer until the optical density (OD) at 280 nm decreased below to 0.05. After the application of a linear salt gradient (0 to 1 M NaCl) to elute the weakly bound proteins, a linear pH gradient (5.2-10) was applied at a flow rate of 0.5 ml/min. Fractions of 1.0 ml were collected and monitored by

327

spectrophotometry at 280 nm. Fractions from a same peak were pooled, extensively dialyzed (36-48 h) against 5 mM ammonium bicarbonate (pH 8), centrifuged at 36 000 X g for 30 min and lyophilized.

2.5. Gel electrophoresis

One-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) were carried out with and without mercaptoethanol (5%) on a vertical cell system. Slab gels (12% acrylamide) were run at 20 mA during the migration in the stacking gel and at 40 mA (6h) in the separating gel (20 X 10 X 0.2 cm). Molecular weight standards (LMW Electrophoresis Calibration Kit; Pharmacia) were run simultaneously. Proteins were either visualized after Coomassie Brilliant Blue R250 (Merck, Darmstad, Germany) staining or transferred onto a nitrocellulose membrane (Hybond ECL, Pharmacia) for Western blotting.

Two-dimensional gel electrophoresis were performed by using pH 3- 10 Immobiline Drystrips (11 cm, Pharmacia) for the first dimension, followed by SDS-PAGE (12%) in the second dimension. After an overnight hydration in a Immobiline DryStrip Reswelling Tray (Pharmacia), focusing was carried out at 300 V for 30 min, 1 000 V for 30 min, 1 550 V for 16 h min and then at 1 850 V for 1 h in a Flat Bed Apparatus (FBE-3000, Pharmacia). Proteins were transferred to 0.2 µm polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes (Bio-Rad, Richmond, CA) on a 2117 Multiphor II Apparatus (Pharmacia). Transfer was carried out at constant voltages (12 V for 45 min and 36 V for 45 min).

328

2.6. Immunoblotting of transferred proteins

Proteins in the slab gel were transferred onto nitrocellulose membrane immediately after one-dimensional SDS-PAGE, essentially as described by TOWBIN et al. (1979). Transfer was carried out at a constant current of 24 mA for 1 h and then at 36 mA overnight (Multiphor II Apparatus; Pharmacia). After protein visualization with Ponceau S (Merck), nitrocellulose membranes were washed with Trisbuffered saline (TBS, pH 7.6) containing 3% BSA (3 X 10 min at 37°C), and then incubated separately (3 h at 37°C) with three different rabbit antisera raised against bovine (boPAG-1; R497) or caprine PAGs (anti-caPAG 55+62 and caPAG 55+59 ; R706 and R708, respectively). Antisera were used at a dilution of 1:200 in a mixture of PAG-serum free and TBS containing 1% BSA (24:75 v/v). After incubation, the membranes were washed with TBS containing 1% BSA (3 X 10 min at 37°C) and incubated (2 h at 37°C) with sheep anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HPR-POD; Chemicon International Incorporation, Temecula, CA) diluted at 1:2 000 in TBS containing 1% BSA. After the second incubation, nitrocellulose paper was washed with TBS (4 X 10 min at 20°C) and the peroxidase substrate (100 ml TBS, 100 µl H 2O2, 20 ml methanol and 60 mg chloronaphthol; 15 min at 0°C) was added to visualize the antigen-antibody complexes.

2.7. NH 2-terminal microsequence analysis

The NH 2-terminal amino acid (aa) sequences of the blotted proteins were determined by the Edman degradation method on a pulse liquid-phase protein sequencer (Procise 492 Applied Biosystems, Foster City, CA). The

329

sequences obtained were compared to known protein sequences in the Swiss-Prot, Trembl and TremblNew data banks by the Fasta 3 search program (PEARSON and LIPMAN, 1988).

3. Results

3.1. Isolation and characterization of PAG extracted from zebu placenta collected in late pregnancy

As determined by RIA, PAG-like proteins represented approximately 0.93% of the total soluble proteins extracted from 30-31-wk zebu placentas. Immunoreactive proteins (334.5 mg) were extracted from fetal cotyledons by homogenization treatment and remained in the supernatant after pH acidification (294.0 mg). After ammonium sulfate precipitation at 0%-40% and 40%-80% saturation, immunoreactive proteins represented 0.44% (0.76 mg) and 7.91% (304.91 mg) of the total soluble proteins, respectively. As shown in Table 1, the 40%-80% ammonium sulfate fraction bound quantitatively to the DEAE column at pH 7.6. Immunoreactive proteins were mainly eluted at NaCl concentrations of 0.04, 0.08 and 0.16 M (17.64%, 45.96% and 20.56% of total DEAE PAG- like activity, respectively). Despite the relatively low PAG:TP ratio of the other DEAE steps, all the fractions were treated by cation exchange chromatography.

Fast protein liquid chromatography (FPLC) profiles on CM ceramic column were shown in Figure 2. One single immunoreactive peak was observed for all DEAE fractions loaded. A major peak of PAG (eluted at NaCl concentrations of 0.14 to 0.18 mol) was observed for both 0.04 and

330

0.08 M NaCl DEAE fractions. Minor reactive peaks (eluted at NaCl concentrations of 0.21 to 0.41 mol) were observed for the other steps of DEAE. The molecular weight and isoeletric points of the highly immunoreactive proteins from CM ceramic chromatographies are described in Table 2.

TABLE 1 - Quantity of immunoreactive PAG and total protein (TP) of the fractions eluted from the DEAE-Sephadex A25.

DEAE fraction PAG a (mg) TP b (mg) PAG:TP ratio (NaCl concentration) 0 M 8.33 282.7 2.95% 0.02 M 5.63 114.6 4.91% 0.04 M 30.74 176.3 17.44% 0.08 M 80.07 292.9 27.34% 0.16 M 35.78 666.0 5.37% 0.32 M 7.49 292.4 2.56% aDetermined by boPAG-1 RIA bDetermined by Lowry method as BSA equivalent.

CM ceramic highly immunoreactive peaks from all DEAE fractions gave several stained bands after SDS-PAGE (Figure 3A). The major band of each peak was immunoreactive by Western blotting analysis with the use of anti-boPAG-1 antiserum (R497; Figure 3B). A similar reactivity was observed when using anti-caPAG 55+62 (R706) and anti-caPAG 55+59 (R708)

331

antisera (data not shown). Reduction with β-mercaptoethanol had no effect on apparent molecular masses of major-stained bands (data not shown).

Non-absorbed 0.02 M 22.9

41.2

0.04 M 0.08 M >100% >100%

0.16 M 0.32 M 29.4

64.6%

FIGURE 2 - FPLC CM ceramic chromatography profiles of all DEAE fractions (0, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16 and 0.32 M NaCl). The column (1 x 3 cm) was previously equilibrated in 10 mM ammonium acetate buffer, pH 5.2. The black lines indicate the salt gradients and the stippled areas indicate the most immunoreactive fractions. Percentages indicated by arrows give the PAG:total protein ratio, as determined by RIA (PAG) and Lowry (TP).

332

TABLE - 2 Electrophoretic characteristics and N-terminal microsequence identities of the highly immunoreactive proteins isolated after CM ceramic chromatography of DEAE fractions.

DEAE MW of major stained bands* pIs of major Identity at the fraction reactive N-terminal aa sequence origin Coomassie Western Blue Blot proteins** 0 M 51 kDa 50 kDa 6.4, 6.6, 6.7 boPAG-1 (10 aa) 0.02 M 62 kDa 56 kDa 5.2, 5.5 boPAG-1 (10 aa) 0.04 M 66 kDa 67 kDa 5.1, 5.2, 5.4 boPAG-1 (25 aa) 0.08 M 67 kDa 71 kDa 5.0, 5.1, 5.2, 5.3 boPAG-1 (25 aa) 0.16 M 67 kDa 67 kDa 4.4, 5.0, 5.5, 6.0 boPAG-1 (10 aa) 60 kDa - - - 0.32 M 62 kDa 62 kDa 5.8, 6.1, 6.3, 6.4 α-N-acetylgalactosaminidase (12 aa) *Molecular weights (MW) were estimated after one-dimensional SDS-PAGE. **Isoeletric points (pIs) were estimated after two-dimensional SDS-PAGE.

3.2. N-terminal amino acid sequence analysis of immunoreactive proteins extracted from zebu placenta collected late in pregnancy

The major-stained SDS-PAGE proteins corresponding to the immunoreactive Western Blot bands had their amino-terminal sequences determined. After CM ceramic chromatography of 0.04 and 0.08 M NaCl DEAE fractions, the immunoreactive bands revealed the RGSXLTTHPLRNIKDLVYMG amino acid sequence, corresponding to the amino terminus of boPAG-1 (Swiss-Prot database accession number Q29432). N-terminal microsequencing (10 aa) of immunoreacive bands from 0, 0.02 and 0.16 M NaCl DEAE fractions also revealed 100% sequence identity with boPAG-1.

333

FIGURE 3 - A) Coomassie Blue-stained SDS-PAGE (12%); B) Western-Blot analysis with antiserum anti-boPAG-1 (R497). Lanes 1, 2, 3, 4 and 5 correspond to the most immunoreactive peaks from CM ceramic chromatography of 0, 0.02, 0.04, 0.08 and 0.16 M NaCl DEAE fractions. Twenty micrograms of each CM ceramic peak were loaded on each lane. Molecular weights (x 10 -3) are indicated on the left and right sides of the figure.

Two-dimensional gel electrophoresis analysis showed that each immunoreactive band was composed by several proteins with different isoeletric points (Table 2). Microsequencing of the N-terminus (20 aa) of the four major spots corresponding to the immunoreactive 67 kDa band from the 0.08M NaCl fraction (data not shown) confirmed the presence of a single amino acid sequence.

Despite a relatively high PAG:TP ratio (65.55%) observed for the most immunoreactive peak obtained after CM ceramic chromatography of 0.32 M DEAE fraction, N-terminal microsequence of the 62 kDa protein (Figure 4) revealed the LENGLLRKPPMG sequence, which has high

334

sequence identity (91.7 %) with murine alpha-N-acetylgalactosaminidase (Swiss-Prot database accession number O88620).

FIGURE 4 - Two-dimmensional electrophoresis of the most immunoreactive peak from CM ceramic chromatography of 0.32 M NaCl DEAE fraction. Molecular weights (x 10 -3) are indicated in the right side. The pH scale is indicated at the top of the gel. Arrows indicate the different charged isoforms (6.4, 6.3, 6.1 and 5.8) of alpha-N-acetylgalactosaminidase.

3.3. Characterization of PAG isolated by means of pepstatin-agarose affinity chromatography

As estimated by RIA, PAG-like proteins represented approximately 1.81% (43.57 mg) and 0.61% (73.73 mg) of total proteins extracted from 10-11 wk and 20-21 wk gestational age zebu placenta at alkaline (pH 8.5) and acid (pH 5) conditions, respectively. Crude extracts from 10-11 wk old zebu placenta gave several peaks after chromatography on a pepstatin- agarose column (Figure 5). The most immunoreactive peak showed a low PAG:TP ratio (3.26%), being eluted at NaCl concentrations of 0.19 to 0.42

335

mol. After pH gradient application (5.2-10) no proteins were eluted. SDS- PAGE analysis revealed the presence of a single major stained protein with apparent molecular masse of 69 kDa and several weak stained bands ranging from 20 to 84 kDa (Figure 6A, lane 2). After Western Blot, major immunoreactive bands were observed at 69 kDa and 84 kDa (Figure 6B, lanes 2). Analyzed in two-dimensional electrophoresis the 69 kDa protein gave 3 isoeletric variants with pIs of 3.1, 3.3 and 6.18. Microsequencing of the 14 N-terminal aa of this protein showed 100% identity with the boPAG-1. Despite the high immunoreactivity observed with use of bovine R497 and caprine R706 and R708 antisera, the 84 kDa protein revealed the DKNAYGIDLIL sequence, which shows 77.78% identity with the alkaline metalloproteinase (GenBank database accession number AAK22731) identified in the Caulobacter crescentus genome.

10 -11 wk 20 -21 wk

3.3% 15.7%

FIGURE 5 - Pepstatin-agarose chromatographic elution profiles of proteins extracted from placentas removed at 10-11 wk and 20-21 wk of gestation. The column (1 x 3 cm) was previously equilibrated with 50 mM sodium acetate (pH 5.2). The black lines indicate the salt gradients and the stippled areas indicate the most immunoreactive fractions. Percentages indicated by arrows give the PAG:total protein ratio, as determined by RIA (PAG) and Lowry (TP).

336

FIGURE 6 - A) Coomassie Blue-stained SDS-PAGE (12%); B) Western-Blot analysis with antiserum anti-boPAG-1 (R497), anti-caPAG 55+62 (R706) and caPAG 55+59 (R708). Lanes 1 and 2 correspond to the most immunoreactive peaks from pepstatin-agarose affinity chromatography of proteins extracted from of placentas removed at 20-21 wk and 10-11 wk of gestation. Sixty micrograms of each immunoreactive peak were loaded on each lane. Molecular weights (x 10 -3) are indicated on the left and right sides of the figure.

4. Discussion

In the last two decades, the biochemical isolation of pregnancy- associated or specific proteins constituted a fundamental step for the development of specific RIA systems applicable for pregnancy diagnosis in ruminant species. By means of multiple step purification procedures, several PAG molecules differing in molecular masses and charges were isolated from placentas of cows (BUTLER et al. , 1982; CAMOUS et al. , 1988; ZOLI et al. , 1991), ewes (WILLARD et al. , 1995; XIE et al. , 1997a), goats (GARBAYO et al. , 1998), moose and elk (HUANG et al. , 1999), some of them being characterized at their N-terminal amino acid sequence.

337

However, at our knowledge, no publication was made on placental proteins extracted from zebu placentas.

In the first part of this study, a protocol including extraction of soluble proteins, acid and ammonium sulfate precipitations and ion exchange chromatographies was used to purify PAG molecules extracted from zebu placentas collected at the third trimester of pregnancy. Considered by some authors as unnecessary (HUANG et al. , 1999), acid precipitation constituted a critical step for PAG purification in zebu taxa. It allowed the elimination of more than 40% (approximately 16 g) of total crude extract soluble proteins with an optimal recovery of immunoreactive proteins (approximately 294 mg, corresponding to 88% of the initial PAG immunoreactivity). If the pH treatment is responsible for elimination of some PAG isoforms extracted from ruminant placenta is not known. Nevertheless, the utilization of a similar purification protocol including acid precipitation in caprine species allowed the isolation of three distinct PAGs with different molecular masses, each containing several isoforms (GARBAYO et al. , 1998).

As recently described, ion exchange chromatography has been proved to be very effective for separation of different PAG molecules extracted from goat and sheep placental tissues. In caprine species for example, after DEAE chromatography, immunoreactive proteins were equally apportioned between the 0.04 M and 0.08 M NaCl fractions. Further fractionation of these steps revealed the presence of a common 55 kDa protein, as well as the presence of distinct PAG molecules with masses of 59 kDa and 62 kDa, eluted respectively at 0.04 and 0.08 M NaCl (GARBAYO et al. , 1998). In ovine species, association of anion and cation exchange chromatographies

338

allowed the characterization of four distinct PAG molecules: ovPAG 55 , ovPAG 60 , ovPAG 61 and ovPAG 65 (XIE et al. , 1997a). Each of these proteins had a distinct NH 2-terminal amino acid sequence and a high amino acid identity with other members of aspartic proteinase family. In the light of these findings, in the first protocol, all DEAE fractions were systematically purified by CM ceramic chromatography and analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. Microsequencing of the 51, 62 and 67 kDa immunoreactive proteins from CM ceramic peaks revealed the RGSXLTTHPL (0, 0.02 and 0.16 M NaCl DEAE fractions) or RGSXLTTHPLRNIKDLVYMG (0.04 and 0.08 M NaCl DEAE fractions) N-terminal amino acid sequences, which were identical to the N-terminus of the boPAG-1 (Swiss-Prot database accession number Q29432). Surprisingly, only one PAG N-terminal microsequence was identified in zebu placenta, despite the recent finding that probably all ruminant Artyodactyla possess possibly 100 or more PAG genes, many of which being placentally expressed (XIE et al. , 1997b).

In fact, till now, all PAG or PSPB related proteins isolated from bovine fetal cotyledons by different research groups shared the same N- terminal microsequence (CAMOUS et al. , 1988; ZOLI et al. , 1991; LYNCH et al. , 1992). There seem to be at least three possible explanations for this apparent reduced variability of PAG expression in bovine placentas. The first is that, although some of the recently characterized PAG cDNAs (XIE et al. , 1997b; GREEN et al. , 2000) could be transcribed and translated into PAG molecules, these proteins are rapidly degraded and thus could not accumulate at detectable levels. The second is that, in bovine species, some of the PAG molecules could be N-terminally blocked. In this

339

case, only co-purified non-blocked immunoreactive proteins could be identified after Edman degradation. The third explanation is that some PAGs could be linked to membranes via fatty acid linkages, being consequently more difficult to extract by conventional procedures. The latter explanation seems more unlikely because bovine PAG cDNAs code for relatively well-conserved pepsinogen-like structure (GURUPRASAD et al. , 1996), which is not originally linked to membranes.

According to XIE et al. (1991), the presence of N-linked carbohydrate chains accounts, at least partially, for discrepancies in molecular masses observed after SDS-PAGE. As previously suggested by ZOLI et al. (1991), different degrees of glycosilation are also involved in the heterogeneity of isoeletric point estimated for boPAG-1. Concerning N-terminal amino sequencing, similarly to the previous observations made in taurine, ovine and caprine species (ZOLI et al. , 1991; XIE et al. , 1997a; GARBAYO et al. , 1998), Edman sequencing of PAGs extracted from zebu placenta failed to give any signal on cycle 4, indicating the presence of a N-glycosilated asparagine.

Although a high RIA immunoreactivity was observed for one CM ceramic peak from the 0.32 M NaCl DEAE fraction (64.55% PAG:TP ratio), N-terminal sequencing of its major protein (62 kDa) showed more than 75% identity with the alpha-N-acetylgalactosaminidase ( α-GalNAc), a lysosomal exoglycosidase synthesized in various tissues of murine (HERRMANN et al. , 1998), chicken (DAVIS et al. , 1993) and human species (WANG et al. , 1990). The α-GalNAc is not structurally neither enzymatically related to the lysosomal aspartic proteinase cathepsin D. Nevertheless, an abnormal expression of both of them seems to be directly

340

related to pathological conditions like cancer (YAMAMOTO et al. , 1997; VIGNESWARAN et al. , 2000) and neurological dystrophic or degenerative diseases (LADROR et al. , 1994; WOLFE et al. , 1995). The human α-GalNAc was also accidentally found as one of the five major bands during purification of placental sialidases (TSUJI et al. , 1989). In this species, α-GalNAc seemed to be synthesized as a 65 kDa glycosylated precursor, which is processed to a mature 48 kDa isoform (SWEELEY et al. , 1983). Directly responsible for immunosuppression by a mechanism that involves the deglycosilation of the precursor of macrophage activating factor (MAF) in cancer patients (YAMAMOTO et al. , 1997), it can be hypothesized that this protein could also play an important role on the local immunology regulation at the foeto-maternal interface.

According to comparative molecular modeling studies, PAGs have retained the well-known bilobed structure of aspartic proteinases, and a peptide binding cleft between the two lobes capable of accommodating peptides up to 7 amino acids (GURUPRASAD et al. , 1996). Thus, it has been hypothesized that they could be purified by use of pepstatin-agarose affinity chromatography (GURUPRASAD et al. , 1996). Pepstatin A is an extremely powerful inhibitor of aspartic proteinases (MARCINISZYN et al. , 1977). It binds reversibly to the active center of pepsin, renin and cathepsin D, being widely used as ligant in affinity chromatography protocols for isolation of these enzymes (DZAU et al. , 1979; AFTING and BECKER, 1981). In the present work, PAG molecules have been successfully identified after pepstatin affinity chromatography of cotyledonary extracts from placentas collected in the first and second trimesters of gestation. When crude extracts from 20-21 wk old zebu

341

placentas were loaded, PAG concentration was enriched by a factor of 25.8 (15.74% PAG:TP ratio after the column procedure vs 0.61% PAG:TP ratio in crude extract). A lower efficacy was observed after affinity chromatography of 10-11 wk old zebu placenta (PAG:TP ratio 3.26% vs 1.81%). In this case, the lower efficacy was probably due to the higher viscosity of crude extracts, which could make difficult an ideal pepstatin A- PAG interaction. PAG molecules were eluted before a high ionic strength was attempted, indicating a weaker interaction of PAG with pepstatin A substract. This observation is consistent with theoretical binding studies of PAG molecules which suggested that the substitution of Tyr189 and Leu220 (porcine pepsinogen numbering) by Asp residues in boPAG-1 molecule are likely to induce a weaker binding to pepstatin A (GURUPRASAD et al. , 1996).

After affinity chromatography, extract of placenta removed at both gestational ages revealed the presence of a 67 kDa immunoreactive protein, which was 100% identical to boPAG-1 (14 aa long). As observed in Figure 6B (lanes 2), another protein with an apparent molecular weight of 84 kDa and showing a high immunoreactivity with 3 antisera (R497, R706 and R708) was observed after extraction of 10-11 wk old zebu placentas. Its microsequencing revealed 77.78% amino acid sequence identity to alkaline metalloproteinase (GenBank database accession number AAK22731), which was previously identified in the Caulobacter crescentus genome by NIERMAN et al. (2001). Two possibilities can be argued to explain the presence of this metalloproteinase in our preparation: first, a bacterial proliferation during the first steps of purification; second, the specific expression of this type of metalloproteinase in zebu placenta. It was

342

interestingly that all the 3 antisera recognized this protein. The characterization of the epitope(s) responsible for this cross-reaction are worthy of further investigations.

In summary, this investigation is the first on the pregnancy-associated glycoproteins in Bos indicus placenta. By use of SDS-PAGE and Western Blot, different isoforms of PAG with apparent molecular weights from 51 to 69 kDa and isoeletric points varying from 4.4 to 6.7 were identified in placentas from different gestational ages. N-terminal microsequencing indicates the expression of one single PAG amino acid sequence in Bos indicus placenta. However, our data are to be considered carefully because it is not excluded that some important differences exist in the hypervariable D-loop region of the molecule. In addition to PAG molecules, two other immunoreactive enzymes showing high N-terminal amino acid identity with alpha-N-acetylgalactosaminidase and alkaline metalloproteinase were identified for the first time in zebu placenta extracts.

5. Acknowledgments

The authors thank Dr. M.A.N. Dode for assistance with zebu placenta collection, Mrs. N. Gérardin-Otthiers (University of Liège) and Dr. R. Wattiez (University of Mons-Hainaut) for peptide sequence analyses, Dr. E. McNamara, Department of General Human Biochemistry and Pathology (Ulg) for carefully reading the manuscript and Mr. C. Ernotte for editorial assistance. Supported by a scholarship from Brazilian Coordination of Training of Higher Educate Graduate (CAPES/Brazil) to N.M.S. and by grants from F.N.R.S. and Belgium Ministry of Agriculture to J.F.B.

343

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Apêndice 5

SOUSA, N.M., ZONGO, M., PITALA, W., BOLY, H., RUTTEN A., DODE, M.A.N., SANON, M.G., FIGUEIREDO, J.R., EL AMIRI, B., PERÈNYI, ZS & BECKERS, J.F. Homologous redioimmunoassay system for Pregnancy- Associated Glycoprotein measurement in zebu plasma. (submetido à Theriogenology )

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Pregnancy-Associated Glycoprotein Concentrations During Pregnancy and Postpartum Period in Azawak Zebu Cattle

SOUSA, N.M. 1, ZONGO, M. 2, PITALA, W. 2, BOLY, H. 2, SAWADOGO, L. 2, SANON, M. 2, FIGUEIREDO, J.R. 1, SULON, J. 3, GONÇALVES, P.B. 1, EL AMIRI, B. 3, PERÈNYI, Z. 3 & BECKERS, J.F. 3

1Faculty of Veterinary Medicine, Federal University of Santa Maria, Brazil. 2UFR/SVT, Ouagadougou University, 03 BP 7021, Ouagadougou 03, Burkina Faso. 3Faculty of Veterinary Medicine, University of Liege, B-4000, Belgium.

Abstract Specific RIA systems were developed then used to measure pregnancy-associated glycoprotein (PAG) concentrations during gestation and postpartum period in Azawak zebu cows. Twelve females palpated per rectum and diagnosed as pregnant were bled at 5-10 days interval approximately from Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). One zebu cow (Z15) initially diagnosed as pregnant showed PAG concentrations lower than the assay sensitivity (<0.20 ng/ml) and did not calve. Another cow (ZSand) showed abnormally high PAG concentrations during gestation, being excluded from the general PAG profile. The 10 other zebu cows gave a very homogeneous PAG profile. In these animals, concentrations increased progressively from Week 8 to Week 35 of gestation (from 6.0 ± 4.2 to 196.0 ± 34.8 ng/ml), remaining relatively constant until

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Week 39 (210.8 ± 74.8 ng/ml), when they increased sharply to reach their highest level (1,095.6 ± 607.2 ng/ml) at parturition. After delivery, PAG concentrations declined significantly (P<0.05) till the Week 2 postpartum (348.4 ± 85.6 ng/ml) and slowly till the Week 10 postpartum. Our results revealed that PAG pattern in zebu cattle was similar to those of taurine breeds during the first two trimesters of pregnancy, but differed in the peripartum period. Key words: Azawak zebu, PAG, RIA, gestation, postpartum

1. Introduction Zebu (Bos indicus ) cattle is an important source of animal protein in Africa and South America developing countries (CUNNINGHAM, 1992). When compared with taurine (Bos taurus ) cattle, they present some notable arid-adaptive characteristics. They are more effective in extracting nutrients from low quality roughages (BARTLE et al. , 1994), having also a remarkable ability to tolerate high temperatures (CARVALHO et al. , 1995; GAUGHAN et al. , 1999). Reproductive differences between taurine and zebu cattle have also been reported (CHENOWETH, 1994). Zebu females are generally considered to take longer to achieve puberty (PLASSE et al. , 1968a) and to have longer gestation lengths (PLASSE et al. , 1968b). Some breeds appear to produce calves lighter at birth, being less vulnerable to calving difficulty and losses (DOWLING, 1979). However, because of the few investigations carried out in this taxa, most of their reproductive characteristics remain unknown. In the last two decades, a highly polymorphic family of placenta- expressed proteins has been discovered in ruminant species. These

350

pregnancy-associated glycoproteins (PAGs), also known as pregnancy- specific protein B (PSPB) (BUTLER et al. , 1982), SBU-3 antigen (GOGOLIN-EWENS, 1986) and 60-kDa pregnancy serum protein (PSP- 60) (CAMOUS et al. , 1988), constitute a large family of aspartic proteinases, showing a greatest sequence identity with pepsinogens (XIE et al. , 1991). They are synthesized by mono and/or binucleate cells of the trophectoderm (GREEN et al. , 2000), some of them being released in the maternal circulation soon after implantation (ZOLI et al. , 1992). By using biochemical procedures, several molecules of the PAG family were isolated from cotyledons of ewes (ZOLI et al. , 1995; XIE et al. , 1997), goats (GARBAYO et al. , 1998), taurine (BUTLER et al. , 1982; ZOLI et al. , 1991) and zebu cattle (SOUSA et al. , 2001). Some of these molecules were used to immunize rabbits and the antisera obtained allowed the development of homologous (ZOLI et al. , 1992) and heterologous (RANILLA et al. , 1994; GONZÁLEZ et al. , 1999) RIA systems for PAG measurements in serum (ZOLI et al. , 1992), plasma (PATEL et al. , 1997) or milk samples (GONZÁLEZ et al. , 2001). During gestation, PAG concentrations differ largely between species and the period of pregnancy (ZOLI et al. , 1992; RANILLA et al. , 1994; SOUSA et al. , 1999). In a same species, they can be influenced by several other aspects like the breed of the female (MIALON et al. , 1993; RANILLA et al. , 1994), the foetal number (DOBSON et al. , 1993; PATEL et al. , 1997), the fetal genotype (GUILBAULT et al. , 1991; WILLARD et al. , 1995) and after embryo transfer, by the length of the period of embryo culture in vitro (ECTORS et al. , 1996). PAG concentrations seems also differ according to the RIA system, this difference being probably due to the specificity of the

351

antisera (GONZALEZ et al. , 1999; GONZALEZ et al. 2000). Although there is a relatively abundant literature on the characterization of PAG profiles during gestation in domestic (ZOLI et al. , 1992, RANILLA et al. , 1994, SOUSA et al. , 1999) and wild ruminant species (HAIGH et al. , 1991; WILLARD et al. , 1994; WILLARD et al. , 1999), at our knowledge, there is no report on the plasmatic profiles of this protein in zebu cattle. The objectives of this study where therefore (i) to develop homologous RIA systems for PAG measurement in the plasma of pregnant zebu females, and (ii) to characterize the time-related profile of changes in peripheral concentrations of PAG throughout gestation and postpartum period in the Azawak zebu breed.

2. Materials and Methods 2.1. Animals and Samples This study was carried out in the Sudan-Sahelian zone of Burkina- Faso (12°22’N, 1°31’W). Mean annual precipitation is 894 mm. Mean monthly minimum and maximum temperatures range from 8 to 20°C in the wet season (June to October) and from 26 to 39°C in the dry season (November to May). Twelve Azawak zebu cows of mixed age and parity were palpated per rectum and diagnosed as pregnant, being selected for this study. All were clinically normal and with good body condition scores (BCS 4 to 5) at the beginning of the experiment (July 1998). The BCS was determined using a 9-point scale, as previously described by EVERSOLE et al. (2000). The females were bred in a semi-intensive system, grazing typical vegetation (savanna) and having free access to water and mineral blocks. The animals were bled at 5-10 days interval approximately from

352

Week 8 of gestation till Week 10 postpartum (pp). Heparinized blood samples (5 ml) were collected from the jugular vein. The plasma was removed by centrifugation (1,500 x g for 15 min) immediately after collection and stored at –20°C until assayed for PAG. Sex of offspring was recorded at birth.

2.2. PAG Radioimmunoassays A pure preparation of zebu PAG (SOUSA et al. , 2001) was used as standard and tracer. A rabbit antiserum (R782) raised against the same preparation was used as the first antibody at an initial dilution of 1:150,000. The double antibody precipitation system was composed by a mixture of sheep anti-rabbit immunoglolobulin (0.83% v:v), normal rabbit serum (0.17% v:v), polyethylene glycol 6000 (20 mg/ml; Vel, Leuven, Belgium), cellulose microcrystalline (0.05 mg/ml; Merck, Darmstad, Germany) and BSA (2 mg/ml; ICN Biochemicals Inc., Aurora, OH) diluted in Tris buffer

(25 mM Tris, 10 mM MgCl 2 and 0.1 mg/ml neomycin sulfate; pH 7.5). Pure stock zebu PAG (lyophilized powder) was diluted with assay buffer (Tris containing 1 mg/ml BSA) to give standard curves ranging from 0.2 to 25 ng/ml in a preincubated system and from 0.8 to 100 ng/ml in a non- preincubated system. The radiolabelled 125 I-PAG was prepared according to the chloramine T method (GREENWOOD et al. , 1963). The first antibody was raised in rabbits as described elsewhere (ZOLI et al. , 1992). Plasma samples were firstly assayed in the non-preincubated system. Briefly, 0.1 ml of each sample or appropriated standard dilution were aliquoted into duplicate assay tubes and diluted respectively with 0.1 ml and 0.2 ml of Tris-BSA buffer. To minimize nonspecific interference of plasma

353

proteins, 0.1 ml of PAG-free plasma was added to all standard tubes. Thereafter, 0.1 ml of radiolabelled 125 I-PAG (28,000 counts per min) and 0.1 ml of the diluted antiserum (R782; 1:150,000) were added and the tubes were incubated overnight at room temperature. The following day, the double antibody precipitation system (1.0 ml) was added to all except total count tubes (T) and a further 30 min incubation was made at room temperature. Bound (B) and free PAG were separated by centrifugation (1,500 g x 20 min) after 2 washes with 2 ml of Tris-BSA buffer. The supernatants were discarded and the radioactivity of the pellet was determined using a Multigamma Counter (LKB Wallac 1261; Turku, Finland) with a counting efficiency of 75%. The binding ratio of the radiolabelled 125 I-PAG to the antiserum was considered as 100% in the zero standard (B 0) assay tube. Samples with lower PAG concentrations than the estimated standard dose at which the percentage B/B 0 was 80% (ED-80) (Table 1) were reassayed in a preincubated system in which an incubation step of 16 h (at room temperature) was made before the addition of the radiolabelled PAG. The next day, 125 I-PAG was added and a further 4 h incubation was made before the addition of the double antibody precipitation system.

TABLE 1 - Characteristics of the preincubated and non-preincubated RIA systems used for PAG measurement in zebu plasma samples.

System Minimum Non-specific B0/T Estimated dose (ng/ml) at B/B 0 detection limit binding (%) (%) 20% 50% 80% (ng/ml) Preincubated 0.20 < 1 23 7.83 2.47 0.76 Non -preincubated 1.11 < 1 28 114.34 26.67 6.24 B0/T = Tracer bound in the zero standard / total tracer added. B/B 0 = Tracer bound / tracer bound in the zero standard.

354

Samples with higher concentrations than the estimated standard dose at which the percentage B/B 0 was 20% (ED-20) (Table 1) were diluted (1/10 or 1/50) and reassayed without preincubation.

2.3. PAG Assay Validation The minimal detection limits (MDL) of both RIA systems (Table 1) were determined as the mean concentration minus twice the standard deviation of 20 replicates of the zero standard. Four plasma samples with known PAG concentrations (Table 2) were used to calculate intra-assay and inter-assay variations in both systems (RODBARD et al. , 1974).

TABLE 2 - Intra and inter-assay coefficients of variation of preincubated and non- preincubated PAG-RIA systems.

Intra-assay Inter-assay

PAG concentration a CV (%) PAG concentration a CV (%) (ng/ml) (ng/ml)

Preincubated

Sample 1 1.49 ± 0.11 7.4 1.62 ± 0.15 9.4

Sample 2 3.24 ± 0.11 3.5 3.37 ± 0.05 1.6

Sample 3 12.73 ± 0.63 4.9 12.01 ± 0.57 4.8

Non -preincubated

Sample 2 3.09 ± 0.34 11.1 3.11 ± 0.43 13.8

Sample 3 11.73 ± 0.76 6.5 11.99 ± 0.74 6.1

Sample 4 60.22 ± 4.81 8.0 53.04 ± 6.06 11.4 a(mean ± SD)

355

2.4. Data Analysis Data are presented as mean ± standard deviation (mean ± SD). PAG concentrations from one pregnant Azawak female (Z Sand) were considered as abnormal after a test of comparison of means (DAGNELIE, 1975), being excluded from further statistical analysis. PAG concentrations during gestation and postpartum period were analyzed as a split-plot design model where the week of pregnancy was the main-plot treatment. The main effect of the week on PAG concentrations was tested against residual error using the STDERR and PDIFF statements of the GLM Procedure in SAS (SAS, 2000). Half-life for PAG was calculated as previously described by KLINDT et al. (1979).

3. Results 3.1. PAG Assay Validation Tables 1 and 2 summarize the characteristics of the homologous RIA systems used to measure plasmatic PAG concentrations in zebu plasma. In the presence of excess antibody, 83.6% of labeled zebu PAG was bound. The displacement of standard inhibition curves was highly repeatable ranging from 90.7 ± 2.0% to 12.5 ± 1.1% of binding in the non- preincubated system (n=10) and from 92.2 ± 1.2% to 6.4 ± 1.0% (n=10) in the preincubated system (Figure 1).

3.2. PAG Profiles One of the twelve Azawak zebu cows palpated per rectum and initially diagnosed as pregnant (Z15) showed PAG concentrations lower than the assay sensitivity (<0.2 ng/ml) and did not calve. Ten Azawak zebu

356

females gave birth to single normal calves (3 males and 7 females). Another zebu cow (ZSand) gave birth to an emaciated female and showed abnormally high PAG concentrations during gestation, having their data excluded from the general PAG profile. Clinically, this cow presented a very low body condition score at the end of gestation (BCS 1 to 2).

B/Bo x 100 100

0 0,1 1 10 100 PAGPAG (ng/mL) ng/mL Figure 1. Standard curves (mean ± SD) for PAG in the preincubated (-▼-▼-) and non-preincubated (-▲-▲-) RIA systems (B/B0 function of Log PAG concentrations).

Figure 2 shows the PAG profile during gestation and postpartum period in 10 Azawak zebu cows. Mean weekly PAG concentration varied significantly among the animals (P<0.0001) and the periods of pregnancy (P<0.0005). However, the time-related variation on PAG concentration was significant only at the end of gestation. The mean PAG concentration increased progressively from the Week 8 to the Week 35 of gestation (from 6.0 ± 4.2 ng/ml to 196.0 ± 34.8 ng/ml).

357

Thereafter, PAG concentrations remained relatively constant until Week 39 (210.8 ± 74.8 ng/ml), then they increased significantly reaching their highest level (1,095.6 ± 607.2 ng/ml) at parturition (Week 40). After delivery, plasma PAG concentrations declined significantly (P<0.05) till the Week 2 postpartum (348.4 ± 85.6 ng/ml). Afterwards, PAG concentrations decreased slowly reaching the lowest levels (5.1 ± 5.2 ng/ml) at the Week 10 postpartum.

PAG (ng/mL) 2000 parturition ↓

1500

1000 *

* ** 500

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp10pp15pp Weeks after fertilization and parturition

FIGURE 2 - PAG concentrations (mean ± SD) during gestation and postpartum period in plasma of 10 Azawak zebu cows. Week 40 of gestation corresponds to the Week 0 postpartum (0pp). Significant differences between weeks of gestation are indicated by asterisks (*P<0.0001, **P<0.05).

358

The half-life of PAG calculated after parturition was 10.1 days. When estimated by regression equation (Figure 3), a period of 14 weeks would be required to reach undetectable PAG concentrations (<0.2 ng/ml) in maternal bloodstream.

Ln PAG (ng/mL) 8

7 Cow ZSand y = -0.5165x + 7.67758 6

4 Homogeneous population y = -0.5095x + 7.42951 3

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 910 Weeks postpartum

FIGURE 3 - Plasmatic PAG concentrations and regression curves calculated for PAG from parturition (Week 0) to the Week 10 postpartum. Azawak zebu cows that presented clinically normal ongoing gestations (n=10) were represented by dots ( ●). The zebu cow presenting higher PAG levels during pregnancy with low BCS at the end of gestation (ZSand) was represented by squares ( ■).

3.3. Atypical PAG Profile The PAG profile during gestation and postpartum period in the Azawak zebu cow (ZSand) presenting high PAG concentrations during pregnancy is given in Figure 4. From Week 10 till parturition, mean weekly concentrations

359

(227.6 ng/ml) were approximately 3.5 times higher than that calculated for the other 10 females (64.1 ng/ml). The estimated PAG half-life in this cow was 9.2 days and the clearance rate after parturition was similar to that observed after normal gestations (14 weeks).

PAG (ng/mL)

Homogeneous 1000 population

800

600 ZSand

400

200

0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 5pp10pp15pp Weeks before and after parturition

FIGURE 4 - PAG profile of Azawak zebu cows presenting clinically normal gestations (homogeneous population) and PAG profile of the individual cow having presented an extremely low BCS at the end of gestation (ZSand). Week 40 of gestation corresponds to the Week 0 postpartum (0pp).

4. Discussion In this study we describe for the first time the plasmatic profiles of PAG concentrations throughout gestation and postpartum period in zebu females. The characteristics of two homologous RIA systems developed for PAG measurement in peripheral circulation of zebu females were also

360

examined. Our data showed that both preincubated and non-preincubated homologous RIA systems developed with the use of a purified preparation of zebu PAG (SOUSA et al. , 2001) were very precise for measuring PAG concentrations in maternal bloodstream. Intra-assay and inter-assay coefficients of variation were relatively low (1.6 to 13.8%), being comparable to those calculated by ZOLI et al. (1992) for the boPAG-1 RIA (6.9 to 11.6%), and by GONZALEZ et al. (1999) for homologous and heterologous caprine RIA systems (5.5 to 10.1%). In addition, when a same sample was measured by both systems, PAG concentrations remained almost the same even if presenting percentage B/B 0 ratios lower than 80% or higher than 20%. Regarding their practical application in laboratory routine, while the preincubated system showed to be suitable to measure lower PAG concentrations (0.8 to 7.8 ng/ml; Table 1), as observed in early pregnancy, the non-preincubated system proved to be able to detect a larger range of concentrations (6.2 to 114.3 ng/ml; Table 1), being very usefull for the follow-up of PAG levels during gestation. In both zebu and taurine taxa (ZOLI et al. , 1992; PATEL et al. , 1997), PAG concentrations increased slowly from Week 8 to the Week 35 of gestation, remaining lower than 200 ng/ml. However, while in zebu females PAG levels remained relatively constant from Week 35 to the last week of gestation (196.0 ± 34.8 ng/ml to 210.8 ± 74.8 ng/ml), in taurine breeds this period corresponded to a rapid increase on PAG concentrations (158.9 ± 60.2 ng/ml to 1,551.9 ± 589.7 ng/ml) (ZOLI et al. , 1992). If the relatively constant PAG concentrations measured in this study result from the use of a zebu PAG preparation in our RIA systems or from genetic

361

differences between these two clades of cattle it is not known. However, the first hypothesis is more unlikely because when different plasmatic samples recovered at early, mid or late gestational periods were measured by both taurine and zebu homologous RIA systems (data not shown), no differences were found on PAG concentrations. At parturition, zebu females reached lower PAG concentrations than taurine cows (1,095.6 ng/ml in zebu versus 1,352.8 ng/ml to 2,462.4 ng/ml in taurine cows) (ZOLI et al. , 1992; PATEL et al. , 1997). Differences on PAG concentrations next to the parturition may be due to a variety of factors, such as the placenta blood flow at late gestation and the placenta mass. There is currently little information about the effect of placental blood flow on the maternal concentration of placenta-specific hormones (NEWNHAM et al. 1986). Nevertheless, because uterine and umbilical blood flows were found to be smaller in zebu than in taurine breeds (FERRELL, 1991), this hypothesis must be taken into consideration to explain some differences on PAG concentrations. Several authors reported an effect of placental mass on PAG concentrations (DOBSON et al. , 1993; MIALON et al. , 1993; PATEL et al. , 1997). As described by MIALON et al. (1993), PSP-60 concentrations at calving are significantly lower in taurine breeds that gave birth to small calves (e.g. Holstein and Normande) than in those that calved larger calves (e.g. Charolais), this difference being probably due to the differences in placental masses and consequently in the total number of binucleate cells. In our study, placenta mass and calf birth weights could not be recorded at parturition. However, because liveweight of Azawak cows are considered to varies between 300 to 410 kg (PAYNE, 1970), it can be supposed that

362

placental mass in this breed is smaller than those recorded in european taurine breeds, justifying the lower PAG levels observed at parturition. With regard to the postpartum period, the time expected for PAG to be undetectable in maternal bloodstream of zebu females (14 weeks) was in the range of those previously described by ZOLI et al. (1992) and MIALON et al. (1993) for taurine cows (average of 11 to 17 weeks), but longer than those estimated by KIRAKOFE et al. (1993) for postpartum beef cows (12 weeks) and for hysterectomised beef cows (10 weeks). This relatively long clearance rate of PAG observed in postpartum zebu cows seems to be more likely due to the long half-life of the molecule than to the concentrations reached at parturition, as previously argued by ZOLI et al. (1991). PAG half-lives were consistently longer in zebu (9.2 to 10.1 days) than in taurine cattle (7.0 to 8.8 days) (SASSER et al. , 1986; SEMAMBO et al. , 1992; ALI et al. , 1997). As the half-lives of glycoproteins are directly influenced by the presence of N-linked carbohydrate and sialic acid chains on their structures (RAFFERTY et al. , 1995), it can be hypothesed that different glycosilation patterns exist on PAG molecules extracted from zebu placentas. However, further studies are needed to confirm this hypothesis. During the course of this study, one Azawak cow (ZSand) presented a very low BCS (1 to 2) and higher PAG concentrations during the last two trimesters of pregnancy. This cow was fecundated early in the wet season (July) and calved late in the dry season (April), when savanna typical vegetation is scarce and with bad quality. An association between severe energy or protein underfeeding and an increase in placental size has been well characterized in both human (LUMEY, 1998) and ovine species (WALLACE et al. , 1997a). Furthermore, an opposite association, i.e. between higher

363

energetic levels, reduced placental size and lower peripheral PSPB concentrations during gestation was recently demonstrated in ovine species (WALLACE et al. , 1997b). These findings support the assumption that, in some conditions, an inadequate food intake by pregnant zebu cows could be associated with a compensatory placental hypertrophy to assure the survival of a developing fetus. Another contributing factor for the higher PAG levels observed in the ZSand cow could be a reduced metabolic clearance of PAG in the maternal circulation. However, because the PAG half-life was smaller in this animal (9.2 days) than in the others (10.1 days), this association seems to be improbable. To conclude, our results indicate that plasma PAG concentrations in zebu cattle were similar to concentrations of taurine breeds during the first two trimesters of pregnancy, but differ in the peripartum period. In addition, our data support the assumption that, in extreme conditions, the nutrition status of the mother could be reflected as a sharp on peripheral concentration of placental proteins. Better adapted to severe energy and protein underfeeding, zebu cattle could constitute an excellent model for the investigation of the consequences of nutritional status of the mother on the placental synthesis of hormones and pregnancy-associated proteins.

5. Acknowledgments This work was supported by grants from CIUF-SPA/Burkina Faso, FNRS and Belgian Ministry of Agriculture. N.M. Sousa was supported by a fellowship from the Brazilian Coordination of Training of Higher Educate Graduate (CAPES/Brazil). The authors are grateful to Dr. M.A.N. for providing the facilities. Authors thank Mrs. R. Fares for her secretariat

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SOUSA, N.M., ZONGO, M., PITALA, W., BOLY, H., SANON, M.G., SAWADOGO, L., RUTTEN, A., DODE, M.A.N., FIGUEIREDO, J.R., EL AMIRI, B., PERÈNYI, Z. et BECKERS, J.F. Pregnancy-associated glycoprotein concentrations during pregnancy and postpartum periods in zébu cattle. 3rd Belgian Workshop on Animal Endocrinology , Namur, 14 de Novembro de 2001. ( Abstract)

EL AMIRI, B., REMY, B., SOUSA, N.M., GERARDIN-OTTHIERS, N., DESBULEUX, H., PERÉNYI, Z., BANGA-MBOKO, H. et BECKERS, J.F. Purification and characterization of a pregnancy- associated glycoprotein (ovPAG-6) from sheep placenta removed between 66 to 100 days of gestation. 3rd Belgian Workshop on Animal Endocrinology , Namur, 14 de Novembro de 2001. ( Abstract)

BANGA-MBOKO, H., THILMAN, P., DESBULLEUX, H., AOUMEUR, N., YOUSSAO I., PERÉNYI, Z., SOUSA, N.M., EL AMIRI, B., LEROY, P. et BECKERS, J.F. Pepsinogen and progesterone concentration during pregnancy in sows. 3rd Belgian Workshop on Animal Endocrinology , Namur, 14 de Novembro de 2001. ( Abstract)

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• Artigos Aceitos

ZONGO, M., BOLY, H., SAWAGADOGO, L., PITALA, W., SOUSA, N.M., BECKERS, J.F. & LEROY, P. (2001) Insémination artificielle des vaches ‘Azawak’ et taurin ‘Gourunsi’ au Burkina Faso. (aceito por Tropicultura )

SOUSA, N.M., FIGUEIREDO, J.R., EL AMIRI, B., BANGA-MBOKO, H. & BECKERS, J.F. Influence potentielle des hormones et protéines synthétisées au cours de la gestation sur l’état immunitaire de la mère. (aceito por Annales de Médecine Vétérinaire )

PERENYI, Z., SZENCI, O., DRION, P.V., BANGA-MBOKO, H., SOUSA, N.M., EL AMIRI, B. & BECKERS, J.F. Aspartic proteinase members secreted by the ruminant placenta: specificity of three radioimmunoassay systems for the measurement of pregnancy-associated glycoproteins. (aceito por Reproduction in Domestic Animals )

• Artigos Submetidos

EL AMIRI, B., SOUSA, N.M., MECIF, K., DESBULEUX, H., BANGA-MBOKO, H. & BECKERS, J.F. Double radial immunofiffusion as a tool to identify pregnancy-associated glycoproteins in ruminant and non-ruminant placenta. (Vet. Res. )

BANGA-MBOKO, H., SULON, J., CLOSSET, J., REMY, B., LAITAT, M., YOUSSAO, I., EL AMIRI, B., SOUSA, N.M. & BECKERS, J.F. Radioimmunoassay of porcine pepsinogen and its validation in healthy pig serum. (Vet. Res. )

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