Molekularphylogenetische Untersuchungen zur Koevolution der Rostpilzgattung Ravenelia mit ihren Leguminosenwirten

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Malte Ebinghaus

2011

DIPLOMARBEIT

VORGELEGT ZUR ERLANGUNG DES GRADES EINES DIPLOM-BIOLOGEN AN DER FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE UND BIOTECHNOLOGIE DER RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM

Molekularphylogenetische Untersuchungen zur Koevolution der Rostpilzgattung Ravenelia mit ihren Leguminosenwirten

von Malte Ebinghaus

Angefertigt in der Arbeitsgruppe Geobotanik

Bochum, im März 2011

Referent: Prof. Dr. Dominik BegerowKoreferent: Prof. Dr. Ulrich Kück

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1 1.1 Die Familie derLeguminosae 1 1.1.1 Die Unterfamilie der Mimosoideae 2 1.1.2. Barcoding der Leguminosae 5 Was bedeutet 'barcoding'? 5 1.1.3. Der verwendete Marker 5 1.2. Die Gruppe der Rostpilze (Basidiomycota: Uredinales) 9 1.2.1. Einführung in die Rostpilze 9

1.2.2. Die Gattung Ravenelia BERK 10 1.2.3. Der verwendete molekulare Marker 11 1.3. Ziele dieser Arbeit 12 2. Material und Methoden 13 2.1. verwendete Puffer und Lösungen 13 2.2. sonstige Materialien 13 2.3. verwendete Kits 14 2.4. verwendete Laborgeräte 14 2.5. Bioinformatikprogramme 15 2.6. Herkunft der Aufsammlungen 15 2.7. Akzessionen aus GenBank 17 2.8. Molekularbiologische Methoden 19 2.8.1. DNA-Isolationen 19 2.8.2. Polymerase Kettenreaktion (PCR 20 2.8.3. Gelelektrophorese 22 2.8.4. Aufreinigung der PCR-Produkte 23 2.8.5. Sequenzierung der PCR-Amplifikate 23 2.9. Bioinformatorische Methoden 24 2.9.1. Das Alignment 24 2.9.2. Phylogenetische Rekonstruktionsmethoden 25 Maximum Likelihood-Analyse 25 Bayessche Statistik 25

2.9.3. Erstellung der Distanzmatrix 26 3. Ergebnisse 27

3.1. Leguminosae 27 3.1.1 DNA-Isolation-, PCR- und Sequenzierergebnisse 27 3.1.2. Topologie der matK/trnK-Genstammbäume für die untersuchten Akazienarten 30 3.1.2.1. ML-Analyse 30 3.1.2.2. Analyse nach Bayesscher Statistik 32 3.1.3. Topologie des ML-Stammbaumes für die Nicht-Akaziendaten 34 3.1.4. Topologie des Bayes-Stammbaumes für die Nicht-Akaziendaten 37 3.1.5. K2P-Distanzmatrix der matK/trnK-Sequenzdaten der südafrikanischen Akazien 39 3.2. Ravenelia 41 3.2.1. Topologie der LSU-/SSU-Genstammbäume für die untersuchten Ravenelia-Arten 42 3.2.1.1. Analyse nach Bayesscher Statistik 42 3.2.1.2. ML-Analyse 44 3.2.2. Neue Wirt-/Parasit-Kombinationen 46 4. Diskussion 47 4.1. Phylogenetische Rekonstruktion der Wirtspflanzen 47 4.1.1. Phylogenie von Acacia s.l 47 4.1.1.1. Phylogenie der Gattung Senegalia 47 4.1.1.2. Phylogenie der Gattung Vachellia 48 4.1.2. Phylogenie der Nicht-Akazien 50 4.1.2.1. Phylogenie der Mimosoideae 50 4.1.2.2. Phylogenie der Faboideae 51 4.2. Barcoding der Wirtspflanzen 51 4.2.1. Barcoding der Gattung Vachellia 52 4.2.2. Barcoding der Gattung Senegalia 53 4.2.3. Zusammenfassung des Wirts-barcoding 54 4.3. Phylogenetische Rekonstruktion des Parasiten 56 4.3.1. Vergleich beider Analyseverfahren 56 4.3.2. Phylogenetische Hypothesen zur Gattung Ravenelia 56

4.3.3. Korrelation der Ravenelia-Phylogenie ,it den Wirtsphylogenien unter Einbeziehung geographischer Gesichtspunkte 57 4.3.4. Identifizierung der Ravenelia-Arten 59

5. Zusammenfassung 61 6. Abkürzungsverzeichnis 62 7. Literaturverzeichnis 63 8. Anhang 69 9. Danksagung 84 10. Erklärung 85

EINLEITUNG 1. Einleitung

1.1. Die Familie der Leguminosae

Mit mehr als 19000 Arten in ca. 730 Gattungen sind die Leguminosen eine der größten Pflanzenfamilien weltweit (zitiert nach Wojciechowski et al. 2004), zu denen einige ökonomisch wichtige Nutzpflanzen wie die Bohne (Phaseolus L.) oder die Soja (Glycine max L.) gehören. Die Vertreter dieser Familie zeichnen sich durch den Besitz eines in den meisten Fällen oberständigen Fruchtknotens aus, der aus einem einzigen Fruchtblatt aufgebaut ist. Die Fruchtform dieser Familie ist ursprünglich eine vielsamige Hülse, deren Samen meist kein Endosperm als Speicherorgan ausbilden, sondern stattdessen Reservestoffe in Form von Stärke und Proteinen in den Embryonen speichern. Weitere Charakteristika sind die meist fiederteiligen und häufig mit auffälligen Stipeln versehenen Laubblätter, sowie die oftmals als Knöllchenbakterien symbiontisch lebenden Actinomyceten, die der Fixierung von Luftstickstoff dienen und somit auch eine Besiedelung von nährstoffarmen Lebensräumen ermöglichen (Kadereit 2002). Bentham (1865) erkannte als einer der ersten drei Hauptgruppen innerhalb der Leguminosae, die er aufgrund der Blütenmorphologie unterschied: 1. Die weltweit verbreiteten Faboideae besitzen die typischen zygomorphen ‚Schmetterlingsblüten’ deren adaxiales Kronblatt außerhalb der anliegenden lateralen Kronblätter steht. Mit ca. 12000 Arten bilden sie die artenreichste Gruppe. 2. Die subtropisch-tropisch verbreiteten Caesalpinioideae zeigen ebenfalls eine zygomorphe Bütensymmetrie, allerdings wird das adaxiale Kronblatt durch die lateralen Kronblätter bedeckt. Zudem werden keine typischen Schmetterlingsblüten ausgebildet. 3. Die ebenfalls subtropisch-tropisch verbreiteten Mimosoideae besitzen als einzige Gruppe radiärsymmetrische Blüten mit einer oftmals vervielfältigten Anzahl an Staubblättern, typisch ist außerdem die Ausbildung von köpfchen- oder ährenförmigen Blütenständen (Schulze-Menz 1964). Polhill et al. bestätigten diese Einteilung und sprachen ihnen den taxonomischen Rang von Unterfamilien zu (Zitiert nach Wojciechowski 2003). Allerdings herrschte lange Zeit Unklarheit über die systematische Stellung der Gruppen zueinander, da eine strikt auf morphologischen Merkmalen basierte Einteilung durch teilweise sich

1 EINLEITUNG widersprechende Merkmale erschwert wurde. Molekular-phylogenetische Untersuchungen (Käss und Wink, 1996) konnten Anhand von rbcL-Daten diese Lücke schließen und zeigen, dass die monophyletischen Mimosoideae und Papillionoideae innerhalb der Cesalpinioideae evolvierten und die Cesalpinioideae paraphyletisch zu ihnen stehen. Diese verwandschaftliche Stellung wurde inzwischen durch weitere matK-basierte Arbeiten bestätigt (Wojciechowski, 2003).

1.1.1. Die Unterfamilie der Mimosoideae

Die Savannenregionen Südafrikas, die sich hauptsächlich im nördlichen und östlichen Teil des Landes ausprägen sind mit einem geschätzten Gesamtanteil von 46% (www.plantzafrica.com) das größte südafrikanische Biom. Klimatisch ist die südafrikanische Savanne geprägt durch eine deutliche Saisonalität in den jährlichen Niederschlagsmengen, die im Jahresmittel meist unter 1500mm liegen und in den Übergangszonen zu Halbwüsten unter 500mm sinken. Physiognomisch betrachtet entspricht die Savanne einer offenen Waldlandschaft, die ihre Entstehung dem saisonalen Auftreten von Feuern sowie dem Verfraß durch zahlreiches Großwild wie Impalas, Antilopen und Elefanten verdankt (Körner 2002). Eine in diesen Regionen stark vertretene Pflanzengruppe stellen die Mimosoideae dar. Sie wurden von Bentham aufgrund divergierender blütenmorphologischer Merkmale in fünf verschiedene Triben eingeteilt (Zitiert nach Luckow et al. 2003). Für die Einteilung in die Triben Parkieae, Mimoseae, Piptadenieae, Acacieae und Ingeae zog er insbesondere Merkmale wie Knospendeckung der Sepalen und Ausprägungen des Androeceums heran. Eine strikte Gruppierung nach diesen Merkmalen führte aber zu Schwierigkeiten, da einige Vertreter der einzelnen Gruppen sich widersprechende Merkmalskombinationen aufweisen. Dennoch wurde die Systematik von Bentham lange Zeit verwendet und von Burkart 1939 zusätzlich um den monotypischen Tribus Mimozygantheae erweitert (Zitiert nach Luckow et al. 2003). 1981 ließ Elias die Piptadenieae in die Mimoseae aufgehen, doch die Monophylie der von ihm erkannten vier Triben wurde schnell durch weitere Arbeiten, die unter anderem auf Pollenstrukturanalysen beruhten, angezweifelt (Zitiert nach Luckow et al. 2003). Molekularphylogenetische Analysen von Käss und Wink (1996) die auf rbcL-

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Sequenzdaten basierten, bestätigten den Verdacht, dass es sich hierbei nicht um die tatsächlichen Verwandtschaftsverhältnisse handelt. Die heute anerkannten Verwandtschaftsbeziehungen innnerhalb der Mimosoideae wurden durch Luckow et al. (2003) rekonstruiert: Demnach werden die Mimosoideae in nunmehr vier Triben unterschieden. Die polyphyletischen Parkieae sind in den Mimoseae aufgegangen die ihrerseits als paraphyletisch angesehen werden, innerhalb derer sich die polyphyletischen Acacieae und die als monophyletisch erkannten Ingeae entwickelten. Die südamerikanischen monotypischen Mimozygantheae sind ebenfalls innerhalb der Mimosoideae verblieben.

Im Folgenden wird vertiefend auf die systematische Stellung der Gattung Acacia im traditionellen Sinne eingegangen werden, da sie in der vorliegenden Arbeit als Hauptwirt der behandelten Rostpilzgattung eine zentrale Rolle einnimmt.

Die Gattung Acacia sensu lato im Tribus der Acacieae (Mimosoideae) ist mit ca. 1450 Arten die zweit größte Gattung innerhalb der Leguminosen und ist weltweit in den Tropen und Subtropen verbreitet (Lewis et al., 2005). Wie alle Mimosoideen besitzen die Akazien actinomorphe Blüten, die in köpfchen- oder ährenförmigen Blütenständen zusammengefasst sind, sowie ein- bis mehrfach fiederteilige Blätter. Nach der Erstbeschreibung der Gattung durch den englischen Botaniker Philip Miller (1754) wurde eine afrikanische Spezies, Acacia nilotica Mill. als Typusbeleg für die Gattung festgelegt. Während Bentham (1875) die Gattung in sechs Serien einteilte, setzte sich die Gruppierung in drei Untergattungen durch, die Vassal 1972 aufgrund blütenmorphologischer und pollenstrukturanalytischer Arbeiten vorgeschlagen hatte: 1. Untergattung Acacia: Verbreitungsschwerpunkt in Afrika (ca. 73 Arten) und Amerika (ca. 60 Arten). 2. Untergattung Aculeiferum: Verbreitungsschwerpunkt in Amerika (ca. 125 Arten) und Afrika (ca. 69 Arten). 3. Untergattung Phyllodineae: Verbreitungsschwerpunkt in Australien (ca. 960 Arten). (Orchard und Maslin 2005, Smit 2008)

Erste fundierte Zweifel an der Monophylie der Akazien äußerte Pedley (1986) nach seinen umfangreichen vergleichenden Analysen zu dieser Gruppe, in die neben den

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üblichen blütenmorphologischen Merkmalen auch biochemische Gesichtspunkte mit einflossen. So unterschied auch Pedley mehrere Akazien-Gruppen, schlug jedoch eine Namensgebung vor, die sich von der von Vassal geprägten wie folgt unterschied: Alle bei Vassal geführten Untergattungen hebt Pedley einerseits auf Gattungsniveau und benennt die einzelnen Gruppen wie folgt um. Die Untergattung Acacia wird zu Acacia, die Untergattung Aculeiferum zu Senegalia und die Untergattung Phyllodineae zu Racosperma (Pedley zitiert nach Maslin et al. 2003). Die Polyphylie der Akazien wurde durch zahlreiche kladistische Untersuchungen bestätigt (Miller und Bayer 2001; Miller et al. 2003a; Miller et al. 2003b; Luckow et al. 2003). Basierend auf diesen Arbeiten folgerte dann auch die Unumgäglichkeit einer neuen Namensgebung, die in dem Proposal von Orchard und Maslin (2003) dem IAPT vorgeschlagen wird und vorläufig zu einer Retypisierung der Gattung mit einer australischen Typusart, Acacia penninervis, führte. Auf dem internationalen botanischen Kongress in Wien (2005) wurde der Vorschlag ratifiziert und als Konsequenz daraus die Umbennenung der Akazien im Sinne von Orchard und Maslin vorgenommen. Die Retypisierung führte jedoch aufgrund einiger Verfahrensmängel zu regem Widerstand in der botanischen Gemeinschaft, sodass diese Entscheidung zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht als endgültig abgeschlossen angesehen werden kann (Luckow et al. 2005; www.acaciavote.com). So wurde es der botanischen Gemeinschaft freigestellt, die Gruppe der Akazien in ihrer ursprünglichen und weitgefassten Nomenklatur zu verwenden oder der neu empfohlenen eng gefassten Namensgebung zu folgen. Ich werde, ohne in jedweder Form Stellung zu diesem Streit zu beziehen, in dieser Arbeit der Nomenklatur von Orchard und Maslin (2003) folgen:

Untergattung Gattung Acacia Vachellia Aculeiferum Sektion Spiciflorae Senegalia Sektion Filicinae Acaciella Acacia coulteri-Gruppe Mariosousa Phyllodinae Acacia

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1.1.2. Barcoding der Leguminosae

Die oben besprochenen Änderungen in der Nomenklatur der Akazien und die Diskurse über die systematischen Zusammenhänge innerhalb der Leguminosen überhaupt sind nicht zuletzt durch die große Artenvielfalt und die mitunter sehr schwierige Artabgrenzung auf morphologischer Basis begründet, was überdies allzu oft zu dem ganz konkreten Problem der sicheren Artzuweisung im Feld führt. Eine exakte Artzuweisung und sichere Kenntnis über die tatsächlichen phylogenetischen Verhältnisse der behandelten (Wirts-)Gruppe sind allerdings eine grundsätzliche Vorraussetzung bei Studien, die sich mit koevolutionären Beziehungen von Parasiten mit ihren Wirtsorganismen befassen, sodass ein Ziel dieser Arbeit war, zu überprüfen, ob eine sichere Bestimmung der südafrikanischen Wirtspflanzen der Rostpilzgattung Ravenelia über einen molekularen Barcodingmarker möglich ist.

Was bedeuted ‚DNA-barcoding’? Der biowissenschaftliche Begriff des ‚barcoding’ wurde als Analogon zum technischen Strichcode eingeführt und soll genau wie sein Vorbild eine schnelle und unkomplizierte Identifizierung ermöglichen. Aufgrund der hohen Merkmalsdichte von DNA-Sequenzen, werden hierzu kurze Fragmente orthologer Gene verwendet. Einige Kriterien, die ein geeigneter Pflanzenbarcode-Marker erfüllen sollte, sind auf der Internet-Seite der CBOL Plant Working Group einsehbar (www.barcoding.si.edu/plant_working_group.html).

In vielen Tiergruppen konnten bereits sehr gute Erfolge für das barcoding mit einem kurzen Fragment der Cytochrom-Oxidase-1 (COX1) erzielt werden (Hebert et al. 2003b; Hebert et al. 2004). Hierbei wird die hohe Rate an identifizierten Arten von den Autoren insbesondere auf das Vorhandensein eines "barcode gap" zurückgeführt. Bei dem kontrovers diskutierten "barcode gap" handelt es sich um eine 'Lücke' zwischen der innerartlichen und der zwischenartlichen Sequenzdivergenz der betreffenden Taxa in Bezug zu der für die Analysen herangezogenen Genregion. Das heißt, dass die Variabilität der barcoding-Sequenz innerhalb einer Art deutlich kleiner ist, als die Variabilität dieser Sequenz zwischen den Arten, die genetische Distanz zwischen den betrachteten Arten also höher ist als es innerhalb dieser Arten der Fall

5 EINLEITUNG ist. Dieser Umstand würde eine sichere Abgrenzung der Arten ermöglichen (Fazekas et al. 2009):

"A gap between the largest intraspecific distance and the smallest interspecific distance is an ideal situation for unambiguous species assignment in the taxonomic group of interest" (Fazekas et al. 2009).

Die Abschätzung der genetischen Distanz erfolgt dabei nach dem Neighbour Joining Verfahren unter Verwendung des Kimura-2-Parameter (Kimura, 1980). Hierbei werden die Markersequenzen der untersuchten Taxa jeweils paarweise miteinander hinsichtlicher ihrer Nukleotidabfolge unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Substitutionswahrscheinlichkeiten verglichen. Als Zahlenwert erhält man so die korrigierten paarweisen Distanzen, die in einer Distanzmatrix dargestellt werden können.

Die veröffentlichten Studien zum Barcodingerfolg mit dem COX1-Marker im Tierreich stimmen insgesamt sehr optimistisch, sodass Schätzungen davon ausgehen mehr als 90% der Tierarten gegeneinander abgrenzen zu können (Chase und Fay 2009). Leider spiegeln diese Erfolge nicht die gegenwärtige Situation im Pflanzenreich wider. Aufgrund der deutlich geringeren Nukleotidsubstitutionsraten pflanzlicher mitochondrialer Gene gegenüber den tierischen, lässt sich keine Artenabgrenzung mit dem COX1-Marker innerhalb der Pflanzen erwarten (Wolfe et al. 1987; CBOL Plant Working Group 2009), weshalb die Wahl vor allem auf verschiedene codierende und nicht-codierende Bereiche der plastidären DNA fiel (CBOL Plant Working Group 2009). Nur wenige Analysen bezogen auch nicht-plastidäre Regionen ein, wie die nukleäre ITS-Region, die im Vorfeld erfolgreich für phylogenetische Rekonstruktionen auf Artniveau eingesetzt wurde (Kress et al. 2005; Chase et al. 2005), sich jedoch in vielen Landpflanzengruppen als nicht geeignet erwiesen hat (Chase et al. 2005; Chase und Fay 2009). Ein nicht zu unterschätzender Vorteil plastidärer DNA ist neben den relativ hohen Substitutionsraten die Tatsache, dass sie zumeist in sehr zahlreichen Kopien in einer Zelle vorliegt, was die Amplifizierbarkeit deutlich erhöht. So wurden in den letzten

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Jahren zahlreiche Studien veröffentlicht, die die Brauchbarkeit verschiedener plastidärer Regionen als Barcode-Marker untersuchten. Bislang zeigte allerdings weder einer der potentiellen Marker alleine vergleichbar hohe Trefferquoten bei der Artzuweisung wie dies für den COX1-Marker bei Tieren der Fall ist, noch liegen die innerartlichen Distanzen deutlich unter den zwischenartlichen Distanzen (Hollingsworth et al. 2008; Lahaye et al. 2007; Fazekas et al. 2009). Diese Erkenntnisse haben zunehmend zu dem Konsens geführt, einen Multilokus-Ansatz zu etablieren, nicht jedoch darüber, welches die am Besten geeigneten Marker sind. So ergab beispielsweise eine Studie der CBOL Plant Working Group 2009 folgende Barcodingerfolge für einige empfohlene Marker-Regionen: matK: 66%, rpoC: 43%, psbK-psbI: 68%, trnH-psbA: 69%, rbcL: 61% (CBOL Plant Working Group, 2009). Eine ähnliche Arbeit unterstützt prinzipiell diese im Vergleich geringeren Erfolgsqouten mit 56% für matK und 59% für trnH-psbA, die Arbeit zeigt jedoch auch, dass die Fähigkeit eines Markers Arten zu unterscheiden von den jeweiligen Pflanzengruppen abhängt (Fazekas et al. 2008). So verwundert es auch nicht, dass die einzelnen Fallstudien zu verschiedenen Empfehlungen hinsichtlich der Marker kommen (Chase et al. 2007; Newmaster et al. 2007; Hollingsworth et al. 2008; CBOL Plant Working Group 2009). Eine Lösung dieses Problems lässt sich eventuell durch einen gestuften Ansatz finden, den Newmaster et al. 2006 vorgeschlagen haben und der sich von der Vorstellung einer Standardkombination an Barcodes entfernt. Demnach sollte eine erste grobe systematische Einordnung der Taxa über einen stärker konservierten aber universell einsetzbaren Marker geschehen, um anschließend mit einer entsprechenden gruppenspezifischen und stärker variablen Region die Artidentifizierung durchzuführen (Newmaster et al. 2006). Letztlich gehen die Schätzungen für einen durchschnittlichen barcoding-Erfolg mittels plastidärer Gene von 70% bis maximal 90% korrekter Artzuweisungen aus, wobei sich die Schätzungen auf Multi-Loci-Ansätze beziehen (Hollingsworth et al. 2008; Lahaye et al. 2007). Der Erfolg des barcodings hängt jedoch stark von der Fragestellung und dem damit verbundenen Sampling ab und kann so im Einzelfall deutlich höher ausfallen, wie am Beispiel eines matK-basierten Barcodeansatzes innerhalb eines Schwesterartenkomplexes der Gattung Acacia s.l. gezeigt werden konnte (Newmaster und Ragupathy 2009).

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1.1.3. Der verwendete Marker

In dieser Arbeit sollte neben dem Wirtsbarcoding auch eine molekulare Wirtsphylogenie erstellt werden (siehe Abschnitt 1.3. Ziele dieser Arbeit). Daher war es (aus Zeit- und Kostengründen) wünschenswert für beide Zielsetzungen ein und denselben Marker verwenden zu können. Das Problem besteht hierbei darin, dass der Marker jeweils andere Bedingungen erfüllen muss. Bei phylogenetischen Untersuchungen sollte genügend Variabilität innerhalb von Synapomorphien vorhanden sein, damit eine ausreichende 'Verlinkung' der Taxa möglich wird. Will man jedoch Taxa, wie im Falle des barcoding, möglichst eindeutig voneinander abgrenzen, müssen stattdessen die Autapomorphien analysiert werden (Chase et al. 2005). Als Marker, der beide Bedingungen zumindest hinreichend erfüllt, ist die plastidäre matK/trnK-Region verwendet worden. Sie setzt sich aus dem matK-Exon, welches für eine Maturase kodiert und den zwei flankierenden trnK-Intronen zusammen. Insgesamt besitzt die Region eine Größe von etwa 2500bp, von denen ca. 1600bp auf das Exon entfallen (Hilu und Liang, 1997; Hilu et al. 2003; Lahaye et al. 2007). Es zeigte sich, dass das matK-Gen eine im Vergleich zu anderen plastidären Genen hohe Sequenzvariabilität aufweist die jedoch nicht homogen in der Sequenz verteilt ist. Während Bereiche der 3'-Region stärker konserviert sind, zeigt sich die 5'-Region deutlich variabler. Dieses Charakteristikum ließ schon früh die Möglichkeit vermuten diese Region auch über weite systematische Entfernungen hinweg als Phylogeniemarker anwenden zu können, was durch zahlreiche Arbeiten gestützt wird (Wojciechowski et al. 2004; Luckow et al. 2003; Miller und Bayer, 2001; Miller und Bayer, 2003). Durch Ermittlung der PICs (parsimony informative sites) einzelner matK-Sektionen konnte zwar gezeigt werden, dass die stärker variablen Regionen am 5'-Ende aufgrund geringerer Sequenzhomologie weniger informative Merkmale für phylogenetische Analysen auf höherem taxonomischen Rang aufweisen als dies für die konservierte 3'- Region der Fall ist (Hilu und Liang 1997). Doch eine 2008 veröffentlichte barcoding- Studie zeigte, dass gerade eben diese stärker variablen Sequenzbereiche Merkmale aufwiesen, die eine gute Artenabgrenzung erlauben (Lahaye et al. 2008). Diese und

8 EINLEITUNG weitere Arbeiten bekräftigen die Anwendbarkeit der matK-Region als Phylogenie- und barcoding-Marker (siehe oben).

1.2. Die Gruppe der Rostpilze (Basidiomycota: Uredinales)

1.2.1. Einführung in die Rostpilze

Die Rostpilze bilden innerhalb der Basidiomycota eine natürliche Verwandtschaftsgruppe und sind mit etwa 7000 Arten in über 120 Gattungen vertreten (Hawksworth et al. 1995; Kirk et al. 2001; Cummins & Hiratsuka 2003). Zu ihren nächsten Verwandten werden aufgrund ultrastruktureller und molekularphylogenetischer Erkenntnisse unter anderem die moosparasitischen Gattungen Eocronartium und Iola gezählt, sowie die mit Schildläusen assoziierten Septobasidiales (Begerow et al. 1997; Maier et al. 2003). Eine der bedeutendsten Eigenschaften der Rostpilze ist die obligat biotrophe Lebensweise dieser Gruppe, sodass sie in der Agrar- und Forstwirtschaft eine zentrale Rolle als Schädling einnehmen. Insbesondere der Erreger des Getreiderostes (Puccinia spp.) oder der Sojabohnenrost (Phakopsora pachyrhizi) sind hier neben vielen anderen Arten zu nennen (Yorinori et al. 2005; Leonard und Szabo 2005). Neben der parasitischen Lebensweise zeichnen sich die Rostpilze durch folgende drei Kennzeichen aus (Cummins & Hiratsuka 2003): 1. Eine Besonderheit ist die Ausbildung von potenziell fünf morphologisch und funktionell unterscheidbaren Sporenstadien, die eine einzelne Art im Laufe ihres vollständigen Lebenszyklus ausbilden kann (z.B. Puccinia graminis). Zahlreiche Arten besitzen jedoch einen reduzierten Lebenszyklus, sodass insgesamt drei Typen unterschieden werden können: Werden alle fünf Sporenstadien ausgebildet handelt es sich um einen makrozyklischen Lebenzyklus. Von einem demizyklischen Rostpilz spricht man, wenn keine Uredosporen mehr ausgebildet werden, wohingegen es sich um einen mikrozyklischen Pilz handelt, wenn zudem die Aecidiosporengeneration fehlt. 2. Viele Arten vollziehen einen Wirtswechsel, um ihren Lebenszyklus vollenden zu können. Hierbei dienen zumeist entfernt verwandte Pflanzen als Wirte. Rostpilze, die

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einen solchen Wirtswechsel vollziehen besitzen einen heterözischen Lebenszyklus.

Für die Gattung Ravenelia BERKELEY konnte bislang in keinem Fall ein Wirtswechsel beobachtet werden, weshalb diese Art als autözisch bezeichnet wird. 3. Das Wirtsspektrum der Rostpilze ist typischerweise sehr eng, sodass eine Art meist nur eine bis wenige Wirtsarten parasitiert. Daher sind diese recht spezifischen Wirt- Parasit-Beziehungen oftmals sehr gut geeignet, die potenziellen Rostpilzgattungen zu identifizieren (Cummins & Hiratsuka 2003).

1.2.2. Die Gattung Ravenelia BERK

Die Rostpilzgattung Ravenelia wurde erstmals von Berkeley 1853 beschrieben und ist mit etwa 200 Arten die drittgrößte Gattung innerhalb der Rostpilze. Mit Ausnahme von Europa ist diese Gattung weltweit in den Tropen und Subtropen verbreitet. Ursprünglich wurde auch Australien vom Verbreitungsgebiet ausgeschlossen, doch konnten einzelne Funde des Parasiten bestätigt werden. Die höchste Diversität erreicht Ravenelia in Nord- und Südamerika mit 116 Arten, gefolgt von Asien und Afrika (Hernandez und Hennen 2002; Cummins und Hiratsuka 2003). Für Südafrika sind bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt 24 Ravenelia-Arten beschrieben (van Reenen 1995). Nach aktuellem Wissensstand gehören alle Ravenelien zu den autözischen Rostpilzen, von denen die meisten Vertreter einen mikrozyklischen Lebenszyklus aufweisen. Einige Arten, wie beispielsweise Ravenelia evansii weisen allerdings einen Makrozyklus auf. Eine morphologische Besonderheit aller Ravenelia-Arten ist die Ausbildung mehrzelliger Teleutosporen, die zu den komplexesten Sporen innerhalb der Pilze zählen (Herandez und Hennen 2002). Diese besitzen eine köpfchenförmige Gestalt und sitzen auf einem Pedicel, der aus zwei oder vielen Hyphen gebildet wird. Typisch ist zudem die Bildung mehrer steriler Zellen, die als hygroskopische Zysten auf der Unterseite des Teleutosporenköpfchens zu finden sind. In der Seitenansicht erscheinen die Köpfe meist abgeflacht rundlich bis nierenförmig. Uneinigkeit herrscht jedoch darin, ob es sich bei den Sporenköpfen um zahlreiche zusammengesetzte einzelne Teleutosporen handelt oder um eine einzige Teleutospore, die wiederum aus zahlreichen probasidialen Zellen besteht (Dietel 1906; Hernandez und Hennen 2002). Die Teleuto- wie auch die Aecidio- und Uredosporen werden meist subepidermal

10 EINLEITUNG

angelegt und brechen bei Sporenreife aus dem Wirtsgewebe hervor (Dietel 1906; Hiremath und Pavgi 1976). Für die Taxonomie der Ravenelien spielt vor allem die große Formenvielfalt der Teleutosporen eine zentrale Rolle, weshalb eine Bestimmung auf Artniveau ohne die Teleutosporengeneration praktisch kaum möglich ist. Zur Artbestimmung werden allerdings auch Merkmale der Uredo- und Aecidiengeneration wie Ausprägung der Sporenlager oder Ornamentierung der Sporen und Anzahl und Orientierung der Keimporen herangezogen (Dietel 1906; Doidge 1950; Hernandez und Hennen 2002).

Abbildung 1: Verschiedene Teleutosporentypen von Ravenelia spp. in Seitenansicht (Bogisch 2010).

1.2.3. Der verwendete molekulare Marker

Für die Erstellung der Gen-Stammbäume für die Gattung Ravenelia sind in dieser Arbeit Sequenzen verwendet worden, die für die große und die kleine ribosomale Einheit (LSU, bzw. SSU) kodieren. Diese Gene sind im nukleären Genom lokalisiert und werden tandemartig wiederholt, weshalb sie oft in tausendfachen Kopien im Genom von Eukaryoten vorzufinden sind (Long und Dawid 1980). Auf Basis dieser Gen-Sequenzen wurden bereits in zahlreichen molekularphylogenetischen Arbeiten robuste Phylogenien für verschiedene Gruppen der Basidiomycota erstellt und werden daher in der Molekularphylogenie standardmäßig eingesetzt (Begerow et al 1997; Maier et al 2003; Maier et al 2006; Aime et al 2006).

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Abbildung 2: Ausschnitt aus dem rDNA-tandem-repeat mit den verwendeten Genregionen der kleinen und großen ribosomalen Einheit (SSU, LSU). ITS1 und ITS2: internal transcribed spacer; IGS1 und IGS2: intergenic spacer (Begerow et al 2010).

1.3. Ziele dieser Arbeit

Bis 1995 wurden für Südafrika insgesamt 20 Ravenelia-Arten beschrieben, die auf etwa 23 Leguminosae-Arten nachgewiesen werden konnten, von denen 11 Arten auf Acacia und 9 Arten auf nicht-Akazien parasitieren (van Reenen 1995). Eine neue Art, Ravenelia acaciae-nigrescentis, wurde für den Wirt Acacia nigrescens beschrieben (Ritschel et al. 2007). Während mehrerer Sammelexkursionen von 2004 bis 2010 konnten auf neun neuen Wirtspflanzen Ravenelia-Arten gesammelt werden, die zum Teil in der Arbeit von Bogisch (2010) auf ihre Gattungs- und Artzugehörigkeit untersucht wurden, wobei der Fokus der Arbeit von Bogisch auf den Akazien als Wirtspflanzen lag. In der vorliegenden Arbeit liegt deshalb der Schwerpunkt auf den Ravenelia-Arten, die die übrigen Vertreter der Leguminosae befallen, zudem werden neue Funde für die Akazienroste einbezogen. Auf diesen Grundlagen soll so einerseits die Diversität der südafrikanischen Ravenelien geklärt werden und darüber hinaus über die Erstellung von Gen-Stammbäumen ein Einblick in die Phylogenie der südafrikanischen Ravenelien gegeben werden. Die sichere Bestimmung der Wirtsidentität ist anhand der verfügbaren Herbarbelege meist sehr schwierig. Lahaye et al. (2007) konnten mit einem matK-basierten barcoding-Ansatz gute Erfolge bei der Artbestimmung eines südafrikanischen Samplings erzielen. Daher wird in dieser Arbeit getestet, ob es mit einem barcoding- Ansatz möglich ist, eine sichere Artbestimmung der südafrikanischen Akazien durchzuführen. Neben der Ravenelia-Phylogenie wird ebenfalls eine Wirtsphylogenie erstellt, um anhand dieser zu untersuchen, ob eine Korrelation beider phylogenetischer Hypothesen möglich ist.

12 MATERIAL UND METHODEN

2. Material und Methoden

2.1. verwendete Puffer und Lösungen

TBE (5x) 440mM Tris-Base pH 8,0 (SIGMA Taufkirchen, Deutschland) 440mM Borsäure (J.T. Baker)

10mM Na2-EDTA (Merck Darmstadt, Deutschland ) in H2O bidest

0,5M EDTA-Lösung pH 8,0

0,5M Na2-EDTA*2H2O in H2O bidest ansetzen, pH-Wert auf 8,0 einstellen

1x TE-Puffer pH 8,0 10mM Tris-Base (SIGMA, Taufkirchen, Deutschland)

1mM Na2-EDTA*2H2O (Merck, Darmstadt, Deutschland) in H2O ansetzen, pH-Wert auf 8,0 einstellen, 5 Minuten bei 121°C autoklavieren

Ladepuffer (6x) 50% Saccharose 0,1% Bromphenolblau

2.2. sonstige Materialien

Größenstandard 1kb Leiter (Bio-Budget Technologies GmbH, Krefeld, Deutschland) dNTP my-Budget dNTP-Set (Bio-Budget Technologies GmbH, Krefeld, Deutschland) Stahlkugeln: 3mm Stahlkugeln, Rostfrei (Werkstatt RUB, Bochum, Deutschland)

13 MATERIAL UND METHODEN

2.3. verwendete Kits my-Budget Double Pure Kit (Bio-Budget Technologies GmbH, Krefeld, Deutschland) innuPrep Plant DNA Kit (Analytic Jena AG, Jena, Deutschland) DNA Clean & Concentrator-5Kit (Zymo Research, Freiburg, Deutschland) Taq-DNA-Polymerase (PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen,

(Kit beinhaltet 10x PCR-Puffer und 20mM MgCl2) Deutschland)

2.4. verwendete Laborgeräte

Thermocycler: DNA Engine Peltier Thermal Cycler (BioRad, München, Deutschland) Geldokumentationsgerät: Vilbert Lourmat Rainbow CCTV RMB 92 (Vilbert, Marne LaVallee, Frankreich) Netzteil für Gelelektrophorese: 1.: Consort EV 243 (SIGMA, Taufkirchen, Deutschland) 2.: BioRad PowerPac Basic (BioRad, München, Deutschland) Thermodrucker: Thermomixer comfort (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Vortex: Vortex Genie 2 (Scientific Industries, Schwerte, Deutschland) Zentrifuge: Centrifuge 5424 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) Schwingmühle: Retsch MM 2000 (F. Kurt Retsch GmbH & Co. KG, Haan, Deutschland) Feinwaage: Mettler Toledo Feinwaage AB 304-S (Mettler Toledo GmbH, Gießen, Deutschland) Sequenzierer: ABI 3130 XL (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland)

14 MATERIAL UND METHODEN

2.5. Bioinformatikprogramme

Se-Al v2.0a11 (Sequence Alignment Editor v2.0a11, Department of Zoology, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, OX13PS, UK) raxmlGUI v.0.93 (Stamatakis et al. 2005; Stamatakis et al. 2008; Silvestro und Michalak 2010) PAUP* (Portable Version 4.0b10 for Unix. Swofford et al. 2002) Sequencher 4.7 (Gene Codes Corporation, 775 Technology Drive, Suite 100A Ann Arbor, Michigan 48108, USA) TextWrangler 2.3 (Bare Bones Software P.O. Box 1048 Bedford MA 01730-1048) MrBayes v3.1.2 (Huelsenbeck & Ronquist 2001; Ronquist & Huelsenbeck 2003) MAFFT v6.832b (2010/10/07, Kazutaka Katoh, http://mafftvcbrc.jp/alignment/softwate/) FigTree v1.3.1 (Andrew Rambaut, Institute of Evolutionary Biology, University of Edinburgh) Mesquite Version 2.1 (Free Software Foundation, Inc., Boston, MA, USA) Microsoft Excel 2008 für Mac v12.2.7 (2007 Microsoft Corporation)

2.6. Herkunft der Aufsammlungen

Die Aufsammlungen, die für diese Arbeit verwendet wurden stammen zum überwiegenden Teil aus dem Privatherbarium von Dr. Wolfgang Maier und wurden während mehrerer Sammelreisen in Südafrika herbariert. Einige Belege sind dagegen Duplikate des National Herbarium des US Department for Agriculture. Die unten stehende Tabelle gibt Auskunft über die genaue Herkunft der Belege.

15 MATERIAL UND METHODEN

Tabelle 1: Liste der untersuchten Herbarproben. Mit 0 gekennzeichnet sind diejenigen Belege, von denen keine Wirtspflanzen in die Analysen mit eingeflossen sind. Privatherbarium Dr. W. Maier: WM; National Herbarium USDA: BPI

16 MATERIAL UND METHODEN

17 MATERIAL UND METHODEN

2.7. Akzessionen aus GenBank

Zusätzlich zu den eigenen Wirtssequenzen wurden für die Phylogenie- und barcoding- Analysen weitere Akzessionen hinzugezogen, die aus der GenBank-Datenbank heruntergeladen wurden. Eine Auflistung dieser Akzessionen findet sich in Tabelle 2

Tabelle 2: Verrechnete GenBank-Akzessionen für die Phylogenie- und barcoding- Analysen

Sequenzen aus GenBank GenBank GenBank davon Acacia s.l. davon Nicht-Acacia Akzession Accession Acacia borleae GQ872214 Abrus precatorius AF142705 Acacia brevispica GQ872215 Albizia versicolor AF274210 Acacia burkei GQ872216 Astragalus lonchocarpus AF142736 Acacia caffra GQ872217 Bauhinia galpinii EU361875 Vachellia collinsii HM020711 Bauhinia tomentosa AY386893 Acacia davyi GQ872219 Caragana arborescens AF142737 Acacia erioloba GQ872221 Cathormium umbellatum AF274122 Acacia erubescens AF523185 Cyamopsisnsenegalensis AF142698 Acacia exuvialis GQ872223 Dalbergiella nyasae AF142706 Acacia galpinii GQ872224 Dichrostachys venosa AF521826 Acacia grandicornuta GQ872227 Dichrostachys richardiana AF521823 Acacia haematoxylon AF523189 Elephantorrhiza elephantina AF521828 Acacia hebeclada GQ872229 Faidherbia albida GQ872256 Acacia karroo AF274137 Galactia striata EU17428 Acacia kirkii GQ872231 Indigofera sphaerocarpa AY386912 Acacia kosiensis GQ872232 Indigofera suffruticosa AF142697 Acacia kraussiana GQ872233 Indigofera tinctoria HM049521 Acacia luederitzii GQ872234 Lonchocarpus lanceolatus AF142717 Acacia mellifera GQ872235 Millettia dura AF142722 Acacia nebrownii GQ872236 Mimozyganthus carinatus AY944556 Acacia nigrescens GQ872237 Philenoptera eriocalyx AF142720 Acacia nilotica AF274139 Piptadenia irwinii DQ790621 Acacia ormocarpoides GQ872239 Piptadenia leucoxylon DQ790622 Acacia polyacantha GQ872241 Piptadenia macradenia DQ790623 Acacia rehmanniana GQ872243 Piptadenia viridiflora EU812020 Acacia robbertsei GQ872244 Pongamiopsis amygdalina AF142711 Acacia robusta GQ872245 Prosopis elata AY944561 Acacia schweinfurthii GQ872246 Prosopis glandulosa AY386851 Acacia sekhukhhuniense GQ872247 Prosopis nigra AY944562 Acacia senegal GQ872248 Prosopis rojasiana AY944563 Acacia senegal GQ872249 Senna alata EU362042 Acacia sieberiana GQ872250 Senna italica AM086872 Acacia stuhlmannii GQ872251 Swainsona pterostylis AF142735 Acacia tortilis AF274140 Tephrosia heckmanniana AF142712 Acacia tortilis GQ872253 Xerocladia viridiramis EU000438 Acacia welwitschii GQ872254 Xeroderris stuhlmannii AF142708 Acacia xanthophloea GQ872255 Zapoteca tetragona AF523097

18 MATERIAL UND METHODEN

2.8. Molekularbiologische Methoden

2.8.1. DNA-Isolationen

Von den unter 2.6 aufgelisteten Herbarbelegen wurden jeweils DNA-Isolationen der Wirtspflanzen sowie der Pilz hergestellt. Für die Gewinnung pflanzlicher DNA wurden etwa 1-1,5cm2 möglichst gut erhaltener Blattmasse den Herbarbelegen entnommen und in ein steriles 2ml Eppendorf-Gefäß gegeben. Um einen mechanischen Aufschluss der Proben zu ermöglichen, wurden den Proben je zwei bis drei rostfreie Stahlkugel beigegeben und so in einer Retsch Schwingmühle für mindestens 2x 2 Minuten bei 30Hz geschlagen, bis sich ein feines Pulver gebildet hat. Aus den so vorbereiteten Proben wurde die DNA mittels dem DNeasy Mini Plant Kit (Qiagen) oder dem innuPrep Plant DNA Kit (Analytic Jena) nach Protokoll isoliert. Die Gewinnung der pilzlichen DNA erfolgte auf ähnliche Weise, allerdings mit leichten Abwandlungen, um dem Umstand Rechnung zu tragen, dass es sich um teils sehr wenig Ausgangsmaterial mit darüber hinaus äußerst hoher mechanischer Widerstandsfähigkeit handelt. Von den Sporenlagern der Rostpilze wurde versucht eine möglichst große Sporenmenge in ein 2ml Eppendorfgefäß zu übertragen in welches ebenfalls zwei bis drei Stahlkugeln und zusätzlich eine kleine Menge (50μl) Lyse-Puffer des DNeasy Mini Plant Kit (Qiagen) gegeben wurden. Die Gefäße wurden anzentrifugiert, um die Sporen in Emulsion zu bringen und über Nacht gelagert. Zweck dieser Vorbehandlung war, die äußerst feste Hülle der Teleutosporen ein wenig aufzuweichen. Im Anschluss wurden die Proben kurz in flüssigem Stickstoff eingefroren und für 2 Minuten in die Schwingmühle gegeben; dieser Vorgang wurde 2x wiederholt. Die eigentliche DNA-Isolation erfolgte mit dem DNeasy Mini Plant Kit (Qiagen) nach Herstellerprotokoll.

Die DNA-Isolationen der Rostpilzgattung Ravenelia sind überwiegend durch Sonja Bogisch (Ruhr-Universität Bochum) im Rahmen ihrer Diplom-Arbeit durchgeführt worden (Bogisch 2010). Ausnahmen betreffen die Isolationen von WM 3589, WM3588, WM 3592, WM 3509, WM 3591, WM3552, WM3310, WM3585 und WM3292.

19 MATERIAL UND METHODEN

2.8.2. Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Die PCR (polymerase-chain-reaction) ist eine einfache und sehr effektive Technik, die Zielsequenz der Ausgangs-DNA in einer sehr hohen Kopienzahl zu synthetisieren. Hierbei muss der Reaktionansatz die vier Nukleotidbasen dATP, dTTP, dCTP und dGTP sowie eine thermostabile DNA-Polymerase, die Primer und template DNA enthalten. Die Vervielfältigung der DNA erfolgt dabei in drei, sich wiederholenden Schritten, der Denaturierung (Auftrennung des DNA-Doppelstrangs), dem Annealing (Anbinden der Primer an die komplementäre Sequenz) und der Elongation (Neusynthese des DNA-Strangs durch anbinden freier Nukleotide mit Hilfe der Polymerase).

Die für die PCR verwendeten Primer sind in der unten stehenden Tabelle getrennt nach Wirtspflanzen - Ravenelia aufgelistet. Bei den matK/trnK-Primern handelt es sich mit Ausnahme des Primers trnK3914F um Akazienspezifische Primer, der Erstere wurde ursprünglich für Saxifragaceaen entwickelt (Johnson & Soltis 1994 zitiert nach Miller und Bayer 2001). Die Primer für die SSU- und LSU-Region sind spezifisch für Basidiomyceten und werden standardmäßig für diese Regionen verwendet.

Tabelle 3: In dieser Arbeit verwendete Primer. verwendete Primer Wirtspflanzen Region Name Sequenz Orientierung Tm(°C) Referenz trnK3914F GGG GTT GCT AAC TCA ACG G forward 64,4 Johnson & Soltis (1994)* Ac283R CAC TGA CGG CAA GCC CCT CTG reverse 73,4 Miller & Bayer (2001) Ac12F GGT GCA (A/C)AA TCT AGG TTA TGA C forward 56,7 Miller & Bayer (2001) Ac1290R AAT ACA GAA AGC CGA AG reverse 54,4 Miller & Bayer (2001) Ac1104F CCT CTA ATT AGA TCA TTG GC forward 55,4 Miller & Bayer (2001)

matK/trnK Ac1707R TGC ACA CGC CTT TCC CTA TG reverse 68,2 Miller & Bayer (2001) Ravenelia NS1 GTA GTC ATA TGC TTT GTC TC forward 48,8 White et al. (1990)**

SSU NS3 GCA AGT CTG GTG CCA GCA GCC forward 73,6 White et al. (1990)** LR0R ACC CGC TGA ACT TAA GC forward 57,9 Moncalve et al. (1995)** LR6 CGC CAG TTC TGC TTA CC reverse 59,5 Vilgalys & Hester (1990)**

LSU LR7 TAC TAAC CAC CAA GAT CT reverse 46,2 Vilgalys & Hester (1990)** * zitiert nach Miller und Bayer 2001; ** zitiert nach www.lutzonilab.net

20 MATERIAL UND METHODEN

Es wurden zwei verschiedene Polymerasen verwendet, für die jeweils verschiedene Reaktionsansätze von Nöten waren. Ein Reaktionsansatz beinhaltete dabei 25μl.

Der Standard taq-Polymerase-Reaktionsansatz enthielt:

Puffer Y (10x mit 20mM MgCl2) 2,5µl Enhancer P 5µl dNTPs (10mM) 0,5µl Primer (10pmol/µl) 0,5µl Primer (10pmol/µl) 0,5µl Taq-Polymerase (5U/µl) 0,1µl DNA 0,5µl ddH2O auf 25µl aliquotieren

Das verwendete PCR-Programm für die Primerkombination trnK3914F/Ac283R des Standard-Ansatzes ist nachfolgend dargestellt.

1. Schritt 96°C 2.00 Min 2. Schritt 95°C 0.20 Min 3. Schritt 48°C 0.45 Min 4. Schritt 72°C 1.00 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 4x 6. Schritt 95°C 0.20 Min 7. Schritt 55°C 0.40 Min 8. Schritt Temperaturerniedrigung um 1°C pro Zyklus 9. Schritt 72°C 1.00 Min 10. Schritt gehe nach Schritt 6 9x 11. Schritt 95°C 0.20 Min 12. Schritt 50°C 0.45 Min 13. Schritt 72°C 1.00 Min 14. Schritt gehe nach Schritt 11 16x 15. Schritt 72°C 7.00 Min 16. Schritt 10°C ∞

21 MATERIAL UND METHODEN

Der PHUSION-Polymerase-Ansatz enthielt:

Puffer H (5x mit MgCl2) 5,0µl dNTPs (10mM) 0,5µl DMSO 0,75µl Primer (10pmol/µl) 0,5µl Primer (10pmol/µl) 0,5µl PHUSION-Polymerase (5U/µl) 0,25µl DNA 0,5µl ddH2O auf 25µl aliquotieren

Das PCR-Programm für die Primerkombination trnK3914F/Ac1290R des PHUSION- Polymerase-Ansatzes umfasste folgende Schritte:

1. Schritt 98°C 0.30 Min 2. Schritt 98°C 0.10 Min 3. Schritt 54°C 0.20 Min 4. Schritt 72°C 0.45 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 34x 6. Schritt 72°C 5.00 Min 7. Schritt 10°C ∞

Alle weiteren verwendeten PCR-Programme für sind im Anhang unter Tabelle A dargestellt.

2.8.3. Gelelektrophorese

Die Gelelektrophorese dient zur Überprüfung der PCR. Hierbei macht man sich die Eigenschaft geladener Moleküle zu nutzen, sich entlang eines elektrischen Feldes zu bewegen. Die Moleküle wandern dabei in Abhängigkeit von ihrer Größe und Ladung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten von der Kathode zur Anode. Durch Parallellauf eines Größenstandards kann so im Anschluss die Größe der PCR-Produkte ermittelt werden und somit eine Kontrolle erfolgen. Die standardmäßig verwendeten Gele besaßen eine Agarosekonzentration von 0,8% und wurden mit 1xTBE-Puffer hergestellt. Ein typisches Gel wurde aus 40ml 22 MATERIAL UND METHODEN aufgekochter Agarose gegossen in welches nach leichtem Abkühlen 2µl Ethidiumbromid gegeben wurden. Ethidiumbromid besitzt die Eigenschaft, sich zwischen die Nukleotide zu binden und unter UV-Bestrahlung sichtbares Licht zu emittieren. Daher lässt es sich als spezifischer Farbstoff zum Anfärben von DNA verwenden. Nachdem das Agarosegel in eine mit 1xTBE-Puffer befüllte Kammer gegeben wurde, sind jeweils 5µl eines PCR-Ansatzes mit 2µl Laufpuffer versetzt und in ausgesparte Taschen des Gels pipettiert worden. Die angelegte Spannung betrug zwischen 120V und 140V, wobei die Laufzeit auf 25 bis 30 Minuten eingestellt wurde. Im Anschluss wurden die Gele im Geldokumentationsgerät unter UV-Licht fotografisch dokumentiert.

2.8.4. Aufreinigung der PCR-Produkte

Erfolgreich amplifizierte DNA-Sequenzen sind für die weitere Verwendung aufgereinigt worden. Neben den gewünschten DNA-Amplifikaten enthalten die PCR- Reaktionsansätze noch weitere Substanzen, die die anschließende Seuqnzierungsreaktion beeinträchtigen können. Hierzu gehören die Salze der Puffer und Enzym- und Nukleotidreste. Zur Aufreinigung ist das my-Budget Double Pure Kit (Bio-Budget), sowie das DNA Clean & Concentrator-5Kit (Zymo Research) verwendet worden. Durchgeführt wurde die Aufreinigung nach Vorgaben des Herstellerprotokolls.

2.8.5. Sequenzierung der PCR-Amplifikate

Die Sequenzierung der Proben erfolgte nach dem Prinzip der Sanger-Sequenzierung und ist durch den Lehrstuhl der Biochemie an der Ruhr-Universität Bochum durchgeführt worden. Hierzu wurden kleine Probenmengen der Amplifikate (5µl) getrennt von den zugehörigen Primern (4pmol/µl) verwendet.

23 MATERIAL UND METHODEN

2.9. Bioinformatorische Methoden

2.9.1. Das Alignment

Das Programm Sequencher 4.7 (Genes Codes Corporation) bietet die Möglichkeit, die Ergebnisse der Sequenzierung zu überprüfen und gegebenfalls manuell zu korrigieren. Dieses Sequenzeditierungsprogramm stellt die bei der Sequenzierungsreaktion ermittelten Ferogramme graphisch der Nukleotidsequenz gegenüber, sodass Anhand dieser Grundlage Fehler erkannt und behoben werden können. Hierzu lassen sich Strang und Gegenstrang an den überlappenden und komplementären Bereichen zu einem Contig zusammenfassen. Die editierten Sequenzen wurden zur weiteren Analyse als fasta-Datei exportiert.

Ein zentraler Arbeitsschritt bei jeder phylogenetischen Rekonstruktion ist das Erstellen des sogenannten Alignments. Hierzu wird mit dem Programm Se-Al v2.0a11 (Department of Zoology, University of Oxford) eine Sequenzmatrix erstellt in der alle Sequenzen untereinander geschrieben werden, um so die homologen Positionen miteinander vergleichen zu können. Das eigentliche Alignment wurde mit dem Programm MAFFT v.6.832b (Katoh et al. 2002) generiert. Da DNA-Sequenzen nicht nur durch Nukleotidsubstitutionen, sondern auch durch Nukleotid-Insertion und Nukleotid-Deletion (Indel) evolvieren, werden mit Hilfe des Programms gaps in die entsprechenden Positionen eingefügt, damit die Sequenzen untereinander wieder die gleiche Länge besitzen. Der Erstellung des Alignments sollte große Sorgfalt zuteil werden, da jede phylogenetische Rekonstruktion nur so gut sein kann, wie das entsprechende Alignment. Überprüft wurden die Alignments mit Hilfe des Sequenzeditorprogramms Se-Al v2.0a11 (Department of Zoology, University of Oxford). Dieses Programm ermöglicht ein manuelles nacheditieren des Alignments, sodass stark variable und daher nur unzureichend homologisierbare Positionen entfernt werden können. Ebenso werden einzelne Sequenzüberhänge entfernt.

Für die phylogenetische Rekonstruktion der Rostpilzgattung Ravenelia wurde überwiegend auf den LSU-SSU-Sequenzdatensatz zurückgegriffen, den Bogisch (2010) im Rahmen ihrer Diplom-Arbeit erstellt hat. Vervollständigt wurde der

24 MATERIAL UND METHODEN

Datensatz von mir durch die Akzessionen von WM3552, WM3589, WM3592, WM3509, WM3292, WM3591 und WM3310, WM3585 und WM3588.

2.9.2. Phylogenetische Rekonstruktionsmethoden

Maximum-Likelihood-Analyse Bei dieser Methode zur Berechnung von phylogenetischen Bäumen handelt es sich um ein parametrisches Schätzverfahren, bei dem nach dem Likelihood gesucht wird der für eine gegebene Datenlage maximal ist. In dieser Anwendung bedeutet dies, dass nach dem Baum gesucht wird, für den die gegebene Datenlage am wahrscheinlichsten ist. Hierzu muss die Likelihoodfunktion maximal sein. Da Nukleotidsequenzen je nach Zusammensetzung unterschiedlich evolvieren, muss durch die Verwendung von Substitutionsmodellen die Wahrscheinlichkeit ermittelt werden, ob eine gegebene Verzweigung im Stammbaum zutrifft (Felsenstein 1981).

Für die Durchführung der ML-Analyse wurde das Programm raxmlGUI v. 0.93 (Stamatakis et al. 2005; Stamatakis et al. 2008; Silvestro und Michalak 2010) unter Einbeziehung des Substitutionsmodells GTRGAMMA verwendet.

Bayessche Statistik Die Bayessche Analyse wurde mit dem Programm MrBayes v3.1.2 (Huelsenbeck & Ronquist 2001; Ronquist & Huelsenbeck 2003) durchgeführt. Das verwendete Substitutionsmodell war GTR+G+I. Befehle: lset nst=6 rates=invgamma mcmc ngen=2000000 samplefreq=100 sump sumt burnin=5000

25 MATERIAL UND METHODEN

2.9.3. Erstellung der Distanzmatrix

Aus dem matK/trnK-Sequenz-Alignment ist für die Akazien eine K2P-Distanzmatrix mit dem Programm Mesquite Version 2.1 (Free Software Foundation, Inc., Boston, MA, USA) erstellt worden. Der Kimura-2-Parameter (Kimura 1980) berücksichtigt dabei die unterschiedlichen Wahrscheinlichkeiten für das Auftreten von Transitionen und Transversionen, weshalb man so die korrigierten genetischen Distanzen erhält.

26 ERGEBNISSE

3. Ergebnisse

3.1. Leguminosae

3.1.1. DNA-Isolation-, PCR- und Sequenzierergebnisse

Es wurde von insgesamt 69 Aufsammlungen DNA isoliert. Davon konnten für 66 Proben Fragmente der matK/trnK-Region erfolgreich amplifiziert werden, wobei allerdings nur in 3 Fällen die gesamte matK/trnK-Region erhalten wurde. Die besten Resultate konnten mit den Primerkombinationen trnK3914F/Ac283R (51 Amplifikate) und Ac12F/Ac1290R (66 Amplifikate) erreicht werden, von denen 36 bzw. 46 Amplifikate auf die Akazien und 15 bzw. 20 Amplifikate auf die Nicht-Akazien entfallen. Für einige Isolationen war es sehr schwierig eine ausreichende Menge an PCR-Produkten zu erhalten. Die größten Schwierigkeiten traten bei der Gattung Abrus

ADANS. auf, für die jeweils nur Fragmente für die Primerkombination Ac12F/Ac1290R amplifiziert werden konnten. Deshalb konnten für diese Gattung nur zwei von sieben Aufsammlungen erfolgreich sequenziert werden. Für den Großteil der übrigen Proben konnten die PCR-Produkte erfolgreich sequenziert werden, allerdings war in vielen Fällen die Sequenzqualität nicht optimal, sodass sorgfältiges Editieren von Strang und Gegenstrang notwendig war, um Sequenzen in ausreichender Qualität und Überlappung zu erhalten.

Die unten abgebildete Tabelle 4 gibt Aufschluss über die in die Untersuchungen eingeflossenen matK/trnK-Sequenzen der jeweiligen Wirtstaxa, sowie über die versuchte Artabgrenzung mittels barcoding. Insgesamt konnten 9 von 23 Akazienarten sicher einer Art zugeschrieben werden, was etwa 39% entspricht. Aufgrund der wenigen Aufsammlungen pro Art für die Nicht-Akazien ist hier auf eine Bemessung des barcoding-Erfolgs verzichtet worden. Ebenfalls dargestellt sind die Arten, für die bei GenBank bislang keine matK/trnK-Referenzsequenz hinterlegt waren (insgesamt für 12 Arten. Gelb hinterlegt).

27 ERGEBNISSE

Tabelle 4: Auflistung der untersuchten Wirtstaxa mit den entsprechenden matK/trnK- Amplifikaten. Rot hervorgehoben sind diejenigen Proben, die von den anschließenden Analysen ausgeschlossen wurden. Gelb hinterlegt sind die Akzessionen, von denen es bislang keine GenBank-Sequenzen gibt. WM: Herbarium Wolfgang Maier, BPI: U.S. National Fungus Collections. trnK3914F, Ac12F, Ac1290R: nur ein Strang des entsprechenden Primers wurde sequenziert.

Herbar- Wirtspflanze Nr. Primerkombination GenBank barcode trnK3914F/Ac283R Ac12F/Ac1290R Sequenz Erfolg amplifizie Akazien rt sequenziert amplifiziert sequenziert Acacia ataxacantha WM3434 ja ja ja ja ja ja Acacia ataxacantha WM3424 ja ja ja ja Acacia burkei WM3405 ja nein ja ja Acacia burkei WM3557 ja ja ja Ac12F ja nein Acacia burkei WM3544 ja ja ja ja Acacia caffra WM3552 ja ja ja ja ja ja Acacia caffra WM3592 ja ja ja ja Acacia collinsii (Costa ja Rica) 2003-177 ja ja ja ja ja Acacia davyi WM3429 ja ja ja ja ja ja Acacia erubescens WM3555 ja ja ja ja Acacia erubescens WM3563 ja ja ja ja Acacia erubescens WM3545 ja ja ja ja ja nein Acacia erubescens WM3554 ja ja ja ja Acacia erubescens WM3545 ja ja ja nein Acacia goetzei WM3416 ja ja ja ja nein n.m. Acacia gerardii WM3425 nein nein ja nein nein nein Acacia gerardii WM3440 ja ja ja ja Acacia grandicornuta WM3418 ja ja ja ja ja ja Acacia hebeclada WM3538 nein nein ja ja ja ja Acacia karroo WM3402 nein nein ja ja Acacia karroo WM3550 nein nein ja ja Acacia karroo WM3421 nein nein ja ja Acacia karroo WM3558 nein nein nein nein ja nein Acacia cf. karroo WM3448 nein nein ja ja Acacia cf. karroo WM3578 nein nein ja Ac12F Acacia cf. karroo WM3283 nein nein nein nein Acacia luederitzii WM3317 ja ja ja ja ja nein Acacia leuderizii WM3303 ja ja ja ja Acacia mapoch WM3308 ja ja ja ja nein n.m. Acacia mellifera WM3548 ja ja ja ja ja ja Acacia mellifera WM3513 ja ja ja ja Acacia natalitia WM3423 ja trnK3914F ja ja nein nein Acacia natalitia WM3292 ja nein ja ja Acacia nigrescens WM3589 ja ja ja ja ja nein Acacia nigrescens WM3282 nein nein nein nein Acacia praecox BPI841185 ja ja ja ja nein n.m. Acacia robusta WM3547 ja ja ja Ac12F ja nein Acacia robusta ssp. clav. WM3585 ja ja ja Ac1290R

28 Acacia robusta ssp. robusta WM3588 ja ja ja ja Acacia rubrodermis WM3310 ja ja ja ja nein nein Acacia rubrodermis WM3433 ja nein ja ja

Acacia sekhukhuniense WM3311 ja ja ja ja ja nein Acacia sekhukhuniense WM3304 ja ja ja ja Acacia senegalia WM3432 ja ja ja ja ja ja Acacia sieberiana WM3591 nein nein ja ja Acacia sieberiana var. woodii WM3428 nein nein ja ja ja ja Acacia sieberiana var. woodii WM3477 nein nein ja ja Acacia stefaniana WM3309 ja ja ja ja nein nein Acacia stefaniana WMWM ja ja ja ja

Nicht-Akazien Abrus Abrus 18.4.09 ja nein ja Ac12F Abrus cf. precatorius WM3602 nein nein ja ja Abrus cf. leavis WM3412 ja trnK3914F ja Ac1290R Abrus cf. leavis WM3401 nein nein ja ja Abrus laevigata WM3426 nein nein ja ja ja Abrus laevigata WM3426 nein nein ja ja Abrus spec. WM3456 nein nein ja ja Albizia adianthifolia WM3345 ja ja ja ja nein Albizia adianthifolia WM3600 ja ja ja ja Bauhinia tomentosa WM3597 ja ja ja ja ja Caliandra formosa (Argentina) BPI841034 ja ja ja ja nein Calpurnia aurea WM3475 ja ja ja ja ja Dalbergia armata WM3598 ja ja ja ja nein Dichrostachys cinerea WM3435 ja ja ja ja nein Elephantorrhiza burkei WM3601 ja ja ja ja nein Indigofera cf. confusa WM3595 ja ja ja ja Indigofera spec. WM3596 ja ja ja ja Indigofera spec. WM3452 ja ja ja ja Prosopis spec. WM3479 ja ja ja ja Senna cf. italica WM3509 ja ja ja ja ja

Aus den erhobenen Sequenzdaten wurden zwei getrennte Alignments erstellt. Das erste umfasst die Gruppe der südafrikanischen Akazien und besteht aus 44 von mir sequenzierten Proben (23 Arten) und 37 Accessionen (35 Arten) aus Genbank. Somit wird annähernd das gesamte Spektrum der südafrikanischen Akazien abgedeckt. Das Alignment besitzt eine Gesamtlänge von 2027 Nukleotidpositionen und beinhaltet 80 Sequenzen, die 43 Arten repräsentieren. Das zweite Alignment umfasst ein breiteres systematisches Spektrum. In dieses sind neben den, von mir sequenzierten Nicht- Akazien-Leguminosen, eine Auswahl an weiteren Sequenzen aus GenBank eingeflossen. Dieses Alignment weist 2759 Nukleotidpositionen auf und beinhaltet 51 Sequenzen von 46 Arten. Aus diesen Alignments sind mit Hilfe einer Maximum Likelihood Methode (Stamatakis et al. 2005; Silvestro und Michalak 2010) und der

29 ERGEBNISSE

Bayesschen Statistik (Huelsenbeck et al. 2001) jeweils zwei phylogenetische Bäume berechnet worden, die im Folgenden kurz vorgestellt werden sollen.

3.1.2. Topologie der matK/trnK-Genstammbäume für die untersuchten Akazienarten

3.1.2.1. ML-Analyse

Die Analysemethode nach dem Maximum-Likelihood Verfahren liefert mit einem Bootstrapsupport von 100 (bt=100) zwei sehr gut unterstützte Gruppen, denen die Gattungen Vachellia (= Untergattung Acacia) und Senegalia (= Untergattung Aculeiferum) entsprechen (Abb. 3). Sehr hohe Bootstrapwerte weisen innerhalb des Vachellia-Cluster die südamerikanischen Acacia collinsii bzw. Vachellia collinsii auf, die hier den zuerst abzweigenden Ast bilden. Auch die als nächstes abzweigende Gruppe, bestehend aus den Arten Acacia haematoxylon und Acacia erioloba wird gut unterstützt (bt=99). Eine große Gruppe wird aus den übrigen südafrikanischen Vachellia-Arten gebildet (bt=91) und scheint ihrerseits tendenziell in zwei Untergruppen unterteilt zu sein. Die Untergruppierung dieses Astes wird bis auf wenige Ausnahmen kaum unterstützt, hierzu gehören beispielsweise Acacia davyi mit einem bootstrap von 90%, sowie Acacia grandicornuta und Acacia sieberiana mit 72% bzw. 88% Unterstützung. Die übrigen Taxa dieser Gruppe bilden allerdings meist nicht unterstützte Gruppen geringer genetischer Distanzen. Innerhalb der gut unterstützten "Senegalia-Gruppe" werden mehr Arten recht klar aufgelöst. So bilden die Arten Acacia senegal, Acacia mellifera, Acacia ataxacantha und Acacia caffra je vier gut unterstützte Artcluster, wohingegen sich die Akzessionen der Acacia erubescens nicht monophyletisch gruppieren lassen (Abb. 3)

30 ERGEBNISSE

Abbildung 3: Stammbaum der südafrikanischen Akazien auf Basis von matK/trnK-Sequenzen nach dem Maximum Likelihood-Verfahren. Es sind nur bootstrap-Werte über 70% im Stammbaum verzeichnet. Die römischen Ziffern kodieren folgende morphologische Kriterien: I = paarige, gerade Dornen, lokalisiert an Nodien; II = paarige, gerade und zurückgebogene Dornen, lokalisiert an Nodien; III = paarige, zurückgebogene Dornen, lokalisiert an Nodien; IV = zurückgebogene Dornen, unregelmäßig angeordnet an Internodien; V = zurückgebogene Dornen, zu Dritt an Nodien

31 ERGEBNISSE

3.1.2.2. Analyse nach Bayesscher Statistik

Der nach Bayesscher Statistik errechnete Baum weist in seinen Grundzügen dieselbe Topologie auf, wie der ML-Baum, besitzt für einige Gruppen allerdings etwas höhere Unterstützungswerte. Die Trennung der beiden Gattungen Vachellia und Senegalia ist auch hier mit einer posterior probability (pp) von 1.0 gut abgesichert. Innerhalb der Vachellia-Gruppe zeigen sich als erste Abzweigungen zwei gut abgesicherte Äste (pp=1.0), die auch durch die südamerikanischen Acacia bzw. Vachellia collinsii und als nächste Abzweigung durch Acacia erioloba und Acacia haematoxylon gebildet werden. Die letztgenannte Gruppe steht hier wieder als Schwester zu der dritten Gruppe. Wie auch in dem ML-Baum sind die Untergruppen nicht unterstützt und bestehen in großen Teilen aus Polytomien (Abb. 4). Eine Ausnahme bilden die Monophyla, die als sichere Artzuweisungen der Tabelle 4 zu entnehmen sind. Die Gruppe der Senegalia weist in ihrer basalen Topologie dieselbe sichere Unterteilung in zwei Artengruppen auf, wie dies der ML-Baum auch aufzeigt und auch durch andere phylogenetische Arbeiten bestätigt wird (siehe z.B. Miller und Bayer 2003; Bouchenak-Khelladi et al. 2010). Das kleinere Cluster wird hierbei durch die Arten Acacia praecox, Acacia kraussiana, Acacia schweinfurthii und Acacia brevispica gebildet. Die größere Gruppe enthält neben einigen Polytomien fünf gut unterstützte Monophyla von denen vier eine sichere Artzuweisungen erlauben. Das übrige Monophylum wird von den Arten Acacia burkei, Ac. nigrescens, Ac. welwitschii, Ac. goetzei und Ac. galpinii gebildet. Auch dieses entspricht der Topologie des ML-Baumes.

32 ERGEBNISSE

Abbildung 4: Stammbaum der südafrikanischen Akazien auf Basis von matK/trnK-Sequenzen nach Bayesscher Statistik. Es sind nur Unterstützungswerte über 0.95 im Stammbaum verzeichnet. Die römischen Ziffern kodieren folgende morphologische Kriterien: I = paarige, gerade Dornen, lokalisiert an Nodien; II = paarige, gerade und zurückgebogene Dornen, lokalisiert an Nodien; III = paarige, zurückgebogene Dornen, lokalisiert an Nodien; IV = zurückgebogene Dornen, unregelmäßig angeordnet an Internodien; V = zurückgebogene Dornen, zu Dritt an Nodien

33 ERGEBNISSE

3.1.3. Topologie des ML-Stammbaumes für die Nicht-Akaziendaten

In das Alignment für die Analyse der Nicht-Akazien sind Akzessionen aller drei Leguminosenunterfamilien eingeflossen, was sich in der Topologie widerspiegelt. Demnach sind prinzipiell drei Großgruppen unterscheidbar, welche den Mimosoideae, Faboideae und den Caesalpinioideae entsprechen (siehe Abbildung 5). Die Mimosoideae bilden eine gut abgesicherte monophyletische Gruppe in der die Gattung Elephantorrhiza den Ast bildet. Die Isolate von Dichrostachys cinerea bilden zwar ein sehr gut abgesichertes Monophylum (bt=100%), fallen allerdings deutlich entfernt von den übrigen beiden Dichrostachys-Akzessionen aus GenBank. Die große Schwestergruppe zu Dichrostachys cinerea wird bei dieser Analysemethode nicht unterstützt, einige Untergruppen sind allerdings gut abgesichert. So gruppiert sich die Aufsammlung von Prosopis in das gut unterstützte Cluster der weiteren Prosopis- Akzessionen. Die beiden Aufsammlungen der Albizia adianthifolia fallen mit einem bootstrap von 100 zueinander, weisen allerdings zu der Schwesterart Albizia versicolor keine signifikante Unterstützung auf. Innerhalb der Faboideae bildet eine Indigofera-Aufsammlung (WM3452) die erste Verzweigung und steht so in einiger Distanz zu der den restlichen Faboideae. Eine zweite Indigofera-Akzession (WM3596) fällt in ein Cluster, welches von den morphologisch recht ähnlichen Astragalus lonchocarpus und Swainsona pterostylis gebildet wird, deren Sequenzen von GenBank stammen. Einzig die Isolation von Indigofera cf. confusa WM3595 gruppiert sich zwischen weitere Vertreter dieser Gattung. Als Schwestergattung zeigt sich hier Cyamopsis senegalensis, was in Übereinstimmung mit Schrire et al. (2009) zu sehen ist. Eine weitere sehr gut unterstützte Gruppe bilden die Arten der Gattung Abrus, innerhalb derer sich die Aufsammlungen ohne erkennbare Distanzen als Schwester zu Abrus precatorius stellen und somit hier die basalste Stellung im Tribus der Milletieae einnehmen. Die Unterfamilie der Caesalpinioideae ist in dieser Arbeit nur durch zwei Gattungen vertreten. Die Gattung Senna stellt sich hier basal zu den Mimosoideae, was mit einem bootstrap von 88 nur mäßig gestützt wird, allerdings durch die Arbeit von Wojciechowski et al. (2004) bekräftigt werden kann. Hier gruppiert sich die Senna cf. italica-Aufsammlung zu den beiden übrigen Senna-Akzessionen, mit deutlicher Distanz in einem Schwesternverhältnis. Weit von dieser Gruppe der Caesalpinioideae

34 ERGEBNISSE entfernt bilden die Vertreter der Gattung Bauhinia ein eigenes gut unterstütztes Cluster, die sich in basaler Position zu allen bisher angesprochenen Unterfamilien befindet. Innerhalb dieser Gruppe fallen beide Bauhinia tomentosa Sequenzen ohne erkennbare Distanz zueinander, wobei die Abgrenzung dieser Art zu Bauhinia galpinii sehr gut abgesichert ist (bt=100).

35 ERGEBNISSE

Abbildung 5: Stammbaum der Nicht-Akazien Wirtspflanzen auf Basis matK/trnK-Sequenzen, berechnet nach dem Maximum-Likelihood Verfahren. Es sind nur bootstrap-Werte über 70 im Stammbaum verzeichnet.

36 ERGEBNISSE

3.1.4. Topologie des Bayes-Stammbaumes für die Nicht-Akaziendaten

Innerhalb des Stammbaumes nach der Bayesschen Statistik lässt sich dieselbe Topologie erkennen, wie schon nach der ML-Analyse, einzig die Unterstützungswerte sind für einige Gruppen etwas höher. Die statistische Unterstützung für die Schwestergruppe von Dichrostachys cinerea erreicht mit einem Wert von 0,92 allerdings auch nach dieser Rechenmethode keine hinreichende Signifikanz, die Prosopis-Gruppe ist aber wieder sehr gut abgesichert. Eine Polytomie findet sich nun für Albizia versicolor und Cathormium umbellatum basal zu dem Albizia adianthifolium-Monophylum. Diese Polytomie zeigte sich schon in der ML-Analyse. Die höchsten Unterstützungswerte finden sich auch in diesem Baum innerhalb der Faboideae wieder. So gruppieren auch hier die drei verschiedenen Aufsammlungen der Indigofera in jeweils drei verschiedenen sehr gut unterstützten Clustern, wohingegen allerdings das Monophylum aus den beiden Abrus-Isolationen mit einem Wert von 0,91 nicht mehr gut gestützt der Schwesternart Abrus precatorius gegenübergestellt werden kann (siehe Abb. 6). Die prinzipielle Trennung der Unterfamilie der Caesalpinioideae in zwei entfernte Gruppen wird auch in diesem Stammbaum durch sehr gute statistische Absicherung gestützt.

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ERGEBNISSE

Abbildung 6: Stammbaum der Nicht-Akazien-Wirtspflanzen auf Basis von matK/trnK-Sequenzdaten, berechnet nach Bayesscher Statistik. Es sind nur Unterstützungswerte über 0.95 im Stammbaum verzeichnet.

38 ERGEBNISSE

3.1.5 K2P-Distanzmatrix der matK/trnK-Sequenzdaten der südafrikanischen Akazien

Aufgrund der Vielzahl an Distanzdaten, sollen nur Beispiele vorgestellt werden. Die vollständige Distanzmatrix befindet sich im Anhang unter Tabelle B. In der unten abgebildeten Tabelle 5 sind die paarweisen Distanzen acht verschiedener Taxa gezeigt. Die rot hinterlegten Werte entsprechen den innerartlichen genetischen K2P-Distanzen von Acacia karroo. Diese sind für die ersten vier Aufsammlungen gleich Null. Lediglich die GenBank-Akzession AF274137 besitzt gegenüber den restlichen Vertretern dieser Art eine geringe Distanz von 0,02 (entsprechen 2%). Die beiden Akzessionen von Acacia rubrodermis zeigen beim Vergleich mit den angesprochenen Distanzen für Acacia karroo deutliche Unterschiede. Während die Sequenz von A. rubrodermis WM3310 hier Distanzen von 3,8% bzw. 2,2% aufweist, zeigt die zweite A. rubrodermis-Sequenz nur zu der A. karroo-Akzession aus GenBank eine Distanz von 2,0% auf. Zu allen anderen A. karroo-Aufsammlungen konnte keine Distanz ermittelt werden. Dies zeigt sich auch in ähnlicher Weise in der Topologie der Stammbäume: Hier gruppiert die A. rubrodermis-Probe (WM3433), die keine Sequenzunterschiede zu Acacia karroo aufweist, entsprechend zusammen mit diesen. Die andere A. rubrodermis (WM3310), mit deutlicheren genetischen Distanzen, fällt dagegen in eine entferntere Gruppe. Ein Vergleich zwischen Acacia ataxacantha (Senegalia-Gruppe) mit Taxa aus der Vachellia-Gruppe zeigen noch größere Distanzen. So wurde für die beiden verechneten A. ataxacantha-Sequenzen ein Wert von 0,2% ermittelt, zwischen diesen Großgruppen jedoch Distanzwerte von 4,5% (z.B. A. ataxacantha WM3424 mit A. stefaniana WM3431) bis 6,3% (zwischen A. ataxacantha WM3434 und A. rubrodermis WM3310). Aus den Sequenzdaten der Nicht-Akazien wurde keine Distanzmatrix berechnet. In diesem Fall standen nur wenige Akzessionen pro Art zur Verfügung, weshalb hier keine Bemessung des barcoding-Erfolgs durchgeführt werden konnte.

39 ERGEBNISSE

Tabelle 5: Auszug aus der Distanzmatrix für den matK/trnK-Datensatz der südafrikanischen Akazien. Farblich markiert sind die Distanzen für jeweils ein betreffendes Taxon.

40 ERGEBNISSE

3.2. Ravenelia

Von insgesamt 21 Aufsammlungen konnten von 8 Ravenelia-Proben erfolgreich PCR- Fragmente amplifiziert werden. Hiervon entfallen 8 Fragmente auf die große ribosomale Untereinheit (LSU) und 3 auf die kleine ribosomale Untereinheit (SSU). Diese zusätzlich gewonnenen Sequenzdaten sind jeweils in die entsprechenden Alignments für diese beiden Genregionen eingegangen, welche im Vorfeld im Rahmen der Diplom-Arbeit von Sonja Bogisch (2010) erstellt wurden. Eine Auflistung der von mir gewonnen Sequenzdaten findet sich in der unten abgebildeten Tabelle. Eine vollständige Auflistung der untersuchten Proben findet sich in Tabelle 1 auf den Seiten 16-17.

Tabelle 6: Auflistung der zusätzlich von mir eingebrachten Ravenelia-Proben. WM: Herbarium Wolfgang Maier

Wirtsart Herbarnr. Parasit Gen-Region LSU SSU Acacia caffra WM3592 Ravenelia sp. ja ja Acacia natalitia WM3292 R. macowaniana ja nein Acacia nigrescens WM3589 Uredo sp. ja nein Acacia robusta ssp. clavigera WM3585 R. cf. evansii ja ja Acacia robusta ssp. robusta WM3588 R. cf. evansii ja nein Acacia rubrodermis WM3310 R. macowaniana ja nein Acacia sieberiana WM3591 R. evansii ja nein Senna cf. italica WM3509 Ravenelia sp. ja ja

In dieser Arbeit werden nur die Ergebnisse aus dem konkatenierten Datensatz der LSU- und SSU-Region vorgestellt. Aus den getrennten Datensätzen sind Stammbäume nach den Maximum Likelihood-Verfahren (Stamatakis et al. 2005; Stamatakis et al. 2008) mit dem Programm raxmlGUI (Silvestro und Michalak 2010) berechnet worden und sind dem Anhang beigefügt (Abbildungen A und B). Das konkatenierte Alignment umfasst 74 Taxa und weist 2175 Nukleotidpositionen auf, wobei die Akzessionen Phakopsora meibomiae EU851164, P. pachyrhizi DQ354537, P. tecta DQ354535 und Batistopsora crucis-fili DQ354539 von GenBank stammen. Aus diesem Alignment sind mit Hilfe einer Maximum Likelihood-Methode (Stamatakis et al. 2005; Stamatakis et al. 2008) und der Bayesschen Statistik

41 ERGEBNISSE

(Huelsenbeck & Ronquist 2001; Ronquist & Huelsenbeck 2003) jeweils zwei phylogenetische Bäume berechnet worden, die im Folgenden kurz vorgestellt werden.

3.2.1. Topologie der LSU-/SSU-Genstammbäume für die untersuchten Ravenelia- Arten

3.2.1.1. Analyse nach Bayesscher Statistik

Der Stammbaum nach dieser Analyse-Methode weist prinzipiell zwei große Gruppen auf, von denen allerdings nur eine Gruppe gut unterstützt wird (pp=1.0). Dieses Cluster umfasst die Arten Ravenelia macowaniana, R. evansii, R. hieronymie, R. cebil und R. argentinica. Hierin entfällt die erste Verzweigung auf die südamerikanischen Arten Ravenelia cebil und Ravenelia argentinica, die ein wenig unterstütztes Monophylum bilden (pp=0.94, nicht dargestellt). Desweiteren findet sich ein großes und gut abgesichertes Cluster (pp=1.0) mehrerer Aufsammlungen von R. macowaniana als Schwestergruppe zu R. evansii mit der hierzu basal abzweigenden R. hieronymie. Die zweite und nicht unterstützte Gruppe setzt sich zum Teil aus Akzessionen zusammen, die zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht näher bestimmbar sind. Hierzu zählen neben Ravenelia escharoides und R. peglerae unter anderem R. cf. halsei, R. cf. pienaarii, R. aff. pretoriensis und R. arizonica (siehe Abbildung 7). In diesem Cluster bildet das unzureichend unterstützte Monophylum aus Ravenelia dichrostachydis und R. arizonica die Schwestergruppe der verbleibenden Akzessionen, die ihrerseits mehrere teils statistisch gut abgesicherte Zweige bilden. Eine sehr gute Auflösung zeigt hier beispielsweise die dunkelgrün hinterlegte Gruppe die u.a. aus R. escharoides, R. cf. pienaarii, R. aff. pretoriensis und Ravenelia sp. gebildet wird. Im Gegensatz hierzu konnte keine Unterstützung für den Zweig von Uredo sp., R. mimosae-sensitivae und R. acaciae-pennatulae gefunden werden hellgrün hinterlegt, siehe Abbildung 7). Neben den beiden beschriebenen Großgruppen zeigt sich eine kleinere Polytomie, die auf die Monophyla von Ravenelia ornata und Uredo sp. (nicht unterstützt), beziehungsweise die zwei Akzessionen von Ravenelia minima (pp=1.0) entfällt.

42 ERGEBNISSE

R. escharoides auf Acacia burkei WM3405 R. escharoides auf Acacia burkei WM 3544 R. escharoides auf Acacia burkei WM3557 R. cf. transvaalensis auf Acacia senegal WM3432 R. cf. transvaalensis auf Acacia mellifera WM3513 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3545 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3554 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3555 R. a!. peglerae auf Acacia ca!ra WM3592 R. a!. peglerae auf Acacia karroo WM3550 R. a! peglerae auf Acacia ca!ra WM3552 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3515 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3516 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3517 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3548 R. acaciae-nigrescentis auf Acacia nigrescens WM3282 Ravenelia sp. auf Acacia goetzei WM3416 Uredo sp. auf Senna cf. italica WM3509 R. macrocarpa auf Senna subulata BPI841195 Ravenelia sp. auf Acacia natalitia WM3423 Ravenela sp. auf Acacia ataxacantha WM3434 Ravenelia sp. auf Acacia sekhukhuniense WM3304 Ravenelia sp. auf Acacia karroo WM3421 Ravenelia sp. auf Acacia gerrardii WM3425 Uredo sp. auf Acacia collinsii 2003-177 R. mimosae-sensitivae auf Mimosa debilis BPI841052 R. acaciae-pennatulae auf Acacia pennatula BPI864189 R. cohniana auf Acacia praecox BPI841185 R. echinata var. ectypa auf Caliandra formosa BPI841034 R. havanensis auf Enterolobium contortisiliquum BPI841002 R. dichrostachydis auf Dichrostachys cinerea WM3435 R. arizonica auf Prosopis sp. WM3479 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3310 R. macowaniana auf Acacia stefaniana WM3431 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3433 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3577 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3453 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3485 R. macowaniana auf Acacia ataxacantha WM3424 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3484 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3448 R. macowaniana auf Acacia natalitia WM3292 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3283 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3307 R. macowaniana auf Acacia mapoch WM3308 R. macowaniana auf Acacia sekhukhuniense WM3311 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3402 R. macowaniana auf Acacia cf. natalitia WM3440 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3512 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3514 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3558 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3562 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3578 R. cf. evansii auf Acacia robusta ssp. clavigera WM3585 R. cf. evansii auf Acacia robusta ssp. robusta WM3588 R. evansii auf Acacia sieberiana WM3591 R. evansii auf Acacia sieberiana var. woodii WM3428 R. evansii auf Acacia davyi WM3429 R. evansii auf Acacia sieberiana WM3477 R. evansii auf Acacia hebeclada WM3538 R. evansii auf Acacia robusta WM3547 R. hieronymi auf Acacia caven BPI841265 R. cebil auf Anadenanthera sp. BPI841029 R. argentinica auf Acacia aroma BPI841267 Uredo sp. auf Acacia nigrescens WM3589 R. ornata auf Abrus cf. laevigatus WM3401 R. minima auf Albizia adianthifolia WM3345 R. minima auf Albizia adianthifolia WM3350

Vachellia Senegalia Caesalpinioideae Faboideae Mimosoideae

Abbildung 7: Stammbaum der Gattung Ravenelia auf Basis des konkatenierten Datensatzes der LSU- und SSU-Region nach Bayesscher Analyse. Rot umrandet sind die Akzessionen, die von mir dem Datensatz hinzugefügt wurden. Unterstützungswerte unter 0.95 sind nicht dargestellt.

43 ERGEBNISSE

3.2.1.2. ML-Analyse

Im Vergleich mit der Topologie, die mit der Bayesschen Statistik erhalten wurde, zeigen sich nur geringe Unterschiede. Im Wesentlichen belaufen sich diese Unterschiede auf die statistische Unterstützungswerte für einzelne Cluster, die nach dem Maximum Likelihood-Verfahren im Allgemeinen etwas geringer ausfallen, wie dies etwa für die Gruppe aus Ravenelia macrocarpa und Ravenelia sp. der Fall ist. Nach dieser Methode erhält dieses Monophylum nur eine bootstrap-Unterstützung von 57%, während es nach Bayesscher Ananlyse mit einer posterior probability von 1.0 abgesichert ist (siehe Abbildung 7 und 8). Ein weiterer Unterschied zeigt sich in der Gruppierung der Akzessionen von Ravenelia minima. Im ML-Stammbaum bilden sie eine frühe Verzweigung (nicht unterstützt) innnerhalb der oben beschriebenen zweiten Großgruppe, wohingegen sie nach Bayesscher Analyse nicht aufgelöst in den "basalen" Ast der Ravenelien gruppieren (siehe Abbildung 7).

44 ERGEBNISSE

R. escharoides auf Acacia burkei WM3405 R. escharoides auf Acacia burkei WM3544 R. escharoides auf Acacia burkei WM3557 R. cf. transvaalensis auf Acacia senegal WM3432 R. transvaalensis auf Acacia mellifera WM3513 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3555 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3545 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3554 R. a!. peglerae auf Acacia ca!ra WM3552 R. a!. peglerae auf Acacia karroo WM3550 R. a!. peglerae auf Acacia ca!ra WM3592 Ravenelia sp. auf Acacia cf. goetzei WM3416 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3515 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3517 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3516 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3548 R. acaciae-nigrescentis auf Acacia nigrescens WM3282 Ravenelia sp. auf Acacia natalitia WM3423 Ravenelia sp. auf Acacia ataxacantha WM3434 R. macrocarpa auf Senna subulata BPI841195 Uredo sp. auf Senna cf. italica WM3509 Ravenelia sp. auf Acacia sekhukhuniense WM3304 Ravenelia sp. auf Acacia karroo WM3421 Ravenelia sp. auf Acacia gerardii WM3425 R. mimosae-sensitivae auf Mimosa debilis BPI841052 Uredo sp. auf Acacia collinsii 2003-177 R. acaciae-pennatulae auf Acacia pennatula BPI864189 R. cohniana auf Acacia praecox BPI841185 R. havanensis auf Enterolobium contortisiliquum BPI841002 R. echinata var. ectypa auf Caliandra formosa BPI841034 R. minima auf Albizia adianthifolia WM3350 R. minima auf Albizia adianth. WM3345 R. dichrostachydis auf Dichrostachys cinerea WM3435 R. arizonica auf Prosopis sp. WM3479 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3310 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3577 R. macowaniana auf Acacia stefaniana WM3431 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3433 R. macowaniana auf Acacia sekhukhuniense WM3311 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3512 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3402 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3485 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3453 R. macowaniana auf Acacia ataxacantha WM3424 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3578 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3514 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3562 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3307 R. macowaniana auf Acacia cf. natalitia WM3440 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3283 R. macowaniana auf Acacia natalitia WM3292 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3558 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3448 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3484 R. macowaniana auf Acacia mapoch WM3308 R. evansii auf Acacia sieberiana WM3591 R. evansii auf Acacia davyi WM3429 R. evansii auf Acacia hebeclada WM3538 R. evansii auf Acacia sieberiana var. woodii WM3428 R. evansii auf Acacia robusta WM3547 R. cf. evansii auf Acacia robusta ssp. robusta WM3588 R. cf. evansii auf Acacia ssp. clavigera WM3585 R. evansii auf Acacia sieberiana var. woodii WM3477 R. hieronymi auf Acacia caven BPI841165 R. argentinica auf Acacia aroma BPI841267 R. cebil auf Anadenanthera sp. BPI841029 Uredo sp. auf Acacia nigrescens WM3589 R. ornata auf Abrus cf. laevigatus WM3401 EU851164 Phakopsora meibomiae DQ354537 Phakopsora pachyrhizi DQ354535 Phakopsora tecta DQ354539 Batistopsora crucis-"lii

Vachellia Senegalia Caesalpinioideae Faboideae Mimosoideae

Abbildung 8: Stammbaum der Gattung Ravenelia auf Basis des konkatenierten Datensatzes der LSU- und SSU-Region nach dem Maximum Likelhood-Verfahren. Rot umrandet sind die Akzessionen, die von mir dem Datensatz hinzugefügt wurden. Unterstützungswerte unter 70% sind nicht dargestellt.

45 ERGEBNISSE

3.2.2. Neue Wirt-/Parasit-Kombinationen

Für die Wirtspflanzen-Arten Acacia nigrescens und Senna cf. italica konnten zwei zusätzliche Parasiten-Arten gefunden werden. Die unten dargestellte Tabelle gibt eine Übersicht über die schon bekannten, sowie die neu gefundenen Wirt-/Parasit- Kombinationen für Südafrika.

Tabelle 7: Darstellung der Wirtspflanzen und ihrer jeweiligen Ravenelia-Parasiten. Grau hinterlegt sind diejenigen Parasiten, die in meiner Arbeit als Neufunde hinsichtlich ihrer Wirtsarten erkannt wurden.

Ravenelia-Arten und ihre Wirtspflanzen

Wirt (Acacia) für den Wirt beschriebene Ravenelia-Arten Neufunde für die Wirte Acacia ataxacantha Ravenelia halsei (Doidge 1950) Ravenelia macowaniana Ravenelia peglerae (Gorter 1981)1 Ravenelia sp. Acacia burkei Ravenelia escharoides (Doidge 1950) Acacia caffra Ravenelia peglerae (Doidge 1950) Ravenelia pienaarii (Doidge 1950) Acacia davyi nichts bekannt Ravenelia evansii Acacia erubescens nichts bekannt Ravenelia cf. pienaarii Acacia gerardii Ravenelia evansii (Doidge 1950) Ravenelia sp. Acacia goetzei nichts bekannt Ravenelia sp. Acacia hebeclada Ravenelia pretoriensis (Crous et al. 2000) Ravenelia modesta (Doidge 1950) Ravenelia evansii Acacia karroo Ravenelia inornata (Doidge 1950) Ravenelia peglerae Ravenelia macowaniana (Doidge 1950) Ravenelia sp. Ravenelia natalensis (Doidge 1950) Acacia mapoch nichts bekannt Ravenelia macowaniana 2 Acacia mellifera Ravenelia acaciae-melliferae (Spoulding 1961; Cast. und Ciferri 1937) Ravenelia aff. pretoriensis Ravenelia transvaalensis (Doidge 1950) Ravenelia cf. transvaalensis Acacia natalitia nichts bekannt Ravenelia sp. Ravenelia macowaniana 3 Acacia nigrescens Ravenelia acaciae-nigrescentis (Ritschel et al. 2007) Uredo sp. Ravenelia escharoides (Masuka et al. 1998) Acacia robusta Ravenelia evansii (Doidge 1950) Ravenelia cf. evansii Acacia rubrodermis nichts bekannt Ravenelia macowaniana Acacia sekhukhuniense nichts bekannt Ravenelia macowaniana Ravenelia sp. Acacia senegal Ravenelia acaciae-senegalae (Eboh 1978)4 Ravenelia cf. transvaalensis Ravenelia acaciicola (Boa und Lenné 1994)5 Acacia sieberiana Ravenelia evansii (Doidge 1950) Acacia stefaniana nichts bekannt Ravenelia macowaniana

Wirt (nicht-Acacia) Albizia adianthifolia Ravenelia minima (Doidge 1950) 6 Caliandra formosa Ravenelia echinata var. ectypa (Cummins 1977) Dichrostachys cinerea Ravenelia dichrostachydis (Doidge 1950) Ravenelia deformis (Tyagi und Prasad 1972)7 Elephantorrhiza burkei auf E. elephantina: R. elephantorrhizae (Doidge 1950) 8 Prosopis sp. Ravenelia arizonica Senna italica Ravenelia macrocarpa 9 Uredo sp.

1 bis 9: Keine Funde für Südafrika beschrieben (van Reenen 1995; www.ars.usda.gov)

46 DISKUSSION

4. Diskussion

4.1. Phylogenetische Rekonstruktion der Wirtspflanzen

4.1.1. Phylogenie von Acacia s.l. Molekularphylogenetische Arbeiten der letzten Jahre über die Gruppe der Akazien konnten die Monophylie dieser Gruppe widerlegen, was zu einer Umbenennung der beiden afrikanischen Untergruppen Aculeiferum und Acacia in die Gattungen Senegalia respektive Vachellia führte (Miller und Bayer, 2001; Miller et al. 2003a; Miller et al. 2003b; Luckow et al. 2003; Orchard und Maslin 2003; www.acaciavote.com). Diese deutliche Zweiteilung der Gruppe wird auch in meiner Arbeit gut unterstützt (bt=100, pp=1.0). Eine Differenzierung dieser Gattungen anhand vegetativer Merkmale ist auf Basis ihrer jeweiligen Bedornung möglich, die hier durch eine einfache Kodierung durch römische Ziffern erfolgt ist. So zeigen die Arten der hellgrün hinterlegten Gattung Vachellia eine an den Nodien inserierte paarweise Bewehrung gerader (Gruppe I) bzw. nur zum Teil gebogener (Gruppe II) Dornen, während innerhalb der Gattung Senegalia drei verschiedene Typen (Gruppe III, IV, V) von gebogenen Dornen auftreten.

4.1.1.1. Phylogenie der Gattung Senegalia Die taxonomischen Umbenennungen der letzte Jahre führten in einer Konsequenz dazu, innerhalb der neu entstandenen Gattung Senegalia keine neuen Untergruppen einzuführen, weshalb im Folgenden die ursprünglichen Sektionen 'Aculeiferum' und 'Monacanthea' zur Erläuterung verwendet werden (Maslin und Stirton 1997). Die beiden Sektionen werden durch die eindeutige Topologie des Stammbaums widergespiegelt siehe Abbildung 3 und 4). Die afrikanischen Vertreter der früheren Sektion Monacanthea weisen köpfchenförmige Blütenstände auf und besitzen eine unregelmäßige Anordnung einzeln stehender Dornen. In diese Arbeit wurden fünf Arten dieser Gruppe verwendet, von denen vier Arten (A. kraussiana, A. praecox, A. brevispica, A. schweinfurthii) ein Monophylum bilden. Die Art Acacia ataxacantha gruppiert hingegen in die Schwestergruppe die durch die Sektion Aculeiferum gebildet wird (siehe Abbildung 3 und 4). Diese Art wurde von Vassal ursprünglich zu den Monacanthea gestellt, allerdings bereits im Vorfeld kontrovers diskutiert (Maslin und

47 DISKUSSION

Stirton 1997). Vorangegangene molekularphylogenetische Untersuchungen stützen die phylogenetische Position von Acacia ataxacantha in meiner Arbeit (Bouchenak- Khelladi et al. 2010). Die Topologie dieses Clusters weist zahlreiche Polytomien auf, dennoch lassen sich einige Tendenzen erkennen: Nach beiden Rekonstruktionsmethoden bildeten die drei Akzessionen von Acacia caffra die erste Verzweigung der Gruppe, in der sich die GenBank-Sequenz mit größerer genetischer Distanz unaufgelöst neben die zusammengruppierten A. caffra-Aufsammlungen stellte. Ein mögliche Ursache für diese distanzierte Positionierung ist in zwei ausgedehnten Lücken in der GenBank- Sequenz zu sehen, die insgesamt über 900 Nukleotide betreffen (siehe Anhang, Abbildung C). Die nächste Verzweigung wird in der Likelihood-Rekonstruktion durch beide Acacia ataxacantha-Akzessionen gebildet, welche sich als Schwestergruppe zu dem nicht unterstützten Cluster aus A. burkei, A. nigrescens, A. erubescens, A. mellifera und A. senegal stellt. Wenngleich diese Gruppe meist keine statistische Unterstützung aufweist, findet sich dieselbe Gruppierung in der Arbeit von Bouchenak-Khelladi et al. (2010). Für die beiden Arten Acacia caffra und Acacia ataxacantha kann so eine eher basale Stellung innerhalb der Sektion Aculeiferum angenommen werden. Auch kann eine Evolutionslinie bestätigt werden, die die Arten A. burkei, A. nigrescens, A. galpinii, A. goetzei und A. welwitschii umfasst. Diese Arten bilden im Bayes-Stammbaum eine hinreichend unterstützte Gruppe (pp=0.99) und werden als distinktes Cluster auch in einer weiteren Arbeit den übrigen Vertretern der Untergruppe gegenübergestellt (Bouchenak-Khelladi et al. 2010).

4.1.1.2. Phylogenie der Gattung Vachellia In den Datensatz der Gattung Vachellia ist neben den südafrikanischen Akazien auch eine südamerikanische Art (Acacia collinsii) mit eingelossen, die in der Baumtopologie an ihrem Schwesterverhältnis und der großen genetischen Distanz zu den übrigen Vertretern der Vachellia gut erkennbar ist. Diese klare Trennung von A. collinsii zu den übrigen ist auch bei Bouchenak-Khelladi et al. (2010) erkannt worden und wird dort zusammen mit der biogeographischen Geschichte dieser Gattung diskutiert. Der Hauptteil der untersuchten südafrikanischen Vachellia-Arten fällt in meiner Arbeit in eine große und gut unterstützte Gruppe, wie es für einige dieser Arten schon früher gezeigt werden konnte (Miller & Bayer 2003; Bouchenak-Khelladi

48 DISKUSSION et al. 2010). Darüber hinaus lassen sich nur vage Vermutungen über die phylogenetischen Zusammenhänge aussprechen, da signifikante Unterstützungswerte nur für einzelne Arten gefunden werden, die aber im Abschnitt zum "barcoding" weiterführend diskutiert werden. Dennoch entsprechen die hier gefundenen Guppierungen (trotz ihrer fehlenden statistischen Unterstützung) im Wesentlichen den Rekonstruktionen früherer Arbeiten (Miller und Bayer 2001; Miller et al. 2003a; Miller et al. 2003b; Luckow et al. 2003; Bouchenak-Khelladi et al. 2010). So zeigt die Artengruppe um Acacia karroo (Cluster B) eine hohe Übereinstimmung mit den verwandtschaftlichen Verhältnissen, die Bouchenak-Khelladi et al. (2010) gefunden haben. Die zweite Untergruppe (Cluster A) zeigt in weiten Teilen dieselben Artgruppierungen. Hier zeigt vor allem eine Gruppe ausgeprägte Polytomie in die A. grandicornuta, A. robusta, A. luederitzii und eine Isolation von Acacia rubrodermis gruppieren. Bei A. rubrodermis (WM3310) handelt es sich sehr wahrscheinlich um eine Fehlbestimmung, da sich einerseits eine andere A. rubrodermis-Akzession (WM3433) im Cluster B befindet und andererseits diese letzte Gruppierung durch die Daten von Bouchenak-Khelladi et al. (2010) bestätigt werden. Eine weitere Akzession, die nach beiden Rkonstruktionsmethoden eine unerwartete Position einnimmt, ist die Probe von Acacia natalitia (WM3292). Diese Art steht der weit verbreiteten Acacia karroo sehr nahe und wurde erst vor wenigen Jahren aus dieser ausgegliedert, weshalb eine zweite Aufsammlung erwartungsgemäß nahe dieser Art gruppiert. Im Alignment besitzt die Sequenz von A. natalitia WM3292 eine Deletion von 24 Nukleotiden in einer Region, in der keine der mutmaßlich nah verwandten Spezies eine solche Deletion aufweisen. Ob es sich hierbei um einen Fehler während der Sequenzeditierung handelt, muss zu einem späteren Zeitpunkt überprüft werden.

Obwohl es sich bei der matK-Region um einen schnell evolvierenden Marker handelt und dieser bereits sehr erfolgreich in phylogenetischen Untersuchungen verwendet wurde (Hu et al. 2000; Luckow et al. 2003; Wojciechowski et al. 2004), ist es nicht möglich gewesen die Verhältnisse auf Artniveau näher aufzuklären. Als mögliche Ursache für das schlechte Auflösevermögen innerhalb der Akazien-Gruppen, wird eine rasche Radiation derselben während klimatischer Umschwünge des späten Oligözäns und frühen Miozäns diskutiert (Bouchenak-Khelladi et al. 2010).

49 DISKUSSION

4.1.2 Phylogenie der Nicht-Akazien

Die drei Unterfamilien der Leguminosae bilden auf Basis der matK/trnK- Sequenzdaten gut unterstützte Gruppen, die die aktuellen systematischen Verhältnisse sehr gut wiedergeben (siehe Käss und Wink 1996; Wojciechowski 2003; Wojciechowski et al. 2004). Auffällig ist hier die paraphyletische Gruppierung der Caesalpinioideae zu erkennen. Diese wird durch die isoliert stehenden Arten der Gattung Bauhinia des Tribus Cercidae und der Gattung Senna verursacht. Die zuletzt genannte Gattung steht als Vertreter der Kern-Caesalpinioideae in einem Schwesterverhältnis zu den Mimosoideae. Die Cercideae sind ursprünglich aufgrund ihrer radiärsymmetrischen Blüten und weiterer blütenontogenetischer Merkmale zu den Caesalpinioideae gestellt worden (Wojciechowski 2003). Die Paraphylie der Unterfamilie wurde jedoch bereits durch Käss und Wink (1996) erkannt und ist seither durch weitere Arbeiten bestätigt worden (Wojciechowski 2003; Wojciechowski et al. 2004).

4.1.2.1. Phylogenie der Mimosoideae Auch innerhalb der Mimosoideae entspricht die Topologie den aktuellen Kenntnissen über die systematischen Verwandtschaftsbeziehungen der untersuchten Taxa (Wojciechowski 2003; Wojciechowski et al. 2003; Luckow et al. 2003; Bouchenakh- Khelladi et al. 2010). So zeigen sich auch hier die Mimoseae mit den Gattungen Prosopis, Xerocladia, Dichrostachys, Piptadenia und Elephantorrhiza als paraphyletisch hinsichtlich der Gattungen Albizia, Cathormion, Caliandra und Zapoteca des Tribus Ingeae. Auch die Gattung Dichrostachys wurde bereits als parapyletisch erkannt (Luckow et al. 2003). Dieser Befund wird durch die entfernte Gruppierung von Dichrostachys cinerea zu den Arten D. venosa und D. richardiana zusätzlich gestützt. Die Positionierung von Prosopis-Akzessionen als Schwestergattung zu Xerocladia viridiramis bestätigt prinzipiell frühere Arbeiten (Bouchenakh-Khelladi et al. 2010), wenngleich in einem umfangreicheren Sampling nachgewiesen werden konnte, dass sich Prosopis paraphyletisch hinsichtlich der Art Xerocladia viridiramis zeigt (Catalano et al. 2008).

50 DISKUSSION

4.1.2.2. Phylogenie der Faboideae Erste molekularphylogenetische Arbeiten über die Faboideae deuteten bereits auf die Monophylie dieser Unterfamilie hin, was jedoch statistisch nicht abgesichert werden konnte (Käss und Wink 1996). Die Ergebnisse meiner Arbeit stützen die matK/trnK- basierten Analysen anderer Arbeitsgruppen, die eine sehr gut unterstützte monophyletische Gruppe der Faboideae zeigen konnten (Wojciechowski 2003; Wojciechowski et al. 2004). Auch wenn es sich in meiner Arbeit um ein sehr kleines Sampling handelt, hinsichtlich der etwa 12000 Arten in etwa 483 Gattungen innerhalb der Faboideae (zitiert nach Wojciechowski 2003; Wojciechowski et al. 2004), spiegelt die erhaltene Topologie in weiten Teilen aktuelle Analysen wider (Wojciechowski et al. 2004; Hu et al. 2000; Schrire et al. 2009). Ein Unterschied zeigt sich in der Stellung der "IRLC" (inverted repeat lacking clade), eine Gruppe die hier durch die Gattungen Astragalus, Swainsona und Caragana vertreten sind. Bei dieser Gruppe handelt es sich um ein stets gut abgesichertes Monophylum, welches in vorangegangenen Untersuchungen in einer Schwesterbeziehung zu den Indigofereae und den Millettioiden stand (Wojciechowski et al. 2004; Hu et al. 2000; Schrire et al. 2009). Die Millettioiden werden hier durch das monophyletische Cluster, bestehend aus den Arten von Millettia dura bis zu Xeroderris stuhlmannii, repräsentiert (siehe Abbildung 5 und 6). Die Topologie innerhalb der Millettioiden entspricht auch den aktuellen systematischen Kenntnissen (Hu et al. 2000). So gruppiert die Gattung Abrus des Tribus Abreae basal zu den Arten des Tribus Millettieae der hier Arten aus den Gattungen Millettia, Lonchocarpus, Pongamiopsis, Tephrosia und Galactia umfasst. Die Klärung der systematische Stellung und Identität der Aufsammlung von cf. Indigofera sp. WM3452 konnte bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht erfolgen.

4.2. Barcoding der Wirtspflanzen

Ausgangspunkt für die Fragestellung, ob eine sichere Artzuweisung für südafrikanische Akazien mit Hilfe eines barcoding-Markers möglich ist, war die Tatsache, dass auf Basis der vorhandenen parasitenbefallenen Herbarbelege oftmals keine korrekte Nachbestimmung der Wirtsidentität möglich ist. Hinzu kommt die ohnehin teilweise schwierige Artbestimmung innerhalb der Leguminosen.

51 DISKUSSION

Eine grundsätzliche Voraussetzung für jeglichen barcoding-Erfolg, d.h. korrekte Artzuweisung, ist, dass in dem Datensatz die 'richtige' Art implementiert sein muss. Zu diesem Zweck wurde versucht, möglichst alle im Untersuchungsgebiet vorkommenden Arten als Referenzsequenzen mit einzubinden, was zum gegenwärtigen Zeitpunkt aufgrund der lückenhaften Datenlage nicht vollständig möglich war. Dennoch konnten einige Aufsammlungen ihren Referenzsequenzen zugeordnet werden. Als ein erstes Maß für den barcoding-Erfolg kann hierbei die bootstrap-Unterstützung des entsprechenden Artmonophylums dienen (Fazekas et al. 2008).

4.2.1. Barcoding der Gattung Vachellia Innerhalb der Gattung Vachellia lassen sich von insgesamt 29 Arten fünf Artmonophyla erkennen. Diese sind neben der südamerikanischen Acacia collinsii die südafrikanischen A. davyi, A. sieberiana, A. hebeclada und A. grandicornuta gehören. Hierbei ist das Monophylum der Acacia collinsii, trotz der sehr guten Unterstützung, mit einer intraspezifischen Distanz von 2,8% mit Vorsicht zu behandeln, da keine weiteren Akzessionen südamerikanischer Arten mit einbezogen wurden. So ist es nicht auszuschließen, dass unter Einbeziehung aller natürlichen südamerikanischen Vachellia-Arten die Monophylie dieser beiden Akzessionen aufgehoben ist (siehe auch Fazekas et al. 2008). Für den südafrikanischen Datensatz wird dieses Risiko durch das umfangreichere Sampling deutlich minimiert, so dass die hier ermittelten Artmonophyla in dieser Hinsicht als sicherer gelten können. Die zwei Akzessionen von Acacia hebeclada bilden ein nur unzureichend abgesichertes Monophylum (bt=57, pp=0,93). Da sich diese Art recht gut mit vegetativen Merkmalen von den beiden ihr nahe stehenden Arten A. tortilis und A. rehmanniana unterscheiden lässt, soll diese Artzuweisung als korrekt gelten. Auffällig ist hierbei für die beiden A. hebeclada-Arten eine relativ hohe innerartliche K2P- Distanz von 3,6% im Vergleich zu den Schwesterarten, die zwischen A. hebeclada WM3538 und A. tortilis GQ872253 bei 3,68% und zwischen A. hebeclada GQ872229 und A. tortilis GQ872253 nur bei 0,15% liegt, zwischen den beiden Schwesternarten der A. hebeclada beträgt sie 0,21% (siehe Anhang, Tabelle B). Dass nun trotzdem die A. hebeclada-Akzessionen miteinander gruppieren und nicht etwa die Akzessionen

52 DISKUSSION von A. tortilis GQ872253 und A. hebeclada GQ872229 (K2P=0,15%), lässt sich indirekt über den bootstrap herleiten: Obschon der größeren K2P-Distanz beider A. hebeclada-Sequenzen zueinander, weist der bootstrap indirekt auf einen relativ höheren Anteil an Synapomorphien für die A. hebeclada-Sequenzen hin, als dies für die andere Kombination der Fall ist. Hier ist allerdings anzumerken, dass die relativ hohe innerartliche Distanz der Acacia hebeclada-Sequenzen wahrscheinlich durch einen Einschub von 52 'N'-Positionen in die GenBank-Akzession begründet ist. Selbige Situation findet sich bei der Sequenz der Acacia sieberiana GQ872250 aus GenBank, weshalb diese vermutlich nicht zu den übrigen drei Aufsammlungen von A. sieberiana fällt. Die Zuweisung der Aufsammlung von Acacia davyi WM3429 zu der GenBankreferenz Acacia davyi GQ872219 lässt sich, trotz einer für Vachellia-Arten relativ hohen intraspezifischen Sequenzdivergenz (K2P-Dist.=1,5%) als sehr sicher ansehen, was insbesondere durch eine gute bootstrap-Unterstützung des Monophylums und recht hoher K2P-Distanzen zu ihren Schwesternarten (mehr als 3,5% für z.B. A. karroo WM3402 oder A. sieberiana WM3591) zu begründen ist (siehe Anhang, Tabelle B). Zudem erscheint es nicht wahrscheinlich, dass in einem vollständigen Sampling für südafrikanische Vachellia-Arten diese Gruppierung hinfällig wird (siehe Bouchenak-Khelladi et al. 2010).

4.2.2. Barcoding der Gattung Senegalia Von insgesamt neun Arten meiner Aufsammlungen bildeten die vier Arten Acacia senegal, Acacia mellifera, Acacia ataxacantha und Acacia caffra jeweils monophyletische Gruppen. Einzig die GenBank-Akzession von Acacia caffra gruppiert mit größerer genetischer Distanz (K2P=4,8%) als Schwestergruppe zu A. caffra (WM3592, WM3552), was vermutlich auf die längeren 'N'-Positionen in dieser Sequenz zurückzuführen ist (siehe Anhang, Abbildung C). Aufgrund des umfangreichen Samplings und der überwiegend guten statistischen Absicherung der Artmonophyla ist davon auszugehen, dass die hier getroffenen Artzuweisungen korrekt sind.

53 DISKUSSION

4.2.3. Zusammenfassung des Wirts-barcoding Es konnten insgesamt etwa 39% der Arten auf Basis des matK/trnK-Markers identifiziert werden, womit die Erfolgsquote deutlich niedriger ausfiel, als dies für andere Datensätze der Fall war (CBOL Plant Working Group 2009; Fazekas et al. 2008). Eine Erklärung für den mäßigen Erfolg findet sich bei der Analyse der jeweiligen K2P-Distanzen: Der Vergleich der ermittelten K2P-Distanzen beider Akaziengruppen untereinander zeigt ein heterogenes Bild: Für die meisten Arten waren die innerartlichen Distanzen sehr gering mit Werten von 0% für Acacia luederitzii (3 Akzessionen), Acacia mellifera (3 Akzessionen) und Acacia caffra (2 Akzessionen unter Auschluss der GenBank-Akzession) und 0-0,4% für Acacia karroo, Acacia grandicornuta, Acacia senegal und Acacia ataxacantha (siehe Anhang, Tabelle B). Eine relativ geringe intraspezifische Divergenz konnte für diesen Marker auch in anderen Gattungen nachgewiesen werden und gilt allgemein als Grundvoraussetzung für einen erfolgversprechenden barcode-Marker (Lahaye et al. 2007). Allerdings weisen hier auch einige Arten eine etwas höhere Divergenz auf, wie Acacia robusta (1,3%), Acacia davyi (1,5%) oder Acacia collinsii (2,8%) (siehe Anhang, Tabelle B). Stellt man einige zwischenartliche Distanzen diesen gegenüber, wird einerseits deutlich, dass die innerartlichen und zwischenartlichen Distanzen in vielen Fällen Überschneidungen zeigen und somit zumindest auf die gesamte Gattung Vachellia bezogen, kein klarer barcode gap vorhanden ist. Andererseits korrelieren die Werte in weiten Teilen mit der Topologie des ML-Baumes. So zeigt sich beispielsweise für die Arten der kaum aufgelösten 'Acacia karroo-Gruppe' überwiegend eine sehr geringe interspezifische Sequenzdivergenz, die für viele Artkombinationen die innerartlichen Distanzen nicht oder kaum übersteigt (siehe Anhang, Tabelle B). Deutlich größere Distanzen sind meist erst zwischen Arten des Cluster B und der zweiten Großgruppe aus A. luederitzii, A. sieberiana und A. hebeclada (Cluster A) zu finden. Auf Basis der K2P-Distanzen ist so eine deutliche Abgrenzung nur zwischen den Gruppen zu erwarten, nicht jedoch innerhalb des wenig divergenten Cluster A. Auch in der Gattung Senegalia findet sich im Wesentlichen diese Situation. Während durchweg hohe Sequenzdivergenzen eine klare Unterscheidung zwischen den beiden Gattungen ermöglicht hat, war eine Abgrenzung in vielen Artengruppen nicht möglich, wie es hier in besonderem Maße für die Gruppe aus A. burkei, A. nigrescens,

54 DISKUSSION

A. galpinii, A. welwitschii und A. goetzei gilt. Diese Arten zeigten untereinander ebenfalls eine geringe Sequenz-Variabilität, sodass weder eine robuste phylogenetische Einordnung, noch eine eindeutige Artabgrenzung möglich war. Die geringe Variabilität in der matK/trnK-Sequenz, die maßgeblich zu der niedrigen DNA-barcoding-Erfolgsquote geführt hat, lässt insbesondere auf eine schnelle Radiation in jüngerer Vergangenheit schließen. Dies trifft insbesondere für den Artenkopmplex des Cluster A zu, deren Arten sich in ihrer Morphologie und Ökologie nur marginal unterscheiden. Die Hypothese einer rezenten Radiation wird durch die Arbeit von Bouchenak-Khelladi et al. (2010) diskutiert und zusätzlich gestützt. Die Ergebnisse dieser Arbeit machen zudem deutlich, wie sehr der barcoding-Erfolg von der untersuchten Pflanzengruppe, bzw. vom Sampling abhängig ist. Im Gegensatz zu den meisten vorangegangen Arbeiten (Lahaye et al. 2007; Fazekas et al. 2008; Newmaster und Ragupathy 2009), wurde hier ein möglichst vollständiges Artensampling für die betreffenden Gattungen angestrebt, wodurch ein deutlich höherer Anteil an den potentiell nächst verwandten Arten untersucht wurde, was offenbar zu einer deutlich geringeren Identifizierungsquote führte. In Kombination dieser Region mit mindestens einer weiteren, möglichst variableren Region wäre es eventuell möglich, eine größere Anzahl an Arten eindeutig gegeneinander abgrenzen zu können. Für solche 'Multi-Loci-Ansätze' konnten in Vergleichsstudien größere Erfolge erzielt werden, als es für die einzelne Region möglich war (Fazekas et al. 2007), allerdings erhöht dies neben dem zusätzlichen Arbeitsaufwand die Kosten. Daher sollte im Einzelfall geprüft werden, ob dies hinsichtlich der Fragestellung gerechtfertigt ist.

55 DISKUSSION

4.3. Phylogenetische Rekonstruktion des Parasiten

4.3.1. Vergleich beider Analyseverfahren

Da Maximum Likelihood und Bayessche Statistik in Simulationsstudien die robustesten Stammbaumrekonstruktionen darstellen, wurde darauf verzichtet, die phylogenetischen Rekonstruktionen auch nach Parsimony- und Neighbour Joining- Verfahren zu erstellen. Aus dem konkatenierten Alignment für die LSU- und SSU- Sequenzdaten wurden phylogenetische Rekonstruktionen nach dem Maximum Likelihood-Verfahren sowie der Bayesschen MCMC-Analyse durchgeführt. Hierbei sind die zwei Stammbaumtopologien überwiegend kongruent zu einander. Unterschiede zeigen sich hauptsächlich in den Unterstützungswerten für die jeweiligen Äste, die nach der Bayesschen MCMC-Analyse meist deutlich höhere Werte aufweisen. So werden die beiden Hauptgruppen im ML-Stammbaum nicht signifikant unterstützt, wohingegen nach Bayesscher Analyse zumindest eine Gruppe sehr gut abgesichert ist (pp=1.0; siehe Abb. 7). Ein weiterer Unterschied zeigt sich in der Positionierung des aus den zwei Ravenelia minima-Aufsammlungen gebildeten Clusters, das in der Bayes-Rekonstruktion in den Ravenelia-"Rückgrat" inseriert, im ML-Verfahren jedoch die zweite Verzweigung innerhalb der ersten Großgruppe bildet. Auch das Monophylum aus Uredo sp. auf Acacia nigrescens (WM3589) und R. ornata fällt nach beiden Methoden in verschiedene Positionen. In beiden Fällen konnte jedoch keine statistische Unterstützung gefunden werden (siehe Abb. 7 und 8). Somit sind diese Unterschiede auch keine signifikanten Widersprüche.

4.3.2 Phylogenetische Hypothesen zur Gattung Ravenelia

Die Gattung Ravenelia BERK. wurde bereits von Dietel (1906) in zwei Sektionen eingeteilt, die er aufgrund der Teleutosporenkopf-Morphologie unterschied. Während die Sporenköpfe der Sektion Haploravenelia sich durch den Besitz von durchweg 1- zelligen Teleutosporen auszeichnen, weisen die Vertreter der Pleoravenelia 2-zellige Teleutosporen auf (Dietel 1906). Obwohl auch der auf konkatenierten Gendaten (28S + 18SrDNA) beruhende Stammbaum eine Trennung der Gattung in zwei

56 DISKUSSION

Untergruppen zeigt, spiegeln diese Ergebnisse nicht die Einteilung nach Dietel (1906) wider: Die Gruppe aus Ravenelia macowaniana, R. evansii, R. hieronymi, R. cebil und R. argentinica sind in ihrer Teleutosporenkopf-Morphologie heterogen, da R. evansii und R. argentinica 1-zellige Teleutosporen aufweisen, wohingegen die übrigen Arten dieses Clusters 2-zellige Sporen besitzen. Rückschlüsse auf natürliche Verwandtschaft scheinen auf Basis dieses morphologischen Merkmals allein somit nicht möglich zu sein (siehe Bogisch 2010). Bogisch (2010) wies allerdings auf eine andere mögliche Synapomorphie dieses Monophylums hin. Und zwar besitzen die Arten dieser Gruppe die Eigenschaft, dass die Aecidiengeneration in verschiedenen Organen der Wirtspflanzen (Dornen, Zweige, Blüten) Gallenwachstum induzieren können und so das Krankheitsbild der sogenannten Hexenbesen hervorrufen (Hernandez und Hennen 2003; Bogisch 2010). Dieses Krankheitsbild kommt nur bei systemischen Infektionen perennierenden Myzels zur Ausprägung (Dietel 1906; Hernandez und Hennen 2003). Darüber hinaus lassen sich nur schwer Merkmale der jeweiligen Arten mit bestimmten Gruppen im Stammbaum korrelieren. So konnten für die Eigenschaften wie Teleutosporenanzahl, Teleutosporenkopfgröße, Anzahl der Zysten oder Sporengenerationen keine klaren Zusammenhänge zu den stammesgeschichtlichen Situationen gefunden werden (Bogisch 2010).

4.3.3 Korrelation der Ravenelia-Phylogenie mit den Wirtsphylogenien unter Einbeziehung geographischer Gesichtspunkte

In dieser Arbeit lag der Fokus auf korrelativen Beziehungen der Gattung Ravenelia zu ihren Wirten. Hierzu sind in den Stammbäumen die Verwandtschaftsgruppen der Wirte farblich hinterlegt worden, um Gruppierung besser kenntlich zu machen. Hierbei lassen sich vor allem in zwei Clustern Parasiten- und Wirtsphylogenien miteinander korrelieren: Bei der ersten handelt es sich um das grau-grün hinterlegte Monophylum der Parasitenarten Ravenelia escharoides, R. cf. transvaalensis, R. cf. pienaarii bis hin zu R. acaciae-nigrescentis und Ravenelia sp. (siehe Abb. 7 und 8). Diese Arten parasitieren alle auf Vertretern der Senegalia-Gruppe. Eine Ausnahme betrifft die Akzession von R. aff. peglerae auf Acacia karroo WM3550 (Vachellia- Gruppe). Diese Aufsammlung gruppiert zusammen mit zwei weiteren R. aff. peglerae-

57 DISKUSSION

Arten in einem signifikant unterstützten Monophylum. Hier muss angemerkt werden, dass die Probe der R. aff. peglerae auf Acacia karroo in einer Region gefunden wurde, die dem Überschneidungspunkt der Verbreitungsgebiete beider Wirtsarten entspricht (siehe Smit 2008). Ob es sich in diesem Fall um einen Wirtssprung handeln könnte lässt bei der vorhandenen Datenlage allerdings noch nicht sicher abschätzen. Zu diesem Zweck wären weitere Aufsammlungen aus den gesamten Verbreitungsgebieten der jeweiligen Wirtsarten von Nöten. Bei der zweiten Gruppe handelt es sich um das hellgrün hinterlegte Cluster welches die Aufsammlungen von Ravenelia macowaniana, R. evansii und R. hieronymie umfasst. Die Wirtspflanzen dieser Arten gehören alle zu der Vachellia-Gruppe (siehe Abb. 7 und 8). Die Akzession von R. macowaniana auf der Art Acacia ataxacantha WM3424 bildet hier die einzige Ausnahme. Darüber hinaus zeigt sich in dieser Gruppe auch eine Korrelation mit den Untergruppierungen, die bei der Analyse der Vachellia-Arten gefunden wurde: So parasitieren alle R. macowaniana-Akzessionen nur Arten aus dem näheren Verwandtschaftskreis von Acacia karroo (siehe " Cluster A" in Abb. 3 und 4). Auch wenn dieses Cluster mehrere distinkte Wirtsarten umfasst, lässt sich aufgrund der großen phylogenetischen Distanz dieser Arten zu Acacia ataxacantha eher ein Hinweis auf einen Wirtssprung finden, als dass diese Situation auf eine Kospeziation zwischen Wirt und Parasit zurückzuführen wäre. Auch die Schwestergruppe des R. macowaniana-Clusters lässt sich sehr gut mit der Vachellia-Phylogenie in Zusammenhang bringen. Der terminale Ast dieser Gruppe wird durch mehrere Aufsammlungen von Ravenelia evansii (bzw. R. cf. evansii) gebildet die ihrerseits ausschließlich Wirtsarten des "Cluster B" befallen (Vergleiche Abb. 4 und 7). In "basaler" Position befindet sich in dieser Gruppe, deutlich abgesetzt, eine südamerikanische Wirt-Parasit-Kombination, die aber ebenso die Untergattung Vachellia betrifft (Vergleiche Abb. 4 und 7). Um diese Situation als geographisches Signal deuten zu können, muss die Wirtsart in die phylogenetische Analyse mit einfließen, was im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht mehr durchgeführt werden konnte. Für die verbleibenden Akzessionen ergibt sich ein weniger schlüssiges Bild hinsichtlich einer Korrelation der Wirtsphylogenie mit der Parasitenphylogenie. So können meist nur kleine Monophyla weniger Arten mit der Wirtssystematik in Beziehung gesetzt werden. Ein Beispiel ist die Gruppe aus Uredo sp. auf Senna cf.

58 DISKUSSION italica und Ravenelia macrocarpa auf Senna subulata. Die Wirtspflanzengattung gehört zu der Unterfamilie der Caesalpinioideae, wohingegen die Wirtspflanzen der Schwestergruppe zu der Gattung Vachellia bzw. Senegalia (innerhalb der Mimosoideae) gehören (siehe Abb. 7). Bei der letztgenannten Gruppe handelt es sich um Vertreter einer einzigen Population von Ravenelia sp. (siehe Tab. 1). Der Umstand, dass diese Art mindestens zwei verschiedene Gattungen parasitiert, lässt auf eine eher plurivore Natur dieser Art hinsichtlich der Wirtswahl schließen (siehe Abb. 7). Insbesondere für die Ravenelia-Arten, die Nicht-Akazien befallen ist auf Basis dieser Datenlage noch keine abschließende Bewertung der Parasit-Wirt-Beziehungen möglich. Die aktuellen Ergebnisse deuten jedoch an, dass Kospeziationsereignisse wahrscheinlich nicht sehr häufig in der Koevolution von Wirt und Parasit waren. Bei weltweit insgesamt über 200 Ravenelia-Arten (Cummins und Hiratsuka 2003) ist es allerdings nicht auszuschließen, dass bei einem annähernd vollständigen Artensampling ein deutlich anderer Schluss gezogen werden muss.

4.3.4 Identifizierung der Ravenelia-Arten

Die Identifizierung der in dieser Arbeit untersuchten Ravenelia-Arten geschah auf Grundlage der Arbeiten von Dietel (1906), Sydow und Sydow (1915), sowie Doidge (1927, 1939, 1950) und Ritschel et al. (2007) und ist von Bogisch (2010), Wolfgang Maier (2011, mündliche Mitteilung) und mir durchgeführt worden. Die genannten Autoren beziehen sich dabei allerdings nur auf die Rostpilzflora des südlichen Afrika. Für die Artbeschreibungen werden in der Literatur insbesondere die spezifischen Unterschiede im Aufbau der Teleutosporenköpfchen herangezogen da diese die meisten morphologischen Merkmale aufweisen. Auf dieser Basis konnte für diejenigen Rostpilze, von denen ausschließlich die Uredogeneration vorhanden war, lediglich die Zuordnung Uredo sp. getroffen werden. Erst die molekularphylogenetische Analyse konnte die Zuweisung zu der Gattung Ravenelia bestätigen (siehe Abb. 7). Die Bestimmung bis auf Artniveau führte allerdings bei vielen Proben zu einigen Schwierigkeiten, die im Folgenden anhand weniger Beispiele angesprochen werden. Eine Gruppe, deren

59 DISKUSSION

Artbestimmung unsicher ist, betrifft die vier Akzessionen von R. aff. pretoriensis auf Acacia mellifera (WM3515, WM3516, WM3517, WM3548). Für diese Art weisen die Merkmale der Teleutosporen(-köpfe) auf die Art Ravenelia pretoriensis hin, lassen sich von dieser jedoch durch eine deutlich stärker ausgeprägte Bestachelung abgrenzen, weshalb hier nur eine Ähnlichkeit zu dieser Art genannt wird (Abb. 7). Ähnliches gilt für den Ast, der durch die Akzessionen von R. cf. transvaalensis auf A. senegal WM3432 bzw. A. mellifera WM3513 gebildet wird. Die Zuordnung gilt in diesem Fall als unsicher, da die Anzahl der Einzelsporen pro Teleutosporenkopf geringfügig von der in der Literatur beschriebenen abweicht. Es konnten aber auch einige Arten gefunden werden, deren Sporenmerkmale es in keiner Weise erlaubt haben sie zu irgendeiner der in der Literatur beschriebenen Arten zuzuweisen. Zu diesen Proben fallen einerseits die Uredo-Arten (Uredo sp. auf A. nigrescens WM3589 und Uredo sp. auf Senna cf. italica WM3509) und andererseits die Ravenelia sp.-Akzessionen (Ravenelia sp. auf Acacia goetzei, Ravenelia sp. auf Acacia natalitia WM3423 und A. ataxacantha WM3434, Ravenelia sp. auf Acacia sekhukhuniense WM3304 und A. karroo WM3421, sowie Ravenelia sp. auf A. gerrardii WM3425). Ob es sich bei diesen Arten um gänzlich neue Arten handelt oder diese in Bezug zum Untersuchungsgebiet noch nicht beschrieben wurden kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht geklärt werden. Um dies zu klären ist in Zukunft eine Revision der Typusbelege für das südliche Afrika nötig.

60 ZUSAMMENFASSUNG

5. Zusammenfassung

Die weltweit in den Tropen und Subtropen verbreitete Rostpilzgattung Ravenelia zählt neben den Gattungen Puccinia und Uromyces zu der artenreichsten Gruppe der Uredinales. Das Wirtsspektrum dieses Parasiten umfasst Vertreter aller drei Unterfamilien der Leguminosae, von denen die artenreiche Gruppe der Akazien den Hauptwirt darstellt. Für das südafrikanische Verbreitungsgebiet waren bislang 21 Ravenelia-Arten auf etwa 24 Leguminosae-Arten beschrieben (van Reenen 1995; Ritschel 2007). Während mehrerer Exkursionen wurden auf 9 weiteren, bisher nicht als Wirte beschriebenen Pflanzenarten Ravenelien gesammelt. Daher war ein Ziel dieser Arbeit die Revision der südafrikanischen Ravenelia-Arten und ihrer Wirte. Zusätzlich wurde durch die Erstellung von Wirts- und Parasitenphylogenien untersucht, inwieweit eine Korrelation beider phylogenetischer Hypothesen möglich ist. Da eine exakte Bestimmung der Wirtspflanzen anhand von Herbarbelegen oft nicht durchführbar ist, wurde außerdem überprüft, ob eine sichere Identifizierung insbesondere der südafrikanischen Akazien über einen trnK/matK-basierten barcoding-Ansatz möglich ist. Hierzu wurde eine Stammbaum-basierte Methode gewählt, mit welcher 9 von 23 Arten sicher zugewiesen werden konnten, was in etwa einem barcoding-Erfolg von 39% entspricht. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Verwendung von trnK/matK allein für das barcoding eines Schwesternartenkomplexes unzureichend geeignet sein kann. In dieser Arbeit konnten zwei weitere, bis dahin nicht beschriebene Wirt-Parasit- Kombinationen für die Wirtsarten Acacia nigrescens und Senna cf. italica gefunden werden. Inwieweit es sich bei den Funden auch um neue Ravenelia-Arten handelt, kann zu gegenwärtigen Zeitpunkt nicht geklärt werden. Basierend auf den Ergebnissen von Bogisch (2010) und meiner Arbeit muss nun das Wirtsspektrum für die südafrikanischen Ravenelien um insgesamt 8 Akazien-Arten und die Art Senna cf. italica erweitert werden (siehe Tab 7). Bei der Analyse der Wirts- und Parasitenphylogenien konnten vor allem die Cluster der Vachellia- und Senegalia-Arten gut mit der Stammbaumtopologie ihrer jeweiligen Parasiten-Arten korreliert werden. Für die übrigen Gruppen wurden jedoch keine phylogenetischen Korrelationen erkannt, sodass die Ergebnisse andeuten, dass Kospeziationsereignisse wahrscheinlich nicht sehr häufig in der Koevolution von Ravenelia mit ihren Wirten waren. Allerdings lässt sich das Vorhandensein von Hemmnissen vermuten, die Wirtssprünge innerhalb einer Wirtsgruppe wahrscheinlicher werden lassen, als Sprünge auf weiter entfernt verwandte Arten.

61 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

6. Abkürzungsverzeichnis dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat ddH2O doppelt destilliertes H2O dGTP Desoxyguanosintriphosphat DMSO Dimethylsulfoxid DNA desoxyribonucleic acid dNTP Desoxynucleotidtriphosphat dTTP Desoxythymidintriphosphat EDTA Ethylendiamintetraacetat GTR general time reversible invgamma inverse gamma lset likelihood settings ML Maximum Likelihood MCMC Marcov-chain monte-carlo ngen number of generations nst number of substitutions PCR polymerase chain reaction samplefreq sample frequency sump summarize parameters sumt summarize trees Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Borat-Na2EDTA TE Tris-EDTA

62 LITERATURVERZEICHNIS

7. Literaturverzeichnis

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68 ANHANG

8. Anhang

8.1. verwendete PCR-Programme für die Ravenelia-Proben taq-Polymerase Name LSU40 Primer: LR0R/ LR6 1. Schritt 95°C 3.00 Min 2. Schritt 95°C 0.30 Min 3. Schritt 59°C 0.45 Min 4. Schritt 72°C 1.00 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 39x 6. Schritt 72°C 7.00 Min 7. Schritt 10°C ∞

PHUSION-Polymerase Name: SSU-PHU2 Primer: NS1/ Rust18sR 1. Schritt 98°C 0.30 Min 2. Schritt 98°C 0.10 Min 3. Schritt 48°C 0.20 Min 4. Schritt 72°C 0.20 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 39x 6. Schritt 72°C 5.00 Min 7. Schritt 10°C ∞

69 ANHANG taq-Polymerase Name: NS3-RUST Primer: NS3/ Rust18sR 1. Schritt 96°C 2.00 Min 2. Schritt 96°C 0.20 Min 3. Schritt 50°C 0.30 Min 4. Schritt 72°C 1.20 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 39x 6. Schritt 72°C 5.00 Min 7. Schritt 10°C ∞

verwendete PCR-Programme für die Wirtspflanzen-Proben

PHUSION-Polymerase Name: MAT-PHU3 Primer: Ac12F/ Ac1290R 1. Schritt 98°C 1.00 Min 2. Schritt 98°C 0.10 Min 3. Schritt 55°C 0.20 Min 4. Schritt 72°C 0.25 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 31x 6. Schritt 72°C 5.00 Min 7. Schritt 10°C ∞

Name: MAT-PHU4 Primer: trnK3914F/ Ac283R 1. Schritt 98°C 1.00 Min 2. Schritt 98°C 0.10 Min 3. Schritt 65°C 0.20 Min 4. Schritt 72°C 0.25 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 34x 6. Schritt 72°C 5.00 Min 7. Schritt 10°C ∞

70 ANHANG taq-Polymerase Name: MAT-FR2B Primer: Ac12F/ Ac1290R 1. Schritt 94°C 2.00 Min 2. Schritt 94°C 0.20 Min 3. Schritt 46°C 1.00 Min 4. Schritt 72°C 1.00 Min 5. Schritt gehe nach Schritt 2 4x 6. Schritt 94°C 0.20 Min 7. Schritt 55°C 0.50 Min 8. Schritt Temperaturerniedrigung um 1°C pro Zyklus 9. Schritt 72°C 1.00 Min 10. Schritt gehe nach Schritt 6 9x 11. Schritt 94°C 0.20 Min 12. Schritt 50°C 0.50 Min 13. Schritt 72°C 1.00 Min 14. Schritt gehe nach Schritt 11 16x 15. Schritt 72°C 7.00 Min 16. Schritt 10°C ∞

71 ANHANG

Tabelle B: K2P-Distanzmatrix des matK/trnK-Sequenzalignments für die Akaziendaten.

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72 ANHANG

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73 ANHANG

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74 ANHANG

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75 ANHANG

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76 ANHANG

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77 ANHANG

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78 ANHANG

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79 ANHANG

80 ANHANG

R. acaciae-nigrescentis auf Acacia nigrescens WM3282 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3515 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3517 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3516 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3548 Ravenelia sp. auf Acacia goetzei WM3416 R. a!. peglerae auf Acacia karroo WM3550 R. a!. geglerae auf Acacia ca!ra WM3592 R. a!. peglerae auf Acacia ca!ra WM3552 R. escharoides auf Acacia burkei WM3544 R. escharoides auf Acacia burkei WM3557 R. escharoides auf Acacia burkei WM3405 R. minima auf Albizia adianthifolia WM3350 R. minima auf Albizia adianthifolia WM3345 R. cf. transvaalensis auf Acacia senegal WM3432 R. cf. transvaalensis auf Acacia mellifera WM3513 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3554 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3555 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3545 Ravenelia sp. auf Acacia karroo WM3421 Ravenelia sp. auf Acacia sekhukhuniense WM3304 Ravenelia sp. auf Acacia gerrardii WM3425 R. mimosae-sensitivae auf Mimosa dbilis BPI841052 Uredo sp. auf Acacia collinsii 2003-177 R. acaciae-pennatulae auf Acacia pennatula BPI864189 R. cohnianaauf Acacia praecox BPI841185 R. havanensis auf Enterolobium contortisiliquum BPI841002 R. echinata var. ectypa auf Caliandra formosa BPI841034 Ravenelia sp. auf Acacia natalitia WM3423 Ravenelia sp. auf Acacia ataxacantha WM3434 Uredo sp. auf Senna cf. italica WM3509 R. macrocarpa auf Senna subulata BPI841195 R. argentinica auf Acacia aroma BPI841267 R. cebil auf Anadenanthera sp. BPI841029 R. macowaniana auf Acacia ataxacantha WM3424 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3453 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3485 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3578 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3562 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3307 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3283 R. macowaniana auf Acacia natalitia WM3292 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3558 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3512 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3448 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3484 R. macowaniana auf Acacia mapoch WM3308 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3402 R. macowaniana auf Acacia cf. natalitia WM3440 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3514 R. macowaniana auf Acacia sekhukhuniense WM3311 R. macowaniana auf Acacia stefaniana WM3431 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3433 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3310 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3577 R. hieronymi auf Acacia caven BPI841265 R. cf. evansii auf Acacia robusta ssp. clavigera WM3585 R. cf. evansii auf Acacia robusta ssp. robusta WM3588 R. evansii auf Acacia sieberiana WM3591 R. evansii auf Acacia davyi WM3429 R. evansii auf Acacia hebeclada WM3538 R. evansii auf Acacia robusta WM3547 R. evansii auf Acacia sieberiana WM3477 R. evansii auf Acacia sieberiana WM3428 Uredo sp. auf Acacia nigrescens WM3589 R. ornata auf Abrus cf. laevigatus WM3401 R. arizonica auf Prosopis sp. WM3479 R. dichrostachydis auf Dchrrostrachys cinerea WM3435 DQ Batistopsora crucis Rost auf Acacia stefaniana WM3309

Abbildung A: Phylogenetische Hypothese der südafrikanischen Ravenelia-Arten auf Basis der LSU-Sequenzdaten. Berechnet mit dem Maximum Likelihood-Verfahren. bootstrap-Werte unter 70 sind nicht mit angegeben.

81 ANHANG

R. arizonica auf Prosopis sp. WM3479 R. havanensis auf Enterolobium contortisiliquum BPI841002 Uredo sp. auf Acacia collinsii 2003-177 Ravenelia sp. auf Acacoia gerrardii WM3425 Ravenelia sp. auf Acacia sekhukhuniense WM3304 Ravenelia sp. auf Acacia karroo WM3421 Uredo sp. auf Senna cf. italica WM3509 Ravenelia sp. auf Acacia natalitia WM3423 Ravenelia sp. auf Acacia ataxacantha WM3434 R. escharoides auf Acacia burkei WM3405 R. escharoides auf Acacia burkei WM3544 R. escharoides auf Acacia burkei WM3557 R. a!. peglerae auf Acacia karroo WM3550 R. a!. peglerae auf Acacia ca!ra WM3552 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3555 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3545 R. cf. pienaarii auf Acacia erubescens WM3554 R. a!. peglerae auf Acacia ca!ra WM3592 R. cf. transvaalensis auf Acacia senegal WM3432 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3548 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3516 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3515 R. a!. pretoriensis auf Acacia mellifera WM3517 R. acaciae-nigrescentis auf Acacia nigrescens WM3282 Ravenelia sp. auf Acacia goetzei WM3416 R. dichrostachydis auf Dichrostachys cinerea WM3435 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3433 R. macowaniana auf Acacia sekhukhuniense WM3311 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3453 R. macowaniana auf Acacia mapoch WM3308 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3577 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3283 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3485 R. macowaniana auf Acacia rubrodermis WM3310 R. macowaniana auf Acacia cf. natalitia WM3440 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3578 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3307 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3514 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3402 R. macowaniana auf Acacia ataxacantha WM3424 R. macowaniana auf Acacia stefaniana WM3431 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3448 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3562 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3484 R. macowaniana auf Acacia karroo WM3512

R. minima auf Albizia adianthifolia WM3345 R. ornata auf Abrus cf. laevigatus WM3401 R. evansii auf Acacia sieberiana WM3428 R. evansii auf Acacia robusta WM3547 R. evansii auf Acacia davyi WM3429 R. evansii auf Acacia hebeclada WM3538 R. cf. evansii auf Acacia robusta ssp. clavigera WM3585 R. cf. evansii auf Acacia robusta ssp. robusta WM3588

Abbildung B: Phylogenetische Hypothese der südafrikanischen Ravenelia-Arten auf Basis der SSU-Sequenzdaten. Berechnet mit nach Bayesscher Statistik. Unterstützungswerte unter 0.95 sind nicht mit angegeben.

82 ANHANG

TTTTACACATTTCTATGAAGCAATGGATTCGTCCATACCATCGGTAGAGTTTGTAAGACCACGACTGATC CAGAAAGGAATGAATGGAAAAAGCAGCATGTCGTATCAATGGAAAATTCTAAGAATATTTCATTGTTATT GGATCGGGCCAAAATCCATGTTTGTATTCTTGGCTCGCAACAAAATAAATTCACAGTTGGGTTGAATTAA TAAATGGATAGAGTTTAGTGGCTCCAATTATAGGGAAACAAAAAGAAAGGAACGAGCTTTTGTTTTGAAT TTGAATGATTCCCCCATCTAATTATACGTTAAAAATAAAAATATTAGTACTTGATGTGGGAAAAGCTTTT CCCATGAATGGATTATTGATTTTTGTTATGAATCCTAACTATTAGCTATTCTCCATTATAATTAGANNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNATNAGAATAGAATACCCTGTTTTGACTGTATCGCACTATGTATTATTTGATAACCAAATAAATNTT CGATCCTTGGCCCAAATCAAATTTCAAAAATGGAGGAATCTCAAGTATATTTAGAACTAGATAGATCTCG TCAACATGACTTCCTATACCCACTTATTTTTCGGGAGTATATTTATGCACTTGCTTACGATCATGGTTTA AATAGTTCCATTTTGGTGCACAATCTAGGTTATGACAATAAATCTAGTTTACTAATTGTAAAACGTTTAA TTACTCGAATGTATCAACAGAATCATTTGATTATTTCTGCTAATAATTCTAACAAGAATCCATTTTTGGG GTATAACAAGAATTTGTATTCTCAAATAATATCAGAGGGGCTTGCCGTCAGTGTGGAAATTCCATTTTCC CTACAATTAATATCTTCCTTACAGAAGGCAGAAATCATAAAATCCTATAATTTACGATCAATTCATTCAA TATTTCCTTTTTTTGAGGAAAAATTTCCATATTTAAATTATGTGTCAGATGTACAAATACCCTACCCTAT CCATCTAGAAATCTTGATTCAAACCCCTTTCGATACTGGGGTGAAAGGATGCCCTCCTCCTTTCATTTTA TTAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNATCCCATTAGTAAGCCGGTCTG GGCCGATTCATCCGATTTTGATATTATTGACCGATTTTTGCAGATATGCAGAGATCTTTCTCATTATTAC AACGGATCCTCAAAAAAAAAGAGTTTGTATCGAATCAAATATATACTTCGGCTTTCTTGTATTAAAACTT TGGCGCGTAAACACAAAAGTACTGTACGGGTTTTTTTGAAAAGATTAGGTTCTGAATTATTGGAAGAATT CTTTACAGAGGAAGAAGATATTTTTTCTTTGATCTTCTCAAGAGCTTCTTCTACTTTGCAGAAGTTATAT AGAGGTCGGATTTGGTATTTGGATATTTTTGATTTTCATCAATGATCTGGTCAATCATGAATAACGGGTT ATCATACTTTGATAATGGAAACTATCCTTAAATCAGGAAAGGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATTTAT TCGTTTCTATTATGAAATATGAAATGGATTATGAAATGCTCATGTAGTAAGAGTAGGAATTGATAAACTA AGTACTTAACTTTTAGAGTC

Abbildung C: GenBank-Akzession für ein Fragment der matK/trnK-Region von Acacia caffra GQ872217.1.

83 DANKSAGUNG

9. Danksagung

Bedanken möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Dominik Begerow, der mir einen Platz in der AG Geobotanik geboten hat, um mich diese Arbeit anfertigen zu lassen. Mein besonderer Dank gilt aber vor allem auch meinem Betreuer der Diplomarbeit, Dr. Wolfgang Maier, der stets dafür gesorgt hat, dass mir auch ja nicht langweilig wird, ...und überhaupt!

Nicht vergessen möchte ich auch Dr. Martin Kemler: Die Sammelreise mit dir war schlicht cool.

Maretha VanderMerwe möchte ich danken für das Zusenden der südafrikanischen Proben sowie Dr. Martin Coetzee vom FABI für die tolle Organisation während der Sammelreise in Südafrika.

Außerdem möchte ich mich bei all den anderen Mitgliedern der AG Geobotanik insbesondere für die tofte Atmosphäre während der letzten Monate, Jahre bedanken!! Aber natürlich auch für die zahlreichen Hilfestellungen und Anregungen die sie mir gegeben haben.

Last but not least danke ich meinen Eltern, die mich während der gesamten Zeit meines Studiums in jeglicher Hinsicht unterstützt haben. Ach, und Franzi, DANKE, dass du so viel Geduld mit mir hattest!

84 ERKLÄRUNG

10. Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die heute eingereichte Diplomarbeit selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt sowie Zitate kenntlich gemacht habe. Bei der vorliegenden Diplomarbeit handelt es sich um vier in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Erstgutachter ist: Prof. Dr. Dominik Begerow Als Zweitgutachter schlage ich vor: Prof. Dr. Ulrich Kück

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