Diversität und Zusammensetzung grüner Biofilme an Gebäuden

Diplomarbeit

vorgelegt von

Imke Lang aus Wardenburg

angefertigt am Albrecht-von Haller-Institut für Pflanzenwissenschaften Experimentelle Phykologie und Sammlung von Algenkulturen an der Fakultät für Biologie

der Georg-August-Universität zu Göttingen

2003

Referent: Prof. Dr. Thomas Friedl Korreferent: Prof. Dr. Gerhard Braus

Tag der Abgabe der Diplomarbeit: 23. Juni 2003 Letzter Tag der mündlichen Prüfung: 25. Juni 2002 Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1 1.1 Aerophytische Grünalgen 1 1.2 Zielsetzung 3 1.3 Phylogenie der Grünalgen 4 1.4 Methoden zur Untersuchung von Biodiversität 5

2 Material und Methoden 8 2.1 Algenkulturen 8 2.1.1 Probennahme für die Isolierung der Algen und 8 Molekulargenetischen Untersuchungen 2.1.2 Kultur-Medium 10 2.1.3 Isolierung der Algen 11 2.1.4 Kultur der isolierten Algen 11 2.1.5 Test auf Kontamination 12 2.2 Genetische Untersuchungen 13 2.2.1 Extraktion genomischer DNA mit dem 13 Puregene DNA-Purification Kit 2.2.2 Agarosegelelektrophorese und Färbung mit Gel Star und Ethidiumbromid 14 2.2.3 Quantifizierung der DNA und PCR-Produkte 15 2.2.4 Amplifikation der 18S rDNA Region 16 2.2.5 Aufreinigung der PCR-Produkte mit Kit 18 2.2.6 Transformation mit dem TOPO TA Cloning® Kit 19 2.2.7 colony screen 21 2.2.8 Minipräparation der Plasmid-DNA aus den 22 positiven Klonen 2.2.9 Reinigen der PCR-Produkte mittels Fällung 22 2.2.10 PCR-RFLP 23 2.3. DNA-Sequenzierung 24 2.4 Auswertung 27 2.4.1 Sequenzen 27 Inhaltsverzeichnis II

2.4.2 Sequenz-Alignment 28 2.4.3 Phylogenetische Analyseverfahren 28

3 Ergebnisse 3.1 Klonierung 31 3.2 PCR-RFLP 32 3.3 Phylogenetische Analysen 49 3.3.1 18S rDNA Sequenzierung der Klonbanken 49 3.3.2 18S rDNA Sequenzierung der Algenisolate 53 3.3.3 Phylogenetische Analysen der 18S rDNA 55 3.3.4 Vorkommen eines Introns 67 3.4 Algenkulturen 68

4 Diskussion 88 4.1 Methoden 89 4.1.1 DNA-Extraktion, PCR und Klonierung 89 4.1.2 PCR-RFLP 90 4.1.3 18S rDNA-Sequenzierung 92

4.2 Vielfalt der Algen 95 4.2.1 Phylogenie der isolierten Algenkulturen und 95 Algenklone 4.2.2 Morphologie der isolierten Algenkulturen 100

5 Zusammenfassung 104

6 Literaturverzeichnis 106

7 Anhang 111

Einleitung 1

Einleitung

1.1 Aerophytische Grünalgen

Unter aerophytischen Algen versteht man solche, die epiphytisch auf Baumrinden, Gemäuern, Blättern und Moosen wachsen oder in Symbiose mit Flechtenpilzen leben. Die Kenntnisse von Biologie und Systematik aeroterrestrischer Algen sind trotz einiger vorhandener Arbeiten gering (GÄRTNER 1994).

LINNÉ (1734) benannte grüne Algen an Baumrinden „Byssus viridis“, traf jedoch keine

Aussagen über Einzelheiten (VISCHER 1960). Später wurde eine Rindenalge von

MENEGHINI 1842 als Pleurococcus bezeichnet, weitere Beschreibungen und Namen folgten. RABENHORST beschrieb 1868 bis zu zwanzig verschiedene „Arten“ von

Pleurococcus (VISCHER, 1960). Die grünen Algenanflüge an Rinden, Mauern und Holz sollten nach früheren Autoren immer auf eine Gattung, nämlich Pleurococcus, zurückzuführen sein. Erst nach gründlichen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es sich keineswegs immer um die gleiche Zusammensetzung von Algen oder gar nur um eine Art handelte, sondern dass durchaus verschiedene Arten und Gattungen in solchen grünen Biofilmen vorzufinden waren. Jedoch sollten Grünalgen, die als Pleurococcus oder Protococcus bezeichnet wurden, den Hauptteil der Algenmasse ausmachen (BRAND 1925).

In seiner Arbeit konzentrierte sich BRAND auf „protopleurococcoide“ Algen, legte Kulturen an und beschrieb einige charakteristische Vertreter aerophytischer Algen, wie

Apatococcus vulgaris BRAND und Desmococcus vulgaris BRAND EM. GEITLER.

BRAND vermutete, dass aufgrund der verschiedenen Witterungsbedingungen und der Jahreszeiten, immer gerade die Arten vorherrschen, die sich als besonders widerstandsfähig erwiesen. So seien besonders artenreiche Algenfilme nur ein vorübergehender Zustand, da das Vordringen der besser angepassten Arten sich sehr langsam vollziehe und bis dahin noch eine gleichmäßige Verteilung der Arten vorzufinden sei. Zudem seien viele der Algen aus den Biofilmen keine aerophytischen Algen, sondern es können auch terrestrische und limnische Arten in Form von Aplanosporen oder Zoosporen durch Regenwasser oder Tiere an die Standorte gelangen. Mikroskopische Untersuchungen zeigen, dass die Morphologie vieler Mikroalgen aus terrestrischen Lebensräumen kaum zu unterscheiden ist und mangelnde Einleitung 2

Bestimmungsliteratur und fehlendes Vergleichsmaterial zudem die Bestimmung der Algen schwierig machen. Folglich ist die Kenntnis über den Artenbestand aeroterrestrischer grüner Algenanflüge an verschiedenen Standorten noch sehr mangelhaft und bedarf weiterer Erforschung

(GÄRTNER 1994). Aeroterrestrische Algen finden jedoch zunehmend Aufmerksamkeit, da sie für die Biokorrosion von Gebäuden verantwortlich gemacht werden. Nach der Wiedervereinigung wurden in Ostdeutschland viele Gebäude (Plattenbauten) mit Wärmedämmsystemen ausgestattet, woraufhin die bauphysikalischen Eigenschaften der Wände verändert wurden. So können diese Gebäude nicht mehr „atmen“, d.h. die Verdunstungsvorgänge werden verhindert. Dies hat zur Folge, dass sich an der Oberfläche der Wände durch Kondensation

Wasser ansammelt (VEZMER et al. 2001). Dies begünstigt die Besiedlung durch Mikroalgen. Der Bewuchs von Dachziegeln und Gebäudefassaden durch aeroterrestrische Algen führt nicht nur zu einer optischen Beeinträchtigung, sondern durch die Ausscheidung von organischen Säuren oder Komplexierung von Calcium und Magnesium-

Ionen zu einer beschleunigten Verwitterung (WELTON et al. 2003). Sie stellen also ein großes Problem für die Bauwirtschaft da. Um entsprechende umweltverträgliche Bekämpfungsstrategien zu entwickeln, ist die Kenntnis über die Taxonomie und Ökophysiologie dieser Algen notwendig. Aufgrund der hohen Sonneneinstrahlung und der starken Temperaturschwankungen sowie unterschiedlicher Wasserverfügbarkeit ist das Dach ein extremer Standort. Die Algen, die dort wachsen können, müssen also Strategien entwickeln haben, sich an diesen Standort anzupassen. Die Dachziegelalgen sind also sowohl in phylogenetischer als auch physiologische Hinsicht interessant sein.

Einleitung 3

1.2 Zielsetzung

In dieser Arbeit soll die Diversität und artliche Zusammensetzung grüner Biofilme auf Dachziegeln und deren Herkunft, durch die Untersuchung einiger Vergleichsstandorte analysiert werden. Anhand der mikroskopischen Untersuchungen zu Beginn der Arbeit wurde deutlich, dass es aufgrund der morphologischen Ähnlichkeit der Dachziegelalgen schwierig war, diese zu identifizieren. Daher reicht es nicht aus Algen zu isolieren, kultivieren und morphologisch zu beschreiben, sondern es soll mit kulturunabhängigen Methoden die phylogenetische Vielfalt der Algen untersucht. Um ein möglichst breites Artenspektrum erfassen zu können, sollen die Biofilmproben zusätzlich in Durchlüftungskulturen kultiviert werden. Algenarten, deren Wachstum auf den Dachziegeln durch andere Arten unterdrückt wird, die sich aber in der Durchlüftungskultur anreichern, können dadurch erfasst werden. Als Vergleichsstandorte sollen ein Straßenpfeiler und der Betonsockel eines Gartenzauns untersucht werden. Von allen Standorten werden Klonbanken angelegt und analysiert. Die Klone sollen mit der Fingerprint-Methode PCR-RFLP nach Schnittmustern gruppiert und jeweils ein Klon pro RFLP-Gruppe für die phylogenetischen Analysen sequenziert werden. Aus dem Standortmaterial und den angelegten Durchlüftungskulturen sollen Algen isoliert und kultiviert werden. Unialgale Kulturen sollen dann morphologisch beschrieben werden und deren phylogenetische Stellung durch 18S rDNA-Sequenzierung ermittelt werden.

Dieser Arbeit liegen Vorarbeiten zur Biodiversität auf Dachziegeln (E. ZUFALL-ROTH) aus der Arbeitsgruppe und Analysen von Gebäudefassaden in Rostock (AG KARSTEN, Uni Rostock) zugrunde. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen bei den phylogenetischen Analysen und der Frage über die Herkunft der Dachziegelalgen berücksichtigt werden.

Einleitung 4

1.3 Phylogenie der Grünalgen

Grüne Pflanzen (Viridiplantae sensu CAVALIER-SMITH 1981) werden in zwei monophyletische Schwestergruppen gegliedert: die Chlorophyta und die Streptophyta

(KAROL et al. 2001, MELKONIAN & SUREK 1995, FRIEDL 1997; CHAPMAN et al. 1998). Die Chlorophyta werden im Wesentlichen in vier Linien unterteilt: die Trebouxiophyceae, Chlorophyceae und Ulvophyceae als drei große monophyletische Linien und die Prasinophyceae als nicht-monophyletische Klasse, die an der Basis der Chlorophyta steht

(FRIEDL 1998). Die Streptophyta enthalten die Embryophyta (höhere Landpflanzen) und mehrere Grünalgenlinien, die vorwiegend den Charophyceae sensu MATTOX & STEWART zugeordnet werden (MARIN & MELKONIAN, 1999).

1) Zu der Klasse der Trebouxiophyceae werden vorwiegend kokkale Grünalgen gezählt die häufig aus terrestrische Habitaten oder Flechtensymbiosen stammen (FRIEDL 1998). Das Merkmal Begeißelung ist mehrmals innerhalb der Trebouxiophyceae verloren gegangen (FRIEDL 1997), aber wenn sie vorhanden sind, dann ist die Orientierung der Basalkörper in 11 Uhr/ 5Uhr Richtung. 2) Zu den Chlorophyceae werden diejenigen Grünalgen gezählt, deren begeißelte Zellen Basalkörper in der 1Uhr/7Uhr-Orientierung besitzen (clockwiseÆCW-Gruppe), aber auch solche mit 12Uhr/6Uhr Orientierung (directly opposedÆDO-Gruppe). In dieser Gruppe kommen sowohl monadoide als auch kokkale oder fadenförmige Algen vor. 3) Die Ulvophyceae beinhalten vor allem marine Vertreter und unterscheiden sich in der

Basalkörperorientierung (11Uhr/5Uhr) von den Chlorophyceae (FRIEDL 1998). 4) Zu den Prasinophyceae werden begeißelte einzellige Grünalgen gezählt, die sich jedoch morphologisch nicht deutlich von begeißelten Stadien anderer Grünalgenlinien unterscheiden. Nach 18S rDNA-Sequenzanalysen bilden sie keine einheitliche Gruppe.

Einleitung 5

1.4 Methoden zur Untersuchung von Biodiversität

Für die Untersuchung der Biodiversität eines Standortes bietet es sich an, das Freilandmaterial zu mikroskopieren und die darin vorkommenden Algen zu bestimmen. Da die aeroterrestrischen Algen aber oftmals sehr merkmalsarm sind, ist es schwierig die Arten voneinander zu unterscheiden. Eine weitere Möglichkeit zur Untersuchung von Diversität ist die Kultivierung isolierter Algen aus dem Freilandmaterial. Dabei werden jedoch Algen, die schlecht oder gar nicht in Kultur wachsen, von der Untersuchung ausgeschlossen. Mit beiden Methoden kann also aufgrund der geringen morphologischen Vielfalt nur ein kleiner Teil der Arten erfasst werden. Daher eignen sich für solche Untersuchungen Sequenzanalysen, um die genetische Diversität der Algen im Biofilm zu ermitteln. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass morphologisch kaum unterscheidbare Mikroalgen durchaus große genetische Unterschiede aufweisen und nach phylogenetischen

Analysen in ganz verschiedene Gruppen eingeordnet werden können (FRIEDL 2002).

Die Erforschung der Biodiversität und Ökologie von Mikroorganismen in ihren natürlichen Habitaten mit molekularbiologischen Methoden begann Mitte der achtziger Jahre. Seitdem kann die Zusammensetzung von solchen Lebensgemeinschaften auch ohne Isolierung der Organismen untersucht werden, so dass folglich von vielen Mikroorganismen nur molekularbiologische Daten vorliegen (HEAD et al., 1997). So wird es möglich, Organismen zu erfassen, die sich schwer oder gar nicht kultivieren lassen. In der Mikrobiologie war es lange Zeit ein Problem, die Ökologie von Bakterien zu erforschen, da nur ein geringer Anteil der Mikroorganismen, ca. 0,1-10%, sichtbar, bzw. kultivierbar ist. Um repräsentative Aussagen über die Zusammensetzung und physiologische Wechselwirkungen in mikrobiologischen Lebensgemeinschaften treffen zu können, mussten Methoden entwickelt werden, mit denen es möglich war, viele der beteiligten Organismen zu identifizieren und darüber hinaus Aussagen über ihre

Stoffwechselphysiologie zu machen (HEAD et al. 1997). Ein wichtiger Schritt war die Entdeckung der ribosomalen DNA als molekularen Marker

(WOESE et al. 1977) für die Untersuchung der Phylogenie von Organismen. Die ribosomale DNA ist eine stark konservierte Sequenz im Reich der Pro- und Eukaryoten. Es gibt aber auch variable Sequenzabschnitte, die im Laufe der Evolution Einleitung 6 durch artspezifische Mutationen entstanden sind. Daher eignet sich die ribosomale DNA besonders gut als Markermolekül. Erst durch Verbesserung der Sequenziertechniken konnten auch längere Moleküle wie die 18S rDNA sequenziert werden. Die 18S rDNA ist mit 2000 Basenpaaren lang genug, um ausreichend variable Bereiche zu beinhalten, die für Rückschlüsse auf die Evolution von Organismen wichtig sind. So sind zahlreiche der ausschließlich anhand der rDNA-Sequenzen charakterisierten Mikroorganismen phylogenetisch nah mit bereits bekannten Mikroorganismen verwandt und lassen sich bestehenden Taxa zuordnen. Nicht selten repräsentieren rDNA-Sequenzen jedoch Mikroorganismen neuer Taxa, für die bisher keine oder nur wenige kultivierte

Vertreter beschrieben wurden (GIOVANNONI et al. 1990)

Mittlerweile sind neben der 16S-, bzw. 18S rDNA-Sequenzierung auch weitere Methoden etabliert worden, um die Biodiversität eines Standortes zu erfassen (Abb. a). Eine dieser Methoden ist das Anlegen einer Klonbank. Dabei wird aus dem DNA-Gemisch des Standortmaterials mit der Polymeraseketten-Reaktion (PCR) (SAIKI et al. 1985) z.B. die 18S rDNA DNA amplifiziert. Die PCR-Produkte werden anschließend kloniert, so dass eine Klonbank entsteht, bei der jeder SSU rDNA-Klon das PCR-Produkt eines anderen Organismus enthalten kann. Mit verschiedenen Methoden, wie z.B. PCR-Screen (colony screen) oder Hybridisierung mit rRNA spezifischen Sonden wird die Klonbank auf positive und negative Klone untersucht. Die SSU rDNA der positiven Klone könnte dann mit PCR wiederum amplifiziert werden und so für die Sequenzierung benutzt werden.

Eine weitere wichtige molekulare Markertechnik, die auf SOUTHERN (1975) zurückgeht, ist die RFLP-Methode (Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus). In Kombination mit PCR wird ein ausgewählter amplifizierter DNA-Abschnitt durch Restriktionsverdau fragmentiert und die Fragmente in einer Gelmatrix aufgetrennt. Bereits geringe Veränderungen in der Nukleotidsequenz (Mutationen, Insertion oder Deletion von Nukleotiden) können zu Polymorphismen führen, d.h. es entsteht eine Variation von Schnittstellen für die Restriktionsenzyme und dadurch unterschiedlich lange Fragmente.

Die PCR-RFLP kann eine Alternative zur DNA-Sequenzierung sein (EDWADS, 1998) und bietet sich bei der Untersuchung von biologischer Vielfalt eines Standortes an. Einleitung 7

Abb. a Kombination der Methoden zur Untersuchung der Biodiversität: Isolieren von

Algenkulturen (1, 14-16) und kulturunabhängige Methoden (1-11) (HEAD et al. 1998 von Friedl verändert) Material und Methoden 8

2 Material und Methoden

2.1 Algenkulturen

2.2.1 Probennahme für Isolierung der Algen und molekulargenetische Untersuchungen

Für die Untersuchungen wurden Biofilmproben von verschiedenen Standorten (Tab. 1a und b, Abbildung von Beispielen siehe Anhang) genommen. Dafür wurde mit einem Tropfen Wasser der Biofilm aufgeweicht und mit einem Skalpell und einer Glaspipette kleine Partikel in ein 2 ml Eppendorfgefäß überführt. Die Proben von den acht verschiedenen Dachziegeln (Dachziegel D1, P1, D2, D3, P3, D4,

D5, D6) wurden in Kulturröhrchen mit der Nährlösung MiEB12 (Tab. 2) gegeben und schließlich in jeweils einer Durchlüftungsröhre mit Nährmedium MiEB12 bei 20°C und einer Lichtintensität von 100 µmol m-2 s-1 (µE) kultiviert. In der Durchlüftungskultur ist das Wachstum von Algen gegenüber Pilzen begünstigt, so dass für weitere Arbeitsschritte, die Kontamination durch Pilze eingeschränkt wurde. Von der Straßenpfeiler- und Betonsockelprobe wurden in 200 ml Erlenmeyerkolben

Rohkulturen in Flüssigmedium MiEB12 angesetzt und bei 18 °C und einer Lichtintensität von 85 µE kultiviert. Die Isolierung von Algenkulturen aus dem Biofilm erfolgte von den Dachziegelproben in der Durchlüftungskultur. Nach sechswöchiger Kultivierung wurden von der Algenmischkultur ca. 5 ml zum Mikroskopieren, Isolieren und für die DNA-Extraktion in einen 10 ml Erlenmeyerkolben überführt. Für die molekulargenetischen Untersuchungen wurde zusätzlich zu den Proben aus der Durchlüftungskultur auch das vorliegende Freilandmaterial (Dachziegel, Straßenpfeiler und Betonsockel) verwendet. Die Biofilmproben wurden in 2 ml Reaktionsgefäße überführt und nach Zugabe von 2 ml Puffer B bis zur Weiterbearbeitung bei –20°C aufbewahrt.

Material und Methoden 9

Tab. 1a Standorte der untersuchten Dachziegel Standort Zustand / Alter Dachziegel P1 Unsleben, Franken, Vordach Büro Ziegelrot matt geringer Plüschke Bewuchs, 15.04.1997

Dachziegel P3 Unsleben, Franken, Vordach Büro Ziegelrot matt, geringer Plüschke Bewuchs, bis September 2001 auf dem Dach Dachziegel D1 Schermbeck (46514), Haus Dr. ziegelrot matt, starker Ammenwert, Burgstrasse, Waldrand Bewuchs mit dunklem Biofilm Flachdach-Ziegel natur, vom Dach Ca. 30 Jahre alt Dachziegel D2 Schermbeck (46514), Haus Nelskamp, ziegelrot matt, schwacher Werderstrasse Bewuchs mit dunklem Biofilm R15 vom Dach, 02.06.1999 Dachziegel D3 Schermbeck, Haus Dr. Ammenwert, ziegelrot matt, starker Burgstrasse, Waldrand Bewuchs mit fädigen Algen Flachdach-Ziegel natur, vom Dach

Dachziegel D4 Schermbeck, Lager der Fa. Nelskamp altfarben Engobe Flachdach, - war nie auf einem Dach- von Hach schwarz matt, geringer Bewuchs 06.02.1999 Dachziegel D5 Unsleben, Franken, Gelände des schwarze Engobe (braun Dachziegelwerkes Jessenberger, matt), leichter Wechterswinkler Str. 15 Flächenbewuchs, guter „Lüfterziegel“ aus einem Stapel, aus Bewuchs Lager (Rücklieferung vom Händler) 11.10.1997

Dachziegel D6 Unsleben, Franken, Gelände des graue Glasur glatt, Oberseite Dachziegelwerkes Jessenberger, nicht bewachsen, Unterseite Wechterswinkler Str. 15 mit gutem Bewuchs - war nie auf einem Dach- anfänglicher Belag in Querverfalzung, 18.11.1999

Tab. 1b weitere untersuchte Standorte Kürzel Beschreibung des Standortes Straßenpfeiler Strpf Bayern, Pullach (Kreis München), Jos.-Heppner-Weg, am Straßenrand, grüner Biofilm um das Katzenauge herum, Probennahme am 05.10.2002 Betonsockel B Bayern, Eschenlohe, Betonsockel von Gartenzaun , fädige Algen und einige Flechten, Probennahme am 09.10.2002

Material und Methoden 10

2.1.2 Kultur-Medium

MiEB12 Medium (SCHLÖSSER 1994)

Tab. 2 Micrasterias+Erddekokt+Vitamin B12 -Medium g Stammlösung/ ml Stammlösung/

100 ml H2O 1000 ml Gebrauchslösung Erddekokt X1 20 Torfextrakt X2 10

KNO3 1 10

(NH4)2HPO4 0,2 0,5

CaSO4 gesättigt 10 Spurenelemente 3A X3 0,5

MgSO4 x 7H2O 0,1 10

H2O 930

Nach dem Autoklavieren des Mediums wurden 10 Tropfen Vitamin B12 (0,001 % = 1 Tropfen) zugegeben. Für Schrägagarkulturen wurden zusätzlich zu den oben angegebenen Reagenzien vor dem Autoklavieren 15 g Agar/ 1000ml zugegeben.

Erddekokt (X1) (SAG)

Torfextrakt (X2) (SAG)

Spurenelemente 3A (X3)

1000 ml Spurenelemente 3A: 1. 781,0 ml H2O bidest. 19,0 ml Salze (Tab.2) 100 ml EDTA-Lösung ( M??)

Æ 200 ml H2O bidest + 0,75 g EDTA (durch langsames Erwärmen in Lösung bringen)

2. 100 ml EDTA-Lösung

0,7 g FeSO4 x 7H2O Die beiden Lösungen wurden getrennt voneinander autoklaviert und nach dem Erkalten zusammengefügt. Material und Methoden 11

Tab. 3 Salze für die Spurenelemente 3A Salze Stammlösung (100ml) ad 1000 ml

ZnSO4 x 7H2O 0,1 g 1 ml (= 0,001g)

MnSO4 x 4H2O 0,1 g 2 ml (= 0,002 g)

H3BO3 0,2 g 5 ml (= 0,01 g)

Co(NO3)2 0,02 g 5 ml (= 0,001 g)

Na2MoO4 x 2H2O 0,02 g 5 ml (= 0,001 g)

CuSO4 x 5H2O 0,0005 g 1 ml (= 0,000005 g)

2.1.3 Isolierung der Algen Für die Isolierung der Algen aus den Durchlüftungskulturen wurden mehrere

Mikrotiterplatten („96 well plates“, Fa. FALCON) mit 250 µl flüssigem MiEB12-Medium pro Kammer („well“) vorbereitet.

Die Isolierung erfolgte am Binokular (Stemi SV 11, FA. ZEISS) im Dunkelfeld. Das

Algengemisch wurde zunächst in einen Tropfen sterilen MiEB12-Medium pipettiert. Mit einer ausgezogenen sterilen Glaskapillare wurde mittels Kapillarkraft zunächst Medium und dann bei nachlassender Saugkraft einzelne Algenzellen aufgesogen. Durch Tropfenwaschung wurden die Algen vereinzelt, so dass letztendlich nur eine Algenzelle in eine Kammer der Mikrotiterplatte pipettiert wurde. Die isolierten Algen wurden bei 20°C und 35 µE kultiviert bis ausreichend Zellen vorhanden waren, um damit Schrägagar zu beimpfen. Die Algenstämme wurden nach der Durchlüftungskultur und der Koordinate des „well“ in dem es kultiviert wurde benannt (z.B. der Algenstamm D5-A4: Durchlüftungskultur D5, „well“ A4).

2.1.4 Kultur der isolierten Algen

Die Kultivierung der isolierten Kulturstämme erfolgte auf Schrägagar (MiEB12) in Reagenzgläsern. Die Algen wurden bei einer Temperatur von 20°C kultiviert. Die Lichtintensität betrug 35 µE.

Material und Methoden 12

2.1.5 Test auf Kontamination

Die isolierten Algenstämme wurden vor der Sequenzierung auf Kontaminationen durch Pilze und Bakterien getestet. Dafür wurden neben der lichtmikroskopischen Überprüfung die Algen auf TOM-Medium (Tab. 4) ausgestrichen, das besonders kohlehydratreich ist und das Wachstum von Pilzen und Bakterien begünstigt.

Tab. 4 TOM-Medium Stammlösung ml Stammlösung/

g/500 ml H2O bidest. 1000ml Gebrauchslösung NaCl 1,25 10

CaCl2 x7H2O 1,25 10

KNO3 25 10

MgSO4 x7H2O 3,25 10

(NH4)2HPO4 12,5 10

CuSO4 x 5H2O 0,79 1 KOH 15 1 EDTA 25 1

FeSO4 x 7H2O 2,49 1

H3BO3 5,52 1

ZnSO4 x 7H2O 4,41 1

MnCl2 x 4H2O 0,72 1

NaMoO4 0,36 1

Co(NO3)2 x 6H2O 0,25 1 Vitamin-Mix X4 10

Vitamin-Mix X4

Tab. 5 Zusammensetzung der Vitamin-Lösung für das TOM-Medium Stammlösung mg/5000 ml H2O (bidest., steril)

Cyanocobalamin (Vitamin B12) 10 Biotin (Vitamin H) 50 Thiamin HCl 5000 Nicotinsäureamid 5 Material und Methoden 13

In 1 l Kulturmedium wurden 0,715 g HEPES (N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N´-2- ethansulfonsäure), p. A.) gelöst. Dazu wurden pro 1000 ml 15 g Glukose und 20 g Proteose-Pepton gegeben und die Lösung auf einen pH-Wert von 5,5, eingestellt. Für die Schrägagarkulturen wurde vor dem Autoklavieren 15 g/1000 ml Agar zum Medium zugefügt.

2.2 Genetische Untersuchungen

2.2.1 Extraktion genomischer DNA mit dem Puregene DNA- Purification Kit

Die Isolierung der genomischen DNA erfolgte in zwei Arbeitsschritten. Im ersten Schritt wurden die Zellen mechanisch aufgeschlossen und im zweiten Schritt erfolgte die Isolierung der DNA nach Arbeitsprotokoll mit dem Puregene DNA-

Purification Kit (Fa. GENTRA SYSTEMS). Das Algengemisch wurde aufgetaut und nach einem kurzen Zentrifugationsschritt bei 14000 rpm für 60 s (Centrifuge 5415C, Fa. EPPENDORF) wurde der Überstand dekantiert. Es folgten zwei Waschschritte, wobei das Algenpellet jeweils mit 1 ml Puffer B durch Vortexen resuspendiert wurde und anschließend nach erneuter Zentrifugation der Überstand abgenommen wurde. Das Volumen des Algenpellet wurde abgeschätzt und das gleiche Volumen Glaskügelchen (‚acid-washed glass beads’, 220- 300 µm; Fa SIGMA) mit einem Spatel dazugegeben. Der Aufschluss der Zellen (rd 5000 rpm, 30 s) wurde mit einem Zellaufbruchgerät (Mini- Beadbeater, Fa BIOSPEC.) durchgeführt und anschließend die Zahl der aufgeschlossenen Zellen unter dem Lichtmikroskop (Olympus BX 60, Fa. OLYMPUS) überprüft. Bei mehr als 60 % aufgeschlossener Zellen kann nicht ausgeschlossen werden, dass durch wirkende Scherkräfte die schon freigesetzte DNA beschädigt wurde. Nun erfolgte die DNA- Extraktion entsprechend des Arbeitsprotokolls. Dabei wurden mit Hilfe verschiedener Puffer die Zellen lysiert, ihre einzelnen Bestandteile ausgefällt und durch Zentrifugation von der DNA getrennt. Die DNA wurde mit 96% Isopropanol gefällt und mit 70% Ethanol gewaschen, um Salze und Isopropanol zu entfernen. Das Pellet wurde nun durch Trocknen bei RT vollkommen von Ethanol befreit und in 50 µl DNA Hydration Solution gelöst.

Material und Methoden 14

Zur Qualitätsüberprüfung wurde die extrahierte genomische DNA gelelektrophoretisch aufgetrennt und fotografiert (3.2.2) und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C aufbewahrt.

2.2.2 Agarosegelelektrophorese und Färbung mit Gel Star oder Ethidiumbromid

Die Gelelektrophorese mit Agarose als Trägermaterial erlaubt eine Auftrennung von doppelsträngigen Nukleinsäuren unterschiedlicher Länge. Aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen des DNA- Rückgrades, wandert die DNA in einem elektrischen Feld in Richtung der Anode, wobei sich größere Fragmente durch ihre geringere Mobilität in der Agarose-Gelmatrix langsamer fortbewegen und kleine Fragmente mit geringerer Masse dementsprechend schneller. Zur optimalen Größenauftrennung linearer doppelsträngiger DNA-Fragmente von ca. 500-6000 Basenpaaren Länge erweist sich ein 1%-iges

Agarosegel als geeignet (LOTTSPEICH UND ZORBAS, 1998, Seite 603-606). Bei der Auftrennung sehr kleiner Fragmente (≤ 100 bp), wie sie bei der Restriktionsanaylse PCR- RFLP entstehen, werden üblicherweise 1,2 -1,7 %-ige Agarosegele verwendet. Zur Qualitätsüberprüfung wurden die isolierte DNA, die PCR-Produkte und PCR-RFLP- Produkte auf Agarosegelen unterschiedlicher Konzentration (Tab.6) elektrophoretisch aufgetrennt. Dafür wurden jeweils x µl Probe zu 2, bzw. 3 µl Auftragspuffer pipettiert, gemischt und auf das Gel aufgetragen. Als Laufpuffer wurde 0,5x TBE (siehe Anhang) verwendet und die Spannung betrug 50- 110 V. Zusätzlich zu den Proben wurden als Bezug zu den relativen Fragmentgrößen 1 µl DNA-Größenmarker auf das Agarosegel aufgetragen. Die Wahl des DNA-Längenstandards hängt von der zu erwartenden Größe der DNA- Fragmente ab. Für die Auftrennung der genomischen DNA und der PCR- Produkte wurde als Größenmarker Lambda DNA, mit EcoRI und HindIII (Fa. MBI FERMENTAS) verdaut, verwendet. Bei der RFLP-Analyse wurde zusätzlich der Größenmarker GeneRuler 100 bp DNA Ladder, pME-80 DNA mit Eco1471 und PvuI verdaut, (Fa. MBI FERMENTAS) aufgetragen. Bei der Qualitätsüberprüfung von isolierter DNA und PCR-Produkten wurde der Farbstoff  Gel Star (FA. BIOZYM) verwendet. Gel Star lagert sich an die Phosphatgruppen der DNA und kann diese bei Bestrahlung mit UV-Licht aufgrund seiner fluoreszierenden Eigenschaft im Gel als Bande sichtbar machen. Gel Star 1:1000 verdünnt in Ficollfarbmarker (siehe Anhang), wird direkt mit der Probe auf das Gel aufgetragen. Material und Methoden 15

Die PCR-RFLP Produkte wurden mit Ethidiumbromid (3,8-Diamino-5-ethyl-6- phenylphenanthridiniumbromid) (Fa. SERVA) nachgewiesen. Dazu wurden nach 0 Beendigung der Elektrophorese die Agarosegele in einem Ethidiumbromidbad (50 /00) für 5-10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Ethidiumbromid interkaliert aufgrund von Stapelwechselwirkungen in die DNA. Um das nicht gebundene Ethidiumbromid (Hintergrundfluoreszenz) zu entfernen, wurde das Gel anschließend in einem Wasserbad für 10 min gewaschen. Der entstandene Etbr-DNA-Komplex erscheint nach Anregung mit UV-Licht (254-366 nm) als leuchtende Bande im Gel. Die Ergebnisse wurden mittels Fotografie festgehalten.

Tab. 6 Übersicht der verwendeten Agarosegele [%] und eingesetzter Menge der Proben [µl]

Gelkonzentration Eingesetzte Menge Laufpuffer DNA 1 % 2 µl 2 µl PCR-Produkt 1 % 2 µl 2 µl PCR-RFLP-Produkt 1,7 % 5 µl 3 µl

2.2.3 Quantifizierung der DNA und PCR-Produkte

Zur Konzentrationsmessung der Nukleinsäuren wurde die optische Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Von den Proben wurden 50 µl Messvolumen in speziellen Kunststoffküvetten (UVette 220- 1600 nm, Fa. EPPENDORF) in dem Photometer (BIO Photometer 6131, Fa. EPPENDORF) gemessen. Material und Methoden 16

2.2.4 Amplifikation der 18S rDNA-Region

Abb.1 Schematische Darstellung des rRNA-Cistrons mit den Bindungsregionen der PCR-Primer 18L/NS1 und Insertionsbereich von Introns (Dreieck 1512) in der 18S rDNA

Die gezielte Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnittes, hier die18S rDNA, in vitro wurde mit der Polymerase Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR)

(SAIKI et al., 1985) durchgeführt. Die PCR ist ein zyklischer Prozess aus Denaturierung, Primer Annealing und Primer Extension (Elongation), wobei sich die Zahl der DNA-Abschnitte mit jedem Zyklus verdoppelt. Die Denaturierung der doppelsträngigen DNA zu Einzelsträngen wird durch Erhöhung der Temperatur auf 95- 98°C erreicht. Wird nun die Temperatur abgesenkt auf ungefähr 52 °C, so lagern sich zuvor definierte Oligonukleotidprimer, kurze einzelsträngige DNA- Moleküle, komplementär an die Enden der definierten Sequenz der DNA- Matrize (template). Die Primer flankieren somit den gewünschten DNA- Abschnitt der amplifiziert werden soll. An den Primer-Bindestellen setzt nach Temperaturerhöhung auf 72° C nun eine thermostabile Magnesium-abhängige DNA-Polymerase an und synthetisiert aus dNTP's jeweils vom 5’-Ende zum 3’-Ende in beide Richtungen einen dem Matrizenstrang komplementären Tochterstrang (primer extension). In der Regel liegt nach 30-35 Zyklen genügend Produkt zur weiteren Analyse vor (LOTTSPEICH UND ZORBAS, 1998, Seite 676). Material und Methoden 17

In dieser Arbeit wurden vier verschiedene PCR- Reaktionen durchgeführt: 1) PCR_18S für die Amplifikation der 18S rDNA mit genomischer DNA als Matrize (s. u.) 2) PCR_Screen für den colony screen (2.2.6) 3) PCR_Amp für die Restriktionsanalyse PCR- RFLP (2.2.8) und 4) PCR_Seq für die Sequenzierung der 18S rDNA (2.3)

Tab. 7 verwendete PCR-Primer Primer Sequenz 5´Æ 3´ Referenz

NS1 GTA GTC ATA TGC TTG TCT HAMBY et al.

18L CAC CTA CGG AAA CCT TGT HAMBY et al. TAC GAC TT M13F ?TGT AAA ACG ACG GCC AGT Promega° M13R ?CAG GAA ACA GCT ATG ACC Promega° ° Referenzsequenz: pGEM®-T-Vektor

PCR_18S

Für die Amplifikation der 18S rDNA wurden die Primer 18L und NS1 ausgewählt. Diese Primer binden an konservierte Bereiche am 5´und 3´-Ende der 18S rDNA (Abb.1), so dass alle 18S rRNA-Gene aus dem DNA-Gemisch der verschiedenen Organismen amplifiziert werden können und keine Selektion durch die Primerwahl vorgegeben ist. Ein entscheidender Faktor für die Spezifität der PCR ist die Magnesiumchloridkonzentration. Um möglichst verschiedene Amplifikate aus dem DNA- Gemisch der Standortproben zu erhalten, wurden drei unterschiedliche

MgCl2-Konzentrationen (1mM, 2mM, 4mM) eingesetzt. Bei der Amplifikation der 18S rDNA von einer Reinkultur wurde eine MgCl2 Konzentration von 1,5 mM verwendet. Das Volumen des PCR- Reaktionsansatzes (mastermix) betrug 50 µl pro PCR- tube (Fa.

BIOZYM). Die genomische DNA wurde verdünnt (1:10 und 1:100) und davon jeweils 5 µl in 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäße vorgelegt. Die Taq-Polymerase [5 U/µl] wurde zum mastermix (Tab. 8) hinzugefügt und dieser dann zu dem DNA-template pipettiert. Die Ansätze wurden zentrifugiert, so dass eine vollständige Vermischung der einzelnen Komponenten gewährleistet war. Das folgende PCR Programm (Abb. 2) wurde verwendet.

Material und Methoden 18

Tab. 8 PCR-mastermix für die Amplifikation der 18S rDNA Mastermix Volumen 10 x Reaktionspuffer 5 µl MgCl2 (50 mM) z µl (1mMÆ1µl, 1,5 mMÆ 1,5 µl, 2 mMÆ 2 µl, 4 mM Æ 4 µl dNTPmix (40 mM) 5 µl NS1(10 µM) 1 µl 18L (10 µM) 1 µl DMSO 1 µl DNA-Extrakt 5 µl H2O x µl Taq-Polymerase [5U/µl] 0,15 µl

95°C 5 min initiale Denaturierung

94°C 1 min Denaturierung 30x 52°C 45 Annealing 71°C 2 min + 3 s Elongation

72°C 7 min finale Elongation 4°C Lagerung

Abb.2 PCR-Programm PCR_18S der 18S rDNA-Amplifikation

2.2.5 Aufreinigen der PCR-Produkte mit dem `PCR Product Purification Kit´

Die Aufreinigung der PCR-Produkte für die Klonierung und Sequenzierung wurde mit dem `High Pure PCR Product Purification Kit` (Fa. ROCHE) nach Arbeitsprotokoll durchgeführt. Nukleinsäuren, die größer als 100 bp sind, werden an eine Glasfaser-Oberfläche in einer Säule gebunden und in mehreren Waschschritten DNA von Primern, überschüssigen Nukleotiden und Salzen durch spezielle Puffer gereinigt und schließlich in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß eluiert.

Material und Methoden 19

2.2.6 Transformation mit dem TOPO TA Cloning Kit

Da das Ausgangsmaterial (Tab. 9) nicht unialgal war, sondern ein Gemisch aus verschiedenen Algen und Pilzen darstellte, wurden die gereinigten 18S rDNA-Amplifikate (PCR_18S) in Escherichia coli kloniert und so eine Klonbank angelegt. Dadurch wird das 18S rDNA-Gemisch vereinzelt, so dass eine Kolonie, bzw. ein Klon die 18S rDNA einer Alge bzw. eines Pilzes enthält, die durch spätere Analysen (18S Sequenzierung, PCR- RFLP-Analyse) identifiziert werden konnte.

Tab. 9 Ausgangsmaterial für Klonierung 1. Straßenpfeiler DNA-Extrakt von Biofilmprobe 2. Dachziegel D1, D3, D5 DNA-Extrakt von Biofilmprobe 3. Durchlüftungskulturen D1-D6 DNA-Extrakt von Durchlüftungskultur 4. Betonsockel B DNA-Extrakt von Biofilmprobe 5. Durchlüftungskultur P1 DNA-Extrakt von Durchlüftungskultur

Für die Klonierung der PCR-Produkte wurde das TOPO TA Cloning Kit (Fa.

INVITROGEN) verwendet. Hier erfolgt die Ligation des Amplifikats in den Vektor nicht über eine DNA-Ligase, sondern über Topoisomerase I. Topoisomerase I aus dem Vaccinia Virus spaltet den DNA- Doppelstrang an spezifischen Bereichen (5´-CCCTT) im Phosphatrückgrat im Einzelstrang

(SHUMAN, 1991). Die dabei freiwerdende Energie wird in der Bindung der Topoisomerase I über einen Tyrosylrest (Tyr-274) an das 3´ Phosphat des gespaltenen Strangs konserviert. Der linearisierte pCRII-TOPO Vektor (Anhang) mit der gebundenen Topoisomerase I wird auch als aktivierter Vektor bezeichnet. Durch einen nukleophilen Angriff der 5´ Hydroxylgruppe des gespaltenen Strangs oder des PCR-Produkts kann die Reaktion umgekehrt werden. Dabei löst sich die Topoisomerase I von der 3´ Phosphatgruppe und der pCRII-TOPO Vektor mit oder ohne „Insert“ liegt wieder geschlossen als Ring vor. Es wurde zunächst der Ligationsansatz nach Herstellerprotokoll zusammen pipettiert (Tab. 10)

Material und Methoden 20

Tab. 10 Ligationsansatz Reagenz Menge PCR-Produkt 0,5-4 µl Salt-Solution 1 µl

Steriles H2O zugeben bis zu einem Volumen von 5 µl TOPO Vektor 1 µl Gesamtes Volumen 6 µl

Der Ansatz wurde vorsichtig durchmischt und bei Raumtemperatur 10 min inkubiert. Für die darauf folgende Transformation wurden die chemisch kompetenten `One Shot

Zellen´ (E. coli, TOP 10, Fa. INVITROGEN) auf Eis aufgetaut, mit dem Ligationsansatz vermischt und bis zu 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 30 s bei 42°C in ein Wasserbad gegeben und dann sofort wieder auf Eis. Zu dem Transformationsansatz wurde 250 µl SOC- Medium (siehe Anhang) zugegeben und nach einer Stunde Inkubationszeit bei 37°C im Schüttler 30 und 50 µl auf vorgewärmte LB+ - Platten (siehe Anhang) mit X-Gal-Lösung ausgestrichen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Da das Medium Ampicillin enthielt, wuchsen auch nur die transformierten Zellen, die durch den pCRII-TOPO Vektor die Ampicillinresistenz erhalten haben. Durch die Zugabe von X-Gal-Lösung (5-Brom-4-Chlor-3-Indoyl-β-D-Galaktosid) wurde eine Blau-Weiß-Selektion durchgeführt. Die Plasmid-codierte β-Galaktosidase spaltet X- Gal im Medium zu Galaktose und dem Farbstoff 5-Brom-4-Chlor-3-Indol. Der Insertionsbereich für das PCR-Produkt liegt im lacZ-Gen, welches für die β-Galaktosidase codiert, d.h. Zellen mit dem „Insert“ haben keine aktive β-Galaktosidase mehr gebildet und eine Blaufärbung der Kolonie blieb aus. Die Blau-Weiss-Selektion ermöglicht also eine Differenzierung von positiven (Vektor mit Insert) und negativen (Vektor ohne Insert) Klonen.

Material und Methoden 21

2.2.7 Colony screen

Zur Überprüfung der Transformation wurde zusätzlich zur Blau-Weiss-Selektion ein colony screen durchgeführt. Mittels einer PCR mit geeigneten Primern wurde festgestellt, ob der Klon das Insert, also die 18S rDNA enthielt, oder nicht. Hierfür wurden die Primer M13F und M13R (Tab.7) verwendet, die im Plasmidvektor pCRII-TOPO ihre komplementären Bindestellen haben, so dass bei der PCR eventuell ein Insert amplifiziert werden. Das template ist in diesem Fall die intakte Zelle. Mit einem sterilen Zahnstocher wurde eine Kolonie von der LB+-Platte gepickt und ein Teil davon auf eine masterplate mit durch Kästchen definierten Bereichen zur späteren Identifikation der Klone übertragen. Der Rest wurde direkt in das PCR-Gefäß gegeben, in dem 50 µl mastermix (Tab. 11) vorgelegt wurde.

Tab. 11 PCR-mastermix für den colony screen Mastermix Volumen 10 x Reaktionspuffer 5 µl MgCl2 (50 mM) 1,5 µl dNTPmix (40 mM) 5 µl M13F (10 µM) 1 µl M13R (10 µM) 1 µl DMSO 1 µl H2O x µl Taq-Polymerase [5U/µl] 0,15 µl

95°C 4 min

94°C 40 s 30x 52°C 30 s 71°C 2 min + 4 s

6x 94°C 40s 70°C 2 min

4 °C Lagerung

Abb. 3 PCR-Programm PCR_screen für colony screen

Material und Methoden 22

Nach der PCR (PCR_screen, Abb. 3) wurden die Proben gelelektrophoretisch aufgetrennt (2.2.2) und fotografiert. Bei den positiven Klonen sollten Fragmentlängen von 1800 Basenpaaren vorliegen, bei Klonen ohne Insert ca. 240 Basenpaare. Für die PCR-RFLP wurden ein Teil der PCR-Produkte der positiven Klone mit der Primerkombination NS1/18L reamplifiziert. Hierfür wurde das PCR-Programm PCR_18S benutzt.

2.2.8 Minipräparation der Plasmid-DNA aus den positiven Klonen

Für die Sequenzierungen wurde Plasmid-DNA aus den positiven Transformanten mit dem

Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System (Fa. PROMEGA) extrahiert. Für die Präparation wurden am Tag zuvor die Klone in 2ml LB+-Medium angeimpft und über Nacht bei 37°C im Schüttler inkubiert. Die Übernachtkulturen wurden in 2 ml Eppendorfgefäßen 5 min bei 10000 rpm abzentrifugiert (Centrifuge 5414C, Fa. EPPENDORF) und der Überstand verworfen. Nach Herstellerprotokoll wurden die Zellen zunächst alkalisch lysiert und die freigesetzten Enzyme durch Proteasen inaktiviert. Nach vollständiger Lyse wurde die Lösung neutralisiert und für 10 Minuten zentrifugiert. Die Plasmid-DNA im Überstand wurde in eine Säule übertragen, in mehreren Schritten gewaschen und schließlich in ein steriles 1,5 ml Eppendorfgefäß eluiert. Anschließend wurde die DNA-Konzentration gemessen (2.2.3).

2.2.9 Reinigen der PCR-Produkte mittels Fällung

Für die PCR-RFLP wurden die PCR-Produkte des colony screens mit Natriumacetat (NaAc) und Isopropanol gefällt. Dafür wurden 1 Vol Isopropanol und 1/10 Volumen NaAc zu dem PCR-Ansatz gegeben und 30 min bei -20°C oder über Nacht bei 4°C gefällt. Anschließend wurden die Proben

30 min bei 14000 rpm und 4°C zentrifugiert (Centrifuge 1517R, Fa. EPPENDORF). Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet zweimal mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen. Zwischen den Waschschritten wurden die Ansätze 15 min zentrifugiert (14000Upm, 4°C) Material und Methoden 23 und nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet bei RT getrocknet bis der Ethanol vollständig verdampft war. Die DNA wurde in TE-Puffer (siehe Anhang) gelöst und bei -20°C aufbewahrt.

2.2.10 PCR-RFLP

Bei der Restriktionsanalyse PCR-RFLP (PCR-Restriktions-Fragment-Längen- Polymorphismus) wird ein bestimmter DNA-Abschnitt (z. B. 18S rDNA) durch ein oder mehrere Restriktionsenzyme verdaut, so dass beim Vergleich unterschiedlicher Organismen aufgrund der verschiedenen Sequenzen entsprechend verschiedene Restriktionsfragmente nach einer Gelauftrennung zu erkennen sind. Diese Polymorphismen beruhen auf Mutationen in der DNA, durch die Restriktionsschnittstellen wegfallen oder hinzukommen können und infolgedessen variieren auch die Fragmentlängen. In der vorliegenden Arbeit wurde die PCR-RFLP-Methode angewendet um die positiven Klone der angelegten Klonbanken nach Schnittmustern zu gruppieren. Aus jeder Gruppe wurden ein oder zwei Klone für die 18S rDNA-Sequenzierung ausgewählt. Zunächst wurde anhand bekannter Sequenzen von Grünalgen und Dachziegelklonen aus dem Praktikum (Anhang) mit dem Programm „webcutter“ (webcutter version 2.0, copyright 1997 Max Heiman; http//www.firstmarket.com/cutter/cut2.html) ein geeignetes Restriktionsenzym ausgewählt, dass eine Gruppierung auf Gattungsebene zuließ. Das Enzym sollte mindestens ein- bis zweimal in der 18S rDNA schneiden und die Erkennungssequenz vorwiegend in Bereichen mit Sequenzvariationen liegen, so dass verschiedene Schnittmuster entstehen konnten. Dafür wurden die vorhandenen Sequenzen mit „webcutter“ geschnitten und die Schnittmuster ermittelt. Für die PCR-RFLP-Analyse der positiven Klone wurde das Enzym MboI (Anhang) mit einer Erkennungssequenz von 4 bp (/GATC) ausgewählt. Zuerst wurden die PCR- Produkte der bekannten Dachziegelalgensequenzen mit MboI verdaut, um festzustellen, ob die theoretisch ermittelten Schnittmuster mit denen des Verdau übereinstimmen. Der Restriktionsansatz (Tab.12) wurde zusammen pipettiert und 3h bei 37°C inkubiert.

Material und Methoden 24

Tab.12 Ansatz des Restriktionsverdau Volumen PCR-Produkt ( 1µg/µl) x µl Enzymspez. Puffer R+ 2 µl MboI (10 units/µl) 1 µl

H2O (dest. autoklaviert) x µl gesamt. Ansatz 23 µl

Nach dem Verdau wurden die Proben in einem 1,7%igen Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und schließlich fotografiert. Anhand der auftretenden Schnittmuster wurden die Klone gruppiert und eine Auswahl sequenziert.

2.3 DNA-Sequenzierung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Sequenzierung nach Sanger (SANGER, 1977) durchgeführt mit Hilfe des Didesoxyverfahren, auch Kettenabbruchverfahren oder Terminatorverfahren. Als template für die Sequenzierung wird das PCR-Produkt des entsprechenden Gens gewählt. Durch Zugabe von Sequenzierprimern, eines Nukleotidgemisches und einer DNA-Polymerase wird in einer PCR der jeweils komplementäre DNA-Strang amplifiziert. Um die Reaktionsprodukte nachweisen zu können sind die Sequenzierprimer mit einem fluoreszierenden Farbstoff am 5´Ende markiert. Zusätzlich zu den natürlichen 2´Desoxynukleotiden wird zu vier getrennten Reaktionen, die mit A, C, G und T bezeichnet werden, jeweils noch ein Typ von 2´,3´-Didesoxynukleotiden (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) gegeben. Wird bei der Strangsynthese ein Didesoxynukleotid eingebaut, kommt es zum Abbruch der Reaktion. So werden basenspezifisch terminierte DNA- Fragmente unterschiedlicher Länge synthetisiert, die in einem denaturierenden Polyacrylamidgel gelelektrophoretisch aufgetrennt werden.

Die Gelelektrophorese wurde an dem Sequenziergerät „LI-COR IR2 DNA Sequencer“ (Fa. LiCor) durchgeführt. Material und Methoden 25

Mit dem ‚Thermo Sequenase fluorescent laballed primer cycle sequencing kit with 7- deaza-dGTP’(ddNTP-MIX) (Fa. AMERSHAM LIFE SCIENCE) wurden die Reaktionsansätze für die Sequenzierung zusammenpipettiert (Tab.13). Folgende Sequenzierprimer wurden verwendet:

Abb. 4 Schematische Darstellung der 18S rDNA mit den Bindungsregionen der verwendeten Sequenzierprimer

Tab.13 Verwendete Sequenzierprimer Primer Sequenz 5´Æ 3´ Referenz Bindungsregion M13F ?TGT AAA ACG ACG GCC AGT Promega® 2942-2958 bp° M13R ?CAG GAA ACA GCT ATG ACC Promega® 161-177 bp° 80F ?GTG AAA CTG CGA ATG GC Mitchell L.Sogin, 82-98 bp * verändert 1422R CTA AGG GCA TCA CAG ACC TG 1447-1428 bp* 600R ATA CGC TAT TGG AGC TGG 601-584 bp*

1050F CCA TAA ACT ATG CCG ACT AG Friedl, pers. 1024-1042* Mittlg 500F AAT TGG AGG GCA AGT CTG Friedl, pers. 545-562* Mittlg 1300R AAC TAA GAA CGG CCA TGC Friedl, pers. 1292-1275* Mittlg. ° Referenzsequenz: pGEM®-T-Vektor * Referenzsequenz: Chlorella vulgaris X13688

Material und Methoden 26

Tab.14 Reaktionsansatz für die Sequenzierung Volumen (µl) DNA 100ng/kb) x µl Primer (F) 1 µl Primer (R) 1 µl DMSO 0,5 µl

H2Odest add 13 µl

In vier Sequenzierreaktionsgefäße wurden jeweils 1 µl der 3´, 5´-Didesoxynukleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP) sowie 3 µl des Reaktionsansatzes (Tab.14) gegeben und anschließend kurz zentrifugiert (Centrifuge 1517R, Fa. EPPENDORF). Die PCR_Seq der Sequenzieransätze erfolgte in einem Thermocycler nach folgendem Programm (Abb.5).

95°C 2 min

94°C 40 sec 27x 52°C 40 sec 72°C 50 sec

6x 94°C 30 sec 72°C 2 min

4 °C Lagerung Abb.5 Programm PCR_Seq für die Sequenzierung

Nach der PCR wurden zu den Proben 3 µl ‚Stop-Solution’(Anhang) dazugegeben.

Zusammenbau der Glasplatten und Gießen des Sequenziergels

Die Glasplatten (66 cm) wurden mit H2O (bidest.) und 70%-igem Isopropanol von beiden Seiten mit Küchenpapier gereinigt. Auf die hintere Glasplatte wurden zwei Plastikspacer (0,2 mm) gelegt und die vordere Glasplatte sofort daraufgelegt. Die Glasplatten wurden durch zwei Schienen fixiert (Æ Gelkassette) und mit dem oberen Teil auf eine 10 cm hohe Ablage gelegt. So wirkt beim Gießen des Gels zusätzlich zu der Kapillarkraft auch das Gefälle mit. Für die Herstellung eines 3,75%igen Polyacrylamidgels wurde das „Zwei Flaschen Gel

System“ ‚SequaGel XR’ (FA. BIOZYM) verwendet. Nach Angaben des Herstellers wurden Material und Methoden 27 die einzelnen Reagenzien zusammengemischt (Tab.12) und das Gel mit einer Plastikspritze über einen Sterilfilter zwischen die Glasplatten gespitzt. Nun wurde die Gelkassette waagerecht auf den Tisch gelegt und ein 48er Haifischzacken-Kamm mit der glatten Kante eingesetzt, so dass sich eine große Tasche an der oberen Gelkante bilden konnte. Das Sequenziergel war nach ca. zwei Stunden auspolymerisiert. Danach wurden Geltasche und Glasplatten von außen gereinigt und die Gelkassette in den Sequenzer gehängt. Daraufhin wurde der Vorlauf gestartet. Als Laufpuffer wurde 1,0 x TBE-Puffer (siehe Anhang) verwendet. Nach Beendigung des Vorlaufs wurde der Kamm in die Tasche eingesetzt, 0,8 µl der Proben aufgetragen und der Lauf gestartet.

Tab.15 Zusammensetzung des Polyacrylamidgels (66 cm, 0,2 mm) Gelkomponenten Volumen Long Ranger® 50% gel solution 4,5 ml (Æ 3,75% Long Ranger) Urea 25,2 g (Æ 7M Urea/1xTBE) 10x TBE 6 ml TEMED 0,04 ml APS (10%) 0,4 ml H2O bidest. add 60 ml (Æ 31,5 ml)

2.3 Auswertung

2.3.1 Sequenzen

Die einzelnen Primersequenzen wurden mit dem Computer-Programm ‚e-Seq V2.0’ (FA.

LICOR) ausgewertet. Mit einem Zusatzprogramm ‚ AlignIR’ (FA. LICOR) wurden diese Einzelsequenzen dann zu einer vollständigen Sequenz zusammengeführt, so dass die homologen Bereiche der Einzelsequenzen überlappten. Die daraus gebildete ‚Consensus-Sequenz’ wurde dann für weitere Sequenzanalysen abgespeichert. Im Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) wurde mit dem BLAST-Server (engl. „basic local alignment search tool“) die Consensus-Sequenz mit den zur Verfügung stehenden Sequenzen im Internet verglichen und die mit der größten Übereinstimmung herausgesucht. Durch die Referenzsequenzen konnten die Klone und isolierten Algen grob eingeteilt werden, so dass Sequenzen von anderen eukaryotischen Organismen aus der Material und Methoden 28

Klonbank aussortiert wurden. Für die Nachbearbeitung der Sequenzen wurde diese mit den ermittelten Referenzsequenzen verglichen und eventuell verbessert.

2.3.2 Sequenz-Alignment

Die bearbeiteten Consensus-Sequenzen wurden mit Hilfe des Computer-Programms

„BioEdit V5.0.9“ (HALL, 1999) untereinander und mit bekannten Grünalgensequenzen verglichen, um übereinstimmende oder ähnliche Sequenzabschnitte zu identifizieren. In einem Alignment wurden diese Bereiche übereinandergestellt und durch Einfügen von Lücken („gaps“) ausgeglichen, so dass Spalten entstehen, in denen alle Nukleotide positionell homolog zueinander sind. Neu hinzukommende 18S rDNA Sequenzen von isolierten Algenkulturen und Algenklonen wurden separat gegen eine Referenzssequenz (z.B. 18S rDNA von Chlorella vulgaris) aus dem Alignment homologisiert und anschließend in das schon bestehende Alignment eingefügt. Introns innerhalb einer Sequenz wurden im Alignment herausgeschnitten und der Insertionsbereich des Introns durch einen Stern gekennzeichnet. Dieses Alignment wurde dann zur Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaums herangezogen (2.3.3)

2.3.3 Phylogenetische Analyseverfahren

Die phylogenetischen Beziehungen der isolierten Algen und der Algenklone wurden mit zwei verschiedenen Methoden untersucht: die Neighbor-Joining (NJ) Methode und die Maximum Parsimonie (MP) Methode. Beide Methoden sind in dem Programm PAUP*4a4b (`Phylogenetic Analysis Using Parsimony* and other methodes (Version 4.0 beta)´) (SWOFFORD, 1998) implementiert.

Neighbor-Joining (NJ) Die Neighbor-Joining-Methode ist eine Clustering-Methode, bei der eine Distanzmatrix erstellt wird, die als Grundlage zur Stammbaum-Berechnung dient Die Distanzmatrix wurde nach dem HKY85-Verfahren (HASEGAWA et al., 1985) erstellt. Beim HKY85-Verfahren wird angenommen, dass Transitionen häufiger als Transversion Material und Methoden 29 auftreten. Zudem wird berücksichtigt, dass innerhalb eines Sequenzabschnitts bestimmte Nukleotidsubstitutionen häufiger als andere vorkommen. Beim NJ-Verfahren wird für jedes Sequenzpaar aufgrund der Basenunterschiede eine Distanz berechnet. Die ähnlichsten Sequenzen werden zu Einheiten zusammengefasst, aus denen wiederum Paare gebildet werden. Letztendlich entstehen zwei große Gruppen von

Sequenzen (SAITU & NEI 1987). Durch Wurzelung mit einer Außengruppe wird der Baum polarisiert, d.h. es wird eine Evolutionsrichtung vorgegeben. Die Wahl der Außengruppe wird durch den phylogenetischen Zusammenhängen der untersuchten Gruppe bestimmt.

Maximum Parsimony (MP) Das Maximum Parsimony-Verfahren ist eine diskrete Methode, d.h. die Sequenzdaten werden direkt für die Baumkonstruktionen verwendet ohne dass zuvor eine Distanzmatrix errechnet wird. Bei dieser merkmalsbasierten Methode wird unter Verwendung eines vorgegebenen Evolutionsmodells ein Stammbaum konstruiert, indem die Sequenzen der Organismen möglichst wenige Basensubstitutionen erfahren haben. Aus einer Reihe möglicher Stammbäume wird derjenige ausgesucht, der eine Evolution der Organismen mit der geringsten Anzahl von Veränderungen zeigt. D.h. es wird der sparsamste (engl. parsimony) Stammbaum gesucht. Die Gesamtsumme aller im Baum nötigen

Mutationen ist das Maß für die Qualität, bzw. die Länge des Baumes (SWOFFORD & OLSEN

1990 and WATERMAN 1995). Beim Weighted Parsimony-Verfahren wird berücksichtigt, dass nicht alle Bereiche der Sequenzen „brauchbar“ für die phylogenetischen Analyse sind. D.h. es gibt einerseits Sequenzbereiche, die sich im Laufe der Evolution sehr schnell verändern und es gibt sehr konservative Bereiche, die sich sehr langsam verändern. Sequenzabschnitte, die sich schnell verändern, können die molekulargenetische Signale überdecken, so dass die genetische Evolution schwer nachzuvollziehen ist. Beim Weighted Parsimony-Verfahren wird eine Gewichtung der verschiedenen Sequenzabschnitte nach dem „rescaled consistency index (RC)“ über ein Intervall von 1-1000 vorgenommen und bei der Berechnung der Phylogenie berücksichtigt.

Material und Methoden 30

Bootstrap-Test Um die Stabilität der berechneten Stammbäume, bzw. die Qualität des Datensatzes zu testen, werden Support-Werte („Unterstützungen“) mit dem Bootstrap-Verfahren ermittelt. Dabei wird der Datensatz systematisch modifiziert, indem ein Teil des Alignments in vielfacher Wiederholung (hier 2000 Replikate) deletiert und ein anderer Teil dupliziert wird, wobei die ursprüngliche Länge des Sequenzdatensatzes erhalten bleibt. Für jeden dieser Pseudodatensätze werden neue Stammbäume mit den jeweiligen Verfahren (NJ oder wMP) berechnet.

Die berechneten Topologien werden zu einem Konsensusbaum zusammengefasst. Jeder Knoten im Baum, der in mindestens 50% aller Bäume wieder gefunden wurde („majority rules“), bekommt einen Wert entsprechend seiner Frequenz zugesprochen. Bootstrap-Wert gibt somit Auskunft über die statistische Signifikanz mit der ein gegebener Datensatz die Phylogenie unterstützt. Bootstrap-Werte über 90% zeigen sichere, über 80% gut unterstütze Verzweigungen an, während Werte unter 50% keine stabile Unterstützung einer bestimmten Gruppe darstellen. .

Ergebnisse 31

3 Ergebnisse

3.1 Klonierung

Es wurden SSU rDNA-Klonbanken von neun verschiedenen Standorten (Tab. 1a und b) mit den in Tabelle 16 aufgeführten Klonen angelegt und mit colony screen positive Klone ermittelt. Von drei Standorten, Dachziegel D1, D3 und D5, wurden jeweils zwei Klonbanken angelegt, da hier sowohl Proben direkt vom Ausgangsmaterial als auch von der Durchlüftungskultur für die Untersuchungen verwendet wurden.

Tab.16 Übersicht der Klonbanken Nr. Name der Anzahl der Positive Klone Ausgangsmaterial Klonbank Klone 1 D1 44 41 Dachziegel D1 2 D3 54 42 Dachziegel D3 3 D5 6 6 Dachziegel D5 4 D1.2 38 28 Durchlüftungskultur von D1 5 D3.2 36 33 Durchlüftungskultur von D3 6 D5.2 45 35 Durchlüftungskultur von D5 7 D2.2 35 32 Durchlüftungskultur von D2 8 D4.2 44 39 Durchlüftungskultur von D4 9 D6.2 43 39 Durchlüftungskultur von D6 10 P1 42 33 Durchlüftungskultur von P1 11 Strpf 77 48 Straßenpfeiler 12 B 24 17 Betonsockel

Ergebnisse 32

3.2 PCR-RFLP

Die Restriktionsanalyse positiver Klone wurde mit dem Enzym MboI mit der Erkennungssequenz „GATC“ durchgeführt. Jede SSU rDNA-Klonbank wurde getrennt ausgewertet und die Gruppierungen für jeden Standort einzeln vorgenommen, da die PCR- Produkte mit zwei verschiedenen Primerkombinationen (M13F/M13R und NS1/18L) gewonnen wurden. Die Ergebnisse für die verschiedenen Standorte sind nacheinander aufgeführt. Die Fragmentlängen wurden anhand der beiden aufgetragenen Größenmarker (GeneRuler 100 bp DNA Ladder: pME-80 DNA mit Eco1471/PvuI geschnitten und Lambda DNA mit EcoRI/HindIII geschnitten) abgeschätzt oder mit dem Programm BioDocAnalyze ® (FA.WHATMAN BIOMETRA ) errechnet.

Dachziegel D1, D3, D5

Ausgangsmaterial Von drei Dachziegeln (D1, D3 und D5) wurden die Klonbanken vom Ausgangsmaterial und der Durchlüftungskultur mit PCR-RFLP untersucht. Die Auftragungen der verdauten PCR- Produkte (NS1/18L) sind in Abbildung 6 und 7 zu sehen. Insgesamt gab es 15 verschiedene Schnittmuster, entsprechend wurden die Klone in 15 Gruppen eingeteilt. Die Gruppierung der Klone mit den zugehörigen Fragmentlängen der Schnittmuster sind in Tabelle 17 aufgeführt. Besonders häufig lag das Schnittmuster der Gruppen 1, 2 und 9 vor, in die sich Klone sowohl von Dachziegel D1 als auch von D3 einordnen. Es wurden also für die drei Dachziegel mindestens 15 verschiedene Eukaryoten erfasst, von denen einige auf zwei Dachziegeln D1 und D3 gefunden wurden: Gruppen 1, 2, 7, 9 auf den Dachziegeln D1 und D3, Gruppe 10 auf D1 und D5

Ergebnisse 33

1031 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp

400 bp

300 bp

200 bp

0 6 6 2 3 3 4 9 7 0 0 5 2 4 4 5 2

0 8 9 1 7 8 0 5 6 9 1 B D

7 8 C 1 1 5 7 7 1 1 5 1 6 2 5 6 6 7 2 5 A 7 8 9 1 1 6 6 6 1 1 2 6 6 1

------

------

1 1 1 1 3 3 3 3 3 3 1 3 1 3 3 3 3 3 3

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

D D D D D D D D D D D D D D D D D D D

D D D D D D D D D D D D D D

Gr.1 Gr.9 Gr.15 Gr.1 Gr.2 Gr.3Gr.4

Gr.6 Gr.7 Gr.8 Gr.9 Gr.10

Abb. 6 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbanken D1, D3 und D5. Spur a und c: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren b und d: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Gr.7 Gr.1 Gr.5 Gr.2 Gr.11 Gr.2 Gr.10 Gr.12 Gr.9 Gr.14 Gr.13

Abb. 7 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbanken D1, D3 und D5. Spur a: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren b: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

.

Ergebnisse 34

Tab.17 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus den Klonbanken von Ausgangsmaterial von D1, D3 und D5 Gruppe Fragmentlängen Anzahl der Klone (bp) Klone 1 700, 555, 470 8 D1-7, -8, -10, -14-16, -33, -38 D3-7-11, -13, -14, -56, -59, -61, -68, - 14 69, -72, -73 2 790, 650, 380 5 D1-6, -17, -23, -28, -36, 3 D3-60, -65, -66 3 790, 420, 350, 250 1 D1-20 4 790, 700, 220 1 D3-55 5 690, 555, 240 1 D3-57 6 960, 650, 1 D3-62 7 830, 690, 520 2 D1-2, -13, 1 D3-64, 8 690, 555, 230, 130 1 D3-74, 9 960, 535, 190 3 D1-25, -31, -40, 4 D3-17, -18, -20, -25 10 1200, 555 1 D3-52, 2 D5-45, -47 11 760, 650, 320 1 D3-53, 1 D1-35 12 950, 580, 300 1 D1-30 13 1020, 830 3 D1-18, -26, -32 14 950, 770, 500, 300, 1 D1-41 15 955, 590, 260 1 D3-19

Ergebnisse 35

Durchlüftungskultur D1.2 Aus der Durchlüftungskultur D1.2 wurden 28 positive Klone mit dem PCR-Produkt NS1/18L gewonnen und nur drei verschiedene Schnittmuster mit PCR-RFLP gefunden (Gruppe 16-18, Abb. 8, Tab. 18), wobei 26 Klone dasselbe Muster aufwiesen (Gruppe 16). Schwache Banden oberhalb der deutlich erkennbaren Banden (Abb. 8) sind vermutlich auf unvollständigen Restriktionsverdau zurückzuführen und wurden bei der Gruppierung nicht berücksichtigt.

1031 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp

400 bp

300 bp

200 bp

100 bp

7 9

1 2 3 4 5 6 8 0

3

0 2 4 6 7 8 9 0 1 B D

2 2

C 2 2 2 2 2 2 2 3

9 1 1

1 2 3 5 6 7 8 1 1 1 1 1 1 1 2

- -

A ------

- - -

------

2 2

2 2 2 2 2 2 2 2

2 2 2

2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

...... - . - .

...... - . - . - ......

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

D D D D D D D D D D

D D D D D D D D D D D D D D D D D D Gr.16 Gr.17 Gr.16 Gr.18 Gr.16

Abb. 8 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbanken D1.2 Spur a und c: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren b und d: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Ergebnisse 36

Tab.18 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D1.2 Gruppe Fragmentlängen Anzahl der Klone Klone (bp) PCR-Produkt NS1/18L 16 970, 550, 300 26 D1.2-1 -3, -6-14, -16-19, - 21-30 17 1100, 550, 176 1 D1.2-5 18 970, 300 1 D1.2-20

Bei den drei verschiedenen Gruppen der Durchlüftungskultur D1.2 handelt es sich vermutlich um Algen, da in der Durchlüftungskultur das Wachstum von Algen begünstig und das der Pilzen unterdrückt wird. Vergleicht man die Schnittmuster der einzelnen Gruppen von D1 (Tab. 17) mit denen von der Durchlüftungskultur D1.2 (Tab.18), so lassen sich deutliche Unterschiede feststellen. Insgesamt lagen von der Klonbank von Ausgangsmaterial D1 neun verschiedene Gruppen vor, während bei der Klonbank von Durchlüftungskultur D1.2 nur drei Schnittmuster gefunden wurden. Von beiden Klonbanken wurde das gleiche PCR-Produkt gewonnen, jedoch traten keine gemeinsamen Schnittmuster auf, so dass mit der Durchlüftungskultur vermutlich Eukaryoten erfasst wurden, die im Ausgangsmaterial nicht gefunden wurden.

Durchlüftungskultur D3.2 Bei der PCR-RFLP der Klonbank von Durchlüftungskultur D3.2 (PCR-Produkt M13F/M13R) wurden 33 positive Klone untersucht. Es wurden insgesamt 4 verschiedene Schnittmuster gefunden (Gruppen 19-22, Abb. 9, Tab. 19), wobei Gruppe 20 die meisten Klone enthält. Bei einigen Proben (z.B. D3.2_26 und D3.2_29) wurde das PCR-Produkt nur unvollständig verdaut, so dass neben den deutlich erkennbaren Banden im Gel auch schwache Banden der partiell verdauten Fragmente zu sehen sind (Abb. 9). Es wurden mindestens vier verschiedene Eukaryoten gefunden.

Ergebnisse 37

A B D

Gr.21 Gr.19 Gr.22 Gr.20 Abb. 9 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D3.2 Spur A und C: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren B und D: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Tab. 19 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D3.2 Gruppe Fragmentlängen (bp) Anzahl der Klone Klone PCR-Produkt M13F/M13R 19 1090, 630, 220 2 D3.2-29, -26 20 1280, 670 24 D3.2-1-3.-5, -6, -8, - 10, -11, -13-15, -18, - 19, -22-25, -27, -30- 34 21 1280, 570 6 D3.2-4, -7, -12, -16, -20, -21 22 1030, 540 1 D3.2-9

Ein Vergleich der Ergebnisse von Klonbank D3 und D3.2 zeigt, dass bei der Klonbank vom Ausgangsmaterial D3 viel mehr Schnittmuster, insgesamt 11 gefunden wurden (Tab. 17) als Ergebnisse 38 bei der Klonbank von Durchlüftungskultur D3.2, wo nur vier unterschiedliche Schnittmuster vorlagen. Jedoch können die Schnittmuster von D3 mit D3.2 nicht verglichen werden, da die PCR- Produkte für die PCR-RFLP-Untersuchung auf Grund verschiedener Primer unterschiedlich lang waren und daher die Schnittmuster bei gleichen Organismen unterschiedlich aussehen würden.

Durchlüftungskultur D5.2 Bei der PCR-RFLP der Klonbank von Durchlüftungskultur D5.2 (PCR-Produkt M13F/M13R) wurden 35 positive Klone untersucht. Es wurden drei verschiedene Gruppen mit unterschiedlichen Schnittmustern (Abb. 10) festgestellt (Gruppe 23-25, Abb. 10, Tab. 20), wobei 33 Klone mit demselben Schnittmuster die größte Gruppe bilden (Gruppe 23).

A BC D

Gr.23 Gr.23 Gr.25 Gr.24 Abb.10 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D5.2 Spur a und c: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren b und d: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Ergebnisse 39

Tab.20 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D5.2 Gruppe Fragmentlängen (bp) Anzahl der Klone PCR-Produkt Klone M13F/M13R 23 970, 520, 300 33 D5.2-2-20, -22-26, -36, -40, -42, -43, -45, -47, -49, -50, -52 24 1300, 520 1 D5.2-27 25 820, 520, 222 1 D5.2-1

Vergleicht man die Ergebnisse von Klonbank D5 und D5.2, so lassen sich deutlich Unterschiede in der Anzahl der gefundenen Schnittmuster feststellen. Bei der Klonbank vom Ausgangsmaterial D5 wurde nur ein Schnittmuster gefunden (Tab. 17), während bei der Klonbank von Durchlüftungskultur D5.2, insgesamt drei unterschiedliche Schnittmuster vorlagen. D.h. es wurden in der Klonbank vom Durchlüftungskultur mehr Eukaryoten gefunden als im Ausgangsmaterial. Ein Vergleich der Schnittmuster von D5 mit D5.2 ist allerdings nicht möglich, da die PCR-Produkte für die PCR-RFLP-Untersuchung auf Grund verschiedener Primer unterschiedlich lang waren und daher die Schnittmuster bei gleichen Organismen unterschiedlich aussehen würden.

Ergebnisse 40

Durchlüftungskulturen D2.2, D4.2, D6.2 und P1

DurchlüftungskulturD2.2 32 positive Klone aus Durchlüftungskultur D2.2 wurden mit PCR-RFLP untersucht. In Abbildung 11 sind die aufgetragenen verdauten PCR-Produkte (M13F/M13R) zu sehen. Aufgrund der Schnittmuster wurden vier verschiedene Gruppen gefunden (Gruppe 26-29), Abb. 11, Tab. 21), von denen das der Gruppe 26 mit 25 Klonen dominiert. In der Durchlüftungskultur D2.2 wurden also mindestens vier verschiedene Algen gefunden.

1031 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp

400 bp

300 bp

200 bp

A 11B11C2 36D

Gr.26 Gr.29 Gr.27 Gr.26 Gr.27 Gr.28 Abb. 11 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D2.2 Spur A und C: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren B und D: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Ergebnisse 41

Tab. 21 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D2.2 Gruppe Fragmentlängen (bp) Anzahl der Klone PCR-Produkte M13F/M13R Klone 26 650, 510, 325, 200 25 D2.2-2-4, -7-10, -13, -15, -18- 26, -28-30, -32-35 27 720, 530, 510, 325, 200 4 D2.2-11, -12, -14, -17 28 1360, 630 2 D2.2-1, -31 29 650, 510, 480, 320, 200 1 D2.2-5

Durchlüftungskultur D4.2 Von der Klonbank der Durchlüftungskultur D4.2 wurden 39 Klone (PCR-Produkt NS1/18L) mit PCR-RFLP untersucht. Aufgrund der verschiedenen Schnittmuster wurden zwei Gruppen (Gruppe 30, 31, Abb. 12, Tab. 22) gefunden, von denen Gruppe 30 mit 38 Klonen die größte ist. Das Gel ist im Bereich D4.2_1-D4.2_24 ungleichmäßig gelaufen, so dass die Banden nicht alle auf einer Höhe lagen, jedoch alle die gleichen Fragmentgrößen aufwiesen und zu Gruppe 30 zugeordnet wurden. Da nur zwei Schnittmuster gefunden wurden, scheinen hier lediglich zwei Algen vorhanden zu sein, wobei die aus Gruppe 30 sehr häufig in der Durchlüftungskultur vorkamen.

1031 bp 900 bp 800 bp 700 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp

11B92C02d5 A

Gr.30 Gr.31 Abb. 12 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D4.2 Spur A und C: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren B und D: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt. Ergebnisse 42

Tab. 22 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D4.2 Gruppe Fragmentlängen (bp) Anzahl der Klone Klone PCR-Produkte (NS1/18L) 30 1300, 490 38 D4.2-1-6, -8-17, -19-24, - 26-30, -32, -35-44 31 1052, 540 1 D4.2-7

Durchlüftungskultur D6.2 Von Durchlüftungskultur D6.2 wurden 39 PCR-Produkte (NS1/18L) mit dem Enzym MboI verdaut. Teilt man die Klone mit gleichen Schnittmustern in Gruppen ein, so ergeben sich 3 Gruppen (Gruppe 32-34, Abb. 13 und 14, Tab. 23). Davon ist Gruppe 32 mit 26 Klonen die größte. Schwache Banden oberhalb von 1380 bp sind auf einen unvollständigen Restriktionsverdau der PCR-Produkte zurückzuführen. Auch für diesen Standort finden sich also nicht mehr als drei verschiedene Algen. .

1A 2B7

Gr.32

Abb. 13 Auftragung 1 der PCR-RFLP der Klonbank D6.2 Spur A: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren B: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Ergebnisse 43

A B

Gr.33 Gr.34

Abb. 14 Auftragung 2 der PCR-RFLP der Klonbank D6.2 Spur A: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren B: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Tab. 23 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D6.2

Gruppe Fragmentlängen (bp) Anzahl der Klone Klone PCR-Produkt NS1/18L) 32 1340, 660 26 D6.2-2-7, -9-11, -13, -16-18, -24, -28-35, -37-40 33 1340, 560 11 D6.2-8, -12, -14, -15, -21, -22, - 26, -27, -36, -42, -43 34 207 2 D6.2-23, -44

Ergebnisse 44

Durchlüftungskultur P1 Es wurden 33 Klone (PCR-Produkt M13F/M13R) der Durchlüftungskultur P1 mit der PCR- RFLP-Methode untersucht. Insgesamt gab es drei verschiedene Schnittmuster, so dass drei Gruppen gebildet wurden (Gruppe 35-37, Abb. 15, Tab. 24). Das Schnittmuster von Gruppe 35 lag am häufigsten vor. Mit der PCR-RFLP Methode wurden in dieser Klonbank also mindestens drei verschiedene Algen gefunden.

AB1 27 28CD37

A B

Gr 35 Gr.36 Gr.35 Gr37 Gr.35

Abb.15 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank P1 Spur A und C: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren B und D: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Tab.24 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur P1 Gruppe Fragmentlängen Anzahl der Klone Klone (bp) PCR-Produkt M13F7M13R 35 1300, 650 27 P1-1-6, -8, -10, -12-15, -24, -26-28, -30-33, -35 36 1360, 620 5 P1-16, -17, -25, -29, -34 37 700, 650, 600 1 P1-7 Ergebnisse 45

Ein Vergleich der einzelnen Gruppen der vier Durchlüftungskulturen D2.2, D4.2 und D6.2 zeigt, dass in allen Durchlüftungskulturen jeweils eine Gruppe besonders häufig vorkam neben zwei bis drei weiteren kleinen Gruppen. Aufgrund der unterschiedlichen PCR- Produkt-Längen kann ein direkter Vergleich der Fragmentgrößen nur zwischen D4.2-D6.2 und P1-D2.2 erfolgen. Die Schnittmuster von D4.2 und D6.2 sehen auf den ersten Blick sehr ähnlich aus, jedoch unterscheiden sich die Fragmentgrößen voneinander (Tab. 22, 23), so dass hier verschiedene Eukaryoten vorliegen müssen. Auch die Klonbanken D2.2 und P1 (Tab. 21, 24) weisen verschiedene Fragmentgrößen auf, so dass hier ebenfalls unterschiedliche Algen vorhanden sein müssen.

Straßenpfeiler (Strpf) Von 48 positiven SSU rDNA-Klonen wurde das PCR-Produkt (NS1/18L) vom Ausgangsmaterial mit der PCR-RFLP-Methode untersucht. Es ergaben sich aufgrund der Schnittmuster 14 verschiedene Gruppen (Gruppe 39-51, Abb. 16, 17, Tab. 25) Drei Schnittmuster kamen sehr häufig vor, so dass drei große Gruppen (Gruppe 38, 42 und 45) und elf kleine Gruppen (Gruppe 39-41, 43, 44, 46-51) entstanden. Letztere sind jeweils durch ein bis zwei Klone vertreten sind. Einige Klone aus Gruppe 42 weisen zusätzliche Fragmente auf, die vermutlich auf unvollständigen Restriktionsverdau der PCR-Produkte zurückzuführen sind. Für diesen Standort wurden also mindestens 14 verschiedene Eukaryoten erfasst, die durch spätere Sequenzierung identifiziert werden sollten.

Ergebnisse 46 9 3 _36 _40 _47 _17 _41 _12 _20 _29 _4 _8 _42 _18 _19 _16 _11 _48 _46 _14 _10 f_ f_ f f f f f f f f f f f f f f f f f f f p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p r r r r r r r r r r r r r r r r r r r t t t t t t t t t t t t t t t t t t t S Str S S S S S S S S S S S S S S S Str S S S

Gr .45 Gr.38 Gr.44 Gr.48 Gr.39 Gr.42 Gr.43 Gr.41 Gr.42 Gr.40 Gr.51 Abb. 16 Auftragung 1 der PCR-RFLP der Klonbank Strpf Spur a: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren b: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

3 2 9 3 6 5 7 6 2 2 _ _ _ _ _ f f f f f p p p p p r r r r r St St St St St

Gr.42 Gr.46 Gr.38 Gr.42 Gr.39 Gr.45 Gr.49Gr.47

Gr.38

Abb.17 Auftragung 2 der PCR-RFLP der Klonbank Strpf, Spur a und b: Größenmarker „100bp Ladder“, Spuren c: Größenmarker „λ- DNA (EcoRI/HindIII)“ Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt. Ergebnisse 47

Tab. 25 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Ausgangsmaterial von Strpf Gruppe Fragmentlängen (bp) Anzahl Klone PCR-Produkt NS1/18L der Klone 38 990, 700 14 Strpf-4, -8, -12,-17,- 20, -26, -29, -38, --40, -41, -47, -54, -57, -60 39 680, 620, 340 2 Strpf-11, -50 40 620, 480, 220 1 Strpf-14 41 750, 480, 450, 270 2 Strpf-2, -19 42 770, 620, 350 11 Strpf-3, -16, -31, -35, -48, -51, - 53, -66, -68, -69, -72 43 770, 620, 320 1 Strpf-46 44 710, 535, 375, 300 1 Strpf-42 45 1030, 535, (280), 240, 90 9 Strpf-9, -36, -43, -45, -62-64, -67, -70 46 980, 770 3 Strpf-23, -39, -65 47 1300, 535 1 Strpf-56 48 940, 535, 375, 300 1 Strpf-18 49 780, 710, 240 1 Strpf-61 50 975, 770, 450 1 Strpf-30 51 1370 1 Strpf-10

Ergebnisse 48

Betonpfeiler (B)

Insgesamt 16 positive Klone (PCR-Produkt M13F/M13R) aus Klonbank B wurden mit PCR-RFLP untersucht. Es traten drei unterschiedliche Schnittmuster auf, so dass entsprechend drei Gruppen gebildet wurden (Gruppe 52-54, Abb. 18, Tab. 26). Da die Summe der Fragmente von Gruppe 53 nur 980 bp ergibt und das PCR-Produkt ca. 1800 bp lang ist, liegen vermutlich zwei Fragmente der gleichen Größe vor.

B1 B21 B2 B3 B4 B8 B7 B13 B15 B16 B20 B22 B14 B17 B18 B19 Gr.54 Gr.52 Gr.53 Abb.18 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank B Spur a Größenmarker „100bp Ladder“, Die aufgetragenen Klone und ihre Gruppenzugehörigkeit sind namentlich unter der jeweiligen Spur aufgeführt.

Tab. 26 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank vom Ausgangsmaterial des Betonsockels Gruppe Fragmentlängen (bp) Anzahl der Klone Klone PCR-Produkt M13F/M13R 52 850, 700, 180 10 B2-4, -7, -8, -13, -15, -16, -20, -22 53 790 (2x), 180 4 B14, -17, -18, -19 54 1300, 620 2 B1, -21

Für diesen Standort wurden also mindestens drei verschiedene Eukaryoten gefunden. Ergebnisse 49

3.3 Phylogenetische Analysen

3.3.1 18S rDNA Sequenzierung der Klonbanken

Aus jeder der ermittelten Gruppe der PCR-RFLP-Analyse (3.2) wurde ein Klon zur DNA- Sequenzierung ausgewählt. Die 18S rDNA der positiven Klone wurde zum Ansequenzieren mit den Primern 80F+1422R sequenziert. Die bearbeiteten Sequenzdaten wurden mit Hilfe der BLAST-Funktion auf der Webseite von NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) mit Einträgen in der NCBI- Datenbank verglichen. In Tabelle 27 sind die ansequenzierten SSU rDNA Klone der einzelnen Gruppen und die Ergebnisse der Sequenzvergleiche aufgeführt. Es liegen nicht von allen RFLP-Gruppen 18S rDNA-Sequenzen vor, da die Qualität mancher PCR-Produkte für die Sequenzierung nicht ausreichend war und aus zeitlichen Gründen keine neuen PCR-Produkte amplifiziert werden konnten.

Ergebnisse 50

Tab. 27 Ergebnisse der Sequenzvergleiche der ausgewählten SSU rDNA-Klone (A=Alge, P=Pilz) RFLP- Ausgewähl- Länge der BLAST Search A P Phylogenetische Gruppe ter Klon Teilsequen- nächst verwandte Sequenz Stellung aufgrund zen („best hit“) der BLAST- mit Accession Nr. ergebnisse 1 D3_59 1636 bp Klebsormidium subtilissimum + Streptophyta 18S partial AF408240.1 Klebsomidiophyceae 2 D1_17 885 bp Chaetosphaeridium ovalis + Streptophyta , 3 D1_20 1176 bp C.perforans 18S rRNA gene + Ascomycota; Y11714 mitosporic Ascomycota 5 D3_57 1611 bp K. subtilissimum + Streptophyta 18S partial AF408240.1 Klebsormidiophyceae 6 D3_62 1187 bp Glyphium elatum 18S partial + Ascomycota; AF346419 Pezizomycotina 7 D1_2 1574 bp Klebsormidium flaccidum + Streptophyta Klebsormidiophyceae 8 D3_74 1681 bp Klebsormidium subtilissimum + Streptophyta 18S partial AF408240.1 Klebsormidiophyceae 9 D3_20 1743 bp Zygnema circumcarinata group I + Streptophyta intron DNA sequence X79495 Conjugatophyceae 9 D1_25 1197 bp Mesotaenium cf. + Streptophyta chlamydosporum Conjugatophyceae 18S partial AJ553923 10 D5_45 Trebouxia jamesii + Chlorophyta Trebouxiophyceae 11 D3_53 1158 bp Phaeotrichum benjaminii 18S + Ascomycota; partial AY016348 Pezizomycotina 14 D1_41 1160 bp Cephaliophora muscicola 18S + Ascomycota; partial AB001108 mitosporic Ascomycota 15 D3_19 1153 bp Mesotaenium chlamydosporum + Streptophyta 18S partial AJ553923 Conjugatophyceae 16 D1.2_25 1225 bp Chlorophyten Isolat BC98 18S + Chlorophyta rDNA AJ302940.1 Trebouxiophyceae 16 D1.2_19 1141 bp Chlorophyten Isola BC98 18S + Chlorophyta rDNA AJ302940.1 Trebouxiophyceae 21 D3.2_26 1165 bp Scenedesmus subspicatus 18S + Chlorophyta partial AJ249514.1 Chlorophyceae 20 D3.2_34 1164 bp Scenedesmus subspicatus 18S + Chlorophyta partial AJ249514.1 Chlorophyceae 25 D5.2_1 1078 bp Chlorophyten Isolat BC98, 18S + Chlorophyta rDNA AJ302940.1 Trebouxiophyceae 24 D5.2_27 1222 bp Chlorophyten Isolat BC98 18S + Chlorophyta rDNA AJ302940 Trebouxiophyceae 23 D5.2_50 1196 bp Chlorophyten Isolat BC98 18S + Chlorophyta rDNA AJ302940 Trebouxiophyceae 26 D2.2_8 1363 bp Chlorella' saccharophila 18S + Chlorophyta partial AB058301 Trebouxiophyceae 27 D2.2_17 1513 bp Chlorella' saccharophila 18S + Chlorophyta partial AB058301 Trebouxiophyceae 28 D2.2_31 1061 bp Raphidonema nivale 18S rDNA + Chlorophyta AF448477 Trebouxiohyceae 29 D2.2_5 1401 bp Chlorella' saccharophila 18S + Chlorophyta partial AB058301 Trebouxiophyceae 31 D4.2_1 1175 bp Scenedesmus abudans gene + Chlorophyta 18S partial AJ249514 Chlorophyceae Ergebnisse 51

- Fortsetzung Tab.27 Ergebnisse der Sequenzvergleiche der ausgewählten SSU rDNA-Klonen (A=Alge, P=Pilz)

RFLP- Ausgewähl- Länge der Blast Search nächst verwandte A P Phylogenetische Gruppe ter Klon Teilsequen Sequenz („best hit“) Stellung aufgrund zen mit Accession Nr. der BLAST- Ergebnisse 31 D4.2_20 1149 bp Scenedesmus subspicatus + Chlorophyta 18S partial AJ249514 Chlorophyceae 32 D6.2_2 1228 bp Scenedesmus subspicatus + Chlorophyta 18S partial AJ249514.1 Chlorophyceae 33 D6.2_36 1142 bp Scenedesmus subspicatus + Chlorophyta 18S partial AJ249514 Chlorophyceae 35 P1_14 1106 bp Scenedesmus subspicatus + Chlorophyta 18S partial AJ249514.1 Chlorophyceae 36 P1_17 1119 bp Scenedesmus subspicatus + Chlorophyta 18S partial AJ249514.1 Chlorophyceae 37 P1_7 1157 bp Scenedesmus subspicatus + Chlorophyta 18S partial AJ249514.1 Chlorophyceae 38 Strpf_40 1196 bp Anguillospora filiformis + Ascomycota 18s partial AY178825 mitosporic Ascomycota 39 Strpf_11 1217 bp Friedmannia israeliensis + Chlorophyta 18S rDNA M62995 Trebouxiophyceae 40 Strpf_14 1242 bp Glyphium elatum + Ascomycota; Pezizomycotina 41 Strpf_19 1230 bp Calvatia gigantea + Basidiomycota; 18s partial AJ237864 Hymenomycetes 42 Strpf_66 1221 bp Graphium calicioides + Ascomycota; 18S partial Pezizomycotina AB007655 43 Strpf_46 1180 bp Phialophora verrucosa + Ascomycota; 18S partial AJ232945 Pezizomycotina; 44 Strpf_42 1224 bp Calvatia gigantean + Basidiomycota; 18s partial AJ237864 Hymenomycetes 45 Strpf_70 1143 bp Myrmecia astigmatica + Chlorophyta 18S rDNA Z47208 Trebouxiophyceae 46 Strpf_39 1166 bp Cucurbitaria berberdis + Ascomycota; 18S partial U42481 Pezizomycotina 47 Strpf_56 1281 bp Serpula lacrymans + Basidiomycota; 18S rDNA gene AJ440945 Hymenomycetes 54 B1 1281 bp Scenedesmus subspicatus + Chlorophyta Chlorophyceae 55 B17 1282 bp Scopulariopsis brevicaulus + Ascomycota; 18S rDNA gene Pezizomycotina AY083220 56 B3 1228 bp Scopulariopsis brevicaulus + Ascomycota; 18S rDNA gene Pezizomycotina AY083220

Die BLAST-Ergebnisse zeigen, dass 14 RFLP-Gruppen Pilze, d.h. vorwiegend Ascomyceten, darstellen (Tab. 27). Alle Pilzklone gehören zu den Klonbanken, die aus dem Ausgangmaterial, d.h. von Dachziegeln und dem Standort Straßenpfeiler (Strpf) gewonnen wurden. Von den insgesamt elf sequenzierten Gruppen bei der Klonbank „Strpf“ sind nur zwei Algen zuzuordnen (Tab. 27). Ergebnisse 52

Die Sequenzen der Gruppen aus Durchlüftungskulturen repräsentieren nur Algen, d.h. es wurden keine Pilze in den Durchlüftungskulturen gefunden. Für 28 RFLP-Gruppen wurden acht verschiedene Algensequenzen ermittelt. Es wurden Algen gefunden, die sowohl in den Durchlüftungskulturen als auch im Ausgangsmaterial vorkamen. So findet man z. B. eine Scenedesmus-ähnliche Alge für alle Gruppen in den Durchlüftungskulturen P1 und D3.2, D4.2, D6.2 und für eine Gruppe im Ausgangsmaterial des Betonsockels (Tab. 27). Andere Algen waren nur für das Ausgangsmaterial nachzuweisen. Auf dem Dachziegel wurden Klebsormidium und Mesotaenium-ähnliche Algen gefunden, die in keiner Durchlüftungskultur vorlagen. Aber es konnten auch für die Durchlüftungskultur Algen gefunden werden, die wiederum nicht im Ausgangsmaterial vorhanden waren. Hier sind als Beispiele Chlorella saccharophila und Ch. ellipsoidea- ähnliche Algen zu nennen (Tab. 27). Keiner der Algenklone vom Dachziegel war in der Klonbank des Straßenpfeilers zu finden. Für die zwei Sequenzen der Algenklone aus der Straßenpfeilerklonbank waren die nächstverwandten verfügbaren Sequenzen die von Friedmannia israeliensis und Myrmecia astigmatica.

Die Sequenzen der Algenklone wurden also drei verschiedenen Algen aus der Abteilung der Streptophyta, vier verschiedenen Algen aus der Klasse der Trebouxiophyceae und einer Alge aus der Klasse der Chlorophyceae zugeordnet.

Die Pilzklone wurden in dieser Arbeit aus zeitlichen Gründen nicht weiter bearbeitet, d.h. es wurden auch keine phylogenetischen Analyse durchgeführt. Für die phylogenetischen Analysen wurden neun verschiedene Algenklone ausgewählt (Tab. 29a und b), deren 18S rDNA-Sequenzen mit den Primern 1050F+600R vervollständigt und in die Vergleichsdatensätze eingefügt wurden.

Ergebnisse 53

3.3.2 18S rDNA Sequenzierung der Algenisolate

Die isolierten Algenstämme wurden mit dem Lichtmikroskop untersucht und für die molekulargenetischen Analysen wurden 12 morphologisch unterschiedliche Kulturen ausgewählt (3.4). Die 18S rDNA wurde mit der Primerkombination 80F+1422R und 1050F+600R komplett sequenziert und die Sequenzen ebenfalls mithilfe der Datenbank im BLAST-Programm verglichen. Die Ergebnisse der Sequenzvergleiche sind in Tabelle 28 dargestellt. Da hier im Gegensatz zu den Klonbanken die Isolate schon aufgrund ihrer Morphologie unterschieden wurden, diente der Sequenzvergleich vorwiegend der groben Zuordnung in die jeweiligen Datensätze für die Stammbaumberechnungen.

Tab. 28 Ergebnisse der Sequenzvergleiche der isolierten Algenstämme Algenstamm Sequenzlänge Blast Search Phylogenetische Stellung anhand der BLAST- Ergebnisse D3a 1734 bp Asterarcys quadricellulare Chlorophyta, Trebouxiophyceae D1e 1703 bp Chlorophyten Isolat 18S Chlorophyta, Trebouxiophyceae D2_G12* 2094 bp Chlorella saccharophila Chlorophyta, (mit Intron) Trebouxiophyceae D2_G4* 1754 bp Stichococcus bacillaris Chlorophyta, Trebouxiophyceae D2_H8* 1228 bp Stichococcus bacillaris Chlorophyta, Trebouxiophyceae D2_F9* 1142 bp Chlorella saccharophila Chlorophyta, Trebouxiophyceae P3_F11* 1706 bp Chlorella luteoviridis Chlorophyta, Trebouxiophyceae P3b 1740 bp Pleurastrum insigne Chlorophyta, Chlorophyceae D5I 1653 bp Klebsormidium flaccidum Streptophyta, Klebsormidiophyceae D3_B12* 1962 bp Haematococcus pluvialis Chlorophyta, Chlorophyceae D4_E1* 1756 bp Scenedesmus subspicatus Chlorophyta, Chlorophyceae D5_A4* 1570 bp Chlorophyten Isolat 18S Chlorophyta, Trebouxiophyceae * = aus Durchlüftungskultur isoliert

Tab. 29a Übersicht der sequenzierten Klone und deren phylogenetische Stellung aufgrund der Sequenzanalysen RFLP PCR- Klone Länge der BLAST Accession Phylogenetische Stellung Komplette Gruppe Primer Teilsequen- Nr. (Abb. 18-20) Sequenzen zen 1 NS1/18L D1_25, 1197 bp Mesotaenium und AJ553923 Streptophyta; Conjugatophyceae 1773 bp D3_20 1743 bp Z.circumcarinata X79495 1743 bp 2 NS1/18L D1.2_19 1225 bp ChlorophytenIsolat BC98 AJ302940.1 Trebouxiophyceae, Coccomyxa-Clade 1744 bp 3 M13F/M13 D2.2_17 1513 bp Chlorella saccharophila AB058301 Trebouxiophyceae, Chlorocloster-Clade 2242 bp R 4 M13F7M1 D2.2_31 1061 bp Raphidonema nivale 18S AF448477 Trebouxiophyceae, Stichococcus-Clade 1935 bp 3R 5 NS1/18L D4.2_1 1175 bp Scenedesmus abundans X73995 Chlorophyceae, Desmodesmus-Clade 2392 bp D4.2_20 1149 bp Scenedesmus subspicatus AJ249514 Chlorophyceae, Desmodesmus-Clade 1734 bp 6 NS1/18L Strpf_11 1217 bp Friedmannia israeliensis M62995 Trebouxiophyceae, Apatococcus-Clade 1746 bp 7 NS1/18L Strpf_70 1143 bp Myrmecia astigmatica Z47208 Trebouxiophyceae, Apatococcus-Clade 1743 bp

Tab. 29b Übersicht der sequenzierten Algenkulturen und deren phylogenetische Stellung aufgrund der Sequenzanalysen Algen- PCR- BLAST Accession Phylogenetische Stellung Komplette isolate Primer Nr. (Abb. 18-20) Sequenzen D3a NS1/18L Asterarcys quadricellulare AF388375 Trebouxiophyceae, Chlorella-Clade 1734 bp D1e NS1/18L Chlorophyten-Isolat BC98 AJ302940.1 Trebouxiophyceae, Coccomyxa-Clade 1703 bp D5I NS1/18L Klebsormidium flaccidum AF408240 Streptophyta, Klebsomidiales 1653 bp P3b NS1/18L Pleurastrum insigne Z28972 Chlorophyceae, Stephanosphaera-Clade 1740 bp P3-F11 NS1/18L Chlorella luteoviridis X73998 Trebouxiophyceae, Chlorocloster-Clade 1710 bp D3-B12 NS1/18L Haematococcus pluvialis AF159369 Chlorophyceae, Polytoma-Clade 1962 bp D2-G4 NS1/18L Stichoccous bacillaris AJ416107 Trebouxiophyceae, Stichococcus-Clade 1754 bp D2-G12 NS1/18L Chlorella saccharophila AB058301 Trebouxiophyceae, Chlorocloster-Clade 2094 bp D4-E1 NS1/18L Scenedesmus subspicatus AJ249514 Chlorophyceae, Desmodesmus-Clade 1754 bp D5-A4 NS1/18L Chlorophyten Isolat BC98 AJ302940.1 Trebouxiophyceae, Coccomyxa-Clade 1570 bp

Ergebnisse 55

Es wurden zehn verschiedene Algenstämme isoliert, da die Kulturen D2-G2+D2-H8 und D2- G12+D2-F9 jeweils gleich waren. Die Algen ordnen sich nach BLAST-Ergebnissen in drei verschiedene Klassen ein: die Trebouxiophyceae, Chlorophyceae und Klebsormidiophyceae. Wie bei den Klonbanken gehören die meisten Sequenzen der Isolate in die Klasse der Trebouxiophyceae (Tab. 28). Ein Vergleich zwischen den Algenisolaten und den Klonbanken von Ausgangsmaterial und Durchlüftungskultur zeigt, dass vier Algen, Scenedesmus, Klebsormidium, Chlorella saccharophila und das Chlorophyten-Isolat BC98 sowohl in den Klonbanken als auch bei den isolierten Algenstämmen als „best hit“ vorkamen. Die anderen Algenkulturen die isoliert wurden, konnten in den Klonbanken nicht nachgewiesen werden: Chlorella luteoviridis, Haematococcus pluvialis, Pleurastrum insigne, Stichococcus bacillaris und Asterarcys quadricellulare. Mit der Isolierung der Algen aus dem Ausgangsmaterial und den Durchlüftungskulturen wurden sechs zusätzliche Algen erfasst. Drei der Algen wurden aus dem Ausgangsmaterial isoliert und nicht in den Durchlüftungskulturen gefunden.

Die Sequenzen der isolierten Algenkulturen wurden ebenfalls für die phylogenetischen Analysen in die entsprechenden Vergleichsdatensätze eingefügt.

3.3.3 Phylogenetischen Analysen der 18S rDNA

Die Sequenzen der isolierten Algenstämme und Algenklone verteilen sich auf drei Datensätze, die die Klassen Trebouxiophyceae und Chlorophyceae der Chlorophyta sowie die Abteilung Streptophyta repräsentieren. Die Vergleichsdatensätze wurden aus laufenden Untersuchungen zur Verfügung gestellt, wobei auch unpublizierte Sequenzen mit einbezogen wurden. Die Stammbaumanalysen wurden für drei Datensätze mit zwei Analyseverfahren, der Distanz- (NJ), und weighted-Maximum Parsimony-Analyse (wMP), durchgeführt. Über das Alignment wurde eine Maske gelegt, d.h. die besonders variablen Bereiche, die sich nicht eindeutig homologisieren ließen, wurden aus den phylogenetischen Analysen ausgeschlossen. Sowohl bei der NJ- als auch der wMP-Analyse wurden die Bootstrap-Werte berechnet. Die Cladogramme und jeweiligen Bootstrap-Werte beider Analysen wurden miteinander verglichen. Ergebnisse 56

Es hat sich gezeigt, dass beide Verfahren für alle drei Datensätze praktisch jeweils die gleiche Stammbaumtopologie lieferten. Zur Darstellung der Ergebnisse wurden die Cladogramme der Parsimony-Analyse ausgewählt. Es werden jedoch aus beiden Analysen die Bootstrap-Werte (2000 Replikate) (wMP/NJ) angegeben. Um einen direkten Vergleich der Sequenzen der Algenklone, isolierten Algenstämme und deren Referenzstämme zu haben, wurden in dem Programm „BioEdit“ die Basenunterschiede der jeweiligen Sequenzpaare festgestellt und gezählt. In Tabelle 30 ist die Anzahl der Basenunterschiede und deren Position für alle untersuchten Sequenzen aufgeführt. Bei über 20 Basenunterschieden wurden die einzelnen Positionen aus Übersichtsgründen nicht aufgeführt.

Phylogenetische Stellung der Klone/Kulturen innerhalb der Trebouxiophyceae

Der Datensatz der Trebouxiophyceae umfasste insgesamt 71 Taxa, von denen zwei die Außengruppe darstellten. Als Außengruppe wurden zwei Stämme (Nephroselmis pyriformis CCMP 717 und Nephroselmis olivacea SAG 40.89) als Vertreter der Prasinophyceae ausgewählt. Der Stammbaum ist in Abbildung 19 gezeigt. Von den 18 untersuchten Sequenzen der isolierten Algenstämme und Algenklone wurden zwölf in die Trebouxiophyceae eingeordnet.

1) Der Stamm D2-G4 und der Klon D2.2_31 ordneten sich in das Stichococcus-Clade ein. Dabei bildete das Stichococcus-Clade mit 100% / 100% eine monophyletische Gruppe (Abb. 19). Zu den Sequenzen von D2-G4 und D2.2-31 waren „Coccomyxa Graz“ und die Sequenz der Fassadenalge Ro771 mit einer Bootstrap-Unterstützung von 96% / 73% die nächstverwandten Stämme. Die Sequenzen von D2-G4 und D2.2- 31 unterschieden sich lediglich an vier Positionen (Tab. 30), so dass sie die gleiche Alge repräsentieren könnten. Der genetische Abstand zu Coccomyxa Graz war ebenfalls nicht sehr groß (sieben Basenunterschiede). Die zwei Dachziegelsequenzen bildeten zusammen mit denen der Fassadenalge Ro771 und Coccomyxa Graz eine neue Gruppe innerhalb des Stichococcus-Clade und repräsentierten alle unbekannte Umweltisolate.

Ergebnisse 57

2) Die Sequenz des isolierten Kulturstamm D3a fiel mit einer Unterstützung von 78% / 79% in die Chlorellales, bildete jedoch eine eigene Linie und ließ sich keiner der Sequenzen klar zuordnen. Der Stamm Chlorella vulgaris SAG 211-11b aus den Chlorellales wurde als Referenzstamm für D3a gewählt auch wenn sich die Sequenzen in 79 Positionen unterschieden (Tab. 30).

3) Im Coccomyxa-Clade fanden sich die Sequenzen der Stämme D1e und D5-A4 sowie die Sequenz des Klons D1.2-19 wieder.

4) Der Kulturstamm D1e bildete innerhalb des Coccomyxa-Clade eine eigene Linie, die mit einem Bootstrap-Wert von 71% / 71% und der hohen Anzahl an Basenunterschieden (65, Tab. 30) unterstützt wurde. Die Schwestergruppe zu D1e wiederum gliederte sich in zwei kleinere Gruppen. Der Klon D1.2-19 und der Kulturstamm D4-A4 ordneten sich beide in eine der zwei Gruppen ein. Dabei bildete D5-A4 innerhalb der Gruppe eine eigene Linie, was wiederum mit 100% / 100% gut unterstützt wurde. Als Referenzkultur zu allen drei Sequenzen wurde Coccomyxa mucigena SAG 216-4 ausgewählt, aber nur die Sequenz von Klon D1.2_19 stand in nächster Verwandtschaft zu der Referenzkultur mit nur sechs Basenunterschieden (Tab. 30)

5) Der Klon D5-47 fiel in die Trebouxiales innerhalb der Gattung Trebouxia, die mit 100% / 100% monophyletischen Ursprungs war. Die Gruppe wurde in zwei weitere kleine Gruppen geteilt, wobei D5-47 und der Stamm Trebouxia jamsii 86.132E2 mit einer Bootstrap-Unterstützung von 100% / 93% eine Linie bildeten. Die Sequenzen unterschieden in sich 38 Basen. Die Sequenz des Klons D5-47 repräsentiert wahrscheinlich eine Alge der Gattung Trebouxia.

6) Das Chlorocloster-Clade wurde in den Analysen in zwei monophyletische Linien aufgespalten, die beide signifikant mit 100% / 100% unterstützt wurden. Allerdings fand Zusammenfassung dieser beiden Linien nur in der wMP-Bootstrap-Analyse hohe Unterstützung mit 99%, während der Bootstrap-Wert der NJ-Analyse nur bei 64% lag. Bei letzterer fiel der Stamm Watanabe reniformis SAG 211-9b in das Chlorocloster-Clade und bildete eine dritte Linie (nicht gezeigt); dieser Stamm wurde Ergebnisse 58

in der wMP-Analyse außerhalb des Chlorocloster-Clades als Schwestergruppe zu diesem eingeordnet (Abb. 19).

7) Die Sequenzen von Stamm D2-G12 und Klon D2.2-17 fanden sich in einer Linie mit Chlorella saccharophila SAG 211-9a wieder. Die Stämme D2-G12 und Ch. saccharophila SAG 211-9a clustern zusammen. Ihre Sequenzen unterschieden sich lediglich in 5 Positionen. Der Klon D2.2-17 stellte eine Schwestergruppe zu diesen dar und wies 29 Basenunterschiede zu Ch. saccharophila SAG 211-9a auf. Diese Gruppierung fand Bestätigung in den hohen Bootstrap-Werten von 100% / 90%. Hier wurden also zwei Ch. saccharophila-ähnliche Algen gefunden.

8) Eine gute Unterstützung mit 100% / 100% fand auch die Einordnung des isolierten Algenstamms P3-F11 in eine Gruppe des Chlorocloster-Clades. In diese Gruppe ordneten sich zudem Dachziegelklone aus früheren Untersuchungen (P1Alge-35a und P1Alge-33) und die Sequenz einer Fassadenalge aus Rostock (Fassadenalge Ro771). Die Referenzkultur zu P3-F11 ist Ch. luteoviridis SAG 211-2a (Abb. 19).

9) Beim Vergleich der Sequenzen von P3-F11 und Ch. luteoviridis SAG 211-2a wurden zwölf unterschiedliche Basen gefunden (Tab. 30).

10) Die Klone Strpf11 und Strpf70 ordneten sich in das Apatococcus-Clade ein, das eine monophyletische Gruppe bildete. Das Clade war mit 100% /100% sehr gut unterstützt und wurde in zwei Gruppen geteilt. Die eine Gruppe wurde von Dachziegelklonen (P2-12a, P2-19a, P2-17a und P2-16a) aus vorherigen Untersuchungen gebildet und die andere von u. a. Apatococcus lobatus SAG 2037, sowie zwei weiteren Dachziegelklonen früherer Analysen und den Straßenpfeiler-Klonen Strpf11 und Strpf70. Beide Strpf-Klone sind nahe verwandt, was durch den hohen Bootstrap- Wert von 100% / 100% bestätigt wurde (Abb. 19). Die Referenzkultur zu den beiden Klonen war Apatococcus lobatus SAG 2037. Auf dem Straßenpfeiler wurden also Apatococcus-ähnliche Algen gefunden, die durch die Klone repräsentiert wurden.

Ergebnisse 59

65/51 from Gingko isolate BC98 100/100 Coccomyxa mucigena SAG 216-4 D1.2-19 71/71 D5-A4 Coccomyxa-Clade Coccomyxa IBV16 100/100 Coccomyxa chodatii SAG 216-2 69/74 98/82 Coccomyxa pringsheimii SAG 69.80 D1e Choricystis minor SAG 251-1 P13-all Chlorella angustoellipsoidea SAG 2041 Chlorella trebouxioides SAG 3.95 Fassadenalge Ro482 100/100 Chlorocloster engadinensis SAG 812-1 Chlorella saccharophila SAG 211-9a Chlorocloster- D2-G12 Clade 100/90 D2.2-17 86/65 P1Alge-35a 99/64 100/100 Fassadenalge Ro771 100/100 Chlorella luteoviridis SAG 211-2a 86/65 P3-F11 P1Alge-33 Watanabea reniformis SAG 211-9b 100/100 Lobosphaera tirolensis ASIB S234 Myrmecia bisecta ASIB T74 100/100 Asterochloris phycobiontica SAG 26.81 93/82 Trebouxia magna UTEX 902 Myrmecia biatorellae UTEX 907 100/93 Trebouxia jamesii 86.132E2 Trebouxiales D5-47 100/100 Trebouxia usneae 87.019A1 96/73 Coccomyxa Graz Fassadenalge Ro474 68/55 D2.2-31 96/97 D2-G4 Diplosphaera SAG 48.86 100/100 P1Alge-39a Diplosphaera sp. SAG 49.86 Chlorella sphaerica SAG 11.88 100/100 Stichococcus bacillaris SAG 379-1b Stichococcus-Clade 100/99 Prasiola crispa SAG 43.96 P1Alge-36a Pabia signiensis SAG 7.90 100/98 Raphidonema nivale CCAP 470/4 Hormidiospora verrucosa SAG 8.85 Chlorella ellipsoidea SAG 211-1a Chlorella mirabilis Andreyeva 748 I Coenocystis inconstans SAG 2040 Chlorella kessleri SAG 211-11c 100/100 Closteriopsis acicularis SAG 11 86 Dicloster acuatus SAG 41.98 99/100 Muriella terrestris ASIB V38 Chlorellales Chlorella vulgaris SAG 211-11b 78/79 Chlorella sorokiniana strain Prag A14 D3a Leptosira obovata SAG 463-3 100/100 100/100 Dictyochloropsis symbiontica SAG 12.86 Dictyochloropsis irregularis SAG 2036 88/84 P2-2a 100/100 Apatococcus lobatus SAG 2037 P2-5a Strpf70 100/100 100/100 Strpf11 Apatococcus- P2-12a Clade P2-19a P2-17a P2-16a 100/100 Microthamnion kuetzingianum UTEX 1914 Coelochlamys perforata UTEX 2104 Nephroselmis pyriformis CCMP 717 Nephroselmis olivacea SAG 40.89 Prasinophyceae 10 changes

Abb.19 Weighted Maximum Parsimony-Stammbaum der Trebouxiophyceae. Die hervorgehobenen Äste werden von beiden Verfahren, wMP und NJ, gut unterstützt; die jeweiligen Bootstrap-Werte von den wMp-Analysen (links) und der Neighbor-Joining-Analyse (rechts) sind über den Ästen aufgeführt. Die isolierten Algenstämme und Algenklone sind rot hervorgehoben.

Ergebnisse 60

Phylogenetische Stellung der Klone/Kulturen innerhalb der Chlorophyceae

Die Chlorophyceae gliedern sich in zwei große Gruppen: die CW-Gruppe und die DO- Gruppe. Die CW-Gruppe bildet eine monophyletischen Gruppe, während die DO-Gruppe sich aus mehreren Abstammungslinien zusammensetzt (PRÖSCHOLD et al. 2001). Innerhalb der CW-Gruppe sind die Basalkörper des Geißelapparates der begeißelten Zellen im

Uhrzeigersinn (engl. clockwise) orientiert (DEASON et al. 1991; NAKAYAMA et al. 1996) während die Basalkörper von begeißelten Zellen der DO-Gruppe direkt gegenüber liegen

(engl. directly opposite) (WATANABE und FLOYD 1989).

Der Datensatz der Chlorophyceae umfasste insgesamt 46 Taxa. Als Außengruppe wurden wiederum Vertreter der Ulvophyceae und Prasinophyceae ausgewählt. Das Kladogramm der wMP-Analyse für die Chlorophyceae ist in Abbildung 20 gezeigt. Die Sequenzen der drei isolierten Algenkulturen P3b, D3-B12 und D4-E1b sowie die der Algenklone D4.2-1 und D4.2-20 ordneten sich in drei verschiedene Gruppen, innerhalb der beiden Schwestergruppen CW und DO ein.

1) Die Kultur P3b fiel in das Stephanosphaera-Clade innerhalb der CW-Gruppe.

2) Das Stephanophaera-Clade bildete mit 99% / 100 % eine monophyletische Gruppe. P3b stand in nächster Verwandtschaft zu den Stämmen Chlamydopodium vacuolatum M63001 und Chlorococcum citriforme SAG 62.80, was durch einen hohen Bootstrap-Wert (99% / 91 %) unterstützt wurde (Abb. 20). Bei der Kultur P3b handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um eine Alge der Gattung Chlorococcum, da die Basenunterschiede zu der Referenzkultur Chlorococcum citriforme SAG 62.80 sehr gering waren (6, siehe Tab. 30)

3) Der isolierte Kulturstamm D3-B12 ordnete sich in das Chlorogonium-Clade ein. Die nächstverwandte Sequenz zu D3-B12 war die von Haematococcus pluvialis SAG 34- 1b. Auch hier fand die nahe Verwandtschaft der Sequenzen eine signifikante Unterstützung durch die geringe Anzahl der Basenunterschiede (Tab. 30) und Bootstrap-Werten von 99% / 100 %. Bei der Kultur D3-B12 handelt es sich wahrscheinlich um einen Vertreter der Gattung Haematococcus, was auch anhand der Morpholgie (siehe Kapitel 3.4) zu erkennen war. Ergebnisse 61

4) Die Sequenzen der Kultur D4_E1b und der Klone D4.2_1 und D4.2_20 ordneten sich in das Desmodesmus-Clade innerhalb der DO-Gruppe. Das Desmodesmus-Clade war zu 100/100% monophyletischen Ursprungs und bildete die Schwestergruppe zum Scenedesmus-Clade. Die Kultur und die beiden Klone standen in nächster Verwandtschaft zu den Stämmen D. costato granulatus SAG18.81 und D. abundans UTEX 343. Beim Vergleich der Sequenzen wurden jedoch noch viele Basenunterschiede gefunden (Tab. 30). Die Klone repräsentieren also eine Alge, die zu der Gattung Desmodesmus gehört, sich aber genetisch von beiden hier aufgeführten Stämmen unterscheidet. Ergebnisse 62

CW- Gruppe 100/100 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 1061 100/100 Volvox carteri UTEX 1885 Chlamydomonas asymmetrica SAG 70.72 Reinhardtii-Clade Lobochlamys culleus SAG 17.73 99/100 Oogamochlamys zimbabwiensis SAG 45.91 Botryococcus braunii Nonomura Ettlia minuta UTEX 776 85/93 Chlamydopodium starrii UTEX 111 79/99 Chlamydopodium vacuolatum M63001 Stephano- 98/91 P3b sphaera- 96/99 Chlorococcum citriforme SAG 62.80 Clade 99/100 Chlorococcum sphacosum SAG 66.80 Chlorococcum vacuolatum SAG 213-8 Chlorococcum minutum SAG 213-7 Stephanosphaera sp. UTEX 2409 99/100 Haematococcus pluvialis SAG 34-1b D3-B12p Chlorogonium-Clade Chlorogonium euchlorum SAG 12-2d Asteromonas gracilis UTEX 635 84/94 Dunaliella-Clade 99/100 Dunaliella salina Chile 100/100 Chlamydomonas moewusii UTEX 9 96/96 Heterotetracystis akinetos SAG 28.95 Moewusii- 94/92 Chloromonas reticulata SAG 26.86 Clade Chloromonas serbinowi UTEX 492 Aphanochaete magna UTEX 1909 57/56 77/65 Chaetophora incrassata UTEX 1289 Chaetophorales Schizomeris leibleinii UTEX 1228 51/52 Monoraphidium braunii SAG 2006 DO-Gruppe 100/100 Monoraphidium neglectum SAG 48.87 Ankistrodesmus stipitatus SAG 202-5 Chlorella zofingiensis SAG 211-14a 100/100 Chaetopeltis orbicularis UTEX 422 Floydiella terrestris UTEX 1709 Chaetopeltidales 98/100 Hormotilopsis gelatinosa UTEX 104 100/100 Ankyra judayi SAG 17.84 Sphaeroplea annulina SAG 377-1a Sphaeropleales 100/100 Atractomorpha echinata Bracteacoccus grandis UTEX 1246 98/100 Scenedesmus obliquus SAG 276-3a Scenedesmus-Clade Scenedesmus ovalternus SAG 52.80 100/98 100/94 Desmodesmus abundans UTEX 343 D4.2 20 81/88 D4.2 1 Desmodesmus- 100/100 D4-E1 Clade 89/64 Desmodesmus costato granulatus SAG 18.81 Hydrodictyon reticulatum 61/61 Bulbochaete hiloensis UTEX 952 100/100 Oedogonium cardiacum UTEX 40 Oedocladium carolinianum UTEX 1686 100/100 Oltmannsiellopsis viridis NIES 360 Ulvophyceae Dangemannia microcystis SAG 2022 100/100 Nephroselmis pyriformis CCMP 717 Prasinophyceae Nephroselmis olivacea SAG 40.89 10 changes

Abb. 20 Weighted Maximum Parsimony-Stammbaum der Chlorophyceae. Die hervorgehobenen Äste werden von beiden Verfahren, wMP und NJ, gut unterstützt; die jeweiligen Bootstrap-Werte von den wMp-Analysen (links) und der Neighbor-Joining-Analyse (rechts) sind über den Ästen aufgeführt. Isolierte Algenstämme und Algenklone sind mit roter Schrift hervorgehoben. Ergebnisse 63

Phylogenetische Stellung der Klone/Kulturen innerhalb der Streptophyta

Der Datensatz der Streptopyta umfasste 15 ingroup Taxa und zwei Vertreter der Glaucophyta, Cyanophora paradoxa und Glaucocystis nostochinearum wurden als Außengruppe ausgewählt. Das Cladogramm gliedert sich in 5 Gruppen: Mestigmatophyceae, Embryophyten, Conjugatophyceae, Klebsormdiales und Charophyceae. Die Sequenzen der Klone D3-20 und D1-25 sowie die des Kulturstamms D5I ordneten sich in zwei Clades ein. Die partiellen Sequenzen der Klone D3-52 und D3-68 wurden im Praktikum 2001 gewonnen.

1) Der isolierte Algestamm D5I lag zusammen mit den Klonen D3_52 und D3_68 innerhalb der Ordnung Klebsormidiales, in nächster Verwandtschaft zu den Stämmen Klebsormidium nitens SAG 335-1a und K. flaccidum SAG 335-2b. Die Klebsormidiales wurden sehr gut (100%/100%) als monophyletische Gruppe unterstützt (Abb. 21). Bei der Kultur D5I handelt es sich mit großer Wahrscheinlichkeit um einen Vertreter der Gattung Klebsormidium. Die Sequenzen von D5I und der Referenzkultur K. nitens SAG 335-1a unterschieden sich in nur drei Positionen (Tab. 30).

2) Innerhalb der Conjugatophyceae clusterten die Klone D1-25 und D3-20 mit dem Stamm Mesotaenium cf. chlamydosporum M-2155 zusammen, welcher die nächstverwandte verfügbare Sequenz zu D1_25 und D3_20 darstellte. Dies wurde mit einem Bootstrap-Wert von 94% / 88% unterstützt. Beim Sequenzvergleich beider Klone und der Referenzkultur M. cf. chlamydosporum M-2155 wurden zwischen den beiden Klonen nur zwei Basenunterschiede festgestellt, so dass die Klone vermutlich die gleiche Alge repräsentieren. Der genetische Abstand zu der Referenzkultur war jedoch mit 28, bzw. 30 Unterschieden relativ groß. Offensichtlich handelt es sich bei den beiden Klonen um Vertreter der Gattung Mesotaenium. Ergebnisse 64

100/98 Chaetosphaeridium globosum M1311T Mesostigmatophyceae Mesostigma viride SAG 50-1

100/100 Zea mays

Pinus walliana Embryophyten Equisetum hyemale Polytrichum formosum

100/100 Coleochaete orbicularis M95611 Coleochaetophyceae Coleochaete scutata SAG 110.80 Cosmarium botrytis Closterium littorale 92/96 Staurastrum punctulatum Staurastrum sp M752

Onychonema sp. UTEX 832 Desmidiales Cosmocladium saxonicum 320 90/90 Sphaerozosma granulatum 204 99/99 Penium margaritaceum SAG 22.82

100/100 Genicularia spirotaenia 329 Gonatozygon aculeatum 64 Conjugatophyceae 60/84 Cylindrocystis sp UTEX 1925 Mesotaenium caldariorum X75763 100/99 Mougeotia scalaris X70705 60/60 Mougeotia sp UTEX 758 Mesotaeniales + 100/100 Cylindrocystis brebissonii SAG 615-1 Zygnematales Zygnema circumcarinatum 241 94/88 D3 20 D1 25 100/100 Mesotaenium cf. chlamydosporum M-2155 Klebsormidium nitens SAG 335-1a Klebsormidium flaccidum SAG 335-2b D5I 100/100 Klebsormidiophyceae D3 52 Klebsormidium D3 68 Klebsormidium

100/100 Chara vulgaris 100/100 Lychnothamnus barbatus U81272 Charophyceae Nitella flexilis Cyanophora paradoxa Glaucocystis nostochinearum 10 changes

Abb. 21 Weighted Maximum Parsimony Stammbaum der Streptophyta. Die hervorgehobenen Äste werden von beiden Verfahren, wMP und NJ, gut unterstützt; die jeweiligen Bootstrap-Werte von den wMp-Analysen (links) und der Neighbor-Joining-Analyse (rechts) sind über den Ästen aufgeführt. Die isolierten Algenstämme und Algenklone sind rot hervorgehoben. Ergebnisse 65

Tab. 30 Vergleich der Sequenzen von Algenstamm/Klon und den Referenzstämmen Algenstamm/ Referenzkultur Accession Basenunter Position und Basensubstitution Klon - Nr. -schiede (ReferenzÆ isolierter Stamm/Klon) D2.2_31 und 4 446: GÆA, 621: CÆT, 1042: AÆ D2-G4 G, 1575: GÆC D2-G4 Coccomyxa Graz unpubl 7 73: SÆG; 256: YÆC, 525: SÆG,

D3a Chlorella vulgaris X13688) 79 SAG 211-11b D5-A4 Coccomyxa unpubl 21 105: CÆA, 206: TÆC; 335: CÆA; mucigena SAG 216- 385: CÆA, 394: AÆG, 830: AÆT, 4 1318: TÆY,1377: -AGÆTGA, 1409 : TÆC, 1428 : CT- ÆTCC, 1446 : TÆC, 1455 : - ÆA , 1458 : GÆC, 1497 : - ÆC, 1550 : GÆC, 1564 : - ÆT D1.2_19 Coccomyxa mucigena Unpubl. 6 108: CÆA, 209: TÆC, 338: CÆA, SAG 216-4 388: CÆA, 397: AÆG, 539: GÆA

D1e Coccomyxa mucigena unpubl. 65 SAG 216-4 D2-G12 C. saccharophila X63505 5 817: YÆC, 1074: YÆT, 1408: SAG 211-9a RÆA, 1576: CÆT, 1644: GÆC D2.2_17 C. saccharophila 29 SAG 211-9a X63505 P3-F11 Chlorella luteoviridis X73998 12 12 : CÆT, 128 : GGTÆTAG, SAG 211-2a 136 : AATCÆTCCA, 624 : CÆA, 661 : G- ÆAT, 1341 : TÆG Strpf_11 Apatococcus lobatus unpubl. 17 162: GÆA, 166: CÆT, 204: GÆA, SAG 2037 213: CÆT, 215: GÆ-, 250: TTÆCG, 256: CÆT, 258 : AÆT, 324 : GÆ-, 664 : CÆ-, 697 : GÆA, 707 : CÆT, 710 : CÆT, 719 : CÆT, 1501 : AÆG, 1690 : CÆT, 1701 : TÆC Strpf_70 Apatococcus lobatus Unpubl. 11 204 : GÆA, 213 : CÆT, 215 : GÆ-, SAG 2037 250 : TTÆ CG, 256 : CÆT, 258 : AÆT, 698 : GÆA, 708 : CÆT, 711 : CÆT, 720 : CÆT, 1701 : TÆC Ergebnisse 66

- Fortsetzung Tab. 30 Vergleich der Sequenzen von Algenstamm/Klon und den Referenzstämmen Algenstamm/ Referenzkultur Accession Basenunter Position und Basensubstitution Klon Nr. -schiede (ReferenzÆ isolierter Stamm/Klon) D3-B12 H. pluvialis SAG 34- AF15936 13 820: AÆT; 770: - ÆG; 787: TÆC, 1b 9 843: GÆC, 918: GÆA; 1002: CÆA, 1432: CÆG; 1435: - ÆC ; 1439 : AÆ/ ; 1468 : AÆ- ; 1751 : TÆC; 1785: AÆT; 1830: CÆT P3b Chlorococcum Unpubl. 6 24 : AÆG, 252 : TÆC, 546 : GÆT, citriforme SAG 62.80 575 : TÆC, 1661 : TÆA, 1738: TÆG D4-E1 Desmodesmus X73995 33 abundans UTEX 343 D4.2_20 Desmodesmus X73995 26 abundans UTEX 343 D4.2_1 Desmodesmus X73995 18 195:AÆG, 201: TÆC, 462:TÆC, abundans UTEX 343 537: AÆ-, 638:CÆT, 652:TCÆAT, 751:CÆT, 777:CÆT, 1026:AÆG, 1255: GÆA, 1317: AÆG, 1332: GÆC, 1336: - ÆC, 1651: TGÆAA, 1671: GÆA, 1673: CÆT D5_47 Trebouxia jamesii Unpubl. 38 86.132E2 D5I Klebsormidium nitens AJ250112 3 715: TÆ-, 1636: - ÆC, 1643: - ÆC SAG 335-1a D3_20 Mesontaenium cf AJ553923 28 chlamydosporum M- 2155 D1_25 Mesotaenium cf. AJ553923 30 Chlamdosporum M- 2155

Ergebnisse 67

3.3.4 Vorkommen von Introns

Die nahe Verwandtschaft der Sequenz vom Kulturstamm D2-G12 zu der vom Klon D2.2_17 wird durch das Vorkommen eines „group I introns“ in der 18S rDNA unterstützt. Die Intronsequenz beider 18S rDNA-Sequenzen umfasste 400 bp und war bis auf drei Positionen identisch. Der Insertionsbereich des Introns liegt in beiden Sequenzen bei 1145 bp. Vergleicht man die Sequenz des Insertionsbereichs der Introns mit bekannten Insertionsbereichen in der 16S rDNA von Escherichia coli, so findet man eine Übereinstimmung mit der Sequenz des Insertionsbereiches bei 943 bp in der 16S rDNA:

5´ ACCACCAGGCGU- Intron –GGAGCGUGCGGCUU 3´

Ergebnisse 68

3.3 Algenkulturen

Die Algen wurden aus dem Biofilm vom Dachziegel oder aus der Durchlüftungskultur mit

der Kapillarmethode isoliert und auf Schrägagar mit MiEB12-Medium kultiviert. Die isolierten Algen von jeder Durchlüftungskultur wurden lichtmikroskopisch betrachtet und von morphologisch gleichen Algen wurde nur eine Kultur für die weiteren Untersuchungen ausgesucht. So blieben von den anfänglich insgesamt 100 Algenkulturen noch 31 übrig. Diese wurden nochmals genau am Lichtmikroskop untersucht und letztendlich wurden 12 verschiedene Algen für die molekulargenetischen Analysen ausgewählt.

Die Algenkulturen wurden auf Kontamination durch Pilze und Bakterien kontrolliert (siehe Kapitel 2.1.4) und bei Befall durch Tropfenwaschung gereinigt. Sobald die Kulturen pilzfrei waren, wurde die DNA isoliert und die 18S rDNA sequenziert. Von einigen Algenkulturen, die eine starke Schleimsekretion zeigen, konnten die einzelligen Pilze (Hefen) nicht entfernt werden, so dass diese zunächst kloniert (Kapitel 2.2.6) wurden und erst dann für die Sequenzierung benutzt wurden (siehe Kapitel 3.2). Zwei Stämme D2-H8 und D2-F9 wurden nach Sequenzvergleichen mit dem BLAST-Server den gleichen Algenstämmen zugeordnet wie D2-G4 und D2-G12, so dass D2-H8 und D2-F9 bei den weiteren Sequenzanalysen nicht mehr mit einbezogen wurden. In Tabelle 31 sind die isolierten Algen, das Ausgangsmaterial, aus dem sie isoliert wurden und ihre phylogenetische Stellung aufgrund der 18S rDNA-Analyse aufgelistet.

Im Folgenden sollen die isolierten Algen anhand von lichtmikroskopischen Bildern gezeigt und beschrieben werden. Dabei wird ihre phylogenetische Stellung aufgrund der 18S rDNA Sequenzanalysen berücksichtigt und ein Vergleich mit dem im Stammbaum nächststehenden Algenstamm angestellt.

Ergebnisse 69

Tab. 31 Übersicht der isolierten Algen und ihre phylogenetische Stellung Nr. Ausgangsmaterial Isolierte Phylogenetische 18S rDNA Sequenz der Kulturstämme Stellung Referenzkultur 1 D1 D1e Trebouxiophyceae, Coccomyxa mucigena Coccomyxa-Clade SAG 216-4 (unpubl.) 2 D2 D2-G4* Trebouxiophyceae, Coccomyxa Graz Stichococcus-Clade (unpubl.) 3 D2-G12* Trebouxiophyceae, Chlorella saccharophila Chlorocloster SAG 211-9a (X63505) 4 D3 D3a Trebouxiophyceae, Chlorella vulgaris Chlorellales SAG 11-11b (X13688) 5 D3-B12* Chlorophyceae Haematococcus pluvialis Chlorogonium-Clade SAG 34-1b (AF159369) 6 D4 D4-E1* Chlorophyceae, Desmodesmus abundans Desmodesmus-Clade UTEX 343 (X73995) 7 D5 D5-A4* Trebouxiophyceae, Coccomyxa mucigena Coccomyxa-Clade SAG 216-4 (unpubl.) 8 D5I Streptophyta, Klebsormidium nitens Klebsormidiales SAG 335-1a (AJ250112) 9 P3 P3b Chlorophyceae, Chlorococcum citriforme Stephanospaera- SAG 62.80 Clade (unpubl.) 10 P3-F11* Trebouxiophyceae, Chlorella luteoviridis Chlorella luteoviridis SAG 211-2a (X73998) * = aus Durchlüftungskultur isoliert

Ergebnisse 70

1. Kulturstamm D1e (Abb. 22a, b) Morphologie. Die Zellen des Algenstammes D1e sind ellipsoid und haben einen Durchmesser von ca. 7 µm. Die Zellwand ist dick und glatt. Die reifen Zellen sind oval-rund und ungefähr 11 µm lang. Der Chloroplast nimmt ungefähr zwei Drittel der Zelle ein und ist wandständig- muldenförmig und am Rand gelappt. Im Chloroplasten liegt ein Pyrenoid, um das Stärkekörner gelagert sind (22a). Zur asexuellen Fortpflanzung werden mehrere längliche kleine Autosporen in einer Mutterzelle gebildet (22b). Die Kultur bildet auf Agar Schleim und zerläuft nach einiger Zeit (nach 2 Wochen Kultivierung).

Phylogenetische Stellung. 18S rDNA Analysen zufolge gehört der Stamm D1e dem Coccomyxa-Clade an. Die nächst-ähnlichste Sequenz ist die von Coccomyxa mucigena SAG 216-4.

Morphologie der Referenzkultur. Coccomyxa mucigena (pelitgerae aphtosae) JAAG 1933

wurde von JAAG als Gonidie in der Flechte Peltigera aphtosa beschrieben, die Schleim produziert und verschieden gestaltete Zellformen aufweist. Die Schleimbildung ist auf eine Verschleimung der Mutterzellmembran zurückzuführen, durch die verklebte Zellgruppen aus Tochterzellen entstehen. Die Zellen sind ellipsoid und haben eine mittlere Länge von 7,1 µm

± 0,91. (JAAG, 1933). Nach JAAG 1933 ergibt sich für die Gattung Coccomyxa (begründet

von SCHMIDLE 1901 mit der Leitart C. dispar) eine einfache natürliche Umgrenzung. Die Zellen sind länglich oval, ellipsoid oder annähernd rundlich. Sie haben einen muldenförmigen Chloroplasten, meist ohne, selten mit Pyrenoid. Die Zellwand ist leicht verschleimend und bei verschiedenen Arten können die Zellen in Gallerte eingehüllt werden. Die Vermehrung der Coccomyxa-Arten erfolgt nur über Autosporenbildung. Charakteristisch für die Gattung ist dabei, dass die Teilungsebene etwas schräg verläuft.

Vergleich mit Referenzkultur. Vergleicht man diese Merkmale mit denen der Kultur D1e, so lassen sich einige Gemeinsamkeiten erkennen. Die Zellformen und die Vermehrung über Autosporenbildung stimmen überein. Eine Teilungsebene war schwer zu erkennen. Verklebte Zellgruppen in einer Gallerte wurden jedoch nicht beobachtet. Der Stamm D1e könnte also in die Gattung Coccomyxa eingeordnet werden, jedoch lässt

sich keine weitere Bestimmung vornehmen. Nach GÄRTNER et al. 1993 sind die Kenntnisse Ergebnisse 71

über die Variabilität, der Größenverhältnisse, Assimilationsanreicherungen und Gallertbildungen der Gattung Coccomyxa noch sehr lückenhaft. Es ist also noch ungeklärt wie viele von den beschriebenen Taxa überhaupt in die Gattung Coccomyxa einzuordnen sind.

2. Kulturstamm D2-G4 (Abb. 22c, d) Morphologie. Die tonnenförmigen Zellen kommen einzeln oder in kurzen Fäden verschleimt vor. Die Fäden können wieder in einzelne Zelle zerfallen. Sie sind bis zu 15 µm lang und 5 µm breit. Der Chloroplast liegt rinnenförmig in der Zelle und füllt sie bis zu zwei Drittel aus. Ein Pyrenoid war nicht zu erkennen. Vegetative Vermehrung konnte in Form von Zellteilung beobachtet werden (Abb.22c). Sexuelle oder asexuelle Fortpflanzung durch Gameten- bzw. Autosporenbildung wurden nicht beobachtet.

Phylogenetische Stellung. Anhand der phylogenetischen Untersuchungen der 18S rDNA wird der Kulturstamm D2-G4 zu „Coccomyxa Graz“ in das Stichococcus-Clade innerhalb der Trebouxiophyceae eingeordnet.

Morphologie der Referenzkultur. Der Referenzstamm „Coccomyxa Graz“ wurde aus einer

Rohkultur von Coccomyxa isoliert (GÄRTNER 1994) und beim Mikroskopieren dieses Stamms hat sich herausgestellt, dass die Morphologie der von Stichococcus bacillaris sehr ähnlich ist. „Coccomyxa Graz“-Zellen sind tonnenförmig, kommen einzeln oder in kurzen Fäden vor. Der Chloroplast ist rinnenförmig und füllt die Zellen zu zwei Drittel aus.

(GÄRTNER et al., 1994)

Morphologisch und genetisch sind sich der Stamm D2-G4 und „Coccomyxa Graz“ also sehr ähnlich. Es handelt sich bei Coccomyxa Graz aufgrund der 18s rDNA-Analysen und der Morphologie nicht um einen Coccomyxa-Stamm, sondern eher um einen Stichococcus-ähnlichen Stamm. Stichococcus bacillaris kommt allerdings als Referenzstamm zu D2-G4 nicht Frage, da der genetischen Abstand zwischen diesen beiden Sequenzen zu groß ist (Kapitel 3.2.3, Abb.19)

Ergebnisse 72

3. Kulturstamm D2-G12 (Abb. 23a-c) Morphologie. Die vegetativen Zellen liegen einzeln vor und die jungen Zellen sind ellipsoid, die ausgewachsenen oval-ellipsoid geformt und besitzen eine glatte etwas dickere Zellwand. Sie sind ca. 4-8 µm lang und 2-7 µm breit. Der Chloroplast nimmt etwa zwei Drittel der Zelle ein. Er ist becher- bis napfförmig und kann zum Ende leicht gelappt sein. Im Chloroplasten liegt ein rundes bis ovales Pyrenoid (siehe Abb. 23b). Die asexuelle Fortpflanzung erfolgt durch Autosporenbildung. Der Protoplast der Mutterzelle wird in mehrere kleine und einen großen Bereich geteilt, so dass zwei bis vier Autosporen (mehr als vier sind nicht beobachtet worden) gebildet werden, von denen eine deutlich größer als die anderen ist (siehe Abb. 23a). Die Autosporen werden durch Aufreißen der Mutterzellwand (Sporangienwand) freigelassen.

Phylogenetische Stellung. Anhand der phylogenetischen Daten wird die 18S rDNA- Sequenz des Kulturstamms D2-G12 in das Chlorocloster-Clade eingeordnet. Der Referenzstamm ist Chlorella saccharophila SAG 211-9a.

Morphologie Referenzstamm. Chlorella saccharophila (KRÜGER) MIGULA 1907 hat zylindrisch-ellipsoid Zellen, die aber auch eiförmig-ellipsoid sein können. Die Zellwand ist dünn. Der Chloroplast erscheint zart und ist mulden-, band-, bis rinnenförmig und kleidet ungefähr die Hälfte der Zelle aus. Im Chloroplasten liegt ein nacktes Pyrenoid. Die Vermehrung erfolgt durch Autosporen, die alle gleich groß sind und durch Aufbrechen der

Mutterzellwand frei werden. (ETTL & GÄRTNER, 1995)

Vergleich mit Referenzkultur. Obwohl die Stämme sich genetisch sehr ähnlich sind und eine Gruppe innerhalb des Chlorocloster-Clade bilden, findet man morphologische Unterschiede. Die Zellformen und die Beschreibung des Chloroplasten stimmen nahezu überein, jedoch ist die Vermehrung unterschiedlich. Stamm D2-G12 bildet ungleich große Autosporen, d.h. eine Autospore ist deutlich größer als die anderen.

Dies ist für Chlorella saccharophila (KRÜGER) MIGULA nicht beschrieben worden.

Ergebnisse 73

4. Kulturstamm D3a ( Abb. 23d, e) Morphologie. Die kugeligen vegetativen Zellen liegen einzeln vor oder in kleinen lockeren Kolonien, wobei die Berührungsbereiche der Nachbarzellen abgeflacht sind (Abb. 23d). Die Zellwand ist dick und glatt. Die Zellen haben einen Durchmesser von 5-10 µm. Der Chloroplast ist gelappt und füllt die ganze Zelle aus. Im Chloroplasten liegt ein relativ großes Pyrenoid mit einer deutlichen Stärkescheide. Die asexuelle Fortpflanzung dieses Stammes erfolgt über Autosporenbildung. Die Autosporen sind kugelig und haben die gleiche Größe. Man findet viele Zönobien aus zwei und vier Tochterzellen in der Kultur vor.

Phylogenetische Stellung. Die Sequenz der Kultur D3a ordnet sich in die Chlorellales innerhalb der Trebouxiophyceae ein, wobei die nächstähnlichste Sequenz die von Chlorella vulgaris SAG 211-1b ist.

Chlorella vulgaris BEIJERNINCK 1890 zeigt jedoch auf morphologischer Ebene einige Unterschiede zu dem Kulturstamm D3a.

Vergleich mit Referenzkultur. Bei beiden Stämmen sind die Zellen kugelig, liegen einzeln oder in kleinen Gruppen vor. Die Angaben zu den Zellgrößen stimmen überein. Die Zellwand ist bei Ch. vulgaris dünn und der Chloroplast napf-becher-bis gürtelbandförmig

(ETTL & GÄRTNER, 1995). Die Zellen der Kultur D3a haben eine dicke Zellewand und die Form des Chloroplasten weicht von der Beschreibung von Ch. vulgaris ab (siehe oben). Bei Ch. vulgaris wird eine große Saftvakuole beschrieben, die bei D3a fehlt, bzw. nicht beobachtet wurde.

Ergebnisse 74

(a) (b)

(c) (d)

Abb. 22a, b Kulturstamm D1e, Abb. 22c, d Kulturstamm D2-G4

(a) Kulturstamm D1e, Zellen liegen einzeln vor, reife Zelle oval- rund. Chloroplast muldenförmig wandständig (langer Pfeil), Pyrenoid mit Stärkekörnern (kleiner Pfeil), relativ dicke glatte Zellwand (b) D1e, Autosporenbildung (kurzer Pfeil), Autosporen/ junge Zellen sind ellipsoid (lange Pfeile) (c) Übersicht, einzelne Zellen, Teilung einer vegetativen Zelle (Pfeil) (Maßstab: 20 µm) (d) tonnenförmige Zellen, die einzeln oder als kurzer Faden verschleimt vorkommen, rinnenförmiger Chloroplast (Pfeil)(Maßstab: 10 µm)

Ergebnisse 75

(a) (b) (c)

(d) (e)

Abb. 23a-c Kulturstamm D2-G12, Abb. 23d,e Kulturstamm D3a

(a) 3 Autosporen, von denen eine deutlich größer als die anderen ist (siehe Pfeil), (Maßstab:10 µm) (b) ellipsoide Zellen mit becher- napfförmigen Chloroplasten (langer Pfeil), schwer erkennbares Pyrenoid (kurzer Pfeil) (c) Autosporenbildung und Freilassung von Autosporen durch Aufbrechen der Mutterzellwand (Pfeil) (Maßstab: 20 µm) (d) kugelige Zellen mit glatter dicker Zellwand, Chloroplast füllt die ganze Zelle aus, Pyrenoid mit Stärkescheide (kurzer Pfeil), Zönobien aus vier Tochterzellen (langer Pfeil) (Maßstab: 20 µm) (e) lockere Kolonien, an den Berührungsstellen abgeflacht (langer Pfeil), Autosporen sind kugelig und gleich groß (kurzer Pfeil) (Maßstab: 20 µm)

Ergebnisse 76

5. Kulturstamm D3-B12 (Abb. 24a-d) Morphologie. Die freischwimmenden vegetativen Zellen sind begeißelt und haben eine auffällig dicke Zellwand, die von Plasmasträngen durchzogen ist. (Abb. 24a) Die Zellen sind bis zu 35 µm lang und 24 µm breit. Die Zellwand ist bis zu 5 µm breit. Der Chloroplast ist muldenförmig, am Rand gelappt und enthält viele Pyrenoide, die ungeordnet im ganzen Chloroplasten verteilt sind (Abb. 24a und d). Es liegen mehrere Vakuolen im Cytoplasma vor. Man findet Dauerzellen in Form von Aplanosporen (Zysten), die bis zu 60 µm Durchmesser haben können (Abb. 24d). Die Zysten können bei ungünstigen Nährstoffbedingungen große Mengen roten Farbstoff einlagern, der bei Haematocococcus pluvialis als Astaxanthin beschrieben wird. (Abb. 24b). Asexuelle Vermehrung erfolgt durch Zoosporen (Abb. 24c), die durch Teilung des Protoplasten der vegetativen Zelle gebildet werden.

Phylogenetische Stellung. Nach den Phylogenetischen Analysen der 18S rDNA vom Stamm D3-B12 ist der Referenzstamm Haematococcus pluvialis SAG 34-1b.

Morpholgie der Referenzkultur. Haematococcus pluvialis FLOTOW 1844 em. WILLE 1903 liegt einzellig vor und die vegetativen Zellen haben zwei körperlange Geißeln. Die Zellwand ist dick, weit abstehend und von Plasmasträngen durchzogen. Der Chloroplast ist topfförmig, dickwandig und ragt nicht in die Plasmafäden hinein. Im Chloroplasten liegen mehrere Pyrenoide. Im Cytoplasma findet man zahlreiche pulsierende Vakuolen. Die Zellen können bis zu 63 µm lang und 53 µm breit werden. Die Aplanosporen können einen Durchmesser von 30-50 µm erreichen und je nach Bedingungen Haematochrom in der Zelle anhäufen. Aus den Aplanosporen treten entweder Schwärmer aus oder es werden weitere Aplanosporen gebildet. Asexuelle Vermehrung durch 4-8 Zoosporen, die durch Querteilung des

Protoplasten gebildet werden. ( KOMÁREK & FOTT, 1988)

Ergebnisse 77

Vergleich mit Referenzkultur. Der Vergleich vom isolierten Kulturstamm D3-B12 mit Haematococcus pluvialis zeigt große Ähnlichkeiten in der Morphologie auf. Die Zellform der beiden Kulturen stimmt überein und auch bei D3-B12 sind die großen Aplanosporen beobachtet worden, die den roten Farbstoff Astaxanthin einlagern können. Für H. pluvialis sind viele pulsierende Vakuolen beschrieben worden, die auch bei D3-B12 vorliegen. Die Anzahl der Zoosporen bei der asexuellen Vermehrung unterscheidet sich bei den beiden Kulturen, bei D3-B12 sind nur zwei beobachtet worden, während für H. pluvialis 4-8 beschrieben worden sind. Bei dem isolierten Stamm D3-B12 könnte es sich um H. pluvialis handeln. Dies wird auch bei den Stammbaumanalysen durch den hohen Bootstrap-Wert von 100%/100% unterstützt (siehe Kapitel 3.2.3, Abb. 20).

Ergebnisse 78

(a) (b)

(c) (d)

Abb. 24a-d: Kulturstamm D3-B12

(a) eiförmige begeißelte vegetative Zelle mit dicker Zellwand die von Plasmasträngen durchzogen ist (langer Pfeil) , mehrere Pyrenoide und kleine Vakuolen (kurzer Pfeil) (b) Farbstoffreiche Aplanosporen, (Maßstab: 20 µm) (c), zwei begeißelte Tochterzellen in Mutterzelle (d) Aplanosporen mit mehreren Pyrenoiden (Pfeil), (Maßstab: 20 µm)

Ergebnisse 79

6. Kulturstamm D4-E1 (Abb. 25 a, b) Morphologie. Die Zellen des Kulturstammes D4-E1 können einzeln oder in einreihigen Zönobien aus 2-4 Zellen vorkommen. Die einzelne Zelle ist ellipsoid-eiförmig und hat an der glatten Zellwand stachelförmige Fortsätze (Abb. 25a, b). An den Ecken der Randzellen sind lange Stacheln, in der Mitte kürzere. Die Außenzellen der Zönobien sind leicht halbmondförmig. Die Zellen sind ungefähr 8 µm lang und die Stacheln auf der Zellwand 4 µm. Der Chloroplast ist gelappt und hat ein zentrales Pyrenoid mit kontinuierlicher Stärkescheide. Vegetative Vermehrung über Autosporen ist nicht direkt beobachtet worden, wohl aber Tochterzönobien. Die Tochterzönobien werden im Zuge der vegetativen Fortpflanzung in einer Mutterzelle gebildet und durch Aufbrechen der Zellwand freigelassen.

Phylogenetische Stellung. Der Referenzstamm ist nach 18S rDNA- Analysen Desmodesmus abundans UTEX 343 innerhalb des Desmodesmus-Clades (Abb. 20)

Morpholgie der Referenzkultur. Desmodesmus (Scenedesmus) abundans (KIRCHNER) R.

CHODAT 1926 bildet Zönobien aus zwei bis vier (oder acht) Zellen, die linear angeordnet

sind. Nach KOMÁREK & FOTT (1983) sind die einzelnen Zellen ellipsoid bis zylindrisch und die Außenzellen der Zönobien manchmal halbmondförmig. In den Ecken der Zönobien an den Polen der Außenseiten sind leicht gebogene lange feine Stacheln, die kürzer als die Zelllänge sind. An der Außenseite der Randzellen sitzen mittig kürzere Nebenstacheln. Zudem findet man an den Seiten der Innenzellen kurze Stacheln. Die Zönobien können zerfallen. Die Zellen sind 5,5-15 µm lang und 1,7-4,5 µm breit. Der Chloroplast mit einem Pyrenoid ist massiv wandständig und füllt den größten Teil der Zelle aus.

Vergleich mit Referenzkultur. Die Morphologie der beiden Stämme ist sehr ähnlich. Beide bilden die Tochterzönobien aus bis zu 4 Zellen aus und haben die charakteristischen Stachelfortsätze an den Außenzellen. Für eine Artbestimmung sollte jedoch die Zelloberfläche und deren Fortsätze durch Lichtmikroskopie und eventuell auch Elektronenmikroskopie näher betrachtet werden.

Ergebnisse 80

7. Kulturstamm D5-A4 (Abb. 25c, d) Morphologie. In Flüssigkultur bildet der Algenstamm auffällige schleimige grüne Klumpen, die in Agarkultur makroskopisch nicht zu erkennen sind. Mikroskopisch kann man jedoch auch hier lockere Zellkolonien erkennen. Die Zellen sind durch Verschleimung aneinander gebunden. (Abb. 25d) Die einzelne vegetative Zelle ist ellipsoid (2-mal länger als breit) und hat eine Länge von ca. 7 µm. Der Chloroplast ist wandständig und füllt 2/3 der Zelle aus. Ein Pyrenoid ist nicht zu erkennen. In der Zelle liegen mehrere Öltröpfchen. In Mutterzellen, die oval sind, werden 2 bis viele Autosporen durch Protoplastenteilung gebildet.

Phylogenetische Stellung. Die Sequenz des Kulturstammes D5-A4 ordnet sich in das Coccomyxa-Clade ein und die nächstverwandte verfügbare Sequenz ist wie für den Stamm D1e die von Coccomyxa mucigena SAG 216-4.

Vergleich mit der Referenzkultur. Für die Gattung Coccomyxa SCHMIDLE (nähere Beschreibung s. o.) ist eine ausgeprägte Schleimbildung charakteristisch, diese findet sich auch bei dem isolierten Stamm D5-A4 wieder. Die Zellen sind z. T. in Gallerte eingehüllt.

Auch findet man Arten in der Gattung Coccomyxa ohne Pyrenoid (nach JAAG 1933).Zudem

sind für die Leitart C. dispar SCHMIDLE mehrere Öltröpfchen im Cytoplasma beobachtet worden, die auch bei dem isolierten Stamm D5-A4 vorzufinden waren.

Ergebnisse 81

(a) (b)

(c) (d)

Abb. 25a, b: Kulturstamm D4-E1, Abb. 25c, d: Kulturstamm D5-A4

(a) D4_E1, 4-Zell-Zönobium mit stacheligen Fortsätzen (Pfeile), zentrales Pyrenoid mit Stärkescheide (b) einzelne ovale/eiförmige Zellen mit Pyrenoid im Chloroplast (Pfeil), stachelige Fortsätze auf der Membran, (Maßstab: 20 µm) (c) Kulturstamm D5-A4, längliche Zellen (2-mal länger als breit), lockere einreihige Kolonien mit Schleimhülle, Chloroplast wandständig füllt bis zu 2/3 der Zelle aus, bilden viele Öltropfen (Maßstab: 20 µm)

Ergebnisse 82

8. Kulturstamm P3b (Abb. 26a-c) Morphologie. Die Zellen kommen einzeln oder in Kolonien vor, die durch Verschleimung der dicken Zellwand zustande kommen. Die Berührungsstellen der Zellen in einer Kolonie sind abgeflacht. (Abb. 26c) Die erwachsenen Zellen sind kugelig, während die jüngeren eher oval geformt sind. Der Chloroplast ist becherförmig und öffnet sich zu einer Seite der Zelle (Abb. 26b). Er füllt die Zelle fast vollständig aus. Man erkennt ein deutliches Pyrenoid mit einer kontinuierlichen Stärkescheide, das im dickeren Bereich des Chloroplasten liegt. Die asexuelle Vermehrung erfolgt über Autosporen, bis zu 16 Autosporen pro Sporangium wurden beobachtet. Die Autosporen sind oval geformt und haben das Pyrenoid ebenfalls im dickeren Bereich des Chloroplasten.

Phylogenetische Stellung. Anhand der phylogenetischen Daten findet sich die Sequenz von dem Kulturstamm P3b in dem Chlorophyceae-Stammbaum wieder und ordnet sich in das Stephanosphaera-Clade ein. Die nächstverwandte Sequenz ist die von Chlorococcum citriforme SAG 62.80.

Morphologie der Referenzkultur. Bei Chlorococcum citriforme ARCHIBALD & BOLD 1970 liegen die Zellen einzeln vor, die jüngeren sind ellipsoid bis eiförmig und die erwachsenen Zellen kugelig mit wenig verdickter Zellwand. Der Chloroplast ist laut Beschreibung wandständig, fast hohlkugelig, mit apikaler Öffnung und auffällig tiefen Spalten. Das Pyrenoid hat eine kontinuierliche Stärkescheide und liegt im kompakteren Teil des Chloroplasten. Es kommen zwei pulsierende Vakuolen in der Chloroplastenöffnung vor. Die vegetative Vermehrung erfolgt hier über 2-8 ellipsoide Autosporen. Die Zoosporen haben zwei körperlange Geißeln und ebenfalls zwei pulsierendeVakuolen und ein Stigma.

Vergleich mit der Referenzkultur. Die Beschreibung von C.citriforme weist einige Unterschiede zu der vom Stamm P3b auf. Die Zellformen sind sehr ähnlich, jedoch findet man bei P3b Zellen die in lockeren Kolonien zusammen liegen. Bei P3b findet man keine auffälligen tiefen Spalten im Chloroplasten. Auch ist nicht sicher, ob P3b pulsierende Vakuolen in der Chloroplastenöffung besitzt. Beide Stämme haben jedoch ein mit Ergebnisse 83 kontinuierlicher Stärkescheide umgebenes Pyrenoid. Die Anzahl der Autosporen ist bei P3b höher (s.o.)

Der Stamm P3b ist in die Gattung Chlorococcum einzuordnen, was durch die phylogenetischen Analysen unterstützt wird. Doch muss es sich um einen andere Art als C. citriforme handeln, da nicht alle vorliegenden morphologischen Daten übereinstimmen.

9. Kulturstamm P3-F11 (Abb. 27a, b) Morphologie. Die vegetative Zellen sind kugelig und liegen einzeln vor. Die jungen Zellen sind zunächst oval geformt. Die Zellwand ist relativ dick und glatt. Der Chloroplast füllt ungefähr die Hälfte der Zelle aus und ist becherförmig-wandständig. Ein Pyrenoid ist deutlich zu erkennen (siehe Abb. 27b) und ist umgeben mit Stärkekörnern. In einigen Zellen findet man mehrere Öltropfen. Die asexuelle Vermehrung erfolgt durch Autosporenbildung. Der Mutterzellprotoplast teilt sich in mehrere Bereiche (2 und 3 beobachtet), aus denen die Autosporen hervorgehen. Die Autosporen sind rund bis eiförmig, eine ist etwas größer als die anderen. Die Zellen haben einen Durchmesser von 3–10 µm.

Phylogentische Stellung. Die Sequenz des Kulturstamms P3-F11 ordnet sich in das Chlorogloster-Clade innerhalb der Trebouxiophyceae ein und der nächstverwandte Algenstamm ist Chlorella luteoviridis SAG 211-2a. Die Ähnlichkeit auf molekulargenetischer Ebene wird durch die mikroskopischen Untersuchungen unterstützt.

Vergleich mit der Referenzkultur. Die Beschreibung von Chlorella lueoviridis CHODAT 1912 zeigt viele Gemeinsamkeiten mit der vom Stamm P3-F11 auf. Die Zellform der jungen und alten Zellen stimmen überein und auch die Chloroplastengestalt ist gleich. Allerdings war nicht deutlich zu erkennen, ob eine Autospore bei der vegetativen Vermehrung von P3-F11 größer als die anderen ist. Die Autosporen werden bei Ch. luteoviridis über eine unregelmäßige Öffnung in der Mutterzellwand freigelassen. Für den Algenstamm P3-F11 liegen dafür keine

Beobachtungen vor. Auch sind die von CHODAT beschriebenen relativ großen Sporangien (bis zu 16,6 µm) nicht beobachtet worden.

Ergebnisse 84

10. Kulturstamm D5I ( Abb.28 a-d) Morphologie. Die Kultur D5I bildet lange Fäden aus, die sich zu makroskopischen Kolonien mit einem charakteristischen Aussehen organisieren: die Zellfäden liegen parallel nebeneinander und bilden Schlingen aus. Sie zerfallen zu kurzen Fäden oder einzelnen zylindrischen Zellen, wenn die Kultur jung ist. Die Zellwand ist relativ dick und schleimig (Abb. 28c). Die Querwände sind nicht eingeschnürt Der Chloroplast ist rinnenförmig-wandständig und enthält ein Pyrenoid mit Stärkekörnern. Zudem können die Zellen Öltropfen einlagern (Abb. 28c) Asexuelle Vermehrung durch Autosporen und sexuelle Vermehrung durch Gametenbildung konnte nicht beobachtet werden. Vegetativ vermehrt sich der Kulturstamm D5I durch Fragmentierung der langen Fäden zu einzelnen Zellen (Abb. 28d), die dann durch einfache Zellteilung (Abb. 28b) zu einem neuen Faden auswachsen.

Phylogenetische Stellung. Die phylogenetischen Analysen der 18SrDNA von dem Stamm D5I haben gezeigt, dass sich die Sequenz mit guter Bootstrap-Unterstützung (Kapitel 3.2.3) in die Klebsormidiales innerhalb der Streptophyta einordnet. Dabei ist der Referenzalgenstamm für die Sequenzanalysen und den morphologischen Vergleich Klebsormidium nitens SAG 335-1.

Morphologie der Referenzkultur. Klebsormidium nitens (MENEGHINI IN KÜTZING)

LOKHORST hat zylindrische Zellen, die an den Querwänden nicht eingeschnürt sind. K. nitens kann lange Zellfäden ausbilden. Der Chloroplast ist parietal und hat ein längliches Pyrenoid.

Vergleich mit der Referenzkultur. Die Morphologie von K. nitens und D5I stimmen somit überein; jedoch ist die Pyrenoidform für den Stamm D5I nicht klar erkennbar.

Ergebnisse 85

a b

c

Abb. 26a-c Kulturstamm P3b

(a) Zellen einzeln oder in lockeren Kolonien, dicke Zellwand (mittlerer Pfeil), Autosporenbildung (langer Pfeil), Pyrenoid mit Stärkescheide (kurze Pfeile). (b) Autosporen in Mutterzelle, der Chloroplast ist becherfömig, zum Zellpol geöffnet (Pfeil) und füllt die ganze Zelle aus. (c) Freiwerden der Autosporen (langer Pfeil), Zellen in Kolonie an Berührungsstellen abgeflacht (kurzer Pfeil). (Maßstab: 20 µm)

Ergebnisse 86

(a) (b)

Abb. 27a, b Kulturstamm P3-F11 (a) 2-3 Autosporen und Autosporenbildung durch Protoplastenteilung in Mutterzelle (langer Pfeil), eine Autospore größer als die andere (kurzer Pfeil) (b) P3-F11 Zellen kugelig, Chloroplast band- bis becherförmig (langer Pfeil), nimmt die Hälfte der Zelle ein, zentrales Pyrenoid mit Stärkekörnern (kurzer Pfeil), Öltröpfchen können vorkommen ( mittlerer Pfeil), (Messbalken: 20 µm)

Ergebnisse 87

(a) (b)

(c) (d)

Abb. 28a-d: Kulturstamm D5I (a) langer Zellfaden aus zylindrischen Zellen mit rinnenförmigem Chloroplasten (Pfeil), (Messbalken: 10 µm) (b) Ausbildung eines neuen Zellfadens, Zellteilung, Pyrenoid (Messbalken:10 µm) (c) vegetative Vermehrung durch Fadenzerfall (Maßstab:20 µm) (d) dicke Zellwand aus Schleim( langer Pfeil), Speichervakuolen (kurzer Pfeil) (Maßstab: 20 µm)

Diskussion 88

4 Diskussion

In dieser Arbeit wurde die Charakterisierung der Diversität und artliche Zusammensetzung grüner Biofilme auf Dachziegeln und deren Herkunft durch Vergleichstandorte bearbeitet. Anhand der mikroskopischen Untersuchungen zu Beginn der Arbeit wurde deutlich, dass es aufgrund der morphologischen Ähnlichkeit der Dachziegelalgen schwierig war, diese zu unterscheiden, daher war es erforderlich mit kulturunabhängigen Methoden die genetische Diversität zu untersuchen. Um ein möglichst breites Spektrum der Grünalgen zu erfassen, wurden hierfür kulturabhängige und kulturunabhängige Methoden kombiniert. Zu Beginn der Arbeit standen mehrere Vergleichsstandorte zu Verfügung, von denen jedoch aus zeitlichen Gründen letztendlich nur zwei vollständig ausgewertet wurden. Die Biofilmproben der sieben Dachziegel (Tab.1a, S.) wurden direkt als Ausgangsmaterial verwendet oder zunächst in Durchlüftungskulturen angereichert. Die Kultivierung in Durchlüftungskulturen sollte den Algen einen Wachstumsvorteil gegenüber Pilzen verschaffen. Zudem konnten dadurch Algenarten, deren Wachstum auf den Dachziegeln durch andere Arten unterdrückt wurde, die sich aber in der Durchlüftungskultur anreichern konnten, erfasst werden. Die Pilze, die im Ausgangsmaterial gefunden wurden, konnten aus zeitlichen Gründen in dieser Arbeit nicht weiter bearbeitet werden. Die angelegten Klonbanken vom Ausgangsmaterial und den Durchlüftungskulturen (Tab. 16, S. ) wurden mit der PCR-RFLP-Methode untersucht, woraus verschiedene RFLP- Muster resultierten. Die Klone wurden nach Schnittmuster gruppiert und jeweils ein Klon pro Gruppe für die Analyse der phylogenetischen Stellung die 18S rDNA Region sequenziert. Mit der Isolierung von Algenkulturen aus Ausgangsmaterial und Durchlüftungskultur konnten unialgale Kulturen gewonnen werden Die Algenkulturen wurden morphologisch beschrieben und durch 18S rDNA-Sequenz-Analysen ihre phylogenetische Stellung untersucht.

Im Folgenden werden die Ergebnisse zur Untersuchung der Biodiversität mit PCR-RFLP und Sequenzanalysen diskutiert. Diskussion 89

4.1 Methoden

4.1.1 DNA-Extraktion, PCR und Klonierung Mit der angewandten Methodik sollten möglichst viele Grünalgen auf Dachziegeln erfasst werden. Die Ergebnisse haben deutlich gezeigt, dass mit kulturabhängigen und kulturunabhängigen Methoden verschiedene Algen gefunden wurden und somit das diese Methodenkombination Spektrum erweiterte. Einige charakteristische Zellformen wie die von Apatococcus konnten schon zu Beginn der Arbeit bei lichtmikroskopischen Untersuchungen der Proben bestimmt werden. Nun wurde aber auf keinem Dachziegel Apatococcus durch die beiden Methoden nachgewiesen, so dass es nahe liegt, auch andere Algen auf dem Dachziegel nicht erfasst zu haben. Das bedeutet, dass trotz der Kombination von Methoden methodische Grenzen vorhanden waren. Eine Selektierung ist bereits bei der Extraktion der DNA aus dem Freilandmaterial gegeben. Vegetative Zellen aber auch Dauerstadien wie Sporen, die sich aufgrund ihrer Zellwandstrukturen schwer lysieren lassen, fallen oftmals bei diesem Schritt heraus. Daher sollte nach dem Aufbrechen der Zellen mikroskopisch überprüft werden, wie effizient der erste Schritt der DNA-Extraktion war (HEAD et al. 1998). Außerdem wird empfohlen mit mehr als einer Extraktionsmethode die DNA zu isolieren, was in dieser Arbeit aus zeitlichen Gründen nicht möglich war. Des Weiteren spielt die Strigenz des PCR-Ansatzes eine Rolle, die Einfluss auf die Anzahl der verschiedenen PCR-Produkte nimmt. Hierfür wurden in der Arbeit verschiedene MgCl2-Konzentrationen eingesetzt wurden um möglichst viele templates zu amplifizieren. Ein weiteres Problem, dass in dieser Arbeit mehrfach auftrat, waren organische Säuren im Freilandmaterial, die die PCR gestört haben. Geplante Untersuchungen von zwei Baumrindenproben als Vergleichsstandorte sind an diesem Schritt gescheitert. Eine Einschränkung der Erfassung der Diversität findet auch bei der Klonierung statt. Um eine repräsentative Aussage der Diversität zu treffen, sollten möglichst viele Klone untersucht werden.

Frühere Untersuchungen zur Methodik (RAINEY et al. 1994) ergaben, dass bei der Klonierung mit verschiedenen PCR-Produkten auch verschiedene Klonbanken entstanden und so mehr Arten erfasst werden können. In dieser Arbeit wurde jedoch nur mit einem Primerpaar gearbeitet, so dass auch nur eine Klonabank entstehen konnte, in der auch nur die „klonierbaren“ PCR-Produkte vorlagen. Diskussion 90

4.1.2 PCR-RFLP Von neun verschiedenen Standorten (Tab. 16, Seite..) wurden SSU rDNA-Klonbanken angelegt und die PCR-Produkte der Klone mit PCR-RFLP untersucht. Dabei wurden von drei Standorten, Dachziegel D1, D3, D5, jeweils zwei Klonbanken angelegt, nämlich direkt vom Ausgangsmaterial und nach Anwachsen einer Durchlüftungskultur. Außerdem wurden die Klonbanken der Vergleichsstandorte Betonsockel und Straßenpfeiler untersucht. Die Klone jeder Klonbank wurden nach ihren RFLPs in Gruppen eingeteilt.

Bei allen Klonbanken wurden mindestens zwei bis mehrere verschiedene PCR-RFLP- Gruppen gefunden, wobei immer ein Schnittmuster besonders häufig auftrat. Der Vergleich der Gruppen von Ausgangsmaterial und Durchlüftungskultur der Dachziegel zeigte, dass die Anzahl der Gruppen im Ausgangsmaterial deutlich höher war als in der Durchlüftungskultur. Eine mögliche Erklärung für die Reduzierung der Muster könnte das Wegfallen der Pilze und einiger Algen sein. Die Ergebnisse der 18S rDNA Sequenzierung der Klone bestätigten diese Annahme. In den Durchlüftungskulturen konnten keine Pilze gefunden werden und die Zahl der gefundenen Algen war niedriger als im Ausgangsmaterial. Des Weiteren wurde auch keine Übereinstimmung der Schnittmuster der Klonbanken von Ausgangsmaterial und Durchlüftungskultur gefunden. Das bedeutet, dass in der Durchlüftungskultur Arten vorkamen, die in der Klonbank des Ausgangsmaterials nicht gefunden wurden und umgekehrt. Die im Ausgangsmaterial vorherrschenden Arten sind in der Durchlüftungskultur nicht gewachsen sind. Durch die Sequenzierung der 18S rDNA konnte gezeigt werden, dass tatsächlich verschiedene Algen in Ausgangsmaterial und Durchlüftungskultur vorlagen. Der Vergleich der beiden Klonbanken von D5 war schwierig, da die Klonbank des Ausgangsmaterials sehr klein war. Es gab insgesamt sechs Klone, von denen nur zwei Klone mit PCR-RFLP untersucht wurden, die eine Gruppe bildeten. Die restlichen vier Klone wurden bereits im Praktikum 2001 sequenziert. Die Klonbank der Durchlüftungskultur von D5 hingegen umfasste 35 positive Klone, die alle mit PCR-RFLP analysiert und durch Sequenzvergleich in der Datenbank einer Alge zugewiesen wurden. Es hätten mehr Klone vom Ausgangsmaterial vorhanden sein müssen, um zu überprüfen, ob auch hier die Anzahl von verschiedenen PCR-RFLP-Gruppen von Ausgangsmaterial zu Durchlüftungsmaterial abgenommen hat. Diskussion 91

Die Schnittmuster von den Klonbanken der Vergleichsstandorte stimmten mit denen der Dachziegelklonbanken nicht überein. So musste zunächst angenommen werden, dass 14 weitere Eukaryoten gefunden wurden und der Standort Dachziegel eine andere Zusammensetzung der Arten aufweist als der Straßenpfeiler. Erst durch die 18S rDNA-Sequenzanalysen konnte überprüft werden, wie viele Gruppen wirklich erfasst wurden, d.h. ob sich hinter zwei verschiedenen Schnittmustern wirklich zwei unterschiedliche Organismen verbergen, oder ob verschiedene Schnittmuster für dieselbe Alge stehen. Die Ergebnisse machten deutlich, dass einige RFLP-Gruppen nur aufgrund der unterschiedlichen PCR-Produkt-Länge (verschiedene Primer benutzt, siehe 3.2) verschiedene Schnittmuster hatten, aber letztendlich doch die gleichen Algen repräsentierten. Abschließend lässt sich festhalten, dass PCR-RFLP eine geeignete Screening-Methode ist. Durch die Sequenzanalysen konnte gezeigt werden, dass verschiedene RFLP-Muster unterschiedliche Algen und Pilze repräsentierten (Abb. 29) und dadurch auch eine Einordnung in verschiedene Klassen möglich war. Zudem konnte die Anzahl der Proben für die Sequenzierung reduziert werden.

Abb. 29 Übersicht der gefundenen Algen- Schnittmuster und der zugehörigen BLAST- Antwort von Diskussion 92

4.1.3 18S rDNA-Sequenzierung

Von 44 Klonen aus 40 PCR-RFLP-Gruppen und sowie von zwölf isolierten Algenkulturen wurde die 18S rDNA ansequenziert. Die Sequenzen wurden mit Hilfe der BLAST- Funktion auf der Webseite von NCBI mit Einträgen in der NCBI-Datenbank vergleichen. Die „BLAST-Antwort“ lieferte dann lieferte dann die nächst-ähnlichste verfügbare Sequenz zu Klonsequenzen und Algenisolaten. Da die 18S rDNA zunächst nur teilweise sequenziert wurde, waren die Antworten der Sequenzvergleiche auch nicht unbedingt die nächst verwandten zu der vollständigen 18S rDNA-Sequenz. Jedoch reicht die Länge der Sequenz aus, um die Algen, bzw. Pilze Klassen zuzuordnen.

Diskussion 93

Sequenzierung der RFLP-Gruppen

PILZ-SEQUENZEN Die Sequenzen von 15 PCR-RFLP-Gruppen wurden sieben verschiedenen Pilzen zugeordnet. Die Pilzsequenzen gehörten vorwiegend zu Ascomyceten-Arten, wie z. B. Phaeotrichum, Cephaliophora, Scopulariopsis und Graphium. Neben diesen wurden aber auch zwei Basidiomyceten gefunden: Serpula lacrymans (echter Hausschwamm) und Calvatia gigantea (Riesenbovist). Letztere wurden nur auf dem Straßenpfeiler gefunden. Sie leben saprophytisch auf Holz und lagen vermutlich in Form von Sporen im Biofilm auf dem Straßenpfeiler vor. Die Pilzklone kamen ausschließlich in den Klonbanken des Ausgangsmaterials vom Dachziegel, Straßenpfeiler und Betonsockel vor. Das bestätigt die Annahme, dass in der Durchlüftungskultur die Pilze schlecht oder gar nicht wachsen können und daher auch in den Klonbanken der Durchlüftungskulturen nicht erfasst wurden. In den bearbeiteten grünen Biofilmen kamen also nicht nur verschiedene Algenarten vor, sondern auch viele Pilze, die mit den Algen vergesellschaftet waren. Im Ausgangsmaterial des Straßenpfeilers wurden sogar mehr Pilze als Algen gefunden. Da der Bewuchs auf dem Straßenpfeiler relativ gering war, kann dies bedeuten, dass Pilze die ersten Besiedler neuer Standorte sind und die Algen erst nach und nach folgen. Um diese Aussage zu stützen, wären weitere Untersuchungen, z. B. Sukzessionsversuche erforderlich.

ALGENSEQUENZEN Die Sequenzen der anderen 25 PCR-RFLP-Gruppen wurden acht Algen zugeordnet, von denen die meisten aufgrund der BLAST-Antworten zu den Trebouxiophyceae oder Streptophyta gehörten und ein kleiner Anteil gehörte zu den Chlorophyceae. In den Klonbanken des Ausgangsmaterials der Dachziegel wurden vor allem Klebsormidium-, Mesotaenium- und Trebouxia-ähnliche Algen gefunden, die aber nicht in den Klonbanken des Straßenpfeilers und Betonsockels vorhanden waren. Bei letzteren wurden beim BLAST-Sequenzvergleich Friedmannia- und Scenedesmus-ähnliche Algen für die Klone angegeben. Die Zusammensetzung des Ausgangsmaterials an den verschiedenen Standorten war also unterschiedlich. Diskussion 94

Ferner zeigte der Vergleich mit den Durchlüftungskulturen, dass Algen, die im Ausgangsmaterial vorhanden waren, größtenteils nicht in den Durchlüftungskulturen wiederzufinden waren (z. B. Mesotaenium cf chlamydosporum, Tab. 27, Seite..). In den Klonbanken aller Durchlüftungskulturen lagen mindestens zwei verschiedene Schnittmuster vor, jedoch wurde bei einigen (z.B. D3.2 und P1) nur eine Alge durch den Sequenzvergleich gefunden. Eine Ursache dafür könnte sein, dass die ansequenzierte 18S rDNA noch zu kurz war und somit eventuell wichtige variable Bereiche, die für eine Unterscheidung auf Artniveau nötig sind, fehlten. Ferner war zu beachten, dass von den untersuchten Algenklonen bisher keine Sequenzen in der Datenbank vorliegen und die angegebenen Referenzen nur die mit den geringsten genetischen Unterschieden aufzeigten. Aufgrund des Sequenzdatenmangels könnten auch verschiedene Arten mit ein und derselben Referenz am nächsten verwandt sein. Es wurden also mindestens acht verschiedene Algensequenzen gewonnen, die in Zukunft zusammen mit weiteren unpublizierten Sequenzen aus laufenden Untersuchungen in der Arbeitsgruppe (BIOLOG-Projekt) der NCBI-Datenbank zur Verfügung gestellt werden können. So kann ein möglichst umfangreiches Referenzsystem zur Einordnung neuer, unbekannter Proben geschaffen werden.

Diskussion 95

4.2 Vielfalt der Algen

4.2.1 Phylogenie der isolierten Algenkulturen und Algenklone

Die Sequenzen der Algenklone und Algenisolate wurden in die entsprechenden Vergleichsdatensätze eingefügt und die Stammbäume mit NJ- und wMP-Analyse berechnet. Dabei hat sich gezeigt, dass die Sequenzen der Klone und Isolate tatsächlich in die Datensätze gepasst haben, in die sie aufgrund der „Blast-Antworten“ eingeordnet wurden. D.h. der Sequenzvergleich in der NCBI-Datenbank war zuverlässig genug, um Sequenzen einer bestimmten Klasse zuzuordnen. In die Vergleichsdatensätze wurden neben bekannten Grünalgensequenzen aus der Datenbank im Internet auch unpublizierte Sequenzen aus laufenden Untersuchungen der Arbeitsgruppe (BIOLOG-Projekt) mit einbezogen. Es hat sich gezeigt, dass einige der Sequenzen von Algenklonen und -kulturen unpublizierten Sequenzen besser zuzuordnen waren als Sequenzen aus der NCBI-Datenbank und nur so eine klare Zuordnung gelang. Zwölf von insgesamt 22 Sequenzen ordneten sich in die Klasse der Trebouxiophyceae ein, das bedeutet, dass die meisten Algen, die auf den Dachziegeln erfasst wurden Vertreter dieser Klasse waren. Fünf Vertreter wurden zu den Chlorophyceae gezählt, zu deren Klasse vorwiegend Algen gezählt werden, die an aquatische Lebensräume angepasst sind. Die restlichen fünf Sequenzen wurden der Abteilung Streptophyta zugeordnet, zu der unter anderem die Charophyceae und die Embryophyta gehören. Das Artenspektrum der Dachziegelalgen war also nicht auf eine Gruppe der Grünalgen beschränkt, sondern es wurden Vertreter mehrerer Klassen gefunden.

Trebouxiophyceae Insgesamt zwölf Sequenzen konnten in sechs Clades innerhalb der Trebouxiophyceae eingeordnet werden (Abb.18, Seite 59).

Coccomyxa-Clade. Der Algenklon D1.2_19 sowie die isolierten Algenstämme D5-A4 und D1e fielen in das Coccomyxa-Clade. Die Gruppierungen innerhalb des Clades wurden durch hohe Bootstrap-Werte gut unterstützt. Die Kultur D1e konnte keinem bekannten Taxon im Coccomyxa-Clade zugeordnet werden und bildete eine eigene Linie, was auch Diskussion 96 durch die hohe Anzahl der Basenunterschiede erkennbar war. Hier waren keine Sequenzen verfügbar, um D1e zu eindeutig zu identifizieren.

Chlorellales. Für den Stamm D3a konnte gleiches festgestellt werden. Die Phylogenie zeigte, dass der Stamm eine monophyletische Gruppe innerhalb der Chlorellales darstellte. Die relativ niedrigen Bootstrap-Werte von 76% /79% unterstützten das Schwestergruppenverhältnis von D3a zu den restlichen Chlorellales nicht sehr gut. Die Stellung von D3a ist also nicht eindeutig. Es fehlten Referenzsequenzen um D3a einem Taxon klar zuzuordnen.

Die restlichen Sequenzen der Klone und Kulturen ließen sich relativ gut bekannten Sequenzen zuordnen, auch wenn die Anzahl der Basenunterschiede z. T. sehr hoch war (Tab. 30 Seite 65). Vermutlich sind hier neue Vertreter der jeweiligen Gattungen gefunden worden.

Stichococcus-Clade. Die Sequenzen von Klon D2.2_31 und der Kultur D2-G4 fielen im Stammbaum eng mit dem Coccomyxa-Isolat „Coccomyxa Graz“ und der Fassadenalge Ro474 zusammen. Diese Sequenzen repräsentieren vermutlich Vertreter einer eigenen Linie im Stichococcus-Clade da keine der bisher veröffentlichen Sequenzen in nächster Verwandtschaft zu diesen standen. Apatococcus-Clade. Die Sequenzen der Klone Strpf_11 und Strpf_70 wurden ebenfalls unpublizierten Sequenzen zugeordnet. Die Dachziegelklone P2-2a und P2-5a standen neben der Sequenz von Apatococcus lobatus SAG 2037 in naher Verwandtschaft zu den beiden Klonen.

Chlorocloster-Clade. Die Sequenz der Kultur P3-F11 stand in nächster Verwandtschaft zu Chlorella luteoviridis SAG 211-2a und der Fassadenalgen Ro771.

Chlorophyceae Die Sequenzen der Klone und Kulturen verteilten sich auf drei Clades, wobei zwei Clades in die CW-Gruppe und eins in die DO-Gruppe gehörte. Diese Gruppierung beruht auf der Orientierung der Basalkörper im Geißelapparat. Die CW- Gruppe ist monophyletischer Diskussion 97

Abstammung und die Verteilung der Gruppierungen in den einzelnen Clades wurde gut durch die Bootstrap-Werte unterstützt.

Chlorogonium-Clade. Die Sequenz der Kultur D3-B12 konnte hier sehr gut das Chlorogonium-Clade innerhalb der CW-Gruppe eingeordnet werden. Dabei handelt es bei der Kultur D3-B12 mit großer Wahrscheinlichkeit um Haematococcus pluvialis, da sowohl die molekulargenetischen als auch morphologischen Daten (3.3) dafür sprechen.

Stephanosphaera-Clade. Die Kultur P3b ist vermutlich ein Vertreter der Gattung Chlorococcum und steht in sehr naher Verwandtschaft mit dem Stamm Chlorococcum citriforme SAG 62.80. Alle Chlorococcum-Sequenzen sind unpubliziert und ohne diese wäre die Zuordnung der Kultur P3b schwieriger gewesen.

Desmodesmus-Clade. Die Klone D4.2_1 und D4.2_20 sowie die Kultur D4-E1 gehörten in das Desmodesmus-Clade innerhalb der DO-Gruppe. Da hier die Anzahl der Basenunterschiede noch relativ hoch waren, kann nur festgehalten werden, dass die drei Sequenzen einen Vertreter der Gattung Desmodesmus repräsentieren. Da die Sequenzunterschiede zueinander sehr gering waren, repräsentieren diese vermutliche eine Art.

Streptophyta Die Sequenzen der Klone D3-52, D3-68 und der isolierte Stamm D5I standen in naher Verwandtschaft zueinander. Auch die geringe Anzahl der Basenunterschiede (drei verschiedene Positionen) zwischen diesen Sequenzen und der Referenzkultur Klebsormidium nitens SAG 335-1a zeigte die nahe Verwandtschaft. Die Klone D3_20 und D1_25 ließen sich bekannten Vertretern der Mesotaeniales zuordnen, nämlich Mesotaenium cf chlamydosporum M-2155 und Zygnema circumcarinata 241. Aufgrund der vielen Basenunterschiede zu den Referenzsequenzen repräsentierten die Klone einen noch unbekannten Vertreter.

Zusammenfassung Die jeweils zehn Sequenzen der Algenklone und Algenisolate ließen sich drei großen Gruppen zuordnen: den Chlorophyceae, Trebouxiophyceae und Streptophyta. Diskussion 98

Der Klasse Trebouxiophyceae werden vorwiegend kokkale Grünalgen zugeordnet, die aus terrestrischen Habitaten und Flechtensymbiosen stammen (FRIEDL 1998). Diese Aussage wird durch die vorliegenden Ergebnisse unterstützt, da die meisten Algensequenzen der Dachziegel und des Straßenpfeilers den Trebouxiophyceae zuzuordnen waren.

Die 18S rDNA-Sequenzanalysen zeigten, dass auf den verschiedenen Dachziegeln sowohl unterschiedliche als auch gleiche Algenarten vorkamen So wurde auf den Dachziegeln D1, D3 und D5 Klebsormidium gefunden. Alle drei Dachziegel waren verschieden alt und stark bewachsen, zudem war Dachziegel D5 schwarz und stammte aus einem Stapel im Lager. Ferner zeigte sich am Beispiel der Kulturen D1e und D3a, dass auch Algen isoliert wurden, die nur auf einem Dachziegel gefunden wurden. Zieht man die unpublizierten Ergebnisse von Untersuchungen zweier Dachziegel (P1 und P2) aus der Arbeitsgruppe hinzu, so konnten neben schon bekannten Dachziegelalgen aus diesen Untersuchungen, auch neue Algen, wie die Kulturen D1e, D3a und P3b, erfasst werden. Im Ausgangsmaterial der Dachziegel P1 und P2 wurden viele Klone gefunden, die in das

Apatococcus-Clade innerhalb der Trebouxiophyceae fielen. Nach BRAND (1925), VISCHER

(1960) und GÄRTNER (1993) sollten die Algen Desmococcus und Apatococcus den Hauptteil der Algenanflüge ausmachen. In dieser Arbeit konnten jedoch nur im Ausgangsmaterial des Straßenpfeilers Apatococcus-ähnliche Algen nachgewiesen werden. Allerdings wurde beim Mikroskopieren des Rohmaterials bei einem Teil der hier untersuchten Dachziegel Apatococcus beobachtet, so dass vermutlich durch die hier angewandten Kulturbedingungen Apatococcus-ähnliche Algen nicht erfasst werden konnten.

Im Vergleich zum Ausgangsmaterial ist die Artenvielfalt in den Durchlüftungskulturen deutlich zurückgegangen. Eine Ursache dafür könnten die Wachstumsbedingungen in der Durchlüftungskultur sein, da nur die Algen, die an längere Perioden im Wasser angepasst waren, sich anreichern konnten und sich gegenüber langsamer wachsenden Arten durchsetzten. Trotz Reduzierung der Diversität in den Durchlüftungskulturen wurden weitere Algen gefunden, die im Ausgangsmaterial nicht vorlagen, wie z. B. Haematococcus und Desmodesmus. Die zusätzliche Kultivierung der Biofilmproben in den Diskussion 99

Durchlüftungskulturen war also sehr sinnvoll, da hierdurch das Artenspektrum erweitert werden konnte. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass die Dachziegel, die untersucht wurden, bereits 1,5 Jahre in einer Plastiktüte im Dunkeln aufbewahrt wurden. Es ist allerdings wahrscheinlich, dass viele der Algen in dieser Zeit abgestorben sind und in den Durchlüftungskulturen nicht mehr anwachsen konnten.

Der Vergleich zu den Standorten Straßenpfeiler und Betonsockel hat ergeben, dass nur auf dem Betonsockel eine gemeinsame Alge gefunden wurde, nämlich Desmodesmus. Hier muss jedoch berücksichtigt werden, dass der Bewuchs an Straßenpfeiler, Betonsockel und den Dachziegeln verschieden stark ausgeprägt war und nicht ausgeschlossen werden kann, dass bei gleichem Alter und Bewuchs die artliche Zusammensetzung gleich, bzw. ähnlich gewesen wäre. Die Vergleichsstandorte dieser Arbeit wiesen nur ein schmales Artenspektrum von Algen auf, so dass ein Vergleich zu den Dachziegeln schwierig war.

Viele Dachziegelsequenzen standen in naher Verwandtschaft zu Sequenzen, die Fassadenalgen repräsentierten. Das bedeutet, dass die Dachziegelalgen auch an anderen Standorten zu finden sind und zum Teil weit verbreitet sind. Ein Vergleich mit der Literatur zeigte, dass einige Algen wie Chlorella luteoviridis, die sowohl mit Fassaden- als auch Dachziegelalgen im Stammbaum in enger Beziehung zueinander standen, schon von

Baumrinden in Japan isoliert wurden (HANAGATA et al. 1997). Es sind aber nach wie vor gründliche Untersuchung weiterer Dachziegel und Vergleichstandorte erforderlich, um über die Verbreitung der Algen, die auf Dachziegeln gefunden wurden Aussagen zu treffen.

Keine der ermittelten Sequenzen war identisch mit den Sequenzen aus den Vergleichsdatensätzen. Einerseits kann dies bedeuten, dass die Sequenzen unterschiedliche Arten repräsentierten und die Basenunterschiede daher artspezifisch waren. Andererseits hätten bei einer geringen Anzahl von Basenunterschiede beide Sequenzen die gleiche Art repräsentieren können und die Unterschiede wären auf die Qualität der Sequenz zurückzuführen. Einige Sequenzen im Datensatz waren relativ alt und konnten deshalb fehlerhaft sein, da die Sequenziertechniken zu der Zeit noch nicht so fortschrittlich waren wie heute. Diskussion 100

Jedoch wiesen auch die gewonnenen Sequenzen zum Teil fehlerhafte Stellen („ambigous sites“) auf, die dazu führen konnten, dass die Basenunterschiede zu den nächst verwandten Sequenzen so hoch waren.

4.2.2 Morphologie der isolierten Algenstämme

Trebouxiophyceae

Der Kulturstamm D1e gehörte den 18S rDNA-Analysen zufolge dem Coccomyxa-Clade an. Als Referenzkultur wurde Coccomyxa mucigena SAG 216-4 gewählt. Ein Vergleich der Merkmale zeigte, dass die Zellform und die Vermehrung über Autosporenbildung übereinstimmte. Ein charakteristisches Merkmal der Gattung

Coccomyxa ist die starke Schleimbildung (JAAG 1933), so dass die Zellen in Gallerte eingeschlossen werden, die makroskopisch große Klumpen bilden können. Dies wurde für den Kulturstamm D1e nicht beobachtet. Da die Kenntnisse über die Gattung Coccomyxa jedoch noch sehr lückenhaft sind

(GÄRTNER et al. 1993), ist auch noch ungeklärt, wie viele der beschriebenen Taxa tatsächlich der Gattung zuzuordnen sind. So ist es aufgrund der geringen Kenntnisse zur Morphologie auch schwierig, Stamm D1e Coccomyxa zuzuordnen. Zudem bildete die Kultur D1e mit sehr guter Unterstützung eine eigene Linie innerhalb des Coccomyxa-Clade. Auch der Kulturstamm D5-A4 wurde aufgrund der phylogenetischen Analysen dem Coccomyxa-Clade zugewiesen. Bei dieser Kultur wurden die charakteristischen Gallertklumpen beobachtet, so dass hier eine Zuordnung zu Coccomyxa leichter fällt. In den Zellen von D5-A4 fand ich Öltröpfchen, die für Leitart Coccomyxa dispar beschrieben wurden.

Des Weiteren wurde eine Stichococcus-ähnliche Kultur isoliert. Die Sequenz von D2-G4 stand in nächster Verwandtschaft zu „Coccomyxa Graz“ und einer Fassadenalge aus Rostock. Bei „Coccomyxa Graz“ handelte es sich um ein Isolat aus einer Rohkultur von

Coccomyxa (GÄRTNER 1993). Da dieser Stamm aufgrund der 18S rDNA-Sequenz aber in das Stichococcus-Clade fiel und auch morphologisch keine Ähnlichkeiten zu Coccomyxa aufwies, muss es sich um eine Stichococcus-ähnliche Art handeln, die aus der Rohkultur Diskussion 101 isoliert wurde. Die Zellform von „C.Graz“ stimmte mit der von D2-G4 überein, so dass diese beiden Stämme nicht nur genetisch nah verwandt sind. Der genetische Abstand von Stichococcus bacillaris SAG 379-1b, als Typusart der Gattung Stichococcus, zu D2-G4 war zu groß, um diesen als Referenzkultur zu D2-G4 zu wählen. Morphologisch ließen sich aber keine großen Unterschiede feststellen. Alle drei Stämme haben die charakteristischen tonnenförmigen Zellen mit einem rinnenförmigen Chloroplast.

Für den isolierten Stamm D3a, der sich weder morphologisch noch genetisch einem bekannten Taxon zuordnen ließ, wurde der Stamm Chlorella vulgaris SAG 211-11b als Referenzkultur gewählt. D3a bildete innerhalb der Chlorellales eine stark unterstützte eigene Linie. Dies wurde auch anhand der Morphologie deutlich. Die charakteristischen Merkmale von Ch. vulgaris, die große Saftvakuole und der bandförmige Chloroplast, waren bei D3a nicht vorhanden. Das bedeutet, dass diese Art ist vermutlich bisher nicht in grünen aeroterrestrischen Algenanflügen gefunden wurden, oder ihre Beschreibung nicht veröffentlicht worden.

Nach 18S rDNA-Analysen wurde der Stamm P3-F11 in das Chlorocloster-Clade eingeordnet. Die nächstverwandte Sequenz war die von der Kultur Chlorella luteoviridis SAG 211-2a. Die morphologischen Merkmale stimmen nahezu überein, so sind die Zellen beider Kulturen rund und auch bei der Autosporenbildung ist bei P3-F11 zumindest andeutungsweise eine Autospore größer als die anderen. Chlorella luteoviridis wurde u. a. in grünen Algenfilmen an Baumrinden in Japan isoliert

(HANAGATA et al. 1997) und scheint eine weit verbreitete aeroterrestrische Grünalgen-Art zu sein, die an verschiedenen Standorten, wo grüne Algenanflüge zu finden sind, vorkommt. So ist der Stamm P3-F11 ein Beispiel für das Vorkommen von einer Ch. luteoviridis-ähnlichen Alge auf Dachziegeln. Außerdem wurde eine ähnliche Art an Gebäudefassaden in Rostock isoliert, die im Stammbaum mit P3-F11 und Ch. luteoviridis clustert.

Für den isolierten Stamm D2-G12 ließ sich wiederum feststellen, dass obwohl die Sequenz mit der der Referenzkultur Chlorella saccharophila SAG 211-9a im Chlorocloster-Clade zusammenclustert, sich die beiden Stämme in einem Merkmal unterschieden. Bei der Diskussion 102

Kultur D2-G12 war eine Autospore deutlich größer als die anderen, während bei Ch. saccharophila die Autosporen alle gleich groß sind. Aufgrund der abweichenden Autosporenmorphologie kann die Kultur jedoch nicht Chlorella saccharophila zugeordnet werden.

Chlorophyceae

Der Stamm D3-B12 fand eine eindeutige Zuordnung zum Stamm Haematococcus pluvialis SAG 34-1b innerhalb des Chlorogonium-Clades. H. pluvialis ist eine aeroterrestrische Grünalgenart, die man häufig in Wasserpfützen und Regenrinnen vorfindet. Das Wasser wird häufig durch den in den Zellen eingelagerten roten Farbstoff Astaxanthin rot gefärbt. Es ist also eine typische aeroterrestrische Algenart, die man in grünen Algenanflügen erwarten kann. In diesem Fall ist sie vermutlich durch Wasserspritzer aus der Regenrinne auf den Dachziegel gekommen ist. In den beiden Klonbanken von Dachziegel D3 wurden jedoch keine Algenklone gefunden, deren Sequenz H. pluvialis zugeordnet wurde. Dies ist verwunderlich, da der Stamm D3-B12 aus der Durchlüftungskultur von D3 isoliert wurde. Eine mögliche Erklärung wäre die, dass bei der DNA-Extraktion die Zellen von H. pluvialis nicht aufgeschlossen wurden und so auch keine PCR-Produkte für die Klonierung gewonnen werden konnten.

Auch der isolierte Stamm D4-E1 ist nah verwandt mit einer Art, für deren Gattung viele aeroterrestrische Vertreter bekannt sind: Desmodesmus abundans (KIRCHNER) R. CHODAT. Die Referenzkultur ist D. abundans UTEX 343. D4-E1 wurde ebenfalls aus der Durchlüftungskultur isoliert. Bei der Kultur D4-E1 wurden die charakteristischen Tochterzönobien beobachtet, die aus bis zu vier Zellen bestanden und wie D. abundans stachelige Fortsätze an der Zelloberfläche hatten. Da jedoch eine hohe Anzahl von Basenunterschieden zu der Sequenz von D. abundans UTEX 343 bestand, kann es sich nur um eine ähnliche Art handeln. Durch nähere Betrachtung der Zelloberfläche, vor allem der Stachelfortsätze im Rasterelektronenmikroskop, könnte der Stamm auch morphologisch besser eingeordnet werden.

Diskussion 103

Der isolierte Stamm P3b ordnete sich aufgrund der 18S rDNA-Analysen in das Stephanosphaera-Clade ein. Ein Vergleich der Morphologie von P3b mit der Referenzkultur Chlorococcum citriforme SAG 62.80 hat ergeben, dass P3b zwar in die

Gattung Chlorococcum gehört, aber nicht mit C. citrifome ARCHIBALD & BOLD identisch ist. Unterschiede in der Chloroplastengestalt und die Beobachtung, dass die Zellen von P3b in lockeren Kolonien zusammen liegen, machten dies deutlich. C. citriforme wurde aus einem Sumpfboden in Indiana (USA) isoliert und wird daher zu den terrestrischen Algenarten gezählt.

Streptophyta

Der einzig isolierte Algenstamm der sowohl morphologisch als auch genetisch den Streptophyta zugeordnet wurde, war D5I. Die Referenzkultur aufgrund der 18S rDNA-

Analysen war Klebsormidium nitens SAG 335-1a. K. nitens (MENEGHINI IN KÜTZING)

LOKHORST und die Kultur D5I haben viele morphologische Gemeinsamkeiten, wie z. B. die zylindrischen Zellen, deren Querwände nicht eingeschnürt sind. Da sich die Sequenzen nur in drei Positionen unterschieden, wird es sich bei dem Stamm D5I mit großer Wahrscheinlichkeit um K. nitens handeln. Klebsormidium ist eine weitverbreitete aeroterrestrische Algengattung, man findet sie an viele Standorten in grünen Biofilmen, so dass es nicht überrascht, diese Alge auch auf Dachziegeln zu finden.

Die isolierten Algenkulturen stehen für zukünftige Untersuchungen als Beispiele für Dachziegelalgen zur Verfügung. Da der Dachziegel aufgrund der oft schnell wechselnden Witterungsbedingungen ein extremer Standort ist, könnten die Algen spezielle Anpassungsmechanismen entwickelt haben, so dass es interessant wäre deren Ökophysiologie zu erforschen.

Zusammenfassung 104

5. Zusammenfassung

Im Rahmen der vorliegenden Diplomarbeit wurde die Diversität und artliche Zusammensetzung grüner Biofilme von verschiedenen Dachziegeln untersucht. Außerdem sollte die Diversität der Dachziegelalgen mit anderen Standorten (Straßenpfeiler und Betonsockel) verglichen werden, um Aussagen über ihre Herkunft zu treffen. Aufgrund der wenigen morphologischen Unterschiede aeroterrestrischer Mikroalgen wurde die genetische Diversität mit kulturunabhängigen Methoden charakterisiert. Von Ausgangsmaterial und Durchlüftungskulturen der verschiedenen Standorte wurden SSU rDNA Klonbanken angelegt, die mit PCR-RFLP und 18S rDNA-Sequenzanalysen charakterisiert wurden. Neben vielen Pilzklonen wurden neun Algenklone nachgewiesen, die sich in drei Gruppen ordneten: Trebouxiophyceae, Chlorophyceae und Streptophyta. Dabei fielen fünf Klone in die Trebouxiophyceae und je zwei Klone in die Chlorophyceae und Streptophyta. Alle Klone repräsentierten Algen, die sich bekannten Taxa zuordnen ließen.

Außerdem konnten zehn unialgale Algenkulturen gewonnen werden, deren Morphologie und phylogenetische Stellung beschrieben wurden. Auch hier konnten die meisten Sequenzen (sechs Kulturen) den Trebouxiophyceae zugeordnet werden. Zwei der Kulturen repräsentierten sowohl aufgrund der Morpholgie als auch der Phylogenie vermutlich neue Arten innerhalb der Chlorellales und des Coccomyxa-Clades, während die restlichen vier Vertreter bekannten Taxa innerhalb des Apatococcus-, Chlorocloster, bzw. Stichococcus-Clade zugeordnet werden konnten. Drei Kulturen wurden der Klasse Chlorophyceae zugeordnet und waren Vertreter der Gattungen Desmodesmus, Haematococcus und Chlorococcum. Es konnte ein Vertreter der Gattung Klebsormidium innerhalb der Streptophyta gefunden werden.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Kombination von kulturabhängigen und -unabhängigen Methoden sinnvoll ist, da so ein breiteres Artenspektrum erfasst werden kann. Zudem konnten durch die Anreicherung der Biofilmproben in Durchlüftungskulturen andere Algen als im Ausgangsmaterial gefunden werden. Ein Vergleich der auf den Dachziegeln erfassten Algen mit denen vom Straßenpfeiler und Betonsockel sowie unpublizierten Ergebnissen vorhergehender Analysen von Dachziegel- und Fassadenalgen zeigte, dass viele Dachziegelalgen auch an anderen Standorten (z.B Zusammenfassung 105

Gebäude, Baumrinden (HANAGATA et al. 1997) zu finden und scheinbar weit verbreitet sind. Es wurden aber auch Algen identifiziert, die nur auf dem jeweiligen Dachziegel zu finden waren.

Mit der PCR-RFLP-Methode konnte von den Algenklonen ein genetischer Fingerabdruck gewonnen werden, der als Referenz für zukünftige Analysen benutzt werden kann. So können auch die hier gewonnenen Algensequenzen zusammen mit weiteren unpublizierten Sequenzen aus laufenden Untersuchungen in der Arbeitsgruppe (BIOLOG- Projekt) der NCBI-Datenbank zur Verfügung gestellt werden, um ein möglichst umfangreiches Referenzsystem zur Einordnung neuer, unbekannter Algenproben zu schaffen. Die isolierten Algenkulturen stehen zudem für weitergehende ökophysiologische Charakterisierungen von aeroterrestrischen Algen zur Verfügung.

Literaturverzeichnis 106

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Anhang 111

7 Anhang

Puffer B- Extraktionspuffer

g/100 ml H2O (bidest., autoklaviert)

NaCl 8,182

Na2EDTA 0,745

Tris 1,212

Die Lösung wird auf einen pH- Wert von 8,6 eingestellt und autoklaviert.

TBE-Puffer (Laufpuffer für Agarose- und Polyacrylamidgele) Als Stammlösung wird ein 10-fach konzentrierter Puffer benutzt. Für Polyacrylamidgele wurde der Puffer 1-fach und für Agarosegele 0,5-fach verwendet.

g/1000 ml H2O (bidest.,)

Tris 109,00

Na2EDTA 7,448

Borsäure 55,650

GelStar

Ficoll Farbmarker: 0,1 M NaCl (58 mg) + 0,25 % Bromphenolblau (25 mg) + 0,25% Xylencyanol (25 mg) + 13 % Ficoll (1,3 g)

Gel Star original auf 1:100 verdünnen: 10 µl Gel Star konz. + 495 µl H2O + 495 µl 0,5 M NaCl

Gel Star 1:100 mit Ficoll Farbmarker auf 1:500 verdünnen: 100 µl 1:100 GelStar + 400 µl Ficoll Vor der Benutzung Gel Star nochmals 1:1 entweder mit 0,5M NaCl oder mit 0,5x TBE verdünnen.

Anhang 112

TE-Puffer

Der TE-Puffer wurde zum Verdünnen von Primern verwendet und zum Auflösen der PCR- Produkte nach Fällung und Aufreinigung.

Konzentration mg

Tris 20 mM 193,0

EDTA 0,1 mM 2,97

Beide Bestandteile wurden in 60 ml mit H2O (bidest.) aufgelöst, in 80 ml aufgefüllt und autoklaviert.

LB-Medium

g/1000 ml H2O (bidest., autokl.)

Bacto-Trypton 10

Hefeextrakt 5

NaCl 5

Die Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und autoklaviert. Für LB-Platten wurden vor dem Autoklavieren zusätzlich pro 1000 ml Medium 15g Agar zugegeben. Um LB-Platten mit Ampicillinzusatz herzustellen wurde nach dem Abkühlen auf ca. 50°C Ampicillin bis zu einer Endkonzentration von 100 µg/ml zugegeben.

Anhang 113

SOC-Medium

g/1000 ml H2O (bidest., autoklaviert)

Bacto-Tryp 20

Hefeextrakt 5

NaCl 584,4

KCl 186,4

MgCl2 x 6H2O 2,033

MgSO4 x 7H2O 2,465

Die Lösung wurde auf einen pH- Wert von 7 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden pro ml Medium 20 µl eine 1-molaren Glukose-Lösung (18g Glukose/100ml, sterilfiltriert) zugegeben.

Anhang 114

Beispiel von Bewuchs auf Dachziegeln

Abb. 30 grüner Biofilm auf Dachziegel Abb. 31 Standort Schermbeck von Dachziegel P1 und P2 ( und P3)

Vergleichsstandorte

Abb. 32 Vergleichstandort Straßenpfeiler Abb. 33 Vergleichstandort Betonsockel

Anhang 115

Karte des pCR®2.1Topo® -Vektors

( aus dem Handbuch- www.invitrogen.com)

Danksagung

Thomas Friedl danke ich dafür, dass er mich immer wieder mit seiner Begeisterung zu dem Thema angesteckt hat und natürlich für die tolle Betreuung meiner Arbeit und die anregenden Gespräche. Nicht zu vergessen die vielen grünen Biofilme auf diversen Exkursionen! Herrn Dr. Siegfried Plüschke danke ich für die Bereitstellung der Dachziegel und das rege Interesse an der Arbeit bei den Besuchen in der EPSAG. Ein großes Dankeschön geht an Elke! Die lustigen Stunden im Labor werde ich nicht vergessen und es hat Spaß gemacht, die grünen Biofilme mit Dir zusammen zu „erforschen“! Vielen lieben Dank auch an die Mädels (Julia, Anke und Jana) aus dem Diplomandenzimmer- ohne Euch wäre es da oben nur halb so schön und vor allem lustig gewesen! Ihr ward mir eine große Hilfe, besonders in den letzten Tagen! Liebe Maike, auch dir ein dickes Dankeschön für fröhliche Stunden, konstruktive Kritik und dafür, dass Du mich für das Thema Algen begeistern konntest! Herzlichen Dank auch an Gert H., der mir mit „BioEdit“ und anderen Computerfragen weitergeholfen hat. Alle weiteren Computerfragen wurden mit Dr. Dierk Mende geklärt, vielen Dank für Deine Geduld mit „Bangia“- letztendlich musste er doch nicht springen. Lieben Dank auch an die Mädels von unten (Ilse, Marlies, Hella, Ruth und Birgit) für Eure Hilfe, Tipps und Ohren und die vielen amüsanten Teestunden und Feten und Rezeptaustausche!! Und Dominik danke ich für so manchen guten Tipp, der mich im Labor weitergebracht hat.

Ein besonderer Dank geht an meinen Freund Gert W., für die vielen Diskussionen, Anregungen und die liebevolle Unterstützung!

Vielen lieben Dank an meine Familie, die immer für mich da ist! Danke, dass Ihr mein Interesse an der Biologie immer gefördert habt und Ihr mit Lob und Kritik mein Studium begleitet habt!!

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis III

Abbildungsverzeichnis

Abb. a Kombination der Methoden zu Untersuchung der Biodiversiät 7 Abb. 1 Schematische Darstellung des rRNA-Cistrons mit den Bindungs- regionen der PCR-Primer 18L/NS1 und Insertionsbereich von Introns in der 18S rDNA 16 Abb. 2 PCR-Programm PCR_18S der 18S rDNA-Amplifikation 18 Abb. 3 PCR-Programm PCR_screen für colony screen 21 Abb. 4 Schematische Darstellung der 18S rDNA mit den Bindungsregionen der verwendeten Sequenzierprimer 25 Abb. 5 Programm PCR_Seq für die Sequenzierung 26 Abb. 6 Auftragung 1 der PCR-RFLP der Klonbanken D1, D3 und D5 33 Abb. 7 Auftragung 2 der PCR-RFLP der Klonbanken D1, D3 und D5 33 Abb. 8 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbanken D1.2 35 Abb. 9 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D3.2 37 Abb. 10 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D5.2 38 Abb. 11 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D2.2 40 Abb. 12 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank D4.2 41 Abb. 13 Auftragung 1 der PCR-RFLP der Klonbank D6.2 42 Abb. 14 Auftragung 2 der PCR-RFLP der Klonbank D6.2 43 Abb. 15 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank P1 44 Abb. 16 Auftragung 1 der PCR-RFLP der Klonbank Strpf 46 Abb. 17 Auftragung 2 der PCR-RFLP der Klonbank Strpf 46 Abb. 18 Auftragung der PCR-RFLP der Klonbank B 48 Abb. 19 Weighted Maximum Parsimony-Stammbaum der Trebouxiophyceae 59 Abb. 20 Weighted Maximum Parsimony-Stammbaum der Chlorophyceae 62 Abb. 21 Weighted Maximum Parsimony- Stammbaum der Streptophyta 64 Abb. 22a, b Kulturstamm D1e 74 Abb. 22c, d Kulturstamm D2-G4 74 Abb. 23a-c Kulturstamm D2-G12 75 Abb. 23d, e Kulturstamm D3a 75 Abb. 24a-d Kulturstamm D3-B12 78

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis IV

Abb. 25a, b Kulturstamm D4-E1 81 Abb. 25c, d Kulturstamm D5-A4 81 Abb. 26a-c Kulturstamm P3b 85 Abb. 27a, b Kulturstamm P3-F11 86 Abb. 28a-d: Kulturstamm D5I 87 Abb. 29 Übersicht der gefundenen Schnittmuster und die Zugehörigen BLAST-Antworten 92 Abb. 30 grüner Biofilm auf Dachziegel 114 Abb. 31 Standort Schermbeck von Dachziegel P1 und P2 ( und P3) 114 Abb. 32 Vergleichstandort Straßenpfeiler 114 Abb. 33 Vergleichstandort Betonsockel 114

Tabellenverzeichnis

Tab. 1a Standorte der untersuchten Dachziegel 9 Tab. 1b weitere untersuchte Standorte 9

Tab. 2 Micrasterias+Erddekokt+Vitamin B12 –Medium 10 Tab. 3 Salze für die Spurenelemente 3A 11 Tab. 4 TOM-Medium 12 Tab. 5 Zusammensetzung der Vitamin-Lösung für das TOM-Medium 12 Tab. 6 Übersicht der verwendeten Agarosegele [%] und eingesetzter Menge der Proben [µl] 15 Tab. 7 Verwendete PCR-Primer 17 Tab. 8 PCR-mastermix für die Amplifikation der 18S rDNA 18 Tab. 9 Ausgangsmaterial für Klonierung 9 Tab. 10 Ligationsansatz 20 Tab. 11 PCR-mastermix für den colony screen 21 Tab. 12 Ansatz des Restriktionsverdau 24 Tab. 13 Verwendete Sequenzierprimer 25 Tab. 14 Reaktionsansatz für die Sequenzierung 26 Tab. 15 Zusammensetzung des Polyacrylamidgels 27 Tab. 16 Übersicht der Klonbanken 31 Tab. 17 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus den Klonbanken vom Ausgangsmaterial von D1, D3 und D5 34 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis V

Tab. 18 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D1.2 36 Tab. 19 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 37 aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D3.2 Tab. 20 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 39 aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D5.2 Tab. 21 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 41 aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D2.2 Tab. 22 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 42 aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D4.2 Tab. 23 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 43 aus der Klonbank von Durchlüftungskultur D6.2 Tab. 24 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 44 aus der Klonbank von Durchlüftungskultur P1 Tab. 25 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 47 aus der Klonbank vom Ausgangsmaterial Strpf. Tab. 26 Übersicht der Fragmentlängen und PCR-RFLP-Gruppen der Klone 48 aus der Klonbank vom Ausgangsmaterial B Tab. 27 Ergebnisse der Sequenzvergleiche der ausgewählten SSU rDNA-Klone 50 Tab. 28 Ergebnisse der Sequenzvergleiche der isolierten Algenstämme 53 Tab. 29a Übersicht der sequenzierten Klone und deren phylogenetischer 54 Stellung aufgrund der Sequenzanalysen Tab. 29b Übersicht der sequenzierten Klone und deren phylogenetischer 54 Stellung aufgrund der Sequenzanalysen Tab. 30 Vergleich der Sequenzen von Algenstamm/Klon und den 65-66 Referenzstämmen Tab. 31 Übersicht der isolierten Algen und ihrer phylogenetischen Stellung 69

Abkürzungsverzeichnis VI

Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius A Adenin Abb. Abbildung aqua bidest zweifach destilliertes Wasser ATP Adenosintriphosphat BLAST engl.: basic local alignment search tool bp engl.: basepair (Basenpaar) bzw. beziehungsweise C Cytosin ca. circa cm Zentimeter CTP Cytosintriphosphat CW engl.: clockwise (im Uhrzeigersinn) (d)dATP (Di)Desoxyadenosin-triphosphat (d)dCTP (Di)Desoxycytosin-triphosphat (d)dGTP (Di)Desoxyguanosin-triphosphat d.h. das heißt DNA engl.: desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) (d)dNTPs (Di)Desoxynukleosid-triphosphate DO engl.: directly opposite (direkt entgegengesetzt) (d)dTTP (Di)Desoxythymidin-triphosphat engl. englisch et al. et altera Fa. Firma G Guanin g Gramm GTP Guanosin-triphosphat h engl.: hour (Stunde) kb engl.: kilobasepair (Kilobasenpaare) l Liter µE Mikroeinstein Abkürzungsverzeichnis VII

µm Mikrometer µmol Mikromol M Molarität m Meter ml Milliliter mm Millimeter mM Millimol min Minute mRNA engl.: messenger RNA (Boten-RNA) N Normalität NCBI engl.: National Center for Biotechnology Information NJ engl.: neighbour joining OD optische Dichte PCR engl.: polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion) p.A. pro analysi rDNA ribosomale DNA RFLP Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus RNA engl.: ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) rRNA ribosomale RNA RT Raumtemperatur s Sekunde(n) S Svedberg (Sedimentations-Koeffizient) SAG Sammlung von Algenkulturen in Göttingen sec. Sekunde(n) s.o. siehe oben SSU engl.: small subunit (kleine Untereinheit des 80S Ribosoms) s.u. siehe unten T Temperatur Tab. Tabelle TTP Thymidintriphosphat U engl.: unit (Einheit der Enzymaktivität) u.a. unter anderem Upm Umdrehungen pro Minute Abkürzungsverzeichnis VIII

UTEX The Culture Collection of Algae at The University of Texas at Austin, Texas, USA UV ultraviolett v engl.: volume (Volumen) w engl.: weight (Gewicht) wMP engl.: weighted maximum parsimony z.B. zum Beispiel