MARTEILIOSI

•Phylum:

•Ordine: Paramyxida

•Specie: refringens Responsabile di ricorrenti episodi di mortalità a carattere devastante in ostriche piatte (M. refringens O)

•Specie ospite:

+ M. refringens M in mitili, inclusi Mytilus edulis e M. galloprovincialis + M. sydneyi in Crassostrea glomerata - “Malattia QX “ + M. cochilia in Cerastoderma edule + M. tapetis in Ruditapes philippinarum

•Localizzazione: tratto digestivo TASSONOMIA MARTEILIOSI MARTEILIOSI MARTEILIOSI

Long-term vacillation in the taxonomic status of lineages in the Marteilia refringens (, , Paramyxida) ‘complex’, with consequences for policy and trade decisions. A working panel of the European Food Safety Authority (EFSA) on Animal Health and Welfare regarding the susceptibility to certain mollusc diseases concluded that M. refringens and M. maurini were synonymous (EFSA, 2007). The synonymization of M. refringens and M. maurini had an important consequence: any new discovery of infection by either type could only be reported as M. refringens, a notifiable pathogen to both the OIE, and to the European Commission under Directive EC/2006/8 MARTEILIOSI

M. refringens and M. pararefringens have different distributions. There is currently no evidence of M. refringens north of France (Kerr et al., 2018).

Consistent with these results are previous findings of a programme monitoring for presence of Marteilia and Bonamia in O. edulis running from 1982 to 2014 (Laing et al. 2014). In total 76 307 from 144 sites in England and Wales were examined by histology, in which no cases of Marteilia infection were found. Similarly, routine sampling of 2,985 Swedish oysters by the Swedish Veterinary Institute revealed no Marteilia infections (unpublished data), and oysters infected with Marteilia have also never been recorded in Norway (Kerr et al., 2018). Arzul et al., 2018 La marteiliosi da M. refringens era conosciuta in passato anche come “Aber disease” dell’ostrica piatta (O. edulis) ed è nota in Europa fin dal 1968, avendo causato ricorrenti episodi di mortalità devastante in popolazioni di ostriche in Francia che nel giro di una decina di anni avrebbero causato il dimezzamento della produzione.

Distribuzione geografica: area Mediterranea (Francia: Bretagna e costa Atlantica), Grecia, Italia (in ostriche piatte lungo le coste adriatiche), Marocco, Portogallo, Spagna - Stati Uniti Marteilia sydneyi in Australia + altre specie in altre zone geografiche CICLO BIOLOGICO

La trasmissione diretta del parassita tra ostriche non è stata dimostrata.

Ciclo di M. refringens: da qualche anno si ritiene che possa essere indiretto con presenza di un ospite crostaceo (alternato? vettore?)

Diversi organismi sono stati implicati come potenziale ospite intermedio di M. refringens:

- Copepodi quali Acartia grani, Canuella perpleja e Euterpina acutrifons

- Cnidaria come Cereus pedunculatus

- Larve di crostacei decapodi

- Il pesce Pomatochistus microps

Con l'eccezione di A. grani, tuttavia, la presenza di M. refringens in questi componenti dello zooplankton è stata dedotta dal ritrovamento di DNA. La trasmissione sperimentale del patogeno da ostriche infette ad A. grani ha avuto successo; tuttavia non c’à alcuna evidenza di trasmissione dal copepode al bivalve CICLO BIOLOGICO

Schematic representation of proposed Marteilia refringens life cycle

Posterior part of the body of Acartia grani infected with M. refringens (white arrow)

Marteilia refringens cells stained by ISH in copepodid stage III (CIII) of Paracartia grani. (A) Alimentary canal epithelium, (B) Carrasco et al., 2018 digestive epithelium, (C) germinal site of ovary (Boyer et al., 2013). CICLO BIOLOGICO

Differenti stadi del parassita possono essere osservati nelle ostriche infette

• I giovani plasmodi si rinvengono nell’epitelio dei palpi labiali e nello stomaco.

• La sporulazione ha luogo nei tubuli e nei dotti della ghiandola digestiva.

• Gli sporangi sono rilasciati nel lume del tratto digestivo ed eliminati con le feci. Possono sopravvivere nell’ambiente per diversi giorni fino a 2-3 settimane in relazione alle condizioni ambientali. CICLO BIOLOGICO

I protozoi Paramyxida sono parassiti di invertebrati marini con un caratteristico sviluppo cell-within-cell che avviene per divisione endogena con la formazione di cellule figlie. A questo tipo di riproduzione si associa spesso la sporogonia.

I plasmodi primari di M. refringens aventi dimensioni di circa 10 µm sono comunemente osservati nell’epitelio dei palpi labiali e nello stomaco.

Per M. refringens, M. cochillia e M. granula il plasmodio primario contiene una sola cellula secondaria da cui internamente originano per divisione binaria 8 cellule secondarie o presporangi.

Questi stadi precoci di infezione sembrano migrare ai tubuli digestivi.

A questo livello I presporangi maturano in sporangi contenenti da 4 (M. refringens e M. granula) a 6 (M. cochillia) . M. sydneyi produce fino a 16 cellule secondarie con 2 spore ciascuna. Le spore mature del genere Marteilia contengono 3 sporoplasmi e vengono rilasciate nel lume dei tubuli digestivi per poi venire disperse nell’ambiente attraverso le feci. CICLO BIOLOGICO Epidemiologia

•Marteilia refringens è causa di elevate mortalità nell’ostrica piatta sebbene si manifesti in alcune popolazioni senza causare malattia. Nei mitili in genere l’infezione è asintomatica.

•La morte si manifesta durante il secondo anno post-infezione.

•I fattori che agiscono sulla risposta dell’ospite non sono noti, ma si ritiene possano essere dovuti a stress ambientali o diminuita resistenza

•Può sopravvivere fino a 2-3 settimane fuori dall’ospite

Fattori predisponenti sono: temperature >17°C (primavera, estate, inizio dell’autunno); salinità<30‰ Tuttavia la malattia non è stagionale ed elevate mortalità si possono verificare anche in inverno Epidemiologia

La "Maladie des Abers" è stata descritta per la prima volta in Bretagna, Francia, in Ostrea edulis - ostrica piatta europea nel 1967, causando perdite fino al 90% annuo. L'agente eziologico è stato descritto da Comps (1970) da ostriche coltivate a Marennes- Oleron Bay mentre Grizel et al. (1974) ha descritto l'organismo in modo più dettagliato denominandolo Marteilia.

Le epizoozie in genere iniziano a maggio, con un picco nel mese di giugno ad agosto e diminuendo gradualmente entro dicembre e gennaio, lasciando un periodo di «eclissi» in marzo-aprile, quando il parassita non può essere trovato.

Le osservazioni hanno dimostrato che lo sporangio maturo, presente da maggio o giugno in poi, viene eliminato entro la fine di gennaio e che giovani plasmodi persistono durante l'inverno per riavviare nuove infestazioni durante il maggio successivo.

Le ostriche possono essere parassitate senza la comparsa della malattia e della mortalità che possono essere regolate, in parte, dalle condizioni ambientali quali la temperatura dell'acqua e l’alta salinità. L'aumento della temperatura dell'acqua in primavera può favorire lo sviluppo dell'organismo, mentre l’aumento di salinità e ricambio idrico possono inibirne lo sviluppo e la trasmissione. Tuttavia, solo questi parametri non possono spiegare le apparenti differenze di virulenza di questo parassita per le ostriche ad esempio in acque francesi e olandesi Epidemiologia

L’emergenza di M. refringens negli anni ‘70 ed il suo impatto economico e sociale è storicamente documentato per l’ostreicoltura francese di O. edulis. Subito dopo la Francia, anche le produzioni di Spagna, Italia e Portogallo vennero devastate dalla Marteiliosi e gran parte dell’allevamento venne dirottato verso l’ostrica concava americana Crassostrea gigas. Quest’ultima ha mostrato una notevole resistenza verso Marteilia e Bonamia e un’ottima adattabilità agli ambienti marini europei con ottimi risultati produttivi.

La produzione di O. edulis in Europa non ha più raggiunto i livelli produttivi precedenti al 1970, quindi attualmente l’ostreicoltura europea si basa sull’allevamento di C. gigas che recentemente è stata colpita da focolai ad elevata mortalità da parte di Ostreid Herpesvirus (OsHv-1 lvar) (Segarra et al., 2010). Epidemiologia Epidemiologia

La prevalenza è molto variabile, fino al 98% in O. edulis. Valori maggiori di prevalenza dipendono dal tipo di gestione dell’allevamento e da tempi di esposizione all’infezione superiori ad 1 anno. L'infezione è letale per le ostriche: un tasso di mortalità del 50-90% è di solito riportato durante l'estate e l'autunno, ed è associato alla sporulazione del parassita. Allo stesso modo, la morbilità è più alta durante i periodi più caldi.

Le cozze sono meno influenzate dall’infezione ma episodi di mortalità fino al 40% sono stati segnalati in alcune delle aree colpite (Berthe et al., 2004) e cozze selvatiche possono presentare valori di mortalità del 100% una volta introdotte in una zona infetta Patogenesi e Sintomatologia

Nelle infezioni pesanti, M. refringens riduce significativamente l'assorbimento di sostanze organiche determinando la perdita di condizione come conseguenza della riduzione di acquisizione dell’energia. Inoltre, il parassita può interferire direttamente con l'alimentazione e l’assorbimento dell’ospite con la sola azione meccanica. In Mytilus galloprovincialis la presenza di M. refringens inibisce lo sviluppo di cellule del mantello destinate allo stoccaggio lipidico e interferisce anche con lo stoccaggio del glicogeno in O. edulis

Segni clinici: non sono patognomonici sebbene spesso si osservi dimagrimento, pallore della ghiandola digestiva e riduzione della crescita, atrofia delle gonadi ed elevata mortalità.

Patogenesi

Marteilia refringens parassita la ghiandola digestiva provocando necrosi dei diverticoli digestivi (soprattutto nelle fasi di sporulazione) con mancato assorbimento dei nutrienti. Vengono coinvolti l’epitelio dei palpi labiali e dello stomaco (forse anche delle branchie) negli stadi iniziali di infezione, poi maturazione e sporulazione del parassita nei tubuli e nei dotti digestivi.

Young stages (without refringent granules) of Marteilia refringens (arrowheads) within the digestive epithelium of Ostrea edulis. H&E staining. Patogenesi

La ghiandola digestiva in cui M. refringens e le altre specie si localizzano, è nei molluschi un sito di digestione intracellulare dell’alimento e uno dei principali siti per lo stoccaggio delle riserve metaboliche.

Picture: Histological section of O. edulis digestive gland showing M. refringens sporangia (arrows) inside the epithelium and free in the lumen (H&E). Histopathological sections of Marteilia spp. parasites in host tissues, hematoxylin and eosin staining. (A) Marteilia refringens in the digestive tubule epithelia of the mussel, Mytilus galloprovincialis. Scale bar = 50 lm. (B) Marteilia cochillia in the digestive tubule epithelia of the cockle, Cerastoderma edule. Scale bar = 100 lm. (C) Marteilia sydneyi early developmental stages (arrows) in the gill of the Sacccostrea glomerata. Scale bar = 20 lm. (D). M. sydneyi mature stages (arrows) at the epithelia of the digestive tubules of S. glomerata. Scale bar = 40 lm. (E) The ovary of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, infected with ovarian Marteilia chungmuensis. Scale bar = 30 µm. (F) The epithelia of digestive diverticula of the Manila clam, Ruditapes philippinarum, infected with Marteilia granula. Scale bar = 10 µm. Diagnosi

Esame macroscopico poco significativo: trasparenza del mantello (esaurimento delle riserve di glicogeno), emaciazione, ghiandola digestiva di colore chiaro, rimpicciolimento e magrezza dell’animale in caso di grave infezione Diagnosi

Esame microscopico a fresco Microscopia elettronica / citopatologia

In infezione avanzata, sporangi In infezione avanzata, diverse fasi dei maturi con granuli rifrangenti parassiti possono essere osservate possono essere osservati in negli epiteli del tratto digestivo. preparati a fresco dagli individui aperti o appena morti o dalle feci di molluschi vivi Diagnosi

Esame microscopico a fresco per impronta previa colorazione Wright-Giemsa o Hemacolor, Diff-QuiK, ecc. Morfologia del parassita (30–40 μm) Diagnosi

Esame istologico effettuato su sezioni di tubuli della ghiandola digestiva

Microscopia elettronica ed indagini biomolecolari (PCR)

La PCR è la tecnica di conferma ISH Smart 2 è in grado di rilevare le specie di Marteilia incluse Marteilia refringens, M. maurini and M. sydneyi. Journal of Pathology February 2013, Volume 112, Issue 2, Pages 175–183 Diagnosi Misure di prevenzione e controllo

Il modo migliore per evitare la diffusione della parassitosi è la restrizione delle movimentazioni di stock infetti in aree considerate Marteilia free.

La Marteiliosi è una malattia notificabile per la legislazione europea (2006/88/CE) e per l’OIE.

Malgrado la normativa sulle movimentazioniSUPERATA sia applicata rigorosamente, la potenziale presenza di Marteilia nei mitili rappresenta un’importante complicazione epidemiologica, almeno finchè non sarà chiarito pienamente il ruolo di questi nella trasmissione del parassita alle ostriche.

Seminare e far crescere le ostriche al di fuori del periodo in cui possono infestarsi più facilmente, può ridurre notevolmente il rischio Marteiliosi.

Alla luce del possibile ruolo dei copepodi nella trasmissione di M. refringens, la mappatura ed il monitoraggio della distribuzione di questi invertebrati potrebbe essere elemento importante di cui tenere conto per un’efficace strategia preventiva. Misure di prevenzione e controllo

Sono stati fatti tentativi in Europa con diverse specie del genere Ostrea, ma hanno tutte dimostrato elevata suscettibilità. Le popolazioni autoctone di Ostrea edulis e Mytilus edulis sono altamente suscettibili all'infezione.

Anche se alcune fasi primarie di Marteilia sono state osservate in Crassostrea gigas (Berthe et al., 2004), questa specie appare resistente alla infestazione del parassita.

Il mantenimento dell’allevamento a basse densità o in associazione a specie di molluschi resistenti come Crassostrea gigas, hanno dimostrato di essere strategie efficaci di controllo dell’infestazione da Marteilia. Misure di prevenzione e controllo

Nelle zone endemiche il controllo viene tentato limitando la semina di ostriche durante il periodo di maggiore trasmissione (luglio e agosto) e da una crescente tendenza ad utilizzare ostriche europee in aree con elevate salinità (35-37‰) per limitare lo sviluppo di Marteilia.

La diversificazione è una questione importante per i produttori perché aiuta ad ampliare le strategie di mercato e anche per mitigare perdite commerciali totali associate con patologie specie-specifiche.

Ad esempio M. cochillia sembra avere avuto un forte impatto sulla produzione di Cerastoderma edule in Spagna. Prevalenze e mortalità associate hanno raggiunto il 100%, causando un collasso di una delle principali risorse economiche per la Galizia (costa atlantica della Spagna) dal 2012. Misure di prevenzione e controllo Misure di prevenzione e controllo Misure di prevenzione e controllo Misure di prevenzione e controllo Misure di prevenzione e controllo Misure di prevenzione e controllo Misure di prevenzione e controllo Misure di prevenzione e controllo