Potenziale di azotofissazione simbiotica della

Leonardo Sulas [email protected]

CNR-ISPAAM, Sassari (Istituto per il Sistema Produzione Animale in Ambiente Mediterraneo)

Bonassai 4 luglio 2019 Fam. Leguminosae Sott. Genere Perenni Annuali H. coronarium H. spinosissimum H. hedysaroides H. glomeratum H. humile

(Sulla coronaria (L.) B.H. Choi & H. Ohashi, 2003)

In Sardegna • “All’isola in gran parte asciutta e spesso arida, si adatta bene, invece, la Sulla o Edisaro (Hedysarum coronarium), la quale, per altro, è spontanea da Senorbì a Sorgono, da Oristano a Elmas, nella provincia di Cagliari”

Fonte: Prof. G. Cusmanno in: La Sardegna agricola, Gazzetta agricola editrice, Milano 1906 In Sardegna • Secondo Cherchi Paba (1974) “la coltura della sulla, provvidenziale coltura dei nostri Campidani, viene introdotta in Sardegna alla fine del XIX secolo “ • Nel 1871, il prof. Gennari direttore dell’Orto botanico dell’Università di Cagliari introdusse e coltivò in particelle sperimentali proprio la sulla In Sardegna • Sull’Indicatore Sardo del 1883: avviso col quale il direttore del Regio Ospizio in San Lucifero invitava i proprietari a presentarsi ”per se o per mezzo dei loro contadini nel vivaio dell’orto del suddetto ospizio dove saranno distribuite due o tre dozzine di piante di sulla, volgarmente detta arsudda ” In Sardegna “Ad margines agrorum et in arvis Campidano di Cagliari; colitur etiam, pabulumque praestantissimum praebet”

Moris J. H., 1840 in Flora sardoa In Sardegna

Nel romanzo “Ziu Mundeddu” (1968) ambientato in Marmilla in un periodo a cavallo tra le due guerre, si fa riferimento alla coltivazione di una nuova foraggera per le pecore, la sulla, la cui semente fu ordinata da Milano da tale don Mario.

“Della sulla dissero che mangiandola le pecore si struggevano il latte, e non si vedevano, pascendo, poiché veniva più alta dell’uomo ” Attività di ricerca del CNR-ISPAAM

• Ruolo della sulla nei sistemi foraggeri estensivi mediterranei per ovini da latte, con approccio interdisciplinare e sistemico • Risposta della sulla sottoposta a diverse intensità di utilizzazione, su base ecofisiologica • Autorisemina e rigenerazione da plantule • Fenologia della sulla e relativa composizione chimica per individuare gli stadi ottimali per l’insilamento Attività di ricerca del CNR-ISPAAM

• Determinazione del contenuto in composti bioattivi • Produzione di seme (C.M. Alta Marmilla) • Impollinazione vs produzione seme • Collezione di germoplasma di popolazioni allo stato spontaneo (seme e simbionte) • Caratterizzazione e valutazione bio- agronomica su scala parcellare Attività di ricerca del CNR-ISPAAM

• Effetto dell’inoculo con diversi ceppi di rizobi sulla produzione foraggera • Quantificazione dell’ azotofissazione • Inoculazione e N fissazione • Rhizobium sullae ed endofiti Stime di quantità di azoto fissato (kg N ha-1 anno-1) da leguminose numerose in letteratura straniera

• Medicago sativa, 189-553 • Trifolium repens 100-224 • Trifolium subterraneum, 2-188 • Pisum sp 16-177 • Vicia faba 110-180 (amb. Med.) • Trifolium repens 290-360 (amb. Padano)

• Ampi range • Quantificazione locale • Fattori che la condizionano Fattori in grado di influenzare il processo di azotofissazione

• pH < 5.5: non consente l’infezione batterica e conseguentemente la formazione dei noduli radicali • Stress idrico e salinità: elevata sensibilità a condizioni di ristagno idrico, di scarsa umidità, e di salinità del suolo • Temperatura elevate e basse influenzano negativamente il processo • N del terreno: effetto inibitorio di N minerale del terreno sul processo di azotofissazione • Disponibilità di altri elementi nutritivi • Durata del ciclo di crescita, età del prato, modalità di utilizzazione Quantificazione dell’azotofissazione

• Esigenza di una quantificazione in campo e a livello locale N harvest

Fixed N2 1

3

2 4 N rhizo- Uptake of deposition soil N

Metodi basati sull’isotopia isotopi dell’N utilizzabili come marcatori Isotopi stabili - in atmosfera: 15N/14N = 1/272 = 0,3663% atomi di N - nel suolo: rapporto leggermente più alto, questa peculiarità si sfrutta per valutare Nfix da atmosfera (anche arricchendo artificialmente il terreno con 15N) Somministrazione azoto marcato Gestione concime marcato

• 4 kg ha-1 di N solfato ammonico marcato al 10% di eccesso isotopico per volta, sciolto in acqua (1 l/m2) Diluizione 15N

Differenze in 15N: N nel suolo normalmente più ricco in 15N

Differenze tra specie: • Sulla cv. Grimaldi (azotofissatrice) • Cichorium inthybus cv. Spadona (specie di controllo non azotofissatrice) Metodo della diluizione isotopica

15N/14N = 1/272 (0,3663%)

15N

14N

15N 15N

14N 14N

15N

14N Fonti di N: 1) Atmosferico (solo leguminosa) 2) Del terreno (leguminosa e NFS) 3) Fertilizzante arricchito (leguminosa e NFS) Assunti metodo • Se LEG e RIFnfs sono coltivate sullo stesso terreno, dal confronto tra eccesso15N leguminosa e eccesso15N controllo, eccesso15 N % atomi (LEG) %Ndfa 1 100 eccesso15 N % atomi (RIFnfs) Quota dell’N totale della leguminosa derivante da fissazione atmosferica, indipendente da dose di fertilizzante arricchito e da produzione delle due colture

Quantità di N2 fissato per unità di superficie:

-1 -1 N2 fissato (kg ha ) = %Ndfa x Ntot LEG kg ha 100 1° ciclo

2° ciclo -1 circa 400 kg ha = a) 17 sacchi di urea agricola b) 30 sacchi di nitrato ammonico

SS (kg ha-1) N fissato (kg ha-1)

Eccesso isotopico in foglie di sulla N0 18 25 30 (kg N fissato/t s.s.)

N100

12 10 18 (kg N fissato/t s.s.) N fissazione vs concimazione

• Effetto depressivo su N fissazione a seguito di somministrazione azotata • Diversi studi riportano sull’uso di N in colture di leguminose (lenticchia, fagiolo, fava, erba medica, etc.) • Tuttavia, gli autori non considerano e/o quantificano che incrementi produttivi vengono ottenuti a discapito dell’efficienza dell’N fissazione • La piena efficienza della simbiosi leguminose-rizobi deve essere conseguita senza l’apporto di fertilizzante azotato, con l’utilizzo di inoculanti idonei, contenenti ceppi rizobici efficaci ed efficienti, in combinazione ottimale col genotipo della leguminosa • N fissazione simbiotica: processo naturale e sostenibile dal punto di vista ambientale per l’acquisizione di N nei sistemi colturali

Co-presenza di endofiti: Pseudomonas, Microbacterium, Pantoea oltre R. sullae

Endofiti in grado di garantire una sorta di «servizi ecosistemici» utili per contrastare carenze nutrizionali, aridità, attacchi di parassiti ed erbivori Produzione di latte media giornaliera nei gruppi al pascolo sul prato di sulla e sull’erbaio di avena

Kg 1,6 1992 Sulla 1,4 avena

1,2

1,0 + latte! 0,8 - spese 0,6

0,4 01-feb 09-feb 12-feb 15-feb 18-mar 21-mar 24-mar 27-mar 30-mar 13-mag 16-mag 19-mag

(Progetto MiRAAF Foraggicoltura prativa, sottoprogetto Pascoli) Il segreto nel pascolo Ovviamente è la materia prima a offrire i risultati certificati dalle università sarde e da un’indagine condotta su 40 persone che hanno mangiato 90 g di formaggio Argiolas per tre settimane ottenendo il calo dei livelli del colesterolo cattivo del 7%. Una qualità che si trova nei pascoli dell’isola che permettono alle pecore di produrre un latte che permette di arrivare al formaggio anti colesterolo. Il segreto è nell’erba Sulla e nei semi di lino. La Sulla, infatti, è considerata una pianta che produrre un effetto ipocolesterolemizzante, cioè in grado di abbassare i livelli del colesterolo cattivo. I semi di lino, invece, garantiscono un’alta concentrazione di Ω3. Sulas, L. Campesi, G. Piluzza, G. Re, G.A. Deligios, P.A. Ledda, L. Canu, S., 2019. Inoculation and N R. Muresu, L. Sulas, S. Caredda, 2003. (Review) Simbiosi leguminose-Rhizobium in campo: Fertilization Affect the Dry Matter, N Fixation, and Bioactive Compounds in Sulla Leaves. Agronomy problematiche e prospettive dell’inoculazione. Rivista di Agronomia, 1, 33-46 2019, 9, 289. Piluzza, G., S. Bullitta, and M. Odoardi. "Condensed tannins in Hedysarum coronarium L. Muresu R., Porceddu A, Sulas L., Squartini A., 2019. Nodule-associated microbiome diversity in wild germplasm." Proc. China International Grassland Conference, Bejing. 2002. populations of Sulla coronaria reveals clues on the relative importance of culturable rhizobium Piluzza, G., Bullitta, S., Deroma, M., & Odoardi, M. (2000). The accumulation of condensed symbionts and co-infecting endophytes. Microbiological Research, 221, 10-14. tannins in local populations of sulla. Cahiers Options Méditerranéennes, 45, 199-202. Sulas L., Piluzza G., Salis M., Deligios P., Ledda L., Canu S., 2017. Cropping systems sustainability: Sulas L., Re G.A, Stangoni A.P., Ledda L., 2000. Growing cycle of Hedysarum coronarium L. Inoculation and fertilisation effect on sulla performances in a new cultivation area. Italian Journal of (sulla): relationship between density, stem length, forage yield and phytomass Agronomy, 12, 938:315-324. partitioning. Cahiers Options Méditerranéennes, Vol. 45, 147-152. Sablok, G., Rosselli, R., Seeman, T., van Velzen, R., Polone, E., Giacomini, A., ... & Squartini, A. Sulas L., Franca A., Caredda S., 2000. Persistence and regeneration mechanisms in forage (2017). Draft Genome Sequence of the Nitrogen-Fixing Rhizobium sullae Type Strain IS123T legumes. Invited paper in Cahiers Options Méditerranéennes, Vol. 45, 331-342. Focusing on the Key Genes for Symbiosis with its Host Hedysarum coronarium L. Frontiers in A. Satta, M. Acciaro, I. Floris, A. Lentini and L. Sulas, 2000. Insect pollination of sulla microbiology, 8, 1348. (Hedysarum coronarium L.) and its effect on seed production in a Mediterranean environment. Piluzza G., Bullitta, Sulas L., 2016. The role of tannins in forage legumes. Options Cahiers Options Méditerranéennes, Vol. 45, 373-378. Méditerranéennes, No. 114, 275-278. Borreani G., Cavallarin L., Peiretti P.G., Re G.A., Roggero P.P., Sargenti P., Sulas L., Tabacco E., Yates R., Howieson J., De Meyer S.E., Tian R., Seshadri R., Pati A., Woyke T., Markowitz V., 2000. Quantifying morphological stage to improve crop management and enhance yield and Ivanova N., Kyrpides N., Loi A., Nutt B., Garau G., Sulas L., Reeve W., 2015. High-quality quality of sulla and lucerne. Cahiers Options Méditerranéennes, Vol. 45, 195-198. permanent draft genome sequence of Rhizobium sullae strain WSM1592; a Hedysarum coronarium Sulas L., 1999. Sulla (Hedysarum coronarium L.) a valuable species for Mediterranean forage microsymbiont from Sassari, Italy. Standards in Genomic Sciences, DOI: 10.1186/s40793-015- farming systems. Basic information and experimental results. Georgia Ktenotrofia. ISSN 1105- 0020-2. 2465, 4, 64-71. Sulas L., Canu, S., Salis M., Re G.A., 2014. Potenziale di azotofissazione di leguminose foraggere, Bullitta S., Meloni M.C., Piluzza G., Sulas L., 1998. Collezione, caratterizzazione e conservazione da granella e da pascolo in ambiente mediterraneo asciutto. II Congresso Nazionale RIRAB – IX di popolazioni naturali di Hedysarum coronarium L. e dei relativi simbionti). IV Congresso Convegno ZooBioDi, Roma, 11-13 giugno 2014, Nazionale Biodiversità: Germoplasma locale e sua valorizzazione. Alghero 8-11 settembre 1998, Piluzza G., Sulas L., Bullitta S., 2013. Tannins in forage and their role in animal husbandry 895-898. and environmental sustainability. A review. Grass and Forage Science, 69, 32-48. Re G.A., Sulas L., 1998. L’inoculazione della sulla (Hedysarum coronarium L.) con ceppi sardi di Muresu R., Tondello A., Polone E., Sulas L., Baldan B., and Squartini A., 2013. Antioxidant Rhizobium hedysari. IV Congresso Nazionale Biodiversità: Germoplasma locale e sua treatments counteract the non-culturability of bacterial endophytes isolated from legume nodules. valorizzazione. Alghero 8-11 settembre 1998, 1023-1026. Archives of Microbiology, (DOI 10.1007/s00203-013-0886-6). Borreani G., Peiretti P.G., Re G.A., Roggero P.P., Sargenti P., Sulas L., Valente M.E., Ciotti A., Piluzza, G., & Bullitta, S. (2010). The dynamics of phenolic concentration in some pasture species 1998. Relazioni tra stadio morfologico di sviluppo, produttuvità e qualità del foraggio della sulla and implications for animal husbandry. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90(9), 1452- (Hedysarum coronarium L) in due ambienti collinari. Rivista di Agronomia, 33, 170-176. 1459. Borreani G., Caredda S., Peiretti P.G., Roggero P.P., Sargenti P., Sulas L., Valente M.E., 1998. Sulas L., Seddaiu G., Muresu R., and Roggero P.P., 2009. Nitrogen Fixation of Sulla under Evolution of yield and quality of sulla in relation to the morphological stage of development. Mediterranean Conditions. Agronomy Journal, 101, 1470-1478. Proc. of fifth ESA congress, Nitra the Slovak Repubblic, 233-234. Sulas L., Ledda M., 2008. Sulla (Hedysarum coronarium) seed production at different sowing rates. Bullitta P., Sulas L., 1998. Le possibilità di utilizzazione della sulla con il pascolamento e il suo Options Méditerranéennes, Series A, No. 79, 483-486. inserimento nei sistemi pascolivi sardi. In: Talamucci, P., Staglianò, N., Sabatini, S. (Eds.), La R. Muresu, E. Polone, L. Sulas, B. Baldan, A. Tondello, G. Delogu, P. Cappuccinelli, S. Alberghini, Y. sulla: possibili ruoli nella foraggicoltura mediterranea. Accademia dei Georgofili, Quaderni, Benhizia, H. Benhizia, A. Benguedouar, B. Mori, R. Calamassi, F. B. Dazzo, A. Squartini (2008) 1998-I, Studio Editoriale Fiorentino, Firenze, 53-70. Coexistence of predominantly nonculturable rhizobia with diverse endophytic bacterial taxa within Sulas L., G. A. Re, S. Nieddu, A. P. Stangoni, 1998. La conversione dell’azoto: esperienze nodules of wild legumes. FEMS Microbiol. Ecol., 63, 3, 383-400. sull’impiego di diversi ceppi di rizobi azotofissatori nelle produzioni foraggere. Sardegna Bullitta S., Piluzzaq G., 2007. Evolution of condensed tannins content in Mediterranean natural Agricoltura, 24-26. populations of leguminous species and forage chicory. In: (Bullitta S. ed.) Bioactive compounds in Sulas L., G.A. Re, A. Loi, J.G. Howieson, 1998. The selection of optimal root-nodule bacteria pasture species for phytotherapy and animal welfare. Composti bioattivi in specie da pascolo per inoculants increases the forage yield of Hedysarum coronarium (sulla). Proc. 17th EGF, scopi fitoterapici e per il benessere animale. Volume issued from the Anfit-Mipaf Project (D.M. Debrecen, Hungary, May 18-21, 1998, 899-904. 361/7303/01), pp 19-29, ISBN 88-901771-1-X., 19-29 Sulas L., Re G.A., Caredda S., 1999. Hard seed breakdown pattern of sulla (Hedysarum Muresu R., Sulas L., Polone E., Tondello A., Baldan B., Ibba M., Squartini A., 2005. Root nodule coronarium L.) in relation to its regeneration capacity and persistence. Cahiers Options bacteria of legumes from Sardinia and other Mediterranean areas. Proc. XVII Eucarpia Genetic Méditerranéennes, 39, 79 - 82. Resources Section Meeting, 30 March-2 April 2005, Castelsardo (I). CNR-ISPAAM sez. Sassari Ligios S., Sulas L., Molle G., Fois N., 1997. Utilizzazione e gestione di colture foraggere in Publisher. Sassari, Italy. 145-150. ISBN 88-901771-3-6. sistemi asciutti per ovini da latte. Rivista di Agronomia, 1 Suppl., 326-331. Sulas L., 2006. La sulla (Hedysarum coronarium L.): foraggera per ambienti marginali o specie Sulas L., Re G.A., Ledda L., Caredda S., 1997. The effect of utilization frequency on the forage strategica? In: (a cura di M. Manias) Atti del III convegno internazionale: l'ossidiana del Monte Arci production of sulla (Hedysarum coronarium L.). Italian Journal of Agronomy, 2, 89-94. nel Mediterraneo, Pau 25-26 settembre 2004, 19-28. Sulas L., C. Porqueddu, P.P. Roggero and P. Bullitta, 1995. The role and potential of sulla Tava, A., De Benedetto, M. G., Tedesco, D., Di Miceli, G., & Piluzza, G. (2005). Proanthocyanidins (Hedysarum coronarium L.) in the Mediterranean dairy sheep farming system. Proc. 5th IRC. from Hedysarum, Lotus and Onobrychis spp. growing in Sardinia and Sicily and their antioxidant Salt Lake City, Utah, USA, 23-28 July 1995, 543-544. activity. In XX International Grassland Congress: Offered papers. Sulas L. e Porqueddu C., 1994. La coltivazione della sulla. Sardegna Agricoltura, 1, 44-46 Sulas L., 2005. The future role of forage legumes in the Mediterranean climatic areas. In: S.G. Reynolds and J. Frame (Eds.) Grasslands: Developments Opportunities Perspectives. Rome, FAO, and New Hampshire, Usa, Science Publishers. Inc. ISBN 1 – 57808-359-1, 29-54. R. Muresu, L. Sulas, E. Polone and A. Squartini, 2005. PCR primers based on different portions of insertion elements can assist phylogeny studies, strain fingerprinting and species identification in rhizobia. FEMS Microbiology Ecology, 54, 445-453. Pubblicazione sopra la Sulla del CNR- Borreani G., Roggero P.P., Sulas L., Valente M.E., 2003. Quantifying morphological stage to predict the nutritive value in sulla (Hedysarum coronarium L.) Agronomy Journal, 95, 1608-1617. ISPAAM nel periodo 1994-2019 Piluzza, G., de Benedetto, M. G., Bullitta, S., Odoardi, M., & Tava, A. (2003). Condensed tannins in forage legumes. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 39(Special issue), 295-297. II CONGRESSO NAZIONALE RIRAB – IX CONVEGNO ZooBioDi, Roma, 11-13 giugno 2014

Potenziale di azotofissazione di leguminose foraggere, da granella e da pascolo in ambiente mediterraneo asciutto

Sulas, L.1, Canu, S.2, Salis, M.1, Re, G.A.1 1CNR-ISPAAM, Istituto per il Sistema Produzione Animale in Ambiente Mediterraneo - Sassari, 2CNR-ICB, Istituto di Chimica Biomolecolare – Sassari, [email protected] Introduzione I fattori che influenzano il processo di azotofissazione delle leguminose impongono l'esigenza di una quantificazione a livello locale, al fine di identificarne il loro potenziale, aumentare il contributo dell’azoto atmosferico nei sistemi colturali e per definire itinerari tecnici innovativi in grado di favorire una maggiore tutela e sostenibilità ambientale

Obiettivo Quantificazione in campo dell'azotofissazione di leguminose foraggere, da granella e da pascolo

Hedysarum coronarium Onobrychis viciifolia

Medicago polymorpha Vicia faba minor Pascolo naturale Trifolium subterraneum Pisum sativum

Materiali e metodi - Attività in corso dal 2001 in 15 siti della Sardegna differenziati per altimetria, caratteristiche pedologiche ed ecologiche. Disegno sperimentale: blocchi randomizzati con 3 replicazioni (parcella 10 m2) - Metodo della diluizione isotopica: distribuzione di 4 kg N ha-1 di solfato ammonico arricchito (10 atom %15N) sia a leguminose sia a specie di controllo non azotofissatrici - Sostanza secca valutata mediante sfalci su aree di saggio con separazione di specie e di componenti entro Lupinus albus specie - Subcampioni analizzati con spettrometro di massa per contenuto in azoto e 15N - percentuale di N derivante dall’atmosfera (Ndfa) calcolata secondo Warembourg (1993) - Azoto fissato = produzione di N (kg ha-1) x %Ndfa/100 Risultati Produzione di sostanza secca epigea, contenuto in azoto, eccesso isotopico, percentuale di azoto derivante dall’atmosfera e azoto fissato per ettaro (valori medi per anno) e per tonnellata di sostanza secca -1 SS (t ha ) N Eccesso Ndfa N N Fissato Anni Relazione fra azoto fissato nella (%) Isotopico (%) Fissato (Kg t-1 ss) granella e produzione in lupino (% 15N) (kg ha-1) Siti di prova Sulla c 6.1 2.9 0.0513 78.2 123.4 18 5 Lupinella c 3.9 3.4 0.0433 84.2 89.0 22 3 Favino c 7.4 3.7 0.0395 80.1 124.3 13-42* 2 Lupino c 10.5 2.4 0.0437 91.3 169.0 10-54* 2 Pisello proteico c 4.7 2.5 0.0580 73.0 100.3 12-38* 2 Medica polimorfa c 7.9 2.5 0.0920 73.6 154.0 20 6 Trifoglio sotterraneo s 0.7 2.5 0.0319 84.7 14.8 23 4 Leguminose annuali s 2.0 2.2 0.0317 82.8 37.0 20 4 c = coltivata; s = spontanea; *solo granella - Importante ruolo dell’azotofissasione simbiotica in diversi contesti colturali - Valori di azoto fissato variabili in funzione della specie di leguminosa - In favino, lupino e pisello gran parte dell’azoto fissato è concentrato nella granella - Nei pascoli naturali, l’azotofissazione è condizionata dal contenuto di leguminose

Attività condotte nell’ambito dei progetti di ricerca Prin Miur 2001 e 2004, Unione Europea LEGGRAZE Ringraziamenti e L..R. 7/ 2007 RAS