Seriola Lalandi in Vitro

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS

Evaluación de patrones de expresión génica en respuesta a distintas concentraciones DHA en tejido hepático y mandibular de Seriola lalandi in vitro

Tesis para optar al Grado Académico de Doctor en Acuicultura

Programa Cooperativo de Doctorado en Acuicultura Universidad de Chile Universidad Católica del Norte Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

JESSICA NOEMI DÖRNER AMPUERO

DIRECTORES DE TESIS: Dr. Víctor Martínez Moncada Dr. Juan Gormaz Araya

SANTIAGO, CHILE 2018

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS

Evaluación de patrones de expresión génica en respuesta a distintas concentraciones DHA en tejido hepático y mandibular de Seriola lalandi in vitro

Tesis para optar al Grado Académico de Doctor en Acuicultura

Programa Cooperativo de Doctorado en Acuicultura Universidad de Chile Universidad Católica del Norte Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

JESSICA NOEMI DÖRNER AMPUERO

DIRECTORES DE TESIS: Dr. Víctor Martínez Moncada Dr. Juan Gormaz Araya

SANTIAGO, CHILE 2018

UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS

INFORME DE APROBACIÓN

Evaluación de patrones de expresión génica en respuesta a distintas concentraciones DHA en tejido hepático y mandibular de Seriola lalandi in vitro

Tesis para optar al Grado Académico de Doctor en Acuicultura Programa Cooperativo de Doctorado en Acuicultura Universidad de Chile Universidad Católica del Norte Pontificia Universidad Católica de Valparaíso

JESSICA NOEMI DÖRNER AMPUERO

Firmas DIRECTORES DE TESIS

Dr. Víctor Martínez Moncada …………………………

Dr. Juan Gormaz Araya …………………………

COMISIÓN DE TESIS: Calificaciones

Dr. Eduardo Uribe Tapia …………………… …………………………

Dr. Federico Winkler Manns …………………… …………………………

Dr. Nelson Díaz Pérez …………………… …………………………

Dr. Patricio Dantagnan D. …………………… …………………………

ESTE PROYECTO DE TESIS NO FUE FÁCIL, PERO ESTUVIERON MOTIVÁNDOME Y AYUDÁNDOME HASTA DONDE SUS ALCANCES LO PERMITÍAN. LOS AMO, HUGO Y BRUNITO

AGRADECIMIENTOS

En primera instancia agradecer por el financiamiento otorgado por el proyecto FONDEF IDEA CONICYT ID14I10125 (PDACH) para llevar a cabo el desarrollo de esta tesis y a la Beca de Doctorado Nacional de CONICYT (Folio N°21130155) que además financió a través de los Gastos Operacionales parte de mi estudio en terreno, además de la asistencia a los congresos IV Congreso Nacional de Acuicultura, Universidad Andrés Bello, Viña del Mar y World Aquaculture 2017, Cape Town, Sudáfrica.

Quiero agradecer a mi tutor, Dr. Víctor Martínez, por darme espacio en su laboratorio y cabida en sus investigaciones de gran relevancia, por su confianza y ayuda durante este largo proceso de tesis doctoral, mis más sinceros agradecimientos y respeto hacia él. También agradecer a mi cotutor de tesis, Dr. Juan Guillermo Gormaz, por todo su apoyo y colaboración en este proceso.

Agradecer a la comisión de tesis por sus recomendaciones y consejos para mejorar este proyecto de tesis.

Agradecer eternamente a mis compañeros del laboratorio INBIOGEN-FAVET, en especial a Phillip el cual me brindo una gran ayuda en el desarrollo de la tesis, también agradecer a Verito que me ayudó y guió pacientemente en los análisis del laboratorio y aEric por su gran labor en llevar a cabo los cultivos de Seriola. También agradecer aClaudio, Karen, Cristian, Álvaro y Paola por toda la ayuda, confianza, buena disposición y buena onda.

También mencionar a mis compañeros del doctorado con quienes compartíamos extensas semanas de estudio y diversión a la vez, gracias Vivita, Kata, Marcela, Liane, Orestes, Michelli, Ljubo, Daniel y Marcelo, les deseo éxito en esta nueva etapa.

Finalmente agradecer de todo corazón a mi familia, el apoyo incondicional que han puesto para que lleve a cabo mis estudios. En especial a mi pareja Hugo y a mi hijo Brunito, que me han acompañado en todas las situaciones que he tenido que abordar en este proceso, los amo!!. Mil gracias también a mis padres y a mis suegros por toda la ayuda brindada en este largo camino.

iii

RESUMEN

Seriola lalandi es un pez teleósteo marino con un alto potencial para su uso en la acuicultura. Sin embargo, una de las principales limitaciones para su cultivo es la aparición impredecible de deformidades mandibulares en etapas tempranas, constituyendo uno de los mayores desafíos para su producción.

Evidencia preliminar cualitativa sugería que factores nutricionales, incluyendo niveles de ácidos grasos esenciales en la dieta se han relacionado con la aparición de malformaciones óseas. En el presente estudio se analizaron los factores transcripcionales relacionados con una malformación mandibular. Se recolectaron dos grupos de juveniles a los 40 días post eclosión procedente de diferentes desoves del mismo lote de reproductores. Los juveniles normales y deformes fueron muestreados a priori basados en la anomalía de la mandíbula inferior alargada. Se utilizaron pool de aislados de ARN de mandíbula inferior e hígado por cada fenotipo mandibular para el secuenciamiento masivo de ARN. Las lecturas filtradas se mapearon a un transcriptoma de referencia. Se identificaron 1445 transcritos expresados diferencialmente en la mandíbula (FDR<0.05). De estos, 1387 transcritos se sobreexpresaron y 58 transcritos se subexpresaron en el grupo deforme. En el caso del hígado no se observó expresión diferencial. Los resultados sugieren que las vías implicadas en los procesos de la matriz extracelular, procesos de osteoblastogénesis y transportadores lipìdicos son de gran importancia para el crecimiento mandibular normal. Aún queda por establecer si las Apolipoproteínas directamente o indirectamente regulan la masa ósea en peces pero nuestro estudio coloca en antecedente su participación en el tejido óseo como la mandíbula.

Debido al rol que se atribuye a los ácidos grasos como el DHA en malformaciones óseas en peces, en este estudio se midió el contenido de DHA en ambos fenotipos. Nuestros resultados mostraron que en el tejido mandibular deforme el contenido de DHA fue significativamente menor comparado con mandíbula normal. Adicionalmente, evaluamos la acción in situ del DHA en el tejido mandibular en el cultivo in vitro, comparando los transcritos expresados diferencialmente entre el RNA-Seq del suplemento de cultivo in vitro con DHA y cultivo in vivo. Se observó una concordancia entre los transcritos expresados diferencialmente in vitro e in vivo, incluidos los transcriptos asociados con el transporte de lípidos, fibronectina y peroxisomas. Una deficiencia del contenido de DHA en el tejido con deformidad mandibular y el efecto del DHA en el componente de la matriz extracelular indican la importancia de este acido graso a nivel local y su papel en la formación de este tejido, que ha sido poco estudiado en peces.

ABSTRACT

Seriola lalandi is a marine teleost fish with a high potential for use in aquaculture. However, one of the main limitations for its cultivation is the unpredictable occurrence of mandibular deformities in early stages, currently constituting one of the greatest challenges for its production.

Qualitative preliminary evidence suggested that nutritional factors, including levels of essential fatty acids in the diet, are related to the occurrence of bone malformations. In the present study we analyze the transcriptional factors related to a mandibular malformation. Two groups of juveniles with 40 days post hatching were collected, which come from different spawnings of the same batch of broodstock. The normal and deformed juveniles were sampled a priori in the anomaly of the elongated lower jaw. A pool of RNA isolates from lower jaw and liver of each jaw phenotype was used for RNA massive sequencing. The filtered reads were mapped to a reference transcriptome. We identified 1,445 differentially expressed transcripts in the jaw (FDR <0.05). Of these, 1387 transcripts were upregulated and 58 transcripts were downregulated in the deformed group. In the case of the liver, it did not show differential expression. The results suggest that the pathways involved in extracellular matrix processes, osteoblastogenesis processes and lipid transporters are of great importance for normal mandibular growth. It remains to be established whether apolipoproteins directly or indirectly regulate bone mass in fish, but our study places in antecedent its participation in the bone tissue as the jaw.

Due to the role that is attributed to fatty acids such as DHA in bone malformations in fish, in this study measured the DHA content in both phenotypes. Our results showed that in deformed mandibular tissue the DHA content was significantly lower compared to normal jaw. Aditionally, we evaluated the in situ action of DHA on the mandibular tissue in the in vitro culture, comparing the differentially expressed transcripts between the RNA- Seq from of in vitro culture suplement with DHA and in vivo. A concordance was observed between in vitro and in vivo differencial expressed transcripts, including transcripts associated with the transport of lipids, fibronectin and peroxisomes. A deficiency of the DHA content in the tissue with jaw deformity and the effect of DHA on the extracellular matrix component indicate the importance of this fatty level locally and its role in the formation of this tissue, which has been little studied in fish.

ÍNDICE DE CONTENIDOS

APROBACIÓN i

DEDICATORIA ii

AGRADECIMIENTOS iii

RESUMEN iv

ABSTRACT v

ÍNDICE DE CONTENIDOS vi

ÍNDICE DE TABLAS x

ÍNDICE DE FIGURAS xi

ABREVIATURAS xiv

INTRODUCCIÓN 1

Fenotipos mandibulares identificados en Seriola lalandi 1

Antecedentes del desarrollo mandibular en teleósteos 2

Metabolismo lipídico implicado en malformación ósea: ácido docosahexaenoico 3

Planteamiento del Problema 5

HIPÓTESIS 7

OBJETIVOS 8

Objetivo General 8

Objetivos Específicos 8

MATERIALES Y MÉTODOS 9

Colección de muestras biológicas 9

Mediciones morfológicas de las mandíbulas 10

Aislación de ARN total 10

Construcción de librerías ADNc y secuenciación 11

Filtro de secuencias y mapeo contra referencia 11

Análisis de expresión génica: caracterización de los transcriptomas y expresión diferencial entre fenotipos 11

Cultivo in vitro de explantes mandibulares suplementados con DHA: Extracción del tejido y preparación de los explantes 12

Incubación de los explantes de mandíbula 12

Suplementación con ácido docosahexaehoico (DHA) al medio de cultivo 13

Ensayos de exposición 13

Análisis de viabilidad de los explantes 13

Expresión relativa de genes candidatos: Extracción ARN total y síntesis de ADNc 14

Genes candidatos: diseño de partidores 14

Cuantificación RT-qPCR 16

Análisis RNA-Seq en explantes suplementados con DHA 16

Contenido de DHA en los tejidos de estudio 16

Análisis estadístico: Datos fenotípicos 17

RESULTADOS 18

Objetivo Específico Nº1. Describir el transcriptoma completo en mandíbula e hígado de individuos normales y deformes de Seriola lalandi bajo condiciones de cultivo intensivo 18

Objetivo Específico N°2. Evaluar los patrones de expresión en las distintas concentraciones DHA bajo condiciones de cultivo in vitro en tejido mandibular y hepático de juveniles de Seriola lalandi en genes candidatos asociados a deformidad mandibular 30

vii

DISCUSIÓN 39

Caracterización transcriptomas por tejido y expresión diferencial entre fenotipos 39

Acción in situ del DHA en tejido mandibular 42

CONCLUSIONES 45

REFERENCIAS 46

ANEXOS 55

Anexo 1. Análisis de estabilidad de los genes de referencia por Normfinder 54

Anexo 2. Prueba de ANOVA de una vía de los datos de peso y longitud total por periodo de desove en juveniles S. lalandi. 55

Anexo 3. Resumen del análisis estadístico aplicando la prueba de t para muestras independientes. L1 representa la longitud relativa de la mandíbula superior y L2 representa la longitud relativa de la mandíbula inferior entre ambos fenotipos mandibulares. 55

Anexo 4. Resumen de los datos obtenidos desde la secuenciación Illumina de tejidos de Seriola lalandi, proceso de filtrado y mapeo utilizando transcriptoma de referencia. 56

Anexo 5. Mapeo de las vías por Kegg de la mandíbula inferior de S. lalandi. 57

Anexo 6. Mapeo de las vías por Kegg del hígado de S. lalandi. 58

Anexo 7. Lista de los transcritos expresados diferencialmente entre fenotipos mandibulares de S. lalandi (FDR<0.05). Obtención de secuencias en Patel et al. (2016). 59

Anexo 8. Mapeo de la vías por Kegg de la lista de transcritos expresados diferencialmente en S. lalandi. 101

Anexo 9. Enriquecimiento de los términos ontológicos significativos de genes expresados diferencialmente en mandíbula por categoría. P: procesos biológicos; F: función molecular y C: componente celular. 102 viii

Anexo 10. Prueba de ANOVA de una vía de viabilidad de los explantes de mandíbula suplementados con DHA y control durante la incubación. 104

Anexo 11. Resumen del análisis estadístico aplicando la prueba de t para muestras independientes. Expresión relativa de los genes candidatos en explantes de mandíbula suplementados con 20 µM de DHA versus el control, incubados a 48 hrs. 105

Anexo 12. Resumen del análisis estadístico aplicando la prueba de t para muestras independientes. Expresión relativa de los genes candidatos en explantes de mandíbula suplementados con 40 µM de DHA versus el control, incubados a 48 hrs. 106

Anexo 13. Lista de los transcritos expresados diferencialmente que presentaron concordancia entre cultivo in vivo y cultivo in vitro de mandíbula (p <0.05). Obtención de secuencias en Patel et al. (2016). 107

Anexo 14. Mapeo de las vías por Kegg de la comparación de los transcritos expresados diferencialmente en mandíbula proveniente de cultivo in vivo y cultivo in vitro de S. lalandi. 111

Anexo 15. Resumen del análisis estadístico aplicando la prueba z para media de dos muestras. Comparación del contenido en porcentaje de ácidos grasos en mandíbula inferior por fenotipo en S. lalandi. 112

Anexo 16. Resumen del análisis estadístico aplicando la prueba z para media de dos muestras. Comparación del contenido en porcentaje de ácidos grasos en hígado por fenotipo en S. lalandi 113

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Lista de genes candidatos (partidores) usados en RT-qPCR para la expresión relativa en explantes de mandíbula de S. lalandi. 15

Tabla 2. Porcentaje de ácidos grasos en proporción del porcentaje de lípidos totales en ambos tejido de estudio (n=2). *Diferencias significativas (p<0.05). 38

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Fenotipo mandibular inferior de Seriola lalandi a los 40 dpe. A y B: anormal elongación. C: normal crecimiento. 9

Figura 2. Puntos de referencias utilizados en las longitudes de la mandíbula superior (L1), mandíbula inferior (L2) y longitud estándar (LS). 10

Figura 3. Porcentaje de la longitud relativa estándar respecto a la mandíbula superior (A) e inferior (B) por fenotipo. Valores están representados en promedio y error estándar. 19

Figura 4. Asignaciones de Ontología de Genes (términos ontológicos nivel 2) para el transcriptoma de Seriola lalandi. (A) Mandíbula inferior; (B) Hígado. Clasificación por categoría: componente celular, función molecular y procesos biológicos. 22

Figura 5. Comparación del porcentaje de genes asociados a términos ontológicos para ambos transcriptomas por fenotipo para cada tejido de estudio en Seriola lalandi. (A) Mandíbula inferior; (B) Hígado. Clasificación por categoría: procesos biológicos, función molecular y componente celular. 23

Figura 6. Asignaciones de Ontología de Genes (términos ontológicos nivel 2) en secuencias transcriptómicas de los transcritos expresados diferencialmente en mandíbula en Seriola lalandi. Clasificación por categoría: procesos biológicos, función molecular y componente celular. 25

Figura 7. Vía de señalización del Receptor Activado por el Proliferador de Peroxisoma mapeado por Kegg. Los recuadros amarillos indican una sobreexpresión en el perfil transcriptómico de la mandíbula inferior deforme de Seriola lalandi. 26

Figura 8. Metabolismo del colesterol mapeada por Kegg. Los recuadros verdes indican una sobreexpresión en el perfil transcriptómico de la mandíbula inferior deforme de Seriola lalandi. 27

Figura 9. Interacción matriz-receptor extracelular mapeada por Kegg. Los recuadros verdes indican una sobreexpresión en el perfil transcriptómico de la mandíbula inferior deforme de Seriola lalandi. 28

Figura 10. Diferenciación de osteoclastos mapeada por Kegg. Los recuadros verdes indican una sobreexpresión en el perfil transcriptómico de la mandíbula inferior deforme de Seriola lalandi. 29

Figura 11. Enriquecimiento significativo en términos ontológicos de los procesos biológicos de los genes sobrexpresados en deformes Seriola lalandi. 30

Figura 12. Viabilidad de explantes de mandíbula de Seriola lalandi incubación con DHA durante 6 h, 12 h, 24 h, 48 h y control. A: explantes suplementados con 20 µM DHA y B: explantes suplementados con 40 µM DHA. Los valores son expresados en promedio y error estándar. Los grupos etiquetados con las mismas letras no son significativamente diferentes. 31

Figura 13. Expresión relativa del “set” de genes involucrados en el transporte y receptor de ácidos grasos esenciales. Explantes de mandíbula expuestos a 20 µM DHA (A) y 40 µM DHA (B) durante 48 hrs incubación. Los valores son expresados en promedio y error estándar. Valores de expresión normalizados. *Diferencias significativas (p ˂0.05). 32

Figura 14. Expresión relativa del “set” de genes involucrados en formación ósea. Explantes de mandíbula expuestos a 20 µM DHA (A) y 40 µM DHA (B) durante 48 hrs de incubación. Los valores son expresados en promedio y error estándar. Valores de expresión normalizados. * Diferencias significativas (p ˂0.05). 33

Figura 15. Vía de señalización del Receptor Activado por el Proliferador de Peroxisoma mapeado por Kegg. Los recuadros verdes indican los transcritos expresados significativamente en la mandíbula inferior de Seriola lalandi proveniente de cultivo in vivo y cultivo in vitro suplementado con DHA. 35

xii

Figura 16. Interacción receptor-matriz extracelular mapeado por Kegg. Los recuadros verdes indican el transcrito expresado significativamente en la mandíbula inferior de Seriola lalandi proveniente de cultivo in vivo y cultivo in vitro suplementado con DHA. 36

Figura 17. Peroxisoma mapeado por Kegg. Los recuadros verdes indican los transcritos expresados significativamente en la mandíbula inferior de Seriola lalandi proveniente de cultivo in vivo y cultivo in vitro suplementado con DHA. 37

xiii

ABREVIATURAS

ARN: Ácido Ribonucleico. FDR: False Discovery Rate DHA: Docosahexaenoic Acid ADNc: Ácido Desoxiribonucleico complementario NCBI: National Center for Biotechnology Information dpe: días post eclosión PUFA: Polyunsaturated fatty acid PPARs: Peroxisome proliferator-activated receptor EPA: Eicosapentaenoic Acid ARA: Arachidonic Acid LCPUFA: Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids RNA-Seq: RNA Sequencing RIN: Ribonucleic Acid Integrity Number DO: Densidad Óptica GCAT: Glicerofosfolipido:Colesterol aciltransferasa. HEPES: 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid. RPKM: Reads Per Kilobase per Million Mapped reads OGs: Ontología de Genes Mg+2: Catión magnesio Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes EdgeR: Empirical Analysis of Digital Gene Expression Data in R BSA: Bovine Serum Albumin LDH: Lactato Deshidrogenasa NADH: Nicotinamida Adenina Dinucleótido de Hidrógeno RT-qPCR: Real-Time Reverse transcription polymerase chain reaction Ct: Cycle threshold DESeq: Differential Expression Sequencing FAMEs: Fatty Acid Methyl Esters

xiv

pb: pares de bases PBS: Phosphate Buffered Saline (Tampón Fosfato Salino). rpm: revoluciones por minuto. KO: Kegg Orthology FATCD36: Fatty Acid Translocase (FAT/CD36) FATP: Fatty Acid Transport Protein FABP: Fatty Acid Binding Protein Apo: Apolipoproteina CYP7A1: Cytochrome P450 7A1 CYP8B1: Cytochrome P450 Family 8 Subfamily B Member 1 LPL: Lipoprotein Lipasa ACS: Acetyl-Coenzyme A Synthetase SCP-X: Sterol Carrier Protein X ACO: Acyl-CoA Oxidase PEPCK: Phosphoenolpyruvate carboxykinase ABCA: ATP Binding Cassette subfamily A LCAT: Lecithin-Cholesterol Acyltransferase CETP: Cholesteryl Ester Transfer Protein SOAT: Sterol O-acyltransferase NCEH: Neutral cholesterol ester hydrolase IL1R: Interleukin 1 Receptor Type Ig-likeR: Immunoglobulin-like Receptor PLC: Fosfatidilinositol fosfolipasa C PXMP2: Peroxisomal Membrane Protein 2 PHYH: phytanoyl-CoA 2-hydroxylase VLACS: Very Long-Chain Acyl-CoA synthetase CROT: Carnitine O-octanoyltransferase MVK: Mevalonate Kinase

INTRODUCCIÓN

El desarrollo del cultivo de nuevas especies es de alta prioridad para la diversificación del sector acuícola en Chile para expandir la producción de recursos de alto valor y estimular la productividad en diferentes zonas geográficas de nuestro país. Como parte del programa de diversificación de la acuicultura chilena (PDACH), se ha seleccionado a Seriola lalandi, comúnmente conocida como dorado o palometa, para el desarrollo de su cultivo comercial en Chile. Este pez presenta atractivas características, incluyendo rápido crecimiento, alta calidad de su carne, excelente adaptación en cautiverio y una importante demanda actual y potencial en el mercado japonés, europeo y norteamericano (Poortenaar et al., 2001; Fowle et al., 2003; Stuart & Drawbridge, 2012).

S. lalandi (Valenciennes, 1833) pertenece al Phylum Cordata, Clase Actinopterygii, Orden Perciformes, Familia Carangidae y Género Seriola (NCBI, 2013ª). Es una especie epipelágica templada y subtropical que se distribuye a lo largo de las costas de los océanos Pacífico y Atlántico. Dentro del género Seriola, es la segunda especie con la más alta producción, estimada en 4558 toneladas en Japón y 4000 toneladas en Australia en el 2010 (Miller et al., 2011). Actualmente se cultiva en Japón, Australia, Nueva Zelanda y recientemente en el norte de Chile (Patel et al., 2016). Sin embargo, a pesar de tener un alto potencial acuícola, la presencia de deformidades esqueléticas en sistemas intensivos o semi- intensivos afecta la producción, incidiendo en el crecimiento, supervivencia y la comercialización de su producto de cosecha (Divanach et al., 1996; Koumoundouros et al., 2002; Cahu et al., 2003a; Sweetman, 2004; Verhaegen et al., 2007). Esta situación es similar a lo observado en otras especies marinas cultivadas comercialmente (Cobcroft & Battaglene 2013).

Fenotipos mandibulares identificados en Seriola lalandi

Las malformaciones identificadas en esta especie son de tipo mandibular, opercular, vertebral y otras, las cuales varían entre 17% y 32%, con una alta incidencia de deformidades mandibulares entre un 12 y 30% en juveniles (Cobcroft et al., 2004; Kolkovski & Sakakura, 2004; Moran et al., 2011). La alta incidencia de las deformidades en mandíbula y opérculo en la etapa juvenil de esta especie, se presenta con una gran variación entre lotes de huevos en cultivo (Jara et al., 2017). Varios fenotipos anormales mandibulares se han descrito previamente en S. Lalandi como una elongación anormal de la mandíbula inferior, mandíbula inferior corta, mandíbula superior corta, mandíbula inferior rota a un lado, fusión de mandíbula superior y mandíbulas dobladas o torcidas (Battaglene & Cobcroft, 2007). Las anomalías mandibulares en S. lalandi se han descrito a los 23 días post eclosión (dpe) mostrando un alargamiento de la mandíbula inferior, a los 45 dpe con un acortamiento de la mandíbula inferior (Cobcroft & Battaglene 2013) y a los 16 dpe mostrando un posicionamiento anormal de la mandíbula inferior y arco hioides con rotura del cartílago de Meckel (Cobcroft et al., 2004). Se han registrado anomalías mandibulares 1

en otras especies marinas cultivadas tales como en lubina (Dicentrarchus labrax), dorada roja (Pagrus major), halibut del Atlántico (Hippoglossus hippoglossus), trompeta rayada (Latris lineata), dorada (Sparus aurata) y barramundi (Lates calcarifer). En lubina, se registraron mandíbulas superior e inferior torcidas y acortadas (Barahona-Fernandes, 1982; Daoulas et al., 1991). En dorada roja se reportaron acortamientos de la mandíbula inferior y/o superior (Matsuoka, 2003). En halibut del Atlántico se ha observado flexión en la parte superior e inferior mandibular (Lewis & Lall, 2006; Cloutier et al., 2011). En trompeta rayada se han presentado mandíbulas abiertas con la maxila y premaxila alineados dorsoventralmente y el arco hioide anterior en posición ventral anormal (Cobcroft et al., 2001; Battaglene & Cobcroft, 2007). En dorada se ha registrado una mandíbula inferior deformada y sin desarrollo de la premaxila (Fernandez et al., 2008) y en barramundi, mandíbulas acortadas y retorcidas (Fraser y de Nys, 2005). La mayoría de las malformaciones en las especies marinas comercialmente cultivadas son una de las preocupaciones más importantes para la producción debido a las pérdidas económicas que causa (Boglione et al., 2013a). La manifestación de las malformaciones ocurre en diferentes etapas durante su desarrollo, desde larvas hasta juveniles (Cobcroft & Battaglene 2013). Un desarrollo mandibular anormal en la etapa larval se manifiesta de diferentes formas, incidiendo en crecimiento y sobrevivencia que puede ser letal o sub-letal, producto de una incapacidad de los peces afectados para alimentarse adecuadamente (Barahona- Fernandes, 1982; Pittman et al., 1989).

Antecedentes del desarrollo mandibular en teleósteos

La formación del esqueleto craneofacial, incluyendo el desarrollo de la compleja estructura mandibular, requiere acciones integradas de muchas vías de señalización entre células de la cresta neural y otras células que se originan desde las tres capas germinales (Szabo-Rogers et al., 2010). Los teleósteos poseen siete arcos faríngeos, donde el primero suministra los elementos de esqueleto necesarios para la formación de ambas mandíbulas (Ahí, 2016).

El tejido mandibular en los peces teleósteos está formado por cartílago y hueso, conteniendo colágenos tipo I y II (Izquierdo et al., 2013). Las estructuras del cartílago de la mandíbula son los primeros elementos esqueléticos en desarrollarse, siendo posteriormente rodeadas por células óseas formando un hueso pericondral, proceso que ocurre el día 11 en S. lalandi (Battaglene & Cobcroft, 2007). La formación de cartílago se da inicio con una proliferación del mesénquima seguido con una condensación precartilaginosa y la posterior diferenciación de condrocitos. Formado el cartílago, las células crecen continuamente y comienzan a secretar una matriz extracelular que es invadida por vasos sanguíneos del periostio, iniciando la diferenciación de condrocitos que posteriormente se hipertrofiarán. Cuando la matriz cartilaginosa se degrada, los condrocitos hipertróficos padecen apoptosis y son reemplazados por osteoblastos provenientes de la circulación, construyendo así el hueso capa por capa (Gilbert & Wood, 1997). En peces teleósteos la remodelación del hueso, necesaria para el crecimiento, ocurre por actividad osteoclástica (Witten & Villwock 1997a, 1997b; Witten et al., 2000, 2001). En los perciformes, la mandíbula se caracteriza por procesos celulares en la matriz extracelular. A lo largo de la vida del pez, tanto la 2

adecuada composición de la matriz como la remodelación continua y coordinada de ésta (producto del equilibrio entre osteoblastos y osteoclastos), son imprescindibles para la mantención de un esqueleto sano, así como para la homeostasis entre la producción de cartílago y la tasa de aposición ósea (Reznick et al, 2002; Akimenko et al., 2003; Du & Haga, 2004).

Metabolismo lipídico implicado en malformación ósea: ácido docosahexaenoico

El desarrollo de la mandíbula es una fase lábil en la etapa larvaria, siendo muy sensible a una serie de factores que pueden controlar y perturbar los procesos del desarrollo esquelético a nivel transcripcional. Esta sensibilidad puede ser útil para descifrar los mecanismos específicos detrás de los procesos asociados a deformaciones mandibulares. Varios factores nutricionales, tales como vitaminas, minerales y/o lípidos, pueden contribuir como reguladores biológicos para controlar el metabolismo en hueso y cartílago específico (Watkins et al., 1997, 2000). A ésta regulación nutricional en la esqueletogénesis se ha atribuido por su efecto en diversas familias de genes morfogenéticos que regulan el desarrollo y formación del hueso (Villeneuve et al., 2005b).

Los lípidos son la principal fuente de suministro de energía para larvas de peces (Sargent et al., 1999a, 1999b). En peces, los lípidos endógenos se sintetizan principalmente en el hígado, órgano que desempeña un papel fundamental en el metabolismo de casi todos los nutrientes. Cíclicamente, grandes cantidades de lípidos se mueven dentro y fuera del hígado transportándose a los tejidos periféricos por el torrente sanguíneo (Henderson & Sargent, 1995; Ferré & Foufelle 2010; Weil et al., 2013). En peces, la deposición de lípidos en los tejidos periféricos implica un conjunto de procesos metabólicos coordinados, incluyendo el transporte por lipoproteínas, lipogénesis, absorción en los tejidos mediada por lipoproteína lipasa, receptores endocitoticos de lipoproteínas de superficie celular o por transporte pasivo; y transportadores de membrana celular e intracelulares. Esto proporciona lípidos dietéticos a una multitud de tipos celulares, incluyendo a los condrocitos y osteoblastos (Sheridan, 1988; Tocher, 2003; Niemeier et al., 2012). A pesar de que la evidencia sugiere la importancia de los lípidos para el desarrollo y homeostasis ósea en peces, son escasos los estudios disponibles en la literatura sobre la interacción entre los transportadores de lípidos y las células óseas. Por tanto, mayoritariamente se considera evidencia extrapolada de mamíferos, dado que en peces teleósteos la composición de las lipoproteínas plasmáticas, apolipoproteínas, receptores y el sistema de transporte de lípidos extracelulares en general, son similares (Tocher et al., 2003). Sin embargo, a pesar de que la estructura y naturaleza de las apolipoproteínas, así como la composición lipídica de las lipoproteínas son bastantes similares entre mamíferos y peces, el contenido de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) es más elevado en los últimos, especialmente aquellos pertenecientes a la familia omega 3.

Al igual que en mamíferos, en peces teleósteos los ácidos grasos se han definido como indispensables para modular la transcripción de genes implicados en el metabolismo,

incluyendo al metabolismo óseo (Watersch et al., 1997). En células óseas, la acción de los ácidos grasos sobre el metabolismo se ha descrito en función de su capacidad para modular diferentes vías de señalización implicadas en el crecimiento celular en general, procesos de diferenciación, inflamación y de apoptosis (During et al., 2015). Los ácidos grasos pueden alterar la expresión/activación de diferentes factores de transcripción nuclear que juegan un papel importante en el metabolismo óseo, como el factor nuclear κB (NF-κB) y receptores activado por proliferadores peroxisomales (PPARs) (Boyce et al., 2010). Para iniciar la señalización celular, los ácidos grasos actúan a través de sensores de proteínas situados en el citosol, es decir, proteínas de unión a ácidos grasos (FABP) y PPARs. También hay receptores específicos de ácidos grasos en la superficie celular pertenecientes a la familia de receptores acoplados a proteína G. Estos últimos desempeñan un importante papel en la fisiología ósea, ya que se expresan ampliamente en la superficie de los osteoblastos y los osteoclastos (Cornish et al., 2008). Los PUFAs se han catalogado como efectores en células óseas alterando la morfología celular, la proliferación, la mineralización y los patrones de expresión génica (Viegas et al., 2012). De especial importancia resultan los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LCPUFAs) como el ácido eicosapentaenoico 20:5n-3 (EPA), ácido docosahexaenoico 22:6n-3 (DHA) y acido araquidónico 20:4n-6 (ARA). Los LCPUFAs son capaces de modular la expresión génica a nivel transcripcional de múltiples vías de señalización, citoquinas y factores de crecimiento, ya sea de forma directa o mediante los efectos de sus metabolitos bioactivos como prostaglandinas, leucotrienos, resolvinas y protectinas.

La cantidad de cada uno de los LCPUFAS, así como las relaciones entre los ácidos grasos n-3/n-6, son consideradas importantes para el crecimiento normal y el desarrollo de las larvas de peces (Izquierdo, 1996; Rainuzzo et al., 1997; Sargent et al, 1999; Izquierdo et al, 2000). Deficiencias en cantidades y proporciones de estos ácidos grasos se han implicado en la aparición de malformaciones craneales (mandibulares y operculares) en peces marinos (Kanazawa et al., 1981; Gapasin et al., 1998). En particular, el ácido docosahexaenoico (DHA), cumple un papel fundamental en el mantenimiento de la integridad estructural y funcional de las membranas celulares de los peces, y es muy importante para el desarrollo neural (Bell et al., 1995b). También se ha descrito como un efectivo promotor para el crecimiento larval, considerándoselo un posible protector del desarrollo de estructuras cartilaginosas y óseas en teleósteos. El DHA y posiblemente también otros n-3 LCPUFAs, puede elevar o conservar la masa ósea a través de estimulación de un número creciente de células madres mesenquimales (MSC) y mediante la inducción de moduladores claves, como los factores de transcripción relacionado con Runt2 (RUNX2) y Osterix en pre-osteoblastos, mejorando la diferenciación a osteoblastos maduros (Awan et al., 2008; Annema & Tietge, 2012; Zhang et al., 2002). La expresión de ambos factores de transcripción se ve reforzada por factores de crecimiento y proteína morfométrica del hueso, como resultado de las dietas ricas en EPA y DHA (Zhang et al., 2002). Además de la importante función de DHA para el metabolismo mineral a través de biomembranas, este ácido graso actúa en la formación ósea y la mineralización de la matriz extracelular. Esto último ocurriría indirectamente a través de productos metabólicos del DHA producidos en el hueso, conocidos como docosanoides (mono-di y trihidroxilados), específicamente docosatrienos, protectinas y resolvinas de la serie D, que tendrían efectos 4

intracrinos y paracrinos (Serhan, 2005). Las resolvinas inhiben la resorción ósea inducida por la inflamación y por lo tanto pueden proporcionar protección en la pérdida ósea, influyendo en los osteoclastos, mediante el receptor activado del factor nuclear κβ (RANK) controlando la osteoclastogénesis. Esto a su vez evita una prolongada resorción del hueso, mecanismo descrito como una de las causas de malformaciones esqueléticas. Se ha reportado también que estos docosanoides afectan el contenido mineral y la masa ósea en ratas (Kruger et al., 2010). Sucesivamente, estos compuestos influyen en la síntesis y acción de factores de crecimiento producidos localmente en el hueso que promueven la proliferación y diferenciación celular (Fernandes et al., 2008; Pozios et al., 2001). Deficiencias de ácidos grasos esenciales, incluido DHA, se han relacionado con la reducción en la síntesis de la matriz del tejido conectivo óseo (Collins & Chambers, 1991) y la expresión de marcadores osteogénicos como osteocalcina (Pombinho et al., 2004). En peces, poco se sabe sobre la acción de los LCPUFAs en el tejido in situ (cartílago y hueso). Sólo existe evidencia en estudios in vivo los cuales han demostrado que la alimentación con un alto nivel de lípidos dietéticos puede mejorar el desempeño del crecimiento de los peces y reducir la malformación esquelética (Cahu et al., 2003; Koven et al., 2003; Izquierdo et al., 2013). También se ha demostrado que excesivos lípidos dietéticos y proporciones desequilibradas de ácidos grasos esenciales pueden conducir a una baja supervivencia y malformaciones esqueléticas (Fernández & Gisbert, 2011; Hamre et al., 2013; Ma & Qin, 2014; Izquierdo et al., 2013). Se ha sugerido que la morfogénesis en larvas de peces puede verse alterado cambiando los lípidos dietéticos (Cahu et al., 2003).

El presente estudio, se enfoca en una malformación mandibular específica en S. lalandi, donde se evaluará a través del uso de herramienta genómica, secuenciamiento masivo (RNA-Seq), la expresión génica diferencial entre fenotipos mandibulares permitiendo descifrar los potenciales mecanismos moleculares específicos que estarían controlando y perturbando estos procesos a nivel transcripcional y a la vez se propone contrastar la expresión de este fenotipo mandibular estableciendo genes candidatos con funciones biológicas implicadas en ésta anomalía. Subsecuentemente, se propone evaluar la actividad metabólica del DHA in situ en la matriz mandibular e hígado, midiendo la expresión de estos genes candidatos obtenidos de la expresión diferencial.

Planteamiento del problema

Se ha identificado que uno de los problemas de mayor relevancia en relación a la producción de S. lalandi, es la presencia de malformaciones esqueléticas. Las principales alteraciones se observan en el desarrollo mandibular durante el período larval, lo cual genera efectos negativos para la producción debido a la incapacidad de los peces para alimentarse adecuadamente. De ésta forma, parámetros productivos importantes, como crecimiento y sobrevivencia, se ven afectados. En las deformidades óseas son varios los factores que interfieren en la morfogénesis, determinando la forma y composición de esta estructura cartilaginosa y ósea. La nutrición larvaria, particularmente a nivel de ácidos grasos poliinsaturados de la familia n-3 se ha visto asociada a la aparición de malformaciones craneales (mandíbulares y operculares) en peces marinos sometidos a déficit o excesos en la dieta, aunque la causalidad entre ácidos grasos y problemas en la 5

formación ósea es poco conocida y estudiada en Seriola lalandi. En particular, el ácido docosahexaenoico (DHA), se ha señalado como uno de los factores nutricionales que actúan en la formación ósea y la mineralización de la matriz a través de su regulación de hormonas y factores celulares conocidos como docosanoides. No obstante lo anterior, la acción in situ de este ácido graso en el tejido mandibular no ha sido estudiada en S. lalandi ni en otras especies marinas. Los antecedentes expuestos respecto al efecto del DHA en el desarrollo del tejido cartilaginoso y óseo han sido demostrados en su mayoría en experimentos in vivo en otras especies marinas, por lo que se debe considerar que la acción de cualquier factor de tipo nutricional puede variar en función de la especie y etapa de desarrollo. Debido a los escasos estudios existentes en teleósteos sobre los efectos de los factores no genéticos en el desarrollo del esqueleto, y menos aún en el tejido específico que presenta la malformación, se hace imprescindible conocer las vías moleculares que se encuentran involucradas y alteradas en la estructura mandibular deforme. El uso de herramientas genómicas, como la secuenciación masiva (RNA–Seq), nos permitirá conocer los cambios en la expresión génica asociados esta malformación mandibular a través de la expresión diferencial, entregando genes candidatos que seran evaluados bajo la acción in situ del DHA en los tejidos de estudio.

HIPÓTESIS

La incidencia de fenotipos normales y deformes en Seriola lalandi esta mediada por la disponibilidad del DHA in situ, lo cual se explica por su efecto regulador sobre la expresión génica asociada a la osteogénesis mandibular.

OBJETIVOS

Objetivo general Evaluar el efecto de distintas concentraciones de DHA sobre la expresión de genes asociados a la formación del hueso condroide mandibular considerando la información del transcriptoma de individuos normales y deformes de Seriola lalandi.

Objetivos específicos 1. Describir el transcriptoma completo en mandíbula e hígado de individuos normales y deformes de Seriola lalandi bajo condiciones de cultivo intensivo.

2. Evaluar los patrones de expresión en las distintas concentraciones DHA bajo condiciones de cultivo in vitro en tejido mandibular y hepático de juveniles de Seriola lalandi en genes candidatos asociados a deformidad mandibular.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colección de muestras biológicas

El procedimiento y manejo de los individuos se realizó de acuerdo al Comité de Bioética Animal N°10-2015, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile. Para el presente estudio se utilizaron larvas de S. Lalandi, las cuales fueron suministradas por Acuinor S.A., empresa comercial que ha desarrollado con éxito la producción completa en cautividad en un centro de producción localizado en Caldera, Región de Atacama, Chile. Dos grupos de larvas de S. lalandi procedentes de diferentes desoves del mismo lote de reproductores dentro de un mismo periodo de desove fueron cultivadas en diferentes tanques hasta 40 días post-eclosión (dpe). La densidad inicial de cultivo fue de 100 larvas/L en estanques cilíndricos (0,6 m3) bajo un sistema de recirculación de agua de mar a 21 ºC, salinidad a 35 g/L, saturación de oxígeno disuelto y fotoperíodo inducido (12L: 12D). La alimentación exógena se inició a los 3 dpe, siguiendo el protocolo de primera alimentación según Stuart and Drawbridge (2012), con modificaciones establecidas por Acuinor. El cultivo se mantuvo hasta alcanzar juveniles con 40 dpe, con una densidad de 0,0022 kg/m3 y una modalidad de co-alimentación a saciedad definido por Acuinor.

Se seleccionaron a priori dos fenotipos o grupos de juveniles, un grupo con normal crecimiento de la mandíbula inferior (normal) versus un grupo con anormal elongación de la mandíbula inferior (deforme) (Figura 1). En cada muestreo de los individuos por grupo, se registró su peso y longitud, y posteriormente se procedió a la extracción aséptica de los tejidos de estudio (mandíbula inferior e hígado) previo proceso de desensibilización en los juveniles, el cual consistió en mantenerlos en agua de mar a baja temperatura para inmovilizarlos. Un set de los tejidos extraídos fueron colocados inmediatamente en RNAlater y otro set en formalina fosfatada siendo posteriormente trasladadas las muestras al Laboratorio de Unidad de Investigaciones en Biotecnología y Genómica Animal (FAVET-INBIOGEN), Universidad de Chile, para su posterior análisis.

A B C

Figura 1. Fenotipo mandibular inferior de Seriola lalandi a los 40 dpe. A y B: anormal elongación. C: normal crecimiento.

Mediciones morfológicas de las mandíbulas

Debido a que la selección por fenotipo mandibular fue a priori en cada muestreo, se procedió a fotografiar cada juvenil por fenotipo registrándose 49 juveniles para el fenotipo normal y 41 juveniles con fenotipo deforme para su posterior análisis de medición de las longitudes de ambas mandíbulas, superior e inferior y la longitud estándar utilizando el software AxioVision 4 (ZEISS, Germany). Los puntos de referencias utilizados para la medición de las distancias entre las mandíbulas superior e inferior de cada individuo por fenotipo, se establecieron siguiendo la metodología de Sawayama & Takagi (2016), donde la longitud estándar (LS) se definió como la distancia desde la punta de la mandíbula inferior hasta al final de la hipural. La longitud de la mandíbula superior (L1) e inferior (L2) se definió como la distancia desde la punta de cada mandíbula hasta el punto final del cleithrum en el lado abdominal del pez (Figura 2). Todas las mediciones de las mandíbulas de individuos normales y deformes se compararon con respecto a la longitud estándar (Sawayama et al., 2012).

Figura 2. Puntos de referencias utilizados en las longitudes de la mandíbula superior (L1), mandíbula inferior (L2) y longitud estándar (LS).

Aislación de ARN total

La extracción de ARN total en las muestras de tejido almacenadas en RNAlater se realizó con Trizol® (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la cuantificación, se midió por fluorometría utilizando el kit de cuantificación RNA Qubit® (Life Technologies), y la pureza fue determinada por espectrofotometría de microplacas (Epoch, BioTek Instruments, USA). La integridad del ARN fue medida y evaluada usando el número de medición de la calidad del ARN (RQN) en el Fragment Analyzer, utilizando el kit para análisis ARN de sensibilidad estándar (Advanced Analytical Technologies).

Construcción de librerías ADNc y secuenciación

Se utilizaron pools de ARN desde mandíbula e hígado de juveniles para la preparación de librerías genómicas ADNc. Cada pool fue realizado con 4 juveniles (4 tejidos) de acuerdo a su fenotipo mandibular, en cantidad equimolares de ARN total por librería. Los ARNs para cada librería fueron seleccionados de acuerdo a los criterios de pureza de 260/280 entre 1.8-2.0 y la integridad de un RQN ≥ 7.5. Se elaboraron 16 librerías ADNc en total (replicadas por fenotipo y tejido), utilizando el kit mRNA-Seq Stranded KAPA (Plataforma Illumina) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midió la longitud de los fragmentos de cada librería por electroforesis capilar utilizando el kit High sensitivity NGS Fragment Analysis (Advanced Analytical) y se cuantificaron por qPCR utilizando el kit Library Quantification (Kapa Biosystems, USA) y por Qubit utilizando el kit dsDNA BR (Life Technology). Una vez seleccionadas las librerías, estas fueron secuenciadas en plataforma Miseq (Illumina) utilizando el kit v3 de 2x75 pb paired end en FAVET-INBIOGEN, Universidad de Chile.

Filtro de secuencias y mapeo contra referencia

El análisis de datos de secuenciación se realizó utilizando el software CLC Genomics Workbench (CLC bio, Denmark). Los datos crudos obtenidos de la secuenciación masiva para cada librería se filtraron por calidad (Q >30), descarte de lecturas menores a 50 pb y la eliminación de los adaptadores. Una vez obtenidas lecturas de alta calidad, estas fueron mapeadas contra un transcriptoma de referencia el cual fue desarrollado en el Laboratorio FAVET-INBIOGEN (Patel et al., 2016). Este transcriptoma de referencia fue ensamblado de novo a partir de 10 larvas de veintitrés días post eclosión de Seriola lalandi, que pertenecen a la misma población utilizada en este estudio. Los parámetros considerados en el mapeo fueron: costo mismatch de 2, costo inserto de 3, longitud mínima del contig de 180 pb, una similitud de 0.8 y una puntuación de calidad recorte de 0.05.

Análisis de expresión génica: caracterización transcriptomas y expresión diferencial entre fenotipos Para la caracterización de los transcriptomas de mandíbula e hígado se utilizó la expresión génica por conteo de lecturas normalizadas por RPKM (Lecturas por kilobases por millón de lecturas mapeadas) utilizando un corte de RPKM ≥ 1 y un mínimo de 10 lecturas mapeadas para cada tejido (Mortazavi et al., 2008). Posteriormente los transcritos se mapearon contra el transcriptoma anotado de S. lalandi y se realizó un análisis funcional en términos de ontología de genes (OGs) para explorar y resumir las categorías funcionales. Se clasificaron por términos ontológicos en las tres categorías funcionales (procesos biológicos, función molecular y componente celular). La prueba Chi-Cuadrado de Pearson se utilizó para identificar términos de OGs que diferían significativamente entre los transcriptomas de mandíbula e hígado para ambos fenotipos (p<0.05). También se realizó

el análisis de rutas publicadas en la base de datos Kegg (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) con el servidor KASS para su caracterización (Moriya et al., 2007).

En cuanto al análisis de expresión diferencial entre fenotipos en mandíbula inferior e hígado, los valores de expresión se estimaron en recuentos totales y el nivel de expresión génica se evaluó utilizando paquete edgeR (Robinson et al., 2010). El método de Benjamini-Hochberg se utilizó para controlar la tasa de descubrimiento falso (FDR) para pruebas múltiples. Se seleccionó el criterio de un FDR < 0.05 para identificar los transcritos sobreexpresados o subexpresados significativamente entre los grupos. También se realizó el análisis funcional en términos ontológicos y el de rutas por Kegg. Además se realizó un análisis de enriquecimiento ontológico de esta lista de transcritos expresados diferencialmente, mapeándolos contra el transcriptoma anotado de S. Lalandi, utilizando software Blast2GO, identificando los procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares, usando la prueba exacta de Fisher con múltiples pruebas de corrección con FDR ˂ 0.05 (Conesa et al., 2005).

Cultivo in vitro de explantes mandibular suplementado con DHA

Extracción del tejido y preparación de los explantes

Juveniles de 40 dpe de S. lalandi fueron obtenidos desde los cultivos de Acuinor S.A. proveniente de Caldera. Los juveniles fueron trasladados vivos en cajas con mangas plásticas con agua de mar saturada de oxígeno hasta el laboratorio FAVET-INBIOGEN, Universidad de Chile, Santiago.

Todos los individuos fueron desensibilizados con isougenol al 50%. Posteriormente fueron limpiados con etanol al 70 %, luego se procedió a la extracción de los tejidos utilizando material quirúrgico estéril, realizando un corte transversal en la mandíbula inferior (región del cartílago de Meckel). Las mandíbulas fueron limpiadas con buffer de perfusión HBSS- a 4ºC (Hank´s Balanced Salt Solution, sin Mg y Ca) y se transfirieron a una placa petri estéril con buffer de conservación de HBSS+ (con Mg y Ca) a 4 °C. Posteriormente se realizaron cortes manuales de 1-2 mm3 aprox. de cada mandíbula, bajo lupa, para obtener los explantes, utilizando buffer a 4°C y material quirúrgico estéril.

Previo a la incubación, los explantes fueron preparados siguiendo la metodología descrita por Koumans & Sire (1996), donde fueron lavados en tres tiempos de 3 minutos con Leibovitz-15 (L-15) y luego dos veces por 3 minutos con L-15 suplementado a 1% solución antibiótico antimicótico para prevenir contaminación bacterial y fungal.

Incubación de los explantes de mandíbula

Los explantes de mandíbula fueron incubados en medio L-15 suplementado con 1% antibiótico antimicótico (10,000 U/ml penicilina; 10,000 ug/ml estreptomicina y 25 ug/ml anfotericina B), 2mM L-glutamina, 150 ug/ml ácido ascórbico, 10 mM de HEPES (Miyake 12

& Hall, 1994; Kousman & Sire, 1996). Los explantes se incubaron a 21°C por 48 horas en placas de 24 pocillos en una incubadora con agitación a 75 rpm.

Suplementación con ácido docosahexaehoico (DHA) al medio de cultivo

El DHA (22:6 n-3) fue obtenido en solución etanol, con un ≥ 98% de pureza (Cayman Chemical, USA). Vitamina E ((+)-α-Tocopherol) fue obtenido en solución aceitosa (Sigma-Aldrich, USA). Las soluciones fueron diluidas en etanol absoluto (200- proof) a una concentración de 10 mg/ml de DHA y 0.2 M de vitamina E, siguiendo la metodología de Scholefield & Schuller (2014). La solución stock del DHA (10 mg/ml) fue mezclado con 6 mM de albumina de suero bovino (BSA, Sigma) a una proporción molar de 2:1 (DHA:BSA) antes de añadirse al medio de cultivo. La solución de vitamina E se diluyó al medio suplementado con DHA para una concentración final de 2 mM. Tanto la solución stock de DHA como la vitamina E se prepararon el mismo día del experimento.

Ensayos de exposición

Los explantes de mandíbula fueron cultivados por triplicado en medio de cultivo suplementado con dos concentraciones de DHA (20µM y 40µM) unida a albúmina de suero bovino (BSA), con el propósito de que el DHA estuviera disponible en la matriz del explante, a una razón molar de 2:1 (DHA:BSA). Se añadió un 1% de tocoferol en cada tratamiento como uso antioxidante del DHA. Se establecieron dos tratamientos en el cultivo: DHA:BSA (20µM:10µM) y DHA:BSA (40µM:20µM). Para cada tratamiento se estableció un control negativo del cultivo, sin suplementación con DHA.

Análisis de viabilidad de los explantes

Para determinar la viabilidad de los explantes en cultivo, se colectó medio de cultivo (n=4 por tiempo de muestreo) a las 6 hr, 12 hr, 24 hr y 48 hr. El medio fue almacenado a -80 °C para su posterior análisis de viabilidad celular.

La medición de la viabilidad de los explantes del cultivo se determinó a través de un ensayo del Lactato Deshidrogenasa (LDH) siguiendo la metodología de Bergmeyer & Bernt (1974) y adaptado por Schmieder et al. (2000). Brevemente, a 29 ul de medio del explante se añadió 503 ul de buffer 0.1 M K2HPO4 y 19 ul de 3.0 mM NADH. Posteriormente se mezcló y se añadió 19 ul de 22.7 mM de piruvato de sodio. Los cambios en absorbancia fueron monitoreados cada 60 segundos a 340 nm utilizando un espectrofotómetro de placas (Epoch, BioTek Instruments, USA). Los valores de la actividad de LDH se obtuvieron mediante la normalización de la absorbancia con los blancos y las tasas fueron transformadas en OD/min/ml del medio (Qingfei et al., 2013; Sato et al., 2015).

Expresión relativa de genes candidatos:

Extracción ARN y síntesis de ADNc

Para la extracción del ARN total de los explantes cultivados bajo los tratamientos, se utilizó el método Trizol® (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN total fue determinada con un fluorometro Qubit (InvitrogenTM) utilizando el kit de ensayo Qubit® RNA (Molecular Probes® InvitrogenTM). El ADN genómico fue removido con tratamiento DNase I y la transcripción reversa se realizó utilizando la enzima SuperScript II para la síntesis de la primera cadena ADN complementario (ADNc) (InvitrogenTM, Eugene, Oregon, USA). La concentración del ADNc fue determinada utilizando el kit de ensayo ssDNA Qubit® (Molecular Probes® InvitrogenTM, Eugene, Oregon, USA). Las muestras de ADNc fueron almacenadas a −20°C para su posterior uso en el protocolo RT-qPCR.

Genes candidatos: diseño de partidores

Los partidores fueron diseñados utilizando la información de las secuencias de los transcritos obtenidos de la expresión diferencial en mandíbula. Se utilizó el programa Primer-Blast NCBI y Fast PCR Primer para el diseño y verificación del tamaño del producto final. Todos los partidores fueron evaluados para la presencia de dímeros de partidores con el programa NetPrimer (PREMIER Biosoft) (Tabla 1). Para los genes de referencia se evaluó la estabilidad con los datos RT-qPCR utilizando el programa NormFinder (Andersen et al., 2004). Este programa genera un valor de estabilidad para el gen candidato de referencia considerando la variación intra e inter grupo, clasificando los genes de acuerdo a su valor de estabilidad. En este estudio se usaron b actina (actb) y proteína ligada a microtúbulos 1-cadena ligera 3B (map1b) para la normalización de datos en el análisis de expresión relativa de los genes candidatos (Anexo 1).

Tabla 1. Lista de genes candidatos (partidores) usados en el RT-qPCR para la expresión relativa en explantes de mandíbula S. lalandi.

Contig target Genes Secuencias partidores (5´-3´) Eficiencia

contig_12273 Elemento-vinculante F: TTGCTCTCTGCGTACTCTTTC 2.51

de respuesta a AMPc (CREB3) R: TTTGTTCCTCTCCCTCTCTCT

contig_53824 Proteína de transporte F: GTCCAGACAGTCCACCAAATC 2

de ácidos grasos (FATP) R: GGTGGCTTTCCTCAACACTAA

contig_1940 Proteína de unión a ácidos F: AGTCATCAAAGTTCTCGCTGGA 2.03

grasos (FABP) R:CCCTTAATGAGAAAACAGATGCTGG

Precursor integrina beta-1 contig_5993 (ITGB1) F: CTTGGATACCGCCTCTTGTATG 2.01

R: TGTACGGTGGCTCACATTTAC

Acetil-CoA sintetasa contig_9387 cadena larga (ACSL) F: GTAGTTGTACTGCAGGCCTATG 2.02

R: CAGGAGAAGATGAGAGCGATTG

Factor de crecimiento Contig1026 insulinico F: AAGAGATGGCTCAACCGATATG 2

tipo 1 (IGF-1) R: GTACTCTTCCTCTGTTCCCTTTG

Familia d que contiene el F: GAAAAGACGCGTCACAGTCG Contig1521 dominio de homología 1.92

pleckstrin d miembro 1- R: ACGGTGCCATCTATTGTGCT like (Phlda1)

Proteína dedo de zinc 2 F: GCTCGGGTATGATCTTGGGG contig_4986 (Zinc2) 2.34

R: TCTCAGTTGGTTGCGCAGAT

Referencia Beta actina (actb) F:AGGGAAATCGTGCGTGACAT 1.95

R: GCTGAAGTTGTTGGGCGTTT

Proteína asociada a microtúbulos 1-cadena F: TCATCAAGATTATCAGGAGGCG Referencia ligera 3B (map1b) 1.95

R:GGAAGCATACACCATGTAGAGG

Cuantificación RT-qPCR

La reacción de PCR se realizó por duplicado en microtubos con 10 µl de mezcla de reacción consistente en KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x), 0,2 µl de cada primer o cebador, 1 µl de cDNA (10 ng) y la diferencia de volumen se completó con agua libre de nucleasa. Las condiciones de ciclos qPCR utilizadas fueron: 3 minutos a 95°C (activación de la polimerasa); 40 ciclos de desnaturalización (3 segundos a 95°C), hibridación y extensión (20 segundos a 60°C). Los niveles de expresión génica se registraron como valores de Ct.

La cuantificación relativa usando datos qPCR de cada gen fue representado como un Qvalue (Q= EdeltaCt = E (valor menor Ct-Ct muestra)), donde E es la eficiencia del qPCR (Vandesompele et al., 2002). Los promedios de los Cts de cada replica técnica fueron calculado y transformados en valores Q y la cuantificación relativa de la expresión de los genes candidatos fueron estimados como el cociente entre valor Q del gen target y un factor normalizador, que corresponden a la media geométrica del valor Q de los dos genes de referencia.

Análisis RNA-Seq en explantes suplementados con DHA

Se construyeron librerías genómicas a partir de ARN de los tratamientos de explantes de mandíbula incubados a las 48 hr suplementado con 20 µm DHA y el control negativo (sin DHA). El mapeo de las librerías contra transcriptoma de referencia se realizó con el programa Salmon para cuantificar la expresión de transcritos (Patro et al., 2017). El conteo total fue analizado usando el algoritmo DESeq para la expresión diferencial entre los grupos de tratamientos (Anders & Huber, 2010). Se definió la lista de transcritos expresados diferencialmente con un ajustado valor de p<0.05. Posteriormente se realizó el análisis de las vías por Kegg de los transcritos expresados diferencialmente para una mayor interpretación de los resultados.

Contenido de DHA en los tejidos de estudio

Se llevó a cabo el perfil de ácidos grasos por cada fenotipo en mandíbula e hígado con el propósito de obtener el contenido del DHA. Las muestras de cada tejido previamente fueron almacenadas en formalina al 10% fosfatada y posteriormente fueron llevadas al Laboratorio de Nutrición y Fisiología de peces, Universidad Católica de Temuco.

La extracción de lípidos totales se realizó siguiendo la metodología de Folch (1957), cuantificando por gravimetría. Posteriormente se realizó la derivatización para la obtención de los esteres metílicos de los ácidos grasos (FAMEs), siguiendo la metodología de Morrison and Smith (1964), con trifloruro metanol al 14% y la resuspensión en diclorometano. Los FAMEs fueron inyectados en un cromatógrafo de gases Hewlet Packard HP 6890 para la separación y cuantificación de los ácidos grasos. Se realizó la identificación de los FAMEs por comparación de los tiempos de retención de las muestras con un estándar interno (Supelco 37 component FAME mix, Sigma) los cuales fueron

entregados en porcentaje de área. El porcentaje de ácido graso se calculó en base a la proporción del porcentaje de lípidos totales por cada muestra.

Análisis estadístico

Datos fenotípicos

Los datos obtenidos de los muestreos de los juveniles, peso y longitud total, por cada período de desove y los datos de viabilidad de los explantes cultivados in vitro fueron evaluados con una prueba de ANOVA de una vía, previa distribución normal de los datos y homogeneidad de varianza, y para observar las diferencias significativas entre fenotipos se aplicó la prueba de Tuckey (p˂0.05). Para los datos obtenidos de las mediciones morfológicas de las mandíbulas (superior e inferior) y los datos de expresión relativa en cultivo de explantes se utilizó la prueba t Student para muestras independientes previa distribución normal de los datos. Los valores se consideraron significativamente diferentes cuando p<0.05. En cuanto al análisis de los contenidos de ácidos grasos en la mandíbula e hígado, se utilizó la prueba z para media de dos muestras, donde los valores de p<0.05 se consideraron significativos.

En la prueba de t que se aplicó para la medición de la mandibula inferior (L2) y en la expresión relativa del gen phdla se procedió a transformar los datos utilizando la función de la raíz cuadrada para cumplir con el supuesto de la homogeneidad de varianza.

RESULTADOS

Objetivo específico n°1: Describir el transcriptoma completo en mandíbula e hígado de individuos normales y deformes de Seriola lalandi bajo condiciones de cultivo intensivo.

Para llevar a cabo el análisis transcriptomico, un total de 158 juveniles de Seriola lalandi fueron recolectados a los 40 dpe durante el periodo del desove. En el primer muestreo del periodo de desove, los juveniles normales recolectados tuvieron un peso promedio de 0.68 ± 0.03g, mientras que los deformes alcanzaron en promedio un menor peso, 0.40 ± 0.03 g, mostrando diferencias significativas por fenotipo (Anexo 2, F= 30.850, gl=1, 76, p˂ 0.05). En cuanto a la longitud total, los juveniles normales en promedio mostraron un mayor crecimiento que los deformes, 3.59 ± 0.07mm y 3.05 ± 0.09 mm respectivamente, observándose diferencias significativas en longitud total entre fenotipos (Anexo 2, F= 21.087, gl=1, 76, p˂ 0.05). En el segundo muestreo del periodo de desove, los juveniles normales alcanzaron en promedio un mayor peso que los deformes, 1.09 ± 0.33g y 0,66 ± 0,33g respectivamente, observándose diferencias significativas entre los fenotipos (Anexo 2, F=42,350, gl=1,39, p˂ 0.05). En tanto, la longitud total promedio de los juveniles normales fue de 4.53 ± 0.08mm y en los deformes de 3.82 ± 0.11mm, mostrando diferencias significativas entre los fenotipos (Anexo 2, F=25.210, gl=1, 39, p˂ 0.05). En ambos muestreos del periodo del desove, los juveniles con fenotipo mandibular normal obtuvieron los mayores crecimientos en peso y longitud total comparados con los juveniles con fenotipo mandibular deforme.

Los resultados mostraron que el porcentaje de la longitud relativa estándar respecto a la mandíbula superior no mostró diferencias significativas entre fenotipos (Anexo 3, t=0.819, gl=88 p<0.05). En tanto, el porcentaje de la longitud relativa estándar respecto a la mandíbula inferior mostraron diferencias significativas entre fenotipos (Anexo 3, t=-3.334, gl=88, p<0.05). Estos resultados corroboraron los fenotipos mandibulares estableciendo la deformidad mandibular como una elongación anormal de la mandíbula inferior respecto a la mandíbula superior (Figura 3).

A) 35 30

25 20 15

%LS (L1) %LS 10 5 0 Normal Deforme

B) 35 * 30

25 20 15

%LS (L2) %LS 10 5 0 Normal Deforme

Figura 3. Porcentaje de la longitud relativa estándar respecto a la mandíbula superior (A) e inferior (B) por fenotipo. Valores se presentan en promedio y error estándar. * Diferencias significativas (p ˂0.05).

Caracterización de los transcriptomas

Desde la secuenciación masiva se obtuvo un total de 190 millones de lecturas en mandíbula y un total de 173 millones de lecturas en hígado, con un tamaño promedio de lectura de 75 pb. Del total de lecturas secuenciadas, un 99,4 % en promedio resultaron del proceso de filtración para la obtención de lecturas de alta calidad en el tejido mandibular y un 99,3 % promedio de lecturas filtradas fueron obtenidas para el hígado, donde en ambos tejidos se obtuvieron un tamaño promedio de lectura de 73 pb. El mapeo se realizó con las réplicas por separado obteniendo un total de 17.309.900 (89,13%) lecturas mapeadas para

mandíbula normal, 20.457.971 lecturas totales (89,73 %) mapeadas para mandíbula deforme, 19.368.980 (91,34 %) lecturas totales mapeadas para hígado normal y 16.611.203 (91,53 %) lecturas mapeadas para hígado deforme (Anexo 4).

Mandíbula inferior

Para la caracterización de la mandíbula se utilizaron un total de 18.678 transcritos normalizados por RPKM mayor a 1 obtenidos desde el mapeo. De esta lista de transcritos normalizados, la clasificación por términos ontológicos arrojó 23 términos para proceso biológico, 13 términos para componente celular y 14 términos para función molecular. Los procesos biológicos más representados fueron para proceso celular (16,4%), proceso metabólico (13,4%), regulación biológica (8,9%), pigmentación (8,2%), proceso de desarrollo (6,3%) y organización de componentes celulares (5,2%). En el componente celular fueron para célula (16,1%), parte celular (16,1%), organelo (10,8%), parte de organelo (6,2%), complejo macromolecular (4,6%) y membrana- lumen cerrado (2,5%). En cuanto a la función molecular fueron para unión (14,2%), actividad catalítica (10,1%), actividad del transductor molecular (1,2%) y la actividad de transporte (1,1%) (Figura 4A).

Para complementar la caracterización, se utilizaron los transcritos con KO para la categorización funcional mediante el análisis de las vías por Kegg. Se asignaron un total de 8433 transcritos con números de la Comisión de Enzimas (EC) que se categorizaron en diferentes grupos funcionales de anotación Kegg. Se asignaron 1557 KOs para el metabolismo donde la mayoria se clasificaron en metabolismo de carbohidrato (291 KOs), metabolismo aminoacidos (242 KOs) y metabolismo lipídico (250 KOs). En adición, 1024 KOs fueron asignados para procesamiento de información genética que incluye traslación (356 KOs), plegado, clasificación y degradación (347 KOs) y para replicación y reparación (163 KOs). Para la categoría de procesamiento de información ambiental se asignaron 2106 KOs siendo representados para transporte de membrana (22 KOs), transducción de señales (1866 KOs) y para moléculas de señalización e interacción (218 KOs). En proceso celular se asignaron 1635 KOs, siendo para catabolismo y transporte (559 KOs) y para muerte y crecimiento celular (601 KOs). Para la categoría de sistemas organismales se asignaron 2784 KOs, donde la gran mayoría fue representada para sistema inmune (821 KOs), sistema endocrino (745 KOs) y para sistema digestivo (191 KOs) (Anexo 5).

La comparación de ambos transcriptomas mandibulares, normal y deforme no mostraron diferencias significativas en el porcentaje genes asociados a terminos ontologicos (Figura 5A).

Hígado

Para la caracterización del hígado, se utilizaron un total de 11687 transcritos normalizados por RPKM mayor a 1. De esta lista de transcritos normalizados, la clasificación por términos ontológicos mostró una asignación de 23 términos para proceso biológico, 13 términos para componente celular y 13 términos para función molecular. Los procesos biológicos más representados fueron para proceso celular (17,7%), proceso

metabólico (16,1%), regulación biológica (8,7%), pigmentación (7,9%), proceso de desarrollo (6%) y componente celular organización (4,8%). En el componente celular fueron para célula (17,3%), parte celular (17,3%), organelo (12,1%), parte de organelo (6,9%), complejo macromolecular (5,4%) y membrana- lumen cerrado (2,7%). En la función molecular fueron para unión (15,1%), actividad catalítica (12,4%), actividad de molécula estructural (1,2%) y actividad de transporte (1,1%) (Figura 4B).

Para complementar la caracterización por las vías Kegg, se asignaron un total de 6184 transcritos con números de la Comisión de Enzimas (EC) que los categorizaron en diferentes grupos funcionales de anotación Kegg. Un total de 1507 transcritos anotados estuvieron involucrados en el metabolismo, siendo la mayoría representado en metabolismo de carbohidratos (282 KOs), metabolismo lipídico (237 KOs), metabolismo de aminoácidos (257 KOs), biosíntesis y metabolismo de glicanos (147 KOs) y metabolismo energético (136 KOs). Un total de 922 transcritos se clasificaron como procesamiento de información genética, que se agruparon en traducción (346 KOs); plegado, clasificación y degradación (321 KOs), replicación y reparación (101 KOs) y transcripción (154 KOs). Un total de 1566 transcritos anotaron para el procesamiento de información ambiental donde la mayoría fueron para transducción de señales (1424 KOs) y moléculas de señalización e interacción (123 KOs). En el proceso celular, un total de 1302 transcritos anotaron en su mayoría para transporte y catabolismo (513 KOs), crecimiento y muerte celular (432 KOs) y eucariotas de la comunidad celular (273 KOs). Un total de 2121 transcritos fueron clasificadas en sistemas orgánicos donde la mayoría fueron para sistema inmune (631 KOs), sistema endocrino (573 KOs), sistema nervioso (269 KOs) y sistema digestivo (170 KOs) (Anexo 6).

La comparación de ambos transcriptomas de hígado, normal y deforme, no mostraron diferencias significativas en el porcentaje de genes por términos ontológicos (Figura 5B).

Los resultados de la caracterización entregaron información de la expresión de los transcritos implicados en cada tejido y su uso como referencia en estudios a futuro en S. lalandi. Dada la importancia económica de éste recurso y la escasa información disponible en ésta especie, resulta necesario su estudio para conocer los genes que se trascriben en este organismo y más específico, en el tejido de interés. Se determinó los términos ontológicos asociados a cada uno de los tejidos, destacando en hígado los procesos metabólicos como catabólicos y biosintéticos y procesos metabólicos celular. Por otra parte, en mandíbula destaca el proceso celular como organización de proyección celular, movimiento celular y organización de estructura extracelular; y en proceso de desarrollo destacan estructura anatómica morfogénesis y parte de región extracelular, los cuales son propios de un tejido óseo. Los resultados mostraron las vías transcripcionalmente activas en ambos tejidos. Los transcriptomas descritos anteriormente proporcionan información importante relacionada con diversos procesos de interés para su estudio en nutrición y crecimiento, no sólo para conocer la biología básica de este organismo, sino que también asociado a la producción de éste recurso marino.

Expresión diferencial entre fenotipos: genes candidatos

Para la obtención de los genes candidatos asociados a la deformidad utilizados en la expresión relativa en el cultivo de explantes suplementados con DHA, se analizó la expresión diferencial entre fenotipos mandibulares y su respectivo hígado. En el análisis de expresión diferencial se detectaron 1445 transcritos expresados diferencialmente entre los fenotipos normal y deforme en mandíbula (FDR < 0.05). De estos, 1387 transcritos fueron sobreexpresados y 58 transcritos fueron subexpresados en individuos deformes respecto a los individuos normales (Anexo 7). En el caso del hígado no mostró transcritos expresados 23

diferencialmente por lo que no se llevó a cabo el cultivo in vitro en éste tejido. Los genes candidatos fueron seleccionados por su función en cuanto al transporte de ácidos grasos y su función osteogénica de acuerdo al objetivo del estudio para ser utilizados en la medición de la expresión relativa en los explantes de mandíbula suplementados con DHA (Tabla 1).

Enriquecimiento ontológico y rutas Kegg de los transcritos expresados diferencialmente

De la lista obtenida de los transcritos expresados diferencialmente en mandíbula, para una mayor comprensión de los procesos implicados en esta malformación, primero se identificaron en términos ontológicos en las tres categorías (procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares). Un total de 1150 transcritos contaban con anotación (79,6% del total) los cuales fueron asignados para 520 términos de Ontología de Genes en las tres categorías. Se asignaron un total de 21 términos para el proceso biológico, 11 términos para el componente celular y 9 términos para función molecular. Los procesos biológicos más representados fueron para proceso metabólico (18,5%), proceso celular (13,8%), regulación biológica (6,6%), proceso del organismo multicelular (5,8%), proceso de desarrollo (4,7%) y pigmentación (4,6%). En el componente celular fueron representados para celular (12,2%), parte celular (12,2%), organelo (5,6%), región extracelular (3,9%) y parte de organelo (3,9%). En la función molecular fueron mayoritariamente representados en actividad catalítica (17,2%), unión (14,5%), actividad del transportador de electrones (1,7%) y actividad de transporte (1,7%) (Figura 6).

Otra interpretación que se realizó con los transcritos expresados diferencialmente que contaban con KOs fue a través de su categorización funcional y anotación mediante el análisis de vías con Kegg. Se asignaron un total de 668 secuencias con números de la Comisión de Enzimas (EC) que categorizaron en diferentes grupos funcionales de anotación Kegg. Un total de 410 transcritos anotados estuvieron involucrados en el metabolismo, siendo la mayoría representado en el metabolismo de carbohidratos (77 KOs), metabolismo de los lípidos (80 KOs) y el metabolismo de los aminoácidos (90 KOs). Solo 15 transcritos se clasificaron en procesamiento de información genética, los cuales se agruparon en traducción (5 KOs), replicación y reparación (6 KOs) y plegamiento, clasificación y degradación (4 KOs). Un total de 137 transcritos anotaron fueron para procesamiento de la información ambiental donde la mayoría fueron representados en transducción de señales (100 KOs) y moléculas de señalización e interacción (30 KOs). En los procesos celulares (84 KOs), los transcritos anotados fueron para el transporte y el catabolismo (34 KOs), eucariotas de la comunidad celular (22 KOs) y el crecimiento y muerte celular (19 KOs). Para los sistemas orgánicos (314 KOs), la mayoría de los transcritos se asignaron para sistema inmune (68 KOs), sistema endocrino (89 KOs) y sistema digestivo (99 KOs) (Anexo 8).

Al analizar el mapeo por Kegg, una de las vías de señalización más representada fue la de receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR). Este receptor nuclear de hormonas es activado por ácidos grasos y sus derivados. En esta vía se observaron genes target del metabolismo de lípidos como aquellos que participan en el transporte de lípidos,

metabolismo del colesterol, transporte de ácidos grasos en la membrana y citosol de la célula y oxidación de ácidos grasos (Figura 7).

La vía del metabolismo del colesterol muestra el esquema general del transporte de lípidos vía circulación sanguínea y su distribución hacia el tejido periférico, donde en algunos estudios in vitro han sugerido un papel directo del colesterol en las células óseas (Figura 8). Otra vía de señalización que mostró el mapeo por Kegg en el componente de la matriz del tejido mandibular fue la representada por la interacción matriz-receptor extracelular indicando la presencia de los genes como colágeno, integrinas, laminina, fibronectina, proteoglicano (Figura 9). Otra vía que mostro el mapeo por Kegg y que se relaciona con el crecimiento óseo fue la de diferenciación de osteoclastos, aunque con pocos genes, mostrando la actividad de remodelación en el tejido óseo en la mandíbula de Seriola lalandi (Figura 10).

Figura 6. Asignaciones de Ontología de Genes (términos ontológicos nivel 2) en secuencias transcriptomicas de los transcritos expresados diferencialmente en mandíbula en Seriola lalandi. Clasificación por categoría: procesos biológicos, función molecular y componente celular.

Figura 7. Vía de señalización del Receptor Activado por el Proliferador de Peroxisoma mapeado por Kegg. Los recuadros amarillos indican aquellos genes provenientes de la expresión diferencial en mandíbula y que están presentes en esta vía.

Figura 8. Metabolismo del colesterol mapeada por Kegg. Los recuadros verdes indican aquellos genes provenientes de la expresión diferencial en mandíbula y que están presentes en esta vía.

Figura 9. Interacción matriz-receptor extracelular mapeada por Kegg. Los recuadros verdes indican aquellos genes provenientes de la expresión diferencial en mandíbula y que están presentes en esta vía.

Figura 10. Diferenciación de osteoclastos mapeada por Kegg. Los recuadros verdes indican aquellos genes provenientes de la expresión diferencial en mandíbula y que están presentes en esta vía.

El análisis de enriquecimiento realizado a partir de los términos ontológicos provenientes de la expresión diferencial en mandíbula, evidenció 46 términos sobrerrepresentados (FDR <0.05). Dentro de las distintas categorías enriquecidas se encontraron 25 términos para procesos biológicos, 19 términos para función molecular y solo 2 términos para la categoría de componente celular (Anexo 9). Los términos sobrerrepresentados para la categoría de los procesos biológicos se asignaron para procesos de oxidación-reducción, representado por un grupo de enzimas que participa en la síntesis de colesterol, crecimiento óseo y metabolismo del calcio, procesos metabólicos de lípidos y vías metabólicas de esteroide. Para el proceso de transporte de lípidos se asignaron los transportadores ABC (ABCA1 y ABCA5), proteínas transmembrana que utilizan la hidrólisis del ATP para facilitar el movimiento de una amplia variedad de sustratos a través de la membrana celular y un grupo de apolipoproteínas que también fueron asignadas para procesos metabólicos de lipoproteínas.

Figura 11. Enriquecimiento significativo en términos ontológicos de los procesos biológicos en mandíbula de Seriola lalandi.

Objetivo n° 2: Evaluar los patrones de expresión en las distintas concentraciones DHA bajo condiciones de cultivo in vitro en tejido mandibular de juveniles de Seriola lalandi en genes candidatos asociados a deformidad mandibular.

Previo a la medición de expresión relativa, se midieron los niveles de liberación de LDH en medios recolectados del cultivo de 4 explantes distintos de mandíbulas S. lalandi en diferentes puntos de tiempo de incubación. Los explantes mandibulares suplementados con ambos concentraciones de DHA en los tiempos de incubación a 6 h, 12 h, 24 y 48 h no mostraron diferencias significativas, por lo tanto la liberación de LDH al medio fue constante para todos los tiempos de incubación (Figura 12). Solo se presentó diferencias significativas en viabilidad con los controles (sin DHA) (p <0.05) (Anexo 10). Por lo tanto la viabilidad se mantuvo constante entre las diferentes horas de incubación con DHA.

0,35 0,30 0,25 0,20

0,15

LDH (OD/min/ml) LDH

0,10 0,05 0,00 Liberación 6 12 24 48 control Tiempo incubación

a 0,4 a 0,35 a 0,3 0,25 b 0,2 0,15 0,1

0,05 Liberación LDH (OD/min/ml) LDH Liberación 0 6 12 24 48 control Tiempo incubación

Figura 12. Viabilidad de explantes de mandíbula de Seriola lalandi incubación con DHA durante 6 h, 12 h, 24 h, 48 h y control. (A) Explantes suplementados con 20 µM DHA y (B) Explantes suplementados con 40 µM DHA. Los valores son expresados en promedio y error estándar. Los grupos etiquetados con las mismas letras no son significativamente diferentes.

Análisis de expresión relativa de genes candidatos

La expresión relativa de genes involucrados en el transporte de ácidos grasos mostró diferencias significativas en la regulación al aumento de la proteína de transporte Fabp en explantes expuestos a 20 y 40 μM de DHA comparados con el control sin suplementación de DHA (Figura 13, Anexo 11). En cuanto a la expresión de los genes implicados en la formación ósea, no se encontraron diferencias significativas en explantes suplementados en ambas concentraciones de DHA comparado con el control (Figura 14, Anexo 12).

A Suplementacion DHA Control

4 * 3

Expresión Relativa Expresión 1

0 Fabp Fatp ACSL

B Suplementacion DHA Control

4 * 3

Expresión Relativa Expresión 1

0 Fabp Fatp ACSL

Figura 13. Expresión relativa del “set” de genes involucrados en el transporte de ácidos grasos. Explantes de mandíbula expuestos a 20 µM DHA (A) y 40 µM DHA (B) durante 48 hrs incubación. Los valores son expresados en promedio y error estándar. Valores de expresión normalizados. *Diferencias significativas (p ˂0.05).

A Suplementacion con DHA Control 5

2 Expresión Relativa Expresión 1

0 Phdla Zinc2 IGF-1 Ig Creb3

B Suplementacion con DHA Control 5

2 Expresión Relativa Expresión 1

0 Phdla Zinc2 IGF-1 Ig Creb3

Comparación en la expresión diferencial por RNA-Seq entre cultivo in vivo y cultivo in vitro

La expresión diferencial entre los explantes cultivados con 20 um DHA y el control, mostro un total de 3516 transcritos sobreexpresados, 3925 transcritos subexpresados y 22619 transcritos remanentes. Se realizó la comparación de los transcritos expresados diferencialmente en mandíbula proveniente de cultivo in vivo y cultivo in vitro. Se encontraron 147 transcritos concordantes entre ambos cultivos (Anexo 13). Se asignaron un total de 108 secuencias con números de la Comisión de Enzimas (EC) categorizados en diferentes grupos funcionales de anotación Kegg. Un total de 96 transcritos anotados estuvieron involucrados en el metabolismo, entre los cuales la mayoría fueron representados en metabolismo de carbohidrato (19 KOs), metabolismo de los lípidos (17 KOs), metabolismo de los aminoácidos (15 KOs) y metabolismo de cofactores y vitaminas (13 KOs). Solo un transcrito fue clasificado para procesamiento de información genética siendo plegamiento, clasificación y degradación (1 KO). Un total de 32 transcritos anotaron para procesamiento de la información ambiental donde la mayoría fueron para transporte membrana (16 KOs) y transducción de señales (11 KOs). En los procesos celulares (21 KOs), los transcritos estuvieron involucrados en transporte y el catabolismo (12 KOs), eucariotas de la comunidad celular (4 KOs) y el crecimiento y la muerte celular (2 KOs). Para los sistemas organismal (39 KOs), la mayoría de los transcritos se asignaron para sistema endocrino (17 KOs), sistema digestivo (9 KOs) y sistema inmune (6 KOs) (Anexo 14). En el mapeo por Kegg, una de las vías más representada en termino KO fue para la señalización de receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR) encontrándose los transcritos que codificaron para proteínas de transporte de ácidos grasos (FATP), proteínas de unión a ácidos grasos (FABP), transcrito involucrado en el metabolismo del colesterol (Esterol 12-alfa-hidroxilasa), transcritos involucrados en el transporte de ácidos grasos (lipoproteína lipasa y acil-CoA sintetasa de cadena larga) y en oxidación de ácidos grasos (Acil-CoA oxidasa y Fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (GTP)) (Figura 15). Otras vías fueron la interacción receptor-matriz extracelular con la fibronectina (Figura 16) y Peroxisoma (Figura 17).

Figura 15. Vía de señalización del Receptor Activado por el Proliferador de Peroxisoma mapeado por Kegg. Los recuadros verdes indican aquellos genes presentes en la vía provenientes del análisis de concordancia entre el cultivo in vivo y cultivo in vitro suplementado con DHA.

Figura 16. Interacción receptor-matriz extracelular mapeado por Kegg. Los recuadros verdes indican aquellos genes presentes en la vía provenientes del análisis de concordancia entre el cultivo in vivo y cultivo in vitro suplementado con DHA.

Figura 17. Peroxisoma mapeado por Kegg. Los recuadros verdes indican aquellos genes presentes en la vía provenientes del análisis de concordancia entre el cultivo in vivo y cultivo in vitro suplementado con DHA.

Contenido de DHA en tejidos de estudio

El tejido mandibular inferior presentó un 4,9 % de lípidos totales promedio en el fenotipo normal y un 3,34% en deforme (Tabla 2). De éste porcentaje de lípidos totales, el contenido en porcentaje de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados no presentaron diferencias significativas entre los fenotipos. En relación a los poliinsaturados de cadena larga, ARA y EPA, no mostraron diferencias significativas entre los fenotipos. El contenido de DHA en mandíbula presentó diferencias significativas entre los fenotipos (p=0.04) donde el tejido mandibular deforme arrojó un porcentaje de 0,22% de DHA y el tejido normal arrojó un 0,49% de DHA (Anexo 14).

Para el caso del hígado, el contenido de lípidos totales promedio fue de 12,77% en el fenotipo normal y un 13,71% en el fenotipo deforme (Tabla 2). El porcentaje de ácidos grasos expresados en proporción de lípidos totales mostro que los totales de ácidos grasos saturados, monoinsaturados y poliinsaturados no arrojarón diferencias significativas entre los fenotipos ni tampoco respecto a los porcentajes de ARA, EPA y DHA (Anexo 15).

Tabla 2. Porcentaje de ácidos grasos en proporción del porcentaje de lípidos totales en ambos tejido de estudio (n=2). * Diferencias significativas (p<0.05).

MANDÍBULA HÍGADO

Normal Deforme Normal Deforme

% Lípidos totales 4,95 ± 1,97 3,34 ± 1,52 12,77 ± 0,89 13,71 ± 0,40

Total ácidos 2,11 ± 0,66 1,51 ± 0,80 6,41 ± 0,61 5,09 ± 0,35 Grasos Saturados

Total ácidos Grasos 1,51 ± 0,92 0,85 ± 0,39 3,76 ± 0,43 3,63 ± 0,13 Monoinsaturados

Total ácidos Grasos 1,32 ± 0,38 0,72 ± 0,31 3,38 ± 0,50 3,74 ± 0,65 Poliinsaturados

ARA 0,09 ± 0,02 0,05 ± 0,01 0,14 ± 0,017 0,14 ± 0,02

EPA 0,37 ± 0,12 0,15 ± 0,05 1,06 ± 0,13 1,13 ± 0,31

DHA 0,49 ± 0,11* 0,22 ± 0,07* 0,50 ± 0,07 0,59 ± 0,19

*Valores se presentan en promedio y error estándar.

DISCUSIÓN

Caracterización de los transcriptomas por tejido y expresión diferencial entre fenotipos

La caracterización de los transcriptomas tuvo como propósito entregar información útil para futuros estudios en Seriola lalandi y a la vez verificar que las vías estuvieran transcripcionalmente activas en cada tejido para llevar a cabo el presente estudio. En mandíbula se mostraron vías transcripcionalmente activas propias del tejido como la vía de desarrollo, específicamente la diferenciación de osteoclastos y formación axis dorso- ventral, la vía del sistema endocrino como la señalización de los receptores nucleares PPARs involucrados en el metabolismo de ácidos grasos, y la vía de interacción y moléculas de señalización tales como la interacción receptor citoquina-citoquina, interacción receptor de la matriz extracelular y moléculas de adhesión. En cuanto al hígado, se mostraron transcripcionalmente activas las vías del metabolismo de lípidos, tales como la biosíntesis de ácidos grasos, elongación de ácidos grasos, metabolismo del ácido araquidónico, ácido linoleico, ácido α linolénico y la biosíntesis de los ácidos insaturados, y la vía del sistema endocrino como la señalización de PPARs. Las vías descritas anteriormente para ambos tejidos son de gran interés para el propósito del presente estudio relacionado con la formación ósea y el metabolismo lipídico.

Junto con la caracterización, se analizó la expresión diferencial de los transcritos entre fenotipos para mandíbula e hígado de S. lalandi con el objetivo de seleccionar genes candidatos asociados a esta deformación para medir su expresión in vitro. Debido a que el hígado no presentó expresión diferencial, sólo seleccionamos genes candidatos desde mandíbula para ser utilizados en el cultivo de explantes que se realizó posteriormente. Para un mayor aporte al estudio, se analizó la lista de transcritos expresados diferencialmente en mandíbula, con el propósito de poder descifrar los potenciales mecanismos moleculares involucrados en esta anomalía a nivel transcripcional, considerando que las malformaciones mandibulares en la producción de juveniles de S. lalandi afectan entre un 12-30% en el cultivo (Cobcroft et al., 2004; Sakakura, 2004; Moran et al., 2011).

La información aportada por la expresión diferencial de los transcritos entre fenotipos mandibulares mostró transcritos sobreexpresados en peces deformes asociados a la vía de formación de la matriz extracelular, específicamente proteínas estructurales básicas de la matriz del tejido como el colágeno (Col2a1 y Col6a6), el proteoglicano aggrecan, las moléculas de adhesión como integrina β (ITGB1) y un grupo de caderinas, todos componentes predominantes en la matriz. En el caso del Col2a1, se ha demostrado que este gen participa en la diferenciación de condrocitos y la formación del cartílago, y también se ha implicado su rol en el crecimiento craneofacial (Garofalo et al., 1991; Richards et al., 2010). Se ha reportado que polimorfismo en este tipo de colágeno puede conducir a un crecimiento anormal del cóndilo mandibular en humanos, evidenciando la asociación de este gen con el prognatismo mandibular, fenotipo similar descrito en nuestro estudio (Xue et al., 2014). También se ha descrito que la expresión del Col2a1 está 39

directamente regulada por la proteína Sox9, la cual participa en la morfogénesis y crecimiento mandibular, y se ha reportado que una regulación anormal del Col2a1 durante la condrogénesis causa anomalías esqueléticas en ratones (Bell et al., 1997; Montenegro & Rojas, 2007). Col6a6 participa en la formación del cartílago actuando en las microfibrillas elásticas (Kielty and Grant, 2002; Bonaldo et al., 1989). Aggrecan es un proteoglicano el cual es secretado continuamente por condrocitos en la matriz del cartílago, y es estimulado por el factor de transcripción Sox9 al igual que el Col2a1 (Seibel et al., 2006; Hu et al., 2012; Kronenberg, 2003). En cuanto al grupo de moléculas de adhesión de la matriz, ITGβ1 y caderinas (CDHR2, CDHR17 y CDHR5), se encuentran presentes tanto en cartílago como el hueso. Por lo tanto, la sobreexpresión de estas proteínas estructurales se condice con el fenotipo anormal de la mandíbula inferior, descrita como elongación anormal o crecimiento excesivo de la matriz ósea.

Otro grupo de transcritos que se sobreexpresaron en individuos con mandíbula deforme y que están presentes en las vías de señalización del crecimiento óseo fueron el indian hedgehog (Ihh), receptor de la hormona paratiroidea (PTH/PTHrP), factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23), factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IFG-1), dominio de homología pleckstrin familia a miembro 1 (phlda1) y proteína del dedo de zinc 2 (Zic2). Ihh ha sido implicado en la maduración y diferenciación de condrocitos en vertebrados terrestres (Goldring et al., 2006; Vortkamp et al., 1996), y en teleósteos, está presente en condrocitos hipertróficos de elementos cartilaginosos de la corteza craneofacial y en el endoesqueleto de aleta en el pez cebra (Avaron et al., 2006). En ratones, se ha demostrado que Ihh tiene efectos sobre las propiedades funcionales de los elementos de la mandíbula, respecto al desarrollo apropiado de la articulación mandibular y la osificación y elongación de la mandíbula (Shibukawa et al., 2007; Abzhanov et al., 2007). En el pez cebra, una función alterada y la expresión temporal de los componentes de la cascada de señalización de las proteínas Hedgehog (Hh) se han relacionado con una variedad de malformaciones en elementos esqueléticos (Schwend & Ahlgren, 2009; Schwend et al., 2010; Swartz et al., 2012). PTH / PTHrP se ha implicado en vías de señalización que controla la osteoblastogénesis (Datta & Abou-Samra, 2009) y se ha atribuido un efecto anabólico en la formación ósea (Esbrit & Alcaraz, 2013). PTHrP ha mostrado ser necesario para mantener a los condrocitos en un estado proliferativo y retrasar su diferenciación en condrocitos hipertróficos, a través de interacciones con las rutas de las proteínas morfogénica del hueso (BMP) e Ihh (Minina et al., 2001). FGF23 se ha involucrado en la morfogénesis esquelética y se ha considerado un gen causal del prognatismo mandibular en humanos (Chen et al., 2015). En teleósteos, FGF23 se expresa en los corpúsculos de stannius y contribuye a la homeostasis de calcio y fosfato, lo que es fundamental para mantener la integridad de la matriz ósea (Vieira et al., 2013). IGF-1 es uno de los reguladores principales del crecimiento óseo y responsable del tamaño corporal en mamíferos (Lupu et al., 2001) y teleósteos (Duan, 1998; Wargelius et al., 2005). Actúa como un regulador en la función de las células del hueso estimulando la proliferación de pre-osteoblastos, aumentando el número de células capaces de producir la matriz ósea. IGF- 1 se ha observado que aumenta la expresión del colágeno, principal componente estructural del hueso (Schmid et al., 1992; Delany et al., 1994). El gen Phlda1 se ha asociado con osteoporosis intermedia autosómica recesiva reflejando un prognatismo mandibular en 40

humanos (Neville et al., 2015). Un estudio de asociación realizado en Dicentrarchus labrax evidenció un gen codificante de la proteína phlda1 en individuos con prognatismo mandibular (Babbucci et al., 2016). Éste estudio también mostró que Zic2, gen clave en la morfogénesis craneofacial, redujo su expresión significativamente en juveniles afectados con prognatismo mandibular, contrario a lo observado en S. lalandi donde se sobreexpresó este gen.

Otros transcritos sobreexpresados en individuos deformes fueron los transportadores de ácidos grasos, FABP, FATP, FATCD36 y VLACS. Los ácidos grasos pueden ingresar a la célula del tejido target por varias vías. La evidencia indica que los ácidos grasos de cadena larga pueden ser transportados a través de la membrana celular mediante proteínas de membrana de unión a ácidos grasos (FABP) que se unen con enzima VLACS y proteínas de transporte (FATP, FATCD36) que cumplen tanto un papel facilitador como regulador en el proceso de captación de ácidos grasos celulares. La homeostasis lipídica requiere un ajuste del transporte y la utilización de ácidos grasos por parte de los tejidos metabólicamente activos. Las alteraciones en el metabolismo de los lípidos probablemente influirán en el funcionamiento de los transportadores de ácidos grasos, mientras que los cambios en el contenido del transportador de ácidos grasos o el funcionamiento inducido por la dieta pueden tener un impacto en el metabolismo lipídico de todo el cuerpo y provocar un estado patológico (Schwenk et al., 2010).

En el análisis de enriquecimiento de los términos ontológicos, los procesos biológicos mostraron los procesos metabólicos de lipoproteínas y transporte de lípidos, donde la mayoría fueron representados por un grupo de apolipoproteínas (Apos), encontrándose ApoAI, ApoB100, ApoCII, Apoeb, ApoAIV y ApoF y por la sub-familia de cassette unión-ATP miembro 1 y 5 (ABCA1 y ABCA5). Las lipoproteínas funcionan como portadores plasmáticos de los lípidos y la absorción de lipoproteínas celulares depende de la interacción de apolipoproteínas con sus respectivos receptores de lipoproteínas de superficie de células endocitóticas (Niemeier et al., 2012). La escasa evidencia disponibles en mamíferos demuestra que en el proceso de diferenciación osteoblástica, algunas apolipoproteínas son inducidas (Roman-Roman et al., 2003). Un estudio realizado por Gui et al. (2012) analizó la expresión génica de varias apolipoproteínas durante la diferenciación osteoblástica in vitro. Los resultados mostraron que todas las apolipoproteínas se expresaron durante el proceso de diferenciación de osteoblastos donde la ApoE mostró una alta expresión, coincidiendo con los resultados obtenidos por Schilling et al. (2005). Sin embargo, un estudio de Hirasawa et al. (2007) mostró que una deficiencia del gen ApoE redujo la formación ósea inducida por una dieta rica en grasa. Por el contrario, se ha señalado que una deficiencia de ApoE conduce a un fenotipo aumentado en la masa ósea en ratones (Niemeier et al., 2012), lo que eventualmente se contradice con los resultados obtenidos en nuestro estudio, donde éste fenotipo de alargamiento de mandíbula inferior que se podría definir como aumento en la masa ósea, mostró una sobreexpresión de ésta apolipoproteína. En cuanto a la ApoAI, se ha demostrado que su deficiencia genera cambios en la población de los precursores de células óseas que incrementan el adipoblasto y disminuye la producción de osteoblastos dando como resultado una reducción de la masa ósea y deterioro de la calidad ósea en ratones (Blair et al., 2016), contrario a nuestros 41

resultados. El rol de la apolipoproteínas en la formación osea no está del todo claro lo que queda demostrado por los antecedentes expuestos anteriormente. No existe evidencia en peces de la función de las Apos en la formación ósea, por lo que nuestro estudio es el primero en señalar la actividad de estos transportadores lipídicos en el tejido óseo en un pez marino como S. lalandi.

Acción in situ del DHA en tejido mandibular

En general, las causas de las malformaciones esqueléticas en peces son multifactoriales, donde se ha indicado a la nutrición lipídica como el DHA, uno de los factores que incide en la osteogénesis, pero su acción in situ hasta ahora no había sido estudiado. Por ésta razón, nuestro estudio implementó por primera vez un sistema in vitro de explantes de mandíbula en S. lalandi suplementado con DHA para medir su acción en algunos genes candidatos obtenidos desde el primer estudio transcriptomico en mandíbula por cada fenotipo. Los resultados de la expresión relativa sugieren que el mecanismo que utilizarón las células en la matriz mandibular para incorporar DHA fue mediado por la proteína de unión del ácido graso (FABP) y que el DHA en ambas concentraciones (20 µm y 40 µm) no afectó la expresión de genes candidatos que participan en la formación ósea. Debido a que sólo medimos la expresión relativa de algunos genes, decidimos realizar un RNA-Seq de estos explantes para obtener el efecto del DHA en todas las vías del tejido mandibular, para aquello se analizó los explantes suplementados con la concentración de 20 µm DHA considerando que para ambas concentraciones no se vieron afectados los genes candidatos osteogénicos, sólo el transportador de ingreso del DHA a la matriz que incrementó a medida que aumentó la concentración del DHA. La concordancia entre los transcritos expresados diferencialmente en el cultivo in vitro con el cultivo in vivo mostró que el DHA utilizó la vía de ingreso intramembrana a través de la proteína FATP y/o también la LPL la cual se ha señalado como una de las vías de ingreso que se une a lipoproteinas o ácidos grasos no esterificados (Bazinet & Layé, 2014). El DHA utilizó también como transporte intracelular la proteína FABP, la cual se ha señalado como el transporte citosólico de los ácidos grasos de cadena larga para o desde varios orgánulos intracelular como el peroxisoma, donde también mostró algunos transcritos concordantes asociados a la β oxidación de los ácidos grasos como el DHA utilizado en la suplementación (Storch & Thumser, 2000). Otra vía concordante que entregó el mapeo por kegg fue el metabolismo del colestrol, específicamente la enzima CYP8b4 y la enzima que participa en la oxidación de ácidos grasos (ACO). También el DHA mostró tener un efecto en la interacción receptor-matriz extracelular asociado a la fibronectina, que si bien la matriz ósea está compuesta principalmente de colágeno, se ha demostrado que la presencia inicial y continua de fibronectina es crucial para mantener la integridad de la matriz del colágeno in vitro, atribuyendo a la fibronectina una participación en la función de los osteoblastos (Bentmann et al., 2010). Se ha señalado que la fibronectina puede afectar la formación del hueso influyendo en la supervivencia de los osteoblastos (Globus et al., 1998) y además en el ensamblaje de colágeno tipo 1 y la integridad de la matriz ósea (Stein

& Lion, 1993). No se ha descrito la acción del DHA sobre la fibronectina, pero nuestro estudio entrega ésta posible interacción, la cual debe ser estudiada con mayor profundidad.

A nivel del contenido de ácidos grasos, los deformes presentaron baja disponibilidad de DHA, lo que indica la importancia de este ácido graso a nivel local y su rol en la formación de este tejido poco estudiado en peces. De acuerdo a los resultados, podríamos deducir que quizás el organismo intenta compensar éste déficit tratando de ingresar más DHA en el tejido y por lo tanto se ven alteradas las vías de transporte de lípidos, transportadores celulares y plasmáticos, mostrados en la expresión diferencial. Ésta alteración del metabolismo lipídico en mandíbula deforme quizás sea mas un efecto que la causa propiamente tal, lo que podría complementarse con un estudio que evalué también los factores genéticos. De acuerdo a los estudios disponibles en peces marinos, que en su mayoría son en cultivos in vivo, se ha demostrado que la presencia de deformidades ósea en larvas de Pagrus pagrus se atribuyó a una alimentación con bajo contenido de DHA (Roo et al., 2010). En el caso de juveniles de Paralichthys olivaceus se ha demostrado una mayor presencia de malformación mandibular atribuido a una alimentación con dieta de bajo contenido DHA y EPA (Sawayama & Sakamoto, 2012). En larvas de Sparus aurata alimentadas con una dieta alta en contenido de DHA se demostró una reducción en la ocurrencia de malformaciones mandibulares (Izquierdo et al., 2013) al igual como se ha demostrado en larvas de Trachinotus ovatus (Ma et al., 2017).

En relación a los resultados en hígado, mostraron que S. lalandi no se ve afectada en su condición de deforme a nivel transcripcional ni en el contenido de los ácidos grasos. Se ha señalado que los peces tienen la capacidad para almacenar y depletar lípidos en condiciones de alta o baja ingesta, lo cual de acorde a nuestros resultados, los juveniles defomes alcanzarón un bajo crecimiento comparados con los normales lo que podríamos asumir una baja ingesta por parte de los deformes. Este panorama se conoce como estrategia adaptativa del metabolismo lipídico en la cual los peces pueden mantener la homeostasis cuando la dieta es alta o baja en lípidos (He et al., 2015). En muchas especies de peces, la dieta limitada en lípidos ha dado como resultado un bajo crecimiento y una serie de síntomas relacionado con la eficiencia de ácidos grasos esenciales (EFA) (Takeuchi et al., 1990; Watanabe, 1993). Sin embargo, algunos peces, como herbívoros y especies omnívoras, como la carpa herbívora (Ctenopharyngodon idella) y tilapia (Oreochromis niloticus), tienen la capacidad de soportar la deficiencia de EFA. Posiblemente el hígado actúa como un sistema de buffer en S. lalandi para equilibrar el contenido de lípidos en el hígado de los individuos con deformidad mandibular respecto a los normales, pero éste supuesto necesita ser comprobado con estudios posteriores.

El metabolismo óseo se ha estudiado desde una perspectiva que no reconoce la importancia potencial de los procesos metabólicos sistémicos, como el metabolismo de los lípidos. Los ácidos grasos poliinsaturados como el DHA son efectores conocidos del metabolismo óseo y pueden reducir la ocurrencia de deformidades esqueléticas en peces de cultivo, sin embargo, sus efectos son poco conocidos en peces. La respuesta celular al DHA y en general a los ácidos grasos puede depender de la maduración de la célula en conjunto con las condiciones entregadas a nivel in vitro como también de la especie. Dado que 43

nuestro estudio implementó un sistema de explantes de hueso mandibular basándose en estudios realizados con explantes de hígado y utilizando concentraciones de DHA proveniente de cultivo de líneas celulares de otras especies, deja abierta la posibilidad que quizás las concentraciones y el tiempo de incubación utilizados no fueron apropiados, interfiriendo en la acción sobre los genes candidatos osteogénicos en S. lalandi donde no se mostraron diferencias significativas con el control. O también podemos atribuir estos resultados a la baja expresión del receptor PPARα en el tratamiento del explante suplementado con DHA el cual arrojó un valor de expresión de -0.63 (log2FoldChange). Los ácidos grasos altamente insaturados como el DHA actúan sobre el genoma a través de los PPARs los cuales se unen al receptor x retinoico (RXR) para regular los genes que participan en el desarrollo esquelético (Cahu et al., 2003).

Son limitados los estudios publicados respecto a las vías que controlan o afectan el desarrollo de la mandíbula en peces y una parte sustancial del conocimiento actual sobre estas vías se ha adquirido a partir de estudios de vertebrados como ratón y pollo. Por lo tanto, en muchos casos la conservación de las cascadas moleculares y las interacciones aún no se han validado en la mayoría de los teleósteos. La ocurrencia común de las anomalías esqueléticas en los peces de cultivo y la ausencia de soluciones para evitar su aparición o disminuir su prevalencia, pone en evidencia la necesidad de mejorar nuestro conocimiento sobre los procesos básicos de la regulación del esqueleto en peces marinos, que están siendo interrumpidos y provocando anomalías en su desarrollo. La variación de la forma de la mandíbula es una característica fundamental pero muy difícil de cuantificar. Se han realizado estudios descriptivos de la morfogénesis de las estructuras mandibulares y sus malformaciones a través de técnicas de tinciones para identificar el momento en que surgen las anomalías y los componentes esqueléticos específicos afectados, sin embargo, estas técnicas son solo cualitativas. Este estudio contribuye a la comprensión de los posibles factores que inciden en estas anomalías, las que son específicas para cada especie y dependiente de la etapa de desarrollo, y además entrega información útil para futuras investigaciones en S. lalandi.

CONCLUSIONES

Una deficiencia del contenido de DHA en el tejido con deformidad mandibular indica la importancia de este ácido graso a nivel local y su rol en la formación en este tejido poco estudiado en peces.

La acción in situ del DHA nos entregó información respecto a la vía de ingreso que utiliza el DHA a través de la membrana celular en un tejido óseo como la mandíbula en S. lalandi y su efecto sobre algunos transportadores de ácidos grasos, proteína de adhesión matriz extracelular como fibronectina y en las vías de señalización en las proteínas peroxisomales que participan en el metabolismo de ácidos grasos de cadena larga.

Aún queda por establecer si las Apolipoproteínas directamente o indirectamente regulan la masa ósea en peces pero nuestro estudio coloca en antecedente su participación en el tejido óseo como la mandíbula.

Este es el primer estudio en S. lalandi que evalúa localmente la malformación mandibular a nivel transcripcional y el efecto in situ de un nutriente que si bien se ha descrito como uno de los factores que afectan las malformaciones óseas en peces, su acción no había sido estudiada. El presente estudio entrega información útil en S. lalandi y para otras especies marinas para futuras investigaciones en este campus.

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ANEXOS

Anexo 1. Análisis de estabilidad de los genes de referencia por Normfinder

Nombre gen Valor de estabilidad map1b 0,099 actb 0,175 Integrina 0,149

Variación intragrupo Variación intergrupo Identificador de grupo 1 2 1 2 map1b 0,008 0,011 0,051 -0,051 actb 0,048 0,058 -0,107 0,107 Integrina 0,055 0,056 0,056 -0,056

Mejor gen map1b Valor estabilidad 0,099

Mejor combinación de dos genes map1b y actb Valor de estabilidad para la mejor combinación de dos genes 0,077

Anexo 2. Prueba de ANOVA de una vía de los datos de peso y longitud total por periodo de desove en juveniles S. lalandi.

Periodo de Suma de Media desove Biometría cuadrados gl cuadrática F P (Sig.) Muestreo 1 Longitud Entre grupos 5,120 1 5,120 21,087 0,000 Dentro de grupos 18,455 76 0,243 Total 23,575 77 Peso Entre grupos 1,324 1 1,324 30,850 0,000 Dentro de grupos 3,262 76 0,043 Total 4,586 77 Muestreo 2 Peso Entre grupos 2,369 1 2,369 44,642 0,000 Dentro de grupos 2,069 39 0,053

Total 4,438 40 Longitud Entre grupos 5,112 1 5,112 25,210 0,000 Dentro de grupos 7,908 39 0,203

Total 13,020 40

Prueba t para la igualdad de medias 95% de intervalo de confianza de la diferencia Sig. Diferencia de t gl (bilateral) medias Inferior Superior

Se asumen L1 varianzas 0,796 88 0,415 0,384 -0,549 1,318 iguales Se asumen RAIZ varianzas -3,334 88 0,001 -0,172 -0,274 -0,069 (L2) iguales

Anexo 4. Resumen de los datos obtenidos desde la secuenciación Illumina de tejidos de S. lalandi, proceso de filtrado y mapeo utilizando transcriptoma de referencia.

Librería nº % Longitud % Muestreo nº lecturas Longitud lecturas lecturas promedio mapeo Post- secuenciadas promedio filtro filtradas Post-filtrado Mandíbula 1 normal 17708114 75,4 17610276 99,45 73,3 89,3 Mandíbula 1 normal 20182916 75,4 20088651 99,53 73,3 89,2 Mandíbula 2 normal 27549394 75,3 27342029 99,25 73,2 88,9 Mandíbula 2 normal 22759374 75,4 22575765 99,19 73,2 89,0 Mandíbula 1 deforme 19110602 75,2 18979477 99,31 73,2 88,8 Mandíbula 1 deforme 18806612 75,4 18750672 99,7 73,4 89,9 Mandíbula 2 deforme 22986004 75,4 22806928 99,22 73,2 90 Mandíbula 2 deforme 41866272 75,4 41547053 99,24 73,2 89,9 Hígado 1 normal 17342638 75,3 17199098 99,17 73,1 87,5 Hígado 1 normal 17044076 75,4 16950857 99,45 73,3 92,3 Hígado 2 normal 27344266 75,4 27149478 99,29 73,3 92,9 Hígado 2 normal 31428052 75,4 31209080 99,3 73,3 92,5 Hígado 1 deforme 17715142 75,3 17565545 99,16 73,1 88,7 Hígado 1 deforme 21232654 75,5 21182950 99,77 73,4 93,0 Hígado 2 deforme 19572402 75,4 19404892 99,14 73,2 91,7 Hígado 2 deforme 21490280 75,4 21303156 99,13 73,2 92,5

Anexo 5. Mapeo de las vías por Kegg de la mandíbula inferior de S. lalandi

KEGG categories represented Number of KOs Metabolism 1557 Carbohydrate metabolism 291 Energy metabolism 140 Lipid metabolism 250 Nucleotide metabolism 156 Amino acid metabolism 242 Metabolism of other amino acids 68 Glycan biosynthesis and metabolism 192 Metabolism of cofactors and vitamins 113 Metabolism of terpenoids and polyketides 26 Biosynthesis of other secondary metabolites 26 Xenobiotics biodegradation and metabolism 53 Genetic Information Processing 1024 Transcription 158 Translation 356 Folding, sorting and degradation 347 Replication and repair 163 Environmental Information Processing 2106 Membrane transport 22 Signal transduction 1866 Signaling molecules and interaction 218 Cellular Processes 1635 Transport and catabolism 559 Cell growth and death 601 Cellular community - eukaryotes 359 Cellular community - prokaryotes 6 Cell motility 110 Organismal Systems 2784 Immune system 821 Endocrine system 745 Circulatory system 140 Digestive system 191 Excretory system 85 Nervous system 379 Sensory system 72 Development 158 Aging 124 Environmental adaptation 69 57

Anexo 6. Mapeo de las vías por Kegg del hígado de S. lalandi

KEGG categories represented Number of KOs Metabolism 1507 Carbohydrate metabolism 282 Energy metabolism 136 Lipid metabolism 237 Nucleotide metabolism 144 Amino acid metabolism 257 Metabolism of other amino acids 70 Glycan biosynthesis and metabolism 147 Metabolism of cofactors and vitamins 118 Metabolism of terpenoids and polyketides 27 Biosynthesis of other secondary metabolites 31 Xenobiotics biodegradation and metabolism 58 Genetic Information Processing 922 Transcription 154 Translation 346 Folding, sorting and degradation 321 Replication and repair 101 Environmental Information Processing 1566 Membrane transport 19 Signal transduction 1424 Signaling molecules and interaction 123 Cellular Processes 1302 Transport and catabolism 513 Cell growth and death 432 Cellular community - eukaryotes 273 Cellular community - prokaryotes 4 Cell motility 80 Organismal Systems 2121 Immune system 631 Endocrine system 573 Circulatory system 86 Digestive system 170 Excretory system 78 Nervous system 269 Sensory system 42 Development 110 Aging 113 Environmental adaptation 49 58

Anexo 7. Lista de los transcritos expresados diferencialmente entre fenotipos mandibulares de S. lalandi (FDR<0.05). Obtención de secuencias en Patel et al..(2016)

EDGE test: jaw EDGE test: jaw normal vs jaw normal vs jaw deforme, tagwise deforme, tagwise dispersions - P- dispersions - Fold SeqName value change Description _contig_10001 2,8E-05 38,2 bile salt-activated lipase-like _contig_10012 1,4E-06 1630,5 _contig_10019 2,8E-04 8,0 disks large homolog 4-like _contig_1002 6,7E-04 4,2 _contig_100305 3,6E-05 35,3 fibroblast growth factor 23 chymotrypsin-like elastase family _contig_10037 2,0E-04 436,0 member 2a-like _contig_10040 3,1E-04 5,3 type ii iodothyronine deiodinase _contig_100529 9,9E-04 21,2 _contig_100647 4,0E-04 11,2 -carotene 9 -oxygenase-like _contig_100664 4,2E-05 43,8 _contig_1007 3,3E-06 30,1 torsin- partial _contig_10095 2,2E-06 38,9 cholesteryl ester transfer _contig_101162 1,8E-04 179,6 hexokinase hkdc1 _contig_10156 1,5E-06 399,6 complement component c8 beta _contig_10159 4,1E-04 5,6 nipsnap homolog 3a _contig_1016 1,7E-07 184,4 fetuin b _contig_1017 1,1E-04 7,8 alkaline ceramidase 3 _contig_102082 4,0E-04 19,9 glucokinase regulatory protein _contig_102364 4,8E-04 40,1 _contig_10238 2,9E-04 2686,3 acidic mammalian chitinase-like _contig_10239 5,4E-06 589,0 acidic mammalian chitinase-like _contig_102724 9,3E-04 107,4 probable proline dehydrogenase 2 _contig_102924 6,0E-04 6,2 _contig_10313 1,8E-03 2,8 _contig_10352 1,3E-04 20,0 PREDICTED: hypothetical protein _contig_10359 8,3E-06 11,5 LOC100519499 _contig_103691 5,7E-05 7,8 cytochrome p450 3a27 _contig_1037 1,3E-05 18,0 glutathione peroxidase 4a _contig_10379 7,3E-04 3,7 dimethylaniline monooxygenase _contig_10383 3,2E-05 27,8 _contig_10428 4,5E-06 46,7 diablo mitochondrial precursor _contig_104711 1,3E-03 24,0 homeo box hb9 like a

sodium-dependent neutral amino acid _contig_10476 2,8E-05 275,3 transporter b at1-like neutral cholesterol ester hydrolase 1- _contig_10506 5,2E-05 24,9 like _contig_105210 1,1E-04 254,3 retrotransposable element tf2 155 kda _contig_105429 1,8E-05 193,0 protein type 1-like _contig_106076 8,3E-04 29,8 perilipin 2 _contig_10632 6,8E-05 -3,1 _contig_10643 1,1E-06 1053,1 glucose-6-phosphatase _contig_1065 6,7E-04 3,1 nadh dehydrogenase _contig_10654 6,4E-06 519,8 glycerophosphodiester phosphodiesterase domain-containing _contig_1066 2,8E-04 53,9 protein 5-like _contig_1068 7,4E-07 426,8 tryptophan -dioxygenase a-like 6-phosphofructo-2-kinase fructose- - _contig_10739 2,9E-04 5,0 biphosphatase-like _contig_107404 1,5E-04 150,5 _contig_107471 7,3E-04 6,0 palmitoyl- oxidase _contig_107738 4,6E-05 341,3 diacylglycerol o-acyltransferase 2-like ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase family member 7- _contig_107811 6,3E-05 129,5 like low quality protein: glutathione _contig_10787 1,9E-04 7,7 peroxidase 3-like _contig_107933 3,3E-04 119,0 _contig_108 2,6E-07 504,2 coagulin factor ii _contig_108595 9,4E-04 6,1 _contig_108655 1,0E-03 108,6 _contig_109116 1,7E-03 31,3 integrin alpha-6-like glycolipid transfer protein domain- _contig_109510 3,6E-04 39,7 containing protein 1-like _contig_109826 4,5E-04 348,9 _contig_11 5,5E-06 721,3 leukocyte cell-derived chemotaxin 2 _contig_110026 7,8E-05 107,2 cgmp-dependent protein kinase 2-like _contig_1101 2,2E-06 467,8 tbt-binding partial _contig_110710 1,7E-03 -5,9 _contig_111307 1,8E-04 123,2 _contig_1115 2,1E-04 4,4 ribonuclease uk114 _contig_11150 4,4E-04 115,5 solute carrier family 22 member 7-like _contig_11185 2,0E-06 308,6 matrix metalloproteinase _contig_11187 1,8E-04 5,8 farnesyl pyrophosphate synthase-like probable g-protein coupled receptor _contig_111917 2,4E-05 1119,2 112-like 60

_contig_11211 1,2E-03 9,1 -dihydroxyvitamin d 24- mitochondrial _contig_112152 2,5E-04 2060,1 e3 ubiquitin-protein ligase trim21-like membrane-associated guanylate ww and _contig_112153 1,3E-03 7,0 pdz domain-containing protein 3-like _contig_11242 2,3E-06 363,4 f10 protein PREDICTED: uncharacterized protein _contig_112685 1,5E-04 1044,0 LOC101063288 _contig_11275 1,2E-04 5,7 squalene synthase-like _contig_113298 6,5E-04 281,7 _contig_11348 1,8E-04 6,1 non-specific lipid-transfer disintegrin and metalloproteinase _contig_113664 2,9E-04 6,8 domain-containing protein 11-like _contig_114212 1,1E-03 14,9 low quality protein: synaptopodin-2 electrogenic sodium bicarbonate _contig_11437 8,3E-04 6,7 cotransporter 1 _contig_11453 6,1E-06 1670,4 apolipoprotein b-100-like _contig_1147 5,3E-04 8,8 l mbt-like solute carrier family facilitated glucose _contig_11471 1,9E-05 12,8 transporter member 9-like group xiib secretory phospholipase a2- _contig_11477 1,3E-03 100,9 like _contig_11493 2,2E-04 27,8 _contig_11526 1,5E-05 353,5 galectin-2 nuclear receptor subfamily 0 group b _contig_11531 2,5E-05 502,2 member 2 _contig_11545 9,6E-04 10,2 _contig_11548 5,8E-05 125,4 _contig_115819 1,1E-04 157,0 phosphoenolpyruvate cytosolic apobec1 complementation factor _contig_1160 3,3E-06 1046,5 isoform 1 mam and ldl-receptor class a domain- _contig_116399 4,7E-06 79,1 containing protein c10orf112-like _contig_1165 3,7E-04 4,1 aldo-keto reductase family 1 member _contig_11656 8,1E-04 3,8 b10-like _contig_1172 7,7E-07 618,9 liver-type fatty acid-binding protein _contig_11727 1,4E-03 2,7 sal-like protein 1 acyl- synthetase family member _contig_11747 3,9E-04 27,9 mitochondrial-like _contig_11759 1,0E-04 3,0 _contig_11774 1,0E-03 6,9 alanine aminotransferase 2-like _contig_1178 4,3E-06 281,3 alcohol dehydrogenase 1-like _contig_117829 1,3E-05 387,3 homeobox protein cdx-1 _contig_11785 1,6E-07 165,4 angiopoietin-related protein 3 _contig_117866 3,8E-05 129,0

_contig_11814 1,2E-03 5,5 chloride anion exchanger-like _contig_118174 8,0E-04 238,2 myelin gene regulatory factor _contig_11860 3,3E-04 287,3 preprosomatostatin ii tetratricopeptide repeat protein 8-like _contig_11893 1,0E-06 42,2 isoform 1 _contig_11902 1,1E-04 9,4 d-threo-3-hydroxyaspartate _contig_11903 2,8E-04 5,8 dehydratase-like _contig_11937 2,6E-06 45,6 kynurenine 3-monooxygenase-like _contig_11956 5,7E-07 89,7 urocanate hydratase-like nuclear receptor subfamily 0 group b _contig_119825 1,9E-05 681,8 member 2 _contig_1199 2,1E-07 83,3 zinc transporter zip8-like _contig_120156 1,0E-03 33,0 transcription factor gata-6-like c-jun-amino-terminal kinase-interacting _contig_12086 5,1E-04 6,4 protein 2-like _contig_120924 4,8E-04 187,4 gtpase imap family member 6-like _contig_12094 1,5E-05 51,8 aromatic-l-amino-acid decarboxylase _contig_121263 1,7E-04 277,6 _contig_12131 2,5E-04 28,0 fep15 selenoprotein precursor low affinity cationic amino acid _contig_12146 2,0E-04 44,7 transporter 2-like _contig_12158 3,7E-06 34,9 alpha- -sialyltransferase st3gal v _contig_1216 9,1E-04 3,7 _contig_121723 9,4E-05 556,2 _contig_1219 2,4E-05 1254,4 apolipoprotein b-100-like _contig_12195 7,9E-05 14,6 protein prune homolog _contig_1223 4,0E-08 329,9 cd59 glyco _contig_1225 1,4E-06 747,2 transmembrane 4 l6 family member 5 _contig_12251 8,5E-05 7,5 complement factor h precursor 7-alpha-hydroxycholest-4-en-3-one 12- _contig_12254 6,9E-06 12,0 alpha-hydroxylase-like _contig_12264 1,0E-07 286,6 tbt-binding partial camp responsive element binding _contig_12273 1,9E-04 161,6 protein 3-like 3 _contig_12317 2,7E-04 5,5 _contig_12346 1,8E-03 4,0 interleukin-6 receptor subunit beta-like _contig_123673 5,8E-07 538,9 c2 domain-containing protein _contig_12382 1,7E-05 79,2 at1g53590-like _contig_124076 8,7E-05 731,2 carbonic anhydrase 4-like ptb domain-containing engulfment _contig_124196 6,8E-06 2323,9 adapter protein 1-like _contig_124224 4,9E-04 333,4

_contig_124361 1,4E-03 28,8 _contig_1245 4,6E-06 68,5 solute carrier family 22 member 6-like _contig_12450 2,0E-04 142,6 occludin-like _contig_12477 9,9E-06 328,8 _contig_12495 2,6E-04 3,9 alanine aminotransferase 2-like _contig_125135 5,6E-05 311,0 _contig_125182 1,1E-03 23,4 low quality protein: beta-klotho _contig_1253 6,5E-04 -3,3 cyclin b3 _contig_125708 2,3E-05 270,0 _contig_125836 5,4E-04 81,4 calbindin 1 _contig_12647 1,1E-03 10,0 serine protease 27-like _contig_12676 1,1E-03 4,4 spermine oxidase-like _contig_126768 2,3E-04 493,8 natterin-3-like _contig_1270 6,4E-04 4,9 succinyl- ligase _contig_12745 2,8E-04 6,2 kinesin-like protein kif16b _contig_1278 3,0E-04 382,2 chymotrypsinogen 2 _contig_128369 8,5E-04 139,4 adp-ribosylation factor-like protein 14- _contig_1284 1,6E-07 1710,6 like _contig_128698 3,3E-05 218,5 _contig_12881 1,8E-06 38,2 fibroblast growth factor 23 _contig_12904 2,8E-05 12,5 acetyl-coenzyme a cytoplasmic _contig_12935 2,5E-05 -5,0 e3 ubiquitin isg15 ligase trim25-like _contig_12946 1,4E-04 7,1 flavin reductase _contig_129684 2,3E-05 86,4 _contig_12991 2,8E-05 544,3 complement c1r subcomponent-like alpha-1-antitrypsin-like protein cm55- _contig_13 9,5E-07 411,2 ms-like bifunctional polynucleotide phosphatase _contig_13003 4,0E-04 4,6 kinase-like _contig_1301 6,3E-05 204,2 nuclear receptor subfamily 1 group i _contig_13024 1,3E-03 4,4 member 2 _contig_13038 6,0E-06 11,6 glycerol-3-phosphate dehydrogenase _contig_130446 1,4E-03 45,7 _contig_13062 5,1E-04 4,8 protein phosphatase 1l _contig_13098 6,9E-05 21,0 vitamin d 25-hydroxylase-like _contig_13108 7,7E-06 110,6 protein fantom _contig_131149 9,8E-04 99,7 _contig_13118 7,4E-08 202,4 bile salt export pump _contig_13169 9,4E-04 11,1 glucokinase regulatory protein _contig_13191 5,6E-04 5,0 phytanoyl- peroxisomal 63

_contig_13212 2,0E-06 58,0 cytochrome p450 2k1-like isoform 2 _contig_13213 1,0E-05 9,6 cytochrome p450 2k1-like isoform 1 _contig_132444 7,1E-04 266,2 _contig_13269 1,6E-05 15,6 cytochrome b5 _contig_13296 1,7E-06 260,9 mitochondrial-like multidrug and toxin extrusion protein 1- _contig_132970 3,8E-04 120,6 like serine (or cysteine) peptidase clade _contig_13303 2,0E-06 568,2 member 2b _contig_13384 3,8E-07 48,1 male-specific protein _contig_13404 1,4E-05 373,3 hydroxyacid oxidase 1 _contig_13417 2,4E-07 895,1 serine--pyruvate mitochondrial-like _contig_134338 3,2E-04 46,7 all-trans-retinol -reductase-like _contig_134365 1,1E-05 370,4 _contig_13453 6,5E-05 8,6 gamma-glutamyl hydrolase-like ras gtpase-activating-like protein _contig_13467 2,6E-04 5,0 iqgap1-like _contig_13504 7,4E-07 46,4 insulin-like growth factor-binding _contig_13528 1,6E-06 410,1 protein complex acid labile subunit-like _contig_135447 1,1E-04 186,0 _contig_13638 4,7E-04 -5,8 _contig_136528 6,6E-04 106,3 _contig_137137 9,9E-07 801,8 bile acid receptor-like atp-binding cassette sub-family g _contig_137165 1,9E-04 61,9 member 2-like _contig_1372 8,1E-07 701,6 leucine-rich alpha-2-glyco _contig_137234 1,0E-04 64,6 enteropeptidase isoform 2 _contig_13752 1,8E-03 -3,3 cytoskeleton-associated protein 2 _contig_137699 9,5E-05 658,9 thiamine transporter 1 inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain _contig_1378 2,2E-05 343,0 h3-like _contig_13821 9,3E-06 428,1 glucose transporter 2 _contig_13833 3,1E-05 80,5 _contig_1384 2,3E-06 405,3 beta-microseminoprotein precursor _contig_13850 3,1E-04 -3,0 unnamed protein product prostate androgen-regulated mucin-like _contig_13924 9,8E-04 7,6 protein 1 homolog heparan-alpha-glucosaminide n- _contig_139465 6,5E-05 92,1 acetyltransferase-like _contig_13953 3,3E-04 4,8 glyoxylate reductase-like _contig_13973 2,4E-05 98,3 si:ch1073- precursor _contig_139849 1,4E-03 120,1 complement factor b-like _contig_13992 1,4E-03 3,8 transmembrane protein 150a-like 64

_contig_14020 1,1E-06 641,2 heparin cofactor 2-like _contig_140892 3,3E-04 449,7 _contig_14118 8,8E-07 996,4 gap junction protein _contig_14119 2,7E-04 -6,2 _contig_14133 3,5E-04 4,8 pyridoxine-5 -phosphate oxidase-like _contig_14136 1,2E-04 9,1 protein disulfide-isomerase a2 _contig_1415 1,2E-05 62,4 cd59 glyco _contig_141685 9,7E-04 20,5 _contig_141765 7,9E-04 16,2 _contig_14180 1,0E-06 751,5 acidic mammalian chitinase-like saxitoxin and tetrodotoxin-binding _contig_14196 4,3E-06 255,2 protein 1-like PREDICTED: uncharacterized protein _contig_141961 9,0E-04 514,5 LOC101158564 _contig_142 9,9E-08 489,8 _contig_14214 8,4E-06 19,0 cytochrome p450 2j2-like acid sphingomyelinase-like _contig_142204 1,7E-03 58,8 phosphodiesterase 3b-like brain-specific angiogenesis inhibitor 1- _contig_142417 6,8E-04 74,9 associated protein 2-like protein 2-like _contig_143383 1,6E-04 159,1 _contig_14346 4,3E-06 341,4 glucose-6-phosphatase-like isoform 1 probable e3 ubiquitin-protein ligase _contig_14348 1,4E-03 -2,5 rnf144a-a _contig_143636 2,6E-04 164,0 solute carrier family 13 member 3 novel protein vertebrate complement _contig_14379 8,5E-07 507,1 component 3 _contig_14437 1,9E-04 6,2 lathosterol oxidase _contig_144397 2,1E-04 182,6 protein disulfide-isomerase-like _contig_14458 4,1E-05 7,1 gdh 6pgl endoplasmic bifunctional _contig_144973 1,8E-04 269,8 _contig_1450 1,8E-04 290,4 trypsinogen 2 _contig_14531 5,1E-04 4,2 choline kinase alpha _contig_14553 2,2E-05 22,7 unnamed protein product _contig_145653 8,8E-05 202,8 _contig_145895 2,6E-05 61,9 xanthine dehydrogenase oxidase-like c-type lectin domain family 4 member _contig_14615 1,2E-05 312,2 m-like probable phospholipid-transporting _contig_14629 1,3E-05 141,0 atpase id-like interferon-induced very large gtpase 1- _contig_146647 1,1E-03 42,8 like _contig_1468 2,9E-05 233,4 complement c1q-like protein 2-like _contig_147 2,9E-07 356,5 fibrinogen alpha chain-like

_contig_14701 1,3E-03 4,6 hemoglobin subunit beta-1 _contig_147324 3,3E-04 45,2 cyclic amp-responsive element-binding _contig_147738 5,1E-05 340,9 protein 3-like protein 3-a-like stromal membrane-associated protein 2- _contig_14774 3,8E-04 5,4 like PREDICTED: hypothetical protein _contig_148 6,2E-07 416,3 LOC100693197 _contig_148045 2,6E-04 12,4 _contig_148166 8,5E-05 185,0 hepatocyte nuclear factor 1-beta-a-like _contig_148356 4,0E-04 70,4 wu:fb63a08 protein 3-beta-hydroxysteroid-delta -isomerase- _contig_1484 1,2E-05 13,9 like _contig_148455 6,5E-04 18,3 extracellular serine threonine protein _contig_148482 1,2E-03 53,0 kinase fam20c-like _contig_148632 1,8E-04 104,6 tryptophan -dioxygenase _contig_14876 2,6E-06 148,4 monocarboxylate transporter 2-like _contig_14950 1,0E-04 111,3 lactose-binding lectin l-2-like _contig_149869 1,3E-04 161,9 _contig_15006 8,6E-04 3,9 glycine n-methyltransferase _contig_15032 4,2E-04 14,3 dipeptidyl peptidase 4-like _contig_151155 4,6E-04 119,2 _contig_15121 8,3E-06 419,3 _contig_15167 9,2E-06 98,2 indoleamine -dioxygenase 2 multidrug resistance-associated protein _contig_152071 1,3E-03 11,9 9 peroxisomal carnitine o- _contig_15246 8,7E-04 5,1 octanoyltransferase-like _contig_15256 8,6E-06 2209,4 apolipoprotein eb-like _contig_15525 4,3E-04 -37,3 _contig_15537 7,0E-06 1169,3 cadherin-related family member 2-like _contig_1555 2,4E-07 93,2 coagulation factor v _contig_15554 4,2E-06 589,2 angiotensinogen precursor _contig_15564 1,5E-04 26,0 laminin subunit alpha-3 _contig_15571 8,9E-06 801,0 3-oxo-5-beta-steroid 4-dehydrogenase _contig_15589 4,6E-04 6,9 mitochondrial-like _contig_15642 7,6E-05 14,5 type-2 ice-structuring _contig_15675 1,0E-03 135,6 ---NA--- _contig_15682 6,6E-05 -4,4 perforin-1-like _contig_15683 7,2E-04 -3,8 perforin-1-like _contig_15684 8,1E-04 -3,2 perforin-1 precursor _contig_156869 2,9E-05 338,7 gtpase imap family member 8-like

_contig_157117 3,9E-04 93,0 _contig_157544 1,2E-03 94,5 _contig_15759 7,2E-04 3,2 plectin isoform 1hij protein kinase c and casein kinase _contig_15790 7,9E-04 11,1 substrate in neurons protein 1-like _contig_15795 7,4E-07 72,3 cytochrome p450 2k1-like isoform 2 _contig_15809 1,4E-07 53,5 histamine n-methyltransferase _contig_15810 6,1E-04 5,0 solute carrier family 12 member 8-like _contig_1584 6,9E-04 8,1 poly binding cytoplasmic 1 _contig_15843 8,8E-04 118,1 prepronociceptin b precursor _contig_1587 2,3E-05 30,8 glycine dehydrogenase _contig_158956 3,3E-05 68,2 uridine phosphorylase 2 antr_ranca ame: full=gastrin cholecystokinin-like peptide ame: _contig_159541 9,0E-04 237,8 full=antral peptide flags: precursor neutral cholesterol ester hydrolase 1- _contig_16012 9,4E-05 34,3 like _contig_160210 4,6E-04 186,6 bile salt export pump-like _contig_16029 2,9E-05 66,9 selenoprotein l _contig_16100 6,5E-06 24,1 g-protein coupled receptor 39-like _contig_161367 7,4E-04 9,3 riken cdna 1700021f07 gene _contig_16170 3,6E-05 23,0 _contig_16229 3,1E-05 15,5 beta-ureidopropionase _contig_162684 8,7E-04 62,9 _contig_162686 4,3E-04 140,8 _contig_16357 4,9E-05 11,0 cytochrome p450 4v2-like transthyretin ( amyloidosis type i) _contig_164283 8,2E-06 325,2 precursor _contig_164653 2,2E-04 113,3 transmembrane protein 120a-like _contig_16478 5,1E-04 4,9 peroxisomal acyl-coenzyme a oxidase 3 _contig_16557 7,2E-05 51,5 protein-coding gene cg057 like protein _contig_1657 7,6E-04 4,7 shc-transforming protein 2-like PREDICTED: hypothetical protein _contig_16571 1,6E-04 27,6 LOC100148910 multidrug and toxin extrusion protein 1- _contig_16653 1,1E-06 898,9 like probable 4-hydroxy-2-oxoglutarate _contig_16659 1,7E-05 17,6 mitochondrial-like nicotinate-nucleotide _contig_16666 9,9E-05 6,5 pyrophosphorylase _contig_166996 1,5E-03 15,3 interleukin-20 receptor alpha chain _contig_16704 1,2E-04 10,5 precursor inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain _contig_16733 1,8E-06 548,6 h3-like 67

_contig_167716 5,6E-04 211,5 solute carrier family 22 member 5-like probable phospholipid-transporting _contig_168069 7,7E-04 47,7 atpase id-like _contig_16834 1,5E-04 50,8 specifically androgen-regulated gene _contig_16885 2,4E-06 375,5 ammonium transporter rh type b-like _contig_16930 4,2E-05 213,6 vitellogenin c _contig_16940 9,4E-05 6,1 liver-expressed antimicrobial peptide 2 _contig_16958 1,1E-07 543,1 carboxypeptidase b2-like _contig_1698 3,0E-07 166,7 coagulation factor xi-like _contig_16990 1,4E-05 652,9 cell death activator cide-b _contig_17055 1,7E-03 -2,9 nuclear mitotic apparatus protein 1 _contig_17060 3,1E-05 1034,4 pancreatic trypsinogen _contig_17077 3,3E-04 5,4 mitochondrial glutamate carrier 1-like _contig_17100 1,1E-03 9,4 adenosine deaminase _contig_17203 2,1E-06 1083,9 complement component c3 PREDICTED: uncharacterized protein _contig_17216 2,1E-05 62,6 LOC101163599 polypeptide n- _contig_17261 4,6E-05 35,8 acetylgalactosaminyltransferase 13-like _contig_172708 1,3E-03 4,3 ---NA--- _contig_17344 5,5E-04 7,0 _contig_17435 1,8E-04 61,9 transmembrane protein 125-like _contig_1746 1,8E-05 483,2 hepatic lipase _contig_17460 4,8E-05 6,0 b-cell receptor cd22-like _contig_175129 1,5E-03 75,9 serine mitochondrial-like cerebellar degeneration-related protein _contig_17527 3,2E-04 8,2 2-like _contig_175344 1,2E-03 -9,9 _contig_17557 3,5E-05 33,1 phosphatidylcholine-sterol _contig_17571 4,2E-07 174,0 acyltransferase-like _contig_17580 8,2E-06 11,5 nadh-cytochrome b5 reductase 2 _contig_1759 3,1E-05 252,8 astacin like metalloprotease protein z-dependent protease inhibitor- _contig_17608 9,7E-04 6,1 like _contig_176187 1,4E-03 196,4 protein nlrc3-like transmembrane emp24 domain- _contig_17625 7,3E-04 10,2 containing protein 11-like _contig_17720 6,9E-05 10,5 _contig_17782 1,5E-04 9,6 src kinase signaling inhibitor 1-like probable phospholipid-transporting _contig_178384 1,2E-04 141,6 atpase id-like _contig_17841 1,6E-04 4,2 _contig_178733 4,3E-05 2025,6 muc12 protein 68

_contig_17887 5,3E-04 63,4 preprosomatostatin i _contig_17980 1,8E-05 201,9 tbt-binding partial _contig_17981 4,1E-05 198,3 gamma-glutamyltranspeptidase 1-like histone-lysine n- h3 lysine-36 and h4 _contig_180382 1,8E-03 -28,7 lysine-20 specific tumor protein p53-inducible nuclear _contig_18136 3,9E-04 -3,3 protein 2-like retrotransposable element tf2 155 kda _contig_18163 4,7E-06 83,8 protein type 1-like _contig_181944 4,9E-05 232,5 chromosome 22 open reading frame 13 betaine--homocysteine s- _contig_182 2,8E-07 702,8 methyltransferase 1-like _contig_18284 8,5E-04 18,8 sodium-dependent neutral amino acid _contig_18298 7,2E-04 3,5 transporter b at2-like betaine--homocysteine s- _contig_183 9,1E-06 28,1 methyltransferase 1-like _contig_18322 9,3E-05 7,3 inhibin beta b chain-like inward rectifier potassium channel 16- _contig_183923 1,1E-03 217,1 like protein-glutamine gamma- _contig_18426 4,4E-04 14,1 glutamyltransferase 2-like PREDICTED: hypothetical protein _contig_18476 5,9E-06 43,3 LOC100690789 _contig_1855 2,7E-07 841,8 tributyltin binding protein type 2 solute carrier family 25 member 38-a- _contig_18566 6,5E-04 4,1 like chymotrypsin-like elastase family _contig_1861 5,2E-05 1176,7 member 2a-like _contig_18656 5,8E-05 12,6 hepcidin antimicrobial peptide 1 _contig_1872 9,8E-07 400,0 tributyltin binding protein type 2 _contig_18759 2,7E-06 858,4 apolipoprotein b-100-like alanine--glyoxylate aminotransferase _contig_18853 7,2E-04 32,8 mitochondrial-like _contig_189 9,8E-05 9,6 cathepsin f precursor _contig_189349 1,6E-03 37,2 5-hydroxytryptamine receptor 4-like _contig_190497 7,3E-04 147,2 _contig_19078 3,2E-04 10,3 pecanex-like protein 2 _contig_1908 9,1E-08 460,7 upf0762 protein c6orf58 homolog _contig_19080 4,4E-04 11,1 monoacylglycerol lipase abhd12-like _contig_19186 2,8E-04 46,2 c2orf55 protein _contig_19187 3,1E-07 290,4 _contig_1923 1,1E-03 -3,5 lysozyme milk isozyme-like _contig_19239 1,7E-03 2,9 adrenomedullin 3 _contig_19275 1,6E-03 4,6 protein spire homolog 2-like

_contig_192768 1,3E-03 104,2 _contig_19279 7,9E-06 483,8 _contig_19291 8,3E-07 1196,4 gap junction protein _contig_19360 1,3E-06 103,1 glycogen _contig_19361 8,0E-07 64,6 serine protease hepsin-like _contig_1940 1,5E-04 7,2 fatty acid binding protein h6-isoform _contig_194394 2,5E-04 113,3 elastase-like serine protease probable flavin-containing monoamine _contig_19442 1,9E-04 33,2 oxidase a-like ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase family member 7- _contig_194739 3,2E-04 805,8 like _contig_194873 9,4E-04 232,6 _contig_194949 1,7E-04 129,6 ammonium transporter rh type b-like myeloid-associated differentiation _contig_194954 1,3E-04 1240,4 marker homolog carcinoembryonic antigen-related cell _contig_195000 3,9E-05 1186,7 adhesion molecule 5 _contig_195011 7,6E-04 258,4 aquaporin 10a carcinoembryonic antigen-related cell _contig_195023 1,9E-04 790,8 adhesion molecule 5-like _contig_195057 1,1E-03 30,1 calcium transporter 2 _contig_195066 1,3E-03 141,3 PREDICTED: olfactomedin-4-like _contig_195112 1,9E-04 304,0 b( +)-type amino acid transporter 1-like _contig_195205 2,5E-04 231,1 hexokinase hkdc1-like _contig_195250 2,2E-04 653,8 complement c1q tumor necrosis factor- _contig_19535 6,7E-06 71,6 related protein 3-like _contig_195351 3,2E-04 462,6 _contig_195458 1,2E-03 154,4 unnamed protein product _contig_195539 2,8E-04 168,1 torsin-1b-like isoform 1 _contig_195569 1,0E-04 619,8 solute carrier family 23 member 1-like _contig_195591 1,9E-04 369,4 cgmp-dependent protein kinase 2-like _contig_195627 1,8E-04 819,2 thiamine transporter 2-like _contig_19617 3,2E-07 103,6 hepatocyte nuclear factor 4-alpha _contig_196319 7,4E-04 111,5 _contig_19632 5,4E-05 744,4 zonadhesin- partial _contig_196555 4,8E-04 335,9 _contig_19660 6,0E-05 11,6 complement factor h-like _contig_196660 3,2E-04 465,2 _contig_1967 4,1E-05 82,1 multivesicular body subunit 12b-like _contig_196747 1,7E-03 178,4 secretory phospholipase a2 receptor _contig_19767 2,7E-06 26,4 guanine deaminase 70

_contig_197675 8,3E-04 77,5 betaine--homocysteine s- _contig_19778 7,5E-05 39,9 methyltransferase 1-like carcinoembryonic antigen-related cell _contig_197811 4,4E-04 356,6 adhesion molecule 5-like _contig_19785 3,1E-06 2360,4 deleted in malignant brain tumors 1 _contig_1979 8,2E-06 644,0 complement component c9 _contig_19804 1,3E-06 156,2 PREDICTED: fetuin-B-like _contig_198237 5,8E-04 206,6 insulin-like growth factor binding _contig_19828 2,5E-07 356,6 protein 2 _contig_19848 2,6E-06 776,4 tyrosinase precursor _contig_198526 4,0E-04 112,1 _contig_198889 7,8E-04 83,3 galactosylceramide sulfotransferase-like _contig_19912 1,4E-03 4,1 cytoplasmic aconitate hydratase butyrophilin subfamily 1 member a1- _contig_199469 4,1E-04 372,1 like _contig_19952 8,4E-07 28,4 _contig_19990 1,3E-03 3,1 peroxisomal membrane protein 2-like alpha-2-macroglobulin-like protein 1- _contig_20010 2,3E-05 163,9 like _contig_20033 1,3E-04 23,6 plastin-1-like isoform 1 alanine--glyoxylate aminotransferase _contig_20074 2,6E-07 107,1 mitochondrial long-chain-fatty-acid-- ligase acsbg2- _contig_20135 8,4E-04 4,5 like _contig_201513 4,6E-04 200,7 Uncharacterized protein ectonucleoside triphosphate _contig_20199 5,3E-04 3,4 diphosphohydrolase 1 _contig_20229 1,0E-04 104,8 long-chain-fatty-acid-- ligase 5 _contig_202724 1,1E-03 76,6 _contig_20339 7,6E-04 30,1 adipose differentiation-related protein multiple inositol polyphosphate _contig_20386 7,1E-05 110,7 phosphatase 1-like _contig_20431 2,2E-04 581,2 nattectin precursor _contig_20475 1,4E-03 11,1 _contig_204751 2,5E-04 440,6 hexokinase hkdc1-like _contig_20611 1,4E-03 18,0 proglucagon ii _contig_20649 5,1E-06 68,9 2-oxoglutarate mitochondrial-like _contig_206494 5,1E-04 8,3 _contig_20668 2,4E-04 10,7 protein fam222a-like _contig_20675 2,9E-04 123,6 _contig_20740 1,2E-03 211,9 ---NA--- _contig_20789 8,2E-07 5810,9 cadherin-17 precursor

_contig_2087 7,4E-05 103,8 indoleamine -dioxygenase 2 aldehyde dehydrogenase family 8 _contig_20878 4,1E-07 145,1 member a1-like isoform 1 _contig_20901 3,3E-04 5,2 crumbs homolog 3 isoform cra_a _contig_2107 2,4E-06 504,5 formiminotransferase cyclodeaminase _contig_211 1,2E-05 15,6 fructose-bisphosphate aldolase b _contig_21101 2,5E-06 20,9 beta-ureidopropionase _contig_21210 1,0E-03 3,8 very long-chain acyl- synthetase-like _contig_21232 7,7E-04 3,1 probable thiopurine s-methyltransferase _contig_21262 3,8E-06 1368,2 coagulation factor vii _contig_21281 8,4E-05 47,9 #¿NOMBRE? _contig_21346 6,9E-05 162,0 patatin-like phospholipase domain- _contig_21436 7,7E-04 4,3 containing protein 2-like _contig_21595 3,0E-06 296,6 histidine ammonia-lyase-like _contig_21653 2,4E-04 17,1 pdzk1l protein _contig_2167 3,7E-06 481,9 trypsinogen-like protease 1 _contig_21718 3,3E-05 43,1 hydroxylysine kinase-like _contig_21728 1,0E-03 132,2 elastase 1 precursor _contig_2178 3,1E-06 592,8 toxin-1 precursor _contig_2180 8,7E-08 656,8 fructose- -bisphosphatase _contig_21869 4,6E-04 6,8 syntaxin-3-like isoform 3 ph domain leucine-rich repeat- _contig_21931 4,1E-04 14,3 containing protein phosphatase 1 _contig_21944 5,6E-05 8,0 protein fam59a-like _contig_21983 1,9E-04 4,2 gram domain-containing protein 2-like _contig_22036 7,2E-04 11,9 soluble guanylyl cyclase alpha1 subunit _contig_22053 7,2E-04 -32,5 metabotropic glutamate receptor 2 _contig_22061 5,5E-06 20,6 3-hydroxyanthranilate -dioxygenase _contig_22146 2,2E-04 135,0 _contig_22164 5,3E-06 489,3 tetraspanin-1 _contig_2219 5,7E-06 22,4 protein unc-93 homolog a-like _contig_22216 5,8E-06 1426,6 transmembrane protein 86a _contig_22227 5,9E-05 7,4 ceramide synthase 2 _contig_22279 3,6E-05 -3,9 deleted in malignant brain tumors 1 _contig_22313 1,9E-04 4,7 retinol dehydrogenase 12-like fxyd domain containing ion transport _contig_22341 1,4E-04 35,0 regulator 2 _contig_22354 1,7E-04 70,9 ---NA--- sulfotransferase family cytosolic 2b _contig_22391 3,2E-06 264,5 member 1 _contig_22410 3,3E-05 248,8 serum amyloid p-component-like

_contig_22414 5,2E-08 192,6 udp-glucuronosyltransferase 2a2-like _contig_22436 8,5E-06 315,6 coagulation factor vii _contig_22502 4,6E-04 14,0 band -like protein 3-like _contig_22589 1,0E-03 224,8 metalloreductase steap4-like _contig_22601 4,9E-07 772,5 matrix metalloproteinase _contig_22639 1,6E-03 7,3 desm protein receptor-type tyrosine-protein _contig_22644 2,4E-06 40,2 phosphatase f-like _contig_22728 2,2E-04 99,6 homeobox protein 2aa _contig_22884 1,1E-04 6,9 _contig_22888 6,9E-04 113,1 _contig_22952 6,4E-04 8,6 progranulin type i _contig_23058 6,6E-04 5,9 warm-temperature-acclimation-related _contig_2323 1,8E-06 638,6 65-kda protein _contig_232904 1,5E-03 124,0 _contig_23514 3,4E-05 173,4 hepatocyte nuclear factor 4-beta-like _contig_23563 8,6E-04 3,8 si:dkey- protein _contig_23672 8,7E-05 18,5 udp-glucuronosyltransferase 2a1-like _contig_23673 2,9E-04 5,0 ribonuclease uk114 hepatocellular carcinoma-associated _contig_23695 7,2E-07 577,1 protein td26 _contig_23756 2,4E-05 39,9 general secretion pathway protein i choline-phosphate cytidylyltransferase _contig_23761 2,1E-07 233,1 b-like _contig_23763 1,3E-04 124,5 g-box binding factor spermatogenesis-associated protein 13- _contig_23793 6,5E-05 10,3 like _contig_24050 6,6E-05 15,4 homeobox protein 3ab _contig_24058 2,9E-05 167,1 microsomal glutathione s-transferase 1 _contig_24090 1,8E-07 95,3 udp-glucuronosyltransferase 1-1-like _contig_2424 1,4E-06 646,8 si:ch73- protein _contig_24244 3,9E-06 338,8 _contig_24251 8,3E-07 863,5 apolipoprotein a-iv precursor _contig_24301 3,4E-04 67,5 nucleoside diphosphate kinase _contig_24304 1,4E-07 546,7 atp-dependent rna helicase mrh4 probable g-protein coupled receptor _contig_2434 4,1E-04 -3,3 116-like _contig_244 4,3E-07 674,1 14 kda apolipoprotein _contig_24566 1,3E-04 9,9 tpa_inf: aldehyde oxidase beta _contig_2459 2,4E-05 636,6 carboxypeptidase b _contig_24631 1,5E-05 116,6 ---NA--- _contig_2472 2,3E-05 11,5 methylsterol monooxygenase 1 73

_contig_24825 4,3E-04 4,9 _contig_24842 4,8E-04 13,2 tape measure domain protein _contig_24887 2,2E-04 38,1 protein disulfide-isomerase-like _contig_24998 3,5E-04 61,7 gata-binding factor 5-a-like 1-phosphatidylinositol- -bisphosphate _contig_25032 1,3E-03 3,3 phosphodiesterase gamma-2 _contig_25039 4,0E-04 15,2 ligand of numb protein x 2-like _contig_2504 1,4E-03 -6,7 hatching enzyme acyl- synthetase family member _contig_25051 7,2E-07 455,6 mitochondrial-like acyl- synthetase family member _contig_25052 1,5E-04 26,5 mitochondrial-like _contig_25164 1,6E-07 39,3 sec14-like protein 2-like _contig_2529 7,1E-05 7,5 klotho-like 2-amino-3-carboxymuconate-6- _contig_25298 1,5E-05 326,2 semialdehyde decarboxylase mannan-binding lectin serine protease _contig_25346 1,7E-06 1447,8 1-like _contig_25363 9,6E-05 2670,8 protein heg-like allc_danre ame: full=allantoicase ame: _contig_25383 3,3E-06 43,2 full=allantoate amidinohydrolase _contig_25416 8,9E-04 5,2 sporulation integral membrane protein _contig_25419 9,3E-06 608,1 bile acid receptor-like _contig_25443 1,3E-04 278,8 conserved hypothetical protein hypothetical protein _contig_25474 1,7E-03 9,5 ALOHA_HF4000APKG6D9ctg2g40 _contig_2548 2,9E-06 411,6 purine nucleoside phosphorylase _contig_25494 3,7E-04 3,9 suppressor of cytokine signaling 8 _contig_25518 3,4E-04 2614,6 aminopeptidase n-like _contig_25525 1,6E-05 10,3 zgc:162297 protein _contig_25600 1,3E-04 24,4 solute carrier family 23 member 1-like _contig_25625 1,4E-04 10,7 sideroflexin 1 _contig_25629 1,9E-05 1106,3 meprin a subunit alpha-like _contig_2569 5,4E-05 7,2 male-specific protein _contig_25732 6,7E-04 8,4 alpha-aspartyl dipeptidase catechol-o-methyltransferase domain- _contig_25760 1,0E-06 1854,9 containing protein 1 _contig_2584 1,8E-05 14,4 kynureninase-like _contig_25843 3,4E-04 20,3 fatty acid-binding intestinal _contig_25891 4,2E-04 37,4 ---NA--- _contig_25913 1,9E-07 1442,4 solute carrier family 22 member 13-like _contig_25946 1,3E-05 420,7 hypothetical protein WUBG_10038 _contig_25980 5,4E-04 5,6 loc100127872 protein _contig_26044 2,3E-04 479,3 bile salt-activated lipase-like 74

_contig_26199 4,5E-04 12,0 sperm protein homolog _contig_26214 4,9E-05 13,4 ocln_chick ame: full=occludin _contig_26227 5,5E-04 80,2 sc:d0144 protein _contig_26234 2,7E-05 65,0 probable g-protein coupled receptor 22 _contig_26243 2,0E-05 12,3 Protein C05D12.2 PREDICTED: uncharacterized protein _contig_2632 7,5E-06 26,2 LOC101173174 _contig_2647 2,4E-05 18,8 5-hydroxyisourate hydrolase-like PREDICTED: uncharacterized protein _contig_26655 2,5E-04 7,4 LOC101073758 _contig_2669 9,8E-04 3,6 alanine aminotransferase 2-like _contig_26699 2,8E-06 259,6 fbp32 precursor _contig_2672 2,8E-04 364,2 pancreatic trypsin _contig_26723 2,3E-04 4,7 hhip-like protein 1-like sodium- and chloride-dependent gaba _contig_2673 5,8E-07 226,6 transporter 2-like _contig_26827 5,2E-06 287,5 _contig_26946 1,1E-04 42,9 nxpe family member 3-like _contig_270 1,0E-06 457,3 transferrin _contig_27181 4,4E-06 113,3 ezrin isoform 2 _contig_27197 1,1E-05 117,8 endonuclease exonuclease phosphatase _contig_27285 8,5E-04 4,4 family domain-containing protein 1-like _contig_27294 7,9E-08 197,9 n-acetylserotonin o-methyltransferase- _contig_27346 1,9E-04 5,0 like _contig_27439 1,9E-04 49,5 collagen alpha-6 chain _contig_27502 1,1E-05 127,2 udp-glucuronosyltransferase 1-10-like conserved hypothetical membrane- _contig_27531 1,5E-06 1238,4 spanning protein _contig_27532 3,2E-06 1156,1 macrophage mannose receptor 1-like _contig_27551 4,1E-04 109,8 protein fam20a-like alanine--glyoxylate aminotransferase 2- _contig_27619 3,4E-04 6,3 like 1-like _contig_27622 3,0E-04 11,9 mucin- partial _contig_27629 2,0E-04 -5,8 rho gtpase-activating protein 19-like _contig_27633 3,5E-07 38,9 udp-glucuronosyltransferase 2b15-like _contig_27685 7,8E-06 25,6 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase _contig_27747 3,0E-04 7,0 cytosolic purine 5 -nucleotidase-like proline-rich protein 15-like protein a- _contig_27760 9,3E-04 6,8 like _contig_27770 6,4E-04 6,3 glycine cleavage system protein t _contig_27784 5,0E-06 621,6 claudin 3b _contig_27820 6,2E-05 7,6 75

_contig_27836 6,4E-08 273,1 af292396_1 transmembrane protein _contig_27910 9,0E-05 56,2 hypothetical protein SafeoMp21 _contig_28065 1,0E-03 4,7 reverse transcriptase _contig_28071 8,4E-07 190,3 solute carrier family 26 member 6-like _contig_28092 1,8E-05 7,5 _contig_28226 1,2E-03 3,3 hypothetical protein CBDKU1_30800 _contig_28347 3,7E-04 22,9 gag protein _contig_28414 5,4E-05 218,4 astacin like metallo-protease precursor PREDICTED: hypothetical protein _contig_28486 3,4E-07 577,3 LOC797886 _contig_28519 3,2E-04 6,8 tetratricopeptide repeat protein 7a _contig_28531 2,6E-05 71,6 PREDICTED: hypothetical protein _contig_28561 5,4E-05 13,3 LOC100693370 _contig_28586 2,2E-07 12061,0 niemann-pick c1-like protein 1-like _contig_28624 5,3E-08 77,4 xanthine dehydrogenase oxidase-like udp- c:betagal beta- -n- _contig_28643 1,2E-03 7,5 acetylglucosaminyltransferase 7-like group xiib secretory phospholipase a2- _contig_28645 8,4E-07 333,0 like _contig_28683 1,9E-05 12,0 cytochrome p450 2j2-like _contig_2880 1,7E-05 342,6 chymotrypsinogen 1 hypothetical protein _contig_28905 2,2E-04 176,9 BRAFLDRAFT_105675 _contig_28920 1,8E-05 153,1 claudin 26 _contig_2893 2,0E-05 15,8 tyrosine aminotransferase PREDICTED: uncharacterized protein _contig_29087 1,1E-03 12,0 LOC101166209 _contig_2915 3,0E-05 63,9 carboxypeptidase a1 precursor _contig_2917 1,1E-04 -3,4 gtpase imap family member 8-like _contig_29290 2,3E-05 497,0 met16_dicdi ame: full=methyltransferase-like protein 16 homolog ame: full=methyltransferase _contig_29328 1,0E-04 161,1 10 domain-containing protein _contig_29435 1,8E-03 4,3 reverse transcriptase-like protein _contig_29475 8,2E-05 9,1 methyltransferase-like protein 7a-like _contig_29496 7,4E-06 342,2 ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase family member 3- _contig_29497 6,3E-06 39,2 like _contig_29569 7,0E-05 194,0 30s ribosomal protein s1 _contig_2961 4,1E-04 201,4 uridine phosphorylase 2 _contig_2964 2,5E-06 493,1 protein ambp-like

_contig_29665 3,7E-05 144,1 carboxypeptidase n subunit 2-like _contig_2970 1,7E-05 372,6 carboxypeptidase a2 precursor hematopoietically-expressed homeobox _contig_29700 6,5E-04 5,5 protein hhex _contig_29722 4,3E-05 18,1 loc558601 protein _contig_2980 1,8E-05 49,6 pancreatic lipase-related protein 1 _contig_29803 3,7E-05 68,9 _contig_2996 2,1E-05 271,5 _contig_29965 1,5E-04 85,3 _contig_2997 4,2E-05 384,9 elastase 4 precursor phospholipid hydroperoxide glutathione _contig_29970 5,7E-07 228,2 mitochondrial-like transmembrane 4 l6 family member 4- _contig_30030 4,1E-06 75,6 like _contig_30069 7,0E-04 19,5 hypothetical protein D477_011671 cub and zona pellucida-like domain- _contig_3012 4,8E-04 -3,3 containing protein 1-like acetyl-coenzyme a synthetase 2- _contig_30127 1,1E-03 6,2 mitochondrial-like _contig_3022 1,2E-04 270,7 elastase 1 precursor _contig_30232 2,2E-06 28,0 aspartate cytoplasmic-like _contig_30241 7,3E-05 5,8 homogentisate -dioxygenase _contig_30315 1,4E-03 6,2 thymidylate synthase thyx na(+) h(+) exchange regulatory cofactor _contig_30366 3,0E-05 59,0 nhe-rf3-like _contig_30429 2,4E-07 438,2 matrix metalloproteinase _contig_30451 2,6E-04 24,6 unconventional myosin-viia solute carrier family member isoform _contig_30491 6,6E-05 179,1 cra_b _contig_30549 1,3E-07 2419,8 malate synthase-like _contig_30550 2,8E-04 6,6 cell adhesion molecule 4-like _contig_30566 3,6E-05 8,1 neutral and basic amino acid transport _contig_30680 5,0E-04 6,7 protein rbat _contig_30729 4,4E-04 5,4 upf0638 protein b-like 25-hydroxyvitamin d-1 alpha _contig_30857 4,6E-07 46,6 mitochondrial-like coenzyme q-binding protein coq10 _contig_30902 3,2E-06 469,3 mitochondrial-like _contig_30962 1,1E-03 5,2 transmembrane protein 198-b-like _contig_3105 1,3E-04 121,9 claudin 15a _contig_31126 3,3E-04 7,9 farnesyl pyrophosphate synthase-like _contig_3113 1,1E-04 11,6 carbonic anhydrase 7-like _contig_3116 1,1E-05 47,3 complement factor h-like

_contig_31168 1,1E-03 -2,8 e3 ubiquitin-protein ligase trim39-like _contig_3117 1,1E-05 173,7 poly -specific endoribonuclease-like _contig_31194 2,0E-05 41,4 glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase _contig_31308 1,4E-07 37,8 lymphocyte g0 g1 switch protein 2 sodium-coupled monocarboxylate _contig_31338 1,3E-04 196,3 transporter 1 probable pancreatic secretory proteinase _contig_31357 1,8E-05 417,2 inhibitor-like _contig_31389 7,0E-04 -7,9 histidine kinase sensor protein immunoglobulin superfamily member _contig_31390 1,9E-04 9,0 5-like 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase- _contig_31400 6,5E-06 14,9 like _contig_31432 6,0E-05 11,5 zgc:55856 protein sulfotransferase family cytosolic 2b _contig_31588 1,2E-04 7,4 member 1-like _contig_31617 4,8E-04 13,2 _contig_31713 7,5E-04 -10,2 pas domain s-box family protein _contig_31725 1,9E-05 140,7 cytochrome p450 2k1-like isoform 2 _contig_31758 1,5E-04 269,8 _contig_31764 1,1E-04 6,2 reverse transcriptase-like protein _contig_31812 4,8E-06 881,3 nonribosomal peptide synthetase _contig_3184 3,1E-05 285,3 complement factor h-related 1 _contig_3203 9,1E-05 24,1 astacin like metallo-protease precursor _contig_32116 9,3E-04 -3,3 troponin fast skeletal muscle-like sodium-dependent neutral amino acid _contig_32125 5,2E-04 432,5 transporter b at1-like _contig_32134 6,6E-04 95,9 zonadhesin-like protein _contig_32142 1,3E-04 65,8 _contig_32222 7,3E-06 31,5 protein ambp-like _contig_32409 3,8E-05 5,2 phosphomevalonate kinase-like _contig_32468 1,9E-04 4,0 hepcidin-like precursor _contig_32506 1,3E-03 -3,2 carcinoembryonic antigen-related cell _contig_32522 6,8E-07 146,9 adhesion molecule 8-like _contig_32540 1,1E-04 830,7 sushi domain-containing protein 2-like hypothetical protein _contig_32541 1,6E-03 6,0 BRAFLDRAFT_89803 _contig_32565 6,0E-05 11,8 gtp cyclohydrolase 1-like _contig_32630 7,8E-04 9,9 alpha-protein kinase partial hypothetical protein _contig_32637 2,3E-05 -24,6 ACD_27C00032G0012 multidrug and toxin extrusion protein 1- _contig_32642 1,6E-04 6,5 like

_contig_32664 5,8E-04 75,4 _contig_32695 6,2E-04 4,1 _contig_3284 1,5E-06 20,2 mitochondrial ornithine transporter 1 _contig_32854 7,4E-06 236,7 endonuclease domain-containing 1 _contig_32884 9,8E-06 409,0 hepatic lipase _contig_33104 1,3E-03 5,5 serine incorporator 1 _contig_3314 7,3E-05 6,6 delta -sterol reductase-like _contig_33143 1,2E-05 346,7 coagulation factor ix precursor _contig_33175 1,5E-03 8,5 riboflavin transporter 2-a-like _contig_3318 6,6E-06 923,9 ceruloplasmin low quality protein: complement factor _contig_33203 7,3E-04 -2,5 b-like _contig_33234 1,3E-05 621,7 acidic mammalian chitinase-like _contig_33242 8,1E-06 12,6 leptin b1 _contig_33277 7,8E-05 174,8 claudin 15 like c-type lectin domain family 4 member _contig_333 4,1E-07 215,8 m-like _contig_33329 5,1E-06 589,8 _contig_33334 8,4E-06 17853,3 apolipoprotein a-iv-like _contig_33335 3,1E-04 1238,7 apolipoprotein a-iv-like _contig_33342 1,0E-03 9,5 monocarboxylate transporter 7-like _contig_33359 1,6E-03 3,1 protein gtlf3b-like _contig_335 1,4E-04 284,2 pancreatic elastase _contig_33615 4,2E-05 430,2 keratin 18 _contig_33635 1,7E-04 19,4 neuromedin-u receptor 1-like _contig_33695 6,8E-04 174,0 killer cell lectin-like receptor 2- partial _contig_33696 1,3E-05 2154,8 ---NA--- _contig_33798 3,9E-07 115,1 transmembrane protease serine 6 atp-binding cassette sub-family g _contig_33999 8,8E-05 24,5 member 2 transmembrane 6 superfamily member _contig_34066 9,1E-07 632,5 2-like _contig_34135 3,9E-04 74,3 ---NA--- _contig_34180 2,6E-04 7,6 retinol dehydrogenase 11-like multidrug resistance-associated protein _contig_34200 8,1E-06 12,9 9-like _contig_34204 2,7E-04 6,1 vesicle-associated membrane protein 8 deleted in malignant brain tumors 1 _contig_34211 1,9E-05 873,7 partial _contig_3427 2,0E-07 189,0 apobec1 complementation factor-like _contig_34352 1,7E-04 15,9 unconventional myosin-xv-like _contig_34370 3,2E-05 29,0 protein c19orf21 like protein _contig_34451 1,3E-04 18,2 b( +)-type amino acid transporter 1 79

_contig_345 7,6E-04 4,0 homogentisate -dioxygenase alpha-2-macroglobulin-like protein 1- _contig_34511 3,6E-06 664,8 like PREDICTED: hypothetical protein _contig_34554 3,4E-06 694,5 LOC100693548 _contig_34563 3,0E-06 442,7 apolipoprotein a-iv precursor decay accelerating factor for _contig_34645 7,9E-05 13,6 complement isoform 1 prepro basement membrane-specific heparan _contig_3475 1,8E-07 711,8 sulfate proteoglycan core _contig_34812 6,8E-06 19,2 _contig_34917 1,5E-04 19,2 carboxypeptidase o-like _contig_35020 1,5E-04 20,2 sodium nucleoside cotransporter 1-like _contig_35047 4,5E-04 46,6 glycerate kinase-like _contig_3529 4,7E-04 7,7 serine hydrolase-like _contig_3532 1,1E-03 4,7 mitochondrial precursor _contig_3535 1,2E-06 89,9 phosphoethanolamine methyltransferase multidrug and toxin extrusion protein 1- _contig_35382 1,2E-03 22,5 like abhydrolase domain-containing protein _contig_35408 1,5E-04 5,6 15-like _contig_35415 1,1E-05 13,9 hypothetical protein Mvan_2002 alanine--glyoxylate aminotransferase _contig_35504 2,7E-06 61,6 mitochondrial _contig_35654 5,5E-04 11,7 sodium calcium exchanger 1-like _contig_35675 6,3E-04 6,1 squalene synthase-like udp-glucuronosyltransferase 2a1- _contig_35775 9,5E-04 10,9 partial PREDICTED: hypothetical protein _contig_35799 2,2E-04 16,8 LOC100712045 _contig_358 4,6E-04 3,8 choline kinase alpha-like _contig_36028 1,6E-05 18,6 sjchgc03036 protein _contig_36032 1,2E-03 12,8 xaa-pro aminopeptidase 2 hypothetical protein _contig_36040 1,7E-03 5,2 HMPREF9129_1532 _contig_36043 1,5E-03 8,6 _contig_36053 4,2E-05 12,1 lanosterol synthase-like _contig_3616 1,2E-06 364,9 c-type lysozyme _contig_36270 1,3E-03 5,3 delta -sterol reductase-like _contig_36272 7,3E-06 144,5 leucine-rich alpha-2-glyco _contig_36296 5,9E-07 103,4 prominin- splice variant _contig_36302 8,7E-04 9,8 erythrocyte band 7 integral membrane _contig_36309 9,1E-04 7,5 y+l amino acid transporter 1 _contig_3635 4,2E-06 37,5

_contig_364 1,8E-03 4,4 middle subunit-like _contig_36536 5,1E-06 633,3 tbt-binding partial _contig_3654 6,2E-04 -2,5 ubiquitin-like protein precursor probable e3 ubiquitin-protein ligase _contig_36590 1,1E-03 4,3 herc6 _contig_36668 1,3E-03 17,9 _contig_36739 4,2E-06 776,5 _contig_36756 8,1E-06 196,3 transcription factor gata-6-like _contig_3705 1,2E-05 36,2 fatty acyl- hydrolase medium chain-like _contig_37162 8,9E-06 25,7 middle subunit-like _contig_37193 8,0E-04 31,9 protein homolog _contig_373 6,3E-07 482,7 tributyltin binding protein type 1 _contig_37432 1,7E-04 1137,3 natterin-3-like _contig_37444 1,4E-05 451,6 _contig_37463 7,7E-04 38,4 solute carrier family 26 member 6-like tropomyosin alpha-4 chain-like isoform _contig_37695 4,5E-05 64,6 5 _contig_3773 2,1E-04 5,0 lipoprotein lipase _contig_3779 2,3E-04 4,8 fumarylacetoacetase wd repeat domain phosphoinositide- _contig_37819 4,6E-05 42,1 interacting protein 3-like _contig_37834 6,1E-04 5,5 hypothetical protein GAGA_0929 _contig_37971 8,0E-04 11,9 solute carrier family 22 member 13-like microsomal triglyceride transfer protein _contig_3798 1,1E-06 62,3 large subunit chymotrypsin-like elastase family _contig_37998 8,1E-05 490,1 member 3b precursor PREDICTED: uncharacterized protein _contig_38000 3,4E-06 17,8 LOC101170276 _contig_38164 1,1E-03 3,6 mevalonate kinase-like _contig_38368 2,4E-05 93,6 tonb-dependent receptor _contig_3838 8,9E-06 100,4 _contig_3841 5,1E-05 12,8 nebulin-related-anchoring protein rap guanine nucleotide exchange factor _contig_38513 1,4E-05 13,8 4-like atp-binding cassette sub-family a _contig_38557 1,1E-03 72,6 member 1 n-acetylserotonin o-methyltransferase- _contig_38567 1,6E-03 3,8 like _contig_38600 3,5E-04 9,9 amine oxidase _contig_38602 8,4E-06 125,1 complement c1q-like protein 2-like _contig_38767 2,8E-06 5175,7 guanylin precursor membrane-associated guanylate ww and _contig_38868 1,8E-05 13,3 pdz domain-containing protein 2-like

_contig_3887 2,5E-05 7,2 gata binding protein 4 ph domain-containing protein c10orf81- _contig_3895 1,1E-03 -2,7 like _contig_38997 1,6E-04 244,6 platelet glycoprotein 4-like g-protein coupled receptor family c _contig_39008 1,6E-05 10,6 group 5 member c-like _contig_39216 2,4E-06 102,5 coagulation factor x-like _contig_39217 7,8E-05 51,3 meprin alpha (paba peptide hydrolase) _contig_39311 1,4E-03 44,7 ---NA--- _contig_3946 1,0E-06 363,1 si:ch211- protein chloride intracellular channel protein 5- _contig_39505 7,2E-07 160,0 like _contig_39691 1,1E-04 11,6 acyl-coenzyme a thioesterase 5 _contig_397 4,1E-06 702,1 apolipoprotein b-100 _contig_39730 3,1E-04 13,7 ni fe- b-type cytochrome subunit _contig_39776 1,1E-04 16,0 indian hedgehog b _contig_39791 6,0E-06 539,1 collectin sub-family member 11 _contig_39857 4,8E-06 27,9 fibrinogen alpha chain-like _contig_39988 1,8E-05 32,7 transferrin receptor protein 2-like _contig_40062 8,7E-04 5,1 conserved plasmodium protein _contig_4010 1,7E-04 21,0 alcohol dehydrogenase 1-like _contig_40122 4,4E-06 104,3 _contig_40160 1,7E-04 11,2 retinol dehydrogenase 11-like _contig_40162 2,9E-04 28,4 _contig_4018 7,1E-05 335,7 ependymin precursor _contig_40251 5,9E-05 82,0 angiotensin-converting enzyme 2-like _contig_40339 3,1E-06 310,4 _contig_40440 1,0E-04 416,3 small integral membrane protein 1 heparan sulfate glucosamine 3-o- _contig_40466 1,7E-03 3,4 sulfotransferase 3b1-like _contig_40492 3,1E-04 133,3 _contig_40568 1,4E-05 326,7 protein fam55c-like _contig_40686 9,7E-05 326,2 alkaline tissue-nonspecific isozyme-like _contig_407 5,2E-04 6,5 cysteine dioxygenase _contig_40760 9,8E-05 171,9 ---NA--- _contig_40797 7,4E-06 22,9 diacylglycerol o-acyltransferase 2 _contig_4081 1,4E-05 10,0 mpv17-like protein _contig_40820 3,8E-04 17,8 usher syndrome 1c (autosomal severe) _contig_40855 1,1E-04 20,5 immunoglobulin i-set domain protein _contig_40858 2,5E-08 439,9 rna exonuclease 1 homolog protein phosphatase 1 regulatory _contig_40864 1,1E-05 127,0 subunit 3g-like

_contig_40908 4,4E-04 26,8 ---NA--- _contig_4104 9,1E-04 3,2 tetratricopeptide repeat protein 36 _contig_41130 1,4E-04 148,3 low affinity cationic amino acid _contig_4121 1,3E-04 5,1 transporter 2-like _contig_41297 9,3E-05 10,1 mucolipin 2 _contig_41307 9,0E-06 15,7 _contig_41321 2,6E-07 628,0 ethanolamine kinase 1-like _contig_41572 6,7E-04 24,7 endoplasmic reticulum resident protein _contig_41732 5,1E-04 110,4 27-like _contig_41787 2,2E-04 28,5 _contig_41890 1,1E-04 15,6 vitamin d 25-hydroxylase-like gtp cyclohydrolase 1 feedback _contig_4193 7,9E-05 6,8 regulatory protein _contig_41994 5,4E-05 25,2 _contig_42118 1,4E-04 23,5 _contig_42122 2,5E-05 11,6 _contig_42144 8,9E-05 6,2 threonine synthase-like 2 _contig_42189 8,1E-04 18,0 _contig_42239 1,1E-03 94,7 _contig_42250 5,8E-04 18,5 cytochrome p450 4v2-like _contig_42354 1,3E-03 4,5 _contig_42359 5,0E-06 38,9 _contig_4236 1,8E-07 51,5 cytochrome p450 2j6-like _contig_42545 6,8E-07 156,1 leucine-rich alpha-2-glyco _contig_42649 7,4E-04 24,4 _contig_42829 3,0E-04 229,8 _contig_42868 1,0E-04 1839,9 clarin-3 _contig_4306 3,9E-06 630,4 complement factor b-like _contig_4309 4,4E-08 728,3 serine--pyruvate mitochondrial-like neutral cholesterol ester hydrolase 1- _contig_43120 1,6E-04 33,8 like 1-phosphatidylinositol _contig_43125 7,7E-04 111,6 phosphodiesterase-like _contig_43221 1,0E-03 5,1 _contig_43274 8,0E-06 57,5 _contig_4330 1,6E-06 33,7 tyrosinase precursor _contig_43313 1,2E-03 3,8 organic solute transporter subunit alpha- _contig_43343 1,4E-04 11,8 like _contig_43350 4,3E-04 20,5 reverse transcriptase-like protein _contig_43417 1,9E-04 14,9 83

_contig_43429 1,7E-04 90,5 secretory phospholipase a2 receptor-like proline-rich protein 15-like protein a- _contig_43430 3,0E-04 5,7 like _contig_43514 5,6E-04 74,9 _contig_436 3,8E-08 271,9 apolipoprotein c-i _contig_43640 1,2E-05 1062,9 nuclear receptor subfamily 5 group a _contig_43745 4,1E-06 1553,3 member 5 _contig_43798 1,1E-03 4,3 glycine n-methyltransferase _contig_43939 1,5E-03 2,7 quinone oxidoreductase pig3-like _contig_44018 7,8E-06 16,6 cholesterol 24-hydroxylase-like _contig_44165 6,6E-05 1192,8 solute carrier family 22 member 5-like _contig_44215 3,5E-04 4,4 probable gluconokinase _contig_4422 2,2E-06 -4,2 choline transporter-like protein 4-like _contig_4423 7,8E-05 399,5 complement component c3 _contig_44282 8,8E-06 10,3 solute carrier family 23 member 2-like _contig_44341 3,0E-04 6,6 udp-glucuronosyltransferase 2a1-like _contig_44440 1,5E-06 78,5 alkylglycerol monooxygenase chymotrypsin-like elastase family _contig_44545 2,8E-04 57,6 member 3b-like _contig_44623 1,0E-03 15,4 _contig_44694 5,0E-05 120,6 immune- lectin-like receptor 4 cytochrome family subfamily _contig_44891 2,1E-05 183,4 polypeptide 24 _contig_44909 5,9E-06 409,9 aminopeptidase n-like sodium-dependent phosphate transport _contig_44918 3,3E-05 91,5 protein 2b _contig_4512 5,9E-04 4,0 at-rich interactive domain-containing _contig_45208 1,2E-03 6,2 protein 3b-like _contig_45211 1,6E-03 -5,4 _contig_45251 1,3E-03 19,3 _contig_45284 1,2E-03 15,2 hydroxymethylglutaryl- cytoplasmic- _contig_453 1,5E-05 12,8 like _contig_45356 8,0E-04 19,1 ---NA--- _contig_454 4,7E-06 589,6 ahsg protein _contig_45589 5,1E-06 501,0 na-k-cl cotransporter _contig_4561 1,1E-04 5,3 udp-glucuronosyltransferase _contig_45626 8,6E-05 -16,9 sodium-dependent multivitamin _contig_4563 6,8E-04 4,6 transporter-like _contig_45827 7,9E-04 7,8 glucagon-like peptide 2 receptor _contig_45853 1,0E-04 9,9 upf0733 protein c2orf88 homolog 84

_contig_45910 8,9E-07 373,5 _contig_46071 3,1E-04 38,4 cysteine sulfinic acid decarboxylase _contig_46236 1,5E-03 191,3 _contig_46252 1,7E-05 28,4 p2y purinoceptor 1-like _contig_46416 2,7E-06 29,4 nuclear receptor coactivator 7-like _contig_46435 6,1E-04 8,9 phospholipase a1 member a-like _contig_46499 2,7E-04 14,1 ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase family member 2- _contig_4653 1,1E-03 4,8 like _contig_4654 1,4E-04 6,4 cytochrome p450 1a _contig_46552 1,7E-03 7,5 thromboxane a2 receptor _contig_46671 3,8E-06 140,9 _contig_4678 1,1E-04 8,1 collagenase 3 precursor _contig_46807 5,5E-04 8,7 collectin sub-family member 10 _contig_4685 2,1E-05 19,9 programmed cell death 1 ligand 1-like _contig_46904 1,7E-06 11,5 _contig_46956 7,6E-05 108,5 loc100135188 protein _contig_47076 1,7E-03 39,8 cd82 antigen _contig_47091 5,2E-04 120,3 _contig_4725 1,5E-06 51,9 cytochrome p450 cyp2n voltage-gated potassium channel _contig_47303 3,7E-04 60,2 subunit beta-2 isoform 1 _contig_47314 2,8E-04 10,1 retinoic acid receptor responder protein _contig_47343 1,2E-03 53,0 3 _contig_4741 3,2E-04 32,6 _contig_47534 2,0E-05 293,2 hepatic lipase _contig_47622 1,4E-03 6,9 _contig_47625 8,0E-06 18,2 cholesterol 24-hydroxylase-like high affinity cgmp-specific 3 -cyclic _contig_47635 9,3E-04 118,8 phosphodiesterase 9a-like potassium voltage-gated channel _contig_47660 1,5E-04 15,4 subfamily kqt member 1-like _contig_4770 2,7E-07 949,6 retinol-binding protein 2-like cholesterol 7-alpha-monooxygenase- _contig_47705 1,7E-04 56,5 like immunoglobulin superfamily dcc _contig_47836 1,2E-03 5,7 subclass member 4-like _contig_47842 6,9E-05 15,5 ---NA--- _contig_4805 9,2E-04 13,0 _contig_48089 1,1E-03 -5,9 _contig_481 1,0E-06 349,1 apolipoprotein c-ii

_contig_48235 6,9E-07 162,7 _contig_48275 7,3E-04 6,6 magnesium transporter nipa4-like _contig_48367 2,3E-06 329,8 _contig_48398 1,1E-03 11,0 cygb1_oryla ame: full=cytoglobin-1 _contig_48459 2,0E-04 281,5 _contig_4868 1,4E-06 217,5 hepatocyte growth factor-like protein inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain _contig_48689 7,6E-05 12,8 h3-like _contig_4874 1,1E-04 72,0 zgc:162946 protein _contig_489 2,0E-04 297,9 trypsinogen 1 _contig_48959 3,4E-06 357,2 _contig_49418 2,7E-04 138,5 _contig_49432 4,4E-06 199,3 cell death activator cide-3 _contig_49470 1,3E-08 1613,8 gram domain-containing protein 3-like protein-glutamine gamma- _contig_49635 7,6E-04 39,8 glutamyltransferase 2 dihydroxyacetone phosphate _contig_49724 6,7E-04 8,9 acyltransferase-like _contig_4986 8,1E-06 255,0 zinc finger protein rfp-like _contig_49885 8,8E-05 73,7 _contig_49923 1,7E-07 927,9 _contig_49949 4,6E-08 845,1 peptidoglycan recognition protein ii _contig_5003 1,8E-03 5,1 _contig_50075 1,3E-03 3,0 _contig_50110 1,9E-04 55,4 _contig_50194 4,0E-06 870,8 ethanolamine kinase _contig_5035 2,1E-04 414,9 trypsinogen 3 _contig_5043 1,9E-05 75,6 solute carrier family 43 member 3-like _contig_50430 1,7E-03 33,6 _contig_50432 3,8E-04 6,6 solute carrier family 13 member 5-like solute carrier family 13 (sodium- dependent dicarboxylate transporter) _contig_50433 6,1E-05 2743,2 member 2 _contig_50443 2,2E-05 70,2 _contig_50498 7,3E-04 18,9 integrin alpha-6-like _contig_50532 1,4E-04 37,8 e3 ubiquitin-protein ligase trim41-like eukaryotic translation initiation factor _contig_5055 4,3E-04 3,8 4e-binding protein 1-like _contig_50650 1,2E-04 35,5 annexin a9-like _contig_50676 6,0E-05 27,1 trimethyllysine mitochondrial-like _contig_50715 6,9E-05 464,9 apolipoprotein b-100-like _contig_5086 4,0E-04 187,6 trypsinogen 1a

_contig_5089 2,1E-06 69,4 sterol o-acyltransferase 2 _contig_50996 7,1E-04 3,8 homeobox protein hmx1 potassium channel subfamily k member _contig_5103 3,9E-04 18,6 18-like _contig_5105 2,8E-05 2290,7 trypsinogen 1 _contig_51148 6,9E-06 394,0 metalloreductase steap4-like _contig_51279 5,7E-04 15,2 interferon-induced protein with _contig_51332 2,1E-04 20,9 tetratricopeptide repeats 2-like _contig_51342 4,3E-05 214,8 group xiib secretory phospholipase a2- _contig_5160 1,8E-05 554,1 like protein precursor _contig_51727 1,2E-04 408,8 aspartate-semialdehyde dehydrogenase c-type lectin domain family 4 member _contig_51729 6,1E-04 57,2 m-like _contig_51756 3,6E-06 15,5 cytochrome p450 2k1-like complement component c8 gamma _contig_5190 7,7E-08 1067,2 chain precursor _contig_52050 1,6E-06 1245,6 somatostatin receptor type 2-like fatty acid hydroxylase domain _contig_5209 9,6E-06 33,1 containing 2 _contig_52130 3,8E-05 19,0 solute carrier family 35 member d3-like _contig_52189 2,3E-04 8,7 _contig_52222 7,1E-06 504,4 transmembrane protein 229b _contig_52234 6,2E-06 33,9 globoside alpha- -n- _contig_52342 1,5E-03 18,0 acetylgalactosaminyltransferase 1-like _contig_52453 5,4E-05 13,1 _contig_5248 8,2E-05 41,1 udp-glucuronosyltransferase 2a2-like oncostatin-m-specific receptor subunit _contig_52608 4,4E-04 8,2 beta-like _contig_52631 1,7E-03 59,6 neuromedin b _contig_52658 5,1E-07 664,9 protein nap homolog 1-like _contig_52923 1,6E-03 7,1 kallikrein-14-like isoform 1 _contig_5294 1,3E-05 865,2 _contig_52940 8,0E-05 3162,9 _contig_52944 5,1E-05 231,2 _contig_53171 8,0E-05 185,0 _contig_53257 3,0E-04 -7,7 cholesterol 7-alpha-monooxygenase- _contig_53417 6,6E-05 16,1 like _contig_53460 6,6E-05 10,5 solute carrier family 25 member 38 zymogen granule membrane protein 16 _contig_5363 1,8E-03 -5,9 precursor

betaine--homocysteine s- _contig_53702 3,0E-04 25,7 methyltransferase 1-like _contig_53703 2,4E-06 1072,7 udp-glucuronosyltransferase 2a3-like _contig_53712 2,4E-05 256,1 long-chain fatty acid transport protein _contig_53824 7,2E-05 8,4 6-like interferon-induced very large gtpase 1- _contig_53849 1,6E-04 28,2 like _contig_539 7,4E-06 10,6 cytochrome p450 2k1-like _contig_5390 6,8E-05 8,0 24-dehydrocholesterol reductase nuclear receptor subfamily 1 group d _contig_53900 9,0E-06 -5,4 member 2-like saxitoxin and tetrodotoxin-binding _contig_5394 2,2E-06 604,9 protein 1-like _contig_54028 2,6E-04 65,3 dep domain-containing mtor-interacting _contig_54157 1,4E-03 75,0 sh3 domain and tetratricopeptide repeat- _contig_54180 4,6E-04 9,9 containing protein 1-like complement component c8 alpha chain- _contig_5420 3,7E-06 610,1 like _contig_54371 4,9E-05 141,8 g-protein coupled receptor family c _contig_5461 2,6E-04 -5,4 group 6 member a isoform 3 _contig_54662 5,4E-04 -4,0 transcription factor etv7-like _contig_5472 4,1E-04 3,5 alanine aminotransferase 2-like mannan-binding lectin serine protease _contig_54843 1,7E-04 15,4 1-like _contig_54847 1,5E-03 5,4 autophagy-related protein 16-1-like _contig_54883 4,4E-05 250,5 _contig_5494 6,9E-07 533,5 complement component c3 _contig_54954 4,5E-04 30,3 probable proline dehydrogenase 2 _contig_55046 4,9E-05 11,5 _contig_55058 5,8E-04 -3,1 replication protein a2 _contig_5517 1,5E-03 4,5 very long-chain acyl- synthetase-like _contig_552 4,1E-06 5610,3 apolipoprotein a-iv precursor _contig_55274 1,5E-03 3,1 _contig_554 1,6E-06 4328,2 apolipoprotein a-iv1 _contig_55563 3,8E-04 9,5 _contig_55605 1,6E-03 28,3 complement c1q tumor necrosis factor- _contig_5563 2,5E-06 299,5 related protein 3-like _contig_55994 1,7E-04 6,2 _contig_5600 8,3E-06 17,5 histamine n-methyltransferase _contig_56001 9,7E-05 6,4

PREDICTED: hypothetical protein _contig_56020 6,9E-05 325,4 LOC100690030 _contig_56340 1,5E-05 99,5 unconventional myosin-ih-like _contig_564 2,2E-04 5,5 phosphoglycerate mutase 1 _contig_56402 3,1E-06 243,8 _contig_565 8,2E-06 492,9 tributyltin binding protein type 2 trp3_pseam ame: full=trypsinogen-like _contig_56564 4,9E-04 17,8 protein 3 flags: precursor _contig_56745 2,9E-05 151,0 glyoxylate reductase hydroxypyruvate _contig_5682 9,4E-06 21,5 reductase-like isoform 1 _contig_56878 6,8E-04 -5,0 _contig_5730 1,4E-06 538,9 cd59 glycoprotein precursor _contig_5733 6,3E-06 26,2 alpha -sialyltransferase _contig_577 6,5E-04 4,9 fibronectin precursor marvel domain-containing protein 2- _contig_57747 1,6E-05 94,8 like multidrug and toxin extrusion protein 1- _contig_57796 1,0E-03 86,3 like 4-aminobutyrate mitochondrial _contig_578 6,9E-05 10,2 precursor _contig_57965 3,6E-04 8,0 thymidine phosphorylase-like glycerophosphodiester phosphodiesterase domain-containing _contig_5803 3,2E-05 10,2 protein 1-like _contig_58054 1,4E-03 6,2 _contig_5815 1,1E-05 231,2 trypsinogen 1 _contig_5816 1,0E-06 28,4 gtp cyclohydrolase 1 cholesterol 7-alpha-monooxygenase- _contig_58195 1,3E-04 15,9 like _contig_58305 2,8E-04 7,5 transcription factor 21 _contig_58335 3,9E-05 -4,0 choline transporter-like protein 4-like _contig_5834 2,7E-04 5,1 pci domain-containing protein 2 _contig_5855 1,6E-03 4,0 #¿NOMBRE? _contig_58670 7,6E-04 5,9 dna-binding protein inhibitor id-3 c-type lectin domain family 10 member _contig_5872 1,4E-06 369,2 a-like _contig_58732 1,6E-04 29,2 _contig_588 6,0E-07 464,3 protein z-dependent protease inhibitor _contig_5909 7,3E-07 55,6 mitochondrial uncoupling protein 1 n-acetylated-alpha-linked acidic _contig_59096 4,0E-05 351,0 dipeptidase-like protein _contig_592 4,1E-07 774,7 antithrombin iii _contig_59239 2,1E-07 1736,2 _contig_59256 3,3E-07 521,7 protein fam55c-like 89

_contig_59288 3,3E-05 67,6 2-acylglycerol o-acyltransferase 2 _contig_59338 2,1E-05 288,6 tumor susceptibility protein partial _contig_59423 1,5E-03 -3,2 transmembrane channel-like protein 5- _contig_59523 2,9E-04 79,6 like _contig_59557 5,9E-05 204,3 _contig_59597 3,7E-04 9,3 succinyl- ligase _contig_59637 3,2E-04 84,8 _contig_59657 1,7E-06 76,6 aldo-keto reductase _contig_59764 3,0E-04 -4,3 nadph oxidase organizer 1-like _contig_59772 4,3E-04 -3,3 _contig_5993 1,1E-05 515,4 integrin beta-1 precursor _contig_59986 5,5E-04 105,3 mannose-binding lectin-associated _contig_60119 2,0E-05 136,3 serine protease- partial _contig_6019 1,3E-05 20,2 dihydropyrimidine dehydrogenase _contig_60263 2,5E-04 122,9 protocadherin-23-like _contig_60287 1,1E-05 402,9 solute carrier family 15 member 1-like _contig_6075 3,9E-06 438,5 hyaluronan-binding protein 2-like _contig_60982 1,5E-03 14,4 solute carrier family 26 member 6 _contig_610 2,9E-07 222,1 _contig_61274 9,7E-07 268,1 coagulation factor v organic solute transporter subunit _contig_6133 2,7E-07 278,6 partial _contig_61382 1,6E-03 115,2 glycine cleavage system h _contig_6164 2,4E-04 18,3 mitochondrial precursor _contig_6177 1,4E-06 29,9 nuclear receptor coactivator 7-like _contig_61876 6,0E-04 18,6 _contig_619 3,0E-05 9,0 urate oxidase tricarboxylate transport mitochondrial- _contig_6210 3,9E-05 10,0 like _contig_6278 4,0E-04 13,7 alpha skeletal muscle b-like isoform 1 _contig_62903 2,3E-04 207,8 _contig_63000 2,9E-04 123,6 _contig_63130 6,8E-04 134,3 high choriolytic enzyme 1-like _contig_63328 3,6E-05 9,9 complement factor h-like _contig_63381 1,6E-05 64,5 nuclear receptor subfamily 0 group b _contig_63603 3,0E-07 854,7 member 2-like _contig_63833 4,7E-05 397,6 serine (or cysteine) peptidase clade _contig_6384 4,6E-06 43,6 member 2 precursor

_contig_64039 4,3E-05 171,6 _contig_64099 7,2E-05 8,4 tpa_inf: aldehyde oxidase beta _contig_64327 1,3E-03 162,9 lactase-phlorizin hydrolase marvel domain-containing protein 2- _contig_64368 9,6E-04 43,8 like _contig_64399 1,2E-04 1488,5 hepatocyte nuclear factor 4-alpha-like PREDICTED: uncharacterized protein _contig_6441 3,3E-05 131,1 LOC101160024 _contig_64434 6,2E-05 11,8 _contig_64508 3,6E-05 42,7 _contig_64580 8,8E-06 430,9 group 3 secretory phospholipase a2 _contig_6461 8,8E-07 491,7 tbt-binding partial _contig_64655 2,5E-04 6,3 _contig_64965 8,6E-05 342,6 maltase- intestinal-like _contig_65015 1,2E-03 7,2 leiomodin-1 isoform 1 _contig_65099 3,4E-05 17,1 _contig_6522 2,2E-05 16,4 adipose differentiation-related protein intestinal-type alkaline phosphatase 1- _contig_65225 5,3E-05 1701,9 like _contig_65255 9,0E-06 120,6 _contig_65544 2,8E-04 26,9 carboxypeptidase o _contig_6581 5,3E-07 145,0 ribonuclease like 2 _contig_6591 2,0E-04 -4,4 imap family member 7 _contig_6601 2,6E-05 10,6 c-1-tetrahydrofolate cytoplasmic-like _contig_66109 9,1E-05 113,4 _contig_66802 1,7E-03 9,5 _contig_6688 1,7E-04 32,7 _contig_6692 6,7E-06 20,2 phospholipase a2-like _contig_6699 2,0E-04 8,1 3-keto-steroid reductase-like _contig_6704 1,3E-06 286,0 vtnb protein ankyrin repeat and sam domain- _contig_67065 4,3E-05 1741,6 containing protein 4b-like _contig_6709 1,7E-05 83,7 _contig_6712 3,7E-04 3,8 ---NA--- _contig_672 4,1E-04 4,6 adenosine kinase-like 2-amino-3-carboxymuconate-6- _contig_6740 2,6E-06 276,7 semialdehyde decarboxylase _contig_67480 3,4E-04 7,2 d-amino-acid oxidase-like _contig_67671 1,6E-03 53,7 _contig_6777 2,2E-07 1031,9 fatty acid binding protein 1b _contig_6778 2,1E-05 285,5 _contig_67858 8,1E-05 155,7 olfactomedin-4-like

_contig_6810 4,0E-04 6,7 _contig_6825 9,8E-04 4,5 chromosome 22 open reading frame 13 _contig_68294 1,5E-03 12,0 _contig_68316 1,1E-03 98,4 aggrecan core protein _contig_68712 6,3E-04 13,7 aminoglycoside phosphotransferase _contig_68768 4,0E-04 91,7 domain-containing protein 1-like cholesterol 7-alpha-monooxygenase- _contig_6885 2,6E-05 18,8 like _contig_68997 1,9E-04 73,9 cysteine sulfinic acid decarboxylase _contig_6910 2,0E-08 327,0 coagulation factor ix precursor sodium-dependent phosphate transport _contig_69251 5,3E-05 499,8 protein 2b-like _contig_69287 1,3E-04 12,8 sec14-like protein 2-like isopentenyl-diphosphate delta- _contig_695 1,3E-03 3,8 isomerase 1 _contig_6955 6,9E-04 12,2 beta-microseminoprotein precursor _contig_69969 1,8E-04 39,6 deleted in malignant brain tumors 1 _contig_70150 1,8E-04 100,3 unnamed protein product _contig_70250 1,8E-04 1053,4 conserved protein _contig_70303 6,4E-07 105,6 gram domain-containing protein 3-like _contig_70511 2,5E-04 85,7 zonadhesin-like _contig_70881 1,2E-05 367,7 glycogen _contig_71041 1,3E-04 16,2 si:dkey- protein _contig_71271 1,1E-04 12,9 _contig_71412 2,2E-04 156,4 _contig_7161 8,1E-04 5,7 epoxide hydrolase 1-like _contig_72 4,2E-07 716,3 secreted phosphoprotein 24 _contig_7205 3,3E-04 9,7 complement c4-like _contig_72061 2,8E-07 1069,2 solute carrier family 22 member 13-like _contig_72072 2,2E-04 417,6 aquaporin 8 elongation of very long chain fatty acids _contig_72153 1,2E-03 25,8 protein 4-like _contig_72163 1,5E-03 3,2 _contig_722 1,2E-03 4,5 eh domain-containing protein 3-like _contig_72408 1,7E-06 1438,8 bile acid receptor-like potassium voltage-gated channel _contig_7251 9,7E-04 -11,2 subfamily s member 2-like _contig_72528 7,3E-05 1263,7 protocadherin fat 4-like _contig_72754 3,2E-04 26,3 dentin sialophosphoprotein _contig_7279 1,8E-06 369,7 serine mitochondrial-like _contig_72941 8,3E-06 451,5 _contig_73346 1,4E-05 200,9 peptide transporter 92

_contig_73639 1,7E-08 2821,8 #¿NOMBRE? _contig_73978 4,4E-05 126,1 _contig_74504 1,3E-03 27,5 _contig_7453 1,1E-03 4,0 glutathione s-transferase theta-1 _contig_747 3,8E-07 536,9 fibrinogen beta chain precursor _contig_74795 1,2E-05 485,2 arrestin domain-containing protein 3- _contig_74815 3,0E-04 27,3 like von willebrand factor a domain- _contig_74943 1,8E-03 6,6 containing protein 7-like _contig_7500 1,8E-04 8,5 cytochrome p450 3a _contig_7562 3,9E-05 680,5 zgc:154142 protein _contig_75655 9,6E-05 22,1 phospholipase membrane-associated- _contig_75674 2,6E-04 18,5 like _contig_7568 5,0E-05 10,1 udp-glucuronosyltransferase 2a2-like _contig_7579 1,4E-03 3,9 cytochrome p450 3a27 leucine-rich repeat-containing protein _contig_75817 2,3E-04 37,5 19-like mitochondrial carnitine acylcarnitine _contig_759 5,3E-05 6,0 carrier _contig_75928 1,8E-05 34,4 _contig_76067 1,7E-04 55,1 CR1-3 aldo-keto reductase family 1 member _contig_76115 1,1E-04 50,4 b10-like _contig_76184 3,1E-05 98,8 claudin 25 _contig_7626 1,4E-04 6,1 acetyl-coenzyme a cytoplasmic _contig_76346 3,7E-04 147,3 cell surface a33 antigen-like _contig_76442 4,0E-04 3,0 _contig_76580 3,2E-04 11,2 _contig_7680 3,9E-06 21,7 _contig_77239 3,0E-06 1252,9 loc100145015 protein _contig_7733 1,7E-06 461,8 pentraxin fusion _contig_77419 1,2E-04 430,9 chitin synthase carcinoembryonic antigen-related cell _contig_77720 3,2E-04 1063,4 adhesion molecule 5-like _contig_78077 2,7E-04 537,5 muc12 protein _contig_78078 2,1E-04 345,9 zen 1 _contig_782 3,5E-04 6,4 dimethylglycine mitochondrial _contig_7861 8,9E-05 396,8 hypothetical loc570390 methylmalonate-semialdehyde _contig_7869 2,6E-04 6,3 dehydrogenase PREDICTED: glucose-6-phosphatase- _contig_78729 1,3E-04 181,5 like

_contig_78737 4,2E-04 14,2 peptidase inhibitor r3hdml-like _contig_78967 1,6E-03 5,2 transmembrane protein 82-like _contig_79278 1,0E-04 230,6 deleted in malignant brain tumors 1 catechol-o-methyltransferase domain- _contig_7963 1,3E-06 197,2 containing protein 1 _contig_79796 2,4E-04 -4,1 perforin 3 _contig_7988 2,2E-04 132,3 apolipoprotein m-like _contig_79886 3,8E-05 159,1 apical endosomal glyco _contig_80186 7,3E-04 153,6 glucose-6-phosphatase-like isoform 1 _contig_80258 1,7E-04 37,5 hepatocyte nuclear factor 4-beta-like _contig_8041 4,8E-06 73,0 hydroxyacid oxidase 2 _contig_80430 7,0E-04 46,0 sterol-4-alpha-carboxylate 3- _contig_8048 1,4E-04 5,0 decarboxylating-like _contig_80598 3,2E-04 238,6 pyruvate kinase isozymes r l PREDICTED: hypothetical protein _contig_8063 7,1E-07 210,8 LOC100705516 _contig_80854 1,2E-04 179,6 _contig_8158 2,9E-04 5,1 hyaluronidase-1-like _contig_81616 7,4E-05 219,5 zgc:162946 protein _contig_8214 9,2E-06 505,1 complement c5 solute carrier organic anion transporter _contig_8233 2,7E-06 390,9 family member 1c1-like liver-expressed antimicrobial peptide 2- _contig_82541 1,4E-04 188,2 like _contig_826 1,3E-07 446,9 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase _contig_8289 1,1E-05 10,7 squalene monooxygenase _contig_82991 2,3E-05 14,6 serine hydrolase-like _contig_8309 1,5E-07 586,1 apolipoprotein b-100-like PREDICTED: hypothetical protein _contig_83177 5,2E-06 911,1 LOC100707181 _contig_83188 2,3E-05 304,6 _contig_83411 2,5E-04 77,8 glycogen _contig_8382 2,0E-04 7,6 cytochrome p450 4v2-like _contig_84 9,0E-07 711,7 apolipoprotein a-i carcinoembryonic antigen-related cell _contig_84014 2,2E-04 230,7 adhesion molecule 5-like _contig_84053 2,7E-04 123,7 _contig_84332 7,9E-05 31,2 _contig_8439 1,0E-06 550,4 plasminogen precursor _contig_84591 3,1E-04 46,5 2-acylglycerol o-acyltransferase 2-a tyrosine-protein phosphatase non- _contig_84783 2,2E-04 31,9 receptor type substrate partial _contig_8487 6,8E-05 21,1 complement factor d-like 94

_contig_8519 3,7E-04 157,8 phospholipase major isoenzyme-like nuclear receptor subfamily 1 group d _contig_85245 4,7E-05 -6,4 member 2-like _contig_85248 6,1E-05 8599,4 phospholipase membrane-associated carbohydrate-responsive element- _contig_862 1,6E-06 35,6 binding _contig_86479 3,0E-04 8,6 vesicle-associated membrane protein 8 nuclear receptor subfamily 1 group d _contig_8658 7,9E-06 -8,0 member 2-like _contig_8663 1,2E-06 369,3 fibrinogen alpha chain-like _contig_86656 1,2E-04 369,3 ovary-specific c1q-like factor _contig_87679 1,6E-03 83,0 homeo box hb9 like a _contig_87744 1,6E-05 94,7 apical endosomal glyco _contig_8776 1,1E-05 362,7 _contig_87932 2,3E-04 100,1 protein bicaudal c homolog 1-like _contig_87933 7,6E-04 -4,7 gtpase imap family member 8-like _contig_88017 6,2E-04 39,5 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme _contig_8813 1,1E-05 15,9 a reductase PREDICTED: hypothetical protein _contig_8829 1,5E-04 26,4 LOC100691497 _contig_8832 2,9E-05 291,6 cd59 glyco _contig_88342 4,9E-04 10,3 _contig_8869 1,4E-04 8,8 apolipoprotein f precursor _contig_89273 1,5E-03 -28,8 class a basic helix-loop-helix protein _contig_89434 4,7E-04 16,8 15-like atp-binding cassette sub-family g _contig_8987 1,4E-06 62,0 member 5 dnaj homolog subfamily c member 22- _contig_8991 6,1E-06 882,2 like _contig_8992 6,4E-05 8,3 complement factor h-like _contig_89994 5,7E-04 111,9 PREDICTED: perilipin-2-like _contig_903 1,2E-04 5,7 plasma retinol-binding protein 1 neuronal tyrosine-phosphorylated phosphoinositide-3-kinase adapter 2- _contig_9038 8,4E-05 39,1 like _contig_904 1,0E-05 161,7 papilin-like protein _contig_90680 2,4E-04 456,6 ferric-chelate reductase 1 _contig_91081 6,5E-07 361,2 udp-glucuronosyltransferase 2a3-like _contig_9158 5,4E-05 7,7 phenylalanine hydroxylase _contig_9199 1,4E-05 17,7 deleted in malignant brain tumors 1 _contig_922 1,7E-06 531,5 alpha-1-antitrypsin homolog _contig_92247 4,6E-05 1543,1 sodium glucose cotransporter 1-like

_contig_92337 1,7E-04 83,8 g-protein coupled receptor 39-1b _contig_92382 8,2E-05 27,2 _contig_924 8,8E-07 506,8 beta-2-glycoprotein 1-like _contig_9258 5,3E-05 8,9 phosphoenolpyruvate carboxykinase cytochrome family subfamily _contig_926 1,0E-06 217,4 polypeptide 24 cytochrome family subfamily _contig_927 2,6E-05 122,8 polypeptide 24 _contig_928 8,8E-04 4,1 c-1-tetrahydrofolate cytoplasmic-like _contig_92868 1,5E-04 184,6 _contig_92881 2,2E-04 537,4 guanylin precursor interferon-induced protein with _contig_93077 1,8E-04 64,7 tetratricopeptide repeats 2-like _contig_93263 2,6E-05 298,2 _contig_9341 3,7E-07 175,6 sex hormone-binding globulin _contig_9349 8,2E-04 4,6 protein nlrc3-like _contig_9386 3,1E-04 12,3 _contig_9387 5,4E-06 18,3 very long-chain acyl- synthetase-like _contig_93901 3,1E-05 188,8 folate receptor alpha precursor _contig_94090 1,8E-05 18,1 beta-ureidopropionase _contig_94105 4,1E-05 88,7 _contig_94349 4,7E-04 112,9 _contig_94516 1,0E-03 22,8 probable polyketide synthase 1-like _contig_94578 2,1E-04 1393,5 cadherin-related family member 5 _contig_9485 2,1E-06 3813,2 pyruvate liver and rbc _contig_9537 6,0E-04 5,2 _contig_9553 2,9E-05 55,4 aquaporin-9-like _contig_9558 2,6E-06 263,9 3-oxo-5-beta-steroid 4-dehydrogenase _contig_95696 1,6E-03 8,7 beta- -galactosyl-o-glycosyl- glycoprotein beta- -n- _contig_9591 7,3E-05 7,7 acetylglucosaminyltransferase 7 _contig_95917 1,2E-03 32,7 s-adenosylmethionine synthase isoform _contig_960 9,3E-08 146,1 type-1-like _contig_96021 7,5E-05 3638,3 collagen alpha-2 chain-like _contig_965 1,0E-06 440,7 fibrinogen gamma chain-like _contig_969 5,5E-06 19,3 frizzled-5 precursor _contig_97176 5,4E-05 229,9 _contig_9745 7,0E-07 1044,1 diamine acetyltransferase 1 mannan-binding lectin serine protease _contig_9762 1,9E-04 10,0 1-like _contig_9819 2,2E-05 9,9 cytochrome p450 2j2-like 96

_contig_982 1,9E-05 120,2 trypsinogen 2 _contig_9823 4,2E-06 29,6 _contig_9824 6,1E-06 30,4 transcription factor cp2-like protein 1 _contig_98708 9,4E-05 89,3 _contig_98771 5,3E-04 67,4 heat-stable enterotoxin receptor-like multidrug resistance associated protein _contig_9888 3,3E-04 7,3 2 multiple coagulation factor deficiency _contig_9905 1,5E-03 3,7 protein 2-like interleukin-6 receptor subunit alpha _contig_99466 1,0E-03 8,9 precursor coenzyme q-binding protein coq10 _contig_99678 9,5E-05 170,5 mitochondrial-like na(+) h(+) exchange regulatory cofactor _contig_99942 5,5E-04 310,1 nhe-rf3-like Contig1014 3,1E-05 142,6 multidrug resistance protein 1-like insulin-like growth factor-binding Contig1026 5,9E-06 38,0 protein 1-like Contig1033 1,1E-04 8,3 catalase-like isoform 1 Contig1038 5,6E-08 681,6 l-aspartate dehydrogenase-like Contig1078 3,9E-04 3,7 Contig1101 1,1E-06 36,8 transcription factor cp2-like protein 1 alanine--glyoxylate aminotransferase 2- Contig1103 7,9E-04 4,9 like 1-like phosphatidylinositol -bisphosphate 5- Contig1108 4,4E-04 108,5 phosphatase a-like Contig1205 9,5E-08 117,2 apolipoprotein a-iv-like Contig1222 6,2E-04 6,0 udp-glucuronosyltransferase 2a1-like Contig1239 8,9E-05 103,8 lectin precursor Contig1281 1,0E-07 3133,7 glycogen Contig1321 7,9E-04 7,4 peroxisome proliferator-activated Contig1353 1,4E-03 3,0 receptor alpha Contig1362 1,8E-07 429,8 claudin 2 sulfotransferase family cytosolic 2b Contig1367 1,3E-03 5,0 member 1 Contig1374 4,1E-05 8,0 complement factor h-like Contig1399 1,3E-03 3,8 Contig1430 2,4E-07 613,0 alpha-1-antitrypsin homolog Contig1450 1,0E-05 19,1 alcohol dehydrogenase Contig1459 1,7E-03 6,7 stonustoxin subunit alpha parathyroid hormone parathyroid Contig1483 1,7E-03 2,5 hormone-related peptide receptor-like Contig1484 2,4E-04 9,6 epoxide hydrolase 1-like Contig1485 5,8E-07 78,1 kininogen-1 precursor

pleckstrin homology domain-containing Contig1521 8,3E-04 3,0 family d member 1-like Contig1522 8,4E-06 254,0 Contig1598 4,4E-04 22,4 Contig1601 4,0E-04 3,9 melanoma-associated antigen g1-like Contig1671 2,0E-07 670,8 phosphoenolpyruvate cytosolic Contig1717 1,0E-03 4,1 Contig1731 1,6E-06 505,5 coagulation factor vii Contig1760 2,3E-06 217,5 interleukin-1 receptor-like 2-like Contig1761 1,6E-03 10,2 nostrin protein Contig1765 2,0E-06 62,4 Contig1783 1,8E-03 4,1 Contig1824 4,1E-08 789,5 cytochrome p450 2f3-like udp- c:betagal beta- -n- Contig1833 9,4E-04 12,2 acetylglucosaminyltransferase 5 Contig1844 3,3E-04 17,5 ceramide synthase 2-like Contig1847 5,3E-07 192,2 methyltransferase ddb_g0268948-like phosphatidylethanolamine n- Contig1854 1,9E-05 5,1 methyltransferase vitelline membrane outer layer protein 1 Contig1894 5,3E-05 135,4 homolog Contig1925 1,0E-05 44,5 transmembrane protein 178-like sodium- and chloride-dependent Contig1972 5,5E-04 80,4 transporter xtrp3a-like Contig1977 1,4E-04 381,0 equilibrative nucleoside transporter 1- Contig2022 3,6E-05 12,8 like immunoglobulin superfamily member Contig2081 1,0E-03 52,0 5-like cytosolic 10-formyltetrahydrofolate Contig2107 2,0E-07 68,8 dehydrogenase Contig2110 2,2E-04 28,1 transmembrane protein 125-like Contig223 1,8E-05 9,2 nucleoside diphosphate kinase Contig2243 7,9E-04 39,5 prominin- splice variant Contig2251 5,3E-05 266,3 neutral ceramidase PREDICTED: hypothetical protein Contig2264 5,7E-04 7,1 LOC100692094 Contig2282 2,6E-05 201,9 amiloride-sensitive amine oxidase Contig2286 1,9E-05 18,5 glucagon receptor-like Contig2287 3,1E-05 231,7 aquaporin 8 beta- -galactosyl-o-glycosyl- glycoprotein beta- -n- Contig2327 1,8E-04 63,5 acetylglucosaminyltransferase-like Contig2341 2,0E-04 75,5 methionine sulfoxide reductase b2 Contig2376 5,7E-07 421,1 vitamin k-dependent protein c-like 98

Contig2380 7,2E-05 68,7 galanin receptor type 1-like Contig2409 1,8E-05 111,5 cysteine sulfinic acid decarboxylase Contig2414 8,0E-05 9,0 catalase-like isoform 1 Contig2420 4,4E-05 150,1 f10 protein Contig2444 1,4E-05 28,3 myelin gene regulatory factor-like Contig2474 3,6E-04 3,9 peroxisomal bifunctional enzyme-like Contig248 7,4E-05 763,5 c1 inhibitor Contig2503 5,7E-04 107,7 inositol oxygenase butyrophilin subfamily 3 member a2- Contig2511 2,6E-04 553,0 like isoform x2 phospholipase membrane-associated- Contig2531 4,7E-04 22,4 like Contig2532 1,3E-04 1248,2 spectrin beta brain 4-like inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain Contig2535 9,2E-07 45,8 h2-like ins_lopam ame: full=insulin contains: ame: full=insulin b chain contains: ame: Contig2554 6,9E-06 5685,7 full=insulin a chain flags: precursor Contig2557 3,7E-06 13,0 nadh-cytochrome b5 reductase 2 warm temperature acclimation-related Contig2571 2,7E-06 575,9 65 kda protein Contig2579 3,2E-05 41,5 glutamyl aminopeptidase Contig371 4,0E-06 1042,8 melanotransferrin precursor Contig410 4,6E-04 11,6 angiotensin-converting enzyme Contig420 1,7E-06 126,5 pancreatic amylase Contig44 1,4E-05 22,3 monocarboxylate transporter 12-b-like Contig452 4,1E-06 -5,1 alpha-2-macroglobulin-like protein 1- Contig487 2,5E-06 82,7 like trimeric intracellular cation channel Contig541 9,7E-05 6,5 type b-like alpha- -mannosyl-glycoprotein 2-beta- Contig592 1,3E-03 3,6 n-acetylglucosaminyltransferase-like Contig689 1,7E-04 5,8 Contig695 4,4E-06 566,5 beta-2-glycoprotein 1-like dna replication atp-dependent helicase Contig70 7,3E-05 6,5 nuclease dna2-like Contig731 2,6E-06 41,1 dihydropyrimidinase Contig794 1,5E-05 23,9 hyaluronan synthase 3 Contig82 1,1E-05 17,0 epidermal retinol dehydrogenase 2-like Contig830 1,6E-04 10,5 Contig849 7,0E-06 315,8 bile salt-activated lipase-like properdin p factor complement 2 Contig934 3,2E-04 4,7 precursor Contig952 1,9E-05 11,4 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 99

inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain Contig956 9,7E-09 259,8 h3-like Contig965 9,2E-05 9,2 Contig973 1,3E-06 111,5 solute carrier family 13 member 5-like

100

Anexo 8 Mapeo de la vías por Kegg de la lista de transcritos expresados diferencialmente en S. lalandi.

KEGG categories represented Number of KOs Metabolism 410 Carbohydrate metabolism 77 Energy metabolism 18 Lipid metabolism 80 Nucleotide metabolism 28 Amino acid metabolism 90 Metabolism of other amino acids 20 Glycan biosynthesis and metabolism 11 Metabolism of cofactors and vitamins 35 Metabolism of terpenoids and polyketides 8 Biosynthesis of other secondary metabolites 16 Xenobiotics biodegradation and metabolism 27 Genetic Information Processing 15 Translation 5 Folding, sorting and degradation 4 Replication and repair 6 Environmental Information Processing 137 Membrane transport 7 Signal transduction 100 Signaling molecules and interaction 30 Cellular Processes 84 Transport and catabolism 34 Cell growth and death 19 Cellular community - eukaryotes 22 Cellular community - prokaryotes 1 Cell motility 8 Organismal Systems 314 Immune system 68 Endocrine system 89 Circulatory system 9 Digestive system 99 Excretory system 8 Nervous system 18 Sensory system 5 Development 6

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Term #not #not Annot Annot Category FDR P-Value #Test #Ref Test Ref oxidation-reduction process P 6,63E-06 2,97E-09 71 418 315 6346 iron ion binding F 1,48E-04 1,19E-07 29 77 357 6687 heme binding F 5,81E-04 5,74E-07 26 64 360 6700 serine-type endopeptidase activity F 8,51E-05 9,16E-07 19 28 367 6736 electron carrier activity F 1,17E-01 1,69E-05 24 73 362 6691 pyridoxal phosphate binding F 5,23E+00 1,22E-02 16 38 370 6726 oxidoreductase activity, acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen, reduced flavin or flavoprotein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen F 2,60E+00 6,76E-02 10 12 376 6752 lipid biosynthetic process P 8,98E+01 2,74E-02 25 123 361 6641 transaminase activity F 3,00E+02 1,02E-01 10 18 376 6746 fibrinogen complex C 6,35E+02 2,57E+00 5 1 381 6763 serine-type endopeptidase inhibitor activity F 1,54E+03 7,34E-03 8 13 378 6751 L-alanine catabolic process P 1,61E+03 8,37E+00 4 0 382 6764 lipid transport P 2,16E+03 1,20E+01 12 39 374 6725 cellular lipid metabolic process P 2,58E+03 1,46E+01 31 223 355 6541 complement activation P 3,75E+03 2,19E+01 5 3 381 6761 lipoprotein metabolic process P 5,15E+03 3,28E+01 9 23 377 6741 S-adenosylmethionine- homocysteine S- methyltransferase activity F 5,32E+02 4,01E+01 4 1 382 6763 tryptophan catabolic process P 5,32E+02 4,01E+01 4 1 382 6763 betaine-homocysteine S- methyltransferase activity F 5,32E+02 4,01E+01 4 1 382 6763 carboxy-lyase activity F 6,25E+03 4,94E+01 6 8 380 6756 methionine metabolic process P 1,09E+04 8,99E+01 5 5 381 6759 glycine metabolic process P 1,38E+04 1,15E+02 4 2 382 6762 alcohol metabolic process P 1,42E+03 1,21E+02 13 60 373 6704 negative regulation of endopeptidase activity P 1,64E+04 1,43E+02 9 29 377 6735 ecdysteroid hormone receptor activity F 1,64E+04 1,56E+02 3 0 383 6764

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ecdysone receptor-mediated signaling pathway P 1,64E+04 1,56E+02 3 0 383 6764 taurine biosynthetic process P 1,64E+04 1,56E+02 3 0 383 6764 thyroid hormone receptor activity F 1,64E+04 1,56E+02 3 0 383 6764 retinoid X receptor binding F 1,64E+04 1,56E+02 3 0 383 6764 cellular response to xenobiotic stimulus P 1,82E+04 1,77E+02 8 23 378 6741 oxidoreductase activity, acting on CH-OH group of donors F 2,42E+04 2,41E+02 13 65 373 6699 cellular response to nutrient P 2,50E+04 2,57E+02 4 3 382 6761 folic acid-containing compound metabolic process P 2,50E+04 2,58E+02 5 7 381 6757 hydrolase activity, acting on carbon-nitrogen (but not peptide) bonds F 3,06E+04 3,18E+02 12 58 374 6706 metallocarboxypeptidase activity F 3,72E+04 4,01E+02 5 8 381 6756 hyaluronan metabolic process P 4,42E+04 4,92E+02 4 4 382 6760 purine nucleobase metabolic process P 4,42E+04 4,92E+02 4 4 382 6760 digestive system development P 4,88E+02 5,55E+02 9 36 377 6728 response to estrogen P 4,88E+02 5,96E+02 5 9 381 6755 oxidoreductase activity, acting on the CH-CH group of donors, NAD or NADP as acceptor F 4,88E+02 5,96E+02 5 9 381 6755 anthranilate metabolic process P 4,88E+02 6,00E+02 3 1 383 6763 triglyceride homeostasis P 4,88E+02 6,00E+02 3 1 383 6763 folic acid binding F 4,88E+02 6,00E+02 3 1 383 6763 plasma lipoprotein particle C 4,88E+02 6,00E+02 3 1 383 6763 'de novo' NAD biosynthetic process from tryptophan P 4,88E+02 6,00E+02 3 1 383 6763 quinolinate biosynthetic process P 4,88E+02 6,00E+02 3 1 383 6763

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Anexo 10. Prueba de ANOVA de una vía de viabilidad de los explantes de mandíbula suplementados con 20 uM y 40 uM de DHA y control durante los tiempos de incubación.

20 uM DHA 40 uM DHA Normality Test (Shapiro-Wilk) P = 0,675 P = 0,053 Equal Variance Test P = 0,821 P = 0,296

All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): 20 uM DHA

Comparisons for factor: Incubation time Diff of Comparison Means p q P T3 vs. control 0,146 5 24,166 <0,001 T3 vs. T1 0,0214 5 3,062 0,235 T3 vs. T2 0,0154 5 2,196 0,543 T3 vs. T4 0,0101 5 1,443 0,843 T4 vs. control 0,136 5 22,499 <0,001 T4 vs. T1 0,0113 5 1,619 0,781 T4 vs. T2 0,00526 5 0,753 0,983 T2 vs. control 0,131 5 21,63 <0,001 T2 vs. T1 0,00605 5 0,866 0,971 T1 vs. control 0,125 5 20,63 <0,001

All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Tukey Test): 40 uM DHA

Comparisons for factor: incubation time Comparison Diff of Means p q P T4 vs. control 0,164 5 16,548 <0,001 T4 vs. T1 0,0333 5 2,916 0,276 T4 vs. T2 0,0224 5 1,957 0,645 T4 vs. T3 0,00877 5 0,767 0,982 T3 vs. control 0,155 5 15,661 <0,001 T3 vs. T1 0,0246 5 2,149 0,563 T3 vs. T2 0,0136 5 1,189 0,914 T2 vs. control 0,141 5 14,288 <0,001 T2 vs. T1 0,011 5 0,959 0,959 T1 vs. control 0,13 5 13,18 <0,001

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prueba t para la igualdad de medias 95% de intervalo de confianza de la Sig. Diferencia diferencia Gen t gl (bilateral) de medias Inferior Superior Raiz (Phdla) Se asumen -2,018 6 0,090 -0,773 -1,711 0,164 varianzas iguales Zinc2 Se asumen 0,208 6 0,842 0,107 -1,149 1,362 varianzas iguales IGF1 Se asumen -0,566 6 0,592 -0,200 -1,065 0,665 varianzas iguales Ig Se asumen 0,214 5 0,839 0,069 -0,763 0,901 varianzas iguales Fabp Se asumen 9,683 6 0,000 2,190 1,637 2,743 varianzas iguales Fatp Se asumen -2,426 6 0,051 -0,579 -1,164 0,005 varianzas iguales ACSL Se asumen -2,067 6 0,084 -0,907 -1,981 0,167 varianzas iguales Creb3 Se asumen -0,585 6 0,580 -0,253 -1,313 0,807 varianzas iguales

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prueba t para la igualdad de medias 95% de intervalo de confianza de la Sig. Diferencia diferencia Gen t gl (bilateral) de medias Inferior Superior Phlda Se asumen -0,693 6 0,514 -0,205 -0,927 0,518 varianzas iguales Zinc2 Se asumen -1,002 6 0,355 -0,430 -1,480 0,620 varianzas iguales IGF1 Se asumen 0,467 6 0,657 0,172 -0,727 1,071 varianzas iguales Ig Se asumen 1,291 5 0,253 0,442 -0,438 1,322 varianzas iguales Fabp Se asumen 7,742 6 0,000 1,846 1,263 2,430 varianzas iguales Fatp Se asumen -1,241 6 0,261 -0,300 -0,892 0,291 varianzas iguales ACSL Se asumen -1,867 6 0,111 -0,838 -1,937 0,261 varianzas iguales Creb3 Se asumen -1,443 6 0,199 -0,631 -1,702 0,439 varianzas iguales

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Anexo 13. Lista de los transcritos expresados diferencialmente que presentaron concordancia entre cultivo in vivo y cultivo in vitro de mandíbula (p<0.05). Obtención de secuencias en Patel et al. (2016)

Transcrito baseMean log2FoldChange pvalue padj Contig1033 2,50E+13 9,99E-01 1,36E-04 1,02E-03 _contig_29497 9,84E+14 -9,94E-01 7,58E-03 3,08E-02 _contig_14531 4,25E+14 -9,86E-01 1,82E+09 1,74E-04 _contig_27622 6,76E+14 9,81E-01 8,25E-04 4,81E-03 _contig_3773 3,36E+14 -9,81E-01 4,83E-03 2,13E-02 _contig_3705 1,12E+14 9,67E-01 4,94E-03 2,17E-02 _contig_8658 5,69E+14 9,51E-01 8,10E+09 6,49E-04 Contig82 2,31E+14 8,96E-01 1,06E-03 5,93E-03 _contig_695 3,65E+14 8,79E-01 4,19E-04 2,71E-03 _contig_13191 2,28E+14 8,75E-01 1,08E-03 6,06E-03 _contig_564 2,99E+14 -8,63E-01 7,88E-04 4,64E-03 _contig_16478 2,45E+14 8,62E-01 2,47E-03 1,21E-02 _contig_12676 4,00E+14 -8,61E-01 1,28E-03 6,98E-03 _contig_16357 1,70E+14 8,49E-01 3,85E-03 1,76E-02 _contig_11814 1,20E+14 -8,42E-01 3,95E+09 3,45E-04 _contig_8289 1,09E+14 8,42E-01 5,02E-04 3,16E-03 _contig_7500 1,82E+14 7,72E-01 1,06E-04 8,20E-04 _contig_577 1,71E+14 7,67E-01 1,67E-04 1,22E-03 _contig_12254 5,24E+14 6,97E-01 1,53E-03 8,07E-03 Contig410 1,39E+14 -5,54E-01 6,11E-03 2,58E-02 _contig_35382 7,84E+14 4,24E+14 9,34E-03 5,96E-01 _contig_3535 7,89E+13 4,06E+14 3,76E-03 2,49E-01 _contig_27685 6,59E+14 4,01E+14 4,64E-01 2,47E+01 _contig_12946 1,17E+14 3,74E+14 4,92E-03 3,23E-01 _contig_132970 2,53E+14 3,73E+14 3,62E+06 6,31E+06 _contig_49432 6,21E+14 3,54E+14 9,06E+02 3,01E+04 _contig_8158 2,21E+14 3,47E+14 2,43E-09 3,02E-08 _contig_31194 6,89E+14 3,28E+14 1,43E+02 5,37E+03 _contig_9888 4,49E+14 3,17E+14 5,84E-18 1,52E-15 _contig_57747 1,56E+14 3,15E+14 2,25E+09 2,10E-04 _contig_9819 1,17E+13 3,02E+14 2,30E+00 1,12E+02 _contig_28683 5,62E+14 2,85E+14 6,12E+05 1,23E+06 _contig_23563 1,17E+14 2,70E+14 1,33E+02 5,01E+03 _contig_59597 7,98E+14 2,66E+14 6,25E-04 3,82E-03 _contig_11903 3,24E+14 2,58E+14 8,02E+08 8,47E+09

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_contig_54847 3,82E+13 2,57E+14 1,46E+08 1,83E+09 _contig_24058 9,15E+14 2,50E+14 1,11E-03 6,19E-03 _contig_34204 1,85E+14 2,45E+14 8,24E-02 4,27E+01

_contig_32468 5,72E+14 2,41E+14 7,18E-06 6,16E-04 _contig_19990 1,78E+14 2,41E+14 1,86E-04 1,35E-03 _contig_22952 1,31E+14 2,41E+14 9,70E-04 5,51E-03 _contig_23673 1,67E+14 2,38E+14 4,93E+01 2,00E+03 _contig_4868 1,71E+14 2,32E+14 7,12E-04 4,26E-03 _contig_16704 2,35E+14 2,31E+14 1,57E-03 8,23E-03 _contig_3284 4,80E+14 2,25E+14 6,70E+08 7,20E+08 _contig_364 2,30E+14 2,14E+14 1,28E-17 3,27E-15 _contig_11937 5,43E+14 2,12E+14 4,54E+08 5,08E+09 _contig_14458 2,14E+13 2,03E+14 8,00E+03 2,26E+05 _contig_4561 3,65E+14 1,94E+14 1,53E+00 7,56E+01 _contig_1587 1,46E+14 1,94E+14 1,47E+07 2,28E+08 _contig_11893 2,83E+14 1,92E+14 6,64E-04 4,01E-03 _contig_5803 4,03E+14 1,90E+14 1,46E-04 1,09E-03 _contig_25980 1,42E+14 1,90E+14 5,77E-03 2,46E-02 _contig_17580 2,81E+14 1,89E+14 9,23E-04 5,29E-03 _contig_6177 1,90E+14 1,87E+14 5,47E+08 6,03E+09 _contig_15246 1,65E+14 1,86E+14 1,09E+05 2,51E+06 _contig_22061 3,13E+14 1,84E+14 9,64E-04 5,48E-03 _contig_1007 3,64E+14 1,83E+14 7,43E-04 4,41E-03 _contig_1484 2,30E+14 1,82E+14 6,76E+06 1,12E+08 _contig_25525 2,60E+14 1,82E+14 2,33E-03 1,15E-02 _contig_1270 5,75E+14 1,76E+14 1,59E-01 8,83E-01 _contig_37162 1,69E+14 1,74E+14 6,38E+06 1,06E+08 _contig_15006 1,37E+14 1,74E+14 6,67E-03 4,29E-01 _contig_36302 1,12E+14 1,72E+14 1,43E+08 1,79E+09 _contig_11187 3,90E+14 1,57E+14 2,66E+06 4,77E+07 _contig_25416 8,92E+14 1,57E+14 4,81E+09 4,09E-04 _contig_6019 2,09E+14 1,57E+14 9,69E+08 1,00E-04 _contig_38164 3,65E+14 1,56E+14 2,31E-03 1,15E-02 _contig_9258 7,32E+14 1,53E+14 1,67E+02 6,16E+03 _contig_14774 4,72E+14 1,50E+14 2,21E-03 1,11E-02 _contig_13453 1,63E+13 1,48E+14 7,30E+08 7,79E+09 _contig_34917 8,41E+14 1,47E+14 1,09E-04 8,41E-04 _contig_27633 2,71E+14 1,46E+14 9,82E-03 3,80E-02 _contig_36053 1,87E+14 1,45E+14 3,81E+08 4,35E+09

108

_contig_13467 2,38E+14 1,44E+14 5,76E+07 7,87E+08 _contig_22313 1,22E+14 1,39E+14 3,03E+09 2,73E-04 _contig_30962 7,15E+14 1,32E+14 9,32E-04 5,33E-03 _contig_43798 7,09E+14 1,26E+14 1,50E-03 7,95E-03 _contig_19912 6,33E+14 1,19E+14 6,72E+07 9,06E+08 Contig956 6,52E+14 1,19E+14 5,15E-03 2,25E-02 _contig_3314 3,47E+14 1,12E+14 1,21E+08 1,22E-04 _contig_2472 1,45E+14 1,06E+14 5,95E+06 9,96E+07 _contig_13062 2,65E+14 1,00E+14 1,61E-04 1,19E-03 Contig248 5,10E+14 4,13E+13 1,03E+02 3,97E+03 _contig_22414 7,71E+14 3,37E+13 8,06E+00 3,66E+02 _contig_6210 2,25E+14 2,74E+13 7,73E-06 6,57E-04 Contig2557 2,07E+14 1,67E+13 6,80E-03 2,83E-02 _contig_74943 7,44E+14 1,39E+13 6,45E-04 3,91E-03 _contig_33342 1,60E+14 1,20E+13 1,39E-04 1,04E-03 _contig_8813 1,60E+14 1,12E+13 2,30E+06 4,17E+07 _contig_21983 7,73E+14 1,08E+13 7,05E-03 2,91E-02 _contig_4653 5,04E+14 -1,10E+12 6,91E+09 5,66E-04 _contig_358 1,56E+14 -1,08E+13 4,52E-04 2,89E-03 _contig_7453 1,37E+14 -1,44E+13 4,47E+09 3,83E-04 _contig_53460 5,25E+14 -1,60E+13 5,49E-04 3,42E-03 _contig_20135 9,79E+14 -1,79E+13 6,13E+08 6,67E+09 _contig_72 2,14E+14 -1,86E+13 2,15E-03 1,08E-02 _contig_11727 3,41E+14 -2,76E+13 1,86E-04 1,40E-02 _contig_25164 3,73E+13 -2,93E+13 1,03E-09 1,34E-07 _contig_33999 1,72E+14 -1,01E+14 7,03E-03 2,91E-02 _contig_17077 1,94E+14 -1,04E+14 7,63E-04 4,51E-03 _contig_22644 1,51E+14 -1,04E+14 7,68E+07 1,02E+09 _contig_4563 7,75E+14 -1,05E+14 8,95E+07 1,17E+09 _contig_2504 6,84E+13 -1,12E+14 7,05E+07 9,46E+08 _contig_23793 5,94E+14 -1,20E+14 1,08E-02 4,10E-02 _contig_18322 9,14E+14 -1,21E+14 1,57E+06 2,94E+07 _contig_2669 1,77E+14 -1,34E+14 2,88E+09 2,62E-04 _contig_4193 4,55E+14 -1,36E+14 4,04E-03 1,84E-02 _contig_9158 1,46E+13 -1,36E+14 1,86E+08 2,28E+09 _contig_14214 9,00E+14 -1,39E+14 2,33E-03 1,16E-02 _contig_18566 1,23E+14 -1,39E+14 2,78E+09 2,54E-04 _contig_6278 4,67E+14 -1,46E+14 3,92E-03 1,79E-02 _contig_25494 4,03E+14 -1,46E+14 5,62E-03 2,41E-02 _contig_4104 9,81E+14 -1,54E+14 1,12E-04 8,60E-04 109

_contig_17460 3,39E+14 -1,54E+14 2,73E-03 1,32E-02 Contig1459 6,25E+14 -1,54E+14 6,06E-04 3,72E-03 _contig_36756 1,74E+14 -1,69E+14 9,42E-03 3,68E-02 _contig_19632 3,15E+14 -1,70E+14 1,34E-03 7,24E-03 _contig_32565 1,93E+14 -1,75E+14 4,89E-03 2,15E-02 _contig_759 2,07E+14 -1,76E+14 5,59E-03 2,40E-02 _contig_18656 1,75E+14 -1,79E+14 3,98E+08 4,53E+09 _contig_50650 1,79E+14 -1,82E+14 4,80E-03 2,12E-02 _contig_23761 1,60E+14 -1,85E+14 5,83E-03 2,48E-02 _contig_25843 3,16E+14 -1,88E+14 4,73E-04 3,00E-03 _contig_19361 2,87E+14 -1,90E+14 6,09E-04 3,73E-03 Contig2282 9,02E+14 -1,95E+14 9,81E-03 3,79E-02 _contig_619 1,00E+13 -1,99E+14 4,09E+08 4,64E+09 _contig_34352 2,09E+14 -2,00E+14 6,30E+03 1,81E+05 _contig_4725 2,20E+14 -2,04E+14 8,27E-04 4,82E-03 _contig_51756 1,22E+13 -2,12E+14 4,14E-03 1,88E-02 _contig_903 3,37E+13 -2,17E+14 4,36E-06 3,89E-04 _contig_5517 2,04E+14 -2,18E+14 4,24E+03 1,07E+06 _contig_40466 2,69E+14 -2,22E+14 1,25E-04 9,46E-04 _contig_13213 1,66E+14 -2,30E+14 1,92E-03 9,78E-03 _contig_30550 1,48E+14 -2,31E+14 7,59E-04 4,49E-03 _contig_31432 1,42E+14 -2,32E+14 2,22E-03 1,11E-02 _contig_137234 5,26E+14 -2,39E+14 8,30E+09 6,62E-04 _contig_2632 4,42E+14 -2,45E+14 2,10E-10 2,95E-08 _contig_211 9,34E+14 -2,53E+14 6,90E-10 9,27E-09 _contig_20199 2,89E+14 -2,57E+14 7,10E-06 6,11E-04 _contig_113664 2,71E+14 -2,62E+14 1,36E+09 1,35E-04 _contig_69287 1,79E+14 -2,64E+14 1,03E-04 8,05E-04 _contig_12647 1,52E+14 -2,69E+14 4,17E-04 2,70E-03 _contig_407 2,23E+14 -2,71E+14 1,54E+02 5,72E+03 _contig_17887 9,67E+14 -2,79E+14 2,44E-04 1,70E-03 _contig_4678 5,20E+14 -2,94E+14 5,93E+04 1,19E+07 _contig_195057 1,02E+14 -3,20E+14 3,06E+08 2,76E-04

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Anexo 14. Mapeo de las vías por Kegg de la comparación de los transcritos expresados diferencialmente en mandíbula proveniente de cultivo in vivo y cultivo in vitro de S. lalandi

KEGG categories represented Number of KOs Metabolism 96 Carbohydrate metabolism 19 Energy metabolism 5 Lipid metabolism 17 Nucleotide metabolism 6 Amino acid metabolism 15 Metabolism of other amino acids 6 Glycan biosynthesis and metabolism 2 Metabolism of cofactors and vitamins 13 Metabolism of terpenoids and polyketides 5 Biosynthesis of other secondary metabolites 1 Xenobiotics biodegradation and metabolism 7 Genetic Information Processing 1 Folding, sorting and degradation 1 Environmental Information Processing 16 Membrane transport 2 Signal transduction 11 Signaling molecules and interaction 3 Cellular Processes 21 Transport and catabolism 12 Cell growth and death 2 Cellular community - eukaryotes 4 Cell motility 3 Organismal Systems 39 Immune system 6 Endocrine system 17 Circulatory system 2 Digestive system 9 Excretory system 1 Aging 3 Environmental adaptation 1

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Anexo 15. Resumen del análisis estadístico aplicando la prueba z para media de dos muestras. Comparación del contenido en porcentaje de ácidos grasos en mandíbula inferior por fenotipo en S.

SAFAs MUFAs PUFAs Normal Deforme Normal Deforme Normal Deforme Mean 2,114 1,510 1,509 0,852 1,327 0,724 Variance 0,886 2,234 1,701 0,318 0,302 0,199 Sample size 2 2 2 2 2 2 z 0,602 0,654 1,204 P(Z<=z) one-tail 0,274 0,257 0,114 z Critical one-tail 1,645 1,645 1,645 P(Z<=z) two-tail 0,548 0,513 0,229 z Critical two-tail 1,960 1,960 1,960

DHA EPA ARA Normal Deforme Normal Deforme Normal Deforme Mean 0,498 0,221 0,373 0,150 0,097 0,051 Variance 0,026 0,011 0,034 0,005 0,001 0,001 Sample size 2 2 2 2 2 2 z 2,014 1,602 1,709 P(Z<=z) one-tail 0,022 0,055 0,044 z Critical one-tail 1,645 1,645 1,645 P(Z<=z) two-tail 0,044 0,109 0,088 z Critical two-tail 0,044 1,960 1,960

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Anexo 16. Resumen del análisis estadístico aplicando la prueba z para media de dos muestras. Comparación del contenido en porcentaje de ácidos grasos en hígado por fenotipo en S. lalandi

SAFAs MUFAs PUFAs Normal Deforme Normal Deforme Normal Deforme Mean 6,410 5,097 3,769 3,639 3,384 3,749 Variance 1,110 0,231 0,042 0,061 0,266 0,867 Sample size 2 2 2 2 2 2 z 1,603 0,570 -0,485 P(Z<=z) one-tail 0,054 0,284 0,314 z Critical one-tail 1,645 1,645 1,645 P(Z<=z) two-tail 0,109 0,569 0,628 z Critical two-tail 1,960 1,960 1,960

DHA EPA ARA Normal Deforme Normal Deforme Normal Deforme Mean 0,506 0,592 1,062 1,130 0,147 0,149 Variance 0,013 0,079 0,063 0,198 0,001 0,001 Sample size 2 2 2 2 2 2 z -0,405 -0,188 -0,061 P(Z<=z) one-tail 0,343 0,425 0,476 z Critical one-tail 1,645 1,645 1,645 P(Z<=z) two-tail 0,685 0,851 0,951 z Critical two-tail 1,960 1,960 1,960

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