EFEITO GENOTÓXICO NOS ERITRÓCITOS DE CAMUNDONGOS TRATADOS COM CREOLINA VIA ORAL
Fabiane Luizetti RESUMO: A creolina, um composto de hidrocarbonetos, fenol e cresóis, é utilizada como desinfetante de eficácia comprovada Zootecnista e Médica Veterinária, Mestre, Discente contra várias bactérias. A creolina também faz parte de do curso de Especialização em Análises Clínicas do experimentos recentes, não como fator de intoxicação, mas na Centro Universitário de Maringá - CESUMAR; E- -mail: [email protected] cura de feridas e sobre reparação tecidual, apresentando uma cicatrização do ferimento, com acentuada neovascularização e Caroline Scilovski Avancini reepitelização. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito genotóxico da creolina nas células sanguíneas de camundongos Farmacêutica; Discente do curso de Especialização através do teste do micronúcleo. Foram utilizados 16 camundongos em Análises Clínicas do Centro Universitário de fêmeas adultas, divididas em 3 grupos, sendo o primeiro, o grupo Maringá - CESUMAR; E-mail: krolscilovski@ controle positivo onde foi administrado ciclofosfamida em hotmail.com dosagem única de 50mg/kg. O segundo grupo recebeu solução Jeronimo Perez Vargas Filho fisiológica 0,9%, como controle negativo e o terceiro grupo foi tratado com a creolina. A eutanásia foi realizada 48 horas Discente do curso de Medicina Veterinária do após os tratamentos e as lâminas confeccionadas com sangue Centro Universitário de Maringá - CESUMAR; intracardíaco, avaliando 1.000 eritrócitos policromáticos para a e-mail: [email protected] contagem de micronúcleos. Na concentração testada, a creolina é uma substância genotóxica capaz de induzir alterações no DNA Tatiane Garcia da Silva celular provocando a formação de micronúcleos residuais. Médica Veterinária; E-mail: tati.garcia.veterinaria@ gmail.com PALAVRAS-CHAVE: Genotoxidade; Creolina; Células Sanguíneas; Micronúcleo Mirian Ueda Yamaguchi
Farmacêutica, Doutora, Docente do curso de GENOTOXIC EFFECT IN ERYTHROCYTES Farmácia, Biomedicina, Especialização em Análises OF MICE TREATED ORALLY WITH Clínicas do Centro Universitário de Maringá - CREOLIN CESUMAR, Mestrado em Promoção da Saúde; e-mail: [email protected] ABSTRACT: Creolin is a hydrocarbonate, phenol and cresol compound used as a highly efficient disinfectant against several bacteria. Creolin has recently been used in experiments in the cure of wounds and tissue recovery. In fact, it features wound healing with neo-vascularization and re-epithelization. Current analysis evaluates the genotoxic effect of creolin in mice’s blood cell by micronucleus test. Sixteen female mice were employed and divided into three groups. The first group was the positive control to which cyclophosphamide at a single dose of 50mg/ kg was administered. The second group received a physiological solution 0.9%, as negative control. The third group was treated with creolin. Euthanasia occurred 48 h after treatment and laminas with intracardiac blood were investigated by evaluating 1000 polychromatic erythrocytes for micronucleus counting. Within the concentration tested, creolin is a genotoxic compound that induces alteration in cell DNA and causes the formation of residual micronuclei. 434 Efeito Genotóxico nos Eritrócitos de Camundongos Tratados com Creolina Via Oral
KEYWORDS: Genotoxicity; Creolin; Blood Cells; de roedores. O grupo que recebeu o tratamento Micronucleus. tópico com hidrocarboneto mostrou uma cicatrização completa do ferimento, com acentuada INTRODUÇÃO neovascularização, reepitelização e presença de fibras colágenas quando comparado ao grupo controle que A creolina, um composto de hidrocarbonetos, recebeu solução fisiológica. fenol e cresóis, é utilizada como desinfetante de Zachiewicz (2003), em estudo sobre a eficácia comprovada contra algumas bactérias automedicação de pacientes com doenças crônicas como Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, (HIV, Chagas e Paracoccidioidomicose), verificou que Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes e Escherichia a ingestão da creolina ocorre com baixa frequência coli. na tentativa de auxiliar a prescrição médica em busca Os cresóis são conhecidos por pertencer a da cura e também para reduzir os efeitos colaterais um grupo de compostos químicos fenólicos que provocados pelos medicamentos em uso. agem sobre o protoplasma de células bacterianas e A análise citogenética permite avaliar os danos dos mamíferos causando desnaturação e precipitação provocados no DNA ou nos cromossomos após uma de proteínas (GORNIAK; SPINOSA, 2003). A exposição a agentes nocivos. Uma vez identificados exposição ao composto geralmente ocorre em níveis os agentes, ações para diminuir sua presença no meio muito baixos, mas, quando são respirados, ingeridos ambiente ou para proteger a população contra eles ou aplicados na pele em níveis muito elevados, podem minimizar as consequências sobre a saúde podem ser muito prejudiciais (HANSEN, 2006). das pessoas (MARTINO-ROTH et al., 2002). Spiller, Quadrani-Kushner e Cleveland Uma parte experimental na confirmação e (1993) avaliaram os efeitos da exposição a liberação de uso de medicamentos é a avaliação da desinfetantes fenólicos numa revisão retrospectiva, capacidade mutagênica e genotóxica da substância onde os principais efeitos encontrados em pacientes em questão. Esse procedimento pode ser realizado após a exposição oral foram uma rápida depressão com sucesso através do teste de micronúcleo. do sistema nervoso central, vômito, tosse, prurido e A mutagênese é determinada quando ardência; entretanto, nenhuma avaliação ou coleta de ocorre uma alteração espontânea ou induzida amostras foram feitas diretamente com os pacientes por agentes físicos ou químicos (LEWIN, 2001) e o risco de contaminação corrosiva e sistêmica e está relacionada ao desenvolvimento do câncer não foram mensurados. Segundo Hansen (2006) os (DE FLORA; IZZOTTI apud GOMES, 2008); cresóis produzem ainda danos ao coração, fígado, entretanto, o desenvolvimento da doença envolve rins, anemia, paralisia facial, coma e morte. mais fatores que apenas uma mutação no material A creolina também faz parte de experimentos genético (ALBERTS et al., 2002). Já a citotoxicidade recentes não como fator de intoxicação, mas na ocorre em nível celular, onde os testes avaliam se a cura de feridas. Miller e Rodríguez (2010) utilizaram viabilidade celular foi ou não afetada pela substância a creolina líquida sobre as feridas causadas por em questão, e tal viabilidade é inferida através da “Tungiasis”, uma infecção cutânea causada pelo atividade mitocondrial (GOMES, 2008). parasita Tunga penetrans. A parasitose foi controlada A genotoxicidade pode ser avaliada de acordo tanto em humanos como em cães, levando os com a interação do agente mutagênico com o DNA, pacientes à cura. sendo a capacidade de ligação ao DNA avaliada Em estudo sobre reparação tecidual, pela observação de aductos no DNA, a capacidade Barbudo et al. (2001) utilizaram um hidrocarboneto de quebra pelo teste cometa e a capacidade de alifático sobre feridas cutâneas provocadas no dorso
Revista Saúde e Pesquisa, v. 5, n. 3, p. 433-440, set./dez. 2012 - ISSN 1983-1870 Luizetti, Avancini, Vargas-Filho, Silva, Yamaguchi 435 Originais Artigos induzir mutações cromossômicas através do teste Foram utilizados 16 camundongos (Mus do micronúcleo ou aberrações cromossômicas musculus) da linhagem Swiss, fêmeas, com 15 semanas (GOETHEM; LISON; KIRSCHI-VOLDERS apud de vida e peso médio de 28g, provenientes do GOMES, 2008). biotério da Universidade Estadual de Maringá. Os A formação de micronúcleos é resultante animais passaram por período de adaptação de 6 da ação de agentes clastogênicos, que promovem dias, recebendo água e ração comercial ad libitum. quebras cromossômicas, bem como alterações na Foi utilizado fotoperíodo de 12 horas de luz fibra do fuso mitótico, que interfere na migração e 12 horas de escuro, em temperatura média de 23ºC. provocando a perda do cromossomo durante a Os animais foram divididos em três divisão celular, denominada aneugênese (GOMES, grupos, sendo o primeiro o grupo controle 2008) positivo, composto por 6 camundongos, onde foi Os agentes genotóxicos interferem durante administrado ciclofosfamida em dosagem única a replicação e divisão do DNA acarretando em de 50mg/kg, que induz a atividade carcinogênica erros e danos ao cromossomo. Assim o material nas células. O segundo grupo, composto por 4 genético pode se separar de forma desigual sendo camundongos, recebeu 0,3mL de solução fisiológica então excluído ou não incorporado corretamente 0,9%, como controle negativo, e o terceiro grupo, no núcleo da célula-filha, originando um núcleo composto por 6 camundongos, foi tratado com a de menor dimensão designado de micronúcleo creolina numa dosagem de 0,0016mL do produto/ (FENECH, 2002). grama de peso corpóreo animal, considerando uma Os micronúcleos são encontrados em concentração de 0,56ml de hidrocarboneto em 1mL uma grande variedade de células da medula óssea: de creolina, diluída em 0,3mL de solução fisiológica. mieloblastos, mielócitos e eritrócitos. No entanto, A administração dos compostos foi feita através de são principalmente observados nos eritrócitos gavage, introduzindo a agulha especial pela boca até o policromáticos (jovens), que durante um período de estômago do animal, sendo a via similar a ingestão 24 horas se “coram em azul-acinzentado basofílico acidental ou intencional da substância testada. com Giemsa” (LEDEBUR; SCHMID apud SILVA; A dose teste da creolina foi estabelecida NEPOMUCENO, 2010; HEDDLE et al., 1983) em um ensaio prévio que determinou a DL50 da Após a expulsão do núcleo, o eritrócito substância seguindo a Resolução Normativa nº 425 propriamente dito cai na circulação sanguínea e da OECD (2001). os micronúcleos formados ainda permanecem A formação dos micronúcleos ocorre no citoplasma. Dessa forma se forem contados apenas em células eucarióticas em divisão, ou seja, é apenas os eritrócitos policromáticos, há uma maior necessário conhecer a cinética da divisão celular da segurança de que os micronúcleos foram formados espécie para pode fazer uma análise quantitativa dos na mitose anterior, na presença do agente mutagênico micronúcleos (FENECH, 2000) independente do (HEDDLE, 1973). cariótipo envolvido (HAYASHI et al., 1998). O objetivo, neste estudo, foi avaliar, através O tempo necessário para a formação dos do teste do micronúcleo, o potencial genotóxico micronúcleos após o tratamento varia, segundo da substância creolina, administrada via oral em os autores, principalmente devido às espécies camundongos. trabalhadas. Em sangue periférico de ratos, Primo et al. (2010), comparando a coleta com 24 e 48 horas após 2 MATERIAIS E MÉTODOS o tratamento, observaram que em 48 horas o número
Revista Saúde e Pesquisa, v. 5, n. 3, p. 433-440, set./dez. 2012 - ISSN 1983-1870 436 Efeito Genotóxico nos Eritrócitos de Camundongos Tratados com Creolina Via Oral de micronúcleos formados era maior. Ribeiro et al. permanecem policromáticos por 10 a 24 horas, que (2009) testou os animais com 48 e 72 horas e observou fornece uma coloração azulada devido à presença que ocorre uma queda na produção de micronúcleos de RNA no citoplasma. A contagem de eritrócitos após as 48 horas. Outros autores como Sewerynek policromáticos garante que os micronúcleos et al. (1996) e Vilar et al. (2008), encontraram que formados são devido à mitose anterior que estava na o pico de produção de micronúcleos ocorre de 36 presença do agente mutagênico, pois o período entre a 48 horas, que concorda com Vikram, Ramarao e a última divisão celular e a formação do eritrócito Jena (2007) em seu experimentos com ratos. Por isso policromático é de 8 a 12 horas (ALMEIDA NETO foi estabelecido, neste estudo, o período de 48 horas et al., 2005). É por esse motivo que a maioria dos para a coleta da amostra. trabalhos realizados com pesquisa de micronúcleos MacGregor, Wehr e Gould (1980) verificaram utiliza uma aplicação única do agente mutagênico, que o pico de incidência dos micronúcleos no sangue, observando os resultados em 24 ou 48 horas após ocorre 24 horas após o pico encontrado na medula o tratamento porque os policromáticos aparecem óssea. O equilíbrio de eritrócitos policromáticos na na circulação e sofrem maturação nesse período medula óssea e no sangue é atingido de 2 a 3 dias, (SCHIMID, 1975). respectivamente, após a administração do indutor Após 48 horas da indução dos tratamentos, mutagênico (COLE et al., 1981). Já os eritrócitos os animais receberam uma dose de 120mg/kg de normocromáticos levam cerca de 35 dias para sua tiopental (via intraperitoneal) como processo de estabilização no sangue periférico (MACGREGOR anestesia para a coleta de sangue. A eutanásia foi et al., 1990). realizada através de deslocamento cervical de cada O ensaio de micronúcleos com sangue animal, como prevê a Resolução nº 876 do Conselho periférico se mostra vantajoso em relação ao teste Federal de Medicina Veterinária (2008) para não através da medula óssea, devido à facilidade no haver interação do anestésico inalatório nos tecidos preparo das lâminas, o uso de pouca quantidade e sangue dos animais. Estes passaram por necrópsia de sangue, possibilidade de avaliação do mesmo para avaliação dos órgãos, principalmente fígado. animal em diversos intervalos, fácil contagem, O sangue coletado através de punção entre outros (MACGREGOR; WEHR; GOULD, cardíaca foi homogeneizado com EDTA na 1980; SCHLEGEL; MACGREGOR, 1984; proporção de 0,1mL/5mL de sangue para então MAVOURNIN; BLANKEY; CIMINO, 1990). ser feito o esfregaço na lâmina. As lâminas foram A medula óssea costuma ser o material secas ao ar por 24 horas e então coradas com May- escolhido para a análise do micronúcleo, por Grunwald-Giemsa, para a contagem de 1.000 células ser o local da produção das células sanguíneas policromáticas. (eritropoiese que ocorre em apenas 24 horas), mas A análise estatística dos dados foi realizada a avaliação através da circulação periférica é indicada por meio de ANOVA Bayesiana, utilizando-se o em camundongos, pois as células micronucleadas software WinBUGS (SPIEGELHALTER et al., 2007). são facilmente detectadas no sangue (SCHLEGEL; O nível de significância assumido foi de 5%. MACGREGOR, 1984; RAMIREZ-MUNOZ et al., 1999) e não são eliminadas, pois seu baço não possui a capacidade de retirar as células micronucleadas 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES da circulação (MACGREGOR; WEHR; GOULD, 1980). O grupo 1 foi tratado com a ciclofosfamida, Após a formação dos eritrócitos, estes um agente clastogênico (que promove a quebra do
Revista Saúde e Pesquisa, v. 5, n. 3, p. 433-440, set./dez. 2012 - ISSN 1983-1870 Luizetti, Avancini, Vargas-Filho, Silva, Yamaguchi 437 Originais Artigos cromossomo) utilizado no tratamento de câncer ciclofosfamida. e neste trabalho, como indutor de micronúcleos Os valores referentes a ratos e camundongos (RIBEIRO et al., 2009). Foi encontrada uma são diferentes devido à capacidade do rato em média de 17,62 micronúcleos. O grupo 2, tratado eliminar as células defeituosas da circulação sanguínea com solução fisiológica, também apresentou por outras vias além do baço, maximizando sua micronúcleos, mas numa quantidade inferior ao eficiência de limpeza, e, assim, os camundongos controle positivo. O controle negativo apresentou apresentam maior número de células micronucleadas média de 3 micronúcleos por animal que já era um na circulação periférica (MACGREGOR; WEHR; valor esperado e o grupo 3, tratado com a creolina, GOULD, 1980). apresentou média de 14,63 micronúcleos, como pode ser observado na tabela 1.
Tabela 1 Número de micronúcleos encontrados nos eritrócitos policromáticos nos esfregaços sanguíneos da punção cardíaca de camundongos após 48 horas do tratamento. Tratamento Nº animais Total MN Média ± desvio Controle positivo 6 106 17,62 ± 0,02 a Controle negativo 4 12 3,02 ± 0,01 b Tratado creolina 6 88 14,63 ± 0,01 a Letras diferentes entre os grupos significam que as médias diferem.
Como o intervalo de credibilidade de 95% Bueno e Agostini (2001) verificaram que para o grupo controle positivo-grupo controle o valor médio de micronúcleos em eritrócitos negativo foi de (-1,53; 7,70), exclui a possibilidade policromáticos no controle negativo varia de 1 a de existir diferença entre esses grupos tratados, pois 3,5 micronúcleos. Alves Júnior (1999) encontrou inclui o valor 0 (zero). Para as demais comparações um valor médio de 3 micronúcleos, semelhante ao conclui-se que as médias são distintas. resultado encontrado neste trabalho, que foi de 3 Os valores encontrados para o controle micronúcleos em lâminas de sangue cardíaco. positivo feito com a ciclofosfamida foram Os números de micronúcleos encontrados semelhantes aos valores encontrados por outros no controle positivo e negativo concordam com as autores como Andrade et al. (2008), que contaram médias encontradas por vários autores referenciados 1.000 células policromáticas na medula óssea de anteriormente e, por tal motivo, o resultado camundongos e encontraram um número de 18,8 observado para a creolina, de 14,63 micronúcleos, micronúcleos após 24 horas do tratamento. Primo et é confiável para afirmar que a substância tem al. (2010), contabilizando 2.000 células policromáticas capacidade genotóxica. de camundongos, encontraram 26,44 e 24,56 Não há trabalhos disponíveis relacionando a micronúcleos em 24 e 48 horas após o tratamento, ingestão de creolina com a formação de micronúcleos, respectivamente, concordando com Yamaguchi entretanto é fato que pessoas fazem uso da substância et al. (2010), que observaram 27 micronúcleos para vários procedimentos como a ingestão e uso para o controle positivo após as 24 horas do em animais, podendo levar a intoxicação aguda tratamento. Ribeiro et al. (2009) encontraram 21,3 e morte. É necessário um estudo mais amplo, micronúcleos em 2.000 eritrócitos policromáticos na considerando também o uso crônico da creolina medula de ratos após 24 horas da administração da e avaliar os benefícios relatados pelos usuários,
Revista Saúde e Pesquisa, v. 5, n. 3, p. 433-440, set./dez. 2012 - ISSN 1983-1870 438 Efeito Genotóxico nos Eritrócitos de Camundongos Tratados com Creolina Via Oral visando relacionar vantagens e desvantagens do uso BUENO, A. M. S.; AGOSTINI, J. M. S. da sustância. Estabelecimento de um controle histórico da frequência de eritrócitos micronucleados em camundongos da linhagem Swiss, do 4 CONSIDERAÇÕES FINAIS Biotério Central da UFSC. 2001. 24 f. Relatório Final. Universidade Federal de Santa Catarina, O teste do micronúcleo é um dos primeiros Departamento de Biologia Celular, Embriologia e parâmetros a ser avaliado para o uso de uma Genética, Florianópolis, out. 2001. substância nos seres vivos. A creolina, administrada CFMV. Conselho Federal de Medicina Veterinária. por via oral, apresentou-se como uma substância Resolução nº 876 de 15 de fevereiro de 2008. genotóxica capaz de induzir alterações no DNA Dispõe sobre procedimentos e métodos de eutanásia celular provocando a formação de micronúcleos em animais. Brasília: [s.n.], 2008. residuais. Entretanto, trabalhos futuros devem ser COLE, R. J. et al. Short-term tests for transplacentally realizados a fim investigação para uso em tratamentos active carcinogens I. micronucleus formation in fetal de aplicação tópica e crônica. and maternal mouse erythroblasts. Mutat. Res., v. 80, p. 141-157, 1981.
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Recebido em: 29 de novembro 2011 Aceito em: 11 de abril 2012
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