JULIANA GALVÃO BEZERRA ______Dissertação De Mestrado Natal/RN, Março De 2016

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO

REARRANJOS CROMOSSÔMICOS, EVOLUÇÃO GENÔMICA E DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA EM TETRAODONTIFORMES

JULIANA GALVÃO BEZERRA ______Dissertação de Mestrado Natal/RN, março de 2016

JULIANA GALVÃO BEZERRA

REARRANJOS CROMOSSÔMICOS, EVOLUÇÃO GENÔMICA E DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA EM TETRAODONTIFORMES

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Sistemática e Evolução/PPGSE da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre em Sistemática e Evolução.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

Co-Orientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Carlos Bertollo

Natal-RN 2016

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Bezerra, Juliana Galvão. Rearranjos cromossômicos, evolução genômica e diversificação cariotípica em tetraodontiformes / Juliana Galvão Bezerra. – Natal, RN, 2016.

60 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina. Coorientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Carlos Bertollo.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução.

1. Tetraodontiformes. – Dissertação. 2. Evolução cromossômica. – Dissertação. 3. Genomas compactos. – Dissertação. I. Molina, Wagner Franco. II. Bertollo, Luiz Antônio Carlos. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 597.556.37

JULIANA GALVÃO BEZERRA

REARRANJOS CROMOSSÔMICOS, EVOLUÇÃO GENÔMICA E DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA EM TETRAODONTIFORMES

______Dr. Paulo Augusto de Lima Filho IFRN

______Dr. Gideão Wagner Werneck Félix da Costa UFRN

______Dr. Wagner Franco Molina (Presidente da Banca – UFRN)

“À minha mãe Ivanoska e familiares.”

AGRADECIMENTOS

À Deus, primeiramente, que permitiu que tudo isso acontecesse, аo longo dе minha vida, pоr tеr mе dado saúde е força pаrа superar аs dificuldades. Agradeço a minha família, aos meus tios e tias, aos primos e irmão, Igor. E todos aqueles que de alguma forma compartilharam comigo os momentos difíceis e que foram imprescindíveis quando tudo parecia impossível. Em especial a minha mãe, Ivanoska, heroína que mе deu apoio, incentivo nаs horas de desânimo е cansaço. Aos amigos de escola, de vida e graduação que torceram e torcem por mim, que buscaram compreender o momento e entender que nem sempre foi possível estar presente. Meus agradecimentos especiais à Karlla, Khadija e Roberta, amigas e companheiras de estudo, em uma etapa em que a união foi o diferencial, obrigada meninas pelos dias e noites de conversas e estudos. Aos amigos do LGRM que contribuíram direta ou indiretamente com esta pesquisa: Allyson, Amanda, Aparecida, Cristiane, Clóvis, Davi, Gideão, Inailson, Jeane, Josi, Karlla, Leonardo Calado, Paulo, Rafael, Roberta, Rodrigo e Vanessa, que sempre me acolheram com simpatia e sempre estiveram dispostos a ajudar! Obrigada pelas boas risadas!! Ao professor Dr. Wagner Franco Molina pela oportunidade que me foi concedida e que tem sido de grande crescimento não apenas acadêmico, mas também pessoal e profissional. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, seu corpo docente, direção е administração pelo ambiente agradável е amigável que proporciona. Ao programa de Pós Graduação em Sistemática e Evolução e todo seu corpo docente pelo suporte oferecido durante o desenvolvimento deste trabalho. Aos membros da banca de qualificação: Professor Doutor Paulo Augusto de Lima Filho, Doutor Gideão Wagner Werneck Félix da Costa e ao Professor Doutor Carlos Alfredo Galindo Blaha. À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pela bolsa concedida.

“Só se pode alcançar um grande êxito quando nos mantemos fiéis a nós mesmos.” Friedrich Nietzsche

RESUMO A ordem Tetraodontiformes se destaca por exibir características morfológicas e genéticas bastante singulares, representando um dos principais ramos derivados da diversificação dos teleósteos. Alguns dos seus grupos constituem os vertebrados com os genomas mais compactos, qualificando-os como modelo de estudo da evolução do genoma. Esta característica genômica parece ser o resultado de perdas evolutivas de DNA. Com vistas a realizar comparações citogenômicas entre espécies de alguns grupos de Tetraodontiformes foram realizadas análises citogenéticas nas espécies Cantherhines pullus e Monacanthus chinensis (Monacanthidae), Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Melichthys niger (Balistidae). As análises foram ralizadas utilizando as metodologias clássicas (coloração pelo Giemsa, bandamento C, Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos e mapeamento cromossômico através da hibridação in situ fluorescente (FISH) de sequências ribossomais 18S e 5S e teloméricas. As espécies C. pullus e M. niger revelaram cariótipos compostos de 40 cromossomos, todos acrocêntricos. Ambas possuem apenas um par de RONs e heterocromatinas, em maior parte, pericentroméricas, contudo, o mapeamento de sequências teloméricas em C. pullus mostrou marcações teloméricas intersticiais, resultado da dinâmica de rearranjos cromossômicos que ocorre no grupo. Comparações citogenéticas entre as espécies S. testudineus (2n=46; NF=74) e M. chinensis (2n=34; NF=34) revelaram cariótipos díspares em relação ao número diploide e de braços cromossômicos, bem como quanto ao diminuto tamanho dos cromossomos de S. testudineus, em relação ao grandes cromossomos acrocêntricos presentes em M. chinensis. A marcante divergência no tamanho dos cromossomos, estrutura cariotípica e distribuição de heterocromatina evidencia a elevada dinâmica cromossômica e as múltiplas tendências carioevolutivas presentes em Tetraodontiformes. Em vista do interesse sobre a evolução genômica na ordem, novas contribuições ao conhecimento dos seus genomas e cariótipos são fornecidos e discutidos sob perspectivas citogenômicas e evolutivas.

Palavras-chave: Tetraodontiformes, evolução cromossômica, rearranjos, sítios intersticiais, genomas compactos.

ABSTRACT

Tetraodontiformes order is featured for exhibiting extremely singular morphological and genetics characteristics, representing one of the main derivatives branches of the teleosts diversification. Some of its groups constitute vertebrates with the most compact genomes, qualifying them as a model of genome evolution studies. This genomic feature looks to be the result of evolutionary DNA loss. In order to perform cytogenomic comparisons between species of some Tetraodontiformes groups, cytogenetic analyzes were done on species Cantherhines pullus and Monacanthus chinensis (Monacanthidae) Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) and Melichthys niger (Balistidae). The analysis used classical methodologies (Giemsa staining, C-banding, Ag-NORs), fluorochromes base-specific staining and chromosomal mapping by fluorescence in situ hybridization (FISH) of telomeric and the ribosomal sequences 18S and 5S. The species C. pullus and M. niger revealed karyotypes composed of 40 chromosomes, all acrocentric. Both have only a single pair of NORs and heterochromatin, mostly, pericentomeric, however, the telomeric sequences mapping in C. pullus showed interstitial telomeric marks, result of the chromosomal rearrangements dynamics wich occurrs in the group. Cytogenetic comparisons among the species S. testudineus (2n = 46, NF = 74) and M. chinensis (2n = 34, NF = 34) revealed disparate karyotypes in relation to diploid and chromosomal arm numbers, as well as the tiny size of S. testudineus chromosomes in relation to the large acrocentric chromosomes present in M. chinensis. The striking differences on the chromosomes size, karyotypical structure and heterochromatin distribution evidences high chromosomal dynamics and multiple karyoevolutive trends present in Tetraodontiformes. In face of the interest on the genomic evolution in this Order, new contributions to the knowledge of their genomes and karyotypes are provided and discussed over cytogenomic and evolutionary perspectives.

Keywords: Tetraodontiformes, evolution, rearrangements, interstitial sites, compact genomes.

LISTA DE FIGURAS E TABELA

INTRODUÇÃO

Figura 1 Diversidade das famílias de Tetraodontiformes, dados obtidos de Eschmeyer & Fong (2016)...... 11

Figura 2 Filogenia de Tetraodontiformes modificado de Santini et al. (2013b). Destaque para as famílias do presente estudo...... 12

Tabela 1 Revisão dos dados genômicos em Tetraodontiformes. Extraído e modificado de Gregory (2016)...... 15

MATERIAL E MÉTODOS

Figura 3 (a) Pontos de coleta das espécies de Tetraodontiformes no Atlântico e no Índico. (b) Em detalhe no litoral de Natal (RN), Salvador (BA), litoral nordeste do Brasil, Arquipélago São Pedro e São Paulo (ASPSP), Ilha da Trindade (IT). (c) Mar de Andaman (MA), Oceano 21 Índico......

CAPÍTULO I

Figura 4 Cariótipos de Cantherhines pullus e Melichthys niger através de (a) coloração convencional; (b) Bandamento C; (c) double-FISH com sondas DNAr 18S (sinais vermelhos) e DNAr 5S (sinais verdes). Em destaque respectivamente os pares organizadores nucleolares evidenciando os sítios Ag-RONs e sob coloração MM/DAPI. Em (d) padrão de distribuição de sondas (TTAGGG)n com destaque para os pares portadores de sítios ITS...... 33

Figura 5 Idiograma de referência dos quatro primeiros pares cromossômicos de C. pullus, indicando a distribuição de heterocromatina e sequências (TTAGGG)n nos mesmos. Os segmentos cromossômicos delimitados entre os sítios teloméricos estão indicados em relação a faixas diferenciais de tamanho observadas entre os cromossomos do complemento da espécie...... 34

CAPÍTULO II

Figura 6 Cariótipos de S. testudineus e M. chinensis através de (a) coloração convencional (em destaque os sítios Ag-RONs); (b) Bandamento C; (c) double-FISH com sondas DNAr 18S (sinais vermelhos), e DNAr 5S (sinais verdes)...... 49

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO...... 10 1.1 Diversidade e filogenia em Tetraodontiformes...... 10 1.2 Distribuição e aspectos biológicos das famílias Monacanthidae, Balistidae e Tetraodontidae...... 12 1.3 Aspectos genômicos dos Tetraodontiformes...... 14 1.4 Aspectos citogenéticos nos Tetraodontiformes...... 18 2. OBJETIVOS...... 19 2.2 Objetivo geral...... 19 2.3 Objetivos específicos...... 19 3. MATERIAL E MÉTODOS...... 20 3.1 Material...... 20 3.2 Métodos...... 22 3.2.1 Estimulação mitótica...... 22 3.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos...... 22 3.2.3 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)...... 23 3.2.4 Detecção de Heterocromatina (Banda-C)...... 23 3.2.5 Coloração com fluorocromos base-específicos DAPI e MM...... 24 3.2.6 Hibridação in situ fluorescente – FISH...... 24 3.2.7 Análises cromossômicas...... 25 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 26 4.1 CAPÍTULO I...... 26 Fusões em tandem na evolução do cariótipo de Balistidae e Monacanthidae (Tetraodontiformes) 4.2 CAPÍTULO II...... 43 Aspectos da redução genômica em Tetraodontiformes inferida por dados citogenéticos em Tetraodontidae e Monacanthidae 5. CONCLUSÕES ...... 55 6. REFERÊNCIAS...... 56

1. INTRODUÇÃO

1.1 Diversidade e filogenia em Tetraodontiformes

Dentre a grande diversidade de peixes marinhos, a ordem Tetraodontiformes se destaca por exibir características morfológicas e genéticas bastante singulares, representando um dos principais ramos da diversificação dos teleósteos. A ordem é um dos grupos sistematicamente mais derivados e contém a maior parte dos peixes atuais (Igarashi et al., 2013). Quanto ao período de origem e diversificação, as ocorrências estratigráficas de Tetraodontiformes datam do final do Cretáceo, com gêneros fósseis que se estendem para o Plioceno e Pleistoceno (Sorbini & Tyler, 2004; Arcila et al., 2015). As 440 espécies de Tetraodontiformes (Figura 1) (Eschmeyer & Fong, 2016), estão divididas em dez famílias, sendo elas Triacanthodidae, Triacanthidae, Balistidae, Monacanthidae, Ostraciidae, Triodontidae, Tetraodontidae, Diodontidae, Molidae e Aracanidae (Figura 1), de ampla distribuição circuntropical, ocupando águas tropicais e temperadas, marinhas e doces (Matsuura, 2014). Representando uma das radiações morfológicas e ecológicas mais peculiares de peixes teleósteos (Santini et al., 2013b), a ordem exibe notável diversidade de formas corporais e tamanhos, estruturas esqueléticas, ecologia e tamanho do genoma (Brainerd et al., 2001; Santini & Tyler, 2003; Jaillon et al., 2004;). Seus representantes, conhecidos popularmente como cangulos, peixes-porco e baiacus, não apresentam comportamento migratório podendo permanecer em um mesmo local durante todo o ano (Figueiredo & Menezes, 2000). Vários aspectos da biologia evolutiva dos Tetraodontiformes são peculiares, como a marcante diversidade de tamanho, com espécies medindo desde pouco mais de 2 cm (Carinotetraodon travancoricus) até mais de 3m (o peixe lua, Mola mola) (Nelson, 2006; Matsuura, 2014). Além disso, podem apresentar diversos mecanismos de defesa, como mecanismos de inflação do corpo, placas ósseas e espinhos cutâneos (Brainerd et al., 2001). A evolução esquelética neste grupo reflete uma forte tendência à redução, simplificação e/ou perda de elementos do esqueleto (Winterbottom, 1974; Santini & Tyler 2003; 2004). O elevado grau de diversificação morfológica é especialmente intrigante tendo em vista que apenas as famílias Monacanthidae (110 espécies) e Tetraodontidae (195 espécies), possuem um elevado número de espécies, enquanto a maioria exibe menos de 25 espécies (Figura 1) (Eschmeyer & Fong, 2016).

Apesar da diversidade observada, o monofiletismo da ordem é suportado com base em 28 sinapomorfias (Arcila et al., 2015), além de amplas evidências envolvendo dados morfológicos e moleculares (Figura 2) (Santini & Tyler, 2003, 2004; Holcroft, 2005; Alfaro et al., 2007; Yamanoue et al., 2008, Santini et al., 2013b). Algumas famílias, como Monacanthidae e Balistidae, constituem grupos irmãos agrupados na superfamília Balistoidea (Yamanoue et al., 2008; Santini et al., 2013a; McCord & Westneat, 2016). Devido a considerável diversidade familiar, várias relações-chave entre linhagens de Tetraodontiformes permanecem controversas, incluindo as relações de alto nível e da posição de alguns fósseis de famílias existentes (Arcila et al., 2015). Com relação ao grau de ancestralidade dos Tetraodontiformes, acredita-se que forme um grupo irmão dos Acanthuroidea, uma subordem dos Perciformes (Holcroft, 2005; Nelson, 2006; Arratia et al., 2010).

Figura 1. Diversidade das famílias de Tetraodontiformes, dados obtidos de Eschmeyer & Fong (2016).

Figura 2. Filogenia de Tetraodontiformes modificado de Santini et al. (2013b). Destaque para as famílias do presente estudo.

1.2 Distribuição e aspectos biológicos das famílias Monacanthidae, Balistidae e Tetraodontidae

Os representantes da família Monacanthidae distribuem-se pelos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico, porém, são em grande parte restritos ao Indo-Pacífico, com apenas algumas espécies ocorrendo no Atlântico e no Mar Vermelho (Matsuura, 2014). Seus representantes geralmente apresentam dois espinhos dorsais sendo o segundo comumente menor do que o primeiro, podendo inclusive estar ausente (Nelson, 2006). Quando adultos atingem cerca de 1 metro de comprimento e a maioria das espécies se alimenta de uma grande variedade de invertebrados bentônicos, mas alguns se especializaram em corais ou zooplâncton (Carpenter, 2002). Normalmente, os monacantídeos colocam ovos demersais em um local preparado, sendo estes guardados pelo macho ou ambos os parentais, podendo também algumas das espécies subtropicais liberarem seus ovos em mar aberto (Nelson, 2006). Dentro da variação cromática desta família, a espécie Cantherines pullus exibe coloração geralmente marrom, onde se destacam faixas claras longitudinais na parte posterior do corpo com numerosas pintas alaranjadas. Presente no Atlântico Ocidental distribui-se desde a costa dos Estados Unidos até São Paulo - Brasil (Carpenter, 2002). A espécie Monacanthus chinensis, habita estuários e recifes costeiros, apresentando hábitos onívoros

que incluem principalmente algas e camarões, bem como de briozoários, ascídias e copépodes (May & Maxwell, 1986; Kuiter & Tonozuka, 2001). Distribui-se pelo Indo-Pacífico nos litorais da Malásia e Indonésia, norte ao sul do Japão, sul da Austrália e ao sul do País de Gales (Shen, 1993). Grupo-irmão de Monacanthidae, os membros da família Balistidae são popularmente conhecidos como cangulos ou peixes porcos, distribuindo-se pelos oceanos Atlântico, Pacífico e Índico (Nelson, 2006). Sua principal característica é a presença de três espinhos dorsais, onde o primeiro é mais desenvolvido que os demais, principal característica que os difere morfologicamente dos Monacanthidae (Carpenter, 2002). As espécies desta família possuem geralmente cores vivas, são diurnas e habitantes comuns de áreas recifais (Chen, 2001). A maioria dos representantes é carnívora alimentando-se de uma grande variedade de invertebrados, incluindo moluscos e equinodermos. Põem ovos demersais em um ninho que é agressivamente vigiado pela fêmea e menos frequentemente pelo macho, sendo bastante populares entre os aquariofilistas (Carpenter, 2002). Entre os Balistidae, o representante mais bem distribuído é a espécie Melichthys niger, denominada cangulo-preto, devido à coloração negra do corpo, com linhas azuis ao longo da nadadeira dorsal e caudal. Esta espécie forma grandes cardumes em ilhas oceânicas, recifes e parcéis em águas claras e afastadas da costa e distribuindo-se pelos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico (Szpilman, 2000). Uma família de particular interesse entre os Tetraodontiformes é Tetraodontidae, cujos representantes são conhecidos como baiacus-lisos, dos quais a maioria é marinha, contudo, algumas espécies de água doce e salobra já foram descritas. Peculiarmente são capazes de inflar o corpo (região ventral), dificultando a predação e fazendo com que pareçam maiores (Carpenter, 2002). Alguns membros desta família possuem elevada toxicidade. A carne, especialmente as vísceras, ou gônadas contém tetrodotoxina, um veneno neurotóxico, que em casos de ingestão pode ser fatal (Nelson, 2006). Um dos representantes desse grupo, Sphoeroides testudineus, tem frequente e abundante ocorrência no litoral do Rio Grande do Norte, nordeste do Brasil, exibindo-se manchas escuras distribuídas sobre o dorso do corpo. Esta espécie tem hábitos solitários, podendo ocorrer em grupos de dois ou três indivíduos, alimentando-se principalmente de moluscos e outros seres bentônicos, os quais esmagam com seus dentes potentes (Szpilman, 2000).

1.3 Aspectos genômicos dos Tetraodontiformes

Com aproximadamente 28.872 espécies, os peixes teleósteos constituem a radiação dominante dos vertebrados em nosso planeta, ainda sendo sugerido que a grande diversidade morfológica e de espécies de teleósteos pode estar relacionada com duplicações de genes independentes em grande escala ou a uma duplicação de todo o genoma de um antigo teleósteos (Santini et al., 2009). Compondo esse clado, os Tetraodontiformes se destacam como os vertebrados com os genomas mais compactos (Dolezel et al., 2003; Noleto et al., 2007, 2009). A família Tetraodontidae, por exemplo, possui as menores quantidades de DNA por célula entre os vertebrados (Neafsey & Palumbi, 2003), estimado em 0,34 – 0,80pg haploide (Tabela 1), que significa mais de oito vezes menor que o genoma humano (3,50pg) (Noleto et al., 2009; Martinez et al., 2011; Gregory, 2016). A variação genômica observada no grupo tem sido atribuída à perda de DNA repetitivo e não codificante (Neafsey & Palumbi, 2003; Noleto et al., 2009). Outras famílias, entretanto, exibem valores maiores, como as famílias Monacanthidae e Balistidae (0,54 – 0,80pg), enquanto que Ostraciidae e Diodontidae exibem valores variando de 0,80 a 1,10pg (Brainerd et al., 2001; Gregory, 2016). Assim, as variações no tamanho do genoma dos Tetraodontiformes sugere que os membros desta ordem podem ser alçados à condição de modelos adequados ao estudo da evolução do genoma dos vertebrados, o que favorece estudos moleculares, assim como comparações com espécies mais basais (Crnogorac-Jurcevic et al., 1997; Jaillon et al., 2004). A família Tetraodontidae, em especial, tem despertado grande interesse como modelo para o estudo do genoma de vertebrados, resultando em uma crescente quantidade de dados disponíveis sobre as sequências gênicas de vários tetraodontídeos, particularmente os gêneros Fugu (Crnogorac-Jurcevic et al., 1997) e Tetraodon (Mandrioli et al., 2000; Jaillon et al., 2004). Entretanto, como a evolução genômica não foi uniforme para todos Tetraodontiformes, as diferenças quanto ao tamanho do genoma nas linhagens sugere que a expansão ou a contração dos genomas ocorreu independente em cada táxon (Hinegardner, 1968; Neafsey & Palumbi, 2003; Jaillon et al., 2004). Enquanto a expansão parece ser o resultado de duplicações em tandem, inserções, poliploidia, atividade de elementos de transposição ou ainda da acumulação de sequências repetitivas, um genoma compacto poderia

ser o resultado de deleções acumuladas constituindo um estado derivado (Venkatesh et al., 2000; Petrov, 2001). As características genômicas dos Tetraodontiformes, como variação na quantidade de DNA, além da ocorrência de diversos rearranjos cromossômicos os tornam especialmente indicados para a identificação in situ de genes. A partir do aprofundamento do conhecimento dos aspectos cromossômicos desta ordem, análises envolvendo sequências de DNA podem ser facilitadas pelo conhecimento prévio da sua ultraestrutura cariotípica e do mapeamento cromossômico de determinados genes. Isso é possível através da técnica de hibridação in situ com fluorescência (FISH), que trouxe avanços significativos para o conhecimento do genoma com base nos cromossomos (Artoni et al., 2015).

Tabela 1 – Revisão dos dados genômicos em Tetraodontiformes. Extraído e modificado de Gregory (2016). Família Espécies Valor C Referência BALISTIDAE Abalistes stellatus 0,64 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Balistapus undulatus 0,67 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Balistapus undulatus 0,74 Ojima & Yamamoto, 1990 Balistes carolinensis 0,54 Mirsky & Ris, 1951 Balistes carolinensis 0,55 Bachmann & Cowden,1967 Balistes sp 0,72 Hinegardner, 1968; Hinegardner & Rosen, 1972 Balistoides viridescens 0,68 Ojima & Yamamoto, 1990 Melichthys niger 0,70 Brainerd et al., 2001 Rhinecanthus aculeatus 0,64 Hardie & Hebert, 2004 Sufflamen 0,58 Hardie & Hebert, 2004 chrysopterum Sufflamen fraenatus 0,64 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Xanthichthys ringens 0,74 Brainerd et al., 2001 Valor médio 0,60

MONACANTHIDAE Aluterus schoepfii 0,64 Hinegardner & Rosen, 1972 Cantherines pullus 0,58 Brainerd et al., 2001 Monacanthus chinensis 0,66 Hardie & Hebert, 2004 Monacanthus ciliatus 0,58 Brainerd et al., 2001 Monacanthus tuckeri 0,58 Brainerd et al., 2001

Nelusetta ayraud 0,65 Hardie & Hebert, 2004 Paramonacanthus 0,77 Hardie & Hebert, 2004 filicauda Pervagor janthinosoma 0,51 Hardie & Hebert, 2004 Pseudomonacanthus 0,43 Hardie & Hebert, 2003; 2004 peroni Stephanolepis cirrhifer 0,62 Ojima & Yamamoto, 1990 Stephanolepis hispidus 0,68 Hinegardner, 1968; Hinegardner & Rosen, 1972 Thamnaconus modestus 0,56 Ojima & Yamamoto, 1990 Valor médio 0,60

TETRAODONTIDAE Arothron diadematus 0,40-0,50 Pizon & Bernardi, 1984 Arothron hispidus 0,40 Ojima & Yamamoto, 1990 Arothron hispidus 0,52 Hardie & Hebert, 2004 Arothron manilensis 0,50 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Arothron meleagris 0,38 Ojima & Yamamoto, 1990 Canthigaster bennetti 0,38 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Canthigaster rostrata 0,45 Brainerd et al., 2001 Canthigaster valentini 0,44 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Lagocephalus lunaris 0,44 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Lagocephalus lunaris 0,72 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Sphoeroides greeleyi 0,71 Noleto et al., 2009 Sphoeroides maculatus 0,50 Hinegardner, 1968; Hinegardner & Rosen, 1972 Sphoeroides nephelus 0,45 Brainerd et al., 2001 Sphoeroides nephelus 0,50 Hinegardner & Rosen, 1972 Sphoeroides spengleri 0,34 Noleto et al, 2009 Sphoeroides 0,82 Noleto et al, 2009 testudineus Takifugu niphobles 0,42 Ojima & Yamamoto, 1990 Takifugu rubripes 0,40 Brenner et al, 1993 Tetractenos hamiltoni 0,51 Hardie & Hebert,2004 Tetraodon cutcutia 0,41 Vinogradov, 1998 Tetraodon fluviatilis 0,35 Lamatsch et al., 2000

Tetraodon fluviatilis 0,40 Hinegardner, 1968; Hinegardner & Rosen, 1972 Tetraodon fluviatilis 0,40 Brainerd et al., 2001 Tetraodon fluviatilis 0,41 Ojima & Yamamoto, 1990 Tetraodon nigroviridis 0,35 Jaillon et al., 2004 Tetraodon nigroviridis 0,51 Hardie & Hebert, 2003; 2004 Tetraodon 0,48 Hinegardner & Rosen, 1972 palembangensis Valor médio 0,46

OSTRACIIDAE Acanthostracion 0,96 Mirsky & Ris, 1951 quadricornis Acanthostracion 1,10 Brenner et al, 1993 quadricornis Lactophrys bicaudalis 0,98 Brenner et al, 1993 Lactophrys trigonis 0,85 Hinegardner & Rosen, 1972 Lactophrys triqueter 1,10 Hinegardner & Rosen, 1972 Valor médio 0,90

DIODONTIDAE Cyclichthys schoepfi 0,81 Brainerd et al., 2001 Chilomycterus schoepfi 0,85 Brainerd et al., 2001 Cyclichthys schoepfi 0,90 Hinegardner & Rosen, 1972 Chilomycterus spinosus 1,00 Noleto et al., 2009 Diodon holocanthus 0,78 Brainerd et al., 2001 Diodon hystrix 0,80 Brainerd et al., 2001 Diodon liturosis 0,85 Ojima & Yamamoto, 1990 Valor médio 0,85

TRIACANTHIDAE Tripodichthys 0,51 Hardie & Hebert, 2003; 2004 angustifrons Valor médio 0,51

MOLIDAE Mola mola 0,84 Brainerd et al., 2001 Mola mola 0,97 Venkatesh et al., 2000

Valor médio 0,90

1.4 Aspectos citogenéticos nos Tetraodontiformes

Tetraodontiformes constitui um dos principais ramos derivados da diversificação dos teleósteos, e apresentam os cariótipos mais diversos com números diploides variando entre 28 e 52 cromossomo, a exemplo disso temos a família Triacanthidae que possui 2n=48 e NF=48 (Arai, 2011), características consideradas basais e extensamente difundida entre os Perciformes. Enquanto famílias, tais como Balistidae, Monacanthidae e Molidae, exibem valores de 2n entre 33 – 46 formado em maior parte por cromossomos monobraquiais (Molina et al., 2014b). Tetraodontidae, Ostraciidae, e Diodontidae, entretanto, exibem as mais variadas fórmulas cariotípicas, com valores 2n=28 a 52 e NF=36 a 96 (Arai, 2011; Nirchio et al., 2014). Essa diversidade de fórmulas cariotípicas, pode ser reflexo da forte especialização do grupo, não sendo possível a identificação de um padrão comum como ocorre nos Perciformes (Sá-Gabriel & Molina, 2005). Nesse sentido, os dados disponíveis para os Tetraodontiformes revelam, ainda, diferentes tendências carioevolutivas como a ocorrência de alguns rearranjos estruturais, tais como fissões e fusões cêntricas (Sá-Gabriel & Molina, 2005; Arai, 2011), associados a ocorrência de cromossomos sexuais e Bs (Nirchio & Oliveira, 2007; Martinez et al., 2011; Molina et al., 2014a), que também são promotores na diversificação cariotípica na ordem. Rearranjos cromossômicos têm desempenhado um papel importante na evolução do cariótipo de diversos grupos de peixes, a exemplo dos salmonídeos (Pomianowski et al., 2012). A ocorrência de diferentes números de cromossomos com a manutenção do número de braços cromossômicos, resultantes de fusões cêntricas é conhecidas como polimorfismos Robertsonianos e são observadas em diversos grupos de peixes, incluindo a ordem Tetraodontiformes (Phillips & Ráb, 2001). Nesse sentido análises citotaxonômicas contribuem significativamente para o estudo da evolução pelo fato do material genético estar contido nos cromossomos (Almeida-Toledo, 2000). Portanto, alterações como, rearranjos cromossômicos, polimorfismos estruturais e/ou numéricos, poliploidia natural, sistemas de cromossomos sexuais entre outros, são quase sempre significativas para que se possa inferir o rumo evolutivo das espécies.

2. OBJETIVOS

2.2 Objetivo geral

O presente trabalho tem como objetivo compreender os processos evolutivos ocorridos nos cariótipos e genomas dos grupos de peixes aqui estudado, com o intuito de ampliar as informações existente para a ordem Tetraodontiformes.

2.3 Objetivos específicos

• Comparar por meio de métodos citogenéticos clássicos (Giemsa, Ag-RON, bandamento C), fluorocromos base-específicos e mapeamento da distribuição de sequências teloméricas e DNA ribossomal 18S e 5S por meio da hibridização in situ com fluorescência (FISH) em Cantherhines pullus (Monacanthidae) e Melichthys niger (Balistidae), grupos com um recorrente processo de redução numérica do valor diploide.

• Analisar citogeneticamente a espécie Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Monacanthus chinensis (Monacanthidae), através de coloração convencional, Ag- RON, bandamento C, fluorocromos MM/DAPI e FISH com sondas de DNAr 18S e 5S com vistas a identificar e discutir a dinâmica cromossômica de espécies com genoma reduzido.

• Identificar os mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica das espécies estudadas.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material

Os exemplares utilizados no presente trabalho foram coletados, na praia de Ponta Negra – Natal (RN) (5º52´S, 35º10´O), no litoral da Bahia, costa de Salvador (BA) (12º58’S, 38º31’O), no Arquipélago São Pedro e São Paulo (ASPSP) (00º 55'15" N 029º20'60" O), ilha da Trindade (IT), distante 1200km da costa da cidade de Vitória, no centro sul do Oceano Atlântico (20º30’13”S, 29º19’50”O), Mar de Andaman (11º04’00”N, 95º44’34”L) (Figura3). Os espécimes foram coletados utilizando-se redes de pesca (arrasto, puçá e tarrafa), bem como linha e anzol, sendo posteriormente acondicionados e mantidos em condições de aeração até que se procedesse as preparações cromossômicas. Para as análises citogenéticas foram empregados indivíduos das espécies Melichthys niger (Bloch, 1786), n=8 (Balistidae); Cantherhines pullus (Ranzani, 1842), n=5 e Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765), n=2 (Monacanthidae), e Sphoeroides testudineus (Linnaeus, 1758), n=12 (Tetraodontidae).

Figura 3. (a) Pontos de coleta das espécies de Tetraodontiformes no Atlântico e no Índico. (b) Em detalhe no litoral de Natal (RN), Salvador (BA), litoral nordeste do Brasil, Arquipélago São Pedro e São Paulo (ASPSP), Ilha da Trindade (IT). (c) Mar de Andaman (MA), Oceano Índico.

3.2 Métodos

3.2.1 Estimulação mitótica

Depois de acondicionados e aclimatados em tanques devidamente aerados, os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica seguindo a metodologia preconizada por Molina et al. (2010), que faz uso dos complexos comerciais de antígenos bacterianos e fúngicos, Munolan® (Allergan Frumtost™) e Aminovac®. Este procedimento consiste na inoculação intraperitoneal de solução do composto (2 comprimidos/1ml de água destilada), na proporção de 1ml/50g de peso corporal, por um período de 24 a 48 horas. Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com Eugenol® – óleo extraído do cravo (Syzygium aromaticum) e eutanaziados para extração de fragmentos do rim anterior.

3.2.2 Obtenção de cromossomos mitóticos

Para a obtenção de cromossomos mitóticos foi adotado o método de preparação in vitro descrito por Gold et al. (1990). Após a eutanásia, procedeu a extração de fragmentos dos rins anterior, que possuem função hematopoiética. Nos casos em que as quantidades de rim eram insuficientes, outros tecidos foram utilizados. O material retirado foi acondicionado em frascos contendo 5ml de meio de cultura (RPMI 1640) e desagregado através de movimentos de sucção e esvaziamento com seringas de vidro. Após essa etapa adicionaram-se 125µl de colchicina 0,025%, agindo por 30 minutos. Após este período o material foi centrifugado por 10 minutos a 1000rpm, sendo descartado o sobrenadante e foram adicionados 8ml de solução hipotônica (KCl 0,075M), agindo por 28 minutos, logo se prefixou com 100µl de fixador (3 Metanol: 1 Ac. Acético), sendo novamente centrifugado por 10 minutos a 1000rpm, descartou-se o sobrenadante e se adicionou 6ml de fixador, centrifugando-se novamente por 10 minutos a 1000 rpm, este último passo foi repetido três vezes. Após a última centrifugação, reservaram-se 2,0ml de fixador ressuspendeu-se o material e transferiu-se a suspensão cromossômica para um microtubo que foi mantido em freezer (-20ºC) até o momento das análises e demais procedimentos. Após a preparação, aproximadamente 100µl de suspensão celular, foi gotejada sobre uma lâmina recoberta com um filme de água destilada aquecida a 60ºC de tal forma que se

descarta a água sobre a lâmina inclinando-a e goteja-se a suspensão cromossômica no espaço gerado, após essa etapa as lâminas são secas ao ar, e posteriormente coradas com Giemsa, diluído a 5% em tampão fosfato (pH 6,8), por 10 minutos. As melhores metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência (OlympusTM BX50) sob aumento de 1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de captura (câmera CCD Optronics, modelo DP73) com o uso do software cellSens© para a captura da imagem. As melhores microfotografias foram utilizadas na preparação do cariótipo das espécies, onde os cromossomos metafásicos foram ordenados em ordem decrescente de tamanho e definidos de acordo com a posição do centrômero segundo Levan et al. (1964).

3.2.3 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs)

A detecção de regiões organizadoras de nucléolos foi obtida pela técnica de impregnação com nitrato de prata preconizada por Howell & Black (1980). Sobre uma lâmina previamente preparada com suspensão celular foram adicionadas 175µl de solução gelatinosa (1g de gelatina incolor, dissolvida em 50ml de água destilada e 0,5ml ácido fórmico), e 150µl de solução de nitrato de prata (AgNO3) à 50%. A solução foi recoberta com a lamínula sendo então incubada em estufa a 60°C de 3 a 5 minutos. Após o período a remoção da lamínula foi realizada com jatos de água destilada, sendo posteriormente secas em temperatura ambiente e analisadas eventualmente, para destacar as marcações argênteas, as preparações podiam ser coradas por cerca de 20 segundos com solução de Giemsa a 5%. Após secas as preparações foram analisadas e fotografadas no mesmo dia para evitar oxidação.

3.2.4 Detecção de Heterocromatina (Banda-C)

A análise das regiões heterocromáticas foi realizada através do bandamento-C, segundo Sumner (1972). Foram utilizadas lâminas com material envelhecido em estufa a 37°C por no mínimo 3 dias, após esse período a lâminas foram imersas em HCl 0,2N por 14 minutos em temperatura ambiente, sendo lavadas com água destilada e secas. Posteriormente a lâmina foram mergulhadas em uma solução a 5% de Ba(OH)28H2O à 42°C por cerca de 1 minuto e 35 segundos sendo rapidamente imersas em HCl 0,1N e posteriormente lavadas em água destilada. Após secar ao ar, as lâminas foram então imersas em solução salina 2xSSC à

60°C em estufa por 30 minutos. Para a análise o material foi corado com Giemsa 5% por 6 minutos.

3.2.5 Coloração com os fluorocromos base-específicos DAPI e MM

A coloração pelos fluorocromos Mitramicina e DAPI foi realizada seguindo a técnica de Schweizer (1976) com pequenas modificações. Após um processo de desidratação por 30 minutos em solução fixadora (metanol 3: 1 ácido acético) e 1 hora em etanol 100%, as lâminas foram secas ao ar e um total de 30µl de solução Mitramicina (0,5 mg/ml – 10 ml) foi depositado em cada lâmina, sendo as mesmas cobertas por lamínulas, permanecendo 1 hora em câmara escura umedecida. Após esse procedimento lavaram-se as lâminas em água destilada, utilizando-se de um jato moderado para a retirada das lamínulas. Depois as lâminas foram secas ao ar no escuro e sobre as mesmas foi depositado um total de 30µl de solução de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) (2 µg/ml - 10 ml) em cada lâmina, sendo cobertas novamente por lamínulas e permanecendo por 30 minutos em câmara escura umedecida. Decorrido esse tempo, as lâminas foram, novamente, submetidas à lavagem com água destilada, utilizando-se do jato moderado para a retirada das lamínulas e secas ao ar no escuro. Por último, aplicou-se 30µl do meio de montagem (Glicerol-Macllvaine, pH 7,0, 1:1), sobre cada lâmina no escuro e sobre as mesmas depositaram-se as lamínulas, sendo o conjunto selado com base incolor de esmalte nas extremidades, para evitar que o meio de montagem se dispersasse durante a estocagem. As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas, sendo as melhores metáfases foram fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência com filtros apropriados (OlympusTM BX50) sob aumento de 1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de captura Olympus DP73 com o uso do software cellSens©.

3.2.6 Hibridação in situ fluorescente – FISH Obtenção de sondas para hibridização

A hibridização in situ com fluorescência foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986) usando sondas de 18S e 5S. As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S DNAr (1400 pb) foram obtidos a partir de amostras de DNA de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), via PCR utilizando os primers A 5'-TAC CCG CGA TCT CGT CCG ATC-3 '/

B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG GTA AGC-3' (Pendás et al., 1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-TCC GCA GGT TCA CCT ACG AG-3' (White et al., 1990), respectivamente. A sonda 18S foi marcada por nick translation digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S foi marcada por nick translation biotina-14-dATP (Roche), de acordo com as especificações do fabricante. As sequências (TTAGGG)n foram mapeadas utilizando o Kit FISH Telomere PNA/FITC® de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation™).

Hibridização cromossômica

A FISH foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986). Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse (20mg / mL em 2xSSC) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005% em HCl 10mM) à 37°C por 10 minutos e fixados com formaldeído à 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em série alcoólica (70%, 80% e 100%), por 5 minutos cada. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC à 72°C por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato de dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/μl). Após hibridação, overnight à 37°C, as lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60°C por 15 minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da sonda foi detectado usando streptavidina-FITC (Vector™) para a sonda DNAr 5S e anti- digoxigenina rodamina conjugada (Roche™) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI® (1,5μg/ml). As preparações cromossômica submetidas à FISH foram analisadas conforme descrito para as análises com fluorocromos.

3.2.7 Análises cromossômicas

Após a obtenção das imagens como previamente explanado para todos as técnicas aqui elucidadas, os cromossomos metafásicos foram definidos de acordo com a posição do centrômero segundo Levan et al. (1964). As imagens foram tratadas com o software Adobe© Photoshop© CS6 versão 13.1.2x64 (1990-2012 Adobe Systems Incorporated, all rights reserved).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1.CAPÍTULO I FUSÕES EM TANDEM NA EVOLUÇÃO DO CARIÓTIPO DE BALISTIDAE E MONACANTHIDAE (TETRAODONTIFORMES)

Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Allyson S. Souza1; Marcelo B. Cioffi2 ; Wagner F. Molina1

1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal – RN, Brasil.

2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo – SP, Brasil.

Resumo Tetraodontiformes exibem diferentes tendências carioevolutivas e filogenéticas, decorrentes da ação preferencial de certos rearranjos estruturais, entre elas fusões em tandem. Estes mecanismos de difícil identificação por métodos citogenéticos convencionais podem eventualmente ser detectados pelo mapeamento de sequências teloméricas ao longo dos cromossomos, através da hibridização in situ com fluorescência (FISH). Com vistas a analisar a ocorrência de cariótipos com números diploides reduzidos nesta ordem, foram realizadas análises carioevolutivas nas espécies Cantherhines pullus (Monacanthidae) e Melichthys niger (Balistidae), através de metodologias da citogenética convencional (coloração pelo Giemsa, bandamento C, Ag-RONs), coloração com fluorocromos base-específicos e mapeamento cromossômico de sequências ribossomais e teloméricas através da técnica de FISH. Ambas as espécies apresentaram cariótipos com 2n=40 cromossomos, todos acrocêntricos, um par de RONs e heterocromatina preferencialmente pericentromérica. Cantherhines pullus apresentou sítios (TTAGGG)n intersticiais, apoiando a ocorrência de eventos de fusão in tandem na diversificação cariotípica de algumas famílias.

Palavras-chave: Balistoidea, carioevolução, FISH, telômeros, rearranjos cromossômicos.

IN TANDEM FUSION IN THE KARYOTYPE EVOLUTION OF BALISTIDAE AND MONACANTHIDAE (TETRAODONTIFORMES)

Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Allyson S. Souza1; Marcelo B. Cioffi2 ; Wagner F. Molina1

1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal – RN, Brasil.

2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Paulo – SP, Brasil.

Abstract

Tetraodontiformes exhibit different karyoevolutive and phylogenetic trends, resulting from the action of preferential structural rearrangements, among them in tandem fusions. These mechanisms are difficult to identify by conventional cytogenetic methods and can be possibly detected by physical mapping of telomeric sequences along the chromosomes through in situ hybridization with fluorescence. In order to analyze the occurrence of karyotypes with reduced diploid number in this Order, karyoevolutive analyzes were performed on the species Cantherhines pullus (Monacanthidae) and Melichthys niger (Balistidae) through methodologies of conventional cytogenetics (Giemsa staining, C-banding, Ag-NORs), fluorochromes base-specific staining and chromosomal mapping of ribosomal and telomeric sequences through FISH technique. Both species showed karyotypes with 2n = 40 chromosomes, all acrocentric, a pair of NORs and heterochromatin preferably pericentromeric. Cantherhines pullus presented interstitials sites (TTAGGG)n, supporting the occurrence of in tandem fusion events in karyotypical diversification of some families.

Keywords: Balistoidea, karyoevolution, FISH, telomeres, chromosomal rearrangements.

Introdução

Os Tetraodontiformes compõem uma linhagem pós-Perciformes e constituem o último ramo da difusão dos teleósteos (Elmerot et al., 2002), ocupando uma posição filogenética de destaque nesse contexto. Desde a detecção das menores quantidades de DNA entre os vertebrados para os peixes da família Tetraodontidae (Hinegardner, 1968), este grupo tornou- se um importante modelo animal com a ocorrência do aumento de informações citogenéticas, identificação de elementos de transposição, sequenciamento do genoma completo e do genoma mitocondrial (Crollius & Weissenbach, 2005). Concomitantemente, intensificou-se o interesse em vários outros grupos de Tetraodontiformes (Jaillon et al., 2004; Santini et al., 2013a), que com a ampliação do espectro filogenético permitiu identificar diferentes tendências carioevolutivas entre suas famílias (Sá-Gabriel & Molina, 2005). Diferenças quanto ao tamanho do genoma em diversas famílias sugere que a expansão ou a contração dos genomas ocorreu independentemente em cada táxon e que, portanto, este tamanho reduzido do genoma não é uniforme para todas as espécies nem característico de todos os Tetraodontiformes, o que torna o grupo bastante peculiar (Venkatesh et al., 2000). Nos Tetraodontiformes ocorre, também, uma marcante diversidade de fórmulas cariotípicas, reflexo da forte especialização do grupo, aparentemente não existindo um padrões amplamente distribuídos como ocorre nos Perciformes (Sá-Gabriel & Molina, 2005). Nesse cenário as espécies da ordem apresentam cariótipos variáveis com números diploides variando entre 28 a 52 cromossomos (Arai, 2011; Nirchio & Oliveira, 2014). Enquanto espécies da família Triacanthidae, possuem números diploide e número fundamental (número de braços cromossômicos, NF) frequentemente iguais a 48, outras famílias, como Balistidae, Monacanthidae, Diodontidae, Tetraodontidae, Ostraciidae e Molidae exibem uma diversidade de fórmulas cromossômicas, com cariótipos mais derivados e números diploides variando de 28 a 52 e números fundamentais com valores de 33 a 96 (Arai, 2011). Os dados disponíveis para a ordem revelam ainda, diferentes tendências carioevolutivas como a ação de alguns rearranjos estruturais, tais como fissões e fusões cêntricas (Sá-Gabriel & Molina, 2005). As famílias Balistidae e Monacanthidae, que divergiram no Eoceno Médio, acerca de 50 milhões de anos, revelam grande proximidade filogenética (Santini et al., 2013b). A proximidade entre essas famílias é reforçada por dados moleculares e morfológicos, que suportam sua provável origem monofilética com formação do clado Balistoidea (Yamanoue et al., 2009; McCord & Westneat, 2016).

Apesar da estreita relação evolutiva, as famílias Balistidae e Monacanthidae apresentam padrões contrastantes de riqueza de espécies e diversidade morfológica. Balistidae compreende 42 espécies, enquanto Monacanthidae inclui, pelo menos, 110 espécies (Eschmeyer & Fong, 2016). Além disso, quase todos os Balistidae são encontrados circuntropicalmente em associação com recifes de coral, já os Monacanthidae são em grande parte restritos ao Indo-Pacífico, com apenas algumas espécies no Atlântico e no Mar Vermelho (Santini et al., 20013b). As causas da redução do número cromossômico nestas famílias, em relação a outros Tetraodontiformes, têm sido inferidas como derivadas de fusões in tandem, contudo sem evidências definitivas sobre esse processo. Nos peixes, fusões cromossômicas têm sido relatadas em processos que envolvem diferenciação de sistemas sexuais múltiplos (Margarido & Moreira-Filho, 2008), principalmente entre cromossomos acrocêntricos, tais como em Eigenmannia sp. e Brachyhypopomus pinnicaudatus (Almeida-Toledo et al., 2000), Erythrinus eyrthrinus (Bertollo et al., 2004), Gymnotus pantanal (Silva & Margarido, 2005) e Harttia carvalhoi (Centofante et al., 2006), embora fusões in tandem também tenham sido detectadas envolvendo cromossomos bibraquiais (Bertollo et al., 1997). Fusões cromossômicas têm desempenhado um papel importante na evolução do cariótipo de diversos grupos de peixes, a exemplo dos salmonídeos (Pomianowski et al., 2012). De fato, fusões Robertsonianas têm sido observadas nos gêneros Hucho, Salmo, Oncorhynchus e Salvelinus (Phillips & Ráb, 2001). Além disso, tem se identificado, através da presença de sítios teloméricos intersticiais (ITS) observados em grandes cromossomos acrocêntricos de Salmo salar, como resultado de fusões in tandem (Amaro et al., 1996). Diante disto, visando uma melhor compreensão da evolução cariotípica nas famílias Monacanthidae e Balistidae aqui foram analisadas a estrutura cromossômica de um de seus representantes, respectivamente Cantherhines pullus e Melichthys niger por métodos citogenéticos clássicos (coloração convencional, bandamento C, Ag-RON), coloração com fluorocromos base-específicos DAPI/MM e pelo mapeamento por FISH de sequências do

DNAr 18S, DNAr 5S e sequências (TTAGGG)n.

Material e Métodos

Coleta de espécimes, obtenção de cromossomos mitóticos e bandamentos cromossômicos

Exemplares de Cantherhines pullus (Ranzani, 1842) (n=5) foram coletados no litoral da Bahia, costa de Salvador (12º58’S, 38º31’O) e de Melichthys niger (Bloch, 1786) no Arquipélago São Pedro São Paulo (n=8) (00º 55'15", N 029º20'60" O) e ilha da Trindade (n=4) (20º30’13”S, 29º19’50”O), distante 1.200 km da costa do Espírito Santo, no centro sul do Oceano Atlântico. Após a coleta, os exemplares foram estimulados mitoticamente com injeção intraperitoneal de complexos comerciais de antígenos bacterianos e fúngicos, por um período de 24 a 48 horas (Molina et al., 2010). Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com óleo de cravo (Eugenol) e após a eutanásia procedeu a extração do rim anterior. Os cromossomos mitóticos foram preparados a partir da suspensão de fragmentos do tecido renal de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os cromossomos foram corados com solução de Giemsa à 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas foram visualizadas através do bandamento C, segundo Sumner (1972). As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram obtidas pela técnica de impregnação por nitrato de prata, idealizada por Howell & Black (1980). A coloração pelos fluorocromos Mitramicina e DAPI foi realizada seguindo a técnica de Schweizer (1976). As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas, sendo as melhores metáfases fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência com filtros apropriados (OlympusTM BX50) sob aumento de 1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de captura (Olympus DP73®) com o uso dos softwares cellSens® (Olympus Optical Co.ltd.) e DPManager®, v.1.2.1.108 (Olympus Optical Co.ltd.) para a sobreposição das imagens.

Hibridização in situ fluorescente – FISH

Obtenção de sondas

As sondas de DNAr 5S (200 pb) e DNAr 18S (1400 pb) foram obtidas via PCR a partir de amostras de DNA de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando os primers A 5'-TAC CCG CGA TCT CGT CCG ATC-3 '/ B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG GTA AGC-3' (Pendás et al., 1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-

TCC GCA GGT TCA CCT ACG AG-3' (White et al., 1990), respectivamente. A sonda 18S foi marcada por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Roche™) e a sonda DNAr 5S foi marcada por nick translation com biotina-14-dATP (Roche™), de acordo com as especificações do fabricante. As sequências (TTAGGG)n foram mapeadas utilizando o Kit FISH Telomere PNA/FITC® de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation™).

Hibridização cromossômica

A hibridização in situ com fluorescência foi realizada em metáfases mitóticas (Pinkel et al., 1986) das duas espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse (20mg/mL em 2xSSC ) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C por 10 minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em série alcoólica. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC à 72°C por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato de dextrano e a sonda desnaturada (5 ng/μl). Após hibridação, overnight à 37°C, as lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60°C por 15 minutos e Tween20 0,5% 4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da sonda foi detectado usando strepavidina-FITC (Vector) para a sonda DNAr 5S e anti- digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contra-corados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml). As análises da FISH e registro fotográfico foram realizados conforme descrito para as análises de fluorocromos. Os cromossomos foram definidos de acordo com a relação entre os braços, segundo Levan et al. (1964).

Resultados

Os resultados obtidos para Melichthys niger e Cantherhines pullus corroboram com os dados citogenéticos prévios para as espécies (Sá-Gabriel & Molina, 2005). Ambas as espécies apresentam 2n=40 cromossomos, todos acrocêntricos, com número fundamental (NF) igual a 40 (Figura 1a). Os exemplares de Melichthys niger do litoral da Bahia e ASPSP, não apresentaram diferenciações cariotípicas detectáveis. Em Cantherhines pullus as regiões heterocromáticas estão distribuídas em posição pericentromérica em todos os cromossomos, como algumas evidências de marcações

intersticiais, nos pares 1, 3 e 4 (Figura 1b). Os sítios Ag-RONs/MM+/DAPI- são únicos e localizados em posição pericentromérica no par 5, corroborado por sinais de DNAr 18S (Figura 1a-c). Sítios DNAr 5S estavam localizados no par 10 (Figura 1c). Sítios (TTAGGG)n foram identificados em posições terminais dos cromossomos, bem como intersticiais, nos pares 1, 3 e 4 (Figura 1). Em Melichthys niger os sítios Ag-RONs/MM+/DAPI- estavam localizados em posição intersticial no par 2, sendo corroborado por sinais de hibridização com sondas DNAr 18S. Os sítios DNAr 5S estão localizados no par 10. As regiões heterocromáticas mostraram-se preferencialmente em posição pericentromérica na maioria dos pares, com uma marcação mais intensa sobre o par 2, sobreposto à localização das RONs. Em alguns dos maiores pares ocorrem regiões heterocromáticas em posição intersticial do braço longo. Os sítios teloméricos ocorrem exclusivamente em marcações terminais nos cromossomos.

Figura 4. Cariótipos de Cantherhines pullus e Melichthys niger através de (a) coloração convencional (em destaque os sítios Ag-RONs); (b) Bandamento C; (c) double-FISH com sondas DNAr 18S (sinais vermelhos), e DNAr 5S (sinais verdes), em destaque os pares organizadores nucleolares sob coloração MM/DAPI (sinais verdes) pares 5 e 2, respectivamente; (d) padrão de distribuição de sondas (TTAGGG)n com destaque para os pares portadores de sítios ITS Barra=5 μm.

Figura 5. Idiograma de referência dos quatro primeiros pares cromossômicos de C. pullus, indicando a distribuição de heterocromatina e sequências (TTAGGG)n. Os segmentos cromossômicos delimitados entre os sítios teloméricos estão indicados em relação a faixas diferenciais de tamanho observadas entre os cromossomos do complemento da espécie.

Discussão

Levantamentos citogenéticos têm apontado que alguns grupos de peixes marinhos apresentam prevalentemente um complemento diploide de 48 cromossomos acrocêntricos (Supiwong et al., 2013). Em contraste, os Tetraodontiformes exibem uma grande diversificação cariotípica, decorrentes de diferentes tendências carioevolutivas, mediadas por rearranjos cromossômicos particulares (Molina & Freitas, 2007), como identificado nos dados apresentados. Tanto em Monacanthidae, cujos números diploides variam de 2n = 33/34 a 36 cromossomos (Lima et al., 2011), como em Balistidae que apresentam 2n variando entre 36- 46 cromossomos, a maioria das espécies apresenta cariótipos preferencialmente formados por elementos mono-braquiais (Supiwong et al., 2013). De fato, tanto C. pullus como M. niger apresentam cariótipos (2n=40) inteiramente compostos por cromossomos acrocêntricos. Essas

reduções numéricas sugerem a ocorrência de rearranjos cromossômicos particulares (Lima et al., 2011). As características cromossômicas observadas em C. pullus e M. niger, como a presença de um único par de RONs e blocos de heterocromatina em sua maior parte pericentroméricos têm sido relatado para outros Tetraodontiformes (Martinez et al., 2010; 2011), Perciformes (Calado et al., 2013; Lima-Filho et al., 2014), Mugiliformes (Nirchio et al., 2009), Beryciformes (Bacurau & Molina, 2004). Estas características fileticamente disseminadas corroboram a hipótese de que constituem características ancestrais para diversos grupos e, portanto, não exclusivas para as famílias Monacanthidae e Balistidae. Além disso, a associação entre RONs e heterocromatina ricas em bases GC, observada em ambas as espécies analisadas, é frequentemente descrita em peixes (Almeida-Toledo et al., 1996; Nascimento et al., 2014), onde estas regiões mostram-se adjacentes, sobrepostas ou intercaladas às RONs, o que pode favorecer rearranjos nos pares portadores (Vicari et al., 2003; Martinez et al., 2011). Em ambas espécies, os sítios ribossomais 5S, foram localizados no par 10, em posição pericentromérica, o que sugere homeologia destes cromossomos e evidências do estreito relacionamento filogenético entre Monacanthidae e Balistidae (Lima et al., 2011). Em muitos vertebrados, genes DNAr 5S estão localizados em um único par de cromossomos, no entanto, nos peixes, estes genes podem ser encontrados em um ou vários pares cromossômicos (Lima- Filho et al., 2014). A localização dos sítios 5S em um único par de cromossomos tem sido relatada para várias espécies de peixes (Sola et al., 2000). Esta característica parece representar uma condição basal para o grupo (Martins & Galetti, 2001; Jacobina et al., 2012). Sítios 5S rDNA não sintênicos com a subunidade DNAr 18S constitui o padrão mais comumente encontrado em peixes (Martins & Galetti, 2001; Neto et al. 2011; Molina et al., 2013), assim como ocorrido para C. pullus e M. niger. Esta situação também já foi evidenciada em outras famílias de Tetraodontiformes, como Diodontidae, Tetraodontidae (Noleto et al., 2007; Vicari et al., 2012). As regiões heterocromáticas são altamente variáveis entre os organismos (Brutlag, 1980), desempenhando um papel chave na evolução dos cariótipos dos peixes. Podem estar relacionadas a polimorfismos, sejam eles intra-individuais (Vasconcelos & Molina, 2009), intra-populacionais (Mantovani et al., 2001) ou inter-populacionais (Molina et al., 2008; Jacobina et al., 2009). Dessa maneira, essas regiões, frequentemente associadas com a

diversificação cariotípica nos peixes (Mantovani et al., 2001; Molina & Freitas, 2007), podem ter contribuído na diferenciação cariotípica de Balistoidea. A presença de heterocromatina associada com RONs, em regiões adjacentes ou intercalados (Pendás et al., 1993), tal qual apresentado para M. niger, pode contribuir para a ocorrência de rearranjos estruturais envolvendo os pares portadores (Vicari et al., 2003). No entanto, deve-se salientar que heterocromatina pode ser mais complexa do que se estima, abrigando um grande número sequências repetitivas (histonas, transposons, retrotransposons e microssatélites), como revelado em algumas espécies de Perciformes (Costa et al., 2013, 2014) As inferências sobre ocorrência de fusões in tandem nos grupos foram corroboradas pelas respostas da FISH com sequências (TTAGGG)n. Estas sequências estão presentes nos telômeros de cromossomos de vertebrados e a sua análise permite determinar a presença de rearranjos envolvidos na evolução cromossômica, tais como fusões ou inversões Robertsonianas e fusões in tandem (Jacobina et al., 2011; Cioffi et al., 2011). Dessa maneira, as sequências (TTAGGG)n foram localizadas nas regiões teloméricas dos cromossomos de M. niger como de C. pullus. Entretanto, sítios teloméricos intersticiais (ITS) estavam presentes, em C. pullus nos pares 1, 3 e 4 (Figura 2) o que indica que fusões in tandem provavelmente estiveram envolvidas na evolução cariotípica do grupo, onde ocorreu a fusão entre pares acrocêntricos menores, dando origem aos três pares citados do complemento. As sequências de DNA repetitivo compreendem uma fração substancial do genoma de muitos eucariotos e podem estar dispersas ou situadas em repetições in tandem (Charlesworth et al., 1994). Esta classe de DNA encontra-se principalmente em regiões centroméricas e teloméricas, achando-se associados a regiões heterocromáticas (Martinez et al., 2010). Assim, ITS se mostraram co-localizados com blocos heterocromáticos intersticiais (Figura 2), situação que reforça pontos de fusões in tandem nas espécies analisadas. Por outro lado, apesar de possivelmente terem sofrido mecanismos de fusão in tandem, em M. niger não foram identificados ITS, com sequências teloméricas presentes apenas nas regiões dos telômeros. Embora a presença de sítios teloméricos intersticiais seja evidência visível de processos de fusões cromossômicas, nem sempre são facilmente detectados, uma vez que essas sequências se modificam rapidamente após a fusão, provavelmente como decorrência da perda da função do telômero ou devido ao acúmulo de mutações que se perderam ao longo do tempo (Jacobina et al., 2011; Fernandes et al., 2015).

O conhecimento sobre os aspectos do genoma Balistoidea ainda é limitado, embora se saiba que, como os Tetraodontidae, este clado é composto por espécies com genomas compactos que evoluíram de forma independente (Brainerd et al., 2001). Contudo, o genoma Tetraodontidae tem sido extensamente estudado (Crollius et al., 2000), revelando que a pequena quantidade de sequências repetitivas está localizada nos centrômeros e braços dos cromossomos. Esta disposição física parece estar presente nos cromossomos de Balistoidea e poderia ajudar a explicar por que as regiões centroméricas e dos telômeros estariam propensas à ocorrência de fusões ou rearranjos cromossômicos. Adicionalmente um número diploide inferior a 48 cromossomos, em ambos Balistidae e Monacanthidae, corrobora que eventos de fusão in tandem, parecem ter sido um mecanismo importante na diferenciação cariotípica destes pós-grupo Perciformes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao CNPq pelo apoio financeiro (556793/2009-9), ao Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Renováveis pela licença de coleta dos exemplares (Processo No. 19135/1), a Universidade Federal do Rio Grande do Norte por prover os meios para conduzir o estudo.

Referências

Almeida-Toledo, L.F., Foresti, F., Daniel, M.F., Toledo-Filho, S.A. (2000). Sex chromosome evolution in fish: the formation of the neo-Y chromosome in Eigenmannia (Gymnotiformes). Chromosoma, 109 (3): 197–200.

Almeida-Toledo, L.F, Stocker, A.J, Foresti F., Almeida Toledo-Filho, S. (1996). Fluorescence in situ hybridization with rDNA probes on chromosomes of two nucleolus organizer region phenotypes of a species of Eigenmannia (Pisces, Gymnotoidei, Sternopygidae). Chromosome Research, 4: 301-305.

Amaro, R., Abuín, M., Sánchez, L. (1996). Chromosomal evolution in salmonids: a comparison of Atlantic salmon, brown trout, and rainbow trout R-band chromosomes. Genetica, 98(3): 297– 302.

Arai, R. (2011). Fish Karyotypes: a check list. Springer, Tokyo, 347.

Bacurau, T.O.F., Molina, W.F. (2004). Karyotypic diversification in two Atlantic species of Holocentridae (Pisces , Beryciformes). October, 57 (3): 300–304.

Bertollo, L.A., Fontes, M.S., Fenocchio, A.S., Cano, J. (1997). The X1X2Y sex chromosome system in the fish Hoplias malabaricus. I. G-, C- and chromosome replication banding. Chromosome Researsh, 5: 493–499.

Bertollo, L.A.C., Oliveira, C., Molina, W.F., Margarido, V.P., et al. (2004). Chromosome evolution in the erythrinid fish, Erythrinus erythrinus (Teleostei: Characiformes). Chromosome Research, 5 (7): 493–99.

Brainerd, E., Slutz, S., Hall, E., Phillis, R. (2001). Patterns of genome size evolutioin in Tetraodontiform fishes. Evolution, 55 (11): 2363–68.

Brutlag, D.L. (1980). Molecular arrangement and evolution of heterochromatic DNA. Annual Review Genetics, 14:121-44.

Calado, L.L, Bertollo, L.A.C., Costa, G.W.W.F., Molina, W.F. (2013). Cytogenetic studies of Atlantic mojarras (Perciformes - Gerreidae): chromosomal mapping of 5S and 18S ribosomal genes using double FISH. Aquaculture Research, 44 (5): 829–35.

Centofante L., Bertollo L.A.C., Moreira-Filho, O. (2006). Cytogenetic characterization and description of an XX/XY1Y2 sex chromosome system in catfish Harttia carvalhoi (Siluriformes, Loricariidae). Cytogenetic and Genome Research, 112:320-324.

Charlesworth, B., Sniegowski, P., Wolfgang, S. (1994) The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes. Nature, 371:215–220.

Cioffi, M.B., Molina, W.F., Moreira-Filho, O., Bertollo, L.A.C. (2011). Chromosomal distribution of repetitive DNA sequences highlights the independent differentiation of multiple sex chromosomes in two closely related fish species. Cytogenetic and Genome Research, 134 (4): 295–302.

Cioffi, M.B., Martins, C., Bertollo, L.A.C. (2010). Chromosome spreading of associated transposable elements and ribosomal DNA in the fish Erythrinus erythrinus. Implications for genome change and karyoevolution in fish. BMC Evolutionary Biology, 10: 271.

Costa, G.W.F., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2013). Transposable elements in fish chromosomes: a study in the marine cobia species. Cytogenetic and Genome Research, 141: 126–32.

Costa, G.W.W.F., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2014). Unusual dispersion of histone repeats on the whole chromosomal complement and their colocalization with ribosomal genes in Rachycentron Canadum (Rachycentridae, Perciformes). Cytogenetic and Genome Research, 144 (1): 62–67.

Crollius, H.R., Jaillon, O., Dasilva, C., Ozouf-Costaz, C. (2000). Characterization and repeat analysis of the compact genome of the freshwater pufferfish Tetraodon nigroviridis. Genome Research, 10 (7): 939–49.

Crollius, H.R., Weissenbach, J. (2005). Fish genomics and biology. Genome Research, 15 (12): 1675– 82.

Elmerot, C., Arnason, U., Gojobori, T., Janke, A. (2002). The mitochondrial genome of the pufferfish, Fugu rubripes and ordinal teleostean relationships. Gene, 295 (2): 163–72.

Eschmeyer, W.N., Fong, J.D. (2016). Catalog of fishes electronic version, San Francisco: California Academy of Sciences. Disponível em: http://researcharchive.calacademy.org/research/ichthyology/catalog/SpeciesByFamily.asp. Acessado em 20 de Janeiro de 2016.

Fernandes, M.A., Affonso, P.R.A.M., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C. et al. (2015). Atlantic surgeonfishes bear only minor microstructural changes in highly derived karyotypes. Zoologischer Anzeiger, 254.

Gold, J.R., Li, Y.C., Shipley, N.S., Powers, P.K. (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology, 37: 563–75.

Hinegardner, R. (1968). Evolution of cellular DNA content in teleost fishes. The American Naturalist, 102 (928): 517–23.

Howell, W.M., Black, D.A., 1980. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36 (8): 1014–15.

Jacobina, U.P., Affonso, P.R.A.D.M., Carneiro, P.L.S., Dergam, J.A. (2009). Biogeography and comparative cytogenetics between two populations of Hoplias malabaricus (Bloch, 1794) (Ostariophysi: Erythrinidae) from coastal basins in the state of Bahia, Brazil. Neotropical Ichthyology, 7 (4): 617–22.

Jacobina, U.P., Cioffi, M.B., Souza, L.G.R., Calado, L.L. et al. (2011). Chromosome mapping of repetitive sequences in Rachycentron canadum (Perciformes: Rachycentridae): Implications for karyotypic evolution and perspectives for biotechnological uses. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2011: 1–8.

Jacobina, U.P., Vicari, M., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2012). Discriminatory profile of rDNA sites and trend for acrocentric chromosome formation in the genus Trachinotus (Lacépède, 1801) (Perciformes, Carangidae). Comparative Cytogenetics, 6 (4): 359–69.

Jaillon, O., Aury, J.M., Brunet, F., Petit, J.L., et al. (2004). Genome duplication in the teleost fish Tetraodon nigroviridis reveals the early vertebrate proto-karyotype. Nature, 431 (7011): 946–57.

Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. (1964). Nomenclature for centromeric position at chromosomes. Hereditas, 201–20.

Lima-Filho, P.A., Bertollo, L.A.C., Cioffi, M.B., Costa, G.W.W.F., Molina, W.F. (2014). Karyotype divergence and spreading of 5S rDNA sequences between genomes of two species: darter and emerald gobies (Ctenogobius, Gobiidae). Cytogenetic and Genome Research, 142 (3): 197–203.

Lima, L.C., Martinez, P.A, Molina, W.F (2011). Cytogenetic characterization of three Balistoidea fish species from the Atlantic with inferences on chromosomal evolution in the families Monacanthidae and Balistidae. Cytogenetic and Genome Research, 142 (3): 197–203.

Mantovani, M., Abel, L.D.D.S., Mestriner, C.A., Moreira-Filho, O. (2001). Accentuated polymorphism of heterochromatin and nucleolar organizer regions in Astyanax scabripinnis (Pisces, Characidae): Tools for understanding karyotypic evolution. Genetica, 109 (3): 161–68.

Margarido, V.P., Moreira-Filho, O., 2008. Karyotypic differentiation through chromosome fusion and number reduction in Imparfinis hollandi (Ostariophysi, Heptapteridae). Genetics and Molecular Biology, 31: 235–38.

Martinez, P.A., Araujo, W.C., Molina, W.F. (2010). Derived cytogenetic traits, multiple NORs and B chromosomes in the compact karyotype of Canthigaster figueiredoi (Tetraodontiformes). Marine Genomics, 3 (2): 85–89.

Martinez, P.A., Jacobina, U.P., Molina, W.F. (2011). Comparative cytogenetics and heterochromatic patterns in two species of the genus Acanthostracion (Ostraciidae: Tetraodontiformes). Marine Genomics, 4 (3): 215–20.

Martins, C., Galetti, P.M. (2001). Two 5S rDNA arrays in Neotropical fish species: is it a general rule for fishes? Genetica, 111: 439–46.

McCord, C.L., Westneat, M.W. (2016). Phylogenetic relationships and the evolution of BMP4 in Triggerfishes and Filefishes (Balistoidea). Molecular Phylogenetics and Evolution, 94: 397–409.

Molina, W.F, Shibatta O., Galetti Jr P.M. (2008). Chromosomal evidence of population subdivision in the freshwater fish Leporinus elongatus in the upper Paraná river basin. Genetics and Molecular Biology, 31(1), 270-274.

Molina, W.F, Freitas, T.O. (2007). Structural and numerical chromosome diversification in marine Perciformes (Priacanthidae and Gerreidae). Cytologia, 71 (3): 237–42.

Molina, W.F., Alves, D.E.O., Araújo, W.C., Martinez, P.A. et al. (2010). Performance of human immunostimulating agents in the improvement of fish cytogenetic preparations. Genetics and Molecular Research, 9 (3): 1807–14.

Molina, W.F, Costa, W.W.F, Soares, R.X., Affonso, P.R.A.M. (2013). Extensive chromosome conservatism in Atlantic butterflyfishes, genus Chaetodon (Linnaeus, 1758) implications for the high hybridization success. Zoologischer Anzeiger, 253 (2): 137–42.

Nascimento, W.S., Bezerra, J.G., Lima-Filho, P.A., Yamamoto, M.E. et al. (2014). Karyotype patterns of Hypsolebias antenori (Cyprinodontiformes: Rivulidae): an endangered killifish of the semiarid region of Brazil. The Scientific World Journal, 862434.

Neto, C.C.M., Cioffi, M.B., Bertollo, L.A.C., Molina, W.F. (2011). Extensive chromosomal homologies and evidence of karyotypic stasis in Atlantic grunts of the genus Haemulon (Perciformes). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 401 (1-2):75–79.

Nirchio, M., Oliveira, C., Ferreira, I.A., Martins, C. et al. (2009). Classical and molecular cytogenetic characterization of Agonostomus monticola, a primitive species of Mugilidae (Mugiliformes). Genetica, 135 (1): 1–5.

Nirchio, M., Rossi, A.R., Foresti, F., Oliveira, C. (2014). Chromosome evolution in fishes: a new challenging proposal from Neotropical species. Neotropical Ichthyology 12 (4): 761–70.

Noleto, R.B., Vicari, M.R., Cipriano, R.R., Artoni, R.F., et al. (2007). Physical mapping of 5S and 45S rDNA loci in pufferfishes (Tetraodontiformes). Genetica, 130 (2): 133–38.

Pendás, A.M., Moran, P., Freije, J.P., Garcia-Vazquez, E. (1994). Chromosomal mapping and nucleotide sequence of two tandem repeats of Atlantic salmon 5S rDNA. Cytogenetics and Cell Genetics, 67: 31–36.

Pendás, A.M., Morán, P., García-Vázquez, E. (1993). Multi-chromosomal location of ribosomal RNA genes and heterochromatin association in brown trout. Chromosome Research, 1: 63–67.

Phillips R., Ráb, P. (2001). Chromosome evolution in the Salmonidae (Pisces): an update. Biological. Reviews, 76: 1–25.

Phillips, R.B., Reed, K.M. (1996). Application of fluorescence in situ hybridization (FISH) techniques to fish genetics: a review. Aquaculture 140 (3): 197–216.

Pinkel, D., Straume, T., Gray, J.W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 83 (9): 2934–38.

Pomianowski, K., Jankun, M., Ocalewicz, K. (2012). Detection of interstitial telomeric sequences in the Arctic charr (Salvelinus alpinus) (Teleostei: Salmonidae). Genome, 55 (1): 26–32.

Reed, K., Phillips, M. (1995). Molecular cytogenetic analysis of the double-CMA3 chromosome of lake trout, Salvelinus namaycush. Cytogenetics and Cell Genetics, 70 (1-2): 104–7.

Sá-Gabriel, L.G., Molina, W.F. (2005). Karyotype diversification in fishes of the Balistidae, Diodontidae and Tetraodontidae (Tetraodontiformes). Caryologia, 58 (3): 229–37.

Santini, F., Sorenson, L., Alfaro, M.E. (2013a). A new phylogeny of tetraodontiform fishes (Tetraodontiformes, Acanthomorpha) based on 22 loci. Molecular Phylogenetics and Evolution, 69 (1): 165–76.

Santini, F., Sorenson, L., Alfaro, M.E. (2013b). A new multi-locus timescale reveals the evolutionary basis of diversity patterns in triggerfishes and filefishes (Balistidae, Monacanthidae: Tetraodontiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, 69 (1): 177–87.

Schweizer, D. (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma, 58 (4): 307–24.

Silva, E.B., Margarido, V.P (2005) An X1X1X2X2/X1X2Y multiple sex chromosome system in a new species of the genus Gymnotus (Pisces, Gymnotiformes). Environmental Biology of Fishes, 73:293-297.

Sola, L., De Innocentiis, S., Gornung, E., Papalia, S., Rossi, A.R., et al. (2000). Cytogenetic analysis of Epinephelus marginatus (Pisces: Serranidae), with the chromosome localization of the 18S and 5S rRNA genes and of the (TTAGGG)n telomeric sequence. Marine Biology, 137 (1):47–51.

Sumner, A.T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 75 (1):304–6.

Supiwong, W., Alongklod, T., Sarun, J., Suthip, K. et al. (2013). Standardized karyotype and idiogram of titan triggerfish, Balistoides viridescens (Tetraodontiformes, Balistidae) in Thailand. Cytologia, 78 (4): 345–51.

Vasconcelos, A.J.M, Molina, W.F. (2009). Cytogenetical studies in five Atlantic Anguilliformes fishes. Genetics and Molecular Biology, 32 (1): 83–90.

Venkatesh, B., Gilligan, P., Brenner, S. (2000). Fugu: a compact vertebrate reference genome. FEBS Letters, 476 (1-2): 3–7.

Vicari, M.R., Artoni, R.F., Bertollo, L.A.C. (2003). Heterochromatin polymorphism associated with 18S rDNA: a differential pathway among Hoplias malabaricus fish populations. Cytogenetic and Genome Research, 101: 24–28.

Vicari, M.R., Noleto, R.B., Cestari, M.M., Artoni, R.F. (2012). Variable B chromosomes frequencies between males and females of two species of Pufferfishes (Tetraodontiformes). Reviews in Fish

Biology and Fisheries, 22 (1): 343–49.

White, T.J., Bruns, S., Lee, S., Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.

Yamanoue, Y., Miya, M., Matsuura, K., Sakai, H., et al. (2009). Unique patterns of pelvic fin evolution: A case study of Balistoid fishes (Pisces: Tetraodontiformes) based on whole mitochondrial genome sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, 50 (1): 179–89.

4.2 CAPÍTULO II

ASPECTOS DA REDUÇÃO GENÔMICA EM TETRAODONTIFORMES INFERIDA POR DADOS CITOGENÉTICOS EM TETRAODONTIDAE E MONACANTHIDAE

Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Rodrigo X. Soares1; Marcelo B. Cioffi2 ;Wagner F. Molina1

1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos

Resumo

A ordem Tetraodontiformes está dividida em dez famílias, algumas apresentando características singulares, com relação as suas estruturas cariotípicas e genômicas. A família Tetraodontidae apresenta, indivíduos com os menores genomas entre os vertebrados e representado, normalmente, por diminutos cromossomos com número diploide em torno de 46. Em contrapartida a família Monacanthidae, também com baixo conteúdo de DNA, apresenta espécies com 2n reduzidos, geralmente, em torno de 36. Visando analisar padrões de mudança em espécies com redução genômica, foram realizadas análises citogenéticas convencionais (coloração pelo Giemsa, bandamento C, Ag-RONs, fluorocromos base- específicos) e mapeamento físico de sequências ribossomais por hibridação in situ com fluorescência (FISH) nas espécies Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Monacanthus chinensis (Monacanthidae). As espécies revelaram cariótipos dispares, tanto em relação ao número diploide, quanto ao número de braços cromossômicos, das quais S. testudineus apresentou 2n=46 (NF=74), com cromossomos diminutos, e M. chinensis com 2n=34 (NF=34) cromossomos acrocêntricos. As marcantes divergências na estrutura cariotípica evidenciam que mesmo genomas compactos podem exibir elevada dinâmica cromossômica.

Palavras-chave: Carioevolução, tamanho do genoma, evolução cromossômica, cangulo, baiacu

ASPECTS OF GENOMICS REDUCTION IN TETRAODONTIFORMES INFERRED BY CYTOGENETICAL DATA IN TETRAODONTIDAE AND MONACANTHIDAE

Juliana G. Bezerra1; Luiz A.C. Bertollo2; Gideão W.W.F da Costa1; Rodrigo X. Soares1; Marcelo B. Cioffi2 ;Wagner F. Molina1

1 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

2 Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos

Abstract

The Tetraodontiformes order is divided into ten families, some featuring singular characteristics, related to their karyotypical and genomic structures. The Tetraodontidae family presents, individuals with the smallest genomes among vertebrates and represented, usually, by tiny chromosomes with diploid number around 46. However the Monacanthidae family, also with low DNA content, presents species with reduced 2n, generally around 36. In order to analyze changing patterns in species with genomic reduction, conventional cytogenetics analyzes were performed (Giemsa staining, C-banding, Ag-NORs, base-specific fluorochromes staining) and physical mapping of ribosomal sequences through in situ hybridization with fluorescence in the species Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) and Monacanthus chinensis (Monacanthidae). The species showed disparate karyotypes, as in relation to diploid number, as well to the number of chromosomal arms, of which S. testudineus presented 2n = 46 (NF = 74) with tiny chromosomes, and M. chinensis 2n = 34 (NF = 34) acrocentric chromosomes. The striking divergences at the karyotypical structure evidenced that even compact genomes can display high chromosomal dynamics.

Keywords: Karyoevolution, genome size, chromosomal evolution, triggerfish, pufferfish.

Introdução

As 440 espécies de Tetraodontiformes (Eschmeyer & Fong, 2016), estão divididas em dez famílias e representam uma das mais peculiares radiações morfológicas e ecológicas de peixes teleósteos (Santini et al., 2013a; Matsuura, 2014). A ordem exibe notável diversidade de formas corporais e tamanhos, estruturas esqueléticas, ecologia e tamanho do genoma (Brainerd et al., 2001; Santini & Tyler, 2003; Jaillon et al., 2004). Embora metade da diversidade de Tetraodontiformes seja associada a ambientes recifais, as 10 famílias reconhecidas habitam uma grande variedade de habitats (Alfaro et al., 2007). Apesar da grande diversidade para o grupo, diversos estudos que envolvem dados morfológicos e moleculares suportam o monofiletismo da ordem (Santini & Tyler, 2003, 2004; Holcroft, 2005; Alfaro et al., 2007; Yamanoue et al., 2008; Santini et al., 2013b). Entre os vertebrados, o tamanho do genoma medido em picogramas (pg) de DNA por célula haploide varia consideravelmente e estas variações também ocorrem entre as famílias de Tetraodontiformes (Dolezel et al., 2003). Dentre elas, Tetraodontidae apresenta os menores conteúdos de DNA dentre os vertebrados (0,34-0,82 pg) (Noleto et al., 2009; Gregory, 2016). Ainda com baixos conteúdos de DNA, destaca-se as famílias Monacanthidae e Balistidae, apresentando valores entre 0,54 – 0,77 (Gregory, 2016). Enquanto que Ostraciidae, Diodontidae, Triacanthidae e Molidae exibem maiores conteúdos de DNA por célula, com valores variando entre 0,60 – 1,10 (Gregory, 2016). Apesar dos Tetraodontiformes ter um complemento similar de genes a de outros vertebrados, o pequeno tamanho é aparentemente o resultado de perda de introns e de DNA repetitivo (Elgar et al. 1999; Loh et al., 2008). Devido a esta notável compactação do genoma, os Tetraodontiformes tornaram-se um modelo atrativo para a genômica comparativa, essencialmente útil no entendimento da evolução genômica e cariotípica de vertebrados (Jaillon et al., 2004). Associado a essa característica, a ordem apresenta, ainda, uma variedade de tendências carioevolutivas com a presença de inúmeros rearranjos, além de valores diploides variando de 2n=28 a 52 cromossomos e de uma considerável diferenciação em relação ao número de braços cromossômicos, com valores de NF entre 34 e 96 (Arai, 2011; Martinez et al., 2011). Essas peculiaridades torna a ordem intrigante e particularmente interessante aos estudos citogenômicos. Assim, com vistas a identificar e discutir a dinâmica cromossômica sob condições de redução genômica em Tetraodontidae e Monacanthidae foram realizadas análises

citogenéticas em Sphoeroides testudineus (Tetraodontidae) e Monacanthus chinensis (Monacanthidae), por métodos citogenéticos clássicos (bandamento C, Ag-RON), coloração com fluorocromos base-específicos MM+/DAPI- e pelo mapeamento por FISH de sequências do DNAr 18S e DNAr 5S.

Material e Métodos

Coleta de espécimes, obtenção de cromossomos mitóticos e bandamentos cromossômicos

Os exemplares de Sphoeroides testudineus (Linnaeus, 1758) (n=12) (Tetraodontidae) e Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765), n=2 (Monacanthidae) utilizados nas análises citogenéticas foram coletados no Atlântico Sul, respectivamente, em Natal, Rio Grande do Norte, (5º52´S, 35º10´O) e no Mar de Andaman (11º04’00”N, 95º44’34”L), no litoral da Tailândia, no oceano Índico. Após a coleta, os exemplares foram estimulados com injeção intraperitoneal de complexos comerciais de antígenos bacterianos e fúngicos, por um período de 24 a 48 horas (Molina et al., 2010). Decorrido este tempo, os exemplares foram anestesiados com óleo de cravo (Eugenol) e após a eutanásia procedeu a extração do rim anterior. Os cromossomos mitóticos foram preparados a partir da suspensão de fragmentos do tecido renal de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os cromossomos foram corados com solução de Giemsa à 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8. As regiões heterocromáticas foram visualizadas através do bandamento C, segundo Sumner (1972). As regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram obtidas pela técnica de impregnação por prata, idealizada por Howell & Black (1980). A coloração pelos fluorocromos Mitramicina e DAPI foi realizada seguindo a técnica de Schweizer (1976). As lâminas foram preservadas em câmara escura à temperatura ambiente por 4 dias e então analisadas, sendo as melhores metáfases fotografadas em fotomicroscópio de epifluorescência com filtros apropriados (OlympusTM BX50) sob aumento de 1000X e capturadas e digitalizadas, por meio de um sistema digital de captura Olympus DP73 com o uso dos software cellSens (Olympus Optical Co.ltd.) e DPManager, v.1.2.1.108 (Olympus Optical Co.ltd.) para a sobreposição das imagens.

Hibridização in situ fluorescente – FISH

Obtenção de sondas

As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S DNAr (1400 pb) foram obtidas via PCR a partir de amostras de DNA de Rachycentron canadum (Teleostei, Perciformes), utilizando os iniciadores A 5'-TAC CCG CGA TCT CGT CCG ATC-3 '/ B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG GTA AGC-3' (Pendás et al., 1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'- TCC GCA GGT TCA CCT ACG AG-3' (White et al. 1990), respectivamente. A sonda 18S foi marcada por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S foi marcada por nick translation com biotina-14-dATP (Roche), de acordo com as especificações do fabricante. As sequências (TTAGGG)n foram mapeadas pela técnica de FISH com Kit FISH Telomere PNA/FITC de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation).

Hibridização cromossômica

A hibridização in situ com fluorescência foi realizada em metáfases mitóticas (Pinkel et al., 1986) das duas espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse (20mg / mL em 2xSSC ) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C por 10 minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em série alcoólica. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC à 72°C por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato de dextran e a sonda desnaturada (5 ng/μl). Após hibridação, overnight à 37°C, as lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60 °C por 15 minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da sonda foi detectado usando streptavidina-FITC conjugada (Vector) para a sonda DNAr 5S e anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml). As análises da FISH e registro fotográfico foram realizados conforme descrito para as análises de fluorocromos. Os cromossomos foram definidos de acordo com a relação entre os braços, de acordo com Levan et al. (1964).

Resultados

Os dados citogenéticos obtidos para S. testudineus corroboram dados prévios para a espécie (Sá-Gabriel & Molina, 2005). O cariótipo é formado por 2n=46 (NF=74). Os sítios Ag-RON/MM+/DAPI- são únicos e localizados em posição terminal no par 5 (Figura 1a), o que foi confirmado com hibridação in situ com sondas DNAr 18S. Os sítios DNAr 5S estão localizados no maior par submetacêntrico, em posição terminal do braço menor (Figura 1c). Regiões heterocromáticas em pequena quantidade se apresentam dispersas em regiões pericentroméricas e terminais na maior parte dos cromossomos (Figura 1b). A espécie Monacanthus chinensis apresentou notável redução do número de cromossomos, com 2n=34 (NF=34) (Fig. 1a). As regiões heterocromáticas (Figura 1b) para a referida espécie, também se apresentaram em pequena quantidade e se mostraram em grande parte com localização pericentromérica, com destaque para os pares 1, 7 e 12 que apresentaram blocos mais conspícuos. Os sítios Ag-RONs/MM+/DAPI- são únicos e localizados no par 5, o que foi corroborado por sinais de hibridização com sondas DNAr 18S.

Figura 6. Cariótipos de S. testudineus e M. chinensis através de (a) coloração convencional (em destaque os sítios Ag-RONs); (b) Bandamento C; (c) double-FISH com sondas DNAr 18S (sinais vermelhos) e DNAr 5S (sinal verde). Barra=5 μm.

Discussão

Os padrões citogenéticos de S. testudineus e M. chinensis, reforçam a diversidade cariotípica presente em Tetraodontiformes. As regiões heterocromáticas em M. chinensis e em S. testudineus estão localizadas em posição pericentromérica da maioria dos pares de cromossomos e apresentam conteúdo reduzido. Em M. chinensis apresentam blocos mais conspícuos sobre alguns poucos pares cromossômicos. O baixo conteúdo heterocromático em ambas as espécies parece ser reflexo da diminuição evolutiva do tamanho do genoma (Hinegardner, 1968; Brainerd et al., 2001; Jaillon et al., 2004). Essa característica genômica deve-se presumivelmente à perda de DNA repetitivo e não codificantes (Neafsey & Palumbi, 2003). Os padrões heterocromáticos presentes nos cromossomos dessas espécies indicam caminhos evolutivos particulares. Em S. testudineus, os blocos heterocromáticos se encontram limitados a pequenos blocos nas regiões centroméricas de alguns pares cromossômicos e associados às regiões organizadoras de nucléolos. Esta condição tem sido observada na maioria das espécies de Tetraodontidae, como em S. greeleyi (Sá-Gabriel & Molina, 2005; Noleto et al., 2009), Tetraodon fluviatilis (Mandrioli & Manicardi, 2001) e T. nigroviridis (Fischer et al., 2000; Mandrioli et al., 2000). Por outro lado, em M. chinensis e outros Monacanthidae (Lima et al., 2011), os blocos heterocromáticos reduzidos, evidenciam a possível perda de sequências de DNA repetitivo (Petrov, 2001), durante o processo carioevolutivo. Genomas compactos são resultado de deleções acumuladas ou representa um estado derivado, esta condição contrapõe à expansões genômicas que ocorreram em outros grupos, derivadas de duplicações in tandem, inserções, poliploidia, atividade de elementos de transposição ou ainda da acumulação de sequências repetitivas, (Venkatesh et al., 2000; Petrov, 2001; Nirchio et al., 2014). A ordem revela outras tendências carioevolutivas, com alguns rearranjos estruturais, tais como, fissões cêntricas, fusões e inversões pericêntricas com ocorrência preferencial em algumas famílias e não em outras (Sá-Gabriel & Molina, 2005). A redução no número do complemento parece ser uma característica para a família Monacanthidae e Balistidae (Lima et al., 2011). Modelos de diversificação evolutiva de cromossomos em peixes são geralmente ausentes, com poucas exceções. Evidências da participação da deriva meiotica, bem como de ortoseleção cariotípica têm sido identificadas em diversos grupos, incluindo

Tetraodontiformes (Molina & Freitas, 2007; Molina et al., 2014b). Nestes grupos alguns clados exibem claramente uma propensão para a fixação de certos tipos de rearranjos cromossômicos em detrimento de outros, condição aparentemente presente tanto em Tetraodontidae, como Monacanthidae (Molina et al., 2014b). As características genômicas desta ordem parece influenciar na dinâmica estrutural e tamanho dos cromossomos, a exemplo do que ocorre em famílias, como Ostraciidae. Nesta família as espécies Acanthostracion polygonius e A. quadricornis apresentam os maiores pares cromossômicos do cariótipo variando em tamanho de 2,5-4,5 µm (Martinez et al., 2011), enquanto que Lactoria diaphana possuem grandes cromossomos metacêntricos, com aproximadamente 8µm (Arai, 1983; 2011). É importante ressaltar, também, que a família Ostraciidae exibe indivíduos com quantidades mais significativas de DNA, quando comparados a membros de outras famílias, a exemplo dos Tetraodontidae (Brainerd et al., 2001; Vicari et al., 2012). Assim, como para a maioria dos organismos, as diferenças no tamanho do genoma para os Tetraodontiformes não está relacionada a diferenças quanto a ploidia, mas pode ser percebida quanto ao tamanho e conteúdo de heterocromatina nos cromossomos, como podes ser percebido para outros Tetraodontiformes, a exemplo de Sphoeroides testudineus e S. spengleri (Tetraodontidae) que apresentam diminutos cromossomos e os grandes cromossomos de Chilomycterus spinosus (Diodontidae) (Noleto et al., 2009). Essas características claramente diferenciam as inúmeras tendências genômicas sofridas entre os diferentes clados da ordem. Nesse contexto, o conjunto de dados de conteúdo de DNA de peixes teleósteos, sugerem uma correlação entre conteúdo de DNA e evolução nesse grupo (Hinegardner, 1968). Espécies mais derivadas de peixes têm menor conteúdo de DNA por núcleo do que formas mais ancestrais, sugerindo implicitamente que a evolução e a especialização em teleósteos tenha sido acompanhada por perda de DNA (Hinegardner, 1968; Yi & Streelman, 2005). Genomas mais basais como os da ordem Acipenseriformes, são cerca de 20 vezes maior que alguns encontrados em Tetraodontiformes, grupo mais derivado (Nirchio et al., 2014). A análise das estruturas cariotípicas de M. chinensis e S. testudineus demonstrou evidências que reforçam para a redução genômica e fixação cariotípica preferencial em famílias de Tetraodontiformes.

Referências

Alfaro, M.E., Santini, F., Brock, C.D.(2007). Do reefs drive diversification in marine teleosts? Evidence from the pufferfish and their allies (order Tetraodontiformes). Evolution, 61 (9): 2104– 26.

Arai, R. (2011). Fish Karyotypes: a check list. Springer, Tokyo, 347.

Arai, R.(1983). Karyological and osteological approach to phylogenetic systematics of Tetraodontiform fishes. Bulletin of the National Science Museum, 9 (4): 175–210.

Brainerd, E.L., Slutz, S.S., Hall, E.H., Phillis, R.W. (2001). Patterns of genome size evolution in Tetraodontiform fishes. Evolution; 55 (11): 2363–68.

Dolezel, J.,Bartos, J., Voglmayr, H., Greilhuber, J. (2003). Nuclear DNA content and genome size of trout and human. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for Analytical Cytology, 51 (2): 127–28.

Elgar, G., Clark, M.S., Meek, S., Smith, S., et al.(1999). Generation and analysis of 25 Mb of genomic DNA from the pufferfish Fugu rubripes by sequence scanning. Genome Research, 9: 960–71.

Fischer, C., Ozouf-Costaz, C., Roest Crollius, H., Dasilva, C., et al. (2000). Karyotype and chromosome location of characteristic tandem repeats in the pufferfish Tetraodon nigroviridis. Cytogenetics and Cell Genetics, 88 (1-2): 50–55.

Gold, J.R., Li, Y.C., Shipley, N.S., Powers, P.K. (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology, 37: 563–75.

Gregory, T.R. (2016). Animal Genome Size Database. Disponével em http://www.genomesize.com. Acessado em 20 de Fevereiro de 2016.

Hinegardner, R. (1968). Evolution of cellular DNA content in teleost fishes. The American Naturalist, 102 (928): 517–23.

Holcroft, N.I. (2005). A molecular analysis of the interrelationships of tetraodontiform fishes (Acanthomorpha: Tetraodontiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, 34 (3): 525–44.

Howell, W.M., Black, D.A. (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36 (8): 1014–15.

Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. (1964). Nomenclature for centromeric position at chromosomes. Hereditas, 201–20.

Lima, L.C., Martinez, P.A, Molina, W.F (2011). Cytogenetic characterization of three Balistoidea fish species from the Atlantic with inferences on chromosomal evolution in the families

Monacanthidae and Balistidae. Cytogenetic and Genome Research, 142 (3): 197–203.

Loh, Y., Brenner, S.,Venkatesh, B. (2008). Investigation of loss and gain of introns in the compact genomes of pufferfishes (Fugu and Tetraodon). Molecular Biology and Evolution, 25 (3): 526– 35.

Mandrioli, M., Manicardi, G.C (2001). Cytogenetic and molecular analysis of the pufferfish Tetraodon fluviatilis (Osteichthyes). Genetica, 111 (1-3): 433–38.

Mandrioli, M., Cuoghi, B., Marini, M., Manicardi, G.C., et al. (2000). Cytogenetic analysis of the pufferfish Tetraodon nigroviridis (Osteichthyes ). Heredity, 237–42.

Matsuura, K. (2014). Taxonomy and systematics of Tetraodontiform fishes: a Review focusing primarily on progress in the period from 1980 to 2014. Ichthyological Research, 62 (1): 72–113.

Molina, W.F., Alves, D.E.O., Araújo, W.C., Martinez, P.A., et al. (2010). Performance of human immunostimulating agents in the improvement of fish cytogenetic preparations. Genetics and Molecular Research, 9 (3): 1807–14.

Molina, W.F, Freitas, T.O. (2007). Structural and numerical chromosome diversification in marine Perciformes (Priacanthidae and Gerreidae). Cytologia, 71 (3): 237–42.

Molina, W.F., Martinez, P. A, Bertollo, L.A.C., Bidau, C.J. (2014b). Evidence for meiotic drive as an explanation for karyotype changes in fishes. Marine Genomics, 15: 29–34.

Neafsey, D.E., Palumbi, S.R. (2003). Genome size evolution in pufferfish: a comparative analysis of Diodontid and Tetraodontid pufferfish genomes. Genome Research, 13 (5) 821–830.

Nirchio, M., Rossi, A.R., Foresti, F., Oliveira, C. (2014). Chromosome evolution in fishes: a new challenging proposal from Neotropical species. Neotropical Ichthyology 12 (4): 761–70.

Noleto, R.B., Guimarães, F.S.F., Paludo, K.S., Vicari, M.R. et al. (2009). Genome size evaluation in Tetraodontiform fishes from the Neotropical region. Marine Biotechnology,11 (6): 680–85.

Petrov, D.A. (2001). Evolution of genome size: new approaches to an old problem. Trends in Genetics, 17 (1): 23–28.

Sá-Gabriel, L.G., Molina, W.F. (2005). Karyotype diversification in fishes of the Balistidae, Diodontidae and Tetraodontidae (Tetraodontiformes). Caryologia, 58 (3): 229–37

Santini, F., Sorenson, L., Alfaro, M.E. (2013a). A new phylogeny of Tetraodontiform fishes (Tetraodontiformes, Acanthomorpha) based on 22 loci. Molecular Phylogenetics and Evolution,

69 (1): 165–76.

Santini, F., Sorenson, L., Alfaro, M.E. (2013b). A new multi-locus timescale reveals the evolutionary basis of diversity patterns in triggerfishes and filefishes (Balistidae, Monacanthidae; Tetraodontiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, 69 (1): 177–87.

Santini, F., Tyler, J.C. (2003). A phylogeny of the families of fossil and extant Tetraodontiform fishes (Acanthomorpha, Tetraodontiformes), Upper Cretaceous to Recent. Zoological Journal of the Linnean Society, 139 (4): 565–617.

Santini, F., Tyler, J.C. (2004). The importance of even highly incomplete fossil taxa in reconstructing the phylogenetic relationships of the Tetraodontiformes (Acanthomorpha: pisces). Integrative and Comparative Biology, 44 (5): 349–57.

Schweizer, D. (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI.Chromosoma, 58 (4): 307–24.

Sumner, A.T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 75 (1):304–6.

Venkatesh, B., Gilligan, P., Brenner, S. (2000). Fugu: a compact vertebrate reference genome. FEBS Letters, 476 (1-2): 3–7.

Vicari, M.R., Noleto, R.B., Cestari, M.M., Artoni, R.F. (2012). Variable B chromosomes frequencies between males and females of two species of pufferfishes (Tetraodontiformes). Reviews in Fish Biology and Fisheries, 22 (1): 343–49. White, T.J., Bruns, S., Lee, S., Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.

Yamanoue, Y., Miya, M., Matsuura, K., Katoh, M., et al. (2008). A new perspective on phylogeny and evolution of Tetraodontiform fishes (Pisces: Acanthopterygii) based on whole mitochondrial genome sequences: basal ecological diversification? BMC Evolutionary Biology, 8: 212.

Yi, S., Streelman, J.T. (2005). Genome size is negatively correlated with effective population size in ray-finned fish. Trends in Genetics, 21 (12): 643–46.

5. CONCLUSÕES

A ordem Tetraodontiformes tem se destacado por suas particularidades genômicas e citogenéticas, no que diz respeito aos tamanhos genômicos que se apresentam com grandes variações, apesar de ser uma ordem relativamente pequena, em número de espécies. Destacam-se por recorrentes processos de diversificação cariotípica, com a diminuição em seus números diploides e a ocorrência de diversos rearranjos estruturais, que têm influenciado significativamente na evolução do grupo. Nesse sentido, análises citogenéticas têm contribuído grandemente para compreensão dos processos de diversificação e os caminhos evolutivos dentro de Tetraodontiformes. Os dados aqui apresentados permitiram algumas conclusões em relação à carioevolução na ordem:

• A presença de sequências teloméricas internalizadas indica a ocorrências de fusões in tandem, preferencialmente envolvendo cromossomos pequenos, na diversificação cariotípica de C. pullus;

• A redução numérica observada, tanto em Balistidae, como em Monacanthidae, sugere que eventos de fusões in tandem, constituem um dos importantes mecanismos de evolução cariotípica para estes grupos pós-Perciformes;

• O baixo conteúdo de heterocromatina, como observado para os cromossomos de S. testudineus e M. chinensis, sugere que seja reflexo do tamanho do genoma, uma vez que a redução do conteúdo de DNA é um mecanismo peculiar envolvido na evolução do genoma dos Tetraodontiformes;

• Apesar de representarem cariótipos compactos, M. chinensis (Monacanthidae) e S. testudineus (Tetraodontidae) exibem tendências evolutivas próprias, onde a redução numérica dos cromossomos na primeira, possivelmente derivada de eventos de fusões, contrasta com cariótipos largamente formado por elementos bi-braquiais encontrados na segunda.

6. REFERÊNCIAS

Alfaro, M.E., Santini, F., Brock, C.D. (2007). Do reefs drive diversification in marine teleosts? Evidence from the pufferfish and their allies (order Tetraodontiformes). Evolution, 61 (9): 2104–26.

Arai, R. (2011). Fish Karyotypes: a check list. Springer, Tokyo, 347.

Arcila, D.; Pyron, R.A; Tyler, J.C; Ortí, G., Betancur-R, R. (2015). An evaluation of fossil tip-dating versus node-age calibrations in Tetraodontiform fishes (Teleostei: Percomorphaceae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 82: 131–45.

Arratia, H.G; Nelson, J.S; Schultze, H.P; Wilson, M.V.H. (2010). Origin and phylogenetic interrelationships of Teleosts. Origin and phylogenetic interrelationships of Teleosts. Vol. 1.

Artoni, R.F., Castro, J.P., Jacobina, U.P., Lima-Filho, P.A., et al. (2015). Inferring diversity and evolution in fish by means of integrative molecular cytogenetics. The Scientific World Journal, 365787.

Bachmann, K., Cowden, R.R. (1967). Specific DNA amounts and nuclear size in fish hepatocytes and erythrocytes. Transactions of the American Microscopical Society, 86: 463-471.

Brainerd, E., Slutz, S., Hall, E., Phillis, R. (2001). Patterns of genome size evolutioin in tetraodontiform fishes. Evolution, 55 (11): 2363–68.

Brenner, S., Elgar, G., Sandford, R., Macrae, A., Venkatesh, B., Aparicio, S. (1993). Characterization of the pufferfish (Fugu) genome as a compact model vertebrate genome. Nature, 366 (6452): 265–68.

Carpenter, K.E. (2002). The living marine resources of the western central Atlantic. Volume 2: Bony Fishes Part 1 (Acipenseridae to Grammatidae). FAO Species Identification Guide for Fishery Purposes; American Society of Ichthyologists and Herpetologists Special Publication No. 5, 601–1374.

Chen, T.C., Ormond, R.F.G., Mok, H.K. (2001). Feeding and territorial behaviour in juveniles of three co-existing triggerfishes. Journal of Fish Biology, 59 (3): 524–32.

Crnogorac-Jurcevic, T., Brown, J.R., Lehrach, H., Schalkwyk, L.C. (1997). Tetraodon fluviatilis, a new puffer fish model for genome studies. Genomics, 41 (2): 177–84.

Dolezel, J., Bartos, J., Voglmayr, H., Greilhuber, J. (2003). Nuclear DNA content and genome size of trout and human. Cytometry. Part A : The Journal of the International Society for

Analytical Cytology, 51 (2): 127–28.

Eschmeyer, W.N., Fong, J.D. (2016). Catalog of Fishes electronic version, San Francisco: California Academy of Sciences. Disponível em: http://researcharchive.calacademy.org/research/ichthyology/catalog/SpeciesByFamily.as p. Acessado em 20 de Janeiro de 2016.

Figueiredo, J.L.; Menezes, N.A. (2000). Manual de Peixes Marinhos do Sudeste do Brasil. VI. Teleostei São Paulo: Museu de Zoologia, Universidade de São Paulo, 5, , 116p.

Galetti, P.M., Aguilar, C.T., Molina, W.F. (2000). An Overview of Marine Fish Cytogenetics. Hydrobiologia, 420 (1-3): 55–62.

Gold, J.R., Li, Y.C., Shipley, N.S., Powers, P.K. (1990). Improved methods for working with fish chromosomes with a review of metaphase chromosome banding. Journal of Fish Biology, 37: 563–75.

Gregory, T.R. (2016). Animal Genome Size Database. Disponével em http://www.genomesize.com. Acessado em 20 de Fevereiro de 2016.

Hardie, D.C., Hebert, P.D.N (2004). Genome-size evolution in fishes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 61: 1636-1646.

Hardie, D.C., Hebert, P.D.N (2003). The nucleotypic effects of cellular DNA content in cartilaginous and ray-finned fishes. Genome, 46: 683-706.

Hinegardner, R. (1968). Evolution of cellular DNA content in Teleost fishes. The American Naturalist, 102 (928): 517–23.

Hinegardner, R., Rosen, D.E. (1972). Cellular DNA ccntent and the evolution of Teleostean fishes. The American Naturalist, 106 (951): 621–44.

Holcroft, N.I. (2005). A molecular analysis of the interrelationships of Tetraodontiform fishes (Acanthomorpha: Tetraodontiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution 34 (3): 525–44.

Howell, W.M., Black, D.A. (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36 (8): 1014–15.

Igarashi, Y., Hiroyuki, D., Yamanoue, Y., Kinoshita, S., et al. (2013). Molecular phylogenetic relationship of tetraodon pufferfish based on mitochondrial DNA analysis. Fisheries Science, 79 (2): 243–50.

Jaillon, O., Aury, J.M., Brunet, F., Petit, J.L., Stange-Thomann, N., et al. (2004). Genome duplication in the Teleost fish Tetraodon nigroviridis reveals the early vertebrate proto- karyotype. Nature, 431 (7011): 946–57.

Kuiter, R.H., Tonozuka, T., (2001). Pictorial guide to Indonesian reef fishes. Part 3. Jawfishes - Sunfishes, Opistognathidae - Molidae. Zoonetics, Australia. p. 623-893.

Lamatsch, D.K., Steinlein, C., Schmid, M., Schartl, M. (2000). Noninvasive determination of genome size and ploidy level in fishes by flow cytometry: detection of triploid Poecilia formosa. Cytometry, 39: 91-95.

Levan, A., Fredga, K., Sandberg, A. (1964). Nomenclature for centromeric position at chromosomes. Hereditas, 201–20.

Mandrioli, M., Cuoghi, B., Marini, M., Manicardi, G.C., et al. (2000). Cytogenetic analysis of the pufferfish Tetraodon nigroviridis (Osteichthyes ). Heredity, 237–42.

Martinez, P.A., Jacobina, U.P., Molina, W.F (2011). Comparative cytogenetics and heterochromatic patterns in two species of the genus Acanthostracion (Ostraciidae: Tetraodontiformes). Marine Genomics 4 (3).: 215–20.

Mirsky, A.E., Ris, H. (1951). The desoxyribonucleic acid content of animal cells and its evolutionary significance. Journal of General Physiology, 34: 451-462.

Matsuura, K. (2014). Taxonomy and systematics of Tetraodontiform fishes: a Review focusing primarily on progress in the period from 1980 to 2014. Ichthyological Research, 62 (1): 72–113.

May, J.L., Maxwell, J.G.H (1986). Trawl fish from temperate waters of Australia. CSIRO Division of Fisheries Research, Tasmania. 492 p.

McCord, C.L., Westneat, M.W. (2016). Phylogenetic relationships and the evolution of BMP4 in Triggerfishes and Filefishes (Balistoidea). Molecular Phylogenetics and Evolution, 94: 397–409.

Molina, WF F, Martinez, P.A. ,Bertollo, L.A.C., Bidau, C.J.(2014a). Preferential accumulation of sex and Bs chromosomes in biarmed karyotypes by meiotic drive and rates of chromosomal changes in fishes. Anais Da Academia Brasileira de Ciências, 86.

Molina, W.F., Martinez, P. A, Bertollo, L.A.C., Bidau, C.J. (2014b). Evidence for meiotic drive as an explanation for karyotype changes in fishes. Marine Genomics, 15: 29–34.

Neafsey, D.E., Palumbi, S.R. (2003). Genome size evolution in pufferfish: a comparative analysis of Diodontid and Tetraodontid pufferfish genomes. Genome Research, 13 (5): 821–30.

Ojima, Y., Yamamoto, K. (1990). Cellular DNA contents of fishes determined by flow cytometry. La Kromosomo II, 57: 1871-1888.

Nelson, J.S. (2006). Fishes of the world. 4th. John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, New Jersey.

Nirchio, M., Oliveira, C., Ferreira, I.A., Martins, C., et al. (2009). Classical and molecular cytogenetic characterization of Agonostomus monticola, a primitive species of Mugilidae

(Mugiliformes). Genetica, 135 (1): 1–5

Nirchio, M., Oliveira, C. (2007). First description of the karyotype and Ag-NORs localization of Stephanolepis setifer (Bennett, 1831) (Tetraodontiformes : Monacanthidae ) with remarks on sex chromosome differentiation. Boletín del Instituto Oceanográfico de Venezuela, 46 (2): 117–23.

Nirchio, M., Rossi, A.R., Foresti, F., Oliveira, C. (2014). Chromosome evolution in fishes: a new challenging proposal from Neotropical species. Neotropical Ichthyology 12 (4): 761–70.

Noleto, R.B., Guimarães, F.S.F., Paludo, K.S., Vicari, M.R. et al. (2009). Genome size evaluation in Tetraodontiform fishes from the Neotropical region. Marine Biotechnology,11 (6): 680–85.

Noleto, R.B., Vicari, M.R., Cipriano, R.R., Artoni, R.F., et al. (2007). Physical mapping of 5S and 45S rDNA loci in pufferfishes (Tetraodontiformes). Genetica, 130 (2): 133–38.

Petrov, D.A. (2001). Evolution of genome size: new approaches to an old problem. Trends in Genetics, 17 (1): 23–28.

Phillips R., Ráb, P. (2001). Chromosome evolution in the Salmonidae (Pisces): an update. Biological. Reviews, 76: 1–25.

Pinkel, D., Straume, T., Gray, J.W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high- sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 83(9):2934–38.

Pomianowski, K., Jankun, M., Ocalewicz, K. (2012). Detection of interstitial telomeric sequences in the Arctic Charr (Salvelinus alpinus) (Teleostei: Salmonidae). Genome, 55 (1): 26–32.

Sá-Gabriel, L.G., Molina, W.F. (2005). Karyotype diversification in fishes of the Balistidae,Diodontidae and Tetraodontidae (Tetraodontiformes). Caryologia, 58 (3): 229–37.

Santini, F., Harmon, L.J., Carnevale, G., Alfaro, M.E. (2009). Did genome duplication drive the origin of Teleosts? a comparative study of diversification in ray-finned fishes. BMC Evolutionary Biology, 9: 194.

Santini, F., Sorenson, L., Alfaro, M.E. (2013a). A New multi-locus timescale reveals the evolutionary basis of diversity patterns in triggerfishes and filefishes (Balistidae, Monacanthidae; Tetraodontiformes). Molecular Phylogenetics and Evolution, 69 (1).: 165–76.

Santini, F., Sorenson, L., Alfaro, M.E. (2013b). A new phylogeny of Tetraodontiform fishes

(Tetraodontiformes, Acanthomorpha) based on 22 loci. Molecular Phylogenetics and Evolution, 69 (1): 177–87.

Santini, F., Tyler, J.C. (2003). A phylogeny of the families of fossil and extant Tetraodontiform fishes (Acanthomorpha, Tetraodontiformes), upper cretaceous to recent. Zoological Journal of the Linnean Society, 139 (4): 565–617.

Schweizer, D. (1976). Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma, 58 (4): 307–24.

Shen, S.C. (1993). Fishes of Taiwan. Department of Zoology, National Taiwan University, Taipei. 960 p.

Pizon, V., Cuny, G., Bernardi, G. (1984). Nucleotide sequence organization in the very small genome of a tetraodontid fish, Arothron diadematus. European Journal of Biochemistry,140: 25-30.

Sorbini, C., Tyler, J.C. (2004). Review of the fossil file fishes of the family Monacanthidae Tetraodontiformes, Pliocene and Pleistocene of europe, with a new genus, Frigocanthus, and two new species related to the recent. Aluterus Boll. Mus. Civ. Storia Nat. Verona 28, 41–76.

Sumner, A.T. (1972). A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin. Experimental Cell Research, 75 (1): 304–6.

Szpilman (2000). Peixes marinhos do Brasil – Guia prático de identificação. Instituto Ecológico Aqualung, Rio de Janeiro, 288p.

Venkatesh, B., Gilligan, P., Brenner, S. (2000). Fugu: A compact vertebrate reference genome. FEBS Letters, 476 (1-2): 3–7.

Vinogradov, A.E. (1998a). Genome size and GC-percent in vertebrates as determined by flow cytometry: the triangular relationship. Cytometry, 31: 100-109 White, T.J., Bruns, S., Lee, S., Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.

Winterbottom, R. (1974). The familial phylogeny of the Tetraodontiformes (Acanthopterygii: Pisces) as evidenced by their comparative myology. Smithsonian Contributions to Zoology, 155: 1–201.

Yamanoue, Y., Miya, M., Matsuura, K., Katoh, M., et al.. (2008). A new perspective on phylogeny and evolution of Tetraodontiform fishes (Pisces: Acanthopterygii) based on whole mitochondrial genome sequences: basal ecological diversification? BMC Evolutionary Biology, 8: 212.