Universidade Federal De Goiás Instituto De Ciências Biológicas Programa De Pós-Graduação Em Ecologia E Evolução

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E EVOLUÇÃO

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PADRÕES E PROCESSOS NA DIVERSIFICAÇÃO DE TROPIDURUS OREADICUS (SQUAMATA, TROPIDURIDAE): UM LAGARTO DE ÁREAS ABERTAS DO CERRADO E

ILHAS SAVÂNICAS NA AMAZÔNIA

RODRIGO DE MELLO

Goiânia-GO

Julho de 2014

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou down- load, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [ X ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor (a): Rodrigo de Mello E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não Vínculo empregatício do autor Universidade Católica de Brasília (UCB) Agência de fomento: Sigla: CAPES País: Brasil UF: CNPJ: Título: Padrões e processos na diversificação de Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae): um lagarto de áreas abertas do Cerrado e ilhas savânicas na Amazônia Palavras-chave: Filogeografia. Modelagem de distribuição geográfica. Datação molecular. Biogeografia histórica. Morfometria Título em outra língua: Patterns and processes in the diversification of Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae): a lizard from open areas of Cerrado and savannic islands in Amazônia Palavras-chave em outra língua: Phylogeography. Geographic distribution modelling. Molecular dating. Historical biogeography. Morpho- metry. Área de concentração: Evolução. Genética. Ecologia. Herpetologia. Data defesa: (dd/mm/aaaa) 27/07/2014 Programa de Pós-Graduação: Ecologia e Evolução Orientador (a): Profª Drª Rosane Garcia Collevatti E-mail: [email protected] Co-orientador:* Guarino Rinaldi Colli *506.486.166-49 E-mail: [email protected] *Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento:

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______Data: / / 2015 Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo. RODRIGO DE MELLO

PADRÕES E PROCESSOS NA DIVERSIFICAÇÃO DE TROPIDURUS OREADICUS (SQUAMATA, TROPIDURIDAE): UM LAGARTO DE ÁREAS ABERTAS DO CERRADO E ILHAS SAVÂNICAS NA AMAZÔNIA

Orientadora: Drª Rosane Garcia Collevatti – UFG Co-orientador: Dr. Guarino Rinaldi Colli - UnB

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Evolução, da Universidade Federal de Goiás, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Ecologia e Evolução.

Goiânia-GO Julho de 2014

Tese defendida em sessão pública em 27 de julho de 2014 e aprovada pela Banca Examinadora constituída pelos membros:

Eu sou é eu mesmo Divêrjo de todo o mundo Eu quase que nada sei, mas desconfio de muita coisa (...) Viver, o senhor sabe: viver é etcétera Vivendo se aprende Mas o que se aprende mais é só a fazer maiores perguntas O correr da vida embrulha tudo, a vida é assim: Esquenta e esfria, aperta e daí afrouxa, sossega e depois desinquieta O que ela quer da gente é coragem.

- Jagunço Riobaldo, vulgo Tatarana, personagem do romance Grande Sertão: Veredas de João Guimarães Rosa.

Aos meus pais (in memorian) Agenor de Mello e Aparecida Assolari de Mello

AGRADECIMENTOS

A Deus, espiritualidade, ou qualquer que seja o nome que se dê a não-aleatoriedade das circunstâncias da vida que me fizeram trilhar os caminhos que me trouxeram até esta conquista.

Aos meus pais, Agenor de Mello e Aparecida de Mello pela criação, oportunidades, exemplos e amparos que me fizeram ser quem sou.

Aos meus irmãos Marcelo, Ricardo e Edimar por sempre me darem apoio, conselhos e ajuda sempre que precisei.

À Universidade Estadual de Maringá e à Universidade Federal de Goiás, pela formação.

Ao Programa de Ecologia e Evolução e ao Laboratório de Genética e Biodiversidade (LGBio), pelo aprendizado e aprimoramento acadêmico.

À profª. Drª Rosane Garcia Collevatti, pela orientação, aprendizado, confiança e oportunidades.

Ao prof. Dr. Guarino Rinaldi Colli, pela co-orientação, pelas oportunidades de aprendizado em minha temporada na Coleção Herpetológica da Universidade de Brasília (CHUNB) e pela mediação no processo de intercâmbio para o doutorado sanduíche.

Ao prof. Dr. Jack W. Sites, pelo acolhimento e atenção durante todo meu período de intercâmbio na Brigham Young University, Provo, UT, EUA.

Às boas amizades que construí em Goiânia, especialmente Natácia Evangelista de Lima, Suelen Gonçalves Rabelo, Talita Braga, Fabíola Fonseca, Alessandro Morais, Tatianne Piza, Rafael Félix de Magalhães e Renan Nunes Costa; e ao André F. Barreto-Lima, pela amizade construída em Brasília e pela ajuda e colaboração no segundo capítulo.

À minha cachorra Chica (in memorian), por sua alegria e companherismo, principalmente durante minha temporada em Goiânia-GO. Também sou grato a todos que cuidaram dela em minha ausência.

A todos que de alguma forma me ajudaram a compreender melhor o pensamento biológico; mesmo àquela parcela de prepotentes e/ou egocêntricos do universo acadêmico, por me lembrarem sempre do que não quero me tornar.

Aos pessimistas, pelo incentivo.

SUMÁRIO Introdução Geral Filogeografia...... 1

Influência dos períodos Terciário e Quaternário na diversificação da herpetofauna do Cerrado ...... 5 Modelagem de distribuição potencial e nicho ecológico...... 8 A espécie Tropidurus oreadicus: ecologia e distribuição geográfica...... 9 Variação geográfica da morfologia...... 11 Referências bibliográficas ...... 13

Capítulo 1. Decifrando a história evolutiva de Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae): um lagarto de áreas abertas do Cerrado com populações isoladas na Amazônia

Resumo...... 25 Abstract...... 26 Introdução...... 27 Teste de hipóteses relacionadas à história evolutiva de T. oreadicus...... 30 Material e Métodos Amostragem e obtenção de DNA ...... 31 Edição e alinhamento das sequências para confecção do banco de dados para as análises...... 35 Diversidade genética e padrões filogeográficos...... 36 Relações filogenéticas e identificação de linhagens recentes...... 39 Estimativas para árvore de espécie e tempos de divergência...... 40 Modelagem de paleodistribuição, identificação de refúgios e projeções de distribuição potencial para o futuro...... 43 Resultados Caracterização dos dados obtidos...... 47 Diversidade genética e padrões filogeográficos...... 47 Relações filogenéticas e identificação de linhagens recentes...... 53

Estimativas para árvore de espécie e tempos de divergência...... 60

Modelagem de paleodistribuição, identificação de refúgios e projeções de distribuição potencial para o futuro...... 61 Discussão...... 65 Referências bibliográficas...... 75 Apêndice...... 90

Capítulo 2. Variação geográfica na morfologia e teste de hipóteses sobre diferenciação fenotípica em Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae)

Resumo...... 95 Abstract...... 96 Introdução...... 97 Material e Métodos Coleta e mapeamento geográfico dos dados...... 99 Análise dos dados morfométricos...... 102 Resultados...... 104 Discussão...... 110 Referências bibliográficas...... 118 Apêndice...... 130

INTRODUÇÃO GERAL

Filogeografia: o estudo da distribuição geográfica da variabilidade genética das espécies

A biogeografia, que é o estudo do padrão de distribuição dos seres vivos na Terra, visa entender os limites da distribuição de uma espécie que podem ser estabelecidos por seus atributos ecológicos (e.g., umidade, temperatura, alimento, predadores e competidores) ou por alguma explicação histórica. Na maioria dos casos, a visão completa da distribuição de uma espécie exige tanto o conhecimento ecológico quanto o histórico; deste modo, os dois fatores não se opõem, sendo que as abordagens mais eficazes de análise consistem justamente em descobrir como ambos (a ecologia e a história) se combinaram para produzir a distribuição de uma espécie (Ridley, 2006). Historicamente, a biogeografia era dividida em dois campos principais, a ecogeografia, que enfatizava o papel das pressões ecológicas contemporâneas na modelagem da distribuição dos organismos (Avise, 2000), e a biogeografia histórica, que preocupava-se mais com a geografia e com as relações de parentesco entre espécies, gêneros e agrupamentos hierárquicos mais elevados (Ridley, 2006). Apesar dessa dicotomia inicial, atualmente há uma tendência de integração entre os biólogos que investigam aspectos biogeográficos. Riddle (2009) ressalta que muito dessa fusão se deve a uma nova geração de biogeógrafos com formação em disciplinas mais sintéticas como a macroecologia e a filogeografia, e que essas novas perspectivas devem trazer uma nova identidade para uma biogeografia mais integrada para esse século. De acordo com o autor, a expansão de nosso conhecimento atual sobre dinâmicas geológicas e climáticas na história da Terra e o desenvolvimento de novos métodos analíticos sofisticados oferecem novos vislumbres para decifrarmos a complexidade temporal e espacial envolvidas na evolução da biota do planeta. Ao se comparar as relações evolutivas das linhagens genéticas com suas localidades geográficas, ganhamos um melhor entendimento sobre as forças biogeográficas históricas que devem ter tido um papel importante no estabelecimento da arquitetura genética na distribuição geográfica de biotas regionais (Avise, 2009). Compreender como eventos históricos influenciaram a atual disposição geográfica de genes, populações e espécies é o maior objetivo da Filogeografia, um termo introduzido por Avise et al. (1987) que pode ser definido como ‘...um campo de estudo preocupado com os princípios e processos que governam a distribuição geográfica de linhagens

1 genealógicas, especialmente aquelas dentro e entre espécies proximamente relacionadas’ (Avise, 2000).

Uma noção radical na época dos primeiros estudos filogeográficos foi que cada indivíduo poderia ser tratado como uma unidade taxonômica operacional (OTU, operational taxonomic unit) nas análises, enquanto os estudos tradicionais da época de genética de populações consideravam as populações como unidades amostrais, ao invés de tratar os indivíduos como unidades focais durante as análises. Isto, por sua vez, requeria uma identificação a priori das populações, que introduziu uma indesejada circularidade em estudos de genética de populações (Hey & Machado, 2003) . Ao invés de se usar um único indivíduo ou vários indivíduos representativos como exemplares, as OTUs são linhagens evolutivas explícitas com múltiplas amostras contidas dentro de cada linhagem. Assim, os métodos estimadores de árvores de espécies modelam a associação de indivíduos com as linhagens evolutivas, em adição ao modelo coalescente de processos populacionais usados na inferência filogenética (Sites & Morando, 2009). O paradigma ‘árvore de espécie vs árvores gênicas’ permite que as relações entre linhagens e amostras individuais dessas linhagens sejam avaliadas em um quadro estatístico robusto (Brito & Edwards, 2009; Edwards & Knowles, 2014).

A abordagem para se reconstruir a árvore de espécies a partir de diversas árvores gênicas representa uma mudança fundamental em como os dados genéticos podem ser usados para se delinear espécies (de Queiroz, 2007). Ao invés de se equiparar árvores gênicas com uma árvore de espécie ou basear o status de uma espécie em algum ponto de corte genético (e.g., Baker & Bradley, 2006), a relação entre árvores de genes e a história das linhagens é modelada probabilisticamente usando a teoria coalescente (Hudson 1991; Rosenberg 2002; ver esquema ilustrativo na Figura 1).

Figura 1. Representação da organização hierárquica de diversidade em diferentes resoluções para ilustrar a discordância entre árvore de espécie e árvores gênicas. A espessura dos ramos da árvore de espécie é proporcional ao tamanho efetivo populacional de cada ramo terminal (A>C>B), um dos principais parâmetros derivados de estudos populacionais e da teoria coalescente utilizada atualmente na sistemática filogenética para se inferir árvores de espécies. As linhas em cinza e vermelho dentro da árvore de espécie representam dois genes que são aqui usados para demostrar diferenças na topologia e nos tempos de coalescência entre os alelos. A introdução de métodos analíticos baseados em DNA mitocondrial (mtDNA) permitiu que as histórias matrilineares de cada organismo fossem estimadas sem a tautológica situação de se predefinir amostras populacionais, e também permitiu aplicar métodos filogenéticos explícitos para perguntas de evolução intraespecífica (Sites & Morando, 2009). Os estudos filogeográficos atuais empregam um grande conjunto de diferentes ferramentas e métodos moleculares (e.g., Knowles, 2001; Hey & Nielsen, 2004; Dolman & Moritz, 2006; Excoffier & Heckel, 2006; Cornuet et al., 2008) e celebram a contribuição de uma ampla gama de disciplinas, de ecologia de comunidades, climatologia e geologia à genômica evolutiva e molecular (e.g., Harter et al., 2004; Carstens & Richards, 2007; Waltari et al., 2007; Rambaut et al., 2008; Carnaval et al., 2009).

Em paralelo ao desenvolvimento da filogeografia, a teoria coalescente foi aprimorada por biólogos demográficos que investigavam a dinâmica da sobreposição de sobrenomes em populações humanas. Eles desenvolveram modelos de processos envolvidos na ramificação de linhagens que puderam ser transformados, com poucas modificações, para estudos de processos de ramificações gênicas de locus de mtDNA (Avise, 2000). Isso levou a um rápido desenvolvimento de um corpo de métodos analíticos e estatísticos relacionados à essa teoria que explora conexões entre demografia populacional e genealogias gênicas dentro e entre espécies proximamente relacionadas. Ao contrário da teoria tradicional em genética de populações, que prevê mudanças futuras em frequências alélicas ao longo do tempo, a teoria coalescente projeta as genealogias gênicas retrospectivamente no tempo para estimar parâmetros como tamanhos populacionais históricos, tempos de divergência e taxas de migração, sendo responsável por processos estocásticos de ordenamento de linhagens (lineage sorting) dentro e entre árvores gênicas (Wakeley, 2008). Assim, a genealogia de qualquer grupo de genótipos pode ser traçada no passado, até que se chegue a um ancestral comum. A partir dessa ideia, vários parâmetros históricos e demográficos podem ser estimados - tais como o tempo do ancestral comum mais recente entre linhagens (ou tMRCA, time to most recent common ancestor), o parâmetro de ‘força coalescente’ (ou θ, que é uma função do tamanho populacional efetivo e da taxa de mutação), o parâmetro ‘força de crescimento’ (ou g, que representa a taxa de flutuação populacional de uma população) e o parâmetro ‘força de migração’ (ou M, que é uma função da proporção de indivíduos que saem e entram na população ponderada pela taxa de mutação). Com estes parâmetros é possível testar hipóteses sobre estruturação populacional, fluxo gênico e flutuações do tamanho das populações ao longo do tempo (Emerson et al., 2001). Isso posto, conclui-se que, com base em uma amostragem apropriada de indivíduos e de genes, os filogeógrafos da atualizado utilizam dados genéticos do presente de uma população para se testar hipóteses biogeográficas, descrever a evolução do isolamento reprodutivo de unidades populacionais, e ainda inferir a respeito da distribuição das genealogias e a origem de processos que as moldaram (Avise, 2009; Beheregaray, 2008). Neste sentido, a abordagem filogeográfica tem gerado contribuições valiosas que agregam conhecimento sobre a história evolutiva das espécies, permitindo inferir suas origens geográficas, a possível localização de refúgios em períodos-chave do passado, incentivando o estudo da evolução de marcadores moleculares e buscando

4 subsídios para o desenvolvimento de estratégias de conservação e manejo sustentável das espécies estudadas (Avise, 2000, 2009; Beheregaray, 2008).

Influência dos períodos Terciário e Quaternário na diversificação da herpetofauna do Cerrado

Os diferentes cenários biogeográficos já propostos na literatura sugerem que as origens de biomas ricos em espécies podem ser extremamente idiossincráticas, impulsionadas tanto por características únicas de histórias e fisiografias em escala regional e continental quanto por processos ecológicos mais universais em escalas mais locais (Qian & Ricklefs, 2000; Linder, 2005; Ricklefs, 2006). Se biomas ricos em espécies realmente possuem histórias muito diferentes, então entender as diferenças entre os biomas - e portanto dos mecanismos responsáveis pela origem e manutenção de suas riquezas - é crucial para interpretarmos os gradientes de biodiversidade ao longo do espaço (e.g., Moore & Donoghue, 2007; Donoghue, 2008) e do tempo (e.g., McKenna & Farrell, 2006; Jaramillo et al., 2006).

Já é bem estabelecido na literatura que as mudanças climáticas e a evolução geomorfológica da paisagem tiveram um papel primordial na diversificação biológica na região Neotropical, estimulando mudanças nos tipos ecológicos predominantes (Van der Hammen, 1974; Salgado-Labouriau, 1997; Pennington et al., 2000, 2004; Jansson & Dynesius, 2002; Ledru, 2002; Rull, 2006, 2008). Além disso, acredita-se que as influências combinadas dos processos orogênicos do Terciário e das flutuações climáticas do período Quaternário tenham tido um papel importante na geração e manutenção dos altos níveis de diversidade, tendo dirigido a diversificação de biomas abertos e biomas adjacentes compostos de florestas úmidas. No entanto, não há consenso de resultados na literatura em relação aos padrões encontrados para diferentes grupos taxonômicos (Werneck et al., 2012), e o papel das mudanças climáticas ocorridas no Quaternário versus eventos geomorfológicos do Terciário (Neógeno) na origem e diversificação da biodiversidade Neotropical ainda é um debate recorrente (Moritz et al., 2000; Rull, 2008, 2011; Hoorn et al., 2010). Eventos geológicos ocorridos no Mioceno (23-5,3 Mya1), por exemplo, foram interpretados como os principais determinantes na diversificação de

1 Milhões de anos atrás. A sigla ‘Mya’ será usada constantemente para se referir a essa medida de tempo 5 gêneros e espécies de lagartos (e.g.,Giugliano et al., 2007; Werneck et al., 2009; Domingos et al., 2014) e dentro de complexos de espécies de anfíbios anuros (e.g., Maciel et al., 2010), enquanto mudanças adaptativas recentes parecem ter sido influenciadas mais fortemente pela dinâmica do fogo (Simon et al., 2009) e mudanças climáticas do Quaternário, que foram invocadas como os principais determinantes genéticos de alguns grupos de plantas (Ramos et al., 2007; Caetano et al., 2008) e de moscas de fruta (Moraes et al., 2009) Um papel foi atribuído aos ciclos climáticos do Quaternário é a estabilidade de certos hábitats ao longo destas mudanças no clima (i.e., refúgios), especialmente no hemisfério norte (Hewitt, 2004), embora o clima também tenha exercido um impacto considerável no hemisfério sul, mesmo sem a ocorrência de geleiras (Carnaval et al., 2009; Pepper et al., 2011; Sérsic et al., 2011). Há consideráveis discussões devotadas às consequências de períodos secos no que diz respeito à contração da floresta úmida para ‘isolados’, e a Teoria dos Refúgios é apresentada como um estímulo possível para eventos de especiação que são refletidos nos padrões atuais de diversidade da Floresta Amazônica ( Haffer, 1969; Prance, 1973, 1982; Brown & Ab´Saber, 1979). Em sua essência, a teoria dos refúgios e dos redutos cuida das repercussões das mudanças climáticas quaternárias sobre o quadro distributivo de floras e faunas, em tempos determinados, ao longo de espaços físicos, paisagísticos e ecologicamente mutantes (Ab'Sáber, 2006). Colli (2005) e Lynch (1998), entretanto, salientam que uma ênfase excessiva tem sido dada a eventos históricos recentes, como as flutuações climáticas do Quaternário e suas consequências, em detrimento de eventos do Terciário, quando parece ter ocorrido grande parte da diversificação da herpetofauna sul-americana ( Heyer & Maxson, 1982; Estes & Báez, 1985; Bauer, 1993; Duellman, 1993). O Cerrado, sendo a maior savana da região Neotropical, comporta uma diversidade florística que cobre mais de 2 milhões de km² do Brasil Central e parte da Bolívia e Paraguai (Eiten, 1972; Oliveira & Marquis, 2002). O bima tem sido considerado como um hotspot global de biodiversidade (Myers et al., 2000) e se encontra majoritariamente sobre o Planalto Central, em locais com 500 a 1.200m de altitude e solos quase sempre mais lixiviados, ácidos e pobres em nutrientes em comparação aos da Caatinga e Chaco (Gottsberger & Silberbauer-Gottsberger, 2006). Na Amazônia, os cerrados existentes, apesar das enormes distâncias que os separam, guardam uma intrigante similaridade florística, o que por si só argumentaria em favor da ideia de tais cerrados representarem relictos botânicos. Ademais, a ausência de qualquer mecanismo

6 ecológico originando tal distribuição poderia reforçar a ideia de uma origem paleoclimática. Ab’Sáber (2003), discutindo os condicionantes do mosaico fitogeográfico do Brasil, defende que ilhas de vegetação exótica dentro das áreas core dos diferentes domínios morfoclimáticos e geobotânicos só podem ser explicados pela existência local de fatores de exceção, de ordem litológica, hidrológica, topográfica e paleobotânica. A ideia que embasa a Teoria dos Refúgios é que flutuações climáticas da passagem para uma fase mais seca e fria durante o Pleistoceno terminal, a biota de florestas tropicais ficou retraída às exíguas áreas de permanência da umidade, sofrendo mais tarde diferenciações resultantes deste isolamento (Haffer, 1969; Vanzolini & Williams, 1970; Viadana, 2000). Em relação à complexa história biogeográfica e os altos índices de biodiversidade do Cerrado, acredita-se que eles resultam de uma combinação da idade do bioma e da dinâmica das flutuações paleoclimáticas ocorridas no Quaternário (Cole, 1986; Oliveira-Filho & Ratter, 2002). Alguns padrões biogeográficos gerais descritos para a fauna geralmente enfatizam a importância da superfície geomorfológica do Cerrado e a acentuada estratificação horizontal de habitat, responsável por uma complexa paisagem em mosaico que pode promover e manter a diversidade apesar de sua simplicidade vertical (Colli et al., 2002). Por isso, espera-se que as avaliações filogenéticas e filogeográficas que levam em consideração a compartimentalização geomorfológica da paisagem do Cerrado revelem grupos de espécies Figura 2: Representação da compartimentalização morfológica da paisagem do Cerrado entre platôs anciãos monofileticamente recíprocos (Figura 2) e vales mais recentes. No topo estão as expectativas de diversificação e estrutura filogenética e filogeográfica: associados a formações do tipo savana monofilia recíproca de grupos de espécies de platôs e de vales. Fonte: Figura 4 de Werneck (2011). (campos cerrados) e florestados (florestas de galeria e matas secas) (Werneck, 2011). Entretanto, muito desse trabalho ainda é limitado pela disponibilidade, qualidade e quantidade de dados, uma vez que registro de

7 evidências fósseis, sequências de DNA multi-lócos e paleoreconstruções acuradas são necessárias para inferir com maior precisão sobre a histórias evolutivas das espécies. Conforme discutido por Colli et al. (2002), estudos prévios sobre a diversidade de lagartos do Cerrado descreveram assembleias pobres e praticamente sem endemismo (e.g., Vanzolini, 1976, 1988; Vitt, 1991; Vitt & Caldwell, 1993), dominadas por espécies generalistas compartilhadas com a Caatinga (e.g.,Vanzolini, 1976, 1988). No entanto, novos dados e interpretações descrevem a fauna de lagartos do Cerrado como assembleias complexas e ricas, dominadas por espécies fortemente associada a micro habitats específicos (Gainsbury & Colli, 2003; Mesquita et al., 2006) distribuídos de forma desigual em mosaicos (Colli et al., 2002; Nogueira et al., 2005). As estimativas de diversidade de lagartos e serpentes são quase duas vezes maiores do que aquelas previamente reportadas por Vanzolini (1988) e Silva & Sites (1995). Além disso, contrariamente às crenças iniciais, o Cerrado abriga um número considerável de espécies endêmicas (Colli et al., 2002; Nogueira et al., 2011). A discrepância aparente de riqueza de lagartos na Amazônia e no Cerrado, por exemplo, é devido a um efeito de área e não ao efeito de heterogeneidade de hábitat, uma vez que a Amazônia brasileira cobre uma área aproximada de 4 milhões de km², aproximadamente duas vezes a área coberta pelos cerrados (Colli et al., 2002).

Modelagem de distribuição potencial e nicho ecológico

Por mais que as causas dos padrões ecológicos em grande escala ainda necessitem de melhores explicações, os avanços nos estudos macroecológicos tem levado a importantes avanços nessa área (Hawkins, 2004). Uma das características ecológicas mais importantes observadas na macroecologia são os gradientes climáticos e latitudinais. Em decorrência dessa observação, surgem modelos ecológicos que pressupõem que os padrões observados são consequências da influência do clima sobre as distribuições das espécies. De fato, os fatores que afetam a distribuição geográfica dos organismos incluem como estes estão relacionados com seus ambientes e às suas interações intra e interespecíficas (Costa et al., 2008). No que se refere aos modelos de nichos ambientais ou ecológicos, estes constituem métodos que usam dados de ocorrência juntamente com os ambientais. Desta forma é possível correlacionar as condições ambientais com os requerimentos ecológicos adequados de uma espécie de um determinado hábitat. Nas décadas recentes houve um

8 interesse maior em estudos de distribuições de espécies geradas por modelagem de nicho potencial (Elith et al., 2006), o que pode ser explicado pela urgência em se conhecer a distribuição atual da biodiversidade no planeta. A modelagem tem sido uma ferramenta eficiente e útil para extrapolação de dados sobre a distribuição potencial das espécies no espaço e no tempo, baseada em modelos estatísticos que usam diferentes tipos de algoritmos, tornando-se importante quando aplicada à Biologia da Conservação (Flanklin, 2009). A modelagem de nicho ecológico (ENM, Ecological Niche Modelling) tem sido amplamente empregada na predição dos efeitos das mudanças climáticas na configuração geográfica das espécies (Parmesan, 2006; Svenning et al., 2011; Peterson & Soberon, 2012). Aplicações dessa abordagem em esforços conservacionistas são frequentemente baseados no mapeamento de áreas climaticamente adequadas para o futuro (Hanna et al., 2007) ou investigar a distribuição histórica de comunidades (i.e., refúgios) por meio da modelagem as distribuições potenciais das espécies (Werneck et al., 2011, 2012). Os ENMs projetados para cenários do passado podem fornecer, juntamente com as evidências de registro fósseis (quando existentes para o táxon sob investigação), um contexto espacial para análises de filogeografia estatística (e.g., Carnaval & Moritz, 2008; Collevatti et al., 2012a, 2012b), gerando cenários pretéritos independentes de histórias demográficas. Utilizando-se, portanto, dessa abordagem integrativa, esses paleocenários podem ser testados usando-se dados genéticos/moleculares a partir de modelos coalescentes (Richards et al., 2007; Collevatti et al., 2013). Na ecologia, de forma geral, é sabido que os répteis são considerados modelos em estudos ecológicos, inclusive, no que diz respeito às características dos efeitos climáticos e ambientais sobre a distribuição das espécies (Costa et al., 2008). Entre os Squamata, a influência de fatores bióticos e abióticos sobre os parâmetros da história de vida tem sido relatada através de estudos sobre variação e distribuição geográfica de espécies de lagartos (Mesquita & Colli, 2003).

A espécie Tropidurus oreadicus (Rodrigues, 1987): ecologia e distribuição geográfica

Tropidurus Wied-Neuwied, 1825, é um gênero diverso (23 espécies) incluído na família Tropiduridae e se distribui em hábitats abertos tropicais e subtropicais cis- Andinos, predominantemente ao longo da diagonal seca da América do Sul, em enclaves de savana na Amazônia e em uma grande área da costa Atlântica Brasileira (Rodrigues

1987, 1988; Ávila-Pires 1995; Harvey & Gutberlet 1998; Carvalho, 2013; Carvalho et al., 2013). Os tropidurídeos são considerados espécies onívoras com estratégias alimentares do tipo senta-e-espera (Araújo, 1987; Van-Sluys, 1995; Van-Sluys et al., 2004). São abundantes em hábitats abertos e menos frequentes em áreas densamente florestadas e, como animais ectotérmicos, estes lagartos se tornam ativos quando o sol primeiramente aquece as rochas e a exposição direta do sol ocorre por extensos períodos do dia ao longo do ano (Vitt, 1993). A ampla distribuição geográfica e as semelhanças morfológicas e ecológicas das espécies que compõem o gênero Tropidurus fizeram com que muitos estudos fossem realizados acerca de suas relações de parentesco, o que culminou em um histórico extenso de revisões taxonômicas para este grupo (Burt & Burt, 1931; Vanzolini & Gomes, 1979; Rodrigues, 1987; Frost, 1992; Frost et al., 2001). A natureza sedentária e o comportamento destes lagartos, que geralmente estão associados com afloramentos rochosos e solos arenosos (Rodrigues, 1987; Kohlsdorf et al., 2001), refletem-se em uma distribuição agregada; consequentemente sua alta abundancia local resulta em um grande número de indivíduos preservados em coleções científicas (Carvalho, 2013), o que é uma vantagem para potenciais estudos com o grupo.

No Brasil, o gênero Tropidurus está representado por 17 espécies, das quais 14 são endêmicas do País (Bérnils & Costa, 2012). As espécies do gênero estão dispostas em quatro grandes grupos (spinulosus, bogerti, semitaeniatus e torquatus). As espécies do grupo torquatus são típicas de formações abertas, ocorrendo por toda a diagonal de formações abertas da América do Sul composta pelas formações vegetacionais do Cerrado, da Caatingas e do Chaco (Rodrigues, 1987). Tropidurus oreadicus (Rodrigues, 1987) pertence ao grupo torquatus (Frost, 1992; Frost et al., 2001) e é um lagarto amplamente distribuído no Cerrado, ocupando os estados do Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Distrito Federal, Minas Gerais, Piauí, Bahia e Maranhão. Esta espécie ocorre em formações abertas ao longo do curso do rio Tocantins e alcança a costa do estado do Pará, na parte mais ao norte de sua distribuição (Rodrigues, 1987; Ávilla-Pires, 1995). Populações isoladas de T. oreadicus são encontradas em enclaves de savana nos estados do Pará, Rondônia e Amazonas (Rodrigues, 1987; Vitt & Caldwell, 1993; Ávila- Pires, 1995; Gainsbury & Colli, 2003). Rodrigues (1987) comenta sobre a variação morfológica observada nas populações de T. oreadicus nos enclaves de savana em Porto Velho, no estado de Rondônia, em relação às populações do Cerrado do Brasil Central. Entretanto, os dados merísticos analisados não permitiram uma separação confiável

10 dessas populações. Gainsbury & Colli (2003) reportam a ocorrência de uma nova variedade de Tropidurus associados com enclaves de savana em Guajará-Mirim, também no estado de Rondônia; de maneira similar, Werneck & Colli (2006) apontam a existência de uma forma de Tropidurus não identificada ocorrendo nos enclaves de florestas secas no Vale do Paranã, no estado de Goiás. Mais recentemente, Carvalho (2013) ressalta que o status das populações acima mencionadas, presumivelmente associadas à T. oreadicus, ainda não foi devidamente investigado.

Variação geográfica da morfologia

Conforme levantado por Barreto-Lima (2012), a predição de que a variação morfológica está relacionada com as características ambientais tem sido um tema que constantemente desperta o interesse de ecólogos e biólogos evolutivos (Luxbacher & Knouft, 2009). Dentro da distribuição geográfica de um táxon, as forças potenciais que explicam a variabilidade morfológica incluem diferentes tipos de presas, pressão de predação (Schneider et al., 1999), os efeitos do clima e outros fatores ambientais sobre as razões de crescimento (Schäuble, 2004). Em geral, um componente da variação morfológica de uma espécie está mais relacionado à variabilidade climática, que é um importante fator para se entender a adaptação, distribuição, mecanismos de diversificação e as respostas às mudanças globais (Millien et al., 2006). Porém, poucos trabalhos têm considerado a extensão de quais características morfológicas podem estar associadas a quais características ambientais em amplas áreas geográficas (Luxbacher & Knouft 2009), que poderiam explicar as causas da variação geográfica na morfologia das espécies, seja por fatores ecológicos e adaptativos atuais ou históricos. A observação de que a forma do corpo dos organismos (morfologia) varia com a latitude é tão antiga quanto a percepção de um gradiente geográfico de diversidade de espécies (Blackburn et al., 1999). Assim, entende-se que o fator geográfico da latitude também pode estar associado à variação morfológica das espécies, pois este está relacionado ao clima de uma área e pode influenciar geograficamente o clima de uma região. O tamanho do corpo é uma das características mais importantes dos organismos (Rodríguez et al., 2006), onde muitos aspectos da vida destes sofrem influência do tamanho do corpo na interação com o ambiente abiótico, nas taxas dos processos fisiológicos ou nas suas interações com outros organismos (Cushman et al., 1993, Terribile, 2009). Além disso, o tamanho do corpo e das suas extremidades tende a seguir

11 alguns padrões ecogeográficos como as regras de Bergmann (1847) e de Allen (1877) (Bidau & Marti, 2008), onde é possível identificar um padrão latitudinal no tamanho de espécies aparentadas, mas alguns autores discordaram, pois o padrão deveria ser um fenômeno apenas intra-específico (Mayr, 1956). A regra de Bergmann seria, por exemplo, mais forte dentro do nível de espécies, mas especula-se que ela poderia também ser aplicada em outros níveis – para todos homeotérmicos em alto nível taxonômico (e.g. espécies dentro da mesma família ou ordem), para espécies dentro do mesmo gênero e para populações dentro da mesma espécie, embora ele provavelmente tenha salientado o segundo padrão acima (Meiri & Thomas, 2007; Barreto-Lima, 2012). Blackburn et al. (1999) afirmaram que haveria uma associação positiva entre tamanho das espécies em um grupo monofilético e a latitude ocupada por estas. Para os vertebrados ectotérmicos, estudos sobre variações latitudinais no tamanho do corpo são controversos, como a regra de Bergmann que se aplica a certos grupos, como anuros (Olalla-Tárraga & Rodríguez, 2007), lagartos (Cruz et al., 2005, Olalla-Tárraga et al., 2006) e quelônios (Ashton & Feldman, 2003). No caso da regra de Allen, esta prediz que nos animais endotérmicos o comprimento relativo das extremidades (asas, bicos, membros, caudas e orelhas) é menor em regiões frias e maior em regiões quentes (Yom-Tov et al., 2002, Aho et al., 2011). Esta regra tem sido frequentemente ofuscada pela de Bergmann (Yom-Tov et al., 2002), pois no que diz respeito a padrões do tamanho do corpo, a maior parte dos trabalhos tem sido dedicada a padrões “Bergmannianos” intra e interespecífica, enquanto que a regra de Allen, embora diretamente relacionada com a forma, tem tradicionalmente recebido menos atenção (Bidau & Marti, 2008; Barreto-Lima, 2012). Esta regra foi também sugerida para ectotérmicos (Ray 1960), mas raramente testada na natureza (Bidau & Marti, 2008; Barreto-Lima, 2012). A temperatura do corpo do ectotérmico é principalmente aumentada pela exposição às fontes externas de calor (e.g. substratos) e a conservação da energia termal é obtida por uma menor área de superfície corpórea, que também é limitada para a absorção de calor (Aho et al., 2011). Isto pode ser uma vantagem em ambientes termicamente heterogênios, como também pode ser uma necessidade para se evitar o superaquecimento em microhábitats quentes e se conservar a energia termal em microhábitats frios (Aho et al., 2011).

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CAPÍTULO 1

Decifrando a história evolutiva de Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae): um lagarto de áreas abertas do Cerrado com populações isoladas na Amazônia

Rodrigo de Mello1,4, Jack W. Sites Jr.2, Guarino Rinaldi Colli3, Rosane Garcia Collevatti4

¹Pós-Graduação em Ecologia & Evolução, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás74001-970, Goiânia-GO, Brasil. ²Department of Biology, Brigham Young University, Provo, UT 84602, EUA. 3Laboratório de Herpetologia, Departamento de Zoologia, Universidade de Brasília, 70910-900, Brasília-DF, Brasil. 4Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, 74001-970, Goiânia-GO, Brasil.

RESUMO

A biogeografia histórica está atualmente revigorada devido à revolução da genética molecular na sistemática filogenética e genética populacional, além das novas abordagens para se testar hipóteses biogeográficas. Além disso, novas ferramentas para gerar modelos paleoclimáticos e de nicho ecológico estão mudando a direção dos estudos filogeográficos, tornando-os mais integrados. O bioma Cerrado cobre cerca de 2 milhões de km² do Brasil Central, representando cerca de 23% da superfície terrestre do país. Embora novos estudos recentes indiquem que o bioma abriga uma fauna de répteis rica, complexa e diversificada, os padrões de distribuição e estrutura genéticas permanecem pouco conhecidos para a herpetofauna do Cerrado. O lagarto Tropidurus oreadicus tem uma histórica ecológica interessante relacionada às formações vegetacionais abertas, ocorrendo em áreas abertas do Cerrado e em enclaves de savana na floresta Amazônica. A fim de investigar sua história evolutiva, nós utilizamos uma amostragem genética e geográfica robusta, um conjunto de dados multi-lócos e modelagem de paleodistribuição baseada na projeção da distribuição atual para ambientes pretéritos (6 e 21 mil anos atrás) usando 11 métodos de modelagem de distribuição de espécie e cinco modelos acoplados de circulação atmosfera-oceânica. Nossos resultados fornecem novos vislumbres sobre a estrutura genética e espacial da espécie, revelando seis grandes linhagens mitocondriais e tempos de divergências com padrões tanto antigos (Terciário) quanto mais recentes (Quaternário) para a árvore de espécie. As análises espaciais para modelagem de paleodistribuição mostram pequenas retrações durante o Holoceno Médio, e o mapa de refúgios sugere uma ampla área de estabilidade para a espécie durante as flutuações climáticas. As importâncias relativas de eventos geomorfológicos do Neógeno e das mudanças climáticas do Quaternário como mecanismos causais da diversificação da espécie são discutidas. Por fim, inferências sobre potenciais mudanças futuras na distribuição geográfica da espécie são apresentadas, visando contribuir com as recentes discussões conservacionistas para a preservação da biodiversidade brasileira em politicas públicas de conservação.

Palavras-chave: Filogeografia, modelagem de distribuição, datação molecular, biogeografia histórica.

ABSTRACT

Historical biogeography is currently invigorated due to the molecular genetics revolution in systematics and population genetics, besides the new approaches to test biogeographical hypothesis. Furthermore, new tools for generating ecological niche and palaeoclimate models are shifting the direction of phylogeographic studies by making them more integrated. The Brazilian savanna (Cerrado biome) vegetation covers some 2 million km² of Central Brazil, representing about 23% of the land surface of the country. Although recent studies indicate that the biome harbours a rich, complex and characteristic reptilian fauna, patterns of species distribution and genetic structure remain poorly understood for the Cerrado herpetofauna. The lizard Tropidurus oreadicus has an interesting ecological history related to the open vegetation formations, occuring in open areas of Cerrado and in savanna enclaves in Amazonia rainforest. In order to investigate its evolutionary history, we used a robust geographical and genetic sampling, a multilocus dataset and palaeodistribution modelling based on the projection of current distribution into past environments (6 and 21ky BP) using 11 methods for SDMs and five coupled atmosphere–ocean global circulation models (AOGCMs). Our results provide new insights on the genetic and spatial structure of the species revealing six major mtDNA lineages and divergence dates with both deep (Tertiary) and shallow (Quaternary) patterns of diversification for the species tree. The spatial analysis for paleodistribution modelling showed little retractions in Mid-Holocene and the refugia map suggests a broad stable area for the species. The relative influences of Neogene geomorphological events and Quaternary climatic changes as causal mechanisms on the species diversification are discussed. Lastly, we present some inferences about potential future changes in the species geographical distribution, aiming to contribute with the recent conservation discussions on how to preserve Brazilian biodiversity in public policies of conservation

Keywords: Phylogeography, species distribution modelling, molecular dating, historical biogeography.

INTRODUÇÃO

O grande impacto da genética molecular na sistemática e genética de populações, que começou com a proposta de que os marcadores moleculares neutros evoluem de forma semelhante a um relógio ( Zuckerkandl & Pauling, 1965; Kimura, 1987), fez com que a Biogeografia recebesse um enorme revigoramento no final da década de 1980 (Avise et al., 1987; Ridlle et al., 2008) . O fato de que mudanças evolutivas são mais completamente compreendidas quando consideramos o contexto geográfico motivou o desenvolvimento de ferramentas analíticas para revelar as pegadas da história espacial em sequências moleculares contemporâneas (Lemey et al., 2010). O interesse em delimitar espécies e inferir sobre os padrões e mecanismos de especiação segundo esses critérios foi grande em meados do século XX, na conhecida era da “Nova Sistemática” (Mayr, 1982). Apesar da atividade ter declinado após essa época (Wiens, 1999), recentemente apareceram sinais de um “Renascimento” (Sites & Marshall, 2003), e alguns métodos novos têm sido propostos para testar os limites das espécies (e.g., Wiens & Servedio, 2000; Puorto et al., 2001; Templeton, 2001;; Wiens & Penkrot, 2002; Edward & Knowles, 2013). A biogeografia moderna, portanto, possui novo fôlego devido aos desenvolvimentos teóricos e analíticos da biologia molecular (Riddle, 2009; Riddle et al., 2008), que culmina com o estabelecimento da disciplina de Filogeografia.

A crescente disponibilidade de marcadores genético nucleares, os recentes avanços na genética de paisagem, a teoria coalescente e as novas ferramentas para se gerar modelos de nicho ecológico mudaram a direção dos estudos filogeográficos. Isso inclui modelos capazes de testar, a priori, hipóteses explícitas quando disponíveis ou estimar a história filogeográfica na ausência de tais hipóteses em um quadro estatístico minucioso (Lemmon & Lemmon, 2008). As informações que podem ser obtidas a partir desse tipo de abordagem fizeram com que a aplicação dos métodos coalescentes na delimitação de espécies crescesse rapidamente (Carstens & Knowles, 2007; Edwards et al., 2007; Liu & Pearl, 2007; Brumsfield et al., 2008), bem como a aplicação de métodos de filogeografia comparada para a conservação de processos evolutivos (Davis et al., 2008). Os estudos filogeográficos atuais incluem os preceitos da geografia em uma perspectiva histórica e multidisciplinar, tendo em vista que as pressões ecológicas e contemporâneas não são as únicas responsáveis pela distribuição espacial das linhagens, e a seleção natural não é o único mecanismo capaz de gerar linhagens que reflitam padrões geográficos (Avise, 2000). O isolamento geográfico de uma população geralmente é decorrente de eventos

27 históricos, podendo ser causado por dispersão e/ou vicariância. Os limites de uma espécie mudarão se os membros dela se moverem no espaço, caracterizando o processo de dispersão. Animais e plantas movem-se ativa e passivamente no espaço para procurar áreas desocupadas ou em resposta a mudanças ambientais (Ridley, 2006; Freeman & Herron, 2009). Embora muitos aspectos iniciais da Filogeografia tenham sido orientados em direção à descoberta de distribuições geográficas de linhagens de um único gene, muitos estudos agora incorporam dados de lócos2 nucleares múltiplos na tentativa de resolver o problema da discordância ‘árvore gênica versus árvore de espécies’ ( Edwards & Beerli, 2000; Carstens & Knowles, 2007). A taxa de divergência das sequências de DNA mitocondrial (mtDNA) parece extraordinariamente adequada para explorar a genealogia da especiação em animais, já que ela é rápida o suficiente para mostrar diferenças populacionais ao longo da distribuição geográfica de uma espécie, e lenta o bastante para não se saturar com mutações recorrentes ao longo de alguns milhões de anos (Hewitt, 1996; Avise et al., 1998). Entretanto, taxas de substituição mais lentas são requeridas para se acessar relações filogenéticas mais profundas, enquanto taxas mais rápidas são mais adequadas para dinâmicas populacionais e divergências mais recentes (ver Tabela 1 em Hewitt, 2001). Qualquer abordagem usada isoladamente provavelmente será incapaz de delimitar acuradamente linhagens evolutiva sob um conjunto de condições plausíveis (Sites & Marshall, 2004). Devido a essa limitação, os pesquisadores que trabalham com investigações que envolvem delimitação de espécies devem analisar seus dados usando uma vasta gama de métodos e depositar sua confiança na congruência observada nos resultados (Carstens et al., 2013). Em vista disso, um passo importante para se reconhecer abordagens genéticas em um contexto mais amplo inclui fontes de dados não-genéticos, preferencialmente aqueles de cunho geográfico explícito, como modelagens de distribuição de espécies (SDM, Species Distribution Modelling) e de nicho ecológico (ENM, Ecological Niche Modelling), que têm sido cada vez mais utilizadas para predizer distribuições geográficas históricas em escalas regionais e global (ver Svenning et al., 2011, para uma revisão recente). Essas ferramentas podem ser usadas em conjunto com métodos paleoambientais (e.g. Cowling et al., 2001, 2004, 2008; Mayle, 2004; Mayle et al., 2004) para entender as respostas de espécies ou comunidades às mudanças climáticas ocorridas nos períodos

2 As palavras ‘lóco’ e ‘lócos’ serão empregadas aqui em lugar dos termos latinos locus e loci, respectivamente 28

Terciário e Quaternário, ou estimar distribuições ancestrais de espécies a fim de formular hipóteses biogeográficas em estudos filogenéticos e filogeográficos (e.g., Carstens & Richards, 2007; Knowles et al., 2007; Richards et al., 2007; Chan et al., 2011; Marske et al., 2011). Apesar de sua importância no âmbito conservacionista global, o Cerrado ainda é muito pouco conhecido no que tange às origens e diversificação de sua biota. Embora ainda escassos, dados de filogenias moleculares, incluindo padrões de endemismo, apontam para uma origem antiga para as cobras e lagartos do Cerrado (e.g., Giugliano et al., 2007; Torres-Carvajal & de Queiroz, 2009; Werneck et al., 2009), incluindo mudanças orogênicas do Terciário como determinantes chave da diversidade da herpetofauna do bioma (Nogueira et al., 2011). Entre os grupos animais, os lagartos são usados extensivamente como modelos biológicos para estudos evolutivos, desde ecologia de comunidades, comportamento, múltiplas origens de alongamento do corpo com perda ou redução de membros, múltiplas origens de novas estratégias reprodutivas, incluindo partenogênese e viviparidade (e.g., Sites et al., 2011), bem como estudos de filogeografia e especiação (e.g., Camargo et al., 2010). Nesse contexto, devido às condições ecológicas e históricas que podem ter influenciado a evolução dos Tropidurus no Cerrado e em enclaves na Amazônia, a espécie T. oreadicus se mostra um modelo relevante para estudos que visam complementar o entendimento acerca das origens e diversificação da herpetofauna do Cerrado, já que é um organismo relativamente sensível a variações climáticas e topográficas. Algumas dúvidas de cunho mais taxonômico, por exemplo, que iniciaram-se no fim da década de 1980, mais recentemente foram revigorados num contexto filogeográfico. Werneck (2011), em uma revisão sobre os aspectos biogeográficos das áreas abertas da América do Sul, especialmente daqueles que usam abordagens moleculares, sugere áreas férteis de pesquisas nos ambientes abertos, entre elas: (i) uma melhor compreensão do papel de enclaves na evolução da diversidade da biota de áreas abertas, como as ilhas de Cerrado na Amazônia; (ii) estimar tempos de divergências para grupos filogeográficos monofiléticos que podem ser associados com grandes eventos geológicos que moldaram a evolução da biota de áreas abertas; e (iii) entender os níveis de diversidade genética e diferenciação de biomas distintos.

Teste de hipóteses relacionadas à história evolutiva de T. oreadicus

De modo geral, é esperado que uma estabilidade populacional durante o Quaternário seja refletida em diversidades genéticas maiores e forte estruturação filogeográfica entre refúgios em oposição a regiões não estáveis, cujas populações apresentariam uma assinatura genética de mudanças de distribuição geográfica repetidas (Hewitt, 2004; Carnaval et al., 2009). A hipótese alternativa prediz que eventos mais antigos deixam assinaturas genéticas mais fortes nas espécies, caracterizadas por estruturação filogeográfica mais profunda com múltiplos clados bem suportados, tempos de divergência que antecedem o período Pleistoceno, presença de espécies crípticas e múltiplas unidades evolutivas significativas (Moritz et al., 2000; Rull, 2008; Hoorn et al., 2010). Por fim, uma terceira hipótese que permanece ainda pouco explorada (Werneck et al., 2012) é que os mecanismos causais do Terciário e Quaternário contribuíram mutualmente para deixar assinaturas genéticas detectáveis ao longo de diferentes níveis, que seriam visualizados em diferentes amostragens de árvores coalescentes (Fujita et al., 2010; Rull 2011). Nesse caso, as divergências mais profundas (antigas) dos principais clados (i.e., crown clades) seriam anterior ao Paleógeno-Neógeno, enquanto a maioria dos ramos terminais divergir-se-ia durante o Quaternário (Rull, 2011). Desta forma, a distribuição geográfica e história natural de T. oreadicus somados ao conjunto de dados levantados para a espécie se fazem condizentes com os requisitos necessários para uma investigação que busque distinguir entre essas hipóteses alternativas, uma vez que elas abarcam uma grande amplitude de tempos coalescentes, taxas de mutação e conta com uma densa amostragem para se estimar a árvore de espécie e tempos de divergência.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostragem e obtenção de DNA

Um total de 343 indivíduos provenientes de 37 localidades (Figura 1A; Tabela 1) foram utilizados no presente estudo, uma amostragem que cobre relativamente bem a extensa distribuição geográfica e as possíveis variações genéticas do táxon denominado atualmente por Tropidurus oreadicus (Figura 1B; Apêndice I).

Figura 1. Amostragem de populações sequenciadas para as análises moleculares (A) e registro de ocorrência para a espécie Tropidurus oreadicus (B).

Tabela 1. Localidades, siglas e coordenadas geográficas dos indivíduos sequenciados. As siglas serão utilizadas para todas as demais tabelas e figuras desse capítulo. N= tamanho da amostra.

Localidade-Estado Sigla N long lat Brasília-DF BSB-DF 1 -47,7978 -15,7760 Cavalcante-GO CAV-GO 2 -47,8289 -13,6808 Minaçu-GO MIN-GO 17 -48,3642 -13,5056 Alto Paraíso de Goiás - GO APG-GO 6 -47,5100 -14,1328 Alvorada do Norte-GO ADN-GO 23 -46,4919 -14,4808 São Domingos-GO SDM-GO 12 -46,4481 -13,4498 Pirenópolis-GO PIR-GO 15 -48,9500 -15,8500 Piranhas-GO PRA-GO 8 -51,8219 -16,4269 Caseara-TO CAS-TO 13 -49,9577 -9,3120 Colinas do Tocantins-TO CDT-TO 1 -48,4750 -8,0592 Paranã-TO PAN-TO 11 -47,8823 -12,6177 Palmas-TO PAL-TO 11 -48,1085 -10,1891 Mateiros-TO MAT-TO 20 -46,4203 -10,5463 Natividade-TO NAT-TO 11 -47,7228 -11,7100 Peixe-TO PXE-TO 18 -48,6006 -12,0350 Brejinho de Nazaré -TO BDN-TO 7 -48,5658 -11,0000 Taquaruçu-TO TAQ-TO 8 -48,1618 -10,2933 Buritizeiro-MG BUR-MG 5 -44,9619 -17,3508 Jaboticatubas-MG JAB-MG 1 -43,7196 -19,4226 Barra do Garças-MT BDG-MT 6 -52,5000 -15,2000 Nova Xavantina-MT NOX-MT 25 -52,5667 -14,8333 Cáceres-MT CAC-MT 9 -57,6667 -16,0667 Barra do Bugres-MT BBU-MT 1 -57,1808 -15,0728 Santo Antônio do Leverger-MT SAL-MT 4 -56,0769 -15,8658 São Desidério-BA SDS-BA 2 -44,9733 -12,3633 Jaborandi-BA JBD-BA 1 -45,8396 -14,3838 Cocos-BA COC-BA 6 -45,2421 -14,5451 Barreiras-BA BAR-BA 3 -44,9900 -12,1528 Ibotirama-BA IBO-BA 8 -43,2208 -12,1850 Muquém de São Francisco -BA MSF-BA 4 -43,5489 -12,0650 Santa Maria da Vitória-BA SMV-BA 2 -44,1978 -13,3978 Macapá-AP MAC-AP 19 -51,0658 0,0389 Parauapebas - PA PAR-PA 14 -49,8833 -5,9000 Serra das Andorinhas-PA SDA-PA 14 -48,4125 -6,1236 Carolina-MA CRL-MA 16 -47,2183 -7,3897 Porto Velho-RO PVE-RO 10 -64,6833 -9,4333 Guajará-Mirim-RO GMI-RO 23 -64,4306 -11,6622

Para o levantamento dos dados moleculares, os DNAs genômicos dos espécimes foram extraídos de amostras de fígado ou músculo utilizando-se o DneasyTM Tissue extraction kit (QIAGEN). Alíquotas do DNA de cada exemplar foram utilizadas para uma estimação visual da quantidade de DNA, por comparação com quantidades conhecidas de DNA do fago λ, em gel de agarose (1,5%) corado com brometo de etídio (20 mg/100 mL). Pares de primers foram utilizados para amplificar segmentos de genes mitocondriais e nucleares (Tabela 2) via PCR (Polimerase Chain Reaction). As condições para amplificação nos termocicladores foram distintas para os diferentes lócos, mas para os fragmentos mitocondriais seguiu basicamente uma desnaturação inicial de 94º, 35-40 ciclos consistindo-se de 94ºC de desnaturação (1min), 53-61ºC de anelamento (0:30- 1:30min), 72ºC de extensão (1min) e uma extensão final de 72ºC (5-7 min). Esse perfil térmico, no entanto, não amplificou a maioria dos genes nucleares, que somente foram amplificadas com perfis denominados ‘touchdown’ ou ‘ANL’(anonymous nuclear markers). Para os ciclos ‘1-touch51’ e ‘1-touch57: 94ºC por 2:45min, 40x [94°C por 15s, 51°C ou 57°C por 20s (diminuindo-se 0,1°C/ciclo), 72°C por 1min], 72°C por 1min; e para o ciclo denominado ‘ANL63’: 95°C por 1:30min, 10x [95°C por 35s, 63°C por 35s (diminuindo-se 0,5°C/ciclo), 72°C por 1min], 10x (95°C por 35s, 58°C por 35s, 72°C por 1min), 15x (95°C por 35s, 52°C por 35s, 72°C por 1min. A mistura de reação de amplificação constitui-se basicamente de tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20 mM pH 8,4 e KCl 50 mM), MgCl2 1,5 mM, 0,7-1,0 mM de cada primer, 250 μM de cada dNTP, 1,0 Unidade/Reação de Taq DNA polimerase, DNA genômico de aproximadamente 15 ng e água deionizada para completar um volume de 20 μL.

Tabela 2. Caracterização das regiões sequenciadas.

A duração dos ciclos e as respectivas temperaturas foram otimizadas em termocicladores com gradientes de temperatura para obtenção de fragmentos amplificados com maior qualidade. Os produtos da PCR foram purificados usando-se as enzimas Exonuclease I e Fosfato alcalino (Shrimp Alkaline Phosphatase) - EXOSAP (GE HealthCare, Sweden). Uma vez purificados, os fragmentos amplificados foram sequenciados nos dois sentidos (foward e reverse). Uma pequena porcentagem das amostras foi submetida no sequenciador automático ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, CA) da Escola de Agronomia da Universidade Federal de Goiás, usando o kit com fluorecências DYEnamic ET Terminator (GE HealthCare, Sweden), em condições padronizadas pelo fabricante. No entanto, grande parte das amostras com as regiões amplificadas e purificadas foi enviada à empresa Macrogen Inc., na Coréia do Sul, para sequenciamento padrão. Os procedimentos acima foram executados para as regiões mitocondriais (12S, 16S e COI) e uma região nuclear (PRLR); os demais genes nucleares utilizados foram sequenciados (baseados na abordagem de subamostragem, descrita adiante) utilizando-se BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems, Foster City, CA), purificados com Sephadex G-50 Fine (GE Healthcare) em placas MultiScreen HV (Milipore Corp.). As amostras foram então analisadas no sequenciador ABI3730xl DNA

Analyzer da instituição Brigham Young University (BYU), em seu centro de sequenciamento de DNA (BYU DNA Sequencing Center), em Provo, Utah, EUA.

Edição e alinhamento das sequências para confecção do banco de dados para análises

O software GENEIOUS® v.6.1.5 (Biomatters Ltd; Drummond et al., 2011) foi utilizado para análise dos cromatogramas, edição das sequências e obtenção da fita consenso de todos os espécimes com êxito de sequenciamento. Em seguida, as sequências foram alinhadas usando-se o ClustalW (Higgins & Sharp, 1988; Thompson et al., 1997) e MUSCLE (Edgar, 2004), implementados no GENEIOUS; gaps, indels e blocos com alinhamentos duvidosos foram posteriormente inspecionados visualmente e alterados manualmente. Para cada uma das regiões que codificam proteína, sequências homólogas depositadas no GenBank foram adicionadas no alinhamento para se encontrar o primeiro códon para o banco de dados das sequências alinhadas utilizando o software MEGA v.6 (Tamura et al., 2013), onde os alinhamentos finais foram então examinados e traduzidos em proteína para confirmação de ORFs (open reading frames) para regiões codificantes. Por fim, o nível de saturação de bases foi inspecionado por meio do teste de saturação (test of substitution saturation; Xia et al., 2003; Xia & Lemey, 2009) no software DAMBE v.5.3.76 (Xia, 2013).

De posse de sequências devidamente alinhadas, as bases nucleotídicas codificadas de acordo com as normas da IUPAC (i.e., ‘Y’ para as bases ‘C’ ou ‘T’; ‘R’ para ‘A’ ou ‘G’; ‘S’ para ‘G’ ou ‘C’; ‘W’ para ‘A’ ou ‘T’; ‘K’ para ‘G’ ou ‘T’; ‘M’ para ‘A’ ou ‘C’) foram inspecionadas visualmente e corrigidas quando necessário. No caso das sequências geradas de regiões nucleares, não houve alteração das bases ambíguas quando havia evidência para heterozigosidade, expressadas por cromotogramas com picos duplos bem evidenciados em ambas as fitas (Figura 2).

Figura 2. Recorte de um cromatograma típico do GENEIOUS® evidenciando (seta vermelha) os picos duplos de bases nitrogenadas que indicam heterozigosidade em ambas as fitas de DNA.

Dados faltantes, comumente encontradas no início e/ou final de sequências, em todos os casos foram codificados como “?”, e indels (i.e., inserções e/ou deleções) como “-“. Para as sequências de regiões nucleares, a reconstrução haplotípica a partir dos sítios heterozigotos foi feita pelo algoritmo PHASE 2.1 (Stephens et al., 2001; Stephens & Donelly, 2003), implementado no software DnaSP v.5.10.01 (Rozas et al., 2010), que usa um método Bayesiano baseado na teoria coalescente para inferir um par de haplótipos mais provável a partir de uma sequência com diversos sítios ambíguos. Por fim, os modelos evolutivos para cada fragmento sequenciado foram eleitos hierarquicamente (HLRTs - Hierarchical Likelihood Ratio Tests) e posteriormente submetido ao critério de correção de Akaike (AIC) no programa jModelTest v.2.1.4 (Darriba et al., 2012).

Diversidade genética e padrões filogeográficos

Para as análises conduzidas nessa seção, de um total de 37 populações, dez foram descartadas das análises por terem um número amostral menor do que quatro, para uma melhor acurácia da investigação. Um N muito baixo, além de ‘poluir’ parâmetros estatísticos em análises populacionais, não fornecendo, assim, informações significativas em investigações de nível intra e interpopulacional (Felsenstein, 2006).

Como os episódios de crescimento e declínio demográfico deixam sinais característicos na distribuição dos diferentes sítios de nucleotídeos entre os pares de indivíduos, eles podem ser inferidos à partir de dados moleculares para se conhecer a história demográfica de populações (Rogers & Harpending, 1992). Assim, para avaliar o passado das populações amostradas de T. oreadicus, estimativas estatísticas foram calculadas para cinco regiões gênicas – três mitocondriais e duas nucleares (12S+16S+COI+PRLR+KIF24, respectivamente; Tabela 2) -, uma vez que a maior parte das amostras foi sequenciada para essas regiões, obtendo-se um número amostral mais robusto que é requerido para análises demográficas. A distribuição da frequência das diferenças de bases entre pares de indivíduos (mismatch distribution) foi feita por meio da abordagem não-linear dos quadrados mínimos proposta por Schneider & Excoffier (1999) feita no programa Alerquin 3.1 (Excoffier et al., 2006). O gráfico da distribuição mismatch foi obtido utilizando-se o programa Dnasp (Librado & Rozaz, 2009), e em seguida foram calculados os seguintes índices de diversidade molecular: número de haplótipos (h), número de sítios polimóficos/segregantes (S), número médio de diferenças entre duas sequências (k), diversidade haplotípica (Hd) e diversidade nucleotídica (π) utilizando os softwares Arlequin ver. 3.1 (Excoffier et al., 2006) e DnaSP v.5 (Librado & Rozaz, 2009). Para verificar se os fragmentos gênicos se encontravam (ou não) sob neutralidade seletiva e em equilíbrio mutação-deriva foram feitos os testes de neutralidade D de Tajima (Tajima, 1989) e Fs de Fu (Fu, 1997), que são baseados no modelo de infinitos sítios sem recombinação. O primeiro compara dois estimadores do parâmetro theta (θ), um deles baseado no número de sítios segregantes na amostra (θS) e o outro baseado no número de diferenças par-a-par entre os haplótipos (θπ) (Tajima, 1989). O Fs de Fu, por sua vez, é baseado na probabilidade de observação de k ou mais alelos em uma população de tamanho x ponderado pelo número médio de diferenças par- a-par (Fu, 1997).

Foi realizada uma análise de variância molecular (AMOVA) (Excoffier, 1992) para testar a diferenciação entre populações e caracterizar a estrutura genética das mesmas, usando o software Alerquin 3.1 (Excoffier et al., 2006). O modelo da AMOVA é baseado nas análises da variância das frequências dos genes, mas leva em consideração o número de substituições entre os haplótipos (Excoffier, 1992). A significância dos componentes de variância e das estatísticas θ foram testadas por meio de um modelo de

37 permutação não paramétrica, que gera índice de fixação  (Weir & Cockerham, 1984), que estima a estruturação populacional intra e interdemes, suportando níveis populacionais hierárquicos.

Para se testar a hipótese de isolamento por distância (Wright, 1943), o teste de

Mantel foi feito a partir da matriz de distâncias par-a-par das populações (i.e., FST linearizado como t/M= FST / [1-FST]; matriz de Slatkin gerada pelo Arlequin) e da matriz de distâncias geográficas (com valores brutos, em quilômetros, transformados em Log10) no programa SAM v.4.0 (Rangel et al., 2010).

A taxa de migração e o tamanho efetivo das populações foram estimados com base na teoria da coalescência (Hudson, 1990; Kingman, 1982, 2000; Tavaré, 1984). Esta análise permite distinguir e compreender melhor eventos históricos de variação demográfica e o fluxo gênico entre populações/demes. Os parâmetros θ (coalescence force), g (growth force) e M (migration force) foram estimados com base em estatística Bayesiana para os fragmentos gênicos. Além disso, os números de migrantes por geração entre as populações (2Nem para o genoma haploide e 4Nem para o diploide) foram estimados multiplicando-se o valor de M (2Nem/θ) pelo valor de θ obtido para cada uma das populações receptoras. As análises foram conduzidas a partir do processo de amostragem Markov Chain Monte Carlo (MCMC), gerado com quatro cadeias simultâneas, com as performances ajustadas automaticamente. Estas análises demográficas foram implementadas no programa Lamarc 2.0.2 (Kuhner, 2006). As análises independentes geradas no Lamarc foram combinadas e a convergência e a estabilidade destas foram checadas usando o programa Tracer v1.6.0. Foram priorizados os valores de ESS (Effective Sample Size) superiores a 200. O ESS é um parâmetro que mede o número de extrações efetivamente independentes da distribuição posterior da qual a cadeia de Markov é equivalente; isto é, o que sobrou da autocorrelação das amostragens. Se o ESS de um parâmetro é muito pequeno, então a estimativa de uma distribuição posterior daquele parâmetro não é robusta, já que o desvio padrão será muito grande. No Tracer é possível calcular o desvio padrão da média da estimativa desses parâmetros.

Relações filogenéticas e identificação de linhagens recentes

Para a reconstrução das árvores filogenéticas, foram adicionados (como grupos externos) nas análises de um a três indivíduos sequenciados das espécies T. insulanus, T. torquatus e T. hispidus, uma vez que são os táxons mais proximamente relacionadas com Tropidurus oreadicus, conforme hipótese filogenética do gênero baseada em dados moleculares e morfológicos (Frost et al., 2001). E espécies alocadas dentro dos gêneros Leiocephalus, Stenocercus e Uranoscodon também foram utilizadas para enraizar a árvore, já que são os mais próximos filogeneticamente do gênero Tropidurus (Frost et al., 2011; Townsend et al., 2011; Daza et al., 2012). Com o objetivo de obter um primeiro acesso às relações evolutivas entre as populações amostradas, foi gerada uma árvore gênica a partir dos dados de sequências mitocondriais no programa BEAST v1.8.0 (Drummond et al., 2012), e o modelo selecionado para a taxa de heterogeneidade entre linhagens foi o relógio molecular relaxado não-correlacionado (uncorrelated relaxed clock; Drummond et al., 2006) com distribuição lognormal. Como prior para a árvore, foi selecionado o modelo de coalescência (Kingman, 1982), assumindo-se um tamanho populacional constante. Os modelos de substituição nucleotídica previamente escolhidos no programa JModeltest para os genes 12S, 16S e COI foram, respectivamente, HKY+I+G, GTR+I+G e K80+G. Foram implementadas quatro corridas independente de 30 milhões de gerações, amostrando-se uma árvore a cada 1.000 gerações; posteriormente foram avaliadas as convergências e estabilidades das corridas de MCMC com o software Tracer v.1.6.0. As duas corridas com maiores valores de ESS foram então combinadas no LogCombiner v1.8.0, com 10% das árvores geradas descartadas como burnin no TreeAnnotator v1.8.0 (pacote do BEAST), visando avaliar somente amostragens posteriores que atingiram estacionaridade. A visualização e edição da árvore de coalescência foi feita pelo programa FigTree v.1.4 (http://beast.bio.ed.ac.uk/FigTree).

Para entender a relação evolutiva entre os haplótipos dentro e entre as populações, foi realizada uma análise pelo método median-joining network (Bandelt et al., 1999) de três conjunto de dados: (i) as três regiões mitocondriais concatenadas, (ii) a região nuclear PRLR e (iii) a região nuclear KIF24. Para os conjuntos (ii) e (iii), as duas fitas de DNA geradas pelo PHASE foram utilizadas. Nessa análise, conduzida no programa Network v.4.6.10 (Fluxus Technology Ltd; Forster et al., 2004), redes do tipo minimum spanning são construídas baseadas na união de árvores com o menor número

39 de mudanças entre nós, considerando todas as sequências de entrada. Utilizando o critério de parcimônia, um algoritmo encontra vetores médios que visam minimizar o número de mutações entre os haplótipos. Esses vetores formados podem ser interpretados biologicamente como possíveis sequências que não foram amostradas ou sequências ancestrais extintas (Bandelt et al., 1999). Em análises preliminares com um conjunto de dados que continham todas as localidades sequenciadas, os gráficos gerados foram muito poluídos (i.e., muitos median joinings), o que tornou extremamente difícil a identificação de padrões informativos. Assim, baseando-se na abordagem utilizada por Fouquet et al. (2014), foram formados subconjuntos de dados com base nos maiores clados da árvore filogenética mais provável que foi resgatada das sequências de mtDNA. Essa estratégia forneceu redes de haplótipos menos complexas e visualmente informativas, tornando mais viável a inspeção das relações filogenéticas entre os haplótipos dentro de cada clado.

Estimativas para árvore de espécie e tempos de divergência

A árvore gerada a partir dos dados de mtDNA concatenados também foi utilizada para guiar esforços de subamostragens para os lócos nucleares. Para agrupamentos populacionais com um N<4, todos os indivíduos foram amostrados; no caso de populações mais abundantes, pelo menos três ou quatro indivíduos foram amostrados para representar a diversidade haplotípica e geográfica daquela linhagem. A abordagem de subamostragem nos permite avaliar estratégias de amostragens ótimas que se aproximam de uma árvore de espécie melhor suportada com um menor conjunto de dados, além de uma relevante economia de tempo computacional nas análises. Pesquisadores geralmente tem um limite de dados para serem trabalhados para estimarem árvores de espécie porque restrições técnicas e/ou financeiras dificultam a obtenção de dados de sequências de DNA de um grande número de lócos (Felsenstein, 2006). Além disso, muitos marcadores potencialmente úteis com variabilidade para resolução de radiações evolutivas recentes (e.g., marcadores ANL, anonymous nuclear loci) podem ser pouco informativos se sequências muito pequenas livres de recombinação são utilizadas nas análises (Camargo et al., 2012a). Além de fornecer estimativas mais acuradas (pelo critério de subamostragem; Camargo et al., 2012a), um maior número de lócos produz estimativas mais robustas para se medir tamanhos populacionais (Felsenstein, 2006), que é um parâmetro crítico para

40 acomodar a discordância ‘árvores gênicas vs. árvore de espécie’ no modelo coalescente multi-espécies (Castilho-Ramirez et al., 2010). Resultados empíricos (e.g., Camargo et al., 2012a, 2012b) sugerem que há uma amplitude ótima de esforço amostral para o número de lócos, de indivíduos e comprimento das sequências nucleotídicas para melhor acessar a história evolutiva das espécies. Os padrões encontrados nas performances simuladas mostram que a subamostragem de indivíduos mimetiza os resultados de simulações obtidas para histórias evolutivas mais antigas, de divergências mais profundas (deep divergence histories). Seguindo a metodologia de subamostragem apresentada, foram testados cerca de 15-20 marcadores nucleares de evolução ‘rápida’ de uma ampla variedade de fontes, dos quais foram amplificados sete lócos variáveis para Tropidurus oreadicus e grupos externos. Um total de 134 indivíduos x 10 lócos (5.821 pb; a partição dos dados pode ser vistos na Tabela 3) foram utilizados para se estimar os tempos de divergências e a árvore de espécie usando o *BEAST (Heled & Drummond, 2010), onde o impacto da variância mutacional pode potencialmente ser reduzido, uma vez que esse método incorpora a incerteza ‘árvores gênicas x árvore de espécie’ (Camargo et al., 2012a). Como a maioria dos métodos que estimam árvores de espécies, o *BEAST requer uma atribuição a priori de alelos individuais para a espécie (‘trait file’) antes de estimar as relações. Não há procedimento padrão em como fazer isso em complexos de espécie pouco conhecidos, mas qualquer abordagem eleita deve evitar subestimar a diversidade intraespecífica (Werneck et al., 2012).

Tabela 3. Subamostragem de indivíduos para cada região genômica sequenciada. N= número total de indivíduos; n_loc.= número de localidades, pb= número de pares de base.

Partição N / n_loc Comprimento (pb) sub12S 134 / 37 405 sub16S 134 / 37 684 subCOI 132 / 37 648 subPRLR 132 /37 536 subKIF24 132 /37 506 subMXRA5 79 /26 634 subb-FIB 113 / 30 659 subCASC5 98 / 30 485 subKCNMB 120 /34 445 subCGNL1 100 /31 819

O software JModelTest 2.1.4 (Darriba et al., 2012) foi utilizado para selecionar o modelo de substituição que melhor explica cada uma das partições sob o critério de informação de Akaike (AIC, Akaike information criterion). Todas as partições foram consideradas sob o modelo que considera a taxa de heterogeneidade entre linhagens (uncorrelated relaxed clock; Drummond et al., 2006) com distribuição lognormal. Assumir um modelo de variação das taxas do relógio molecular permite selecionar um modelo mais apropriado de variação de taxas ao longo dos ramos em uma árvore filogenética. O modelo de relógio molecular relaxado no *BEAST é chamado “não- correlacionado” porque não há correlação a priori entre as taxas das linhagens e de seus ancestrais (Drummond et al., 2006). Isso permite que as datas de divergências dos clados (definidos como agrupamentos monofiléticos ou como o tMRCA, time to most recente common ancestor, de um conjunto de dados especificado) sejam calculadas com base na melhor adequabilidade para taxas de mutação ao longo da árvore. As estimativas de tempos de divergência foram calculadas no BEAST v.1.8 (Drummond et al., 2012) com um conjunto de dados particionado por gene ou região gênica (i.e., três partições mitocondriais e sete nucleares). Em análises preliminares usando-se o relógio lognormal não-correlacionado para cada partição gênica, não foi possível obter convergência. Para auxiliar na mistura das cadeias foi aplicado dois relógios relaxados lognormal não-correlacionados – um para o conjunto de dados mitocondriais (12S+16S+COI) e o segundo para o conjunto de dados nucleares (PRLR+KIF24+MXRA5+b-FIB+CASC5+KCNMB+CGNL1). Os modelos dos relógios foram unidos para cada relógio local (i.e., mtDNA e nDNA) e foi permitida a heterogeneidade de taxas entre os genes, assumindo-se a opção Yule speciation para a árvore de espécie. Os nós representando o tMRCA de Leiocephalus, Stenocercus, Uranoscodon e Tropidurus, foram especificado como um conjunto de prior para uma distribuição normal com a determinação dos grupos monofiléticos baseados na literatura (Frost et al, 2001; Townsend et al., 2011; Daza et al., 2012). Os monofiletismos a priori foram determinados como se segue: (i) Tropidurus oreadicus, (ii) T. oreadicus + demais Tropidurus (T. hispidus, T. torquatus, T. insulanus), (iii) T. oreadicus + demais Tropidurus + Uranoscodon, (v) T. oreadicus + demais Tropidurus + Uranoscodon + Stenocercus e (vi) T. oreadicus + demais Tropidurus + Uranoscodon + Stenocercus + Leiocephalus. As datas de divergência utilizadas como calibradores estão listadas na Tabela 4. O fornecimento dessas informações externas é tido como crucial para restringir o universo de histórias evolutivas possíveis nas análises (Garrick et al., 2010).

Tabela 4. Calibradores disponíveis na literatura (Townsend et al., 2011). *Milhões de anos.

Calibrador Data média* Desvio padrão* tMRCA para Tropidurus e Uranoscodon 27 8 tMRCA para Uranoscodon e Stenocercus 47 10 tMRCA para Leiocephalus, Uranoscodon e Tropidurus 55 10

Foram implementadas quatro corridas independente de 30 milhões de gerações, amostrando-se uma árvore a cada 1.000 gerações, e o pacote BEAGLE v. 1.8 (Ayres et al., 2012) foi utilizado para acelerar as análises. Posteriormente foram avaliadas as convergências e estabilidades das corridas de MCMC com o software Tracer v1.6.0 e as duas corridas com maiores valores de ESS foram então combinadas no LogCombiner v1.8.0, com 10% das árvores geradas descartadas como burnin no TreeAnnotator v1.8.0, visando, assim, avaliar somente amostragens posteriores que atingiram estacionaridade. A visualização e edição da árvore de coalescência foi feita pelo programa FigTree v.1.4 (http://beast.bio.ed.ac.uk/FigTree).

Modelagem de paleodistribuição, identificação de refúgios e projeções de distribuição potencial para o futuro

Foram obtidos 156 registros de ocorrência da espécie Tropidurus oreadicus, a partir de dados de distribuição geográfica levantados para o relatório anual do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, ICMBIO (G. R. Colli, 2013, comunicação pessoal) (Figura 1B, Apêndice I). As camadas de clima atual usadas na modelagem de distribuição de espécies (SDM, species distribution modelling) foram representadas pelas condições pré-industriais derivadas das simulações de quatro modelos gerais de circulação oceano-atmosférica (AOGCMs, atmosphere–ocean general circulation models) (Tabela 5, para detalhes de cada AOGCM). Esses modelos foram obtidos dos projetos Coupled Model Intercomparison Phase 5 (CMIP5: http://cmip- pcmdi.llnl.gov/) e Paleoclimate Modelling Intercomparison Phase 3 (PMIP3: http://pmip3.lsce.ipsl.fr/).

Tabela 5. Descrição dos modelos climáticos utilizados na modelagem de nicho ecológico; *longitude x latitude.

Sigla do modelo Instituição responsável pelo desenvolvimento Resolução* Fonte CCSM4 University of Miami-RSMAS, USA 0,9° × 1,25° CMIP5/PMIP3 CNRM-CM33 Centre National de Recherches Météorologiques, France 2,5° × 2,0° CMIP5/PMIP3

Atmosphere and Ocean Research Institute (University of Tokyo), MIROC-ESM National Institute for Environmental Studies, and Japan Agency 2,8° x 2,7° PMIP II for Marine-Earth Science and Technology, Japan

MRI-CGCM3 Meteorological Research Institute, Japan 1,1° × 1,1° CMIP5/PMIP3

Para contornar o problema de multicolineariedade entre as 19 variáveis bioclimáticas (http://www.worldclim.org/bioclim) geralmente utilizadas nas predições dos modelos de nicho ecológico (ENMs, ecological niche models), uma análise fatorial foi conduzida usando-se o método varimax rotation e selecionadas as variáveis com maiores escores. O espaço ambiental para os ENMs foi caracterizado por cinco variáveis bioclimáticas resultantes: temperatura anual média (Bio1), amplitude da temperatura anual (Bio7), precipitação no mês mais úmido (Bio13), precipitação no mês mais seco (Bio14), precipitação no mês mais quente (Bio18). Essas variáveis foram calculadas para o período pré-industrial (representando condições climáticas atuais), Último Máximo Glacial (LGM, Last Glacial Maximum – 21 ky BP3), Holoceno Médio (6 ky BP2) e futuro (2080-2100, aqui designado como EOC, end-of-century), derivado dos quatro AOGCMs acoplados, cujos dados disponíveis eram compatíveis com projeções no passado, presente e futuro. A ocorrência de todos os registros foi mapeada em um grid de células de 0,5º x 0,5º (longitude x latitude), englobando a região Neotropical para gerar uma matriz de presença usada para calibrar os ENMs utilizados. Devido à resolução relativamente grosseira dos outpus de AOGCMs (que variou de 0,9° × 1,25° até 2,8° x 2,7° [longitude x latitude], Tabela 5), as camadas climáticas foram convertidas para uma escala de resolução de 0,5º de acordo com a abordagem descrita em Collevatti et al. (2013): (i) a partir da resolução original, foram calculadas as diferenças entre as condições do LGM e do presente (i.e., tendências para mudança climática); (ii) a diferença relativa entre o LGM e o clima atual, bem como apenas o clima atual, foi interpolada a uma grid de

2 A expressão ‘ky BP’ será usada para designar a escala temporal de ‘mil anos antes do presente’ 44 resolução 0,5º x 0,5º usando um método krigin; (iii) a diferença foi adicionada aos dados pré-industriais para a obtenção do cenário LGM interpolado. Dessa forma, cenários climáticos foram produzidos em uma resolução que é relevante à escala da modelagem de paleodistribuição, mantendo-se uma resolução mais alta para a topografia e ao mesmo tempo assegurando a coerência dos padrões climáticos ao longo do tempo (Hijmans & Graham, 2006). Por fim, os dados convertidos de LGM para as condições climáticas pré- industriais foram calibrados (ao invés de usar os dados climáticos do WorldClim, ver Waltari et al., 2007), que previne erros quando dados climáticos observados interpolados e simulados são comparados (Collevatti et al., 2013). A distribuição potencial de Tropidurus oreadicus foi então modelada usando-se diversos algoritmos (Tabela 6; para descrições mais específicas dos métodos ver Elith & Leathwick, 2009; Franklin, 2009; Elith & Phillips, 2011; Peterson et al., 2011). Todos os ENMs foram analisados na plataforma computacional integrada Bioensembles (Diniz- Filho et al., 2009), onde a combinação de todos os ENMs e AOGCMs gerou 48 mapas preditivos independentes (12 ENMs x 4 AOGCMs) para cada período de tempo (6 ky BP, 21ky BP, presente e futuro). A performance preditiva de cada modelo foi avaliada usando- se a estatística true skill (TSS, true skill statistics; Allouche et al., 2006), e os modelos com performances ruins foram eliminados. Uma análise de variância (ANOVA) hierárquica foi aplicada usando-se adequabilidade preditiva de todos os modelos (12 ENMs x 4 AOGCMs x 4 períodos de tempo) como variáveis-resposta para identificar e mapear as incertezas devido aos componentes da modelagem, que foram aninhados em componentes de tempo (ver Terribile et al., 2012 para detalhes da abordagem). Os mapas preditivos dos períodos do pretérito (21ky BP e 6ky BP) e presente foram combinados para gerar um mapa de refúgios históricos (i.e., ambientes estáveis ao longo do tempo). Para se gerar esse mapa, foram considerados todas as células dentro do grid que tinham valores de adequabilidade ≥ 0,5 nos três períodos de tempo como refúgio.

Tabela 6. Métodos utilizados para modelar a distribuição da espécie Tropidurus oreadicus. Os nomes em inglês foram mantidos a fim de preservar as siglas originais.

Método Tipo de dados considerados Bioclimatic Envelope (BIOCLIM) Somente presença Ecological Niche Factor Analysis (ENFA) Somente presença Euclidian Distance (EucliDist) Somente presença Generalized Linear Models (GLM) Presença/pseudo-ausência Gower Distance Somente presença Mahalanobis Distance Somente presença Maximum Entropy (Maxent) Presença/pseudo-ausência Generalized additive models (GAM) Presença e ausência Flexible discriminant analysis (FDA) Presença e ausência Multivariate adaptive regression splines (MARS) Presença e ausência Neural Networks (NNET) Presença e ausência Random Forest (RNDFOR) Presença e ausência

Para cada SDM, os pontos de ocorrência foram particionados ao acaso em dois subconjuntos (calibração e validação) englobando 75% e 25% do conjunto de dados, respectivamente, e esse procedimento foi repetido 10 vezes selecionando-se diferentes combinações aleatórias de pontos para a calibração/validação dos conjuntos de dados. Assim, considerando os SDMs e AOGCMs para a espécie T. oreadicus, os modelos foram gerados e convertidos em ocorrências no grid usando a curva característica operacional receptora (ROC, receiver operating characteristic) para se definir o ponto de corte truncado. Os mapas de ocorrência foram então usados para calcular uma frequência de ocorrência para a espécie em cada célula da América do Sul para camadas climáticas do presente, passado e futuro. Em seguida, os mapas preditivos dos períodos 6ky BP, 21ky BP e presente foram combinados para gerar um mapa de refúgios históricos (i.e., ambientes estáveis ao longo do tempo). Para se gerar esse mapa, foram considerados todas as células dentro do grid que tinham valores de adequabilidade ≥ 0,5 nos três períodos de tempo como refúgio. Computou-se a mudança de amplitude de distribuição (diferença no tamanho da amplitude predita entre as distribuições geográficas atuais, do passado e futuro) e classificou-se os 48 mapas preditivos de acordo com suas congruências com três cenários: (1) estabilidade, i.e., sem diferenças no tamanho da amplitude de distribuição geográfica, (2) retração, i.e., tamanho da amplitude de distribuição geográfica menor no passado do que no presente e (3) expansão, i.e., tamanho da amplitude de distribuição geográfica maior no passado do que no presente.

RESULTADOS

Caracterização dos dados obtidos

Após alinhamento e edição, os produtos amplificados das regiões sequenciadas geraram fragmentos de tamanhos diversos, variando de 405 (12S) a 819 (CGNL1) pares de bases (pb) com um total de 1.737 e 4.084 pb para os marcadores mitocondriais e nucleares, respectivamente. Os menores valores de diversidade nucleotídica foram de 0,034% (KCNMB) e 0,048% (MXRA5) e as diversidades haplotípicas e os números de diferenças entre duas sequências apresentaram valores elevados. Foram encontrados números relativamente altos de sítios polimórficos para as regiões mitocondriais e nucleares, embora as nucleares apresentem, em geral, números menores em proporção ao comprimento das sequências (Tabela 7).

Tabela 7. Marcadores moleculares sequenciados para Tropidurus oreadicus. N= número de amostras sequenciadas; pb = número de pares de base; H= número de haplótipos; S= número de sítios polimórficos; k= número médio de diferenças entre duas sequências; h= diversidade haplotípica (DP, desvio padrão); π= diversidade nucleotídica.

Índices de diversidade Fragmento N/localidades pb Modelo Evolutivo H S k h DP h π 12S 357/37 405 90 78 9,864 0,973 0,002 0,02485 HKY+I+G 16S 357 /37 684 86 93 13,072 0,957 0,005 0,08790 GTR+I+G COI 357 /37 648 141 215 50,461 0,985 0,002 0,07787 K80+G PRLR 316 /37 536 167 94 8,847 0,909 0,010 0,01669 TIM1+I+G KIF24 322 /37 506 285 152 11,401 0,989 0,001 0,02308 GTR+I+G MXRA5 90 /26 634 44 58 2,906 0,885 0,017 0,00458 HKY+I b-FIB 117 /30 659 79 108 12,041 0,965 0,005 0,01927 K80+I CASC5 96 /30 726 58 80 11,305 0,954 0,007 0,01601 HKY+I KCNMB 122 / 34 445 30 30 1,363 0,682 0,032 0,00337 JC CGNL1 103 /31 819 78 104 12,377 0,976 0.004 0,01553 K80+I

Diversidade genética e padrões filogeográficos

Os dados concatenados para a região mitocondrial revelaram 211 haplótipos e 386 sítios polimórficos para os 357 indivíduos sequenciados. A diversidade gênica/haplotípica (h) geral para esse conjunto de dados foi de 0,9915, enquanto a diversidade nucleotídica (π) foi de 0,04896. Os índices e estimativas dos conjuntos de

47 dados moleculares são apresentadas na Tabela 8 e na Tabela 9 são apresentados os índices para cada uma das populações. A análise de variância molecular (AMOVA, Excoffier et al., 1992) revelou uma alta estruturação em todos os níveis hierárquicos, com uma diferenciação elevada e significativa entre as populações (FST= 0,81008; p<0,01) onde a maior parte dessa variância (85%) foi explicada pela variação entre os grupos de populações. As comparações par-a-par entre os valores de FST das populações mostram uma diferenciação significativa entre elas (Tabela 10), com exceção de IBO-BA x MSF-

BA (FST= 0,04; p>0,05). Valores de FST par-a-par podem ser usados como um termo genérico para as distâncias genéticas entre as populações (Slatkin, 1995). As comparações par a par entre os valores de FST referente a maioria das populações mostram uma diferenciação significativa entre elas, evidenciada pelo FST global.

Tabela 8. Índices de diversidade molecular, testes de expansão e valores de FST para cada conjunto de dados utilizados nas análises populacionais. N= número de amostras sequenciadas; pb= número de pares de base; H= número de haplótipos; S= número de sítios polimórficos; k= número médio de diferenças entre duas sequências; h= diversidade haplotípica (DP, desvio padrão); π= diversidade nucleotídica.

Praticamente todos os haplótipos foram exclusivos por localidade, com ausência de haplótipos compartilhados por outras populações, um indício de que há uma correlação entre distribuição das linhagens genéticas com o espaço geográfico. O teste de Mantel sugere que a diferenciação entre as populações está positivamente relacionada com distância geográfica, embora apresente um coeficiente com valor relativamente baixo (r²= 0,137 e p<0,05 para os dados concatenados; Figura 3).

Figura 3. Gráficos gerados para o teste de Mantel para os dados concatenados (mtDNA+PRLR+KIF24; pb= 2.779). A distância genética foi baseada na matriz quadrática dos valores de FST linearizado, e a distância geográfica na matriz quadrática de distâncias geográficas com valores brutos, em quilômetros, logaritimizados.

Tabela 9. Índices de diversidade molecular e testes de expansão cada população, baseada no conjunto de dados concatenados (mtDNA+PRLR+KIF24; pb= 2.779). N= número de amostras sequenciadas; S= número de sítios polimórficos; h= diversidade haplotípica (dp, desvio padrão); π= diversidade nucleotídicas; k= número médio de diferenças entre duas sequências; HR= índice Harpending´s Raggedness.

D de População N S h / dp π / dp k índice HR* p F de Fu p p Tajima ADG-GO 46 39 1,0 +/- 0,004 0,0033 +/- 0,001 11,52 0,00898 0,71 -24,7175 <0,01 0,1660 0,62 APG-GO 12 189 1,0 +/- 0,034 0,0310 +/- 0,016 73,24 0,04752 0,33 -0,0803 0,282 1,7683 0,98 BDG-MT 12 151 1,0 +/- 0,034 0,0176 +/- 0,009 0,026 0,13682 1 -0,9127 0,191 -0,0853 0,49 BDN-TO 14 61 1,0 +/- 0,027 0,0095 +/- 0,005 36,087 0,02874 0,50 -2,8993 0,058 1,7126 0,98 BUR-MG 10 26 1,0 +/- 0,044 0,0035 +/- 0,001 8,333 0,07555 0,28 -3,5541 0,028 0,2932 0,66 CAC-MT 18 37 1,0 +/- 0,018 0,0032 +/- 0,001 9,733 0,02033 0,41 -11,0453 <0,01 -0,6366 0,30 CAS-TO 26 10 1,0 +/- 0,010 0,0016 +/- 0,001 3,528 0,14527 0,01 -26,4262 <0,01 0,2317 0,62 COC-BA 12 35 1,0 +/- 0,034 0,0050 +/- 0,002 14,461 0,03007 0,61 -3,7223 0,03 1,0072 0,87 CRL-MA 32 42 1,0 +/- 0,007 0,0048 +/- 0,002 10,918 0,00681 0,79 -24,3501 <0,01 0,2099 0,67 GMI-RO 46 62 1,0 +/- 0,004 0,0053 +/- 0,002 4,236 0,01231 0,88 -24,2992 <0,01 0,2222 0,67 IBO-BA 16 167 1,0 +/- 0,022 0,0191 +/- 0,009 12,981 0,02173 0,61 -2,4324 0,071 -0,6516 0,26 MAC-AP 38 1 1,0 +/- 0,006 0,0001 +/- 0,000 0,476 0,41330 0,44 -34,0282 <0,01 -0,2712 0,29 MAT-TO 40 53 1,0 +/- 0,005 0,0057 +/- 0,002 13,924 0,00590 0,68 -24,4187 <0,01 0,1507 0,61 MIN-GO 34 13 1,0 +/- 0,007 0,0019 +/ 0,001 3,418 0,03566 0,52 -26,1407 <0,01 0,1450 0,62 MSF-BA 8 48 1,0 +/- 0,062 0,0069 +/- 0,003 21,364 0,12244 0,21 -0,9696 0,195 0,2349 0,62 NAT-TO 22 10 1,0 +/- 0,013 0,0012 +/- 0,000 2,546 0,22999 0,07 -26,8993 <0,01 -0,6548 0,28 NOX-MT 50 30 1,0 +/- 0,004 0,0039 +/- 0,002 9,253 0,00604 0,91 -24,7349 <0,01 1,1802 0,89 PAL-TO 22 19 1,0 +/- 0,013 0,0031 +/- 0,002 2,525 0,02715 0,85 -21,332 <0,01 0,2334 0,62 PAN-TO 22 41 1,0 +/- 0,013 0,0055 +/- 0,003 19,434 0,00648 0,89 -10,7256 <0,01 1,4520 0,96 PAR-PA 28 27 1,0 +/- 0,009 0,0026 +/- 0,001 2,063 0,02757 0,89 -25,6888 <0,01 -1,2548 0,10 PIR-GO 30 34 1,0 +/- 0,008 0,0022 +/- 0,001 1,406 0,04684 0,78 -25,5251 <0,01 -1,4973 0,05 PRA-GO 16 9 1,0 +/- 0,022 0,0012 +/- 0,001 2,871 0,06222 0,30 -19,0688 <0,01 0,0284 0,55 PXE-TO 36 155 1,0 +/- 0,006 0,0335 +/- 0,016 62,882 0,02790 0,01 -9,1366 <0,01 2,0772 0,99 SAL-MT 8 20 1,0 +/- 0,062 0,0029 +/- 0,002 9,822 0,04336 0,82 -2,5800 0,06 0,4103 0,70 SDA-PA 28 22 1,0 +/- 0,009 0,0024 +/- 0,001 6 0,01896 0,46 -25,4345 <0,01 -0,1201 0,52 SDM-GO 24 244 1,0 +/- 0,012 0,0191 +/- 0,009 13,83 0,00577 0,96 -4,5512 0,037 -0,7503 0,23 TAQ-TO 16 66 1,0 +/- 0,022 0,0068 +/- 0,004 24,805 0,00680 0,99 -5,0461 0,014 -0,1697 0,46 PVE-RO 20 8 1,0 +/- 0,015 0,0017 +/- 0,001 4,302 0,21994 0,07 -22,0052 <0,01 2,6396 0,99

Tabela 10. FST entre pares de populações para os dados concatenados. O valor marcado em negrito (0,049) é o único que não é significativo.

A distribuição mismatch (Figura 3) resultante das análises com todas as populações agrupadas para os dados concatenados sugere que não há sinal de retração no tamanho das populações seguido por expansão (0,00073; p= 0,34). Para os testes de neutralidade, o D de Taijma, não foi significativo (D= 0,15812; p>10) enquanto o Fs de Fu apresentou valor significativo (Fs= -3,767; p<0,05). Entretanto, para que o valor de Fs seja considerado como indicativo de expansão populacional é preciso que este seja muito elevado (R. G. Collevatti, comunicação pessoal). A seleção direcional positiva (selective sweep) também pode deixar o mesmo sinal na genealogia que a expansão demográfica, gerando resultados significativos que não propriamente indiquem expansão (Fu, 1997). Assim, esses resultados parecem indicar um tamanho populacional constante. Para populações com pequena proporção de diferenças par-a-par, espera-se encontrar um gráfico bimodal, uma vez que a pequena proporção de diferenças par-a-par encontrada pode não ser devida a uma expansão populacional recente, mas sim porque o tempo não foi suficiente para que o genoma das populações da espécie sofresse alterações que reflitam grandes diferenças entre os pares de haplótipos observados. Para T. oreadicus, grandes diferenças par-a-par foram encontradas, refletindo-se em um gráfico multimodal, sugerindo que as populações da espécie encontram-se em equilíbrio demográfico (Figura 4).

Figura 4. Distribuicao mismatch Harpending's Raggedness para as populações de Tropidurus oreadicus sem sinal de retração recente seguido por expansão (p> 0,05)

O conjunto de dados concatenados (mtDNA+PRLR+KIF24) revelou as seguintes populações apresentando valores mais altos de diversidade nucleotídica e diversidade haplotípica: APG-GO (h= 1; π= 3,10%), BDG-MT (h= 1; π= 1,70%), BDN- TO (h= 1; π= 0,90%), GMI-RO (h= 1; π= 0,53%), IBO-BA (h= 1; π= 1,90%), MAT-TO (h= 1; π= 0,57%), PAN-TO (h= 1; π= 0,55%), PXE-TO (h= 1; π= 3,35%) e TAQ-TO (h= 1; π= 0,68%). O restante das populações (i.e., ADN-GO, BUR-MG, CAC-MT, CAS-TO, COC-BA, CRL-MA, MAC-AP, MIN-GO, MSF-BA, NAT-TO, NOX-MT, PAL-TO, PAR-PA, PIR-GO, PRA-GO, SAL-MT, SDA-PA, SDM-GO e PVE-RO) apresentaram valores menores que 0,5% para a diversidade nucleotídica que, em conjunto com os altos valores de diversidade haplotípica, indicam um alto nível de divergência entre haplótipos (Tabela 9).

As análises de coalescência sugerem que as populações não estão em expansão, mas apresentam tamanho populacional constante e parâmetro de mutação muito baixo. As análises de coalescência combinadas revelaram valores relativamente baixos, mas significativos para o parâmetro demográfico theta (θ= 0,4658). O parâmetro θ geral com valores mais elevados sugere populações com grandes tamanhos efetivos e/ou com alta taxa de substituição, um padrão que gera altas taxa de substituição que se refletem no grande número de haplótipos encontrados para T. oreadicus. Para o parâmetro força de crescimento geral (g= 58,213) foram encontrados valores positivos e significativos. Valores elevados e positivos de g indicam crescimento populacional, mas se a taxa de mutação for muito baixa, provavelmente não seria visível quase nenhum crescimento tanto para os valores de g quanto para θ (Kuhner, 2006). As análises de coalescência, assim como indicado pela distribuição mismatch, sugerem que as populações não estão em expansão, mas apresentam um tamanho populacional constante e parâmetro de mutação relativamente alto.

Relações filogenéticas e identificação de linhagens recentes

A árvore filogenética resgatada dos dados de mtDNA (1.737 pb) apresenta nós relativamente bem suportados para os principais agrupamentos (Figura 4), com a grande maioria das localidades apresentando monofilia (com exceção de APG-GO, SDM-GO e PXE-TO). Os principais haploclados resgatados (i.e., populações colapsadas da Figura

5A) foram utilizados posteriormente nas atribuições para se estimar a árvore de espécie. Apesar de poucos haploclados apresentarem baixo suporte (e.g., SDA-PA), eles foram considerados quando concordantes com a geografia, para se evitar uma subestimativa de diversidade nas análises de datação e para a reconstrução da árvore de espécie. Em uma resolução mais abrangente, foram reconhecidas seis linhagens principais que englobam todas as populações de T. oreadicus; essas linhagens foram assumidas como novas unidades amostrais para as análises subsequentes (i.e., redes de haplótipos, diversidade de haplótipos por região e análises morfométricas, ver Capítulo 2). Com exceção dos indivíduos agrupados na ‘linhagem’ 4, todas as outras linhagens (1-3, 5 e 6) apresentaram monofiletismo. As populações englobadas dentro de cada linhagem podem ser vistas na Figura 5B.

Figura 5. Árvore gênica Bayesiana gerada a partir das sequências de mtDNA. A proporção dos tamanhos dos círculos representa as probabilidades posteriores (maioria > 0,80). Seis grandes linhagens são identificadas (A) e as relações de parentesco dentro dos clados terminais estão colapsadas para facilitar a representação e explicitar a correspondência geográfica (B).

A correspondência geográfica de cada linhagem demonstrou forte estruturação espacial, com sobreposições relevantes no Planalto Central (Figura 6). As relações filogenéticas entre os haplótipos dentro de cada uma das linhagens reveladas pela árvore

54 de mtDNA se mostraram bem estruturadas por localidade, com praticamente nenhum haplótipo compartilhado entre as diferentes populações. A diversidade haplotípica por localidade e a rede de haplótipos de cada linhagem são mostradas nas Figura 7 e 8, respectivamente.

Figura 6. Representação esquemática das populações sequenciadas e sua relação de parentesco baseada nos dados de mtDNA, onde cada linhagem está representada por um símbolo e cor correspondente (A): linhagem 1 em vermelho (B), linhagem 2 em verde (C), linhagem 3 em azul (D), linhagem 4 em cinza (E), linhagem 5 em roxo (F) e linhagem 6 em amarelo (G).

Figura 7. Mapas relacionando a distribuição geográfica das linhagens (A-F, que correspondem a 1-6) de Tropidurus oreadicus. Cada ponto no mapa representa uma localidade, cuja sigla está representada no gráfico circular correspondente. As diferentes cores representam diferentes haplótipos, os tamanhos dos círculos representam o tamanho amostral e suas partições refletem a frequência dos haplótipos daquela localidade.

Figura 8 (incluindo as redes das páginas anteriores). Relações entre os haplótipos por redes median- joining baseada em cada linhagem do mtDNA. Os tamanhos das circunferências são proporcionais à frequência de cada haplótipo, como especificado pelos círculos/números de cada gráfico. O número de mutações é mostrado nos ramos, omitindo-se números menores que quatro. Os círculos menores em branco são vetores médios, que biologicamente representam haplótipos extintos ou não amostrado. Para cada rede de haplótipo há um mapa com a distribuição geográfica de cada linhagem. 59

Estimativas para árvore de espécie e tempos de divergência

As corridas independentes de MCMC para as análises de árvore de espécie no *BEAST não apresentaram valores altos (i.e., >200) para a maioria dos parâmetros, mesmo quando os arquivos ‘.log’ foram combinados, provavelmente porque o número de lócos utilizados deve exigir um maior número de cadeias (e.g., ≥ 100 milhões). Assim, embora a árvore de espécie gerada baseada nos 10 lócos sequenciado tenha de ser interpretada com cautela (principalmente em relação à sua topologia, que aqui foi omitida), as datas estimadas apontam para uma origens e divergências das linhagens mais antigas de T. oreadicus ocorrendo durante o Terciário, especificamente dentro dos limites do Mioceno, seguido de divergências para os principais agrupamentos entre a transição Mioceno-Plioceno (Figura 9). Essas estimativas são concordantes com outros estudos que apontam uma origem mais antiga para as principais linhagens de lagartos do Cerrado (e.g., Giugliano et al., 2007; Werneck et al., 2012). Entretanto, o padrão de diversificação para T. oreadicus parece não se limitar a tempos mais antigos, uma vez que muitas divergências ocorrem no Plioceno Tardio e Pleistoceno. Ainda que limitados pelo rigor estatístico (i.e., baixas convergências de ESS e baixos suportes para os clados gerados), esses resultados sugerem que as populações de T. oreadicus iniciaram sua diversificação durante Terciário, mas suas linhagens ainda sofrem eventos cladogênicos importantes no Quaternário.

Figura 9. Árvore de espécie (Tropidurus oreadicus) com credibilidade máxima dos clados baseada em 10 lócos. Os tempos estimados derivam do modelo coalescente implementado no *BEAST. Os ramos terminais correspondem às subamostragens – populações colapsadas – da árvore resgatada dos dados mtDNA. Os grupos externos que enraizaram a árvore foram os seguintes táxons: Leiocephalus personatus, Stenocercus caducus, Uranoscodon superciliosus, Tropidurus hispidus, T. torquatus e T. insulanus. A espessura das linhas é proporcional à mediana do comprimento de cada ramo da árvore. A escala de períodos e tempo geológicos é baseada na tabela oficial Geologic Time Scale.

Modelagem de paleodistribuição, identificação de refúgios e projeções de distribuição potencial para o futuro.

Os modelos de todos os AOGCMs e ENMs mostram diferenças notáveis na probabilidade de distribuição de T. oreadicus ao longo dos diferentes tempos estimados. A amplitude de tamanho da distribuição geográfica mostra estabilidade entre o Holoceno Médio e o clima atual comparado com a amplitude geográfica reduzida durante o LGM (Figura 10). Entretanto, as probabilidades de ocorrência da espécie durante o Holoceno Médio diminuem consideravelmente nas regiões mais ao centro e sudoeste do Cerrado, especialmente no estado do Mato Grosso e sul de Goiás; enquanto as distribuições mais ao nordeste do bioma permanecem quase sem nenhuma alteração. Interessantemente, o

61 mapa para o cenário de 6ky BP revela uma área de alta probabilidade de ocorrência entre os limites dos estados de Rondônia, Amazonas e Mato Grosso. Já no LGM, as áreas mais quentes do mapa limitam-se a duas áreas principais, uma delas abarcando o estado do Tocantins em quase sua totalidade, o extremo sul do estado de Goiás e nordeste e oeste do Mato Grosso – onde a menor área quente ocupa a região central do estado. Apesar dessas mudanças significativas nas áreas com as maiores probabilidades de ocorrência (i.e., áreas quentes dos mapas) ao longo dos diferentes cenários climáticos, há pouca alteração em relação às áreas com menores probabilidades, embora ainda sejam altas (amplitudes de 60-75%; i.e., áreas em tons amarelados e esverdeados nos mapas). Por fim, o mapa com a projeção para o futuro indica a tendência de uma severa redução da amplitude de distribuição geográfica da espécie, bem como o seu deslocamento para região mais ao sudeste da distribuição atual.

Figura 10. Mapas das médias de adequabilidade ambiental com as frequências estimadas para Tropidurus oreadicus na região Neotropical baseada no consenso de 12 modelos de nicho ecológico e cinco modelos acoplados de circulação atmosfera-oceânica global.

A ANOVA hierárquica revelou a variável tempo como o principal componente responsável pela maioria da variação na distribuição geográfica da espécie, com altos índices de incerteza ao longo das bordas de distribuição de T. oreadicus (Figura 11A; Tabela 11).

Tabela 11. Incertezas dos componentes da modelagem sobre os modelos preditos para Tropidurus oreadicus revelados pela ANOVA hierárquica. *Sum of squares

Fonte de variação Mediana SS* Mínimo Máximo Range Tempo 0,396 <0,001 0,945 0,944 AOGCMs 0,260 0,006 0,886 0,880 ENMs 0,167 0,011 0,756 0,745 Resíduos 0,084 0,167 0,379 0,374

Figura 11. Mapas de incertezas baseadas nos Sum of squares relativos para os componentes da modelagem para Tropidurus oreadicus que foram estimados pela ANOVA aplicada à frequência de ocorrência de cada célula do grid. As diferentes tonalidades de cor representam a variação espacial dos efeitos do tempo (A), dos modelos de nicho ecológico (ENMs) (B), dos modelos de circulação atmosférica-oceânica global (AOGCMs) e dos resíduos (D).

Entre os 48 mapas preditos (12 ENMs x 4 AOGCMs), a dinâmica de distribuição para o cenário de retração foi o mais frequente enquanto o cenário para estabilidade foi predito com maior probabilidade apenas para o período 0-6ky BP (Tabela 12). Os valores de TSS de cada modelo são fornecidos na Tabela 13, e mostram valores relativamente altos de acurácia para todos os modelos utilizados. O mapa de refúgio histórico gerado a partir dos mapas preditivos dos períodos combinados pode ser visto na Figura 12.

Tabela 12. Resumo da classificação dos mapas de predição para Tropidurus oreadicus para os 12 modelos de nicho ecológico e quatro modelos de circulação atmosférica-oceânica global.

Cenário Períodos retração (%) estabilidade (%) expansão (%) 0-6ky BP 33 48 19 0-21 ky BP 91 3 6 6-21 ky PB 80 8 12

Tabela 13. Média das estatísticas TSS (true skill statistics) e AUC (area under the ROC [receiver operating characteristic] curve) e a acurácia para cada ENM, considerando-se os quatro AOGCMs.

Modelo AOGCM CCSM CNRM MIROC MRI Modelo ENM AUC / dp TSS Acurácia AUC / dp TSS Acurácia AUC / dp TSS Acurácia AUC / dp TSS Acurácia BIOCLIM 0,8837 / 0,0688 0,4923 0,7462 0,8519 / 0,0657 0,4351 0,7175 0,8646 / 0,0687 0,5131 0,7565 0,8208 / 0,0628 0,4322 0,7161 ENFA 0,8014 / 0,066 0,4722 0,7361 0,7428 / 0,0527 0,3491 0,6745 0,8062 / 0,0765 0,5720 0,7860 0,8151 / 0,0807 0,5546 0,7773 Euclidian distance 0,8362 / 0,0672 0,4806 0,7479 0,8321 / 0,0856 0,5671 0,7742 0,8453 / 0,0781 0,5837 0,7918 0,7869 / 0,0691 0,4752 0,7376 GLM 0,9074 / 0,0866 0,6198 0,8099 0,9096 / 0,095 0,6294 0,8147 0,9176 / 0,0857 0,6406 0,8203 0,9178 / 0,0975 0,6703 0,8352 Gower distance 0,8379 / 0,0693 0,4958 0,4958 0,7873 / 0,0726 0,4808 0,7404 0,8774 / 0,0845 0,8158 0,8158 0,7931 / 0,0675 0,4642 0,7321 Mahal. distance 0,8503 / 0,0733 0,5242 0,7621 0,7997 / 0,0801 0,5306 0,7653 0,8604 / 0,0821 0,6138 0,8069 0,7766 / 0,0647 0,4446 0,7223 Maxent 0,9643 / 0,0901 0,6445 0,8222 0,9353 / 0,0902 0,5975 0,7988 0,9253 / 0,0899 0,6722 0,8361 0,9466 / 0,0937 0,6445 0,8222 GAM 0,9393 / 0,0995 0,7117 0,8558 0,9342 / 0,098 0,6489 0,8245 0,9227 / 0,0825 0,6165 0,8082 0,9369 / 0,0978 0,6723 0,8362 FDA 0,9402 / 0,0959 0,6862 0,8431 0,9197 / 0,0864 0,572 0,786 0,9121 / 0,0857 0,6402 0,8201 0,6203 / 0,0902 0,6203 0,8102 MARS 0,9465 / 0,0981 0,7018 0,8509 0,9401 / 0,0971 0,6431 0,8215 0,9196 / 0,0859 0,6423 0,8212 0,9404 / 0,0965 0,6637 0,8318 NNET 0,9266 / 0,0854 0,6111 0,8055 0,8859 / 0,0768 0,5088 0,7544 0,9459 / 0,0886 0,6625 0,8312 0,9340 / 0,087 0,5983 0,7992 RNDFOR 1 / 0,0999 0,7148 0,8574 1 / 0,0997 0,6606 0,8303 1 / 0,0916 0,6848 0,8424 1 / 0,0926 0,6365 0,8182

Figura 12. Mapa de refúgios históricos considerando todas as células dentro do grid que tinham valores de adequabilidade ≥0,5 nos diferentes períodos de tempo analisados (presente, 6 e 21ky BP).

DISCUSSÃO

Nossos resultados fornecem novas percepções sobre a distribuição espacial da de Tropidurus oreadicus, já que revela uma estruturação genética expressiva ao longo das paisagens de áreas abertas onde a espécie ocorre. Considerando que os níveis de biodiversidade Neotropical são reconhecidamente subestimadas, e que grandes quantidades de espécies ainda aguardam ser descritas (Fourquet et al., 2007, 2014; Mora et al., 2011; Scheffers et al., 2012; Wheeler et al., 2012; Costello et al., 2013; Domingos et al., 2014;) isso é particularmente uma verdade para o Cerrado (Domingos et al., 2014). Embora relativamente ainda pouco estudado, investigações recentes tem demonstrado que lagartos com distribuições geográficas no bioma apresentam linhagens crípticas

revelados por dados moleculares (e.g., Werneck et al., 2012; Giugliano et al., 2013; Recoder et al., 2013; Santos et al., 2014), aos quais geralmente são agregados dados morfológicos para delimitação (e.g., Domingos et al., 2014) ou descrição de novas espécies (e.g., Colli et al., 2009; Recoder et al., 2014). Os padrões de diversificação revelados por nossos resultados demonstram que as linhagens crípticas em Tropidurus oreadicus são consoantes com o que parece ser uma regra para espécies dos Trópicos, onde a alta biodiversidade, processos históricos e heterogeneidade espacial podem interagir com o clima para moldar padrões de diferenciação (Schneider et al., 1999; Moritz et al., 2000; Hill & Hill, 2001; Thorpe et al., 2010; Recoder et al., 2013). As proporções de membros e tamanhos corporais das populações analisadas parecem estar associados a essas divergências moleculares encontradas na espécie sob nossa investigação (ver Capítulo 2). Os índices moleculares obtidos no presente estudo em geral sugerem que as populações de T. oreadicus não apresentam evidências de gargalos populacionais marcantes seguidos de expansão (Tabela 8 e 9). Populações que sofreram uma expansão demográfica repentina podem apresentar uma distribuição mismatch em forma Poisson, ao passo que populações que tem estado em equilíbrio demográfico por um tempo relativamente longo mostram uma distribuição bimodal ou irregular (Rogers & Harpending, 1992) (Figura 4). Em relação aos índices de diversidade nucleotídica (π) e haplotípica (h) entre os pares de haplótipos analisados, os resultados dessas métricas parecem se enquadrar no ‘padrão 4’ proposto por Grant & Bowen (1998), onde os índices de π e h refletem um alto nível de divergência entre haplótipos, que pode ser atribuído a contato secundário entre linhagens alopátricas previamente diferenciadas, ou devido a uma longa história evolutiva de populações grandes e estáveis - que os dados sugerem ser o caso para Tropidurus oreadicus. O mapa gerado para as áreas de refúgios (Figura 12) potencias no passado sugerem o mesmo com dados espaciais. Essa congruência de padrões revelados por dados independentes sugere que as flutuações climáticas não causaram uma retração muito acentuada na distribuição da espécie, embora essas mudanças de clima tenham provavelmente contribuído para a conformação final da arquitetura genética e espacial de suas populações atuais. Os valores altos e significativos de FST encontrados (Tabela 10) podem ser um indício de que a dispersão de indivíduos de T. oreadicus tenha sido em grande parte restringida localmente.

Em relação às populações isoladas na bacia Amazônica, as hipóteses mais prováveis são (i) que elas são derivadas de populações de espécies de formações abertas que se tornaram isoladas conforme as florestas invadiram as áreas abertas, ou (ii) que elas se dispersaram para seus locais atuais pelos rios que estavam se originando nas áreas abertas ao sul (Vitt, 1993). É sabido que a região Amazônica experimentou períodos de expansão e retração das florestas, mas a maioria das evidências biológicas demonstra que espécies de habitats florestados ficaram isoladas em manchas mais úmidas circundadas por áreas secas tais como a caatinga ou cerrado (Haffer, 1969; Vanzolini & Williams, 1970; Vanzolini, 1981). Os Tropidurus de formações abertas nos enclaves amazônicos representariam o inverso: espécies de formações abertas isoladas em ilhas secas rodeadas por florestas (Vitt, 1993). Este acontecimento teria gerado uma barreira geográfica na distribuição para os Tropidurus de formações abertas, isolando populações de habitats relictuais abertos e secos conforme a floresta tropical substituía os habitats de cerrado e caatinga (Harley, 1988; Vitt, 1993; Colli, 2005). O isolamento em enclaves atuais de vegetação aberta aparentemente resultou na diferenciação de espécies de Tropidurus em vários fragmentos do cerrado, como em Rondônia e na Serra do Cachimbo (Rodrigues, 1987; Vanzolini, 1986; Vitt, 1993). Análises biogeográficas ainda são necessárias para melhor explorar os dados moleculares levantados aqui e formalizar estatisticamente essa lógica, mas os resultados até agora parecem indicar que as populações de Rondônia, que ficaram aqui classificadas como linhagem 6, potencialmente divergiram a partir de populações incluídas na linhagem 5, muito provavelmente por rotas de dispersão pelo estado do Mato Grosso durante a expansão da vegetação aberta. Para outras espécies, é relatado que o ótimo climático do Mioceno Médio (17- 15 Mya) foi um período quente e seco entre períodos de forte sazonalidade associada a expansões das amplitudes de distribuições geográficas de vertebrados ectotérmicos e de eventos de extinção (Bohme, 2003). Para anuros, restrições geográficas e ecofisiológicas são salientadas pela forte heterogeneidade ambiental dentro das formações denominadas “Diagonal Seca” (i.e., Chaco, Cerrado e Caatinga), que são considerados componentes históricos notórios que influenciaram os padrões de especiação e distribuição geográfica desses esses anfíbios que, em geral, possuem baixa habilidade de dispersão (Diniz-Filho et al., 2008; Hillman et al., 2009; Valdujo et al., 2012, 2013). De fato, alguns habitats correspondem a pequenos enclaves de florestas de galeria ao longo do Cerrado, enquanto espécies como Adenomera hylaedactyla e A. martinezi são adaptadas a ambientes

dominados por vegetação rasteira. Essas observações indicam que as tendências para diversificações subsequentes a mudanças de habitat são provavelmente associados com adaptações ecofisiológicas importantes (Fouquet et al., 2014). Estes autores, quando discutem a diferenciação do clado que contém a espécie Adenomera martinezi, que é típica de ambientes abertos, sugerem que a sua fragmentação deve ter ocorrido há cerca de 10 Mya, levando ao isolamento da espécie dentro da Amazônia, e afirmam que isso pode ser um testemunho da expansão da Amazônia e de enclaves estáveis (e antigos) de vegetação aberta dentro desse bioma. Vanzolini (1986), discutindo o papel das flutuações climáticas na Amazônia, defende que os Tropidurus de Rondônia ilustram bem a lógica do modelo de especiação geográfica, ressaltando que os espécimes do Cerrado do Brasil Central e da Amazônia diferem principalmente em caracteres de coloração bem evidentes e de pequena variação intrapopulacional; por outro lado, o autor afirma claramente que são formas estreitamente aparentadas, derivadas de um ancestral comum. O modelo sugerido para explicar essa diferenciação é um modelo de refúgios, com faunas de lagartos que teriam ficado confinadas em enclaves, sofrendo extinções estocásticas que produziram diferenças na riqueza de espécies entre localidades (Gainsbury & Colli, 2003). O agrupamento das populações de Rondônia, (i.e., linhagem 6) parece refletir essa lógica na topologia da árvore filogenética resgatada dos dados de mtDNA, que mostra uma forte estruturação para separar essas populações das demais (Figura 5). Além de T. oreadicus, o lagarto Ameiva parecis também parece ter evoluído dessa forma (Gainsbury & Colli, 2003). A modelagem de distribuição para T. oreadicus (Figura 10) mostra uma ampla distribuição da espécie durante o Holoceno Médio, apesar de apresentar sutis diferenças quando comparada à distribuição atual, e salienta uma quebra na frequência de ocorrência que promove uma macha quente isolada justamente na região do estado de Rondônia. Como esperado, o mapa de incerteza para o componente ‘tempo’ (Figura 11A) apresenta suas maiores incertezas justamente nas bordas da distribuição da espécie, evidenciando as mudanças na amplitude de distribuição geográfica ao longo do tempo. Uma ideia amplamente difundida em macroecologia é que a abundância das populações de uma espécie é maior no centro de sua distribuição geográfico e declina na direção das bordas (Kirkpatrick & Barton, 1997; Sagarin & Gaines, 2002; McGill & Collins, 2003; Guo et al., 2005; Rivadeneira et al., 2010). Esta hipótese de centro de abundância (HCA) assume

que as condições de vida são ideais no centro da amplitude de distribuição geográfica, e que a abundância local é um reflexo do sucesso a nível individual (Brown, 1984). Dado que as linhagens encontradas para T. oreadicus se sobrepõem no espaço geográfico, essa sobreposição se dá coincidentemente na região mais central do Cerrado, entre os limites dos estados de Goiás e Tocantins, alcançando porções ao oeste da Bahia e Minas Gerais – áreas que estão incluídas (ou muito próximas) nos grids do mapa de refúgio (Figura 12). Muito provavelmente essa região deve ter sido uma zona híbrida no passado para as populações de T. oreadicus, pois alguns agrupamentos filogenéticos aparentemente se mostram como um arranjo incompleto de linhagens (e.g., indivíduos das populações APG-GO, SDM-GO e PXE-TO, que foram incluídos em mais de uma linhagem; Figuras 5 e 8). Há evidências de que esse tipo de padrão seja decorrente de uma separação de linhagens que foi mantida pelas características ambientais contemporâneas, com populações provindas de diferentes refúgios, e que encontram em áreas ‘menos ótimas’ do clima atual (Moritz et al., 2009) ou em zonas hibridas do passado (Dasmahapatra et al., 2010, Pyron & Burbrink, 2010). Essa lógica parece fazer sentido quando levamos em conta que, ao contrário do que ocorre na floresta amazônica, a variação na heterogeneidade de habitat é mais pronunciada verticalmente, i.e., do chão da floresta até a copa das árvores (Pires & Prance, 1985), em ambientes abertos, como é o caso do Cerrado, esta variação é mais intensa horizontalmente, conforme as diferentes fitofisionomias se intercalam (Colli et al., 2002). Em outras palavras, enquanto na Amazônia há grande variedade dentro dos habitats, no Cerrado esta variação se dá entre os habitats (Garda et al., 2013). Para T. oreadicus, populações ADN-GO, BUR-MG, CAC-MT, CAS-TO, COC-BA, CRL-MA, MAC-AP, MIN-GO, MSF-BA, NAT-TO, NOX-MT, PAL-TO, PAR-PA, PIR-GO, PRA-GO, SAL-MT, SDA-PA, SDM-GO e PVE-RO apresentaram valores menores que 0,5% para a diversidade nucleotídica que, em conjunto com os altos valores de diversidade haplotípica, indicam um alto nível de divergência entre haplótipos (Tabela 9). De acordo com Grant & Brown (1998), isso pode ser atribuído a contato secundário entre linhagens alopátricas previamente diferenciadas, ou devido a uma longa história evolutiva de populações grandes e estáveis. Diversas espécies de lagartos, mesmo com ecologias e morfologias distintas (e.g., Phyllopezus pollicaris, Tropidurus etheridgei, Bachia bresslaui, Vanzosaura rubricauda) apresentam padrões de distribuição disjunta na porção central do Cerrado (Vanzolini, 1968; Rodrigues, 1987; Nogueira, 2006; Rodrigues et al., 2008; Recoder et al., 2013;

Teixeira Jr. et al., 2013). Para o geconídeo Phyllopezus pollicaris, por exemplo, há evidências genéticas que divergências antigas entre populações ocorreram na região de Serra Geral (Gamble et al., 2012; Werneck et al., 2012), que possui uma história geomorfológica complexa relacionada a formações antigas erodidas, o que parece ter favorecido a presença e diversificação de muitas espécies (Rodrigues et et al., 2008; Colli et al., 2009; Recoder et al., 2013). O soerguimento do Planalto Central é considerado outro importante evento geológico que impulsionou especiações por alopatria na região (Colli, 2005; Werneck, 2011; Zanella, 2011). Do ponto de visto geológico, de acordo com Ab’Sáber (2003), os cerrados ocupam depressões interplanálticas muito mais quentes do que as cimeiras dos platôs – ainda que sujeitos à mesma sazonalidade - e que o domínios morfoclimáticos dos cerrados e cerradões em sua área de máxima tipicidade nos planaltos sedimentares e cristalinos de altitude média de Goiás e Mato Grosso são muito mais antigos do que aqueles ainda hoje existentes nas depressões interplanálticas que margeiam ou interpenetram o Brasil Central. Assim, além das mudanças climáticas terem dirigido as flutuações na amplitude de distribuição geográfica da espécie, o gradiente de altitude também pode ter exercido alguma influência na conformação genética de T. oreadicus. Embora sejam necessárias novas metodologias e análises para melhor explorar essa hipótese, é possível inferir que a sobreposição de linhagens evolutivas coincidindo com áreas heterogêneas em relação a altitude possa ser um indício de que o gradiente altitudinal também tenha algum papel na diversificação da espécie (Figura 13).

Figura 13. Ilustração da interpolação do mapa de refúgios históricos (A) e das linhagens de mtDNA resgatadas de T. oreadicus (C) a partir de todos os registros de ocorrência para a espécie (B). Os gradientes de altitude são evidenciados por um shape de elevação do relevo no mapa B, salientando as áreas mais elevadas (mais esculras) próximas à sobreposição das linhagens.

Tendo em vista que os critérios para se delinear espécies geralmente são difíceis em radiações evolutivas ricas em espécies (ou linhagens, em nível intraespecífico) (Frost & Hills, 1990; de Queiroz, 1998, 1999; Tobias et al., 2010) como é o caso do gênero Tropidurus, futuras considerações taxonômicas podem surgir deste conjunto de dados moleculares e espaciais e dos dados morfométricos analisados no Capítulo 2. Dados não analisados de escamação/folidose também aguardam tempo hábil para serem acoplados em uma abordagem de taxonomia integrativa e eclética para delimitar este táxon atualmente denominado como T. oreadicus. Uma vez que a conservação de nichos tem se tornado um princípio muito influente em estudos de evolução (Wiens et al., 2010), informações a respeito de traços ecológicos e suas associações com a filogenia são cruciais para determinarmos quais processos mais influenciaram a estrutura de comunidades locais (Garda et al., 2013), que deve, por sua vez, também determinar os

mesmos processos em níveis taxonômicos menores, como populações e espécies. Correspondências ecológicas entre variáveis ambientais e forma/proporções do corpo também sugerem uma variação morfológica em T. oreadicus pode estar sendo determinada por processos adaptativos locais e por uma arquitetura genética estabelecida (Capítulo 2).

Por fim, cabe ressaltar a essa altura a relevância de se entender os processos históricos relacionados à história evolutiva de uma espécie é essencial para a elaboração de estratégias conservacionistas e políticas públicas de preservação da biodiversidade atual (e.g., Loyola et al., 2008). Reconhecer a localização de áreas climaticamente estáveis no futuro depende de modelos de nicho ecológicos e de variações climáticas que podem oferecer informações sobre a variação da amplitude de distribuição das espécies ao longo do tempo. O mapa revelado pela projeção da distribuição potencial de T. oreadicus para o futuro indica uma drástica redução da amplitude de sua distribuição geográfica (Figura 10), concentrando-se em regiões entre a divisa dos estados de Goiás e Minas Gerais. Essas projeções e inferências conservacionistas sobre as potenciais alterações na distribuição espacial de espécies do Cerrado tem sido atualmente bem exploradas. Terribile et al. (2012), por exemplo, geraram modelos de nicho ecológico para 18 espécies de plantas do Cerrado, cujas distribuições geográficas potenciais foram projetadas para o passado e para o futuro. Comparando essas predições, os autores identificaram uma área climaticamente estável e discute as priorizações espaciais para conservação do bioma.

Há cada vez mais evidências de que áreas expostas a estabilidades climáticas de longa duração (refúgios) tem um papel crítico em promover a persistência da biodiversidade, especialmente em períodos de mudanças climáticas globais ou regionais (e.g., Graham et al., 2006). Assim, se áreas climaticamente estáveis do passado são frequentemente associadas com altos níveis de diversidade e endemismo (e.g., Haffer, 1969; Fjeldså et al., 1999; Araújo et al., 2008), no futuro, analogamente, áreas de altas estabilidades climáticas podem ter um papel similar para proteger a biodiversidade atual. Devido sua importância no contexto conservacionista, elas são consideradas como amortecedores para os impactos do aumento global de temperatura e outras mudanças climáticas previstas para o século 21 (Williams et al., 2008; Terribile et al., 2012; Werneck et al., 2012).

Desta forma, a identificação de áreas potenciais para a maior adequabilidade de T. oreadicus, pode lançar luz sobre estratégias mais amplas que englobem outras espécies de lagartos de ecologia e/ou distribuição geográfica parecidas. Terrible et al. (2012) salientam a importância de se identificar essas áreas, uma vez que são localidades importantes na tarefa de conservação da biodiversidade brasileira em meio a mudanças climáticas futuras. Para plantas do Cerrado, como Caryocar brasiliense, há evidências de que as áreas estáveis para esta espécie tendem a se restrigir à uma distribuição menor mais ao sudeste do país. A diversidade genética e o número de alelos deve diminuir, impondo diversas ameaças à espécie, já que esta área projetada coincide com ambientes mais perturbados no Brasil (Collevatti et al., 2011). Fazer a caracterização genética das espécies atuais, portanto, é de suma importância, já que a resposta evolutiva ocorre em termos de adaptação a mudanças ambientais (Peterson et al., 1999; Araújo & Pearson 2005; mas ver Pearman et al., 2010). Assumindo-se que a evolução de atributos adaptativos é limitado pela variabilidade genética, ou restringida por outros fatores, a plasticidade fenotípica envolvida na largura do nicho pode permitir persistência mesmo em condições ambientais que não são atualmente as mais adequadas (Bradshaw, 1991; Burt, 2001; Diniz-Filho & Bini, 2008). Atualmente, é possível identificar um florescimento de discussões e investigações no âmbito conservacionista fazem inferências sobre o papel das mudanças climáticas do futuro e seus efeitos na distribuição geográfica que podem ter impactos relevantes em políticas públicas para a conservação da biodiversidade brasileira (e.g., Loyola et al., 2008; 2014; Lemes & Loyola, 2014; Lemes et al., 2014; Schlottfeldt et al., 2015; Vilar et al., 2015).

Em geral, nossos resultados alteram a nossa percepção da distribuição espacial de T. oreadicus, uma vez que desembaraça a disposição geográfica de suas linhagens reveladas pelos seus genes e populações, agregando dados e informações à tentativa de compreender como os eventos históricos influenciam os limites genéticos de lagartos neotropicais. Assim conclui-se que a histórica evolutiva de Tropidurus oreadicus corrobora a terceira hipótese testada: que tanto eventos do Terciário quanto do Quaternário influenciaram a conformação da espécie. Isso equivale dizer que tanto processos antigos quanto mais recentes no tempo histórico parecem ter ditado as divergência das linhagens que atualmente se desdobram ao longo da distribuição geográfica disjunta da espécie. Os nossos resultados, sejam aqueles relacionados à topologia e padrões de divergências das árvores filogenéticas, aos índices moleculares ou 73

à modelagem de distribuição, somam-se aos esforços para se testar hipótese explícitas que ajudem a identificar quais eventos históricos mais contribuíram no estabelecimento da arquitetura genética das espécies contemporâneas do Neotrópico. Sendo os lagartos ótimos grupos para esses estudos que investigam os processos subjacentes ao processo de especiação (Pianka & Vitt, 2003; Camargo et al., 2010), T. oreadicus se mostrou um interessante modelo de diversificação que pode lançar luz no melhor entendimento de diversos répteis ectotérmicos e oportunistas adaptados a ambientes de vegetação aberta e, portanto, devem ter acompanhado as dinâmicas de fitofisionomias dominantes ao longo das flutuações climáticas do pretérito. Conforme a filogeografia caminha a passos largos em direção a abordagens cada vez mais integradas, a comparação entre histórias evolutivas de animais de ecologias similares promete vislumbres cada vez maiores em relação aos padrões e processos que impulsionaram o surgimento de tantas linhagens independentes que se refletem na tão rica biodiversidade dos biomas brasileiros.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICE

Espécie Estado Cidade Longitude Latitude Referência Tropidurus oreadicus AM Lábrea -65.716667 -8.333333 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus AP Macapá -51.065833 0.038889 CHUNB06458 Tropidurus oreadicus BA Cocos -45.24205 -14.54507 CHUNB51537 Tropidurus oreadicus BA Correntina -45.305972 -13.484921 CHUNB06164 Tropidurus oreadicus BA Ibipetuba -44.5333 -11 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus BA Jaborandi -45.83963 -14.38383 CHUNB51123 Tropidurus oreadicus BA São Desidério -45.08716 -12.70555 CHUNB51119 Tropidurus oreadicus BA São Desidério -44.9733 -12.3633 CHUNB62975 Tropidurus oreadicus BA São Desidério -44.97975 -12.35551 CHUNB51122 Tropidurus oreadicus DF Brasília -47.79779 -15.77597 CHUNB30852 Tropidurus oreadicus DF Brasília -47.79779 -15.77597 CHUNB06151 Tropidurus oreadicus GO Araguacema -49.5667 -8.8333 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus GO Araguatins -48.1167 -5.6333 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus GO Arraias -46.93777 -12.930833 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus GO Aruanã -50.959 -14.71677 CHUNB06171 Tropidurus oreadicus GO Baliza -52.443646 -16.3405 CHUNB06181 Tropidurus oreadicus GO Barro Alto -49.01 -15.093331 13042, Rogério Pereira Bastos, Tropidurus oreadicus GO Barro Alto -48.9 -14.96666 Ávila_2011 Tropidurus oreadicus GO Catalão -47.71859 -17.97796 CHUNB50416 Tropidurus oreadicus GO Cavalcante -47.828889 -13.680833 17483, Frederico Gustavo Tropidurus oreadicus GO Cavalcante -47.72167 -13.64236 CHUNB59500 Tropidurus oreadicus GO Cocalzinho -48.75 -15.8 Meira_2007 Tropidurus oreadicus GO Cocalzinho de Goiás -48.554315 -15.636567 CHUNB39923 Tropidurus oreadicus GO Colinas do Sul -48.09216 -13.99034 CHUNB36000 Tropidurus oreadicus GO Goiânia -49.2539 -16.6786 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus GO Goiás -50.22113 -15.83856 CHUNB05982 Tropidurus oreadicus GO Gurupi -49.0667 -11.7164 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus GO Iaciara -46.704755 -14.085906 CHUNB06178 Tropidurus oreadicus GO Luziânia -48.02176 -16.55405 CHUNB47403 Tropidurus oreadicus GO Mambaí -46.113055 -14.487777 Cintra_2009 Tropidurus oreadicus GO Minaçu -48.3642 -13.5056 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus GO Minaçu -48.3974 -13.49575 CHUNB00128 Tropidurus oreadicus GO Mineiros -52.67492 -17.55908 CHUNB23751 Monte Alegre de Tropidurus oreadicus GO -47.1 -13.2 CHUNB53048 Goiás Tropidurus oreadicus GO Niquelândia -48.407437 -14.477248 CHUNB06190 Tropidurus oreadicus GO Niquelândia -48.45 -14.466666 Ávila_2011 Tropidurus oreadicus GO Paraúna -50.4486 -16.9478 CHUNB53125 Tropidurus oreadicus GO Pedro Afonso -48.016824 -9.20444 Carvalho et al, 2013

Tropidurus oreadicus GO Pirenópolis -48.95 -15.85 Faria_2004 Tropidurus oreadicus GO Pirenópolis -49.01104 -15.82596 CHUNB06275 Tropidurus oreadicus GO Porangatu -49.1486 -13.4408 Carvalho et al, 2013 Santa Rita do Tropidurus oreadicus GO -53.065858 -17.250995 Carvalho et al, 2013 Araguaia Tropidurus oreadicus GO São Domingos -46.4481 -13.44979 CHUNB12893 Sao Miguel do Tropidurus oreadicus GO -50.15 -13.266666 Santos_2008 Araguaia Tropidurus oreadicus GO Teresina de Goiás -47.239945 -13.693844 CHUNB21852 Tropidurus oreadicus MA Balsas -46.370414 -8.287721 CHUNB05209 Tropidurus oreadicus MA Balsas -46.370414 -8.287721 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MA Barra do Corda -45.233333 -5.4833333 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.21829 -7.38965 CHUNB52052 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.20434 -7.30161 CHUNB52030 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.36219 -7.29771 CHUNB52029 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.29194 -7.2445 CHUNB52028 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.255 -7.21983 CHUNB52026 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.2353 -7.19502 CHUNB52035 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.22455 -7.16172 CHUNB52041 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.15607 -7.12393 CHUNB52033 Tropidurus oreadicus MA Carolina -47.12981 -7.05511 CHUNB52036 São Pedro da Água Tropidurus oreadicus MA -48.25 -5.133333 Carvalho et al, 2013 Branca Tropidurus oreadicus MG Arinos -46.002441 -15.8036 CHUNB37300 Tropidurus oreadicus MG Buritis -64.007492 -9.705896 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MG Buritizeiro -45.17693 -17.28082 CHUNB44520 Tropidurus oreadicus MG Chapada Gaúcha -45.440201 -15.458816 CHUNB33945 Tropidurus oreadicus MG Chapada Gaúcha -45.950278 -15.343889 Recorder & Nogueira, 2007 Tropidurus oreadicus MG Formoso -45.950277 -15.343888 Recoder_2007 Tropidurus oreadicus MG Jaboticatubas -43.719605 -19.422609 CHUNB57685 Tropidurus oreadicus MS Anastácio -55.8069 -20.4836 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MS Aquidauana -56.032441 -19.548712 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MT Barra do Garças -52.5 -15.2 CHUNB55923 Tropidurus oreadicus MT Cáceres -57.666666 -16.066666 Carvalho et al, 2013 Chapada dos Tropidurus oreadicus MT -55.56035 -15.10068 CHUNB05840 Guimarães Chapada dos Tropidurus oreadicus MT -55.8 -14.416666 Cassel_2012 Guimarães Tropidurus oreadicus MT Cocalinho -50.9958 -14.3972 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MT Manso -55.066666 -15.316666 Strussmann_?_Rafael_Valadão Tropidurus oreadicus MT Nova Xavantina -52.5667 -14.8333 CHUNB63766 Tropidurus oreadicus MT Rondonópolis -54.6356 -16.4708 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MT São Domingos -46.4481 -13.44979 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MT São José da Serra -55.3 -15.6667 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus MT Serra do Roncador -55 -15.6667 Carvalho et al, 2013 91

Tropidurus oreadicus MT Xavantina -52.8 -21.25 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Ananindeua -48.3722 -1.3656 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Augusto Corrêa -46.635 -1.0217 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Baião -49.6717 -2.7906 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Belém -48.5044 -1.4558 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Benevides -48.2447 -1.3614 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Breu Branco -49.461 -4.009 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Cametá -49.5 -2.25 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Canaã dos Carajás -49.8783 -6.4969 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Capanema -47.183333 -1.2 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Carajás -49.883333 -5.9 Rocha & Bergallo, Tropidurus oreadicus PA Carajás -51.8667 -2.95 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Castanhal -47.9264 -1.2939 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Jacundá -49.115833 -4.450833 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Jatobal -49.5333 -4.5333 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Mocajuba -49.5072 -2.5842 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Muru -49.6725 -3.7661 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Paragominas -47.384444 -2.960278 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Parauapebas -50.9 -6.2 CHUNB05702 Tropidurus oreadicus PA Parauapebas -49.8833333 -5.9 Rocha_2008 Tropidurus oreadicus PA Redenção -49.978333 -8.0758333 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Remansão -49.5667 -4.4167 Carvalho et al, 2013 Santa Bárbara do Tropidurus oreadicus PA -48.2944 -1.2236 Carvalho et al, 2013 Pará Tropidurus oreadicus PA Santa Isabel do Pará -48.1606 -1.2986 Carvalho et al, 2013 Santo Antônio do Tropidurus oreadicus PA -48.1294 -1.1519 Carvalho et al, 2013 Tauá São Geraldo do Tropidurus oreadicus PA -48.787162 -6.169111 CHUNB05202 Araguaia São Geraldo do Tropidurus oreadicus PA -48.4125 -6.123611 CHUNB47243 Araguaia Tropidurus oreadicus PA Tucuruí -49.6725 -3.7661 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PA Vigia -48.1417 -0.8583 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus PI Caracol -43.483333 -9.2166666 Arias et al, 2011 Tropidurus oreadicus PI RIBEIRO GONCALVES -45.343506 -7.595042 29613, Robson Walde Tropidurus oreadicus PI Ribeiro Gonçalves -45.2422 -7.5583 CHUNB57022 Tropidurus oreadicus RO Ariquemes -63.0408 -9.9133 Carvalho et al, 2013 Cachoeira de Santo Tropidurus oreadicus RO -63.9167 -8.7833 Carvalho et al, 2013 Antônio, rio Madeira Tropidurus oreadicus RO Guajará-Mirim -64.430556 -11.662222 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus RO Jirau direita -64.6833 -9.4333 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus RO Porto Velho -64.5 -9.6 CHUNB66132 Tropidurus oreadicus TO Aragominas -48.5275 -7.1597 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus TO Araguaína -48.2072 -7.1911 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus TO Araguatins -48.1244 -5.6511 Carvalho et al, 2013 92

Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.949167 -9.314639 CHUNB58040 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.949167 -9.314639 CHUNB58038 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.949167 -9.314639 CHUNB59581 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.960638 -9.31425 CHUNB45189 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.960638 -9.31425 CHUNB45182 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.958361 -9.3126388 CHUNB45198 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.949194 -9.312361 CHUNB58037 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.949194 -9.312361 CHUNB59583 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.957722 -9.312 CHUNB58036 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.967583 -9.3104722 CHUNB45181 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.956833 -9.307222 CHUNB59582 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.960888 -9.3047777 CHUNB45183 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.957638 -9.3045 CHUNB45197 Tropidurus oreadicus TO Caseara -49.959666 -9.3038055 CHUNB45196 Tropidurus oreadicus TO Colinas do Tocantins -48.475 -8.0592 CHUNB50897 Conceição do Tropidurus oreadicus TO -47.185994 -12.407097 CHUNB62688 Tocantins Tropidurus oreadicus TO Dianópolis -46.98027 -11.79763 CHUNB33303 Tropidurus oreadicus TO Figueirópolis -49.1742 -12.1308 CHUNB62800 Tropidurus oreadicus TO Goiatins -47.316666 -7.7 CHUNB57014 Tropidurus oreadicus TO Guaraí -48.5103 -8.8342 CHUNB50819 Tropidurus oreadicus TO Ipueiras -48.45 -11.216666 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus TO Lageado -48.084722 -10.256388 Kohlsdorf_2004 Tropidurus oreadicus TO Mateiros -46.41278 -10.70224 CHUNB40506 Tropidurus oreadicus TO Mateiros -46.420333 -10.546302 Mesquita_2006 Tropidurus oreadicus TO Muricilândia -48.61 -7.1458 Carvalho et al, 2013 Tropidurus oreadicus TO Palmas -48.10853 -10.18914 CHUNB11298 Tropidurus oreadicus TO Paraíso do Tocantins -48.8667 -10.1761 CHUNB53179 Tropidurus oreadicus TO Paranã -47.882344 -12.617719 CHUNB62689 Tropidurus oreadicus TO Pedro Afonso -48.016824 -9.20444 CHUNB50818 Tropidurus oreadicus TO Peixe -48.60056 -12.035 CHUNB52624 Porto Alegre do Tropidurus oreadicus TO -46.9858 -11.6767 CHUNB38903 Tocantins Tropidurus oreadicus TO Porto Nacional -48.483969 -10.548531 CHUNB47801 Santa Fé do Tropidurus oreadicus TO -48.7028 -7.1558 Carvalho et al, 2013 Araguaia São Salvador do Tropidurus oreadicus TO -48.2356 -12.7436 Carvalho et al, 2013 Tocantins

CAPÍTULO 2

Variação geográfica na morfologia e teste de hipóteses sobre diferenciação fenotípica em Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae)

Rodrigo de Mello1,2, André Felipe Barreto-Lima3, Guarino Rinaldi Colli3 &

Rosane Garcia Collevatti2

¹Pós-Graduação em Ecologia & Evolução, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás74001-970, Goiânia-GO, Brasil. ²Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, 74001-970, Goiânia-GO, Brasil. ³Laboratório de Herpetologia, Departamento de Zoologia, Universidade de Brasília, 70910-900, Brasília-DF, Brasil.

RESUMO

Variações nos padrões de história de vida dos organismos podem surgir de condições ambientais distintas, determinadas principalmente pelo clima, topografia, pela combinação desses fatores, como também por processos históricos. A ecologia morfológica é uma abordagem que estuda a relação funcional da forma dos organismos e seu hábitat, usando-se dados de variação individual dentro de populações, espécies ou comunidades. A variação na história de vida dos répteis Squamata é bem conhecida para vários grupos taxonômicos, mas pouco ainda se sabe sobre os padrões de diversificação para lagartos do Cerrado. Assim, neste trabalho foram examinadas 35 populações de Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae) provenientes de nove estados brasileiros, que ocorrem em hábitats de condições ambientais distintas. As variáveis ambientais foram obtidas de cada localidade através de coordenadas geográficas, que foram selecionadas e consideradas de modo independente nas análises. Os dados morfológicos foram usados com as variáveis ambientais em uma análise de correspondência canônica para explicar as fontes causais da variação fenotípica. Um conjunto de dados baseado nas linhagens filogenéticas da espécie também foi avaliado para investigar se há relação entre a diferenciação fenotípica e a diversidade molecular críptica da espécie. . Pela primeira vez são demonstradas variações do tamanho corporal que distinguem diferentes populações de T. oreadicus ao longo de sua distribuição geográfica. Obtivemos cerca de 85% da explicação do modelo para as variações morfológicas, sendo a maior parte explicada por variáveis ambientais. O estudo indicou mudanças nas proporções e tamanho corporais de T. oreadicus, que podem ser explicadas possivelmente por respostas adaptativas às condições ambientais locais.

Palavras-chave: Ecogeografia, diferenciação intraespecífica, morfometria, lagartos.

ABSTRACT

Variations in life history patterns of the organisms can arise from distinct environmental conditions, mainly determined by climate, topography, by the combination of both or historical processes. The morphological ecology is an approach that studies the functional relation between the shape of organisms and their habitat, using data provided from individual variation in morphology within populations, species or communities. Variation in life history of Squamata reptiles is well known for several taxonomic group, but little is known about the patterns of diversification for lizards that inhabit the Cerrado biome. We examined 35 populations of Tropidurus oreadicus (Squamata, Tropiduridae) from nine Brazilian states across habitats with distinct environmental conditions. Environmental variables were obtained from each location through geographic coordinates that were selected and considered as independent variables in the analysis. The morphological data were used with environmental variables in a canonical correlation analysis in order to explain the causal sources of phenotypic variation. A data set based on mtDNA lineages were also assessed to investigate whether the phenotypic differentiation is related to the species’ molecular cryptic diversity. For the first time we demonstrate that variations in body size and proportions distinguishing different populations of T. oreadicus along its geographic distribution. We obtained approximately 85% of the model explanation for morphological variations, most of it explained by environmental variables. The study suggests some shifts in body size and proportions that could be possibly due to adaptive responses to local environmental conditions.

Keywords: Ecogeography, intraspecific differentiation, morphometry, lizards.

INTRODUÇÃO

A variação geográfica é um tema fundamental na Biologia Evolutiva e está intimamente associada às características ecológicas das espécies (Futuyma, 1986), e a análise de padrões de variação morfológica representa um passo básico importante em estudos de Sistemática Zoológica para o reconhecimento de diferenciação entre as espécies (Vanzolini, 1970). Em geral, as diferenças no tamanho do corpo e em caracteres reprodutivos é resultado da ação de condições ambientais locais e das diferenças genéticas entre as populações (Ralls, 1985; Seigel et al.,1993; Seigel & Ford, 2001) e a forte ligação de uma dessas variáveis entre as espécies é uma evidência indireta da ação da seleção natural na formação de padrões macroevolutivos (Elstrott & Irschick, 2004). Assim, um meio de explorar este assunto é comparando as características morfológicas e ecológicas de grupos relativamente próximos de espécies ou populações em diferentes ambientes (Macrini et al., 2003). A percepção de que a morfologia dos organismos varia com a latitude é tão antiga quanto a noção de um gradiente geográfico de diversidade de espécies (Blackburn et al.,. 1999). Entende-se que a latitude também possa estar associada à variação morfológica das espécies, uma vez que áreas geograficamente distintas podem apresentar climas regionais distintos (Barreto-Lima, 2012). Desta forma, o tamanho do corpo e das suas extremidades tende a seguir padrões ecogeográficos (Bidau & Marti, 2008; Hurd et al., 2007) ao compararmos grupos de organismos pertencentes a diferentes ambientes (Jaramillo, 2000). Neste contexto, é interessante notar que embora as espécies e populações possam ser confundidas quando os caracteres são estudados individualmente, elas se tornam entidades próprias quando muitos caracteres são considerados em conjunto (Jaramillo & Dujardin, 2002). As análises multivariadas atuais permitem extrair informações sobre a variação morfológica dos organismos, separando a variação morfométrica em função da variação de tamanho e de forma (Hoyos et al., 2003). A partir de um conjunto de medidas entre pontos de referência, este tipo de análise permite obter variáveis novas resumindo os dados iniciais em poucas dimensões de estudo e suas relações em função dos caracteres estudados (Pimentel, 1992). Com essa informação, é possível então relacionar esses componentes morfométricos aos aspectos biológicos significativos dos organismos (Jaramillo & Dujardin, 2002). Nos Squamata, a influência de fatores ambientais bióticos e abióticos sobre os parâmetros da história de vida tem sido mais relatada em estudos sobre variação e 97

distribuição geográfica de espécies de lagartos (e.g., Mesquita & Colli 2003), como atualmente observado para algumas espécies brasileiras (e.g.: Barreto-Lima, 2012, Giugliano et al., 2013, Recoder et al., 2014). Este grupo taxonômico é um excelente modelo em estudos evolutivos e ecológicos (Pianka & Vitt, 2003), inclusive quanto às características climáticas e ambientais atuando sobre a distribuição das espécies (Costa et al., 2008). Estudos recentes têm demostrado que a herpetofauna do Cerrado apresenta uma alta diversidade e níveis de endemismo (Colli et al., 2002; Nogueira et al., 2005; Mesquita et al., 2006; Costa et al., 2007), e as diversas novas espécies de lagartos que vêm sendo descritas para a região (e.g., Colli et al., 2003; Nogueira & Rodrigues, 2006; Rodrigues et al., 2007; Rodrigues et al., 2008, Giugliano et al., 2013) evidenciam que o bioma ainda continua mal amostrado (Costa et al., 2007, 2010). Pouco se conhece acerca dos padrões ecológicos e históricos destes organismos, visto que trabalhos que abordem significantemente estes aspectos foram desenvolvidos recentemente (e.g., Mesquita et al., 2006, 2007; Vitt et al., 2007; França et al., 2008; Vitt et al., 2008; Werneck et al., 2009), de maneira que a região ainda carece de pesquisas que abordem tais assuntos.

Ao longo de suas distribuições geográficas, as populações Tropidurus oreadicus (Rodrigues, 1987) (Squamata, Tropiduridae) ocorrem em hábitats que apresentam condições ambientais contrastantes, provavelmente definidas por diferentes temperaturas e regimes de precipitação, assim como ocorre para outras espécies de ampla distribuição (e.g., Cruz, 1994; Vitt, 1995; Mesquita et al., 2006; Recoder et al., 2013). Na tentativa de explicar a complexa distribuição de muitos animais sul-americanos, Rodrigues (1987) salienta que estamos atualmente em uma fase tardia de um ciclo de umidade, caminhando para condições mais secas e favoráveis à expansão de alguns grupos de lagartos (e.g., T. oreadicus T. hispidus, T. etheridgei, apoiando-se em investigações que já mostravam evidências a favor dessa ideia (e.g., Vanzolini, 1974; Vanzolini & Ramos, 1977). Vanzolini (1993), discutindo o papel das flutuações climáticas na Amazônia, sugere que os Tropidurus de Rondônia ilustram bem a lógica do modelo de especiação geográfica, ressaltando que os espécimes do Cerrado do Brasil Central e da Amazônia diferem principalmente em caracteres de coloração bem evidentes e de pequena variação intrapopulacional, evidenciando claramente que são formas estreitamente aparentadas. Assim, é de grande valia que novos esforços sejam concentrados para ampliar a gama de informações disponíveis para testes de hipóteses que gerem conhecimentos 98

acerca dos processos que influenciaram na diversificação, estruturação genética e especiação desses organismos. Historicamente as diferenças morfológicas entre populações são usadas como um indícios de isolamento reprodutivo, e posterior identificação dos limites de uma espécie (Mayr, 1942; Simpson, 1951). Considerando que distintos padrões encontrados em caracteres morfológicos entre diferentes localidades sugerem que tais características estão sujeitas à seleção natural de acordo com as diferentes pressões impostas pelo ambiente, e ponderando que ainda há muito a ser explorado no sentido de compreender a história e ecologia dos organismos do Cerrado, o presente capítulo apresenta um estudo da variação morfológica do lagarto T. oreadicus ao longo de sua extensa (e disjunta) distribuição geográfica, de maneira a contribuir na compreensão das variáveis envolvidas na sua evolução em termos adaptativo decorrente dos eventos históricos relacionados à diferenciação geográfica de suas populações. Desta forma, as análises aqui conduzidas visaram como objetivos de estudo: (1) revelar os padrões geográficos de diferenciação morfológica (caracteres morfométricos) entre as populações da espécie, e verificar se há relação entre variabilidade na forma corporal e a filogenia; e (2) identificar quais variáveis ambientais melhor explicam os padrões de variação geográfica e morfológica de suas populações. Para isso, serão testadas as seguintes hipóteses: (1) a variação geográfica na morfologia de T. oreadicus está relacionada com variáveis ambientais e distribuição espacial (latitude e longitude), e (2) a variação geográfica na morfologia de T. oreadicus está relacionada com as relações de parentesco entre as populações.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta e mapeamento geográfico dos dados

Para o levantamento do conjunto de dados morfológicos, foram examinados 459 espécimes provenientes de 35 localidades (Tabela 1), devidamente tombados nos seguintes museus e/ou coleções científicas: Coleção Herpetológica de Brasília (CHUNB), Coleção Herpetológica do Instituto Nacional de Pesquisas na Amazônia (INPA) e Museu Paraense Emílio Goeldi (MPEG) (Apêndice I). Os indivíduos foram medidos com um paquímetro digital (precisão de 0,01 mm) para a obtenção das medidas morfométricas: 99

comprimento rostro-anal (cra); comprimento da cauda (ccau); largura do corpo (lco); altura do corpo (aco); largura da cabeça (lca); altura da cabeça (aca); comprimento da cabeça (cca); comprimento do membro anterior (cmant); e comprimento do membro posterior (cmpost). As últimas duas medidas foram tomadas sempre do lado direito dos lagartos, salvo quando os membros estavam danificados. A representação e o

delineamento das medidas tomadas de T. oreadicus podem ser observados na Figura 1.

Figura 1. Representação das oito medidas morfométricas tomadas dos espécimes de Tropidurus oreadicus: 1. comprimento rostro-anal [cra]: rostro até primeira fissura da cloaca; 2. comprimento da cauda [ccau]: segunda linha cloaca ate fim da cauda; 3. altura do corpo [aco]: extremidade ventre-dorso na altura do tórax; 4. largura da cabeça [lca]: parte mais ampla da região do timpano; 5. altura da cabeça [aca]; 6. comprimento da cabeça [cca], mesma linha da lca, do limite anterior do ouvido até o rostro; 7. comprimento do membro anterior [cmant]: cotovelo até 'inserção do braço no corpo' anterior + cotovelo até ponta 4º dedo; 8. comprimento do membro posterior [cmpost]: inserção da coxa no corpo até o joelho + joelho até ponta do 4º artelho.

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Tabela 1. Localidades, siglas e coordenadas geográficas das populações utilizadas nas comparações morfológicas. N= tamanho da amostra.

Localidade-Distrito ou Estado Código N Longitude Latitude Brasília-DF BSB-DF 13 -47,7978 -15,7760 Cavalcante-GO CAV-GO 6 -47,8289 -13,6808 Minaçu-GO MIN-GO 19 -48,3642 -13,5056 Alto Paraíso de Goiás - GO APG-GO 21 -47,5100 -14,1328 Alvorada do Norte-GO ADN-GO 23 -46,4919 -14,4808 São Domingos-GO SDM-GO 17 -46,4481 -13,4498 Pirenópolis-GO PIR-GO 18 -48,9500 -15,8500 Piranhas-GO PRA-GO 8 -51,8219 -16,4269 Caseara-TO CAS-TO 13 -49,9577 -9,3120 Colinas do Tocantins-TO CDT-TO 4 -48,4750 -8,0592 Paranã-TO PAN-TO 11 -47,8823 -12,6177 Palmas-TO PAL-TO 19 -48,1085 -10,1891 Mateiros-TO MAT-TO 19 -46,4203 -10,5463 Natividade-TO NAT-TO 11 -47,7228 -11,7100 Peixe-TO PXE-TO 18 -48,6006 -12,0350 Brejinho de Nazaré -TO BDN-TO 7 -48,5658 -11,0000 Taquaruçu-TO TAQ-TO 8 -55,6778 -15,5636 Buritizeiro-MG BUR-MG 10 -44,9619 -17,3508 Barra do Garça-MT BDG-MT 9 -52,5000 -15,2000 Nova Xavantina-MT NOX-MT 25 -52,5667 -14,8333 Cáceres-MT CAC-MT 9 -57,6667 -16,0667 Barra do Bugres-MT BBU-MT 1 -57,1808 -15,0728 Santo Antônio do Leverger-MT SAL-MT 4 -56,0769 -15,8658 São Desidério-BA SDS-BA 6 -44,9733 -12,3633 Cocos-BA COC-BA 23 -45,2421 -14,5451 Barreiras-BA BAR-BA 3 -44,9900 -12,1528 Ibotirama-BA IBO-BA 8 -43,2208 -12,1850 Muquém de São Francisco -BA MSF-BA 4 -43,5489 -12,0650 Santa Maria da Vitória-BA SMV-BA 2 -44,1978 -13,3978 Macapá-AP MAC-AP 24 -51,0658 0,0389 Parauapebas - PA PAR-PA 27 -49,8833 -5,9000 Serra das Andorinhas-PA SDA-PA 9 -48,4125 -6,1236 Carolina-MA CRL-MA 27 -47,2183 -7,3897 Porto Velho-RO PV-RO 10 -64,6833 -9,4333 Guajará-Mirim-RO GMI-RO 23 -64,4306 -11,6622

O programa Maxent v.3.3.3 (Phillips et al., 2006) foi usado neste capítulo especificamente como ferramenta para se elucidar quais as variáveis ambientais mais importantes para a espécie, bem como entre as linhagens evolutivas de T. oreadicus. Este

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software usa o princípio da entropia máxima sobre os dados de presença para estimar funções que revelam as variáveis ambientais e a adequabilidade de uma espécie ao seu hábitat, visando esclarecer tanto nicho ecológico como a distribuição potencial geográfica de um táxon (Phillips et al., 2006). Assim, dez modelos foram gerados como uso da média destes para obtenção dos dados ambientais finais, considerando na seleção aleatória de 30% dos sítios registrados para testes dos modelos (Barreto-Lima, 2012).

As variáveis ambientais foram obtidas através das coordenadas geográficas de cada localidade, em resolução de 2,5 arc minutos, utilizando o banco de dados do WorldClim (Hijmans et al., 2005) para os últimos 50 anos e rodadas no Maxent (Barreto- Lima, 2012). Vinte e duas variáveis ambientais foram extraídas: latitude x longitude (em graus decimais), altitude (em metro), cobertura vegetal ou NDVI (normalized difference vegetation index – escala de 0-255), temperatura anual média (Bio1), média da amplitude de temperatura diurna (Bio2), isotermalidade (Bio3), temperatura sazonal (Bio4), temperatura máxima do mês mais quente (Bio5), temperatura mínima do mês mais frio (Bio6), amplitude da temperatura anual (Bio7 = Bio5 - Bio6), temperatura média do trimestre mais úmido (Bio10), temperatura média do trimestre mais seco (Bio11), média anual de precipitação (Bio12), precipitação no mês mais úmido (Bio13), precipitação no mês mais seco (Bio14), precipitação sazonal (Bio15), precipitação no trimestre mais úmido (Bio16), precipitação no trimestre mais seco (Bio17), precipitação no mês mais quente (Bio18) e, por fim, precipitação no trimestre mais frio (Bio19).

Análises dos dados morfométricos

Para análises dos dados, a metodologia empregada foi de acordo com Barreto- Lima (2012), em estudo sobre a distribuição potencial e variação geográfica da morfologia de lagartos do gênero Enyalius. Nos dados incompletos das medidas morfológicas dos lagartos (e.g., perna ou cauda quebrada), a metodologia de imputação múltipla foi aplicada para complementar a matriz de dados morfológicos. Este método é baseado em predições que buscam valores médios com o uso do pacote mice (Zhang, 2003), estimando os valores faltantes através dos observados, utilizando um algorítmo (Barreto-Lima, 2012). Uma vez completa, os valores da matriz de dados morfométricos foram transformados em logaritmo decimal (log10) para atender os requerimentos de 102

normalidade (Zar, 2009). O tamanho do corpo foi definido como os escores de um vetor isométrico, com valores de p= 0,5, onde p é o número de variáveis (Jolicoeur, 1963), a fim de separar a variação morfométrica em componentes de tamanho e forma do corpo (Barreto-Lima, 2012). Os escores foram calculados por multiplicação n x p da matriz de dados (‘log transformados´), onde n é o número de observações pelo vetor isométrico p x 1 (Somers, 1986). O efeito do tamanho corporal das variáveis morfométricas, i.e., a forma do corpo, foi retirado usando-se a fórmula de Burnaby (1966):

L = Ip – V(VTV)-1VT onde Ip é a identidade matriz p x p, V o vetor isométrico p x 1 e VT a matriz transposta de V. Testes de correlação foram feitos entre as variáveis ambientais para se evitar colinearidades no modelo e as correlações com mais de 75% foram desconsideradas das análises (p < 0,05) para se evitar redundâncias no modelo (Barreto-Lima, 2012). Devido a possibilidade de autocorrelação espacial dos dados (Bocard et al., 1992), regressões múltiplas foram realizadas associando-se o tamanho do corpo ajustado às variáveis ambientais, com base nas coordenadas geográficas de cada localidade (Barreto-Lima, 2012), sendo a análise complementada pela seleção das variáveis ambientais via “AIC” (Akaike information criterion) e do model averaging (Burnham & Anderson, 2002). Nove variáveis ambientais foram consideradas independentes e utilizadas nas análises: longitude, latitude, média da amplitude de temperatura diurna (Bio2), temperatura sazonal (Bio4), média anual de precipitação (Bio12), precipitação no mês mais seco (Bio14), precipitação no mês mais quente (Bio18), altitude e a cobertura vegetal (ndvi). Uma matrix binária de identidade foi criada para correlacionar os conjuntos de dados morfológicos e ambientais baseado na seleção das variáveis mais importantes, ao passo que uma análise de correlação foi feita entre essas variáveis e o tamanho corporal ajustado para se determinar o nível e tipo de associação entre elas (Barreto-Lima, 2012). Uma análise de correspondência canônica (CCA) foi feita utilizando-se a média de valores morfológicos e o modelo das características ambientais em três passos, utilizando o pacote estatístico vegan (ver Barreto-Lima, 2012). Testes de significância desses modelos foram realizados com análise de variância (ANOVA) (1.000 permutações). Esses procedimentos foram realizados para analisar a significância da variação geográfica da morfologia de dois conjuntos de dados: um considerando todas as populações em

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conjunto, e outro separando-as em seis grupos – aqueles da árvore filogenética resgatada a partir dos dados moleculares mitocondriais (Capítulo 1). Todas as análises descritas foram realizadas no programa R v.2.1.4.1 (R Development Core Team, 2011), com nível de significância de p ≤ 0,05.

RESULTADOS

Segundo o modelo de distribuição potencial gerado, as variáveis ambientais que melhor explicaram, i.e., com as maiores proporções, a distribuição geográfica das populações de T. oreadicus foram: latitude, longitude e média de precipitação anual. Porém, quando cada linhagem evolutiva foi avaliada separadamente, sob os mesmos critérios, a importância das variáveis variou consideravelmente (Tabela 2). A cobertura vegetal (ndvi), por exemplo, foi a variável que mais explicou (34,7%) a distribuição da linhagem 6, cujas populações se encontram justamente em enclaves de cerrado na região amazônica. Por sua vez, a média de precipitação anual (Bio12), precipitação no mês mais seco (Bio14) e temperatura sazonal (Bio4) foram as variáveis mais frequentes na explicação da distribuição das linhagens evolutivas da espécie.

Tabela 2. Variáveis ambientais e suas porcentagens de importância no modelo de distribuição das populações de Tropidurus oreadicus e para cada linhagem evolutiva revelada pelo mtDNA. % cont= porcentagem de contribuição; I.P.= importância na permutação; Bio12= média de precipitação anual; Bio14= precipitação no mês mais seco; ndvi= índice de cobertura vegetal; Bio18= precipitação no mês mais quente; Bio2= média da amplitude de temperatura diurna; Bio4= temperatura sazonal. As três variáveis mais importantes são salientadas em negrito para cada conjunto de dados analisados.

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Por outro lado, no modelo da CCA (Figura 2) que avaliou a morfologia e as variáveis ambientais, quanto à tabela de partição, a morfologia explicou apenas 8,8% do modelo, ao passo que o ambiente teve maior importância, explicando 83,8% do modelo. Porém, quando analisados em conjunto, a morfologia e o ambiente explicaram 85,8% do modelo. No que se refere à fração individual, é assumido como verdadeiro que 77,7% do modelo foi explicado pelo ambiente, enquanto que apenas 1,8% foi explicado pela morfologia. A ANOVA desta CCA acusou que os resultados foram significativos (F= 7,2167; p=0,001), indicando que ambos os conjuntos de dados amostrados foram satisfatórios ao modelo. Neste modelo, as variáveis Bio2 (média da amplitude de temperatura diurna), Bio18 (precipitação no mês mais quente) e ndvi (cobertura vegetal= veg) foram as mais importantes para a espécie. Embora a maioria das medidas se encontrem em espaços mais neutros no gráfico, a altura da cabeça parece mostrar uma sutil associação negativa com a média da amplitude da temperatura diurna (Bio2) (Figura 2).

Figura 2. Gráfico da CCA entre a morfologia de todas as populações de Tropidurus oreadicus analisadas e as variáveis ambientais mais importantes no modelo: Bio2= média da amplitude de temperatura diurna, Bio18= precipitação no mês mais quente e veg= cobertura vegetal (ndvi). cra= comprimento rostro-ânus; ccau= comprimento da cauda; aco= altura do corpo; lca= largura da cabeça; aca= altura da cabeça; cca= comprimento da cabeça; cmant= comprimento do membro anterior; cmpost= comprimento membro posterior. 105

Quando as variáveis foram analisadas separadamente, a média da amplitude de temperatura diurna (Bio 2) foi a que mais explicou a variação no tamanho corporal de T. oreadicus em função da distribuição potencial, com uma correlação negativa e significativa (Figura 3; r²= -0,2223 t = -4,8746, df= 457, p< 0,001). O padrão mais notável desta análise foi que a maior frequência e variação no tamanho corporal ocorreram entre 105 a 140 da amplitude média de temperatura diurna (círculo tracejado, Figura 3).

Figura 3. Gráfico da correlação entre o tamanho corporal ajustado de T. oreadicus e a média da amplitude de temperatura diurna (Bio 2).

Considerando a CCA dos agrupamentos filogenéticos (clados) e suas relações com as medidas morfológicas (Figura 4), os padrões encontrados foram: a linhagem 4 mais positivamente associada com comprimento dos membros posteriores e negativamente com altura da cabeça; a linhagem 2, mais positivamente associada com comprimento rostro-anal e comprimento dos membros anteriores, e negativamente ao comprimento da cabeça; e a linhagem 5 associada positivamente ao comprimento da cauda. Os demais clados (1, 3 e 6) não apresentaram tendências a padrões morfológicos, mantendo-se em posição neutras, no gráfico. Na restrição acumulada para os valores dos vetores (eigenvalues), o eixo 1 desta CCA explicou 73,5% da variação no modelo, enquanto que o eixo 2 explicou 23% (Tabela 3).

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Figura 4. Gráfico da CCA entre as linhagens de T. oreadicus em relação às medidas morfométricas: cra= comprimento rostro-ânus; ccau= comprimento da cauda; aco= altura do corpo; lca= largura da cabeça; aca= altura da cabeça; cca= comprimento da cabeça; cmant= comprimento do membro anterior; cmpost= comprimento membro posterior.

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Tabela 3. Componentes da CCA na variação da morfologia de seis linhagens encontradas para as populações de T. oreadicus a partir dos dados de mtDNA em relação às variáveis espaciais. cra= comprimento rostro-anal; ccau= comprimento da cauda; aco= altura do corpo; lca= largura da cabeça; aca= altura da cabeça; cca= comprimento da cabeça; cmant= comprimento do membro anterior; cmpost= comprimento membro posterior.

Quando considerada a variação da forma corporal pelo fator espacial (i.e., coordenadas geográficas), o eixo 1 da CCA (latitude x longitude) forneceu 56,7% da explicação, demonstrando uma variação relevante na morfologia da espécie (Tabela 4). A latitude e longitude (lat:long) em conjunto foram positivamente associadas com o comprimento da cabeça (cca), comprimento rostro-anal (cra), a largura da cabeça (lca), e

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o comprimento do membro anterior (cmant), enquanto o comprimento da cauda (ccau) foi negativamente associado a ambas variáveis geográficas. Com relação à longitude, a altura do corpo (aco) foi associada positivamente à essa variável e enquanto que o comprimento membro posterior (cmpost) foi negativamente associado. Finalmente, o comprimento da cauda (ccau) esteve associado positivamente à latitude enquanto que o comprimento da cabeça (cca) esteve associado negativamente (Figura 5; Tabela 4).

Figura 5. Gráfico da CCA referente à variação morfológica de Tropidurus oreadicus em relação às coordenadas geográficas. As siglas são: lat= latitude; long= longitude; lat:long= latitude + longitude; cra= comprimento rostro-anal; ccau= comprimento da cauda; aco= altura do corpo; lca= largura da cabeça; aca= altura da cabeça; cca= comprimento da cabeça; cmant= comprimento do membro anterior; cmpost= comprimento membro posterior.

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Tabela 4. Componentes da CCA na variação da morfologia de Tropidurus oreadicus em relação às variáveis espaciais. lat= latitude; long= longitude; cra= comprimento rostro-ânus; ccau= comprimento da cauda; aco= altura do corpo; lca= largura da cabeça; aca= altura da cabeça; cca= comprimento da cabeça; cmant= comprimento do membro anterior; cmpost= comprimento membro posterior.

DISCUSSÃO

Nossos dados mostraram que o modelo explicou a maior parte da variação na morfologia de T. oreadicus, sugerindo mudanças sutis impulsionadas pelas diferentes pressões do ambiente ao longo do extenso espaço geográfico ocupado por suas populações (Tabela 2; Figuras 2 e 3). Assim, o gradiente ambiental parece atuar como um importante componente na estruturação espacial da variabilidade dos caracteres fenotípicos investigados. Este é um padrão já esperado para espécies de lagartos de regiões tropicais (Recoder et al., 2013), onde a alta diversidade somada a restrições históricas e heterogeneidade espacial pode interagir com o clima para moldar padrões de 110

diferenciação (Schneider et al., 1999; Moritz et al., 2000; Hill & Hill, 2001; Thorpe et al., 2010). Conforme os valores da Tabela 2 evidenciaram, as variáveis ambientais que melhor explicam a distribuição geográfica de T. oreadicus estão relacionadas à geografia (latitude e longitude), precipitação, temperatura e à cobertura vegetal. Estas variáveis também foram as mais importantes para a explicação da distribuição geográficas e padrões na forma do corpo de espécies do gênero Enyalius (Barreto-Lima, 2012). Pelo menos alguma destas três variáveis está associada diretamente com a evolução morfológica de lagartos da família Gymnophthalmidae (Rodrigues, 1991; Grizante et al., 2012) e da família Tropiduridade (Kohlsdorf et al., 2001; Grizante et al., 2010; Kohlsdorf & Navas, 2012) Esses indícios demonstram que a influência de condições ambientais na história evolutiva dos Squamata pode ser relativamente bem resgatada por estudos de variação geográfica (Mesquita & Colli, 2003). Em consonância com essa afirmação, o modelo sugere que o ambiente explica 83,8% (Figura 2) da variação morfológica de T. oreadicus, onde a ANOVA da CCA indicou a média de amplitude de temperatura diurna (Bio2), precipitação no mês mais quente (Bio18) e cobertura vegetal (ndvi) como as variáveis mais importantes para as variações morfométricas na espécie. Estas evidências refletem uma regra evolutiva já bem estabelecida para táxons com distribuição geográfica disjunta, como é o caso de T. oreadicus: o isolamento geográfico implica no impedimento ou limitação da troca de genes entre populações, o que acaba sendo um força motriz na diferenciação das características físicas que vão sendo selecionadas (e herdadas) em diferentes ambientes (Dobzhansky, 1937; Mayr, 1942; Avise, 2000). Distintos padrões encontrados nos caracteres morfológicos entre diferentes localidades podem ser características sujeitas à seleção natural e, portanto, variar geograficamente de acordo com as diferentes pressões impostas pelo ambiente ao longo do tempo evolutivo (Endler, 1986). Para a espécie Vanzosaura rubricauda, Recoder et al. (2013) encontraram que os padrões mais relacionados com a variação na forma destes lagartos estão relacionados a alongamento do corpo e comprimento dos membros posteriores e anteriores. Estas distinções morfológicas mais tarde acabaram servindo como evidências para um rearranjo taxonômico com a descrição de uma nova espécie (Recoder et al., 2014). Em suas análises, os autores demonstraram que a maior parte da explicação se deve à variação geográfica das populações analisadas, refletindo uma tendência evolutiva observada entre

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espécies da família Gymnophthalmidae (Rodrigues et al., 2005; Wiens et al., 2006; Grizante et al., 2012). De acordo com Wiens et al.(2006), a evolução de formas corporais mais alongadas acompanhadas de redução dos membros locomotores é onipresente em Squamata, um padrão associado a adaptações a hábitats crípticos ou fossoriais. Variações relacionadas a gradientes clinais de temperatura e umidade já foram observadas para espécies da família Geckonidae (Thorpe, 1991) no Cerrado. Domingos (2009) encontrou uma correlação entre as variáveis ambientais de temperatura máxima do mês mais quente e de sazonalidade térmica com caracteres de folidose em Gymnodactylus amarali. O autor sugere que as pressões seletivas devem mais intensas quando altas temperaturas estariam influenciando de maneira fundamental a sobrevivência dos indivíduos durante a transição das estações, uma vez que a capacidade de se adaptar a variações e/ou transições de temperatura teria mais influência na seleção destes organismos do que a simples adaptação a situações mais extremas de aridez. Para o Cerrado, tal vantagem adaptativa se configura como uma realidade principalmente considerando as enormes flutuações climáticas a que esta região está sujeita ao longo do ano (Eiten, 1972). Nesse contexto, é relevante ressaltar que a variável relacionada a sazonalidade de temperatura (Bio4) contribui com porcentagens de importâncias relativamente altas no modelo de distribuição das linhagens evolutivas de T. oreadicus (Tabela 2). Outro padrão demonstrado em nossos resultados é que locais com maiores amplitudes térmicas diurnas parecem se refletir em maiores variações no tamanho corporal em T. oreadicus (Figura 3). No curso de sua atividade diária, um lagarto depende de um amplo conjunto de fontes e calor do ambiente, tais como o calor da irradiação direta do sol e o calor do ar e do substrato (e.g., Heatwole & Taylor, 1987; Rocha & Bergallo, 1990; Vrcibradic & Rocha, 2002; Kiefer et al., 2005; Rocha & Van Sluys, 2008; Silva & Araújo, 2008). As espécies do gênero Tropidurus são geralmente ativas ao longo de todo o dia (Rocha & Bergallo, 1990; Van Sluys, 1992; Bergallo & Rocha, 1993; Vitt, 1995; Teixeira-Filho et al., 1996; Hatano et al., 2001) e sua atividade tende a ser mais longa do que a de outras espécies simpátricas (ver Rocha & Van Sluys, 2007) em áreas mais abertas de vegetação (Rocha et al., 2009). Em áreas restinga, por exemplo, o período de atividade de T. torquatus geralmente abrange todo o período diurno, com redução na atividade nos períodos mais quentes do dia (Araújo, 1984; Bergallo & Rocha, 1993; Hatano et al., 2001).

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De modo geral, populações de áreas florestais são termoconformistas quando comparadas com lagartos provenientes de áreas mais abertas, que tendem a termorregular mais ativamente. Indivíduos provenientes de populações distintas também podem diferir no grau de precisão da regulação de sua temperatura corpórea (Rocha et al., 2009). As temperaturas corporais preferenciais em Squamata são positivamente associadas com massa corporal e negativamente relacionada com a precipitação (Clusella-trullas et al., 2011); assim, espécies maiores em regiões com altos índices de precipitação tendem a ter maiores temperaturas em comparação às espécies menores (Grizante et al., 2012). As espécies caracterizadas por pequenas massas corporais tem menores inércias termais (Bartholomew & Tucker, 1964), e a variação na forma pode contribuir como um componente adicional a esta relação, uma vez que o alongamento do corpo afeta a dinâmica de trocas térmicas entre o organismo e seu ambiente (Grizante et al., 2012). Entretanto, o grau de termorregulação ativa pode variar dependendo das condições do ambiente (Huey & Pianka, 1983; Pianka, 1986; Kiefer et al., 2007). Para T. oreadicus em áreas da Amazônia, Rocha & Bergallo (1990) concluíram que a temperatura ambiental (ar e substrato) nos microhabitats investigados explicaram consideravelmente parte da variação na temperatura corporal, influenciando na distância de fuga que, por sua vez, pode ter valor de sobrevivência em áreas abertas com afloramentos rochosos. Devido a divergência recente (Frost et al., 2001), T. oreadicus parece compartilhar ecologias térmicas bem parecidas com T. torquatus. Kiefer et al. (2007) ao estudarem a termorregulação de diversas populações de T. torquatus encontram que a eficiência de termorregulação dos lagartos variou de acordo com as temperaturas ambientais locais às quais cada uma estava submetida. Na medida em que as temperaturas do ambiente aumentaram, os lagartos tenderam a termorregular mais ativamente, e indivíduos de populações que estiveram sujeitas a temperaturas ambientais locais mais baixas tenderam a ser termorreguladores mais passivos (Kiefer et al., 2007). Em outro estudo, foi demonstrado que as populações de T. torquatus, apesar de serem influenciadas pelas temperaturas ambientais locais, permanecem dentro de uma determinada faixa, uma característica que parece ter sido determinada ao longo da história evolutiva da espécie (Kiefer et al., 2005). Por outro lado, Barreto-Lima (2012) encontrou correlação inversa para espécies do gênero Enyalius, visto que as maiores variações no tamanho corporal estava associado com os menores índices de precipitação do trimestre mais frio (Bio19), demonstrando que

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tamanhos corporais nesses lagartos brasileiros podem ser decorrentes de pressões de variáveis ambientais distintas. Para lagartos de outras famílias, a precipitação teve fundamental importância na variações morfométricas resultaram em similaridades morfológicas entre populações de Vanzosaura rubricauda da Caatinga e Chaco (Recoder et al., 2013), que compartilham um clima semi-árido em comparação às condições mais mésicas do Cerrado (Nimer, 1989). Em relação à correlação entre variáveis ecológicas de acordo com a estrutura filogenética das populações (Figura 6), é possível inferir que há correspondência entre espaço (latitude e longitude), fatores ambientais e as seis grandes linhagens mitocondriais encontradas para T. oreadicus. A Figura 4 mostra que a primeira função discriminante da CCA, que contribuiu com 73,5% da variação total (Tabela 3), associa negativamente a linhagem 4 com comprimento da cabeça, comprimento dos membros posteriores e largura da cabeça. Por outro lado, a linhagem 2 se associa positivamente com comprimento rostro-anal, comprimento do membro anterior, altura da cabeça e altura do corpo. Ou seja, parece haver uma tendência para que os indívíduos em enclaves de savana na região do estado de Rondônia terem cabeças menores, o que pode, por exemplo, estar influenciar em sua dieta, conforme já observado para outras espécies de lagartos (e.g., . Herell et al., 2001; Verwaijen et al., 2002). Já nas localidades nas quais habitam as populações da linhagem 2 (Caseara, Palmas, Taquaruçu, Mateiros e Natividade, no estado do Tocantins), mesmo em um nível intraespecífico sutil, parecem abrigar indivíduos com corpos e membros anteriores mais longos. Cabe aqui ressaltar a localidade de Mateiros-TO, que se situa na Serra Geral (Jalapão), que é uma importante área de endemismo que abriga uma fauna rica de lagartos (Nogueira et al., 2011). Esta é considerada uma região com uma história geomorfológica complexa relacionada a formações antigas erodidas do platô da Serra Geral, o que parece ter favorecido a presença e diversificação de muitas espécies (Rodrigues et et al., 2008; Colli et al., 2009; Recoder et al., 2013). Recoder et al. (2014) sugerem que as diferenças morfológicas encontradas na espécie recentemente descrita (i.e., Vanzosaura savanicola, Recoder et al., 2014; Cnemidophorus mumbuca, Colli et al., 2009) muito provavelmente foram adaptações moldadas por fatores ecológicos dessa região do Cerrado. Na família destes lagartos (i.e., Gymnophthalmidae) é bem sabido que mudanças no comprimento do corpo e dos membro locomotoress são características que tem sido associada a adaptações a hábitos comportamentais; aquelas com hábitos crípticos ou fossoriais, por

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exemplo, tem corpos mais alongados acompanhado de redução dos membros (Wiens et al., 2006; Recoder et al., 2013).

Variações em proporções corporais já foram registradas para o gênero Tropidurus. Vargens et al. (2008), por exemplo, ao estudarem o tamanho corpóreo médio de T. hygomi demonstraram que os menores lagartos registrados foram populações de áreas de restinga. Provavelmente os menores tamanhos corpóreos encontrados para estas sejam um reflexo das estratégias reprodutivas, onde os indivíduos tornam-se maduros no primeiro ano de vida (Vanzolini & Gomes, 1979). Por outro lado, T. plica, ocorrente em áreas amazônicas, é maior que os outros tropidurídeos, e tem corpo mais achatado em comparação com seus congenéricos; tais mudanças presumivelmente acompanham as divergências ecológicas (Vitt, 1991) de uma espécie arborícola com necessidades morfológicas e de uso de hábitats diferentes de uma terrícola. Embora nosso enfoque não tenha sido a investigação do uso de substrato, as diferenças morfométricas que identificamos para T. oreadicus parecem estar de acordo com padrões gerais já registrados para o gênero. Kohlsdorf et al. (2001) sugerem que algumas mudanças evolutivas em proporções e tamanhos corporais dos tropidurídeos estão ligadas a

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divergências no uso de hábitat e/ou substrato, onde a especialização morfométrica foi detectada quando substratos típicos foram considerados para locomoção. Para espécies do gênero Tropidurus, análises filogenéticas de covariância sugerem que as espécies que habitam solos arenosos têm pés relativamente maiores do que outras espécies, e que elas se agrupam dentro do mesmo subclado dentro da filogenia do gênero Tropidurus. As análises indicam que as mudanças no comprimento de caudas e membros parece ter ocorrido relativamente rápido desde que divergiram de um clado vizinho, em consonância com as interpretações lógicas de que essas divergências são adaptações ao estilo de vida daquele clado (Kohlsdorf et al., 2001). A longo prazo, a capacidade locomotora de uma espécie pode até mesmo influenciar sua distribuição geográfica por meio de eventos de dispersão (Pounds, 1991). A incorporação de alguma variável ambiental relacionada com a composição de solos pode oferecer futuras informações sobre a influência do substrato nos aspectos morfométricos relacionados à locomoção de lagartos em diferentes regiões geográficas, ampliando o quadro para o testes de hipóteses que investiguem, por exemplo, se diferenças ou semelhanças morfológicas são mais relacionadas aos ambientes ou à filogenia da espécie. Os padrões ilustrados na Figura 4 e na Tabela 2 indicam que as diferentes linhagens parecem responder de forma diferente às variáveis que melhor explicam sua forma e sua distribuição espacial. De maneira geral, sabe-se que a extensa distribuição geográfica, a grande variabilidade de condições ambientais às quais as populações estão expostas, o tempo de isolamento e a alta diversidade genética são fatores que podem contribuir nas adaptações encontradas entre populações de uma espécie (Sites & Marshall, 2003). Em escalas taxonômicas maiores, é sabido (e mais documentado) que os diferentes hábitats e suas condições climáticas distintas podem influenciar a história de vida de organismos e suas respostas ecológicas em função da distribuição geográfica (Pincheira-Donoso et al., 2007, 2008; Barreto-Lima, 2012). Como os resultados também indicaram, parte da variação da forma de T. oreadicus é associada às variáveis média da amplitude de temperatura diurna; precipitação no mês mais quente; cobertura vegetal (ndvi), demonstrando já é possível identificar alguns padrões evolutivos moldados pela ecologia, mesmo intraespecificamente (Figuras 2 e 3). Variações congruentes entre caracteres morfológico e moleculares encontradas em diversas espécies de lagartos (e.g., Anolis, Malhotra & Thorpe, 1994; Gymnodactylus, Pellegrino et al., 2005) indicam que a morfologia pode estar sofrendo seleção de acordo

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com variações ambientais, corroborada pelo fato das populações se tratarem de linhagens distintas sujeitas a diferentes pressões, assim demonstrando a enorme importância desses componentes ambientais na evolução das populações naturais de lagartos (Domingos, 2009). Dados de escamação/folidose para todos os indivíduos analisados no presente capítulo aguardam análises em tempo hábil para somar informações e potencialmente corroborar alguns padrões levantados até o momento. Os nossos resultados sugerem que os processos envolvidos na diferenciação da espécie são complexos e envolvem tanto fatores históricos (filogenia) quanto os ecológicos (variáveis ambientais e espaciais). A temperatura, precipitação e a cobertura vegetal foram as variáveis mais determinantes no padrão da variação corporal identificado para as populações de T. oreadicus analisadas, com correspondências sutis entre o efeito de diferentes variáveis ambientais na diversificação morfológica das linhagens evolutivas resgatada dos dados moleculares. Assim, ambas as hipóteses testadas aqui parecem ser corroboradas, pois a variação geográfica na morfologia de T. oreadicus se mostrou relacionada tanto às relações de parentesco quanto às variações ambientais refletidas ao longo da distribuição geográfica das populações. Dada a importância e relevância em se considerar a variação morfológica no contexto espacial, essas informações focadas na variação fenotípica intraespecífica pode agregar conhecimento para revelar padrões gerais na diversificação da herpetofauna do Cerrado.

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APÊNDICE Tropidurus oreadicus (N= 459) - DISTRITO FEDERAL, Brasília (13): CHUNB 6153, 52399, 6497, 1293, 1295, 1298, 8905, 6151, 1297, 6154, 1296, 6884, 6496; -GOIÁS, Alvorada do Norte (23): CHUNB 33332, 33341, 33345, 33347, 33348, 33350, 33360, 33389, 33370, 33371, 33372, 33374, 33387, 33398, 37599, 37602, 37603, 37607, 37605, 37614, 37616, 37619, 37606; Alto Paraíso de Goiás (21): CHUNB 43643, 43642, 43644, 59059, 58280, 58282, 58444, 6419, 6418, 5978, 5984, 43644, 59059, 5971, 5976, 43642, 5979, 43643, 5985, 5972, 6415; Cavalcante (6): 58286, 58289, 58284, 58287, 58283, 58288; Minaçu (19): CHUNB 6589, 6583, 6686, 6579, 6578, 6570, 6700, 6689, 6572, 6688, 6568, 6695, 6683, 6581, 6681, 6576, 6565, 6687, 6564; Pirenópolis (18): CHUNB 67400, 67401, 67402, 67403, 67404, 67405, 67442, 6303, 6309, 6332, 6345, 6294, 6342, 6299, 6291, 6343, 6319, 9496; Piranhas (8): CHUNB 74245, 74246, 74247, 74248, 74249, 7425, 74251, 74252; São Domingos (17): CHUNB 25327, 25324, 25329, 25328, 25325, 35364, 35360, 35357, 35358, 43834, 35361, 43833, 35359, 43836, 43835, 35363, 35362; - BAHIA, Barreiras (3): CHUNB 74323, 74324, 74325; Cocos (24): CHUNB 51210, 51222, 51215, 51229, 51221, 51213, 6105, 51210, 51226, 6097, 6100, 51214, 51230, 51217, 51236, 51240, 51234, 51220, 5506, 5502, 49160, 5503, 6102, 6095; Ibotirama (8): CHUNB 74326, 74327, 74328, 74329, 7433, 74331, 74332, 74333; Muquém de São Francisco (4): CHUNB 74178, 74.334, 74335, 74336; São Desidério (6): CHUNB 62973, 62974, 62972, 62976, 62975, 62971; Santa Maria da Vitória (2): CHUNB 74337, 74338; - MARANHÃO, Carolina (28): CHUNB 52022, 52023, 52024, 52025, 52026, 52027, 52028, 52029, 52031, 52032, 52033, 52034, 52035, 52036, 52037, 52038, 52051, 52044, 52046, 52038, 52036, 52047, 52028, 52023, 52031, 52035, 52033, 52029; - MATO GROSSO, Barra do Bugres (1): CHUNB 74238; Barra do Garças (9): CHUNB 74243, 74244, 55918, 55913, 55917, 55917, 55918, 55913, 55923; Cáceres (9): 74229, 74230, 74231, 74232, 74233, 74234, 74235, 74236, 74237; Nova Xavantina (25): CHUNB 63794, 63795, 63796, 63797, 63798, 63799, 63801, 63802, 63804, 63805, 63806, 63807, 63808, 63810, 63815, 63816, 63817, 63818, 63819, 63820, 63821, 63822, 63823, 63824, 63828; Santo Antônio do Leverger (4): CHUNB 74239, 74240, 74241, 74242 - TOCANTINS, Brejinho do Nazaré (7): CHUNB 74308, 74309, 7431, 74311, 74312, 74313, 74314; Caseara (13): 5186, 5187, 5188, 5190, 45189, 45191, 45192, 45193, 45194, 45198, 45197, 45196, 45195; Colinas do Tocantins (4): 57012, 57011, 57015, 57013; Mateiros (20): CHUNB 28592, 28602, 28603, 28604, 28608, 28610, 28626, 28636, 28750, 28638, 28642, 28672, 28683, 28711, 28720, 28721, 28732, 28746, 28748, 28752; Natividade (11): CHUNB 74268, 74269, 74270, 74271, 74272, 74273, 74274,

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74275, 74276, 74277, 74278; Palmas (19): CHUNB 1305, 11308, 11344, 11346, 11341, 11304, 11343, 11348, 12257, 12247, 12244, 12228, 12221, 12223, 12237, 12232, 12233, 12248, 12242; Paranã (11): CHUNB 37563, 37564, 37567, 37569, 37570, 37575, 37577, 37580, 37591, 37593, 37594; Peixe: CHUNB 74279, 74280, 74282, 74283, 74281, 74284, 74285, 74286, 74287, 74288, 74289, 7429, 74291, 74292, 74293, 74294, 74295, 74296; Taquaruçu (8): CHUNB 74315, 74316, 74317, 74318, 74319, 74320, 74321, 74322. - MINAS GERAIS, Buritizeiro (10): CHUNB 44516, 44517, 44518, 44519, 44520, 44516, 44517, 44518, 44519, 44520; - AMAPÁ, Macapá (24): CHUNB 6456, 6484, 6448, 6459, 6447, 6472, 6470, 6462, 6457, 6454, 6451, 6464, 6486, 6491, 6485, 6460, 6465, 6468, 6475, 6467, 6481, 6469, 6478, 6482; - PARÁ, Parauapebas (27): CHUNB 6398, 6383, 6417, 6397, 6370, 6380, 6400, 6384, 6399, 6387, 6416, 6407, 6395, 6394, 6396, 6414, 6391, 6375, 6410, 6403, 6404, 6408, 6405, 6516, 6519, 6513, 6514; Serra das Andorinhas (9) MPEG 31180, 31195, 31176, 31190, 31189, 31186, 31173, 31183, 31175 - RONDÔNIA, Guajará-Mirim (23): CHUNB 22278, 22261, 22373, 22265, 22277, 22363, 22280, 22347, 22410, 22270, 22384, 22351, 22375, 22269, 22341, 22450, 22419, 22366, 22367, 22378, 22346, 22353, 22361; Porto Velho (10): INPA-H 33018, 32949, 32946, 33027, 33015, 33014, 33023, 33016, 33017, 32944.

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