Dantų Implantų Atramų Paviršių, Paruoštų Atliekant Standartizuotą Poliravimą Ir Naudojant Biokeramines Dangas, Fizikocheminis Ir Biologinis Vertinimas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

Julius Maminskas

DANTŲ IMPLANTŲ ATRAMŲ PAVIRŠIŲ, PARUOŠTŲ ATLIEKANT STANDARTIZUOTĄ POLIRAVIMĄ IR NAUDOJANT BIOKERAMINES DANGAS, FIZIKOCHEMINIS IR BIOLOGINIS VERTINIMAS

Daktaro disertacija Medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija (M 002)

Kaunas, 2020 Disertacija rengta 2015–2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Odontologijos fakulteto Dantų ir žandikaulių ortopedijos klinikoje.

Mokslinis vadovas prof. dr. Gintaras Juodžbalys (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto odontologijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkas prof. dr. Alvydas Gleiznys (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002).

Nariai: prof. dr. Nomeda Basevičienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002); prof. dr. Algimantas Kriščiukaitis (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biofizika – N 011 ir biologija – N 010); doc. dr. Darius Virbukas (Kauno technologijos universitetas, gamtos mokslai, fizika – N 002); prof. dr. Mutlu Özcan (Ciuricho universitetas (Šveicarija), medicinos ir sveikatos mokslai, odontologija – M 002).

Disertacija ginama viešame Odontologijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. rugpjūčio 21 d. 10 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Nau- jausių farmacijos ir sveikatos technologijų centre, 205 auditorijoje. Disertacijos gynimo vietos adresas: Sukilėlių pr. 13, LT-50166 Kaunas, Lietuva. LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

Julius Maminskas

PHYSICOCHEMICAL AND BIOLOGICAL EVALUATION OF DENTAL IMPLANT ABUTMENT SURFACES PREPARED BY STANDARDIZED POLISHING AND USING BIOCERAMIC COATINGS

Doctoral Dissertation Medicine and health sciences, Odontology (M 002)

Kaunas, 2020 The Dissertation has been prepared at the Department of Prosthodontics of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2015–2020.

Scientific Supervisor: Prof. Dr. Gintaras Juodžbalys (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Odontology – M 002).

Dissertation is defended at the Odontology Research Council of the Li- thuanian University of Health Sciences: Chairperson Prof. Dr. Alvydas Gleiznys (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Odontology – M 002).

Members: Prof. Dr. Nomeda Basevičienė (Lithuanian University of Health Scien- ces, Medical and Health Sciences, Odontology – M 002); Prof. Dr. Algimantas Kriščiukaitis (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biophysics – N 011 and Biology – N 010); Assoc. Prof. Dr. Darius Virbukas (Kaunas University of Technology, Natural Sciences, Physics – N 002); Prof. Dr. Mutlu Özcan (University of Zurich, Medical and Health Sciences, Odontology – M 002).

Dissertation will be defended at the open session of the Odontology Research Council on the 21th of August 2020 at 10:00 a.m. in the auditorium No. 205 of the Center for the Lastest Pharmaceutical and Health Technologies of the Lithuanian University of Health Sciences Address: Sukilėlių 13, LT-50166 Kaunas, Lithuania.

TURINYS

PAGRINDINĖS SANTRUMPOS ...... 7 ĮVADAS ...... 8 1. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ...... 11 2. MOKSLINIO DARBO NAUJUMAS IR PRAKTINĖ REIKŠMĖ ...... 12 3. LITERATŪROS APŽVALGA ...... 13 3.1. Protezavimo įtaka implantų ilgaamžiškumui ...... 13 3.2. Periimplantinių minkštųjų audinių sandara ...... 14 3.3. Bakterinė bioplėvelė ...... 18 3.4. Implantų atramoms naudojamos medžiagos ...... 19 3.5. Implantų atramų paviršiai ...... 21 3.6. Biokeramikos odontologijoje ...... 22 3.7. Biokeraminių dangų formavimas, naudojant zolių-gelių metodą ...... 23 3.8. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ...... 26 4. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI...... 28 4.1. Implantų atramoms naudojamų medžiagų paviršiaus poliravimo strategijos sudarymas ir efektyvumo vertinimas ...... 29 4.1.1. Mėginių paruošimas ...... 29 4.1.2. Paviršių poliravimas ...... 30 4.1.3. Paviršiaus morfologijos vertinimas ...... 31 4.1.4. Vandens kontaktinis kampas ir paviršiaus laisvoji energija ...... 31 4.2. Paviršiaus modifikavimo galimybių įvertinimas taikant paviršiaus padengimą zolių-gelių metodu ...... 32 4.2.1. Reagentai paviršiaus padengimui ...... 32 4.2.2. Kalcio hidroksiapatito zolių paruošimas ...... 32 4.2.3. Silicio nitrido dengimas kalcio hidroksiapatito dangomis ...... 32 4.2.4. Dangų indentifikavimas ...... 33 4.2.5. Dangų paviršiaus morfologijos vertinimas ...... 33 4.2.6. Vandens kontaktinis kampas ...... 33 4.3. Medžiagų naujoms biokeraminėms dangoms parinkimas, naujų biokeraminių dangų kūrimas ir pritaikymas titano lydinio paviršiaus padengimui...... 33 4.3.1. Reagentai paviršiaus padengimui ...... 33 4.3.2. Itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato zolių paruošimas ...... 34 4.3.3. Titano lydinio pagrindų dengimas itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato dangomis...... 34 4.3.4. Dangų indentifikavimas ...... 34 4.3.5. Dangų paviršiaus morfologijos vertinimas ...... 35 4.4. Naujai sukurtų dangų biologinių savybių vertinimas ...... 35 4.4.1. Baltymų adsorbcija ...... 35 4.4.2. Ląstelių auginimas ...... 35 4.4.3. Biosuderinamumo vertinimas ...... 36 4.4.4. Ląstelių adhezijos vertinimas imunocitochemijos metodu ...... 36 4.4.5. Bakterijos padermė ir kultūros gavimas ...... 37 4.4.6. Paviršių kolonizavimas P. gingivalis ...... 37 4.4.7. Statistinė analizė ...... 38

5. REZULTATAI ...... 39 5.1. Poliravimo įtaka įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų paviršių savybėms ...... 39 5.1.1. Poliravimo įtaka įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų paviršių šiurkštumui ...... 39 5.1.2. Įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių vandens kontaktinis kampas ir laisvoji energija ...... 41 5.1.3. Fizikocheminių savybių koreliacija ...... 45 5.2. Zolių-gelių metodo pritaikymas ir biokeraminių dangų formavimas ...... 45 5.2.1. Zolių-gelių metodo pritaikymas paviršiaus modifikavimui ...... 45 5.2.2. Kalcio hidroksiapatito dangų paviršiaus morfologijos tyrimai ...... 46 5.2.3. Kalcio hidroksiapatito dangų vandens kontaktinis kampas ...... 47 5.2.4. Biokeraminių itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato dangų formavimas ...... 48 5.2.5. Biokeraminių dangų paviršiaus morfologijos tyrimai ...... 50 5.3. Biokeraminių dangų fizikocheminių savybių vertinimas ...... 51 5.3.1. Biokeraminių dangų ir titano lydinio paviršiaus šiurkštumas ...... 51 5.3.2. Biokeraminių dangų ir poliruoto titano lydinio paviršių vandens kontaktinis kampas ir laisvoji energija ...... 52 5.4. Biokeraminių dangų biologinių savybių vertinimas ...... 54 5.4.1. Baltymų adsorbcija ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių ...... 54 5.4.2. Biokeraminių dangų ir įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių biosuderinamumas ...... 55 5.4.3. Dantenų fibroblastų adheziniai plotai ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių ...... 56 5.4.4. Dantenų fibroblastų fokalinės adhezijos ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių ...... 58 5.4.5. Bakterijų augimas ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių ...... 61 5.4.6. Biologinių ir fizikocheminių paviršių savybių koreliacijos ...... 62 6. REZULTATŲ APTARIMAS ...... 64 6.1. Paviršių fizikocheminių savybių aptarimas ...... 64 6.2. Paviršių biologinių savybių aptarimas...... 68 IŠVADOS ...... 72 MOKSLINĖS IR PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...... 73 SUMMARY...... 74 BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ...... 111 MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS DARBO TEMA ...... 125 CURRICULUM VITAE ...... 170 PADĖKA ...... 174

PAGRINDINĖS SANTRUMPOS

AFM – atominės jėgos mikroskopas (angl. Atomic force microscope) CLSM – konfokalinis lazerinis skenuojantis mikroskopas (angl. Confocal laser scanning microscope) CAM – optinis tensiometras (angl. Contact angle meter) CHAp – kalcio hidroksiapatitas (angl. Calcium hydroxyapatite) DMEM – Dulbeco modifikuota Eagle’o terpė (angl. Dulbecco’s modified Eagle medium) DMSO – dimetilsulfoksidas (angl. Dimethyl sulfoxide); EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis (angl. Ethylenediaminetetraacetic acid) ECM – tarpląstelinis užpildas (angl. Extracellular matrix) FA – fokalinė adhezija (angl. Focal adhesion) FBS – fetalinis veršelio serumas (angl. Fetal bovine serum) HA – hidroksiapatitas (angl. Hydroxyapatite) HGF – žmogaus dantenų fibroblastai (angl. Human gingival fibroblasts) KFV – kolonijas formuojantis vienetas (angl. Colony-forming unit) LS2 – ličio disilikatas (angl. Lithium disilicate) Mfa – bakterinės suspensijos drumstumo vienetai (angl. McFarland unit) PBS – fosfatinis buferinis tirpalas (angl. Phosphate-buffered saline) PEEK – polietereterketonas (angl. Polyether ether ketone) PMMA – polimetilmetakrilatas (angl. Poly[methyl methacrylate]) PVA – polivinilo alkoholis (angl. Polyvinyl alcohol) Sa – paviršiaus šiurkštumo vidurkis (angl. Surface roughness average) RPM – apsisukimų skaičius per minutę (angl. Revolutions per minute) SEM – skenuojantis elektronų mikroskopas (angl. Scanning electron microscope) SFE – paviršiaus laisvoji energija (angl. Surface free energy) SiC – silicio karbidas (angl. Silicon carbide) SN – standartinis nuokrypis (angl. Standard deviation) TEA – trietanolaminas (angl. Triethanolamine) Ti – V klasės titano lydinys (Ti6Al4V) (angl. titanium alloy) TRITC – tetrametilo rodamino izotiocianatas (angl. Tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate) (3)YSZ – itriu stabilizuotas cirkonio oksidas (angl.Yttria stabilized zirconium oxide) XRD – rentgeno spindulių difrakcinė analizė (angl. X-Ray Diffraction) WCA – vandens kontaktinis kampas (angl. Water contact angle)

ĮVADAS

Implantų naudojimas dantų eilių defektų atstatymui, be abejonės, šiuo metu tobuliausias pritaikomas sprendimas, turintis aukštus sėkmės rodiklius. Sėkmingai prigyja 95 proc. dantų implantų [60], tačiau svarbus ne tik implan- to prigijimas, bet ir ilgalaikis funkcionavimas. Pagrindinis sėkmingo funkcio- navimo rodiklis – sveiki ir stabilūs implantą supantys audiniai [145, 162]. Periimplantinis kaulas svarbus kaip atraminis audinys dantų implantui, o implanto ir kaulo santykis lemia sėkmingo kramtymo biomechaniką [34, 181, 221]. Implantą supantys minkštieji audiniai yra svarbūs kaip barjeras, atlie- kantis apsauginę funkciją [187]. Fiziologiškai apie implantą vyksta nuolati- niai kaulo pokyčiai ir po funkcinio apkrovimo galima tikėtis 1,0–1,5 mm kaulo netekimo pirmaisiais metais bei po <0,2 mm kiekvienais kitais metais [45, 179]. Tačiau apnašų kaupimasis ant implantų bei jų protezinių elementų paviršiaus gali pažeisti dantenų barjero vientisumą ir dėl periimplanto audinių uždegimo yra tikimybė prasidėti negrįžtamam patologiniam kaulo tirpimui. Šiuo metu vis daugiau dėmesio skiriama dantų implantų ilgalaikiam funkcionalumui ir periimplantinių ligų prevencijai, o periimplantinių dantenų barjeras – vienas svarbiausių veiksnių [75, 154]. Visų pirma, dantenos prie implanto, kaip ir prie natūralaus danties, formuoja epitelinę jungtį, kuri užtikrina kaulo-implanto jungties hermetiškumą ir mechaniškai apsaugo nuo infekcijos patekimo [212]. Antra, minkštieji audiniai pasižymi gera imunine funkcija ir tokiu būdu biologiškai neleidžia skverbtis patogenams [135, 207]. Taigi dėl barjerinės funkcijos neabejotina sveikų periimplantinių dantenų svarba. Visgi, nepaisant aukštų implantacijos sėkmės rodiklių, atokieji klinikinių tyrimų rezultatai rodo, kad fiziologiškai sėkmingas implanto funkcionavimas lengvai gali virsti patologiniu periimplantinių minkštųjų audinių uždegimu – periimplantiniu mukozitu ar vėlesne jo forma – periimplantitu [157]. Penkių metų laikotarpiu periimplantinis mukozitas pasireiškia apie 39 proc., o periimplantitas 12–22 proc. atvejų [125]. Kaip vienos pagrindinių priežasčių, dėl kurių kyla vėlyvosios dantų implantų komplikacijos, išskiriamos šios: bakte- rinės kilmės veiksniai, bendroji sveikatos būklė (cukrinis diabetas ir bifosfo- natų vartojimas), rūkymas, perkrova ir jatrogeniniai veiksniai [45, 50, 174]. Tačiau be predisponuojančių veiksnių, visgi, pagrindinė priežastis, nulemian- ti periimplantinių audinių pokyčius – bakterinės bioplėvelės formavimasis ant implanto atramos paviršiaus. Dantų implantų sistemos funkciškai turi dvi, savo savybėmis skirtingas, dalis – šakninę ir vainikinę. Šakninė implanto sistemos dalis – tai ta dalis,

kuri tiesiogiai kontaktuoja su kaulu, ir kurios paviršiaus makro- ir mikrodi- zainas svarbus maksimaliam implanto ir kaulo kontaktui, osteoblastų įaugi- mui ir osteointegracijai [34, 181, 221]. Siekiant padidinti paviršiaus plotą, taikomi įvairūs paviršiaus apdirbimo metodai, didinantys paviršiaus šiurkš- tumą ir keičiantys morfologiją, todėl dažniausiai implantų šakninės dalies paviršiai yra smėliuojami, ėsdinami rūgštimis, purškiami plazma ar veikiami lazeriu [4, 47, 170]. Vainikinė implanto sistemos dalis, kuri dažniau vadi- nama implanto atrama, naudojama danties ar dantų protezo fiksavimui ant implanto. Implanto atrama prasideda nuo kaulo ribos, tęsiasi dantenų lygyje ir naudojama implanto protezavimui. Dantenų lygyje ji kontaktuoja su dantenų ląstelėms, apsaugančiomis implanto šakninę dalį nuo mikroorganiz- mų patekimo [220]. Taigi implanto atramos fizikocheminės savybės svarbios užtikrinant dantenų gyvybingumą, proliferaciją ir adheziją [14, 137], atsparu- mą bakterinės bioplėvelės prisitvirtinimui bei augimui [12, 13, 220]. Implantų atramoms gali būti naudojamos tiek skirtingos kilmės medžia- gos, tiek skirtingi paruošimo ir paviršiaus apdirbimo būdai [171]. Ir šakninės implanto dalies, ir vainikinės (atramos) gamybai dažniausiai naudojami titano lydiniai. Kiek dažniau, dėl geresnių mechaninių savybių [89], atramoms naudojamas V klasės Ti6Al4V titano lydinys [189]. Taip pat populiarėja keraminių medžiagų pasirinkimas – dėl estetinių priežasčių [100, 153] ar polimerų – siekiant restauracijų biomimetikos ir amortizacinio efekto [112]. Atramų paviršių apdirbimui dažniausiai naudojamos mechaninio poveikio metodikos frezuojant ar poliruojant, tačiau galimas ir paviršiaus padengimas taikant elektrocheminį, elektroforezinį, tribocheminį, purškimo plazma ir zolių-gelių metodus [73, 86]. Biologiniu požiūriu, implantų protezavimui naudojamų medžiagų pasirinkimas, jų paviršiaus fizikocheminės savybės yra svarbūs periimplantinių minkštųjų audinių sveikatai. Deja, mokslinėse duomenų bazėse nėra aiškių ar vienareikšmiškų, faktais pagrįstų rekomendacijų implantų protezavimui naudojamų medžiagų parinkimui. Linkevičiaus ir kt. pateiktoje sisteminėje apžvalgoje nustatytas cirkonio oksido keramikos pasirinkimo privalumas dėl estetinių priežasčių, tačiau kriterijai, užtikrinantys geresnę periimplantinių minkštųjų audinių sveikatą, neįrodyti [100]. Kita sisteminė apžvalga pateikia išvadas, kad sveikesni periimplantiniai minkštieji audiniai nustatomi prie cirkonio oksido keramikos atramų, nei prie titano lydinio ir įrodo egzistuo- jantį skirtumą tarp implantų protezavimui naudojamų medžiagų pasirinkimo [180]. Tačiau nei viena studija neapibrėžė rekomendacijų fizikocheminėmis atramų paviršių savybėmis. Biologinę svarbą turi tokios fizikocheminės savybės, kaip paviršiaus šiurkštumas, vandens kontaktinis kampas (WCA) ir paviršiaus laisvoji ener-

gija (SFE), kurios gali būti keičiamos pritaikant skirtingas apdirbimo meto- dikas. Tiek frezavimas, tiek poliravimas – labiausiai paplitę ir dažniausiai taikomi restauracinių medžiagų paviršiaus mechaninio apdirbimo būdai, naudojami įvairiose odontologijos srityse. Dėl paprasto pritaikymo, jie dažnai pasirenkami ir implantų atramų apdirbimui. Be abejonės, jų efektyvumas labai priklauso nuo restauracinių medžiagų savybių: fazinės sudėties, krista- liškumo, kristalitų dydžio ir formos, medžiagos kietumo, lydymosi tempera- tūros. Tai reiškia, kad abu šie metodai smarkiai priklauso nuo medžiagų prigimties ir dėl to jų efektyvumas gali būti ribotas. Šiuo metu populiarėja paviršių modifikavimas taikant įvairiausias dangas ir padengimo schemas [73, 86]. Atliekant medžiagų padengimą, be abejo- nės, susiformavusi nauja paviršiaus kompozicija keičia jo fizikochemines savybes. Kita vertus, paviršiaus padengimas izoliuoja substratą, bet nekeičia jo mechaninių savybių, kadangi dangos ir substrato santykis būna itin mažas. Taigi šiais metodais galima keisti paviršiaus savybes, kurios svarbios tiek sąveikai su žmogaus audinių ląstelėmis, tiek su bakterinėmis apnašomis, ir manipuliacijos dantų implantų atramų paviršių savybėmis gali būti perspekty- vus sprendimas, padedantis sumažinti periimplantinių ligų išsivystymo tiki- mybę. Biomedicinoje paviršių padengimo naudojimo tendencijos didėja, nes itin plonos organinės ar neorganinės dangos gali būti pritaikomos audinių inžinerijos tikslais.

1. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas – sukurti naują biokeraminę plono sluoksnio dangą, tinka- mą dantų implantų atramų paviršiaus padengimui, ištirti jos fizikochemines ir biologines savybes in vitro.

Darbo uždaviniai: 1. Įvertinti standartizuotų mechaninio poliravimo protokolų efekty- vumą, poliruojant komerciškai prieinamų implantų atramų medžia- gų paviršius ir nustatant bei palyginant jų fizikochemines savybes po poliravimo. 2. Pritaikyti zolių-gelių metodą biokeraminių dangų sintezei ir lygių paviršių padengimui plono sluoksnio dangomis. 3. Zolių-gelių metodu sintezuoti itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato biokeramines dangas, jomis padengti poliruotą titano lydinio paviršių bei kokybiškai įvertinti dangų formavimąsi, chemi- nę sudėtį, morfologiją. 4. Atlikti gautų naujų medžiagų paviršių fizikocheminių savybių verti- nimą, nustatant paviršiaus šiurkštumą, paviršiaus vandens kontaktinį kampą ir paviršiaus laisvąją energiją. 5. Naudojant standartinę žmogaus dantenų fibroblastų ląstelių kultūrą, in vitro įvertinti poliruoto titano lydinio, padengto itriu, stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato biokeraminėmis dangomis, biosu- derinamumą, baltymų adsorbciją, ląstelių adhezijos plotą ir fokalinę adheziją ant paviršių bei palyginti su įprastai implantų protezavimui naudojamų medžiagų poliruotų paviršių atitinkamomis savybėmis. 6. Naudojant vieno iš pagrindinių periimplantito sukėlėjų Porphyro- monas gingivalis standartinę monokultūrą, įvertinti bakterijų kolonijas formuojančių vienetų susidarymą ant itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato biokeraminėmis dangomis padengto poliruoto titano lydinio paviršiaus in vitro ir palyginti su bakterijų kolo- nijų susidarymu ant įprastai implantų protezavimui naudojamų me- džiagų poliruotų paviršių.

2. MOKSLINIO DARBO NAUJUMAS IR PRAKTINĖ REIKŠMĖ

Šiame moksliniame darbe pasiūlytos naujos implantų atramų paviršių biokeraminės itriu stabilizuoto cirkonio oksido (3YSZ) ir ličio disilikato (LS2) dangos, kurių savybės galėtų pagerinti minkštųjų audinių periimplantinio barjero funkcionalumą. Šio tyrimo metu nustatyta ir patvirtinta, kad įprastai dantų implantų protezavimui naudojamos medžiagos pasižymi itin skirtingomis paviršių fiziko- cheminėmis savybėmis, kurios gali būti keičiamos tiek taikant nuoseklaus mechaninio poliravimo protokolus, tiek pasitelkiant paviršiaus padengimo strategijas. Įrodyta, kad fizikocheminės paviršių savybės lemia ir ląstelių atsaką, ir bakterijų kolonijų formavimąsi. Naudojant zolių-gelių metodiką, buvo naujai sintezuotos ir sėkmingai panaudotos 3YSZ ir LS2 biokeraminės dangos poliruoto titano lydinio pavir- šių padengimui. In vitro eksperimentais dangos identifikuotos pagal cheminę bei fazinę sudėtį ir apibūdintos pagal jų paviršiaus morfologiją. Nustatyta, kad taikant paviršių padengimą biokeraminėmis dangomis, gali būti keičia- mos jų fizikocheminės savybės. Atlikti eksperimentai rodo, kad 3YSZ ir LS2 biokeraminės dangos yra biosuderinamos ir sumažina bakterijų kolonijų formavimąsi. 3YSZ danga didina ląstelių prisitvirtinimo greitį ir efektyvumą. Šio mokslinio darbo in vitro rezultatai rodo sėkmingą zolių-gelių metodo pritaikymą implantų atramų paviršiaus padengimui biokeraminėmis dangomis ir leidžia toliau vystyti šį metodą. Abi pasirinktos dangos turi klinikinio panaudojimo perspektyvą ir toliau gali būti tiriamos in vivo modeliuose bei klinikiniuose eksperimentuose. Sukurtų naujų Ti-3YSZ ir Ti-LS2 paviršių pritaikymas gali būti plačiai tiriamas ir kitose biomedicinos mokslo srityse.

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Protezavimo įtaka implantų ilgaamžiškumui

Dantų eilių defektų protezavimas ant dantų implantų fiksuotomis restauracijomis yra daugeliui klinikinių atvejų sėkmingai pritaikomas sprendimas, kuris vis dažniau pasitelkiamas klinikinėje praktikoje. Vis dėlto, svarbu suprasti, kad šio tipo restauracijos, kaip ir visos kitos restauracinės procedū- ros, yra skirtos ne tik atkurti prarastą dantį, bet ir užtikrinti ilgalaikę aplinki- nių audinių sveikatą bei stabilumą [60, 111, 181]. Protezavimas turi reikšmin- gą įtaką implanto ilgaamžiškumo prognozei, o protezinės konstrukcijos nulemia tiek krūvio perdavimą implantui [114], tiek periimplantinių audinių būklę, tiek apnašų susidarymo ir išsivalymo galimybes [43, 58]. Okliuzinė perkrova įvardijama kaip priežastis, lemianti biomechanines dantų implantų komplikacijas [55]. Mokslinėje literatūroje aprašytas dantų implantų netekimas dėl tiesioginės jų perkrovos in vivo tyrime naudojant žiurkes [132], taip pat perkrovos įtaka įvardinta ir retrospektyvinėje studijoje [71]. Kitoje in vivo studijoje nustatyta, jog periimplantitas sukeliamas dėl bakterijų bioplėvelės susidarymo, tačiau perkrova, kaip predisponuojantis veiksnys, gali reikšmingai pagreitinti periimplantinio kaulo tirpimą [82, 149]. Kita vertus, krūvio perdavimą implantui ir jį supančiam periimplantiniam kaului lemia protezo dizainas, nuo kurio gali priklausyti įtampų susidarymas tiek proteziniuose elementuose, tiek implante ar periimplantiniame kaule [129]. Protezų dizainas taip pat turi didelę biologinę reikšmę dėl poveikio minkštiesiems periimplantiniams audiniams. Neteisingai parinkta protezo forma, dantų išdėstymas, santykis su antagonistais gali lemti minkštųjų periimplantinių audinių mechaninį traumavimą ir pažeidimą dėl stringančio maisto, jo likučių [43]. Be abejo, maisto likučiai po proteziniais elementais gali sukelti ir biologinį uždegiminį atsaką. Taigi dar viena svarbi sąlyga dantų protezams ant implantų – protezo konstrukcija, apsauganti nuo maisto stri- gimo ir tiesioginio periimplantinių audinių traumavimo. Biologiniu požiūriu taip pat svarbus ir protezavimui naudojamų medžia- gų pasirinkimas. Implantų protezavimui naudojamoms medžiagoms taikomi tokie patys kriterijai, kaip ir kitoms medicinoje pasitelkiamoms biomedžia- goms [159, 200, 218]. Jos turi būti biosuderinamos, nesukeliančios imuninių reakcijų, nedarančios mutageninio poveikio. Implanto atramoms naudojamų medžiagų paviršiai yra betarpiškame kontakte su minkštaisiais audiniais, todėl, dėl tiesioginio kontakto, gali sąlygoti ląstelių elgseną. Kita vertus, jie

yra skalaujami burnos skysčių, taigi svarbus ir netiesioginis sisteminis poveikis organizmui. Vienas svarbiausių reikalavimų, sąlygojančių implantų protezavimui naudojamų medžiagų parinkimą – jų biosuderinamumas, kadangi implantų atramų paviršius gali būti palanki terpė dantenų ląstelėms [30, 31, 121, 220]. Taip pat svarbi dantenų ląstelių adhezija ir proliferacija ant pavir- šiaus, nes tai nulemia dantenų barjerinę funkciją [18]. Po implantacijos gyjant žaizdoms, periimplantiniai minkštieji audiniai formuojasi ir tvirtinasi prie atramos paviršiaus. Gijimo procesas užtrunka 6–8 savaites [178]. Jam reikš- mingą įtaką turi paviršiaus fizikocheminės savybės: paviršiaus cheminė sudė- tis ir stabilumas [59, 137], paviršiaus hidrofiliškumas (apibūdinamas pavir- šiaus vandens kontaktiniu kampu) [62, 185, 186], paviršiaus laisvoji energija [92] ir paviršiaus morfologija [80]. Paviršiaus fizikocheminės savybės tiesiogiai koreliuoja su bakterijų adhezija [49] ir svarbu suprasti, kad implantų protezavimui naudojamų medžia- gų paviršius turėtų būti nepalankus apnašų kaupimuisi ir bakterinės bioplė- velės formavimuisi, nes būtent bakterijos gali sukelti periimplantinių audinių uždegimą [75, 97]. Nepaisant minkštųjų audinių barjero sandarumo, bakterijos, išskirdamos virulentiškumo faktorius, sugeba jį pažeisti ir skverbtis gilyn link šiurkštesnės implanto šakninės dalies [46,190]. Dėl šios priežasties, dirbtinių medžiagų paviršius dantenų lygyje turėtų būti nepalankus bakterijų prisivirtinimui ir bioinertiškas bei tinkamas minkštųjų audinių adhezijai ir gyvybingumui užtikrinti [53, 54]. Bakterijos ir ląstelės skirias ne tik savo dydžiu ir morfologija, bet ir adheziniais mechanizmais, todėl svarbu suprasti, kokios paviršiaus savybės turėtų būti siekiamybė [8]. Taigi planuojant dantų eilių defektų protezavimą ant implantų fiksuotomis restauracijomis reikia ypatingą dėmesį skirti tiek parenkant tinkamą konstrukcijos dizainą, tiek medžiagas, kad proteziniai sprendimai užtikrintų maksimalią periimplantinių audinių sveikatą ir stabilumą.

3.2. Periimplantinių minkštųjų audinių sandara

Periimplantiniai minkštieji audiniai – tai dantenos, kontaktuojančios su dantų implanto sistemos vainikine dalimi – atrama. Histologiškai, dantenos prie implanto savo sandara turi panašumų į audinius prie natūralių dantų. Dantenos aplink danties implantą, kaip ir aplink natūralų dantį, formuoja bio- loginį plotį ir implantą apsaugo žemiau susiformavusi epitelinė jungtis bei jungiamojo audinio barjeras [203]. Blanco ir kt. (2016) pateiktame 3.2.1 paveiksle matomas histologinis periimplantinių audinių pjūvis [25]. Išorinis periimplantinių dantenų sluoksnis apsaugotas gerai keratinizuotu daugia-

sluoksniu burnos epiteliu, kuris vagelėje keičiasi į nekeratinizuotą viena- sluoksnį vagelės epitelį ir tęsiasi formuodamas epitelinę jungtį su implanto atramos paviršiumi [19]. Epitelinė jungtis prie implanto atramos panaši į prie natūralaus danties paviršiaus dantenų formuojamą epitelinę jungtį, kurią su- kuria pamatinė membrana ir hemidesmosomos [99]. Žemiau epitelinės jungties tęsiasi prie paviršiaus prisitvirtinęs jungiamasis audinys, kuris palaiko audinių homeostazę ir užtikrina apsauginę funkciją.

3.2.1 pav. Periimplantiniai audiniai. Blanco ir kt. (2016) tyrime pateikta histologinė mikrografija ir histomorfometriniais matavimais paremtas struktūrų nustatymas [25].

Gyjant minkštiesiems audiniams ir reorganizuojantis laikiną barjerą užti- krinančiam kraujo krešuliui, 1–2-ą savaitę prasideda periimplantinės dantenų vagelės epitelio formavimasis, kuris baigiasi 6–8-ą savaitę [18]. Vykstant fibroblastų migracijai, formuojasi jungiamasis audinys, o epitelio migracija baigiasi tada, kai jis pasiekia žemiau prisitvirtinusį jungiamąjį audinį [169]. Tik susiformavus periimplantinių dantenų vagelės epiteliui užtikrinamas maksi- malus periimplantinių dantenų barjero sandarumas [83]. Pilnai dantenos prie implanto atramos susiformuoja ir prisitvirtina 6–8-ą savaitę [178, 187].

Vidiniuose dantenų sluoksniuose vyraujančiame jungiamajame audinyje gausu dantenų fibroblastų (HGF) ir tarpląstelinio užpildo (ECM) [127]. Bio- logiškai HGF svarbūs dėl imuninio atsako išskiriant citokinus bei kitas biologiškai aktyvias medžiagas ir dėl ECM baltymų išskyrimo, kurie būtini audinio struktūrai ir homeostazei [165]. Taip pat jungiamajame audinyje randama tiesiogiai už imuninį atsaką atsakingų ląstelių: makrofagų, leukocitų, limfocitų [191]. Tačiau, lyginant su dantimi, jungiamasis audinys prie implanto labiau panašus į randinį jungiamąjį audinį tiek ląstelių tankiu, tiek retesne vaskuliarizacija, tiek neorientuotu skaidulų išsidėstymu [187]. Jame mažesnė ląstelių ir didesnė ECM koncentracija, periimplantiniai minkštieji audiniai turi retesnį kraujagyslių ir skaidulų tinklą. Dantenos prie natūralaus danties turi intensyvesnę kraujotaką. Jos arteri- niu krauju yra aprūpinamos per antkaulio kraujagyslių pluoštą ir kraujagyslių pluoštą, esantį periodonte [19, 61, 197]. Dėl gero kraujotakos intensyvumo, dantenos puikiai aprūpinamos pirminėmis ląstelėmis, atsakingomis už audi- nių regeneraciją, imuninėmis ląstelėmis, apsaugančiomis nuo infekcijos, ir maisto medžiagomis. Deja, dantenoms prie implanto kraujas yra tiekiamas tik vienu keliu – per antkaulio kraujagyslių pluoštą, todėl periimplantinių dante- nų tiek regeneracinis, tiek imuninis potencialas yra silpnesnis [197]. Jungiamajame audinyje gausu skaidulų. Jas formuoja vienas iš ECM baltymų – kolagenas, kurį taip pat išskiria dantenų fibroblastai [21, 103]. Tai vienas iš svarbiausių struktūrinių dantenų komponentų, užtikrinantis audinių tvirtumą. Dar daugiau, kolageno skaidulų išsidėstymas lemia minkštųjų audi- nių barjero stabilumą ir hermetiškumą. Prie natūralaus danties kolageno skaidulos išsidėsto statmenai danties šaknies paviršiui [19, 197]. Dalis jų jungiasi su danties šaknies cementu, suteikdamos tvirtumo epiteliniam dantenų vage- lės barjerui. Dantenų fibroblastų sintetinamas kolagenas [21] sudaro jungtis su labiau mineralizuotomis, šaknies cementoblastų sintetinamomis Šarpėjaus skaidulomis [40, 183]. Prie danties implanto atramos kolageno skaidulų tink- las išsidėsto lygiagrečiai jos paviršiui ir su juo jungčių neformuoja, todėl ši konfigūracija lemia blogesnį epitelinės jungties mechaninį tvirtumą bei san- darumą [19, 88, 127, 197]. Epitelinės jungties sandarumą prie implantų atra- mų formuoja tik hemidesmosomos, todėl ji yra silpnesnė [99]. Tačiau esama studijų, įrodančių, kad ir prie implantų atramų paviršiaus formuojasi paviršiui statmenos kolageno skaidulos, kurių išsidėstymą gali nulemti atramos paviršiaus savybės [185]. Taip pat įrodyta, kad būtent atramos paviršiaus glotnumas veikia kolageno skaidulų pluošto organizaciją ir paviršiaus savy- bės – veiksnys, tiesiogiai lemiantis ECM genų išskyrimą ir biocheminę ko- munikaciją [216].

Vis dėlto, pilnai sugiję ir susiformavę minkštieji audiniai prie implantų struktūriškai skiriasi nuo audinių prie natūralių dantų. Parpaiola ir kt. (2015) savo studijoje nurodo, kad keratinizuotos dantenos prie implantų yra statistiš- kai reikšmingai plonesnės nei prie dantų [148]. Įdomu tai, kad visgi fiziolo- giškai sveika dantenų vagelė prie implantų gilesnė (3,4±0,8 mm) nei prie dantų (2,2±0,4 mm). Taip pat prie implantų nustatomas ir didesnis gylis nuo dantenų krašto iki kaulo (4,4±0,8 mm), lyginant su dantimis (3,2±0,5 mm). Manoma, kad prie implantų didesnį atstumą nuo dantenų krašto iki kaulo ribos lemia mažesnė hemidesmosomų koncentracija nei prie danties pavir- šiaus [80, 148, 187]. Tačiau matematinis gylių skirtumas, tiriant dantenų va- gelę ir kaulo ribą, rodo, kad prie paviršiaus prisitvirtinusio ir barjerą formuo- jančio jungiamojo audinio storis, tiek prie danties, tiek prie implanto yra pa- našus ir siekia ~1 mm. Visgi, funkciškai nurodomas prastesnis jungties epitelio mechaninis atsparumas prie implanto, nei prie danties [224]. Nustatyta, kad periimplantinis uždegimas imunologiniu požiūriu greitesnis, agresyves- nis ir ryškesnis, o jo regeneracija – lėtesnė [215]. Uždegimas prie periimplan- tinių audinių progresuoja lengviau, negu periodonte [20] galimai dėl prastes- nės audinių barjerinės funkcijos [81, 197]. Pagrindinis skirtumas lyginant dantį ir implantą išlieka su dantena kon- taktuojančios medžiagos paviršius, kuris lemia periimplantinių audinių ląste- lių elgseną [137]. Manoma, kad minkštųjų audinių architektūrą formuoja būtent kontaktuojančios medžiagos paviršiaus fizikocheminės savybės [185, 186]. Medžiagos cheminė sudėtis, paviršiaus hidrofiliškumas, laisvoji energija, šiurkštumas – tai veiksniai, galintys nulemti ląstelių gyvybingumą, adhe- ziją, ląstelių tipą ir morfologiją, kolageno koncentraciją bei išsidėstymą [52]. Taip pat, dėl grįžtamojo ryšio, aplinkinės ląstelės sąveikauja su ECM, kurį formuoja baltymai, dengiantys implanto paviršių [201]. Sąveika vyksta dėka transmembraninių ląstelinių baltymų, turinčių receptorinę funkciją – integri- nų. Ekstraląsteliniams integrinams komunikuojant su ECM, intraląsteliniai baltymai (vinkulinas, paksilinas, talinas ir kt.) formuoja makromolekulines struktūras – fokalines adhezijas (FA). FA lemia ląstelės prisitvirtinimo stabi- lumą, mechaninį ir cheminį signalizavimą, jėgos sukūrimą ir mechanojautru- mą [164]. Fokalinių adhezijų skaičius parodo ląstelės prisitvirtinimo prie paviršiaus stiprumą, o ląstelės užimamas plotas – FA kontakto dydį. Be to, FA kiekis priklauso nuo substrato paviršiaus, kadangi jis gali veikti ląstelių traukos jėgas, sukeldamas ląstelės citoskeleto persitvarkymą [15, 223]. Pa- vyzdžiui, manoma, kad paviršiaus nano topografija gali tiek nulemti ankstyvą dantenų fibroblastų prisitvirtinimą ir proliferaciją, tiek paskatinti kolageno skaidulas formuotis statmenai atramos paviršiui [54, 79, 88, 98, 103]. Taigi

implantų atramų paviršiai turėtų būti ne tik biologiškai suderinami, bet ir skatinti ląstelių prisitvirtinimą [134].

3.3. Bakterinė bioplėvelė

Pagal žmogaus mikrobiomų duomenų bazę (HOMD) (http://www.homd. org/) [42], burnos ertmėje randama daugiau kaip 700 skirtingų bakterijų rūšių ir dalis jų – patogeninės. Bakterijų prisitvirtinimui ir bioplėvelės formavimuisi reikalingas baltyminis pagrindas – pelikulė [28]. Seilėse ir dantenų vagelėje cirkuliuojantys baltymai yra adsorbuojami natūralios kilmės ir dirb- tinių burnos ertmės paviršių, suformuodami pelikulę. Prie jos savo adhezinais pradeda tvirtintis burnos ertmės seilėse esančios planktoninės bakterijos [94]. Pirmiausia tvirtinasi pradinių kolonizuotojų bakterijų rūšys, po to – anksty- vųjų ir pagaliau vėlyvųjų kolonizuotojų bakterijų rūšys, formuodamos ryšius mikroorganizmų polimikrobinėje bendruomenėje (3.3.1 lentelė). Dantenų vagelėje prie danties yra palankios anaerobinės sąlygos. Prie implanto, dėl didesnio dantenų vagelės gylio, jos dar palankesnės, todėl su periimplantinių ligų išsivystymu siejami mikroorganizmai – aneorobinio pobūdžio vėlyvieji kolonizuotojai. Būtent šios patogeninės bakterijos gali sukelti fibroblastų uždegiminio pobūdžio atsaką, kuris pasireiškia periimplantinių minkštųjų audinių uždegimu – periimplantiniu mukozitu [163, 182]. Dėl uždegimo taip pat yra pažeidžiamas epitelinis barjeras, todėl negydomas periimplantinis mukozitas gali nesunkiai pasiekti periimplantinį kaulą ir tapti periimplantitu [85, 157]. Formuojantis ir gilėjant dantenų kišenei, tampa sudėtingesnis mechaninis ir/ar cheminis apnašų pašalinimas bei gerėja anaerobinės sąlygos ir polibakterinėje bioplėvelėje didėja anaerobinių patogenų kiekis. Studijų duomenys rodo, kad periimplantito sukėlėjo rūšys yra tos pačios, kaip ir patogenų, sukeliančių periodontitą [74, 120]. Bioplėvelėje vyrauja anaerobi- nės rūšys: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Prevotella intermedia/nigrescens, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus [95, 124, 142, 152]. Dažniausiai nustatomas ir specifiškai periimplantito atvejais randamas pato- genas – P. gingivalis kultūra, kurios koncentracija lemia išskiriamų virulen- tiškumo faktorių gausą, o nuo to priklauso ligos progresavimas [78, 190, 194]. Taip pat ši bakterijų rūšis dažniausiai randama bioplėvelės išoriniame sluoksnyje. Todėl, klinikiniu požiūriu, svarbu sumažinti apnašų formavimosi ir kaupimosi galimybes ant dantų implantų atramų paviršiaus, užtikrinant periimplantinių audinių homeostazę. Tai galima padaryti keičiant atramų paviršiaus fizikochemines savybes [44, 53, 54].

3.3.1 lentelė. Periimplantinių audinių uždegimą sukeliantys mikroorganizmai Pradiniai Ankstyvieji Vėlyvieji kolonizuotojai kolonizuotojai kolonizuotojai Streptococcus oralis Eikenella corrodens *Aggregatibacter actinomycetemcomitans Streptococcus Veillonella atypica *Prevotella intermedia/nigrescens sanguinis Prevotella loescheii *Treponema denticola Streptococcus mitis *Fusobacterium *Porphyromonas gingivalis nucleatum Kolenbrander ir kt. (2006) (2010) pateiktos pagrindinės bakterijų rūšys, formuojančios poli- mikrobines bakterijų bioplėveles, galinčias sukelti periimplantinių audinių mukozitą arba periimplantitą [93, 94]. Specifiniai anaerobai, išskiriantys su periimplantitu siejamus viru- lentiškumo faktorius, pažymėti „*“.

3.4. Implantų atramoms naudojamos medžiagos

Pirmieji dantų implantai buvo vienatūriai (vientisi) ir protezavimui naudojama atrama nuo šakninės dalies nebuvo atskirta. Toks vientiso implanto dizainas lemdavo ir atramų medžiagos pasirinkimą – vainikinė dalis dantenų lygyje, kaip ir šakninė dalis, būdavo gaminama iš titano lydinių. Didelio grynumo >98,90 proc. I–IV klasės [109] titano lydiniai pasižymi itin geru biosuderinamumu ir osteoindukcinėmis savybėmis, kurios itin svarbios implanto osteointegracijai [91, 139]. Keičiantis ir tobulėjant implantų dizainui, buvo pradėtos naudoti dviejų komponentų (šakninė dalis – implantas, vainikinė dalis – atrama) dantų implanto sistemos. Mažesnio grynumo (90 proc.) V kla- sės titano lydinys Ti6Al4V dažniausiai taip pat turi itin aukštą biosuderinamumo laipsnį ir, nors prasčiau osteointegruojasi, dėl geresnių jo mechaninių savybių yra tinkamesnis implantų atramų ir kitų protezinių elementų gamybai [189]. Dar vienas populiarus ir mechaniškai tvirtas lydinys, naudojamas implantų atramų gamybai – chromo-kobalto. Jis pasižymi dideliu tvirtumu, geru biosuderinamumu, nesudėtingu apdirbimu ir lengva detalių gamyba, tačiau fibroblastų gyvybingumas ir adhezija ant jo prastesnė nei ant titano lydinių [171] – tai lemia cheminė sudėtis ir didesnis šio lydinio elektrinis aktyvumas [76]. Vengiant metalinių komponentų elektrinio aktyvumo, implantų atramų gamybai dažnai pasirenkamos keraminės medžiagos. Dantų ir implantų protezavimui naudojamos keramikos pasižymi aukštu biosuderinamumu, kuris užtikrina geresnę medžiagos biointegraciją ir ilgalaikį stabilumą, kontaktuo- jant su gyvaisiais audiniais [144, 180]. Reikia pabrėžti, kad keraminės me- džiagos turi pranašumą prieš metalinius komponentus ir dėl savo estetinių savybių [153]. Jų spalva artima natūralių danties audinių spalvai ir tai lemia geresnę implantų protezavimo estetinę sėkmę. Dažniausiai implantų atramų

gamybai naudojama keramika – itriu stabilizuotas cirkonio oksidas (tetrago- nalinė forma) 3Y-TZP (3.4.1 lentelė). Tai amorfinio komponento (stiklo) neturinti polikristalinė keramika, kurioje visi atomai susijungę taisyklingo tetragono kristalinėmis gardelėmis [172]. Taip pat vis dažniau pasirenkama ličio disilikato (LS2) stiklo keramika, kuri pasižymi geresniu elastingumu, nei 3Y-TZP [17].

3.4.1 lentelė. Cirkonio oksido keramikos fazės ir jų formavimosi tempera- tūros Fazė Temperatūra Monoklininė 400–1100 °C Tetragonalinė 1100–2370 °C Kubinė 2370–2600 °C Davar ir kt. (2013) [48].

Visos keramikos yra gana jautrios mechaniniam tempimui ar lenkimui ir šios savybės yra kritinis veiksnys implantų protezavime [156]. Natūralaus danties šaknis yra apsupta periodonto raiščių, kurie lemia mikro paslankumą ir danties judesiai ašine kryptimi gali siekti 25–100 μm. Osteointegruotas dantų implantas gali judėti tik 3–5 μm ir mikro paslankumas atsiranda tik dėl kaulo deformacijos krūvio metu [184, 188]. Be to, dėl periodonte esančių propriorecepcinių skaidulų, kramtant natūraliu dantimi stebima geresnė kramtymo proprioreceptorika ir jos nulemtas kramtymo jėgos valdymas [65]. Taigi restauracijose ant dantų implantų didesni įtempiai formuojasi tiek dėl mažo amortizacinio potencialo, tiek dėl mažesnio krūvio valdymo jautrumo. Dėl mechaninių savybių, keramikų deformatyvumas yra ribotas ir perkovos gali lemti mechanines komplikacijas [189]. Ribotas keramikų deformatyvumas taip pat kelia didesnes rizikas gami- nant grupę implantų sujungiančias restauracijas [156]. Įtempiai implantų proteziniuose komponentuose gali formuotis ne tik dėl funkcinio apkrovimo, bet ir dėl nepasiekto pasyvaus protezo atitikimo [1], kurio, skirtingai nei ant dan- tų, negali kompensuoti periodonto raištis. Taigi metalų lydiniai, dėl didesnio atsparumo lenkimui ar tempimui ir didesnio plastiškumo, turi didesnį prana- šumą nei vientisos keramikinės implantus jungiančios konstrukcijos. Amortizacijos nebuvimas yra svarbus veiksnys ne tik dėl dantų protezų ant implantų mechaninių komplikacijų rizikos, bet ir periimplantinio kaulo perkrovos [55]. Nors periimplantinio kaulo netekimas dažniausiai siejamas su bakterinės bioplėvelės sukeltu periimplantitu, tačiau įtempių koncentracijos periimplantiniame kaule įvardijamos kaip predisponuojantis veiksnys, pagreitinantis kaulo tirpimą [82, 132]. Implantų protezavimui naudojamos

polimerinės kilmės medžiagos: polimetilmetakrilatas (PMMA), polietereterketonas (PEEK), polieterketonketonas (PEKK) ar kompozitinės medžia- gos pasižymi elastinėmis savybėmis, todėl būtent jos gali būti pasirenkamos implantų atramų gamybai, siekiant sumažinti perkrovas ir sukurti amorti- zacinį efektą [112]. Deja, šių medžiagų naudojimą riboja prastesnis ląstelinis atsakas [69].

3.5. Implantų atramų paviršiai

Dantų implantų atramų paviršiai kliniškai svarbūs dviem aspektais: dėl minkštųjų periimplantinių audinių sveikatos ir dėl atsparumo bakterinių apnašų susidarymui. Vienas paprasčiausių ir universaliausių implantų atramų paviršių paruo- šimo būdų – mechaninis apdirbimas. Jis gali būti skirstomas į frezavimą ir poliravimą. Frezavimas – tai paviršiaus apdirbimas jį tekinant ar pjaunant. Šis būdas dažnai yra taikomas pramoninėje implantų sistemų gamyboje. Palygi- nus su smėliuotu paviršiumi, frezuotiems titano lydiniams būdingas mažesnis šiurkštumas ir geresnis fibroblastų prisitvirtinimas [92]. Poliravimas – papildomas etapas, skirtas sumažinti dantų implantų atramų paviršiaus šiurkštumą [70]. Literatūroje nurodoma, kad frezuoto titano lydinių paviršių papildomas poliravimas leidžia sumažinti jo šiurkštumą, padidinti hidrofiliškumą ir ląstelių adheziją [137], sumažinti bakterinės bioplėvelės formavimąsi [51, 115]. Visgi, abu šie metodai yra riboti keičiant paviršiaus fizikochemines savybes, todėl vis dažniau naudojamas atramų paviršiaus modifikavimas taikant padengimą [102]. Implantų atramų dangos gali būti aktyvios ir pasyvios [64, 222]. Akty- vios dangos – tai tokios dangos, kurios, reaguodamos su periimplantiniais minkštaisiais audiniais, atpalaiduoja biologiškai aktyvias medžiagas [16]. Paprastai jos naudojamos dėl dviejų priežasčių: minkštųjų audinių biostimu- liacijai ir antimikrobiniais tikslais. Pasyvios atramų dangos nieko neišskiria ir nekeičia savo savybių funkcijos metu, tačiau jų naudojimas leidžia keisti paviršiaus fizikochemines savybes bei moduliuoti ląstelinį ir bakterinį atsaką. Taip pat galimas paviršiaus mikroarchitektūros modifikavimas taikant biopolimerines dangas, tokias, kaip keratino nano skaidulos, kurios galėtų būti naudojamos Šarpėjaus skaidulų biomimetikai [44, 53]. Taigi implantų atramų paviršių padengimas – nauja kryptis, leidžianti keisti paviršių fizikochemines ir biologines savybes.

3.6. Biokeramikos odontologijoje

Biokeramikos – tai keraminės medžiagos, priklausančios biomedžiagų grupei [23, 117]. Jos pasižymi aukštu biosuderinamumu ir yra plačiai naudojamos įvairiose medicinos srityse. Ortopedijoje, plastinėje ir rekonstrukcinėje chirurgijoje biokeramikos pritaikomos kelių, klubų, raiščių, sausgyslių protezavimui [33], kaulinių defektų rekonstrukcijoms [108]. Odontologijoje daž- niausiai naudojamos dantų protezų, implantų ir jų atramų gamybai, taip pat pasitelkiamos kaulinių defektų augmentacijai, pulpos audinių regeneracijai, karieso prevencijai ir gydymui, ortodontinių prietaisų gamybai. Biokerami- kos gali būti klasifikuojamos pagal įvairias klasifikacijas, bet biomedicinoje jas racionaliausia skirstyti į dvi grupes: bioaktyvios ir bioinertiškos [68]. Bioaktyvios keramikos – tai tokios keramikos, kurios, sąlytyje su gyvaisiais audiniais, reaguoja, disocijuoja, išskirdamos biologiškai aktyvius jonus ar jų grupes [155]. Tokių keramikų aktyvumas gali skatinti audinių mineralizaciją, veikti antimikrobiškai. Regeneracinėje ir rekonstrukcinėje odontologijoje tai labai svarbios savybės, todėl biologiškai aktyvios keramikos naudojamos kaip dirbtiniai kaulo pakaitalai, kaip užpildas dantų šaknų kanalų gydymui, taip pat taikomos kaip remineralizuojančios priemonės kariesologijoje ir odontologinių ligų prevencijoje. Keisdamos savo fazę, šio tipo keramikos turi skirtingą biodegradavimo laipsnį, kuris svarbus priklausomai nuo naudojimo tikslo. Tačiau, kalbant apie bioaktyvumą, svarbu suprasti, kad neišvengiamas ir keramikų tirpumas. Tai reiškia, kad bioaktyvios keramikos neturi nei fazinio, nei cheminio stabilumo, todėl ir jų struktūros stabilumas yra ribotas. Bioinertiškos keramikos – tai tokios keramikos, kurios, kontaktuodamos su biologiniais audiniais ir jų skysčiais, išlaiko cheminį ir fazinį stabilumą [161, 173]. Šios savybės yra svarbios dantų protezų gamybai, kadangi nuo jų tiesiogiai priklauso ir protezo mechaninis stabilumas bei ilgaamžiškumas. Kalcio hidroksiapatitas (CHAp) – natūralios kilmės biokeramika, randama žmogaus kauluose ir dantų struktūrose. Biomedicininiais tikslais dažnai naudojama sintetinė jo forma, kuri yra mažiau tirpi. Ši biokeramika, priklausomai nuo kristalinės formos (fazinės sudėties), kalcio ir fosforo santykio, pasižymi skirtingu bioaktyvumo-bioinertiškumo laipsniu. Tačiau, pritaikant įvairius CHAp laboratorinius sintezės mechanizmus, galima keisti šios biokeramikos savybes. Taigi CHAp gali būti naudojama biomedicinoje kaip įvairiapusiška ir biomimetiška medžiaga. Itriu stabilizuotas cirkonio oksidas odontologijoje dažniausiai naudojamas tetragonalinės T-YZP formos. Tai bioinertiška biokeramika, nepasižy- minti tirpumu ar disociacija. Nustatyta, kad ši medžiaga turi geresnį bioiner- tiškumą nei titano lydiniai [72]. Dėl savo gerų biologinių savybių naudojama dantų ir dantų implantų protezavimui, taip pat populiarėja jos pasitelkimas

implantų [72] ir biokeraminių šaknų kanalų užpildų gamybai [3]. Tačiau šios keramikos naudojimą dažniausiai riboja sudėtinga sintezė ir tam reikalingos aukštos lydymosi temperatūros (3.4.1 lentelė). Ličio disilikato (LS2) biokeramika– viena populiariausių keramikų, pasirenkama dantų protezų gamybai dėl emalio biomimetikos [225]. Ji savo mechaninėmis ir optinėmis savybėmis panašiausia į emalį, pasižymi bioiner- tiškumu. Įprastai odontologijoje naudojamą LS2 biokeramiką sudaro krista- linė ir stiklo fazės [77]. Deja, jos įtaka minkštiesiems burnos ertmės audiniams nėra plačiai ištyrinėta. Taigi, biokeraminės medžiagos plačiai naudojamos odontologijoje ir turi daug biologinių privalumų, lyginant jas su kitomis biomedžiagomis. Nors „auksiniu standartu“ implantų atramų gamybai yra laikomas titano lydinys, vis dažniau tam sėkmingai pasitelkiamos įvairios biokeramikos.

3.7. Biokeraminių dangų formavimas, naudojant zolių-gelių metodą

Zolių-gelių metodas paviršių padengimui nėra naujas. Pagal paiešką PubMed duomenų bazėje, naudojant raktinius žodžius sol-gel AND coatings AND titanium, 2015–2020 metais buvo rastos 140 publikacijų. Dvidešimt trys iš jų aprašė titano lydinių paviršių padengimus, naudojant zolių-gelių metodą biomedicininiais tikslais (3.7.1 lentelė). Pastaraisiais metais ši metodika yra vis dažniau taikoma ir leidžia sėkmingai paviršius padengti tiek biokerami- nėmis, tiek organinėmis, tiek kompozitinėmis dangomis. Dažniausiai buvo naudojami skirtingi sintezės mechanizmai stiklinių silicio oksido (SiO2) junginių ar stiklo keramikų ant titano lydinio formavimui, tačiau buvo sintezuotos ir sudėtingesnės biokeraminės struktūros. Paviršiai taip pat buvo padengiami audinių inžinerijoje naudojamais biopolimerais arba derinant juos su biokeramikomis, kuriant kompozitines dangas. Dangų struktūroms sukurti buvo išbandyti ir laisvi metalų jonai – varis (Cu) [63] bei sidabras (Ag) [56], kurių naudojimas dangose leido padidinti paviršių antibakterinį poveikį, tačiau turėjo neigiamos įtakos biosuderinamumui. Visos kitos litera- tūroje aprašytos ir titano lydinio padengimui naudotos dangos buvo biosuderinamos. Taigi 3.7.1 lentelėje pažymėtuose literatūros šaltiniuose aprašomos plačios zolių-gelių metodikos pritaikymo galimybės titano lydinio paviršiaus inžinerijoje, pakeičiant jo savybes. Zolių-gelių metodika yra nebrangi, efek- tyvi ir technologiškai nesudėtinga. Dangos parametrai gali būti kontroliuo- jami keičiant zolio-gelio koncentraciją, įmerkimo/sukimo parametrus ir iškai- tinimo temperatūrą [38, 202]. Zolių-gelių ir įmerkimo technikų derinimas

duoda kitų potencialių privalumų: kontroliuojamas dangos grynumas, homo- geniškumas, mažas dangos storis.

3.7.1 lentelė. Literatūros šaltiniuose aprašytas titano lydinių padengimas Biosuderi- Antibakterinis Šaltinis Danga namumas poveikis

Romero-Gavilan ir kt. (2018) [168] SiO2 nd nd

Martinez‐Ibanez ir kt. (2018) [118] SiO2 + nd

Chellappa ir kt. (2017) [41] SiO2/ZnO nd nd

Voicu ir kt. (2016) [208] SiO2/nd + nd

Romero-Gavilan ir kt. (2018) [167] Sr/SiO2 nd nd

Araujo‐Gomes ir kt. (2018) [11] SiO2/želatina nd nd

Palla-Rubio ir kt. (2019) [143] SiO2/chitozanas nd +

Catauro ir kt. (2015) [37] SiO2/polietelinglikolis + nd

Catauro ir kt. (2016) [39] CaO·SiO2 + nd

Maleki-Ghaleh ir kt. (2015) [113] Ca3Mg(SiO4)2 + nd

Marzban ir kt. (2018) [119] Ca2MgSi2O7 + nd

TiO2 + – Gollwitzer ir kt. (2018) [63] TiO2/Cu – +

Zemtsova ir kt. (2016) [219] TiO2 + nd

Boukchina ir kt. (2019) [27] TiO2/PbO2 nd nd

TiO2 + nd

Nascimento ir kt. (2017) [136] CaTiO2 + nd CaP + nd

Catauro ir kt. (2017) [36] TiO2/polikaprolaktonas nd nd Vakili ir kt. (2020) [205] Chitozanas/alginatas + +

Garcia-Casas ir kt. (2019) [57] P (OR)3 + nd Fu ir kt. (2018) [56] ZnO/Ag – + Bi ir kt. (2020) [24] ZnHAp/BiHAp + +

Carrado ir kt. (2017) [35] Na2Ti9O19/HAp + nd Lou ir kt. (2015) [105] LaHAp + nd Anglies nano Park ir kt. (2019) [147] + nd pluoštas/HAp Dangų poveikis pažymėtas kaip: „+“ – teigiamas; „–“ – neigiamas; „nd“ – nėra duomenų.

Technologiškai, dangų formavimas, naudojant zolių-gelių metodiką, įprastai turi 2 etapus: sintezės ir padengimo [131]. Sintezės etapo metu yra ruošiami zoliai-geliai, kurie paskui naudojami padengimui. Zolių-gelių pa- ruošimui pasitelkiami skystos fazės reagentai, bet ne netirpios kristalinės

medžiagos. Reagentų paruošimo strategija yra paremta cheminėmis reakcijomis bei jų etapais, maišant skirtingų reagentų tirpalus, kol galiausiai susinte- tinama galutinė medžiaga zolių-gelių forma. Be abejo, tai nėra grynas pro- duktas ir zolyje-gelyje taip pat egzistuoja reakcijų šalutiniai produktai, kurie yra pašalinami tolimesnių padengimo etapų metu. Dažniausiai tai yra orga- ninės kilmės šalutiniai produktai ir tirpikliai, kurie tolimesniuose sintezės eta- puose, naudojant temperatūrą, išgaruoja ar išdega. Padengimo etapo metu zoliai-geliai yra paskleidžiami ant substrato paviršiaus. Tam dažniausiai yra taikomos įmerkimo arba sukimo metodikos (3.7.1 pav.) [160, 211]. Substrato padengimas įmerkimo būdu yra patogus todėl, kad tinka netaisyklingų formų substratams, taip pat nesudėtingai pritaikomas serijinei gamybai. Taikant padengimą įmerkimo būdu, galima keisti galutinės dangos savybes, taikant skirtingus substrato įmerkimo, išlai- kymo ir ištraukimo greičius. Kita vertus, šios technikos naudojimas gali riboti dangos storį ir pasiskirstymo ant substrato tolygumą. Sukimo metodika už- tikrina tolygesnį zolio-gelio pasiskirstymą ir tuo pačiu tolygesnį dangos susi- formavimą ant substrato paviršiaus. Dėl sukimo metu sukuriamų išcentrinių jėgų, veikiant sunkio jėgai, dalelės įgauna didesnį pagreitį, todėl geriau pasklinda ant paviršiaus ir suformuoja plonesnes dangas, nei naudojant įmer- kimo metodą. Deja, šis metodas labiau tinka santykinai taisyklingų substratų paviršiams.

3.7.1 pav. Zolių-gelių padengimų schemos: (A) įmerkimo metodas; (B) sukimo metodas. Raut ir kt. (2011) [160].

Po padengimo reikalingas zolių-gelių fiksavimas-stabilizavimas ant substrato paviršiaus, atliekant iškaitinimą [195]. Tam naudojami įvairūs tempe- ratūriniai režimai, kurie reikalingi dėl kelių priežasčių. Pirma, didėjant tempe- ratūrai, kūnai plečiasi ir, didėjant tarpatominiams atstumams substrato pavir- šiuje, pagerėja adhezija tarp dangos ir substrato. Antra, temperatūra yra reikalinga šalutinių produktų pašalinimui (išgarinti tirpikliams ir išdegti priemai- šoms). Trečia, temperatūra pasitelkiama fazės formavimuisi. Įdomu tai, kad naudojant zolių-gelių metodiką, kai kuriems cheminiams procesams reikalinga gerokai mažesnė temperatūra, nei atliekant jų sintezę su kieta medžiagos forma. Įprastai dantų ir dantų implantų protezavimui naudojamas cirkonio oksidas frezuojamas iš pusiau kietos formos blokelių, kuriuose yra supresuota monoklininės formos cirkonio oksido pudra su itrio prie- dais. Itris reikalingas tetragoninės formos cirkonio oksido stabilizacijai. Tačiau, norint sukelti cirkonio oksido kristalų persiformavimą iš monoklini- nės į tetragonalinę formą, reikalinga aukšta (1260 °C) temperatūra, kuri įgrei- tina dalelių judėjimą. Zolių-gelių sintezės procese nenaudojamos kristalinės medžiagų formos, todėl pasiekiamas didesnis dalelių reaktyvumas. Skirtingai nei dirbant su kietomis frakcijomis, zolių-gelių metodui užtenka gerokai že- mesnės temperatūros fazės transformacijoms išgauti. Mokslinėse publikaci- jose galima rasti sėkmingai aprašytų eksperimentų, kur T-YZP sėkmingai sintezuojamas 500 °C temperatūroje [138, 213]. Aukštos temperatūros nerei- kalingos ir kitoms keramikoms formuotis – Li2Si2O5 formuojasi 550 °C temperatūroje [110, 195, 209]. Taigi, ši metodo savybė ypač palanki tiek dėl proceso technologinio paprastumo, tiek dėl tinkamumo padengti aukštai tem- peratūrai jautrias medžiagas.

3.8. Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Titano lydiniai plačiai naudojami dantų implantų ir jų atramų gamyboje bei ortopedinėje medicinoje dėl savo bioinertiškumo ir mechaninių savybių [91, 140]. Visgi, nepaisant šių privalumų, metalinių lydinių naudojimas dantų implantų protezavimui yra ribotas dėl tikimybės pasireikšti korozijai, alergi- joms [91] ir dėl jų netinkamų estetinių savybių [100]. Metalinis titano pavir- šius yra jautrus mechaniniams pažeidimams [177], todėl, atliekant profesio- nalios burnos higienos procedūrą, galima subraižyti atramų paviršių ir dėl šios priežasties ant jų gali imti kauptis bakterinės apnašos [96]. Naujausių tyrimų, kuriuose buvo tirtos protezavimui naudojamos keraminės medžiagos, rezultatai parodė geresnį jų bioinertiškumą ir minkštųjų periimplantinių audinių integraciją [137] bei didesnį paviršiaus tvirtumą [116], bet jų naudojimas yra ribotas dėl mažo atsparumo lenkimui [156] ir trapumo [126].

Įprastai dantų protezų gamybai naudojama sluoksniuojamoji keramika, dėl savo estetinių savybių, buvo sėkmingai pritaikyta metalo keramikos res- tauracijų gamybai. Deja, keramikos prisilydymas prie titano lydinių vis dar išlieka sudėtingas dėl susidarančios mažesnės adhezijos jėgos tarp titaninio pagrindo ir keramikos [9]. Tai lemia po atlikto smėliavimo titano paviršiuje įstrigusios smėlio dalelės [146] ir lydinio reaktyvumo sąlygotas storas oksi- dacinis sluoksnis [10]. Paviršių padengimas plonomis dangomis atveria naujas medžiagų tobulinimo ir pritaikymo galimybes. Tikimasi, jog šiame tyrime sukurtos naujos biokeraminės dangos pagerins sąveiką tarp ląstelių ir pavir- šiaus. Atliktuose panašiuose tyrimuose, kuomet naudotos kitos biokeraminės dangos, gauti rezultatai parodė, jog galima tikėtis teigiamų rezultatų [22, 214]. Šiame tyrime buvo naudotos unikalios itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato biokeraminės dangos, pritaikant zolių-gelių metodą titano lydinio substrato paviršiaus apdorojimui. Biokeraminių dangų naudojimas ant Ti lydinių gali būti tinkamas sprendimas, siekiant sujungti mechanines Ti substrato savybes ir biokeramikos paviršiaus pranašumus. Titano substrato paviršiaus izoliavimas biokeramine danga sumažina korozijos tikimybę ir pa- gerina keramikos sąlytį su minkštaisiais audiniais. Pasirinktos keramikos yra plačiai naudojamos protezavimo tikslais ir jų biosuderinamumas bei patvaru- mas jau pagrįstas įrodymais [32]. Dengimui zolių-gelių metodas buvo pasirinktas dėl savo paprastumo, ekonomiškumo ir sėkmingo pritaikymo kitiems substratams bei biokeraminėms medžiagoms [204].

4. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI

Mokslinis darbas vykdytas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Medicinos akademijos Odontologijos fakulteto Dantų ir žandikaulių ortopedijos klinikoje, bendradarbiaujant su Valstybinio mokslinių tyrimų instituto Fizinių ir technologijos mokslų centro (FTMC) Cheminės inžine- rijos ir technologijos skyriumi, Vilniaus universiteto Chemijos ir Geomokslų fakultetu, Vilniaus universiteto Biochemijos instituto Gyvybės mokslų centru ir LSMU Laboratorinės medicinos klinika. Šį eksperimentinį in vitro mokslinį darbą sudaro keturios dalys: a) implantų protezavimui naudojamų medžiagų paviršiaus poliravimo protokolų sudarymas ir efektyvumo vertinimas; b) paviršiaus modifikavimo galimybių įverti- nimas pritaikant paviršiaus padengimą zolių-gelių metodu; c) medžiagų naujoms biokeraminėms dangoms parinkimas, naujų biokeraminių dangų kūri- mas ir pritaikymas titano lydinio paviršiaus padengimui; d) naujai sukurtų dangų biologinio pritaikymo perspektyvų vertinimas in vitro ir palyginimas su įprastai implantų protezavimui naudojamų medžiagų poliruotais paviršiais. A – implantų protezavimui naudojamų medžiagų paviršiaus poliravimo protokolų sudarymo ir efektyvumo vertinimo schema: 1. Tiriamųjų grupių sudarymas ir mėginių paruošimas; 2. Paviršių poliravimo protokolų sudarymas ir poliravimas; 3. Paviršiaus fizikocheminių savybių vertinimas; 4. Duomenų statistinė analizė ir palyginimas. B – paviršiaus modifikavimo galimybių įvertinimas taikant paviršiaus padengimą zolių-gelių metodu: 1. Kalcio hidroksiapatito dangos sintezavimas zolių-geliu metodu ir jos padengimas ant silicio nitrido paviršių skirtingu sluoksnių skaičiumi naudojant įmerkimo techniką; 2. Dangos (paviršiaus) fizikocheminių savybių vertinimas. C – medžiagų naujoms biokeraminėms dangoms parinkimas, naujų bio- keraminių dangų kūrimas ir pritaikymas titano lydinio paviršiaus padengimui: 1. Itriu stabilizuoto cirkonio oksido (3YSZ) ir ličio disilikato (LS2) dangų sintezavimas zolių-geliu metodu ir titano lydinio paviršiaus padengimas naudojant sukimo metodą; 2. Dangų (paviršiaus) fizikocheminių savybių vertinimas ir palyginimas su poliruotu titano lydiniu; 3. Duomenų statistinė analizė ir palyginimas.

D – naujai sukurtų dangų biologinio pritaikymo perspektyvų vertinimas in vitro ir palyginimas su įprastai implantų protezavimui naudojamų me- džiagų poliruotu paviršiumi: 1. Naujai suformuotų Ti-3YSZ ir Ti-LS2 bei poliruotų paviršių balty- mų adsorbcijos vertinimas; 2. Naujai suformuotų Ti-3YSZ ir Ti-LS2 paviršių biosuderinamumo vertinimas ir palyginimas su poliruotais paviršiais. 3. HGF-1 ląstelių adhezijos ploto nustatymas ant paviršių po 2 ir 24 valandų; 4. HGF-1 ląstelių fokalinių adhezijų (FA) susidarymo nustatymas po 2 ir 24 valandų; 5. Paviršių kolonizavimo Porphyromonas gingivalis bakterijomis įverti- nimas ir palyginimas su įprastai implantų protezavimui naudojamų medžiagų poliruotu paviršiumi.

4.1. Implantų atramoms naudojamų medžiagų paviršiaus poliravimo strategijos sudarymas ir efektyvumo vertinimas

4.1.1. Mėginių paruošimas Tyrimui buvo parinktos komerciškai prieinamos ir įprastai dantų im- plantų protezavimui naudojamos medžiagos, kurios pateiktos 4.1.1.1 lente- lėje. Pagal suplanuotų eksperimentų dizainą, buvo parinkta kvadratinės plokš- telės forma, visiems mėginiams nustačius 10×10×0,5 mm matmenis. Pagal nurodytą geometriją, visų grupių mėginiai buvo išfrezuoti iš pateiktų me- džiagų, taikant CAD/CAM technologiją (Dental Concept Systems DC1, Dental Concept Systems GmbH, Ulmas, Vokietija). Laikantis technologinio režimo, ZrO2 mėginiai po frezavimo buvo papildomai sinteziruojami 1450 °C temperatūroje (Zubler Vario S400, Zubler USA, Dalasas, Teksaso valstija, JAV), parinkus 2 valandų sinterizacijos programą.

4.1.1.1 lentelė. Duomenys apie eksperimentuose naudotas komerciškai pri- einamas dantų implantų protezavimo medžiagas Cheminis Komercinis pavadinimas, Sudėtis proc. Grupės pavadinimas gamintojo duomenys. (pagal svorį) Ti Titano lydinys Ti6Al4V, DC Titan 5, Dental Ti – 90 proc. Concept Systems GmbH, Al – 6 proc. Ulmas, Vokietija V – 4 proc.

ZrO2 Itriu stabilizuotas ZrO2 Y-TZP Nacera Pearl, ZrO2 – 92,5 proc. cirkonio oksidas Doceram Medical Ceramics Y2O3 – 5,5 proc. GmbH, Dortmundas, Vokietija HfO2 – 1,9 proc. Kiti oksidai – 0,1 proc. PEEK Polietereterketonas BioHPP, Bredent GmbH, PEEK – 70 proc. Sendenas, Vokietija TiO2 – 30 proc. PMMA Polimetilmetakrilatas Brecam Universal, Bredent PMMA – 100 proc. GmbH, Sendenas, Vokietija

4.1.2. Paviršių poliravimas Visų mėginių paviršių poliravimui buvo sumodeliuoti ir naudoti du mechaninio poliravimo protokolai (A ir B). Poliravimo metu, laikantis sekos, laipsniškai mažintas abrazyvinių dalelių dydis (abrazyvinio popieriaus šiurkštumas), kaip pavaizduota 4.1.2.1 lentelėje. Pradinis paviršiaus poliravimas buvo atliekamas naudojant ISO 6344:3 abrazyvo standartus atitinkantį silicio karbido abrazyvinį popierių: P2000, P2500, P3000, P4000 (Starcke GmbH & Co. KG, Melė, Vokietija) ir P5000 (Trizact ™, 3M Company, Sant Paulas, Minesotos valstija, JAV). Kiekvienam sekančiam poliravimo ciklui buvo naudojamas mažesnio šiurkštumo abrazyvinis popierius. Poliravimo ciklai buvo atliekami naudojant pusiau automatines tekinimo stakles (Holz- mann metal lathe ED3000ECO, Maschinenhandel Gronau Inh., Gehrenas, Vokietija), taikant ekscentrinį sukimą ir plaunant vandeniu. Ciklo trukmė – 60 sekundžių, greitis – 3000 RPM. Galutinis paviršiaus poliravimas A ir B grupėms buvo atliktas naudojant deimantinę poliravimo pastą ir natūralaus plauko šepetėlį (Zirkopol, Feguramed GmbH, Odenvaldas, Vokietija).

4.1.2.1 lentelė. Duomenys apie eksperimentuose taikytus A ir B poliravimo protokolus Abrazyvo Abrazyvo Protokolas A Protokolas B Ciklas rūšis dydis (ciklo trukmė) (ciklo trukmė) 1 P2000 10,3 µm 60 s 60 s 2 P2500 8,4 µm 60 s 60 s 3 P3000 6 µm 60 s 60 s 4 ↓ P4000 5 µm 60 s 60 s 5 P5000 4 µm – 60 s 6 Deimantinė pasta Nėra duomenų 60 s 60 s

4.1.3. Paviršiaus morfologijos vertinimas Paviršiaus šiurkštumo matavimai buvo atlikti atominės jėgos mikroskopu (AFM) (Agilent 5500 AFM/SPM, Agilent Technologies, Palo Alto, Kalifornijos valstija, JAV). Kiekvieno mėginio paviršiuje buvo atsitiktinai parinkti ir kontaktiniu režimu nuskenuoti 0,25 µm2 paviršiaus plotai. Kontak- tiniam skenavimui naudotas 10 mm viršūnės spindžio silicio zondas. Kiek- vienas vaizdas buvo įrašytas 256×256 taškų dydžio raiškos mikrografijomis, kurios naudotos 2D ir 3D projekcijose kokybiniam paviršių aprašymui ir topografijos vertinimui. Sa paviršiaus šiurkštumo reikšmės naudotos tolimes- nei kiekybinei statistinei analizei.

4.1.4. Vandens kontaktinis kampas ir paviršiaus laisvoji energija Mėgininiai nuplauti ultragarsinėje vonelėje su heksanu ir dvigubai disti- liuotu vandeniu. Dvi valandas mėginiai džiovinti vakuuminėje krosnelėje 50 oC temperatūroje. Paviršių WCA ir SFE nustatymui naudotas optinis tensiometras (CAM 200, KSV Instruments Ltd, Helsinkis, Suomija). Mata- vimams naudotas sunkiosios fazės dvigubo distiliavimo vanduo. Kambario temperatūroje ant mėginio paviršiaus buvo dedamas nedidelis skysčio lašas (4–7 µl) ir įvertintas kampas tarp lašo bei paviršiaus šoninėje projekcijoje. SFE buvo apskaičiuojama naudojant Owens-Wendt metodą, atskirai skaičiuo- jant polines ir dispersines paviršiaus laisvąsias energijas [141].

4.2. Paviršiaus modifikavimo galimybių įvertinimas taikant paviršiaus padengimą zolių-gelių metodu

4.2.1. Reagentai paviršiaus padengimui Sintezei buvo naudotas kalcio acetato monohidratas (99,9 proc.; Fluka; Šarlotė, Šiaurės Karolinos valstija, JAV), 1,2-etandiolio, etilendiamino tetra- acto rūgštis (EDTA) (99,0 proc.; Alfa Aesar; Haverhilas, Masačusetso valstija, JAV), trietanolamino (TEA) (99,0 proc.; Merck; Darmštatas, Vokietija), ortofosforo rūgšties (H3PO4 85 proc.; Reachem; Čenajus, Indija) ir polivinilo alkoholio (PVA) (PVA 70000, 99,5 proc.; Aldrich; Sent Luisas, Misūrio valstija, JAV) reagentai. Visi reagentai buvo naudoti be papildomų modifikacijų.

4.2.2. Kalcio hidroksiapatito zolių paruošimas Naudojant zolių-gelių metodą, buvo sintezuojama kalcio hidroksiapatito (Ca10(PO4)6(OH)4, [CHAp]) biokeramikos nano danga, kuri, taikant įmer- kimo metodą, padengta ant silicio nitrido (Si3N4) paviršiaus. Ruošiant CHAp dangą, kaip pradinė medžiaga buvo naudotas 0,03 mol kalcio acetato monohidratas. Į jo vandeninį (2,22 mol vandens) tirpalą buvo pridėta 0,036 mol 1,2-etandiolio. Gautas mišinys buvo maišomas 30 min. 65 °C temperatūroje. Tada buvo pridėta 0,033 mol EDTA ir po 15 min. lėtai pridėtas 0,113 mol rišantysis agentas TEA. Tirpalas buvo maišomas 10 valandų. Po to pridėta skiestos 0,018 mol ortofosforo rūgšties, pasiekiant 1,67 kalcio/fosforo santy- kį. Galiausiai, šis tirpalas santykiu 5:3 buvo sumaišytas su 5,39 mol distiliuo- tame vandenyje ištirpintu 0,00004 mol PVA. Gautas zolis-gelis naudotas dengimui.

4.2.3. Silicio nitrido dengimas kalcio hidroksiapatito dangomis Kaip substratas nano dangos sukūrimui buvo naudotas neoksidinio tipo Si3N4 keramikos pagrindas. Prieš padengimą visi mėginiai buvo išplauti ultragarsinėje vonelėje laikantis sekos: acetonas, etanolis, distiliuotas vanduo. Naudojant įmerkimo metodą ant Si3N4 substrato buvo išgautos plonos daugia- sluoksnės CHAp dangos. Mėginių įmerkimui buvo naudojamas plėvelių pa- ruošimo įrenginys (Dip Coater D; KSV NIMA, Biolin Scientific; Gioten- burgas, Švedija). Mėginių įmerkimo greitis buvo 85 mm/min., iškėlimo greitis – 40 mm/min. Mėginys buvo paliekamas gelio tirpale 20 s. Padengti mėginiai buvo kaitinti 5 valandas, temperatūrą didinant 1 °C/min., kol buvo pasiekta 650 °C temperatūra. Po to taikytas pasyvus aušinimas, mėginius paliekant krosnyje, kol bus pasiekta vidutinė aplinkos temperatūra. Paden- gimo, kaitinimo ir aušinimo etapai buvo kartojami 10, 20 ir 30 kartų.

4.2.4. Dangų indentifikavimas Dangų formavimasis ir jų elementinė sudėtis vertinta naudojant rentgeno spindulių difrakcinę analizę (XRD). Paviršiai vertinti komerciškai prieinamu rentgeno difraktometru (Rigaku SmartLab, Rigaku Corporation, Tokijas, Japonija).

4.2.5. Dangų paviršiaus morfologijos vertinimas Paviršiaus morfologijos analizė atlikta paviršių vertinant skenuojančiu elektroniniu mikroskopu (SEM) (Hitachi SU-70, Hitachi, Ltd., Chiyoda, Tokijas, Japonija). Skenuojant perlaužtų mėginių skerspjūvį buvo išmatuotas ir įvertintas suformuotų dangų storis. Paviršiaus šiurkštumo matavimai buvo atlikti AFM. Buvo skenuoti trys atsitiktinai parinkti 0,25 µm2 mėginio paviršiaus plotai.

4.2.6. Vandens kontaktinis kampas Mėgininiai nuplauti ultragarsinėje vonelėje su heksanu ir dvigubai disti- liuotu vandeniu. Dvi valandas mėginiai džiovinti vakuuminėje krosnelėje 50 °C temperatūroje. Paviršių WCA nustatymui naudotas optinis tensiometras. Matavimams naudotas sunkiosios fazės dvigubo distiliavimo vanduo. Matuojant tirpiklio lašelio kontaktinį kampą, kambario temperatūroje ant mėginio paviršiaus buvo dedamas nedidelis skysčio lašas (4–7 µl) ir įvertintas kampas tarp lašo ir paviršiaus šoninėje projekcijoje.

4.3. Medžiagų naujoms biokeraminėms dangoms parinkimas, naujų biokeraminių dangų kūrimas ir pritaikymas titano lydinio paviršiaus padengimui

4.3.1. Reagentai paviršiaus padengimui Buvo naudotas itrio nitrato heksahidratas (99 proc.), acetilo acetonas (AcAc, 99,5 proc.) (Sigma-Aldrich Inc., Sant Luisas, Misūrio vastija, JAV), cirkonio propoxidas (ZIP, 70 proc. sol. 1-propanolyje), ličio metoksidas (LiOMe, 2.2M sol. metanolyje), tetrametilo ortosilikatas (TMOS 99 proc.) iš AcrosOrganics (Acros Organic ™, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Masačutseso valstija, JAV). Visi reagentai naudoti be papildomų modi- fikacijų. Metanolis, etanolis ir isopropanolis buvo laikomi 3A molekuliniuose sietuose 48 valandas ir po to distiliuojami sauso azoto atmosferoje.

4.3.2. Itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato zolių paruošimas Dangoms buvo taikytas zolių-gelių metodas, iš pradžių paruošiant pre- kursoriaus alkoksido tirpalą, po to juo padengiant poliruoto titano pagrindą sukamojo dengimo metodu. 3YSZ (3 mol% Y2O3) dangos paruošimui, 0,0073 mol itrio nitrato heksa- hidrato ir 0,115 mol cirkonio propoxilo tirpalai buvo ištirpinti dehidratuotame 2-propanolyje. Gautas tirpalas stabilizuotas 0,0345 mol acetilo acetonu. Hidrolizės reakcija inicijuota galutiniame etape, pridedant 0,23 mol H2O. Ličio disilikato dangos paruošimui 0,01 mol ličio metoksido (LiOMe) ir 0,01 mol tetrametilo ortosilikato (TMOS) tirpalai buvo ištirpinti dehidratuotame etanolyje. 0,015 mol H2O buvo įdėta paskutiniame etape. Abu tirpalai buvo laikomi kambario temperatūroje 24 valandas ir po to gauti zoliai buvo naudoti sukamajam padengimui.

4.3.3. Titano lydinio pagrindų dengimas itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato dangomis Ti mėginių padengimas buvo atliekamas formuojant vieno sluoksnio 3YSZ ir LS2 biokeramines dangas. Prieš dengimą zoliai buvo nufiltruoti per 0,2 µm nailoninės membranos filtrą. Titano lydinio pagrindai nuplauti ultra- garso vonelėje (Sonorex, BANDELIN electronic GmbH & Co., Berlynas, Vokietija) nejoniniais surfaktantais (RBS Neutral T, Carl-Roth), po to nuplauti dejonizuotu vandeniu ir galiausiai 2-propanoliu. Paviršiai pasyviai nudžiovinti oru. Ant titano lydinio pagrindo poliruoto paviršiaus buvo uždėta 50 µl zolio ir sukamuoju būdu, taikant 2000 RPM sūkius, zoliai paskleisti ant paviršiaus. Po padengimo 3YSZ ir LS2 dangos 2 valandas iškaitintos mufelinėje krosnyje (SNOL 13/1100, Umega group, Utena, Lietuva) 600 °C temperatūroje. Padengti pagrindai pasyviai aušinti kambario temperatūroje.

4.3.4. Dangų indentifikavimas Dangų formavimasis ir jų elementinė sudėtis vertinti XRD. Norint pasiekti didesnį jautrumą, spektrai buvo užfiksuoti taikant liečiančio kampo geometriją: 0,01 laipsnio žingsnio dydis ir 1 laipsnio/min. nuskaitymo greitis.

4.3.5. Dangų paviršiaus morfologijos vertinimas Paviršiaus morfologijos analizei atliktas paviršių vertinimas skenuojan- čiu elektroniniu mikroskopu (Hitachi SU-70 SEM, Hitachi, Ltd., Chiyoda, Tokijas, Japonija). Taip pat SEM buvo išmatuoti ir įvertinti suformuotų dan- gų storiai. Dangų storio matavimui, taikant tą patį padengimo protokolą, buvo padengtos 10×10 mm silicio (100) plokštelės. Po to jos perlaužtos per pusę ir, nuskenavus skerspjūvį, pamatuotas dangos storis. Paviršiaus šiurkštumo matavimai buvo atlikti AFM. Buvo skenuoti trys atsitiktinai parinkti 0,25 µm2 kiekvieno mėginio paviršiaus plotai.

4.4. Naujai sukurtų dangų biologinių savybių vertinimas

4.4.1. Baltymų adsorbcija Tiriamųjų mėginių paviršių baltymų adsorbcijos buvo vertintos atliekant Bradfordo testą [130]. Tuo tikslu mėginiai buvo merkiami į FBS, inkubuoti 24 val., aplinkoje esant 37 °C ir 5 proc. CO2. Po numatyto laiko mėginiai buvo 2 kartus plaunami PBS (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Valthamas, Masačutseso valstija, JAV), taip pašalintas perteklinis FBS kiekis. Po plovimo ant karkasų piltas Bradfordo reagentas (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, Misūrio valstija, JAV) ir susidariusio tirpalo optinis tankis matuotas plokštelių skaitytuvu (Varioskan Flash, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, Misūrio valstija, JAV), pasirinkus 595 nm bangos ilgį.

4.4.2. Ląstelių auginimas Standartinės linijos žmogaus dantenų fibroblastai (HGF-1; CRL-2014, ATCC) auginti Dulbeco modifikuotoje Eagle’o terpėje (DMEM; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Masačutseso valstija, JAV), praturintoje 10 proc. fetalinio veršelio serumu (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Valthamas, Masačutseso valstija, JAV) bei antibiotikų penicilino ir strepto- micino (atitinkamai 100 vnt./ml ir 100 μg/ml) mišiniu (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Valthamas, Masačutseso valstija, JAV). Ląstelės inkubuotos 37 °C temperatūroje termostate (NUAIRE NU-4750E), drėgnoje aplinkoje, kurioje palaikoma 5 proc. CO2 koncentracija. Ląstelės buvo persėjamos 1–2 kartus per savaitę (kai monosluoknis sudarė 80–90 proc. paviršiaus padengimo), monosluoksnis disperguotas 0,02 mol EDTA / 0,025 proc. tripsino (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Valthamas, Masačutseso valstija, JAV) mišiniu (paruoštas santykiu 4:1). Eksperimentams naudotos ne didesnio kaip 15 pa- sažo ląstelės.

4.4.3. Biosuderinamumo vertinimas Mėginių biosuderinamumas buvo įvertintas naudojant 3-[4,5-dimetil- taizolo-2-yl]-2,5-difeniltetrazolo bromido (MTT) testą. HGF-1 (3×104 ląst./cm2) suspensija buvo išpilstyta į ląstelėms auginti skirtų plokštelių duobutes. Po 24 val. ant susiformavusio monosluoksnio buvo uždedami tiriamieji karkasai, inkubuota 24 val. Po numatyto laiko augimo terpė pašalinta, mėginiai 1 kartą plauti PBS, po to užpiltas 0,2 mg/ml MTT (MTT, Sigma-Aldrich Inc., Sent Luisas, Misūrio valstija, JAV) tirpalas (ruoštas PBS), inkubuota 1 val. 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 aplinkoje. Pašalinus MTT tirpalą, susidariusios nuosėdos buvo ištirpintos dimetilsulfokside (Dimethyl sulfoxide, Sigma- Aldrich, Dorsetas, Didžioji Britanija), inkubuota 10 min. kambario tempera- tūroje, purtytuve supant 25 RPM greičiu. Susidariusio tirpalo optinis tankis matuotas plokštelių skaitytuvu (Varioskan Flash, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, Misūrio valstija, JAV), pasirinkus 570 nm bangos ilgį.

4.4.4. Ląstelių adhezijos vertinimas imunocitochemijos metodu Kokybinis ir kiekybinis, ant tiriamųjų mėginių augintų HGF-1, adhezijos efektyvumas ir stiprumas buvo įvertintas imunocitochemijos metodu, vizuali- zuojant ląstelių suformuotus F-aktino filamentus bei sutelktinius sąlyčius (fokalines adhezijas [FA]). Tuo tikslu HGF-1 (15×103 ląst./cm2) buvo išsėtos ant tiriamųjų mėginių, inkubuota 2 ir 24 val. Po numatytų laikų mėginiai su ląstelėmis plauti PBS, fiksuoti 4 proc. paraformaldehido (Carl Roth, GmbH, Karlsrūjė, Vokietija) tirpalu (inkubuota 15 min. kambario temperatūroje švel- niai purtant 25 RPM greičiu). Po to, mėginiai 2 kartus plauti 0,05 proc. Tween-20 (Sigma-Aldrich Co, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, Misūrio valstija, JAV) tirpalu (paruoštas PBS), permeabilizuoti su 0,2 proc. Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co, Sigma-Aldrich, Sent Luisas, Misūrio valstija, JAV) tirpalu (paruoštas PBS), vėl 2 kartus plauti 0,05 proc. Tween-20 tirpalu ir 30 min. blokuoti blokavimo tirpale (3 proc. jaučio serumo albuminas [BSA; BSA; AppliChem GmbH, Darmštatas, Vokietija], 10 proc. FBS, PBS) kambario temperatūroje, supant 25 aps./min. greičiu. Po šios procedūros mėginiai 1 val., švelniai supant (25 RPM greičiu), inkubuoti su pirminiais pelės anti- kūnais, atpažįstančiais vinkuliną (1:50; Merck Millipore, Karlsbadas, Kali- fornijos valstija, JAV) (paruošta blokavimo tirpale). Po inkubacijos karkasai su ląstelėmis buvo 3 kartus po 5 min. plauti 0,05 proc. Tween-20 (paruoštas PBS), po to 1 val. inkubuoti su Alexa Fluor 488 konjuguotų ožkos IgG (H+L) antrinių antikūnų (atpažįstančių pelės antikūno Fc domeną) (Invitrogen) ir tetrametil rodamino izotiocianatu (TRITC) žymėto faloidino (1:500; Merck Millipore, Karlsbadas, Kalifornijos valstija, JAV) mišiniu (paruošta PBS)

kambario temperatūroje, tamsoje, švelniai supant (25 RPM greičiu). Po inkubacijos, mėginiai 3 kartus po 5 min. plauti PBS ir 5 min. dažyti 12,5 μg/ml DAPI (1:500; Merck Millipore, Karlsbadas, Kalifornijos valstija, JAV) tirpalu (paruoštas PBS) kambario temperatūroje, tamsoje, švelniai supant (25 RPM greičiu). Po to mėginiai buvo dar kartą plaunami 3 kartus po 5 min. PBS ir vizualizuoti konfokaliniu lazeriniu skenuojančiu mikroskopu (CLSM) (Leica SP5 TCS, Leica Microsystems, Velzeris, Vokietija). Kiekybiniai ląstelių adhezijos efektyvumo rezultatai gauti ImageJ (ImageJ 1.8.0_112) (Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, Bethesda, Merilando vastija, JAV) programa, skaičiuojant adhezijos dina- mikoje kintančius ląstelių plotus. Kiekybiniai ląstelių adhezijos stiprumo skirtumai buvo gauti ImageJ programos pagalba, skaičiuojant ląstelėse susi- formavusių fokalinių adhezijų kiekį.

4.4.5. Bakterijos padermė ir kultūros gavimas Mikrobiologiniams tyrimams buvo naudota standartinė Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (Microbiologics, Grenoblis, Prancūzija) bakterijų kultūra. Laikantis tiekėjo nurodyto protokolo, liofilizuotos bakterijos pasėtos ant Shaedler anaerobinio agaro, su L-cisteinu, vitaminu K1 ir 5 proc. avies krauju (Acumedia, Lansingas, Mičigano valstija, JAV) standžioje mitybinėje terpėje. Bakterijoms augti buvo sudarytos anaerobinės sąlygos (10 proc. H2, 10 proc. CO2, ir 80 proc. N2) 35±1 °C temperatūroje, kuriose jos buvo kultivuojamos 48 valandas. Anaerobinėje aplinkoje surinktos P. gingivalis kolonijos ir suspenduotos sterilioje redukuotojoje skystoje terpėje iki pasiekta 0,5 Mfa suspensija, atitinkanti 1,5×108 bakterijų koncentraciją 1 ml.

4.4.6. Paviršių kolonizavimas P. gingivalis Prieš mikrobiologinius tyrimus mėginiai buvo plaunami 10 minučių ultragarsinėje vonelėje (Clifton SW, Nickel Electro Ltd, Somersetas, Jungtinė Karalystė), naudojant 70 proc. etilo alkoholio tirpalą. Po plovimo pasyviai džiovinti kambario temperatūroje, supakuoti į sterilizavimo pakuotes ir sterilizuoti autoklavuojant 121 °C temperatūroje 39 minutes (Hygoclave 90, Dürr Dental, Bietigheimas, Vokietija). Kiekvienai tiriamajai grupei buvo naudota 10 mėginių (n=10). Reakcijos vykdytos 10 ml talpos mėgintuvėliuo- se, atskirai kiekviename mėgintuvėlyje talpinant po vieną tiriamąjį mėginį. Į mėgintuvėlius su tiriamaisiais paviršiais įpilta 4,5 ml redukuotos P. gingivalis skystos tioglikolinės mitybinės terpės (Sigma-Aldrich, Taufkirchenas, Vokie- tija). Po to dar 0,5 ml 0,5 Mfa vieneto tankio standartizuotos bakterijų suspensijos perkelta į mėgintuvėlius su mėginiais ir 4,5 ml P. gingivalis mity- bine terpe. Inokuliuoti mėgintuvėliai inkubuoti anaerobinėje aplinkoje

(10 proc. H2, 10proc. CO2, ir 80 proc. N2) 35±1 °C laipsnių temperatūroje 48 valandas. Po 48 valandų mėginiai atsargiai perkelti į sterilius mėgintu- vėlius su 1 ml PBS ir 1 proc. proteinaze K (Sigma-Aldrich, Taufkirchenas, Vokietija). Mėginiai su proteinaze K ir PBS tirpalu buvo laikomi 37 °C tem- peratūroje 60 minučių anaerobinėmis sąlygomis. Po to mėgintuvėliai perkelti į automatinį purtytuvą ir purtyti 1 minutę. Purtymas buvo atliekamas tam, jog būtų mechaniškai nuo mėginių paviršiaus pašalintos visos susidariusio P. gingivalis kultūros kolonijos. Iš mėgintuvėlių išimti mėginiai ir suspensijos tankis išmatuotas naudojant McFarland Densitometer (Biosan, Ryga, Latvija) aparatą. Mikroorganizmų tankis buvo vertintas Mfa vienetais. Gauta Mfa skaitinė vertė, kuri pagal proporciją perskaičiuota į kolonijas formuojan- čius vienetus viename mililitre (KFV/ml). Norint įsitikinti, jog mėgintuvė- liuose auga būtent bakterijos P. gingivalis kolonijos, buvo atliktas kontrolinis suspensijos išsėjimas. Kiekvienos biologinės replikos mėginiai skiesti seri- jiniu būdu naudojant tioglikolio augimo terpę ir išsėti taškais (3 replikos, t. y. 3 taškai per skiedimą) ant Shaedler agaro. Lėkštelės inkubuojamos anaero- biškai 48 valandas.

4.4.7. Statistinė analizė Statistinė analizė atlikta „GraphPad Prism 8“ programiniu paketu (San Diegas, Kalifornijos valstija, JAV). Matavimų duomenys aprašyti vidurkiu ir standartiniu nuokrypiu. Kintamųjų pasiskirstymas buvo vertintas D'Agostino- Pearson testais. Po duomenų pasiskirstymo pagal normalųjį skirstinį patvirti- nimo, duomenys toliau tarpusavyje lyginti naudojant Anova duomenų anali- zės modelį, atliekant Tukey testus. Taip pat matavimų priklausomybių tyrimui buvo įvertintos duomenų tarp skirtingų tyrimų regresijos, naudojant Pearson koreliacinę analizę. Visiems statistiniams vertinimams nustatytas p<0,05 statistinio reikšmingumo lygmuo, o p≥0,05 – statistiškai nereikšminga (ns).

5. REZULTATAI

5.1. Poliravimo įtaka įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų paviršių savybėms

5.1.1. Poliravimo įtaka įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų paviršių šiurkštumui Po paviršių poliravimo, laikantis A ir B protokolų nuoseklumo, atlikti paviršiaus šiurkštumo matavimai poliravimo efektyvumo vertinimui. Mata- vimams išreikšti buvo naudojama Sa vidutinio paviršiaus šiurkštumo reikšmė. Visų paviršių šiurkštumo vidurkiai buvo žemiau mikro šiurkštumo skalės. Po poliravimo pagal A protokolą, mažiausias paviršiaus šiurkštumas nustatytas ant cirkonio oksido paviršiaus (Sa = 9,36±0,41 nm, p<0,0001), didžiausias – PMMA (Sa = 62,33±0,96 nm, p<0,0001) (5.1.1.1 pav., A). Po poliravimo pagal B protokolą, taip pat mažiausias šiurkštumas nustatytas cirkonio oksido paviršiaus (Sa = 5,53±0,21 nm, p<0,0001), didžiausias – PMMA (Sa = 65,23± 2,40 nm, p<0,0001) (5.1.1.1 pav., B). Sa statistiškai reikšmingai skyrėsi tarp visų grupių, tiek lyginant jas po poliravimo pagal A, tiek pagal B protokolą (p<0,0001). Pritaikius B poliravimo protokolą, trijose grupėse statistiškai reikš- mingai sumažėjo paviršiaus šiurkštumas (p<0,0001), tik vienoje PMMA gru- pėje, po poliravimo pagal B protokolą, paviršiaus šiurkštumas buvo statistiškai reikšmingai didesnis, nei pagal A protokolą (p<0,0001) (5.1.1.2 pav.).

5.1.1.1 pav. Atominės jėgos mikroskopo (AFM) mikrografijos. 2D (a, c, e, g, i, k, m, o) ir 3D (b, d, f, h, j, l, n, p) skenavimo rekonstrukcijos. Paviršių šiurkštumai (Sa) pateikti vidurkiais ir standartiniais nuokrypiais (SN). Paviršių analizė po poliravimo pagal A ir B protokolus.

5.1.1.2 pav. Paviršių šiurkštumai (Sa ir SN). Daugybinių Tukey testo palyginimų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „****“ – p<0,0001.

Paviršiaus morfologijos kokybiniam vertinimui buvo atlikta 2D ir 3D AFM rekonstrukcijų analizė, pagal kurią aprašyta paviršių topografija. Lygi- nant nuotraukas, stebimi aiškūs skirtumai tarp paviršiaus struktūros ir ypač išryškėja nehomogeniški polimerinės kilmės medžiagų (PEEK ir PMMA) paviršiai. Taip pat, z ašis, parodanti įrėžimų gylį, ant šių paviršių fiksuota didžiausia: PEEK – 5.1.1.1 pav. A (j, l) ir PMMA – 5.1.1.1 pav. A (n, p). Ant poliruotų polimerinių medžiagų buvo aptikti gilesni, ryškesni grioveliai ir įbrėžimai bei netaisyklingi iškilumai. Tuo tarpu, ant neorganinės kilmės paviršių, z ašies pokyčiai fiksuoti nano skalėje: Ti – 5.1.1.1 pav. A (b, d) ir ZrO2 – 5.1.1.1 pav. A (f, h). Ant paviršių lydymosi požymių nestebėta.

5.1.2. Įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių vandens kontaktinis kampas ir laisvoji energija WCA buvo matuotas siekiant įvertinti paviršių hidrofiliškumą – WCA didėjimas rodo hidrofiliškumo mažėjimą. Atlikus paviršių poliravimą pagal A protokolą, didžiausias WCA nustatytas ant PMMA (100,10±1,40°, p< 0,0001), o mažiausias – ant PEEK (76,79±1,10°, p<0,0001). Ti ir ZrO2 gru- pėse nustatytos tarpinės WCA reikšmės, kurios tarpusavyje statistiškai reikš- mingai nesiskyrė (p≥0,05) (5.1.2.1 lentelė). Po A poliravimo, tarp visų grupių nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05), o PMMA paviršius buvo labiausiai hidrofobiškas (p<0,0001).

5.1.2.1 lentelė. Skirtingų grupių paviršių vandens kontaktinio kampo (WCA) vidurkių daugkartiniai palyginimai po A ir B poliravimo, taikant Tukey testą. Tukey vidurkių Vidurkis 1 Vidurkis 2 Vidurkių skirtu- p reikšmingumo

palyginimo testas (laipsniai °) (laipsniai °) mas (laipsniai °) lygmuo ns Ti vs. ZrO2 88,20 90,55 2,35 0,1146 Ti vs. PEEK 88,20 76,79 11,42 <0,0001**** Ti vs. PMMA 88,20 100,10 11,88 <0,0001**** A ZrO2 vs. PEEK 90,55 76,79 13,76 <0,0001****

ZrO2 vs. PMMA 90,55 100,10 9,53 <0,0001**** PEEK vs. PMMA 76,79 100,10 23,29 <0,0001****

Ti vs. ZrO2 60,21 57,32 2,89 0,0175* Ti vs. PEEK 60,21 75,62 15,41 <0,0001**** Ti vs. PMMA 60,21 68,84 8,63 <0,0001**** B ZrO2 vs. PEEK 57,32 75,62 18,30 <0,0001****

ZrO2 vs. PMMA 57,32 68,84 11,52 <0,0001**** PEEK vs. PMMA 75,62 68,84 6,78 <0,0001**** Palyginimui taikytas statistinio reikšmingumo p<0,05 lygmuo (ns – p≥0,05).

Po poliravimo pagal B protokolą, paviršiaus WCA mažėjo visose grupės ir paviršiai tapo hidrofiliškesni (5.1.2.1 pav.). Statistiškai reikšmingo skirtumo tarp A ir B protokolų nebuvo tik PEEK grupėje (p≥0,05). Po poliravimo pagal B protokolą, PEEK paviršius buvo labiausiai hidrofobiškas (75,62± 2,50°, p<0,0001), o labiausiai hidrofiliškas buvo ZrO2 paviršius (57,32± 1,90°, p<0,05).

5.1.2.1 pav. Paviršių vandens kontaktiniai kampai (WCA) pateikti vidurkiais ir SN. Daugybinių Tukey testo palyginimų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „ns“ – p≥0,05.

Paviršiaus SFE matuota išskiriant polinę ir dispersinę SFE, o jų vidurkių sumos išreikštos kaip suminė SFE (5.1.2.2 pav.). Po poliravimo pagal A protokolą, didžiausią suminę SFE turėjo PEEK paviršius (38,07±0,93 mN/m, p<0,0001) (5.1.2.2 lentelė). Kitų paviršių SFE buvo statistiškai reikšmingai mažesnės, o statistiškai reikšmingo skirtumo tarp grupių nebuvo (p≥0,05).

5.1.2.2 pav. Dispersinės (juodas įrėminimas) ir polinės (raudonas įrėminimas) paviršiaus laisvosios energijos (SFE) matavimų rezultatai pateikti vidurkiais ir SN. Suminę SFE parodo visas stulpelis. Daugkartinis palyginimas atliktas lyginant pokyčius po poliravimo pagal A ir pagal B protokolus. Po daugkartinio Tukey testo palyginimo, suminių SFE reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „****“ – p<0,0001.

5.1.2.2 lentelė. Paviršių suminių laisvųjų energijų (SFE) vidurkių daugkartiniai palyginimai taikant Tukey testą, palyginimas tarp medžiagų, pritaikius A ir B poliravimo protokolus. Tukey vidurkių Vidurkis 1 Vidurkis 2 Vidurkių skirtumas p reikšmingumo

palyginimo testas (mN/M) (mN/M) (mN/M) lygmuo ns Ti vs. ZrO2 33,31 31,70 1,61 0,0809 Ti vs. PEEK 33,31 38,07 4,76 <0,0001**** Ti vs. PMMA 33,31 31,70 1,61 0,0807ns A ZrO2 vs. PEEK 31,70 38,07 6,366 <0,0001**** ns ZrO2 vs. PMMA 31,70 31,70 <0,01 >0,9999 PEEK vs. PMMA 38,07 31,70 6,37 <0,0001****

Ti vs. ZrO2 41,81 45,10 3,29 <0,0001**** Ti vs. PEEK 41,81 43,46 1,65 0,0691ns Ti vs. PMMA 41,81 44,34 2,53 0,0004*** B ns ZrO2 vs. PEEK 45,10 43,46 1,64 0,0684 ns ZrO2 vs. PMMA 45,10 44,34 0,76 0,8606 PEEK vs. PMMA 43,46 44,34 0,88 0,7401ns Palyginimui taikytas statistinio reikšmingumo p<0,05 lygmuo (ns – p≥0,05).

Polinė SFE, po poliravimo pagal A protokolą, didžiausia buvo PEEK gru- pėje (5,71±0,53 mN/m, p<0,0001), o mažiausia – PMMA (0,37±0,17 mN/m, p<0,0001) (5.1.2.3 lentelė.). Po poliravimo pagal B protokolą, visose grupėse statistiškai reikšmingai padidėjo suminė SFE (p<0,0001). Didžiausia suminė SFE buvo ant ZrO2 (45,10±0,34 mN/m, p<0,0001), o mažiausia – ant Ti (41,81±2,00 mN/m, p<0,0001) paviršiaus. Visos reikšmės statistiškai reikšmingai skyrėsi tarpusavyje (p<0,0001).

5.1.2.3 lentelė. Paviršių polinės SFE vidurkių daugkartiniai palyginimai taikant Tukey testą, palyginimas tarp medžiagų, pritaikius A ir B poliravimo protokolus. Tukey vidurkių Vidurkis 1 Vidurkis 2 Vidurkių skirtumas p reikšmingumo

palyginimo testas (mN/M) (mN/M) (mN/M) lygmuo ns Ti vs. ZrO2 2,49 2,16 0,33 0,9496 Ti vs. PEEK 2,49 5,71 3,22 <0,0001**** Ti vs. PMMA 2,49 0,37 2,12 <0,0001**** A ZrO2 vs. PEEK 2,16 5,71 3,55 <0,0001****

ZrO2 vs. PMMA 2,16 0,37 1,79 <0,0001**** PEEK vs. PMMA 5,71 0,37 5,34 <0,0001****

Ti vs. ZrO2 7,37 14,72 7,35 <0,0001**** Ti vs. PEEK 7,37 4,14 3,23 <0,0001**** Ti vs. PMMA 7,37 7,36 0,01 >0,9999ns B ZrO2 vs. PEEK 14,72 4,14 10,58 <0,0001****

ZrO2 vs. PMMA 14,72 7,36 7,36 <0,0001**** PEEK vs. PMMA 4,14 7,36 3,22 <0,0001**** Palyginimui taikytas statistinio reikšmingumo p<0,05 lygmuo (nereikšmingas (ns) – p≥0,05).

Polinė SFE, po poliravimo pagal B protokolą, taip pat padidėjo visose gru- pėse, didžiausia nustatyta ant ZrO2 (14,72±0,36 mN/m, p<0,0001) paviršiaus, mažiausia – ant PEEK (4,14±0,20 mN/m, p<0,0001). Po poliravimo pagal B protokolą, vienintelėje PEEK grupėje polinė SFE statistiškai reikšmingai su- mažėjo (p<0,0001), tačiau visose kitose grupėse – padidėjo (p<0,0001).

5.1.3. Fizikocheminių savybių koreliacija Nustatyta stipri neigiama koreliacija tarp WCA ir suminės SFE (r = –0,93), rodanti, kad didėjant paviršių WCA, mažėjo suminė SFE. Taip pat nustatyta vidutinė teigiama koreliacija tarp Sa ir WCA (r = 0,61), rodanti, kad didėjant paviršiaus šiurkštumui, stebimas ir WCA padidėjimas. Silpna neigiama koreliacija nustatyta tarp paviršių Sa ir suminės SFE (r = –0,42).

5.1.3.1 lentelė. Pearson koreliacijos fizikocheminių eksperimentų rezultatų priklausomybės įvertinimui.

Pearson koreliacija Sa vs. WCA Sa vs. suminė SFE WCA vs. suminė SFE r 0,61 –0,42 –0,93 p (two-tailed) <0,0001**** 0,0008*** <0,0001**** Koreliacija reikšminga, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „****“ – p<0,0001; „***“ – p = 0,0008.

5.2. Zolių-gelių metodo pritaikymas ir biokeraminių dangų formavimas

5.2.1. Zolių-gelių metodo pritaikymas paviršiaus modifikavimui

Siekiant įvertinti technologinį zolių-gelių metodo efektyvumą, Si3N4 pa- viršiai buvo dengiami CHAp dangomis (10, 20 ir 30 sluoksnių). Pagal XRD rezultatus pastebėta, kad vienfazis CHAp susiformuoja padengus 10, 20 ir 30 sluoksnių dangomis ir tyrimas parodė dangų cheminį vientisumą, nepriklau- santį nuo padengimų skaičiaus (5.2.1.1 pav.). CHAp difrakcijos intensyvumas didėjo priklausomai nuo CHAp sluoksnių – didėjant sluoksnių kiekiui, didėjo CHAp išraiška difraktogramose. Naudojant kalcio fosfato zolių-gelių tirpalą, ant silicio nitrido (Si3N4) substrato sėkmingai sintezuotos CHAp dangos.

5.2.1.1 pav. Padengtų paviršių rentgeno spindulių difrakcinė analizė (XRD). XRD kreivės: (A) 30 sluoksnių kalcio hidroksiapatitas (CHAp) (mėlyna kreivė); (B) 20 sluoksnių CHAp (raudona kreivė); (C) 10 sluoksnių CHAp (juoda kreivė).

5.2.2. Kalcio hidroksiapatito dangų paviršiaus morfologijos tyrimai Remiantis SEM ir AFM mikrografijomis, nustatyta paviršiaus morfologijos priklausomybė nuo dangos sluoksnių kiekio. SEM gauti CHAp dangų vaizdai parodyti 5.2.2.1 pav. Ant Si3N4 substratų, dengtų dešimties sluoksnių CHAp dangomis, matomas CHAp salelių formavimasis (5.2.2.1 pav., A). Paviršiaus morfologija kinta didėjant CHAp sluoksnių kiekiui. Salelių formavimasis išlieka ir atlikus 20 padengimų (5.2.2.1 pav., B), tačiau, padidėjus sluoksnių skaičiui, pradėjo formuotis įtrūkimai. Dar labiau pastebimi įtrūki- mai pasidarė po 30 padengimų serijos (5.2.2.1 pav., C). Įtrūkimai jungėsi tarpusavyje ir formavo tinklą.

5.2.2.1 pav. Skenuojančio elektroninio mikroskopo (SEM) mikrografijos. Padengimai: (A) 10 sluoksnių CHAp danga; (B) 20 sluoksnių CHAp danga; (C) 30 sluoksnių CHAp danga.

AFM patvirtino SEM tyrimo rezultatus. Įtrūkimų kraštai nustatyti AFM mikrografijose CHAp dangose, gautose atlikus 20 ir 30 įmerkimo ciklų (5.2.2.2 pav.). Taip nustatytas visų trijų CHAp dangų porėtumas.

5.2.2.2 pav. Atominės jėgos mikroskopo (AFM) mikrografijos. Padengimai: (A) 10 sluoksnių CHAp danga; (B) 20 sluoksnių CHAp danga; (C) 30 sluoksnių CHAp danga.

5.2.3. Kalcio hidroksiapatito dangų vandens kontaktinis kampas Šių matavimų rezultatai yra apibendrinti 5.2.3.1 lentelėje. Tiriant sinte- tintus mėginius, kuriems atlikta 10, 20 ir 30 įmerkimo ciklų, WCA reikšmės nustatytos intervale tarp 92–100°. Didžiausias WCA gautas esant 20 sluoks- nių, o mažiausias – esant 30 sluoksnių dangai.

5.2.3.1 lentelė. Kalcio hidroksiapatito (CHAp) skirtingo storio dangų vandens kontaktinis kampas (WCA), vidurkiai ir standartinis nuokrypis (SN). Aprašomoji statistika 10 CHAp 20 CHAp 30 CHAp WCA Mėginių skaičius 10 10 10 Vidurkis (laipsniai °) 97,2±1,1 100,3±3,5 93,4±1,0 Atlikti matavimai po padengimo 10, 20 ir 30 sluoksnių CHAp danga.

5.2.4. Biokeraminių itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato dangų formavimas Taikant zolių-gelių metodą, pagal B protokolą poliruoti titano lydinio paviršiai padengti 1 sluoksnio 3YSZ ir LS2 nano dangomis. 5.2.4.1 paveiksle keraminių 3YSZ ir LS2 dangų susidarymas ant substrato nustatytas rentgeno difraktometru, pagal kurio pikus matoma, kad ant substratų formuojasi būtent cirkonio oksido (mėlynai) ir ličio disilikato (raudonai) dangos. Abiem atvejais buvo gautos vienfazės kristalinės dangos. 3YSZ dangos atveju stebimos XRD smailės atitinka tetragonalinę ZrO2 fazę. Matomos LS2 dangos XRD difrakcijos smailės gali būti siejamos su ortorombine ličio disilikato faze Li2Si2O5 (kristalinė LS2 forma). LiSiO3 fazė, dažniausiai randama ličio sili- kato stiklo keramikoje, šiuo atveju nebuvo aptikta. Abejose XRD difraktogramose užfiksuotas žalias pikas, rodantis titanui būdingas chemines savybes. Svarbu pažymėti, kad LS2 dengto Ti difrakcijos smailė, atitinkanti [040] plokštumą, buvo intensyvesnė, nei tikėtasi, o tai gali parodyti, kad susidarė šiek tiek tekstūruota ličio disilikato kristalų orientacija. Šie abiejų paviršių duomenys patvirtino, kad monofazinės 3YSZ ir LS2 dangos buvo gautos naudojant zolių-gelių metodą.

5.2.4.1 pav. Padengtų paviršių XRD analizės. XRD kreivės: (A) Itriu stabilizuotu cirkonio oksidu padengto titano lydinio (Ti-3YSZ) paviršiuje mėlynai pažymėti itriu stabilizuoto cirkonio oksido (ZrO2) ir žaliai – titano (Ti) sukeliami virpesiai; (B) Ličio disilikatu padengto titano lydinio Ti-LS2 paviršiuje raudonai pažymėti stebimi Li2Si2O5 ir žaliai – Ti sukeliami virpesiai.

5.2.5. Biokeraminių dangų paviršiaus morfologijos tyrimai Ti-3YSZ ir Ti-LS2 biokeraminių dangų morfologijos vertinimas atliktas SEM. Abiejose nuotraukose stebimas tolygus dangų pasiskirstymas. 5.2.5.1 pav. (A) matomi smulkūs, pavieniai, tinklo neformuojantys 3YSZ dangos įtrū- kimai, tačiau absoliučiai vientisa ir taisyklinga LS2 danga 5.2.5.1 pav. (B). Visi nustatyti įtrūkimai nebuvo didesni kaip 1 µm. Didesniu didinimu stebimi keraminių dangų kristalitai. 3YSZ dangos susideda iš vienodo nano dydžio dalelių sluoksnio, tuo tarpu LS2 turi mikroninius klasterius, pasižyminčius skirtingai orientuotomis nano dydžio dalelėmis ir (arba) stiklo faze. Abiejų biokeraminių dangų dalelių dydis buvo mažesnis nei 10 nm, tačiau tikslaus kristalito dydžio nustatymą ribojo prietaiso skiriamoji geba. 5.2.5.1 pav. (C ir D) stebimi abiejų dangų skerspjūviai. Nustatyti 3YSZ ir LS2 dangų storiai buvo atitinkamai 182 nm ir 159 nm, o vientisas ir tolygus storio pasiskirstymas matomas visame pjūvyje.

5.2.5.1 pav. SEM mikrografijos. Paviršiai: (A) Ti-3YSZ; (B) Ti-LS2; (C) 3YSZ dangos skerspjūvis; (D) LS2 dangos skerspjūvis.

5.3. Biokeraminių dangų fizikocheminių savybių vertinimas

5.3.1. Biokeraminių dangų ir titano lydinio paviršiaus šiurkštumas Atlikus pagal B protokolą poliruoto titano paviršiaus padengimą biokeramikomis, sumažėja substrato paviršiaus šiurkštumas (p<0,05) (5.3.1.1 pav.). Pritaikius 3YSZ dangą, palyginus su Ti (Sa = 17,67±0,35 nm), paviršiaus šiurkštumo sumažėjimas buvo nedidelis, tačiau statistiškai reikšmingas (Sa = 16,61±0,52 nm, p = 0,0003). Po padengimo LS2 danga šiurkštumas sumažėjo dar ženkliau (Sa = 9,61±0,66 nm, p<0,0001). Pagal AFM mikrografijas, vertinant paviršiaus morfologiją, aiškiai stebimas kristalitų formavimasis ir augimas (5.3.1.2 pav.). Taip pat nustatyta, kad formuojantis kristalinėms dangoms, lygėjo paviršiaus reljefas ir užsipildė po poliravimo likę įbrėžimai.

5.3.1.1 pav. Paviršių šiurkštumai pateikti Sa vidurkiais ir SN. Daugybinių Tukey testo palyginimų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „***“ – p = 0,0003; „****“ – p<0,0001.

5.3.1.2 pav. AFM mikrografijos. 2D (a, c, e) ir 3D (b, d, f) skenavimo rekonstrukcijos. Sa pateiktas vidurkiais ir SN.

5.3.2. Biokeraminių dangų ir poliruoto titano lydinio paviršių vandens kontaktinis kampas ir laisvoji energija Po padengimo biokeraminėmis dangomis, lyginant su substratu (Ti 60,21±1,58°), 5.3.2.1 paveiksle stebimi beveik dvigubai sumažėję WCA ro- dikliai. Tiek po padengimo 3YSZ, tiek LS2 biokeramikomis, paviršiaus WCA statistiškai reikšmingai sumažėjo (p<0,0001) ir mažiausias buvo ant Ti-LS2 paviršiaus (25,71±1,33°, p<0,0001).

5.3.2.1 pav. Paviršių WCA pateikti vidurkiais ir SN. Daugybinių Tukey testo palyginimų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „****“ – p<0,0001.

Suminė SFE, po padengimo biokeramikomis, statistiškai reikšmingai pa- didėjo abiejose grupėse, o didžiausia buvo Ti-LS2 grupėje (65,70±1,00 mN/m, p<0,0001) (5.3.2.2 pav.). Abi biokeraminės dangos ryškiai padidino polinį SFE komponentą (p<0,0001).

5.3.2.2 pav. Dispersinės (juodas įrėminimas) ir polinės (raudonas įrėminimas) SFE matavimų rezultatai pateikti vidurkiais ir SN. Suminę SFE atspindi visas stulpelis. Taikant daugkartinius Tukey testo palyginimus, suminių SFE reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „****“ – p<0,0001.

5.4. Biokeraminių dangų biologinių savybių vertinimas

5.4.1. Baltymų adsorbcija ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių Siekiant kiekybiškai įvertinti baltymų adsorbciją ant paviršių, mėginiai buvo inkubuojami 24 val. FBS. Po to nuo paviršių nuplautas ir pamatuotas ant mėginių paviršiaus nusėdusių baltymų kiekis (5.4.1.1 pav.). Gauti rezultatai rodo, kad daugiausia baltymų adsorbavo polimero PEEK paviršius (0,44±0,03). Statistiškai reikšmingai mažesnė adsorbcija fiksuota ant ZrO2 (p = 0,0033) ir kitų paviršių (p<0,0001). Mažiausia baltymų adsorbcija nustatyta ant poliruoto titano paviršiaus (0,31±0,01), tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo, lyginant su Ti-3YSZ grupe (0,33±0,04, p≥0,05), negauta. Taip pat statistiškai reikšmingai nesiskyrė vidutinę adsorbciją demonstravę Ti-LS2 (0,37±0,01) ir PMMA (0,37±0,01) paviršiai (p≥0,05).

5.4.1.1 pav. Baltymų adsorbcija ant mėginių paviršiaus atlikta matuojant Bradford reagento šviesos sugertį terpėje. Rezultatai pateikti vidurkiais ir SN. Daugybinių Tukey testo palyginimų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „ns“ – p≥0,05; „*“ – p = 0,0135; „**“ – p = 0,0042; „#**“ – p = 0,0065; „#**#“ – p = 0,0019; „**#“ – p = 0,0033. Visi nepažymėti skirtumai, kai p<0,0001.

5.4.2. Biokeraminių dangų ir įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių biosuderinamumas Biosuderinamumo tyrimai atlikti siekiant įvertinti naujai suformuotus paviršius ir palyginti juos su implantų protezavimui įprastai naudojamų me- džiagų biosuderinamumo rodikliais. Poliruotas Ti buvo parinktas kaip kont- rolinė grupė ir rezultatai buvo standartizuoti pagal ląstelių skaičių ant jo. Pagal HGF-1 santykinį ląstelių skaičių, buvo nustatyta, kad visos tyrimui naudotos medžiagos – biosuderinamos (5.4.2.1 pav.). Didžiausias ląstelių skaičius (geriausias biosuderinamumas) nustatytas ZrO2 grupėje (1,08±0,05), tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų nebuvo ir tarp poliruoto Ti (1,00±0,17), bei Ti-3YSZ (0,94±0,12) grupių, lyginant su ZrO2 (p≥0,05). Taip pat tarpusavyje nesiskyrė Ti (1,00±0,17) ir Ti-LS2 (0,87±0,11) grupių biosuderinamumas (p≥0,05). Mažiausias biosuderinamumas nustatytas polimerinės kilmės medžiagų (PMMA – 0,65±0,17 ir PEEK – 0,79±0,06), jis buvo statistiškai reikšmingai mažesnis, lyginant su bet kuria kita grupe (p<0,05). Išimtis – Ti-LS2, kuri statistiškai nesiskyrė nuo PEEK (p≥0,05). Tarpusavyje PMMA ir PEEK taip pat nesiskyrė (p≥0,05).

5.4.2.1 pav. Standartinės kultūros žmogaus fibroblastų (HGF-1), augintų ant mėginių paviršiaus, santykinis ląstelių skaičius. Rezultatai pateikti vidurkiais ir SN. Daugybinių Tukey testo palyginimų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „*“ – p = 0,0135; „**“ – p = 0,006; „#**“ – p = 0,004; „**#“ – p = 0,0024; „****“ – p<0,0001. Visi nepažymėti skirtumai „ns“ – p≥0,05.

5.4.3. Dantenų fibroblastų adheziniai plotai ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių HGF-1 ląstelių plitimas ir tvirtinimasis prie paviršių įvertintas suskai- čiavus ląstelių plotą po 2 ir 24 valandų auginimo. Ant visų paviršių CLSM buvo atsitiktinai fotografuotos imunocitocheminiais markeriais dažytos HGF-1 ląstelės. Jų užimamas plotas skaičiuotas pagal nudažytą atsidėjusį F- aktiną, matomą 5.4.3.1 paveiksle. Stebint ląstelių elgseną, atliktas nuotraukų kokybinis vertinimas. HGF-1 adhezijos rezultatai rodo, kad visi tirti paviršiai buvo patrauklūs ląstelių prisitvirtinimui. Įvertinus HGF-1 užimamo pavir- šiaus ploto pokyčius (nuo jų išsėjimo praėjus 2 ir 24 val.), galima matyti, kad ant visų tirtų mėginių ląstelių plotas didėjo. Ląstelės keitė savo citoskeleto formą, plėtėsi, plokštėjo. Taip pat vizualiai stebėtos palyginti mažesnės ląstelės ant PEEK ir PMMA grupių paviršių po 2 valandų. Po 24 valandų labiausiai verbstiškos ląstelės stebimos ant Ti-LS2 paviršiaus.

5.4.3.1 pav. Ant mėginių paviršiaus augintų HGF-1 nuotraukos atliktos konfokaliniu lazeriniu skenuojančiu mikroskopu (CLSM). Imunocistochemijos metodu vizualizuoti: ląstelių branduoliai (dažyti mėlynai DAPI) – ląstelių kiekio skaičiavimui; F-actino filamentai (dažyti raudonai tetrametil rodamino izotiocianatas (TRITC) konjuguotu faloidinu) – ląstelių ploto skaičiavimui. Ląstelių elgsenos vertinimas po 2 ir 24 valandų nuo išsėjimo.

Po 2 valandų didžiausias ankstyvosios ląstelių adhezijos plotas nustatytas ant Ti-3YSZ paviršiaus (1789 μm2, p<0,0001) (5.4.3.2 pav.). Taip pat nebuvo statistinio skirtumo ir tarp Ti (1572 μm2) bei Ti-LS2 (1507 μm2) paviršių (p≥0,05), nors ląstelių adhezijos ploto vidurkis buvo mažesnis. Mažiausias plotas suskaičiuotas ant PEEK paviršiaus (581,8 μm2), tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo ir ant PMMA paviršiaus (648,6 μm2) (p≥0,05).

5.4.3.2 pav. HGF-1 adhezija ant mėginių. Ląstelių plotų matavimai po 2 ir 24 valandų auginimo. Rezultatai pateikti vidurkiais ir SN. Daugybinių Tukey testo palyginimų tarp abiejų laiko periodų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „*“ – p = 0,0232; „****“ – p<0,0001; „ns“ – p≥0,05.

Po 24 valandų ant Ti-3YSZ paviršiaus taip pat fiksuotas didžiausias pri- sitvirtinusių HGF-1 ląstelių plotas (2630 μm2), kuris statistiškai reikšmingai 2 nesiskyrė ir ant ZrO2 paviršiaus (2515 μm ) (p≥0,05). Mažiausias ląstelių plotas ir po 24 valandų stebimas ant PEEK paviršiaus 1534, tačiau, palyginus, statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo ir tarp nežymiai didesnius plotus turėjusių PMMA (1847 μm2) ir Ti-LS2 paviršių (1888 μm2) (p≥0,05). Lyginant adhezijos pokyčius grupėse po 2 ir po 24 valandų, visose grupėse padidėjo ląstelių prisitvirtinimo plotas, tačiau ploto prieaugis Ti-LS2 grupėje buvo mažiausias ir statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo ploto po 2 valandų (p≥0,05). Ant polimerų adhezijos plotas po 24 valandų didėjo sta- tistiškai reikšmingai (p<0,0001), tačiau pasiekė tik panašų adhezijos plotą, koks buvo nustatytas ant Ti-3YSZ jau po 2 valandų.

5.4.4. Dantenų fibroblastų fokalinės adhezijos ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių Ląstelių adhezijos stiprumo vertinimui buvo atliekamas imunocitocheminiais markeriais žymėto vinkulino sankaupų (sutelktinių arba fokalinių adhezijų) skaičiavimas ląstelėje. 5.4.4.1 pav., po 2 valandų nuo išsėjimo, ląstelės periferijoje stebimi žalių dažų židiniai, rodantys, kad ląstelės pradėjo formuoti FA ant visų tirtų paviršių. Vertinant kokybiškai ląstelių elgseną po 24 valandų, stebimas mažesnis dažyto vinkulino susitelkimas ląstelėse ant PEEK ir PMMA paviršių, lyginat su kitomis grupėmis po tiek pat laiko.

5.4.4.1 pav. Ant mėginių paviršiaus augintų HGF-1 nuotraukos atliktos CLSM. Imunocitochemijos metodu vizualizuoti: ląstelių branduoliai (dažyti mėlynai DAPI) – ląstelių kiekio skaičiavimui; vinkulinas ir jo suformuotos fokalinės adhezijos (dažytos žaliai Alexa Fluor 488) – FA skaičiavimui. Ląstelių elgsenos vertinimas po 2 ir 24 valandų nuo išsėjimo.

Kiekybiškai FA ant medžiagų paviršiaus išreikštos ląstelių tankio ir adhe- zijų skaičiaus pasiskirstymo grafikais po 2 ir 24 valandų ląstelių auginimo (5.4.4.2 pav.). Grafikai po 2 valandų rodo, kad ant PEEK ir PMMA paviršių didžioji dalis ląstelių neformavo FA arba formavo jų labai nedaug (5.4.4.2 pav., D ir F). Abiejų grafikų projekcijos buvo itin panašios ir parodė, kad abiejų polimerų paviršiai nebuvo patrauklūs ląstelių ankstyvajam prisitvirtinimui. Taip pat ant šių paviršių buvo nustatyti mažiausi FA vidurkiai ląstelei: PEEK 5,15±0,74 ir PMMA – 5,76±0,93, kurie statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo visų kitų grupių (p<0,0001) (5.4.4.1 lentelė). Ant Ti-3YSZ paviršiaus ištirtas platus įvairaus kiekio adhezijas formuojančių ląstelių spektras (5.4.4.2 pav., C).

Ląstelės gana tolygiai pasiskirstė grafike, panašia gausa formuodamos FA nuo 0 iki 100. Šioje grupėje tendencingo ląstelių susikoncentravimo pagal FA nestebima, o FA vidurkis ląstelėje 28,00±3,76. Ti-LS2 grupėje didžiausia ląstelių koncentracija buvo 15–20 FA intervale, ZrO2 FA koncentravosi ties ~35 ir didžiausios FA nustatytos Ti grupėje (FA koncentracija ~50). Tačiau tiek ZrO2, tiek Ti grafikai atkartoja Ti-3YSZ grafiko dalį, rodančią daugiausia FA turinčių ląstelių koncentraciją ir visų trijų, daugiausiai adhezijų formuo- jančių, grupių ląstelių koncentracija buvo labai panaši (p≥0,05). 5.4.4.1 lentelė. Aprašomoji statistika fokalinių adhezijų koncentracijos vidur- kio ląstelėje (FA) po 2 ir 24 val. (vidurkis±standartinis nuokrypis).

Aprašomoji statistika Ti Ti-3YSZ Ti-LS2 ZrO2 PEEK PMMA FA vidurkis ląstelei 36,16± 28,00± 16,94± 29,02± 5,15± 5,76± (2 val.) 0,79 3,76 1,57 2,42 0,74 0,93 FA vidurkis ląstelei 43,47± 66,75± 26,03± 47,69± 23,45± 28,66± (24 val.) 3,14 4,91 2,98 3,27 3,71 3,67

Grafikai po 24 valandų rodė išliekančią didelę ląstelių, kurios formavo labai silpnas adhezijas ant PEEK paviršiaus, koncentraciją. Tačiau, lyginat su grafiku po 2 valandų, po 24 valandų jau stebimi du FA koncentracijų pikai. Ląstelės pradėjo prisitvirtinti prie paviršiaus ir stebima ląstelių, turinčių net gana stiprias adhezijas. Ląstelių koncentracija didėjo ties ~60 FA. Panašiai elgėsi ląstelės ir ant PMMA paviršių. Didesnioji dalis jų formavo silpnas FA ties ~20, tačiau kita, santykinai mažesnė, ląstelių dalis turėjo stiprias 75–80 FA. Todėl PEEK ir PMMA grupėse ląstelių vėlyvasis prisitvirtinimas geresnis, lyginant su ankstyvuoju. Ti-LS2 FA po 24 valandų taip pat padidėjo ir didžiausia ląstelių koncentracija nustatyta turinti ~25 FA. Tačiau PEEK, PMMA ir Ti-LS2 grupėse FA koncentracijų ląstelėje vidurkiai po 24 valandų, pateikti 5.4.4.1 lentelėje, buvo mažiausi ir tarpusavyje statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p≥0,05). Ant Ti paviršiaus po 24 valandų ląstelių tankio pasiskirstymo pokyčių, formuojant FA, nestebima. Ant ZrO2 paviršiaus vėlyvoji ląs- telių adhezija pagerėjo ir didžiausia ląstelių koncentracija stebima ties ~45 FA. Ti-3YSZ grupėje taip pat didžiausia ląstelių koncentracija stebima ties ~45 FA, tačiau antroji grafiko banga rodo, kad ląstelės koncentruojasi ir formuodamos stipresnes adhezijas. Ant šio paviršiaus stebimas platus įvai- raus kiekio adhezijas formuojančių ląstelių spektras ir daugiausia FA randama taip pat šioje grupėje. Nuo ląstelių išsėjimo praėjus 24 val., daugiausia FA suformavo ląstelės ant Ti-3YSZ paviršiaus, tai stebima ir CLSM nuotraukose, ir kiekybiniuose FA matavimuose. FA koncentracijų vidurkis ląstelei buvo didžiausias (66,75±4,91, p<0,05).

5.4.4.2 pav. Kiekybinis HGF-1 fokalinių adhezijų vertinimas lyginant po 2 ir po 24 valandų po išsėjimo. Rezultatai pateikti ląstelių pasiskirstymo tankio funkcijos histograma. Po dažymo imunohistochemijos metodu, suskaičiuotos ląstelių suformuotos fokalinės adhezijos (dažyta žaliai Alexa Fluor 488) ir branduoliai (dažyti mėlynai DAPI). FA vertintos po 2 ir 24 valandų po išsėjimo: (A) Ti; (B) ZrO2; (C) Ti-3YSZ; (D) PEEK; (E) Ti-LS2; (F) PMMA.

5.4.5. Bakterijų augimas ant biokeraminių dangų ir ant įprastai implantų atramoms naudojamų medžiagų poliruotų paviršių Po 48 valandų inkubacijos, išsėjus suspensiją ant anaerobinio Shaedler agaro, patvirtintas P.gingivalis kultūros buvimas po auginimo. Nuo mėginių paviršiaus nuplovus bakterijas ir įvertinus terpės drumstumą, suskaičiuoti KFV/ml. 5.4.5.1 paveiksle pateikta P.gingivalis kiekybinė bakterijų augimo išraiška. Didžiausia P.gingivalis KFV koncentracija nustatyta ant PMMA paviršiaus ((2,36±0,30)×108 KFV/ml) ir ji statistiškai skyrėsi nuo visų kitų grupių (p<0,0001). Mažiausias KFV koncentracijos vidurkis buvo ant Ti-LS2 paviršiaus ((0,35±0,11)×108 KFV/ml), tačiau statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo ir tarp nežymiai didesnes KFV/ml reikšmes turėjusių Ti-3YSZ 8 8 ((0,46±0,07)×10 KFV/ml) ir ZrO2 grupių ((0,52±0,09)×10 KFV/ml) (p≥0,05). Įdomu, kad palyginus bakterijų KFV koncentraciją tarp poliruoto titano lydinio (Ti), kuris buvo naudotas ir kaip substratas padengimui, grupės, nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai po padengimo. KVF/ml kiekis ant Ti-3YSZ buvo mažesnis nei ant Ti (p = 0,0191) bei dar mažesnis ant Ti-LS2 paviršiaus (p<0,0001).

5.4.5.1 pav. Kiekybinis P. gingivalis KFV/ml augimo vertinimas po 48 valandų inkubavimo standartizuotoje bakterijų suspensijoje. Rezultatai pateikti vidurkiais ir SN. Daugybinių Tukey testo palyginimų tarp abiejų laiko periodų reikšmingas skirtumas, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „*“ – p = 0,0191; „*#“ – p = 0,0142; „**“ – p = 0,0191; „****“ – p<0,0017. Visi nepažymėti skirtumai statistiškai nereikšmingi („ns“ – p≥0,05).

5.4.6. Biologinių ir fizikocheminių paviršių savybių koreliacijos Tarp baltymų adsorbcijos ant paviršių ir ląstelių biosuderinamumo bei tarp bakterijų KFV koreliacijos nebuvo statistiškai reikšmingos (p≥0,05) (5.4.6.1 lentelė).

5.4.6.1 lentelė. Pearson koreliacijos baltymų adsorbcijos ir biosuderinamo bei baltymų adsorbcijos ir bakterijų kolonijų formavimosi eksperimentų rezultatų priklausomybės įvertinimui. Pearson koreliacija Baltymai vs. biosuderinamumas Baltymai vs. bakterijų KFV r –0,16 0,12 p (two-tailed) 0,2171ns 0,3544 ns Koreliacija reikšminga, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „ns“ – p≥0,05.

Įvertinus fizikocheminių ir biologinių savybių koreliaciją, tarp daugelio palygintų grupių buvo stebėtos priklausomybės (5.4.6.2 lentelė). Nustatyta stipri neigiama koreliacija tarp Sa ir biosuderinamumo (r = –0,70, p<0,0001), rodanti, kad didėjant paviršiaus šiurkštumui, mažėja biosuderinamumas bei stipri teigiama koreliacija tarp Sa ir bakterijų kolonijų formavimosi (r = 0,94, p<0,0001), atskleidžianti, kad didėjant paviršių šiurkštumui, didėja ir kolo- nijų formavimasis. WCA ir KFV koreliacija buvo vidutinio stiprumo, teigiama (r = 0,61, p<0,0001). Tai rodo ryšį, kad, didėjant paviršiaus hidrofiliškumui, didėja ir bakterijų kolonijų formavimasis. Kitos koreliacijos buvo silpnos arba statistiškai nereikšmingos (p≥0,05). Suminė SFE koreliavo silpnai arba nekoreliavo su biologinėmis savybėmis, o baltymų kaupimasis koreliavo silpnai arba nekoreliavo su fizikocheminė- mis savybėmis.

5.4.6.2 lentelė. Pearson koreliacijos fizikocheminių ir biologinių eksperimen- tų rezultatų priklausomybės įvertinimui.

Sa vs. Sa vs. Sa vs. Pearson koreliacija biosuderinamumas baltymai bakterijų KFV r –0,70 0,18 0,94 p <0,0001**** 0,1781ns <0,0001**** WCA vs. WCA vs. WCA vs. Pearson koreliacija biosuderinamumas baltymai bakterijų KFV r –0,25 0,43 0,61 p 0,0497* 0,0006*** <0,0001**** Suminė SFE vs. Suminė SFE vs. Suminė SFE vs. Pearson koreliacija biosuderinamumas baltymai bakterijų KFV r 0,06 –0,27 –0,46 p 0,6427ns 0,0395# 0,0002**# Koreliacija reikšminga, kai p<0,05. Statistiniai reikšmingumai pažymėti: „*“ – p = 0,0497; „#“ – p = 0,0395; „***“ – p = 0,0006; „**#“ – p = 0,0002; „ns“ – p≥0,05.

6. REZULTATŲ APTARIMAS

6.1. Paviršių fizikocheminių savybių aptarimas

Implantų atramų paviršių fizikocheminių savybių reikšmė periimplan- tinių audinių sveikatai vis dažniau aptariama mokslinėje literatūroje. Deja, trūksta susistemintų duomenų, kokių savybių ir kokių jų rodiklių turėtų būti siekiama. Manoma, kad didesnis paviršiaus glotnumas (mažesnis šiurkštu- mas) turėtų būti siekiamybė, norint sumažinti bakterinės bioplėvelės forma- vimąsi ir užtikrinti periimplantinių minkštųjų audinių sveikatą. Siekiant sumažinti medžiagų paviršiaus šiurkštumą, dažniausiai naudojamas pavir- šiaus poliravimas. Atlikta nemažai tyrimų, vertinančių poliravimo efektyvu- mą, tačiau juose populiaru naudoti specializuotas poliravimo priemones, labai dažnai nenurodant nei abrazyvo tipo, nei dalelių dydžio, nei rišamosios medžiagos. Kai kuriose studijose galima rasti informacijos apie poliravimui naudojamų priemonių abrazyvumą, tačiau gamintojų pateiki specializuoti poliravimo instrumentai tinkami tik tam tikrai medžiagai [101]. Kita vertus, trūksta ir studijų, lyginančių skirtingos prigimties medžiagų savybes. Taigi, nepaisant metodikos paprastumo, mokslinėse duomenų bazėse randami duomenys apie protezavimui naudojamų medžiagų poliravimą gana hetero- geniški. Siekiant standartizuoto paviršių poliravimo ir studijų atkartojamumo, naudotas abrazyvinis popierius, pradedant šiurkštesniu ir baigiant glotnesniu (smulkesniu abrazyvu). Autoriai, poliravimui naudoję SiC abrazyvinį popie- rių, kaip ir šio tyrimo A protokole, poliravimą užbaigdavo P4000 (5 µm) šiurkštumu, tačiau studijose nepateikiama informacija apie tarpiniams eta- pams naudotą šiurkštumą ir poliravimo eigą [44, 53, 54, 89]. Sudarant B poliravimo protokolą, buvo įtrauktas papildomas poliravimo etapas, naudojant P5000 (4 µm) SiC abrazyvinį popierių. Galutiniam blizginimo etapui atliktų studijų autoriai naudojo silicio dioksido koloidinę suspensiją (0,5 µm), o šiame tyrime buvo pasirinkta kliniškai labiau pritaikoma deimantinė poliravimo pasta. Biomedžiagų paviršių morfologijos aprašymui, kaip vienas tinkamiausių įrankių, pasirinktas AFM [176], o paviršiaus šiurkštumui išreikšti – plačiai naudojamas Sa parametras [104]. Poliravimo efektyvumo tyrimo rezultatai parodė, kad šiurkštumas priklauso nuo medžiagos tipo ir nuo poliravimo protokolo. Buvo pastebėtos tendencijos, kad tiek naudojant A, tiek B poliravimo protokolą, efektyvumą lėmė medžiagos tipas. Mažiausią šiurkštumą turėjo ZrO2, kurio kietumas ir literatūroje nurodomas didžiausias, pagal Vickers ~1251 kg/mm2 [87], kitų tirtų medžiagų šiurkštumas didėjo, o

kietumas mažėjo: Ti ~341 kg/mm2 VHN [166], PEEK ~31 kg/mm2 [87], PMMA ~20 kg/mm2 [2]. Poliravimas pagal B protokolą statistiškai reikšmin- gai sumažino paviršiaus šiurkštumą Ti, ZrO2 ir PEEK grupėse (p<0,0001). Skirtumai tarp Ti ir ZrO2 paviršių šiurkštumo gali būti siejami su medžiagos kilme bei paviršiaus kietumu, kuris turi įtakos poliravimo efektyvumui. Poliravimo efektyvumas atsispindėjo ir paviršiaus WCA pokyčiuose. Po paviršių poliravimo pagal B protokolą, trijose iš keturių standartiškai implan- tų protezavimui naudojamų medžiagų grupių, statistiškai reikšmingai mažėjo WCA (p<0,05). Įprastai, priklausomai nuo medžiagos cheminės sudėties, priklauso jos hidrofiliškumas ir, manoma, kad polimerinės kilmės medžiagų paviršius yra hidrofobiškesnis, lyginant su neorganinės kilmės medžiagų paviršiais [158]. Po poliravimo pagal A protokolą, šiame tyrime nustatytos taip pat didžiausios WCA reikšmės ant polimerinės kilmės PMMA paviršiaus (p<0,0001). Įdomu tai, kad kitas tirtas polimerinės kilmės paviršius (PEEK), po poliravimo pagal A protokolą, turėjo mažiausią WCA (p<0,0001), tačiau nesikeitė priklausomai nuo poliravimo protokolo (p≥0,05) ir, po poliravimo pagal B protokolą, paviršiaus WCA buvo didžiausias. Šis fenomenas galėjo atsirasti dėl medžiagos kompozitinės sudėties, kadangi PEEK turėjo 30 proc. TiO2 užpildo. Tikėtina, kad poliravimo metu atsidengusių užpildo dalelių/polimero santykis paviršiuje galėjo lemti WCA sumažėjimą po poliravimo pagal A protokolą, kuris nebesikeitė atlikus poliravimą pagal B protokolą. Poliravimo efektyvumą, lyginant A ir B protokolus, taip pat parodė SFE išmatuoti pokyčiai. Pritaikius B protokolo eiliškumą, buvo nustatytas SFE statistiškai reikšmingas padidėjimas visose tirtose grupėse (p<0,0001). Viso- se grupėse, išskyrus PEEK, padidėjo ir polinė SFE, o tai vėlgi galėjo lemti kompozitinė sudėtis. Dėl geresnių fizikocheminių savybių, tolimesniems eksperimentams naudoti pagal B protokolą poliruoti mėginiai. Padengimui 3YSZ ir LS2 dangomis, taip pat buvo pasirinkti pagal B protoklą poliruoti Ti substratai. CHAp – labiausiai gyvuosiuose organizmuose paplitusi biokeramika, kuri didžiąja dalimi yra skeleto ir dantų neorganinis komponentas [26]. Bio- medicininiais tikslais dažnai naudojama CHAp sintetinė forma, o CHAp dangos taikomos implantų paviršiaus padengimui biomimetiniais tikslais. Taip pat ši medžiaga sėkmingai pritaikyta ir padengimui, naudojant zolių-gelių metodą [192], tačiau šis metodas ant lygių paviršių dar nebuvo išbandytas. Dėl pastarosios priežasties, šiame tyrime zolių-gelių padengimo efektyvumo vertinimui buvo naudoti standartizuotai lygaus paviršiaus Si3N4 substratai. Pagal gautus kokybinius morfologinius tyrimų rezultatus, galima teigti, kad 20 ir 30 sluoksnių CHAp dangos trūkinėjo ir įtrūkimai ryškėjo didėjant dangų sluoksnių skaičiui. Įtrūkimus galėjo sukelti terminio išsiplėtimo neatitikimas tarp dangos ir mėginio. Sluoksniams storėjant, jie tampa labiau pažeidžiami

nuo išsiplėtimo ir susitraukimo svyravimų. Dėl struktūrinio vientisumo de- fektų, šių dangų tolimesnis tyrinėjimas buvo netikslingas. 10 CHAp sluoks- nių danga demonstravo vientisumą, tačiau paviršiaus porėtumas, kuris buvo ir kitose grupėse, taip pat netinkama savybė implantų atramų paviršiui, nors galėtų būti pritaikoma pačių implantų paviršiaus padengimui [106,133]. Salelių formavimasis rodo netolygią kristalų pasiskirstymo koncentraciją visose trijose grupėse. Bet to, remiantis WCA, visos dangos demonstravo hid- rofobinį charakterį. Taigi, nepaisant sėkmingo zolių-gelių metodo pritaikymo CHAp dangos sintezei ir paviršiaus padengimui, dėl morfologinių savybių, ji plačiau šiame darbe nebebuvo tyrinėta. Zolių-gelių dangų paruošimo principas buvo taikytas kitų biokeraminių dangų paruošimui. Poliruoto Ti substrato paviršius buvo padengtas vieno sluoksnio 3YSZ ir LS2 biokeraminėmis dangomis. Abiejų dangų formavimasis buvo patvirtintas XRD, kuriuo nustatytos fazinės 3YSZ ir LS2 formos ant poliruoto titano lydinio paviršiaus, patvirtinusios kristalų formavimąsi. SEM rezultatai atskleidė dangų morfologinius skirtumus. 3YSZ sluoksnis nebuvo tolygus ir turėjo submikroninių įtrūkimų, o LS2 danga jokių įtrūkimų neturėjo. Tokį rezultatą galėjo lemti fazinės dangų formos: gamtoje natūrali 3YSZ būsena yra visiškai kristališka, o LS2 paprastai yra stiklo keramika (pusiau amorfinė fazė), todėl skiriasi šių medžiagų kristalizacijos mechanizmas ir kinetika. Tačiau, priešingai nei kitame tyrime, kuriame buvo naudota visiškai kitokia metodika 3YSZ dangai [84], šiame darbe nustatytų pavienių įtrūkimų Ti-3YSZ paviršiuje negalime sieti su fazine transformacija iš tetra- gonalinės į monoklininę. Šioje studijoje XRD tyrimas patvirtina būtent tetra- gonalinę fazę, todėl įtrūkimų formavimasis labiau tikėtinas dėl skirtingų susitraukimo koeficientų, o ne dėl fazės pokyčių. Skirtingi medžiagų susitraukimo koeficientai lemia šiluminių įtempių susidarymą medžiagų kontakte aušinimo metu [107]. Taip pat nereikėtų atmesti ir galimos priemaišų įtakos lydinyje [67]. Svarbu pabrėžti, jog XRD tyrimu nenustatytas titano oksido ar mar- tensito formavimasis po dangomis, ko tikėtasi viršijus Ti6Al4V lydinio fazės transformacijos temperatūrą [54]. Tai tik patvirtina, kad abejais atvejais neįvyko nepageidaujamas Ti lydinių substratų oksidavimasis, kuris kai kuriose situacijose gali sukelti viršutinio keramikos sluoksnio skilinėjimą. XRD virpesių, fiksuojančių titano lydinį, dažnis ir intensyvumas Ti-3YSZ ir Ti-LS2 grupėse nesiskiria, todėl galima teigti, jog šios dangos efektyviai apsaugo Ti lydinio paviršių, sumažindamos galimybę į aplinką išsiskirti lais- viesiems Al ar V jonams, kurie skatintų alergines reakcijas [139]. Pavieniai submikroniniai 3YSZ įtrūkimai stebimi dangos paviršiuje, tačiau dangos vientisumas nepažeistas.

Aptartų dangų sintezė, pasitelkiant zolių-gelių metodą, unikali ir tuo, kad keramikų kristalinei fazei formuotis pakako žemesnės temperatūros, nei to paties tipo odontologijoje naudojamoms kietos formos keramikoms. Frezuo- jamai pusiau kietos formos (presinterizuotai) YSZ keramikai po frezavimo reikalinga sinterizacija aukštoje temperatūroje. Sinterizacijos metu įgreiti- namos dalelės ir, cirkonio oksido kristalitams prisijungiant itrį, stabilizuo- jama tetragonalinė T-YZP cirkonio oksido forma. Taikant zolių-gelių meto- diką, kristalinės formos cirkonio dalelės nenaudojamos. Šiam metodui reikalingi skystos fazės reagentai, kurie nuosekliai maišomi skystoje formoje, etapiškai vykstant reakcijomis, todėl fazinio formavimosi temperatūros yra žemesnės. Atlikta ne viena studija, kurioje gauti rezultatai parodo, jog tetragonalinis YSZ gali būti išgautas esant 500 °C [138, 213], o Li2Si2O5 – esant 550 °C [110, 195, 209] temperatūrai. Todėl atliekant tyrimą prireikė žemesnės temperatūros, nei sinterizuojant standartinę YSZ miltelių pagrindo keramiką ir ji buvo parinkta atsižvelgiant į titano lydinių fazių kitimo tempe- ratūras. Vertinant fizikochemines savybes po padengimo, tyrimo rezultatai atskleidė tendenciją, jog, panaudojus dangas, paviršių šiurkštumas sumažėjo, nes jų dalelės užpildė ir uždengė paviršiuose esančius nelygumus ir po poliravimo likusius įbrėžimus. Lyginant su pagal B protokolą poliruoto Ti paviršiumi (Sa = 17,67±0,35 nm), po padengimo labiausiai šiurkštumas ma- žėjo Ti-LS2 grupėje (Sa = 9,61±0,66 nm, p<0,0001), o Ti-3YSZ grupėje skirtumas buvo mažesnis (Sa = 16,61±0,52 nm, p = 0,0003), ką taip pat galėjo lemti kitoks dangos kristalizavimosi mechanizmas. Deja, abi medžiagos nepasiekė tokio mažo paviršiaus šiurkštumo, kaip gerai išpoliruotas ZrO2 paviršius (Sa = 5,53±0,21 nm, p<0,0001). Taigi, idėja dengti paviršius dangomis gali turėti perspektyvių galimybių, siekiant sumažinti metalinių lydinių paviršių šiurkštumą ir taip paskatinti jų naudojimą dantų implantų protezavimui bei kitiems biomedicininiams tikslams. Šiame tyrime naudotas Ti lydinio paviršiaus padengimas biokeraminė- mis dangomis statistiškai reikšmingai sumažino paviršių WCA (p<0,0001). Tai siejama su cheminiais ir morfologiniais paviršių pokyčiais. Šios dangos sudarytos iš nano dydžio kristalinių dalelių, kurios padidina bendrą substrato paviršiaus plotą. Remiantis atliktais WCA matavimais, didžiausias hidrofiliš- kumas buvo Ti-LS2 grupėje (p<0,0001), o tai galėjo lemti paviršiuje susifor- mavę Li jonai, dėl kurių galimai stipriai padidėjo paviršiaus poliškumas bei hidrofiliškumas. Pritaikytas Ti substrato padengimas biokeraminėmis 3YSZ ir LS2 dangomis leido dar padidinti paviršiaus suminę SFE (p<0,0001) ir ypatingai jos polinę dalį (p<0,0001). Visgi, siekiant įvertinti fizikocheminių savybių reikš- mę biologiniam panaudojimui, paviršiai taip pat turi būti biosuderinami.

6.2. Paviršių biologinių savybių aptarimas

Tyrimams su ląstelėmis buvo naudota standartinė HGF-1 ląstelių kultūra. Pirmiausia, dantenų fibroblastai buvo parinkti todėl, kad tai pagrindinės periimplantiniame jungiamajame audinyje randamos ląstelės, kurios turi diferen- ciacijos galimybes. Antra, standartinė kultūra neapriboja eksperimentų pa- kartojimo ir leidžia lyginti tyrimų rezultatus su kitose studijose gautais duomenimis. Biosuderinamumo vertinimas buvo atliktas pagal B protokolą poliruotų įprastai implantų protezavimui naudojamų medžiagų ir naujų eksperimenti- nių Ti-3YSZ ir Ti-LS2 paviršių. Šiame tyrime buvo nustatytas aukštas tirtų eksperimentinių biokeraminių dangų biosuderinamumo lygis. Jis buvo pana- šus ar net aukštesnis, nei įprastai protezavimui naudojamų, komerciškai prieinamų medžiagų, o tai leidžia palankiai vertinti šios technologijos panau- dojimą ir pritaikymą biomedicininiais tikslais bei dantų implantų protezavime. Naujų paviršių grupėse nebuvo nustatyta jokio citotoksinio poveikio, kurį sukeltų cheminė sudėtis, jos nestabilumas ar dangų paviršiaus morfologija. Kita vertus, lyginant su kitomis tiriamosiomis grupėmis, nebuvo nustatyta ir biosuderinamumo pagerėjimo. Tyrime įvertintos polimerinės medžia- gos PEEK ir PMMA pasižymėjo mažiausiomis biosuderinamumo vertėmis (p<0,05), tad jos mažiau tinkamos tiesioginiam kontaktui su gyvaisiais audiniais, palyginus su neorganinėmis medžiagomis. Tai gali būti siejama su medžiagų kilme bei jų chemine sandara, pavyzdžiui, PMMA likusiu laisvuoju monomeru [193]. Vis dėlto, tai taip pat gali būti nulemta šių medžiagų hidrofobiškumo [158]. Taigi, nors visos tirtos medžiagos buvo biosuderinamos, neorganinės kilmės medžiagos pasižymi aukštesniu biosuderinamumo laipsniu. Paviršiaus morfologija yra kitas svarbus veiksnys, lemiantis ląstelių elgseną [175]. Šiame tyrime taip pat buvo nustatyta neigiama koreliacija tarp biosuderinamumo ir paviršiaus šiurkštumo (r = –0,70; p<0,0001). Visose tirtose, pagal B protokolą poliruotose, įprastai protezavimui naudojamų me- džiagų grupėse buvo matomas akivaizdus ryšys tarp paviršiaus šiurkštumo ir santykinio ląstelių kiekio. Kai sumažėdavo Sa, padidėdavo santykinis ląstelių skaičius, todėl paviršiaus glotnumo padidėjimas galimai pakeičia tiesioginę sąveiką tarp ląstelių ir substrato. Priešingai, ši tendencija nepasitvirtino su padengtais paviršiais, kur šiurkštumas buvo palyginti žemas. Tai patvirtina, jog nano dalelės pakeičia paviršių savybes ir jų sąveiką su gyvomis ląstelėmis [206]. Ląstelių adhezija ant paviršių – kitas svarbus rodiklis, nuo kurio priklauso audinių gijimo efektyvumas ir dantenų barjero formavimasis [18, 212]. Šio tyrimo metu buvo nustatyta, jog biokeraminėmis dangomis modifikuoti titano

lydinio paviršiai tapo tinkamesni (patrauklesni) ląstelių adhezijai. Padidėjęs ląstelių užimamas paviršiaus plotas parodė prisitvirtinimo prie paviršių dina- miką. Yra žinoma, jog kuo greičiau ląstelės užima didesnį paviršiaus plotą, tuo substratas tinkamesnis ląstelių prisitvirtinimui [90]. Po 2 ir 24 val. laiko periodų, didžiausias HGF ląstelių plotas buvo nustatytas ant Ti-3YSZ pavir- šiaus ir, palyginus su kitomis tirtomis medžiagomis, šis paviršius paskatino greičiausią ląstelių prisitvirtinimą. Greitas ląstelių atsakas ir palyginus didelis paviršiaus plotas taip pat buvo nustatytas ir ant Ti-LS2 paviršiaus po 2 val., tačiau, praėjus 24 val., ląstelių ploto pokytis buvo nedidelis, nepaisant to, jog šis paviršius turėjo mažiausias šiurkštumo ir WCA reikšmes. Visgi, koky- biškai vertinant po 24 val. imunocitohemiškai dažytų ląstelių elgseną CLSM ant Ti-LS2 paviršiaus, buvo stebima HGF-1 dinamika. Ląstelės įgavo verps- tės formą, kurios skirtinguose poliuose koncentravosi aktino ir vinkulino sankaupos, rodančios besikeičiantį citoskeletą ir besiformuojantį ląstelių prisitvirtinimą. Ši ląstelinė elongacija leidžia daryti prielaidą, jog ant minėto substrato ląstelių proliferacija vyksta greičiau, nei ant kitų substratų ir, dėl intensyvios proliferacijos, jos atsiskiria nuo paviršiaus, sudarydamos mažesnį adhezijos plotą bei mažesnį FA kiekį [198, 210]. Tačiau, norint tai įrodyti, reikalingi papildomi ląstelių migracijos ir proliferacijos vertinimo tyrimai. Taigi ant Ti-LS2 palyginus didelis ląstelių adhezinis plotas nustatytas tik po 2 val. Įdomu, jog PEEK ir PMMA paviršiai buvo mažiau patrauklūs ląstelių prisitvirtinimui. Ląstelės paviršiaus ploto matavimo duomenys parodė, jog ant šių mėginių HGF-1 adhezija buvo lėčiausia, taip pat šiose polimerinėse grupėse gautas mažiausias tarp ląstelių susidariusių FA skaičius. Tai galėjo nutikti dėl santykinai hidrofobiško paviršiaus, o ši savybė gali sumažinti paviršiaus tinkamumą ląstelių adhezijai [103] ir minkštųjų audinių integraci- jai [186]. Kita vertus, įdomu tai, kad PEEK paviršius, nepaisant hidrofobinio charakterio, mažiausios suminės paviršiaus laisvosios energijos ir mažiausio polinio jos komponento, geriausiai absorbavo plazmos baltymus. Tačiau, nepaisant efektyvaus substrato pasidengimo baltymais, deja, ląstelės tvirti- nosi ir plėtėsi nežymiai. Kitas svarbus ląstelių prisitvirtinimo prie paviršių rodiklis – FA susidarymas. Jis taip pat parodo substrato tinkamumą ląstelės prisitvirtinimui, o ląstelėje susidariusių FA kiekis parodo ląstelės ir paviršiaus sąveikos stip- rumą [90, 128]. Šioje studijoje ant Ti-3YSZ paviršių augintos HGF-1 ląstelės, palyginus su kitais tirtais mėginiais, po 24 val. sudarė didžiausią kiekį FA. Siejant su fizikocheminėmis paviršiaus savybėmis, svarbu atkreipti dėmesį, kad Ti-3YSZ paviršiai pasižymėjo mažu paviršiaus šiurkštumu, hidrofiliš- komis savybėmis ir didele paviršiaus sumine bei poline laisvąja energija. Priešingi rezultatai gauti tirtose polimerinėse medžiagose – PEEK ir PMMA.

Šiose grupėse nustatytas itin mažas FA tankis ląstelei, rodantis silpną HGF-1 adheziją. Mėginiai pasižymėjo didžiausiu paviršiaus šiurkštumu ir tuo galima paaiškinti mažą susiformavusių FA tankį. Kitos studijos taip pat nustatė, jog FA didėjimas tiesiogiai priklauso nuo paviršių šiurkštumo mažėjimo [123, 150, 196]. Manoma, kad glaudesnį kontaktą tarp ląstelės ir paviršiaus galima išgauti ant lygaus nei ant šiurkštaus paviršiaus [66]. Be to, fibroblastai yra ląstelės, kurios jautrios paviršiaus morfologijos pokyčiams, kadangi pavir- šiaus nelygumai sukelia įtampą ląstelės viduje ir citoskeleto deformaciją [29]. Todėl fibroblastams palankesni lygesni paviršiai. PEEK ir PMMA turi hidrofobiškesnį paviršių nei Ti-3YSZ, o paviršiaus hidrofobiškumas keičia ECM baltymų adsorbciją ir todėl gali pasireikšti silpnesnė FA [5, 217]. Ląste- lių prisijungimas prie paviršiaus yra skatinamas tik ląstelinio atsako į ECM baltymus ant paviršiaus [164], todėl baltymų adsorbcija prie paviršiaus yra svarbus veiksnys FA susidarymui ir glaudžiai susijęs su paviršiaus WCA [66]. Tačiau šiame tyrime koreliacijos tarp baltymų adsorbcijos ir paviršių fizikocheminių savybių nebuvo nustatytos, taip pat neįrodyta ir ląstelių adhezijos priklausomybė nuo ECM baltymų kiekio. Tiriant dantų implantų restauracijoms naudojamų medžiagų biologines savybes, taip pat svarbu įvertinti ne tik ląstelių, bet ir mikroorganizmų elgseną bei jų priklausomybę nuo paviršiaus fizikocheminių savybių. Ribojant bakte- rijų kaupimąsi, paviršiaus šiurkštumas turėtų būti mažesnis nei 0,2 µm [199]. Visgi, kai kuriose studijose nurodoma, jog bakterijos gali kauptis ir ant lyges- nio paviršiaus [7], nors bakterijų kaupimasis yra tiesiogiai priklausomas nuo šiurkštumo [6]. Šiame tyrime nustatyta, kad P. gingivalis kolonijų formavimasis sumažėjo po Ti padengimo abejomis biokeraminėmis dangomis (p<0,05). Tai paaiškina pasikeitusios paviršiaus fizikocheminės savybės. Šiame tyrime bakterijų kolonijų formavimasis stipriai koreliavo su didėjančiu paviršiaus šiurkštumu (r = 0,94, p<0,0001), tai reiškia, kad didėjant paviršiaus šiurkštumui, didėja ir P. gingivalis kolonijas formuojančių vienetų susidarymas. Tokios pat tendencijos stebimos ir kitų autorių in vivo tyrimuose, kuriuose aprašyta teigiama koreliacija tarp podanteninių apnašų kaupimosi ir paviršiaus šiurkštumo [185, 186]. Šiame tyrime taip pat nustatyta vidutinė koreliacija tarp WCA ir KFV (r = 0,61, p<0,0001). Nors esama publikacijų, kuriose rasta koreliacija tarp SFE ir bakterijų augimo [151], tačiau šiame tyrime eksperimentų duomenys koreliavo silpnai (r = –0,46, p = 0,0002).

Šiame tyrime naudotas titano lydinių paviršių padengimas biokerami- nėmis dangomis keitė paviršių fizikochemines savybes ir atitinkamai nulėmė ląstelių bei bakterijų elgseną. Naujai sintezuotos ir pirmą kartą in vitro panaudotos 3YSZ bei LS2 biokeraminės dangos tinkamos pagerinti HGF adhezijos procesus ir sumažinti bakterijų bioplėvelės formavimąsi. Taip pat dangų naudojimas gali padidinti paviršiaus tvirtumą ir atsparumą subrai- žymui [122], tačiau šiam vertinimui reikalingi papildomi tyrimai. Be to, įprastai, jungiamojo audinio susidarymas aplink atramos titaninį paviršių gali užtrukti 4–8 savaites [18, 178, 187]. Šios studijos duomenys parodė perspek- tyvias Ti-3YSZ ir Ti-LS2 paviršių panaudojimo galimybes in vivo tyrimams, siekiant pagreitinti minkštųjų periimplantinių audinių barjero formavimąsi.

IŠVADOS

1. Smulkesnės frakcijos abrazyvo įtraukimas į poliravimo protokolą leidžia pasiekti didesnį poliravimo efektyvumą, nes mažėja paviršiaus šiurkštu- mas, didėja hidrofiliškumas ir laisvoji energija. 2. Zolių-gelių metodas gali būti taikomas ir naudojamas mažo šiurkštumo paviršių padengimui biokeraminėmis dangomis. 3. Zolių-gelių metodą galima taikyti poliruoto titano lydinių padengimui itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato biokeraminėmis dangomis. 4. Itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato biokeraminės dangos sumažina poliruoto titano lydinio paviršiaus šiurkštumą, padidina jo hidrofiliškumą ir laisvąją energiją. 5. Abi naujai sintezuotos ir panaudotos biokeraminės dangos (itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato) yra biosuderinamos. Ląstelių adheziniai plotai ir fokalinės adhezijos parodė, jog itriu stabilizuota cirkonio oksido biokeramikos danga didina ląstelių prisitvirtinimo efek- tyvumą, tačiau ličio disilikato dangos teigiamas poveikis neįrodytas. 6. Abi naujai sintezuotos ir panaudotos biokeraminės dangos (itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato) sumažina Porphyromonas gingivalis kolonijas formuojančių vienetų koncentraciją ant paviršių.

MOKSLINĖS IR PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

1. Moksliniuose tyrimuose naudoti standartizuotos frakcijos abrazyvines medžiagas ir taip užtikrinti studijų aiškumą, duomenų homogeniškumą ir sistemizavimą. 2. Klinikinėje praktikoje vertinti paviršių poliravimo kokybę, kaip svarbų veiksnį, galintį nulemti medžiagų fizikochemines savybes ir biologinius rezultatus. 3. Pasirenkant implantų atramas, dėl geresnių paviršiaus fizikocheminių ir biologinių savybių, pirmenybę teikti neorganinės kilmės medžiagoms. 4. Tęsti sukurtų eksperimentinių itriu stabilizuoto cirkonio oksido ir ličio disilikato biokeraminių dangų tyrimus, siekiant jų pritaikymo kliniki- niam naudojimui. Zolių-gelių metodas gali būti naudojamas ir kitais biomedicininiais tikslais.

SUMMARY

ABBREVIATIONS AFM – atomic force microscope CLSM – confocal laser scanning microscope CAM – contact angle meter CFU – colony-forming unit CHAp – calcium hydroxyapatite DMEM – Dulbecco’s modified Eagle medium DMSO – dimethyl sulfoxide EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid ECM – extracellular matrix FA – focal adhesion FBS – fetal bovine serum HA – hydroxyapatite HGF – human gingival fibroblasts LS2 – lithium disilicate Mfa – McFarland unit PBS – phosphate-buffered saline PEEK – polyether ether ketone PMMA – poly[methyl methacrylate] PVA – polyvinyl alcohol Sa – surface roughness average RPM – revolutions per minute RCC – relative cell count RT – room temperature SEM – scanning electron microscope SFE – surface free energy SiC – silicon carbide SN – standard deviation TEA – triethanolamine Ti – Ti6Al4V titanium alloy TRITC – tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate (3)YSZ – yttria stabilized zirconium oxide XRD – X-Ray diffraction WCA – water contact angle

INTRODUCTION The use of dental implants for the replacement of missing teeth is undoubtedly the best currently available solution, showing the highest success rates. The estimated success rate of dental implants is 95% [60]; however, their long-term functionality should also be taken into consideration. The main indicator of successful functionality is healthy and stable tissue surrounding the implant [145, 162]. An increased focus is being placed on the long-term functionality of dental implants and the prevention of peri-implant

diseases; the peri-implant gingiva barrier is one the most important factors for implant success [34, 181, 221]. First, the gingiva surrounding the implant, similarly to that around a natural tooth, forms an epithelial junction that ensures the hermeticity of the bone-implant junction and provides a mechanical barrier against infections [187]. Furthermore, the soft tissue pos- sesses good immune capacity and biologically inhibits the spread of patho- gens [135, 207]. Therefore, the peri-implant gingiva without a doubt plays an important role due to its barrier-forming function. However, the accumulation of plaque on implants and their prosthetic elements’ surfaces may cause a disruption in the uniformity of the gingiva barrier, and the resultant peri- implant tissue inflammation might cause irreversible pathological bone loss. Regardless of implantation’s high success rates, a clinical research meta- analysis shows that physiologically successful implantation can easily lead to pathological peri-implant soft tissue inflammation – peri-implant mucositis – or its later stage form, peri-implantitis [157]. Peri-implant mucositis occurs in 39% and peri-implantitis in 12–22% of cases during a five-year period [125]. The following are a few of the main reasons for late stage implant complications: causes of bacteriological origin, general health conditions (diabetes and the use of bisphosphonates), smoking, overload, and iatrogenic factors [45, 50, 174]. However, the main cause of peri-implant tissue transfor- mation is the formation of bacterial biofilms on the surface of implant abutments. Dental implant systems have two functional parts that differ in their properties: the root and the coronary prosthetic part. The root of the implant system is the part that comes into direct contact with the bone tissue, and the micro and macro design of its surface has the greatest impact on the maximal implant-bone contact and the formation of osteoblasts and osteointegration [34, 181, 221]. Various methods that increase the roughness of the surface and change its morphology are used for surface improvement. Therefore, the surfaces of the implant’s root areas are usually sandblasted, treated with acid, lasered, or sprayed with plasma [4, 47, 170]. The prosthetic part is in contact with gingival cells at the gingiva level, which protect the root part of the implant from the entry of microorganisms [220]. Therefore, the physicochemical properties of implant abutments are important for ensuring the longevity, proliferation, and adhesion of the gingiva [14, 137] as well as resistance to adhesion and the growth of bacterial biofilms [12, 13, 220]. The physicochemical properties of the implant abutment surface that are important for the health of peri-implant soft tissues from a biological perspec- tive are as follows: surface roughness, water contact angle (WCA), and surface free energy (SFE). These surface properties can be modified by applying different treatment methods. Usually mechanical treatment methods

such as milling or polishing are used for working with abutment surfaces, but surface coating using electrophoresis, plasma spraying, electrochemical, tribochemical, or sol-gel methods are also possible [73, 86]. Nowadays, the modification of surfaces by applying different coatings and coating schemes is becoming more popular [73, 86]. The new surface composition that forms during the process of coating changes the physicochemical properties of the surface. On the other hand, however, coating the surface isolates the substrate without changing its mechanical properties due to the very small substrate-to-coating ratio. Therefore, these methods allow for the modification of surface properties that are as important for the interaction with human tissue cells as for the interaction with bacterial plaque. Manipulations of implant abutment surface properties could be a prospective solution for lowering the risk of peri-implant tissue diseases. There is an increasing tendency to use surface coatings in biomedicine because extremely thin organic and inorganic coatings can be used in tissue engineering.

1. AIM AND OBJECTIVES OF THE STUDY

Aim of the study The aims of the study were to develop a novel bioceramic thin layer coating suitable for coating implant abutments and to research its physicochemical and biological properties in vitro.

Objectives of the study 1. To polish surfaces of different commercially available materials used for implant abutments according to standardized mechanical polishing protocols and evaluate the surfaces’ physicochemical properties, compare them, and use the available data to evaluate the effectiveness of polishing. 2. To use the sol-gel method for synthesis of bioceramic coatings and for coating even surfaces with a thin layer of the coatings. 3. To use the sol-gel method for synthesis of yttria-stabilized zirconium oxide (3YSZ) and lithium disilicate (LS2) coatings to use them for coating a polished titanium alloy surface and perform a qualitative evaluation of the formation of the coating and its chemical composition and morphology. 4. To perform an evaluation of the physicochemical surface properties of these new materials by measuring the roughness of the surface, water contact angle (WCA), and surface free energy (SFE).

5. To evaluate biocompatibility, protein adsorption, cell adhesion area, and focal adhesions on the surface of a polished titanium alloy coated with 3YSZ and LS2 bioceramic coatings using a standard human gingiva fibroblast cell culture in vitro. To compare them against the polished surface properties of conventionally used prosthetic implant materials. 6. To evaluate the development of colony-forming units on the polished surface of a titanium alloy coated with 3YSZ and LS2 bioceramic coatings using a standard monoculture of one of the main bacterial causes of peri-implantitis, Porphyromonas gingivalis in vitro, and compare it against the development of bacterial colonies on the polished surfaces of other conventionally used materials.

2. NOVELTY AND PRACTICAL VALUE OF THE STUDY Peri-implant tissue inflammation is the main expected problem associated with the restoration of chewing function by using dental implants, which requires a long and difficult treatment period. Additionally, this is the most common factor determining the longevity of the implant. The cause of peri-implant tissue inflammation is usually of septic origin and is caused by bacterial plaque; therefore, it is especially important to protect the implant from the colonization of pathological microorganisms on its surface. Usually, a healthy and stable soft tissue barrier serves a protective function; however, the gingiva’s functionality directly depends on the surface properties of the materials used for implant abutments. The novel yttria-stabilized zirconium oxide (3YSZ) and lithium disilicate (LS2) bioceramic coatings for implant abutment surfaces offered in this study could increase the functionality of the peri-implant soft tissue barrier. This study showed that materials conventionally used for dental implant abutments have varying physicochemical surface properties that can be modified using consistent mechanical polishing protocols or adapting surface coating strategies. It also showed that the physicochemical surface properties impact the cellular response to and formation of bacterial colonies. Novel yttria-stabilized zirconium oxide (3YSZ) and lithium disilicate (LS2) bioceramic coatings were synthesized using the sol-gel method and were used successfully for coating a polished titanium alloy. In vitro experiments were used for describing chemical, phase composition, and characte- rizing coatings according to their surface morphology. This study also showed that coating surfaces with bioceramic coatings changes their physicochemical properties.

The performed experiments showed that the 3YSZ and LS2 coatings are biocompatible and reduce the formation of bacteriological colonies. The 3YSZ coating increased the effectiveness and speed of cell adhesion. The in vitro results of this scientific study showed an effective use of bioceramic coatings for implant abutment surface coating, allowing for further development of this method. Both coatings used for this study showed promise for possible clinical application and should be further studied using in vivo models as well as in clinical studies. The application of the newly developed Ti-3YSZ and Ti-LS2 surface materials could be researched broadly in other scientific fields.

3. MATERIALS AND METHODS

3.1. The strategy for polishing surfaces of materials used for implant abutments development and assessment of its effectiveness

3.1.1. Specimen preparation A plate in the shape of a square and size 10×10×0.5 mm was used as specimens for this study. They were milled using the computer-aided design and computer-aided manufacturing system (Dental Concept Systems DC1, Dental Concept Systems GmbH, Ulm, Germany) from commercially available prosthetic materials (Table 3.1.1.1). Samples of the ZrO2 group were additionally sintered in the furnace (Zubler Vario S400, Zubler USA, Dallas, TX, USA) for 2 h at 1450 °C.

Table 3.1.1.1. Data on commercially available dental implant abutment materials used in the experiments. Group Chemical name Commercial name, company Composition, % Ti Titanium alloy Ti6Al4V, DC Titan 5, Dental Ti – 90% Concept Systems GmbH, Ulm, Al – 6% Germany V – 4%

ZrO2 Yttria-stabilized ZrO2 Y-TZP Nacera Pearl, ZrO2 – 92.5% zirconium oxide Doceram Medical Ceramics Y2O3 – 5.5% GmbH, Dortmund, Germany HfO2 – 1.9% Other oxides – 0.1% PEEK Polyether ether ketone BioHPP, Bredent GmbH, PEEK – 70% composite Senden, Germany TiO2 – 30% PMMA Poly(methyl Brecam Universal, Bredent PMMA – 100% methacrylate) GmbH, Senden, Germany

3.1.2. Surface polishing Two mechanical polishing protocols (A and B) were modeled and used for polishing all specimens surfaces. The abrasive particle size (the coarseness of the abrasive paper) was gradually decreased according to a defined sequence during the polishing process as it is shown in the Table 3.1.2.1. The initial surface polishing was performed using silicon carbide (SiC) abrasive paper P2000, P2500, P3000, P4000 (Starcke GmbH and Co. KG, Melle, Germany) and P5000 (TrizactTM, 3M Company, St. Paul, MN, USA) that complies with ISO 6344:3 standards. Each next polishing cycle was done using abrasive paper of a lower coarseness grade. The polishing cycles were performed using semi-automatic metal lathe (Holzmann metal lathe ED3000ECO, Maschinenhandel Gronau Inc., Gehren, Germany) by applying eccentric rotation and water rinsing. The duration of the cycles was 60 s, speed – 3000 RPM. The final surface polishing for groups A and B was performed using diamond polishing paste and natural brush (Zirkopol, Feguramed GmbH, Odenwald, Germany).

Table 3.1.2.1. Data on the polishing strategies used for experiments A and B. Type of abrasive Abrasive Protocol A Protocol B Cycle material size (cycle duration) (cycle duration) 1 P2000 10.30 µm 60 s 60 s 2 P2500 8.40 µm 60 s 60 s 3 P3000 6 µm 60 s 60 s

4 ↓ P4000 5 µm 60 s 60 s 5 P5000 4 µm – 60 s 6 Diamond paste No data 60 s 60 s

3.1.3. Assessment of surface morphology The specimens of surface morphology and roughness parameters of specimens were characterized by using a scanning electron microscope (SEM) (Hitachi SU-70, Hitachi, Ltd., Chiyoda, Tokyo, Japan) and atomic force microscope (AFM) (Agilent 5500 AFM/SPM, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Data of the surface topography and roughness average (Sa) were collected by randomly scanning each sample in three areas. AFM topographic images were recorded in contact mode using a silicon probe with a 10 nm tip radius. Each image was recorded in 256×256 pixel size.

3.1.4. Water contact angle and surface free energy All specimens were all cleaned in 2-propanol and bi-distilled water using sonication. They were then dried for 2 h in a vacuum oven at 50°C. An optical tensiometer (CAM 200, KSV Instruments Ltd., Helsinki, Finland) was used to measure the WCA and SFE. For measurement purposes, bi-distilled water was used in a heavy phase. To measure the WCA of the solvent droplet, a modest drop (4–7 μL) of a particular liquid was placed on a tested substrate at room temperature (RT). The SFE was calculated using the Owens-Wendt method [141].

3.2. The evaluation of surface modification possibilities by using surface coating by sol-gel method

3.2.1. The reagents for surface coating The synthesis was performed using calcium acetate monohydrate (99%, Fluka, Charlotte, NC, USA), 1,2-ethandiol, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (99%, Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA), triethanolamine (TEA) (99%, Merck, Darmstadt; Germany), orthophosphoric acid (H3PO4 85%; Reachem, Chennai, India), and polyvinyl alcohol (PVA) (PVA 70000, 99.5%, Aldrich, Saint Louis, MI, USA) reagents. All reagents were used without any modifications.

3.2.2. The preparation of calcium hydroxyapatite sols

Calcium hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2, [CHAp]) bioceramic coating was synthesizes using sol-gel method and layered on silicon nitride (Si3N4) surface using immersion method. 0.03 mol calcium acetate monohydrate was used as a starting material for preparation of CHAp coating. 0.036 mol of 1,2-ethandiole was added to calcium acetate monohydrate water solution (2.22 mol). The mixture was then stirred for 30 min in 65°C temperature. Then 0.033 mol EDTA was added and another 15 min later 0.113 mol binding reagent TEA was added. The mixture was then stirred for 10 h. After that diluted 0.018 mol orthophosphoric acid was added to the mixture achieving 1.67 calcium/phosphorus ratio. Finally, this solution was mixed with 0.00004 mol PVA dissolved in 5.39 mol water using ratio of 5:3. The prepared sol-gel was used for coating.

3.2.3. Silicon nitride coating with calcium hydroxyapatite

As a substrate for the development of nano coating, non-oxide type Si3N4 ceramic base was used. All specimens were rinsed in an ultrasonic bath according to a defined sequence before the coating: acetone, ethanol, distilled water. Thin multiple layers of CHAp coating were developed on the Si3N4 substrate using dip coating method. Film preparation machine (Dip Coater D, KSV NIMA, Biolin Scientific, Gothenburg, Sweden) was used for immersing the specimens. The used immersion speed was 85 mm/min, the specimen extraction speed was 40 mm/min. The specimens stayed immersed in the gel solution for 20 s. The coated specimens were then heated for 5 h, increasing the temperature by 1°C/min until the temperature of 650°C was reached. Continuous cooling was applied afterwards leaving the specimens in the furnace until the RT was reached. The coating, heating, and cooling stages were repeated 10, 20 and 30 times.

3.2.4. The identification of coatings After this step, prepared coatings were evaluated using X-ray diffraction (XRD) and ready for other experiments. A commercial X-ray diffractometer (Rigaku SmartLab, Rigaku Corporation, Tokyo, Japan) was used for the XRD analysis of deposited coatings. To achieve higher sensitivity, spectra were recorded by employing grazing angle geometry, 0.01 deg. step size, and 1 deg/min scan speed.

3.2.5. The assessment of morphology of coating surfaces Surface morphology and roughness parameters of specimens were characterized using SEM and AFM. Data of the surface topography were collected by randomly scanning each sample in three areas. AFM topographic images were recorded in contact mode using a silicon probe with a 10 nm tip radius. Each image was recorded in 256×256 pixel size.

3.2.6. Water contact angle All specimens were all cleaned in 2-propanol and bi-distilled water using sonication. They were then dried for 2 h in a vacuum oven at 50°C. An optical tensiometer was used to measure the WCA and SFE. For measurement purposes, bi-distilled water was used in a heavy phase. To measure the WCA of the solvent droplet, a modest drop (4–7 μL) of a particular liquid was placed on a tested substrate at RT. The SFE was calculated using the Owens- Wendt method [141].

3.3. Selection of materials used for novel bioceramic coatings, their development and application for coating titanium alloys

3.3.1. The reagents for surface coating Yttrium nitrate hexahydrate (99%) and acetylacetone (AcAc, 99.5%) were purchased from Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO, USA); zirconium propoxide (ZIP, 70% sol. in 1-propanol), lithium methoxide (LiOMe, 2.2M sol. in methanol), and tetramethyl orthosilicate (TMOS 99%) were purchased from Acros Organics (Acros OrganicsTM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). All reagents were used as received. Methanol, ethanol, and iso- propanol were kept on 3A molecular sieves for 48 h and further distilled under dry nitrogen.

3.3.2. Preparation of yttria-stabilized zirconium oxide and lithium disilicate sols The coatings were prepared using the sol-gel process, initially preparing an alkoxide solution of the precursors, followed by spin-coating them on the polished titanium alloy substrate. For the preparation of 3YSZ (by mol% Y2O3) sol, 0.0073 mol of yttrium nitrate hexahydrate and 0.115 mol of ZIP were dissolved in dry 2-propanol solution stabilized with 0.0345 mol of AcAc. To initiate a hydrolysis reaction, 0.23 mol of H2O was added in a final step. For the preparation of lithium disilicate, LiOMe sol 0.01 mol and 0.01 mol TMOS were dissolved in dry methanol, then 0.015 mol of H2O was added in a final step. Both solutions were kept at RT for 24 h, and after that, obtained sols were ready for the spin-coating procedure.

3.3.3. Deposition of yttria-stabilized zirconium oxide and lithium disilicate coatings Prior to the coating procedure, prepared sols were filtered through a 0.2 μm nylon membrane filter. Ti substrates were cleaned with a non-ionic surfactant solution (RBS Neutral T, Carl-Roth) in an ultrasonic bath (Sonorex, BANDELIN electronic GmbH and Co., Berlin, Germany), then thoroughly washed with deionized H2O and 2-propanol and allowed to dry in air. To prepare the desired coating, 50 μL of the corresponding sol was placed on a Ti substrate and spin-coated up to 2000 RPM. Prepared 3YSZ and LS2 coatings were placed in a muffle furnace (SNOL 13/1100, Umega group, Utena, Lithuania) and heated at 600°C for 2 h.

3.3.4. Identification of coatings After this step, prepared coatings were evaluated using XRD and ready for other experiments. A commercial X-ray diffractometer (Rigaku SmartLab, Rigaku Corporation, Tokyo, Japan) was used for the XRD analysis of deposited coatings. To achieve higher sensitivity, spectra were recorded by employing grazing angle geometry, 0.01 deg. step size, and 1 deg/min scan speed.

3.3.5. Surface morphology The specimens surface morphology and roughness parameters of specimens were characterized by using SEM and AFM. Data on the means of the surface topography and roughness average (Sa) were collected by randomly scanning each sample in three areas. AFM topographic images were recorded in contact mode using a silicon probe with a 10 nm tip radius. Each image was recorded in 256×256 pixel size. For evaluation of coating thickness, Si-coated samples were broken in half, and the thickness of sample cross-sections was measured by SEM.

3.4. Evaluation of biological properties of the newly developed coatings

3.4.1. Protein adsorption The protein adsorption of the studied specimens was evaluated using Bradford test [130]. The specimens were immersed into FBS, incubated for 24 h at 37°C and 5% CO2 environment. After that the specimens were twice washed with PBS (PBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) removing the excessive amount of FBS. Bradford reagent was poured over the specimens after their washing (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) and the optical density of the formed solution was measured using plate reader (Varioskan Flash, Saint Louis, MO, USA) at a 595 nm wave length.

3.4.2. Cell cultivation Human gingival fibroblasts (HGF-1; CRL-2014, ATCC) were retained in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) combined with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and a penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 mg/mL) antibiotics solution (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). It was completed at 37°C in a humidified atmosphere containing 5% CO2 until 70–80% confluen- ce was achieved. The cells used in the experiments were up to 15 passages.

3.4.3. Evaluation of biocompatibility To determine the biocompatibility of specimens, 3-[4,5-dimethylthia- zole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was used. It was conducted by seeding HGF-1s (3×104 cell/cm2) in tissue culture plates. After 24 h, samples were placed on an HGF-1 monolayer and were incubated for a further 24 h. After reaching a predetermined time point, the growth media was removed, and specimens were rinsed once with phosphate-buffered saline (PBS). Furthermore, in each sample, 0.2 mg/mL MTT (MTT, Sigma- Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) solution was added in PBS and incubated for 1 h at 37°C in a humidified atmosphere consisting of 5% CO2. MTT solution was subsequently discarded, and formed formazan was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (dimethyl sulfoxide, Sigma Aldrich, Dorset, UK) by incubating with mild shaking (25 RPM) at RT for 10 min. Using a microplate spectrophotometer (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), the absorbance was evaluated at 570 nm. A specimen without contact with cells was attributed as a background value.

3.4.4. Cell adhesion evaluation by immunocytochemical method A quantitative and qualitative assessment was used to determine cell adhesion efficiency and adhesion strength on tested specimens by applying F-actin staining and focal adhesion (FA) visualization. To achieve this, HGF-1s were cultivated (15×103 cell/cm2) for 2 h and 24 h on tested surfaces. After specific time points that were previously determined, specimens were fixed with 4% paraformaldehyde (Carl Roth, GmbH, Karlsruhe, Germany) in PBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). This was achieved at RT for 15 min with mild agitation (25 RPM). Samples were then rinsed twice in PBS with 0.05% Tween-20 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA), permeabilized with 0.2% Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) in PBS for 5 min at RT with 25 RPM agitation, and then washed twice with 0.05% Tween-20 solution. After that, specimens were blocked for 30 min with 3% bovine serum albumin (BSA; AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany) and 10% FBS prepared in PBS. After the subsequent blocking procedure, samples were incubated with primary mouse anti- vinculin antibody (1:50; Merck Millipore, Burlington, MA, USA) at RT for 1 h in blocking solution while using gentle shaking at 25 RPM. Soon after, specimens were washed three times for 5 min with a 0.05% Tween-20 solution. They were then incubated with secondary goat anti-mouse Alexa Fluor 488-conjugated antibodies (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate (TRITC)-conjugated phalloidin (1:500; Merck Millipore, Carlsbad, CA, USA) in PBS in a darkened environment at

RT for 1 h with 25 RPM agitation. After that, the samples were washed three more times with PBS for 5 min at RT and stained with 12.5 μg/mL 4′,6- diamidino-2-phenylindole (DAPI; Merck Millipore, Carlsbad, CA, USA) solution in PBS for 5 min in the dark at RT with 25 RPM agitation. Then, specimens were washed three times with PBS for 5 min at RT and visualized using a confocal laser scanning microscope (CLSM) (Leica SP5 TCS, Leica Microsystems, Wetlzer, Germany). Using the image processing program ImageJ (1.8.0_112) (Wayne Rasband, National Institute of Mental Health, Bethesda, MD, USA), measurement of the cells’ surface area and counting of FAs within the cells on different samples were performed. Then, the quantitative differences in cells’ adhesion efficiency and strength were determined.

3.4.5. Bacteria type and cell culture cultivation A standard Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (Microbiologics, Grenoble, France) bacteria culture was used for microbiological tests. Accor- ding to the supplier’s protocol, the lyophilized bacteria were introduced on Shaedler anaerobic agar solid nutrient medium with L-cysteine, vitamin K and 5% sheep blood (Acumedia, Lansing, MI, USA). The bacteria culture was kept for 48 h in anaerobic conditions (10% H2, 10% CO2, 80% N2) 35±1°C. The P. gingivalis colonies were collected in anaerobic environment and suspended in sterile reduced liquid medium until 0.5 Mfa suspension that corresponds to 1.5×108 bacteria was reached.

3.4.6. Introduction of P. gingivalis on the surfaces The specimens were rinsed in an ultrasonic bath (Clifton SW, Nickel Electro Ltd, Somerset, United Kingdom) using 70% ethyl alcohol solution for 10 min before the microbiological tests. Then they were passively dried at RT, packed into sterilization packs and sterilized in autoclave (Hygoclave 90, Dürr Dental, Bietigheim, Germany) at 121°C for 39 min. Each test group consisted of 10 specimens (n=10). The tests were performed in separate 10 mL tubes, placing one test specimen per tube. 4.5 mL of reduced thioglycolic P. gingivalis liquid nutrient medium (Sigma-Aldric Taufkirchen, Germany) was poured into the tubes with the test specimens. Later another 0.5 mL 0.5 Mfa unit density standardized bacteria suspension was transferred to the tubes with the test specimens and 4.5 mL P. gingivalis nutrient medium. Ino- culated test tubes were incubated in anaerobic environment (10% H2, 10% CO2, 80% N2) 35±1°C temperature for 48 h. After the 48 hours, the test specimens were carefully transferred to sterile tubes with 1 mL of PBS and 1% proteinase K (Sigma-Aldric Taufkirchen, Germany). The test specimens with proteinase K and PBS solution were kept at 37°C temperature for 60 min

in anaerobic conditions. After that, the test tubes were transferred to an automatic shaker and shook for 1 min. The shaking was performed to mecha- nically remove all P. gingivalis colonies that formed on the specimen surfaces. The specimens were removed from the test tubes and the suspension density was measured using McFarland Densitometer (Biosan, Riga, Latvia). The density of microorganisms was evaluated by Mfa measuring units. The received Mfa numerical value was then proportionally recalculated to colony forming units per milliliter (CFU/mL). In order confirm that it was P. gingivalis that was forming the colonies in the test tube control samples of the solution were taken. Each biological replica samples were serially diluted by thioglycolic medium and introduced on Shaedler agar. The dishes were incubated in anaerobic conditions for 48 h.

3.4.7. Statistical Analysis The statistical analysis was performed using “Graph Pad Prism” statistical package (San Diego, CA, USA). The measurements data was described by mean and standard deviation. The distribution of variables was evaluated using D’Agostino-Pearson test. After confirmation of data distribution according to the normal probability distribution, the data was later compared using Anova data analysis methods, performing Turkey tests. Correlation of data among different measurements was evaluated for assessment of measurement data dependencies using Pearson correlation analysis. A P-value of <0.05 was considered statistically significant and P≥0.05 statistically non-significant for all statistical evaluations.

4. RESULTS

4.1. Polishing influence on the surface properties of materials conventionally used for implant abutments

4.1.1. Polishing influence on the surface roughness of materials conventionally used for implant abutments Surface roughness measurements were performed to evaluate polishing effectiveness after applying polishing protocols A and B. Mean surface roughness value of Sa was used to define the measurements. All surface roughness mean values were below micro roughness level. After polishing according to the protocol A, the lowest surface roughness was measured on zirconia oxide surface (Sa = 9.36±0.41 nm, P<0.0001), the highest – PMMA (Sa = 62.33±0.96 nm, P<0.0001) (Fig. 4.1.1.1, A). After polishing according to the protocol B, the lowest surface roughness was also measured on zirconia

oxide surface (Sa = 5.53±0.21 nm, P<0.0001), the highest was also PMMA (Sa = 65.23±2.40 nm, P<0.0001) (Fig. 4.1.1.1, B). When compared Sa was statistically different among all groups, after polishing according to protocol A and protocol B (P<0.0001). Statistically significant decrease of surface roughness (P<0.0001), was measured in the three groups after polishing according to protocol B. The surface roughness was statistically significantly higher after polishing according to protocol B than protocol A (P<0.0001) only in one group – PMMA (Fig. 4.1.1.2).

Fig. 4.1.1.1. Atomic force microscope (AFM) images. 2D (a, c, e, g, i, k, m, o) ir 3D (b, d, f, h, j, l, n, p) scanning reconstructions. Surface roughness means (Sa) shown as means and standard deviations (SD). Surface analysis after polishing according to protocols A and B.

Fig. 4.1.1.2. Surface Sa and SD. Multiple Tukey test comparison significant difference, when P<0.05. Statistically significant are marked: “****” – P<0.0001.

2D and 3D AFM analysis of reconstructions was done for the qualitative analysis of surface morphology, that was used for describing surface topography. Clear differences in surface structure were visible when comparing micrographics, especially clear were non-homogenic surfaces of materials of polymer origin (PEEK and PMMA). The highest Z axis that shows the depth of the cuts was on these surfaces: PEEK – 0.33 µm (Fig. 4.1.1.1, A (j)) and PMMA – 0.37 µm (Fig. 4.1.1.1 A (n)). The Z axis variation of non-organic origin surfaces was measured on nano scale Ti – 0.54 nm (Figure 4.1.1.1, A (b)), and ZrO2 – 0.43 nm (Fig. 4.1.1.1, A (f)). Deeper valleys and incon- sistent prominences were observed on the polished polymer surfaces. No indication of melting was observed on the surfaces.

4.1.2. Water contact angle and surface free energy of polished materials conventionally used for implant abutments The WCA was measured to evaluate surface hydrophobicity – increase of WCA shows the decrease of hydrophilicity. The highest WCA after performing polishing according to protocol A was observed on the PMMA (100.10±1.40°, P<0.0001), the lowest – on PEEK (76.79±1.10°, P<0.0001). The WCA values observed in the Ti and ZrO2 groups were not statistically different (P≥0.05) (Table 4.1.2.1). Statistically significant difference was observed in all groups after polishing (P<0.05), and the PMMA surface was the most hydrophobic (P<0.0001).

Table 4.1.2.1. Multiple mean comparisons of WCA of different surface groups after A and B polishing. Tukey mean Mean 1 Mean 2 Mean difference P significance comparison test (degrees °) (degrees °) (degrees °) ns Ti vs. ZrO2 88.20 90.55 2.35 0.1146 Ti vs. PEEK 88.20 76.79 11.42 <0.0001**** Ti vs. PMMA 88.20 100.10 11.88 <0.0001**** A ZrO2 vs. PEEK 90.55 76.79 13.76 <0.0001****

ZrO2 vs. PMMA 90.55 100.10 9.53 <0.0001**** PEEK vs. PMMA 76.79 100.10 23.29 <0.0001****

Ti vs. ZrO2 60.21 57.32 2.89 0.0175* Ti vs. PEEK 60.21 75.62 15.41 <0.0001**** Ti vs. PMMA 60.21 68.84 8.63 <0.0001**** B ZrO2 vs. PEEK 57.32 75.62 18.30 <0.0001****

ZrO2 vs. PMMA 57.32 68.84 11.52 <0.0001**** PEEK vs. PMMA 75.62 68.84 6.78 <0.0001**** Statistical significance of P<0.05 (ns – P≥0.05) was applied for comparison.

WCA decreased in the all groups after polishing according to protocol B and surfaces became more hydrophilic (Fig. 4.1.2.1). Only in group PEEK there was no statistical difference between protocols A and B. After polishing according protocol B, PEEK surface was the most hydrophobic (75.62±2.50°, P<0.0001), and the most hydrophilic surface was ZrO2 surface (57.32±1.90°, P<0.05).

Fig. 4.1.2.1. Surface WCA means and SD. Statistically significant difference of multiple Tukey tests when P<0.05. Statistical differences are marked: “ns”– P≥0.05.

Surface SFE was measured using polar and dispersive SFE and their mean sums were shown as a total SFE (Fig. 4.1.2.2). The highest total SFE was of PEEK surface after polishing according to protocol A (38.07±0.93 mN/m, P<0.0001) (Table 4.1.2.2). Other surface SFE were statistically significantly lower and there was no statistically significant difference between the groups (P≥0.05).

Fig. 4.1.2.2. Dispersive (black frame) and polar (red frame) SFE measurement results shown as means and SD. Total SFE is shown as the whole column. Multiple comparison is done comparing differences after polishing according to A and B protocols. After multiple Tukey test comparison total SFE significant difference as P<0.05. Statistically significant are marked as “****” – P<0.0001.

Table 4.1.2.2. Multiple comparison of surface total free energy means using Tukey test, comparison between materials using A and B polishing protocols. Tukey mean Mean 1 Mean 2 Mean difference P significance comparison test (mN/M) (mN/m) (mN/m) ns Ti vs. ZrO2 33.31 31.70 1.61 0.0809 Ti vs. PEEK 33.31 38.07 4.76 <0.0001**** Ti vs. PMMA 33.31 31.70 1.61 0.0807ns A ZrO2 vs. PEEK 31.70 38.07 6.366 <0.0001**** ns ZrO2 vs. PMMA 31.70 31.70 <0.01 >0.9999 PEEK vs. PMMA 38.07 31.70 6.37 0.0001****

Table 4.1.2.2. Continued Tukey mean Mean 1 Mean 2 Mean difference P significance comparison test (mN/M) (mN/m) (mN/m)

Ti vs. ZrO2 41.81 45.10 3.29 <0.0001**** Ti vs. PEEK 41.81 43.46 1.65 0.0691ns Ti vs. PMMA 41.81 44.34 2.53 0.0004*** B ns ZrO2 vs. PEEK 45.10 43.46 1.64 0.0684 ns ZrO2 vs. PMMA 45.10 44.34 0.76 0.8606 PEEK vs. PMMA 43.46 44.34 0.88 0.7401ns The statistical significance of P<0.05 was used for comparison.

Polar SFE after polishing according to protocol A was highest in the PEEK group (5.71±0.53 mN/m, P<0.0001), and lowest in PMMA group (0.37±0.17 mN/m, P<0.0001) (Table 4.1.2.3). The total SFE (P<0.0001) statistically increased in all the groups after polishing according to protocol B. The highest total SFE was on ZrO2 (45.10±0.34 mN/m, P<0.0001), and lowest on Ti (41.81±2.00 mN/m, P<0.0001) surface. All values were statistically different in all groups (P<0.0001).

Table 4.1.2.3. Surface polar SFE mean multiple comparisons using Tukey comparison method after applying polishing protocols A and B. Tukey mean Mean 1 Mean 2 Mean difference P significance comparison test (mN/m) (mN/m) (mN/m) ns Ti vs. ZrO2 2.49 2.16 0.33 0.9496 Ti vs. PEEK 2.49 5.71 3.22 <0.0001**** Ti vs. PMMA 2.49 0.37 2.12 <0.0001**** A ZrO2 vs. PEEK 2.16 5.71 3.55 <0.0001****

ZrO2 vs. PMMA 2.16 0.37 1.79 <0.0001**** PEEK vs. PMMA 5.71 0.37 5.34 <0.0001****

Ti vs. ZrO2 7.37 14.72 7.35 <0.0001**** Ti vs. PEEK 7.37 4.14 3.23 <0.0001**** Ti vs. PMMA 7.37 7.36 0.01 >0.9999ns B ZrO2 vs. PEEK 14.72 4.14 10.58 <0.0001****

ZrO2 vs. PMMA 14.72 7.36 7.36 <0.0001**** PEEK vs. PMMA 4.14 7.36 3.22 <0.0001**** Statistical significance of P<0.05 was used for comparison (insignificant (ns) – P≥0.05).

Polar SFE increased in all the groups after polishing according to protocol B, the highest value was observed on ZrO2 (14.72±0.36 mN/m, P<0.0001) surface, the lowest on PEEK (4.14±0.20 mN/m, P<0.0001). After polishing according to protocol B only PEEK (P<0.0001) was statistically lower, but SFE increased in all other groups (P<0.0001).

4.1.3. Correlation of physicochemical properties Strong negative correlation was observed between the WCA and total SFE (r = –0.93) which demonstrated that increase in WCA results in lower total SFE (Table 4.1.3.1). Average positive correlation was observed between Sa and WCA (r = 0.61), which demonstrated that when surface roughness increased, water contact angle increased too. Weak negative correlation was observed between surface Sa and total SFE (r = –0.42).

Table 4.1.3.1. Pearson correlations for evaluation of physicochemical test results dependencies. Pearson correlation Sa vs. WCA Sa vs. total SFE WCA vs. total SFE r 0.61 –0.42 –0.93 P (two-tailed) <0.0001**** 0.0008*** <0.0001**** Correlation is significant when P<0.05. Statistical significancies are marked “****” – P<0.0001; “***” – P = 0.0008

4.2. The application of sol-gel method and development of bioceramic coatings

4.2.1. The application of sol-gel method for surface modification In order to evaluate the technological effectiveness of sol-gel method, Si3N4 surfaces were coated with CHAp coatings (10, 20 and 30 layers). The XRD results showed that single phase CHAp forms with 10, 20 and 30 layers of coatings and that the chemical uniformity is not dependable on the number of layers (Fig. 4.2.1.1). The intensity of CHAp diffraction increased with the number of CHAp layers – as the number of CHAp layers increased, so did the CHAp expression in diffractograms. CHAp coatings were successfully synthesized on silica nitride (Si3N4) substrate by using calcium phosphate sol- gel solution.

Fig. 4.2.1.1. Coated surfaces X-rays diffractive analysis (XRD). XRD: (A) 30 layers CHAp (blue curve); (B) 20 layers of CHAp (red curve); (C) 10 layers of CHAp (black curve).

4.2.2. Morphological research of calcium hydroxyapatite coating surfaces Surface morphology dependency on the number of layers of the coating was observed using SEM and AFM micrographs. Images of CHAp coatings received by SEM are shown in Fig. 4.2.2.1. Formation of CHAp islands was observed on Si3N4 substrates covered with 10 layers of CHAp coating. The surface morphology has been changed when the number of CHAp layers increased. The island formation was visible on 20 layers of coating (Fig. 4.2.2.1, B) however if the number of layers increased, cracks started to form on the surface. More prominent cracks on the surface appeared after 30 layering series (Fig. 4.2.2.1, C). The cracks started connecting and forming a chain.

Fig. 4.2.2.1. Scanning electon microscope (SEM) images. Layers: (A) 10 layers CHAp coating; (B) 20 layers of CHAp coating; (C) 30 layers of CHAp coating.

4.2.3. Water contact angle of calcium hydroxyapatite coatings The results of these measurements are summarized in Table 4.2.3.1. The WCA values were measured in the interval of 92–100° of coated specimens that had 10, 20 and 30 dip coating cycles. The highest WCA was measured when there were 20 layers and the lowest when there were 30 layers of coatings.

Table 4.2.3.1. Water contact angle means and standard deviation of different thickness of calcium hydroxyapatite (CHAp) coating. Descriptive statistics 10 CHAp 20 CHAp 30 CHAp WCA Number of samples 10 10 10 Mean (degrees °) 97.2±1.1 100.3±3.5 93.4±1.0 The measurements were done after coating of 10, 20 and 30 layers of CHAp.

4.2.4. Formation of yttria-stabilized zirconium oxide and lithium disilicate bioceramic coatings The formation of ceramic 3YSZ and LS2 glass-ceramic coatings was confirmed by XRD (Fig. 4.2.4.1). In both cases, single-phase crystalline coatings were obtained. Some additional diffraction peaks of the Ti alloy substrate were visible in both patterns. In the case of the 3YSZ coating, observable peaks in the XRD pattern correspond to the tetragonal ZrO2 phase. Visible diffraction peaks on XRD patterns of the LS2 coating can be associated with the ortho- rhombic lithium disilicate phase. The LiSiO3 phase commonly found in lithium silicate glass-ceramics was not detected in this case. It is important to note that the diffraction peak on LS2-coated Ti corresponding to the [040] plane was more intense than expected, which could indicate the formation of slightly texturized lithium disilicate crystal orientation. These findings on both surfaces established that coatings of monophase 3YSZ and LS2 were achieved by the sol-gel method. Other groups were excluded due to lack of chemical modification of polished surfaces.

Fig. 4.2.4.1. X-ray diffraction (XRD) spectra of coated surfaces.

Spectres: (A) peaks caused by yttria-stabilized zirconium oxide (ZrO2) marked in blue and by titanium (Ti) marked green observed on the titanium alloy coated with yttria-stabilized zirconium oxide (3YSZ); (B) peaks caused by lithium disilicate (Li2Si2O5) (red) and Ti (green) were observed on the titanium alloy coated with lithium disilicate Ti-LS2.

4.2.5. Surface morphology evaluation of bioceramic coatings The morphology of Ti-3YSZ and Ti-LS2 bioceramic coatings was evaluated by SEM. In both images, a uniform surface structure was observed. In the image (Fig. 4.2.5.1, A), small cracks in the 3YSZ coating were detected, while the LS2 layer was without cracks and regular (Fig. 4.2.5.1, B). All detected cracks were less than 1 µm in size. 3YSZ coatings consisted of a uniform layer of nano-sized grains, whereas LS2 contains micron-sized

domains of differently orientated nano-sized grains and/or glassy phase. The grain size of both ceramic coatings was less than 10 nm. The determination of the exact crystallite size was limited by instrument resolution. The determined coating thickness of 3YSZ and LS2 was 182 nm and 159 nm, respectively (Fig. 4.2.5.1, C and D).

Fig. 4.2.5.1. SEM images of nanocoated surfaces. Surfaces: (A) Ti-3YSZ; (B) Ti-LS2; (C) cross-section of 3YSZ coating; (D) cross-section of LS2 coating.

4.3. Evaluation of physicochemical properties of bioceramic coatings

4.3.1. Surface roughness of bioceramic coatings and titanium alloy Substrate surface roughness was reduced after layering nano bioceramic coatings on titanium surface polished according to protocol B (P<0.05) (Fig. 4.3.1.1). When compared 3YSZ coating with Ti (Sa = 17.67±0.35 nm) surface roughness reduction was not substantial but statistically significant (Sa = 16.61±0.52 nm, P = 0.0003). The surface roughness reduced even more after coating with LS2 layer (Sa = 9.61±0.66 nm, P<0.0001). When evaluating surface morphology according to AFM micrographies, clear formation and growth of crystals was observed (Fig. 4.3.1.2). It was also observed that during the formation of crystal coatings, the surface became more even and cuts that were formed during the polishing were filled in.

Fig. 4.3.1.1. Surface roughness presented in Sa means and SD. Multiple Tukey tests comparison significant difference when P<0.05. Statistical significance is marked as: “***” – P = 0.0003; “****” – P<0.0001.

Fig. 4.3.1.2. AFM micrographies: 2D (a, c, e) and 3D (b, d, f) scanning reconstruction. Sa presented as means and SD.

4.3.2. Water contact angle and surface free energy of bioceramic coatings and polished titanium alloy surfaces The measured WCA was almost two times lower on surfaces covered with bioceramic coatings when compared to substrate (Ti 60.21±1.58°) (Fig. 4.3.2.1). The WCA was statistically significantly lower (P<0.0001) after coating with 3YSZ and LS2 bioceramics and was the lowest on Ti-LS2 surface (25.71±1.33°, P<0.0001).

Fig. 4.3.2.1. Surface WCA shown as means and SD. Multiple Tukey tests comparison significant difference when P<0.05. Statistically significant differences are marked as: “****” – P<0.0001.

The total SFE statistically significantly increased in both groups after coating with bioceramic coatings and it was the highest in the Ti-LS2 group (65.70±1.00 mN/m, P<0.0001) (Fig. 4.3.2.2). Also, both of bioceramic coatings significantly increased polar SFE component (P<0.0001).

Fig. 4.3.2.2. Dispersive (black frame) and polar (red frame) SFE measurements results presented in means and SD. The total SFE is represented by the whole column. Using multiple Tukey tests comparison, total SFE significant difference when is P<0.05. Statistical significances marked “****” – P<0.0001.

4.4. Evaluation of biological properties of bioceramic coatings

4.4.1. Protein absorption on novel coated surfaces and polished surfaces of conventional implant abutment materials The specimens were incubated in PBS for 24 hours to perform quantitative analysis of protein adsorption on surfaces. The sedimented proteins were then washed off the specimen surfaces and their amount was measured (Fig. 4.4.1.1). The received results showed that polymer PEEK surface adsor- bed the highest quantity of protein (0.44±0.03). Statistically significant lower absorption was measured on ZrO2 (P = 0.0033) and other surfaces (P<0.0001). The lowest protein adsorption was measured on polished titanium surface (0.31±0.01) however a statistically significant difference was not observed when compared to group Ti-3YSZ (0.33±0.04, P≥0.05). Statistically non-significant were Ti-LS2 (0.37±0.01) and PMMA (0.37±0.01) surfaces (P≥0.05) that showed intermediate adsorption.

Fig. 4.4.1.1. Protein adsorption on specimen surfaces measured using Bradford reagent light absorption in the medium. Results are presented as means and SD. Multiple Tukey tests significant difference when P<0.05. Statistically significant are marked as “ns” – P≥0.05; “*” – P = 0.0135; “**” – P = 0.0042; “#**” – P = 0.0065; “#**#” – P = 0.0019; “**#” – P = 0.0033. All unmarked significant differences, when P<0.0001.

100

4.4.2. Biocompatibility of bioceramic coatings and polished surfaces of materials conventionally used for implant abutments. The biocompatibility of the newly formed coatings on the Ti alloy surface was evaluated and compared with the biocompatibility of conventional implant prosthetic materials. The results were standardized by the number of cells obtained on the polished Ti alloy control surface. After evaluating the growth of relative HGF-1 cell count (RCC), it was found that all materials used for the assay were biocompatible (Fig. 4.4.2.1). The highest RCC (i.e., the best biocompatibility) was observed for the ZrO2 (1.08±0.05) surfaces. Moreover, no statistically significant differences were found between polished Ti (1.00±0.17) and Ti-3YSZ (0.94±0.12) (P≥0.05) or Ti (1.00±0.17) and Ti-LS2 (0.87±0.11) (P≥0.05) specimens. The lowest biocompatibility was found to be of materials of polymer origin (PMMA – 0.65±0.17 ir PEEK – 0.79±0.06) it was found to be statistically significantly lower when compared with any other group (P<0.0001). An exception was Ti-LS2 that did not statistically differ from from PEEK (P≥0.05). There was no difference between PMMA and PEEK either (P≥0.05).

Fig. 4.4.2.1. Charts of biocompatibility expressed by means and standard deviations of human gingival fibroblast (HGF) relative cell counts (n = 10 for each group). Multiple comparisons by Tukey’s test and significant difference at the following levels: **** – P<0.0001; #** – P = 0.004; ** – P = 0.006; **# – P = 0.0024; ns – P≥0.05 (for all unmarked groups).

101

4.4.3. Gingival fibroblast adhesive areas on bioceramic coatings and polished surfaces of materials conventionally used for implant abutments HGF-1 adhesion on tested specimens was determined by calculating cell surface areas 2 h and 24 h post-seeding. The HGF-1 surface area was visualized by cell F-actin staining (Fig. 4.4.3.1). To evaluate cell adhesion differences that occurred on tested specimens, a qualitative and quantitative assessment of the images obtained by CLSM was performed. The results of HGF-1 adhesion showed that all tested surfaces were attractive for cell attachment. Changes in the HGF-1 surface area (2 h and 24 h after seeding) showed that the cells were growing on all specimens, as the surface areas increased during the time (Fig. 4.4.3.2).

Fig. 4.4.3.1. Confocal laser scanning microscope (CLSM) images of immunocytochemically stained cells on surface coatings at a different time (2 h and 24 h). HGF-1 nucleus (DAPI, blue) and F-actin filaments (TRITC conjugated phalloidin, red).

Moreover, 2 h after seeding, the largest HGF-1 surface area (the best cell adhesion) was found on the Ti-3YSZ specimens (1789 µm2) (P<0.0001), and the lowest cell area was determined on both polymeric surfaces (PEEK [581.8 µm2] and PMMA [648.6 µm2]), but these two were not significant different (Fig. 4.4.3.2). Furthermore, after 24 h, the highest cell adhesion area was observed on the Ti-3YSZ (2630 µm2) specimens, and the lowest was determined on polymeric PEEK (1534 µm2) and PMMA (1847 µm2) surfaces as well as Ti-LS2 specimens (1888 µm2).

102

It is also important to mention that compared to 2 h, after 24 h, the cell attachment area increased in all groups except the Ti-LS2 group (1507 µm2 after 2 h and 1888 µm2 after 24 h), where the increment of adhesive cell area was not statistically significant (P≥0.05). Moreover, even though the increase of cell surface area on PEEK and PMMA samples after 24 h was statistically significant (P<0.0001), it reached only a similar surface area size as on Ti-3YSZ after 2 h (Fig. 4.4.3.2).

Fig. 4.4.3.2. Adhesive areas (µm2) of HGF-1-stained actin on surfaces at a different times (2 h and 24 h) expressed by means and standard deviations. Multiple comparisons of different times in groups by Tukey’s test and significant difference at the following levels: **** – P<0.0001; * – P = 0.0232; ns – P≥0.05.

4.4.4. Focal adhesions of gingiva fibroblasts on bioceramic coatings and polished surfaces of materials conventionally used for implant abutments Immunocytochemically stained FAs were visualized (Fig. 4.4.4.1) and quantified (Fig. 4.4.4.2) to evaluate cell adhesion strength. Obtained quantitative FA results were expressed as the density distribution function of cells and number of focal adhesions 2 h and 24 h after seeding. Also, means of FAs per cell were provided for statistical data comparison (Table 4.4.4.1).

103

Fig. 4.4.4.1. CLSM images of immunocytochemically stained cells on surface coatings at a different time (2 h and 24 h). HGF-1 nucleus (DAPI, blue) and FA spots (vinculin stained with AlexaFluor 488-conjugated antibodies, green).

The images obtained by CLSM showed that 2 h after seeding, cells began to form FAs on all examined surfaces (Fig. 4.4.4.1); moreover, the quantitative results revealed the differences between them (Fig. 4.4.4.2). It was observed that on polymeric PEEK and PMMA surfaces, most of the cells did not form FAs (Fig. 4.4.4.2, D and F) or formed only a small amount of them: PEEK – 5.15±0.74 FAs/cell, PMMA – 5.76±0.93 FAs/cell. The projections of both histograms had similar configurations and revealed that the surfaces of both polymers were not attractive for an early cell attachment. A wide range of FA distribution was observed on the Ti-3YSZ surface (Fig. 4.4.4.2, C). In this group, cells were relatively uniformly distributed with a similar quantity of 0 to 100 FAs. Additionally, the concentration of cells without FAs on Ti- 3YSZ was lower than on polymers but higher than on other surfaces, while cells with the highest FA counts after 2 h were also the highest. No trend in cellular concentration by FAs was observed in this group, while its mean was 28.00±3.76 FAs/cell. In the remaining groups, FA numbers in cells increased respectively: Ti-LS2 FAs ranged from 15 to 20 (Fig. 4.4.4.2, E), ZrO2 FAs ~35 (Fig. 4.4.4.2, B), and Ti FAs ~50 (Fig. 4.4.4.2, A). However, both the ZrO2 and Ti alloy histograms replicated the portion of the Ti-3YSZ plot showing similar concentrations of the most FA-rich cells, and the concentration of the FAs within the cells in all three groups were very similar. Com- paring FAs/cell, the statistical difference did not exist between these three groups (P>0.05).

104

Table 4.4.4.1. Descriptive statistics of focal adhesions concentration means (FA) after 2 h and 24 hours (mean ± standard deviation)

Descriptive statistics Ti Ti-3YSZ Ti-LS2 ZrO2 PEEK PMMA 36.16± 28.00± 16.94± 29.02± 5.15± 5.76± FAs per cell (2 h) 0.79 3.76 1.57 2.42 0.74 0.93 43.47± 66.75± 26.03± 47.69± 23.45± 28.66± FAs per cell (24 h) 3.14 4.91 2.98 3.27 3.71 3.67

Twenty-four-hour results revealed that the highest number of FAs were formed in HGF-1 grown on the Ti-3YSZ surface (Fig. 4.4.4.2, C). Two peaks of cell concentrations were detected in this group. The highest cell concentration was ~45 FAs per cell, but even a wave of 75–80 FAs per cell was observed. The mean on Ti-3YSZ group was 66.75±4.91 FAs/cell, and it was statistically the highest (P<0.05). Differently, the PEEK group showed persistent high concentrations of cells that formed comparable weak adhesions after 24 h (Fig. 4.4.4.2, D). However, compared to the histogram after 2 h, two peaks of FA concentrations were already observed after 24 h; cells that began to attach to the surface (cells with a relatively small number of FAs) and cells with relatively strong adhesions (cells with a high number of FAs [~60]) were found. On the PEEK surface, cells behaved similarly as on the PMMA group: Higher concentrations of cells formed weak adhesions (~20 FAs per cell), but another, relatively lower, portion of cells demonstrated strong attachment (~75–80 per cell) (Fig. 4.4.4.2, F). The FA numbers in cells grown on Ti-LS2 also increased after 24 h, and the maximum cell concentration was found containing ~25 FAs (Fig. 4.4.4.2, E). Thus, PEEK and PMMA sample groups induced weak and slow HGF-1 adhesion and comparing FAs/cell, the statistical difference did not exist between these three groups (P≥0.05). On the ZrO2 surface, cell adhesion during the time also improved: The maximum FA number determined in HGF-1, 24 h after seeding, was ~45 (Fig. 4.4.4.2, B). Comparing both periods (2 h and 24 h), all tested groups showed an increment of FAs, except the Ti alloy surface group. There were no changes in FA numbers on the latter sample, comparing 2 h and 24 h.

105

Fig. 4.4.4.2. Histograms of HGF focal adhesions (FAs) at a different time 2 h (line + fill) and 24 h (dashed line) after seeding.

Histograms of groups: (A) Ti; (B) ZrO2; (C) Ti-3YSZ; (D) PEEK; (E) Ti-LS2; (F) PMMA.

106

4.4.5. Bacteria growth on bioceramic coatings and polished surfaces of materials conventionally used for implant abutments P. gingivalis culture growth was confirmed after 48 hours incubation period on anaerobic Shaedler agar. Colony forming units were counted (CFU/mL) after washing the bacteria from the test specimens and evaluating the media turbidity. Fig. 4.4.5.1 shows quantitative P. gingivalis growth expression. The highest P. gingivalis CFU concentration was measured on PMMA surface ((2.36±0.30)×108 CFU/mL) and was statistically different form all other groups (P<0.0001). The lowest CFU concentration mean was on Ti- LS2 surface ((0.35±0.11)×108 CFU/mL), however there was no statistical significance between other groups that had slightly higher CFU concentra- 8 8 tions Ti-3YSZ ((0.46±0.07)×10 CFU/mL) and ZrO2 ((0.52±0.09)×10 CFU/mL) (P≥0.05). It is interesting to notice that after comparing CFU concentration on polished titanium alloy group (Ti) which was used as a substrate for coating, statistically significant differences after coating were observed. The CFU/ml amount on Ti-3YSZ was lower than on Ti (P = 0.0191), even lower on Ti-LS2 surface (P<0.0001).

Fig. 4.4.5.1. Quantitative P. gingivalis CFU/ml growth assessment after 48 hours incubation in standard bacteria suspension. The results are shown as means and SD. Multiple Tukey tests comparisons among both time periods significant difference when P<0.05. Statistically significant are marked “*” – P = 0.0191; “*#” – P = 0.0142; “**” – P = 0.0191; “****” – P<0.0017). All unmarked differences are statistically non-significant (“ns”– P≥0.05)

107

4.4.6. Correlations of biological and physicochemical properties Correlations between protein adsorption on surfaces and cell biocompatibility or colony forming units were statistically non-significant (P≥0.05) (Table 4.4.6.1).

Table 4.4.6.1. Pearson correlations for evaluation of experimental results of protein adsorption and biocompatibility and protein adsorption and bacteria colony formation. Pearson correlation Protein vs. biocompatibility Protein vs. bacteria CFU r –0.16 0.12 P (two-tailed) 0.2171ns 0.3544 ns Correlation is significant when P<0.05. Statistically non-significant are marked as: “ns” – P≥0.05.

After evaluation of correlation between physicochemical and biological properties, dependencies were observed among many groups (Table 4.4.6.2). Strong negative correlation was observed between Sa and biocompatibility (r = –0.70, P<0.0001), which shows that increase in surface roughness results in decreased biocompatibility. Strong positive correlation was observed between Sa and bacteria colony development (r = 0.94, P<0.0001), which shows that increase in surface roughness results in increase of colony formations. WCA and CFU correlation was positive and of medium strength (r = 0.61, P<0.0001). It shows the connection between the increase of surface hydrophilicity and the increase of formation of bacteria colonies. Other correlations were weak or statistically non-significant (P≥0.05). Total SFE correlated weakly or did not correlate at all with biological properties, protein accumulation correlated weakly or did not correlate at all with physicochemical properties.

108

Table 4.4.6.2. Pearson correlations for the evaluation of physicochemical and biological experiments dependencies.

Pearson Sa vs. Sa vs. Sa vs. correlation biocompatibility protein bacteria CFU r –0.70 0.80 0.94 P (two-tailed) <0.0001**** 0.1781ns <0.0001**** Pearson WCA vs. WCA vs. WCA vs. correlation biocompatibility protein bacteria CFU r –0.25 0.43 0.61 P (two-tailed) 0.0497* 0.0006*** <0.0001**** Pearson Total SFE vs. Total SFE vs. Total SFE vs. correlation biocompatibility protein bacteria CFU r 0.06 –0.27 –0.46 P (two-tailed) 0.6427ns 0.0395# 0.0002**# Correlation significant when P<0.05. Statistically significant are marked: “*” – P = 0.0497; “#” – P = 0.0395; “***“ – P = 0.0006; “**#” – P = 0.0002; “ns” – P≥0.05.

CONCLUSIONS 1. The use of lower fraction abrasive materials for polishing resulted in increased polishing effectiveness by reducing surface roughness and increasing hydrophilicity and surface free energy. 2. The sol-gel method can be applied for bioceramic coatings on smooth surfaces. 3. The sol-gel method can be applied for coating highly polished titanium alloys with yttria-stabilized zirconium oxide (3YSZ) and lithium disilicate (LS2) bioceramic coatings. 4. Yttria-stabilized zirconium oxide (3YSZ) and lithium disilicate (LS2) bioceramic coatings reduce the surface roughness of a polished titanium alloy and increase its hydrophilicity and surface free energy. 5. Both newly synthesized bioceramic coatings (yttria-stabilized zirconium oxide [3YSZ] and lithium disilicate (LS2)) are biocompatible. Cell adhesion areas and focal adhesions showed that the yttria-stabilized zirconium oxide bioceramic coating increases cell adhesion effectiveness, but the lithium disilicate (LS2) coating does not have the same positive effect. 6. Both newly synthesized bioceramic coatings (yttria-stabilized zirconium oxide (3YSZ) and lithium disilicate (LS2)) lower the Porphyromonas gingivalis colony-forming unit concentration on surfaces.

109

SCIENTIFIC AND PRACTICAL RECOMMENDATIONS 1. To use standardized fraction abrasives in research to ensure study clarity, data homogeneity, and systematization. 2. To evaluate surface polishing quality in clinical practice as an essential factor that can determine materials’ physicochemical properties and biological results. 3. To give preference to materials of inorganic origin when choosing implant abutments, because of the better physicochemical and biological properties of their surfaces. 4. To continue the research on the developed experimental yttrium stabilized zirconium oxide and lithium disilicate bioceramic coatings for their clinical application and to develop other coatings based on sol-gel methods for surface coating for biomedical purposes.

110

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS

1. Abduo J, Judge RB. Implications of implant framework misfit: a systematic review of biomechanical sequelae. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 2014;29:608–621. 2. Al‐Dwairi ZN, Tahboub KY, Baba NZ, Goodacre CJ, Özcan M. A Comparison of the Surface Properties of CAD/CAM and Conventional Polymethylmethacrylate (PMMA). J Prosthodont 2019;28:452–457. 3. AL-Haddad A, Aziz ZACA. Bioceramic-Based Root Canal Sealers: A Review. International Journal of Biomaterials 2016;2016:9753210–10. 4. Allegrini S, Yoshimoto M, Salles MB, Bressiani AH de A. Biologic response to titanium implants with laser-treated surfaces. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 2014;29:63–70. 5. Allen LT, Tosetto M, Miller IS, O’Connor DP, Penney SC, Lynch I, et al. Surface- induced changes in protein adsorption and implications for cellular phenotypic responses to surface interaction. Biomaterials 2006;27:3096–3108. 6. Almaguer-Flores A, Olivares-Navarrete R, Wieland M, Ximénez-Fyvie LA, Schwartz Z, Boyan BD. Influence of topography and hydrophilicity on initial oral biofilm formation on microstructured titanium surfaces in vitro. Clinical Oral Implants Research 2012;23:301–307. 7. Amoroso PF, Pier-Francesco A, Adams RJ, Waters MGJ, Williams DW. Titanium surface modification and its effect on the adherence of Porphyromonas gingivalis: an in vitro study. Clinical Oral Implants Research 2006;17:633–637. 8. Anselme K, Davidson P, Popa AM, Giazzon M, Liley M, Ploux L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomaterialia 2010;6:3824–3846. 9. Antanasova M, Jevnikar P. Bonding of Dental Ceramics to Titanium: Processing and Conditioning Aspects. Current Oral Health Reports 2016;3:234–243. 10. Antanasova M, Kocjan A, Kovač J, Žužek B, Jevnikar P. Influence of thermo- mechanical cycling on porcelain bonding to cobalt-chromium and titanium dental alloys fabricated by casting, milling, and selective laser melting. Journal of Prosthodontic Research 2018;62:184–194. 11. Araújo‐Gomes N, Romero‐Gavilán F, Lara‐Sáez I, Elortza F, Azkargorta M, Iloro I, et al. Silica–gelatin hybrid sol–gel coatings: A proteomic study with biocompatibility implications. J Tissue Eng Regen M 2018;12:1769–1779. 12. Avila E de, Molon R de, Spolidorio DP, Mollo F de A. Implications of Surface and Bulk Properties of Abutment Implants and Their Degradation in the Health of Periodontal Tissue. Materials 2013;6:5951–5966. 13. Avila E de, Molon R de, Vergani C, Mollo FJ de A, Salih V. The Relationship between Biofilm and Physical-Chemical Properties of Implant Abutment Materials for Successful Dental Implants. Materials 2014;7:3651–3662. 14. Baharloo B, Textor M, Brunette DM. Substratum roughness alters the growth, area, and focal adhesions of epithelial cells, and their proximity to titanium surfaces. Journal of Biomedical Materials Research Part A 2005;74:12–22. 15. Balaban NQ, Schwarz US, Riveline D, Goichberg P, Tzur G, Sabanay I, et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology 2001;3:466–472.

111

16. Banerjee I, Pangule RC, Kane RS. Antifouling coatings: recent developments in the design of surfaces that prevent fouling by proteins, bacteria, and marine organisms. Advanced Materials (Deerfield Beach, Fla) 2011;23:690–718. 17. Basso GR, Moraes RR, Borba M, Griggs JA, Bona AD. Flexural strength and reliability of monolithic and trilayer ceramic structures obtained by the CAD-on technique. Dent Mater 2015;31:1453–1459. 18. Berglundh T, Abrahamsson I, Welander M, Lang NP, Lindhe J. Morphogenesis of the peri-implant mucosa: an experimental study in dogs. Clinical Oral Implants Research 2007;18:1–8. 19. Berglundh T, Lindhe J, Ericsson I, Marinello CP, Liljenberg B, Thornsen P. The soft tissue barrier at implants and teeth. 20. Berglundh T, Zitzmann NU, Donati M. Are peri-implantitis lesions different from periodontitis lesions?: Peri-implantitis and periodontitis lesions. J Clin Periodontol 2011;38:188–202. 21. Berkovitz BKB, Moxham BJ, Newman HN. The periodontal ligament in health and disease. 22. Besinis A, Hadi SD, Le HR, Tredwin C, Handy RD. Antibacterial activity and biofilm inhibition by surface modified titanium alloy medical implants following application of silver, titanium dioxide and hydroxyapatite nanocoatings. Nanotoxicology 2017;11:327–338. 23. Best SM, Porter AE, Thian ES, Huang J. Bioceramics: Past, present and for the future. J Eur Ceram Soc 2008;28:1319–1327. 24. Bi Q, Song X, Chen Y, Zheng Y, Yin P, Lei T. Zn-HA/Bi-HA biphasic coatings on Titanium: fabrication, characterization, antibacterial and biological activity. Colloids Surfaces B Biointerfaces 2020;189:110813. 25. Blanco J, Caneiro L, Liñares A, Batalla P, Muñoz F, Ramos I. Peri‐implant soft tissue analyses comparing Ti and ZrO2 abutments: an animal study on beagle dogs. Clin Oral Implan Res 2016;27:1221–1226. 26. Bonjour J-P. Calcium and Phosphate: A Duet of Ions Playing for Bone Health. J Am Coll Nutr 2011;30:438S-448S. 27. Boukchina S, Akrout H, Berling D, Bousselmi L. Highly efficient modified lead oxide electrode using a spin coating/electrodeposition mode on titanium for electrochemical treatment of pharmaceutical pollutant. Chemosphere 2019;221:356–365. 28. Brand HS, Ligtenberg AJM, Veerman ECI. Saliva and Wound Healing. Monogr Oral Sci 2014;24:52–60. 29. Brunette DM. Principles of Cell Behavior on Titanium Surfaces and Their Application to Implanted Devices, in: : pp. 485–512. 30. Brunot C, Grosgogeat B, Picart C, Lagneau C, Jaffrezic-Renault N, Ponsonnet L. Response of fibroblast activity and polyelectrolyte multilayer films coating titanium. Dental Materials 2008;24:1025–1035. 31. Brunot-Gohin C, Duval JL, Azogui EE, Jannetta R, Pezron I, Laurent-Maquin D, et al. Soft tissue adhesion of polished versus glazed lithium disilicate ceramic for dental applications. Dental Materials : Official Publication of the Academy of Dental Materials 2013;29:e205-12. 32. Brunot-Gohin C, Duval J-L, Verbeke S, Belanger K, Pezron I, Kugel G, et al. Biocompatibility study of lithium disilicate and zirconium oxide ceramics for esthetic dental abutments. Journal of Periodontal & Implant Science 2016;46:362–10.

112

33. Bunpetch V, Zhang X, Li T, Lin J, Maswikiti EP, Wu Y, et al. Silicate-based bioceramic scaffolds for dual-lineage regeneration of osteochondral defect. Biomaterials 2018;192:323–333. 34. Buser D, Schenk RK, Steinemann S, Fiorellini JP, Fox CH, Stich H. Influence of surface characteristics on bone integration of titanium implants. A histomorphometric study in miniature pigs. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials 1991;25:889–902. 35. Carradò A, Perrin-Schmitt F, Le QV, Giraudel M, Fischer C, Koenig G, et al. Nanoporous hydroxyapatite/sodium titanate bilayer on titanium implants for improved osteointegration. Dent Mater 2017;33:321–332. 36. Catauro M, Bollino F, Giovanardi R, Veronesi P. Modification of Ti6Al4V implant surfaces by biocompatible TiO2/PCL hybrid layers prepared via sol-gel dip coating: Structural characterization, mechanical and corrosion behavior. Mater Sci Eng C 2017;74:501–507. 37. Catauro M, Bollino F, Papale F, Ferrara C, Mustarelli P. Silica–polyethylene glycol hybrids synthesized by sol–gel: Biocompatibility improvement of titanium implants by coating. Mater Sci Eng C 2015;55:118–125. 38. Catauro M, Papale F, Bollino F. Characterization and biological properties of TiO2/PCL hybrid layers prepared via sol-gel dip coating for surface modification of titanium implants. Journal of Non-Crystalline Solids 2015;415:9–15. 39. Catauro M, Papale F, Bollino F. Coatings of titanium substrates with xCaO·(1−x)SiO2 sol–gel materials: characterization, bioactivity and biocompatibility evaluation. Mater Sci Eng C 2016;58:846–851. 40. Catros S, Pothuaud L, Dard M, Fricain J. Collagen Fibrils of Human Acellular Extrinsic Fiber Cementum. J Periodontol 2008;79:1095–1100. 41. Chellappa M, Vijayalakshmi U. Electrophoretic deposition of silica and its composite coatings on Ti-6Al-4V, and its in vitro corrosion behaviour for biomedical applications. Mater Sci Eng C 2017;71:879–890. 42. Chen T, Yu W-H, Izard J, Baranova OV, Lakshmanan A, Dewhirst FE. The Human Oral Microbiome Database: a web accessible resource for investigating oral microbe taxonomic and genomic information. Database : The Journal of Biological Databases and Curation 2010;2010:baq013. 43. Chopra A, Sivaraman K, Narayan AI, Balakrishnan D. Etiology and classification of food impaction around implants and implant‐retained prosthesis. Clin Implant Dent R 2019;21:391–397. 44. Cochis A, Ferraris S, Sorrentino R, Azzimonti B, Novara C, Geobaldo F, et al. Silver- doped keratin nanofibers preserve a titanium surface from biofilm contamination and favor soft-tissue healing. Journal of Materials Chemistry B 2017;5:8366–8377. 45. Dalago HR, Filho GS, Rodrigues MAP, Renvert S, Bianchini MA. Risk indicators for Peri-implantitis. A cross-sectional study with 916 implants. Clinical Oral Implants Research 2016; 46. Damek-Poprawa M, Korostoff J, Gill R, DiRienzo JM. Cell Junction Remodeling in Gingival Tissue Exposed to a Microbial Toxin. Journal of Dental Research 2013;92:518–523. 47. Daudt NF, Bram M, Barbosa APC, Jr. CA. Surface modification of highly porous titanium by plasma treatment. Materials Letters 2015;141:194–197. 48. Davar F, Hassankhani A, Loghman-Estarki MR. Controllable synthesis of metastable tetragonal zirconia nanocrystals using citric acid assisted sol–gel method. Ceram Int 2013;39:2933–2941.

113

49. Derchi G, Vano M, Barone A, Covani U, Diaspro A, Salerno M. Bacterial adhesion on direct and indirect dental restorative composite resins: An in vitro study on a natural biofilm. The Journal of Prosthetic Dentistry 2017;117:669–676. 50. Derks J, Schaller D, Hakansson J, Wennström JL, Tomasi C, Berglundh T. Effectiveness of Implant Therapy Analyzed in a Swedish Population: Prevalence of Peri-implantitis. Journal of Dental Research 2016;95:43–49. 51. Dhaliwal JS, Rahman NA, Knights J, Ghani H, Junior RF de A. The effect of different surface topographies of titanium implants on bacterial biofilm: a systematic review. SN Applied Sciences 2019;1:1139–16. 52. Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Engler D. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage SpecificationCell 126, 677689. 53. Ferraris S, Giachet FT, Miola M, Bertone E, Varesano A, Vineis C, et al. Nanogrooves and keratin nanofibers on titanium surfaces aimed at driving gingival fibroblasts alignment and proliferation without increasing bacterial adhesion. Materials Science & Engineering C, Materials for Biological Applications 2017;76:1–12. 54. Ferraris S, Warchomicka F, Ramskogler C, Tortello M, Cochis A, Scalia A, et al. Surface structuring by Electron Beam for improved soft tissues adhesion and reduced bacterial contamination on Ti-grade 2. Journal of Materials Processing Tech 2019;266:518–529. 55. Fu J-H, Hsu Y-T, Wang H-L. Identifying occlusal overload and how to deal with it to avoid marginal bone loss around implants. European Journal of Oral Implantology 2012;5 Suppl:S91-103. 56. Fu T, Zhang F, Alajmi Z, Yang SY, Wu F, Han SL. Sol–Gel Derived Antibacterial Ag-Containing ZnO Films on Biomedical Titanium. J Nanosci Nanotechno 2018;18:823–828. 57. Garcia-Casas A, Aguilera-Correa JJ, Mediero A, Esteban J, Jimenez-Morales A. Functionalization of sol-gel coatings with organophosphorus compounds for prosthetic devices. Colloids Surfaces B Biointerfaces 2019;181:973–980. 58. García-Minguillán G, Río JD, Preciado A, Lynch CD, Castillo-Oyagüe R. Impact of the retention system of implant fixed dental restorations on the peri-implant health, state of the prosthesis, and patients’ oral health-related quality of life. J Dent 2020;94:103298. 59. Gasik M. Understanding biomaterial-tissue interface quality: combined in vitro evaluation. Sci Technol Adv Mat 2017;18:550–562. 60. Giannobile WV, Lang NP. Are Dental Implants a Panacea or Should We Better Strive to Save Teeth? J Dent Res 2016;95:5–6. 61. Gibbs S, Roffel S, Meyer M, Gasser A. Biology of soft tissue repair: gingival epithelium in wound healing and attachment to the tooth and abutment surface. European Cells & Materials 2019;38:63–78. 62. Gittens RA, Scheideler L, Rupp F, Hyzy SL, Geis-Gerstorfer J, Schwartz Z, et al. A review on the wettability of dental implant surfaces II: Biological and clinical aspects. Acta Biomater 2014;10:2907–2918. 63. Gollwitzer H, Haenle M, Mittelmeier W, Heidenau F, Harrasser N. A biocompatible sol–gel derived titania coating for medical implants with antibacterial modification by copper integration. Amb Express 2018;8:24. 64. Goodman SB, Yao Z, Keeney M, Yang F. The future of biologic coatings for orthopaedic implants. Biomaterials 2013;34:3174–3183.

114

65. Grieznis L, Apse P, Blumfelds L. Tactile Sensibility of Natural Teeth and Osseointegrated Dental Implants to Loading. Acta Chirurgica Latviensis 2016;15:1– 5. 66. Größner-Schreiber B, Herzog M, Hedderich J, Dück A, Hannig M, Griepentrog M. Focal adhesion contact formation by fibroblasts cultured on surface-modified dental implants: an in vitro study. Clinical Oral Implants Research 2006;17:736–745. 67. Gu D, Hagedorn Y-C, Meiners W, Meng G, Batista RJS, Wissenbach K, et al. Densification behavior, microstructure evolution, and wear performance of selective laser melting processed commercially pure titanium. Acta Mater 2012;60:3849–3860. 68. Gul H, Khan M, Khan AS. Bioceramics, in: : pp. 53–83. 69. Guo L, Smeets R, Kluwe L, Hartjen P, Barbeck M, Cacaci C, et al. Cytocompatibility of Titanium, Zirconia and Modified PEEK after Surface Treatment Using UV Light or Non-Thermal Plasma. International Journal of Molecular Sciences 2019;20:. 70. Hahnel S, Wastl DS, Schneider-Feyrer S, Giessibl FJ, Brambilla E, Cazzaniga G, et al. Streptococcus mutans biofilm formation and release of fluoride from experimental resin-based composites depending on surface treatment and S-PRG filler particle fraction. The Journal of Adhesive Dentistry 2014;16:313–321. 71. He J, Zhao B, Deng C, Shang D, Zhang C. Assessment of implant cumulative survival rates in sites with different bone density and related prognostic factors: an 8-year retrospective study of 2,684 implants. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 2015;30:360–371. 72. He X, Reichl F-X, Milz S, Michalke B, Wu X, Sprecher CM, et al. Titanium and zirconium release from titanium- and zirconia implants in mini pig maxillae and their toxicity in vitro. Dent Mater 2020;36:402–412. 73. Heimann RB. The challenge and promise of low-temperature bioceramic coatings: An editorial. Surface & Coatings Technology 2016;301:1–5. 74. Heitz-Mayfield LJA, Lang NP. Comparative biology of chronic and aggressive periodontitis vs. peri-implantitis. Periodontology 2000 2010;53:167–181. 75. Heitz-Mayfield LJA, Salvi GE. Peri-implant mucositis. Journal of Clinical Periodontology 2018;45 Suppl 20:S237–S245. 76. HJALMARSSON L, SMEDBERG J ‐I., WENNERBERG A. Material degradation in implant‐retained cobalt‐chrome and titanium frameworks. J Oral Rehabil 2011;38:61–71. 77. Höland W, Schweiger M, Watzke R, Peschke A, Kappert H. Ceramics as biomaterials for dental restoration. Expert Rev Med Devic 2014;5:729–745. 78. Holt SC, Kesavalu L, Walker S, Genco CA. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontology 2000 1999;20:168–238. 79. Iglhaut G, Becker K, Golubovic V, Schliephake H, Mihatovic I. The impact of dis‐ /reconnection of laser microgrooved and machined implant abutments on soft‐ and hard‐tissue healing. Clin Oral Implan Res 2013;24:391–397. 80. Iglhaut G, Schwarz F, Winter RR, Mihatovic I, Stimmelmayr M, Schliephake H. Epithelial Attachment and Downgrowth on Dental Implant Abutments—A Comprehensive Review. J Esthet Restor Dent 2014;26:324–331. 81. Ikeda H, Shiraiwa M, Yamaza T, Yoshinari M, Kido MA, Ayukawa Y, et al. Difference in penetration of horseradish peroxidase tracer as a foreign substance into the peri-implant or junctional epithelium of rat gingivae. Clin Oral Implan Res 2002;13:243–251. 82. Isidor F. Histological evaluation of peri-implant bone at implants subjected to occlusal overload or plaque accumulation. Clinical Oral Implants Research 1997;8:1–9.

115

83. Ivanovski S, Lee R. Comparison of peri-implant and periodontal marginal soft tissues in health and disease. Periodontology 2000 2017;76:116–130. 84. Jeong B-H, Park S-M, Hwang W-S, Hyun K-H, Park Y-O, Jung T-K, et al. Thermal Properties of Plasma-Sprayed Multilayer Al₂O₃/Yttria-Stabilized Zirconia Coating. Journal of Nanoscience and Nanotechnology 2020;20:524–529. 85. Jepsen S, Berglundh T, Genco R, Aass AM, Demirel K, Derks J, et al. Primary prevention of peri-implantitis: managing peri-implant mucositis. Journal of Clinical Periodontology 2015;42 Suppl 16:S152-7. 86. Jian X, Huang W, Wu D, You D, Lin Z, Chen J. Effect of Fibronectin-Coated Micro- Grooved Titanium Surface on Alignment, Adhesion, and Proliferation of Human Gingival Fibroblasts. Medical Science Monitor 2017;23:4749–4759. 87. Kassem YM, Alshimy AM, El-Shabrawy SM. MECHANICAL EVALUATION OF POLYETHERETHERKETONE COMPARED WITH ZIRCONIA AS A DENTAL IMPLANT MATERIAL. Alexandria Dent J 2019;44:61–66. 88. Kearns VR, Williams RL, Mirvakily F, Doherty PJ, Martin N. Guided gingival fibroblast attachment to titanium surfaces: an in vitro study. J Clin Periodontol 2013; 40:99–108. 89. Ketabchi A, Weck A, Variola F. Influence of oxidative nanopatterning and anodize- tion on the fatigue resistance of commercially pure titanium and Ti-6Al-4V. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials 2015;103:563–571. 90. Khalili AA, Ahmad MR. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences 2015;16:18149– 18184. 91. Kim KT, Eo MY, Nguyen TTH, Kim SM. General review of titanium toxicity. International Journal of Implant Dentistry 2019;5:10–12. 92. Kim Y-S, Shin S-Y, Moon S-K, Yang S-M. Surface properties correlated with the human gingival fibroblasts attachment on various materials for implant abutments: a multiple regression analysis. Acta Odontologica Scandinavica 2015;73:38–47. 93. Kolenbrander PE, Palmer RJ, Periasamy S, Jakubovics NS. Oral multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nature Reviews Microbiology 2010; 8:471–480. 94. Kolenbrander PE, Palmer RJ, Rickard AH, Jakubovics NS, Chalmers NI, Diaz PI. Bacterial interactions and successions during plaque development. Periodontol 2000 2006;42:47–79. 95. Lafaurie GI, Sabogal MA, Castillo DM, Rincón MV, Gómez LA, Lesmes YA, et al. Microbiome and Microbial Biofilm Profiles of Peri-Implantitis: A Systematic Review. Journal of Periodontology 2017;88:1066–1089. 96. Lang MS, Cerutis DR, Miyamoto T, Nunn ME. Cell Attachment Following Instrumentation with Titanium and Plastic Instruments, Diode Laser, and Titanium Brush on Titanium, Titanium-Zirconium, and Zirconia Surfaces. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 2016;31:799–806. 97. Lang NP, Berglundh T, Periodontology WG 4 of SEW on. Periimplant diseases: where are we now?--Consensus of the Seventh European Workshop on Periodon- tology, in: : pp. 178–181. 98. Lee K, Kim EH, Oh N, Tuan NA, Bae NH, Lee SJ, et al. Contribution of actin filaments and microtubules to cell elongation and alignment depends on the grating depth of microgratings. J Nanobiotechnol 2016;14:35. 99. Lindhe J, Berglundh T. The interface between the mucosa and the implant. Perio- dontol 2000 1998;17:47–54.

116

100. Linkevicius T, Vaitelis J. The effect of zirconia or titanium as abutment material on soft peri-implant tissues: a systematic review and meta-analysis. Clinical Oral Implants Research 2015;26 Suppl 11:139–147. 101. Linkevicius T, Valantiejiene V, Alkimavicius J, Gineviciute E, Andrijauskas R, Linkeviciene L. The Effect of a Polishing Protocol on the Surface Roughness of Zirconium Oxide. The International Journal of Prosthodontics 2020;33:217–223. 102. Littuma GJS, Sordi MB, Curtarelli RB, Aragonês Á, Cruz ACC da, Magini RS. Titanium coated with poly(lactic-co-glycolic) acid incorporating simvastatin: Biof- unctionalization of dental prosthetic abutments. Journal of Periodontal Research 2019. 103. Liu X, Zhou X, Li S, Lai R, Zhou Z, Zhang Y, et al. Effects of titania nanotubes with or without bovine serum albumin loaded on human gingival fibroblasts. International Journal of Nanomedicine 2014;9:1185–1198. 104. Löberg J, Mattisson I, Hansson S, Ahlberg E. Characterisation of Titanium Dental Implants I: Critical Assessment of Surface Roughness Parameters. The Open Bioma- terials Journal 2010;2:18–35. 105. Lou W, Dong Y, Zhang H, Jin Y, Hu X, Ma J, et al. Preparation and Characterization of Lanthanum-Incorporated Hydroxyapatite Coatings on Titanium Substrates. Int J Mol Sci 2015;16:21070–21086. 106. Łukaszewska-Kuska M, Krawczyk P, Martyla A, Hedzelek W, Dorocka-Bobkowska B. Hydroxyapatite coating on titanium endosseous implants for improved osseointegration: Physical and chemical considerations. Adv Clin Exp Med 2018;27:1055– 1059. 107. Lütjering G, Williams JC. Engineering Materials and Processes. 2003;149–175. 108. Ma H, Feng C, Chang J, Wu C. 3D-printed Bioceramic Scaffolds: from Bone Tissue Engineering to Tumor Therapy. Acta Biomater 2018;79:37–59. 109. Mabilleau G, Bourdon S, Joly-Guillou ML, Filmon R, Baslé MF, Chappard D. In- fluence of fluoride, hydrogen peroxide and lactic acid on the corrosion resistance of commercially pure titanium. Acta Biomater 2006;2:121–129. 110. Maçon ALB, Jacquemin M, Page SJ, Li S, Bertazzo S, Stevens MM, et al. Lithium- silicate sol-gel bioactive glass and the effect of lithium precursor on structure-property relationships. Journal of Sol-Gel Science and Technology 2017;81:84–94. 111. Magne P, Douglas WH. Rationalization of esthetic restorative dentistry based on biomimetics. Journal of Esthetic Dentistry 1999;11:5–15. 112. Magne P, Silva M, Oderich E, Boff LL, Enciso R. Damping behavior of implant- supported restorations. Clinical Oral Implants Research 2013;24:143–148. 113. Maleki-Ghaleh H, Hafezi M, Hadipour M, Nadernezhad A, Aghaie E, Behnamian Y, et al. Effect of Tricalcium Magnesium Silicate Coating on the Electrochemical and Biological Behavior of Ti-6Al-4V Alloys. Plos One 2015;10:e0138454. 114. Maminskas J, Puisys A, Kuoppala R, Raustia A, Juodzbalys G. The Prosthetic Influence and Biomechanics on Peri-Implant Strain: a Systematic Literature Review of Finite Element Studies. Journal of Oral & Maxillofacial Research 2016;7:e4. 115. Maminskas J, Zaleckyte M, Pilipavicius J, Kareiva A, Zekonis G, Juodzbalys G. Prosthetics of dental implants- surface roughness and P. gingivalisgrowth in vitro. Clinical Oral Implants Research 2018;29:356–356. 116. Marchi J, Ussui V, B CDRP, 2010. Analysis in vitro of the cytotoxicity of potential implant materials. I: Zirconia‐titania sintered ceramics. Wiley Online Library n.d.; 117. Marin E, Boschetto F, Pezzotti G. Biomaterials and biocompatibility: An historical overview. J Biomed Mater Res A 2020;

117

118. Martínez‐Ibáñez M, Murthy NS, Mao Y, Suay J, Gurruchaga M, Goñi I, et al. Enhancement of plasma protein adsorption and osteogenesis of hMSCs by function- nalized siloxane coatings for titanium implants. J Biomed Mater Res Part B Appl Biomaterials 2018;106:1138–1147. 119. Marzban K, Rabiee SM, Zabihi E, Bagherifard S. Nanostructured akermanite glass- ceramic coating on Ti6Al4V for orthopedic applications. J Appl Biomater Func 2018; 17:2280800018793819. 120. Mayanagi G, Sato T, Shimauchi H, Takahashi N. Microflora profiling of subgingival and supragingival plaque of healthy and periodontitis subjects by nested PCR. International Congress Series 2005;1284:195–196. 121. Mehl C, Kern M, Schütte A-M, Kadem LF, Selhuber-Unkel C. Adhesion of living cells to abutment materials, dentin, and adhesive luting cement with different surface qualities. Dental Materials : Official Publication of the Academy of Dental Materials 2016;32:1524–1535. 122. Mengel R, Meer C, Flores-de-Jacoby L. The treatment of uncoated and titanium nitride-coated abutments with different instruments. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 2004;19:232–238. 123. Merhie AE, Salerno M, Toccafondi C, Dante S. Neuronal-like response of N2a living cells to nanoporous patterns of thin supported anodic alumina. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces 2019;178:32–37. 124. Millhouse E, Jose A, Sherry L, Lappin DF, Patel N, Middleton AM, et al. Develop- ment of an in vitro periodontal biofilm model for assessing antimicrobial and host modulatory effects of bioactive molecules. BMC Oral Health 2014;14:80. 125. Mir-Mari J, Mir-Orfila P, Figueiredo R, Valmaseda-Castellón E, Gay-Escoda C. Pre- valence of peri-implant diseases. A cross-sectional study based on a private practice environment. Journal of Clinical Periodontology 2012;39:490–494. 126. Monaco C, Tucci A, Esposito L, Scotti R. Microstructural changes produced by abra- ding Y-TZP in presintered and sintered conditions. Journal of Dentistry 2013;41:121– 126. 127. Moon IS, Berglundh T, Abrahamsson I, Linder E, Lindhe J. The barrier between the keratinized mucosa and the dental implant. Journal of Clinical Periodontology 1999; 26:658–663. 128. Moon Y-H, Yoon M-K, Moon J-S, Kang J-H, Kim S-H, Yang H-S, et al. Focal adhesion linker proteins expression of fibroblast related to adhesion in response to different transmucosal abutment surfaces. The Journal of Advanced Prosthodontics 2013;5:341–350. 129. Mumcu E, Bilhan H, Cekici A. Marginal bone loss around implants supporting fixed restorations. The Journal of Oral Implantology 2011;37:549–558. 130. Myung S, Ko Y, Kim B. Protein adsorption and cell adhesion on three-dimensional polycaprolactone scaffolds with respect to plasma modification by etching and deposition techniques. Jpn J Appl Phys 2014;53:11RB01. 131. Nadargi DY, Gurav JL, Hawi NE, Rao AV, Koebel M. Synthesis and characterization of transparent hydrophobic silica thin films by single step sol–gel process and dip coating. J Alloy Compd 2010;496:436–441. 132. Nagasawa M, Takano R, Maeda T, Uoshima K. Observation of the bone surrounding an overloaded implant in a novel rat model. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 2013;28:109–116.

118

133. Nakazawa M, Yamada M, Wakamura M, Egusa H, Sakurai K. Activation of Osteo- blastic Function on Titanium Surface with Titanium-Doped Hydroxyapatite Nano- particle Coating: An In Vitro Study. Int J Oral Maxillofac Implant 2017;32:779–791. 134. Narimatsu I, Atsuta I, Ayukawa Y, Oshiro W, Yasunami N, Furuhashi A, et al. Epithelial and Connective Tissue Sealing around Titanium Implants with Various Typical Surface Finishes. ACS Biomaterials Science & Engineering 2019; acsbio- materials.9b00499. 135. Naruishi K, Nagata T. Biological effects of interleukin-6 on Gingival Fibroblasts: Cytokine regulation in periodontitis. Journal of Cellular Physiology 2018;233:6393– 6400. 136. Nascimento RM do, Carvalho VR de, Govone JS, Hernandes AC, Cruz NC da. Effects of negatively and positively charged Ti metal surfaces on ceramic coating adhesion and cell response. J Mater Sci Mater Medicine 2017;28:33. 137. Nothdurft FP, Fontana D, Ruppenthal S, May A, Aktas C, Mehraein Y, et al. Diffe- rential Behavior of Fibroblasts and Epithelial Cells on Structured Implant Abutment Materials: A Comparison of Materials and Surface Topographies. Clinical Implant Dentistry and Related Research 2015;17:1237–1249. 138. Okubo T, Nagamoto H. Low-temperature preparation of nanostructured zirconia and YSZ by sol-gel processing. Journal of Materials Science 1995;30:749–757. 139. Oliveira MN, Schunemann WVH, Mathew MT, Henriques B, Magini RS, Teughels W, et al. Can degradation products released from dental implants affect peri‐implant tissues? J Periodontal Res 2018;53:1–11. 140. Osman R, Swain M. A Critical Review of Dental Implant Materials with an Emphasis on Titanium versus Zirconia. Materials 2015;8:932–958. 141. Owens DK, Wendt RC. Estimation of the surface free energy of polymers. Journal of Applied Polymer Science 1969;13:1741–1747. 142. Padial-Molina M, López-Martínez J, O’Valle F, Galindo-Moreno P. Microbial Profiles and Detection Techniques in Peri-Implant Diseases: a Systematic Review. Journal of Oral & Maxillofacial Research 2016;7:e10. 143. Palla-Rubio B, Araújo-Gomes N, Fernández-Gutiérrez M, Rojo L, Suay J, Gurru- chaga M, et al. Synthesis and characterization of silica-chitosan hybrid materials as antibacterial coatings for titanium implants. Carbohyd Polym 2019;203:331–341. 144. Pandoleon P, Bakopoulou A, Papadopoulou L, Koidis P. Evaluation of the biological behaviour of various dental implant abutment materials on attachment and viability of human gingival fibroblasts. Dental Materials: Official Publication of the Academy of Dental Materials 2019;35:1053–1063. 145. Papaspyridakos P, Chen CJ, Singh M, Weber HP, Gallucci GO. Success criteria in implant dentistry: a systematic review. Journal of Dental Research 2012;91:242–248. 146. Parchańska-Kowalik M, Wołowiec-Korecka E, Klimek L. Effect of chemical surface treatment of titanium on its bond with dental ceramics. The Journal of Prosthetic Dentistry 2018;120:470–475. 147. Park J-E, Jang Y-S, Bae T-S, Lee M-H. Biocompatibility Characteristics of Titanium Coated with Multi Walled Carbon Nanotubes–Hydroxyapatite Nanocomposites. Materials 2019;12:224. 148. Parpaiola A, Cecchinato D, Toia M, Bressan E, Speroni S, Lindhe J. Dimensions of the healthy gingiva and peri‐implant mucosa. Clin Oral Implan Res 2015;26:657–662. 149. Pellegrini G, Canullo L, Dellavia C. Histological features of peri-implant bone subjected to overload. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger : Official Organ of the Anatomische Gesellschaft 2016;206:57–63.

119

150. Pennisi CP, Dolatshahi-Pirouz A, B MFC and S, 2011. Nanoscale topography reduces fibroblast growth, focal adhesion size and migration-related gene expression on platinum surfaces. Elsevier n.d. 151. Pereni CI, Zhao Q, Liu Y, Abel E. Surface free energy effect on bacterial retention. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces 2006;48:143–147. 152. Pérez-Chaparro PJ, Duarte PM, Shibli JA, Montenegro S, Heluy SL, Figueiredo LC, et al. The Current Weight of Evidence of the Microbiologic Profile Associated With Peri-Implantitis: A Systematic Review. Journal of Periodontology 2016;87:1295– 1304. 153. Pitta J, Zarauz C, Pjetursson B, Sailer I, Liu X, Pradíes G. A Systematic Review and Meta-Analysis of the Influence of Abutment Material on Peri-implant Soft Tissue Color Measured Using Spectrophotometry. The International Journal of Prostho- dontics 2020;33:39–47. 154. Pranskunas M, Poskevicius L, Juodzbalys G, Kubilius R, Jimbo R. Influence of Peri- Implant Soft Tissue Condition and Plaque Accumulation on Peri-Implantitis: a Systematic Review. Journal of Oral & Maxillofacial Research 2016;7:e2. 155. Primus CM, Tay FR, Niu L. Bioactive tri/dicalcium silicate cements for treatment of pulpal and periapical tissues. Acta Biomaterialia 2019;96:35–54. 156. Quinn GD, Hoffman K, Scherrer S, Lohbauer U, Amberger G, Karl M, et al. Fractographic Analysis of Broken Ceramic Dental Restorations, in: : pp. 161–174. 157. Ramanauskaite A, Daugela P, Juodzbalys G. Treatment of peri-implantitis: Meta- analysis of findings in a systematic literature review and novel protocol proposal. Quintessence International (Berlin, Germany : 1985) 2016;47:379–393. 158. Ramenzoni LL, Attin T, SCHMIDLIN PR. In Vitro Effect of Modified Polyethere- therketone (PEEK) Implant Abutments on Human Gingival Epithelial Keratinocytes Migration and Proliferation. Materials 2019;12:1401. 159. Ratner BD. Replacing and Renewing: Synthetic Materials, Biomimetics, and Tissue Engineering in Implant Dentistry. J Dent Educ 2001;65:1340–1347. 160. Raut HK, Ganesh VA, Nair AS, Ramakrishna S. Anti-reflective coatings: A critical, in-depth review. Energy & Environmental Science 2011;4:3779. 161. Reclaru L, Ardelean LC, Miu CA, Grecu AF. Are Zirconia Bioceramics and Ceramics Intended to Come in Contact with Skin Inert? Materials 2020;13:. 162. Renvert S, Persson GR, Pirih FQ, Camargo PM. Peri-implant health, peri-implant mucositis, and peri-implantitis: Case definitions and diagnostic considerations. Journal of Clinical Periodontology 2018;45 Suppl 20:S278–S285. 163. Renvert S, Polyzois I. Risk indicators for peri-implant mucositis: a systematic literature review. Journal of Clinical Periodontology 2015;42 Suppl 16:S172-86. 164. Ringer P, Colo G, Fässler R, Grashoff C. Sensing the mechano-chemical properties of the extracellular matrix. Matrix Biology : Journal of the International Society for Matrix Biology 2017;64:6–16. 165. Ritz U, Nusselt T, Sewing A, Ziebart T, Kaufmann K, Baranowski A, et al. The effect of different collagen modifications for titanium and titanium nitrite surfaces on functions of gingival fibroblasts. Clinical Oral Investigations 2017;21:255–265. 166. Rocha SS da, Adabo GL, Henriques GEP, Nóbilo MA de A. Vickers hardness of cast commercially pure titanium and Ti-6Al-4V alloy submitted to heat treatments. Braz Dent J 2006;17:126–129. 167. Romero-Gavilán F, Araujo-Gomes N, García-Arnáez I, Martínez-Ramos C, Elortza F, Azkargorta M, et al. The effect of strontium incorporation into sol-gel biomaterials

120

on their protein adsorption and cell interactions. Colloids Surfaces B Biointerfaces 2018;174:9–16. 168. Romero-Gavilan F, Araújo-Gomes N, Sánchez-Pérez AM, García-Arnáez I, Elortza F, Azkargorta M, et al. Bioactive potential of silica coatings and its effect on the adhesion of proteins to titanium implants. Colloids Surfaces B Biointerfaces 2018; 162:316–325. 169. Rompen E, Domken O, Degidi M, Pontes AEF, Piattelli A. The effect of material characteristics, of surface topography and of implant components and connections on soft tissue integration: a literature review. Clin Oral Implan Res 2006;17:55–67. 170. Rong M, Lu H, Wan L, Zhang X, Lin X, Li S, et al. Comparison of early osseointegration between laser-treated/acid-etched and sandblasted/acid-etched titanium implant surfaces. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2018;29:43. 171. Rutkunas V, Bukelskiene V, Sabaliauskas V, Balciunas E, Malinauskas M, Baltriu- kiene D. Assessment of human gingival fibroblast interaction with dental implant abutment materials. Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2015;26:169. 172. Ryan DPO, Fais LMG, Antonio SG, Hatanaka GR, Candido LM, Pinelli LAP. Y-TZP zirconia regeneration firing: microstructural and crystallographic changes after grinding. Dent Mater J 2017;36:2016–2124. 173. S. SN, N. S, D. S, N. S, Tsai W-B, N. S, et al. Nanoceramics on osteoblast proliferation and differentiation in bone tissue engineering. Int J Biol Macromol 2017;98:67–74. 174. Saaby M, Karring E, Schou S, Isidor F. Factors influencing severity of peri- implantitis. Clinical Oral Implants Research 2016;27:7–12. 175. Salerno M, Caneva-Soumetz F, Pastorino L, Patra N, Diaspro A, Ruggiero C. Adhe- sion and proliferation of osteoblast-like cells on anodic porous alumina substrates with different morphology. IEEE Transactions on Nanobioscience 2013;12:106–111. 176. Salerno M, Giacomelli L, Derchi G, Patra N, Diaspro A. Atomic force microscopy in vitro study of surface roughness and fractal character of a dental restoration composite after air-polishing. Biomedical Engineering Online 2010;9:59–11. 177. Salerno M, Itri A, Frezzato M, Rebaudi A. Surface microstructure of dental implants before and after insertion: an in vitro study by means of scanning probe microscopy. Implant Dentistry 2015;24:248–255. 178. Salvi GE, Bosshardt DD, Lang NP, Abrahamsson I, Berglundh T, Lindhe J, et al. Temporal sequence of hard and soft tissue healing around titanium dental implants. Periodontology 2000 2015;68:135–152. 179. Sánchez-Pérez A, Moya-Villaescusa MJ, Caffesse RG. Tobacco as a risk factor for survival of dental implants. Journal of Periodontology 2007;78:351–359. 180. Sanz-Martín I, Sanz-Sánchez I, Albornoz AC de, Figuero E, Sanz M. Effects of modified abutment characteristics on peri-implant soft tissue health: A systematic review and meta-analysis. Clinical Oral Implants Research 2018;29:118–129. 181. Schenk RK, Buser D. Osseointegration: a reality. Periodontology 2000 1998;17:22– 35. 182. Schincaglia GP, Hong BY, Rosania A, Barasz J, Thompson A, Sobue T, et al. Clinical, Immune, and Microbiome Traits of Gingivitis and Peri-implant Mucositis. Journal of Dental Research 2017;96:47–55. 183. Schroeder HE. The Periodontium. 1986;1–2. 184. Schulte W. Implants and the periodontium. International Dental Journal 1995;45:16– 26. 185. Schwarz F, Ferrari D, Herten M, Mihatovic I, Wieland M, Sager M, et al. Effects of surface hydrophilicity and microtopography on early stages of soft and hard tissue

121

integration at non-submerged titanium implants: an immunohistochemical study in dogs. Journal of Periodontology 2007;78:2171–2184. 186. Schwarz F, Sculean A, Wieland M, Horn N, Nuesry E, Bube C, et al. Effects of hydrophilicity and microtopography of titanium implant surfaces on initial supragingival plaque biofilm formation. A pilot study. Mund-, Kiefer- Und Gesichtschirurgie : MKG 2007;11:333–338. 187. Sculean A, Gruber R, Bosshardt DD. Soft tissue wound healing around teeth and dental implants. Journal of Clinical Periodontology 2014;41 Suppl 15:S6-22. 188. Sekine H, Komiyama Y, Hotta H. Mobility characteristics and tactile sensitivity of osseointegrated fixture-supporting systems. 189. Sghaireen MG. Fracture Resistance and Mode of Failure of Ceramic versus Titanium Implant Abutments and Single Implant-Supported Restorations. Clinical Implant Dentistry and Related Research 2015;17:554–561. 190. Shibli JA, Melo L, Ferrari DS, Figueiredo LC, Faveri M, Feres M. Composition of supra- and subgingival biofilm of subjects with healthy and diseased implants. Clinical Oral Implants Research 2008;19:975–982. 191. Siar CH, Toh CG, Romanos GE, Ng KH. Comparative assessment of the interfacial soft and hard tissues investing implants and natural teeth in the macaque mandible. Clin Oral Invest 2015;19:1353–1362. 192. Sidane D, Rammal H, Beljebbar A, Gangloff SC, Chicot D, Velard F, et al. Biocompatibility of sol-gel hydroxyapatite-titania composite and bilayer coatings. Mater Sci Eng C 2017;72:650–658. 193. Steinmassl P-A, Wiedemair V, Huck C, Klaunzer F, Steinmassl O, Grunert I, et al. Do CAD/CAM dentures really release less monomer than conventional dentures? Clinical Oral Investigations 2017;21:1697–1705. 194. Stephen AS, Millhouse E, Sherry L, Aduse-Opoku J, Culshaw S, Ramage G, et al. In Vitro Effect of Porphyromonas gingivalis Methionine Gamma Lyase on Biofilm Composition and Oral Inflammatory Response. PLOS ONE 2016;11:e0169157. 195. T BZ, Easteal AJ, Edmonds NR, Bhattacharyya D. Sol?Gel Preparation and Characterization of Lithium Disilicate Glass?Ceramic. Journal of the American Ceramic Society 2007;90:1592–1596. 196. Takamori ER, Cruz R, Gonçalvez F, Artificial RZ, 2008. Effect of roughness of zirconia and titanium on fibroblast adhesion. Wiley Online Library n.d.; 197. Takamori Y, Atsuta I, Nakamura H, Sawase T, Koyano K, Hara Y. Histopathological comparison of the onset of peri‐implantitis and periodontitis in rats. Clin Oral Implan Res 2017;28:163–170. 198. Tetè S, Zizzari VL, Borelli B, Colli MD, Zara S, Sorrentino R, et al. Proliferation and adhesion capability of human gingival fibroblasts onto zirconia, lithium disilicate and feldspathic veneering ceramic in vitro. Dental Materials Journal 2014;33:7–15. 199. Teughels W, Assche NV, Sliepen I, Quirynen M. Effect of material characteristics and/or surface topography on biofilm development. Clinical Oral Implants Research 2006;17:68–81. 200. Tevlin R, McArdle A, Atashroo D, Walmsley GG, Senarath-Yapa K, Zielins ER, et al. Biomaterials for Craniofacial Bone Engineering. J Dent Res 2014;93:1187–1195. 201. Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, Karamanos NK. Extracellular matrix structure. Advanced Drug Delivery Reviews 2016;97:4–27. 202. Thongsuriwong K, Amornpitoksuk P, Suwanboon S. Structure, morphology, photo- catalytic and antibacterial activities of ZnO thin films prepared by sol–gel dip-coating method. Advanced Powder Technology 2013;24:275–280.

122

203. Tomasi C, Tessarolo F, Caola I, Wennström J, Nollo G, Berglundh T. Morphogenesis of peri-implant mucosa revisited: an experimental study in humans. Clinical Oral Implants Research 2014;25:997–1003. 204. Usinskas P, Stankeviciute Z, Niaura G, Maminskas J, Juodzbalys G, Kareiva A. Sol– gel processing of calcium hydroxyapatite thin films on silicon nitride (Si3N4) substrate. Journal of Sol-Gel Science and Technology 2017;83:268–274. 205. Vakili N, Asefnejad A. Titanium coating: introducing an antibacterial and bioactive chitosan-alginate film on titanium by spin coating. Biomedical Engineering / Biomedizinische Technik 2020;0–20180108. 206. Veerachamy S, Hameed P, Sen D, Dash S, Manivasagam G. Studies on Mechanical, Biocompatibility and Antibacterial Activity of Plasma Sprayed Nano/Micron Ceramic Bilayered Coatings on Ti-6Al-4V Alloy for Biomedical Application. Journal of Nanoscience and Nanotechnology 2018;18:4515–4523. 207. Verardi S, Quaranta M, Bordin S. Peri-implantitis fibroblasts respond to host immune factor C1q. Journal of Periodontal Research 2011;46:134–140. 208. Voicu G, Miu D, Dogaru I, Jinga SI, Busuioc C. Vitroceramic interface deposited on titanium substrate by pulsed laser deposition method. Int J Pharmaceut 2016;510:449– 456. 209. Wang F, Li K, Ning C. Sintering properties of sol–gel derived lithium disilicate glass ceramics. Journal of Sol-Gel Science and Technology 2018;87:372–379. 210. Wang X, Lu T, Wen J, Xu L, Zeng D, Wu Q, et al. Selective responses of human gingival fibroblasts and bacteria on carbon fiber reinforced polyetheretherketone with multilevel nanostructured TiO2. Biomaterials 2016;83:207–218. 211. Wang X, Shi F, Gao X, Fan C, Huang W, Feng X. A sol–gel dip/spin coating method to prepare titanium oxide films. Thin Solid Films 2013;548:34–39. 212. Welander M, Abrahamsson I, Berglundh T. The mucosal barrier at implant abutments of different materials. Clinical Oral Implants Research 2008;19:635–641. 213. Wen TL, Hebert V, Vilminot S, Bernier JC. Preparation of nanosized yttria-stabilized zirconia powders and their characterization. Journal of Materials Science 1991;26:3787–3791. 214. Wilde EAWJD, Jimbo R, Wennerberg A, Naito Y, Coucke P, Bryington MS, et al. The soft tissue immunologic response to hydroxyapatite-coated transmucosal implant surfaces: a study in humans. Clinical Implant Dentistry and Related Research 2015;17 Suppl 1:e65-74. 215. Wong RL, Hiyari S, Yaghsezian A, Davar M, Casarin M, Lin Y, et al. Early intervention of peri‐implantitis and periodontitis using a mouse model. J Periodontol 2018;89:669–679. 216. Yamano S, Al‐Sowygh ZH, Gallucci GO, Wada K, Weber H, Sukotjo C. Early peri‐ implant tissue reactions on different titanium surface topographies. Clin Oral Implan Res 2011;22:815–819. 217. Ying P, Yu Y, Jin G, Biointerfaces ZTC and SB, 2003. Competitive protein adsorption studied with atomic force microscopy and imaging ellipsometry. Elsevier n.d.; 218. Zafar MS, Ullah R, Qamar Z, Fareed MA, Amin F, Khurshid Z, et al. Advanced Dental Biomaterials. 2019;7–35. 219. Zemtsova EG, Arbenin AYu, Valiev RZ, Orekhov EV, Semenov VG, Smirnov VM. Two-Level Micro-to-Nanoscale Hierarchical TiO2 Nanolayers on Titanium Surface. Materials 2016;9:1010. 220. Zhao B, Mei HC van der, Subbiahdoss G, Vries J de, Rustema-Abbing M, Kuijer R, et al. Soft tissue integration versus early biofilm formation on different dental implant

123

materials. Dental Materials : Official Publication of the Academy of Dental Materials 2014;30:716–727. 221. ZHAO G, Raines AL, Wieland M, Schwartz Z, Boyan BD. Requirement for both micron- and submicron scale structure for synergistic responses of osteoblasts to substrate surface energy and topography. Biomaterials 2007;28:2821–2829. 222. Zhao L, Chu PK, Zhang Y, Wu Z. Antibacterial coatings on titanium implants. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials 2009;91:470–480. 223. Zhou X, Shi J, Hu J, Chen Y. Cells cultured on microgrooves with or without surface coating: Correlation between cell alignment, spreading and local membrane deformation. Mater Sci Eng C 2013;33:855–863. 224. Zitzmann NU, Berglundh T, Ericsson I, Lindhe J. Spontaneous progression of experimentally induced periimplantitis. J Clin Periodontol 2004;31:845–849. 225. Zorzin J, Beck S, Belli R, Petschelt A, Boccaccini A, Lohbauer U. Adhesion and interfacial characterization of biomimetically texturized lithium disilicate. Int J Adhes Adhes 2019;91:131–141.

124

MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS DARBO TEMA

Straipsniai leidiniuose, referuojamuose duomenų bazėje „Clarivate Analytics Web of Science“ ir turinčiuose citavimo rodiklį: 1. Maminskas J, Pilipavicius J, Staisiunas E, Baranovas G, Alksne M, Dau- gela P, et al. Novel Yttria-Stabilized Zirconium Oxide and Lithium Disi- licate Coatings on Titanium Alloy Substrate for Implant Abutments and Biomedical Application. Materials. 2020;13(9):2070. [Citavimo rodiklis: 2,972 (2018)] 2. Usinskas P, Stankeviciute Z, Niaura G, Maminskas J, Juodzbalys G, Ka- reiva A. Sol-gel processing of calcium hydroxyapatite thin films on silicon nitride (Si3N4) substrate. Journal of Sol-Gel Science and Techno- logy. 2017 May 27;83(2):268–74. [Citavimo rodiklis: 1,745 (2017)]

Straipsniai recenzuojamuose mokslo leidiniuose, referuojamuose kitose duomenų bazėse: 1. Maminskas J, Puisys A, Kuoppala R, Raustia A, Juodzbalys G. The Pros- thetic Influence and Biomechanics on Peri-Implant Strain: a Systematic Literature Review of Finite Element Studies. Journal of oral & maxilla- facial research. 2016 Jul;7(3):e4. 2. Claudio Stacchi, Francesca Andolsek, Inesa Astramskaite, Federico Berton, Roberto Di Lenarda, Maria Helena Fernandes, Andrea Frassetto, Pedro de Sousa Gomes, Zygimantas Guobis, Ryo Jimbo, Gintaras Juodz- balys, Aiman Khoury1, Ricardas Kubilius, Ritva Kuoppala, Teresa Lom- bardi, Julius Maminskas, Ingrida Pacauskiene, Giuseppe Perinetti, Lukas Poskevicius, Mindaugas Pranskunas, Algirdas Puisys, Aune Raustia. The 1(st) Baltic Osseointegration Academy and Lithuanian University of Health Sciences Consensus Conference 2016. Summary and Consensus Statements: Group I – Peri-Implantitis Aetiology, Risk Factors and Pa- thogenesis. Journal of oral & maxillofacial research. 2016 Jul;7(3):e7.

Disertacijos tema pristatytų pranešimų sąrašas: 1. Maminskas J, Zaleckyte M, Pilipavicius J, Kareiva A, Zekonis G, Juodz- balys G. Prosthetics of dental implants – surface roughness and P. gingivalis growth in vitro. Clinical Oral Implants Research. 2018 Oct 8;29:356–356. 2. Maminskas, Julius; Puišys, Algirdas; Kuoppala, Ritva; Raustia, Aune; Juodžbalys, Gintaras. The Influence and bio-mechanics of implant loading in fixed structures on peri-implant bone: a systematic literature

125

review. / Šeštasis BOA ir LSMU kongresas ir konsensuso konferencija: 2016 m. rugsėjo 9–10 d., Kaunas, Lietuva: programa ir pranešimų santraukos = The Sixth BOA and LUHS congress and consensus conference p. 28–29, no. 19. 3. Stacchi, Claudio; Andolsek, Francesca; Astramskaitė, Inesa; Berton, Federico; Fernandes, Maria Helena; Frassetto, Andrea; Gomes, Pedro de Sousa; Guobis, Žygimantas; Jimbo, Ryo; Juodžbalys, Gintaras; Khoury, Aiman; Kubilius, Ričardas; Kuoppala, Ritva; Di Lenarda, Roberto; Lombardi, Teresa; Maminskas, Julius; Pacauskienė, Ingrida Marija; Peri- netti, Giuseppe; Poškevičius, Lukas; Pranskūnas, Mindaugas; Puišys, Algirdas; Raustia, Aune. The 1st Baltic Osseointegration Academy and Lithuanian University of Health Sciences consensus conference 2016, Kaunas, Lithuania. Summary and consensus statements: Group I – peri- implantitis aetiology, risk factors and pathogenesis. / Šeštasis BOA ir LSMU kongresas ir konsensuso konferencija: 2016 m. rugsėjo 9–10 d., Kaunas, Lietuva: programa ir pranešimų santraukos = The Sixth BOA and LUHS congress and consensus conference: Kaunas, Lithuania 9–10 September, 2016: programme and abstract book / Baltijos osteointegracijos akademija/Baltic Osseointegration Academy. Kaunas: Baltijos osteointegracijos akademija, 2016. p. 21–23, no. 13. 4. Maminskas Julius. Peri-implant gingival lodge: the way to harmony. / Rugsėjo 5 d., 2015: Baltijos osteointegracijos akademijos konferencija 2015, Kaunas, Lietuva.

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

145

146

147

148

149

150

151

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

169

CURRICULUM VITAE

Name, Surname: Julius Maminskas Address: Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Department of Prosthodontics, Sukilėlių 51, Kaunas. Mobile phone: +370 601 00033 E-mail: [email protected]

Medical education: 2015–Pres Doctoral (Ph.D.) studies in dentistry, Lithuanian University of Health Sciences Department of Prosthodontics 2012–2015 Residency of prosthetic dentistry Lithuanian University of Health Sciences, Department of Prosthodontics 2007–2012 Odontology studies, Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Odontology, A. Mickevičiaus 9, Kaunas, Lithuania

Work experience: 2012–Pres Assistant, Educational work at Lithuanian University of Health Sciences 2012–Pres Clinician, Private clinical practice “Senamiesčio Stomatologijos Klinika”

Membership at professional societies: 2019–Pres Member of European Prosthodontic Association. 2019–Pres Member of the Board, Baltic Osseointegration Academy (BOA) 2014–Pres Member of the Board Society of Lithuanian Prosthodontics (LOOD) 2012–Pres Member of Lithuanian Dental Chamber. 2010–2012 Chairman of Odontology research group

Scientific activity / lectures: 2020 “Novel Yttria-Stabilized Zirconium Oxide and Lithium Disilicate Coatings on Titanium Alloy Substrate for Implant Abutments and Biomedical Application“ Maminskas J, Pilipavicius J, Staisiunas E, B- aranovas G, Alksne M, Daugela P, Juodzbalys G., Materials. 2020; 13(9):2070. 12–13 of October, “Prosthetics of dental implants – surface roughness and P. gingivalis 2018 growth in vitro” Clin Oral Impl Res 2018;29:356–6. Maminskas J, Zaleckyte M, Pilipavicius J, Kareiva A, Zekonis G, Juodzbalys G. EAO Congress, Vienna, Austria.

170

24–25 of February, “Restorations of the endodontically treated teeth. Today's 2018 opportunities” at the BMOD conference, Birstonas, Lithuania. May of 2018 “Dental implant prosthetics. Influence of restorations on peri-implant tissues” at the conference “Science progress in dentistry”, Druskininkai, Lithuania. 2017 “Sol-gel processing of calcium hydroxyapatite thin films on silicon nitride (Si3N4) substrate” Usinskas P, Stankeviciute Z, Niaura G, Maminskas J, Juodzbalys G, Kareiva A. J Sol-Gel Sci Technol 2017;83: 268–74. doi:10.1007/s10971-017-4431-y. 12–13 of May, “Endodontically treated teeth. Interdisciplinary approach for better 2017 results” at the International LOOD Conference, Vilnius, Lithuania. 9–10 of September, “The Influence and bio-mechanics of implant loading in fixed structures 2016 on peri-implant bone: a systematic literature review” at the International BOA Consensus Conference, Kaunas, Lithuania. 9–10 of September, “Prosthetic treatment on dental implants: challenges, solutions and 2016 influence to peri-implant tissues” at the International BOA Consensus Conference, Kaunas, Lithuania. 9–10 of September, “The 1st Baltic Osseointegration Academy and Lithuanian University 2016 of Health Sciences consensus conference 2016, Kaunas, Lithuania. Summary and consensus statements: Group I – peri-implantitis aetiology, risk factors and pathogenesis” at the International BOA Consensus Conference, Kaunas, Lithuania. July of 2016 “The Prosthetic Influence and Biomechanics on Peri-Implant Strain: a Systematic Literature Review of Finite Element Studies.” Maminskas J, Puisys A, Kuoppala R, Raustia A, Juodzbalys G., Journal of oral & maxillofacial research. 2016 Jul;7(3):e4. 23 of May, 2016 Hands-on course “Advances in Implant and Prosthetic Dentistry”, Kaunas, Lithuania, 2016. 6 of May, 2016 “Ultra-conservative dental restorations” at the International LOOD Conference, Kaunas, Lithuania. 12 of December, “Occlusal splints for treatment. Intro.” at the conference “The progress 2015 in dentistry – the way to perfection”, Kaunas, Lithuania. 5 of September, “Peri-implant gingival lodge: the way to harmony” at the BOA 2015 conference 2015, Kaunas, Lithuania. 2015 “Periapical and endodontic status scale based on periapical bone lesions and endodontic treatment quality evaluation using cone-beam compu- ted tomography” Tadas Venskutonis, Gianluca Plotino, Luigi Tocci, Gianluca Gambarini, Julius Maminskas, Gintaras Juodzbalys // Journal of endodontics. New York: Elsevier Science. ISSN 0099-2399. 2015, vol. 41, iss. 2, p. 190-196. 20 of April, 2014 “Restorative solutions: CAD/CAM vs. classical way. Technical features, comfort, costs“ at the LDTS conference 2014, Kaunas, Lithuania.

171

13 of September, “Implants in the aesthetic zone: prosthetic solutions” at the BOA 2013 conference 2013, Kaunas, Lithuania. 2013 “Biomimetic mineralization on a macroporous cellulose-based matrix for bone regeneration” / Petrauskaite O, Gomes Pde S, Fernandes MH, Juodzbalys G, Stumbras A, Maminskas J, Liesiene J, Cicciù M // BioMed research international. New York : Hindawi Pub. Co. (Research article). ISSN 2314-6133. 2013, vol. 2013, p. Article ID 452750 (9 p.). 5 of October, 2012 “Supra-constructions on dental implants: perspectives of composites” at the International conference of Dental Society: “Treat – not leave behind”, Druskininkai, Lithuania. 10–13 of October, “Composite prosthetic components on dental implants: elements 2012 arrangemanet and biomechanic“ at the EAO 21th Annual Scientific Meeting, Copenhagen, Denmark. 8 of September, “Analysis of alloplastic cellulose-hydroxyapatite bone scaffold biologi- 2012 cal features“ “The Fourth International BOA Congress“, Kaunas, Lithuania. 8 of September, “Composite prosthetic components on dental implants: elements 2012 arrangement and biomechanics“ at the “The Fourth International BOA Congress“, Kaunas, Lithuania. 25 of April, 2012 “Nanohybrid composite-glass fiber post prothesis: mechanical strenght and properties analysis“ at the DENSPLY Student Clinicial Research Program, Copenhagen, Denmark. May of 2012 “Bone tissue engineering: polimeric cellulose – hydroxyapatite scaffold as bone grafting material. Synthesis and analysis” at the Annual Young Researchers Scientific Conference, Kaunas, Lithuania 1 of October, 2011 “Bone tissue engineering: polymeric cellulose – hydroxyapatite scaffold as bone grafting material: Synthesis and analysis“ at the „The Third International BOA Congress“, Kaunas, Lithuania. 27 of May, 2011 “Tissue engineering: cellulose scaffolds for bone replacement.” O. Petrauskaitė, V. Vitkauskas, J. Liesienė, A. Stumbras, J. Maminskas, G. Juodžbalys // Polymer chemistry and technology: Proceedings of scientific conference Chemistry and Chemical Technology: 27 May 2011, Kaunas / Kaunas University of Technology; [Editorial board: Juozas Vidas Gražulevičius (ed.), Julė Kiverienė ir kt.]. Kaunas: Tech- nologija. ISSN 2029-2457. 2011, p. 37–40. May of 2011 “Combined intracanal nanohybrid composite glass fiber post prosthesis” at the Annual Young Researchers Scientific Conference, Kaunas, Lithuania. May of 2011 “Re-lining efficiency of the temporary bis-acrylic prosthesis” at the Annual Young Researchers Scientific Conference, Kaunas, Lithuania.

172

May of 2011 “Immediate dentin sealing – the new point of view” at the Annual Young Researchers Scientific Conference, Kaunas, Lithuania. May of 2011 “Bone tissue engineering: cellulose – hydroxyapatite scaffold” at the Annual Young Researchers Scientific Conference, Kaunas, Lithuania. May of 2010 “Core build-up of the teeth: a direct and indirect way” at the Annual Young Researchers Scientific Conference, Kaunas, Lithuania. May of 2010 “Aetiology and risk factors in maxillofacial traumatology and odontogenic infections” at the Annual Young Researchers Scientific Conference, Kaunas, Lithuania.

173

PADĖKA

Su didžiausia pagarba, esu dėkingas savo moksliniam vadovui profesoriui Gintarui Juodžbaliui už mokslo kelią, kuriuo kartu vedėsi. Už tai, kad padėjo pažinti ir suprasti mokslo vertę. Esu labai dėkingas savo moksliniam partneriui dr. Jurgiui Pilipavičiui už jo genialius sprendimus ir darbą, kuriant, tiriant ir pritaikant biokeramines dangas. Už mokslinę sinchroniją ir požiūrio kampą pakeitusias chemijos žinias. Visada dėkingas ir savo rezidentūros studijų vadovui bei savo moksliniam mentoriui profesoriui Gediminui Žekoniui už suteiktas žinias ir prie- žiūrą, didžiulį palaikymą ir pasitikėjimą. Už mokslinių kelių paieškas, pamokas, puikų pavyzdį, komandinį darbą ir vertingas įžvalgas esu labai dėkingas dr. Povilui Daugėlai. Esu dėkingas Artūrui Stumbrui, kuris parodė mokslo kelią ir sinchro- niškai ėjo kartu. Ačiū, kad neleidom vienas kitam atsilikti. Esu dėkingas dr. Mildai Alksnei iš VU Biochemijos instituto Gyvybės mokslų centro už bendradarbiavimą, pagalbą, patarimus ir galimybes, atliekant citologinius tyrimus. Ačiū, už vertingas pamokas ir žinias. Esu dėkingas profesoriui Alvydui Gleizniui už nuolatinį rūpestį, palaiky- mą ir žmogišką paprastumą ieškant sprendimų. Taip pat visam supratingam Dantų ir žandikaulių ortopedijos klinikos kolektyvui. Taip pat esu dėkingas visiems buvusiems ir likusiems šalia. Visgi, Jūsų daug. Jūs man leidote suprasti, kad nesvarbu, ar laimi loterijoje, ar ištrauki nesėkmingą bilietą – netampi kitoks. Ačiū, kad niekad nebuvau vienas. Ir žinoma, svarbiausia, esu dėkingas savo šeimos nariams ir artimiesiems už tikėjimą, gal – žinojimą, už saugumo jausmą.

174