Thesis Reference

Thesis

Étude de plantes médicinales et contrôle de qualité des préparations utilisées dans le traitement de la tuberculose au Sénégal

DIOP, El Hadji Assane

Abstract

En Afrique, la population a souvent recours à la médecine traditionnelle pour soigner des maux courants tels que la toux et la fièvre, classiques lors de tuberculose(TB). Ce travail a identifié des plantes médicinales utilisées pour traiter la TB au Sénégal. Il a consisté en une enquête ethnopharmacologique, une évaluation de l’activité des préparations et l’identification des composés avec un effet antimycobactérien. Une sélection guidée par les essais biologiques sur un modèle novateur in vitro a permis d’identifier les extraits/composés les plus actifs. Les extraits de Combretum aculeatum et de Guiera senegalensis ont montré des activités intéressantes. En étudiant les aspects de biodisponibilité, un certain rationnel quant à l’usage traditionnel de ces plantes a été montré. Des méthodes de contrôle de qualité analytique de préparations médicamenteuses utilisant l’électrophorèse capillaire ont été appliquées pour le dosage d’un ellagitanin actif,dansC. aculeatum. Cette méthode a aussi été utilisée pour analyser les médicaments antituberculeux de première ligne.

Reference

DIOP, El Hadji Assane. Étude de plantes médicinales et contrôle de qualité des préparations utilisées dans le traitement de la tuberculose au Sénégal. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2018, no. Sc. 5246

URN : urn:nbn:ch:unige-1087749 DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:108774

Available at: http://archive-ouverte.unige.ch/unige:108774

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1 / 1 Université de Genève (UNIGE) Professeur Faculté des sciences - Section des sciences pharmaceutiques Jean-Luc Wolfender Laboratoire de Phytochimie et Produits naturels bioactifs(LPP) Professeur Laboratoire des sciences analytiques – Analyses biomédicales Serge Rudaz

Université Cheikh Anta Diop – Dakar (UCAD) Professeur Département de Biologie Végétale Tahir Abdoulaye Diop Ecole Doctorale Science de la Vie, de la Santé et de l’Environnement (EDSEV)

ETUDE DE PLANTES MÉDICINALES ET CONTRÔLE DE QUALITÉ DES PRÉPARATIONS UTILISÉES DANS LE TRAITEMENT DE LA TUBERCULOSE AU SÉNÉGAL

THÈSE en cotutelle

présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève, pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques et un doctorat unique de l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar par

ElHadji Assane DIOP

Dakar (Sénégal) / Gelterkinden (BL)

Thèse N° 5246

GENÈVE

ATELIER REPROMAIL

AOÛT 2018

« La vraie sagesse de la vie consiste à voir l’extraordinaire dans l’ordinaire. »

Pearl S. Buck

Résumé

La tuberculose (TB) pulmonaire a fortement resurgi ces dernières années avec des cas de résistances et de multi-résistances aux antibiotiques de base à savoir la rifampicine et l’isoniazide. La plupart des nouveaux cas est retrouvée en Afrique subsaharienne du fait de la progression de l’infection au VIH. Cette maladie affecte environ 10 millions de personnes sur le globe dont 10% sont des patients VIH. Il existe cependant un traitement offert dans les pays en voie de développement avec la stratégie « End-TB », mais on observe de plus en plus d’échecs thérapeutiques dus à la non-compliance, la résistance aux antibiotiques mais aussi à la survenue d’effets indésirables majeurs. Il est urgent de trouver des nouvelles opportunités thérapeutiques afin de contrer cette expansion de la maladie. La TB est décrite comme une maladie consomptive causant le dépérissement lorsqu’elle atteint les personnes avec un système immunitaire affaibli ou vivant dans des conditions de promiscuité et de malnutrition. Dans le contexte africain, la population a souvent recours à la médecine traditionnelle pour soigner des maux courants tels que la toux et la fièvre, des symptômes classiques de la tuberculose.

Le présent travail a visé à identifier les plantes médicinales les plus utilisées dans la prise en charge de la TB au Sénégal, investiguer leurs principes actifs et développer des méthodes simples et efficaces pour le contrôle de qualité des préparations traditionnelles. Cette approche a englobé une enquête ethnopharmacologique chez les patients et tradipraticiens, une évaluation de l’activité antimycobactérienne de ces préparations et l’identification des composés majeurs avec un effet antiinfectieux. Cela a conduit à l’identification de deux extraits traditionnels de Combretum aculeatum et de Guiera senegalensis, deux combrétacées largement utilisées au Sénégal en médecine traditionnelle. Un isolement guidé par les essais biologiques sur un modèle novateur in vitro a permis d’identifier les composés les plus actifs dans ces extraits et de caractériser l’activité de certains de leurs métabolites. En étudiant les aspects de biodisponibilité des principes actifs, nous avons pu démontrer un certain rationnel quant à l’usage traditionnel de ces plantes pour traiter la tuberculose. Des méthodes de contrôle de qualité analytique de préparations médicamenteuses utilisant l’électrophorèse capillaire ont été appliquées pour le dosage d’un ellagitanin actif, la punicalagine dans l’extrait de C. aculeatum. Cette méthode analytique a aussi été utilisée pour contrôler la qualité des médicaments antituberculeux de première ligne sous forme de combinaison de dose fixe. Ceci a été effectué pour permettre à terme une implantation pratique au niveau local de contrôles de qualité pour une meilleure prise en charge des patients.

Cette thèse, en cotutelle, est le fruit d’un projet collaboratif entre l’université Cheikh Anta Diop de Dakar (UCAD-Département de biologie végétale) et l’Université de Genève (Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne-EPGL). Ainsi les enquêtes et collectes de plantes ont été menées au Sénégal ; les investigations pharmacognosiques au laboratoire de phytochimie et produits naturels bioactifs et les approches de contrôle de qualité dans le laboratoire d’analyses biomédicales et métabolomique (Sciences analytiques) à l’EPGL.

Discipline : Sciences de la vie, de la Santé et de l’environnement / Sciences pharmaceutiques

Mots clés : Tuberculose – plantes médicinales - Mycobacterium marinum - Test hôte- pathogène – Combretum aculeatum- Guiera senegalensis - contrôle de qualité - Electrophorèse capillaire

Study of medicinal plants and quality control of preparations used for the treatment of tuberculosis in Senegal

Summary

Pulmonary tuberculosis (TB) has reappeared in recent years with the occurrence of many cases of resistance and multi-resistance (MDR) encountered against basic antibiotics namely rifampicin and isoniazid. Most of the new TB cases are found in sub-Saharan Africa because of the progression of HIV infection. This disease affects about 10 million people worldwide, 10% of whom are HIV patients. A treatment is available in developing countries with the "End-TB" strategy. There are however more and more treatment failures due to non-compliance, antibiotic resistance and the occurrence of major adverse effects. It is urgent to find new therapeutic opportunities to counter the expansion of the disease. TB is described as a consumptive disease that causes wasting when it reaches people with weakened immune systems or living in conditions of promiscuity and malnutrition. In the African context, the population often uses traditional medicine to treat common ailments including cough and fever, classic symptoms of tuberculosis.

The aim of the present work was to identify the plants traditionally used in the management of TB. This approach combined an ethnopharmacological survey in patients and traditional healers, followed by an evaluation of the antimycobacterial activity of these preparations and the identification of major active principles with an anti-infective effect. This led to the identification of two aqueous extracts of Combretum aculeatum and Guiera senegalensis, two combretaceae widely used in Senegal in traditional medicine. Bioassay guided isolation using a novel stringent in vitro model, has identified the most active compounds in these extracts as well as some of their metabolites. By extrapolating the possible bioavailability of the active ingredients, we have been shown a possible rationale for the use of these plants in Tb treatment. Analytical quality control approaches of drug preparations using capillary electrophoresis were applied for the determination of one active ellagitanin punicalagin in C. aculeatum extracts. In addition this analytical technique was also used to monitor the quality of first-line anti-TB drugs in a fixed dose combination. This part should finally permit a practical implementation of validated control quality procedures at the local level for an improved treatment of the patients.

This thesis, in ‘cotutelle’, is the result of a collaborative project between the University Cheikh Anta Diop of Dakar (UCAD-Department of Plant Biology) and the University of Geneva (School of Pharmacy Geneva-Lausanne-EPGL). Thus, the surveys and collections of plants were carried out in Senegal; phamacognostic investigations at the laboratory of phytochesmistry and bioactive natural products and quality control approaches in the laboratory of biomedical and metabolomic analyses (analytical sciences) at the EPGL.

Disciplines: Life, Health and Environmental Sciences / Pharmaceutical Sciences

Key words: Tuberculosis - medicinal plants - Mycobacterium marinum - Host-pathogen assay - Combretum aculeatum - Guiera senegalensis - quality control - Capillary electrophoresis

Cette thèse est rédigée en français avec l’inclusion de certains articles publiés et soumis en anglais.

iii

TABLE DES MATIERES

Résumé ...... i Summary ...... ii Remerciements ...... 5 Liste des Abréviations ...... 8 Introduction générale ...... 10 Objectif principal de la thèse ...... 13 Synthèse bibliographique ...... 16 La tuberculose (TB) ...... 16 Historique et généralités sur la maladie ...... 16 I.1.2 Diagnostic ...... 19 I.1.3 Prise en charge et traitement ...... 21 Etat actuel de la recherche dans la prise en charge de la tuberculose ..... 27 Moyens diagnostic ...... 27 Traitements ...... 28 Plantes médicinales et tuberculose ...... 30 Histoire de l’usage des plantes médicinales ...... 30 Plantes utilisées contre la tuberculose ...... 30 La médecine traditionnelle africaine ...... 33 Etat actuel de la recherche sur les plantes médicinales à usage thérapeutique ...... 36 Avant-propos ...... 36 Les nouveaux outils de la recherche pour étudier les plantes médicinales et leur mode d’action ...... 37 I.4.2.1 En résumé ...... 37 I.4.2.2 Profilage de constituants naturels et Métabolomique ...... 39 I.4.2.3 Evolution des tests d’activité biologique ...... 41 I.4.2.4 Biodisponibilité des produits naturels ...... 42 I.4.2.5 Conclusion ...... 43 Contrôle de qualité des médicaments ...... 44 Médicaments allopathiques ...... 44 L’électrophorèse capillaire (CE) ...... 47 Médecine traditionnelle et phytothérapie ...... 49

Conclusions ...... 52 Ethnopharmacologie et tuberculose...... 54 Enquête ethno pharmacologique sur l’usage des plantes médicinales lors de tuberculose pulmonaire au Sénégal ...... 54 Ethnopharmacologie et pharmacologie inversée ...... 54 Enquêtes plantes/tuberculose et protocoles ...... 56 Collecte de plantes médicinales ...... 57 Etude de l’activité biologique des plantes médicinales contre les mycobactéries à l’aide d’un modèle hôte-pathogène (Amibe - Mycobactérie) ... 57 Essais biologiques d’étude d’activité antimycobactérienne ...... 57 Modèle hôte-pathogène Mycobacterium marinum - Acanthamoeba castellanii ...... 58 II.2.2.1 Test d'activité antibiotique ...... 59 II.2.2.2 Test antiinfectieux avec A. castellanii ...... 59

Détermination des IC50 des extraits de plantes ...... 60 Conclusions ...... 61 Survey on medicinal plants traditionally used in Senegal for the treatment of tuberculosis (TB) and assessment of their antimycobacterial activity 62 Abstract ...... 63 Introduction ...... 64 Materials and methods ...... 65 II.3.3.1 Study area ...... 65 II.3.3.2 Interviews with TB diagnosed patients ...... 66 II.3.3.3 Interviews with traditional healers ...... 67 II.3.3.4 Data analysis ...... 67 II.3.3.5 Plant material ...... 67 II.3.3.6 Plant extractions ...... 68 II.3.3.7 Host-pathogen assay on Mycobacterium marinum ...... 68 II.3.3.8 Evaluation of the antimycobacterial activity and determination of extracts IC50 ...... 70 II.3.3.9 Statistical analysis ...... 71 Results and discussion ...... 71 II.3.4.1 Survey outcome ...... 71 II.3.4.2 Antimycobacterial activity of selected plant extracts ...... 79

Conclusion ...... 84 Pharmacognosie et phytochimie des plantes actives ...... 86 Etude phytochmique et biologique des parties aériennes de Combretum aculeatum Vent...... 86 Description botanique ...... 86 Pharmacognosie ...... 87 Isolement et identification des composés actifs de l’extrait aqueux de Combretum aculeatum ...... 88 Méthodologie ...... 88 III.1.4.1 Analyses HPLC-PDA et UHPLC-HRMS de l’extrait de parties aériennes de C. aculeatum et déréplication des composés connues...... 91 Activité antimycobactérienne des ellagitanins de C. aculeatum et de leurs métabolites ...... 95 Ellagitannins from Combretum aculeatum and their metabolites: Assessment of their antimycobacterial activity in a single cell infection assay . 96 Abstract ...... 97 Introduction ...... 98 Materials and Methods ...... 99 III.2.3.1 General Experimental Procedures ...... 99 III.2.3.2 Plant material ...... 100 III.2.3.3 Extraction ...... 100 III.2.3.4 Chemical and reagents ...... 100 III.2.3.5 Quantitation of total polyphenols and tannins content using ultra-violet spectroscopy ...... 101 III.2.3.6 HPLC-PDA-ELSD analysis ...... 101 III.2.3.7 UHPLC-Orbitrap-HR-MS/MS analysis ...... 102 III.2.3.8 Bioassay guided fractionation of C. aculeatum extract by Flash Chromatography-UV ...... 103 III.2.3.9 Compound isolation from the extract of Combretum aculeatum using Medium Pressure liquid chromatography (MPLC-UV) ...... 103 III.2.3.10 Host-pathogen assay using Mycobacterium marinum ...... 104 III.2.3.11 Statistical Analysis ...... 105 Results and Discussion ...... 105 III.2.4.1 Bioassay-guided fractionation of the Combretum aculeatum aqueous extract ...... 105

III.2.4.2 Dereplication of constituents from the active fractions by UHPLC- HR-MS/MS ...... 107 III.2.4.3 Bioassay guided isolation of active compounds ...... 110 III.2.4.4 Identification of isolated compounds ...... 110

III.2.4.5 Antimycobacterial IC50 determination for identified compounds 111

III.2.4.6 IC50 determination of punicalagin metabolites (ellagic acid and urolithins) 113 III.2.4.7 The European pharmacopeia assay for total polyphenols and tannins 116 Conclusion ...... 117 Acknowledgments ...... 117 Etude phytochmique et biologique des parties aériennes de Guiera senegalensis J.F.Gmel ...... 118 Description botanique ...... 118 Pharmacognosie ...... 119 Isolement et identification des composés actifs de l’extrait aqueux de Guiera senegalensis ...... 121 III.3.3.1 Méthodologie ...... 121 III.3.3.2 Déréplication basé sur les analyses HPLC-PDA et UHPLC-HRMS 122 III.3.3.3 Fractionnement et isolement bioguidé ...... 127 Discussion sur la biodisponibilité des tanins ...... 133 Contrôle de qualité par l’électrophorèse capillaire ...... 137 Dosage de la punicalagin dans les extraits de Combretum aculeatum Vent. 137 Résumé ...... 137 Quantitative CE analysis of punicalagin in Combretum aculeatum extracts traditionally used in Senegal for tuberculosis treatment ...... 138 Abstract ...... 139 Introduction ...... 140 Materials and methods ...... 142 IV.2.3.1 Plant material ...... 142 IV.2.3.2 Samples and Reagents ...... 143 IV.2.3.3 Analytical methods...... 143 IV.2.3.4 Preparation of running buffers and solutions ...... 145

IV.2.3.5 Sample preparation for CE ...... 145 Results and discussions ...... 146 IV.2.4.1 Selection of the antimycobacterial extracts ...... 146 IV.2.4.2 Quantitative method development by CZE for punicalagin in C. aculeatum extracts ...... 149 IV.2.4.3 Quantitative aspects...... 153 IV.2.4.4 Method application: consistency analysis of different extracts .. 153 IV.2.4.5 Punicalagin content in different plant part extracts ...... 154 IV.2.4.6 Influence of the extraction modus and duration of extraction on the PNG content ...... 156 IV.2.4.7 Influence on the harvested period of aerial parts ...... 157 Concluding remarks ...... 158 Contrefaçons de médicaments : Développement d’outils analytiques adaptés pour détecter les sous-standards dans les pays en voie de développement ...... 159 Electrophorèse capillaire Budget (ECB) ...... 159 Mise en place d’une stratégie analytique fiable pour le contrôle de qualité des médicaments dans les pays emergents...... 159 IV.3.2.1 Contexte ...... 159 IV.3.2.2 Situation actuelle ...... 160 IV.3.2.3 Stratégie analytique ...... 160 IV.3.2.4 Electrophorèse Capillaire Budget – ECB ...... 161 IV.3.2.5 Méthodes ...... 161 IV.3.2.6 Résultats ...... 163 Conclusion ...... 164 Dosage des antituberculeux combinés de première ligne (RH, RHZ, RHZE) 165 Dosage des antituberculeux RHZE par électrophorèse capillaire ... 170 IV.4.1.1 Introduction ...... 170 IV.4.1.2 Matériel et méthodes ...... 174 IV.4.1.3 Résultats et discussion ...... 178 Conclusions et perspectives ...... 184 Références bibliographiques ...... 188 Liste des annexes ...... I Communications scientifiques ...... XIII

Remerciements

Je voudrais d’abord remercier mes Chers, Professeur Tahir Abdoulaye Diop, Professeur Jean-Luc Wolfender et Professeur Serge Rudaz. Je leur suis extrêmement reconnaissant de m’avoir accordé leur confiance dès le début du projet et de m’avoir guidé tout le long. Le Professeur Tahir Diop, pour l’accès à son laboratoire, les échanges avec les collègues du labo et les contacts différents aux jardins botaniques et herbiers de la faculté des sciences. Je remercie particulièrement Serge Rudaz pour ses judicieux conseils et pour m’avoir permis d’intégrer l’unité des sciences analytiques dans laquelle je me suis bien épanoui, comme assistant doctorant. Mais surtout pour ses qualités précieuses comme tuteur et conseiller scientifique sans lesquelles ce travail de thèse n’aurait pas eu la même forme. Je remercie Jean-Luc Wolfender de m’avoir intégré dans l’unité de Phytochimie et Produits Naturels Bioactifs, qui offre une atmosphère scientifique et de vie passionnée dans laquelle j’ai eu beaucoup de plaisir à travailler. J’aimerais adresser mes très sincères remerciements aux Professeurs membres du jury, pour avoir accepté de juger ce travail de thèse. Un grand merci pour leur lecture assidue de ce manuscrit, ainsi que pour les discussions et les remarques constructives qui vont en découler. Je remercie vivement le Dr. Emerson Ferreira Queiroz, mon encadreur particulier en phytochimie pour m’avoir enseigné tant dans les méthodes de séparation et d’isolement que la gestion d’une thèse. En chimie analytique pharmaceutique, la Docteur Julie Schappler avec qui j’ai eu plaisir de travailler et qui a relu attentivement les publications. Nos échanges scientifiques ont été précieux pour moi. J’ai aussi beaucoup apprécié son enthousiasme et son côté humain et multidisciplinaire. Pour l’apprentissage et la prise en main de l’électrophorèse capillaire, j’exprime ma profonde gratitude à Emilie Reginato pour son accompagnement, sa patience et son soutien technique sans faille. Tout au long de ce projet de thèse, j’ai eu la chance de pouvoir travailler en étroite collaboration avec de nombreux acteurs, provenant de différents partenariats en

5 interne au sein de la faculté des sciences de l’Université de Genève. J’ai éprouvé un plaisir sincère à travailler avec ces chercheurs. Je tiens ainsi à témoigner de ma profonde reconnaissance au Dr Sébastien Kicka et au Professeur Thierry Soldati, qui m’ont initié au modèle révolutionnaire d’évaluation de composés antituberculeux. Merci pour leur grande disponibilité et pour nos discussions scientifiques enrichissantes. Je remercie de tout cœur, Yvonne Arnold pour m’avoir initié et accompagné lors des essais de perméation, merci pour les échanges en « Schwizer-dütch » et le Prof. Kalia qui m’a permis de faire ces expériences au sein de son laboratoire. J’aimerais citer mes collègues du laboratoire de biotechnologies des champignons qui m’ont intégré dans leur équipe pendant mes séjours au Sénégal. Vous avez été d’un grand soutien pour mes contacts au Sénégal et pour les collectes de plantes. Ndiogou, Adiouma, Ndeye Fatou, Ali et tous les autres. Au Sénégal j’aimerais remercier les patients et tradipraticiens qui ont accepté de répondre à mon questionnaire et très particulièrement Mr Bachirou Gueye, conservateur au jardin botanique de Hann, qui a été mon enseignant de botanique locale lors de mes séjours. Je remercie chaleureusement mes collègues du groupe de sciences analytiques, et le Professeur Jean-Luc Veuthey avec lequel je n’ai cessé d’apprendre à chaque discussion. J’adresse également mes remerciements à tous mes collègues de l’unité de Phytochimie et Produits Naturels Bioactifs, avec qui j’ai partagé des échanges scientifiques très intéressants et d’innombrables bons moments. Merci à toute l’équipe pour son dynamisme, son enthousiasme et son agréabilité, au travail comme en dehors. Travailler avec cette équipe dynamique a été très motivant pour moi. Je tiens notamment à remercier particulièrement Aymeric et Pierre Marie. Dr. Claudia Avello Simões-Pires qui a été un soutien scientifique. Un grand merci également à Sylvia Passaquay-Rion et Natalie Schregle- Aeschlimann pour leur efficacité dans la gestion des questions administratives.

Ce travail de thèse a aussi été l’occasion pour moi d’encadrer des étudiants de Bachelor et de Master en Pharmacie au cours de différents travaux pratiques.

À ce titre, je voudrais remercier personnellement Jenna Jaquat dont le travail de Master a beaucoup apporté à ma thèse. J’adresse enfin une reconnaissance particulière à tous mes amis qui sont présents depuis tant d’années, et qui m’ont soutenu et avec lesquels j’ai pu partager régulièrement les idées, afin de tenir toutes ces années de thèse. Merci à Antoine Wildhaber, de m’avoir laissé la flexibilité de travail à la pharmacie de l’Orangerie et d’avoir été un conseiller précieux depuis la fin de mon Master en Pharmacie. Les Dr Jacques Falquet, Bertrand Graz et Merlin Willcox avec lesquels j’ai eu des échanges instructifs sur l’ethnopharmacologie et l’étude des plantes médicinales. Merci à mes amis qui m’ont accueilli chez eux lors des nuitées à Genève pendant ces 5 années. Lune et Maria, Henry, Vladimir, Jacques et famille. Merci à Raphael pour les différents travaux de mise en page. Pour finir avec les remerciements, je tiens à remercier ma Maman, Nafissatou et mon Papa, Moustapha de m’avoir donné la chance à l’éducation mais tout en étant présent à chacune des étapes de ma vie. Merci à mes frères et sœurs d’être là pour la famille et toujours disponible.

Et un Grand Merci à ma femme Anna-Rosita, à mes enfants Aïda, Malick et Ella qui m’ont soutenu et donné le courage jour après jour d’affronter les multiples tâches pour l’avancement de cette thèse.

Liste des Abréviations

Les abréviations utilisées dans ce travail sont répertoriées ci-dessous. Une partie d’entre elles sont des acronymes anglais, reconnus par la communauté scientifique internationale.

A.castellaniii Acanthamoeba castellanii

AD/SA Standard addition Ajouts dosés

BAAR bacilles acido-alcoolo-résistants

BCG Bacillus Calmette–Guérin Bacille de Calmette-Guérin

BGE Background Electrolyte Tampon de séparation

CCM Chromatographie sur couche mince

CDF Combinaison de dose fixe

CE Capillary Electrophoresis Electrophorèse capillaire

CLHP Chrommatographie liquide à haute performance

CZE Electrophorèse capillaire de zone

DAD Diode Array Detector Détecteur à barettes de diodes

DER Drug Extracted Ratio Rendement d’extraction

ECB Electrophorèse Capillaire Budget

EOF Electroosmotic Flow Flux électroosmotique

HIV Human immunodeficiency virus

HPLC High performance liquid chromatography

HRMS High resolution mass spectrometry

IC50 Inhibitory Conc.50% Concentration inhibitrice à 50%

IS Internal Standard

Leff Efficient length Longueur effective

LOD Limit of Detection Limite de détection

Ltot Total length Longueur totale

ID Inner Diameter Diamètre interne

MDR Multi-drug Resistant Multi-résistant

M. marinum Mycobacterium marinum

M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis min minute ml millilitre mM : millimole/litre

OD Outer Diameter Diamètre externe

RFU Relative fluorescence units Unités relative de fluorescence

RHZE Rifampicine, Isoniazide, Pyrazinamide, Ethambutol

RLU Relative luminescence units Unités relative de luminescence

QC Quality control Contrôle de qualité

SD Standard Deviation Ecart-type

SI Internal Standard Standard interne

TB Tuberculosis Tuberculose tm Migration time Temps de migration tEOF Electroosmotic flow time T flux électroosmotique

µl microlitre

µm : micromètre

µM micromole/litre

UPLC Ultra high performance liquid chromatography

USP United States Pharmacopeia

VIH Virus de l'Immunodéficience Humaine

XDR Extended-drug Resistant Résistance étendue

μel Electrophoretic mobility Mobilité électrophorétique

Introduction générale

Au cours de ces dix dernières années, la tuberculose, une maladie qui semblait être vaincue, est réapparue et de surcroît avec de fulgurantes poussées. Cette maladie infectieuse qui, causée par une mycobactérie, est l’une des plus mortelles après le VIH/SIDA. Un tiers de la population mondiale est porteuse du bacille et sur les 8 millions de cas déclarés la mortalité s’élève à 1,4 million en 2016 (WHO, 2017). La tuberculose constitue ainsi la première cause de mortalité chez les patients HIV positif (Getahun et al., 2010). Bien qu’étant, globalement, en diminution légère et constante, c’est en Afrique subsaharienne que l’on compte le plus grand nombre de nouveaux cas par habitants (Figure 1) (WHO, 2017). Les populations les plus vulnérables sont celles vivantes dans des conditions de précarité sévère, à savoir la malnutrition, la promiscuité et/ou présentant un système immunitaire affaibli. Cela permet d’expliquer l’endémie au Sénégal, où la prévalence est de 140 cas pour 100000 habitants (WHO, 2017).

Figure 1 : Incidence mondiale de la tuberculose (WHO, 2017)

Il existe cependant un traitement de base recommandé par l’OMS qui est actuellement gratuit dans la plupart des pays en voie de développement. Ce traitement est basé sur la rifampicine en combinaison avec d’autres molécules et qui est prescrit pour une durée moyenne de 6 à 12 mois. Ces traitements sont des combinaisons de doses fixe d’antibiotiques nommés RH (pour Rifampicine, Isoniazide) ou RHZE (pour Rifampicine, Isoniazide, Pyrazinamide et éthambutol) (WHO, 2017). Un des facteurs limitant le succès de cette thérapie réside dans l’adhérence thérapeutique des patients. Celle-ci peut être rompue par une difficulté d’accès au traitement, suite aussi à la survenue d’effets indésirables graves impliquant l’arrêt du traitement (Yee et al., 2003). Ainsi l’OMS en collaboration avec plusieurs acteurs (END TB) a mis en place la stratégie DOTs (Directly- Observed Treatment strategy), qui a pour objectif majeur de mettre à disposition des populations des médicaments de bonne qualité. Ensuite les patients bénéficient d’un suivi dans des centres de traitements ayant la capacité d’améliorer le diagnostic par l’analyse de crachats et/ou l’usage des tests rapides. A l’heure actuelle, le pourcentage de rechute après un traitement classique est d’environ 10% (WHO, 2017). De plus, suite au développement de souches résistantes et multi résistantes, la prise en charge est devenue plus compliquée (Ormerod, 2005). La détection des cas de résistances et de multi résistances est bien documentée, ces constatations révèlent un problème de santé publique majeur pour lequel de nouvelles approches devraient être investies pour y remédier (WHO, 2016). Ainsi des traitements médicamenteux de qualité sont mis en œuvre par l’OMS et un besoin d’évaluation continue de la thérapie est primordiale pour son succès. Afin d’éviter l’apparition de sous standards sur le marché, un contrôle de qualité fréquent des molécules doit être mis en place. En plus des traitements standards, il est important d’étudier les alternatives thérapeutiques utilisées par les patients avant leur accès aux centres de santé. Il est aussi important de pouvoir documenter, si celles-ci sont utilisées en combinaison avec l’allopathie ou si elles présentent une éventuelle utilité thérapeutique pour améliorer la prise en charge de la tuberculose. En Afrique, la médecine traditionnelle est utilisée pour atténuer les symptômes ou même traiter la tuberculose et elle a culturellement toujours été présente (Asres et al., 2001; Bunalema et al., 2014). Des décoctions ou des infusions de parties

11 de plantes sont le plus souvent utilisées dès que les premiers symptômes de toux, sueurs nocturnes, fatigue, manque d’appétit et perte de poids surviennent (Bunalema et al., 2014). Plus de 80% de la population africaine a recours aux plantes médicinales en première intention pour traiter différents maux. Ces traitements sont très peu évalués, tant sur la fréquence de leur utilisation que sur leur rapport bénéfice/risque pour les populations (Fyhrquist et al., 2006). Il faut noter que les produits naturels ont un rôle prépondérant lors de la découverte de nouveaux médicaments. Ils constituent donc une source non négligeable de remèdes potentiels pour lutter contre le développement des différentes résistances aux traitements actuels (Koehn and Carter, 2005).

La médecine traditionnelle peut contribuer à combler les besoins de santé publique pour autant qu’elle soit utilisée d’une façon sûre et bien documentée (Willcox et al., 2011). Afin de pallier à la disparité des savoirs traditionnels causée par le manque de transmission, une étude approfondie de ces approches thérapeutiques est nécessaire (Taylor et al., 2001). Les médecines traditionnelles chinoises et indiennes ont réussi à établir des standards pour leurs pratiques. Ainsi des études pharmacognosiques poussées ont permis d’établir des monographies pour les différents remèdes sous forme de pharmacopées accessibles aux traitants et aux patients. En comparaison, le continent africain, malgré la pression des maladies et la biodiversité végétale, tarde à mettre en place des études pharmacognosiques et cliniques sur l’efficacité et l’innocuité des plantes indigènes (Sofowora, 1982). Dans le cas de la tuberculose et des autres maladies infectieuses, ce besoin d’étude est encore plus urgent ; étant donné que ces maladies se déclarent et s’installent principalement dans les pays à bas et moyens revenus. Une preuve de l’innocuité et de l’efficacité de produits naturels permettrait d’offrir une solution locale et abordable pour ces populations, afin d’améliorer l’accès à des traitements locaux de qualité.

Il a été estimé que 50% de la population en Afrique subsaharienne vit avec une tuberculose latente ; l’urgence de trouver des nouveaux remèdes pour contrer l’épidémie dans cette région n’en est que plus forte (Frothingham et al., 2005). Cela étant, quelques phytothérapies africaines ont déjà démontré leur efficacité pour lutter contre les infections telles que la malaria avec notamment

Argemone mexicana (Simões-Pires et al., 2009). A. mexicana a été citée lors d’enquêtes ethnopharmacologiques au Mali (Willcox et al., 2011) et les études pharmacologiques avec essai clinique à l’appui ont montré son efficacité dans la prise en charge de la malaria en zone rurale (Willcox et al., 2012). Ensuite un remède provenant de la tradition zulu préparé à base de racines de Pelargonium sidoides a récemment été développé comme phytomédicament contre les bronchites chroniques et aigües (Bladt and Wagner, 2007). D’autres plantes africaines sont source de composés majeurs dans le traitement de cancer avec Vinca minor (Scheindlin and Rubin, 1955). On peut aussi rencontrer des extraits végétaux traditionnels qui ont contribué à pallier les effets indésirables liés aux médicaments de synthèse (Iwu, 2014). En somme, si elles sont bien étudiées en pharmacognosie, les plantes médicinales peuvent être d’une aide considérable dans une optique de renforcement en santé globale (Hoareau and DaSilva, 1999).

Objectif principal de la thèse

L’objectif de cette thèse est d’étudier le possible risque ou le potentiel bénéfice lié à l’usage de la médecine traditionnelle dans la prise en charge de la tuberculose pulmonaire au Sénégal et en Afrique subsaharienne. Parallèlement des méthodes de contrôle de qualité de ces préparations et des médicaments allopathiques seront investiguées.

Ce travail est présenté sous forme de 4 chapitres principaux qui constituent les résultats obtenus en réponse aux objectifs spécifiques de cette thèse :

- Le chapitre I présente une synthèse bibliographique sur la tuberculose et ses possibilités de traitements. Ainsi dans ce chapitre une présentation des généralités sur la maladie est apportée, suivie de l’état actuel de la recherche pour les traitements possibles. Une partie est dédiée à l’usage de plantes en lien avec la tuberculose. En fin de chapitre l’aspect de contrôle analytique de qualité des préparations pharmaceutiques est aussi présenté ainsi que l’utilisation de l’électrophorèse capillaire comme technique analytique.

- Le chapitre II présente la mise en place et les résultats d’une enquête ethnopharmacologique sur les plantes utilisées lors d’affections pulmonaires avec les symptômes de la tuberculose au Sénégal. Les plantes révélées par cette enquête ont été soumises à des essais d’activité biologique sur des souches de Mycobactéries à l’aide d’un nouveau modèle hôte-pathogène faisant le mimétisme de l’ingestion de M. tuberculosis par les macrophages (Kicka et al., 2014). Ces essais in vitro très innovants, étudiant l’activité antibiotique et antiinfectieuse contre M. marinum, sont présentés ainsi que leur usage pour la sélection et la détermination d’extraits actifs.

- Le Chapitre III concerne les investigations pharmacognosiques et phytochimiques des plantes sélectionnées qui ont montrées des activités antibactériennes sur des souches de Mycobacterium. L’isolement guidé par les essais in vitro a permis d’identifier les principales molécules responsables de ces activités. Des aspects pharmacologiques liés à la biodisponibilité des principes actifs ellagitanins seront abordés et des essais complémentaires

sont présentés sur leurs métabolites pour une évaluation des IC50 de ces composés actifs sur les mycobactéries.

- Le Chapitre IV présentera l’utilisation de l’électrophorèse capillaire pour le développement de méthode de contrôle de qualité des extraits de plantes et la détection des sous standards dans les pays en voie de développement et. Une application liée à ce travail est le développement de méthode de quantification de punicalagin dans des extraits de C. aculeatum. Une évaluation de l’emploi de cette méthode pour l’analyse quantitative simultanée des antituberculeux est aussi présentée.

- Le chapitre V, conclusions et perspectives, discutera les résultats obtenus dans ce travail de recherche. Il ouvre ainsi la discussion sur les différentes opportunités pour la valorisation des résultats avec des perspectives d’études complémentaires et d’applications.

CHAPITRE I

SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

La tuberculose (TB)

Historique et généralités sur la maladie

Depuis les origines de la vie en société, la tuberculose est une maladie qui accompagne l’humain. Les médecins de l'antiquité gréco-latine, tels que Galien ou Hippocrate, donnaient une description relativement précise d'une maladie dépérissant les individus affectés. Elle est à évolution lente et touche principalement le système respiratoire. La TB était alors désignée par le terme « phtisie » qui vient du grec signifiant dépérissement, extinction et/ou décroissance. C’est à la seconde moitié du 19e siècle que fût identifiée par Robert Koch (1843-1910) la cause effective de la maladie et qu'on lui donna son nom actuel de tuberculose (Bagnoud and Walter, 1998). La tuberculose fût, à cette époque, la première cause de mortalité au niveau mondial, elle était une maladie associée à la pauvreté, aux conditions de travail et de vie incluant le surpeuplement et le manque d’aération des foyers (Zurcher et al., 2016).

La tuberculose est une maladie infectieuse et contagieuse causée par des mycobactéries du complexe tuberculosis dont le principal agent est le bacille tuberculeux Mycobacterium tuberculosis (un bacille acido-alcoolorésistant, BAAR), qui touche le plus souvent les poumons. Le genre Mycobacterium comprend plus de 139 espèces, dont le M. tuberculosis qui est une bactérie évolutive de plus de 10000 ans et ayant évolué depuis les bactéries du sol (Negi et al., 2010). Les espèces les plus fréquentes sont le M. tuberculosis, M. bovis et M. africanum. L’Homme est le principal réservoir et agent de transmission de ces espèces de Mycobactérie. M. tuberculosis se transmet principalement par voie aérogène (aérosol) lors de l’expectoration de gouttelettes de sécrétions bronchiques par des personnes atteintes de tuberculose-maladie (Figure I.1). Après inhalation du bacille, il arrive au poumon et est ingéré par la première ligne de défense immunitaire constituées par les macrophages et les cellules dendritiques alvéolaires. Le bacille tuberculeux a la capacité de survivre dans les cellules phagocytaires et est reconnu grâce à sa membrane constituée d’arabinogalactane

16 et des cires tels que les acides mycoliques. Sa constitution spécifique donne, au bacille, la caractéristique de pouvoir retarder la réponse immunitaire spécifique (Schaaf and Zumla, 2009). Les principaux facteurs contrôlant la réponse à l’infection tuberculeuse sont les lymphocytes T CD4+ et 3 cytokines et/ou interleukines : Tumor Necrosis Factor α (TNFα), l’Interféron γ (IFNγ) et l’interleukine 12 (IL12) (Herrmann et al., 2006). Ces facteurs sont souvent perturbés lors de défaillance du système immunitaire causée par certaines maladies telles que le SIDA caractérisé par une diminution des LT CD4+ ou lors de maladie auto-immune traitée par des anti TNFα (Keller et al., 2006).

La tuberculose-maladie ne peut être détecter qu’après 10 semaines suite au contact avec le bacille. Ce laps de temps correspond à la succession des processus de migration des cellules dendritiques infectées vers le ganglion relais, l’induction de la réponse immunitaire spécifique et enfin par la dissémination au niveau du liquide lymphatique par les cellules dendritiques puis dans le sang par les polynucléaires neutrophiles (Keller et al., 2006). Ce qui explique la possible dissémination de la tuberculose dans tous les organes.

Non traitée, la tuberculose peut être mortelle avec une longue phase de maladie dégénérative pouvant conduire à des affections extra pulmonaire, dont la plus fréquente est la tuberculose ganglionnaire avec des manifestations atypiques sur le plan cutané. La tuberculose peut aussi avoir des affections osseuses et urinaires (Schaaf and Zumla, 2009). Suite au retardement de la réponse immunitaire le bacille phagocyté continue à se multiplier dans le poumon et le ganglion relais aboutissant à la formation de granulomes primaires qui constitue la lésion pulmonaire initiale caractéristique de la maladie (Schaaf and Zumla, 2009). Chez une personne en bonne santé, l’infection à Mycobacterium tuberculosis est souvent asymptomatique car le système immunitaire « emprisonne » le bacille. Lorsqu’elle se déclare, la tuberculose pulmonaire se manifeste par une toux, parfois productive ou sanglante (hémoptysies), des douleurs thoraciques, une asthénie, une perte de poids et des sueurs nocturnes. Seulement 5 à 10% des personnes en contact avec le bacille développe la maladie, elle peut aussi se manifester seulement après plusieurs années. La tuberculose peut présenter une phase de latence chez des sujets sains et peut se déclarer lors de faiblesses immunitaires liés à l’âge, à une malnutrition, patients sous immunosuppresseurs ou présentant une maladie telle

17 que le SIDA. La promiscuité et les conditions de vie dans certains pays d’Afrique et d’Asie, accompagnée par la recrudescence d’infection au VIH sont les facteurs principaux de la recrudescence de cette épidémie de TB (Chaisson and Martinson, 2008). D’autres facteurs augmentent le risque de développer la maladie, ce sont principalement les patients avec insuffisance rénale, le diabète, le cancer, le tabagisme, l’alcoolisme et la malnutrition (WHO, 2009).

Figure I.1: Cycle de l’infection pulmonaire de la Tuberculose chez l’humain (Source : Nature Reviews / microbiology)

I.1.2 Diagnostic

Le diagnostic des maladies infectieuses est une problématique majeure et un facteur clef pour leur éradication. Plus vite un diagnostic est posé, meilleure sera la prise en charge pour éviter toutes complications et surtout la dissémination de celles-ci. Dans le cadre de la tuberculose, la toux est le symptôme majeur, qui peut avoir d’autres étiologies allergiques ou tout simplement d’affections des voies aériennes non tuberculeuse.

Ainsi les patients arrivent bien après le début de l’infection aux centres de santé pour avoir un diagnostic fiable. Ainsi plusieurs tests sont mis en jeu pour mettre en évidence la présence d’une infection à Mycobacterium tuberculosis.

Il existe différents moyens diagnostic moderne de la tuberculose maladie dont le plus répandu de nos jours est le test du crachat des patients par examen bactériologique à l’aide de la microscopie. C’est une méthode de coloration des bacilles par le réactif de Ziehl-Neelsen qui permet de détecter la tuberculose et traiter assez tôt les patients les plus contagieux mais elle est peu sensible (Truffot- Pernot et al., 2006). Ce test peut être suivi par la culture du bacille pour l’identifier. Ainsi pour obtenir un antibiogramme et faire l’identification des mycobactéries, la culture sur milieu liquide ou solide est indispensable. Celle-ci peut prendre 4 à 8 semaines selon le milieu de culture. Cette méthode vient également en soutien pour la détection de tuberculose multi-résistante à la rifampicine et de la résistance à haut niveau à l’isoniazide, par une approche d’hybridation moléculaire sur bandelettes (Truffot-Pernot et al., 2006). Il existe d’autres moyens modernes comme l’amplification génique par des réactions de polymérisations en chaîne (PCR) pour la recherche de M. tuberculosis. Cette méthode qui est difficile à utiliser en routine est moins performante que la culture (Truffot-Pernot et al., 2006).

Depuis 2010, Il existe un nouveau test moléculaire très sensible est utilisé largement suite à la diffusion par FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics) et l’OMS, il est nommé GenXpert MTB/RIF®. Celui-ci permet notamment un diagnostic rapide en 2 heures mais aussi la détection des souches résistantes à la rifampicine. Très important chez les patients HIV positif ou multi résistants, ce test est disponible dans plusieurs pays en voie de développement et

19 a donné un impact important pour la prise en charge de la tuberculose (Haraka et al., 2018) (Geleta et al., 2015). Et récemment des tests nommés MTBDRsl basés sur l'ADN pour la détection de mutations spécifiques associées à la résistance aux fluoroquinolones et aux médicaments injectables de deuxième intention (sl pour second line) dans le complexe Mycobacterium tuberculosis. Ces essais ont été mis à disposition dans les laboratoires nationaux de lutte contre la tuberculose par l’OMS pour la détection rapide des multi-résistances aux médicaments de seconde ligne (Ormerod, 2005).

Lors d’une infection à la TB, la formation du granulome tuberculeux est asymptomatique et c’est à ce moment qu’intervient le test de réactions cutanées à la tuberculine. Celui-ci communément appelé test de Mantoux s’effectue en injectant sous la peau (face antérieure de l’avant-bras), un extrait protéique, la tuberculine du bacille donnant une réaction cutanée spécifique à la présence d’infection. C’est un élément majeur pour le dépistage précoce de la maladie. Il peut également être utilisé, à ce stade, un test de libération de l’interféron gamma en réponse à des antigènes de M. tuberculosis appelés IGRA dont les plus utilisés sont le Quantiferon® et le TspotTB®. Ceux-ci permettent de détecter la tuberculose latente avec des tests sérologiques prometteurs (Truffot-Pernot et al., 2006). La radiographie des poumons (Rx du thorax) a été introduite depuis les années 1890 en Europe (Zurcher et al., 2016) et elle est également utilisée dans des hôpitaux et des centres spécialisés dans les pays en voie de développement. L’examen radiologique permet de détecter 3 types de lésions tuberculeuses à savoir les cavernes, nodules et infiltrats (www.respir.com ). Le coût et la maintenance des appareils de radiologie étant un facteur limitant pour sa disponibilité autour du monde, cette méthode n’est pas utilisée en routine. Cependant il existe des initiatives pour améliorer l’accès et la formation du personnel hospitalier à cette technologie (Lönnroth et al., 2010).

Ces moyens diagnostiques présentés permettent d’aiguiller assez vite les patients vers une prise en charge adéquate, tout d’abord dans la prévention des disséminations autour des proches et de la communauté mais aussi sur la mise en place rapide de traitements adaptés en fonction du cas.

I.1.3 Prise en charge et traitement

L’amélioration des conditions de vie en société et des actions de prévention ont relativement été les facteurs déterminant de la baisse de l’épidémiologie dans les pays développés et notamment en Suisse. Des sanatoriums ont été construits à la montagne ou à la mer pour les tuberculeux indigents, ce qui a fortement ralenti l’évolution de l’épidémie dans les milieux défavorisés. Un lien a été mis en cause entre la mortalité et le nombre de personnes par chambre (Zurcher et al., 2016). Une meilleure aération et de la présence de lumière dans les lieux de vie en communauté sont des approches de base lors d’infection à la tuberculose. Ainsi en plus de ces facteurs, les recommandations sanitaires sont, dans la mesure du possible, d’éviter la promiscuité pour éventuellement éviter la propagation de l’infection. Ensuite vient l’état nutritionnel des patients pour s’assurer d’une bonne défense immunitaire avant la mise en place de traitements. Une revue systématique a évalué les suppléments alimentaires (macro et micronutriments) ayant un effet sur le traitement de la TB, mais aucun lien direct n’a pus être corrélées avec une supplémentation alimentaire spécifique. Cependant ces suppléments apportent un gain considérable pour la prise de poids et la diminution de la fatigue liée à la maladie (Grobler et al., 2016). A la suite de ces moyens non médicamenteux très relevant il existe plusieurs moyens de prise en charge tant pour la prévention que le traitement antiinfectieux.

Pour la prévention, un moyen vaccinal est disponible et obligatoire dans les pays où la maladie est endémique, cette vaccination se fait par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) qui n’offre cependant qu’une protection partielle. Le test à la tuberculine permet essentiellement d'effectuer un premier tri parmi les personnes susceptibles d'être tuberculeuses mais aussi de vérifier l'efficacité du vaccin.

Le traitement de base obéit à la stratégie DOTs (de l’anglais Direct Observed Therapy strategy) mise en place par l’OMS depuis le début des années 90 (1994 en Afrique). La stratégie DOTS aide à fournir des antibiotiques aux malades quotidiennement dans des centres de traitement pendant toute la durée du traitement. Les traitements sont actuellement gratuits dans les pays en voie de développement offerts par la coalition Stop-TB ( http://www.stoptb.org/about/).

Ainsi cette stratégie englobe cinq éléments essentiels pour le succès de la lutte contre la tuberculose, il s’agit de la volonté politique des gouvernements, le dépistage par des examens bactériologiques de qualité, un traitement normalisé avec surveillance et soutien des patients ; une gestion pharmaceutique efficace et une évaluation régulière de la situation(WHO, 2017).

Il est possible de traiter la tuberculose par la prise d’antibiotiques pendant une durée moyenne de six mois. On parle à ce stade de traitement d’une tuberculose susceptible aux antibiotiques. Dans un faible pourcentage des cas, les bactéries sont résistantes aux principaux antibiotiques, de sorte que le traitement dure plus longtemps et se révèle plus compliqué. Le traitement est difficile pour le patient tant dans sa durée que dans le nombre de médicaments à absorber. Il peut entraîner également des effets secondaires et toxiques. Lors de la prescription d'un traitement, il est important d'assurer le suivi du patient en l'accompagnant dans sa maladie, en lui fournissant toutes les explications nécessaires et en le responsabilisant quant à sa prise médicamenteuse.

Les antituberculeux sont classés en 5 sous-groupes distincts dont le premier sous- groupe regroupe les traitements de base pour une tuberculose sensible aux médicaments, les sous-groupes 2 à 4 regroupent les médicaments utilisés pour les tuberculoses résistantes et le dernier sous-groupe regroupent les molécules avec un rôle non défini ou pas clairement établi. Ces 3 lignes de traitement sont les suivantes (Zumla et al., 2013) :

- Première ligne de traitement :

Groupe 1 : Voie Orale: isoniazide (H), rifampicine (R/Rif), pyrazinamide (Z), éthambutol (E), rifapentine (P) ou rifabutine (Rfb).

- Deuxième ligne de traitement :

Groupe 2. aminoglycosides injectables: streptomycine (S), kanamycine (Km), amikacine (Amk). Polypeptides injectables: capréomycine (Cm), viomycine (Vim).

Groupe 3. fluoroquinolones par voie orale et injectable: ciprofloxacine (Cfx), lévofloxacine (Lfx), moxifloxacine (Mfx), ofloxacine (Ofx), gatifloxacine (Gfx).

Groupe 4 : Voie Orale: para-aminosalicylic acid (Pas), cycloserine (Dcs), terizidone (Trd), ethionamide (Eto), prothionamide (Pto), thioacetazone (Thz), linézolide (Lzd).

- Troisième ligne de traitement :

Groupe 5. Clofazimine (Cfz), linézolide (Lzd), amoxicilline plus clavulanate (Amx/Clv), imipenem plus cilastatine (Ipm/Cln), clarithromycine (Clr).

Le traitement de la tuberculose pulmonaire susceptible aux antibiotiques comprend une phase intensive avec une quadrithérapie pendant 2 mois associant rifampicine(R), isoniazide(H), pyrazinamide(Z) et éthambutol(E) en une association de dose fixe (ADF 4) et une phase de continuation avec une bithérapie par isoniazide et rifampicine (ADF 2) pendant 4 mois. Le traitement bien conduit s’accompagne de moins de 2% de rechute. L’isoniazide, le pyrazinamide et l’éthambutol sont des antibiotiques qui agissent sur des composés spécifiques de la paroi des mycobactéries (acides mycoliques et arabinogalactane) ce qui explique leur sélectivité face à d’autres espèces bactériennes. La rifampicine est un antibiotique a spectre plus large, actif sur les bactéries à Gram positif, elle inhibe la transcription de l’ADN. Il existe d’autres antituberculeux qui sont utilisés en association au RHZE en cas de TB multi résistante. Il s’agit essentiellement de la streptomycine et de l’amikacine (aminoglycosides), de la moxifloxacine (fluoroquinolones), de l’éthionamide, la thioacétazone et l’acide para-amino- salicylique(PAS).

Les principales molécules antituberculeuses RHZ présentent une hépato toxicité très prononcée, et l’isoniazide a une toxicité particulière chez les métaboliseurs (par acétylation) lents au niveau du cytochrome P450 (CYP). Cette enzyme est souvent déficiente chez certaines populations africaines et d’Amérique du Sud qui sont le plus concerné par l’épidémie de tuberculose.

Cette toxicité peut fortement diminuer l’adhérence thérapeutique par peur d’effets indésirables sévères pouvant causer une hépatite médicamenteuse (Senousy et al., 2010). La pyrazinamide montre un plus grand taux d’hépato toxicité chez les patients traités avec cette molécule surtout lorsqu’elle est associée à la rifampicine.

La toxicité est le plus souvent rencontrée lors d’association des molécules, mais elle peut être monitorée pour en diminuer les conséquences (Yee et al., 2003).

Les principaux effets indésirables rencontrés pour les traitements de base avec RHZE sont les suivants : la surdité pour la streptomycine, la névrite optique avec l’éthambutol, l’anurie et le purpura cutané avec le RH. Ces effets indésirables impliquent des arrêts de traitement. Alors qu’en cas d’ictère avec le RH et Z, l’arrêt et la réintroduction à faible posologie est possible. Il existe d’autres effets mineurs pour lesquels on peut remédier avec des traitements complémentaires, on rencontre notamment des signes gastro intestinaux à type d’anorexie, de la nausée, des douleurs abdominales avec le RH. Des douleurs articulaires, des sensations de brûlures dans les pieds et des changements de couleur de l’urine sont aussi peu fréquemment cités. Le tableau 1 ci-dessous résume les activités et propriétés pharmacologiques des différentes molécules de l’association RHZE. Les dosages, des différentes formes combinées, sont les suivants : Rifampicine/Isoniazide (RH) 150 mg/75 mg ou 60 mg/30 mg, l’association Ethambutol/Isoniazide (EH) 400 mg/150 mg, l’association Rifampicine /Isoniazide/Pyrazinamide (RHZ) 150 mg/75 mg/400 mg ou 60 mg/30 mg/150 mg et enfin l’association Rifampicine /Isoniazide/ Pyrazinamide/ Ethambutol: (RHZE) 150 mg/75 mg/400 mg/275 mg en 1 comprimé.

Les interactions médicamenteuses sont un souci particulier lors de traitement avec les antituberculeux car la rifampicine est un inducteur majeur des cytochromes P450 et de la glycoprotéine P (PgP). Lorsqu’elle est associée à l’isoniazide, qui elle, inhibe certains CYP 450 et en induit d’autres, la production de métabolite comme l’hydrazine et ses dérivés toxiques est exacerbée (Senousy et al., 2010). L’isoniazide est métabolisé entre autre à travers le CYP 2E1, qui métabolise également l’alcool donc la consommation d’alcool est un facteur de risque lors de traitement antituberculeux pour la survenue d’effet indésirables. Ainsi pour éviter les problèmes hépatiques causés par ces interactions il est impératif d’évaluer le régime pour chaque patient ou groupe de population en fonction des critères d’âge, d’habitude alimentaire, de consommation d’alcool ou prise d’autre toxiques / médicaments (Yee et al., 2003).

Tableau I.1 : Pharmacologie des antituberculeux de première ligne (source : compendium® suisse des médicaments www.kompendium.ch )

Molécules de base Pharmacologie et pharmacocinétique pour le traitement de la TB

Rifampicine (R) Action bactéricide et stérilisante avec une concentration plasmatique active(CMI) : 0,005 et 0,2 µg/ml A : Résorption presque complète diminuée par une prise alimentaire D : 80% liée aux protéines plasmatique et diffusion du reste dans l’organisme jusqu’au LCR. Passe la barrière placentaire et dans le lait maternel M : Cycle entéro-hépatique Désacétylation (métabolite actif) permettant une élimination plus rapide (Pas de résorption intestinale) E : Demi vie : 3h à 5h (selon la dose) et elle est réduite à 2h après administration répétée 30% éliminer dans les urines (la moitié sous forme inchangée) Interactions : Inducteur des CYP450 2B6, 2C8, 2C9, 2C19,3A4/5, et la Glycoprotéine P(PgP) Augmente l’hépato toxicité des antirétroviraux (saquinavir, ritonavir,et Névirapine) - Diminue efficacité de plusieurs médicaments Isoniazide (H) Action bactéricide et stérilisante avec Concentration plasmatique active(CMI) : 0,025 et 0,05 µg/ml A : Résorption presque complète (Cmax= 8 µg/ml en 2h après une prise de 10mg/kg de poids) D : 4-30% liée aux protéines plasmatique et bonne diffusion dans l’organisme jusqu’au LCR(90% environ de celle du sang). Passe la barrière placentaire et dans le lait maternel M : Inactivé par acétylation (acétyleurs lents chez les noirs) et deshydrazination dans le foie. Seulement 20% des métabolites sont actifs E : Demi-vie d’élimination plasmatique: 3h à 5h. Elimination de 50 à 70% de la dose administrée dans les urines en 24H. 27% en dose inchangée chez les noirs Interactions : Inhibiteur des CYP 2C19 et 3A4/5, Inducteur puissant du CYP450 2E1 Augmente la concentration de certains médicaments-L ’isoniazide peut inhiber la monoamine oxydase et la diamine

oxydase. L’absorption d’aliments contenant de la tyramine (par ex. fromage, vin) ou de l’histamine (par ex. thon) peut provoquer des céphalées, des palpitations cardiaques, une sensation de chaleur

Pyrazinamide (Z) Action bactéricide intracellulaire et stérilisante avec une concentration plasmatique active(CMI) : 12,5 et 20 µg/ml A : Résorption presque complète et diffusion rapide (Cmax= 26-38 µg/ml en 2h après une prise de 25mg/kg de poids) D : 50% liée aux protéines plasmatique et bonne diffusion dans l’organisme jusqu’au LCR(C° égale à celle dans le sang). Passe dans le lait maternel M : Hydrolyse dans le foie (Acide pyrazinoïque actif), Inactivé par hydroxylation (5-Hydroxy A.pyrazinoïque). (Z) est fortement métabolisé E : Demi-vie d’élimination plasmatique: 9h à 10h. Elimination de 70% de la dose administrée dans les urines en 24H (Filtration glomérulaire). 4-14% en dose inchangée Interactions : pas d’effets sur les CYP connus dans la littérature

Ethambutol (E) Action bactériostatique avec une concentration plasmatique active(CMI) : 0,5 et 2 µg/ml A : Résorption presque complète (Cmax= 2-5 µg/ml en 2h à 4h après une prise de 25mg/kg de poids), Biodisponibilité de 80% D : 20-30% liée aux protéines plasmatiques et bonne diffusion dans l’organisme, la concentration dans le LCR peut varier de 20 à 80% de celle dans le plasma. Le taux dans les érythrocytes est 2 fois plus élevé que dans le plasma. Passe la barrière placentaire et dans le lait maternel M : 8 à 15% apparaissent sous forme de deux métabolites inactifs (Produits d’oxydation de l’éthambutol) E : Demi-vie d’élimination plasmatique: 3.5h à 4.6h. Elimination de 50% de la dose administrée dans les urines en 24H (forme inchangé) et 20% dans le fèces (forme inchangée). Ia : pas d’effets documentés sur les CYP

Résorption diminué par administration concomitante de sels d’aluminium

Ces molécules présentées constituent les traitements de première ligne pour la tuberculose, mais de nos jours la résistance à la rifampicine et l’isoniazide est de plus en plus documentée (Calver et al., 2010). On parle de multi résistances (MDR/RR-TB) mais aussi de résistances étendues à tous les antituberculeux (XDR- TB). Pour ces formes de tuberculose, les traitements sont plus contraignant et peuvent associer jusqu’à une dizaine de molécules avec des durées de traitement pouvant aller de 12 à 24 mois. En 2015, il a été enregistré un succès thérapeutique de 83% sur la totalité des cas traité de tuberculose simple alors que ce pourcentage chute à 78% pour la TB associé au VIH, à 54% pour MDR-TB et seulement 30% pour XDR/TB (WHO, 2017). Pour cette dernière il est primordial d’isoler les patients ayant développé des résistances pour éviter les infections nosocomiales qui sont la source d’extension de cette résistance (Calver et al., 2010). Pour les patients avec coïnfection au VIH, le traitement se fait au cas par cas après l’étude méticuleuse de la médication et adapter progressivement le traitement pour éviter les effets indésirables sévères et interactions médicamenteuses pouvant provoquer des échecs thérapeutiques(WHO, 2017).

Etat actuel de la recherche dans la prise en charge de la tuberculose

Moyens diagnostic

L’examen microscopique après coloration des BAAR et la culture sont encore aujourd’hui des outils incontournables. Cependant de nouveaux outils et des approches diverses, sont en développement pour le diagnostic de la tuberculose. Surtout dans la détection de tuberculose latente pour laquelle une faiblesse est clairement identifiée. Il y’a également des efforts considérables dans la détermination de la sensibilité des souches mycobactériennes aux antibiotiques (Truffot-Pernot et al., 2006). Ainsi le plan global 2016-2020 pour éradiquer la tuberculose est basé sur une règle 90-(90)-90 qui implique un diagnostic et traitement de 90% des cas, incluant 90% des cas clés pour aboutir à un succès thérapeutique d’au moins 90% (del Granado et al., 2016). Le diagnostic et la détection des nouveaux cas et des résistances restent les points clés de la lutte contre l’expansion de la maladie (Geleta et al., 2015).

L’ONG FIND (https://www.finddx.org/target-product-profiles/ ) travaille à l’amélioration des moyens diagnostiques et a notamment pu supporter le développement d’une microscopie par fluorescence LED dont la performance est supérieure à la microscopie classique pour l’identification des BAAR. L’OMS recommande depuis 2010 la mise en place de la microscopie LED car elle est plus sensible, présente un avantage pour le coût et du point de vue opérationnel en comparaison à la microscopie conventionnelle Ziehl-Neelsen. Les tests Xpert MTB/RIF® ont apportés un gain de sensibilité pour la détection rapide sur les échantillons de crachats, cependant cette sensibilité peut varier selon les pays et sa mise en place dans les programmes nationaux (Geleta et al., 2015). Ainsi plus que de développer des tests il faut mettre l’accent sur l’implémentation dans les différentes conditions des états pour améliorer la sensibilité. FIND travaille à une adoption rapide de ce test depuis 2010 et travaille à une amélioration avec des nouvelles cassettes ULTRA qui devraient être utilisées dans des situations de haute prévalence VIH et TB (Kendall et al., 2017). La recherche de biomarqueurs spécifiques lors d’infections à la tuberculose a bien avancé avec les récentes applications de la métabolomique, protéomique et génomique. Ces biomarqueurs sont très souvent utilisés pour suivre la guérison, la rechute où la réponse au traitement et constitue un outil intéressant pour éviter le développement des résistances (Zumla et al., 2013). La création de bio banques, composés de spécimens mycobactériens isolés de patients ayant développé une résistance ou avec échec thérapeutique, est une approche beaucoup utilisé de nos jours afin d’identifier assez rapidement le traitement adéquat lors de tuberculose multi résistante (Zumla et al., 2013).

Traitements

La streptomycine, un antibiotique isolé de Streptomyces grisea, fût le premier antituberculeux découvert dans les années 50, suivie par l’introduction de la combinaison des 4 antibiotiques RHZE pour une durée de 6mois comme traitement standard depuis les années 70 (Zumla et al., 2013). L’introduction de la stratégie DOT de l’OMS pour accompagner la quadrithérapie a permis ainsi d’augmenter considérablement le succès thérapeutique. Cependant depuis plus de 50 ans il n’y a pas encore eu de traitement de première ligne avec un nouveau principe actif,

la recherche est principalement basée sur la découverte de nouveaux outils contre les résistances. On assiste à l’apparition de nouvelles molécules prometteuses pour lutter contre la tuberculose résistante et multi résistante (MDR-TB et XDR-TB). L’identification de nouvelles activités thérapeutiques contribue à la réintroduction d’anciennes molécules et au développement de nouveaux dérivés plus actifs. On peut notamment citer la bédaquiline récemment approuvée par la FDA en combinaison avec le RHZE et la streptomycine pour les adultes ayant une tuberculose multi résistante, les nitro-imidazolés (PA 824 and OPC67683) et SQ109 sont présentés comme nouvelles entités chimiques (Zumla et al., 2013). Il existe beaucoup de nouvelles molécules qui sont au stade de développement préclinique, on peut y classer le nitroimodazolé TBA 354, la fluoroquinolone DC 159a, une dipiperidine SQ609, la capuramycine SQ641, une benzothiazinone BTZ043 et le nucléoside caprazène CPZEN 45 (Zumla et al., 2013). La figure I.2 ci-dessous résume les modes d’actions des principaux antituberculeux et des nouvelles molécules (Source : National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)).

A) Cible des anti-TB classiques B) Cible des molécules en développement

Figure I.2 : Cible des antituberculeux utilisés en thérapie et des molécules en développement (NIAID) https://www.niaid.nih.gov/diseases-conditions/tbdrugs (Mars 2018)

Plantes médicinales et tuberculose

Histoire de l’usage des plantes médicinales

Depuis la nuit des temps les plantes médicinales sont utilisées pour traiter les différents maux et affections chez l‘humain et l’animal. En 2400 avant J.C apparue la description des premières drogues végétales dans les documents sumériens et babyloniens. Ensuite Dioscoride écrit un manuel, « De materia medica », contenant 500 drogues végétales en l’an 77 après J.C. Ensuite avec le début de la pharmacie expérimentale, Paracelse (1493-1541) décrit la notion de spécificité et de principe actif au 15ème siècle (Quetin-Leclercq, 2002). Les essais pharmacologiques mis en place par Claude Bernard (1813-1878) marque le début de la pharmacie moderne et la pharmacognosie. C’est seulement en 1958 que l’OMS publie une première liste de plantes utiles contenant 54 plantes essentielles pour la thérapie déjà citées par Dioscoride (Quetin-Leclercq, 2002).

Selon une étude américaine (National cancer Institute) 61% des 877 nouvelles molécules développées proviennent ou sont inspirées du monde végétal (Negi et al., 2010). Les substances d’origine naturelles ont un grand potentiel pour trouver des nouveaux pharmacophores mais les plantes et extraits sont très peu évalués dans leur globalité (Negi et al., 2010). Les premières études pharmacologiques sur les plantes médicinales remontent alors à la fin du 19ème siècle alors que la tuberculose faisait l’objet d’une attention croissante chez les médecins et les populations en Europe (Bagnoud and Walter, 1998).

Plantes utilisées contre la tuberculose

En 1897, est introduit en Angleterre un traitement à base de plante contre la Tuberculose nommé « Stevens consomptions cure » à la suite du traitement de la Tuberculose d’un Major Anglais Stevens par un guérisseur Sud-Africain (Newsom, 2002). Cependant l’usage de cette cure fût condamné et banni pour un usage médicinal (Newsom, 2002). Les premières études publiées sur des plantes médicinales contre la tuberculose remontent à 1930 avec le « Stevenscure » contenant des extraits d’un Pelargonium du cap nommé « Umckaloabo »par le médecin genevois Adrian Sechehaye (Sechehaye, 1929).

Les retours cliniques de ce médecin genevois parlent alors à l’époque d’une prise en charge de 800 patients tuberculeux avec description de 64 cas guéris. Ainsi déjà au début du siècle les plantes médicinales ont montré leur capacité à traité la tuberculose (Newsom, 2002). Pelargonium sidoides DC. et/ou reniforme Curt. a refait son apparition dans la thérapeutique sous forme d’extraits standardisés et est commercialisé en Europe pour le traitement des bronchites chroniques. On parle ainsi de l’évolution de la médecine traditionnelle Zulu à la phytothérapie européenne reconnue (Bladt and Wagner, 2007). Ce qui constitue une évidence primaire pour son usage traditionnel rationnel dans le traitement de la tuberculose dont le principal symptôme est une toux chronique de plus de deux semaines.

Figure I.3 : Parties aériennes de Pelargomium reniforme curt. (Afrique du Sud)

Cette plante a fait l’objet de multiples études pharmacognosiques. Les racines ont notamment fait l’objet d’une monographie de la pharmacopée européenne (PhEur 7.0) et la conformité qualité de la racine est déterminée par sa teneur en tanins qui doit d’être au moins 2% exprimée en équivalent pyrogallol (PhEur., 2014). En pharmacologie, les études des extraits de Pelargonium sidoides avec l’aide des essais biologiques contre Mycobacterium ont documentées plusieurs activités antibiotiques in vitro. On trouve dans l’extrait aqueux qui stimule l’élimination des mycobactéries, dans les macrophages, les composés suivants : l’acide gallique, le méthyl gallate, la myricétine et la quercitin-3-O-glucoside. Les analyses phytochimiques de la fraction active de l’extrait éthanolique des racines de P. sidoides ont permises l’isolement et l’identification de 6 composés dont des coumarines (umckaline, scopolétine, 6,8-dihydroxy-5.7-dimethoxy-2H-

31 benzopyran-2-one et 6,8-dihydroxy-7-methoxy-2H-benzopyran-2-one) et des flavonoïdes (catéchine et épigallocatéchine). L’épigallocatéchine et la scopolétine ont également montrées une activité in vitro contre M. smegmatis) (Mativandlela et al., 2008). D’autres essais montrent que le composé le plus actif de l’extrait éthanolique est l’acide linoléique avec une CMI de 2 mg/l contre Mycobacterium aurum (Seidel and Taylor, 2004). Plusieurs enquêtes ethnobotaniques en Afrique ont documentés un large usage des plantes médicinales par les tradipraticiens et les populations. En Ouganda, on recense ainsi 90 plantes réparties dans 44 familles botaniques dont les plus intéressantes en fonction du nombre de citations sont Zanthoxylum leprieurii, Piptadeniastrum africanum, Albizia coriaria et Rubia cordifolia. Cette étude, montre que les familles les plus souvent citées sont les Fabaceae, les Asteraceae, les Moraceae et les Rutaceae (Bunalema et al., 2014). Une étude nigériane a identifié des plantes avec activité antimycobactérienne à partir de 78 recettes collectées chez es tradipraticiens. Parmi celles-ci 15% ont présenté une bonne activité contre des souches de M. tuberculosis utilisant la méthode de dilutions dans des milieux de cultures (Duckworth et al., 2012; Ibekwe et al., 2014). Cette étude a déterminé les activités in vitro (Concentration minimale inhibitrice, CMI) d’extraits méthanoliques et montre une bonne corrélation d’usage et d’activité pour certaines plantes notamment Anogeissus leiocarpus, Erythrina senegalensis, Securidaca longepediculata et Combretum molle (Ibekwe et al., 2014). Très récemment une revue a fait le tour des plantes médicinales ayant une activité antimycobactérienne, celle-ci énumère une large liste de plantes médicinales utilisées en Afrique en Europe et en Asie. Cette liste va de Abrus precatorius (Fabaceae) à Zanthoxyllum chalybeum (Rutaceae) en passant par une diversité de famille botanique présentes dans différentes régions du globe (Chinsembu, K. C., 2016). La pharmacognosie et la phytochimie de nombreuses plantes citées traditionnellement ont permis de classifier les principales molécules rencontrées dans ces plantes avec une activité antimycobactérienne in vitro. Les principales classes chimiques rencontrées sont les alcaloïdes, les composés phénoliques dont les flavonoïdes et les coumarines, quelques stéroïdes et terpénoïdes (Negi et al., 2010). Plusieurs recherches montrent ainsi la relevance de l’usage des plantes

32 médicinales avec les potentiels à trouver des substances ou extraits antituberculeux. Ainsi il est nécessaire de mieux investiguer les plantes utilisées en Afrique pour combattre l’infection à la tuberculose et ainsi des approches combinées de politique sanitaire et de recherche sont à mettre en œuvre.

La médecine traditionnelle africaine

Conscient de l’importance de la médecine traditionnelle pour garantir au patient des soins et produits de qualité accessibles financièrement et géographiquement, l’Union Africaine a promulgué en 2000 la décennie 2001-2010 « Décennie de la Médecine Traditionnelle Africaine (MTA). De même l’OMS qui a proclamé à son tour la journée du 31 Août « Journée Internationale de la Médecine Traditionnelle Africaine », a publiée récemment (OMS, 2013) la stratégie de l’OMS pour la médecine traditionnelle durant la décennie 2014-2023. Cette publication réaffirme que dans le monde entier la médecine traditionnelle constitue soit le mode principal de prestation de soins de santé, soit un complément à ce dernier.

L’OMS recommande à tous les états d’adopter une politique de développement de la médecine traditionnelle. Ceci passera inéluctable par la valorisation des ressources naturelles en général et des plantes de la pharmacopée traditionnelle en particulier qui ont fourni par le passé des remèdes efficaces contre des maladies mortelles. On peut notamment citer la quinine et l’artémisinine pour traiter le paludisme respectivement isolés de Cinchona sp et Artemisia annua. Mais aussi pour le traitement des cancers avec la vincristine isolé du Catharantus roseus et le paclitaxel isolé de l’If, Taxus brevifolia et tant d’autres (David, B. et al., 2015).

En Afrique, le développement de la médecine traditionnelle en général et de la phytothérapie en particulier est freiné par l’absence d’un cadre réglementaire bien défini, de phytomédicaments à la qualité peu ou pas maîtrisée du fait de leur composition complexe et variable (Liang et al., 2004). Ceci constitue un obstacle majeur à leur enregistrement officiel. Cependant il est possible de développer des médicaments traditionnels améliorés, avec l’exemple du Mali (Willcox et al., 2012).

Ensuite des approches combinées d’amélioration de remèdes traditionnels et d’études pharmacognosiques pourraient aboutir à valider des phytomédicaments de qualité (Willcox et al., 2011).

De même, l’OMS met en garde contre l’utilisation de produits médiocres, falsifiés ou contrefaits qui constitue aussi un frein au développement de la médecine traditionnelle. L’approche botanique et d’ethnomédecine bien qu’utile depuis longtemps a montré ses limites face aux nouveaux défis de la qualité des phytomédicaments.

Ainsi trouver des solutions analytiques pour maîtriser davantage la qualité pharmaceutique des médicaments à base de plantes se révèle être une solution importante pour le développement de la phytothérapie et à son intégration officielle aux systèmes nationaux de soins au grand bonheur des populations démunies.

En Afrique, les stratégies analytiques pour assurer la qualité des phytomédicaments sont rares et les initiatives timides. Ainsi la première édition de la pharmacopée de l’Organisation de l’Unité Africaine (OUA) (devenue Union Africaine) date de 1985 et n’intégrait pas véritablement la problématique de la qualité des phytomédicaments face aux enjeux actuels (Gassita, 1995).

Ce n’est que près de 30 ans plus tard qu’un document sur la pharmacopée de l’Afrique de l’Ouest a été publié. Ce document insiste plus sur les usages de plantes médicinales ouest africaines, leur identité botanique que sur des stratégies analytiques adaptées au contexte actuel et répondant efficacement à la problématique de la qualité pharmaceutique des plantes médicinales et phytomédicaments dérivés (Gassita, 1995). Plus récemment une première pharmacopée africaine permettant l’identification et l’analyse de quelques espèces retrouvées sur le continent a été publié par l’AAMPS (African Association for Medicinal Plants Standard) (Eloff et al., 2010).

En Afrique de l’Ouest, d’importants efforts devraient être faits dans ce domaine tant le retard est énorme alors que les attentes et espoirs sont grands. D’où la pertinence d’orienter la recherche analytique vers la prise en charge de cette préoccupation.

Hors d’Afrique, dans des pays comme la Chine et plus récemment dans l’union européenne, les médicaments issus des pharmacopées traditionnelles sont standardisés et des méthodes analytiques d’authentification puissantes ont été élaborées (Bannerman et al., 1983; Cai et al., 2015). Ces outils de contrôle et d’assurance de la qualité des phytomédicaments permettent de s’assurer de l’identité, de la teneur, de l’efficacité et de la sécurité de ces traitements (Calixto, 2000).

Etat actuel de la recherche sur les plantes médicinales à usage thérapeutique

Avant-propos

Vu l’intérêt grandissant et l’usage ubiquitaire des plantes médicinales dans les traitements de maladies humaines, il est nécessaire de développer des stratégies efficaces pour l’étude de ces remèdes à base de plantes. Il existe plusieurs approches qui restent complémentaires et l’interdisciplinarité est un des éléments majeurs pour le développement de la recherche en pharmacognosie. Ces aspects ont été développés dans l’article ci-dessous qui a été rédigé au sein du département de pharmacognosie et de phytochimie de l’université de Genève.

Figure I.4 : Schéma regroupant les étapes principales de l’analyse d’extraits végétaux bruts par méthode de profilage de métabolites LC-MS et identification partielle des constituants par des approches de réseaux moléculaires et de recherche dans les bases de données spectrales in silico. L’ensemble des données génère idéalement des informations sur la composition des extraits ; elles sont combinées avec des tests d’activité biologique et des mesures de perméation pour une documentation détaillée de phytopréparations d’intérêt.

Les nouveaux outils de la recherche pour étudier les plantes médicinales et leur mode d’action

Jean Luc Wolfender, ElHadji Assane Diop, Pierre-Marie Allard 1 1Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne (EPGL), Université de Genève, Université de Lausanne, Genève.

Publication parue en Juin 2017 dans la « Phytothérapie Européenne ». Contribution personnelle dans le choix du sujet et la rédaction de l’article

I.4.2.1 En résumé

Les recherches en pharmacognosie et en phytochimie ont pour but d’apporter une connaissance approfondie de la composition chimique des plantes médicinales et d’établir les liens entre l’activité pharmacologique des extraits végétaux et de leurs constituants (principes actifs).

Il est bien connu que ce type de recherches a mis en évidence des composés naturels avec des effets thérapeutiques marqués (exemples: Paclitaxel, Artémisinine et plus récemment le mébutate d’Ingenol un médicament pour traiter les kératoses actiniques (Fidler and Goldberg, 2014)). D’un autre côté, les connaissances détaillées sur les profils chimiques ont permis de mettre sur le marché des extraits standardisés avec composition constante donnant des résultats cliniques probants (exemples : Hypericum perforatum, Gingko biloba, Rhodiola rosea).

La caractérisation complète des extraits végétaux reste un défi important à la lumière de leurs compositions extrêmement complexes et de leurs fortes chimio diversités. Cette richesse de composés naturels (des métabolites secondaires bio synthétisés principalement pour des aspects de défense) les rend particulièrement intéressants pour rechercher des composés bioactifs originaux.

Durant cette dernière décennie les méthodologies analytiques principalement la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (LC/MS) se sont considérablement développées pour identifier les constituants de matrices complexes, notamment dans le domaine de la métabolomique. Appliquées à la chimie des produits naturels, de telles technologies permettent d’analyser des extraits avec une sensibilité et un niveau de détails encore inégalé (Wolfender et al., 2015).

En parallèle à ces développements les tests d’activité biologique se sont également miniaturisés et ils permettent d’évaluer l’activité des constituants des extraits souvent déjà à l’échelle analytique. Dans ce cadre par exemple, même des tests in vivo avec le modèle Zebrafish dans un format de criblage à haut débit peuvent être effectués. Ces larves de poissons sont utilisées de plus en plus pour observer l’effet de composés sur des pathologies qui peuvent être induites dans ce modèle (Challal et al., 2012).

La combinaison de techniques analytiques et de tests biologiques permet ainsi d’identifier rapidement des principes actifs prometteurs dans les extraits végétaux et de mieux documenter leurs profils chimiques et pharmacologiques. Un aspect important, qui doit également être pris en compte dans l’évaluation de plantes médicinales principalement utilisées par voie orale, est la biodisponibilité de leurs principes actifs. Pour ce faire, différents modèles in vitro ou ex vivo de perméation intestinale existent ; ils peuvent être idéalement combinés aux méthodes de profilage chimique pour évaluer rapidement quels sont les composés qui ont une chance d’atteindre des taux plasmatiques significatifs pour un effet in vivo et donc une activité thérapeutique clinique possible (Petit et al., 2015; Westerhout et al., 2014).

Dans notre laboratoire (https://epgl.unige.ch) ces différentes approches sont combinées pour mettre en lumière de la façon la plus rationnelle et efficace possible, d’une part, la présence de principes actifs originaux dans des plantes non étudiées, d’autre part, pour fournir des données afin de supporter l’usage traditionnel et la sécurité d’emploi de certaines plantes d’intérêt et enfin, la contribution au développement de méthodes de contrôle de qualité des phyto- extraits.

I.4.2.2 Profilage de constituants naturels et Métabolomique

En pharmacognosie les produits naturels d’intérêt sont généralement des métabolites secondaires. Ces composés sont des petites molécules à poids moléculaire de <1000 Da) qui sont nécessaires à la survie d’un végétal dans un environnement donné. Il s’agit principalement de composés de défense tels que les polyphénols, les alcaloïdes, les terpènes, et certains polypeptides.

Ces différents composés présentent une forte chimio diversité et actuellement plus de 300'000 d’entre eux ont été décrits dans la littérature dans l’ensemble du règne végétal (Hall, 2012). Dans les démarches visant à identifier de nouveaux principes actifs, il est nécessaire de caractériser correctement ces composés avant de procéder à leur isolement à partir des extraits végétaux, une démarche longue et coûteuse. Cette approche est décrite comme la déréplication. Elle vise donc à identifier, au niveau analytique, des métabolites secondaires connus afin d’éviter leur isolement ou de le cibler si une activité biologique nouvelle serait à mettre en évidence.

Avec le développement des méthodes basées sur la spectrométrie de masse, notamment dans les sciences de la vie en lien avec la métabolomique, il est devenu possible dans ces cinq dernières années, de mesurer / d’acquérir les masses moléculaires de l’ensemble des métabolites présents dans un extrait dans des spectres MS à haute résolution (HRMS1). Ceci permet idéalement d’extraire l’ensemble des formules brutes de tous les composés détectés. Ces procédures sont maintenant automatisées, et la recherche de l’occurrence d’une formule brute dans un extrait donné, limitée à une espèce ou un genre végétal, permet d’annoter des pics chromatographiques avec des structures putatives de produits naturels vraisemblablement présents. Très récemment, des méthodes complémentaires visant à analyser les spectres de masse tandem (MS2) ont été développées, contrairement à des approches standard, soit des spectres de fragmentation comparés à des bases de données où chacun des composés à comparer devait être analysé séparément (étape presque impossible à effectuer avec 300'000 produits naturels).

Il est maintenant possible de chercher des similarités structurales sans avoir à analyser les substances pures.

Dans ce cadre, notre laboratoire utilise des méthodes basées sur la création de réseaux moléculaires à partir de l’ensemble des spectres MS2 acquis sur un ou plusieurs extraits d’intérêt. Ces méthodes novatrices permettent de regrouper l’ensemble des spectres de masse par familles de composés qui présentent des analogies structurales. Cette façon de visualiser les données met en évidence des agrégats de composés (cluster) pour lesquels une recherche de fragmentation peut être faite dans les bases de données calculées in silico. La combinaison de ces deux types d’information des formules brutes déterminées et des filtres chimio- taxonomiques permet d’identifier en tout cas partiellement un grand nombre de produits naturels dans chacun des extraits analysés, et ceci avec uniquement quelques microgrammes d’extraits (Allard et al., 2016). Ce type d’approche représente un changement de paradigme en chimie naturelle. Il devient alors possible de générer rapidement un grand nombre d’informations de compositions chimiques en parallèle sur un important nombre d’extraits de végétaux complexes (Wolfender et al., 2015).

Ainsi, des informations précises sur la composition peuvent être acquises en parallèle à toutes sortes de tests de bio activité et il devient possible d’établir par des méthodes chimio métriques des corrélations entre activité biologique et composition chimique. A l’ère des « big data », l’acquisition de ce type de données sur un très grand nombre d’extraits devrait permettre de tirer efficacement des conclusions sur l’occurrence de certains composés et la réponse à un test biologique donné (Allard et al., 2017). Toutes ces méthodes très nouvelles sont en développement et des preuves de concept sont encore nécessaires, mais elles permettent déjà, dans différents cas, d’éviter un isolement guidé par l’activité pour accéder à des principes actifs. Dans nos travaux l’isolement des composés est de plus en plus guidé par la spectrométrie de masse, et l’activité est directement confirmée par des mesures sur des produits isolés.

I.4.2.3 Evolution des tests d’activité biologique

En parallèle à ces développements importants dans les sciences analytiques, différents tests d’activité biologique compatibles avec les faibles quantités analysées par les méthodes de profilage de métabolites ont été mis au point. Dans le cadre des recherches sur les produits naturels, il est important dans les premières étapes de la découverte de principes actifs de maintenir des tests si possible simples à appliquer et qui soient faisables à haut débit.

Si par le passé beaucoup de campagnes de découverte de médicaments se sont faites en criblant des extraits bruts avec des tests d’activité biologique établis, notamment des tests enzymatiques, il s’est avéré que la complexité des extraits était un facteur limitant résultant en un nombre significatif de faux positifs ou faux négatifs (David, Bruno et al., 2015). De plus en plus, les campagnes de criblage se font actuellement sur des extraits fractionnés à l’échelle analytique pour éviter au maximum les interférences. Avec ce type d’information, il devient plus aisé de mettre en évidence des composés bioactifs. Certains tests biologiques, notamment pour des activités antibiotiques, peuvent être aussi faits directement sur des composés séparés par profilage analytique et il est ainsi possible de localiser les pics chromatographiques actifs dans un chromatogramme HPLC. Ces informations sont clés pour décider d’isolements éventuels car elles permettent de lier directement l’activité biologique à la présence d’un pic chromatographique identifié par déréplication. Dans notre laboratoire, ce type d’approche nous a permis d’identifier rapidement un grand nombre de composés antifongiques (Favre-Godal et al., 2014).

D’autre part, le criblage d’extraits végétaux est bien adapté à des tests phénotypiques et dans ce cadre ces dernières années, les essais sur un modèle de poisson in vivo, le poisson-zèbre (Zebrafish Danio rerio) se sont multipliés (Crawford et al., 2008). En effet, les larves du poisson-zèbre permettent d’effectuer toutes sortes de tests dans des domaines très variés comme l’oncologie, la toxicologie, la tératologie ou la neurobiologie notamment. Ainsi, dans le cadre d’un programme de développement de médicaments, ce modèle permet aux chercheurs non seulement d’identifier des gènes qui sont impliqués

41 dans des maladies humaines mais également de développer de nouveaux agents thérapeutiques innovants. Le modèle est simple à mettre en œuvre et les expériences menées sur des larves de moins de 5 jours ne sont pas considérées comme des tests sur l’animal dans de nombreux pays européens.

Dans le cadre de nos recherches, nous avons par exemple utilisé ce modèle avec succès pour identifier des composés naturels anti-convulsant susceptibles d’être développés dans le cadre de médicaments antiépileptiques. Pour ce genre de tests, c’est le comportement de la larve du poisson soumise à un agent convulsant qui est suivie par vidéo et l’analyse des images permet de quantifier des mouvements. Une réduction significative des mouvements chez un poisson soumis à l’action d’un produit naturel indique un effet potentiellement intéressant, et ceci, avec des quantités de produit extrêmement réduites compatibles avec des profilages analytiques (Challal et al., 2014).

I.4.2.4 Biodisponibilité des produits naturels

Un autre aspect important pour non seulement évaluer l’efficacité d’un produit naturel qui peut devenir un candidat médicament, mais également d’avoir des éléments plus concrets sur les principes actifs d’un phyto-extrait est d’évaluer leur biodisponibilité. En effet, la très grande majorité des plantes médicinales sont consommées sous forme de décoctions, tisanes ou de phyto-médicaments contenant des extraits standardisés. Dans tous ces cas, les constituants de ces drogues végétales sont ingérés par voie orale et souvent sans formulation galénique. Ainsi, si classiquement les études en pharmacognosie se bornent à évaluer l’activité des produits naturels in vitro, il est nécessaire de comprendre si ces mêmes constituants ont la possibilité de se retrouver in vivo dans le compartiment sanguin pour produire leurs effets. De plus en plus, des études notamment menées sur l’animal en lien avec la médecine traditionnelle chinoise indiquent des taux plasmatiques pour certains composés. Toutefois, il est nécessaire de développer des modèles de perméation intestinale qui permettent de simuler le passage de ces barrières biologiques pour étudier la biodisponibilité des produits naturels. Dans ce cadre notre laboratoire a développé d’un côté des

42 méthodes de perméation in vitro sur le modèle PAMPA (perméation sur membrane artificielle) adapté à l’analyse d’extraits végétaux bruts. Cette technique permet de faire un criblage à large échelle de nombreux constituants pour déterminer leur perméation intestinale passive (Petit et al., 2016). Ce modèle ne tient donc pas compte, toutefois, de mécanisme de passage actif, et dans ce cadre, et en collaboration avec le groupe du Prof. Y. Kalia à l’Université de Genève, un modèle ex vivo permettant de mesurer la perméation sur des fragments d’intestin de porcs a été mis au point (Westerhout et al., 2014). Ce modèle permet de simuler une situation in vivo réelle et de déterminer la perméation d’un grand nombre de produits naturels directement dans les extraits.

Ce type de données va être évalué en parallèle aux données pharmacologiques obtenues pour les constituants des extraits et la combinaison de ces informations doit permettre d’obtenir des données factuelles pour mieux expliquer le mode d’action de certaines plantes médicinales et/ou phytopréparations (Allard et al., 2017).

I.4.2.5 Conclusion

En résumé les développements importants réalisés ces dernières années en métabolomique constituent un changement de paradigme dans notre façon de mener des investigations en pharmacognosie. Dans les années qui viennent, il deviendra de plus en plus facile et aisé d’obtenir des informations très détaillées sur la composition d’un extrait naturel un peu comme cela s’est fait en génomique. Ces informations chimiques pourront être corrélées avec toutes les données pharmacologiques déjà existantes pour des produits connus et pourront être complétées par des études ciblées menées sur des composés inconnus. Ces données très riches combinées avec des informations sur la biodisponibilité des constituants permettront de documenter de façon très détaillée l’usage de phytomédicaments et de soutenir des allégations de santé par une approche de médecine factuelle.

Contrôle de qualité des médicaments

Médicaments allopathiques

Le développement de médicaments par les industries pharmaceutiques et leur mise sur le marché sont soumis à des lois précises concernant les bonnes pratiques de laboratoires et de fabrication. Ainsi tous les médicaments développés doivent passer par des contrôles d’uniformités de teneur et de masse devant assurer la conformité du dosage déclaré sur les emballages. D’autres essais de technologie pharmaceutique doivent également montrer une bonne libération des principes actifs ainsi que leur biodisponibilité pour agir aux sites attendus (PhEur., 2014). Dans le cadre des maladies infectieuses, le contrôle de qualité des antibiotiques est primordial pour éviter toute non-conformité pouvant favoriser le développement des résistances et des échecs thérapeutiques. L’artémisinine, un antipaludéen majeur en fit les frais dès sa mise sur le marché et ainsi un durcissement sur le contrôle des antiinfectieux a été mis en place (Martino et al., 2010).

Avec le programme mondial Stop-TB, les médicaments sont mis à disposition gratuitement pour les pays en voie de développement et ceci depuis le début des années 2000 (WHO, 2017). Cependant la qualité de ces médicaments doit être impérativement évalués localement par les laboratoires nationaux de contrôle des médicaments. En 1988 l’assemblée de l’OMS a établi des recommandations pour renforcer le contrôle de qualité des médicaments et lutter contre les contrefaçons médicamenteuses (WHO, 1999). Ce renforcement a été soutenu par les laboratoires de recherches et les états concernés, en mettant en avant la responsabilité partagée entre instance politique, firmes pharmaceutiques, distributeurs, professionnels de santé, consommateurs et la population générale (WHO, 1999). Ce travail est un effort à plusieurs niveaux et nécessite une coopération internationale et régionale. Ainsi les autorités pharmaceutiques sont hautement concernées par la stratégie de l’OMS pour la prise en charge médicamenteuse de la tuberculose, et des monographies de la pharmacopée américaine (USP) présentent des méthodes analytiques pour évaluer ces uniformités de teneur (Nguyen et al., 2008).

La contrefaçon de médicament constitue un préjudice économique mais surtout une atteinte à la santé des populations. Elle peut concerner différentes parties du médicament à savoir la composition, la galénique, le dosage, l’étiquetage et l’emballage. Ainsi le développement de méthodes uniformisées est nécessaire pour avoir des médicaments de bonne qualité (Pecoul et al., 1999). Ainsi plusieurs acteurs se sont réunis pour faciliter le contrôle de qualité des médicaments en développant des approches complémentaires allant du financement à la capacitation technique des organismes concernés. Globalement le chiffre exact de médicaments contrefaits sur le marché n’est pas connu mais avoisine vraisemblablement 10% des remèdes selon l’OMS (Figure I.5). Ce phénomène se rencontre plus dans les pays en voie de développement où cette proportion peut atteindre 50% pour certaines spécialités (Martino et al., 2010). Une association nommée « fight the fakes », met en ligne des outils pour aider à la surveillance des contrefaçons. L’image ci-dessous résume très bien la problématique notamment l’impact des faux médicaments pour les maladies comme la malaria et la tuberculose.

Figure I.5 : Chiffre sur les faux médicaments dans le monde, tirée de www.fightthefakes.org

La lutte contre les médicaments contrefaits est complexe et fait intervenir plusieurs niveaux d’intervention, juridiques, économiques, toxicologiques, techniques, etc. D’un point de vue pragmatique, le contrôle de qualité des lots de médicaments importés ou envoyés dans les pays émergents est l’une des actions concrètes reconnue pour combattre ce fléau. Cependant ce contrôle de qualité n’est pas toujours établi pour diverses raisons, tels que : La disponibilité des substances de référence, la disponibilité puis le coût des instruments et des consommables et la maintenance des instruments analytiques. Une approche simple, robuste et économe est donc nécessaire pour pallier les limitations des techniques existantes. Cette approche constitue le cœur du travail de développement de méthode établi par les sciences analytiques à l’EPGL (Schappler et al., 2014).

La méthode analytique de référence utilisée pour le contrôle des médicaments est la chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Celle-ci est largement utilisée dans les laboratoires occidentaux mais présente ses limites lorsqu’elle doit être appliquée dans des pays en voie de développement. Cette méthode a la particularité de pouvoir être utilisée avec différents type de détection. On rencontre également la chromatographie sur couche mince (CCM) moins couteuse et d’autres méthodes colorimétriques et/ou spectrophotométriques qui sont plutôt qualitatives (Martino et al., 2010).

Les médicaments antituberculeux sont souvent constitués d’association de doses fixes d’antibiotiques rendant ainsi le contrôle analytique un peu plus complexe (Argekar et al., 1996). Les méthodes validées pour leur contrôle sont faites par CLHP (USP) et elles arrivent difficilement à faire une analyse simultanée des principales molécules présentes dans le RHZE. Ainsi il faut utiliser des méthodes diverses, avec des besoins importants en matériel analytique (Nguyen et al., 2008). Plusieurs développements de méthodes analytiques pour l’analyse combinée des molécules ont été faits ces 20 dernières années, notamment en diminuant le temps d’analyse avec la chromatographie liquide à ultra haute performance (UHPLC). Cette méthode permet une analyse d’un plus grand lot de médicaments avec des temps raisonnables, facilitant ainsi le contrôle d’une combinaison des 3 molécules RHZ. Cette méthode qui réduit le temps d’analyse de 15 min (méthode USP) à 2 min, pourrait être utilisée en routine dans des laboratoires ayant cette technologie à disposition (Nguyen et al., 2008). Plus

46 récemment la CLHP a été comparée à l’électrophorèse capillaire (CE) pour le dosage des doses fixes de 4 antibiotiques, et cette dernière s’avère équivalente et applicable pour le contrôle de qualité en routine (Marcellos et al., 2012).

L’électrophorèse capillaire (CE)

L’électrophorèse capillaire (CE) est une méthode d’analyse permettant la séparation, la détection et la quantification de composés organiques et inorganiques. Le principe de séparation est basé sur le rapport taille/charge des espèces chimiques ionisées soumis à un champ électrique. L’appareillage est constitué de deux récipients généralement, remplis d’une solution électrolyte tamponnée, dans lesquelles trempent les extrémités d'un tube capillaire (diamètre interne entre 25 et 75 μm) ainsi que deux électrodes de platine. Le mélange à analyser est injecté par pression dans le capillaire, puis une tension de plusieurs kilovolts est appliquée entre les deux électrodes. Le champ électrique ainsi créé induit permet le déplacement des molécules et la séparation de celles-ci. On peut alors détecter le passage des molécules à travers le capillaire à l’aide d’un détecteur UV. Lorsqu’une molécule passe, elle absorbe une certaine quantité de lumière et le détecteur transcrit cette information en un signal, visible sous forme de pic dans un électrophérogramme. La figure ci-dessous schématise le principe de l’électrophorèse capillaire (CE).

A) Dispositif de la CE B) Migration des p.a et électrophérogramme

Figure I.6 : Schéma du dispositif analytique pour l’électrophorèse capillaire (LCAP UNIGE)

C’est une méthode rapide et efficace. Cependant les appareils disponibles dans le commerce ont encore un certain coût et la technique analytique est mal connue et peu utilisée (Marini et al., 2010).

Ainsi est né l’ECB (Electrophorèse capillaire Budget) et le projet analytique qui l’accompagne (Figure I.7), grâce à une collaboration entre l’Ecole d’Ingénieurs de Fribourg, l’Université de Genève et la Pharmacie des Hôpitaux Universitaires de Genève. Cette collaboration a permis la mise au point d’un dispositif de contrôle de qualité simple basée sur une technologie peu coûteuse en terme de fabrication, de maintenance et d’utilisation.

L’appareil développé basé sur cette technique nécessite une quantité minimale de solvant et de petits volumes d’échantillon (de l’ordre du nanolitre), ce qui permet de consommer très peu de médicaments et de produits de référence (Marini et al., 2010). Cet instrument a été mis à disposition dans une dizaine de pays émergents dont le Sénégal pour le contrôle de qualité des médicaments essentiels. Cette initiative est actuellement portée par l’association Pharmelp (www.pharmelp.org).

Figure I.7: Présentation du projet Pharmelp, Source Site http://www.unige.ch/sciences/pharm (Mai 2010)

Le développement et la mise en place de cet outil a permis d’utiliser des méthodes validées (Sarr et al., 2016a; Sarr et al., 2016b) pour analyser un grand nombre de médicaments présents sur la liste des médicaments essentiels de l’OMS (Westenberger et al., 2005). Elle pourrait être également être appliquée au contrôle de qualité des extraits végétaux et phytomédicaments (Gotti, 2011).

L’électrophorèse capillaire pourrait ainsi permettre de déterminer la présence de principes actifs notamment les flavonoïdes dans Passiflora incarnata (Marchart et al., 2003), de substances toxiques et/ou d’impuretés dans différents extraits de plantes, par exemple : l’ acide aristolochique qui est néphrotoxique retrouvée dans des espèces d’Aristolochia acuminata, la colchicine dans les extraits de Colchicum officinale ou même la sanguinarine pour l’Argemone mexicana (Gotti, 2011).

Médecine traditionnelle et phytothérapie

Largement utilisée sur le continent africain les remèdes de la médecine traditionnelle sont très diversifiés du point de vue des espèces végétales utilisées mais aussi du point de vue des méthodes de préparations. Originellement, le savoir pour la cueillette des plantes et la préparation des remèdes était transmis d’anciens aux jeunes par la tradition orale. Mais surtout par l’intermédiaire des tradipraticiens formés dans les cercles de famille (Sofowora, 1982). Cette tradition est en voie de disparition, alors que l’usage des plantes médicinales continue à prendre de l’ampleur chez les populations en Afrique. Les drogues végétales sont retrouvées dans tous les marchés publics en Afrique et celles-ci sont vendue librement au marché de Dakar et des environs. Depuis la période coloniale, beaucoup d’auteurs ont répertoriés les savoirs de médecine traditionnelle et rédigés des pharmacopées afin de noter les usages les plus fréquents et les connaissances sur les plantes médicinales africaines notamment la pharmacopée sénégalaise traditionnelle de Kerharo alors professeur de pharmacognosie au Sénégal (Kerharo and Adam, 1974). Cependant il existe peu d’étude sur la qualité et l’innocuité des préparations à base de plantes bien que celles-ci sont largement utilisées. Il y’a donc un besoin urgent de documenter et de développer des méthodes d’analyse qualitative et quantitative des préparations à base de plantes.

Ces méthodes sont exigées pour plusieurs phytomédicaments utilisés en Europe selon les recommandations des agences nationales sur le médicament. Plusieurs recherches dans le développement de méthode de contrôle de qualité des plantes ont été mises en œuvre en Europe. Et ceci depuis l’avènement dans les années 90 de l’utilisation des préparations traditionnelles chinoises et indiennes mais aussi par l’utilisation importante de plantes médicinales dans les populations occidentales (Calixto, 2000). L’ampleur de cet usage des médecines complémentaires est démontrée par son impact sur le marché financier européen atteignant des chiffres d’environ ~6 milliards de dollars en 2008 (Ganzera, 2008). Les plantes médicinales et leurs extraits constituent des matrices complexes rassemblant une diversité en composés chimiques intéressante mais rendant la caractérisation de ceux-ci plus compliquée que l’analyse d’une molécule dans une formulation allopathique. Les phytomédicaments peuvent être constitués de mélanges d’extraits différents, et on dispose actuellement de données insuffisantes sur leur qualité et efficacité (Calixto, 2000). L’idée reçue que les médecines naturelles sont sans danger et dépourvues d’effets indésirables reste cependant fausse.

On parle ainsi de drogues végétales dans les différentes pharmacopées et elles englobent les parties de plantes cultivées ou sauvages pour usage thérapeutique.

Pour garantir leur qualité, des conditions appropriées de récolte, de culture, de séchage, de fragmentation et de conservation sont essentielles. Ces conditions assureront l’absence d’impuretés telles que des poussières, les contaminations animales, fongiques et par les insectes. Ainsi les drogues végétales et extraits sont soumis à un contrôle de qualité microbiologique pour éviter la contamination bactérienne du consommateur, pour les taux de résidus de métaux lourds (Plomb, Cadmium et Mercure), les résidus de pesticides et pour finir viennent les analyses qualitative et quantitative. Cette première analyse est primordiale avant tout développement d’extraits à usage thérapeutique (Folashade et al., 2012).

Les drogues végétales sont caractérisées le plus souvent par la présence de famille de substance chimique donnée. Par exemple les tanins et polyphénols totaux sont souvent exprimé en équivalents pyrogallol (PhEur., 2014), les flavonoïdes totaux exprimés en rutine (Wichtl, 2004), mais aussi en d’autres composés

50 caractéristiques de la plante. Cette détermination se fait souvent sur un extrait dont le rendement d’extraction est exprimé en DER (Drug extracted ratio) qui permet une première standardisation du mode d’extraction. Ensuite la détermination d’un principe actif ou composé important est mis en œuvre pour une évaluation quantitative. Actuellement dans la plupart des pharmacopées des méthodes de contrôle de qualité des plantes ou de phytomédicaments sont proposées et celles-ci sont largement basées sur la chromatographie liquide à haute performance(CLHP) (Ganzera, 2008; PhEur., 2014).

De nos jours les contrôles de qualité des phytomédicaments les plus utilisés au niveau mondial sont basées sur la CLHP et la CPG. On peut notamment citer les applications de la CLHP qui sont le dosage des gingkolides dans Gingko biloba, de l’hypericine et de l’hyperforine dans les extraits d’Hypericum perforatum. D’autres méthodes chromatographiques sont aussi proposées telles la chromatographie sur couche mince (CCM) qui arrive a caractérisé clairement les familles de composés par révélation UV ou par l’’usage de réactifs de sprayage spécifiques (WHO, 1991; Wichtl, 2004), la chromatographie gazeuse (CPG) pour l’analyse des huiles essentielles et végétales. LA CPG est largement utilisée et est la méthodologie de référence pour analyser les composés volatiles dans les huiles essentielles de Thym, de romarin et tant d’autres reconnue dans les pharmacopées internationales (Liang et al., 2004). Ces méthodes sont de plus en plus couplée à la spectrométrie de masse (MS) pour le « fingerprinting » des extraits mais aussi la détection des structures moléculaires et la quantification de principe actif (Liang et al., 2004). Des méthodes spectrales sont aussi bien utilisées pour la caractérisation d’extraits, notamment l’Infrarouge (IR) et la résonnance magnétique nucléaire (RMN). Ces méthodes viennent compléter les méthodes spectrales et permettent ainsi à l’aide d’outils de chimiométrie d’approfondir les analyses d’extraits compliqués ou la détermination de structures secondaires de molécules d’intérêt (Kwaambwa and Maikokera, 2008). Mais aussi récemment l’électrophorèse capillaire qui a montré son utilité pour les extraits végétaux (Ganzera and Krüger, 2014).L’analyse de substances naturelles par CE jusqu’à nos jours a fait preuve d’une grande efficacité de séparation notamment avec les produits polaires (dérivés phénoliques en particulier dans les

échantillons de vins) mais également de produits neutre par une approche micellaire de la CE (MEKC) et de produits moins polaire par une CE en milieux non aqueux (NACE) (Kapnissi-Christodoulou, 2012). Il est aujourd’hui nécessaire de trouver des méthodologies adaptées au contexte local africain ou l’impact économique est différent mais l’impact global sur la santé des populations serait optimal. Ainsi des exigences de robustesse, d’accessibilité, d’efficience de coût sont en prendre en compte lors de développement d’approche analytique (Folashade et al., 2012).

Conclusions

En résumé, la tuberculose reste une maladie infectieuse avec un impact social prononcé, et le développement des nouvelles résistances en fait une urgence de santé publique majeure. Le développement de stratégies, de nouvelles molécules et approches de lutte sont bien présents à travers l’OMS et End-TB. Des alternatives efficientes seraient bienvenues pour soutenir la prise en charge des patients

Ce premier chapitre a montré l’importance des plantes médicinales dans les différentes thérapies et ainsi aussi ouvert les différentes opportunités pour les étudier. Etant considéré comme des remèdes de premier recours leurs investigations présente un intérêt particulier pour améliorer l’accès à des traitements de qualité pour les populations en Afrique de l’Ouest.

L’identification des thérapies alternatives et le contrôle de qualité de ces préparations reste cependant primordiale afin de pouvoir les évaluer. Pour cela, l’ethnopharmacologie, la pharmacognosie et les analyses pharmaceutiques seront utilisés et appliqués dans le contexte de la tuberculose.

Dans la suite de ce travail, seront présentés les aspects de recherche développés lors de cette thèse en rapport avec la problématique présentée dans ce premier chapitre.

CHAPITRE II

ETHNOPHARMACOLOGIE ET TUBERCULOSE

Ethnopharmacologie et tuberculose

Enquête ethno pharmacologique sur l’usage des plantes médicinales lors de tuberculose pulmonaire au Sénégal

Ethnopharmacologie et pharmacologie inversée

L’ethnopharmacologie est une discipline de l’anthropologie qui étudie la relation entre l’Homme et les éléments de son entourage qu’il utilise pour des soins sanitaires. Le terme ethnopharmacologie serait équivalent ou utilisé au même titre que l’ethnomédecine et/ou l’ethnobotanique. Les enquêtes ethnopharmacologiques auprès des populations et des tradipraticiens peuvent fournir une riche source de données sur les plantes médicinales et les maladies pour lesquelles elles sont utilisées. Ces données peuvent guider le chercheur dans la sélection de plantes prometteuses pour le développement de nouveaux traitements. Le Sénégal en particulier et l’Afrique en général ont une riche tradition de pratiques en médecine traditionnelle (Pousset, 2006). Les tradipraticiens sont les experts pour l'utilisation des plantes médicinales et également des fournisseurs de soins de santé primaires aux populations rurales et urbaines (Sofowora, 1982). Dans les approches classiques de pharmacologie utilisées depuis le début du 20ème siècle il s’agit d’identifier des molécules pouvant être utiles dans le traitement d’une maladie. Pour cela on procède généralement un screening in vitro sur des cibles connues pour trouver des « Hit » ou principe actif important. C’est une approche très couteuse et qui peut durer de 10 à 15 ans avant d’arriver à une molécule leader à apporter dans les études cliniques. Ainsi on a assisté à l’avènement de l’industrie pharmaceutique qui a mise au point une belle panoplie de traitements contre la plupart des maladies infectieuses, non infectieuses et/ou chroniques (Khanna, 2012). Cependant l’accès aux médicaments industriels reste encore très restreint pour les populations dans les pays en voie de développement du fait de leur coût, d’où l’urgence de trouver des nouvelles approches pouvant réduire les prix des traitements ou améliorer les médecines traditionnelles déjà connues et largement utilisées (Patwardhan and Vaidya, 2010).

C’est dans ce contexte que la pharmacologie inversée est née en Inde, légérement différente dans le concept de la pharmacologie inverse utilisée en génomique (Takenaka, 2001).

La pharmacologie inversée est définie comme une science intégrant des réponses cliniques documentées et des observations sur le terrain (en pratique). Des explorations transdisciplinaires sont nécessaires pour développer les découvertes sous forme de nouvelles formulations ou remèdes avec l’appui solide d’essai précliniques et cliniques. Le but majeur étant d’aller de la « Clinique au laboratoire » au lieu du schéma classique, mais sans oublier que l’objectif majeur est la sécurité et l’efficacité pour les patients (Patwardhan and Vaidya, 2010).

Certaines approches de la pharmacologie inversée sont intéressantes et peuvent permettre une réduction du temps et du coût du développement de traitements validés scientifiquement. Le résultat du traitement, étudié de manière rétrospective, peut apporter une information essentielle à partir des habitudes thérapeutiques de la population (Patwardhan and Vaidya, 2010; Willcox et al., 2011). Conformément à l'exigence du Protocole de Nagoya sur l'accès aux ressources génétiques, les connaissances sur les plantes doivent être étudiées et diffusées en tenant compte des détenteurs de savoirs traditionnels, suivant les normes de du droit de la propriété intellectuelle (Roa et al., 2016).

Selon l’OMS, Quatre-vingt pour cent (80%) de la population en Afrique a utilisé la médecine traditionnelle comme premier recours pour le traitement des affections courantes et parfois ces médicaments sont combinés avec la médecine moderne (Sofowora, 1982). Dans les enquêtes de population et auprès des tradipraticiens, de nombreuses plantes sont déclarées utiles pour traiter les symptômes de la tuberculose et sont utilisées. Certaines études ont analysé l’activité inhibitrice des produits naturels sur la croissance mycobactérienne (Bunalema et al., 2014; Green et al., 2010). Dans le contexte actuel de diffusion spectaculaire des souches résistantes aux antibiotiques, il est urgent de trouver de nouvelles solutions thérapeutiques. Les études ethnopharmacologiques apportent de nouveaux espoirs de traitement de la tuberculose, par de nouveaux médicaments ou par des solutions alternatives (Calver et al., 2010).

Enquêtes plantes/tuberculose et protocoles

Dans le cadre de ce travail, une enquête a été menée afin de comprendre s’il y’a effectivement un large usage des plantes médicinales par les patients lors de premiers symptômes de la Tuberculose. Nous nous sommes également intéressés à la prise concomitante de traitements modernes et traditionnels.

Des protocoles d’enquêtes ont été rédigés en suivant les recommandations pour des entretiens semi-structurés auprès d’ informateurs (patients et tradipraticiens sur le terrain), selon les manuels de (Martin, 1995) et (Maundu, 1995). Des fiches adaptées à la situation de la tuberculose ont été rédigées et utilisées pour recueillir les données ethno médicinales (Annexe 1 et 2).

Les questionnaires et protocoles ont été soumis pour validation aux autorités sanitaires au Sénégal avant utilisation (Annexe 3). De mars à mai 2014, une enquête ethnopharmacologique a été conduite dans 4 régions du Sénégal. Cent vingt (120) patients diagnostiqués pour une tuberculose déclarée et trente (30) guérisseurs traditionnels ont été interrogés sur leur utilisation de plantes médicinales pour traiter les symptômes courants de la tuberculose (toux, fièvre, sueurs nocturnes, perte de poids, expectorations sanglantes, etc.)(WHO, 2016).

Cette présente enquête a démontré que la plupart des patients n'utilisent pas de manière concomitante des plantes et des médicaments antituberculeux (~ 90% des informateurs) mais que la plupart sont traités avec des plantes médicinales avant d'être admis à l'hôpital (41%).

Une trentaine de plantes ont été citées pour soigner les symptômes de la tuberculose, les familles de plantes médicinales les plus citées étaient les Combretaceae, Euphorbiaceae et les Fabaceae. Une corrélation entre les plantes citées par les guérisseurs et les patients n'a pas été possible en raison de la diversité des herbes citées et le type de mélange utilisé. Guiera senegalensis est la plante la plus citée.

Collecte de plantes médicinales

L’identité des plantes indiquées par les informateurs a été établie d’abord à partir de la dénomination locale et de sa description etc). Les plantes ont été collectées et séchés sur place selon les bonnes pratiques de collecte qui évitent toute dénaturation ou contamination. Nous avons sélectionné douze (12) plantes médicinales parmi les plus citées au Sénégal. Cette sélection s’est basée sur le nombre de citation pour chaque espèce et sur le niveau de fidélité(FL). Le niveau de fidélité (FL) est le pourcentage d'informateurs affirmant l'utilisation d'une espèce végétale donnée pour le même but principal ; il a été calculé pour la Tuberculose comme suit: FL (%) = (Np / N) × 100 (Alexiades and Sheldon, 1996) où Np est le nombre d'informateurs qui déclarent l'utilisation d'une espèce de plante pour traiter les symptômes de la tuberculose maladie et N le nombre total d'informateurs qui utilisent les plantes comme remède antituberculeux. Les plantes ont été identifiées par l’équipe du Dr Matthieu Gueye à l'Herbarium de l'IFAN (Institut français d’Afrique Noire) -Université de Dakar.

Etude de l’activité biologique des plantes médicinales contre les mycobactéries à l’aide d’un modèle hôte- pathogène (Amibe - Mycobactérie)

Essais biologiques d’étude d’activité antimycobactérienne

La recherche de nouveaux médicaments antituberculeux prend de plus en plus de l’ampleur depuis le développement des résistances extensives à tous les antituberculeux à disposition. Dans la découverte des médicaments, il y’a une série de tests à effectuer avant de passer à des phases précliniques et aussi chez l’humain. Une pléthore de systèmes et de conditions de criblage sont utilisées pour étudier l'effet des médicaments candidats sur la croissance de M. tuberculosis, ce qui rend difficile la comparaison des données d'un laboratoire à un autre. Parmi les systèmes utilisés, le plus classique est l’antibiogramme, qui évalue l’activité d’une molécule sur la cible Mycobacterium tuberculosis isolée à partir de patients ou de bibliothèques biologiques.

Une revue générale parue dans Tuberculosis a étudié les différents modèles, certains essais in vitro et modèles d'efficacité chez la souris(in vivo) ont été réévalués et des recommandations ont été fournies sur la base des résultats obtenus (Franzblau et al., 2012).

Un caractère spécifique de l’infection à M. tuberculosis est le fait que les mycobactéries sont typiquement d'abord ingérées par les macrophages dans les poumons et, après dissémination, des structures de type granulome sont retrouvées dans d'autres organes. Avec une telle protection des agents infectieux au sein d’autres cellules et dans des granulomes,, la plupart des candidats médicaments retenus comme antibiotiques potentiels dans les tests d’antibiogramme se révélaient inefficaces contre l'infection proprement dite chez l’humain (Franzblau et al., 2012).

Malgré de multiples efforts récents, la majorité des découvertes par le criblage basé sur des cibles traditionnelles ont montré une faible efficacité in vivo. Par conséquent, il y a une augmentation de la demande pour des approches à base de cellules entières utilisant directement les systèmes hôte-pathogène(Kicka et al., 2014). Ainsi pour l’étude de nos extraits de plantes, nous avons pu collaborer avec une équipe <> à l’Université de Genève qui ont mis au point un modèle hôte-pathogène phénotypique, présenté ci-dessous.

Modèle hôte-pathogène Mycobacterium marinum - Acanthamoeba castellanii

M. tuberculosis est connue comme une bactérie à croissance lente (temps de doublement de 24 heures), comparée à M. marinum qui se divise toutes les 8 heures. Cette dernière montre des similarités avec Mtb et présente des caractéristiques favorables pour un usage en infection cellulaire expérimentale. Elle est aussi moins dangereuse pour la manipulation humaine.

L'amibe libre, Acanthamoeba castellanii est utilisée comme receveur ou hôte cellulaire pour étudier la croissance intracellulaire de M. marinum.

Ce modèle a été validé en screening de la base de données de plusieurs antibiotiques (Kicka et al., 2014) et a été choisi ici, après adaptation pour les extraits aqueux de plantes médicinales.

Avec ce test il est possible d’effectuer deux essais successifs dont le premier est nommé test d’activité antibiotique et le second est essai antiinfectieux (Figure II.1).

II.2.2.1 Test d'activité antibiotique

105 UFC (unités formatrices de colonies) de M. marinum exprimant de la lumière ont été transférées dans chaque puits de plaques à 96 puits. La croissance bactérienne à 25 ° C a été surveillée en mesurant la luminescence dans un dispositif de lecture de plaques (Synergy H1, Biotek®) pendant 72 heures avec une mesure ponctuelle toutes les 30 minutes.

II.2.2.2 Test antiinfectieux avec A. castellanii

Les cellules d’Acanthamoeba castellanii ont été cultivées en milieu PYG (Peptone Yeast Glucose) dans des boîtes de Pétri de 10 cm à 25 °C, pour atteindre 90% de confluence. M. marinum a été cultivé dans une culture agitée à 32 ° C jusqu'à une

DO600 de 0,8-1 dans du milieu 7H9. Les mycobactéries ont été centrifugées sur une monocouche de cellules Acanthamoeba à une MOI (Multiplicité de l’infection) de 10 pour favoriser une absorption efficace et synchrone. La centrifugation a été effectuée à TA à 500 g pendant deux périodes de 10 min. Après une incubation supplémentaire de 20 à 30 minutes, les bactéries non digérées ont été lavées avec du PYG et les cellules infectées ont été remises en suspension dans du PYG contenant 10 uM d'amikacine (Pubchem CID 37768) pour éviter la croissance extracellulaire de M. marinum. Ainsi, 5 x 104 cellules infectées sont transférées dans chaque puit d'une plaque à 96 puits (plaque de culture tissulaire, fond transparent noir de Falcon®) avec des extraits pré-remplis, des médicaments de référence et des témoins. L'évolution de l'infection à 25 ° C a été surveillée en mesurant la fluorescence dans un lecteur de plaques (Synergy H1, BioTek®)

59 pendant 72 heures avec des points de temps pris toutes les 3 heures. Les images sont prises par un lecteur d'imagerie Cytation, BioTek®.

Figure II.1 : Essai hôte-pathogène adapté de (Kicka et al., 2014). A) Essai d'activité antibiotique (M. marinum) - B) Essai antiinfectieux avec Acanthamoeba castellanii. L'évolution de l'infection à 25 ° C est surveillée en mesurant la luminescence et la fluorescence dans un lecteur de plaques (Synergy H1, BioTek®) pendant 72 heures avec des mesures prises toutes les 30 minutes ou 3 heures. Les unités relatives de luminescence (RLU) et de fluorescence (RFU) sont ainsi enregistrées.

Détermination des IC50 des extraits de plantes

Ces différentes approches combinées ont permis de déterminer les extraits les plus actifs étant ceux de Combretum aculeatum et de Guiera senegalensis puis à la suite de calculer les concentrations actives. Les IC50 déterminées (n = 3) pour ces deux extraits étaient respectivement de 220 ± 20 µg / ml pour C. aculeatum et de 410 ± 80 µg / ml pour G. senegalensis, tandis que la rifampicine, le témoin positif présentait une IC50 de 0,4 ± 0,03 µg / ml. En ce qui concerne les courbes, nous n'avons pas pu utiliser une concentration supérieure à 0,8 mg / ml en raison des limites de solubilité des extraits. Ce test antibiotique préliminaire nous a permis de sélectionner ces deux extraits aqueux pour un autre essai anti-infectieux pour guérir les cellules d'amibes des souches de M. marinum. Ces derniers ont révélé pour les extraits de G. senegalensis et de C. aculeatum des valeurs intéressantes

60 d'IC50 (n = 3) de 98 ± 9 µg /ml et de 74 ± 6 µg /ml, respectivement, par rapport

à une IC50 de 7 ± 0.4 µg / ml pour la rifampicine (article publié).

L’IC50 de la rifampicine est plus élevée dans le test d'infection des amibes que dans le test d’activité antibiotique, ce qui est dû à la faible disponibilité des composés à l'intérieur des cellules amibiennes.

En revanche, les IC50 anti-infectieux pour les deux extraits actifs étaient plus faibles que leurs activités antibiotiques. Fait intéressant, certains extraits de plantes ont déjà été signalés comme exerçant un effet inhibiteur sur les bactéries et les pompes (Garvey et al., 2011), ce qui pourrait indiquer une explication de la potentialisation des deux extraits dans le test d'infection à base de cellules entières.

Conclusions

D’autre part, parmi les extraits aqueux testés, deux extraits (Combretum aculeatum (Combretaceae) et Guiera senegalensis (Combretaceae)) recueillis dans le cadre de cette enquête démontrent des activités antimycobactériennes sur le test hôte-pathogène à base de cellules entières. Les deux extraits ont montré des activités significatives dans un essai intracellulaire et extracellulaire sur la croissance de M. marinum présentant des IC50 inférieure à 0,5 mg / ml par rapport

à la rifampicine (IC50 de 0,4 et 7 μg / ml). Des investigations supplémentaires seraient nécessaires afin d’établir un lien entre ces activités et la présence de certains composés dans ces extraits.

Ci-dessous, l’article publié dans journal of Ethnopharmacology(Diop et al., 2017a) avec le détail de la partie d’enquête et d’investigation d’activité antimycobactérienne des extraits

Survey on medicinal plants traditionally used in Senegal for the treatment of tuberculosis (TB) and assessment of their antimycobacterial activity

a,c a b ElHadji Assane Diop , Emerson Ferreira Queiroz , Sébastien Kicka , Serge a c b a Rudaz , Tahir Diop , Thierry Soldati , Jean-Luc Wolfender a School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, University of b Lausanne, CMU – Rue Michel Servet 1, 1211 Geneva 11, Switzerland Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of Geneva, Quai Ansermet 30, Geneva 4, Switzerland c Biology Department, University Cheikh Anta Diop, Dakar, Senegal

Publication parue en décembre 2017 dans « Journal of Ethnopharmacology ». Contribution personnelle dans le choix du sujet, l’écriture des protocoles d’enquête, les entretiens, les essais biologiques et la rédaction de l’article

Keywords: Tuberculosis – Senegal - Medicinal plants - TB Drugs - Mycobacterium marinum host-pathogen assay

Abstract

Ethnopharmacological relevance: In West Africa, populations are used to taking traditional medicine as a first aid against common health problems. In this aspect, many plants are claimed to be effective in the treatment of Tuberculosis (TB), which according to the World Health Organization (WHO) remains one of the world’s deadliest communicable diseases. Aim of the study: The main aim of this study was to identify plants used to treat TB-symptoms by the population of Senegal and to evaluate their possible concomitant use with clinically approved TB-drugs. This approach allowed the selection of plants used in traditional medicine. In order to verify if the usage of some of these plants can be rationalized, the activity of their traditional preparations was assessed with both an intracellular and extracellular antimycobacterial host-pathogen assays. Materials and methods: An ethnopharmacological survey conducted on 117 TB- patients and 30 healers in Senegal from March to May 2014. The questionnaires were focused on the use of medicinal plants to treat common TB-symptoms (cough longer than 2 weeks, fever, night sweats, weight loss and bloody sputum). Local plant names, utilized organs (herbal drugs) and traditional formulations of the plants were recorded. Extracts were prepared by mimicking the traditional decoction in boiling water and screened for their antimycobacterial activity using Mycobacterium marinum, as a validated TB surrogate, and an Acanthamoeba castellanii - M. marinum whole-cell based host-pathogen assay, to detect anti- infective activities. Results: By the end of the survey, nearly 30 plants were cited and the 12 most cited herbal drugs were collected and their usage documented by extensive literature search. Extracts of the chosen herbs were screened with the described assays; with a main focus on traditional formulas (mainly herbal decoctions). Two of the water extracts from Combretum aculeatum and Guiera senegalensis showed significant antimycobacterial activities when compared to the positive control drug (rifampin). These extracts showed no observable toxicity against amoeba host cells (Acanthamoeba castellanii). Conclusions: This study demonstrates that most of the patients do not concomitantly use plants and TB drugs (~90% of informants) but, instead, most are treated with medicinal plants before they are admitted to a hospital (41%).

Interestingly, among the aqueous extracts assayed, two extracts (Combretum aculeatum (Combretaceae) and Guiera senegalensis (Combretaceae)) collected within this survey demonstrate antimycobacterial activities on the validated whole- cell based host-pathogen assay. Both extracts showed signiﬁcant activities against intracellular and extracellular -M. marinum growth presenting IC50 lower than 0.5 mg/ml compared to the reference drug Rifampin (IC50 of 0.4 and 7 µg/ml). No toxicity was observed for amoebae cells at concentration until 0.8 mg/ml.

Introduction

Tuberculosis (TB) is an infectious bacterial disease caused by Mycobacterium tuberculosis that most commonly affects the lungs. The disease is spread when TB infected patients cough and expel Mycobacteria. According to the WHO, TB remains one of the world’s deadliest communicable diseases. In 2014, it was estimated that 9.6 million people developed TB and 1.5 million died from the disease, 400,000 of whom were HIV-positive. TB cases in Africa represent 28% of the world TB burden and the death related rate of patients in Africa is approximately 34%. It is estimated that approximately 50% of the African population are latent carriers of TB, where this rate is approximately 30% in the worldwide population (Frothingham et al., 2005; WHO, 2015). About 10% of infected people will develop clinical Pulmonary TB disease due to immunosuppression as a result of HIV infection or as a result of a weakened immune system (low-and middle-income populations) (Chaisson and Martinson, 2008). TB is a curable disease; the first line treatment consists in a 6 months rifampicin based-regimen with a combination of 4 antibiotic drugs: Rifampin, Isoniazid, Pyrazinamide and Ethambutol (RIPE) in two phases. 'The treatment of TB has become increasingly difficult due to a limited clinical benefit achieved with this standard of care due to the emergence of an increasing number of multiple drug resistant M. tuberculosis (MDR-TB) strains, as well as an increase in the prevalence of HIV/AIDS. The hallmarks of human M. tuberculosis infection are the ingestion phase of mycobacteria by alveolar macrophages and the latent period of TB- infection(Chaisson and Martinson, 2008). Thus TB has become one of the deadliest global health emergencies. From the previously treated TB cases in 2014, 16%

64 were MDR-TB in Senegal (Simon J. Holton et al., 2007). Serious side effects of TB drugs are not frequent but, in some cases, treatment can be highly hepatotoxic. Hepatotoxicity associated symptoms can result in the interruption of therapy or affect the patient's adherence to it, which can limit the efficacy of the antitubercular treatment (Senousy et al., 2010; Yee et al., 2003). Eighty percent of the population in Africa takes traditional medicine as a first aid for treating affections. Since one of the main symptoms of pulmonary TB is a cough that last longer than 2 weeks, many medicinal plants, or plant mixtures, are traditionally used for pulmonary ailments and are claimed to have antitussive properties. Moreover, in general many of these traditional treatments are also combined with modern drugs in order to increase efficacy and alleviate other disease symptoms (Farnsworth et al., 1985). In the specific context of TB, a survey of plants used by healers and patients was performed in Senegal with the aim of assessing the usage of a plant or herbal mixtures for TB ailments and the possible concomitant use of plant and drugs. The traditional treatments were carefully evaluated (herbal drug, traditional formulation, posology and treatment duration). The frequency of usage of some of these preparations was assessed either as a first-line remedy for pulmonary ailments, which may potentially have an activity against TB or act as adjuvant treatment of TB symptoms. In addition, the antimycobacterial activity of extracts mimicking the traditional preparation was systematically assessed.

Materials and methods

II.3.3.1 Study area

In Senegal, the prevalence of pulmonary and extra pulmonary TB is about 1.5/1000 inhabitants with a case detection rate of 66%. In 2014, there were approximately 13,500 new TB cases and relapse patients, and treatment with the current clinical regimen resulted in approximately 87% treatment success (WHO, 2016). The current study was conducted in three regions of Senegal from March to June of 2014. The capital, Dakar, was the most concerned region due to its high population density and number of inhabitants.

The cities of Saint Louis and Kaﬀrine were chosen to provide additional data from the North and the central regions of the country. The patients’ surveys were performed at the health centers where patients came daily to receive TB-drugs from WHO Directly Observed Therapy strategy (DOTs). Traditional healers were interviewed mostly in Dakar. Among the traditional healers (30) some of them were herbalists (8) in markets and the others are recognized healers (22). The protocols were reviewed by the University Cheikh Anta Diop, Dakar/ Senegal and submitted to the medical authorities. Authorizations for running the interviews were given by the medical region supervisors of medical centers in Dakar, Kaﬀrine and Saint-Louis (N°101RMD/MSAS).

II.3.3.2 Interviews with TB diagnosed patients

According to the WHO DOT Strategy TB, diagnosed patients in the intensive treatment phase had to go every morning to the treatment centers. This was a good opportunity to perform this survey with patients taking TB drugs. TB patients were submitted to face-to-face interviews systematically following a questionnaire (Annex A). A key aspect of the questionnaire was to enquire whether patients did use traditional medicine (herbal drug, traditional formulation, posology and treatment duration). The informants in the study were requested to indicate the local name of the plants used for treatment. In order to be perfectly understandable by all participants, interviews were conducted in ‘Wolof”, the local language in Senegal. Other informations related to the disease occurrence, the patient’s health status, the allopathic TB treatment and the geographic origin of the patient were also gathered. Observed side eﬀects of drugs, compliance or concomitant usage of allopathic medication and herbal drugs were also assessed. 117 TB diagnosed patients were interviewed on their use of medicinal plants to treat common pulmonary TB symptoms (cough longer than 1 month, fever, night sweats, weight loss, and bloody sputum). Mean age of the respondents was 31 years (in 12–63 years range) with 23% of female and 77% of male.

II.3.3.3 Interviews with traditional healers

A questionnaire was specifically prepared for traditional healers and medicinal herb sellers and interviews were conducted in the same way as for the patients (Annex B). More specifically, in regards to the healers, they were asked to indicate if they are familiar with TB and its associated symptoms, as described for patients, and if they had to treat such disease. Moreover, the questionnaire drew attention to their ability to treat symptoms of pulmonary TB with traditional herbal preparations and the resulting effects.

II.3.3.4 Data analysis

Outcomes of this descriptive survey are presented according to the informants’ characteristics, drug treatment type and association, use of medicinal plants and evaluation of the therapies. The ﬁdelity level (FL), the percentage of informants claiming to use a given plant species for TB symptoms, was calculated as: FL (%) = (Np / N) × 100 (Alexiades and Sheldon, 1996); where Np is the number of informants who claim to use a given plant species to treat the described TB symptoms and N corresponds to the number of informants who use plants as a medicine to treat TB symptoms. The most relevant FL values were used to select plants that were collected and extracted according to the traditional preparation formula (water decoction) to assess their antimycobacterial activities.

II.3.3.5 Plant material

The selected plants parts used by patients and traditional healers were collected in regions of Kaﬀrine (Lat. N 14° 20' 47.9328'' Long. W 15° 13' 10.1316''), Fandène (Lat. N 14° 48' 0'' ''Long. W 16° 52' 0.0006'') and Dakar (Lat. N 14° 45' 51.84'' Long. W 17° 21' 50.0544'') in Senegal (May and June 2014). These plants were collected based on their local names, according to the “Pharmacopée sénégalaise traditionnelle” (Kerharo and Adam, 1974), and their botanical identiﬁcation were

67 conﬁrmed by Dr. Matthieu Gueye & team at the IFAN, Herbarium, University Cheikh Anta Diop of Dakar. The plant collection was performed after obtaining signatures of a material transfer agreement (MTA) between University of Dakar and University of Geneva. The collected material was correctly packed and presented to the customs in Senegal and brought to Geneva for further analysis and study. Voucher specimen for Guiera senegalensis (N°G00431526) and Combretum aculeatum (N°G00431528) have been deposited at the Herbarium of the Conservatoire des Jardins Botaniques de la Ville de Genève, Genève, Switzerland.

II.3.3.6 Plant extractions

The plants were extracted according to the traditional preparation formula that corresponds to a simple decoction in water (30 min in boiling water). Extracts were ﬁltrated and lyophilized. The drug extracted ratio (DER) (Wichtl, 2004) was determined for each extract and stated for extracts studied in this paper.

II.3.3.7 Host-pathogen assay on Mycobacterium marinum

M. marinum is a relatively fast growing bacterium (8 h doubling time) compared to M. tuberculosis which divides every 24 h, while sharing cellular infection hallmarks and being less dangerous for human manipulation. The free-living amoeba, Acanthamoeba castellanii, is used as cellular recipient to promote M. marinum intracellular growth (Kicka et al., 2014).

Mycobacteria and amoebae cells cultures

Acanthamoeba castellanii (ATCC 30234) was grown in peptone yeast glucose (PYG) medium at 25 °C as previously described (Moffat and Tompkins, 1992) using proteose peptone (Becton Dickinson Biosciences) and yeast extract (Difco)). The M. marinum M-strain (wildtype) was cultured in Middlebrook 7H9 (Difco) supplemented with 10% OADC (Becton Dickinson), 5% glycerol and 0.2% Tween80 (Sigma Aldrich) at 32 °C in shaking culture. M. marinum and the msp12::GFP plasmid were gifts by Dr. L. Ramakrishnan (Washington University, Seattle, USA).

The M. marinum strain expressing GFP in a constitutive manner was obtained by transformation with msp12::GFP, and cultivated in the presence of 20 µg/ml kanamycin (Pubchem CID 6032), as previously described (Kicka et al., 2014).

Antibiotic activity assay

The M. marinum strain constitutively expressing the bacterial luciferase reporter from the pMV306-lux plasmid (Arafah et al., 2013) has been described previously (Arafah et al., 2013) and the assay to monitor in vitro growth performed as follows.

5 Brieﬂy, 10 LUX-expressing M. marinum were transferred to each well of 96-well plates. Bacterial growth at 25 °C was monitored by measuring the luminescence in a platereader (Synergy H1, Biotek®) for 72 h with a time point taken every 30 min.

Acanthamoeba infection assay

A. castellanii were cultured in PYG medium in 10 cm Petri dishes at 25 °C to reach 90% confluency. M. marinum were cultivated in a shaking culture at 32 °C to an OD 600 of 0.8–1 in 7H9 medium. Mycobacteria were centrifuged onto a monolayer of A. castellanii cells at a multiplicity of infection (MOI) of 10 to promote efficient and synchronous mycobacterial phagocytosis. Centrifugation was performed at RT at 500 g for two periods of 10 min. After additional 20–30 min incubation, uningested bacteria were washed off with PYG and infected cells resuspended in PYG containing 10 μM amikacin (Pubchem CID 37768) to avoid extracellular M.

4 marinum growth. 5 × 10 infected cells were transferred to each well of a 96-well plate (Tissue Culture Treated Plate, black, transparent bottom from Falcon®) with preplated extracts, reference drugs and controls. The course of infection at 25 °C was monitored by measuring ﬂuorescence in a plate reader (Synergy H1, BioTek®) for 72 h with time points taken every 3 h. Images -taken by a-Cytation imaging reader, BioTek®.

II.3.3.8 Evaluation of the antimycobacterial activity and

determination of extracts IC50

Lyophilized aqueous extracts were dissolved in puriﬁed water to obtain aqueous solution at concentration 10 mg/ml. Volumes of ex-tracts from 1 µl to 8 µl were added in wells containing 200 µl mycobacterial suspension in 7H9 broth. For the extracts the higher concentration used were 0.8 mg/ml because of the lack of solubility above this concentration limit. Water and DMSO were used as blank by adding in wells 4 and 8 µl of puriﬁed water or 2 µl of DMSO.

A half inhibitory concentration IC50 was evaluated according to Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; formerly NCCLS) procedures (Barry et al.,

1999). The IC50 corresponded to the lowest extract solution concentration inhibiting 50% of observable mycobacterial growth (intracellular or extracellular). That was the concentration effecting a reduction in growth at the end of the incubation period (3 days) relative to untreated controls. Readouts are either ﬂuorescence or luminescence, depending on the expressing M. marinum strain. The differences (ΔRFU or ΔRLU) were determined between each infection point and the endpoint of incubation at 72 h. All experiments were performed three times to ensure the reproducibility of results. A standard stock solution of Rifampin (Pubchem CID 6913622) at 25 mg/ml (~30 µM) was used as the positive control. DMSO at concentration of 1% and water at 4% were used as negative controls. Results were expressed in graphs showing the growth kinetics of M. marinum in presence of extracts compared to the negative control H2O and dose–response curves were constructed for the determination of IC50 values. IC50 values were generated from the results of four serial dilutions of extracts. The mean of RFU/RLU diﬀerence at endpoint between negative control and assayed extract or rifampin was used to plot curves. With these experimental conditions, the cellular toxicity (for the infection assay) could be evaluated – the integrity of A. castellanii cells- observed on the Cytation® microscopic images at 72 h post infection. An explicit scheme of – both assays – is provided Figure II.1

II.3.3.9 Statistical analysis

The Z factor was calculated for each experiment to ensure that the response of luminescence or ﬂuorescence was representative for our assays. The Z factor was calculated using the mean and standard deviation of both positive (Rifampin) and negative (DMSO/H2O) controls at (mp, σp and mn, σn). The following formula was applied: Z-factor = 1–3(σp+ σn)/|mp-mn|(Zhang et al., 1999). Experiments with Z factor higher than 0.6 were considered and used for the evaluation of the antimycobacterial activity.

Results and discussion

II.3.4.1 Survey outcome

The survey of patients was performed on 117 TB diagnosed in health center of 3 regions of Senegal (Figure II.2B). All these patients were under WHO DOTs strategy and received conventional TB drugs. Interviewed patients were classified according to their drug regimen (Figure II2A). Seventy-four percent of them received their first TB treatment, 15% of these patients had a relapse of TB and 8% of retreatment after treatment failure that was due to non-compliance. The standard treatment was a combination of Rifampin, Isoniazid, Pyrazinamide and Ethambutol (RIPE) at the intensive phase for two months and Rifampin, Isoniazid (RI) for the continuum phase of four months. Streptomycin was added to RIPE for the relapse cases. Among all patients, 5 cases of multi-drug resistant TB (MDR-TB) were observed (3%). These patients received a special treatment (including drugs such levofloxacin, kanamycin or para amino salicylic acid).

Thirty-six percent of patients observed an improvement (cough and chest pain reduction, bloody sputum disappear) regarding their health status based on their symptoms at the beginning of the classic TB treatment and 32% were stationary (no amelioration observed). For the rest of the patients (32%), their cough remained during treatment and sometimes until the end of the treatment.

For this reason, patients were motivated to initiate an herbal drug treatment in order to eliminate the cough. Patients were also monitored for bacteremia (by collection of sputum every month) by medical doctors; however this data was not assessed in this study.

Figure II.2. Survey information and outcomes, including type of the informants and use of medicinal plants. Geographical map of Senegal showing the areas of study and informants distribution in the survey

This cohort of 117 TB diagnosed patients were systemically interviewed to enquire about the usage of plant or herbal mixtures for TB ailments and the possible concomitant use of plant and drugs (Annex 1). On the other hand, 30 healers from diﬀerent regions of Senegal were also interviewed for their prescriptions of herbal drugs to treat TB symptoms (Annexe 2).

Compilation of both survey results reveal the utilization of 30 different herbal drugs for treating TB symptoms such as persistent cough associated with chest pain, loss of appetite or night sweating. The most common preparations of these plants were decoctions in boiling water during 30 min in rare cases macerations or infusions were reported. From herbal drugs, the most cited were selected and 12 herbal drugs were collected for further analysis and pharmacognosy purpose (Table II.1). The other cited plant parts were not collected but documented regarding their traditional use in Table II.2. Among all patients interviewed only 41% indicated that they have used traditional herbal preparations while the rest claimed that they never took herbal preparations in relation with their pulmonary disease (Fig. II.2C).

For patients using traditional remedies, most herbal treatment usage was recorded before the formal TB diagnostic. Half of these patients received mixtures of herbs. The other half received diﬀerent single herbal drugs (dried plant parts) that they had to combine by themselves. All these patients were able to indicate the name of the prescribed herbal drugs. In 6% of all cases, the mixtures consisted of a commercialized micronized powder without information on the composition. After initiation of the TB treatment, the concomitant usage of traditional remedies was only rarely mentioned (6% of all patients). Consumption of herbal remedies occurred most frequently before TB treatment.

Healers in most cases prescribed in general either ready-to-use mixtures of herbs or sets of herbal drugs (Figure II.2D) that have to be used in combination to treat TB symptoms. Very rarely only a single herbal drug was recommended. Herbal drugs were selectively selected according to symptoms described by each patient for example Guiera senegalensis was systematically used for treating cough before and after the TB treatment; Combretum aculeatum is documented to increase appetite and against bleeding (Kerharo and Adam, 1974).

More than a quarter of healers conﬁrmed that they sent patients with complicated TB symptoms to the health centers. However, contrary to the patient survey that reveals 6% of concomitant usage of TB drugs and traditional preparations, healers pretended to frequently give traditional medicine as a support to TB treatment or as follow up treatment.

Answers of all interviews were compiled to identify the most commonly used plants based on their ﬁdelity levels (FL). The most encountered medicinal plant families were Combretaceae (> 21% of use-reports), Euphorbiaceae (> 17%), and Fabaceae (> 8%). Correlation between cited plants from healers and patients was not possible due to the diversity of herbs cited and the type of mixtures used. Among the 30 cited plants, the most frequent herbal drug was the aerial parts of Guiera senegalensis used by all informants (ﬁdelity level of 38%). Twelve medicinal plants were selected based on an in depth litterature search of their reported usage related to TB symptoms and harvested in Senegal. They were all documented in the African pharmacopeias focused on west African countries(Eklu- Natey, R.D. et al., 2012; Kerharo and Adam, 1974). Their traditional use and composition are summarized (Table II.1).

Table II.1. List of medicinal plants and their traditional use according to “Pharmacopée sénégalaise traditionnelle”(Kerharo and Adam, 1974) and “Pharmacopée Africaine”(Eklu-Natey, R.D. et al., 2012) FL: Fidelity level

Scientific Local Botanic Plant Mode of FL Community uses name name Family parts preparation (%) (INPI) Languages used W Guiera Nguer Combretaceae Leaves Decoction 41.4% cough, senegalensis NguelokyP, and gastrointestinal J.F. GMel. S aerial disorders, wound Ngud parts and skin ulcers W Lawsonia Fudeen Lythraceae Leaves Decoction 4.3% skin diseases, P inermis L. Lalle and bark urinary tract infections P Combretum Lawñandé , Combretaceae Aerial Decoction 5.7% cough, bronchitis, aculeatum W parts tuberculosis, Savaat Vent. stomach cramps, vomiting S Euphorbia Mbal-Mbal , Euphorbiaceae Aerial Decoction 7.1% Amoeba infection, hirta L. W parts diarrhea, common Mbal cold

Lippia Duté Verbenaceae Leaves Decoction 2.9% cough, cold, W chevalieri Gambie and gastrointestinal Mol. flowers disorders P Combretum Tanta , Combretaceae Bark and Maceration, 4.3% diarrhea, tonic, paniculatum W Roots Decoction stomach disorders Tundal Vent. W Anacardium Darkassu Anacardiaceae Gum and Decoction, 4.3% wound healing, occidentalis S Bark Maceration leprosy, Daf duruba L. hemorrhoids W Sterculia Mbep , Sterculiaceae Root and Decoction 2.9% leprosy, dysentery, setigera P stem bronchitis, diarrhea Babore Delile. Bark W Ficus Loro, Lodo Moraceae Root Decoction 10% cough and thonningii WarndonayP Bark, tuberculosis, Blume. S roots leprosy, maniac Yasul disorders W Pterocarpus Ween , Fabaceae Stem Decoction, 14.3% bronchial erinaceus P Bark maceration infections, Mbani Poir. toothache, dysentery, leprosy, wounds healing Lepisanthes Sis,MbujS, Sapindaceae Leaves Decoction 2.9% wounds healing W senegalensis Xevör With other ( Poir.) plants Leehn. Detarium N’doreyeS, Fabaceae Stem Decoction 4.3% leprosy, wounds W senegalense Ditakh and Root healing J.F.Gmel. Bark

W=wolof, P=Pulaar, S=Serer

According to “La pharmacopée sénégalaise tra¬ditionnelle” most of these plants were reported to be used to treat cough (Guiera senegalensis, Euphorbia hirta, Lippia chevalieri, Ficus thonninghii, Combretum aculeatum and Sterculia setigera). A traditional use for the roots and bark of Ficus thonningii in the treatment of tuberculosis and leprosy was also mentioned; Sterculia setigera bark was documented to have activity against leprosy (Kerharo and Adam, 1974). Guiera senegalensis leaves were cited for veterinary TB treatment in Nigeria (Ofukwu et al., 2008). The documented pharmacological activities of these plants in relation with their use in the treatment of TB symptoms are summarized below. Some species of Combretaceae family have been described for their in vitro and in vivo antimycobacterial eﬀects. Combretum species demonstrated antimycobacterial activity against strains of Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium aurum (Magwenzi et al., 2014). Among the species investigated, the stem bark acetone fraction of C. molle showed interesting in vitro antimycobacterial activity against M. tuberculosis. According to the authors, ellagitannins (punicalagins) are the compounds responsible for this activity(Asres et al., 2001). Guiera senegalensis is a well-known herbal drug widely used in West Africa as an antitussive (Sanogo et al., 1998), as well for the treatment of lung and bronchial disorders (Fiot et al., 2006; Somboro et al., 2011). Recently, a methanolic extract from the roots of G. senegalensis has shown antimycobacterial activity in vitro on rifampin resistant strains of M. tuberculosis (Adebiyi, 2016).

Euphorbia hirta and Lippia chevalieri are also traditionally used to treat respiratory diseases (Kerharo and Adam, 1974). The ethanoic extract of the aerial parts of E. hirta possessed antibacterial and antiasthmatic properties (Kumar et al., 2010), while the ethyl acetate leave extract has shown inhibitory activity on the growth of M. tuberculosis (Rajasekar et al., 2015). L. chevalieri, known for its essential oil containing mainly thymol, has already demonstrated antimicrobial activity. Interestingly, thymol has also shown interesting in vitro antimycobacterial eﬀects (Jiménez-Arellanes et al., 2006). L. chevalieri is also used against cough and breathing disorders (Bassole et al., 2005).

Lawsonia inermis or Henna is commonly used for the coloring properties of their seeds and roots due to the presence of lawsone, a naphthoquinone derivative. The henna herb’s aqueous extracts has already been documented for its antimycobacterial activity in vitro and in vivo (Sharma, 1990). L. inermis demonstrated a wide range of biological activities in vitro and in vivo comprising antimicrobial, antimycobacterial and immunomodulatory eﬀects (Chaudhary et al., 2010).

Anacardium occidentale, a native plant from Brazil, is mostly well known for its nuts that provide substantial ﬁnancial income for West African populations. The Aerial parts of A. occidentale were found to exhibit inhibitory in vitro activity against M. smegmatis (Tan, 2008).

“Karaya gum” extracted from Sterculia setigera and commercialized worldwide for diﬀerent uses is the most important part of this plant. The hexanic and dichloromethane leaf extracts have shown antimycobacterial activity in vitro against M. tuberculosis strains (Babalola et al., 2012). Ficus thonninghii, from the Moraceae family, is mainly associated in traditional medicine with other plants to treat respiratory diseases and has also shown various biological activities in vitro and in vivo such as anti-inﬂammatory and antimicrobial (Dangarembizi et al., 2013). Finally, Detarium senegalense is an important tree in West Africa for the nutritional value of its fruits. While the pulp of the bark has been described as a traditional herbal drug to treat tuberculosis (Eklu-Natey et al., 2012).

For the remaining herbs Lepisanthes senegalensis (Sapindaceae) or Pterocarpus erinaceus (Fabaceae) no biological activity was found to be correlated to TB.

Other plants were cited during the survey but they were not harvested. They names, botanical family, traditional use and used parts are documented in Table II.2.

Table II.2. List of other cited medicinal plants and their traditional use according to “Pharmacopée sénégalaise traditionnelle”(Kerharo and Adam, 1974) and “Pharmacopée Africaine”(Eklu-Natey, R.D. et al., 2012)

Scientific name Local name Botanic Plant Mode of Community (INPI) Languages Family parts preparation uses used W Adansonia Gouy Bombacaceae Seeds and seeds Asthma, P S digitate L. Boky , Nak barks powder or bleeding, Decoction gastrointestinal disorders, wound healing

Callistemon - Myrtacea Aerial Decoction Not described rigidus R.Br parts,barks S Cassia Bégné-fégné , Caesalpiniaceae Aerial Decoction Hepatitis, occidentalis L. W parts diuretic, anti- Bantamaré inflammatory, gonorrhea Combretum ndukoworoP Combretaceae Aerial Decoction Wound W glutinosum Yaays Rât parts,roots healing, G.Don Leprosy, cough, Syphilis W Eucalyptus Xootu buteel Myrtaceae Leaves Maceration, cough, globulus Labill. Decoction common cold

W S Gossypium Weteen ,Likit Malvaceae Roots, Decoction Cough, barbadensis L. Aerial diarrhea, parts bleeding W Hibiscus Mbep , Malvaceae Leaves and Decoction, Fatigue, sabdariffa L. P flowers maceration diuretic, Babore wound healing W Khaya Khaay Meliaceae Root Bark, Decoction Wound P S senegalensis Kahi Ngarin Stem bark healing, (Des.)A. Juss leprosy, malaria, Syphilis W Lannea acida A. Soon , Anacardiaceae Stem Bark, Decoction, hemorrhoids, rich. NduguutS, leaves, maceration toothache, P roots dysentery, Cinngooli leprosy, wound healing W Lantana camara gnuur Verbenaceae Leaves Decoction Cough, L. var. camara With other Asthma plants Melaleuca - Myrtaceae Leaves Decoction Cough, quinquinerva common cold (Cav. ) S.T.Blake

Prosopis Africana NgolS, KoyP, IrW Mimosaceae Leaves, Diarrhea, (Guill & Perr.) Stem bark fungal Taub. infections

Saba MadaW, MatS, Apocynaceae Leaves, Maceration, Tuberculosis, senegalensis LamunéP Latex Decoction cough, wound (A.DC.) Pichon healing, gonorrhea, hemostatic Sorghum bicolor sorghoW Poaceae seeds powder Diarrhea, (L.) Moench anemia Vitex doniana LungW, NgabP Verbenaceae Aerial Decoction, Cough, Sweet parts, Maceration Leprosy, stem bark gastric disorders Zanthoxylum GuenguideukW, Rutaceae Roots, Decoction Fatigue, P zanthoxyloides IgnokS, Dori Leaves Dysentery, (Lam.) Zepern. sickle cell &Timler disease

W=wolof, P=Pulaar, S=Serer

II.3.4.2 Antimycobacterial activity of selected plant extracts

In order to assess if the plants traditionally used were only valuable for the symptomatic treatment of TB or may have an antimycobacterial activity, they were submitted on two complementary bioassays. For this, the 12 selected herbal drugs were extracted according to the traditional preparation always by water decoction (boiling water during 30 min) and lyophilized.

The extracts were ﬁrstly screened in the antibiotic assay against M. marinum. Then extracts with relevant activities (observable growth inhibition of M. marinum) were assessed in the infection model using the host-pathogen assay

with amoebae as living host organisms. For both assays IC50 of extracts were determined and compared to rifampin.

In vitro antimycobacterial eﬀects

The aqueous extracts obtained were evaluated in the antibiotic assay against – M. marinum. The kinetic of the mycobacterial growth was obtained by plotting the value of the relative luminescence units (RLU). In the first screening assays 12 different water extracts of plants were evaluated. Two extracts at 0.2 mg/ml showed a significant inhibition of M. marinum growth (Figure II.3A). Most active extracts were those from aerial parts of Combretum aculeatum (DER of 1:7) and aerial parts of Guiera senegalensis (DER of 1:4) while the other ten extracts did not present any significant activity when compared to the negative control (Figure II.3B). For these two active extracts (Figure II.3A), the growth kinetic of M. marinum revealed by luminescent was recorded using 0.2 mg/ml concentration and compared to the negative control water. The IC50 determined (n = 3) for these two extracts were 0.22 ± 0.02 mg/ml for C. aculeatum and 0.41 ± 0.08 mg/ml for

G. senegalensis, while the positive control rifampin showed an IC50 of 0.0004 ±

0.00003 mg/ml. Regarding the IC50 curves, we could not use higher concentration than 0.8 mg/ml due to the solubility limits of the extracts. This preliminary antibiotic assay allows us to select these two aqueous extracts for a further anti-infective assay on the activity of extract to cure amoebae cells from M. marinum.

Anti-infective eﬀects of the selected plant extracts

The active extracts of C. aculeatum and G. senegalensis were selected and submitted to a whole-cell based assay (Kicka et al., 2014). This host-pathogen assay using amoebae aims at reproducing the infectious cycle in humans where Mycobacteria are ﬁrst ingested by macrophages in the lungs and granuloma structures, before they are found in other organs after dissemination (Franzblau et al., 2012). This infection assay is highly stringent to assess the compound or extract’s activity against Mycobacteria infection since it is known that many antitubercular compounds with in vitro antibiotic potency, lose their eﬀectiveness when assayed using a whole cell assay, due to low membrane penetration of the active compounds.

The membranes of amoebae are rich in eﬄux pumps, this is why the concentration of the Rifampin used as a positive control is ten-fold higher than in the antibiotic in vitro assay (Kicka et al., 2014).

In order to estimate the growth of M. marinum, 72 h (T72) post infection pictures of wells containing controls and plants extracts were compared to the picture at the infection time (T0)(Figure II.4). Regular growth of amoebae with remaining intracellular fluorescence from M. marinum was observed in the blank wells (Figure II.4A). For the positive control (Figure II.4B) and extracts, the intracellular bacterial load remaining after incubation (Figure II.4C and D) emitted no more fluorescence. This confirmed the effective antimycobacterial activity of such extracts in this assay. Relative fluorescence units (RFU) were also monitored every 3 h during these 3 days and were used to generate M. marinum growth inhibition profiles. This revealed for both G. senegalensis and C. aculeatum water ex-tracts interesting IC50 (n = 3) of 0.098 ± 0.009 mg/ml and 0.074 ± 0.006 mg/ml, respectively, compared to an IC50 of 0.007 ± 0.0004 mg/ml for Rifampin.

The IC50 of rifampin is higher in the amoebae infection assay than in the antibiotic assay, which is due to poor compound availability inside amoeba cells. In sharp contrast, the anti-infective IC50 for the two active extracts were lower than their antibiotic activities. Interestingly, some plant extracts have already been reported to exert an inhibitory effect on bacteria efflux pumps (Garvey et al., 2011), which could hint at an explanation for the potentiation of the two extracts in the whole- cell based infection assay. The assay robustness was confirmed by a Z Factor higher than 0.6 for the considered experiments. The activities observed for G. senegalensis and C. aculeatum water extracts were compared to other investigations on plant extracts showing antimycobacterial activity in vitro, however those assays were performed in different setups. For example in an antimycobacterial assay using M. tuberculosis typus humanus (ATCC 27294) performed by dilution assay using Löwenstein–Jensen medium, the acetonic extract of another Combretum specie (C. molle) revealed complete inhibition at concentration higher than 1 mg/ml (Asres et al., 2001). Recently the methanolic extract of Guiera senegalensis showed antimycobacterial activity with a MIC of 8 µg/ml in an in vitro activity against an ATCC strain of M. tuberculosis using broth dilution method (Adebiyi, 2016).

Figure II.3. Growth kinetic of M. marinum in presence of plant extracts compared to the blank (H2O), antibiotic assay. A) For Combretum aculeatum and Guiera senegalensis vs blank. B) Example of mycobacteria growth for inactive extracts.

Figure II.4. Anti-infectious eﬀect (intracellular) of the water decoction extracts of C. aculeatum and G. senegalensis measured by ﬂuorescence in comparison with blank and positive control Rifampin. Images are taken by a cytation imaging reader from Biotek®. Measurements was performed at time 0 (top pictures) and after 72 h (bottom pictures) incubation. A) Blank (H2O) B) rifampin C) C. aculeatum extract D) G. senegalensis extract.

The main difference with our study is that we performed a whole-cell based infection assay using an amoeba host, instead of an in vitro targeted approach. The strength of infection models using amoebae is that they fulfill some in vivo criteria such as membrane permeability and compound efflux, and inherently select for compounds with high anti-infective activity and low toxicity against the host. The amoeba model is easy to manipulate, can be adapted as a medium-throughput screening for plant extracts, and monitors anti-infective activities of antibiotic or even non-antibiotic compounds according to the assays using amoebae (Harrison et al., 2015; Kicka et al., 2014; Ouertatani-Sakouhi et al., 2017; Slepikas et al., 2016).

Beside the activity assessment, the toxicity of the extracts was also determined in order to verify that the measured eﬀects were not linked to cytotoxicity. Cell integrity and regular growth of amoeba organisms after 3 days of incubation indicate absence of cytotoxic eﬀects of the extracts at the maximum concentration used of 0.8 mg/ml.

Conclusion

This ethnopharmacological survey revealed a frequent usage of medicinal plants by patients to treat tuberculosis symptoms in Senegal, however, mainly restricted to a period before formal TB diagnosis. The concomitant use of plant with antitubercular drugs was very rare (6% of interviewed cases) as revealed by patient and contrary to healer’s declaration. Such results are interesting since possible drug interaction between herbal drug and conventional treatment might appear. The low frequency of concomitant usage indicates that this seems not to be a major issue. Most of cited plants were reported in the traditional medicine for the treatment related to TB symptoms such as cough. In vitro activity against mycobacterial strains were documented for some of cited plants. The water extracts of Guiera senegalensis and Combretum aculeatum were found to exhibit a strong mycobacterial growth inhibitory effect in the Acanthamoeba castellanii – M. marinum host-pathogen models. Our results revealed, for the first time in a whole-cell based assay, an antimycobacterial activity of extracts mimicking the traditional decoction of Combretum aculeatum and Guiera senegalensis. G. senegalensis, which is recognized as an antitussive herbal drug (Sanogo et al., 1998) was cited in this survey to treat also residual cough after 6 months antibiotic therapy and has recently shown antimycobacterial effects in other models but with only with lipophilic extracts (Adebiyi, 2016). These results precisely document the usage of traditional medicinal plants used as a first treatment option for TB ailments and for symptoms such as cough or loss of appetite in Senegal and will support further studies for a rational assessment of their efficacy and safety.

The active compounds involved in the antimycobacterial activity have yet to be identiﬁed. The evaluation of the beneﬁt/risk balance for the use of these plants in TB treatment could be better documented. A bioassay guided fractionation study of the active extract of these plants is underway to identify the compound(s) responsible for this activity.

CHAPITRE III

PHARMACOGNOSIE ET PHYTOCHIMIE DES PLANTES

ACTIVES

Pharmacognosie et phytochimie des plantes actives

Etude phytochmique et biologique des parties aériennes de Combretum aculeatum Vent.

Description botanique

Combretum aculeatum a pour principaux synonymes Poivrea aculeata (Vent.) DC. ou Poivrea ovalis (G. Don) Walp. et Poivrea hartmanniana Schweinf. Cette plante appartient à la famille des Combretaceae. Ses différents noms locaux au Sénégal et en Afrique de l’Ouest sont Sawat en wolof, Wolo en mandingue, Laoñâdi en peul, Nalafum en sérère et au Mali il est nommé Lawnandi (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012). Combretum est un genre composé d’environ 370 espèces présentes dans les régions tropicales et subtropicales du globe, on rencontre environ 300 espèces en Afrique tropicale. «Combretum» était le nom donné auparavant à une plante grimpante dont l'identité a été perdue avec le temps et « Combretums » réfèrent également aux « baies de brousse » (Kerharo and Adam, 1974; Schmelzer and Gurib-Fakim, 2013).

Combretum aculeatum est un arbuste de brousse pouvant mesurer de 0,5 à 4 m de hauteur avec des branches recourbées atteignant 8 m de long; l’écorce est grise ou rouge foncée. Recourbées, les épines mesurent jusqu’à 3 cm de long et sont formées de pétioles persistants et agrandis. Les feuilles sont alternes ou sub- opposées, elliptiques et/ou obovales; à base cunéiforme; avec un sommet arrondi à brièvement acuminé, de taille 7 x 5 cm elles sont plus ou moins pubescentes. Les fleurs sont en grappes axillaires courtes d'environ 1,9 cm de longueur se terminant en pousses feuillues; elles forment des pentamères, le réceptacle et le calice sont violacés; le tube est rétréci au-dessus de l'ovaire. Elles ont 5 pétales blancs de taille 4-6 x 1-2 mm, largement lancéolés; les étamines sont avec des anthères rouges. Le fruit est pétiolé, jaune pâle ou rougeâtre pâle, à 5 ailes, légèrement ovale, pouvant mesuré des tailles comprises entre 11-22 x 10-23 mm. C. aculeatum se retrouve dans les savanes sèches, le plus souvent sur les sols secs et est parfois riverain; enregistré de la Mauritanie jusqu’au nord du Nigeria et à travers l'Afrique subsaharienne jusqu'au nord-est de l'Afrique (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012; Schmelzer and Gurib-Fakim, 2013).

C. aculeatum est une espèce particulière de Combretum car contrairement aux autres elle peut se reproduire à partir de ses graines en fonction de l’humidité du sol. Sa floraison peut durer jusqu’à 3 mois et s’étend de la saison sèche au début de la saison des pluies ainsi on rencontre parfois des fruits et des fleurs sur le même pied (Arbonnier, 2009).

Répartition en Afrique Fleur caractéristique Parties aériennes

Figure III.1 : Fleurs et parties aériennes de Combretum aculeatum Vent. ainsi que sa répartition sur le continent africain (Schmelzer and Gurib-Fakim, 2013). Photos (E. Assane Diop)

Pharmacognosie

Bien connu pour son usage vétérinaire dans les régimes pour bovins et caprins, Combretum aculeatum a des propriétés nutritionnelles intéressantes pour le bétail à savoir dans la production de lait chez les femelles (Gaze et al., 1998). Les feuilles, les fruits et les graines sont un fourrage important, très apprécié par les ruminants. En zone soudanienne, C. aculeatum est une source importante d’aliment pour les petits ruminants, chez les nomades peulhs, au Sahel, elle est nommée “arachide des chèvres” car privilégié par eux lors des saisons sèches (Bosma and Bicaba, 1997).

Chez l’humain, la plante aurait entre autre des propriétés diurétiques. L'eau, dans laquelle les feuilles ont été bouillies, est bue dans le nord-ouest du Sénégal pour promouvoir la miction dans les cas où une maladie vénérienne obstruant l'urètre. La plante est également purgative. Elle est prescrite pour la blennorragie, l'helminthiase et la perte d'appétit. Des usages médico-magiques sont également documentés pour le traitement de la stérilité chez la femme et les affections psychiatriques (Kerharo and Adam, 1974). Il est également utilisé au Burkina Faso et au Sénégal pour le traitement de la lèpre (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012). Au Sénégal, la tribu des Socé prétend qu'une décoction de racine a une réputation bien établie dans le traitement du catarrhe; la tribu Sérère au Sénégal utilise la sève du centre de la tige pour des troubles oculaires (Kerharo and Adam, 1974).

Les racines bouillies sont prises au Kenya pour des troubles gastriques, les décoctions de feuilles, d’écorces et/ou de graines sont utilisées pour traiter la tuberculose cutanée au Soudan (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012).

Il y’a cependant très peu d’études pharmacologiques sur les extraits de Combretum aculeatum, des analyses de composition chimique ont démontrés une teneur en tanins avoisinant 7% dans la plante entière (Kerharo and Adam, 1974). Des analyses nutritionnelles sur les feuilles vertes sèches montrent des teneurs en matière organique de 91%, en protéines brutes de 16,1 %, 28,5% de fibres et 3,8% de lignine (Kerharo and Adam, 1974).

Isolement et identification des composés actifs de l’extrait aqueux de Combretum aculeatum

Méthodologie

Lors de l’enquête ethnopharmacologique menée au début de cette thèse Combretum aculeatum a été sélectionnée pour des études plus approfondies car cette plante est utilisée traditionnellement dans le traitement de la tuberculose et son extrait aqueux a présenté des activités antimycobactérienne in vitro (Diop et al., 2017a(Diop et al., 2017a).

Afin d’identifier les principes actifs responsables de l’activité antimycobactérienne in vitro, une méthodologie d’isolement bio guidé a été utilisée (Figure III.2).

La méthodologie employée commence par la collecte et l’identification de la plante par un botaniste spécialisé. La drogue végétale est ensuite séchée à l’abri de la lumière à température ne dépassant pas 50°C, afin d’éviter la dégradation des principes actifs. Ensuite, la drogue végétale est extraite par décoction avec de l’eau (préparation traditionnelle). La solution est ensuite filtrée, congelée et lyophilisée. L’extrait obtenu a été soumis aux tests d’activité biologique. Celui-ci en fonction des activités obtenues, permet de sélectionner les extraits les plus actifs et de les soumettre à des analyses phytochimiques afin d’identifier les composés actifs.

L’extrait actif est ensuite soumis à des analyses chimiques utilisant les méthodes couplées telle que la chromatographie liquide à haute performance couplé à la spectrométrie de masse à haute résolution (UHPLC-HRMS). Les données obtenues par ces analyses sont ensuite comparées à ceux des composés déjà décrits dans la famille botanique des combrétacées. Ceci est réalisée par un software qui va interroger des bases de données comme le « dictionnaire de produits naturels- DNP » (Chapman, 2014). Cette technique de screening chimique va donner une idée de la composition chimique de l’extrait, et dans certains cas permettre l’identification de certains composés connus (dereplication)(Wolfender and Queiroz, 2012).

L’extrait a été d’abord analysé par chromatographie liquide à haute performance couple à un détecteur à barrettes de photodiodes (PDA) et aussi couplée à un détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL). La séparation été réalisé utilisant une colonne analytique a phase inversée (C18). Le détecteur PDA a fourni le spectre UV de chaque composé UV actif. Le spectre UV permet dans certaines cas l’identification des familles chimiques, comme par exemple les flavonoïdes (Mabry, 1975). En plus, l’analyses HPLC couplée au détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL) a fourni une idée sur la quantité relative de ces composés dans l’extrait (Ganzera and Stuppner, 2005).

L’extrait aqueux a été ensuite fractionné par chromatographie liquide a moyenne pression utilisent une colonne flash en phase inversé type C18. Les fractions obtenues ont été soumises aux tests biologiques. Utilisant cette approche, il a été possible de connecter l’activité antimycobactérienne a certaines régions du chromatogramme HPLC-PDA-DEDL (Diop et al., 2017a).

Dans une dernière étape, l’extrait aqueux de C. aculeatum a été fractionné par chromatographie à moyenne pression (MPLC-UV) et les composés responsables de l’activité antimycobactérienne ont été isolées. La structures de ces composés sont obtenues par les analyses spectroscopiques classiques telle que la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS) et la résonnance magnétique nucléaire (RMN). Les composés purs ont été aussi soumis à des tests biologiques afin de déterminer leurs activités respectives activités moyennes inhibitrice (IC50).

Figure III.2. Méthodologie générique d'isolement guidé par la bio activité et l’identification de principes bioactifs à partir de sources naturels (plantes, champignons etc.) (Schéma tiré de(Queiroz et al., 2009) utilisé au sein du LPP- UniGE pour l’étude des produits naturels)

La méthodologie décrite ci-dessus a été réalisé avec succès dans le cadre de la thèse. Les résultats de cette investigation sont présents sous forme d’un article scientifique qui vient d’être soumis au « Journal of Ethnopharmacology ».

III.1.4.1 Analyses HPLC-PDA et UHPLC-HRMS de l’extrait de parties aériennes de C. aculeatum et déréplication des composés connues

La technique de déréplication chimique a permis de déterminer l’identité de quatorze composés retrouvés dans l’extrait active. La figure III.3 présente les analyses en HPLC-PDA et UHPLC-HRMS. Le tableau III.1 liste les composés dérépliqués de cet extrait avec l’aide « dictionnaire de produits naturels- DNP »(Chapman, 2014). Le processus de dereplication est décrit en détail comme suit.

L’analyse UHPLC-HRMS en mode négatif a montré que le composé 5 présenté un

- ion m/z 781.0546 [M-H] correspondant à une formule moléculaire de C34H22O22 (Δppm=2.02). La recherche avec le DNP relative à cette formule brute a donné 3 hits possibles, parmi ces hits figurent deux ellagitanins. En utilisant les spectres UV obtenus avec maxima à (220, 262 et 378 nm) il a été possible de dérépliquer le composé 5 comme étant l’isoterchebuloylglucose déjà décrit dans Terminalia macroptera (Conrad et al., 2001).

L’analyse UHPLC-HRMS a aussi montré qui le composé 6 présenté des fragments de pics caractéristiques avec un ion doublement chargé avec m/z de 541.0269 [M-

2- - 2H] et m/z 1083.0613 [M-H] , correspondant à une formule brute de C48H28O30 (Δppm=1.52). Une recherche avec l’aide du DNP a montré 5 candidats possibles pour cette formule brute. Finalement, le composé 6 a été identifier par résonance magnétique nucléaire après isolement par chromatographie preparative comme étant la punicacortéine D, un ellagitanin déjà décrit dans l’écorce de grenade, Punica granatum (Tanaka T et al., 1986).

Les composés 8 and 9 présentent également un ion doublement chargé avec une m/z de 541.0269 [M-2H]2- et un ion avec une m/z de 1083.0605 [M-H]-, donnant une formule brute de C48H28O30 (Δppm=0.84/0.73). Ces composés ont été identifiés comme étant les formes alpha et beta de punicalagine. Il s’agit d’un ellagitanin souvent reporté comme un seul composé mais il se retrouve naturellement en solution sous forme de deux anomers réversibles α et β (Doig et al., 1990).

Cette interconversion entre les deux anomers est régie par une constante d’équilibre (K) et celle-ci a été déjà déterminée dans l’eau K=[β]/[α] comme étant égale à 4 (Lu et al., 2008). En se basant sur la littérature et les chromatogrammes obtenus (Lu et al., 2008), on a pu identifier de façon putative 8 pour la forme α- Punicalagine et 9 correspond à la β-Punicalagine. Ces deux anomères de punicalagine ont déjà été identifiés dans des extraits de combrétacée nommément, Combretum molle et Terminalia chebula mais tout d’abord décrite dans les années 1970 comme constituant majeur du péricarpe du fruit de grenade (Punica granatum) d’où le nom de la molécule (Purple et al., 1969).

Les composés 10 et 11 révèlent un ion négatif (NI) BPI-HRMS avec une m/z de

- 447.0938 [M-H] , correspondant à la formule brute de C20H15O12 (Δppm=1.11), alors que l’ion positif (PI) BPI-HRMS montre un fragment avec une m/z de

+, 449.1074 [M+H] C20H17O12 (Δppm=-2.28). Ces composés ont été identifiés avec la même procédure de déréplication décrites pour les composés 5, 6, 8 and 9.

Les composés 10 et 11 correspondent à des dérivés de l’acide ellagique substitué par une molécule de rhamnose. La structure de ces deux composés a été confirmée par l’analyse RMN après isolement par chromatographie préparative.

Le composé 13 présente un ion négatif avec une m/z de 300.9995 [M-H] -, correspondant à C14H5O8 (Δppm=1.52) et spectre UV caractéristique de l’acide ellagique. Son identité a été confirmé avec l’aide d’un standard de l’acide ellagique commerciale. Utilisant la même stratégie, il a été possible identifier le 12 comme

étant dérivé glycoside de l’acide ellagique avec une formule brute de C21H19O10 (Δppm=0.8).

Parmi les composés décrits ci-dessus, la punicalagine a été déjà décrite pour une activité in vitro contre quelques souches de Mycobacterium (Asres et al., 2001; Fyhrquist et al., 2014). Les ellagitanins identifiés dans cet extrait aqueux de C. aculeatum semblent également avoir d’autres activités biologiques documentés telles que l’immunomodulation par activation des macrophages mais aussi une activité antioxydante en piégeant les radicaux libres (Kolodziej et al., 1999; Kulkarni et al., 2004; Lin et al., 1998).

Cependant, c’est la première fois que ces ellagitanins et particulièrement la punicalagine sont décrits dans des extraits aqueux de Combretum aculeatum utilisés traditionnellement pour traiter la tuberculose.

Figure III.3 : Analyse par chromatographie liquide, CLHP-UV-DEDL et UPLC- HRMS mode négatif de l’extrait aqueux de Combretum aculeatum A) Spectres UV des composés numérotés tirés du détecteur DAD de la CLHP, avec formule moléculaire(FM) déduite de la masse et l’erreur sur la détermination de la FM (Δ ppm) B) Détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL) couplé à la CLHP C) Détection UV à λ=280nm de l’extrait à 10mg/ml, Injection de 10µl, Colonne X- Bridge® C18, 4.6mm*250mm, 5µm diamètre des particules. Phase mobile A: H2O+0.1%acide formique(FA) B: MeOH+0.1%FA. Gradient: B 2% => 30%: 0- 20min, B 30%-100% : 20min-45min, B 100% :45min-50min D) UPLC-HRMS en mode négatif par Orbitrap® (voir paramètre dans l’article).

Tableau III.1 : Composés dérépliqués de l’extrait aqueux de C. aculeatum en utilisant le dictionnaire de produits naturels-DNP avec les filtres formule moléculaire et Famille botanique “Combretaceae” (Dawe et al., 2013; Mena et al., 2012)

- ID Composés [M-H] (FM) Δ ppm fragment Source 2 (tr*) m/z ** MS naturelle ***

1 - 195.05 C H O -2.8 177, 129, Dioscorea spp, 6 12 7 (0.43) 9 hits 99, 87, 75 Glycine 0hit

2 et 3 Hexahydroxydiphenoyl- 481.06 C H O 1.82/2.22 301, 275 - 20 18 14 (0.65, HHDP-Hexoside 26 hits 0.82)

4 Acide gallique 169.01 C H O -4.8 151, 125 Kalanchoe 7 6 5 (1.15) 13hits bloesfeldiana 0 hit

5 Isoterchebuloylglucose 781.05 C H O 2.02 721, 623, Terminalia 34 22 22 (1.37) 3 hits 601, 299 macroptera 1 hit

6 Punicacortéine D 1083.06 C H O 1.52 1065, 721, Punica granatum 48 28 30 (1.54) 5 hits 601, 299, 3 hit 270

7 Ellagitanin non identifié 1083.06 C H O -0.291 109 - 41 32 35 (1.66)

C H O 8 et 9 Punicalagine 1083.06 48 28 30 0.84/0.73 781,601, Terminalia spp., (1.88, α et β 5 hits 623, 575, Combretum molle et 2.09) 3 hit 301 Punica granatum

10 et 11 - 447.09 C H O 1.11/1.31 357, 327, 21 20 11 (2.73, 116 hits 297 2.79) 0 (353,329, 299, 285)

- Acide ellagique; 2-O-α-L- 447.06 C H O 20 16 12 Rhamnopyranoside 6 hits (Eschweilenol C) 1 hit

12 Dérivés d’acide ellagique 431.10 C H O 341, 311, 21 20 10 (2.95- 103 hits 283 3.02)

13 Acide ellagique 301 C H O 1.43 283, 257, Combretum 14 6 8 (3.04) 1 hit 229 yunnanensis 0 hit

14 - 471.13 C H O 1.24 307, 163, 24 24 10 (4.08) 15 hits 145, 119

*temps de rétention en minutes ** Nombre de hits avec filtre formule moléculaire (FM) sur DNP *** Nombre de hits avec filtre formule moléculaire (FM) sur DNP restreints a la famille Combretaceae

Activité antimycobactérienne des ellagitanins de C. aculeatum et de leurs métabolites

En utilisant la méthodologie décrite précédemment les composés actifs ont pu être isolés et identifiés dans l’extrait aqueux de C. aculeatum. Notamment en fonction des zones présentant les meilleurs profils d’inhibition de croissance mycobactérienne. Ainsi une détermination des IC50 a pu être faite pour la punicalagine isolée de l’extrait aqueux et ses métabolites plasmatiques décrits dans la littérature à savoir l’acide ellagique et les urolithines A, B et D (Espin et al., 2013). Les résultats obtenus (tableau 2 de l’article) montrent une activité antibiotique intéressante, comparée à la rifampicine (IC50~1.87µg/ml), pour la punicalagine (IC50~1.96 µg/ml), l’acide ellagique (IC50~48.3 µg/ml) et l’urolithine

D (IC50~ 54.41µg/ml) alors que les urolithines A et B montrent une plus faible activité. Ces substances montrent également une faible toxicité sur les cellules eucaryotes d’amibe utilisées dans les essais in vitro.

La punicalagine a déjà montré des activités inhibitrices de croissance in vitro contre plusieurs souches de mycobactérie (Asres et al., 2001; Mativandlela et al., 2008).

Notre travail a montré son activité antiinfectieuse (IC50~ 55.84µg/ml) et celle d’un de ses métabolites urolithin D (IC50~89.91µg/ml). En plus la punicalagine a une très faible toxicité par voie orale chez le rat et la souris, avec un LD50 avoisinant 1.5g/kg de poids par jour (Patel et al., 2008).

Après une administration répétée pendant 90 jours, une dose de PNG de 180mg/kg/jour ne révèle aucun effet indésirable chez les modèles animaux rat et souris (Patel et al., 2008).

En comparant les teneurs en ellagitanins dans les extraits de Combretum aculeatum et les possibles concentrations plasmatiques, on pourrait en déduire une certaine rationalité de l’usage de ces extraits pour le traitement de la tuberculose. Ces investigations ont résulté à la rédaction de l’article scientifique ci-dessous qui est en préparation pour soumission.

Ellagitannins from Combretum aculeatum and their metabolites: Assessment of their antimycobacterial activity in a single cell infection assay

El Hadji Assane Diop 1,3, Emerson Ferreira Queiroz1, Laurence Marcourt1, Sébastien

Kicka 2, Pierre-Marie Allard1, Serge Rudaz 1, Tahir Diop3, Thierry Soldati 2, Jean-Luc

Wolfender 1*

1 School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, University of Lausanne,

CMU – Rue Michel Servet 1, 1211 Geneva 11, Switzerland.

2 Department of Biochemistry, Faculty of Science, University of Geneva, Quai

Ansermet 30, 1211 Geneva 4, Switzerland.

3 Biology Department, University Cheikh Anta Diop, Dakar, Senegal.

Publication soumise au « Journal of Ethnopharmacology »

Contribution personnelle : choix du sujet, l’isolement des principes actifs, les essais biologiques et rédaction de l’article

Keywords: Combretum aculeatum, Combretaceae, Mycobacterium, Punicalagin, Single cell infection assay, urolithins

Abstract

Ethnopharmacological relevance The water decoction of Combretum aculeatum aerial parts is traditionally used in Senegal to treat tuberculosis (TB). The extract showed significant antimycobacterial activity in a validated single cell infection assay. Aim of the study: The main aim of this study was to identify the antimycobacterial compounds in water decoction of Combretum aculeatum, and additionally to learn about their possible activity in human based on the correlation with the documented metabolite bioavailability. Materials and methods: The C. aculeatum water decoction extract was fractionated by flash chromatography. The fractions were submitted to an antibiotic assay against Mycobacterium marinum and to a single cell infection assay involving Acanthamoeba castellanii as a host. Using these approaches, it was possible to correlate the antimycobacterial activity with two zones of the chromatogram. In parallel with this LC-based activity, profiling, high-resolution mass spectrometry (UHPLC-HR-MS/MS) reveals the presence of ellagitannins (Ets) derivatives in the active zones of the chromatogram. Isolation of the active compounds was performed by preparative chromatography. The structures of the isolated compounds were elucidated by nuclear magnetic resonance (NMR) . Results: The in vitro bioassay guided isolation of the Combretum aculeatum water extract led to the identification of three Ets (1-3). The major compounds (α- and

β-punicalagin), exhibited anti-infective activity with an IC50 of 55.84 µg/ml. In view of the documented intestinal metabolism of these compounds, some metabolites, namely urolithin A (5), urolithin B (6) and urolithin D (7) were investigated for their antimycobacterial activity in the two assays. Urolithin D (7) exhibited the most significant anti-infective activity with an IC50 of 89.91 µg/ml. The compounds assayed had no observable cytotoxicity towards the amoeba host cells at concentrations lower than 200 µg/ml. Conclusion The observed antimycobacterial properties of the traditional water decoction of C. aculeatum might be related to the activity of Ets derivatives (1-3) and their metabolites, such as ellagic acid (4) and urolithin D (7). Despite the relatively weak activity of these metabolites, the high consumption of tannins achieved via

the traditional decoction intake should lead to an important increase in the plasmatic concentration of these active and bioavailable metabolites. Our results support to some extent the traditional use of Combretum aculeatum to treat tuberculosis.

Introduction

Tuberculosis (TB) is an infectious bacterial disease caused by Mycobacterium tuberculosis, which most commonly affects the lungs. According to the WHO, TB remains one of the world’s deadliest communicable diseases. In 2016, 6.3 million new cases of TB were reported and an estimated 10.4 million people developed TB, from which 1.3 million died, 27% of whom were additionally HIV-positive (WHO, 2017). In Africa, home of 11% of the world population, the TB cases represents 29% of the global burden and the death-related rate is about 34% (Chaisson and Martinson, 2008). This situation has worsened with the emergence of resistant strains and living condition of populations promoting the infection diffusion. In the last few years, the number of resistant TB cases has dramatically increased and most of the new TB cases were localized to Africa (WHO, 2017). About 10% of infected people develop the clinical pulmonary TB disease because of their immune system weakness (HIV patients, low-and middle-income populations). Indeed, HIV prevalence is one of the most important factors of the growing epidemic (Chaisson and Martinson, 2008). TB is a curable disease; treatment consists in a combination of antibiotic drugs based on Rifampin with a standard duration of six months (WHO, 2016). Although serious side effects of TB drugs are not common, those are highly toxic to the liver (Yee et al., 2003). In this context, the African population which continues to use traditional medicine as a first aid for curing infection diseases, is using many plants claimed to be useful for the treatment of tuberculosis symptoms (Bunalema et al., 2014; Mann et al., 2009; Ogu, 2011). Recently, our ethnobotanical survey performed in Senegal has identified plants used to treat TB-symptoms and we evaluated their biological activity against Mycobacteria in a single cell infection assay (Diop et al., 2017b). Among nearly 30 plants cited and 12 harvested, the water extract from Combretum aculeatum showed significant antimycobacterial activities, both antibiotic and anti-infective, when compared to the positive control drug, rifampin.

Moreover, this extract exerted no observable toxicity against amoeba host cells (Acanthamoeba castellanii) (Diop et al., 2017b). Combretum aculeatum Vent. is a Combretaceae, a widespread pantropical family consisting of small herbs and shrubs that spontaneously grow in tropical regions. Some of the Combretum species are medicinal plants used in Asian and African traditional medicines (Lima et al., 2012). The ethnic tribe “Sereres” in Senegal uses the juice from the center of the stem to treat eye disorders (Eklu- Natey, Raphaël D. et al., 2012). Stem bark is also used to heal wounds (Eklu- Natey, Raphaël D. et al., 2012). The roots and/or the aerial parts are traditionally used as purgative and against helminthiasis, for the treatment of wounds, stomach aches, colic, gonorrhea, loss of appetite and leprosy (Burkill et al., 1985; Eklu- Natey, Raphaël D. et al., 2012). In Senegal, the roots decoction is traditionally used to treat catarrh (Eklu-Natey, Raphaël D. et al., 2012). To the best of our knowledge, no phytochemical study has been performed yet on this plant.

The present study describes the targeted isolation of the antimycobacterial compounds from the water decoction of Combretum aculeatum. Furthermore, the biological activity of known human metabolites from these compounds were also evaluated in this study.

Materials and Methods

III.2.3.1 General Experimental Procedures The nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopic experiences were achieved on a 500 MHz Varian Inova spectrometer and on a Bruker Avance III HD 600 MHz NMR spectrometer equipped with a QCI 5mm Cryoprobe and a SampleJet automated sample changer (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Germany). Chemical shifts are reported in parts per million (δ) Chemical shifts are reported in parts per

1 13 1 million (d) using the residual CD3OD signal ( H 3.31; C 49.0) or DMSO-d6 ( H 2.50; 13C 39.5) as internal standards for 1H and 13C NMR, and coupling constants (J) are reported in Hz. Complete assignment was performed based on 2D experiments (COSY, TOCSY, NOESY, edited-HSQC and HMBC). ESI-HR-MS/MS data were obtained on a Thermo Dionex Ultimate 3000 UHPLC system interfaced to a Q-Exactive Focus mass spectrometer (Thermo Scientific, Bremen, Germany), using a heated electrospray ionization (HESI-II) source.

III.2.3.2 Plant material

Combretum aculeatum Vent. aerial parts were collected in Senegal (Region of Missira/saloum in June 2014) and identified by Dr. Matthieu Gueye & team at IFAN, herbier, University Cheikh Anta Diop of Dakar. Voucher specimen for Combretum aculeatum (N° G00431528) has been deposited at the Herbarium of the “Conservatoire des Jardins Botaniques de la Ville de Genève”, Geneva (Switzerland). The plant was brought to Geneva for further studies with a material transfer agreement (MTA) signed by both the university of Dakar and Geneva.

III.2.3.3 Extraction

The leaves, flowers and stem of C. aculeatum (31g) were extracted by water decoction (traditional preparation) with 1000 ml of water during 30 min. The solution was filtrated, frozen and lyophilized affording 4g (12.9%) of the water decoction extract.

III.2.3.4 Chemical and reagents

HPLC-PDA-ESI-MS analysis was performed with H2O (Millipore, Billerica, MA, USA) and MeOH HPLC grade (Fisher Scientific, Leicestershire, UK). UHPLC-HR-MS analysis was performed with LC-MS grade H2O and acetonitrile (Biosolve, Valkenswaard, Netherlands). Flash chromatography and MPLC-UV isolation was performed with H2O (Millipore, Billerica, MA, USA) and MeOH (technical grade). Punicalagin standard (purity >99% by HPLC) were purchased from Phytolab® Germany, ellagic acid (purity 98%) from Sigma Aldrich. Urolithins A, B and D (purity>98%) were purchased from Brunschwig® Switzerland.

100

III.2.3.5 Quantitation of total polyphenols and tannins content using ultraviolet spectroscopy

The total amount of polyphenolic compounds and tannins in the extract were determined based on a colorimetric assay according to the European Pharmacopeia “the tannins content in herbal drug” (2.8.14. European Pharmacopoeia). Measurement of UV absorption in the Ph.Eur. assay was performed using a PerkinElmer Lambda 35(PerkinElmer, Waltham, MA, USA), UV instrument at fixed wave length λ=760nm. The assay is designed as a differential method, subtracting the value corresponding to the presence of tannins from the total value of polyphenols. This is performed by using hide powder, a collagen product obtained from bovine hide. This is performed using pyrogallol as standard and values were obtained using the formula below where A1 represent the absorption for total polyphenols, A2 the absorption of the polyphenols not absorbed by hide powder and A3 the absorbance of the standard pyrogallol. Then m1 corresponding to the weighting mass of C. aculeatum extract and m2 to the weighting mass of the standard pyrogallol. The analyses were done in triplicates (n=3). Formula below is used for the calculations: 62,5 x (A1-A2) x m2/((A3 x m1)) (Ph. Eur., 2014). The values are expressed in percentage of pyrogallol equivalent.

III.2.3.6 HPLC-PDA-ELSD analysis

Extracts, fractions and compounds were analyzed by HPLC-PDA-ELSD with an Agilent HP 1260 series system connected to a PDA-ELSD detector. The HPLC conditions were as follows: a Waters® X-Bridge C18 column (5 µm, 250 x 4.6 mm i.d.); The mobile phase was composed of (A) H2O and (B) MeOH both containing 0.1% FA; gradient: 2–30% of B in 20 min followed by 30–100% of B in 20 min and 100% of B for 10 min; flow rate: 1 mL/min; injection volume: 10 µL; and sample concentration: 10 mg/mL in Water. The column was used at a temperature of 25°C. The UV absorbance was measured at 254 and 280 nm, and UV spectra (PDA) were recorded between 190 and 400 nm (with increments of 2 nm). The ELSD detection parameters were as the following: pressure 3.5 bar, 45 °C, split to provide a 500 μL/min flow rate, gain 8.

101

III.2.3.7 UHPLC-Orbitrap-HR-MS/MS analysis

Chromatographic separation was performed on a ThermoDionex Ultimate 3000 UHPLC system interfaced to a Q-Exactive Focus mass spectrometer (Thermo Scientific, Bremen, Germany), using a heated electrospray ionization (HESI-II) source. The LC conditions were as follows: column, Waters BEH C18 100 × 2.1 mm i.d., 1.7 μm at 40 °C; mobile phase, (A) water with 0.1% formic acid and (B) acetonitrile with 0.1% formic acid; flow rate, 500 μL/min; injection volume, 2μL; isocratic 2% of B over 0.2 min, then gradient 2%−100% of B over 11 min, then 100% of B from 11 to 13min.

+ In positive ion mode, diisooctyl phtalate C24H38O4 [M + H] ion (m/z 391.28429) was used as internal lock mass. The optimized HESI-II parameters were as follows: source voltage, 3.5 kV (pos), 2.5kV(neg); sheath gas flow rate (N2), 52.5 units; auxiliary gas flow rate, 13.75 units; spare gas flowrate, 2.75; capillary temperature, 268.75 °C, S-Lens RF Level, 50. The mass analyzer was calibrated using a mixture of caffeine, methionine-arginine-phenylalanine-alanine-acetate (MRFA), sodium dodecyl sulfate, sodium taurocholate and Ultramark 1621 in an acetonitrile/methanol/water solution containing 1% acid by direct injection. The data-dependent MS/MS events were performed on the 3 most intense ions detected in full scan MS (Top 3 experiment). The MS/MS isolation window width was 1 m/z, and the stepped normalized collision energy (NCE) was set to 15 – 30 – 45 units. In data-dependent MS/MS experiments, full scans were acquired at a resolution of 35 000 FWHM (at m/z 200) and MS/MS scans at 17’500 FWHM both with a maximum injection time automatically determined. After being acquired in MS/MS scan, parent ions were placed in a dynamic exclusion list for 2.0 seconds. Data were acquired in the centroid mode. Detection was performed in negative ion mode (NI) with a m/z range of 120–1500. The MS. All instruments were controlled by Thermo scientificTM XcaliburTM software system. The molecular formulae were calculated using the ‘elemental composition’ module version (Thermo Fischer scientific).

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III.2.3.8 Bioassay guided fractionation of C. aculeatum extract by Flash Chromatography-UV

The fractionation of the decoction water extract was performed by semi- preparative flash chromatography-UV with a Puriflash® HQ C18 column (15 µm, 150 mm x 35 mm ID, Interchim, Montluçon, France). The extract was introduced in the flash column by dry injection. For this, 350 mg of the crude extract were mixed with 2g of Zeoprep® 60 C18 (40-63µm). The mixture was conditioned in a dry load cell. The dry load cell was connected between the pump and the flash column. The solvent system used was H2O (A) and MeOH (B) both containing 0.1% of formic acid. The separation was performed using a gradient method as follow: 2% of B to 15% of B in 4hs, 15% to 45% of B in 30 min, 45-65% in 2hs and 65 - 100% in 30 min. In order to obtain a rough fractionation and identify the zone of the chromatogram containing bioactive constituents fractions were collected every 50 min. The flow rate was set at 10 mL/min. After collection, each fraction was evaporated to dryness using a SpeedVac (HT-4X Genevac, Stone Ridge, NY, USA). The fractions were analyzed by HPLC-PDA and combined in 4 main fractions (F1- F4) (Figure III.4A). The fractions were evaluated for the host-pathogen antimycobacterial assay.

III.2.3.9 Compound isolation from the extract of Combretum aculeatum using Medium Pressure liquid chromatography (MPLC-UV)

The water decoction of Combretum aculeatum (2 g) was fractionated by MPLC with

® Zeoprep C18 column (15-25µm, 460 x 49 mm i.d.; Zeochem , Uetikon am See,

Switzerland). The solvent system used was (A) H2O and (B) MeOH both containing 0.1% FA. The separation was performed using the follow gradient method; 5% B during 18 min, 5% of B to 20% of B in 177 min, 20% of B to 50% of B in 126 min, 50% of B to 100% of B in 63 min. The extract was introduced in the MPLC column by dry injection. For this, 2 g of the extract were mixed with 8 g of Zeoprep C18 stationary phase. The mixture was conditioned in a dry load cell (11.5 x 2.7 cm i.d.). The dry load cell was connected between the pump and the MPLC column. The flow rate was set to 30 mL/min.

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Detection was performed by at 254 and 280 nm. The MPLC yielded 44 fractions. The fractions content were controlled by HPLC-UV and HR-MS.

Fractions F13 yield compound 1 (~13 mg), while fractions between F15 and F21 yield compound 2 and 3 (~250mg, when masses are combined).

III.2.3.10 Host-pathogen assay using Mycobacterium marinum

One of the disadvantage of M. tuberculosis is to be a very slow growing bacterium compared to M. marinum, which has a doubling time of 8 hours instead of 24 hours. M. marinum is a close relative to M. tuberculosis, but it is a BSL-2 pathogen and a and is thus less dangerous for laboratory manipulations. The in-vitro assays performed in this study are of two different types. First, an antibiotic assay, which assesses the activity of compounds on the growth of M. marinum in broth, and second, an anti-infective assay that assesses the activity of compounds on itracellular M. marinum. The particularity of this novel and stringent anti-infective assay is that it makes use of Acanthamoeba castellanii, an amoeba, as phagocytic host for M. marinum (Kicka et al., 2014). Both assays for the determination of antimycobacterial activity were conducted according to validated protocols published previously (Trofimov et al., 2018). A complete description of both assays for the evaluation of plant extracts and fractions was recently published (Diop et al., 2017b, a). Briefly, a known amount of each fraction or compound in water was transferred to 96-well plates with each well containing either 105 Lux expressing M. marinum (for the antibiotic assay) or 5 × 104 cells of A. castellanii infected with M. marinum expressing GFP (for the anti-infective assay). Then, plates were incubated for 72 hours at 25°C or 37 °C. Distinguishing between growth inhibition and cytotoxicity was performed by visual inspection (by mean of Cytation® Image reader) as an end-point measurement after 72 hours of incubation in the presence of the compound. Bacterial growth was monitored by measuring the luminescence in a plate reader (Synergy H1, Biotek®) with a time point taken every 30 minutes or reading the fluorescence (Synergy H1, Biotek®) every 3 hours. For the infection assay, images are taken by a Cytation image reader, BioTek®.

104

III.2.3.11 Statistical Analysis

The Z factor is calculated for each experiment to ensure that the response of luminescence or fluorescence is sufficiently robust. The Z factor was calculated using the means and standard deviations of both positive (Rifampin) and negative

(H2O) controls at (mp, σp and mn, σn). The following formula was applied: Z-factor

= 1–3(σp+ σn)/|mp-mn| (Zhang et al., 1999). Experiments with a Z factor higher than 0.6 were considered and used for the evaluation of the antimycobacterial activity.

Results and Discussion

Extracts from C. aculeatum, fractions and compounds isolated were first characterized for their antibiotic properties in the - assay with luminescent M. marinum. The most actives were then scrutinized in a fluorescence-based assay for anti-infective properties and visual evaluation of cytotoxicity against the host amoebae.

III.2.4.1 Bioassay-guided fractionation of the Combretum aculeatum aqueous extract

In our recent study, the water decoction of Combretum aculeatum showed significant anti-infective activity (IC50 of 74 µg/ml) and antibiotic effect (IC50 of 220 µg/ml) against M. marinum (Diop et al., 2017b). An HPLC-PDA-ELSD profiling of the extract revealed the presence of main peaks in the UV chromatogram displaying PDA-UV possibly characteristic for ellagic acid derivatives (Amakura et al., 2000). This data seems consistent since members of the Combretaceae family are known to contain tannins (Baba-Moussa et al., 1999). The ELSD trace in addition revealed, beside large amounts of saccharides, the presence of two main compounds (2 at RT of 11.12min and 3 at RT of 14.26min Figure III.5A). To identify compounds responsible for the activity, the extract was fractionated in four main fractions (F1 to F4) by direct transfer of the analytical HPLC-UV conditions to flash chromatography (Figure III.4). These fractions and the extract were submitted to the antibiotic assay.

105

The growth kinetic of M. marinum revealed by luminescence was recorded using 0.1 mg/ml concentration for each fraction and compared to water as the negative control. The most relevant antimycobacterial effects were found in fractions F2 and F3, which mainly concentrated the activity of the original extract. Fractions F1 and F4 showed a lower inhibition activity (Figure III.4B).

Figure III.4. A) Fractions of Combretum aculeatum decoction obtained by reverse phase Flash-UV chromatography (UV 280 nm). Column Puriflash® C18 HQ 15µm, 4.6mm IDx250mm.Gradient MeOH+0.1%FA(B) /H2O + 0.1%FA(A) B: 2- 15% 4H, 15-45% 3min, 45-65% - 2Hours, 65 -100% 30min UV 280nm B) Representative graph from replicates (n=3) of the antimycobacterial activity (antibiotic) monitoring with luminescence reading (RLU) as a function of time (hour). The beginning of the reading time corresponds to one hour after the plating of the bacteria.

106

III.2.4.2 Dereplication of constituents from the active fractions by UHPLC-HR-MS/MS

The extract was additionally profiled by UHPLC-HR-MS/MS for dereplication. A comparison between the PDA-UV and HR-MS data obtained with those published for compounds previously isolated from the Combretaceae family in the Dictionary of Natural Products (DNP)(Chapman, 2014) was performed. The major compounds 1-4 (Table III.2) displayed similar UV spectra with maxima at 258-260 nm and 378-380 nm (Figure III.5A), indicating closely related phenolic structures possibly related to ellagic acid derivatives (Fischer et al., 2011).

Figure III.5. A) HPLC-ELSD and B) HPLC-PDA-UV and C) UHPLC-HRMS analysis of the water decoction of Combretum aculeatum aerial parts.

107

Compounds 1, 2 and 3 were found to be isomers and all displayed a deprotonated molecular ion at m/z 1083.0605 [M-H] - as well as a doubly charged ion at m/z

2- 541.0269 [M-2H] sharing a similar molecular formula (MF) C48H28O30 (Figure III.5A). A search in the Dictionary of Natural Products (DNP) gave five hits related to Ets for this MF.

An extended search in DNP database with the key word “Combretaceae” as biological source and the MF gave a single hit corresponding to the Ets punicalagin previously described in Punica granatum (Tanaka et al., 1986a), and found to occur in two combretaceae (Combretum molle (Asres et al., 2001) and Terminalia chebula (Pellati et al., 2013)).

In the MS/MS spectra acquired during profiling, the isomers 1, 2 and 3 exhibited one common fragment at m/z 601.20 that fits well for to the gallagyl group

2 (C28H11O16) thus confirming the occurrence of Ets (Mena et al., 2012). The MS spectra of 2 and 3 exhibited four other ions fragments at m/z of 781, 623, 575 and 301 in addition to m/z 601. This fragmentation profile supported the presence of punicalagin previously described in other documented dereplication procedures (Mena et al., 2012). Based on the reported retention behavior of 2 and 3 in reversed phase HPLC (Lu et al., 2008), compounds 2 and 3 might correspond to the α- and β-anomer of punicalagin, respectively. Using the same dereplication

- procedure, compound 4 (m/z 300.9995 [M-H] , C14H5O8, Δppm=1.52) was assigned to ellagic acid (Wansi et al., 2007).

This was confirmed by the comparison of its retention time (RT) with the RT of a pure commercial standard. UV and HR-MS/MS data were not sufficient for any other early structure assignments. These compounds were present in the active fractions and were isolated in order to determine their IC50 in the two antimycobacterial assays.

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Table III.2: Identification of compounds from the aqueous extract of C. aculeatum proceeded with UHPLC-Orbitrap-HR-MS/MS analysis and using DNP (Keywords: Molecular formula, Combretaceae) and (Dawe et al., 2013; Mena et al., 2012)

- 2 ID Compounds/ [M-H] Molecular Δ ppm MS ion Natural (rt) m/z Formula fragments source

1 Punicacortein 1083.06 C48H28O30 1.52 1065, Punica (1.54) D 5 hits* 721, 601, granatum 3 hits** 299, 270

2 Punicalagin α 1083.06 C48H28O30 0.84/0.73 781,601, Terminalia (1.88) 5 hits* 623, 575, spp., 3 hits** 301 Combretum molle and Punica granatum

3 Punicalagin β 1083.06 C48H28O30 0.84/0.73 781,601, Terminalia (2.09) 5 hits* 623, 575, spp., 3 hits** 301 Combretum molle and Punica granatum

4 Ellagic acid 300.9995 C14H6O8 1.43 283, 257, Combretum (3.04) 1 hit* 229 yunnanensis 0 hit** and Eschweilera coriacea

* Number of hits filtering DNP by molecular formula ** Number of hits filtering DNP restricted to Combretaceae compounds by molecular formula

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III.2.4.3 Bioassay guided isolation of active compounds

The water decoction of C. aculeatum was fractionated by reversed-phase medium- pressure liquid chromatography (MPLC-UV). A direct transfer of the analytical HPLC conditions to MPLC using the same reversed-phase material provided a rational and efficient fractionation (Challal et al., 2015) of 2 g of C. aculeatum aqueous extract into 44 fractions. All these fractions were submitted to the antibiotic assay. This confirmed that the fractions between 15 to 21 containing 2 and 3 presented the most relevant M. marinum growth inhibition activity while the fraction 13 containing compound 1 showed a weaker activity. The other less active fractions (F35 to F38) contained ellagic acid (4).

This procedure resulted in the isolation of three pure compounds (1-3). Fraction F13 yielded compound 1 (~13 mg), while fractions between F15 and F21 yielded compounds 2 and 3 (~250 mg, combined fractions). The NMR analysis confirmed the identity of 2 and 3 as being the α- and β-anomers of punicalagin (2 and 3) (Kraszni et al., 2013). Compound 1 was unambiguously identified as punicacortein D (1) (Tanaka et al., 1986b). It is reported for the first time in plants of the Combretaceae family according to DNP. The NMR analysis of compounds 2 and 3 were identical and revealed mixture of α- and β-anomers of punicalagin (2 and 3). It is known in solution that punicalagin occur as a mixture of interconvertible α- and β-anomers. The equilibrium constant (K) for the interconversion of the two anomers in water expressed as K=[β]/[α] is equal to 4, and this value is dependent on the nature of the solvent used (Lu et al., 2008).

III.2.4.4 Identification of isolated compounds

20 1 Punicacortein D (1): yellow amorphous powder ; [α] -96.1 (c, 0.6 in H2O; H NMR and 13C NMR data are identical with literature values (Tanaka et al., 1986b).

- HR-ESI MS (neg. ion mode) m/z 1083.066 [M-H] (calculated for C48H27O30

- 1084.06655); m/z 541.0.23 [M-2H] (calculated for C24H14O15 542.023, Δ ppm = 1.52). NMR spectras in Annexe 5 (frequency 600 MHz, solvent acetone-d6)

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Punicalagin (2 and 3): Mixture of α and β anomers, yellow amorphous powder

20 28 1 (+H2O); mp 232°C; [α] -181 (c, 1.0 in H2O), [α] +3.8 (c, 0.9 in MeOH); H NMR and 13C NMR data are identical with literature values (Kraszni et al., 2013).

- HR-ESI MS (neg. ion mode) m/z 1083.066 [M-H] (calculated for C48H27O30:

- 1083.06605); m/z 541.0.23 [M-2H] (calculated for C24H12O15: 541.023 Δ ppm(α

)= 0.84 Δ ppm (β)= /0.73). NMR spectra (frequency 500MHz, solvent D2O)

Figure III.6. Structure of the identified compounds (1-4) from the water decoction of Combretum aculeatum aerial parts and their metabolites (5-7) .

III.2.4.5 Antimycobacterial IC50 determination for identified compounds

The antibiotic effect of the compounds was monitored with quantitative luminescence measurement (RLU) of M. marinum growth, and the anti-infective activity monitoring and characterization of the compounds with quantitative fluorescence measurements and high-content microscopy of infected A. castellanii. Results are expressed in graphs showing the growth kinetics of M. marinum in presence of compounds compared to the negative control H2O. Dose–response curves were constructed for the determination of IC50 values.

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IC50 values were calculated from the results of four serial dilutions of compounds. The mean of RFU/RLU difference at endpoint between negative control and assayed compound was used to plot curves.

The punicalagin presented an antibiotic effect against M. marinum with an IC50 activity at 1.96 ± 0.78 µg/ml, which is close to the reference drug Rifampin (IC50 of 1.87 ± 0.25 µg/ml) in this assay. However, compared to rifampin (IC50=5.75 ±

2.25 µg/ml), the IC50 of punicalagin found in the anti-infective assay was at 55.84±7.62 µg/ml, illustrating the poor intracellular availability of PNG, likely due to the shielding effect of the host. The IC50 of Punicacortein D could not be measured due to the low quantity of the compound available to us, but as previously reported in the bioassay-guided isolation, its inhibition profile was moderate compared to PNG.

These results clearly indicate that the antimycobacterial activity of the extract is related to the presence of Ets and particularly punicalagin. Such compounds are however known to be heavily metabolized and to display very low bioavailability (Espin et al., 2013). To better evaluate the possible efficacy of the traditional decoction administrated orally against TB, we decided to investigate the activity of known metabolites of punicalagin clearly evidenced as the main ellagitannin present in the decoction (see ELSD trace). In human, Ets and particularly punicalagin are metabolized in the intestine by the gut microflora into the dibenzopyranone-type urolithins, a subfamily of metabolites from the dibenzopyranone family. They can readily enter the systemic circulation, but the bioavailability of different metabolites varies considerably between individuals according to the gut microbiota (Espin et al., 2013; Garcia-Muñoz and Vaillant, 2014; Mertens-Talcott et al., 2006). Ellagic acid as a main hydrolysis product of dietary ETs may also serve as a substrate in the formation of urolithins.

Seven different urolithins are cited in the literature as metabolites identified in the human plasma after oral intake of punicalagin and ellagic acid (Espin et al., 2013). Punicalagin was found at very low concentration in rat plasma (Cerda et al., 2003) and EA is slightly present in plasma after Ets ingestion with maximum concentrations around ~32 µmol/l, this occurs one-hour after intake (Espin et al., 2013). Urolithins are found at concentrations from 0.2 to 20 µmol/l level in blood and in urine after dietary Ets ingestion and remain at high concentration level after 3 days (Garcia-Muñoz and Vaillant, 2014).

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III.2.4.6 IC50 determination of punicalagin metabolites (ellagic acid and urolithins)

Ellagic acid (4) and three commercially available urolithins A (5), B (6) and D (7) were acquired and evaluated for their antimycobacterial properties. The IC50 determined for both antibiotic and anti-infective effect against M. marinum were systematically compared to rifampin. Representative pictures of amoeba cells infected by GFP-expressing M. marinum and graphs monitoring RFU reading as a function of time are presented in Fig III.7ABCD.

Figure III.7: A) Representative pictures of amoeba infected cells: a) Bright-field and GFP microscopy of A. castellanii cells infected with M. marinum (cells were transferred to the wells, the measurements were taken after 72 hours of incubation. b) Bright-field and GFP microscopy of A. castellanii cells infected with M. marinum. c) Pictures of active fluorescent GFP M. marinum and in A. castellani. d) Dead amoebae cells after exposition to a toxic compound. The scale bars correspond to 200 μm for a and b) and 100 μm for c and d).

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B) Representative anti-infective curves of the compounds showing the inhibition of intracellular growth of M. marinum in A. castellanii. GFP-expressing M. marinum growth kinetics were measured in broth culture and during cellular infection (72h) in presence of compounds in a defined concentration range. Comparison betweenpunicalagin(Fr 20 ) and metabolites assayed.

C) Plotting of intracellular M. marinum growth in the presence of different concentrations of urolithin D D) Dose–response curve constructed for the determination of the anti-infective IC50 value for urolithin D

The growth inhibition of M. marinum in A. castellanii, namely the anti-infective effect for punicalagin and its metabolites is presented in Fig. III.7B and similar curves at five concentrations are displayed in Figure III.7C for urolithin D, the most active metabolite. The IC50 values are presented in Table III.3.

Urolithin D (7) showed interesting antibiotic activity with an IC50 of 54.4 ± 25.61 µg/ml. Additionally, the metabolite also showed significant anti-infective activity with an IC50 of 89.9±21.82 µg/ml. Urolithin A (5) showed no significant activity (>300 µg/ml) in both assays, but urolithin B (6) presented a moderate anti- infective activity compared to urolithin D, thus indicating a selectivity for the target according to the substitution patterns of urolithins. Ellagic acid (4) as the main hydrolysis product of punicalagin, inhibited the growth of M. marinum in A. castellanii only at very high concentrations (IC50 >300 µg/ml) but showed a good antibiotic effect with an IC50 of 48.3 ± 5.72 µg/ml.

The significance of the activities was evaluated in comparison to the IC50 of rifampin, when values were inferior than 20-foldhigher the positive control. The

IC50 of the compounds were also in a range comparable with the 168 antibiotics of the GlaxoSmithKline (GSK) TB-set evaluated with the same assay (Trofimov et al., 2018). That study revealed that only ~5% of the 168 compounds presented a significant anti-infective activity, while 88% of them exerted strong antibiotic activity. For these lead compounds, the values of the strongest anti-infective activities were between 2 and 6 µM (Trofimov et al., 2018). Comparing with our assayed compound for which IC50 are between ~50 µM for PNG and ~200 µM for Urolithin D.

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Table III.3: Inhibitory concentrations 50% (IC50) values for M. marinum growth in extracellular and intracellular (ingestion by A. castellanii) conditions. GFP- expressing M. marinum growth kinetics were measured in broth culture and during cellular infection in presence of compounds in a concentration range, and IC50 values were graphically determined from a series of 3 experiments with similar outcome. Values higher than 300 µg/ml were not reported. The toxic concentration is visually determined for each compound.

In vitro antimycobacterial activities of punicalagin (2 and 3) were already described (Chinsembu, K. C, 2016). A total growth inhibition of an ATCC strain of M. tuberculosis typus humanus was reported at concentrations higher than 0.6 mg/ml (Chinsembu, K. C, 2016), while the antimycobacterial activity of ellagic acid and urolithin D (7) is described here for the first time. Ellagic acid has been documented as antioxidant, antifungal and as presenting antimalarial activities (Li et al., 2015; Soh et al., 2009), while urolithins showed antioxidant activity related to their lipophilicity and the presence of hydroxyl groups (Bialonska et al., 2009; Cerda et al., 2004). The metabolic pathways using gut microbiota showed that Urolithin D (tetrahydroxylated) is the first product of transformation followed by the trihydroxylated urolithin C and the dihydroxylated analog urolithin A (Bialonska et al., 2010). Regarding these metabolism profile of Ets, it is relevant to compare to the tannins content in C. aculeatum extract using validated analytical procedure such as the European pharmacopeia procedures.

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III.2.4.7 The European pharmacopeia assay for total polyphenols and tannins

Our results indicate that the effects of the traditional decoction seem to be mostly related to the release of ellagic acid and urolithin D after the oral intake of the Ets contained in C. aculeatum. To evaluate the total amount of tannins in the decoction, the total content was evaluated by the spectrophotometric assay using the Folin–Ciocalteau reagent, as described in the European pharmacopeia (Moller et al., 2009). These values are expressed as pyrogallol equivalent in the extract. The lyophilized decoction extract gave a total polyphenols content of 41.35 ± 2.35 % and corresponding total tannins content of 25.30 ± 4.30 %.

According to traditional usage (400-800 ml decoction per day), a rough estimation indicates that a patient consumes between 400 mg to 1000 mg of Ets daily. According to results related to pomegranate juice consumption, the intake of 180 ml of pomegranate extract containing 318 mg punicalagin and 12 mg free ellagic acid shows plasmatic concentration of EA close to 18 µg/ml (Seeram et al., 2006). It is rational to estimate that the consumption of C. aculeatum (with 25% of tannins, mainly punicalagin) might yield plasma concentrations of EA in a range between 20 to 60 µg/ml, which is more than two-fold higher than the IC50 of EA in the antibiotic assay. And then we should obtain higher concentration of urolithins in blood according to literature (Garcia-Muñoz and Vaillant, 2014). C. aculeatum extracts could be considered as a prodrug, providing active Ets. Thus, the anti-infective activity of this extract seems to be a combination of different active principles bioavailable after oral intake. Further analytical investigations are needed to quantify punicalagin in C. aculeatum extract and correlate it with the plasmatic levels of ellagic acid and urolithins.

This can help to evaluate whether such concentrations are relevant in the frame of the assay used in this study for the possible efficacy of C. aculeatum for TB management. Furthermore, plasmatic concentrations of urolithins in-patient using C. aculeatum traditionally would be interesting to assess for correlation of the possible anti-infective activity of the decoction

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Conclusion

Our results clearly indicate that the antimycobacterial properties of the traditional water decoction of C. aculeatum is a result of combined activities. On one hand, due to the presence of the Ets derivatives such as punicalagin (2 and 3), and on the other hand of the metabolites of these compounds. Ellagic acid and urolithin D showed a weaker activity than rifampin in the very stringent intracellular infection assay, while both EA and UD were strongly active in the antibiotic assay. The estimated consumption of Ets from the traditional decoction indicates that metabolites such EA may reach high plasmatic levels (between 20-60 µg/ml), resulting also in high levels of urolithins. This, compared to the in vitro IMC (between 0.005 to 0.2 µg/ml) for bactericidal activity of rifampin, these metabolites may thus exert a curative effect (Gonzalez-Barrio et al., 2011; Seeram et al., 2004). These results support the rational of the use of C. aculeatum to treat tuberculosis. To further document this usage, an in vivo assay in relevant rodent infection models should be performed with an oral administration of lyophilized water decoction extracts of C. aculeatum. Extracts of C. aculeatum standardized for punicalagin are needed for this type of preclinical studies, and development of quantitative analysis methods is underway for the quality control of these extracts. Since the metabolism of Ets is microflora-dependent, further randomized clinical assays in human are needed to determine the efficacy and relative toxicity. In the amoebae infection assay used, the compounds showed no observable cellular toxicity at concentrations lower than 200 µg/ml.

Acknowledgments

The authors thank University of Dakar for plants harvesting and identification. A special thank goes to Cristina Bosmani and Florence Leuba from the Soldati Lab for their help with the bioassays. Work in the Soldati lab was supported by grant from the SNF and SystemsX.ch. Aymeric Montelier and Prof M. Cuendet for the training and use of Cytation® Biotek. The School of Pharmaceutical Sciences of the University of Geneva (Prof. J-L. Wolfender) is thankful to the Swiss National Science Foundation for the support in the acquisition of the NMR 600 MHz (SNF R’Equip grant 316030_164095).

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Etude phytochmique et biologique des parties aériennes de Guiera senegalensis J.F.Gmel

Description botanique

Guiera senegalensis a comme synonyme Guiera glandulosa Sm. et appartient à la famille des combretaceae. Guiera senegalensis est une espèce unique du genre Guiera Adans. ex Juss. genus Exell & Stace, 1966 (Silva et al., 2008). Ses différents noms locaux au Sénégal et en Afrique de l’Ouest sont Nguer en wolof, Kundé en mandingue, Ngeloki en peulh, Ngud en sérère et N`gu jé en Bambara, kululu or Saabaraa sont les appellations populaires au Nigeria (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012).

La famille des combrétacées est une famille des zones tropicales et subtropicales très représentée au Sahel. On y rencontre six genres dont les plus importantes sont Terminalia, Guiera et Combretum. On rencontre une vingtaine d’espèces du genre Combretum qui forme le fond arbustif et arboré des forêts sèches au Sénégal. Les combrétacées sont caractérisées par des espèces à gommes et tanins.

Guiera senegalensis est décrit comme étant un arbuste qui peut atteindre une hauteur de 3 à 5 m selon la région ou elle pousse. Sa tige présente de nombreux nœuds d’où partent les branches. La tige grise cendré et les branches ont des écorces fibreuses ou pubescentes. Les feuilles sont opposées, courtes, ovales et pétiolées, parfois avec mucrons, parfois même cordés à leur base, avec des tailles de 2 à 4 cm de long sur 1 à 2 cm de large. Les feuilles de couleur gris-vert, plus foncées sur leur surface supérieure, présentent des taches noires sur leur surface inférieure et sont légèrement duveteux sur les deux côtés. Les fruits sont des akènes en étoiles, pubescent à poils soyeux (Kerharo and Adam, 1974).Les poils gris-blancs profèrent une teinte argentée aux arbrisseaux (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012).

C’est une espèce qui peuple les savanes lors des saisons sèches de Novembre à Juin, sa floraison a lieu deux fois par année à la saison des pluies et durant la saison sèche. On peut donc observer les fleurs plusieurs mois de l’année et les graines arrivant à maturité peuvent se ressemer pour développer de nouveaux individus (Schmelzer and Gurib-Fakim, 2013).

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Répartition en Afrique Feuilles Plante entière (environnement naturel)

Figure III.8 : Parties aériennes et plante de Guiera senegalensis J.F.Gmel. ainsi que sa répartition sur le continent africain (Schmelzer and Gurib-Fakim, 2013). Photos (E. Assane Diop).

Pharmacognosie

Selon les connaissances populaires G. senegalensis est largement utilisée dans les communautés autochtones en Afrique de l’Ouest, toutes les parties de la plante sont prescrites (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012). La plante est utilisée dans la médecine et dans l’alimentation vétérinaire chez les Toucouleurs (peuple de la région sahélienne) dans les régimes conçus pour augmenter le poids corporel, la capacité de reproduction et la sécrétion lactée chez les animaux (Gaze et al., 1998). Chez l’homme, G. senegalensis est principalement utilisé comme calmant pour la toux et contre la fièvre, et ce sont principalement les feuilles qui sont utilisées en décoction du Sénégal jusqu’au Nord du Nigéria (Pousset, 2004). Les branches, les feuilles, l'écorce et les racines de G. senegalensis sont recommandées pour le traitement de douleur à l'estomac et la diarrhée dysentérique, la syphilis, le béribéri, la lèpre et l’impuissance (Kerharo and Adam, 1974). Un thé à base de feuilles est utilisé au Mali par voie orale pour traiter l'eczéma (un litre par jour), et il est également utilisé contre les attaques de fièvre, pour guérir les affections bronchiques et des rhumes (Malgras, 1992). La pâte fraîche de feuilles mâchées ou coupées est utilisée comme hémostatique sur une plaie saignante (Berhault, 1971).

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Les feuilles séchées en poudre associées à Melanthera scandens sont administrés par voie nasale pour traiter maux de tête et sinusite (Berhault, 1971). Les feuilles sont également utilisées sous forme de cataplasme chaud contre le ver de Guinée (Berhault, 1971). Au Niger, au Mali et en Guinée, les feuilles et fruits sont utilisés comme anti-lépromateux et au Mali les feuilles ont de multiples usages dont le traitement de l’impuissance sexuelle, de la syphilis, de la malaria et aussi comme contrepoison (Eklu-Natey, R.D. et al., 2012). Certaines populations au Sénégal réduisent les galles en poudre avec la moelle des tiges séchées de Combretum aculeatum et du sel. Cette poudre est diluée dans de l'eau immédiatement avant utilisation et est prescrite pour les crampes d'estomac douloureuses avec production de mucus accompagnée de selles et vomissements (Kerharo and Adam, 1974). Outre ces utilisations dans la médecine traditionnelle, certains extraits de cette plante ont été décrits comme présentant des propriétés pharmacologiques: antimicrobienne (Ficarra et al., 1997; Sanogo et al., 1998), antifongique (Silva and Gomes, 2004), antioxydant (Bouchet et al., 2000; Fiot et al., 2006) et trypanocide (Aderbauer et al., 2008). Des effets pharmacologiques sont aussi documentés pour le système nerveux central et sur les cellules cancéreuses (Amos et al., 2001; Bosisio et al., 1997). Des activités in vitro ont été montré pour la désintoxication contre le venin du serpent (Abubakar et al., 2000). Différents extraits organiques (acétate d’éthyle, méthanol et hexane) des feuilles de G. senegalensis ont montré des activités analgésiques, antiinflammatoires et anti malariques in vivo chez la souris, avec une très faible toxicité jusqu’à

600mg/kg présentant des LD50 allant jusqu’à 1.1g/kg (Jigam et al., 2011). Ainsi connu pour sa non toxicité et son large usage par les populations comme « soigne tout », des phytomédicaments ont été développés base de feuilles de Guiera senegalensis pour leur effet antitussif, notamment au Sénégal un médicament traditionnel amélioré par Enda® a été mis à disposition de la population. D’autres aspects et études pharmacologique ont été déjà cité dans le chapitre précédent et l’article (Diop et al., 2017a). G. senegalensis a fait l’objet de plusieurs études phytochimiques et celles-ci ont contribuées à identifier les principaux composants de cette plante. Ainsi on retrouve dans différentes parties de la plante une prédominance des flavonoïdes libres et des tanins catéchiques et galliques, à savoir dans les feuilles, les fruits, les écorces de tiges et de racines.

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On retrouve aussi dans ces organes des stérols, des triterpènes ainsi que des hétérosides cardiotoniques (Somboro et al., 2011).

Dans la plante, différentes parties ont montré des variations quantitatives et qualitatives en ce qui concerne la composition chimique en tanins. Des gallotanins à noyau d’acide quinique et deux tanins condensés (l’épicatéchine et l’épigallocatéchine gallate) ont déjà été isolés (Bouchet et al., 2000). Le principal tanin dans toutes les parties de la plante est l’acide 3,4,5-tri-O-galloylquinique (Bosisio et al., 1997).On y retrouve également l’acide 1,3,4,5-tétragalloylquinique qui a montré des propriétés antiasthmatiques in vivo (Neszmelyi et al., 1993). Des alcaloïdes de la famille des bêta-carbolines ont été isolés des racines principalement de type harmane, harmalane et tetrahydroharmane (Silva et al., 2008). On retrouve également dans les feuilles des guieranones, qui sont des naphtylbutenones montrant une certaine cytotoxité, particulièrement le guieranone A actif contre différentes lignées de cellules cancéreuses (Fiot et al., 2006).

Isolement et identification des composés actifs de l’extrait aqueux de Guiera senegalensis

III.3.3.1 Méthodologie

Comme décrit dans le chapitre 2, l’enquête ethnopharmacologique menée lors de cette thèse a mise en évidence un usage très fréquent par les populations des extraits de feuilles de Guiera senegalensis. L’extrait aqueux traditionnel des feuilles a été soumis à l’essai hôte pathogène pour déterminer son activité antibiotique et antiinfectieuse (Kicka et al., 2014). La méthodologie décrite pour l’isolement et identification des composes actifs à partir de C. aculeatum (III.2.2) a été employée pour les investigations phytochimiques de l’extrait aqueux de feuilles de Guiera senegalensis.

L’extrait aqueux de feuilles de G. senegalensis à montrer une activité in vitro intéressante contre des souches de Mycobacterium marinum exprimant un IC50 de 98 µg/ml (Diop et al., 2017a). L’extrait active est ensuite soumis à des analyses chimiques utilisent les méthodes couplées comme la chromatographie liquide à

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haute performance couplé à l’spectrométrie de masse à haute résolution (UHPLC- HRMS). Les donnes obtenues par ces analyses sont ensuite comparées à ceux des composés déjà décrits dans la famille combrétacée. Ceci est réalisé par un software qui vas interroger des bases de donnes comme le « Dictionnary of Natural Product» (Chapman, 2014). Cette technique de screening chimique va donner une idée de la composition chimique de l’extrait, et dans certains cas permettre l’identification de certains composés connues (dereplication).

L’extrait a été d’abord analysé par chromatographie liquide à haute performance couple à un détecteur à barrettes de photodiodes (PDA) et aussi couplée à un détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL). La séparation a été réalisée utilisant une colonne analytique de phase inversée (C18). Le détecteur PDA a fourni le spectre UV de chaque composé UV actif. Le spectre UV permet dans certaines cas la identification des certaine familles chimiques, comme par exemple les flavonoïdes (Mabry, 1975). En plus, l’analyse CLHP couplée à un détecteur évaporatif à diffusion de lumière (DEDL) a fourni une idée sur la quantité relative de ces composés dans l’extrait (Ganzera and Stuppner, 2005).

III.3.3.2 Déréplication basé sur les analyses HPLC-PDA et UHPLC-HRMS

Les analyses HPLC montrent que les composés (3 à 13) éluant entre 4 min et 28 min présentent des spectres UV donnant des maximas entre 213-220 nm et 270- 275 nm (Figure III.9A) très caractéristiques du chromophore de l’acide gallique (Sary et al., 2004). Ceci a suggéré sur une certaine similarité structurale entre ces différents composés (Figure III.9 et Tableau III.4). La trace du DEDL (Figure III.9C) montre que les composés majoritaires de l’extrait sont très polaires. Ceux- ci pourraient correspondre aux polysaccharides, ce qui vient renforcer les précédentes études notant la présence de glycosides (Fiot et al., 2006; Jigam et al., 2011).

Cette déréplication sur la base des spectres de masse BPI-HRMS (±) (Figure III.10) a notamment permis d’annoter une vingtaine de composés présentés dans le tableau III.4.

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Les fragments MS2 les plus abondants sont présenté en gras, on peut noter dans ce tableau une récurrence des fragments de m/z 169.013 et 191.055 qui informe sur la présence de dérivés d’acide galloyquinique dans l’extrait de G. senegalensis (Clifford et al., 2007).

L’ionisation en mode négatif (NI) BPI-HRMS de 1 montre un composé avec un rapport masse sur charge (m/z) de 191.055 [M-H]- résultant une formule moléculaire (FM) de C7H12O6 (Δppm=2.23) donne 32 hits avec le DNP. 1 a été dérépliqué comme étant l’acide quinique au regard des fragments MS2 de m/z 127.038 et 85.028, des données spectrales et des publications (Bouchet et al., 1998; Bouchet et al., 2000).

- Le composé 4 (m/z de 169.013 [M-H] , C7H6O5, Δppm=4.59) a été attribué à l’acide gallique en utilisant la même approche que pour 1.

Les composés 2, 5 et 6 présentent le même ion négatif [M-H]- avec une m/z de

343.067 correspondant à une formule brute de C14H16O10. Avec le DNP on obtient 5 hits et ces composés seraient attribué aux 3 isomères de l’acide O-galloyquinique présentant des fragments MS2 caractéristique avec m/z 191.055 et 169.013. Les composés 9a et 10 présentent des fragments MS2 similaires (343, 325, 191, 169,

- 125) pour un ion négatif (m/z de 495.078[M-H] , C21H20O14, Δppm=1.680) donnent un hit étant déjà identifié dans Guiera senegalensis. Ces deux composés seraient alors des énantiomères de l’acide 1,5 digalloylquinique.

Pour 12, un ion négatif [M-H]- est retrouvé avec m/z de 647.090 donnant la formule brute de C28H24O18 pouvant correspondre à l’acide 3,4,5-trigolloyl- quinique. Le composé 13 donne un ion proche de ce premier [M-H] - avec une m/z de 799.101 (C28H32O27) identifié comme l’acide 1,3,4,5-tetragalloyl-quinique au regard des fragments MS2 (601, 477, 325, 169, 125), des données spectrales et de la publication (Clifford et al., 2007). Le composé 14 correspondrait à un alcaloïde, le 1,2,3,4-Tetrahydro-2-methyl-β-carboline donnant un ion positif

+ [M+H] avec m/z de 187.123 (C12H14N2).

Les ions négatifs [M-H]- 15 et 16 avec respectivement une m/z de 463.088

(C21H20O12, Δppm = 1.384) et 447.094 (C21H20O11, Δppm = 1.734) n’ont pu être attribué à des composés mais la liste des hits trouvés dans le DNP pour les formules moléculaires indique principalement des flavonoïdes. Le composé 17 donne un ion positif [M+H]+ avec m/z de 163.039 donnant la formule brute de

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C9H6O3 avec 16 hits dans le DNP pouvant correspondre à un dérivé d’hydroxy coumarine avec un spectre UV caractéristique.

+ Les composés 18 (ion positif [M+H] avec m/z de 301.107 et FM de C17H16O5) et

+ 19 (ion positif [M+H] avec m/z de 303.122 et FM de C17H18O5) présentent des spectres UV semblables. Utilisant la recherche DNP restreinte à Guiera, 18 a été identifié comme l’asperxanthone;5-Methylether et 19 correspondrait de manière putative à l’asperxanthone;2,3-dihydro-5-Methylether, deux naphtopyrones déjà citées dans les feuilles de Guiera senegalensis (Silva and Gomes, 2003). Le composé 20 a été dérépliqué en utilisant les données UV et MS déjà publiées (Bucar et al., 1996; Fiot et al., 2006) pour le guieranone A avec la formule

+ C18H20O5 pour l’ ion [M+H] avec une m/z de 317.1389 (Δppm=0.540). Le tableau III.4 présente les détails de la déréplication en mode positif et négatif et liste le nombre de composés identifiés. Afin d’identifier complétement les composés présents dans l’extrait et évaluer leur activité antibiotique, un fractionnement bio guidé par MPLC a été effectué.

Figure III.9: Guiera senegalensis décoction. 10mg/ml. Conditions d’analyse : injection 10µl, Colonne Xbridge® C18 250x 4.6mm ID 5µm, détection UV 280nm. Phase mobile : A: H2O+0.1% acide formique(FA), B: MeOH+0.1% FA utilisant un gradient : 2-30% B entre 0-30min puis 30-100% de B entre 30-50min et finalement 100% B 50-60min. A) Spectres UV (tiré du DAD) pour les composés caractéristiques B) Trace chromatogramme UV 280nm C) Trace DEDL

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Figure III.10 : Spectre UPLC-Orbitrap MS de Guiera senegalensis extrait aqueux

5mg/ml. Conditions : UPLC : Colonne: Waters BEH C18 100 × 2.1 mm i.d., 1.7 μm at 40°C. Condition d’analyse : phase mobile, (A) H2O avec 0.1% FA. and (B) acétonitrile avec 0.1% FA; Flux : 500 μL/min; volume injecté, 2μL; isocratique 2%B pendant 0.2 min, puis gradient 2%−100% B pendant 11 min, puis 100%B de 11 to 13min. HRMS : Condition d’analyse Voltage source, 3.5 kV (po sitif),

2.5kV (négatif); sheath gas flow rate (N2), 52.5 units; auxiliary gas flow rate, 13.75 units; spare gas flowrate, 2.75; capillary temperature, 268.75 °C, S-Lens RF Level, 50. La détection a été effectuée en mode ions négatifs (NI) et ions positifs (PI) avec une plage m/z de 120-1500. Les analyses MS / MS dépendant des données ont été réalisés sur les 3 ions les plus intenses détectés en mode scan complet (Top 3).

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Tableau III.4 : Composés dérépliqués de l’extrait aqueux de C. aculeatum en utilisant le DNP(Chapman, 2014) avec les filtres (Formule moléculaire et Famille “Combretaceae”) plus les articles suivants(Bouchet et al., 2000; Clifford et al., 2007; Fiot et al., 2006)

* Nombre de hits avec filtre formule moléculaire sur DNP ** Nombre de hits avec filtre formule moléculaire sur DNP restreints aux combrétacées

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III.3.3.3 Fractionnement et isolement bioguidé

Pour identifier les composés avec activité antimycobactérienne pour cet extrait aqueux de G. senegalensis. L’extrait lyophilisé a été soumis à un fractionnement par chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC-UV).

Pour cela, 8 g d’extrait lyophilisé ont été triturés avec de la phase inversée C18 et disposer dans une cartouche pour procéder à une introduction solide sur la colonne. Le mélange est injecté depuis la cellule de charge sèche (11,5 x 2,7 cm i.d.) en y faisant passer le solvant. La séparation a été effectuée avec une colonne

® Zeoprep C18 (15-25 µm, 460 x 49 mm, à savoir Zeochem , Uetikon am See,

Suisse). Le système de solvants utilisé était (A) H2O et (B) MeOH contenant tous les deux 0,1% d’acide formique.

La séparation a été effectuée en utilisant la méthode de gradient suivante; 2% de B à 19% de B en 180 min, suivie de 19% de B à 100% de B en 300 min. L'extrait a été introduit dans la colonne MPLC par injection sous support solide. La cellule de charge sèche était connectée entre la pompe et la colonne MPLC. Le débit a été réglé à 15 ml/min. La détection a été effectuée à 254 nm et 280 nm. La MPLC a donné 38 fractions distinctes après regroupement des fractions obtenues. Ces fractions ont été lyophilisées ou séchées au rotavapor et conservées au réfrigérateur pour usage ultérieur (Figure III.11).

Pour effectuer les essais antiinfectieux, les fractions ont été solubilisées dans de l’eau milli-Q à 10 mg/ml, puis 4 µl de chaque fraction (correspondant à une concentration de 0.2 mg/ml) a été déposé dans les puits d’une plaque 96puits contenant les milieux avec A. castellanii infecté par M. marinum GFP (Diop et al., 2017a). Les actions antimycobactériennes sont évaluées en faisant le monitoring pendant 72h de cette croissance par lecture de fluorescence toutes les 3 heures, a permis de mettre en évidence les fractions les plus actives. Ci-dessous une courbe représentative d’un test de quelques fractions montrant le RFU (fluorescence) normalisé en fonction du temps (Figure III.12).

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Figure III.11 : Fractionnement de Guiera senegalensis par MPLC. 8g d’extrait trituré avec 32g de Zeoprep® Silicagel C18(40-63Å) pour injection. Colonne Zeoprep C18 (15-25 µm, 460 x 49 mm), Débit 15ml/min, Détection UV 280nm. Fractions présentant une bonne activité antimycobactérienne sont annotées et mises en vert.

Figure III.12 : Courbes représentatives d’expériences semblables (n=3) pour l’inhibition de croissance de M. marinum avec le test antiinfectieux pour les fractions de G. senegalensis. Fluorescence relative (RFU) en fonction du temps (heure). A) Comparaison entre les fractions 10,12,13,14,27 et 31 (C°= 0.2 mg/ml) par rapport au contrôle (H2O) 128

L’extrait de Guiera senegalensis pour lequel un IC50 de 98 µg/ml a été trouvé, montre une activité sur la croissance des mycobactéries dans les amibes (Figure

II.4D, Images à T0 et T72) d’où son pouvoir antiinfectieux contre Mycobacterium marinum(Diop et al., 2017a). Cet extrait fractionnée à l’aide de la MPLC a pu révéler les fractions les plus actives dans l’extrait et ainsi elles ont été identifié. Principalement, les fractions Fr27 et Fr31 ensuite suivent les fractions Fr12, Fr13 et Fr14. Le fractionnement par MPLC a abouti pour certaines de ces fractions à l’isolement de composés purs. Grâce à l’analyse RMN de ces différentes fractions, l’identité des composés isolés suivants a été déterminé en fonction des fractions investiguées (Annexe 6: RMN 1H des fractions). Les composés isolés et totalement caractérisés sont documentés ci-dessous :

Tableau III.5 : Identification des composés isolés avec structures confirmées par RMN de l’extrait aqueux de G. senegalensis et les informations du DNP(Chapman, 2014).

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Figure III.13 Structures des dérivés galloyquiniques et autres composés retrouvés puis identifiés dans la décoction de Guiera senegalensis

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Les composés présentant les meilleures activités dans l’extrait sont la gallocatéchine (Fr14), l’acide 1,3,4,5-tetra-O-galloylquinique (Fr27) et la fraction Fr31 qui n’a pas totalement identifiée mais dérépliqué comme pouvant être un dérivé flavonoïde.

Figure III.14: Comparaison entre les Fr27, Fr31 de Guiera senegalensis et de la punicalagin toutes à 0.2 mg/ml avec les contrôles positif (rifampicine) et négatif (H2O)

La figure III.14 présente une activité antiinfectieuse semblable entre la punicalagine décrite dans C. aculeatum et les fractions Fr27 et Fr31 de G. senegalensis. D’où un intérêt comparable entre ces deux combrétacées utilisées traditionnellement pour le traitement de la tuberculose.

Ainsi, pour la première fois que l’activité antimycobactérienne de l’acide 1,3,4,5 tetragalloylquinique (Fr27) est présenté, malheureusement leurs IC50 dans ces essais n’ont pu être déterminé lors de ce travail.

Des études complémentaires sur ces fractions et les composés isolés devraient

être faites afin de déterminer les IC50 respectifs de chaque composé et des analyses/purification plus poussés pour isoler un maximum de composés purs.

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L’extrait aqueux de Guiera senegalensis a montré une très faible toxicité pour les cellules d’amibe utilisées et dans d’autres études la décoction n’a montré aucune génotoxicité comparé à des extraits méthanoliques (Bosisio et al., 1997). Des extraits au méthanol et à l’acétate d’éthyle ont récemment montré une activité in vitro contre M. tuberculosis présentant un IC50 de 2.80 µg/ml et ~40 µg/ml (Adebiyi, 2016).

Les activités antiinfectieuses contre les mycobactéries rencontrées pour les gallotanins identifiés dans G. senegalensis et les ellagitanins isolés de C. aculeatum ont inspirées les recherches de littérature et discussion sur leur biodisponibilité afin de comprendre leur possible activité thérapeutique chez l’homme.

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Discussion sur la biodisponibilité des tanins

Lorsque des médicaments ou des remèdes sont prescrits et utilisés, la voie d’administration est relevante afin de pouvoir évaluer les activités pharmacologiques attendues pour une efficacité au niveau des cibles thérapeutiques. Dans le cadre de la tuberculose, les composés présentant une activité doivent atteindre la circulation systémique et ainsi pouvoir se disséminer dans les différents organes infectés. Les extraits de C. aculeatum, G. senegalensis et autres plantes utilisées lors de prise en charge traditionnelle de la tuberculose sont majoritairement consommés par voie orale chez les patients.

Cependant des études de bases sur une activité in vitro concernent le plus souvent l’extrait utilisé, alors qu’il est consommé par voie orale. Ainsi pour avoir un lien avec la réalité physiologique chez l’humain, il faudrait savoir si les extraits avec leurs substances actives atteignent la circulation systémique pour inhiber la croissance des mycobactéries.

Concernant les études de biodisponibilité, le premier facteur est l’absorption au niveau du système digestif donc les essais de laboratoire utilisés, ont pour objectif d’évaluer la perméation membranaire des molécules étudiées. Ce sont des paramètres physiologique et biochimique que ces études permettent de déterminer. Principalement, il y’a l’étude du métabolisme en fonction des propriétés physico-chimiques des molécules (log P etc.), de leurs interactions avec les membranes, les enzymes et le milieu intestinal. Il faut noter que la barrière intestinale est constituée d’entérocytes qui modulent le transport des nutriments et des médicaments. Ceux-ci sont transportés vers la circulation sanguine à travers le système entéro-hépatique avec possibilité de métabolisation des différentes molécules en d’autres substances, soit pour leur action systémique ou leur élimination (Alqahtani et al., 2013).

Ce travail a montré dans les paragraphes précédents que lors d’une prise orale d’ellagitanins et dérivés, une faible biodisponibilité de la punicalagine était observée et certains métabolites tels que l’acide ellagique et les urolithines sont retrouvés dans le plasma humain. Ce métabolisme serait important à étudier et comprendre car étant totalement variable entre individus en fonction du microbiote (Bialonska et al., 2010).La présence de punicalagine a été déjà démontrée dans l’écorce de grenade comme première source connue. Vu la consommation

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ubiquitaire du fruit de la grenade, il existe beaucoup d’études concernant les extraits de grenade utilisés comme complément alimentaire ou dans les médecines traditionnelles. Une synthèse brève de celles-ci vient documenter les aspects de disponibilité et de toxicité.

En restant sur la problématique de la tuberculose, on note que des extraits hydro- alcooliques du fruit entier de Grenade sont utilisées à Cuba pour le traitement des bronchites chroniques et autres maladies respiratoires (Vidal et al., 2003). Et des études de toxicité in vivo montrent que des doses de ces extraits allant jusqu’à 730 mg/kg n’étaient pas toxiques chez le rat (Vidal et al., 2003). D’autres études montrent également une faible toxicité des extraits standardisés à 30% de punicalagine après administration chronique donnant un LD50 par voie orale de 5 g/kg d’extrait (Patel et al., 2008).

La très faible toxicité des ellagitanins identifiés comme antiinfectieux donnent un intérêt à pousser la recherche sur leur biodisponibilité à partir des extraits de combrétacées étudiés. Du point de vue chémotaxonomique, les combrétacées sont proches des punicacées selon la classification par Cronquist et Engler (Yoshida et al., 2010) et ceci est également soutenue par la présence de ces ellagitanins simples et monomérique tels que la punicalagine, caractéristiques de ce rapprochement. Et des approches de compréhension de voies biosynthétiques (Figure III.15) montrent un certain parallélisme entre gallotanins et ellagitanins d’où une possible corrélation sur leur métabolisme chez l’humain.

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Figure III.15 : Proposition de voie métabolique pour la formation des ellagitanins et des gallotanins tirée de (Bouchet et al., 1998)

Ces arguments viennent apporter des perspectives relevantes pour poursuivre ces études d’activité. Il serait alors intéressant de développer des essais de perméation, de métabolisme sur ces deux familles de tanins.

Dans le chapitre suivant, seront présentés les aspects de chimie analytique et de développement de méthode pour le dosage et la standardisation des phytopréparations. Il sera également abordé le contrôle de qualité des médicaments avec la méthode de l’électrophorèse capillaire appliquée aussi dans ce travail pour les dosages de ces extraits de plantes notamment aux extraits aqueux de C. aculeatum.

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CHAPITRE IV

CONTRÔLE DE QUALITE PAR ELECTROPHORÈSE CAPILLAIRE

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Contrôle de qualité par l’électrophorèse capillaire

Dosage de la punicalagin dans les extraits de Combretum aculeatum Vent.

Les recherches présentées ici sont issues d’un travail de Master en sciences pharmaceutiques effectué en Juin 2017 en collaboration avec Mme Jenna Jacquat et M. Nicolas Drouin. Ce travail est disponible dans l’archive ouverte de l’université de Genève.

Résumé

Plusieurs parties de la plante sont utilisées traditionnellement en Afrique de l’Ouest en thérapeutique et celles-ci contiennent des composés actifs avec une action antimycobactérienne démontrée in vitro, comme la punicalagine. Nos précédentes études ont montré une activité significative (Diop et al., 2017a) d’extraits aqueux de Combretum aculeatum sur le modèle hôte-pathogène. Cette plante contient notamment de la punicalagine et celle-ci s’est révélée être un des principes actifs majeur pour l’activité antimycobactérienne dans nos essais.

Dans une optique d’évaluation de ces phytopréparations, il est nécessaire de pouvoir contrôler la qualité d’extraits aqueux de C. aculeatum et donc de développer une méthode analytique permettant le dosage quantitatif de la teneur en punicalagin. L’électrophorèse capillaire (CE) a montré des preuves d’efficacité et de robustesse pour l’analyse des extraits de plantes (Gotti, 2011). Ainsi, ces 20 dernières années elle a démontré une capacité à analyser de nombreux composés avec une bonne sélectivité. De plus, c’est une technique parfaitement adaptée aux pays en voie de développement car c’est une méthode analytique qui présente une relative simplicité et de nombreuses qualités tels que des coûts d’analyse faible, et la possibilité de travailler avec des solvants aqueux préservant l’environnement.

Le travail effectué a permis le développement d’une méthode CE pour quantifier la punicalagine présente dans les extraits aqueux de C. aculeatum, permettant son application en Afrique. Cette méthode développée a permis l’analyse de différents extraits de C. aculeatum avec la détermination des teneurs en PNG pour les parties

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aériennes de la plante et en fonction des périodes de récolte. Cette étude fait l’objet fruit d’une publication scientifique, actuellement en soumission.

Quantitative CE analysis of punicalagin in Combretum aculeatum extracts traditionally used in Senegal for tuberculosis treatment

ElHadji Assane Diop 1,2, Jenna Jacquat 1, Nicolas Drouin1, Emerson Ferreira Queiroz 1, Jean-Luc Wolfender 1, Tahir Diop2, Julie Schappler1, Serge Rudaz *1

Affiliation

1 School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, University of Lausanne, CMU – Rue Michel Servet 1, 1211 Geneva 11, Switzerland

2 Biology Department, Université Cheikh Anta Diop, Dakar, Senegal

Correspondence

*Prof. Serge Rudaz

School of Pharmaceutical Sciences, Analytical sciences - University of Geneva

CMU - 1, rue Michel Servet, [email protected]

Tel: +41 22 37 96572

Fax: +41 22 379 33 93

Publication en cours de soumission pour « Electrophoresis ». Contribution personnelle dans la conception du projet, le développement de la méthode et la rédaction de l’article

Keywords: Capillary electrophoresis, Combretum aculeatum, Punicalagin, Tuberculosis, Method development

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Abstract

Punicalagin (PNG) is an ellagitannin isolated from an aqueous extract of Combretum aculeatum, this extract used in traditional medicine has showed antimycobacterial activity.

In the search of novel lead compound or medicine against tuberculosis, an ethnopharmacological survey combined with a host-pathogen assay has highlighted this extract. Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of Tuberculosis, an infectious bacterial disease which most commonly affects the lungs. Punicalagin (PNG) was isolated and linked to the biological activity.

The extract was analyzed by CZE, the most used electrophoretic technique in herbal medicines quality control. Internal standards approach was used for a better reproducibility on mobility and integral data. After optimization the conditions below were employed: Silica capillary of 75 µm ID and 65 cm effective length, BGE 25 mM Phosphate at pH 7.4, hydrodynamic injection of samples, 15kV as separation voltage and detection by UV absorbance at 280nm.

A standard addition method was developed comparing the area ratio between diclofenac and PNG for each analysis to avoid matrix effect. An application of the method was tested on extracts to determine the content of PNG related to extractions mode, decoction duration, origins of herbs and harvesting period. This developed method permits to show that decoction during 30 min in boiling water is the best extraction modus of C. aculeatum in terms of PNG content.

The leaves have the higher content in PNG (~5.45 %) compared to seeds (~2.80 %) and stems (~2.45 %). Finally, the appropriate harvesting period in Senegal, for the aerial parts of C.aculeatum, seems to be in May where the maximum PNG content of 17.6 % is found.

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Introduction

Tuberculosis (TB) is an infectious bacterial disease caused by Mycobacterium tuberculosis, which most commonly affects the lungs. According to WHO, TB remains one of the world’s deadliest communicable diseases. In 2014, it was reported 6 million of new cases of TB and an estimated 9.6 million people developed TB and 1.5 million died from the disease, 27% of whom were HIV- positive (WHO, 2015).

This situation has worsened with development of resistant strains and living condition of populations promoting the infection diffusion. In the last few years, the number of resistant TB cases has dramatically increased and most of new TB cases are localized in Africa. One of the most important factors of the growing epidemic is attributable to HIV prevalence (Chaisson and Martinson, 2008) and About 10% of infected people develop the clinical Pulmonary TB disease because of their immune system weakness.

TB is a curable disease; the first line treatment consists in a 6 months rifampicin based-regimen with a combination of 4 antibiotic drugs: Rifampin, Isoniazid, Pyrazinamide and Ethambutol (RIPE) in two phases. 'The treatment of TB has become increasingly difficult due to a limited clinical benefit achieved with this standard of care due to the emergence of an increasing number of multiple drug resistant M. tuberculosis (MDR-TB) strains, as well as an increase in the prevalence of HIV/AIDS This treatment give a good success but the percentage of rewards and failure on therapy is estimated at 10% (Korzeniewska-Kosela, 2016). Serious side effects of TB drugs aren't common but can be dangerous when they do occur because medications can be highly toxic to the liver (Yee et al., 2003).

Eighty percent (80%) of population in Africa uses traditional medicine as a first aid for treating affections, sometimes these medicines are combined with modern medicine (Cunningham, 1993). Many plants are claimed to be useful to treat TB symptoms and are used by population and recommended by healers. Some reviews have categorized natural products and their susceptibility to inhibit mycobacterial growth (Bunalema et al., 2014; Green et al., 2010; Negi et al., 2010). Thus ethnopharmacological surveys are used to guide such selection of interesting medicinal plants (Bunalema et al., 2014). According to the requirement of the Nagoya Protocol on Access to Genetic Resources, plants have to be studied

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in respect of traditional knowledge holders and intellectual property rights (Roa et al., 2016). It was conducted in this study an ethnopharmacological survey in Senegal from March to July 2014, interviewing TB patients and traditional healers on their use of medicinal plants against TB symptoms. Twelve different herbal drugs were collected and extracted in Phytochemistry Lab according to traditional use (Diop et al., 2017a). Extracts of these plants were submitted to a whole-cell based assay.

The identification of antimycobacterial plant extracts are assessed by an original host-pathogen assay on M. marinum (Kicka et al., 2014) and the extracts have been analyzed by HPLC-UV-ESI-MS in view to dereplicate known compounds (Wolfender and Queiroz, 2012). This approach leads to a revelation of good antitubercular activity from the decoction of Combretum aculeatum aerial parts. The approach combining bioassay guided isolation, UHPLC-TOF-MS analysis and NMR assignments allows to the efficient identification of α- and β-anomers of Punicalagin present in C. aculeatum. PNG was already found in Punica granatum, Combretum molle and Terminalia chebula (MacDonald et al., 2014). PNG has been described as active against many Mycobacterium strains in vitro (Asres et al., 2001).

C. aculeatum is traditionally used as purgative, for helminthiasis, for the treatment of wounds, stomachaches, colic, gonorrhea, loss of appetite and leprosy. In Senegal population uses decoction of C. aculeatum to treat catarrh. Phytochemistry of this plant is not yet documented but elemental and constituents analysis reveals about 7% of tannins constituent in leaves (Arbonnier, 2009; Orwa et al., 2009). A recent work was done during this work on the characterization of compounds isolated from the aqueous extract of C. aculeatum(Diop et al., 2016).

In the context of development of efficient quality control methods, a cost effectiveness approach is essential for developing countries and to adapt financial costs for pharmaceutical analysis. In US pharmacopeia and European pharmacopeia, a general trend for QC is to use liquid chromatography but this involves high maintenance, column and solvents costs. Capillary zone electrophoresis is one of the simplest CE method widely use in separation and analysis of natural products due to its versatility and high separation power (Gotti, 2011). Furthermore CE is considered as of the most economical alternative for drug analysis and the recent development of instruments dedicated to control of

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counterfeit drugs in developing countries (Marini et al., 2010). In the other hand some validated methods in CE permits also a simultaneous analysis of Fixed dose combined drugs such as RIPE drugs for TB treatment (Faria et al., 2010). Separation and analysis of several phytochemical compounds by CE have been reviewed and offer a wide range of methods for herbal drugs fingerprinting (Gotti, 2011). With the abovementioned reasons, a rapid, highly efficient and cost- effective CE method is developed and applied on different batches of samples herein, suitable for the quantification of punicalagin in C. aculeatum extracts.

Figure IV.1. Combretum aculeatum aerial parts and Chemical structure of punicalagin (PNG).

Materials and methods

IV.2.3.1 Plant material

The plant parts were collected in regions of Fandene, Dakar and Kaffrine in Senegal. Combretum aculeatum Vent. aerial parts were collected in Senegal (from April to July 2014) and identified by Dr Matthieu Gueye & team at University Cheikh Anta Diop of Dakar (IFAN, herbier). Voucher specimen for Combretum aculeatum (N° G00431528) has been deposited at the Herbarium of “Conservatoire des Jardins botaniques de la Ville de Genève”, Geneva (Switzerland). The dried plant materials were brought to the School of Pharmaceutical Sciences for further studies with a material transfer agreement (MTA) signed by both universities of Dakar and Geneva. Extractions were done according to the traditional described preparation way.

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That was almost decoction in water. Dried C.aculeatum leaves, flowers, fruits and stem were disposed in flask with demineralized water and bring to boil for 10 to 120 min. Upon evaporation and lyophilization dried extracts were obtained and conserved between 2 and 8°C for further analysis.

IV.2.3.2 Samples and Reagents

The deionized water (H2O) used throughout the study was prepared by a Milli-Q Direct 8 Millipore system (Milford, Billerica, MA, USA). HPLC-grade acetonitrile (ACN), methanol (MeOH), 2-propanol and formic acid (FA) were products of Biosolve, Valkenswaard, Netherlands and Fischer Scientific UK (Leics, UK). Trisaminomethane (TRIS), anhydrous sodium dihydrogen phosphate, sodium tetraborate decahydrate, NaOH, ammonia and phosphoric acid 85% (w/w) were of analytical grade and purchased from local commercial suppliers of Sigma-Aldrich (Steinheim, Allemagne).

CE-analysis were performed using methanol HPLC grade and with H2O (Millipore, Billerica, MA, USA). Punicalagin standard (purity >99% by HPLC) was purchased from Phytolab® (Vestenbergsgreuth, Germany), Ellagic acid (purity 98%) from (Sigma Aldrich, Switzerland) diclofenac from Acros Organics (New Jersey, USA).

IV.2.3.3 Analytical methods

Compound isolation from the extract of Combretum aculeatum using Medium Pressure liquid chromatography (MPLC-UV)

The dried aerial parts (31 g) were extracted under decoction with water (1L during 30min). The residue was evaporated and lyophilized to obtain 4 g (12.9%). A portion of that extract was fractionated using MPLC with Zeoprep C18 as the stationary phase (PS 25µm, 460 x 49 mm i.d.; Zeochem®, Uetikon am See,

Switzerland). The solvent system used was (A) H2O and (B) MeOH both containing 0.1% FA in the following gradient; at room temperature (~20°C). Start 5% B, 18min 5% B, 177min 20%B, 126min 50% B, 63min 100% B. The extract was introduced in the MPLC column by dry injection. For this, 2g of the extract were

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mixed with 8 g of Zeoprep C18 stationary phase. The mixture was conditioned in a dry load cell (11.5 x 2.7 cm i.d). The dry load cell was connected between the pump and the MPLC column. The flow rate was 30 mL/min, and the UV absorbance was detected at 254 and 280 nm. The MPLC yielded 44 fractions. The fractions were analyzed by HPLC-UV and HRMS.

LC-MS analysis: Chromatographic separation was performed on a Thermo Dionex Ultimate 3000 UHPLC system interfaced to a Q-Exactive Focus mass spectrometer (Thermo Scientific, Bremen, Germany), using a heated electrospray ionization (HESI-II) source. The LC conditions were as follows: column, Waters BEH C18 100 × 2.1 mm i.d., 1.7 μm at 40°C; mobile phase, (A) water with 0.1% formic acid and (B) acetonitrile with 0.1% formic acid; flow rate, 500μL/min; injection volume, 2μL; isocratic 2%B over 0.2min, then gradient 2%−100% B over 11 min, then100%B from 11 to 13min. In positive ion mode, diisooctyl phthalate C24H38O4 [M + H] + ion (m/z 391.28429) was used as internal lock mass. The optimized HESI-II parameters were as follows: source voltage, 3.5 kV (pos),2.5kV(neg); sheath gas flow rate (N2), 52.5 units; auxiliary gas flow rate, 13.75 units; spare gas flowrate, 2.75; capillary temperature, 268.75 °C, S-Lens RF Level, 50. The mass analyzer was calibrated using a mixture of caffeine, methionine-arginine- phenylalanine-alanine-acetate (MRFA), sodium dodecyl sulfate, sodium taurocholate and Ultramark 1621 in an acetonitrile/methanol/water solution containing 1% acid by direct injection. The data-dependent MS/MS events were performed on the 3 most intense ions detected in full scan MS (Top3 experiment). The MS/MS isolation window width was 1 m/z, and the stepped normalized collision energy (NCE) was set to 15 – 30 – 45 units. In data- dependent MS/MS experiments, full scans were acquired at a resolution of 35 000 FWHM (at m/z 200) and MS/MS scans at 17 500 FWHM both with a maximum injection time automatically determined. After being acquired in MS/MS scan, parent ions were placed in a dynamic exclusion list for 2.0 seconds. Data were acquired in the centroid mode.

Detection was performed in both negative and positive ion mode (NI) with a m/z range of 120–1500 m/z. All instruments were controlled by Thermo scientificTM XcaliburTM software system. The molecular formulae were calculated using the ‘elemental composition’ module version (Thermo Fischer scientific).

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CE-UV analysis: All CE experiments were performed on a ProteomeLab® PA 800plus system (Beckman coulter, Walbronn Germany) equipped with a photodiode array detector (PDA) and 32-karat V9.1 software for data handling. Fused silica capillaries with different diameters (50 and 75 µm) and total lengths (35 to 75 cm) from Polymicro® were used. Conditioning of new capillary was conducted by flushing with MeOH for 3 min at 30psi followed by H2O for 3 min. According to the working pH, capillaries were then conditioned with 1 M NaOH (3 min) followed by H2O (3 min) and 1M HCL (3 min) for pH≤ 6.5. NaOH and HCL were interchanged at pH ≥ 6.5. Prior to all runs capillaries were flushed with the BGE for 3 min. Analysis were performed at room temperature ~ 20° C. UV detection was performed at 200, 254, 280 and 366 nm. All quantification studies were performed at 280 nm. Hydrodynamic injections were performed at 0.5 psi x 5s and running voltages were between 10 kV and 20 kV (generating current from 20 to 115 µA).

IV.2.3.4 Preparation of running buffers and solutions

In published studies borate buffers and phosphate buffers are well documented for CZE analysis of polyphenolic compounds in plant extracts and they prove a good technique on such kind of analysis (Ehala et al., 2005; JI et al., 2013). Buffers were prepared by weighting/pipetting appropriate and predetermined amounts of sodium tetraborate decahydrate or phosphoric acid 85% (w/w). The pH settings were done by addition of adequate amount of 1M Tris, 1M sodium hydroxide or 1M ammonia all prepared in water.

IV.2.3.5 Sample preparation for CE

Unless stated otherwise, stock solutions of punicalagin were prepared in water at 1 mg/ml (1000 ppm). Further dilutions were done in water. Stock solutions of extracts and fractions containing punicalagin and punicacortein D were done at 10mg/ml in water. Stock solution of diclofenac (IS) was prepared in methanol at 10 mg/ml. The herbal drug was prepared by water extraction decoction, maceration or infusion during different time. Then after the extracts were lyophilized to obtained dry extracts and conserved in the fridge (2-8°C) until further use.The concentration range used in standard addition method was 50-400 ppm. During the quantification all solutions were freshly made and used in the

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same day. Quantification of punicalagin was done in different aqueous extracts of C. aculeatum. To prepare samples for analysis, the lyophilized extracts were dissolved in water for stock solutions and then brought at appropriate dilution for CE experiments.

Results and discussions

IV.2.4.1 Selection of the antimycobacterial extracts

The ethnopharmacological survey conducted in Senegal in 2014, showed the use of medicinal plants for treating TB symptoms. According to the traditional use, 12 plants were extracted by decoction (30min in boiling water) to assess their activities. Then aqueous extracts of harvested plants were submitted to a bioassay for antimycobacterial purpose.

In the framework of new antitubercular drug search a host-pathogen bioassay based on the ingestion of Mycobacterium marinum by Acanthamoeba castellanii have been recently validated (Kicka et al., 2014). The activity was measured by monitoring the growth inhibition of M. marinum in presence of plant extracts compared to a reference drug Rifampin and a blank. This assay has the particularity in the mimesis of the Mycobacteria ingestion by macrophages in Human. These approaches lead to a revelation of good antitubercular activity from the decoction of Combretum aculeatum aerial parts. This extract present an IC50 lower than 0.5mg/mL (Diop et al., 2017a) and was analyzed by HPLC-UV-ESI-MS in view to dereplicate active compounds.

UHPLC-MS analysis and semi preparative chromatographic methods as MPLC combined with a bioassay guided fractionation permit us to isolate one major active compound in the extract (Diop et al., 2016). The details of the LC-PDA-MS analysis on C. aculeatum extract and identification of active zone (Figure IV.2) corresponding to α and β forms of punicalagin (PNG) (2 and 3).

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Figure IV.2: LC-MS analysis of C. aculeatum aqueous extracts

These identifications of product 1 Punicacortein D and PNG (2,3) were confirmed by NMR and comparison to the acquired standards(Diop et al., 2016). To confirm the activity of punicalagin, the host-pathogen assay was assessed with comparison to the positive (Rifampin) and negative control (DMSO and H2O). Punicalagin exhibited an IC50 of 1.96±0.78µg/ml compared to to the antibiotic control Rifampin presenting an IC50 1.87±0.25 µg/ml (Diop et al.,2018 submitted article). Therefore, punicalagin could be considered as an interesting marker of antimycobacterial activity to standardize or qualify the aqueous extracts of Combretum aculeatum.

To learn more about the amount of PNG present in active extracts, it’s important to characterize C. aculeatum aqueous extracts on their content in PNG. Considering these results an attempt to quantify the content of PNG in this C. aculeatum extract is done and a method development by CE is presented in this paper. Simple, reliable, and cost-efficient drug control approaches are needed for such phytomedicine (Martino et al., 2010). Short analysis time, simple instrumentation, low sample and solvent consumption as well as reduced operating costs are relevant for the quality control of drugs and phytomedicine in developing countries.

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Capillary electrophoresis (CE) can give a high separation efficiency and good resolution power for complex samples (Ignat et al., 2011).

In this work CE was chosen because of the technique possibility to rapidly evaluate drug quality and characterize plant extracts (Gotti, 2011). The recent works on medicinal plants analysis (Ganzera, 2008; Marini et al., 2010; Rudaz and Schappler, 2016; Sarr et al., 2016a)and method development for quality control of drugs by CE (Sarr et al., 2016a) show that CE technique could be easily used for the local QC of C. aculeatum extracts.

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IV.2.4.2 Quantitative method development by CZE for punicalagin in C. aculeatum extracts

CE-UV

In order to have a good separation of ellagitannins found in the C. aculeatum extract, a first selection of the nature of the background electrolyte (BGE) with borate, phosphate and combination of both buffers was considered. Various concentrations at different pH of phosphate and borate buffers were investigated as well as the nature of the counter ion with 1M NaOH, 1M NH4OH and 1M Tris buffering.

Because ellagitannins are phenolic compounds, they can be analyzed in CZE using borate buffer due to the stabilized complex formed between Bore and hydroxyl groups (Kapnissi-Christodoulou, 2012). Briefly, the use of basic borate buffer in CZE allows generally a good separation of polyphenolic compounds in plant extracts, since these form stable complexes with borates (Juang et al., 2004; Kapnissi-Christodoulou, 2012). Punicalagin has a predicted pKa of 1.90 (Swain, 2012), but due to the chiral carbon png has a varied ratio of enantiomers at fixed pH. Thus buffer pH between 6 and 10 could be used where a highest ratio of one of enantiomers is in majority (Swain, 2012). Starting with the 25mM borate buffer (pH 10 and pH 9), an important peak distortion of punicalagin standard was observed. Migration time were found to increase at higher pH, probably due to the increase in the negative charge of punicalagin and greater complexation with borate through the phenols moieties (Kapnissi-Christodoulou, 2012). An important current was observed with the borate buffer 25mM (85 μA) inducing possibly a joule effect and a decrease in resolution (peak broadness and deformation).

A combination of borate at 25mM and phosphate at 5mM in buffer (pH 7) was efficient for the separation of gallotanins (Juang et al., 2004), but when mixing phosphate to borate buffer, the peak deformation was reduced but remains relatively large.

Approaches using phosphate buffer alone or in combination are also used for plant extracts fingerprinting and analysis (Tubaon et al., 2014; Zhou et al., 2008). Using a phosphate buffer (30mM) and Tris (30mM) at pH 8.4 with an applied voltage of

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20kV, a CZE method showed suitable quantification for ellagic acid in pomegranate peel extracts (Zhou et al., 2008).

When using only phosphate buffer, better peak shapes were obtained and therefore higher resolution to the increase the efficiency of the separation. An important reduction in migration time was also obtained.

Since plants extracts are complexes and can contain a high diversity of compounds, it is important to have an optimized separation before quantification of compounds and to be sure that any co-migration is observed. Therefore, for further method development, not only the available standards were used but also several extracts of C. aculeatum, allowing to evaluate the selectivity between PNG and the main interfering compounds.

Considering that when the concentration of the buffer increases (25-75 mM), the migration time increased due to the decrease in EOF, the final concentration was set at 25mM. Achievements of analysis at four levels of the BGE pH between 6.6 and 12.9, showed that the high pH were not appropriate to obtain a good separation for the two compounds of interest, PNG and punicacortein D. The pH between 6.6 and 7.4 gave better separation profiles and the pH of BGE at 7.4 afforded a better resolution.

The counter ion Tris (1M) was selected giving less variability on analysis and better separation. This can due to the basic aspect of Tris which improve the viscosity of the buffer and could prevent absorption of analyzed compounds on capillary wall (Varesio et al., 1999).

At low voltage (10kV), the analysis time was very long (~ 50 min) and at 20kV a joule heating effects was observed, resulting to a high current generation and peak broadening. A low resolution was observed for extracts analysis. A voltage of 15kV was a good compromise giving a satisfactory resolution for the compounds of interest and result on an analysis time of 30min, which is reasonable for the analysis of complex matrices.

Temperature analysis was set at ambient temperature (~25°C). The hydrodynamic injection of samples were adapted to obtain à maximum volume of 1% of the capillary to avoid peak broadening.

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Internal standard choice

To anticipate the quantitative performance of the developed method, the selection of an appropriate internal standard (IS) was achieved. The latter is mandatory according to the complexity of the plant matrix and should allow correcting the variability on the injected volume of samples.

The required characteristic for the IS were to be an acidic compound to present a good separation with the PNG and also to present any co-migration with other analyte that was evidenced in the extract. A choice of a relatively simple internal standard with acidic pKa under 5 was an important criterion. After several assays, diclofenac was selected because of it presents a good separation in the matrix against punicalagin and other compounds present. Diclofenac could be easily detected at interesting wavelengths, 254nm (low cost capillary electrophoresis) and 280nm for UV detection.

The stability and the commercial availability of the IS for further use of the method in Senegal were also one of the criteria of choice. Diclofenac give us a better compromise, regarding the electropherogram below (Figure IV.3C) with the extract containing diclofenac as IS.

Optimized method conditions

The optimization process and studies on extracts permit to choose adapted conditions for the quantitative analysis of punicalagin in C. aculeatum extracts. The most adequate conditions found for this dosage were the following: 25mM phosphate buffer at pH 7.4 (with 1M tris), applied voltage 15kV; temperature 25°C; 0.5psi during 5s hydrodynamic injection; UV detection at 280nm; diclofenac is used as internal standard.

Using this method we could have a good resolution and selectivity between punicalagin, punicacortein D and the IS diclofenac. Any co-migration is observed.

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Figure IV.3. Electropherograms of A) CZE standard analysis of C. aculeatum extract at 2000 ppm with 500 ppm diclofenac as internal standard (IS) (*punicalagine, **punicacortéine D, *** diclofénac) B) punicalagin (PNG at 300ppm) and internal standard diclofenac (500ppm) compared to C) the extract at 2000ppm. Conditions: BGE: 25 mM, phosphate buffer pH 7.4; applied voltage: 15 kV; temperature: 25°C; 0.5psi × 2 s hydrodynamic injection at the long-end of the capillary. Analysis time 30min. UV Detection at 280 nm.

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IV.2.4.3 Quantitative aspects

C. aculeatum plant is traditionally consumed using different modus of extraction with water, and population used to take for antitubercular purpose the aerial parts containing leaves, flowers, seeds and stems. That’s why, in this part of our study we would like to assess which type of extraction and duration give a better content in Punicalagin which is a marker of antimycobacterial activity. It is also important to know about parts of plant to be used (leaves, stems or seeds) and the best period for harvesting plants. It’s well known that many factors can affect the composition of a plant including the age of the plant, soil composition, presence or absence of different nutrients, sun exposition (growing region), usage of pesticides and many more(Daniel et al., 1999). One of the accessible factors that could be measured is the variability depending on the age and harvesting season for each plant species. For an extract, it’s relevant to find a good extraction method and mainly in traditional medicine where a wide range of formulations are used. For development of Improved traditional medicine or phytomedicine, herbal drugs have to be standardized on a known compound active or mainly present (Folashade et al., 2012). Thus, it is relevant to know about which extraction give a better content on active principle. Method development for plant extract analysis and quantification has the particularity to be dependent on the complexity of the samples to analyze. In most of cases, the complete compounds content is not well known and standardization and fingerprinting are based on known active principle (Folashade et al., 2012). Thus response functions, detection limit and quantification possibility have to be assessed first with an adapted methodology.

IV.2.4.4 Method application: consistency analysis of different extracts

The antimycobacterial assays have highlighted C. aculeatum aerial parts decoction as an active extract against Mycobacteria (Diop et al., 2017a) and the bioassay guided isolation showed an interesting activity of punicalagin identified in this extract (Diop et al., 2016). Because analytical studies are needed to know which part of the plant, modus of extraction, or period of harvesting give a good concentration of the identified active principle PNG.

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The method developed should be applied to different extracts for quantification purpose. Due to the variability of the investigated matrices, namely seeds, leaves and stems, a standard addition method was considered.

A plot of response versus spike concentration of PNG was first investigated. Ten concentration levels between 50 and 700 ppm were analyzed in replicates and the results showed a linear response function between 50 and 400 ppm with a resulting determination coefficient R2 of 0.988. At higher concentration (400-700 ppm), a relative important curvature has been observed. The sensitivity of the method was evaluated for determination of punicalagin. The LOD of PNG was determined at 39 ppm yielding a signal-to-noise ratio equal to S/N 4.3, while the LOQ (S/N=8) was found at 50 ppm.

Extracts were prepared at an initial concentration of 2000 ppm. Using the standard addition methods, 3 independent sample preparations were achieved and the punicalagin concentration determined in the different extracts. The standard addition employed three identical aliquots of the analyzed sample. Each aliquots was spiked with the same concentration of reference concentration (0, 100 and 250 ppm of PNG added).

The analytical responses obtained (noted in the text as y0, y100, y250) were represented against their corresponding concentrations (noted as x0, x100, x250). The recovered concentration of the analyte punicalagin in the initial extract was calculated by extrapolating the y intercept of the standard addition curve to the intercept of the abscissa (the independent variable, x-axis). The internal standard diclofenac was added in each sample at concentration of 500ppm.

IV.2.4.5 Punicalagin content in different plant part extracts

Using the decoction in water during an half an hour, C.aculeatum leaves, fruits (seeds) and stems were extracted separately and brought to dryness. Then after stock solutions were made at 10mg/ml then diluted to 2000 ppm for quantitative analysis of PNG in each part of the herbal drug. The standard addition method is applied for each extract with three repetitions and we quantified punicalagin used curves on Figure IV.3. The results have showed a higher concentration in leaves (5.45%) than in seeds (2.80%) and stems (2.45%).

154

Figure IV.4: Quantification of PNG using standard addition method in different parts of C. aculeatum. Diclofenac (500ppm) as internal standard

(IS). Plot of ratio (PNG area/Diclofenac area as y0, y100, y250) in function of spiked punicalagin concentration (x0, x100, x250)

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IV.2.4.6 Influence of the extraction modus and duration of extraction on the PNG content

To determine or giving recommendation on the extraction mode and duration giving a higher content in PNG, decoction, maceration and infusion of C. aculeatum aerial parts were compared. Then after the extraction giving the higher ration of PNG were used in duration varying from 10 to 120minutes.

These results in Figure IV.5 show that decoction is more effective for PNG extraction. The optimum time of decoction is between 20min and 50min. 30min was selected as the recommended decoction time. After 50min we could observed that, in boiling water the PNG content decreased significantly, incicating a possible degradation of the PNG.

Figure IV.5. PNG content according to the extraction modus and duration A) Comparison between decoction, maceration and infusion B) Effect of decoction duration on the content of PNG

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IV.2.4.7 Influence on the harvested period of aerial parts

With the described results, we can already say that leaves are more interesting in terms of PNG content to prepare this traditional medicine and duration of decoction recommended could be 30minutes. To learn more about an adapted period for the harvesting of plants parts, samples harvested at different time point were extracted and then analyzed with this method. This information could be useful for further recommendations for the good collecting procedure and harvesting period. Before developing an improved traditional drug or giving user’s recommendations, all these before mentioned informations are relevant and necessary. The results (Table IV.1) showed a higher amount of PNG in plants harvested in May corresponding on the latest vegetative period of this plant and it is just before the beginning of raining season.

Extracts April May July

1 94

2 63

3 129

4 66

5 356

6 34

Table IV.1. Punicalagin concentration (ppm) in 6 different extracts of herbs from 3 harvesting periods

157

Concluding remarks

Our ethnopharmacological survey revealed a series of plants used for the treatment of TB in Senegal. The host-pathogen assay applied on these extracts highlighted an extract of C. aculeatum that contains punicalagin as an active ingredient with antimycobacterial activity.

The optimized capillary electrophoresis method allowed quantifying PNG in different extracts of C. aculeatum. This study showed a precise method to quantify Punicalagin in C. aculeatum aqueous extracts using CZE with phosphate buffer 25mM at pH 7.4. Diverse extraction modus were evaluated and harvesting recommendation gathered. The decoction will be the best extraction modus during 30min, and harvesting should be done in May.

For the quality control of this type of preparation, capillary electrophoresis has showed good, reproducible and reliable quantification possibility for water extracts of Combretum aculeatum aqueous extracts.

This developed method is suitable for a cost-effective quantitative analysis of punicalagin in Combretum aculeatum extracts. For further development or recommendation of this phytomedicine, CE quantification could be achieved for standardization of extracts.

The authors would like to thank authorities in Senegal for the collaboration on the plant harvesting and transport.

The authors have declared no conflict of interest.

158

Contrefaçons de médicaments : Développement d’outils analytiques adaptés pour détecter les sous-standards dans les pays en voie de développement

Electrophorèse capillaire Budget (ECB)

Cette partie présente l’usage de l’électrophorèse capillaire et de l’implémentation d’un appareil à bas coût dans des pays émergents. L’article présenté ci-dessous a été publié sous invitation dans le journal de la Société suisse des Pharmaciens et résume le travail accompli pour la mise en place de cette stratégie.

Mise en place d’une stratégie analytique fiable pour le contrôle de qualité des médicaments dans les pays emergents

E.A. Diop1, J. Schappler1, E. Reginato1, C. Rohrbasser2, P. Bonnabry1,2, S. Rudaz1,2

1 Ecole de Pharmacie Genève-Lausanne, CMU, 1 rue Michel-Servet, 1211 Genève 4, Suisse

2 Pharmelp (www.pharmelp.ch), Fribourg, Suisse

Publication parue en décembre 2016 dans « PharmaJournal » Société Suisse des pharmaciens.

Contribution personnelle dans le choix du sujet et la rédaction de l’article

IV.3.2.1 Contexte

Selon les données de l’OMS, les médicaments contrefaits constituent 10% du marché du médicament mondial et représentent un problème majeur pour les pays en voie de développement, où cette proportion peut atteindre 50% pour certaines spécialités.

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La contrefaçon de médicament constitue un préjudice économique mais surtout une atteinte à la santé des populations. Elle peut concerner différentes parties du médicament dont la composition générale, la forme galénique, la teneur du principe actif, l’étiquetage et l’emballage. Ce phénomène s’est particulièrement amplifié ces dernières années dans les pays émergents à cause de plusieurs facteurs, dont la facilité de production de ces produits, au coût élevé lié au contrôle de qualité des médicaments, et finalement une législation ne permettant pas une répression efficace des autorités.

IV.3.2.2 Situation actuelle

La lutte contre les médicaments contrefaits est complexe et fait intervenir plusieurs niveaux d’intervention : juridiques, économiques, toxicologiques, techniques, etc. D’un point de vue pragmatique, le contrôle de qualité des lots de médicaments importés ou envoyés dans les pays émergents est l’une des actions concrètes reconnue pour combattre ce fléau. Cependant, ce contrôle de qualité n’est pas toujours possible pour diverses raisons, tels que :

 La disponibilité des substances de référence.  La disponibilité et le coût des instruments et des consommables.  La maintenance des instruments analytiques.

Une approche simple, robuste et économe est donc nécessaire pour pallier les limitations des techniques existantes et constitue le cœur du travail établi.

IV.3.2.3 Stratégie analytique

Ainsi est né l’ECB (Figure IV.6) et le projet analytique qui l’accompagne, grâce à une collaboration entre l’Ecole d’Ingénieurs de Fribourg, l’Université de Genève et la Pharmacie des Hôpitaux Universitaires de Genève. Cette collaboration a permis la mise au point d’un dispositif de contrôle de qualité simple basée sur une technologie peu coûteuse en termes de fabrication, de maintenance et d’utilisation. L’appareil développé est basé sur la technique d’électrophorèse capillaire qui nécessite une quantité minimale de solvant et de petits volumes d’échantillon (de l’ordre du nanolitre), ce qui permet de consommer très peu de médicaments et de produits de référence (Fillet et al., 1999).

160

Figure IV.6: Electrophorèse capillaire Budget (ECB) de Pharmelp®

IV.3.2.4 Electrophorèse Capillaire Budget – ECB

La particularité de cet appareil est qu’il a été entièrement conçu par des étudiants ingénieurs, en collaboration avec des spécialistes en analyse pharmaceutique. Se basant sur des schémas disponibles pour les appareils commercialisés et en l’adaptant aux besoins du contrôle de qualité, le coût de fabrication à pu être réduit par dix et devenir ainsi accessible pour la plupart des laboratoires de contrôle. Une détection innovante a également diminué les coûts en conservant l’aspect pratique pour son usage dans les pays émergents.

IV.3.2.5 Méthodes

Dans l’optique d’analyser la plupart des principes actifs médicamenteux, notamment ceux de la liste des médicaments essentiels de l’OMS, l’équipe des Sciences Analytiques de l’Université de Genève a développé et validé des méthodes d’identification et de dosage génériques et simples (Marini et al., 2010). Grâce à seulement 3 méthodes d’analyse et 2 modes de détection, la plupart des médicaments ont pu être analysés (Figure IV.7).

161

Figure IV.7: Méthodes de détection utilisées et validées pour le dosage

Grâce à la technique de double injection (Figure IV.8) il est possible d’effectuer simultanément une analyse qualitative et quantitative avec de bonnes performances analytiques (Schappler et al., 2014).

Figure IV.8: Méthodologie de la double injection : A) Principe B) Exemple du Métronidazole

162

IV.3.2.6 Résultats

L’ECB a été comparée en termes de robustesse et de fiabilité aux appareils commercialement disponibles et les performances se sont avérées équivalentes. Une dizaine de prototypes ont été mis en place dans différents pays (Figure IV.9) et accompagnée d’un support de formation analytique. Par exemple, les méthodes développées ont permis l’analyse de médicaments récoltés par Pharmaciens sans frontières (PSF) en Tanzanie (Figure IV.10). Ce projet est actuellement soutenu par l’association Pharmelp (www.pharmelp.ch).

Figure IV.9 : Chronologie des activités d’implémentation de l’ECB par Pharmelp®

163

Figure IV.10: Résultats des dosages de différents médicaments collectés par PSF en Tanzanie et Madagascar

Conclusion

Grâce à des temps d’analyse courts, une instrumentation simple et robuste, un faible besoin de solvants et d’échantillons, cette stratégie analytique a prouvé être parfaitement adaptée à:

 La vérification de la présence des principes actifs annoncés  La quantification de ces principes actifs  L’évaluation de la qualité de la formulation par la détection d’impuretés

164

Dosage des antituberculeux combinés de première ligne (RH, RHZ, RHZE)

IV.3.1 Antituberculeux et méthodes actuelles de dosage

Les principales molécules utilisées dans le traitement de la tuberculose à savoir la rifampicine, l’isoniazide, la pyrazinamide et l’éthambutol (RHZE) présente une diversité structurale et physico-chimique importante (Figure IV.10). Ces composés sont cependant souvent associés sous forme de doses fixes dans des comprimés pouvant contenir de 2 à 4 de ces principes actifs. Ainsi pour le dosage, la teneur de chaque substance doit être déterminée avec précision afin de s’assurer de la conformité des médicaments disponibles. Parmi les difficulté de ce dosage simultané de plusieurs principes actifs, on note également une dégradation très rapide de la rifampicine en quinone, accélérée en présence d’isoniazide (Marcellos et al., 2012).

Ces molécules étant photosensibles, le travail analytique doit se faire dans des récipients hermétiques, protégés de la lumière et à une température contrôlée. Les différentes pharmacopées américaines, japonaises de l’OMS décrivent plusieurs méthodes de dosage pour chacune des molécules ou les multiples combinaisons de 2, 3 ou 4 molécules (Pharmacopeia, 2006).

Pour chaque formulation, il existe une monographie USP permettant la quantification et les tests de dissolution (U.S. Pharmacopeia 28-NF 23, 2005). Les normes exigent une teneur comprise entre 95% et 105% de la quantité de principe actif déclarée sur les emballages. Ces analyses doivent être effectuées dans les deux heures suivant la dissolution des comprimés ou capsules compte tenu des problèmes liés à la stabilité de ces molécules. (http://www.tbdrugmonographs.co.uk/ )

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Figure IV.11. Médicaments antituberculeux: Rifampicine (R), Isoniazide (H), Pyrazinamide (Z) et Ethambutol (E)

Au Sénégal, le dosage de ces combinaisons fixes suit la méthodologie décrite par l’OMS qui utilise, entre autre, la chromatographie sur couche mince (CCM) pour une analyse semi quantitative et la chromatographie liquide (CLHP). Les méthodes de référence correspondent à celles décrites dans la pharmacopée américaine (USP) et consistent en deux analyses distinctes (U.S. Pharmacopeia 28-NF 23, 2005).

La première propose une analyse simultanée de RHZ ou de RH en utilisant une colonne de phase inverse C18 (4.6 mm x 25 cm) contenant des particules de diamètre de 5 µm. La phase mobile est constituée d’acétonitrile et de tampon phosphate (0.14% de Na2HPO4 à pH 6.8) suivant un gradient à un débit de 1.5 ml/min pour une durée d’analyse de 15min. La détection se fait en UV à une longueur d’onde fixée de λ=238 nm. Cette méthode permet de déterminer quantitativement les ratios de rifampicine, d’isoniazide et de pyrazinamide, ceci à l’aide de standard et un calcul basé sur les aires des différents pics

166

chromatographiques. La validité du dosage est évaluée par des paramètres chromatographiques fondamentaux tels que les temps de rétention, l’efficacité et le nombre de plateaux théoriques (N). La répétabilité de la mesure est évaluée en déterminant l’écart type qui doit être inférieure à 2% entre les différentes injections. Cette analyse permet aussi de détecter un produit majeur de la dégradation de la rifampicine en présence d’isoniazide (l’isonicotinyl hydrazone du 3-formyl R) et son ratio par rapport à la rifampicine doit être conforme aux exigences USP (U.S. Pharmacopeia 28-NF 23, 2005).

Pour cet essai il est impératif d’utiliser les standards lors de chaque analyse et les solutions de standard diluées dans le solvant (Méthanol-tampon phosphate 4 :96) doivent être analysée dans les 10min après préparation. L’échantillonnage doit être fait sur au moins 20 unités pour permettre un prélèvement d’une masse correspondant à 8mg d’isoniazide pour 100ml de solvant. Cette dernière solution test doit être utilisée dans les 2h suivant sa préparation, si elle est stockée à une température ambiante.

La deuxième méthode de quantification dans les médicaments combinés concerne le dosage de l’éthambutol (E) qui est une molécule sans véritable chromophore et donc présentant une faible absorption molaire. Plusieurs approches de dérivatisation ou de complexation sont possibles pour la détecter par spectrophotométrie UV ou Fluorescence (da Silva et al., 2010). Il faut aussi noter que l’éthambutol existe sous deux formes énantiomériques et c’est l’isomère(S,S) qui est utilisée dans les formulations pharmaceutiques car la forme (R,R) serait responsable de cécité, comme effet indésirable majeur (da Silva et al., 2010).

Selon l’USP, des méthodes de titration sont possibles pour l’éthambutol et la pyrazinamide et il existe aussi une méthode CLHP pour le dosage dans les comprimés.

Celle-ci se fait à l’aide une colonne de silice greffée de groupe cyano (CN), L10 (4.6mm x 15cm) contenant des particules de silice de diamètre de 5µm. La phase mobile est constituée d’un mélange de 1ml de triéthylamine dans 1L d’eau milli-Q (pH=7 ajusté avec de l’acide phosphorique 1M) suivant un mode isocratique à un débit de 1 ml/min. L’analyse dure 7 minutes.

La détection se fait par spectrophotométrie UV à une longueur d’onde fixée de λ=200nm. La quantification se fait par comparaison entre les chromatogrammes

167

des solutions des échantillons et ceux des standards d’éthambutol. La répétabilité de la mesure est évaluée en déterminant l’écart type qui doit être inférieure à 2% entre les différentes injections.

Figure IV.12 : Chromatogrammes de référence pour l’analyse des préparations combinées d’antituberculeux (Pharmacopeia, 2006; U.S. Pharmacopeia 28-NF 23, 2005) a : isoniazide, b : pyrazinamide, c :isonicotinyl hydrazone du 3- formylrifampicine, d : Rifampicine et dans les chromatogrammes du bas A : isoniazide, B : pyrazinamide et C : éthambutol

Ces méthodes décrites sont les méthodes de références utilisées en routine dans plusieurs laboratoires dans le monde. Elles présentent cependant des limitations pour leur application dans des laboratoires de pays en voie de développement. D’abord la disponibilité des standards puis la qualité et la maintenance des chaines de CLHP avec les colonnes spécifiques nécessaires.

168

Ainsi, la littérature indique plusieurs autres essais pour améliorer cette analyse avec des méthodes chromatographiques plus adaptées ou des analyses plus rapides. Parmi celles-ci on peut citer notamment celle développée à Genève (LCAP,UNIGE) en ultra haute pression (UHP) LC-UV qui a été validée et permetant l’analyse quantitative des préparations combinées des 3 antituberculeux RHZ

(Nguyen et al., 2008). La méthode utilise une colonne Acquity Shield® RP18 (50 mm x 2.1mm id,1.7µm) à une température de 90°C. La phase mobile est constituée de tampon phosphate 50mM à pH 7 et d’acétonitrile avec une analyse en mode gradient. Les temps d’analyse maximum étaient de 1.7min (Nguyen et al., 2008) réduisant ainsi d’un facteur de 10 pour le temps par rapport à la pharmacopée américaine. Cette méthode est applicable dans uniquement certains laboratoires possédant la technologie de type UHPLC, serait d’un gain de temps précieux pour le contrôle de qualité de routine des antituberculeux. Cependant ces appareils sont couteux et les besoins en maintenance supérieurs à ceux de la CLHP classique. Ainsi plusieurs autres approches ont été développées au brésil et en argentine pour l’analyse quantitative simultanée des antituberculeux. Parmi celles- ci, on peut citer une méthode de spectrophotométrie directe (Goicoechea and Olivieri, 1999) et de CE ont montré une bonne validité et reproductibilité des deux méthodologies (Marcellos et al., 2012). Ces deux techniques étant plus accessible et moins couteuses, elles pourraient être appliquées dans les pays émergents.

Dans ce travail, des méthodes d’électrophorèse capillaire sont investiguées et une présentation détaillée de ces méthodes est présentée ainsi que leur application pour l’analyse des médicaments antituberculeux.

169

Dosage des antituberculeux RHZE par électrophorèse capillaire

IV.4.1.1 Introduction

L’électrophorèse capillaire, dont le principe de séparation est basé sur le rapport charge sur taille des molécules analysées, a été investigué pour l’analyse des antituberculeux.

En électrophorèse capillaire de zone, il est difficile d’analyser les 4 composés, d’abord pour leur ionisation dans un BGE (tampon d’analyse) donné et ensuite pour leur détection. Ceux-ci, au vu leurs différences au niveau des propriétés physico-chimiques, ne sont pas toujours ionisés en fonction du pH entre 0 et 9 et souvent, la pyrazinamide est sous forme neutre (Faria et al., 2010).

En plus de l’ionisation, le choix du détecteur est aussi relevant car l’éthambutol absorbe peu en UV. Ainsi, une approche utilisant une détection par conductimétrie (C4D pour Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detector) a été proposée pour le dosage de l’éthambutol dans les comprimés (da Silva et al., 2010).

Cette méthode rapide effectue en 3 min. l’analyse d’échantillon à l’aide d’un tampon (BGE) composé d’histidine à 50 mM et de MES (acide 2-(N-morpholino)- éthanosulfonique) à 30 mM, le pH du tampon est optimal à 6.3. Le capillaire utilisé a un diamètre interne de 50 µm et une longueur effective de 38 cm, l’injection a été effectuée en mode hydrodynamique (1.6psi, 10s). Avec cette méthode validée, il est possible de bien séparer l’éthambutol de son produit de dégradation le 2- amino-1-butanol (2-AMB), mais aussi d’avoir une quantification fiable comparée à la détection par UV (da Silva et al., 2010).

Pendant cette thèse, une évaluation de la conductimétrie pour un dosage simultané des antituberculeux a pu être faite dans le cadre d’un travail de Master (Lucie Despine). Cependant ce travail a montré une méthode de détection fiable pour la quantification de 3 molécules (RHE) antituberculeuses, mais la préparation des échantillons reste encore un facteur limitant du fait de la dégradation rapide de la rifampicine en solution. Pour la détection UV une approche de complexations avec

170

le cuivre (Cu2+) a permis notamment de former un complexe stable avec l’éthambutol qui est ainsi détectable à 260nm (Figure IV.13/14).

De façon native, cette molécule présente une très faible absorption molaire en UV alors qu’en présence de d’ions Cu2+ il est possible de la détecter en même temps que les 3 autres molécules(RHZ) à 262 nm (Jiang et al., 2002).

Figure IV.13 : Complexation de l’éthambutol à l’aide du sulfate de cuivre

(CuSO4)

Figure IV.14 : Spectres UV de l’éthambutol (ETB), le Cu-éthambutol(CuETB), la rifampicine (Rif), l’isoniazide (ISO)et la pyrazinamide (PYR) tirés de (Faria et al., 2010)

171

La présence d’ions Cu2+ dans le tampon permet aussi d’avoir une charge positive pour la pyrazinamide évitant ainsi son inclusion dans le pic du flux électroosmotique. Le cuivre permet également d’éviter la dégradation rapide donc l’hydrolyse en milieu acide de la rifampicine en 3-formylrifampicine. Cette dégradation est deux fois plus rapide en présence d’isoniazide donc il est important de stabiliser la rifampicine pour l’analyse des combinaisons RHZE (Faria et al., 2010).

Après la détection, il a fallu également trouver une méthode d’analyse avec un BGE (tampon d’analyse) adéquat permettant l’élution et la détection des molécules avec des temps de migration adéquat. Dans plusieurs études, il est montré que la pyrazinamide migre avec le flux électroosmotique (EOF) et que le temps de migration de la rifampicine était très élevé avec un BGE acide. En milieu basique, l'isoniazide et la pyrazinamide sont observés avec l'EOF et au-delà de pH 12, l'isoniazide est séparé de l'EOF, mais pas la pyrazinamide (Acedo-Valenzuela et al., 2002).

Ces indications ont suggéré un développement de méthode en MEKC (chromatographie électrocinétique micellaire). La MEKC est une méthode d’électrophorèse capillaire permettant l’analyse et la détection des composés neutres, hydrophobes ou peu solubles. Cette approche est basée sur la formation de micelles qui permettent une interaction avec les composés neutres par la présence d’une phase pseudo-stationnaire à l’intérieur du capillaire (Hansen and Sheribah, 2005). Cette méthode a permis une analyse simultanée de RHZ utilisant des solutions avec du SDS (sodium dodecylsulfate), un surfactant anionique, dans un tampon borate à un ph de 8.5 (Acedo-Valenzuela et al., 2002).

La figure ci-dessous (Figure IV.15) montre un exemple avec des micelles chargées négativement. A noter qu’il est également possible d’utiliser des tensioactifs non ioniques avec le même principe d’interactions entre les molécules neutres et hydrophobes. Ainsi d’autres auteurs proposent l’usage d’un surfactant non ionique, le Brij® 35 pour l’analyse simultanée des 4 antibiotiques (Faria et al., 2010).

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Figure IV.15 : Représentation schématique de la MEKC avec des micelles de SDS (Wikipédia®)

Ainsi grâce à une détection UV, une méthode alternative en MEKC décrite et validée dans la littérature propose l’analyse simultanée des 4 antituberculeux (RHZE) par CE. Cette technique peut être combinée avec la méthode de complexation au cuivre décrite auparavant pour la détection UV de l’éthambutol combinée aux molécules RHZ (Faria et al., 2010).

L’analyse dure 8 minutes et présente une particularité dans la préparation d’échantillon. Le solvant pour la dissolution des échantillons est composé de Brij®

35 comme tensioactif (non ionique) à 2 mM et du sulfate de cuivre(CuSO4) à 12.5mM. Le tampon d’analyse est constitué de mélange acide acétique/acétate de sodium à 50mM (pH 4.6) et du CuSO4 à 12.5mM. Le capillaire est de diamètre interne de 75µm avec une longueur effective de 40cm. Un mode d’injection hydrodynamique (30 mbar,5 s) et une tension d’analyse de 22 kV ont été utilisés. La longueur d’onde de détection a été fixée à λ=262nm pour tous les composés (Faria et al., 2010). Cette méthode a été validée et appliqué à des échantillons sous forme de comprimés et de sachets pour une quantification simultanée de R, H, Z et E (Faria et al., 2010).

Cette méthode a été finalement appliquée sur des échantillons de comprimés provenant du Sénégal présentant une combinaison des 4 antibiotiques (RHZE). Ainsi le travail ci-dessous décrit la méthode appliquée ainsi que son adaptation potentielle pour la longueur d’onde de détection de l’ECB (254 nm).

173

IV.4.1.2 Matériel et méthodes

Réactifs et standards

L’hydroxyde de sodium et le phosphate de sodium de Sigma-Aldrich (Seelze, Allemagne). L’eau Millipore (eau de qualité ultra pure) est fournie par un système de purification Milli-Q Advantage A10, couplé à un instrument Elix 3, tous deux de Millipore (Bedford, MA, États-Unis).

Le méthanol (MeOH) provient de Fisher Chemics (Leicestershire, UK). Le sulfate de cuivre CuSO4 provient de Acros organics, New jersey USA (CAS :7758-98-7), Le Brij® 35 (CAS 9002-92-0), l’isoniazide (CAS 54-85-3), l’éthambutol chlorhydrate (CAS 1070-11-7), la pyrazinamide (CAS 98-96-4) et la sparfloxacine (CAS 110871-86-8) ont été achetés chez Sigma, Sigma–Aldrich (St. Louis, USA).

Médicaments

Les médicaments ont été obtenus grâce au laboratoire national de contrôle des médicaments du Sénégal (LNCM) et des centres de traitements. Ils ont été récoltés entre mars 2014 et Mai 2016 et ont été stockés à température ambiante ~25°C dès réception.

Les indications figurant dans le tableau suivant ont été relevées sur les plaquettes obtenus dans les centres de traitement de la tuberculose.

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Tableau IV.2 : Récapitulatif de quelques échantillons ayant servi d’échantillon pour le développement de la méthode

Composition Fabricant Descriptif Photo du Lieu de collecte / par comprimé Dates comprimé R :150mg/ LUPIN Centre de H :75mg/ LTD® traitement Kolda Z :400mg/ Mumbai /LNCM E :275mg MFD : 11.2017 Exp :12.2014

R :150mg/ Svizera® CDT Kaffrine H :75mg/ Europe BV MFD: 03/2007 Z :400mg/ Netherland Exp: 02/2010 E :275mg

R :60mg/ MACLEODS CDT Kaffrine H:30mg/ Pharmaceut MFD 06/2016 Z :150mg icals Exp:05.2018 Mumbai India

CDT: Centre de traitement MFD: Date de fabrication Exp: Date d’expiration

Préparation des échantillons et des solutions

Solutions stocks standards

Les solutions mères d’isoniazide H (1 mg/ml), de pyrazinamide Z (2 mg/ml) et d’éthambutol E (1 mg/ml) ont été préparées et stockées dans de l’eau Milli Q au réfrigérateur. La rifampicine a été pesée et dissoute dans la solution de Brij® 58 à 2 mM puis disposée dans un bain ultrason.

La sparfloxacine (IS) à 50ppm a été utilisée comme standard interne (IS) ajouté directement dans les échantillons d’analyse. La solution mère a été préparée dans du méthanol à 1mg/ml.

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L’équivalent d’environ 5 mg de chaque standard a été pesé et placé dans un ballon jaugé de 5 ml. 4 ml de solvant ont été ajoutés et mis sous agitation (10 min). La solution stock a été laissée à température ambiante 20 min avant d’être complétée avec le solvant.

Une solution mère de Brij®58 à 10 mM a été préparée en pesant la quantité adéquate (1.122 g) disposée dans un flacon en verre avec de l’eau milli-Q et mis au bain ultrason pendant 1heure. Une solution mère de sulfate de Cuivre (CuSO4) a 50mM a été préparée dans de l’eau milli-Q en dissolvant la poudre sous agitation. Cette solution a été conservée au réfrigérateur à 4°C.

Le solvant pour la dilution des échantillons avant l’injection est composé de Brij® 58 comme tensioactif à 2 mM (préparée en diluant la solution mère à 10 mM) et du sulfate de cuivre (CuSO4) à 12.5 mM. Cette solution a été disposé pendant une demi-heure dans le bain ultrason et cette opération a été répété tous les matins et deux fois par jour en observant la limpidité de la solution.

Echantillons / Etalons

Les standards ont été analysées séparément et préparé en diluant la quantité adéquates dans le mélange (Brij® 58 2mM et CuSO4 12.5mM) aux concentrations respectives suivantes R : 30ppm, E : 50ppm, H : 30ppm, Z : 80ppm. Chaque échantillon contenait une concentration de 50ppm de sparfloxacine.

Les comprimés ont été pesés séparément et des aliquotes ont été prélevés afin d’obtenir des solutions avec de la rifampicine à ~3mg/100ml (~30ppm). Ainsi le prélèvement a été effectué à partir d’un mélange de 3 comprimés écrasés. La masse adéquate a été pesée et disposée dans un flacon puis dissous avec 5ml de solvant (Brij® 58, 2 mM avec CuSO4, 12.5 mM). Ces solutions ont été déposées dans un bain ultrason pendant 30minutes puis filtrées à 45 µm. Ensuite les vials d’injection ont été préparés en ajoutant à ce filtrat 50ppm de sparfloxacine(IS).

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Tampon d’analyse BGE

Le tampon d’analyse est constitué de mélange acide acétique/acétate de sodium

à 50mM (pH 4.6, NaOH 1M) et du CuSO4 à 12.5mM. Il est préparé à partir d’acide acétique à 99% en pipetant la quantité nécessaire pour préparer 100ml. La solution mère de CuSO4 a été diluée pour obtenir la concentration adéquate.

Les mesures de pH ont été effectuées avec un pH mètre SevenMulti pH meter de Mettler-Toledo (Schwerzenbach, Suisse). Les tampons d’analyse et solvant ont été stockés pendant 3 jours à ~25°C et remis au bain ultrason (~1heure) tous les matins avant utilisation.

Appareil

L’appareil utilisé pour ces essais est une électrophorèse capillaire, Agilent HP 3DCE, Agilent Technologies (Waldbronn, Allemagne). Il est équipé d’un détecteur d’absorbance UV (DAD) réglée à 4 longueurs d’onde 200, 254, 262 et 280 nm, avec contrôle de température maintenu à ~25 ◦C Pour toutes les expériences, un capillaire 48.5 cm (Longueur effective de 40,0 cm) × 75 μm ID × 375 μm OD fusionné de silice capillaire recouvert de polyimide (BGB Analytik AG (Böckten, Suisse).

Avant une première utilisation, le capillaire est conditionné par le passage successif de MeOH (1 bar x 3 min), eau (1 bar x 3 min), NaOH 1 M (1 bar x 30 min), eau (1 bar x 5 min), BGE (1 bar x 10 min). Les trois premières injections sont faites avec un blanc pour assurer la stabilité du capillaire nouvellement préparé. Entre les injections le capillaire est conditionné par le passage de NaOH 0.2M (3min), eau (2min), BGE (3min). Quotidiennement, le capillaire est conditionné par le même cycle qu’entre les injections en commençant par le MeOH (3min). En fin de journée, le capillaire est lavé au moyen d’eau (1 bar x 3 min) et séché à l’air (1 bar x 2 min).

Les échantillons ont été déposés dans l’échantillonneur de l’appareil à température ambiante durant la séquence d’analyse. Pour l’injection, les conditions ont été les suivantes: échantillon 30 mbar x 5 s (3.4% du volume du capillaire). Les analyses ont été effectuées dans des conditions de polarité normale et de tension constante entre +10 kV et +17,0 kV permettant d’obtenir un courant stable inférieur à 73.5 µA.

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IV.4.1.3 Résultats et discussion

Les analyses effectuées ont permis d’adapter différents paramètres afin d’obtenir des bonnes conditions d’analyse surtout pour la détection et la séparation des différents composés analysés.

BGE et Solution

Tout d’abord la concentration du tensioactif a été évaluée afin d’éviter la précipitation du Cuivre dans le vial d’injection qui est liée à la concentration micellaire critique (CMC) du Brij® 58.

La préparation des échantillons avant l’injection a été adaptée en comparaison des concentrations micellaires critiques (CMC) des surfactants, Brij® 35 et 58 qui sont respectivement de 0.08 mM et 0.09 mM (Sigma Aldrich). Le but étant d’éviter toute précipitation et signe de dégradation des analytes. Ainsi, la concentration de Brij® 58 a été fixée à 2mM dans le solvant pour obtenir des meilleures analyses. Ce qui donne, après l’injection d’un volume d’environ 4%, dans le capillaire une concentration idéale et approximativement proche de la CMC du Brij confirmant ainsi l’importance de la stabilité dans le mélange pour injection (Faria et al., 2010).

Pour chaque échantillon analysé, une simple injection a été effectuée afin de confirmer la présence de chacun des 4 principes actifs et du standard interne (IS).

Longueur d’onde de détection

Dans l’optique d’avoir une méthode applicable sur le dispositif disponible à l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar, il a été nécessaire de confirmer la possibilité d’utiliser une longueur d’onde de détection de 254 nm en UV afin de détecter et de quantifier l’ensemble des composés présents dans la dose combinée et en présence de IS (sparfloxacine). Les composés détectés montrent une bonne réponse autant à 254 nm qu’à 262 nm. Ci-dessous une figure montrant la détection de tous les analytes à 254nm

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Figure IV.16 Electrophérogramme montrant l’analyse de la CDF des 4 antibiotiques (standards) avec détection de tous les composés présent dans l’échantillon. pyrazinamide (Z) comparaison entre deux longueur d’onde (254 nm et 262 nm). Cu2+ : Cuivre, CuE : Cu2+-éthambutol, IS : sparfloxacine, H : isoniazide, *H :isonicotinyl hydrazone, R : rifampicine, Z : pyrazinamide *H correspondrait au produit de dégradation de isoniazide en (Isonicotinyl hydrazone) (Mohan et al., 2003)

Présence des principes actifs

Pour confirmer la présence des principes actifs dans les trois préparation précitées l’identification se base sur la différence entre le rapport du temps de migration de l’échantillon à identifier et le standard interne (IS). Les échantillons ont été injectés tout d’abord séparément et en présence de la sparfloxacine. Ensuite en comparant les temps de migration relatifs des différents pics, les composés ont pu être identifiés.

Ci-dessous 3 électrophérogrammes caractéristiques qui ont permis d’identifier les composés injectés en présence du standard interne. En comparant A), B) et C) il était possible d’attribuer les composés injectés séparément (Figure IV.16). Cette figure donne ainsi une bonne séparation entre RHE et l’IS, la pyrazinamide sortant en fin d’analyse ne présentait aucun risque de superposition avec les autres composés.

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Figure IV.17 : Electrophérogramme montrant l’identification des analytes avec les standards : Cu2+ : Cuivre, CuE : Cu2+-ethambutol, IS : sparfloxacine, H : isoniazide, *H :isonicotinyl hydrazone, R :rifampicine. Electrophérogrammes A) Mélange de rifampicine (R), Cu-éthambutol(CuE), l’isoniazide (H) B) Isoniazide et IS et C) Rifampicine et IS

Influence de la tension

En appliquant une tension de +17 kV et de +13 kV pour tous les échantillons, il y’a toujours l’apparition de 2 pics pour l’isoniazide sans chevauchement entre les différents composés.

A 17 kV l’intensité maximale de courant obtenue est de 72.5 µA, ce qui n’est pas trop élevé et obtient une bonne séparation des analytes avec le standard interne. L’analyse dure 13 min. Cependant le choix s’est porté sur une analyse à 13kV, produisant une intensité plus faible de courant (~50 µA) avec une bonne séparation.

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Condition optimale

La sélection des paramètres instrumentaux a été faite en fonction des contraintes de transfert sur ECB, de coût et de simplicité mais aussi des performances analytiques attendues (sensibilité, efficacité, vitesse). Un capillaire en silice vierge pourrait être utilisé 48.5 cm de longueur totale, 40 cm de longueur effective, et 75 µm de diamètre interne peut être envisagé.

L’injection se fait de manière hydrodynamique par l’application d’une pression de 30 mbar pendant 5 s qui correspond à 3.4% du volume du capillaire. La tension appliquée pour l’analyse est de 17kV. La figure ci-dessous présente deux chromatogrammes issus de l’analyse d’un échantillon sans IS (A) avec un autre contenant l’IS (sparfloxacine à 50ppm)

Figure IV.19 : Electrophérogrammes montrant l’analyse de la CDF des 4 antibiotiques R (rifampicine) H (isoniazide) Z (Pyrazinamide) CuE (Cuivre- ethambuthol) A) sans l’IS (sparfloxacine) et B) en présence de l’IS

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Discussion

La méthode décrite par (Faria et al., 2010) a été adaptée pour des conditions d’analyse correspondant aux appareils disponibles au Sénégal et sur des échantillons récoltés au Sénégal entre 2014 et 2017. La préparation du tampon d’analyse et des solvants de dissolution est plus complexe qu’un tampon tout simple en CZE. Ainsi elle nécessite une certaine compétence pour obtenir des émulsions de qualité et stable. Il est également nécessaire de posséder des moyens de dissolution rapides. Cette méthode doit donc être optimisée dans le contexte local et fera l’objet d’un travail de Master à Dakar au Sénégal. Ce travail devrait permettre d’établir les possibilités d’applications de façon plus rigoureuses pour être validée. Lors de cette validation, il faudra tenir compte de plusieurs paramètres importants dont ceux exigés lors du contrôle de qualité des médicaments.

Plusieurs objectifs spécifiques doivent être atteints : a) Evaluer la présence ou l’absence du composé dans l’échantillon prélevé et analysé b) la conformité de l’identification du composé et d’éventuels produits de dégradation et c) la conformité de teneur selon la pharmacopée européenne (quantification sur n=10 comprimés d’un lot donné) (Schappler et al., 2014).

Ensuite spécifiquement au dosage des médicaments avec les 4 molécules RHZE, le temps d’analyse et la stabilité des solutions, la conservation (verre brun, réfrigération, etc.). Et ainsi cette méthode pourrait être utilisé en routine et apporterait un gain de temps pour le dosage simultané des antituberculeux.

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CHAPITRE V

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

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Conclusions et perspectives

L’utilisation des plantes médicinales pour le traitement des maladies courantes reste très répandu en Afrique, et au Sénégal en particulier. Beaucoup de patients utilisent des plantes ou des extraits de plantes en premier recours pour soigner des maux divers. Dans le traitement de la tuberculose, plusieurs drogues végétales sont décrites et fréquemment utilisées en médecine traditionnelle.

L’enquête ethnopharmacologique menée lors de cette thèse a montré un usage fréquent de plantes médicinales chez les patients tuberculeux après cueillette, achat ou prescription par les tradipraticiens. Le recours à ces traitements phytothérapeutiques se fait généralement bien avant l’accès des patients aux centres de soins pour un diagnostic médical et un suivi thérapeutique. Les extraits des plantes les plus citées/les plus utilisées ont été soumises à des tests d’activité biologique et pour certains des effets antimycobactériens et antiinfectieux in vitro significatifs ont été démontrés. Deux de ces plantes ont fait l’objet d’investigations phytochimiques poussées, en associant des tests biologiques innovants pour découvrir les composés pouvant être responsables des activités pharmacologiques.

Les plantes sélectionnées Guiera senegalensis et de Combretum aculeatum appartiennent à la famille des combrétacées, une famille d’une importance majeure dans la région soudano-sahélienne où l’on rencontre une grande diversité d’espèces médicinales utiles pour les populations. Les parties aériennes séchées de ces deux plantes sont utilisées en décoction (eau bouillante en une demi-heure) et utilisées à des fins thérapeutiques. Leurs propriétés antitussives sont bien documentées dans la littérature. Dans le cadre de cette thèse, les extraits mimant les décoctions se sont avérés actifs in vitro contre la croissance des mycobactéries. Un fractionnement s’en est suivi et a permis l’identification des substances actives, notamment pour C. aculeatum qui jusque-là, n’avait fait l’objet d’investigation phytochimique.

Pour C. aculeatum, la punicalagine, la punicacortéine D et d’autres dérivés d’acide ellagique ont été formellement identifiés dans les extraits aqueux. Ces ellagitanins sont métabolisés lors de leur ingestion et on retrouve dans la circulation sanguine humaine, de l’acide ellagique ainsi que d’autres composés de type urolithines. Ces

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métabolites ont été testés et il a été démontré qu’ils contribuent, également, significativement à l’activité antimycobactérienne.

L’activité biologique majeure de ces deux extraits apparaît être majoritairement liée à la présence de punicalagine (un ellagitanin) dans C. aculeatum et d’acide 1,3,4,5-tetragalloylquinique (un gallotanin) dans G. senegalensis. Ces molécules sont des macromolécules dont l’absorption intestinale et la biodisponibilité sont très faibles. Néanmoins, les études de perméation membranaire, de métabolisation et de dégradation par la microflore du système digestif, montrent qu’après une prise par voie orale, les métabolites plasmatiques présentent aussi un effet inhibiteur sur la croissance des mycobactéries in vitro.

L’acide ellagique et l’urolithine D sont des composés avec des IC50 antibiotiques et antiinfectieuses intéressantes et confirment ainsi l’intérêt de l’usage de décoctions de C. aculeatum et G. senegalensis contre la tuberculose. Vu l’activité de ces substances, il a été nécessaire de quantifier dans les extraits la quantité d’ellagitanins pour estimer si les doses prises en décoction pouvaient revendiquer une certaine efficacité.

Les essais in vitro ont montré une très faible toxicité des extraits étudiés sur les modèles eucaryotes utilisés confirmant que ces deux plantes largement utilisées par les populations locales n’ont pas été reportées pour des problèmes d’intoxication majeures chez l’humain à ce jour.

Des études cliniques complémentaires sur ces extraits seraient intéressantes pour confirmer leur utilité dans le traitement de la tuberculose avec une préparation traditionnelle standardisée. L’évaluation de leur innocuité à des dosages contrôlés devraient également être établie par des essais appropriés de toxicologie.

Afin de s’assurer de la qualité de ces extraits des méthodes d’analyse permettant leur standardisation ont été développées dans une deuxième partie de cette thèse. La standardisation permet d’assurer une prise constante de principe actifs et ainsi d’assurer une bonne efficacité par rapport à une étude clinique de référence.

Dans le cadre d’un contrôle de qualité le dosage des principes actifs, ou tout au moins de composés marqueurs, doit être effectué et la stabilité des phytopréparation doit être évaluée.

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Dans ce travail, plusieurs méthodes ont été évaluées et une méthode analytique de type « Chimie Verte » a été explorée. Il s’agit de l’électrophorèse capillaire (CE) qui est une méthode analytique de choix pour la séparation et l’analyse des composés pharmaceutiques. Elle présente l’avantage d’utiliser très peu de solvants organiques polluants (méthanol, acétonitrile), et nécessite que très peu de standards de référence couteux. La maintenance technique de l’appareil est relativement aisée et la méthode est fiable. La robustesse de l’équipement a été démontrée au préalable pour le contrôle de qualité des médicaments essentiels. Très récemment son utilité a été évaluée pour le profilage des métabolites d’extrait complexes de plantes.

Ainsi à l’aide de la CE, une méthode a été développée, permettant de déterminer la teneur en punicalagine dans différents extraits de Combretum aculeatum. La punicalagine et ses métabolites ayant une activité antimycobactérienne la méthode a été utilisée pour la sélection des extraits les plus riches possible en principes actifs. La méthode développée a permis de déterminer que les feuilles de plantes sont plus riches en principes actifs que les graines et les tiges. Les analyses ont permis aussi d’estimer la période à laquelle la récolte des parties aériennes serait la plus optimale. Cette méthode devrait être appliquée à un large échantillonnage de spécimens de l’espèce afin de la valider et peut être l’adopter dans une optique future de contrôle de phytomédicaments.

L’électrophorèse capillaire a été un outil majeur dans ce travail, car elle a été aussi utilisée parallèlement dans le développement et la validation de méthode de contrôle de qualité d’une dizaine de médicaments au Sénégal (diclofenac, paracétamol, captopril et d’autres). Dans le cadre de cette thèse, l’usage de cette technique a abouti à des essais concluant pour le contrôle quantitatif des médicaments contenant les molécules anti TB, RHZE (Rifampicine, Isoniazide, Pyrazinamide et Ethambutol). La CE a ainsi démontré pouvoir être une alternative crédible pouvant être appliquée localement pour le contrôle de futurs lots de médicaments antituberculeux, il reste cependant encore à valider la méthode pour un usage systématique lors de dosage. Ceci contribuerait à répondre aux exigences de contrôle d’uniformité de teneur pour les patients et donc de contribuer à la sécurité d’usage des médicaments au Sénégal.

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Une étude approfondie de la médecine traditionnelle par des approches combinant enquête de population en pharmacologie inversée, investigations pharmacognosiques poussées et développements de méthodes de contrôle de qualité ont permis d’une part de bien documenter l’usage de plantes anti TB par une approche basée sur l’évidence et de contribuer très pratiquement à leur contrôle de qualité avec des approches implémentables au Sénégal pour un meilleur service aux patients touchés.

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201

Liste des annexes

Annexe 1 : Questionnaire d’enquête auprès des patients diagnostiqués pour la tuberculose maladie

Annexe 2 : Questionnaire d’enquête auprès des tradipraticiens utilisant des plantes pour traiter la TB

Annexe 3 : Autorisation pour mener les enquêtes auprès des patients

Annexe 4 : Exemple de certificat phytosanitaire pour transport sur les plantes collectées au Sénégal

Annexe 5 : Analyses RMN (600MHz, solvant Acetone-d6) pour l’identification et la description de Punicacortein D, Fraction 13 isolée de l’extrait aqueux de Combretum aculeatum

1 Annexe 6 : Analyse par RMN H (500MHz, solvant D2O) des fractions isolées et complétements identifiées de la décoction de Guiera senegalensis

Annexe 1 : Questionnaire d’enquête auprès des patients diagnostiqués pour la tuberculose maladie

Questionnaire patients avec médicaments antituberculeux « C’est pour une enquête dans le cadre de ma thèse de doctorat en sciences pharmaceutiques. Le sujet de celui-ci est Contrôle de qualité des médicaments antituberculeux et évaluation de leur association avec la médecine traditionnelle. Donc s’il vous plaît, j’aimerai vous poser quelques questions, répondez simplement selon ce que vous avez fait et observé, pour que l’étude soit valable. Il n’y a pas de « bonne » ou « mauvaise » réponse, je ne juge pas ce que vous avez fait, j’aimerais seulement avoir votre témoignage le plus exact possible. Les réponses de tout le monde seront mises ensemble et resteront anonymes, dans le sens qu’on ne pourra pas dire qui a dit quoi. » A) Groupes Patients/Clients

Numéro de Feuille : Date : / /2014 Région/Département : Patients ou Famille de Patients Age : Sexe : Localité : Traitement antituberculeux Oui □ Non □ Début du traitement et quelles molécules : Premier traitement □ Récidive (après échec) □ Autres maladies traitées : Oui □ (lequel: ) Non □

Patient hospitalisé Oui □ Non □

B) Enquête Tuberculose : Nom local………………….. Traduction en Français mot à mot … Définition OMS des symptômes d’une tuberculose déclarée : Une toux (+2semaines sans autres étiologies), parfois productive ou sanglante, des douleurs thoraciques, une asthénie, une perte de poids et des sueurs nocturnes 1) Depuis quand souffrez-vous de cette maladie ? Symptômes : □ 1 mois ou moins □ 2mois □ 5mois □ 8mois et plus

2) Avez-vous traité ou Traitez-vous cette maladie traditionnellement ? Si oui avec quelles plantes ?

1. Nom local :………………….. Nom latin (selon Ph. Kerharo)………………………….. 2. Nom local :………………….. Nom latin (selon Ph. Kerharo)………………………….. 3. Nom local :………………….. Nom latin (selon Ph. Kerharo)………………………….. 4. Nom local :………………….. Nom latin (selon Ph. Kerharo)………………………….. 5. Nom local :………………….. Nom latin (selon Ph. Kerharo)…………………………..

o Mélange de plantes ? : nom et composition :

o Association de plantes ? o autre méthode mystique ou locale de la soigner ?

3) Mode de préparation : o Décoction o Infusion o Macération - Temps de macération : o Poudre de plantes o Bain, douche o Fumigation o Autre mode : Description……………..

4) Posologie et Durée du traitement ? □ 15 jours □ 1mois □ 2mois □ 3mois et plus

5) Quel est le succès de votre thérapie traditionnelle ? □ Guérison médicale □ Amélioration des symptômes □ Complication □ Rechute

6) Pourquoi le choix d’une thérapie traditionnelle :

□ Premier choix □ Effets indésirables □ Accompagnement □Durée du TTT moderne □ Autres : …

7) Est-ce que vous avez toujours pris les médicaments « modernes » comme indiqué ?

Oui □ Non □

Remarque :

8) Etat actuel du patient (Médicament, Poids, thérapie auxiliaire) o tout-à-fait guéri o guéri mais avec séquelles -- dans ce cas préciser les séquelles :______o amélioration o stationnaire o rechute o aggravation

□ Médication en cours ( □ Prise régulière de médicaments traditionnels : Oui □ Non □ □ Evolution du poids les 6 derniers mois (Prise de poids ~ Perte de poids ~ )

9) Commentaires : Détails éventuels

III

Annexe 2 : Questionnaire d’enquête auprès des tradipraticiens utilisant des plantes pour traiter la TB

Questionnaire tradipraticiens « C’est pour une enquête dans le cadre de ma thèse de doctorat en sciences pharmaceutiques. Le sujet de celui-ci est Contrôle de qualité des médicaments antituberculeux et évaluation de leur association avec la médecine traditionnelle. Donc s’il vous plaît, j’aimerai vous poser quelques questions, répondez simplement selon ce que vous avez fait et observé, pour que l’étude soit valable. Il n’y a pas de « bonne » ou « mauvaise » réponse, je ne juge pas votre travail, j’aimerais seulement avoir votre témoignage pour ma recherche. C) Groupes Guérisseurs/Tradithérapeutes/Phytothérapeutes

Numéro de Feuille : Date : Région/Département : Guérisseur/Herboriste traditionnel ou …. Nom et Prénoms (Autres noms): Age : Sexe : Adresse :

D) Enquête Tuberculose (Nom local………………………………..) : Définition OMS d’une tuberculose pulmonaire: Une toux (+2semaines sans autres étiologies), parfois productive ou sanglante, des douleurs thoraciques, une asthénie, une perte de poids et des sueurs nocturnes 10) Connaissez-vous cette maladie ? Description locale : (Symptômes) o Toux Productive o Crachats sanguinolents o Perte de poids o Fatigue chronique o Douleurs thoraciques o Sueurs nocturnes o Essoufflement lors d’efforts o Autres :………………..

11) Traitez-vous cette maladie ? Si oui avec quelles plantes ? o Association de plantes ? o Plante seule o autre méthode mystique ou locale de la soigner ? o Autres

12) Plantes (parties) en associations

6. …….. 7. …….. 8. …….. 9. ……..

13) Mode de préparation du remède o Décoction o Infusion o Macération - Temps de macération : o Poudre de plantes o Bain, douche o Fumigation o Autre mode : Description

14) Posologie et Durée du traitement

15) Quel est le succès de votre thérapie (Observations et retours des patients) ? o tout-à-fait guéri o guéri mais avec séquelles -- dans ce cas préciser les séquelles :______o amélioration o stationnaire o rechute o aggravation (Recours à autres thérapies ou médecine)

16) Quel est la fréquence des consultations pour cette maladie chez vos patients/Clients?

□ Très rare (< à 1cas/3mois) □ rare (>1cas/3mois) □ peu fréquent (>1cas /mois) □ Fréquent (>1cas/semaine) □ Autres :…………………….

17) Les patients sont-ils déjà allés à l’Hôpital pour le diagnostic ? Oui □ Non □

Si Oui ?

18) Suivent-ils ou ont-ils suivi un traitement antituberculeux moderne pendant votre traitement ?

o Déjà suivi le traitement mais séquelles (toux résiduelle, autre………………..), Test TB négatif o Traitement combiné avec le traitement traditionnel (RHZE, ou RH) o Traitement traditionnel seul

Annexe 3 : Autorisation pour mener les enquêtes auprès des patients

Annexe 4 : Exemple de certificat phytosanitaire pour transport sur les plantes collectées au Sénégal

VII

Annexe 5 : Analyses RMN (600MHz, solvant Acetone-d6) pour l’identification et la description de Punicacortein D, Fraction 13 isolée de l’extrait aqueux de Combretum aculeatum

VIII

1 Annexe 6 : Analyse par RMN H (500MHz, solvant D2O) des fractions isolées et complétements identifiées de la décoction de Guiera senegalensis

XII

Communications scientifiques

Communications orales - Seminar on the sahelian Biodiversity ,OMI-Tessekere” University Cheikh Anta Diop , Dakar /French Diop E. A(2013), “Phytomedicine for West African countries”

- Symposium of the Senegalese chemical society(CSC) , University Cheikh Anta Diop of Dakar /French Diop E. A(2014), “Plants Drug Interactions : The case of TB ?”

- PhD Day Auditoire Louis Jantet –Genève - EPGL-Université de Genève - 22 Juin 2017

Posters

- Congrès IOCD 2015, Marrakech/Maroc - Prix du meilleur poster Diop E. A et al. (2015), “Screening of medicinal plants traditionally used in Senegal for the treatment of Tuberculosis with an innovative host-pathogen assay model

- Congrès Phytopharm 2015, Université de Bonn - Allemagne (June 2015, 3ème place prix du poster) Diop E. A et al. (2015), “Medicinal plants traditionally used in Senegal for tuberculosis treatment: Are they active against Mycobacterium strains?” Poster

- GA-JNCP Copenhague – Juillet 2016 Diop E. A et al. (2017), Identification of antimycobacterial ellagitannins from the aqueous ex-tract of Combretum aculeatum

- ITP 2018 – Gdansk/Pologne – Septembre 2017 Diop E. A et al. (2017), Punicalagin quantification by CZE in extracts of Combretum aculeatum used traditionally for TB ailments

- Geneva health Forum – Genève/ Suisse - Avril 2018 Diop E. A et al. (2018), Counterfeits and Sub-Standards medicines: Five years’ experience in Senegal with CE

XIII

Congrès IOCD – Marrakech/Maroc - Mars 2015

XIV

Congrès Phytopharm – Bonn/Allemagne - Juin 2015

Congrès JNCP – Copenhague/Danemark - Juillet 2016

XVI

Congrès ITP – Gdansk/Pologne – Septembre 2017

XVII

Congrès Geneva Health Forum – Genève/Suisse - Avril 2018

XVIII