MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta DIPLOMOVÁ PRÁCE Brno 2007 Eva Bartoňová
Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ODDĚLENÍ GENETIKY A MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Sekavčík horský ( Sabanejewia balcanica ) – populační genetická identita ve vztahu k záměru repatriace druhu do povodí Bečvy. Diplomová práce Brno 2007 Eva Bartoňová
Diplomovou práci jsem vypracovala v rámci řešení výzkumného projektu reg.č. VaV SM/6/05 „Genetická diverzita ohrožených druhů ryb – nezbytný základ efektivní ochrany biodiverzity“, který je financován Ministerstvem životního prostředí ČR. Projekt je řešen v Ichtyologickém oddělení Ústavu biologie obratlovců AV ČR v.v.i., kde jsem diplomové téma zpracovala. Ráda bych poděkovala školitelce RNDr. Věře Luskové, CSc. za vedení, pomoc a podporu při práci. Děkuji doc. Ing. Stanislavu Luskovi, CSc. a Mgr. Ivo Papouškovi za cenné rady a připomínky. Jsem vděčná RNDr. Miroslavu Švátorovi, CSc. a RNDr. Jánu Koščovi, CSc. za poskytnutí vzorků sekavčíka z povodí Bečvy a z území Slovenska.
2
OBSAH 1. ÚVOD ...... 3 2. PROBLEMATIKA ...... 5 2.1. Historie a taxonomie ...... 5 2.2. Současný pohled na taxonomii rodu Sabanejewia ...... 7 2.3. Výskyt a taxonomické hodnocení sekavčíka na území Československa ...... 11 2.4. Stručná biologie druhu ...... 13 2.5. Ochrana druhové diverzity ...... 14 2.6. Vnitrodruhová genetická diverzita a její ochrana ...... 16 2.7. Analýza a hodnocení vnitrodruhové diverzity ...... 18 2.8. Cíle diplomové práce ...... 21 3. MATERIÁL A METODIKA ...... 22 4. VÝSLEDKY ...... 29 4.1 . Molekulární charakterizace genu (proteinu) cytochrom b (B) u Sabanejewia balcanica ...... 29 4.2. Genetická diverzita a blízkost populací Sabanejewia balcanica ...... 34 4.3. Příslušnost zkoumaných populací Sabanejewia balcanica k subliniím dunajsko balkánského komplexu...... 38 4.4. Genetická identifikace vymizelé populace z řeky Bečvy a vyhledání nejbližší vhodné populace pro repatriaci Sabanejewia balcanica ...... 40 5. DISKUZE ...... 43 6. ZÁVĚR ...... 50 7. SUMMARY ...... 51 LITERATURA ...... 52
3
1. ÚVOD
Ochrana biodiverzity je v současné době obecně vnímaným a uznávaným fenoménem. Na ochranu biologické rozmanitosti byl přijat systém legislativně právních předpisů, mezinárodních i národních. Nezbytným předpokladem pro efektivní ochranu je znalost na všech jejích úrovních. Česká republika, vzhledem k poloze ve středu Evropy, vyniká vysokou druhovou pestrostí. Vzhledem k relativně malému území však řada druhů v minulosti vymizela anebo je jejich existence u nás kriticky ohrožena. Proto je v současné době v rámci ČR vyvíjeno velké úsilí směřující ke stabilizaci aktuálního stavu biodiverzity a následně i k postupnému obnovení výskytu druhů, které u nás v minulosti z různých důvodů vymizely. Ichtyofauna České republiky z hlediska druhové pestrosti patří k velmi početné složce fauny obratlovců, která však byla v minulosti silně negativně dotčena lidskými aktivitami. Jedním z cílů výzkumného projektu MŽP ČR, který je zaměřen na chráněné a ohrožené druhy, je i získání vědeckých podkladů pro vypracování a realizaci záchranných programů a dalších aktivních opatření k ochraně a obnovení původní biodiverzity ryb. Jedním z druhů, který se původně velmi omezeně vyskytoval v povodí Bečvy, byl sekavčík horský. Druh, velmi náročný na kvalitu vodních toků, však ze svého původního areálu u nás vymizel. Jeho výskyt v ČR tvoří západní okraj rozšíření v Evropě. Zcela pochopitelně byl proto zařazen do výzkumného programu s cílem získat potřebné znalosti o jeho genetické identitě z hlediska populační blízkosti pro připravovaný záchranný program obnovy jeho výskytu v povodí Bečvy. Problematika populační a mezipopulační genetické diverzity sekavčíka horského se stala tématem mé diplomové práce. Výsledky uvedené v diplomové práci jsem prezentovala jako referát na III. mezinárodní konferenci „Loaches of the genus Cobitis and related genera“ v chorvatském Šibeniku 23. – 29. září 2006. Upravený referát byl přijat k tisku v Suplementu mezinárodního časopisu Folia Zoologica.
4
2. PROBLEMATIKA
2.1. Historie a taxonomie
Historie a taxonomie rodu Sabanejewia – sekavčík je provázena nejasnostmi a změnami na rodové i druhové úrovni. Rod patří do třídy Paprskoploutví (Actinopterygii), řádu Máloostní (Cypriniformes) a čeledi Sekavcovití (Cobitidae). Původně byli příslušníci rodu Sabanejewia , až na výjimky, řazeni do rodu Cobitis. Jako první druh zařazený v současné době do rodu Sabanejewia byl popsán Cobitis caspia Eichwald, 1838. Z dalších je potřebné uvést druh Acanthopsis aurata De Filippi, 1865 popsaný z jižního Íránu. Pod změněným druhovým názvem Cobitis auratus byli následně po řadu let označováni všichni jedinci v Evropě a Asii s tím, že v rámci tohoto druhu byly popisovány nové poddruhy a natia. Jednotlivé taxony sekavčíků byly dlouho řazeny do rodu Cobitis – sekavec. Vladykov (1928) signalizoval vyčlenění „sekavčíků“ z rodu Cobitis a jejich ustanovení jako nového rodu Sabanejewia : „Na základě shora uvedeného chtěl bych učinit návrh, aby se považovaly druhy C. balcanica a C. montana za nový rod Sabanejewia n. g. Blíže a přesně popíši nový rod v nejbližší době“, (přeloženo z německého originálu). O rok později Vladykov slib splnil a v práci Vladykov (1929) nový rod vyčlenil: „Zvláštní aspekt sexuálního dimorfismu u Sabanejewia (Cobitis ) balcanica se liší od C. taenia a přinutil mě studovat sexuální dimorfismus u všech našich zástupců čeledi Cobitidae. Na základě této studie byl jsem povinen oddělit Cobitis balcanica od rodu Cobitis a ustavit nový rod Sabanejewia “, (přeloženo z francouzského originálu) . Do nového rodu začlenil dva druhy, S. aurata (Filippi, 1865) a S. balcanica (Karaman, 1922). Trvalo téměř půl století, než byl obecně respektován a přijat rodový název Sabanejewia pro sekavčíka. Např. Berg (1949) v základním ichtyologickém kompendiu ještě použil pro sekavčíka původní rodový název Cobitis. S rodovým označením Cobitis se setkáváme i v jednotlivých studiích zabývajících se problematikou sekavčíků. Banarescu (1964) přiznal názvu Sabanejewia podrodovou úroveň. Postupné a definitivní uznání samostatnosti rodu Sabanejewia nastává v poslední čtvrtině minulého století. Významná byla pro taxonomii rodu Sabanejewia revalidace Nalbantem (1963), který potvrdil Sabanejewia jako platný rodový název a až od tohoto roku byl postupně akceptován i ostatními autory. Oprávněnost
5 samostatnosti rodu Sabanejewia potvrdil i Grossu et al . (1971) na základě elektroforetické analýzy svalových a sérových proteinů. Obdobně komplikovaný proces jako uplatňování a prosazování samostatnosti rodu Sabanejewia provázel i problematiku druhů. Původní druhový název Cobitis balcanica Karaman, 1922, pozměnil Vladykov (1929) na Sabanejewia balcanica (Karaman, 1922), současně uznal svůj původní popis nového druhu Cobitis montana jako synonymum uvedeného, též Vladykov (1931). Rovněž druhová determinace sekavčíka, který se vyskytuje na území původního Československa (Podkarpatská Rus, Slovensko, Morava) obdobně jako v celé Evropě, prodělala řadu změn a variant. Většina autorů přisuzovala Cobitis aurata případně Sabanejewia aurata druhovou úroveň, v rámci které byly popisovány poddruhy či natia. Jako příklad složitého vývoje na druhové či nižší úrovni lze uvést problematiku sekavčíka v povodí Dunaje a v oblasti Balkánu. V průběhu let byla popsána řada poddruhů, přechodných forem a synonym pro S. balcanica . Za synonymum S. balcanica uznal Vladykov (1929) jím popsaný druh S. montana a později i S. bulgarica (Vladykov, 1931). Bacescu (1943) poprvé vyslovil názor, že S. balcanica je poddruh S. aurata . Tomuto názoru oponoval Berg (1949), který považoval za platný druh pouze S. aurata a stále jej řadil do rodu Cobitis . Další vývoj názorů na taxonomický status sekavčíků signalizoval, a později na základě genetických analýz determinovaný, nevyjasněný stav v povodí Dunaje a Balkánu (Perdices et al ., 2003). V 50. letech byla poprvé popsána tzv. přechodná forma mezi C. aurata balcanica a C. bulgarica (Banarescu, 1948). Proto bylo navrženo, aby byla S. bulgarica považována za poddruh S. aurata , jak se domníval Vladykov (1931). Ihned poté začaly diskuse mezi odbornou veřejností o platnosti tohoto poddruhu, a byl vyjádřen názor, že jde spíše o infrasubspecifickou variaci C. a. balcanica (Oliva et al. , 1952). Další přechodné formy popsal Banarescu (1964) opět mezi C. a. balcanica a C. a. bulgarica a nově mezi C. a. balcanica a C. a. vallachica, za platné druhy považoval C. romanica a C. aurata. Podruhovou úroveň přisuzoval C. a. balcanica , C. a. vallachica , C. a. radnensis a C. a. bulgarica . V následujících letech nastalo podrobné studium populací sekavčíka v některých zemích. V Rumunsku průzkum provedl Banarescu a na základě vyhodnocení uvádí přítomnost druhů Cobitis romanica , C. aurata a čtyř poddruhů C. aurata balcanica , C. a. bulgarica , C. a. vallachica a C. a. radnensis (Banarescu, 1964; Banarescu, 1966). V Rusku se tímto tématem zabývali Vasiljeva and Vasiljev (1988). Publikovali názor, že S. bulgarica je
6 samostatný druh odlišný od S. aurata , ale S. balcanica stále považovali za poddruh S. aurata . Současně popsali nový podruh Sabanejewia aurata kubanica. Kottelat (1997) ve své přehledné revizní studii o rybách Evropy uvedl, že výskyt S. aurata je omezen na území Íránu a v Evropě se vůbec nevyskytuje (tedy v Evropě se vyskytuje pouze S. balcanica ). Konečné potvrzení předpokladů přinesla cytogenetická analýza (Boron, 2000). Kottelat (1997) považoval krátce předtím popsaný nový poddruh z povodí Odry S. aurata baltica (Witkowski, 1994) za synonymum S. balcanica . Pro oblast Evropy Kottelat (1997) považoval za validní následující druhy: S. balcanica (Karaman, 1922), S. bulgarica (Drensky, 1928), S. larvata (Filippi, 1859) a S. romanica (Bacescu, 1943). Je potřebné uvést, že naprostá většina popisů druhů, poddruhů a změn v taxonomii sekavčíků byla prováděna na základě morfometrie – tj. hodnocení plastických a meristických znaků a případně některých dalších vizuálně detekovaných odlišností.
2.2. Současný pohled na taxonomii rodu Sabanejewia
Významný přínos a další nové pohledy na formování taxonomie a fylogenetických vztahů v rámci rodu Sabanejewia přináší aplikace karyologických a zejména molekulárních metod. U všech druhů sekavčíka bylo zjištěno 2n = 50 chromozomů (Obr. 1) (Vasiljeva and Vasiljev, 1988; Vasiljeva and Ráb, 1992; Boron, 2000), přičemž u S. a. balcanica bylo zjištěno charakteristické pruhování (Ráb et al ., 1991). Obrázek 1: Idiogram a karyotyp S. balcanica 2n = 50 chromozomů (m metacentrické, sm submetacentrické, st subtelocentriské, a akrocentrické chromosomy).
Vasiljeva and Ráb (1992) provedli karyologickou studii při které zjistili, že karyotyp S. balcanica z dunajského povodí je zcela odlišný od karyotypu S. aurata a S. kubanica z Ruska. Nemohli tedy nadále považovat S. balcanica za poddruh S. aurata .
7
Ludwig et al . (2000) provedli molekulární analýzu na části genu pro cytochrom b u druhů S. romanica, S. vallachica, S. bulgarica, S. radnensis, S. balcanica, S. montana a S. larvata . Došli k závěru, že S. larvata je předkem pro ostatní druhy Sabanejewia. Dále se oddělovala jako samostatný druh i S. montana , což bylo v rozporu s tvrzením, že jde o synonymum S. balcanica (Vladykov, 1929; Vladykov, 1931; Kottelat, 1997). Dalším rozporem oproti předpokladům byl fakt, že nedošlo k separaci S. romanica a S. bulgarica , jež byly do té doby považovány některými autory za samostatné druhy (Banarescu et al ., 1972; Kottelat, 1997). Došli tedy ke stejnému závěru jako před nimi i Banarescu (1999), že rod Sabanejewia může být rozštěpen na dvě podskupiny a zcela samostatné druhy. Také zjistili existenci nesouladu mezi morfologickými a molekulárními analýzami. Nejnovější taxonomické a evoluční poznatky o rodu Sabanejewia publikovali Perdices et al . (2003). Protože se jedná zatím o poslední výsledky, ze kterých jsem vycházela při vypracování diplomové práce, zmiňuji je podrobněji. Perdices et al . (2003) provedli molekulární studii pomocí dvou mitochondriálních (mt) markerů, genů pro ATP syntázu 8/6 a pro cytochrom b (cyt b). Jejich cílem bylo vyjasnit evoluční vztahy mezi evropskými a asijskými příslušníky rodu Sabanejewia, vztahy druhů v rámci Evropy a zkonstruovat historii jejich evoluce. Zkoumali také hypotézu o předpokládaném východoasijském původu celého rodu, který podle ní začal osídlovat Evropu v oligocénu přes Sibiř (Banarescu, 1992). Identifikovali šest hlavních evolučních linií (lineages) v Evropě a Asii: Sabanejewia larvata, Sabanejewia romanica, Sabanejewia aurata/Sabanejewia caucasica, Sabanejewia cubanica, Sabanejewia baltica a dunajsko balkánský komplex (Obr. 2). Samostatně se od ostatních oddělovaly druhy S. larvata ze severu Itálie a S. romanica z Rumunska. Potvrzuje to domněnku autorů Ludwig et al . (2000), že S. larvata a S. romanica jsou základní předci pro ostatní druhy Sabanejewia , ovšem s výjimkou dunajsko balkánského komplexu. Zmíněným autorům oponuje také skutečnost, že S. romanica je evolučně příbuzná s evropskými druhy povodí Dunaje (nebyl nalezen společný předek). Další tři linie S. aurata/S. caucasica , S. baltica a S. kubanica hodnotí Perdices et al . (2003) souhrnně jako tzv. kavkazsko kaspický komplex. Došlo tedy k jasnému oddělení asijských a evropských druhů. Jelikož se S. aurata , v minulosti považovaná za základní druh v evropských vodách, významně odděluje od ostatních evropských linií a tvoří samostatný komplex s asijskými druhy, učinili autoři závěr, že se tento druh v Evropě vůbec nevyskytuje. To však již uvedl Kottelat (1997). Evropské poddruhy S. aurata by se tedy měly stát platnými druhy. U S. baltica , považované za synonymum S. balcanica (Kottelat, 1997), se ukázal jasný evoluční vztah s asijskými
8 genotypy, a tedy jej lze jednoznačně považovat za samostatný druh. Podle autorů je absence mt DNA haplotypů dunajských linií v povodí Kaspického a Černého moře způsobena pohořím Karpat, které vytvořily bariéru migrace evropských druhů do těchto oblastí. Obrázek 2: Fylogenetické vztahy v rodu Sabanejewia na základě markerů ATPáza 8/6 a cyt b (Perdices et al ., 2003).
9
Poslední linie, do které se zařadila většina taxonů ve střední Evropě a na Balkáně, byla nazvána dunajsko balkánský komplex (DB komplex), který se rozpadá do šesti sublinií: I. S. vallachica/S. balcanica z Rumunska, II. S. balcanica/S. doiranica ze západního Řecka, III. S. bulgarica/S. balcanica/S. montana ze střední části povodí Dunaje, IV. S. radnensis/S. balcanica z povodí řeky Mures, V. S. thrakica/S. balcanica z Řecka a VI. S. balcanica z povodí řeky Mur. Z uvedeného je zřejmé, že podstatu DB komplexu tvoří S. balcanica . Uvedené charakteristiky DB komplexu potvrdily nevyhraněnost resp. existenci přechodných forem (Banarescu, 1948; Banarescu, 1964). Nízká variabilita mezi subliniemi svědčí o nedávné genetické homogenizaci v Evropě, v důsledku změny habitatu (cyklického střídání teplot). Dále se u druhů DB komplexu nepotvrdil předpoklad asijského původu (Banarescu, 1992). Nově se přiklání k vlivu středozemních linií (řeckých), jenž byl pozorován i u příbuzného rodu Cobitis (Economidis and Nalbant, 1996; Perdices and Doadrio, 2001). Hypotézu podporují geologické důkazy o propojení povodí Dunaje s řekou Vardar (Řecko) v pleistocénu (Economidis and Banarescu, 1991) a genetická podobnost řeckých a dunajských Cyprinidae (Zardoya et al ., 1999). Změn názvů rodů, druhů, poddruhů či natií bylo u sekavčíka v průběhu let opravdu hodně, proto jsem na závěr zařadila přehlednou tabulku těch nejdůležitějších (Tab. 1).
Tabulka 1: Přehled vývoje a stavu taxonomie rodu Sabanejewia . Původní popis Synonyma Současný stav Cobitis caspia Sabanejewia caspia Eichwald, 1838 (Eichwald, 1838) Acanthopsis aurata Cobitis aurata Sabanejewia aurata De Filippi, 1865 (De Filippi, 1865) (De Filippi, 1865) Sabanejewia aurata aurata (De Filippi, 1863) Acanthopsis larvata Sabanejewia larvata De Filippi, 1859 (De Filippi, 1859) Cobitis aralensis Cobitis aurata aralensis Sabanejewia aurata aralensis Kessler, 1877 Kessler, 1877 (Kessler, 1877) Cobitis balcanica Cobitis montana Sabanejewia balcanica Karaman, 1922 Vladykov, 1925 (Karaman, 1922) Sabanejewia balcanica Cobitis aurata balcanica Cobitis bulgarica Sabanejewia balcanica Sabanejewia bulgarica Drensky, 1928 Cobitis aurata bulgarica (Drensky, 1928) Cobitis taenia caucasica Cobitis caucasica Sabanejewia caucasica Berg,1906 Berg, 1906 (Berg, 1906) Cobitis caspia romanica Cobitis romanica Sabanejewia romanica Bacescu, 1943 Bacescu, 1943 (Bacescu, 1943)
10
Cobitis aurata vallachica Nalbant, 1957 Sabanejewia aurata Sabanejewia cubanica cubanica (Vasiljeva & Vasiljev, 1988) Vasiljeva & Vasiljev, 1988 Sabanejewia aurata baltica Sabanejewia baltica Witkowski, 1994 Witkowski, 1994 Sabanejewia aurata doiranica Economidis & Nalbant, 1996 Sabanejewia aurata thrakica Economidis & Nalbant, 1996
2.3. Výskyt a taxonomické hodnocení sekavčíka na území Československa
Vzhledem k návaznosti uvádím přehled výskytu a taxonomického hodnocení sekavčíka na území původního Československa po roce 1918. Původní český název, kdy byl sekavčík řazen do rodu Cobitis , byl sykavec horský ( Cobitis montana ) (Schönfeld and Pytlík, 1926; Vladykov, 1926). Později Záleský (1944) použil názvu sykavec balkánský ( S. balcanica ). V dalších studiích bylo použito jméno sykavec horský ( C. aurata ) (Oliva et al., 1952), později se začalo používat pojmenování sekavec horský (Kratochvíl et al ., 1954; Kux and Weisz, 1964). V kompendiu fauna ryb ČR a SR (Baruš et al ., 1995) bylo použito pojmenování sekavčík horský ( S. aurata ). Po zveřejnění revize evropských ryb Kottelat (1997), kdy bylo zřejmé, že S. aurata se v Evropě nevyskytuje, setrvalo se u českého názvu sekavčík horský s tím, že je používán latinský název S. balcanica (Lusk et al ., 2000; Lusk et al ., 2002a; Hanel, 1995; Hanel and Lusk, 2005). Sekavčík byl v rámci původního Československa na Zakarpatské Ukrajině zjištěn v přítocích Tisy v letech 1923 a 1924 Vladykovem, který jej popsal původně jako nový druh Cobitis montana n.sp. (Vladykov, 1925). Sykavec horský (tehdejší český název) byl podle Vladykova (1926) v tamnějších tocích obecně rozšířeným a početným druhem. V roce 1922 Karaman popsal nový druh C. balcanica podle jedinců z řek bývalé Jugoslávie (Sáva, Vardar, Miljacka, Veles) (Karaman, 1922). Vladykov (1929) srovnáním materiálu „obou“ druhů došel k závěru, že jsou shodné a uznal prioritu Karamana. Současně však dospěl k závěru, že se jedná o nový rod Sabanejewia . Do nového rodu zařadil dva druhy Sabanejewia balcanica (Karaman) a Sabanejewia aurata (Filippi).
11
První nález sekavce horského ( C. aurata ) na území Slovenska uveřejnil Pavlík (1953) z potoku Biela voda, pravostranný přítok Váhu pod Púchovem. Další nálezy tohoto druhu následovaly postupně, s rozvojem intenzity ichtyologických výzkumů na Slovensku. Brtek (1953) jej nalezl na několika lokalitách Dunaje, Kux and Weisz (1957) v Topl´e a další nálezy uvádí přehledně (Oliva et al ., 1968). Současný výskyt a stav populací sekavčíka horského ve vodách Slovenska je hodnocen ve studiích Koščo et al . (2006) a Koščo et al . (2007). Z uvedených poznatků a dat je zřejmé, že početnost a rozšíření sekavčíka horského se zvyšuje od západu (povodí Dunaje) směrem na východ (povodí Tisy). V povodí Tisy je sekavčík značně rozšířeným druhem. V rámci stávající České republiky byl sekavčík poprvé zjištěn v řece Bečvě (přítok Moravy) u Lipníka v roce 1943. Tento nález publikoval Záleský (1944) pod názvem sykavec balkánský ( Sabanejewia balcanica Vlad.). Výskyt sekavčíka zůstal omezen na povodí Bečvy. Oliva (1950) uvádí nález sekavčíka na shodné lokalitě jako Záleský (Bečva pod splavem u Lipníka n. B.). Zelinka (1951) jej zjistil v dolní části Bečvy nad ústím do Moravy v Troubkách, Oliva et al . (1952) v Lipníku nad Bečvou a v Bečvě při ústí do řeky Moravy. Ve Vsetínské Bečvě a v jejím pravostranném přítoku Senici zjistil přítomnost sekavčíka Kux (1957) a Kux (1964). Nález sekavčíka ve Vsetínské Bečvě v oblasti ústí přítoku Bystřička zmiňují Banarescu and Oliva (1966). Poslední záznam o výskytu sekavčíka horského v povodí Bečvy je z roku 1967 z náhonu u Hovězí (Libosvárský – nepublikováno in Lusk et al ., 2006a). Další snahy o zjištění resp. potvrzení výskytu sekavčíka horského v povodí Bečvy proběhly až v devadesátých letech (1997 2000), byly však neúspěšné (Lusk et al ., 2000). Proto byl tento druh hodnocen pro Českou republiku jako vymizelý (Lusk and Hanel, 2000). V roce 2001 při ichtyologickém průzkumu říčky Vláry byl těsně při hranicích se Slovenskem (obr. 2, ř.km 19,9) (Obr. 3) zjištěn výskyt sekavčíka na území ČR (Lusk et al ., 2002b). Návazně provedený výzkum dolního toku Vláry na území Slovenska prokázal výskyt tohoto druhu na všech zkoumaných lokalitách. Výskyt sekavčíka na území ČR zahrnuje úsek toku Vláry o délce pouze několika stovek metrů a jeho výskyt tam byl opakovaně potvrzen (Lusk et al ., 2006a). Výskyt sekavčíka v toku Vláry na území ČR je pravděpodobně výsledkem protiproudové migrace tohoto druhu z dolního toku Vláry na území Slovenska , což umožnila zlepšená kvalita vody v posledních letech a obnovení migrační průchodnosti v oblasti dolního toku Vláry (Lusk et al ., 2002b).
12
Obrázek 3: Mapka výskytu sekavčíka na dolním a středním toku Vláry. Šipkami jsou vyznačeny zkoumané lokality s uvedením říčních kilometrů (ř.km). Na lokalitách ř.km 15,1 a 19,0 sekavčík zjištěn nebyl. Na území ČR se vyskytuje na ř.km 12,9 (Lusk et al ., 2002a). Fotografie lokalit s výskytem sekavčíka: ř.km 3,5 (nahoře) a ř.km 12,9 (dole).
13
2.4. Stručná biologie druhu
Poznatky o biologii sekavčíka horského (Obr. 4) z našich podmínek jsou nedostatečné. Přispěla k tomu skutečnost, že jeho výskyt v ČR byl velmi omezený (povodí Bečvy odkud vymizel), v současnosti se vyskytuje pouze v krátkém úseku říčky Vláry. Z našich podmínek s výjimkou morfometrického posouzení (popis, zbarvení, pohlavní dvojtvárnost) v souvislosti s taxonomickým hodnocením (Oliva et al ., 1952; Halačka and Vetešník, 2002) a poznámek o charakteru mikrohabitatu (Vladykov, 1926; Oliva et al ., 1952) není více publikací. Většina biologických charakteristik vychází z poznatků uvedených v zahraniční literatuře. Obrázek 4: Sekavčík horský ( Sabanejewia balcanica ) (http://www.izwberlin.de/de/forschung/fg2/index.html?cobitis.html~rechts, upraveno).
Sekavčík horský je krátkověký druh dožívající se maximálně 4 (5) let, průměrně 2 3 roky, dorůstá délky 10 cm. Jde o druh teritoriální, věrný svému stanovišti, které neochotně opouští a vždy se na něj vrací (Vladykov, 1926). V podmínkách ČR a SR se vyskytuje pouze v tekoucích vodách podhorského charakteru. Mikrohabitat tvoří buď štěrkovité či písčité dno, do kterého se v některých případech zahrabává, zejména v zimním období. Obvykle se však zdržuje mezi štěrkem. Živí se zooplanktonem, fytoplanktonem, ale i vodním hmyzem a živočichy žijícími u dna. Pohlavně jedinci dospívají ve věku 2 let, samice vytírá jikry v průběhu května až července v několika dávkách obvykle na štěrkovitý či písčitý podklad. Jikry nechrání, s ohledem na analogii (morfologie a vlastností jiker) se sekavcem ( Cobitis ) je řazen k druhům fytofilním (Hanel, 1995; Hanel and Lusk, 2005).
14
2.5. Ochrana druhové diverzity
V současné době je ochrana druhů řešena především legislativními předpisy (zákony, vyhlášky) v rámci jednotlivých států. V evropské unii se uplatňují společné ochranářské předpisy, jež jsou členské státy povinny zařadit do systému národní legislativy. V České republice je základním obecným ochranářským předpisem zákon č. 114/1992 Sb. o ochraně přírody a krajiny a navazující prováděcí vyhláška č. 395/1992 Sb., kde jsou uvedeny konkrétní druhy, chráněné podle těchto legislativních norem. V příloze III. této vyhlášky je jako kriticky ohrožený druh uveden sekavčík horský – Cobitis aurata. Zde je jednoznačná nejasnost, neboť podle současného stavu znalostí, správné označení sekavčíka horského je Sabanejewia balcanica . Problém nesouladu mezi aktuální vědeckou terminologií a označením v platných legislativních normách je dán především zdlouhavostí legislativních procesů a nemožností jejich aktualizace. Tyto rozpory mohou v některých případech oslabovat jejich ochranářské působení. Areál rozšíření rodu Sabanejewia zahrnuje značnou část Evropy i část Asie. S konkrétními údaji o výskytu jednotlivých druhů, případně poddruhů, je to komplikovanější. Problémem je existence tzv. přechodných forem (které nemají druhové označení) a odlišné taxonomické pojmenování druhů (poddruhů) v minulosti. Při vytváření ochranářské legislativy je často dána přednost zažitým stabilním druhovým označením s případným, co nejširším areálem. Vědecké poznatky o změnách taxonomie jednotlivých objektů, často i protichůdné, jsou do oblasti legislativy promítány se značným zpožděním a velmi neochotně. Klasickým případem je situace u sekavčíka horského. Při přípravě legislativních předpisů (okolo r. 1990) byl obecně vžitý odborný název pro sekavčíka horského Cobitis aurata i v rámci Evropy (Lelek, 1987). Proto v ochranářských předpisech ČR je stále zakotven odborný název C. aurata pro sekavčíka horského, i když na základě současných poznatků je zcela jednoznačné, že druh s tímto označením se v Evropě vůbec nevyskytuje. Proto se, z důvodu uchování legislativní jednoznačnosti, odborníci přiklonili k zachování původního českého názvu – sekavčík horský, i když byl původně používán pro druh, který se u nás nevyskytuje (Hanel and Lusk, 2005). Obdobně bylo postupováno i při konstituování evropských ochranářských norem – příloha II Směrnice Rady č. 62/43/EEC, kde je v seznamu druhů, pro něž jsou členské státy evropské unie povinny vymezit „evropsky významné lokality“ uveden sekavčík horský jako C. aurata . Významná úloha při ochraně druhové pestrosti připadá tzv. Červeným seznamům, které jsou silně vnímány odbornou i laickou veřejností, i když nemají legislativní sílu (vymahatelnost). Tyto materiály jsou sestavovány na základě aktuálních informací o stavu
15 ohrožení jednotlivých druhů na národní i mezinárodní úrovni. V ČR je sestavován Červený seznam pro mihule a ryby v pětiletých intervalech. V poslední verzi národního Červeného seznamu je sekavčík horský s vědeckým názvem Sabanejewia balcanica zařazen do skupiny druhů „kriticky ohrožené“ (Lusk et al ., 2006b). Na základě implementace evropského předpisu Směrnice Rady č. 62/43/EEC do naší národní legislativy (vyhláška č. 166/2005 Sb., kde je uveden sekavčík horský s označením Sabanejewia aurata/balcanica ) byla pro tento druh vymezena jediná “evropsky významná lokalita“ a to na dolním úseku toku Vláry na území ČR pod označením „ CZ0723434 Vlára“. Obdobná situace je i v ostatních evropských státech, kde se sekavčík vyskytuje v různých formách. V Evropě je výskyt S. balcanica uváděn z Bosny a Hercegoviny, Bulharska, Makedonie, Rumunska, Ukrajiny (Hanel and Lusk, 2005), Slovinska (Povž and Šumer, 2000), Chorvatska (Delić et al ., 2003a; Delić et al ., 2003b), Polska (Wikowski, 1994). Na Slovensku je sekavčík horský dlouhodobě běžným druhem (Kux and Weisz, 1964; Koščo et al., 2006; Koščo et al. , 2007). V rámci národní legislativy (vyhláška č. 24/2003 Z.z.), je na Slovensku posuzován jako druh „ohrožený“. O podstatně hojnějším výskytu sekavčíka horského na Slovensku svědčí i vyšší počet evropsky významných lokalit (celkem 17), které byly vymezeny v rámci implementace evropské legislativy při instalaci systému Natura 2000.
2.6. Vnitrodruhová genetická diverzita a její ochrana
Ochrana vnitrodruhové genetické diverzity je založena především na druhovém principu, zakotveném ve většině legislativních ochranářských norem, kde základním objektem ochrany je druh. V posledních letech, při možnosti aplikace moderních výzkumných postupů, se odborníci zaměřili v širokém rozsahu i na dosud omezeně poznanou úroveň biodiverzity – tzv. vnitrodruhovou genetickou diverzitu. Lusk et al . (2002c) uvádí: „Vnímání vnitrodruhové diverzity jako významného fenomenu a součásti biodiverzity ryb u nás nabývá na intenzitě. Dnes je vnitrodruhová diverzita téměř výlučně chápána na úrovni vnitropopulační a mezipopulační genetické variability .“ V téže studii autoři zdůrazňují o populaci: „Jde tedy o jedinečný výtvor biologických procesů v rámci rozdílných vnějších podmínek a vlivů. V zásadě vnitrodruhová diverzita je unikátní výtvor, který by měl být maximálně ochraňován.“ Část našich odborníků si stále více uvědomuje potřebu chránit nejen druh všeobecně, ale i konkrétní lokality, kde se vyskytují, tedy jednotlivé populace. Uvědomili si, že jedinečnost je v celku, který populace vytvářejí společně s prostředím, ve kterém žijí. Jde o to, že 16 jedinci určitého genotypu jsou nejlépe vybaveni pro prostředí, ve kterém žijí, a přesun tohoto genotypu do jiné lokality by mohl vést k horší životaschopnosti. Významně o tom svědčí materiály, které byly dosud prezentovány na periodických konferencích „Biodiverzita ichtyofauny ČR“. Ochrana genetické diverzity není v legislativě ČR přímo obsažena, ale určité formy nebo prvky ochrany genetické diverzity se zde objevují. Tuto formu ochrany nepřímo představuje především aplikace evropských ochranářských norem do legislativy ČR. V již uvedené Směrnici Rady č. 92/43/EEC se jedná o vymezení evropsky významných lokalit pro vybrané druhy, které jsou chráněny v rámci systému Natura 2000. Tento systém ochrany představuje ochranu určité populace na vymezené, evropsky významné lokalitě. V rámci národní legislativy systém Natura 2000 a tedy i vymezení a ochranu evropsky významných lokalit pro vybrané druhy (i pro sekavčíka horského) zajišťují novela zákona č. 114/1992 Sb. formou zákona č. 218/2004 Sb. a vyhláška č. 166/2005 Sb. V rámci naší národní legislativy (§ 52, z.č. 114/1992 Sb. v úplném znění pod č. 460/2004 Sb.) pro zvláště chráněné druhy lze aplikovat tzv. záchranné programy. Cílem záchranného programu je podpora ohroženého druhu a obnova jeho výskytu na lokalitách odkud vymizel (repatriace). Podle zákona, záchranné programy spočívají v návrhu a uskutečňování zvláštních režimů řízeného vývoje, jako jsou záchranné chovy, introdukce, reintrodukce, záchranné přenosy a jiné přístupné metody vhodné k dosažení sledovaného cíle. Ve vypracované „Osnově pro zpracování záchranného programu živočichů“ (Brejšková et al., 2002), kde jsou vymezeny zásady přípravy a realizace záchranného programu, jsou zcela pominuty otázky ohrožení a udržení vnitrodruhové diverzity (Hanel and Lusk, 2005). V souladu se současnými znalostmi o vnitrodruhové diverzitě je nezbytné změnit přístup k podpoře oslabených populací anebo k repatriaci (nesprávně reintrodukci) tj. obnově výskytu druhu na lokalitě (lokalitách), odkud v minulosti vymizel. Prvním krokem by mělo být poznání genetické diverzity jedinců, jež se na lokalitě vyskytují (vyskytovali) a na základě genetických dat následné hledání jedinců (populace) po genetické stránce shodných, či podobných. Pro realizace záchranného programu by měla být použita populace geneticky nejbližší populaci, kterou chceme podpořit či obnovit. Tento vědecky oprávněný a uznávaný princip obnovy výskytu druhu na lokalitách, odkud v minulosti vymizel, se stal jedním z cílů mé diplomové práce. Konkrétně se jedná o výběr vhodné populace či populací sekavčíka horského, pro obnovu jeho výskytu v povodí Bečvy, odkud tento druh v minulosti vymizel. V rámci realizovaného výzkumného projektu jsem provedla identifikaci genetické charakteristiky sbírkových jedinců pocházejících
17 z populace sekavčíka v řece Bečvě a stanovení genetické charakteristiky jedinců sekavčíka z populací v různých tocích na území Slovenska, které připadají v úvahu jako zdrojové populace pro repatriaci tohoto druhu. Provedené vyhodnocení (viz. část Výsledky) umožnilo vymezit nejvhodnější zdrojové populace z hlediska aspektu zachování původní genetické diverzity při obnově zaniklé populace sekavčíka horského v povodí řeky Bečvy.
2.7. Analýza a hodnocení vnitrodruhové diverzity
V současné době se k analýze a hodnocení vnitrodruhové diverzity, tj. genetické diverzity vnitropoulační a mezipopulační, využívají metody molekulární biologie. Ve stručnosti uvedu postupy, ze kterých jsem vycházela při mé práci. Zásadní změna nastala již při odběru potřebných vzorků. V minulosti se ryby většinou usmrcovaly, aby bylo možno získat vzorky tkání (svalovina aj.). Dnes se preferuje s ohledem na ochranářské aspekty tzv. neinvazivní (non intrusive) odběr vzorků – po odchytu se rybě ustřihne část ploutve nebo se odebere několik šupin a ryba je puštěna zpět do vody. Získané vzorky jsou uchovávány v lihu. Po izolaci DNA je pomocí PCR amplifikován marker vybraný pro konkrétní studii jako nejvhodnější. Jedná se buď o marker mt DNA, nebo o jaderný marker. Jaderný marker je vhodný pro studium evolučně vzdálenějších taxonů, např. rodů či druhů. Důvodem je všeobecně nižší mutabilita jaderného genomu oproti mt DNA, jak uvádí Sykes (2004): „Náchylnost jaderné DNA k mutacím je velice nízká – při jednom dělení buňky dojde k záměně zhruba jen jedné nukleotidové báze z miliardy. Na druhé straně, mitochondrie nedisponují tak bdělými opravnými mechanismy, což vede k asi dvacetkrát vyššímu výskytu mutací. To znamená, že v mitochondriální DNA můžeme najít mnohonásobně více změn než ve stejně dlouhém úseku DNA jaderné. “ Podstatně rychleji mutující mt DNA vede k ustanovení diverzity u jednotek na podstatně nižší úrovni než je druh či poddruh, tj. u populací. Její kružnicová dsDNA obsahuje geny pro rRNA, tRNA a polypeptidy (Obr. 5). Ke speciálním charakteristikám, které se dají u populačních studií dobře využít, patří haploidita, absence rekombinace a maternální dědičnost (při oplodnění se mitochondrie ze spermie ve vajíčku neuplatňují, tedy plod dostává vždy mitochondrie pouze z vajíčka, od matky). Lze tedy říci, že populační historie je „zapsána” v haplotypu mt DNA. Dalším krokem po výběru vhodného markeru a jeho amplifikaci je přečištění od nezreagovaných komponent a následné sekvenování. V dnešní době už se ve všech laboratořích provádí automatické sekvenování, jehož základem je enzymatická Sangerova 18 metoda. Fragmenty pro vlastní sekvenování se připravují pomocí PCR. Od primerů probíhá syntéza komplementárního řetězce podle matrice (DNA) ve směsi obdobné běžné PCR. Na rozdíl od klasické, se při sekvenační PCR do směsi přidávají v poměru 1:99 dideoxynukleositrifosfáty (ddNTP) k deoxynukleosidtrifosfátům (dNTP). ddNTP jsou zařazeny polymerázou s pravděpodobností 1 % na místo dNTP.
Obrázek 5: Schématické znázornění genů na mt DNA. (http://images.google.cz/imgres?imgurl=http: //home.comcast.net/~john.kimball1/BiologyP ages/M/mtDNA2.gif&imgrefurl=http://home. comcast.net/~john.kimball1/BiologyPages/C/ CellularRespiration.html&h=303&w=271&s z=31&hl=cs&start=39&tbnid=Qbs09J8J5j0P eM:&tbnh=116&tbnw=104&prev=/images% 3Fq%3Dmt%2BDNA%26start%3D20%26nd sp%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dcs% 26lr%3D%26sa%3DN). Zařazení ddNTP zastaví prodlužování řetězce v důsledku absence OH skupiny nukleotidu, přesněji kyslíku, na nějž se váže fosfor dalšího nukleotidu. V tomto místě tedy končí 1 % syntéz a 99 % pokračuje. Tímto způsobem pokračuje reakce až do vyčerpání složek. Např. pokud je do směsi dodán ddATP, zařadí se tam, kde je na templátu tymin. V tomto případě jsou reakce zastavovány za templátovými tyminy, u ddTTP za templátovými adeniny, u ddGTP za cytoziny a u ddCTP za guaniny. K detekci fragmentů se používá kapilární elektroforéza a fluorescenční značení terminátorů (ddNTP) na 3´konci. Každému ddNTP odpovídá jiná barva (fluorescein), reakce proto může být provedena pro všechny čtyři nukleotidy v jedné zkumavce (emisní maxima jsou při rozdílných vlnových délkách). Jednotlivé barvy (terminátory) jsou rozpoznávány CCD kamerou, která snímá fluorescenci vyvolanou laserovým paprskem. Výsledná sekvence je zobrazena v podobě chromatogramu. K nevýhodám automatického sekvenování patří citlivost na koncentraci DNA, podmínky při sekvenování a v neposlední řadě obtížná sekvenovatelnost úseků bohatých na GC/AT páry. Dříve k nevýhodám patřila i finanční náročnost (Imsiridou and Zaldívar, 1999), ta se však neustále snižuje a tato technika se stává dostupnou téměř pro všechny laboratoře.
19
K poslední částí analýzy patří ruční vyhodnocení sekvencí a fylogenetická, případně statistická analýza. Data vstupující do analýzy mohou být dvojího typu: znaková a distanční. Znaková data lze převést na distanční, nikoliv naopak. Ze znakových dat se nejvíce používají sekvence (pozice nukleotidu = znak), nebo dříve alozymy, z distančních např. RAPD marker. Oboru zabývajícímu se klasifikací taxonů na základě znaků se říká kladistika. Srovnání znakových dat (sekvencí) probíhá na základě příbuznosti (analýzy MP Maximum Parsimony, ML Maximum Likelihood), distančních na základě podobnosti (UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean, NJ Neighbour Joining). Analýza pomocí znakových dat je obecně přesnější, ale náročná časově a finančně (potřeba výkonného počítače), proto se v menších laboratořích provádí spíše NJ analýza, UPGMA slouží spíše orientačně a v dnešní době není považována za vhodnou. Před vlastním vypočtením stromu je třeba zvolit matematický model, podle kterého bude strom vytvořen. Model vybere počítačový program (Model Test, Find Model) dle zadaných požadavků (četnost mutací, především transverzí, % G, C, A, T atd.). Důležitou hodnotou u všech fylogenetických stromů (případně kladogramů), je tzv. bootstrap hodnota (Obr. 6), která nám říká, jak správně jsou jednotlivé větve rozděleny. Jaký je princip? Program vybere náhodně jedince, vyloučí ho z analýzy a vytvoří strom. Poté ho zpět vrátí a zase náhodně vybere dalšího, vyloučí ho a vytvoří strom. Takto se postup opakuje podle počtu replikací, které zadáme (např. 1000). U každé větve (kromě outgroup) jsou pak zapsány bootstrap hodnoty, např. pokud je hodnota 75, říká nám, že program dal tuto větev v 75 % z příslušného počtu replikací právě do této pozice. Obrázek 6: Část fylogenetického stromu s ukázkou bootstrap hodnot (zakroužkovány červeně) (Zardoya et al ., 1999).
20
2.8. Cíle diplomové práce
Cíle diplomové práce byly stanoveny v souladu s požadavky výzkumného projektu reg.č. VaV SM/6/05 „Genetická diverzita ohrožených druhů ryb – nezbytný základ efektivní ochrany biodiverzity“ Ministerstva životního prostředí ČR. U sekavčíka horského, který patří ke kriticky ohroženým druhům, nebyly k dispozici žádné informace o jeho vnitrodruhové diverzitě. Jejich potřeba je vyvolána i záměrem obnovit výskyt tohoto druhu v povodí Bečvy, kde přes v minulosti hojný výskyt, vymizel. Získané poznatky o genetické diverzitě populací sekavčíka horského na území ČR a Slovenska by měly přispět i k ověření jejich druhové příslušnosti. Byly vymezeny následující základní problémy: 1. Molekulární charakterizace genu (proteinu) cytochrom b (B) u Sabanejewia balcanica . 2. Genetická diverzita a blízkost populací Sabanejewia balcanica . 3. Příslušnost zkoumaných populací Sabanejewia balcanica k subliniím dunajsko balkánského komplexu. 4. Genetická identifikace vymizelé populace z řeky Bečvy a vyhledání nejbližší vhodné populace pro repatriaci Sabanejewia balcanica .
21
3. MATERIÁL A METODIKA
Vzorky z populací sekavčíka horského byly odebírány z jedinců získaných elektrolovem (170 220 V, 0,5 30,5 A) v letech 2002 2006. Rybám byly ustřiženy kousky ploutví a uchovávány v lihu. Jedinci byli následně vypuštěni zpět do vody. Vzorky z vymizelé populace z Bečvy byly odebrány z fixovaných sbírkových jedinců (Zoologický ústav PřF. Univerzity Karlovy v Praze). Celkem byly sebrány vzorky ploutví z devíti populací. Zastoupeno je šest populací ze Slovenska z řek Ol’šava v povodí Topl‘e, Ol’šava v povodí Hornádu, Ondava, Ublianka (povodí Tisy), Ipel’ a Malý Dunaj (povodí Dunaje), jedna populace ze Zakarpatské Ukrajiny z řeky Tisy a dvě populace z České republiky z řek Bečva (vymizelá populace) a Vlára (povodí Dunaje), viz. Obr. 7. Všechny uvedené vodní toky patří k úmoří Černého moře. Obrázek 7: Mapa sběru vzorků: 1 Bečva, 2 Vlára, 3 Malý Dunaj, 4 Ipel’, 5 Ol’šava/Hornád, 6 Ol’šava/Topl’a, 7 Ondava, 8 Ublianka, 9 Tisa (Zakarpatská Ukrajina).
Analyzovala jsem markery cyt b, mt specifický marker (část genu tRNA Glu + část genu pro cyt b) a dodatečně i 12S rRNA. Ze zkoumaných populací byl analyzován úspěšně gen pro cyt b celkem u 77 vzorků (jedinců) (Tab. 2). Následně u vybraných 23 vzorků z celého souboru (2734, 2736, 3570 71, 3573 74, 4526, 4527, 4889, 4891, 4893, 4913, 5608 09, 5615, 5624, 5655, 5657, 5660, 5668, 5670 71, 5677 – Tab. 2) a u dalších 12 vzorků (Tab. 3) byl analyzován marker pro mt specifickou kombinaci. U markeru 12S rRNA jsem provedla amplifikaci pouze u části vzorků (3570, 3573, 4890, 5605, 5624, 5670, 5674, 6163, 6166, 6171, 6172, 6184, 6187, 6600, 6967).
22
Tabulka 2: Přehled analyzovaných vzorků cyt b (řazeny podle čísla vzorku vzestupně) ze zkoumaných populací sekavčíka horského . Číslo Počet Hlavní Vodní tok (populace) Přístupové číslo vzorku jedinců povodí 2727 2730 4 Tisa Ol’šava/Hornád (Slovensko) DQ996468 471 2732 1 Tisa Ol’šava/Hornád (Slovensko) DQ996472 2734 2736 3 Tisa Ol’šava/Hornád (Slovensko) DQ996473 475 2949 1 Dunaj Vlára (ČR) DQ996517 2951 2952 2 Dunaj Vlára (ČR) DQ996518 519 3570 3574 5 Tisa Ublianka (Slovensko) DQ996476 480 4526 4527 2 Tisa Ondava (Slovensko) DQ996481 482 4889 4893 5 Tisa Ol’šava/Topl’a (Slovensko) DQ996483 487 4910 4914 5 Tisa Ol’šava/Topl’a (Slovensko) DQ996488 492 5604 5616 13 Dunaj Ipel’ (Slovensko) DQ996493 505 5621 5624 4 Dunaj Ipel’ (Slovensko) DQ996506 509 5655 5661 7 Dunaj Ipel’ (Slovensko) DQ996510 516 5662 1 Dunaj Ipel’ (Slovensko) EF447286 5667 1 Dunaj Vlára (ČR) DQ996520 5669 5679 11 Dunaj Vlára (ČR) DQ996521 531 6162 6163 2 Dunaj Bečva (ČR) DQ996534 535 6166 1 Dunaj Bečva (ČR) DQ996536 6600 6601 2 Dunaj Vlára – Sidonie (ČR) EF447287 88 6602 6603 2 Dunaj Vlára – Sidonie (ČR) DQ996532 533 6964 6965 2 Dunaj Malý Dunaj (ČR) EF447289 90 6967 6968 2 Dunaj Malý Dunaj (ČR) EF447291 92 6972 1 Dunaj Malý Dunaj (ČR) EF447293 Tabulka 3: Přehled analyzovaných vzorků mt specifického markeru (UK Zakarpatská Ukrajina). Číslo vzorku Počet jedinců Hlavní povodí Vodní tok (populace) 5022 5023 2 Dunaj Vlára (ČR) 5039 5040 2 Dunaj Vlára (ČR) 6165 6168 4 Dunaj Bečva (ČR) 6171 6172 2 Tisa Tisa (UK) 6176 1 Tisa Tisa (UK) 6178 1 Tisa Tisa (UK) Kompletní genomovou DNA jsem izolovala fenol chloroform izoamylalkoholovou metodou (Sambrook et al ., 1989) s modifikacemi následovně: 1. Vzorek ploutve osušit a vložit do 1,5 ml eppendorfovy zkumavky (dále jen zkumavky); 2. Přidat 500 l STE pufru; 3. Přidat 30 l 10 % SDS; 4. Přidat 20 l proteinásy K (10 mg/ml 50 % glycerolu ve vodě);
23
5. Inkubovat v termobloku při 50 °C přes noc; 6. V digestoři přidat 500 l směsi fenol:chloroform:izoamylalkohol (PCIA) 25:24:1; 7. Točit 10 min na kolotoči; 8. Centrifugace 10 min při 4 °C a 14 000 otáčkách (14 000/10´/4 °C) ; 9. Přenést horní vodnou fázi do nové zkumavky; 10. V digestoři přidat 500 l PCIA; 11. Točit 10 min na kolotoči. 12. Centrifugace 14 000/10´/4 °C; 13. Přenést horní fázi do nové zkumavky; 14. V digestoři přidat 500 l směsi chloroform:izoamylalkohol 24:1; 15. Točit 10 min na kolotoči; 16. Centrifugace 14 000/10´/4 °C; 17. Přenést horní fázi do nové zkumavky; 18. Přidat 2 3 díly 96 % etanolu; 19. Jemně protřepat, a po vysrážení DNA pomalým obracením nechat klubíčko DNA sbalit a klesnout na dno; 20. Centrifugace 14 000/30´/4 °C; 21. Odlít supernatant; 22. Přidat 350 l 70 % etanolu; 23. Centrifugace při 14 000/5´/4 °C; 24. Odlít supernatant a vysušit pod alobalem; 25. DNA rozpustiit v 150 200 l TE pufru. Podle absorbance při 260 nm jsem vypočítala koncentraci DNA. Markery jsem amplifikovala pomocí PCR na termocykleru TGRADIENT (Whatman Biometra). Gen pro cyt b (1140 bp) pomocí primerů GluDG.L (5´ TGACT TGAAR AACCA YCGTTG 3´) a H16460 (5´ CGAYC TTCGG ATTAA CAAGA CCG 3´) (Perdices and Doadrio, 2001), specifický mt marker tRNA Glu + cyt b (449 bp) pomocí primerů L14735 (5’ AAAAA CCACC GTTGT TATTC AACTA 3’) a H15149 (5´ GCCCC TCAGA ATGAT ATTTG TCCTC A 3´) (Ludwig et al ., 2000; Prado et al ., 2005). Analýzu vzorků z Bečvy jsem v případě genu cyt b musela rozdělit na dvě části a amplifikovat každou část samostatně. První polovinu pomocí primerů L15267 (5‘ AAT GAC TTG AAG AAC CAC CGT 3‘) a H15891 (5‘ GTT TGA TCC CGT TTC GTG TA 3‘) (Briolay et al ., 1998) a druhou polovinu pomocí primerů L15840 (5‘ GAT TCT TCG CAT
24
TCC ACT T 3‘) (Briolay et al ., 1998) a H15918R (5‘ CTC CAT CTC CGG TTT ACA AGA C 3‘) (Song et al ., 1998). Dodatečně jsem provedla u vybraných vzorků amplifikaci části genu 12S rRNA pomocí primerů L1091 (5' AAAAAGCTTCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT 3') a H1478 (5' TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT 3') (Kocher et al. , 1989).
Složení PCR směsi: dd H 2O podle množství DNA
pufr (NH 4)2SO 4 (10x) 5 l (1x)
MgCl 2 (25 mM) 3 l (1,5 mM) dNTP (10 mM) 1 l (0,2 mM) primery (100 mM) každý 1 l (2 mM) DNA podle koncentrace Taq DNA polymeráza (Fermentas) 0,4 l celkový objem 50 l
Složení směsi bylo u všech markerů stejné, kromě koncentrace MgCl2 u mt specifického markeru, jež byla 2 mM (4 l). Podmínky PCR byly následující: • cyt b (Perdices and Doadrio, 2001) predenaturace 94 °C/120 s 5 cyklů 94 °C/45 s 53 °C/45 s 72 °C/90 s 29 cyklů 94 °C/45 s 58 °C/45 s 72 °C/90 s • Bečva cyt b predenaturace 94 °C/180 s 35 cyklů 90 °C/60 s 46 °C resp. 38 °C/60 s 72 °C/120 s závěrečná ext. 72 °C/420 s • tRNA Glu + cyt b (Ludwig et al ., 2000) 30 cyklů 94 °C/10 s
25
55 °C/10 s 72 °C/120s U vzorků z Tisy proběhla amplifikace za annealingové teploty 52 °C, u vzorků z Bečvy jsem použila k amplifikaci 31 cyklů. • 12S rRNA (Ludwig and Kirschbaum, 1998) 30 cyklů 94 °C/10 s 55 °C/10 s 72 °C/20 s Po kontrole produktů na elektroforéze jsem PCR produkty přečistila pomocí precipitace PEG/Mg/NaAc následujícím postupem: 1. Do zkumavky se 40 l amplifikátu napipetovat 40 l PEG/Mg/NaAc (1:1); 2. Zamíchat na vortexu a nechat 10 15 min stát při laboratorní teplotě; 3. Centrifugace 14 000/20´/4 °C; 4. Odsát supernatant a k peletu přidat 200 l 96 % etanolu a chvíli nechat stát; 5. Centrifugace při 14 000/5´/4 °C; 6. Odsát supernatant a promýt 200 l 70 % etanolu; 7. Centrifugace 14 000/5´/4 °C; 8. Odsát supernatant a vysušit pelety pod alobalem; 9. DNA rozpustit ve 25 l PCR vody. Pro zjištění koncentrace přečištěných produktů jsem odebrala 2 l vzorku (spektrofotometr Helios Gamma). Podle naměřené koncentrace jsem připravila sekvenační PCR. Složení sekvenační PCR: ddH2O podle množství DNA (0 4 l) pufr (5x) 2 l (1x) sekvenační kit 2 l primer (5 mM) 1 l (0,5 mM) DNA dle koncentrace (1 5 l) celkem 10 l Sekvenační kit (ABI PRIM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) obsahuje AmpliTaq DNA polymerázu FS, dNTPs, fluorescenčně značené ddNTP (Dye Labeled Terminators) a pufr.
26
Podmínky sekvenační PCR byly stejné pro všechny markery: 34 cyklů 96 °C/36 s 50 °C/20 s 60 °C/240 s Produkty jsem přečistila od nezreagovaných komponent metodou EtOH/EDTA precipitace. Postup přečištění (pro 10 l směsi): 1. Po sekvenační PCR produkty přenést do zkumavek pro sekvenování; 2. Přidat 2,5 l 125 mM EDTA (5 l zásobní EDTA:15 l PCR vody); 3. Přidat 25 l 96 % etanolu; 4. Uzavřít, několikrát převrátit a nechat stát při laboratorní teplotě 15 min; 5. Centrifugace 3000/30´/4 °C (zde je nutné ihned pokračovat dále); 6. Odsát supernatant a přidat 30 l 70 % etanolu; 7. Centrifugace 1650/15´/4 °C; 8. Odsát supernatant a vysušit v termobloku pod alobalem při 60 °C; 9. Pelet rozpustit ve 20 l formamidu. Po rozpuštění DNA jsem provedla denaturaci při 95 °C/120 s a ihned zchladila na ledu, aby nedošlo k renaturaci fragmentů DNA. Takto připravené vzorky jsem uzavřela septem, aby nedocházelo k vypařování a vložila do automatického dávkovače (autosampler) sekvenátoru ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Výsledné sekvence jsem zpracovala v programu MEGA 3.1 (Kumar et al ., 2004). Sekvence cyt b jsem vložila do databáze GenBank pod přístupovými čísly (accession numbers) DQ996468 DQ996536, EF447286 EF447293 (Tab. 2). Pro ověření správnosti jsem v programu MEGA 3.1 nukleotidové sekvence přeložila do proteinu cyt B 380 aminokyselin (AMK) dlouhého a mt specifický marker do proteinu 149 AMK dlouhého. Nenalezla jsem žádné stop kodony. Ve stejném programu jsem provedla statistické vyhodnocení genu cyt b (nukleotidové složení, variabilní místa, informativní místa, atd.) a proteinu cyt B (AMK složení). Fylogenetické stromy jsem konstruovala na základě algoritmů Neighbour joining (NJ) (Saitou and Nei, 1987) a Maximum parsimony (MP), jako outgroup jsem použila sekvenci Misgurnus fossilis (Piskoř pruhovaný) (GenBank přístupové číslo AF263097; Perdices and Doadrio, 2001). K výběru vhodného modelu evoluce jsem použila internetovou stránku programu FindModel (http://hcv.lanl.gov/content/hcv db/findmodel/findmodel.html). Jako nejvhodnější byl vybrán TN 93 s gamma korekcí 1,5 (Tamura and Nei, 1993), který počítal i
27 vzdálenosti mezi populacemi a skupinami. Konstruované stromy zahrnují všechny pozice v kodonu (1.+2.+3.+nekódující) včetně tranzicí i transverzí. U bootstrap analýzy jsem považovala za statisticky významnou hodnotu (cut off level) nad 60 %. Tam, kde byla pro názornost použita hodnota nižší, to bude uvedeno. Počet opakování (replikací) byl u MP 200 a u NJ 10 000. Pro analýzu příslušnosti jedinců k DB komplexu jsem dále použila 30 sekvencí, pomocí kterých byl tento komplex definován (GenBank přístupová čísla AY059332, 336, 338 342, 356, 358, 361 363, 365, 368; AF263094; AF499173, 176 177, 179, 182, 184, 188, 189, 191, 193, 195 198, 200; Perdices et al ., 2003).
28
4. VÝSLEDKY
4.1. Molekulární charakterizace genu (proteinu) cytochrom b (B) u Sabanejewia balcanica .
Z celkového počtu 77 analyzovaných sekvencí byl prokázán výskyt 57 různých haplotypů, z čehož 47 hyplotypů bylo zjištěno vždy pouze u 1 jedince, dalších 10 haplotypů mělo různou frekvenci výskytu, jak je patrné z Tab. 4. Nukleotidové složení (Tab. 5) je typické pro tento gen, stejně jako tzv. anti G bias (16,4 % G – nejmenší procento G) (Perdices et al ., 2003). Vypočtená procenta variabilních a informativních míst ukázala, že variabilita je dána substitucemi především na třetí pozici v kodonu, následuje pozice první a nejméně variabilní pozice druhá (Tab. 5). Z výpočtů jsem vyřadila populaci z Bečvy, jež vykazovala mnohem vyšší variabilitu v první polovině genu ve srovnání s ostatními populacemi. Tuto problematiku jsem dále analyzovala. Tabulka 4: Přehled a frekvence výskytu 10 haplotypů u 30 jedinců (čísla vzorků jež zde nejsou uvedeny mají jedinečné haplotypy). 2727, 2730, 2734 , 2735 2952, 5674 4890, 4912 4893, 4910, 2736 4914 5611, 5614, 5612, 5613 5657,6601 5659, 5670, 6967, 6968 5621, 5622, 5671, 5673, 5656, 5661 5676, 5677 Tabulka 5: Molekulární charakteristika mt genu cyt b u Sabanejewia balcanica (není zahrnuta populace z Bečvy). Hodnoty jsou udány v procentech s absolutními čísly v závorce, vypočítány modelem Tamura Nei TN 93. Nukleotidové Variabilní místa Informativní místa složení % T (U) 30,2 První pozice 0,7 (8) 0,3 (3) % C 27,3 Druhá pozice 0,7 (8) 0,0 (0) % A 26,1 Třetí pozice 3,6 (41) 2,8 (32) % G 16,4 Celkem 5,0 (57) 3,1 (35) Na Obr. 8 lze vidět variabilní místa individuelně pro každou analyzovanou sekvenci (celkový počet variabilních míst je shrnut v Tab. 5). Lze vidět charakteristické substituce („vzorce“)
29 pro jednotlivé populace, např. u Vláry na pozici 106 C, 138 T, 348 A, 360 A. 361 G, 492 C atd., což je typické i pro některé jedince z Ipel’u. Oproti tomu jiným jedincům z Ipel’u tyto substituce chybí. U populace z Ol‘šavy/Topl‘e je pak typické 138 T, 198 G nebo 591A atd. Také je z obrázku patrná „variabilita“ Bečvy v první části sekvence, kterou se budu, jak jsem již naznačila, zabývat v poslední podkapitole této části. Gen cyt b byl pomocí programu MEGA 3.1. přeložen do proteinu o délce 380 AMK. Vypočítala jsem AMK složení a stejně jako u genu cyt b i procento variabilních a informativních míst (Tab. 6). Tabulka 6: Molekulární charakteristika proteinu cyt B u Sabanejewia balcanica . Zastoupení variabilních a informativních míst je uvedeno v procentech s absolutními čísly v závorce. Ala 8,6 Cys 0,8 Asp 2,9 Glu 1,6 Phe 7,6 Gly 6,6 His 3,2 Ile 7,9 Aminokyselinové Lys 2,4 Leu 15,8 Met 2,1 Asn 4,7 Pro 5,5 Gln 1,6 Arg 2,1 Ser 6,3 složení Thr 5,8 Val 7,4 Trp 3,4 Tyr 3,7 Variabilní místa 3,4 (13) Informativní místa 0,5 (2)
30
Obrázek 8: Variabilní místa v sekvenci cyt b analyzovaných vzorků včetně populace z Bečvy. Tečky znázorňují shodné nukleotidy s první sekvencí. Čísla v horní části vyjadřují pozici nukleotidu v sekvenci.
31
32
33
4.2. Genetická diverzita a blízkost populací Sabanejewia balcanica
Pomocí fylogenetické analýzy cyt b (NJ, MP) jsem identifikovala pět základních skupin v ČR a na Slovensku (označení 1 5) (Obr. 9), jež měly podporu bootstrap nad 60 %. Do skupiny číslo 1 se zařadila většina jedinců (18 z 25) z řeky Ipel’, po jednom vzorku z Vláry a M. Dunaje (vše povodí Dunaje) a všichni jedinci (8) z Ol‘šavy v povodí Hornádu (povodí Tisy). Do skupiny 2, která obsahuje „přechodné“ haplotypy, se zařadili zástupci z Ublianky (2 z 5), Ol‘šavy/Topl‘e (2 z 10) (obě řeky z povodí Tisy) a Malého Dunaje (2 z 5) (povodí Dunaje). Ve 3. skupině se nacházejí téměř výhradně jedinci z povodí Dunaje – většina jedinců z Vláry (19 z 20), z Ipel’u (7 z 25) a 2 z 5 z Malého Dunaje, doplněni jedním vzorkem z Ondavy (povodí Tisy). Zbylí jedinci z Ublianky (3 z 5) tvoří samostatnou skupinu číslo 4 (povodí Tisy). Do poslední 5. skupiny se zařadilo 8 z 10 vzorků z Ol‘šavy/Topl‘e a jeden vzorek z Ondavy (povodí Tisy). Genetické vzdálenosti mezi populacemi se pohybovaly v rozmezí 0,6 % (Ipel versus Ol´šava/Hornád) až 1,5 % (Vlára versus Ol´šava/Topl´a), blíže Tab. 7. Shodné hodnoty genetické vzdálenosti (0,6 1,6 %) jsem zjistila mezi definovanými skupinami (Tab. 8). V rámci zkoumaných populací se genetická vzdálenost na nukleotidové úrovni pohybovala v rozmezí od 0,2 do 1,0 %, v rámci vymezených skupin od 0,2 do 0,5 % (Tab. 9). Genetické vzdálenosti na aminokyselinové úrovni mezi zkoumanými populacemi byly 0,1 až 0,2 % (Tab. 10). Tabulka 7: Genetické vzdálenosti mezi populacemi na nukleotidové úrovni vypočítané pomocí Tamura Nei TN93. 1 2 3 4 5 6 7 [1] Ol’šava/Hornád [2] Ublianka 0,007 [3] Ondava 0,010 0,008 [4] Ol’šava/Topl’a 0,012 0,009 0,007 [5] Ipel’ 0,006 0,008 0,012 0,013 [6] Vlára 0,014 0,011 0,012 0,015 0,011 [7] Malý Dunaj 0,010 0,009 0,012 0,014 0,009 0,010
34
Obrázek 9 : Fylogenetické vztahy populací S. 5607 Ipel 2949 Vlara balcanica na území ČR a Slovenska na 5622 Ipel 5611 Ipel základě kompletního mt genu pro cyt b (1140 5621 Ipel 5656 Ipel 5614 Ipel bp). Horní boostrap hodnoty reprezentují NJ 5661 Ipel 5604 Ipel a dolní MP analýzu. 5610 Ipel 6965 M. Dunaj 5612 Ipel 5613 Ipel 64 5657 Ipel skupina 1 63 5658 Ipel 2734 Olsava/Hornad 2735 Olsava/Hornad 5616 Ipel 5662 Ipel 2736 Olsava/Hornad 2730 Olsava/Hornad 2727 Olsava/Hornad 2729 Olsava/Hornad 2732 Olsava/Hornad 5623 Ipel 2728 Olsava/Hornad 5655 Ipel 5660 Ipel 3570 Ublianka 4913 Olsava/Topla 3574 Ublianka skupina 2 4891 Olsava/Topla
74 6964 M. Dunaj 89 6972 M. Dunaj 4527 Ondava 5624 Ipel
82 5606 Ipel 60 5615 Ipel 5669 Vlara 5667 Vlara 5609 Ipel 63 5608 Ipel 60 6967 M. Dunaj 6968 M. Dunaj 5605 Ipel 5679 Vlara 2952 Vlara 5674 Vlara 93 skupina 3 6602 Vlara 95 65 6600 Vlara 60 6603 Vlara 6601 Vlara 2951 Vlara 5675 Vlara 5672 Vlara 5676 Vlara 5670 Vlara 5671 Vlara 5673 Vlara 5677 Vlara 5659 Ipel 5678 Vlara 3573 Ublianka 3571 Ublianka skupina 4 3572 Ublianka 4526 Ondava 66 4890 Olsava/Topla 95 60 4912 Olsava/Topla 95 4911 Olsava/Topla 4893 Olsava/Topla 65 skupina 5 64 4910 Olsava/Topla 4914 Olsava/Topla 4889 Olsava/Topla 4892 Olsava/Topla Misgurnus fossilis AF263097 35
Tabulka 8: Genetické vzdálenosti mezi identifikovanými skupinami 1 5 na nukleotidové úrovni vypočítané pomocí Tamura Nei TN93. 1 2 3 4 5 Skupina 1 Skupina 2 0,006 Skupina 3 0,008 0,008 Skupina 4 0,014 0,013 0,009 Skupina 5 0,014 0,012 0,011 0,016 Tabulka 9: Genetické vzdálenosti uvnitř populací a uvnitř skupin na nukleotidové úrovni, vypočítané pomocí Tamura Nei TN93. uvnitř populací uvnitř skupin Ol‘šava/Hornád 0,002 Skupina 1 0,002 Ublianka 0,005 Skupina 2 0,005 Ondava 0,010 Skupina 3 0,003 Ol’šava/Topl’a 0,005 Skupina 4 0,002 Ipel’ 0,007 Skupina 5 0,002 Vlára 0,003 M. Dunaj 0,009 Tabulka 10: Genetické vzdálenosti mezi populacemi na aminokyselinové úrovni, vypočítané pomocí Tamura Nei TN93. 1 2 3 4 5 6 7 [1] Ol’šava/Hornád [2] Ublianka 0,001 [3] Ondava 0,002 0,002 [4] Ol’šava/Topl’a 0,001 0,002 0,002 [5] Ipel’ 0,001 0,002 0,002 0,002 [6] Vlára 0,001 0,002 0,002 0,001 0,002 [7] Malý Dunaj 0,001 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 Provedla jsem také analýzu mt specifického markeru na 23 vybraných vzorcích z jednotlivých populací, u nichž byla provedena analýza cyt b (viz. kap. Materiál a metodika) a 12ti dalších vzorků (Tab. 3). Variabilita mt specifického markeru je nízká na nukleotidové úrovni (Tab. 11) i na úrovni proteinu (0,4 % variabilních míst a 0 % informativních míst). Proto se mi nepodařilo zařadit čtyři vzorky z Tisy přesněji, než do skupiny 2 nebo 4. Protože u těchto vzorků nebyla amplifikace kompletního genu pro cyt b úspěšná, může jít o přechodné haplotypy nebo o populaci z Ublianky, která je této populaci z Tisy geograficky nejblíže. Mt specifický marker potvrdil rozdělení hodnocených vzorků do skupin 1, 3 a 5, skupiny 2 a 4 však nerozlišil (Obr. 10). 36
Tabulka 11: Molekulární charakteristika mt specifického markeru u Sabanejewia balcanica. Hodnoty jsou udány v procentech s absolutními čísly v závorce, vypočítány modelem Tamura Nei TN 93. Nukleotidové Variabilní místa Informativní místa složení % T (U) 31,7 První pozice 0,2 (1) 0,2 (1) % C 24,9 Druhá pozice 0,4 (2) 0,0 (0) % A 27.8 Třetí pozice 1,8 (8) 1,8 (8) % G 15,7 Celkem 2,4 (11) 2,0 (9) Obrázek 10: Rozdělení skupin na 5668 Vlara 5624 Ipel základě mt specifického markeru 5677 Vlara (NJ nahoře/MP dole). Vzorky 5671 Vlara 5615 Ipel z Tisy jsou vyznačeny černě a 88 5023 Vlara skupina 3 zakroužkovány. 88 5022 Vlara 5040 Vlara 5609 Ipel 68 72 5670 Vlara 5039 Vlara 5608 Ipel 4527 Ondava 4891 Olsava/Topla 3571 Ublianka 3573 Ublianka 3574 Ublianka skupina 2+4 3570 Ublianka 6171 Tisa 6178 Tisa 66 6172 Tisa 64 6176 Tisa 2734 Olsava/Hornad 2736 Olsava/Hornad 87 5660 Ipel 89 skupina 1 5655 Ipel 5657 Ipel 4913 Olsava/Topla 4526 Ondava 86 skupina 5 88 78 4889 Olsava/Topla 76 4893 Olsava/Topla
37
4.3. Příslušnost zkoumaných populací Sabanejewia balcanica k subliniím dunajsko balkánského komplexu.
Pro možnost zařazení skupin (1 5) zkoumaných jedinců do sublinií DB komplexu jsem vybrala z každé skupiny pouze několik zástupců, aby byl fylogenetický strom přehledný. Výběr jsem uskutečnila v závislosti na počtu jedinců ve skupině s cílem, aby každá populace ze skupiny v něm byla zastoupena. Sekvence vybraných zástupců (ve stromu odlišeni barevně) (Skup. 1: 2727, 2734, 5611, 5612, 5657, 6965; Skup. 2: 3570, 3574, 4891, 4913, 6964; Skup. 3: 4527, 5606, 5609, 5670, 5674, 5675, 6967; Skup. 4: 3571, 3572, 3573; Skup. 5: 4526, 4890, 4892, 4911) jsem pak porovnala se sekvencemi, pomocí kterých byly definovány sublinie DB komplexu pro rod Sabanejewia (viz. kap. Materiál a metodika). Podle fylogenetické analýzy, definované skupiny jedinců 1 4 u studovaného materiálu sekavčíka horského náleží k sublinii III DB komplexu ( S. bulgarica/S. balcanica/S. montana ) ze střední části povodí Dunaje a skupina číslo 5 se jako jediná řadí do sublinie IV DB komplexu ( S. balcanica/S. radnensis) z povodí řeky Mures (Obr. 11).
38
S.montana 1c AF499198 Obrázek 11: Zařazení 2727 Olsava/Hornad 2734 Olsava/Hornsd skupin 1 5 do DB 78 6965 M. Dunaj 75 komplexu, definovaného 61 5612 Ipel skupina 1 79 5657 Ipel pro rod Sabanejewia 5611 Ipel v Evropě (Perdices et al ., 67 3570 Ublianka 60 6964 M. Dunaj skupina 2 2003). Horní boostrap 4891 Olsava/Topla S.montana 198 AF499173 III hodnoty reprezentují NJ a 3574 Ublianka dolní MP analýzu. 4913 Olsava/Topls 3573 Ublianka 77 3571 Ublianka skupina 4 73 66 82 60 3572 Ublianka 87 S.bulgarica AF499188 94 S.montana 3c AF499200 77 4527 Ondava S.balcanica AF263094
66 5606 Ipel 74 60 5609 Ipel skupina 3 70 6967 M. Dunaj
97 S.balcanica 1a AF499191 98 5674 Vlara 5670 Vlara
84 5675 Vlara 85 99 S.doiranica AY059356 99 S.balcanica MNCN 513G AY059342 II
99 S.balcanica 1b AF499193 VI 99 S.balcanica 3b AF499195 dunajsko-balkánský komplex
82 S.radnensis AY059361 77 S.radnensis AY059358 100 69 4526 Ondava 99 IV 73 4890 Olsava/Topla 4892 Olsava/Topla skupina 5 4911 Olsava/Topla
100 S.thrakica AY059363 V 100 S.thrakica AY059362 S.vallachica AY059365 99 99 I 99 99 S.vallachica AY059368 100 S.a.kubanica 1 AF499182
100 S.a.kubanica 3 AF499184 S.aurata 1- AF499179 99 S.aurata 245 AF499189 99 96 99 S.caucasica AY059338 99 65 100 S.caucasica AY059339 60 95 S.baltica 264 AF499176 100 97 S.baltica 265 AF499177 100 85 S.baltica AY059340 94 S.baltica AY059341 100 S.romanica G74 AF499196 100 S.romanica G23 AF499197 100 S.larvata AY059332 100 S.larvata AY059336 Misgurnus fossilis AF263097
39
4.4. Genetická identifikace vymizelé populace z řeky Bečvy a vyhledání nejbližší vhodné populace pro repatriaci Sabanejewia balcanica .
Gen pro cyt b se podařilo kompletně amplifikovat a osekvencovat jen u tří vzorků z původní populace sekavčíka z Bečvy (vzorky odebrány ze sbírkových jedinců sebraných v roce 1952). První část genu (1 552 bp) se jevila extrémně variabilní ve srovnání s ostatními populacemi, druhá (553 1140 bp) vykazovala „obvyklou“ variabilitu (Tab. 12). Tabulka 12: Porovnání populace z Bečvy a ostatních populací na základě první (1 552 bp) a druhé (553 1140 bp) části genu cyt b. Čísla vyjadřují poměr průměrných hodnot všech populací k hodnotám z Bečvy. Hodnoty jsou udány v %. Bečva 1 552 bp Bečva 553 1140 bp Genetická vzdálenost 27,9 1,7 Variab./inf. místa – nukleotidy 26,8/20,6 5,4/2,7 Variab./inf. místa – AMK 7,6/6,5 4,6/0,5 Protože extrémní variabilita v první části sekvence byla zarážející a pro vysvětlení příčin byla nutná další analýza, zařazení vzorků z Bečvy jsem proto provedla pouze na základě druhé části 533 1140 bp. Populace se zařadila do skupiny 1 (Obr. 12), kde je i většina vzorků z populace Ipel’. Možnost, zda se v případě první poloviny jedná o amplifikovaný jaderný pseudogen jsem ověřovala pomocí specifické kombinace primerů pro mt DNA. Nepodařilo se mi však analyzovat stejné vzorky jako u cyt b, kromě vzorku č. 6166. Zde se potvrdilo, že sekvence exonu 1 cyt b na základě mt specifických primerů byla odlišná od sekvence, kterou jsem amplifikovala pomocí primerů pro cyt b (Obr. 13). Další tři analyzované vzorky 6165, 6167 a 6168 se mi podařilo namnožit pouze u mt specifického markeru, nikoliv u cyt b, ale jejich sekvence byly shodné se vzorkem 6166. Všechny čtyři vzorky jsem podrobila fylogenetické analýze, abych zjistila jejich zařazení do skupin. Dva vzorky se zařadily do skupiny 1, kam spadají vzorky z populací Ipel´, Ol´šava/Hornád, M. Dunaj stejně jako u cyt b, dva do skupiny 3, kde jsou vzorky z populací Vlára, Ipel´případně M. Dunaj (Obr. 14).
40
Obrázek 12: Zařazení populace 3570 Ublianka 5611 Ipel z Bečvy do skupin 1 5 na základě 6162 Becva části sekvence 533 1140 bp genu 6163 Becva cyt b. Horní bootstrap hodnoty 6965 M. Dunaj skupina 1 6166 Becva 50 reprezentují NJ a dolní MP 2727 Olsava/Hornad 46 analýzu. Cut off level hodnota 50. 2734 Olsava/Hornad 50 5612 Ipel 50 5657 Ipel
61 3574 Ublianka 51 6964 M. Dunaj 56 4913 Olsava/Topla 49 5674 Vlara 70 5606 Ipel 65 5675 Vlara 87 6967 M. Dunaj 62 87 5609 Ipel 63 5670 Vlara 4527 Ondava 3573 Ublianka 3571 Ublianka 3572 Ublianka 4890 Olsava/Topla 58 77 51 4526 Ondava 50 4914 Olsava/Topla Misgurnus fossilis AF263097 Obrázek 13: Porovnání sekvencí (430 bp) vzorků z Bečvy amplifikovaných pomocí mt specifických primerů (6165, 6166, 6167, 6168) se vzorkem 6166 (2), jenž byl amplifikován pomocí primerů pro cyt b. Tečky vyjadřují shodné nukleotidy s první sekvencí.
41
Obrázek 14: Zařazení populace 5023 Vlara 5609 Ipel z Bečvy do skupin 1 5 na základě 5615 Ipel 5671 Vlara mt specifického markeru. Horní 5677 Vlara boostrap hodnoty reprezentují NJ 5040 Vlara 88 5624 Ipel 89 a dolní MP analýzu. 5668 Vlara skupina 3 5608 Ipel 6165 Becva 65 5022 Vlara 66 5039 Vlara 5670 Vlara 6166 Becva 4527 Ondava 3573 Ublianka 4891 Olsava/Topla 3571 Ublianka 6171 Tisa 6178 Tisa 3574 Ublianka 4913 Olsava/Topla 66 6172 Tisa 67 6176 Tisa 6168 Becva 6167 Becva 65 2734 Olsava/Hornad 67 5655 Ipel skupina 1 65 2736 Olsava/Hornad 67 5657 Ipel 5660 Ipel 3570 Ublianka 4526 Ondava 86 4889 Olsava/Topla 89 78 73 4893 Olsava/Topla
42
5. DISKUZE
Pro zhodnocení vztahů mezi populacemi S. balcanica v České republice a na Slovensku pomocí mt genu pro cytochrom b jsem úspěšně analyzovala 77 vzorků ze sedmi populací, v případě mt specifického markeru 35 vzorků z devíti populací. Fylogenetické analýzy ukázaly značnou heterogenitu mezi populacemi. Rozdělily jedince do pěti skupin, které se nekryjí s geografickou lokalizací populací (skupina ≠ populace), i když lze vysledovat určité pravidlo v geografickém rozložení skupin. Populace z povodí Dunaje (Bečva 1, Vlára 2, Malý Dunaj 3, Ipel’ 4) a populace Ol’šava/Hornád (5) z povodí Slané (Tisy), se řadí do skupin 1 nebo 3, které geograficky spadají do levé části mapky (Obr. 15). Do pravé části spadají ostatní populace z povodí Tisy, řadící se do skupin 4 a 5 (Ol’šava/Topl’a 6, Ondava 7, Ublianka 8, případně Tisa 9). Vzorky ze skupiny dvě s přechodnými haplotypy (Malý Dunaj 3, Ol’šava/Topl’a 6, Ublianka 8, případně Tisa 9) se vyskytují v levé i v pravé části mapky. Obrázek 15: Mapka lokalit populací se zaznačením geografického rozložení skupin.
V každé skupině jsou zástupci alespoň dvou populací (s výjimkou skupiny 4, která obsahuje pouze jedince z Ublianky) a každá populace je zastoupena alespoň ve dvou skupinách (s výjimkou populace Ol’šava/Hornád, jež je celá zařazena do skupiny 1). Toto rozdělení je poněkud odlišné od studie Bartoňová et al . (2007), ve které ještě nebyla hodnocena a zařazena populace M. Dunaj. Skupinu 2 v ní tvoří pouze vzorek z Ondavy a ostatní jedinci, jež se zařadili v této práci do skupiny 2, se ve studii Bartoňová et al . (2007) řadí do skupiny 1. Protože se však od hlavní větve stromu skupiny 1 oddělují, a za nižší boostrap podpory (50) vytvářejí nesourodý celek větví, byly i ve studii označeny za
43
„přechodnou“ formu. Tuto teorii jsem potvrdila v předkládané práci, za nižší boostrap podpory (40) opět skupina 2 vytváří nesourodý celek vedlejších větví, jež se řadí ke skupině 1. Haplotypy se tedy chovají stejně, avšak při jiné boostrap podpoře, což je způsobeno zařazením další populace (viz. dále). Lze proto překlasifikovat „přechodné“ vzorky z práce Bartoňová et al . (2007) na samostatnou skupinu 2. Vzorek z Ondavy v práci Bartoňová et al ., (2007) vytváří samostatnou skupinu 2, ale za nižší bootstrap podpory se řadí do skupiny 3 (jako v této práci). Po vstoupení další populace do analýzy došlo k výraznějšímu rozdílu mezi přechodnými haplotypy a Ondavou, tedy k vyšší podpoře (více než 60) zařazení Ondavy do skupiny 3 a naopak k nižší podpoře zařazení přechodných haplotypů do skupiny 1 (tedy vyšší podpora tvorby samostatné skupiny 2). Na Obr. 16 lze vidět porovnání skupin z obou prací. Nejvíce heterogenní je skupina č. 2, která obsahuje „přechodné“ haplotypy s největší průměrnou genetickou vzdáleností uvnitř skupiny (0,5 %). Genetické vzdálenosti mezi populacemi i mezi skupinami se pohybují v průměru kolem 1 %, jednotlivé populace tedy nelze přesně geneticky odlišit. Toto zjištění je v souladu se studií Perdices et al . (2003), kteří definovali sublinie dunajsko balkánského komplexu pro rod Sabanejewia na vzorcích, jež pocházejí z celé Evropy. Sublinie III, do které se zařazují skupiny 1 4, je také nejvíce heterogenní, jedinci zde zařazení pocházejí z povodí střední části toku Dunaje (Rumunsko, Slovinsko, Slovensko, Rakousko). Sublinie III je označována jako S. montana/S bulgarica/S. balcanica . Skupina 5 se řadí k sublinii IV S. radnensis/S. balcanica , jež byla dříve považována za samostatný druh Cobitis aurata radnensis (Banarescu, Muller and Nalbant, 1960) z řeky Mures v Rumunsku, ale později ji Kottelat (1997) prohlásil za synonymum S. balcanica . Značnou heterogenitu rodu Sabanejewia především ve střední Evropě (povodí Dunaje, Dněstru) signalizovaly již dříve i morfometrické a morfologické studie. Iftime (2002) zkoumal všechny poddruhy Sabanejewia především z Rumunska, ale také Moldávie (povodí Dunaje a Dněstru) a Maďarska (povodí Tisy, řeky Mures), přičemž měl k dispozici i vzorky od dřívějších autorů (Banarescu, 1966; Banarescu et al ., 1972). Dospěl k závěru, že nejvíce heterogenním poddruhem ze všech je S. a. balcanica , jež měla ve všech měřených hodnotách největší variabilitu: „This (balcanica) appears to be the most variable and heterogenous of all described subspecies in the area analyzed. It has a wide range of variation in all characters examined.“
44
Obrázek 16: Srovnání skupin 1, 2 a 3 5607 Ipel 2949 Vlara ze studie Bartoňová et al. (2007) a z této 5622 Ipel 5611 Ipel práce. Skupiny Bartoňová et al . (2007) 5621 Ipel 5656 Ipel 5614 Ipel značeny barevně (skupina 1 červeně , 5661 Ipel
43 5604 Ipel skupina 2 zeleně a skupina 3 žlutě ), 5610 Ipel 6965 M. Dunaj skupiny z této práce značeny černě a 5612 Ipel skupina 1 35 5613 Ipel zakroužkovány. Z obrázku je patrno, že 64 59 5657 Ipel 5658 Ipel
31 2734 Olsava/Hornad zakroužkovaná skupina 2 je za nízké 2735 Olsava/Hornad skupina 1 5616 Ipel bootstrap podpory (44) součástí skupiny 5662 Ipel 2736 Olsava/Hornad
1, jako ve studii Bartoňová et al. (2007). 42 2730 Olsava/Hornad 35 2727 Olsava/Hornad Jako cut off level zadána hodnota 30. 2729 Olsava/Hornad 2732 Olsava/Hornad 5623 Ipel 2728 Olsava/Hornad
44 32 5655 Ipel 5660 Ipel 3570 Ublianka 4913 Olsava/Topla 3574 Ublianka 30 skupina 2 4891 Olsava/Topla
74 6964 M. Dunaj 6972 M. Dunaj 4527 Ondava skupina 2 5624 Ipel
82 5606 Ipel 33 5615 Ipel 63 5669 Vlara 35 5667 Vlara 5609 Ipel 30 5608 Ipel
52 6967 M. Dunaj 93 6968 M. Dunaj
36 5605 Ipel 5679 Vlara
38 2952 Vlara 5674 Vlara 6602 Vlara skupina 3
65 6600 Vlara 6603 Vlara skupina 3 55 6601 Vlara 2951 Vlara 5675 Vlara 5672 Vlara 5676 Vlara 5670 Vlara 5671 Vlara 5673 Vlara 5677 Vlara 5659 Ipel 5678 Vlara 3573 Ublianka 35 3571 Ublianka 3572 Ublianka 4526 Ondava
95 66 4890 Olsava/Topla 4912 Olsava/Topla 65 4911 Olsava/Topla 38 4893 Olsava/Topla 4910 Olsava/Topla 40 4914 Olsava/Topla
51 4889 Olsava/Topla 4892 Olsava/Topla Misgurnus fossilis AF263097 45
Poddruhy z povodí Dněstru také vykazovaly téměř ve všech znacích podobnost s poddruhem S. a . balcanica , přičemž u dalších byla podobnost v některých znacích (u S. a. vallachica délka těla, suborbitral spin). Iftime (2002) se proto v důsledku nejednoznačného morfologického odlišení jednotlivých poddruhů domnívá, že v povodí Dunaje se vyskytuje pouze jeden poddruh, který současně posuzuje i jako druh, a to S. balcanica. „…there are no clear cut morphological and morphometrical differences between the Sabanejewia populations in Romania and nearby countries (Danube and Dnjestr basins) that would support the creation of distinct species…“ „….we would suggest that all populations in the Romanian, Moldavian and Hungarian basins of the Danube and Dnjestr be regarded as belonging to a single monotypical species Sabanejewia balcanica (Karaman 1922) with no need for subspecific distinctions…“ Se závěrem této studie se shoduje i mé zjištění o populacích S. balcanica na území ČR a Slovenska. Jak na základě morfologických údajů, i na úrovni genetické vykazují populace značnou heterogenitu a nelze je jednoznačně odlišit. Tento fakt je kromě heterogenních skupin podpořen i zjištěnou nízkou variabilitou genu cyt b. Tato variabilita je dána především substitucemi na třetí pozici v kodonu (3,6 %), což je patrno při porovnání variability na úrovni nukleotidové (5 %) a aminokyselinové (3,4 %), která se snížila zhruba o 2 % (nejvyšší mutabilita třetí pozice je způsobena tím, že je „nejméně důležitá“ v kodonu, oproti druhé pozici, která je naopak u AMK nejdůležitější a tedy nejméně mutující). Heterogenita na genetické úrovni je dále podpořena již zmíněnými nízkými vzdálenostmi mezi skupinami, či populacemi (kolem 1 %) a také nízkou variabilitou mt specifického markeru (2,4 % na nukleotidové úrovni a 2 % na AMK úrovni). Analýzu mt specifického markeru (449 bp) jsem provedla za účelem zjištění, zda jsem neamplifikovala pseudogen cyt b u jedinců z Bečvy. Současně to bylo i ověření správnosti sekvencí a potvrzení rozdělení do skupin. Analýza dokázala rozlišit skupiny 1, 3 a 5, skupiny 2 a 4 zařadila do jednoho celku (2+4), což znamená, že rozdíly v sekvenci druhé a čtvrté skupiny jsou především ve druhé polovině genu cyt b. Potvrzuje to i skutečnost, že v první části sekvence jsou nejvíce konzervativní struktury (helixy A, B, C) (Esposti et al., 1993), tedy není zde dostatečná variabilita. Kontrolní oblast mt DNA (D loop), přestože je asi o polovinu kratší než cyt b, by pravděpodobně dokázala rozlišit i skupiny 2 a 4. Je to úsek s asi 10x vyšším počtem mutací oproti ostatní mt DNA, u sekavčíka nebyl dosud amplifikován a mé pokusy byly neúspěšné.
46
U vzorků z Tisy byly amplifikace i sekvenování úspěšné pouze u mt specifického markeru čtyř jedinců (zařazeni do skupiny 2+4), celý cyt b se amplifikovat nepodařilo. Důvod obtíží analýzy hledám ve vyschnutí ploutví během skladování vzorků (sběr z roku 2001) , převozu po odchytu nebo jiným způsobem poškozené DNA (fragmentace). Mutace v sekvencích pro primery považuji za nepravděpodobné, protože čtyři sekvence exonu 1 cyt b, jež se s obtížemi podařilo vyhodnotit, oproti ostatním populacím nevykazují variabilitu. Navíc při PCR reakci byly viditelné slabé proužky i u jiných vzorků, takže u části molekul k nasednutí došlo. Pro zjištění, zda je problém pouze u tohoto markeru, případně cyt b (protože se překrývají) nebo v celé DNA, jsem provedla amplifikaci 12S rRNA, se stejným výsledkem. U některých vzorků analýza neproběhla, u některých se vytvořily velmi slabé proužky, nevhodné pro další analýzu. Vzorky z ostatních populací se amplifikovaly bez problémů. Šlo tedy pravděpodobně o poškození mt DNA nikoliv o problém jednoho markeru. Mutace v primerovém místě u všech jedinců (13) by byla vysvětlitelná pouze v případě společného předka v mateřské linii v minulosti, u kterého by tato mutace vznikla a dále se přenášela na celé jeho potomstvo. Strom na základě AMK sekvencí jsem nezařadila do výsledků, protože u takto vzájemně blízkých populací nedošlo k substitucím, jež by populace či skupiny rozlišily. Skupiny a populace nejsou ve stromu rozlišeny a vytváří jeden celek, kromě outgroup. To potvrzuje fakt, že se na úrovni proteinu jedná o fylogeneticky konzervovaný gen (Esposti et al ., 1993), což je patrno i z genetických vzdáleností mezi populacemi na úrovni AMK, jež jsou mezi všemi populacemi 0,2 %. Právě tyto tendence ke spíše pomalým změnám během evoluce však z tohoto markeru vytvářejí dobrý nástroj pro studium fylogenetických vztahů. Jedním z cílů práce bylo popsat vztahy mezi populacemi na československém území a zpřesnit druhovou klasifikaci Sabanejewia balcanica . Důvodem byly dohady, zda se na východě Slovenska nevyskytuje další druh S. baltica , jenž byl popsán v oderském povodí v Polsku (Witkowski, 1994) a mohl by se tedy vyskytovat i v Bečvě. Druhým důležitým cílem bylo definitivně potvrdit nebo vyvrátit, zda se na území ČR vyskytuje S. aurata , která je paradoxně jako jediný druh rodu Sabanejewia chráněna českou i evropskou legislativou. Ze zjištěných údajů jsem učinila závěr, že v České republice a na Slovensku se vyskytuje jediný druh a to Sabanejewia balcanica (Karaman, 1922). Proto by v legislativních normách pro území ČR i SR mělo být vědecké označení Sabanejewia aurata nahrazeno názvem Sabanejewia balcanica. Obdobně by měla být upravena i evropská legislativa Pro dosažení posledního cíle, identifikace vymizelé populace z řeky Bečvy a nalezení populace geneticky nejbližší, jsem měla k dispozici muzejní vzorky, přesněji jedince, jež byli
47 uchováváni v etanolu. Protože však v 50. letech minulého století, kdy byly ryby odchyceny, bylo běžnou praxí vzorky konzervovat ve formaldehydu, nemohla jsem si být jista, zda vzorky nebyly takto původně skladovány a do etanolu dány až později. Pokud by tomu tak bylo, DNA by byla znehodnocena a v závislosti na době působení formaldehydu by analýza byla přinejmenším obtížná nebo zcela nemožná. Důvodem jsou interakce mezi DNA a formaldehydem (Srinivasan et al ., 2002). Bylo zjištěno, že formaldehyd iniciuje denaturaci DNA na AT bohatých místech, může způsobit vznik AP míst (purinových nebo apyrimidinových) vedoucích ke vzniku volných purinů či pyrimidinů. Dále může způsobit vznik křížových vazeb mezi cytoziny, v důsledku toho pak dochází k chybám při PCR a ke vzniku mutací. Je také příčinou pomalé hydrolýzy fosfodiesterových vazeb, vedoucí k tvorbě krátkých polydeoxyribózových řetězců. Je tedy patrno, že formaldehyd je příčinou celé řady chemických změn DNA, které mají vliv na analýzu. Při izolaci DNA vzorků z Bečvy nenaznačovalo nic tomu, že by mohl nastat problém. Až při PCR se potvrdila domněnka, že u takto starých vzorků, u nichž není jistota, jakým způsobem byly skladovány (v čem, za jakých podmínek), bude amplifikace požadovaného úseku obtížná. Gen pro cyt b v plné délce 1140 bp nebylo možné namnožit. To by odpovídalo poškození a fragmentaci DNA, kdy úsek 1 kb byl příliš dlouhý pro amplifikaci. Mutaci v primerových místech jsem později vyloučila, protože i s dalšími markery (mt specifický, 12S rRNA) byly stejné problémy a výsledná sekvence exonu 1 cyt b nebyla oproti ostatním významně variabilní. Rozhodla jsem se proto požadovaný úsek cyt b namnožit po částech. Zkoušela jsem optimalizovat kombinace různých primerů. Žádná z nich však nedávala přesvědčivé výsledky, což potvrdilo názor o poškození DNA. Obě části genu cyt b se podařilo namnožit a osekvencovat pouze u tří vzorků. První část genu se po osekvenování ukázala jako naprosto odlišná od ostaních populací, zatímco druhá nevykazovala extrémní rozdíly. Proto jsem provedla zařazení Bečvy do skupin 1 5 pouze na základě druhé části sekvence cyt b a první jsem dále analyzovala. Všechny tři vzorky se zařadily do skupiny 1. V případě první části mohlo jít buď o kontaminaci (amplifikaci cyt b jiného organismu) nebo amplifikaci jaderného genu (pravděpodobně pseudogenu). Pro toto zjištění jsem použila mt specifickou kombinaci primerů, které amplifikují část genu tRNA Glu (pouze v mt genomu) a část genu cyt b. Stejnou kombinaci jsem pro kontrolu kromě vzorků z Bečvy použila i pro vybrané vzorky z ostatních populací. Stejně jako u cyt b nastaly obtíže i při amplifikaci tohoto markeru. Kompletní analýza byla úspěšná u čtyř vzorků z Bečvy, pouze jeden z nich však byl osekvenován i na cyt b (6166), porovnat jsem tedy mohla pouze tento vzorek. Zde se potvrdilo, že sekvence exonu 1 cyt b amplifikovaná pomocí mt specifických
48 primerů je odlišná od sekvnece exonu 1 amplifikované pomocí kombinace primerů pro cyt b. Sekvence u vzorků z ostatních populací se shodovaly. Mohlo jít tedy buď o amplifikovanou část jaderné DNA (pravděpodobně pseudogenu) nebo o amplifikovanou mt DNA jiného organismu (kontaminace vzorků během PCR). Kontaminaci izolátů jsem tímto vyloučila. Existenci pseudogenu vyvrací fakt, že se jedná o kódující oblast a ve většině případů o synonymní substituce (při translaci se variabilita snížila o 4 %). Spíše se proto přikláním k názoru, že jde o kontaminaci . Při srovnání úseku 1 537 bp s databází GeneBank se tato sekvence shoduje se sekvencí Gobio gobio (hrouzek obecný) v 92 – 98 % nukleotidů. Příčinu, že nedošlo ke vzniku jasných překrývajících se píků při sekvenaci (náznaky u některých sekvencí v pozadí jsou) lze přisoudit poškození DNA z Bečvy, většina primerů nasedla na nepoškozenou DNA hrouzka místo DNA sekavčíka. Úspěšně osekvencované vzorky Bečvy na mt specifický marker jsem zařadila do skupin 1 5, které tento marker potvrdil. Bečva se zařadila do skupin 1 a 3, což odpovídá předběžnému závěru z cyt b i předpokladům. Ve skupině 1 jsou nejvíce zastoupeny jedinci z populací Ipel’, jsou zde vzorky z populací Ol’šava/Hornád a Malý Dunaj. Ve skupině 3 jsou jedinci z populací z Vláry, Ipel’u, Malého Dunaje a jeden vzorek z Ondavy. Pro repatriaci sekavčíka horského do povodí Bečvy bych na základě získaných výsledků jako vhodný zdroj doporučila populace tohoto druhu z Ipel’u a z Vláry. Malý Dunaj se vyskytuje kromě skupin 1 a 3 ještě ve skupině 2, proto k repatriaci vhodný není, stejně jako Ondava (skupina 2 a 5). Populace z Ol‘šavy/Hornádu je sice zastoupena pouze v první skupině, ale jedná se o jiné hlavní povodí (Tisa). Podle charakteristiky by sice jako zdroj pro repatriaci případně mohla sloužit, ale k dispozici jsou vhodnější řeky Ipel’ a Vlára patřící ke stejnému hlavnímu povodí (Dunaj) jako Bečva. Vlára je kromě genetické blízkosti ze všech populací nejblíže i geograficky, a proto se jeví jako alternativa první volby. Plánovaný záchranný program s cílem repatriace sekavčíka horského do povodí Bečvy by na základě výsledků prezentovaných v této studii měl využít jako zdrojových populací geneticky nejbližší populace z řek Vlára nebo Ipel’. V budoucnu bych ještě chtěla doplnit analýzy u tohoto druhu o vzorky z evropských zemí Chorvatsko, Srbsko a Makedonie a porovnat je s československými populacemi.
49
6. ZÁVĚR
Sekavčík horský ( Sabanejewia balcanica ) – populační genetická identita ve vztahu k záměru repatriace druhu do povodí Bečvy. Pro zjištění vztahů mezi populacemi sekavčíka horského v ČR a na Slovensku jsem úspěšně provedla molekulárně genetické analýzy 89 vzorků z devíti populací pomocí genu pro cytochrom b a mt specifického markeru. Byly použity základní metody molekulární biologie: PCR, sekvenování a následně fylogenetická analýza. Gen cyt b se podařilo amplifikovat u osmi populací (Bečva, Vlára, Ipel’, Malý Dunaj, Ol’šava/Hornád, Ondava, Ol’šava/Topl’a, Ublianka), přičemž vzorky z Bečvy byly amplifikovány ve dvou částech. Mt specifický marker byl amplifikován u vybraných vzorků také u osmi populací (Bečva, Vlára, Ipel’, Ol’šava/Hornád, Ondava, Ol’šava/Topl’a, Ublianka, Tisa). Analýza cyt b rozdělila populace na českém a slovenském území do pěti skupin, které se nekryjí s jejich geografickou lokalizací. Tato heterogenita byla podpořena malými genetickými vzdálenostmi mezi populacemi i skupinami (u obou průměrně 1 %), což znamená, že populace ani skupiny nejsou přesně geneticky odlišitelné. To potvrdila i zjistěná nízká variabilita genu cyt b, přičemž většina variability byla dána substitucemi na třetí pozici v kodonu. Bečva byla zařazena na základě druhé části genu do skupiny 1, kde je majoritní populace Ipel’. První část genu vykazovala extrémní odlišnost oproti druhé a pro zjištění, zda se jedná o pseudogen nebo kontaminaci, byla použita mt specifická kombinace primerů. Mt specifický marker potvrdil rozdělení do skupin, i když skupiny 2 a 4 nedokázal rozlišit. Populaci z Tisy, u které nebyla úspěšná amplifikace cyt b, zařadil do skupiny 2+4, čtyři vzorky z Bečvy do skupin 1 a 3. Na základě těchto poznatků bylo doporučeno použít pro repatriaci sekavčíka horského do řeky Bečvy jako zdrojové populace z toků Vlára a Ipel’. Pro vyjasnění taxonomické příslušnosti populací sekavčíka horského ( Sabanejewia balcanica ) bylo vyhodnoceno zařazení vymezených pěti skupin jedinců v rámci dunajsko balkánského komplexu. Skupiny 1 až 4 spadají do nejvíce heterogenní sublinie III, skupina 5 do sublinie IV. Toto zařazení potvrdilo heterogenitu, která je pro rod Sabanejewia v Evropě a zejména v povodí Dunaje (střední Evropa, Balkán) typická. Získané výsledky potvrdily, že zkoumané populace ve vodách ČR a Slovenska patří k druhu Sabanejewia balcanica (Karaman, 1922). Proto bude nutné změnit i v tomto smyslu vědecké označení sekavčíka horského, který je stále v legislativních předpisech uváděn jako Sabanejewia aurata .
50
7. SUMMARY
Sabanejewia balcanica – the population genetic identity in realtion to repatriation of this species into Bečva basin. To detection of relationships between the populations in the Czech Republic and Slovakia 89 samples from nine populations were analysed by the way of cytochrome b (cyt b) gene and mt specific marker. The basic methods of molecular biology were used: PCR, sequencing and consequently fylogenetic analysis. It managed to amplification the cyt b gene in eight popuations (Bečva R., Vlára R., Ipel’ R., Malý Dunaj R., Ol’šava R./Hornád, Ondava R., Ol’šava R./Topl’a, Ublianka R.), the Bečva samples were amplified in two parts. Mt specific marker was amplified by the selected samples from eight populations too (Bečva R., Vlára R., Ipel’ R., Ol’šava R./Hornád, Ondava R., Ol’šava R./Topl’a, Ublianka R., Tisa R.). Analysis of the cyt b gene separated populations in the Czech and Slovakian territories into five groups, but this grouping does not correspond to geographic distribution of populations. This heterogeneity was supported by the low genetic distances between the populations and groups (in both on average 1 %), so they are hardly genetically distinguishable. The detected low variability of the cyt b gene confirmed it, variability was mainly due to substitutions on the third position of the codon. The Bečva samples, on the base of second part of the gene, were included in group 1, where is the majority population from the Ipel’ R. The first part of sequence showed high variability and for evaluation of the pseudogene or contamination mt specific combination of primers was used. The mt specific marker established division in groups, though it didn´t distinguish groups 2 and 4. It included the Tisa population (the cyt b analysis was unsuccessful) in group 2+4, four samples from the Bečva R. in groups 1 and 3. On grounds of this work the rapatriation of the Bečva population will be proceeded. The Ipel’ and Vlára R. populations will be serve like the source populations which is in accordance with primary assumption. To clear the systematics in the Czech R., groups 1 5 were included into the danubian balkanian complex. Groups 1 4 fall into sublineage III, group 5 belongs to sublineage IV. This insertion confirmed heterogeneity, typical for the european genus Sabanejewia . On grounds of presented resaults it can be said, in the waters of the Czech Republic and Slovakia it occurs the species Sabanejewia balcanica (Karaman, 1922), not Sabanejewia aurata , which is included in czech or european legislature. It will be necessary to change some testaments in order to achive efficient protection of this critically endangered species of our waters.
51
LITERATURA
Bacescu, M. 1943. Deux Poissons nouveaux pour la faune de la Roumanie: Cobitis aurata balcanica Karaman et Cobitis caspia romanica n. ssp. Bulletin de la Section seietifique de Academie Roumanie 26 (2): 133 144. Banarescu, P. 1948. Formes de transition entre Cobitis balcanica et Cobitis bulgarica . Cahiers de Recherche du Cerele zoologique de Cluj. 1947 : 8 15. In: Iftime, A. 2002. Considerations over the taxonomical status of the Balkan golden loach (Sabanejewia balcanica ) (Pisces: Ostaryophysi: Cobitidae) in Romania and Republic of Moldova. Trav. Mus. Hist. Nat. „Grigore Antipa“ 44: 335 355. Banarescu, P. 1964. Fauna Republicii populare Romine Pisces – Osteichthyes. Volumul 13 . Academiei R. P. R, Bucuresti. Banarescu, P. 1966. Intraspecific variation, Subspeciation and Speciation in Roumanian Fresh water fishes. Zeitschrift fur Zoologie. Systematik and Evolutionforschung 4 (3 4): 378 396. Banarescu, P. 1992. Zoogeography of Fresh Waters, vol. 2. AULA Verlag, Wiesbaden. Banarescu, P. 1999. Mikroevolution and dispersal probléme in fishes involving the Olt river Valley. Transylvanian revue of Systematical and Ecological Research 1 : 165 169. Banarescu, P., Nalbant, T. T. and Chelmu, S. 1972. Revision and geographical variation of Sabanejewia aurata in Romania and the origin of S. bulgarica and S. romanica (Pisces, Cobitidae). Annot. Zool. Bot. (Bratislava) 75 : 1 49. Banarescu, P. and Oliva, O. 1966. A note on Gobio kessleri Dybowski, 1862, and Gobio albipinatus Lukasch, 1933 (Cyprinidae, Osteichthyes) from the River Bečva. Věst. Čs. Spol. zool. 30 : 1 4. Bartoňová, E., Papoušek, I., Lusková, V., Koščo, J., Lusk, S., Halačka, K. and Vetešník, L. 2007. Genetic diversity and taxonomy of Sabanejewia balcanica (Karaman 1922) (Osteichthyes: Cobitidae) in the waters of the Czech Republic and Slovakia . Folia Zool. 56 (Suppl. 1): v tisku. Baruš, V., Oliva, O. (edc.) 1995. Fauna ČR a SR. Mihulovci – Petromyzontes a ryby – Osteichthyes (2), Academia, Praha. Berg, L. S. 1949. Freshwater fishes of the USSR and adjacent countries. Akad. Nauk. SSSR, Moscow II , p. 469 925 (v ruštině). Boron, A . 2000. Cytogenetic characterization of the loaches of the genera Sabanejewia , Misgurnus and Barbatula (Pisces, Cobitidae). Folia Zool. 49 (Suppl. 1): 37 44.
52
Brejšková, L., Marhoul, P., Suchomelová, E. and Volf, O. 2002. Osnova pro zpracování záchranného programu živočichů. In: Klaudisová, A. (ed.). Metodika pro zpracování záchranných programů pro zvláště chráněné druhy cévnatých rostlin a živočichů. AOPK ČR, Praha: 39 47. Briolay, J., Galtier, N., Miguel Brito, R. and Bouvet, Y . 1998. Molecular phylogeny of Cyprinidae inferred from cytochrome B DNA sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 9: 100 108. Brtek, J. 1953. Príspevok k poznaniu rozšírenia niektorých pre faunu ČSR nových alebo málo známych pontokaspických druhov živočichov v Dunaji. Biologia, Bratislava 8 (4): 297 309. Delić, A., Bučar, M., Kučinić, M. and Mrakovčić, M. 2003a. New Data about Distribution of Sabanejewia balcanica (Karaman, 1922) (Cobitidae) in Croatia. Folia biologica (Kraków) (Suppl.) 51 : 39 42. Delić, A., Kučinić, M., Bučar, M., Lazar, B. and Mrakovčić, M. 2003b. Morphometric and Meristic Characteristics of the Goldside loach Sabanejewia balcanica (Cobitidae) in Central Croatia. Folia biologica (Kraków) (Suppl.) 51 : 33 38. Economidis, P. S. and Banarescu, P. M. 1991. The distribution and origins of freshwater fishes in the Balkan Peninsula, especially in Greece. Int. Rev. Gesamten Hydrobiol. 76 : 257 347. Economidis, P. S. and Nalbant, T. T. 1996. A study of the loaches of the genera Cobitis and Sabanejewia (Pisces, Cobitidae) of Greece, with description of six new taxa. Trav. Mus. Hist. Nat. „Grigore Antipa“ 36 : 295 347. Esposti, M. D., De Vries, S., Crimi, M., Ghelli, A., Patarnello, T. and Meyer, A. 1993. Mitochondrial cytochrome b: evolution and structure of the protein. Biochimica et Biophysica Acta 1143 : 243 271. Grossu, A., Mester, L. and Tesio, C. 1971. Etude electrophorétique des protéiness sériques et sarcoplasmatiques, appliquée a la systématique de la famille Cobitidae (Pisces). Trav. Mus. Hist. Nat. „Grigore Antipa“ 11 : 339 346. Hanel, L. 1995 . Ryby a mihule, p. 76 99. Ochrana ryb a mihulí, metodika ČSOP č. 10, ZO ČSOP, Vlašim. Hanel, L. and Lusk, S. 2005. Ryby a mihule České republiky. Rozšíření a ochrana. ZO ČSOP, Vlašim. Halačka, K. and Vetešník, L . 2002. The morphological variability of Sabanejewia balcanica from different rivers. Book of abstracts, II. Int.cong. Loaches of the genus Cobitis and related genera, Olsztyn: 34.
53
Iftime, A. 2002. Considerations over the taxonomical status of the Balkan golden loach (Sabanejewia balcanica ) (Pisces: Ostaryophysi: Cobitidae) in Romania and Republic of Moldova. Trav. Mus. Hist. Nat. „Grigore Antipa“ 44 : 335 355. Imsiridou, A. and Zaldívar, J. M . 1999. Methodology and formats for genetic identification of fish species. European commission joint research cebtre. Technical Note N°I.99.16. Karaman, S. 1922. Über eine neue Cobitis Art aus Jugoslavien, Cobitis balcanica n. sp. Glsnik Kroatisches. Naturwissenschaftliches Gesellschaft, Zagreb 34: 1 4. Kocher, T. D., Thomas, W. K., Meyer, A., Edwards, S. V., Paabo, S., Villablanca, F. X. and Wilson, A. C. 1989. Dynamics of mitochondrial DNA evolution in animals: amplification and sequencing with conserved primers. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86 : 6196 6200. Koščo, J., Košuth, P., Lusková, V., Lusk, S., Košuthová, L. and Halačka, K. 2006. Súčasný stav rozšírenia zástupcov čelade Cobitidae v slovenskom povodí Tisy, p. 15 24. Biodiverzita ichtyofauny ČR (VI), ÚBO AV ČR, Brno. Koščo, J., Lusk, S., Pekárik, L., Košuthová, L., Lusková, V. and Košuth, P. 2007. The occurrence and status of species of the genera Cobitis, Sabanejewia and Misgurnus in Slovakia. Folia Zool. 56 (Suppl. 1): v tisku. Kottelat, M. 1997. European freshwater fishes. Biologia Bratislava 52 (Suppl. 5): 90 92. Kratochvíl, J., Bartoš, E. (edc.) 1954. Soustava a jména živočichů. ČSAV Praha. Kumar, S., Tamura, K. and Nei, M. 2004. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics 5: 150 163. Kux, Z. 1957. Příspěvek k poznání ichtyoufauny dunajského povodí ČSR. Acta. Mus. Moraviae 42 : 67 84. Kux, Z. 1964. A – Ichtyofauna západní části Karpatského oblouku a přilehlých nížin. B – Bionomie mihule karpatské ( Lampetra danfordii Regan). Kand. Dis. Práce, Brno. Kux, Z. and Weisz, T. 1958. Příspěvek k poznání ichtyofauny řeky Toplé v bardějovském okrese. Časopis moravského musea, 43: 145 174. Kux, Z. and Weisz, T. 1964. Příspěvek k poznání ichtyofauny slovenských řek. Acta. Mus. Moraviae 49 : 101 243. Lelek, A. 1987. The freshwater fishes of Europe. Vol. 9. Threatened fishes of Europe. AULA Verlag Wiesbaden. Ludwig, A., Becker, J. and Bohlen, J. 2000. Small differences in Cytochrome b sequences within the genus Sabanejewia. Folia. Zool. 49 (Suppl. 1): 85 90 .
54
Ludwig, A. and Kirschbaum, F . 1998. Comparison of mitochondrial DNA sequences between the European and the Adriatic sturgeon. J. Fish. Biol. 52 : 1289 1291. Lusk, S. and Hanel, L. 2000. Červený seznam mihulí a ryb České republiky – verze 2000, p. 5 13. Biodiverzita ichtyofauny ČR (III), ÚBO AV ČR, Brno. Lusk, S., Hanel, L., Lusková, V., Lojkásek, B. and Hartvich, P . 2006b. Červený seznam mihulí a ryb České republiky – verze 2005, p. 7 16. Biodiverzita ichtyofauny ČR (VI), ÚBO AV ČR, Brno. Lusk, L., Lusková, V. and Dušek, M. 2002c. Biodiverzita ichtyofauny České republiky a problematika její ochrany , p. 5 22. Biodiverzita ichtyofauny ČR (IV), ÚBO AV ČR, Brno. Lusk, S., Lusková, V. and Halačka, K. 2000. On the occurrence of populations of the genera Cobitis and Sabanejewia (Pisces, Cobitidae) in the Czech Republic. Folia Zool. 49 (Suppl. 1): 97 106. Lusk, S., Lusková, V., Halačka, K., Šlechta, V. and Šlechtová, V. 2002a. Status and protection of species and intraspecific diversity of the ichthyofauna in the Czech Republic. In: Collares Pereira, M.J., Coelho, M.M. and Cowx, I.G. (edds). Conservation freshawater fishes: Options for the future. Fishing News Books, Blackwell Science Ltd, Oxford, Cap.2: 23 33. Lusk, S., Lusková, V., Lojkásek, B., Halačka, K., Vetešník, L. and Merta, M. 2006a. K výskytu vzácných a chráněných druhů mihulí a ryb v povodí řeky Moravy, p. 87 94. Biodiverzita ichtyofauny ČR (VI), ÚBO AV ČR, Brno. Lusk, S., Májsky, J., Lusková, V. and Halačka, K. 2002b. Výskyt sekavčíka horského – Sabanejewia balcanica (Karaman, 1922) v toku Vláry na území České republiky a Slovenska, p. 121 126. Biodiverzita ichtyofauny ČR (IV), ÚBO AV ČR, Brno. Nalbant, T. T. 1963. A study of the genera of Botiinae and Cobitinae (Pisces, Ostaryophysi, Cobitidae). Trav. Mus. Hist. Nat. „Grigore Antipa“ 4: 343 379. Oliva, O. 1950. Sykavec horský Cobitis aurata (De Filippi 1865) na Moravě. Akvar. listy 22 (7): 116 117. Oliva, O., Balon, E. and Frank, S. 1952. K systematice našich sykavců, Cobitis (L.) . Věst. Čs. Spol. Zool. 16 (3 4): 271 297. Oliva, O., Hrabě, S. and Lác, J. 1968. Stavovce Slovenska I Ryby, obojživelníky a plazy. SAV, Bratislava. Pavlík, I. 1953. Objav sekavce horského na Slovensku. Československé rybářství 1: 13. Perdices, A. and Doadrio, I. 2001. The molecular systematics and biogeography of the European cobitids based on mitochondrial DNA sequences. Mol. Phylogenet. Evol. 19 : 468 478.
55
Perdices, A., Doadrio, I., Economidis, P. S., Bohlen, J. and Banarescu, P. 2003. Pleistocene effect on the European freshwater fish fauna: double origin of the cobitid genus Sabanejewia in the Danube basin (Osteichthyes: Cobitidae). Mol. Phylogenet. Evol. 26 : 289 299. Povž, M. and Šumer, S. 2000. Present status and distribution of the species of the genera Misgurnus , Cobitis and Sabanejewia in Slovenia. Folia Zool. 49 (Suppl. 1): 107 112. Prado, M., Calo, P., Cepeda, A. and Barros Velázquez, J . 2005. Genetic evidence of an Asian background in heteroplasmic Iberian cattle ( Bos taurus ): Effect on food authentication studies based on polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism analysis. Electrophoresis 26 , 2918–2926. Ráb, P., Rábová, M., Bohlen, J. and Lusk, S. 1991. Genetic differentiation of the two hybrid diploid polyploid complexes of loaches, genus Cobitis (Cobitidae) involving C. taenia, C. elongatoides, and C. spp. In the Czech Republic: Karyotype and cytogenetic diversity. Folia Zool. 49 (Suppl. 1): 55 66. Saitou, M. and Nei, M. 1987. The neighbor joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4 (4): 406 425. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T . 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Schönfeld, A. and Pytlík, R. 1926 . Ryby našich vod. Zprávy Výzk.ústavů zemědělských 24 , Praha. Song, C., Near, T. J. and Page, L. M. 1998. Phylogenetic relations among percid fishes as inferred from mitochondrial cytochrome b DNA sequence data. Mol. Phylogenet. Evol. 10 : 343 353. Srinivasan, M., Sedmak, D. and Jewell, S . 2002. Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids. American Journal of Pathology 161 (6): 1961 1971. Sykes, B . 2004. Sedm dcer Eviných. Ladislav Horáček – Paseka, Praha. Tamura, K. and Nei, M. 1993. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Mol. Biol. Evol. 10 : 512 526. Vasiljeva, E. D. and Ráb, P. 1992. Zolotistaja šipovka Sabanejewia aurata (Cobitidae) reki Loborec (Golden loach Sabanejewia aurata (Cobitidae) in the Laborec). Vopr. Ikhthyol. 32 : 176 181 (v ruštině).
56
Vasiljeva, E. D. and Vasiljev, V. P. 1988. Studies in infraspecific structure of Sabanejewia aurata (Cobitidae) with the description of a new subspecies, S. aurata kubanica subsp. nov. Vopr. Ikhtiol. 28 : 192 212 ( v ruštině, angl. překl. z J. Ichthyol). Vladykov, V. 1925. Über eine neue Cobitis Art aus Tschechoslovakei: Cobitis montana n.sp. Zool. Jahrb. 50 : 320 338. Vladykov, V. 1926. Ryby Podkarpatské Rusi a hlavní způsoby rybolovu. Užhorod. Vladykov, V. 1928. Über sekundären Geschlechtsdimorphismus bei unseren Cobitiden. Zool. Jahrb. 55 : 147 162. Vladykov, V. 1929. Sur un nouveau genre de Cobitides: Sabanejewia. Bull. Mus. Nat. Hist. Nat. Paris 2 (1): 85 90. Vladykov, V. 1931. Less poisons de la Russie Sous Carpathique. Memories de la Société Zoologique de France 29 : 214 373. Witkowski, A. 1994. Morphological characteristics of Sabanejewia aurata (DE FILLIPI, 1865) from the Odra river basin, with description of new subspecies (Teleostei: Cypriniformes: Cobitidae). Zoologische Abhendlungen 48 (3): 23 51. Záleský, M. 1944. Sykavec balkánský – Sabanejewia balcanica Vlad. – nová ryba moravská. Rybářský věstník 24 (4): 37 38. Zardoya, R., Economidis, P. S. and Doadrio, I. 1999. Phylogenetic relationships of Greek Cyprinidae: molecular evidence for at least two origins of the Greek cyprinid fauna. Mol. Phylogenet. Evol. 13 : 122 131. Zelinka, M. 1951. Nová lokalita sykavce horského ( Cobitis aurata Fil.) na Moravě. Akvar. listy 23 (9 10): 123 124.
57