Universidad Central Del Ecuador

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

Actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán).

Proyecto de Investigación presentado como requisito previo a la obtención del título de:

QUÍMICA FARMACÉUTICA

AUTOR: Verónica Elizabeth Tovar Caisapanta

TUTOR: PhD. María Gabriela Leal Reverol

Quito, Abril 2018

Dedicatoria

Dedicado a mi Madre por ser mi soporte y mi inspiración en cada paso que doy en mi vida, por su apoyo incondicional y por haberme enseñado que no hay obstáculo que impida alcanzar las metas propuestas.

Agradecimiento

Quiero agradecer primeramente a Dios por sus bendiciones y por haberme dado la fuerza necesaria de llegar hasta aquí, a mi Madre que siempre ha sido y será mi más grande admiración, el motivo de ser mejor cada día, por estar conmigo en cada paso que doy y por la confianza depositada en mí.

A toda mi familia, mis abuelitos, mis tías, mis primas, en especial a mi Tía Graciela que ha sido un gran apoyo durante todo el transcurso de mi vida, y a mi hermano Jorge que ha estado en cada situación difícil.

A Mauro por haber llegado a mi vida en el momento indicado, por ser mi amigo, mi compañero y por ser esa personita que ha estado brindándome su apoyo y recordándome lo lejos que puedo llegar, por los lindos momentos compartidos durante esta etapa.

A mi tutora Dra. Gabriela Leal por haberme permitido llevar a cabo este trabajo de investigación y por el apoyo brindado para su realización. A mis maestros que nos han sabido guiar durante toda nuestra formación profesional, a mis tribunales el MSc. Trosky Yánez y sobre todo a la Dra. Dayana Borja por todo el apoyo brindado durante esta etapa.

A mis amig@s con los que compartí mi vida estudiantil, por haberme brindado siempre su apoyo, en los buenos y malos momentos en especial a Jenny y Evelyn que han formado parte de toda esta trayectoria.

Y finalmente a la Universidad Central del Ecuador, principalmente a la Facultad de Ciencias Químicas que ha sido como mi segundo hogar.

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LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN

La investigación se llevó a cabo en las instalaciones de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, en los laboratorios de éste establecimiento como son: los laboratorios de Productos naturales, Microbiología y Química Analítica y además en los laboratorios de Investigación de la Facultad de Ingeniería Química de esta Universidad.

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Índice de contenidos

Introducción ...... 1 Capítulo I ...... 3 1. El problema ...... 3 1.1. Planteamiento del problema ...... 3 1.2. Formulación del problema ...... 4 1.2.1. Preguntas de investigación ...... 4 1.3. Objetivos de la investigación ...... 5 1.3.1. Objetivo general...... 5 1.3.2. Objetivos específicos...... 5 1.4. Importancia y justificación de la investigación ...... 5 Capítulo II ...... 8 2. Marco teórico ...... 8 2.1. Antecedentes ...... 8 2.2. Fundamento teórico ...... 10 2.2.1. Farmacognosia ...... 10 2.2.2. Producto natural ...... 10 2.2.3. Metabolitos primarios y secundarios ...... 11 2.2.4. Aceites esenciales ...... 12 2.2.4.1. Distribución de aceites esenciales ...... 13 2.2.4.2. Composición química de los aceites esenciales ...... 14 2.2.4.3. Rendimiento de aceites esenciales ...... 14 2.2.4.4. Propiedades Organolépticas de los aceites esenciales...... 15 2.2.4.5. Propiedades físicas de los aceites esenciales...... 15 2.2.5. Métodos de extracción de aceites esenciales...... 16 2.2.5.1. Destilación con agua o Hidrodestilación...... 16 2.2.5.2. Extracción por fluidos supercríticos ...... 18 2.2.6. Propiedades Fitoterapéuticas de los aceites esenciales...... 19 2.2.6.1. Actividad antibacteriana ...... 20 2.2.6.2. Actividad antioxidante ...... 24 2.2.7. Caracterización de aceites esenciales...... 27 2.2.7.1. Tipos de análisis de aceites esenciales...... 28 2.2.8. Descripción botánica de Handroanthus chrysanthus (Guayacán)...... 29 2.3. Fundamento legal ...... 31 2.4. Hipótesis ...... 32 2.4.1. Hipótesis alternativa. (Hi) ...... 32 viii

2.4.2. Hipótesis Nula. (Ho) ...... 32 2.5. Sistema de variables ...... 32 2.5.1. Etapa 1: Extracción del aceite ...... 32 2.5.1.1. Variable dependiente: ...... 33 2.5.1.2. Variable independiente ...... 33 2.5.2. Etapa 2: Caracterización del aceite ...... 33 2.5.3. Etapa 3: Evaluación de actividad antibacteriana ...... 33 2.5.3.1. Variable dependiente: ...... 33 2.5.3.2. Variable independiente: ...... 33 2.5.3. Etapa 4: Evaluación de actividad antioxidante ...... 33 2.5.4.1. Variable dependiente ...... 33 2.5.4.2. Variable independiente ...... 33 Capítulo III: ...... 34 3. Marco metodológico ...... 34 3.1. Diseño de la Investigación ...... 34 3.2. Población ...... 34 3.3. Muestra o materia prima ...... 35 3.4. Métodos ...... 35 3.4.1. Reactivos, materiales y equipos ...... 35 3.4.2. Desarrollo experimental ...... 38 3.4.3. Parte procedimental ...... 39 3.4.3.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial...... 39 3.4.3.2. Etapa II: Caracterización del aceite...... 43 3.4.3.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana ...... 44 3.4.3.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite esencial48 3.5. Diseño experimental ...... 50 3.5.1. Etapa I: Extracción del aceite ...... 50 3.5.1.1. Operacionalización de las Variables Etapa I...... 51 3.5.1.2. Factores y dominio experimental de la etapa I...... 51 3.5.1.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados ...... 52 3.5.2. Etapa II: Caracterización del aceite...... 52 3.5.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial. ... 53 3.5.3.1. Operacionalización de las Variables Etapa III...... 53 3.5.3.2. Factores y dominio experimental de la etapa III...... 53 3.5.3.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados ...... 54 3.5.4. Etapa IV: Evaluación actividad antioxidante del aceite ...... 56 3.5.4.1. Operacionalización de las Variables Etapa IV ...... 56 3.5.4.2. Factores y dominio experimental de la etapa IV...... 57 3.5.4.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados ...... 58 3.6. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos (IRD)...... 58

Capítulo IV ...... 59 4. Análisis y discusión de resultados ...... 59 4.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial ...... 59 4.1.1. Control de calidad de la materia prima ...... 59 4.1.2. Extracción por Hidrodestilación ...... 60 4.1.3. Extracción con Fluidos supercríticos ...... 62 4.2. Etapa II: Caracterización del aceite esencial ...... 64 4.2.1. Porcentaje de rendimiento ...... 64 4.2.2. Características organolépticas ...... 65 4.2.3. Características físico-químicas ...... 66 Índice de refracción ...... 66 4.3.2.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas ...... 66 4.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite ...... 73 4.3.1. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por Hidrodestilación ...... 74 4.3.2. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por fluidos supercríticos ...... 75 Análisis estadístico de actividad antibacteriana...... 76 4.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite...... 80 4.4.1. Evaluación del porcentaje de inhibición en el estándar de referencia Trolox. 80 Condiciones espectrofotométricas ...... 80 4.4.2. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido por Hidrodestilación ...... 83 4.4.3. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido con Fluidos supercríticos ...... 85 4.4.4. Comparación del estándar de referencia Trolox y los aceites...... 87 4.4.5. Análisis estadístico de la actividad antioxidante ...... 89 Capítulo V ...... 92 5. Conclusiones y Recomendaciones ...... 92 5.1. Conclusiones ...... 92 5.2. Recomendaciones ...... 93 6. Referencias ...... 94 7. Anexos ...... 101

Índice de anexos

Anexo A: Árbol de problemas ...... 101 Anexo B: Diagrama de flujo para la metodología realizada ...... 102 Anexo C: Categorización de variables ...... 104 Anexo D: Matriz de Operacionalización de Variables ...... 105 Anexo E: Instrumento de recolección de datos ...... 107 Anexo F: Autorización de propiedad de la muestra ...... 109 Anexo G: Certificación de la muestra ...... 110 Anexo H: Perfiles cromatograficos de las muestras de aceite ...... 111 Anexo I: Certificados de los reactivos utilizados...... 113 Anexo J: Figuras de la experimentación por etapas ...... 114

Índice de ecuaciones

Ecuación 2.1: Cálculo del porcentaje de inhibición ...... 27 Ecuación 3.1: Cálculo del porcentaje de rendimiento ...... 43

Índice de figuras

Figura 2.1: Elementos básicos del metabolismo primario y secundario...... 11 Figura 2.2: Aceites esenciales...... 12 Figura 2.3: Equipo de clevenger empleado para la determinación del contenido de aceite esencial...... 17 Figura 2.4: Diagrama esquemático del sistema de extracción de fluido supercrítico. (1) bomba de CO2, (2) bomba modificadora, (3) celda de extracción, (4) celda de fraccionamiento I, (5) celda de fraccionamiento II, (6) válvula...... 18 Figura 2.5: Perforación de agar...... 20 Figura 2.6: Placa para microdilución ...... 21 Figura 2.7: Staphylococcus aureus ...... 22 Figura 2.8: Pseudomonas aeruginosa ...... 23 Figura 2.9: Estructura química de la Ceftriaxona ...... 23 Figura 2.10: Vitamina E y su análogo Trolox...... 26 Figura 2.11: Reacción del 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)...... 26

Figura 2.12: Equipo Cromatografía de gases acoplado a Espectrometría de masas...... 29 Figura 2.13: Handroanthus chrysanthus ...... 31 Figura 3.1: Muestras de la especie Handroanthus chrysanthus ...... 39 Figura 3.2: Obtención de aserrín mediante máquina de aserradero ...... 39 Figura 3.3: Secado y licuado de la muestra ...... 40 Figura 3.4: Tamizaje de la muestra y pesaje de las fracciones ...... 41 Figura 3.5: Proceso de extracción por Hidrodestilación...... 41 Figura 3.6: Equipo de extracción con fluidos supercríticos ...... 42 Figura 3.7: Frascos preparados para Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas...... 44 Figura 3.8: Diluciones seriadas en la placa de microtitulación ...... 45 Figura 3.9: Concentraciones de los aceites ...... 45 Figura 3.10: Preparación del medio Mueller hinton ...... 46 Figura 7.1: Aceites extraídos por los dos métodos ...... 114 Figura 7.2: Equipo de CG-EM ...... 114 Figura 7.3: Solubilidad del aceite obtenido por fluído y Microdilución en placa ...... 114 Figura 7.4: Halos de inhibición medidos frente a S. aureus y P. aeruginosa...... 115 Figura 7.5: Preparación de diluciones del estándar y aceites ...... 115 Figura 7.6: Agitación de los tubos y lectura de las absorbancias ...... 115

Índice de tablas

Tabla 2-1: Partes de la planta utilizadas para extraer aceite esencial...... 13 Tabla 2-2: Rendimientos según el estado de la planta...... 15 Tabla 2-3: Métodos de extracción de aceite esencial...... 16 Tabla 2-4: Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, ceftriaxona ...... 24 Tabla 2-5: Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas bacterianas ...... 24 Tabla 2-6: Parámetros de caracterización de aceites esenciales...... 27 Tabla 2-7: Jerarquía taxonómica ...... 29 Tabla 3-1: Reactivos ...... 35 Tabla 3-2: Materiales ...... 36 Tabla 3-3: Equipos ...... 37 Tabla 3-4: Parámetros de control de calidad de la materia prima de corteza de canela. 40 Tabla 3-5: Volúmenes para la curva de calibración con trolox ...... 49 Tabla 3-6: Volúmenes de las muestras de aceite...... 49 Tabla 3-7 : Operacionalización de Variables Etapa I...... 51 Tabla 3-8: Factores y Niveles Experimentales de la etapa 1...... 51 Tabla 3-9: Tabla para recolección de datos de la etapa I...... 52 Tabla 3-10 : Operacionalización de Variables Etapa III...... 53

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Tabla 3-11: Factores y Niveles Experimentales de la etapa III...... 54 Tabla 3-12: Tabla ANOVA para el modelo bifactorial con replicación...... 55 Tabla 3-13: Operacionalización de Variables Etapa IV...... 56 Tabla 3-14. Factores y Niveles Experimentales de la etapa IV ...... 57 Tabla 3-15: Tabla para recolección de datos de la etapa IV...... 57 Tabla 3-16: Modelo univariante ...... 58 Tabla 4-1: Parámetros de control de calidad de la materia prima del tronco y corteza de Handroanthus crysanthus ...... 59 Tabla 4-2: Miligramos de aceite esencial extraído por Hidrodestilación ...... 61 Tabla 4-3: Miligramos de aceite esencial extraído con fluidos supercríticos...... 62 Tabla 4-4: Porcentaje de rendimiento de las muestras de aceite esencial ...... 64 Tabla 4-5: Características organolépticas del aceite esencial extraído por hidrodestilación...... 65 Tabla 4-6: Características organolépticas del aceite esencial extraído por fluidos supercríticos ...... 65 Tabla 4-7: Determinación del índice de refracción ...... 66 Tabla 4-8: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por hidrodestilación ...... 67 Tabla 4-9: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por fluidos supercríticos ...... 70 Tabla 4-10: Concentración mínima inhibitoria de los aceites esenciales ...... 73 Tabla 4-11: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido por Hidrodestilación ...... 74 Tabla 4-12: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido con Fluidos supercríticos 75 Tabla 4-13: Esquema de diseño experimental para comparación de factores ...... 76 Tabla 4-14: Análisis de varianza de dos factores ...... 77 Tabla 4-15: Datos de la curva de calibración con Trolox...... 81 Tabla 4-16: Resultados del % de inhibición con el trolox ...... 82 Tabla 4-17: Resultados de absorbancias del aceite obtenido por hidrodestilación ...... 83 Tabla 4-18: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido por Hidrodestilación ...... 84 Tabla 4-19: Resultados de absorbancias del aceite obtenido con fluidos supercríticos . 85 Tabla 4-20: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido con fluidos supercríticos ...... 86 Tabla 4-21: Comparación de concentraciones ...... 87 Tabla 4-22: Comparación de porcentajes de inhibición de los aceites y el estándar ..... 88 Tabla 4-23: Datos del porcentaje de inhibición de las fuentes de actividad antioxidante ...... 89 Tabla 4-24: Análisis univariante...... 89

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Índice de gráficos

Gráfico 4.1: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial extraído por hidrodestilación con los dos tamaños de partícula...... 62 Gráfico 4.2: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial extraído con fluidos supercríticos con los dos tamaños de partícula...... 63 Gráfico 4.3: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y las cepas bacterianas ...... 78 Gráfico 4.4: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y las concentraciones ...... 78 Gráfico 4.5: Gráfico de perfil entre el halo de inhibición frente a la cepa y la concentración ...... 79 Gráfico 4.6: Longitud de onda máxima para el estándar trolox ...... 80 Gráfico 4.7: Curva de calibración del estándar trolox ...... 81 Gráfico 4.8: Porcentaje de inhibición vs Volumen del trolox uL ...... 82 Gráfico 4.9: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL...... 84 Gráfico 4.10: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL ...... 86 Gráfico 4.11: Comparación entre el estándar trolox y los aceites obtenidos ...... 88 Gráfico 4.13: Gráfico de perfil de medias marginales de los porcentajes de inhibición frente a los aceites y el estándar ...... 90 Gráfico 4.14: Diagrama de barras de error del porcentaje de inhibición frente a los aceites y el estándar de referencia...... 91 Gráfico 7.1: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por hidrodestilación ...... 111 Gráfico 7.2: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por hidrodestilación ...... 111 Gráfico 7.3: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por fluidos supercríticos ...... 112 Gráfico 7.4: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por fluidos supercríticos ...... 112 Gráfico 7.5: Certificado del reactivo estándar Trolox...... 113 Gráfico 7.6: Certificado del reactivo DPPH ...... 113

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

Tema: Actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán).

AUTOR: Verónica Elizabeth Tovar Caisapanta ([email protected])

TUTOR: PhD. Maria Gabriela Leal

([email protected])

Resumen

El presente proyecto de investigación tuvo como propósito la evaluación de las actividades antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus, el cual se realizó en cuatro etapas, en la primera etapa se obtuvo el aceite esencial mediante extracción sólido-líquido por hidrodestilación y extracción con fluidos supercríticos, en la segunda etapa se realizó la caracterización del aceite mediante características organolépticas y ensayos físico-químicos, en la tercera etapa se realizaron pruebas de solubilidad y con el mejor solvente se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar por perforación frente a cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), y en la cuarta etapa se evaluó la actividad antioxidante mediante el método del radical DPPH, al culminar con la investigación se concluye que el aceite obtenido por fluidos supercríticos tuvo mejor rendimiento de extracción (88,1 ± 7,8 mg por cada 100 g de muestra), así como también en su composición contiene esteroles como el stigmasterol, además presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus (ATCC 25923) a una concentración de 50mg/ml, por otra parte, los aceites esenciales extraídos por ambos métodos no presentaron actividad antioxidante representativa.

Palabras clave: ACEITE ESENCIAL, Handroanthus chrysanthus, ACTIVIDAD, ANTIBACTERIANA, ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE.

Antibacterial and antioxidant activity of the essential oil extracted from the trunk and bark of the species Handroanthus chrysanthus (Guayacan).

Abstract

The purpose of this research project was to evaluate the antibacterial and antioxidant activities of the essential oil extracted from the trunk and bark of the species Handroanthus chrysanthus. This research was carried out in four stages. In the first stage, the essential oil was obtained by a solid -liquid extraction using hydrodistillation and extraction with supercritical fluids. In the second stage, the characterization of the oil was executed through a process of organoleptic characteristics and physical-chemical tests. In the third stage, solubility tests were made, and antibacterial activity was evaluated with the best solvent through the method of diffusion in agar by perforation against strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Finally, the antioxidant activity was evaluated by the DPPH radical method. To conclude, this investigation determines that the oil obtained by supercritical fluids had a better extraction performance (88.1 ± 7,8 mg per 100 g of sample), in the composition of oil presents sterols as stigmasterol, the oil presents antibacterial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 25923) at a concentration of 50mg / ml, on the other hand, the essential oils extracted by both methods did not show representative antioxidant activity.

Key words: ESSENTIAL OIL, Handroanthus chrysanthus, ACTIVITY ANTIBACTERIAL, ACTIVITY ANTIOXIDANT.

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Introducción

En la presente investigación se evaluaron las actividades antibacteriana y antioxidante en el aceite esencial que fue extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán) mediante la extracción por hidrodestilación y por fluidos supercríticos.

Con el pasar de los años la necesidad del hombre por curar enfermedades ha permitido que se continúe haciendo uso de la medicina ancestral por su poder curativo, en la actualidad se reconocen innumerables especies de plantas con fuentes de compuestos biológicamente activos, entre ellos los aceites esenciales que por su constitución de componentes químicos pueden brindar un aporte al desarrollo de la salud, ya que encontrar fuentes naturales con posible actividad antibacteriana y antioxidante es uno de los objetivos primordiales en investigaciones relacionadas, debido a la alta resistencia a los antibacterianos y procesos oxidativos que afectan a la salud.

El primer capítulo describe el problema del proyecto de investigación, en el cual se establece la importancia de las actividades antibacteriana y antioxidante en aceites esenciales, su composición y el uso de la medicina ancestral a través de los años. Se detallan los factores importantes que influyen en la calidad del aceite esencial como es la identificación correcta de la especie. Una vez formulado el problema y establecidos los objetivos, se indica la justificación e importancia del proyecto, esto con el fin de establecer si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus presenta actividad antibacteriana y antioxidante.

En el segundo capítulo se detallan las referencias bibliográficas en las cuales se basa el fundamento teórico que permitió la aplicación del tema de investigación. Se detallan la Farmacognosia, características químicas y físicas de los aceites esenciales, así como también los métodos de extracción más usados y las técnicas de evaluación de actividades antibacteriana y antioxidante.

En el tercer capítulo se planteó el diseño y la metodología de la investigación, con lo cual se estableció el enfoque, el tipo y nivel. Se fijó la muestra, los materiales y los equipos con los cuales se trabajó durante toda la investigación. Se desarrolló el diseño experimental, la matriz de operacionalización de variables y el instrumento de recolección de datos.

En el cuarto capítulo se analizó cuidadosamente todos los resultados obtenidos en las diferentes etapas de investigación mediante cálculos, tablas y gráficos que permitan una adecuada interpretación de los datos obtenidos durante toda la investigación.

En el quinto capítulo se establecen las conclusiones obtenidas con el desarrollo experimental realizado, en el cual se específica que el aceite esencial obtenido por fluidos supercríticos presenta actividad antibacteriana, así también se resumen los principales resultados obtenidos en base a los objetivos y se plantean las respectivas recomendaciones.

Capítulo I

1. El problema

1.1. Planteamiento del problema

El uso de la medicina ancestral durante años ha sido una alternativa para el tratamiento de diversas molestias y terapias, su popularidad se mantiene debido a razones históricas y culturales. Actualmente se reconocen innumerables especies de plantas con fuentes de compuestos biológicamente activos, incrementando el interés científico de obtener información acerca de propiedades fitoterapéuticas tales como: las actividades antibacteriana y antioxidante.

Debido a que surge la resistencia a los antimicrobianos se considera una problemática de interés en temas de salud pública a nivel mundial, en consecuencia, es de gran importancia y reto de mayor índole la búsqueda de compuestos con actividad antibacteriana, por lo cual se plantea el estudio de especies pertenecientes a la biodiversidad ecuatoriana con potencial para el aislamiento de posibles antibióticos. Diversos estudios realizados hasta la fecha como el reportado por Franco y colaboradores (2013) indican que los extractos etanólicos obtenidos de dos especies del género Tabebuia presentan actividad antiinflamatoria, antioxidante y antibacteriano, de ahí la alternativa terapéutica del estudio en plantas pertenecientes a la familia Bignoniaceae. (Franco L, Castro J, Ocampo Y, Pájaro I y Díaz F, 2013)

La especie Tabebuia chrysantha, actualmente denominada Handroanthus chrysanthus, ampliamente diseminada en las regiones sub-tropicales del país, representa una buena alternativa ya que ha sido poco estudiada tanto desde el punto de vista de sus constituyentes como de sus actividades biológicas, el tronco y corteza por presentar propiedades aromáticas.

Por otro lado, la oxidación celular y el estrés oxidativo están directamente relacionados con la génesis de gran cantidad de patologías como aquellas provocadas por 3 el envejecimiento celular, daños genéticos que producen mutaciones y aceleran algunos procesos de cáncer y la diabetes; daños cerebrales como la demencia senil, enfermedad de Parkinson y Alzheimer, desarreglos inmunológicos y enfermedades autoinmunes. Por lo que encontrar fuentes que contengan actividad antioxidante ayudaría a prevenir dichas patologías debido a que pueden reaccionar con especies reactivas de oxígeno impidiendo el daño oxidativo a componentes vitales tales como ADN o membranas de la célula. (Hernandez, 2007)

Los aceites esenciales por su mezcla compleja de componentes como terpenos, principalmente monoterpenos y sesquiterpenos, los fenilpropanoides y compuestos alifáticos de cadena corta es que pueden cumplir diversas funciones en propiedades terapéuticas (Cañigueral S y Vila R, 2007), sin embargo contienen principios volátiles que pueden ser alterados durante su procesamiento por lo que la elección del método adecuado para su extracción y el tratamiento inicial de la muestra es fundamental.

El estudio de la especie Handroanthus chrysanthus como fuente de aceite esencial con posibles propiedades terapéuticas abre camino al desarrollo de productos como los antibacterianos o antioxidantes que pueden aportar a un mejor tratamiento y calidad de vida. Por lo cual proponer un tratamiento adecuado de las muestras fue prioridad para la obtención de un aceite esencial ya que se pudo aplicar técnicas adecuadas para evaluar las actividades antibacteriana y antioxidante.

1.2. Formulación del problema

¿El aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus presenta actividades antibacteriana y antioxidante.?

1.2.1. Preguntas de investigación

- ¿Cómo garantiza la calidad de la materia prima?

- ¿Con cuál de los métodos de extracción de aceite esencial utilizados se obtiene mejor rendimiento y calidad? - ¿Qué características y propiedades presenta el aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus? - ¿El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus presenta actividad antibacteriana? - ¿El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus presenta actividad antioxidante?

1.3. Objetivos de la investigación

1.3.1. Objetivo general.

Evaluar la actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus.

1.3.2. Objetivos específicos.

- Realizar un estudio de parámetros de calidad de la materia prima - Extraer el aceite esencial del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus mediante Hidrodestilación y Fluidos supercríticos. - Caracterizar calidad y rendimiento de los aceites esenciales extraídos por Hidrodestilación y Fluidos supercríticos - Evaluar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus presenta actividad antibacteriana - Determinar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus presenta actividad antioxidante.

1.4. Importancia y justificación de la investigación

“Los aceites esenciales son fracciones líquidas volátiles que contienen mezclas complejas de varias sustancias químicas biosintetizadas por las plantas que dan el aroma característico a flores, árboles, frutos, hierbas, especias, semillas y a productos de origen animal” (Delgado J, Sánchez M y Bonilla C, 2016). La calidad final de los productos fitoterápeuticos depende de factores importantes que van desde la identificación correcta de la especie, el manejo del cultivo, la cosecha y el beneficio. En los últimos años, el

5 estudio de los aceites esenciales ha cobrado importancia debido a sus diferentes aplicaciones terapéuticas, por lo que resulta, de gran interés en la aplicación industrial ya sea en productos naturales o productos farmacéuticos.

Debido a la importancia que adquieren ciertos componentes presentes en los aceites esenciales y a las diversas investigaciones del género Tabebuia en medicina tradicional como el de Flores (2017) donde indica que la especie Tabebuia rosea conocida también como “lapacho” presentó actividad antioxidante en el extracto etanólico por medio del método de DPPH en cromatografía en capa fina, además, en un estudio presentado por García y López (2015), indica que en el extracto acuoso de corteza interna de Tabebuia rosea mostró poseer actividad antiinflamatoria y en el extracto metanólico de hojas de Tabebuia. rosea presentó actividad anticancerígena y antioxidante. Por lo anteriormente expuesto es que se planteó a Tabebuia chrysantha, actualmente Handroanthus chrysanthus como especie de estudio ya que pertenece al mismo género. (Flores, 2017)

A nivel mundial uno de los más altos desafíos es la resistencia que producen los microorganismos a ciertos medicamentos antimicrobianos, por lo que encontrar fuentes que contengan componentes con funcionalidades es un avance y un aporte al ámbito industrial para la elaboración de productos naturales y productos farmacéuticos que contengan beneficios y sean alternativas para diversos tratamientos, así como también encontrar fuentes naturales de antioxidantes permitiría mejorar la calidad de vida y prevenir el desarrollo de procesos oxidativos que es un problema para la salud debido a que nuestro organismo tiene que soportar un exceso de radicales libres durante años. (Avello, M y Suwalsky, M, 2006)

En la actualidad no se dispone de datos reales que denoten el valor de la difusión del uso de las plantas o de los principios activos en los sistemas de salud correspondientes a diferentes países. Sin embargo, la Organización Mundial de la Salud, estima que quizá un 80% de la población mundial, principalmente de los países en vías de desarrollo, confía en las medicinas tradicionales para solucionar las principales necesidades de la salud

(Mata R, 2012), por lo cual se puede afirmar que mayormente las terapias tienen como base el uso de las plantas o de sus principios activos, debido a esto el estudio de actividades antibacteriana y antioxidante en aceites esenciales resultó motivador e innovador pues es un plus para el uso en diferentes aplicaciones del campo industrial.

Para obtener resultados satisfactorios en cuanto a la extracción del aceite esencial y para poder evaluar mediante técnicas específicas las actividades antibacteriana y antioxidante fue necesario un adecuado tratamiento de la materia prima certificada, así como también la aplicación de métodos de extracción que favorecieron su rendimiento, puesto que algunas sustancias son volátiles y pueden verse afectadas e interferir en las técnicas evaluativas de la actividad biológica de dicho aceite.

El trabajo también se halla justificado porque forma parte de uno de los temas de investigación de Proyectos Semilla III que se lleva a cabo en la Universidad Central del Ecuador, con los docentes de la Facultad de Ciencias Químicas, docentes de otras Facultades y sus alumnos.

Capítulo II

2. Marco teórico

2.1. Antecedentes

Se han reportado estudios en extractos etanólicos de la corteza de Tabebuia rosea y Tabebuia ochracea, en los cuales se evidenció significativa actividad antiinflamatoria y antioxidante, así como también ambas especies de Tabebuia presentaron importante actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus ATCC25923. (Franco L, Castro J, Ocampo Y, Pájaro I y Díaz F, 2013) Lo que constituye un reporte que valida dichas actividades en el uso popular de la medicina ancestral de las diferentes especies, así como punto de partida para investigaciones en especies del mismo género como la Tabebuia chrysantha, actualmente Handroanthus chrysanthus perteneciente a la familia Bignoniaceae.

Según el estudio presentado por Ramírez y colaboradores (2013) la familia Bignoniaceae se ha usado en la medicina tradicional para tratar úlceras, sífilis, problemas gastrointestinales, candidiasis, cáncer, diabetes, prostatitis y alergias. La especie ha tenido un uso tradicional en la zona cafetera como antiinfecciosa. El “taheebo” (producto obtenido de la corteza de los árboles del género Tabebuia), es usado como astringente, antiinflamatorio, antibacteriano, antifúngico y laxante, por lo cual es considerada como una de las familias de interés para la investigación de actividades biológicas en sus diferentes especies. (Ramirez A, Isaza G y Pérez J, 2013)

Existen varios estudios de la familia Bignoniaceae, entre ellas un estudio in vitro de la actividad antiinflamatoria en diferentes extractos de n-butanol y cloroformo obtenidos a partir de la corteza interna de la especie Tabebuia chrysantha mostrando mayor actividad anti-inflamatoria en el extracto clorofórmico, por lo que Velazquez y Posada (2013) recomiendan evaluar la actividad antioxidante y antibacteriana de los extractos de Tabebuia chrysantha. (Velazquez S y Posada V., 2013)

En la investigación presentada por Pérez y colaboradores (2007) se evaluó la actividad antibacteriana en extractos metanólico, clorofórmico y éter de petróleo de las hojas de las especies Phenax rugosus y Tabebuia chrysantha frente a Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris y Pseudomona aeruginosa en el cual se evidenció leve actividad antibacteriana con los extractos metanólicos de ambas plantas por lo que recomiendan el metanol como un solvente adecuado para futuras investigaciones de estas plantas que busquen aislar sus principios activos. (Pérez J, Isaza G y Acosta S, 2007)

La especie de Tabebuia chrysantha a través de sus investigaciones in vitro ha presentado actividad antiinflamatoria, sin embargo hay pocos reportes desde el punto de vista de sus componentes químicos responsables de diferentes actividades biológicas por lo cual Jiménez (2016) llevó a cabo un estudio dentro del Grupo Polifenoles en la Universidad Tecnológica de Pereira en la caracterización química del extracto clorofórmico que permitió concluir que el extracto evaluado puede contener compuestos como taninos, lactonas sesquiterpénicas, glicósidos cardiotónicos, alcaloides, saponinas y posibles fenoles, sin embargo recomienda más estudios de caracterización en extractos obtenidos de diferentes partes de la especie de Tabebuia chrysantha. (Jimenez, 2016)

Además, el estudio realizado por Flores (2017) en las hojas de la especie Tabebuia rosea perteneciente a la familia Bignoniaceae, identificó por medio de tamizaje fitoquímico en el extracto etanólico; flavonoides, antocianinas y saponinas, además este mismo extracto etanólico presentó actividad antioxidante por medio del método de DPPH en cromatografía en capa fina, lo cual son aportes considerables para el análisis de otras especies y en diferentes partes de la planta. (Flores, 2017)

Por lo anteriormente expuesto fue importante el estudio del aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus mediante métodos de extracción por Hidrodestilación o con Fluidos supercríticos, así mismo la evaluación de actividades antibacteriana y antioxidante que a futuro son de gran ayuda en el campo industrial para nuevas alternativas antimicrobianas.

2.2. Fundamento teórico

2.2.1. Farmacognosia

Su etimología deriva de los vocablos griegos PHARMAKON (remedio) y GNOSIS (conocimiento), por lo que la Farmacognosia es una ciencia multidisciplinaria cuyo objetivo fundamental es el estudio de los productos naturales con propiedades medicinales (Mata R, 2012).

La historia de la farmacognosia es incierta pues hace años una mezcla entre magia, religión y una incipiente ciencia médica quedó en manos del llamado “chamán”, conocedor de las propiedades curativas de las plantas, actualmente las áreas de la investigación farmacognósica continúa ampliándose y ya se incluyen los aspectos de la biología celular y molecular en relación con productos naturales, la etnobotánica, la fitoterapia y fitoquímica entre otros (Hernández, A, 2002).

2.2.2. Producto natural

Es todo producto de origen orgánico o inorgánico, que se halle en la naturaleza y que pueda ser aislado o procesado por el hombre. Este término no debe ser aplicado a productos cuya estructura molecular haya sido modificada (Mata R, 2012).

La importancia de los productos naturales radica en la propia función biológica en la que son biosintetizados. Sin lugar a duda los productos naturales son estructuras biológicamente validadas a través de la co-evolución con el resto de los seres vivos. En sentido amplio un producto natural está formado por todos los compuestos de la naturaleza mientras que en sentido más restrictivo un producto natural sólo es un metabolito secundario (Gutiérrez, A y Estevez A, 2009).

2.2.3. Metabolitos primarios y secundarios

El conjunto de reacciones químicas que tienen lugar en un organismo constituye el metabolismo. La mayor parte del carbono, del nitrógeno y de la energía termina en moléculas comunes a todas las células, necesarias para su funcionamiento y el de los organismos. Se trata de aminoácidos, nucleótidos, azúcares y lípidos, presentes en todas las plantas y desempeñando las mismas funciones. Se denominan metabolitos primarios (Fig. 2.1). (Ávalos A y Pérez E, 2009)

Figura 2.1: Elementos básicos del metabolismo primario y secundario. Fuente: (Ávalos A y Pérez E, 2009)

Los metabolitos secundarios además de no presentar una función definida en los procesos fotosintéticos, respiratorios, asimilación de nutrientes, transporte de solutos o síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos, difieren también de los metabolitos primarios en que ciertos grupos presentan una distribución restringida en el reino vegetal, es decir, no todos los metabolitos secundarios se encuentran en todos los grupos de plantas. Se sintetizan en pequeñas cantidades y no de forma generalizada, es importante destacar que también reciben la denominación de productos naturales y tienen un importante y significativo valor medicinal y económico, derivado éste último de su uso en la industria cosmética, alimentaria y farmacéutica. (Ávalos A y Pérez E, 2009)

Se agrupan en cuatro clases principales: (Ávalos A y Pérez E, 2009)

 Terpenos: entre los que se encuentran hormonas, pigmentos o aceites esenciales.  Compuestos fenólicos: cumarinas, flavonoides, lignina y taninos.

 Glicósidos: saponinas, glicósidos cardiacos, glicósidos cianogénicos y glucosinolatos.  Alcaloides.

El grupo de los terpenos, como antes se menciona, incluye hormonas (giberelinas y ácido abscísico), pigmentos carotenoides (carotenos y xantofilas), esteroles (ergosterol, sitosterol, colesterol), derivados de los esteroles (glicósidos cardiacos), latex y aceites esenciales (proporcionan el olor y el sabor característico de las plantas). Aunque las citoquininas y las clorofilas no son terpenos, contienen en su estructura una cadena lateral que es un terpeno. A la vista de esta variedad de compuestos, es evidente que muchos terpenos tienen un importante valor fisiológico y comercial. (Ávalos A y Pérez E, 2009)

2.2.4. Aceites esenciales

Bruneton (2001) indica que en la 8va edición de la Farmacopea francesa (1965), define a los aceites esenciales (esencias = aceites volátiles) (Fig. 2.2) como: “productos de composición generalmente muy compleja que contienen los principios volátiles que se encuentran en los vegetales más o menos modificados durante su preparación”.

Los aceites esenciales pueden almacenarse en todos los órganos vegetales como hojas, flores, cortezas, leños, raíces y frutos, sin embargo aunque todos los órganos de una misma especie tengan aceite esencial la composición de dicho aceite puede variar según su localización. (Bruneton, J, 2001)

Figura 2.2: Aceites esenciales.

Fuente: (ECOVIDASANA, 2013)

Ávalo y Pérez (2009) mencionan que los aceites esenciales contienen terpenos, éstos terpenoides son comercialmente interesantes por su uso como aromas y fragancias en alimentación y cosmética, o por su importancia en la calidad de productos agrícolas. Otros compuestos terpenoides tienen importancia medicinal por sus propiedades anticarcinogénicas, antiulcerosas, antimalariales, antimicrobianas, etc.

2.2.4.1. Distribución de aceites esenciales

Los aceites esenciales se encuentran ampliamente distribuidos en unas 60 familias de plantas entre las cuales se incluyen las Compuestas, Labiadas, Lauráceas, Mirtáceas, Pináceas, Rosáceas, Rutáceas, Umbelíferas, etc. (Martinez A., 2003) Se les puede encontrar en diferentes partes de la planta de las cuales se puede extraer aceite esencial como se observa en la Tabla 2.1.

Tabla 2-1: Partes de la planta utilizadas para extraer aceite esencial.

Aceite esencial Parte de la planta utilizada Ciprés, jara Ramas Lavanda, lavandín Sumidades floridas Menta, hierba limón, eneldo Planta entera Geranio, petitgrain Hojas Neroli, rosa, ylang, ylang Flor Limón, naranja, mandarina Flavedo (capa externa del fruto) Romero, tomillo, ajedrea, mejorana Planta entera con flor Melisa Planta fresca Abeto de Siberia Acículas Manzanilla Flor seca Canela Corteza Cedro Madera Lima Fruto entero Clavo Botones florales Vetiver Raíz Mostaza Semillas Fuente: (Ortuño, M, 2006)

2.2.4.2. Composición química de los aceites esenciales

Los aceites esenciales son mezclas complejas y muy variables de constituyentes que pertenecen, de manera casi exclusiva, a dos grupos caracterizados por orígenes biogenéticos distintos: el grupo de terpenoides, mono-sesquiterpenos, y compuestos aromáticos derivados del fenilpropano, poco frecuente. (Bruneton, J, 2001) Aunque en los aceites esenciales tanto los mono-, los sesquiterpenos y los fenilpropanos se les encuentra en forma libre, más recientemente se han investigado los que están ligados a carbohidratos, ya que se considera que son los precursores inmediatos del aceite como tal. (Martinez A., 2003)

Los aceites esenciales dependiendo de su método de extracción pueden ser extraídos acompañados de ceras o esteroles que son sustancias que se encuentran de forma natural en el mundo animal (por ejemplo, colesterol, que es el principal y el más importante), en el mundo vegetal (por ejemplo, sitosterol) y en hongos y levaduras (por ejemplo, ergosterol), siendo el más abundante el sitosterol (o beta-sitosterol), seguido por el campesterol y el estigmasterol. (Meco J, Fuster V y Alberich R, 2016)

2.2.4.3. Rendimiento de aceites esenciales

De una planta a otra el rendimiento de un aceite cambia mucho, puede variar desde 0,01% en flores de jazmín y rosa hasta el 4-6% en semillas de cilantro, anís o coriandro. En promedio las plantas aromáticas herbáceas poseen de 0,5-2% de aceite esencial.(Tabla 2-2) Muchos factores inciden sobre la composición y el rendimiento de aceite esencial en la planta entre los principales se encuentra la localización geo-climática, tipo de suelo, estado de desarrollo de la planta e inclusive la hora de cosecha, entre otros. (Stashenko, 2009)

Tabla 2-2: Rendimientos según el estado de la planta.

Especie Rendimiento Estado de la planta poleo 1,5% Oreado Orégano 0,2% Fresca romero 0,6% fresca romero 0,88% seca albahaca 0,6% fresca albahaca 1,11% seca cedrón 1% seca manzanilla 0,4% flores secas Fuente: (Stashenko, 2009)

2.2.4.4. Propiedades Organolépticas de los aceites esenciales.

Estas propiedades se miden a través de análisis sobre las sensaciones que producen, éste análisis sensorial parte de cuatro parámetros básicos tales como color, olor, sabor y textura. El color es un indicador de las reacciones químicas que se producen, el olor es considerada una de las más difíciles de definir y caracterizar ya que viene dada por distintas sustancias volátiles presentes, bien de manera natural o procedente de su procesado, el sabor es identificado por las papilas gustativas de la lengua que son capaces de identificar sabores como dulce, salado, amargo y ácido, y la textura es una propiedad que evalúan los estudios reológicos, que se centran en el análisis de aspectos como la viscosidad, el grosor, la dureza o la rigidez. (Chavarrías, 2016)

2.2.4.5. Propiedades físicas de los aceites esenciales.

Los aceites esenciales se caracterizan por sus propiedades físicas como densidad, viscosidad, índice de refracción y actividad óptica. Los aceites esenciales son líquidos a temperatura ambiente, volátiles, lo que les diferencia de los aceites fijos, muy raramente son coloreados. En general, su densidad es inferior a la del agua. Poseen un índice de refracción elevado y la mayoría desvían la luz polarizada. Son liposolubles y solubles en los disolventes orgánicos habituales. Aunque son muy poco solubles en agua pueden ser arrastrados en el vapor de ella, sin embargo son solubles como para comunicarle un olor neto (Bruneton, J, 2001).

2.2.5. Métodos de extracción de aceites esenciales.

Bruneton (2001) indica que los aceites esenciales se consideran mezclas complejas de sustancias orgánicas volátiles, de origen vegetal, que en su mayoría se obtienen por destilación, sin embargo, menciona que en la norma AFNOR NF T 75-006 (febrero 1998) un aceite esencial es un producto obtenido a partir de una materia prima vegetal ya sea por arrastre de vapor, o bien por procedimientos mecánicos a partir del epicarpio de los citrus, o por destilación en seco. (Bruneton, J, 2001) En la Tabla 2.3 se observa los métodos utilizados para la obtención de aceite esencial.

Tabla 2-3: Métodos de extracción de aceite esencial.

Tipo de Método Procedimiento Productos obtenidos  Métodos - Extrusión Aceites esenciales cítricos directos - Exhudación Gomas, resinas, bálsamos

- Directa - Arrastre con vapor de agua Aceites esenciales y aguas  Destilación - Destilación – maceración aromáticas (liberación enzimática de agliconas en agua caliente)

- Solventes volátiles Infusiones y resinoides  Extracción alcohólicos con Concretos y absolutos solventes - Solventes fijos (grasas y Absolutos de pomadas aceites) Absolutos de enflorados

- Extracción con fluidos en estado supercrítico Fuente: (SENA, 2007)

2.2.5.1. Destilación con agua o Hidrodestilación.

La Hidrodestilación consiste en poner a hervir agua, bien sea por fuego directo, camisa de vapor o camisa de aceite, en la cual se ha sumergido previamente el material vegetal, preferiblemente en polvo, con el objeto de que el vapor de agua ejerza su acción en el mayor número posible de partículas vegetales. (SENA, 2007)

Éste sistema de extracción tiene el inconveniente de que la temperatura que se emplea provoca que algunos compuestos presentes en las plantas se degraden y se

16 pierdan. En general, los aceites producidos por destilación en agua son de menor calidad por las siguientes razones: algunos componentes son sensibles a la hidrólisis, mientras que otros, son susceptibles de polimerización, los compuestos oxigenados tienden a ser parcialmente solubles en el agua de destilación, por lo que es imposible la remoción completa de estos compuestos y los tiempos requeridos de destilación son demasiado largos, lo cual se asocia a un detrimento de la calidad del aceite obtenido. (SENA, 2007)

 Determinación del contenido de aceite esencial de un material vegetal.

Flores (2010) indica que el método utilizado tradicionalmente esta descrito en la Farmacopea Europea (2005), y que se basa en efectuar una hidrodestilación de un peso conocido de material vegetal y recoger el aceite esencial en un tubo graduado (1ml dividido en 0,01 ml), que se encuentra en un colector especialmente diseñado para esto. El equipo está compuesto de un balón, donde se deposita la materia prima molida y una cantidad conocida de agua pura. Se le calienta constantemente, el aceite esencial con el agua presente se evapora continuamente. Un condensador va acoplado al balón y una conexión en forma de D, permite acumular y separar el aceite esencial de la mezcla condensada, tal como se observa en la figura 2.3.

Figura 2.3: Equipo de clevenger empleado para la determinación del contenido de aceite esencial. Fuente: (Cerpa, 2007)

2.2.5.2. Extracción por fluidos supercríticos

Los fluidos supercríticos presentan propiedades intermedias entre un gas y un líquido como la densidad elevada que es próxima a la de un líquido, baja viscosidad que es cercana a la del gas y un coeficiente de difusión superior al del líquido. Estas características favorecen su penetración en diferentes matrices y la solubilización de los solutos (Castaños, 2015).

Consiste en utilizar como material de arrastre sustancias químicas en condiciones especiales de temperatura y presión. El material vegetal se corta en trozos pequeños, se licua y se empaca en una cámara de acero inoxidable por donde se hace circular un líquido supercrítico, en este caso CO2. Los aceites esenciales se solubilizan y el líquido supercrítico CO2 que actúa como solvente extractor se elimina por descompresión progresiva hasta alcanzar la presión y temperatura ambiente, para finalmente obtener un aceite puro (Fig. 2.4) (SENA, 2007).

Figura 2.4: Diagrama esquemático del sistema de extracción de fluido supercrítico. (1) bomba de CO2, (2) bomba modificadora, (3) celda de extracción, (4) celda de fraccionamiento I, (5) celda de fraccionamiento II, (6) válvula. Fuente: (Castaños, 2015)

Usando CO2, en particular, el tratamiento es a temperatura moderada y es posible lograr una alta selectividad de micro-componentes valiosos en productos naturales. La selectividad del CO2 también es apropiada para la extracción de aceites esenciales, pigmentos, carotenoides antioxidantes, antimicrobianos y sustancias relacionadas, que

18 son usadas como ingredientes para alimentos, medicinas y productos de perfumería y que son obtenidas de especias, hierbas y otros materiales biológicos (García, 2017).

Entre las ventajas de la extracción por fluidos supercríticos se encuentran: el tiempo de extracción se reduce, se obtienen rendimientos mayores, es posible seleccionar sustancias y la composición de extracción, además se requiere menos energía.

La principal desventaja es que ceras cuticulares y compuestos de alto peso molecular son extraídos junto con el aceite esencial. (Peredo A, García P y López A, 2009)

2.2.6. Propiedades Fitoterapéuticas de los aceites esenciales.

Desde la antigüedad la fitoterapia ha sido un medio fundamental para el hombre en el manejo de enfermedades, y es empleada por miles de personas en el mundo entero, en el tratamiento de un gran número de afecciones entre las que se destacan diferentes tipos de infecciones. La necesidad del hombre por curar sus enfermedades lo ha dirigido a las plantas y a su capacidad curativa; práctica que se ha mantenido a lo largo de los siglos (Gutiérrez, A y Estevez A, 2009).

Entre los componentes destacados de los aceites esenciales están los terpenos, principalmente monoterpenos y sesquiterpenos, los fenilpropanoides, y los compuestos alifáticos de cadena corta. Esta diversidad estructural determina que los aceites esenciales puedan tener actividades farmacológicas muy variadas: antimicrobiana, expectorante, espasmolítica, carminativa, colerética y colagoga, antiinflamatoria, analgésica, sedante, estimulante del sistema nervioso central, etc. Estas actividades biológicas explican, total o parcialmente, el uso terapéutico de muchas drogas vegetales, por lo que Gutiérrez y Estevez (2009) indica que en un estudio realizado por la FDA (Food and Drug Administration) entre los años de 1981 y el 2008 el 57.7% de nuevos fármacos aprobados son de productos naturales, razón por la cual es importante el estudio de los mismos, entre ellos los aceites esenciales.

2.2.6.1. Actividad antibacteriana

La potencia o actividad antibacteriana se define como la habilidad específica o capacidad de un producto de lograr su efecto planeado y se basa en la medición de algún atributo del producto, por ejemplo, su efecto inhibitorio frente a un determinado microorganismo (halo de inhibición), normalmente métodos microbiológicos. La potencia debe ser una propiedad o un atributo medible y definible para un producto biológico o semisintético. (Pedraza, P y Castellanos H, 2009).

Para lograr un correcto tratamiento de las infecciones provocadas por los microorganismos, es necesario desarrollar métodos apropiados debido a que los microorganismos son capaces de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha utilizado contra él durante un periodo largo de tiempo, entre los métodos se encuentran: métodos de dilución, métodos de difusión en agar (antibiograma o por perforación en gel), método de bioautografía, y cámara hermética (Parra, 2017).

 Métodos de evaluación de actividad antibacteriana

Método de Difusión en agar por perforación.

Este método consiste básicamente en incorporar al medio de cultivo el antibiótico o el microorganismo en concentración conocida para que luego de solidificado el medio, se adicione la contraparte en una perforación producida con un sacabocado (Fig. 2.5) y de esta manera observar la inhibición de crecimiento en forma de halos. Una de las grandes ventajas de ésta técnica de evaluación de actividad antimicrobiana es que requiere de muy pequeñas cantidades de extracto o aceite a evaluar y ofrecen la posibilidad de ensayar varias sustancias contra un mismo microorganismo (Parra, 2017).

Figura 2.5: Perforación de agar.

Fuente: (Parra, 2017)

Una de las cepas de prueba generalmente utilizadas son Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).(Salud, n.d.)

Microdilución en placa

La microdilución es una técnica basada en la actividad inhibitoria, se utiliza para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) que se define como la mínima concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de incubación a 37°C. Esta técnica se realiza en una policubeta de poli-estireno que contiene 96 pocillos de fondo cónico o redondo (Fig. 2.6), cada pocillo contiene volumen aproximado de 300uL. Una placa puede contener de 7 a 8 diluciones de 12 diferentes agentes antibacterianos, usando una celdilla como control positivo (caldo + inóculo), otra como control negativo (sólo caldo) y también una para el control de la estabilidad del antibacteriano usando una concentración ya conocida. Para evitar la desecación se debe sellar cada policubeta con su tapa plástica o plástico adhesivo. El tiempo de incubación para la mayoría de los microorganismos es de 16-20 hs, tanto para la técnica en macro o micro a 35±2°C. (R, Carmilema S y Delgado, 2010)

Figura 2.6: Placa para microdilución Fuente: (Mexicalexpo)

Cepas de prueba

Staphylococcus aureus: pertenece a la familia Staphylococcaceae. Es Gram positivo, aunque las cepas viejas o los microorganismos fagocitados se tiñen como Gram negativo. Tiene forma de coco y puede aparecer en parejas, en cadenas o en racimos. Su tamaño oscila entre 0,8 a 1,5 micras de diámetro, es inmóvil y algunas cepas producen una cápsula externa mucoide que aumenta su capacidad para producir infección. En

21 relación con su metabolismo, es anaerobio facultativo, coagulasa positivo, catalasa positivo y oxidasa negativo. (INSHT, 2012)

Staphylococcus aureus (Fig. 2.7) es el que causa más infecciones, entre ellas: infecciones en la piel, neumonía, intoxicación por alimentos, síndrome del shock tóxico e intoxicación sanguínea (bacteremia). Las infecciones en la piel son las más comunes. (Pahissa A, 2009)

Figura 2.7: Staphylococcus aureus Fuente: (Pahissa A, 2009)

Pseudomonas aeruginosa: pertenece a la familia Pseudomonaceae. Se trata de un bacilo recto o ligeramente curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-1 micras, y móvil gracias a la presencia de un flagelo polar. En relación con su metabolismo, es aerobio (aunque puede desarrollarse en condiciones anaerobias utilizando nitrato), catalasa positivo y oxidasa positivo. Se caracteriza por producir una variedad de pigmentos, como la piocianina (de color azul verdoso), la pioverdina (pigmento fluorescente de color verde amarillento) y la piorrubina (de color rojo). (Instituto nacional de seguridad e higiene en el trabajo, INSHT, 2016)

P. aeruginosa (Fig. 2.8) es un patógeno oportunista suele manifestarse como: infecciones dérmicas, neumonía, otitis externa, infección ocular, es responsable de numerosos casos de infección nosocomial, afectando principalmente a individuos inmunocomprometidos, con quemaduras graves, heridas quirúrgicas, neutropenia o con infecciones pulmonares subyacentes. (Instituto nacional de seguridad e higiene en el trabajo, INSHT, 2016)

Figura 2.8: Pseudomonas aeruginosa Fuente: (Instituto nacional de seguridad e higiene en el trabajo, INSHT, 2016)

Control positivo

Ceftriaxona (Fig. 2.9) es un antibiótico betalactámico que pertenece a las cefalosporinas de tercera generación con acción bactericida de amplio espectro contra numerosos microorganismos gramnegativos y grampositivos. Destaca por su vida media prolongada y, en consecuencia, su administración puede ser cada 24 h. Inhibe en forma selectiva la síntesis de la pared celular en los microorganismos susceptibles, acción derivada de su unión a proteínas específicas localizadas en las membranas citoplásmicas de las bacterias, y que impide las reacciones de transpeptidación (transpeptidasas). La ceftriaxona no se metaboliza en el organismo. Una parte de ella se elimina sin cambios por filtración glomerular en la orina y el resto en la bilis. Su vida media sérica es de 6 a 8 h. (Rodriguez R, 2013)

Figura 2.9: Estructura química de la Ceftriaxona Fuente: Wikimedia Commons

Criterios de interpretación

Según los nuevos criterios de interpretación de la CLSI (The Clinical & Laboratory Standards Institute) la suceptabilidad antimicrobiana de la ceftriaxona frente a microorganismos patógenos viene dada de la siguiente manera en las tablas 2-4 y 2-5.

Tabla 2-4: Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, ceftriaxona

Agente Disco difusión (mm) Concentración mínima inhibitoria (ug/ml) S I R S I R Ceftazidima ≥21 18-20 ≤17 ≤4 8 ≥16 Ceftriaxona ≥23 20-22 ≤19 ≤1 2 ≥4 Cefotaxima ≥26 23-25 ≤22 ≤1 2 ≥4 S: sensible; I: intermedio; R: resistente

Fuente: (Comité de Resistencia Bacteriana e IAAS ACIN y otros, 2013)

Tabla 2-5: Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas bacterianas

CEFTRIAXONA Cepas Difusión en disco (mm) Concentración bacterianas mínima S I R inhibitoria (ug/ml) Escherichia ≥23 20-22 ≤19 ≥0,125 coli Pseudomonas ≥21 14-20 ≤13 ≥16 aeruginosa Staphylococcus ≥14 11-13 ≤10 ≥4 aureus S: sensible; I: intermedio; R: resistente

Fuente: (Secretaria distrital de salud, 2010)

2.2.6.2. Actividad antioxidante

Cada vez son más abundantes los estudios que afirman que varias especies de origen vegetal son capaces de producir gran cantidad de fracciones químicas que actúan como antioxidantes para controlar el estrés oxidativo causado por la radiación solar, el oxígeno y otros factores; y que pueden servir de fuente para la obtención de nuevos compuestos antioxidantes. (Altamirano, I, 2015)

Los antioxidantes derivados de las plantas se pueden clasificar en dos grupos como: los antioxidantes endógenos que son biosintetizados por el propio organismo, y los antioxidantes exógenos que son aquellos que ingresan a través de la dieta como: la vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E (tocoferoles) y vitamina A (beta-caroteno) (Altamirano, I, 2015).

 Tocoferoles (Vitamina E)

Son antioxidantes de origen lipofílico que se localizan exclusivamente en los plastos y se biosintetizan solamente en plantas, en algunas algas y cianobacterias. Todos los tocoferoles son moléculas anfipáticas es decir que poseen una región hidrofóbica que se encuentra asociada a las membranas y una región polar que permanece en la superficie de éstas; por lo que interactúan con los grupos acilos de los lípidos poliinsaturados, estabilizan las membranas, secuestran y atenúan varias ROS, especialmente •O2 y •OH. Entre ellos la vitamina E. (Altamirano, I, 2015)

Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) es un análogo de la vitamina E (Fig. 2.10) soluble en agua. Es un antioxidante como la vitamina E y se utiliza en aplicaciones biológicas o bioquímicas para reducir el estrés oxidativo o daño. La actividad antioxidante no puede ser medida directamente, pero puede determinarse por los efectos del compuesto antioxidante en un proceso de oxidación controlado (Tovar, J, 2013)

Entre los métodos utilizados para determinar la actividad antioxidante se encuentran método del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), ensayo de decoloración del catión radical ABTS (2,2'-azino-bis- (3-etil benzotiazolin-6-sulfonato de amonio), ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) y la capacidad antioxidante total de plasma (FRAP) (Tovar, J, 2013).

Figura 2.10: Vitamina E y su análogo Trolox.

Fuente: Sigma-Aldrich Merck

 Método del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH).

El método DPPH está entre los ensayos de captación de radicales libres, siendo el más rápido y simple. También de un costo inferior en comparación con otros modelos. La molécula 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH) es conocida como un radical libre estable debido a la deslocalización de un electrón desapareado sobre la molécula completa, por lo cual la molécula no se dimeriza, como es el caso de la mayoría de los radicales libres. La deslocalización del electrón también intensifica el color violeta intenso típico del radical, el cual absorbe en metanol a 514 nm. Cuando la solución de DPPH reacciona con el sustrato antioxidante (Trolox) que puede donar un átomo de hidrógeno como se muestra en la figura 2.11, el color violeta se desvanece. El cambio de color es monitoreado espectrofotométricamente y es utilizado para la determinación de los parámetros para las propiedades antioxidantes (Tovar, J, 2013).

El modelo que explica la actividad de un compuesto como antirradical se ejemplifica con el siguiente gráfico:

Figura 2.11: Reacción del 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH).

Fuente: (Castañeda C, Ramos E y Ibañez B, 2008)

La actividad antioxidante se expresa como porcentaje de inhibición lo cual corresponde a la cantidad de radical DPPH neutralizado por el extracto a una determinada concentración, de acuerdo a la siguiente ecuación:

(퐴 − 퐴 ) % 퐼푁퐻퐼퐵퐼퐶퐼Ó푁 = %퐼 = 1 푥 100 퐴 A = Absorbancia del blanco

A1 = Absorbancia del sistema (muestra)

Ecuación 2.1: Cálculo del porcentaje de inhibición

Fuente: (Castillo, M, 2010)

2.2.7. Caracterización de aceites esenciales.

Para la utilización de los aceites esenciales es necesario cumplir con ciertos parámetros de caracterización, debido a que la composición y calidad de un aceite esencial varía de una especie vegetal a otra, dentro del mismo género de la planta, y también dentro de la misma especie dependiendo del clima, región de cultivo, la madurez de la planta, etc. (Rodas, 2012) Se deben tomar en cuenta los siguientes parámetros analíticos (Tabla 2.6) en la caracterización de los aceites esenciales:

Tabla 2-6: Parámetros de caracterización de aceites esenciales.

1. Características  Color  Sabor organolépticas  Olor  Apariencia

 Densidad  Punto de congelación 2. Determinaciones  Índice de refracción físicas  Poder rotatorio  Solubilidad en etanol  Punto de inflamación  Rango de destilación

 Índice de acidez  Índice de éster 3. Índices químicos  Índice de saponificación  Índice de acetilo  Índice de fenoles

4. Características  Perfil cromatográfico por CG cromatográficas  Cuantificación de los principales componentes

5. Características  Ultravioleta – visible espectroscópicas  Infrarrojo

6. Otras  Porcentaje de humedad del material vegetal determinaciones  Pesticidas  Materiales pesados

7. Identificación de  CG – EM compuestos  CL – EM mayoritarios  CG x CG Fuente: (Montoya Cadavid, 2010)

2.2.7.1. Tipos de análisis de aceites esenciales.

A continuación, se detallan los diferentes tipos de análisis que se realizan a los aceites esenciales:

 Características organolépticas.

Se describe el olor, color, sabor y textura de los aceites obtenidos, puesto que estas características físicas contribuyen a la definición de la calidad y además orientan sobre las posibles aplicaciones industriales. (Montoya, G, 2010)

 Características físico-químicas.

Índice de refracción: El índice de refracción de un aceite esencial con respecto al del aire, corresponde a la razón del seno del ángulo de incidencia al seno del ángulo de refracción emitido, de un rayo de luz que pasa del aire al aceite. Aunque los valores representados por el índice de refracción de los aceites esenciales oscilan entre límites muy pequeños, se practica su determinación porque puede señalar adulteraciones y envejecimientos de los mismos. (Montoya, G, 2010)

Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas: La asociación de las dos técnicas, GC (“Gas Chromatography”) y MS (“Mass Spectrometry”) da lugar a una técnica combinada GC-MS (Fig. 2.12) que permite la separación e identificación de mezclas complejas. La utilización de la cromatografía de gases acoplada a un espectrómetro de masas requiere sistemas especiales de conexión. En principio, se trata

28 de dos técnicas que trabajan en fase gaseosa y necesitan una muy pequeña cantidad de muestra para su análisis, por lo que son muy compatibles. El único obstáculo serio a la hora de realizar su acoplamiento es que el efluente que emerge de la columna cromatográfica sale a presión atmosférica y debe introducirse en el interior del espectrómetro de masas que trabaja a alto vacío. Actualmente, el acoplamiento directo resulta fácil cuando se utiliza la cromatografía de gases capilar, que es el caso más habitual. (Gutiérrez, Droguet, & Odeur, 2002).

Figura 2.12: Equipo Cromatografía de gases acoplado a Espectrometría de masas. Fuente: (Gutiérrez, Droguet, & Odeur, 2002).

2.2.8. Descripción botánica de Handroanthus chrysanthus (Guayacán).

Handroanthus chrysanthus conocido como guayacán amarillo y anteriormente como Tabebuia chrysantha. es nativo de México, Centroamérica, el norte de Sudamérica, Ecuador y Perú.

Jerarquía Taxonómica.

Tabla 2-7: Jerarquía taxonómica

REINO PLANTAE PHYLUM Magnoliophyta CLASE Magnoliopsida ORDEN Lamiales CLASIFICACIÓN Tabebuia SUPERIOR FAMILIA Bignoniaceae GÉNERO Handroanthus ESPECIE Handroanthus chrysanthus (Jacq.) S.O.Grose Fuente: (Catalogoflora)

Nombre científico: Handroanthus chrysanthus

Nombre común: Guayacán

Nombres relacionados: Guayacán amarillo (Fig. 2.13)

Sinónimia: Bignonia chrysantha Jacq, Bignonia chrysantha Jacq, Handroanthus chrysanthus subsp. Chrysanthus, Tabebuia chrysantha (Jacq.) G.Nicholson, Tabebuia rufescens J.R.Johnst., Tecoma chrysantha (Jacq.) DC., Tecoma evenia Donn.Sm., Tecoma palmeri Kraenzl. (Catalogoflora)

Etimología: Handroanthus: género creado por J.R. Mattos en 1970 para diferenciar parte de las espécies del género Tabebuia. El nombre Handroanthus fue un honor al botánico brasileño Oswaldo Handro (1908-1986). (Catalogoflora) chrysanthus: epíteto latíno que significa (‘con flores de color dorado’). Variedades

 Handroanthus chrysanthus subsp. meridionalis (A.H.Gentry) S.O.Grose  Handroanthus chrysanthus subsp. pluvicola (A.H.Gentry) S.O.Grose (Catalogoflora)

Distribución geográfica: Esta especie habita en laderas, planicies, hondonadas del bosque seco. Crece entre 0-2 000 msnm, en las provincias de Bolívar, Chimborazo, El Oro, Esmeraldas, Guayas, Loja, Los Ríos, Manabí, Morona Santiago, Napo, Pastaza, Pichincha y Sucumbíos (Ministerio del Ambiente, 2012)

Tipo de bosque: Bosque seco pluvioestacional, bosque seco andino y bosque siempre verde de tierras bajas de la Amazonía.

Descripción botánica: Árbol caducifolio, entre 12-20 m de altura y 20-40 cm de DAP. Fuste recto, escasamente ramificado, copa amplia, extendida e irregular. Corteza fisurada pardo-oscuro. Fuste cilíndrico, copa amplia extendida e irregular. Hojas palmadas compuestas, opuestas, ápice agudo y bordes aserrados, de 5 foliolos, de 6-12 cm de longitud, envés áspero y ligeramente pubescente por el envés. Flor tubular, 5 cm de longitud, con pedúnculo, cáliz de 5 sépalos cafés; corola de 5 pétalos amarillos, en inflorescencia racimosa. (Ministerio del Ambiente, 2012).

Usos: Esta especie da una de las maderas más pesadas y duraderas. Madera de valor y buena calidad, y muy resistente al comején. Usada en ebanistería, carpintería. Partes para vehículos; carrocerías, carruajes, vagones, ejes de carreta, etc. Instrumentos musicales;

30 arcos para violín. Artículos deportivos; cañas para pesca. Se utiliza en sistemas silvopastoriles, linderos, como sombra y ornamental. Se ha encontrado que el extracto de la corteza se usa como medicina, las flores en infusión se usan como tratamiento de la hepatitis y la corteza en cocción ayuda a aliviar la osteoporosis (forestal, 2012).

Figura 2.13: Handroanthus chrysanthus Fuente: (Ministerio del Ambiente, 2012).

2.3. Fundamento legal

 Constitución de la República del Ecuador

Expedida por la Asamblea Constituyente-Montecristi 2008

Publicada: Registro Oficial No. 449

Fecha de publicación 20-oct-2008

Última modificación: 13-Julio-2011

Art. 14. Se reconoce el derecho de la población a vivir en un ambiente sano y ecológicamente equilibrado, que garantice la sostenibilidad y el buen vivir, sumak kawsay. Se declara de interés público la preservación del ambiente, la conservación de los ecosistemas, la biodiversidad y la integridad del patrimonio genético del país, la prevención del daño ambiental y la recuperación de los espacios naturales degradados.

 USP-39

Valoraciones microbiológicas.

En las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibióticos puede demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos. La reducción en la actividad microbiana puede ser difícil de demostrar por métodos químicos. En la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) para los que la valoración microbiológica es el método analítico estándar se utilizan dos técnicas generales: la valoración en cilindro- placa (o en placa) y la valoración turbidimétrica (o en tubo).

2.4. Hipótesis

2.4.1. Hipótesis alternativa. (Hi)

El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus presenta actividad antibacteriana.

El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus presenta actividad antioxidante.

2.4.2. Hipótesis Nula. (Ho)

El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus no presenta actividad antibacteriana.

El aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus no presenta actividad antioxidante.

2.5. Sistema de variables

El presente proyecto de investigación consta de 4 etapas:

2.5.1. Etapa 1: Extracción del aceite

Extracción del aceite esencial del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus mediante los métodos de Hidrodestilación y de Fluidos supercríticos previamente aplicando los parámetros de calidad de la materia prima.

2.5.1.1. Variable dependiente:

Rendimiento del aceite

2.5.1.2. Variable independiente

Tamaño de partícula (dos tamaños)

2.5.2. Etapa 2: Caracterización del aceite

Se realizó mediante el análisis de parámetros de caracterización del aceite tales como características organolépticas (color, olor y textura) y características físico- químicas como índice de refracción y cromatografía de gases acoplado a espectrofotometría de masas, a continuación, se seleccionó una muestra de aceite de cada método de extracción.

2.5.3. Etapa 3: Evaluación de actividad antibacteriana

Se evaluó la actividad antibacteriana en la muestra de aceite seleccionado en cada método de extracción mediante el método de difusión en agar por perforación utilizando como control positivo la ceftriaxona (1mg/ml), previamente se realizaron pruebas de solubilidad con etanol, Propilenglicol y glicerina.

2.5.3.1. Variable dependiente:

Antibacteriano (Halo de inhibición)

2.5.3.2. Variable independiente:

Tipo de cepa (S. aureus y P. aeruginosa)

Concentración de aceite (1mg/ml, 20mg/ml y 50mg/ml)

2.5.3. Etapa 4: Evaluación de actividad antioxidante

Se evaluó la actividad antioxidante en la muestra de aceite seleccionado en cada método de extracción mediante el método del radical DPPH para lo cual se utilizó como estándar de referencia Trolox.

2.5.4.1. Variable dependiente

Antioxidante (porcentaje de inhibición)

2.5.4.2. Variable independiente

Tipo de muestra (muestra de aceite y estándar de referencia Trolox)

Capítulo III:

3. Marco metodológico

3.1. Diseño de la Investigación

La presente investigación correspondió a un estudio de la siguiente forma: un paradigma cuantitativo ya que se aplica métodos experimentales con técnicas previamente desarrolladas y aprobadas, el nivel de investigación es explicativo pues la hipótesis y variables se establecieron de las preguntas de investigación por lo que tiene la característica de causa efecto, permitiendo manipular las diferentes variables independientes como son: tamaño de partícula en la obtención del aceite, tipo de cepa y concentración para evaluar la actividad antibacteriana y su tipo de muestra en la actividad antioxidante, estableciendo un diseño que permitió probar y medir variables, su enfoque sigue una línea de investigación en el área de productos naturales y microbiología.

Los tipos de investigación que se utilizaron son:

Investigación bibliográfica o documental: ya que estudia los problemas con el propósito de profundizar y ampliar el conocimiento sobre el tema en cuestión, apoyándose de trabajos previos e información de medios electrónicos o impresos de investigaciones anteriores.

Investigación de laboratorio: ya que permite desarrollar en un lugar que se puede controlar las variables de forma artificial puesto que se carece de las características propias del ambiente natural.

3.2. Población

Para el presente estudio se describió como población a la especie certificada como es Handroanthus chrysanthus y como muestra, a una parte del tronco y corteza de dicha especie. (anexo G)

3.3. Muestra o materia prima

La muestra fue parte de las ramas de la especie mencionada se obtuvo directamente de una propiedad en la cual fue sembrada ubicada en Salinas de Montenuevo donde el propietario autorizó la entrega. (anexo F) 3.4. Métodos

El diagrama procedimental de todos los ensayos experimentales se encuentra detallado en el Anexo B.

3.4.1. Reactivos, materiales y equipos

Tabla 3-1: Reactivos

Reactivos Marca Grado CAS #  Etanol 96 % EMSURE® Merck Analítico 64-17-5  Agua destilada - - -  Heptano Merck Analítico 142-82-5  Metanol Merck Analítico 67-54-1  Solución salina DISPROQUIM Analítico -  Medio de cultivo HIMEDIA - Ref. M1084-100G Mueller Hinton  Medio de cultivo BD - Ref. 211043 TSA  TROLOX SIGMA-ALDRICH Analítico 53188-07-1  Cetfriaxona IMEXFAR - -  Radical DPPH SIGMA-ALDRICH Analítico 1898-66-4

Tabla 3-2: Materiales

Materiales Marca Descripción  Papel empaque - -  Guantes Nitrilo Talla S  Regla - 100cm  Marcador para vidrio - Color negro  Papel film - -  Papel aluminio - -  Fundas plásticas - grandes  Fundas herméticas - Tamaño pequeña y mediana  Frascos ámbar - Volumen 100 ml  Papel filtro - Cualitativo  Espátula - pequeña  Crisoles - Pequeños  Desecador - Capacidad de 4 crisoles  Mechero bunsen - -  Pinza - Para mechero Malla de 0,18 mm; 0.5cm y  Juego de tamices SARGENT Y CO 2,0mm  Manguera de agua Fisher scientific -  Soporte universal - -  Pinzas para soporte - - RANGO (-20 a +110) ± 0,1  Termómetro ALL FRANCE °C INSUMEDIC,  Cajas petri Plástico-medianas Caricia  Sacabocados - Metal  Hisopos - -  Gradilla - Capacidad de 10 tubos  Asa - metálica  Matraz erlenmeyers KIMAX Capacidad 500 y 1000ml  Balón de extracción KIMAX Capacidad 1000 ml  Balón aforado PIREX, KIMAX Capacidad 10, 20, 50ml  Aparato clevenger Schott duran - BOECO- Capacidad 100, 250, 500 y  Vasos de precipitación Germany 1000ml  Tubos de ensayo KIMAX Capacidad 15ml  Agitador de vidrio KIMAX -  Pipetas KIMAX Capacidad 1, 10ml  Micropipetas ------Capacidad 20-200u, 1000uL  Columna de enfriamiento de BOECO - bolas

Tabla 3-3: Equipos

Equipo Marca Descripción  Cortadora de Hurtado HNS - aserradero - Modelo: UNB 500

 Estufa MEMMERT - Resolución: 0,5°C - Rango T: 20-220°C

 Mufla Sybron thermolyne -  Balanza analítica METTLER - Modelo AL 204 TOLEDO  Microscopio - - TO speed - METTLER  Licuadora doméstica - DENVER - Modelo PJ360 INSTRUM ENT  Cocineta HACEB - Serie: G- 042332883 - Modelo: B-490

 Evaporador rotativo BUCHI - Capacidad: Matraces de 25, 100,250 y 500 ml. - Serie 1500  Fluidos supercríticos Spe-ed SFE System - Solvente: CO2  Cromatograma de gases acoplado a Agilent - Tecnologies masas (cg-em)  Refractómetro de abbé - Zona de muestra inferior - Software: CaryWinUV  Espectrofotómetro Varian Cary® 50 Bio UV-vis Versión 3.00(182)  Refrigeradora ELTACHI - Wisd –  Autoclave LABORATORY - INSTRUMENTS - Modelo: Harvard Trip  Balanza de dos platos OHAUS® - Intervalo de operación

1-5000± 0,1 g

 Incubadora - -  Cabina de aire estéril - -

 Agitador magnético Thermolyne - SYBRON Microrganismos de prueba Cepas Numeración Código Staphylococcus aureus ATCC 25923 PSBS002 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 PSBS003

3.4.2. Desarrollo experimental

La presente investigación se encuentra dividida en cuatro etapas:

- Etapa I: Obtención, identificación, homogeneización, control de calidad de materia prima, secado y extracción del aceite esencial del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán) mediante hidrodestilación y fluidos supercríticos. - Etapa II: Caracterización del aceite esencial obtenido por los diferentes métodos, como características organolépticas (color, olor y textura) y características físico- químicas como índice de refracción y cromatografía de gases acoplado a espectrofotometría de masas. - Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana en la muestra de aceite esencial obtenido en cada método de extracción mediante el método de difusión en agar por perforación utilizando como control positivo la ceftriaxona, previamente se realizó pruebas de solubilidad con etanol, propilenglicol y glicerina. - Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante en la muestra de aceite seleccionado en cada método de extracción mediante el método del radical DPPH para lo cual se utilizó como estándar de referencia el Trolox.

3.4.3. Parte procedimental

3.4.3.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial.

 Obtención.

Figura 3.1: Muestras de la especie Handroanthus chrysanthus

La muestra (tronco y corteza) de la especie Handroanthus chrysanthus se obtuvo en forma de troncos de las ramas en papel film, fueron recolectadas en la propiedad Caisapanta ubicada en Salinas de Montenuevo. A la muestra obtenida se realizó tratamiento de desinfección con rocio de etanol etílico para posterior proceso.

 Identificación

Junto con la muestra se obtuvo hojas de la especie de estudio, de las cuales se seleccionaron las hojas sanas y limpias, se desinfectó, se agregó en comercio y se entregó a la Botánica Carmita Reyes para el boucher e identificación (Véase anexo G).

 Troceado y Homogeneizado

Figura 3.2: Obtención de aserrín mediante máquina de aserradero

Se realizó la correspondiente limpieza de la máquina de aserradero modelo C45A, a continuación, se llevó las muestras y una por una se pasó por la máquina para la obtención de aserrín al finalizar se recolectó en fundas plásticas.

 Control de calidad de la materia prima

Refiriendo a la metodología MGA-FH 0040 de la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos tomando como referencia la corteza de canela (tabla 3-4), ya que aún no se encuentra establecido para la corteza o tronco de Handroanthus chrysanthus, se realizó la descripción macroscópica de la muestra previamente desinfectada y de una parte de aserrín se realizó la descripción microscópica, determinación del porcentaje de cenizas totales y adicionalmente la humedad.

Tabla 3-4: Parámetros de control de calidad de la materia prima de corteza de canela.

DEFINICIÓN Consiste en la corteza seca de las ramas jóvenes. DESCRIPCIÓN La corteza tiene un grosor aproximado de 0,2 mm a 0,8 MACROSCÓPICA mm y se presenta como fragmentos tubulares aislados o embutidos unos de otros. Cara externa lisa, de color pardo amarillento, con leves cicatrices que señalan la posición de las hojas y de las yemas axilares, provista de finas estrías, longitudinales blanquecinas y sinuosas. Cara interna ligeramente más oscura y estriada longitudinalmente. Fractura limpia y fibrosa. Olor característico. DESCRIPCIÓN Polvo de color amarillento o café rojizo. Examinar al MICROSCÓPICA microscopio utilizando glicerol al 50%. El polvo muestra las siguientes características diagnosticas: abundantes gránulos de almidón. Los fragmentos de súber están ausentes o son muy escasos. CENIZAS TOTALES No más de 6%

 Secado

Figura 3.3: Secado y licuado de la muestra

La muestra obtenida en forma de aserrín se agregó en cajas de papel empaque, se pesó y se dejó secar al ambiente hasta que el peso se mantenga constante, a continuación, se licuó para disminuir el tamaño de partícula.

 Tamizado

Figura 3.4: Tamizaje de la muestra y pesaje de las fracciones

La muestra licuada se pasó por un juego de tamices de tamaño 0,18mm; 0,5mm y 2,0mm de las cuales se tomaron el tamaño de partícula 0,5 y 2mm. De cada tamaño de partícula se pesaron 10 fracciones de 100 gramos, 5 fracciones de cada tamaño para la extracción por hidrodestilación y las fracciones restantes para la extracción por fluidos supercríticos, cada fracción se almacenó en fundas de cierre herméticas correctamente rotuladas.

 Extracción por Hidrodestilación

Figura 3.5: Proceso de extracción por Hidrodestilación

Se inició con las fracciones de tamaño de partícula de 0,5mm, se armó el equipo para la extracción previamente agregando 2 ml de heptano en el embudo de separación que se encuentra en el aparato de clevenger, se agregó la muestra en un balón de 1L junto con 800ml de agua destilada y un núcleo de ebullición, se procedió a extraer durante 6 horas a partir de su ebullición (Fig. 3.5), al finalizar el tiempo de extracción se apagó las cocinetas y se recolectó la fase orgánica en frascos de vidrio previamente pesados, se dejó evaporar el heptano, se volvió a pesar y se almacenó el aceite esencial en la refrigeradora de marca Eltachi, se repitió el proceso hasta terminar las 10 fracciones de muestra.

 Extracción con Fluidos supercríticos

Figura 3.6: Equipo de extracción con fluidos supercríticos

Se inició con las fracciones de tamaño de partícula de 2mm, se prendió el equipo y se abrió la válvula del tanque de gas de CO2, se agregó la muestra en el cilindro correspondiente y se incorporó en el equipo asegurando que no haya escape de presión, se pesó el frasco recolector de aceite y se añadió en el equipo, se ajustó las condiciones de extracción a 45°C al interior, 325 Bar y 60°C al exterior, a continuación, se ajustan las temperaturas hasta llegar a las condiciones, pasado el tiempo se ajusta la velocidad de flujo y se procede a realizar la extracción durante 2 horas, finalmente se pesó el frasco recolector y se almacenó en la refrigeradora, se repitió el proceso con cada una de las fracciones (Fig. 3.6).

3.4.3.2. Etapa II: Caracterización del aceite.

Una vez obtenidas las muestras de aceite mediante los dos métodos de extracción: Hidrodestilación y Fluidos supercríticos con diferentes tamaños de partícula se midieron los siguientes parámetros:

 Porcentaje de rendimiento

Para ello se utilizó la ecuación 3.1, se tomó en cuenta los gramos de aceite esencial extraído hasta agotamiento de la muestra y se relacionó con la cantidad de muestra vegetal inicial.

푚푙 표 푔 푑푒 푎푐푒푖푡푒 푒푠푒푛푐푖푎푙 푒푥푡푟푎í푑표 % 푅 = ∗ 100 푔푟푎푚표푠 푑푒 푚푢푒푠푡푟푎 푣푒푔푒푡푎푙 푖푛푖푐푖푎푙 Ecuación 3.1: Cálculo del porcentaje de rendimiento

A continuación, se midieron los parámetros de caracterización de los aceites obtenidos, entre ellos parámetros organolépticos y físico-químicos.

 Características organolépticas

Se realizó en cada frasco de aceite esencial mediante análisis sensorial como el olfato para determinar el olor, la vista para determinar el color y el tacto para determinar la textura.

 Características físico-químicas.

Índice de refracción: se utilizó un refractómetro de ABBÉ, para ello se ajustó la escala colocando de 1 a 2 gotas de agua destilada en la superficie del prisma principal con una jeringa. Para medir el índice de refracción de los aceites se abrió el prisma secundario y se colocó una gota de la muestra en el centro de la superficie del prisma, se cerró cuidadosamente el prisma secundario, se observó por el ocular, se giró la perilla de compensación de color hasta que aparezca una línea clara y definida en el campo de visión, se giró la perilla de medición alineando la línea delimitadora con las líneas de intersección y se leyó en la escala superior el índice de refracción.

Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de masas: Una vez obtenidas las muestras de aceites se encendió el equipo de cromatografía de marca Agilet technologies,

43 se ajustó a las condiciones para aceites esenciales, se agregó en frascos de cromatografía disueltas en 2ml de cloroformo (Fig. 3.7) y se realizaron las corridas durante una hora, se determinó los componentes en el aceite, mismos que se observan en la tabla 4-7 y 4-8.

Figura 3.7: Frascos preparados para Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas.

3.4.3.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana

Para la evaluación de la actividad antibacteriana y antioxidante se utilizaron los aceites con mejor rendimiento, es decir los aceites obtenidos por los métodos de hidrodestilación y fluidos supercríticos con el tamaño de partícula de 0,5mm.

 Microdilución en placa

Se realizó la microdilución para determinar la concentración mínima inhibitoria y seleccionar las 3 concentraciones que se evaluaron en el método de difusión en agar por perforación, para ello se realizó de acuerdo con algunos lineamientos descritos por la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) presentes en el trabajo de Suquillo V, (2017) con algunas modificaciones.

Se prepararon 10 diluciones seriadas de cada aceite esencial en las placas de microtitulación. La distribución de los pocillos en la placa de microtitulación se muestran en la figura 3.8. Desde el pocillo 2 hasta el 10 se colocó 100 uL de medio líquido caldo de mueller hinton previamente esterilizado y en el pocillo 1 se puso 200 uL del aceite esencial a determinada concentración. Con la ayuda de una micropipeta se cogió 100 uL del pocillo 1 y se añadió al pocillo 2, luego se tomó 100 uL del pocillo 2 y se colocó en el pocillo 3, se repitió este procedimiento hasta llegar al pocillo 10. Se colocó 200 uL y 100 uL de medio líquido caldo mueller hinton en los pocillos 11 y 12 respectivamente. Se inocularon todos los pocillos, excepto los controles de esterilidad (pocillo 11). Se cubrió la placa de microtitulación con papel film para evitar la evaporación del medio de cultivo y del aceite esencial. Se incubó la placa de microtitulación hasta que se observó 44 crecimiento en el pocillo control de crecimiento a 35 °C por 24 horas. Se determinó la concentración mínima inhibitoria como la concentración más baja que produce una inhibición visual del crecimiento. (De haber un solvente presente en la concentración agregar en otro pocillo junto con el caldo y cepa como control)

Figura 3.8: Diluciones seriadas en la placa de microtitulación

De acuerdo a las diluciones se obtiene las siguientes concentraciones para cada pocillo en la figura 3.9.

Figura 3.9: Concentraciones de los aceites

 Preparación de medios de cultivo

Figura 3.10: Preparación del medio Mueller hinton

Se prepararon los medios de cultivo: Tripteína Soya Agar para crecimiento bacteriano y Mueller Hinton para la susceptibilidad antimicrobiana.

Tripteína Soya Agar: Se disolvió 10 gramos del medio en 250ml de agua destilada, se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos, se calentó agitando suavemente hasta ebullición po 2 minutos, se esterilizó en el autoclave de marca Wisd a 121°C durante 1 hora, a una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en cajas Petri y se dejó solidificar. Para el control de calidad se dejó una caja en la incubadora a 35°C por 24 horas y se observó que no haya crecimiento.

Mueller Hinton Agar: Se disolvió 40 gramos del medio en un litro de agua destilada, se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos, se calentó agitando suavemente hasta ebullición po 2 minutos, se esterilizó en el autoclave de marca Wisd a 121°C durante 1 hora, a una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en cajas Petri cumpliendo con los siguientes parámetros antes de su utilización:

- Espesor: debe ser de 4mm, es decir se debe colocar una cantidad de medio entre 25-30ml en plcas de 85-100mm de diamétro interno. Cuando existe un espesor mayor a 4 mm, se genera un diámetro de halo de inhibición menor (falsa resistencia) mientras que en un espesor menor a 4mm se genera un diámetro de halo de inhibición mayor (falsa sensibilidad).

 Cultivo de Cepas ATCC bacterianas

Se realizó el cultivo de las cepas bacterianas en los medios TSA previamente preparados, para ello a partir de las cepas bacterianas activadas se tomó con un asa de inoculación 2 a 3 colonias aisladas y se estrió en el medio solidificado, se incubó de 18- 24 horas. Una vez utilizadas las cepas deben ser cubiertas, cerradas las cajas Petri y guardadas en refrigeración a una temperatura aproximada de 8°C.

 Preparación de la escala Mac farland.

A partir de las cepas bacterianas Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa anteriormente preparadas en TSA se tomó una colonia con un asa y se inoculó directamente en un tubo de 9 ml con solución salina al 0,85%. Se ajustó el inoculo a una turbidez 0,5 MacFarland que equivale a 1.5 x 108 ufc/ml, leyendo en un espectrofotómetro a 594nm para confirmar el valor de la escala que debe presentar una absorbancia entre 0,08-0,1.

 Preparación del control positivo

Como control positivo se utilizó la ceftriaxona para ello se pesó 1mg y se disolvió en 1ml de agua estéril obteniendo una concentración de 1mg/ml.

 Preparación de la muestra

Con la muestra de aceite esencial obtenida en tamaño de partícula 0,5mm por Hidrodestilación se realizó la solubilidad en glicerina, etanol y Propilenglicol, posteriormente se prepararon las 3 concentraciones establecidas 1mg/ml, 20mg/ml y 50mg/ml en etanol, el cual presentó mayor solubilidad. De la misma manera con el aceite obtenido por fluidos supercríticos.

 Método de difusión en agar por perforación.

Se desinfectó una cabina, todo el área de trabajo con etanol para crear un ambiente estéril, a continuación se procedió aplicar el método, se introdujo un hisopo estéril dentro de la suspensión bacteriana Staphylococccus aureus (0,5 MacFarland) previamente preparada, se rotó por las paredes del tubo para eliminar el exceso de líquido, se inoculo en las cajas del medio Mueller Hinton Agar con la técnica de hisopado, se dejó secar por 5 minutos, pasado el tiempo se realizó 4 perforaciones en el medio con ayuda de un sacabocado, para el control positivo (ceftriaxona 1mg/ml), la muestra de aceite obtenido por Hidrodestilación y fluidos supercríticos a la concentración de 1mg/ml y el solvente (etanol), se rotuló correctamente, luego con ayuda de una micropipeta se agregó 100uL de las muestras en cada perforación y se llevó a la incubadora de bacterias a 37°C durante 24 horas, una vez finalizado el tiempo se midieron los halos de inhibición. Se repitió el procedimiento para cada concentración y con la cepa Pseudomonas aeruginosa por triplicado.

3.4.3.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite esencial

Método del radical DPPH

 Preparación del radical DPPH.

Para la presente evaluación se realizó el método planteado por Coronel (2017) mediante el método del radical DPPH con algunas modificaciones, para ello se preparó una solución patrón de 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH) en metanol grado analítico por lo que se pesó 3mg del reactivo y se aforó a 50ml, se conservó en la oscuridad durante 15 min hasta su uso. Se realizó un barrido espectral con la solución preparada para determinar la longitud de onda máximo, la cual fue de 517 nm.

 Curva de calibración Preparación del estándar trolox

Se realizó una solución madre para lo cual se pesó 0,9 mg de reactivo trolox y se aforó a 10 ml con metanol grado analítico, a continuación, para la curva de calibración se

48 realizaron diluciones tomando alícuotas de la solución madre presentados en la tabla 3-5 en tubos de ensayo cubiertos de papel aluminio.

Tabla 3-5: Volúmenes para la curva de calibración con trolox

Volumen Trolox (uL) Volumen DPPH (ml) Volumen metanol

(0,09 mg/ml) (0,06 mg/ml) (ml) 0 Blanco 1,5 2,5 1 25 1,5 2,475 2 75 1,5 2,425 3 100 1,5 2,400 4 150 1,5 2,350

Los tubos preparados se sometieron agitación a 200rpm durante 30 minutos y se realizó las lecturas de absorbancia a 517nm, este procedimiento se repitió hasta encontrar una curva de calibración con coeficiente de correlación lo más cercano a 1.

Preparación de la muestra de aceite esencial.

Para realizar el análisis del aceite se preparó una solución con cada muestra de aceite obtenida por los diferentes métodos, el aceite extraído con fluidos supercríticos se pesó 5mg y se aforo a 10ml con metanol grado analítico mientras que el aceite extraído por hidrodestilación se pesó 12mg y se aforó a 10ml con el mismo metanol y se procedió a preparar en tubos de ensayo cubiertos de papel aluminio como se presenta en la tabla 3- 6 por separado.

Tabla 3-6: Volúmenes de las muestras de aceite.

Volumen DPPH (ml) Volumen metanol Volumen aceite (uL) (0,06mg/ml) (ml) 0 Blanco 1,5 2,5 1 250 1,5 2,475 2 750 1,5 2,425 3 1000 1,5 2,400 4 1500 1,5 2,350

Los tubos preparados se llevaron agitación a 200rpm durante 30 minutos y se realizó las lecturas de las absorbancias, este procedimiento se realizó por triplicado con cada muestra de aceite.

A continuación, se realizó el cálculo del porcentaje de inhibición con la ecuación 2.1 tanto para la muestra de aceite obtenido con fluidos supercríticos como por hidrodestilación.

Nota: Los certificados de los reactivos DPPH y estándar Trolox se encuentran en el anexo I.

3.5. Diseño experimental

En la presente investigación se aplicó un diseño en las diferentes etapas.

En la primera etapa se realizó la extracción del aceite esencial de tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus tomando en cuenta la muestra en 2 tamaños de partícula 0,5 y 2 mm, mediante 2 métodos de extracción (hidrodestilación y fluidos supercríticos), en la segunda etapa se realizó ensayos de parámetros de caracterización del aceite y se seleccionó una muestra en cada método de extracción, en la tercera etapa se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar por perforación y en la cuarta etapa finalmente se evaluó la actividad antioxidante mediante el método del radical DPPH.

3.5.1. Etapa I: Extracción del aceite

En esta etapa se realizó la extracción del aceite esencial utilizando dos métodos de extracción tales como extracción por Hidrodestilación y extracción con Fluidos supercríticos se opta por aplicar un diseño de bloques, mismo que en cada bloque se realizó una comparación de sus niveles haciendo uso de la prueba de t, con cinco replicas.

La hipótesis nula establece que la media del rendimiento (medias de los niveles del factor) es igual mientras que la hipótesis alternativa establece que es diferente, esto para cada método de extracción.

Hipótesis nula: HO: U1 = U2

Hipótesis alternativa: Hi: U1 ≠ U2

3.5.1.1. Operacionalización de las Variables Etapa I.

Tabla 3-7 : Operacionalización de Variables Etapa I.

FACTOR O INDICADOR (VARIABLE NIVELES VARIABLE DEPENDIENTE)

 0,5 mm Rendimiento de extracción (mg de Tamaño de partícula  2,0 mm aceite por cada 100g de muestra)

3.5.1.2. Factores y dominio experimental de la etapa I.

Codificación factores (variable independiente)

 Tamaño de partícula de la muestra extraída por Hidrodestilación.: FACTOR A

El tamaño de partícula utilizado para la extracción es:

 Tamaño 1 = 0,5 mm = H  Tamaño 2 = 2.0 mm.= F

Tabla 3-8: Factores y Niveles Experimentales de la etapa 1.

CODIFICACIÓN Factor Nivel (+) Nivel (-)

A Tamaño de partícula H F

El factor y el nivel es analizado mediante la prueba t en cada bloque, siendo el factor el tamaño de partícula con sus niveles, de igual manera para el aceite obtenido con Fluidos supercríticos.

Tabla 3-9: Tabla para recolección de datos de la etapa I.

Aceite esencial extraído por Hidrodestilación/Fluidos supercriticos Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm (mg/100g de muestra) (mg/100g de muestra) H1 F1 H2 F2 H3 F3 H4 F4 H5 F5 퐻̅ 퐹̅ DESV. S. DESV. S.

3.5.1.3. Técnicas de análisis e interpretación de resultados

Se realizará una prueba t de significancia de medias al 95%; Prueba t para dos muestras independientes, donde se aplicará las siguientes ecuaciones

푥̅ − 푥̅ 푡 = 1 2 2 푆 ∗ √ 푋1푋2 푛

1 푆 = √ (푆2 + 푆2 ) 푋1푋2 2 푋1 푋2

3.5.2. Etapa II: Caracterización del aceite.

En esta etapa no se aplicó un diseño experimental debido a que se aplicaron parámetros de caracterización que se encuentran en la tabla 2-6, así como también se tomó en cuenta los mg de aceite por cada 100 gramos de muestra obtenidos de la etapa I para el cálculo del porcentaje de rendimiento.

3.5.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial.

En esta etapa se aplicó el método de microdilución en placa para obtener la concentración mínima inhibitoria, se realizó pruebas de solubilidad con tres solventes tales como etanol, Propilenglicol y glicerina, con el solvente de mejor solubilidad (etanol) se evaluó la actividad antibacteriana mediante el método de difusión en agar por perforación frente a dos cepas Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa, a 3 concentraciones de 1mg/ml, 20mg/ml y 50 mg/ml por lo que se hará uso de un diseño por bloques, en cada bloque se aplicó un diseño a x b (2x3) de análisis de varianza (ANOVA) que permitió evaluar la importancia de varios factores al comparar las medias de la variable de respuesta en los diferentes niveles de los factores.

3.5.3.1. Operacionalización de las Variables Etapa III.

Tabla 3-10 : Operacionalización de Variables Etapa III.

FACTOR O NIVELES INDICADOR (VARIABLE VARIABLE DEPENDIENTE) Tipo de cepa  Staphylococcus aureus  Pseudomonas Poder de inhibición bacteriano aeruginosa comparado con un control Concentración de  1mg/ml positivo (ceftriaxona). (Halo de aceite  20mg/ml inhibición en mm)  50mg/ml

3.5.3.2.Factores y dominio experimental de la etapa III.

Codificación factores (variable independiente)

 Tipo de cepa: FACTOR A

El tipo de cepa utilizado para la evaluación antibacteriana es:

 Staphylococcus aureus = S  Pseudomonas aeruginosa = Q

 Concentración de aceite: FACTOR B  Al 1mg/ml = H  Al 20mg/ml = I  Al 50mg/ml = J

Tabla 3-11: Factores y Niveles Experimentales de la etapa III.

FACTOR B

H I J 1mg/ml 20mg/ml 50mg/ml F A SHr1 SIr1 SJr1 C SHr SIr SJr T S. aureus (S) 2 2 2 O SHr3 SIr3 SJr3

R QHr1 QIr1 QJr1 A P. aeruginosa QHr2 QIr2 QJr2 (Q) QHr3 QIr3 QJr3

NOTA: Este diseño estadístico fue aplicado para cada microorganismo de prueba ATCC, siendo la variable respuesta la actividad antibacteriana mediante la medición del halo de inhibición después de 24 horas de incubación, mismo que se realizó 3 repeticiones y 6 tratamientos (2x3) (r).

De la misma manera se aplica para el aceite esencial extraído por Fluidos supercríticos.

3.5.3.3.Técnicas de análisis e interpretación de resultados

Para la recolección de datos en este estudio e interpretación de la actividad antibacteriana mediante la medición del halo de inhibición se realizó el análisis de varianza completamente al azar con 3 repeticiones, para ello se tomó en cuenta la tabla 3-11. (Porras, 2000)

Tabla 3-12: Tabla ANOVA para el modelo bifactorial con replicación.

F.V. S.C. G.L. C.M. Fexp Factor A SCA a - 1 CMA CMA/CMR Factor B SCB b - 1 CMB CMB/CMR Interacción SC(AB) (a - 1) ( b – 1) CM(AB) CM(AB)/CMR Residual SCR ab (r – 1) CMR TOTAL SCT abr - 1 CMT

Fuente: (Porras, 2000)

Hipótesis general: La hipótesis nula establece que todas las medias de la población (medias de los niveles de los factores) son iguales, mientras que la hipótesis alternativa establece que al menos una es diferente.

Hipótesis nula: HO: U1 = U2 = U3 = U4 =

Hipótesis alternativa: Hi: U1 ≠ U2 ≠ U3 ≠ U4 ≠

Hipótesis de estudio en cada factor

- Para el factor A (Tipo de cepa):

퐻o: 퐸푓푒푐푡표 퐴 = 0

퐻1: 퐸푓푒푐푡표 퐴 ≠ 0

퐻o: El tipo de cepa no ejerce ningún tipo de actividad antibacteriana (halo de inhibición).

퐻1: El tipo de cepa ejerce actividad antibacteriana (halo de inhibición).

- Para el factor B (Concentración de aceite)

퐻o: 퐸푓푒푐푡표 퐵 = 0

퐻1: 퐸푓푒푐푡표 퐵 ≠ 0

퐻o: La concentración del aceite no influye en la actividad antibacteriana (halo de inhibición).

퐻1: La concentración del aceite influye en la actividad antibacteriana (halo de inhibición).

- Para la interacción AB (Tipo de cepa - Concentración de aceite):

퐻o: 퐸푓푒푐푡표 퐴퐵 = 0

퐻1: 퐸푓푒푐푡표 퐴퐵 ≠ 0

퐻o: No hay interacción entre los factores A y B.

퐻1: Hay interacción entre los factores A y B.

3.5.4. Etapa IV: Evaluación actividad antioxidante del aceite

Se realizó mediante el método del radical DPPH teniendo como variable independiente la muestra de análisis y como variable respuesta la actividad antioxidante (porcentaje de inhibición frente al radical DPPH), para ello se optó por el diseño por bloques en el cual se realizó una comparación entre los porcentajes de inhibición del radical libre del aceite (dos muestras de aceite por el diferente método de extracción) y el estándar de referencia utilizado como es el Trolox mediante el diseño de varianza univariante.

3.5.4.1. Operacionalización de las Variables Etapa IV

Tabla 3-13: Operacionalización de Variables Etapa IV.

FACTOR O NIVELES INDICADOR (VARIABLE VARIABLE DEPENDIENTE)  Aceite esencial obtenido FUENTE DE por Hidrodestilación Porcentaje de inhibición frente al ACTIVIDAD  Aceite esencial obtenido radical DPPH ANTIOXIDANTE por fluidos supercríticos  Estándar de referencia trolox

3.5.4.2. Factores y dominio experimental de la etapa IV.

Codificación factor (variable independiente)

 Fuente de actividad antioxidante: FACTOR A

La fuente de actividad antioxidante comparativa es:

 Aceite obtenido por Hidrodestilación = M  Aceite obtenido por fluidos supercríticos = N  Estándar de referencia trolox = O

Tabla 3-14. Factores y Niveles Experimentales de la etapa IV

CODIFICACIÓN

Fuente de variación Aceite de Aceite de Estándar de referencia fluidos Hidrodestilación trolox supercríticos

 Comparación M N O

Tabla 3-15: Tabla para recolección de datos de la etapa IV.

ACEITE ESENCIAL ESTÁNDAR DE (Hidrodestilación / Fluidos REFERENCIA Trolox (% de supercríticos) (% de inhibición inhibición de radicales) de radicales)

Volumen Repeticiones Media Volumen Repeticiones Media (uL) (uL) Curva de Blanco 1 2 3 - Blanco 1 2 3 - calibración en 25 - - - - 25 - - - - Hidrodestilación 75 - - - - 75 - - - - 100 - - - - 100 - - - - 150 - - - - 150 - - - -

Se realizó cada tratamiento por triplicado y se aplica un diseño univariante que compara la actividad antioxidante de los aceites esenciales obtenidos frente a un estándar de referencia (trolox).

3.5.4.3.Técnicas de análisis e interpretación de resultados

Se realizó un análisis de variación unifactorial con un nivel de confianza del 95%.

Tabla 3-16: Modelo univariante

F.V. S.C. G.L. C.M. Fexp Factor A SCA a - 1 CMA CMA/CMR Residual SCR ab (r – 1) CMR TOTAL SCT abr - 1 CMT

La hipótesis nula establece que no hay diferencia significativa entre las fuentes de actividad antioxidante (aceite esencial obtenido de Hidrodestilación y Fluidos supercríticos) y el estándar (trolox), mientras que la hipótesis alternativa establece que si hay diferencia significativa.

Hipótesis nula: HO: U1 = U2 = U3

Hipótesis alternativa: Hi: U1 ≠ U2 ≠ U3

3.6. Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos (IRD).

Para la recolección de datos se usará la técnica de observación, mediante el instrumento de guía de observación del anexo D.

Técnica de observación: Implica principalmente establecer la relación de una señal emitida por un instrumento utilizado durante la experimentación.

Capítulo IV

4. Análisis y discusión de resultados

El análisis de los resultados obtenidos se realiza en cada etapa desde el control de calidad de la materia prima (tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus).

Además, los datos obtenidos se describieron y analizaron con el uso del software especializado IBM® SPSS® Statistics versión 20.

4.1. Etapa I: Extracción del aceite esencial

4.1.1. Control de calidad de la materia prima

En la tabla 4-1 se observan los resultados de los parámetros de control de calidad de la materia prima entre ellos la descripción macroscópica, microscópica, humedad y cenizas totales planteados en la metodología MGA-FH 0040 de la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos.

Tabla 4-1: Parámetros de control de calidad de la materia prima del tronco y corteza de Handroanthus crysanthus

DEFINICIÓN Consiste en la corteza seca de las ramas jóvenes. Descripción La corteza tiene un grosor aproximado de macroscópica 0,5 mm a 0,8 mm y se presenta en capas muy finas pegadas. La cara externa con leves cicatrices que señalan presencia de yemas axilares, presentan estrías longitudinales algo blanquecinas y sinuosas. La cara interna amarillenta lisa,

fractura limpia y fibrosa con olor característico a madera. Descripción Polvo de color amarillento o pardo. Al microscópica examinar al microscopio con glicerol al

50% se observó fibras incoloras y paredes ligeramente punteadas. Humedad 35,06 + 35,62 + 35,03 =

35,24%

Cenizas 0,51 + 1,10 + 1,21 = totales 0,94%

Fuente: (Farmacopea, 2013)

Según los parámetros establecidos en la Farmacopea herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos para la corteza de canela (tabla 3-4), que es la que se tomó como referencia ya que para el tronco y corteza de Handrohanthus chrysanthus aún no se establecen, cumplen dichos requisitos excepto la humedad ya que este parámetro fue adicional para determinar la humedad (35,24%) de la muestra ya que se encontraba fresca, sin embargo la temperatura en el método utilizado podría interferir debido a que en la humedad determinada puede estar el aceite esencial.

4.1.2. Extracción por Hidrodestilación

La masa del aceite esencial obtenida por Hidrodestilación reflejada en la tabla 4- 2, a diferente tamaño 0,5 mm y 2 mm tiene una notoria diferencia en contenido por cada 100 gramos de muestra, dando como mejor rendimiento con el tamaño 0,5 mm.

Tabla 4-2: Miligramos de aceite esencial extraído por Hidrodestilación

Aceite esencial extraído por Hidrodestilación Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm (mg/100g de muestra) (mg/100g de muestra) H1 30,0 F1 24,0 H2 33,0 F2 23,0 H3 37,0 F3 15,0 H4 27,0 F4 22,0 H5 46,0 F5 25,0 푯̅ 34,6 푭̅ 21,8 DESV. 7,37 DESV. 3,96 S. S.

El análisis estadístico realizado con un nivel de confianza del 95%, indica lo siguiente:

 Son muestras en las cuales su contenido de aceite tiene homogeneidad de varianzas según la prueba de Levene (F = 1,730; p > 0,05)  La prueba t para muestras independientes indica que si hay diferencia estadística significativa entre el contenido de aceite obtenido por cada tamaño de partícula (t = 3,421; gl = 8; p < 0,05)

El contenido de aceite esencial obtenido se ve influenciado por el tamaño de partícula como se observa en el gráfico 4.1, con el tamaño 0,5 mm se obtiene un mejor rendimiento, pero con una dispersión del contenido muy alto, mientras que con el tamaño 2 mm disminuye el rendimiento, pero aumenta su homogeneidad, dicha influencia según Navarro F y Costa J, (1993) se debe a que al disminuir el tamaño de partícula aumenta la superficie de contacto del solvente y la fase sólida.

Gráfico 4.1: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial extraído por hidrodestilación con los dos tamaños de partícula.

4.1.3. Extracción con Fluidos supercríticos

La masa del aceite obtenida por Fluidos supercríticos en el cual se utilizó como solvente CO2 a diferente tamaño 0,5 mm y 2 mm se ve reflejada en la tabla 4-3 donde se observa la diferencia en contenido por cada 100 gramos de muestra, dando como mejor rendimiento con el tamaño 0,5 mm.

Tabla 4-3: Miligramos de aceite esencial extraído con fluidos supercríticos.

Aceite esencial extraído con fluidos supercríticos Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm (mg/100g de muestra) (mg/100g de muestra) H1 84,8 F1 67,4 H2 81,0 F2 60,4 H3 91,2 F3 50,1 H4 83,4 F4 90,2 H5 100,3 F5 65,2 푯̅ 88,14 푭̅ 66,66 DESV. 7,78 DESV. 14,75 S. S.

El análisis estadístico realizado con un nivel de confianza del 95%, indica lo siguiente:

 Son muestras en las cuales su contenido de aceite tiene homogeneidad de varianzas según la prueba de Levene (F = 0,577; p > 0,05)  La prueba t para muestras independientes indica que si hay diferencia estadística significativa entre el contenido de aceite obtenido por cada tamaño de partícula (t = 2,881; gl = 8; p < 0,05)

Al igual que el contenido de aceite esencial obtenido por hidrodestilación se ve influenciado por el tamaño de partícula en cuanto al aumento de superficie de contacto en el sistema de extracción como se observa en el gráfico 4.2, sin embargo, con el tamaño 0,5 mm se obtiene un mejor rendimiento y aumenta su homogeneidad, mientras que con el tamaño 2 mm disminuye el rendimiento y presenta mayor dispersión de contenido, lo que indica que el método de extracción por fluidos supercríticos es más viable de aplicación.

Gráfico 4.2: Barras de error de medias obtenidas del contenido de aceite esencial extraído con fluidos supercríticos con los dos tamaños de partícula.

4.2. Etapa II: Caracterización del aceite esencial

4.2.1. Porcentaje de rendimiento

Con los datos obtenidos en la etapa I y mediante el uso de la ecuación 3.1 se obtuvieron los siguientes resultados de porcentaje de rendimiento (tabla 4-4).

Tabla 4-4: Porcentaje de rendimiento de las muestras de aceite esencial

Aceite esencial extraído por Hidrodestilación Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm (% de rendimiento) (% de rendimiento) H1 0,03 F1 0,02 H2 0,03 F2 0,02 H3 0,04 F3 0,01 H4 0,03 F4 0,02 H5 0,05 F5 0,02 푯̅ 0,036 푭̅ 0,018 Aceite esencial extraído por Fluidos supercríticos Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm (% de rendimiento) (% de rendimiento) H1 0,08 F1 0,07 H2 0,08 F2 0,06 H3 0,09 F3 0,05 H4 0,08 F4 0,09 H5 0,10 F5 0,06 푯̅ 0,086 푭̅ 0,066

Las medias de los porcentajes de rendimiento de los aceites esenciales obtenidos por los métodos de hidrodestilación y fluidos supercríticos se encuentran en el rango de aceites extraídos de 0,01-6 %, como Stashenko (2009) lo menciona en su trabajo de investigación, sin embargo en la tabla 4-4 se observa que por el método de fluidos supercríticos y al disminuir el tamaño de partícula el porcentaje de rendimiento aumenta

64 debido a que mejora la superficie de contacto en el sistema de extracción como lo indican Navarro F y Costa J (1993).

4.2.2. Características organolépticas

Se realizó al finalizar la extracción tanto por Hidrodestilación como por fluidos supercríticos, y los datos obtenidos se observan en las tablas 4-5 y 4-6.

Tabla 4-5: Características organolépticas del aceite esencial extraído por hidrodestilación.

Aceite extraído por Hidrodestilación Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm Color Olor Textura Color Olor Textura H1 Incoloro madera aceitosa F1 Incoloro madera aceitosa H2 Incoloro madera aceitosa F2 Incoloro madera aceitosa H3 Incoloro madera aceitosa F3 Incoloro madera aceitosa H4 Incoloro madera aceitosa F4 Incoloro madera aceitosa H5 incoloro madera aceitosa F5 incoloro madera aceitosa

Tabla 4-6: Características organolépticas del aceite esencial extraído por fluidos supercríticos

Aceite extraído con Fluidos supercríticos Tamaño de partícula 0,5mm Tamaño de partícula 2,0mm Color Olor Textura Color Olor Textura D1 anaranjado madera viscosa C1 anaranjado madera viscosa D2 anaranjado madera viscosa C2 anaranjado madera viscosa D3 anaranjado madera viscosa C3 anaranjado madera viscosa D4 anaranjado madera viscosa C4 anaranjado madera viscosa D5 anaranjado madera viscosa C5 anaranjado madera viscosa

Como se observa en la tabla 4-5 los aceites obtenidos por hidrodestilación, en los diferentes tamaños de partícula, son incoloros y tienen las mismas características en olor y textura, mientras que estos difieren de los aceites obtenidos con fluidos supercríticos (tabla 4-6), ya que en ellos aumentan la viscosidad y adquieren un color anaranjado. En

65 la extracción con fluidos supercríticos el aceite extraído viene acompañado de cera y otros compuestos de alto peso molecular según lo explican Peredo y Col. (2009), sin embargo, a pesar de esas diferencias tienen una característica en común como es el olor fuerte a madera húmeda que es característico en aceites extraídos de troncos y cortezas.

4.2.3. Características físico-químicas

Se realizó tomando una muestra al azar de cada tamaño de partícula en cada método de extracción.

Índice de refracción

Con las muestras escogidas se procedió a determinar el índice de refracción en un refractómetro de ABBÉ obteniendo los resultados de la tabla 4-7.

Tabla 4-7: Determinación del índice de refracción

Hidrodestilación Fluidos (N) supercríticos (N) Tamaño 0,5 mm 1,431 0,5 mm 1,470 partícula 2,0 mm 1,424 2,0 mm 1,464

Los índices de refracción obtenidos tienen una similitud entre los métodos de extracción, sin embargo, no todos se encuentran en el rango de índice de refracción para aceites y grasas que es de 1,440-1,480 indicado por Medina G, (2016).

4.3.2.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

Se realizó el perfil cromatográfico en 2 muestras diferentes de aceite esencial obtenidos por cada método de extracción (véase anexo H), en las cuales se logró separar los compuestos constituyentes del aceite esencial.

Tabla 4-8: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por hidrodestilación

Comp Aceite esencial obtenido por hidrodestilación . Tamaño de partícula 0,5 mm N° Tiempo Proba- Nombre Estructura retención bilidad , min , % 1 18,78 10,8 1-Bromo-3-(2- Bromoetil) nonano,

C11H22Br2

2 19,73 75,2 2,6-Di-terc-butil-4-

metilfenol, C15H24O

3 21,22 81,1 Ftalato de dietilo

C12H14O4

4 23,53 10,9 Decano,5,6-bis (2,2dimetilpropilideno

)-,(5E, 6Z)-, C20H38

5 29,71 85,2 Palmitato de etilo,

C18H36O2

6 32,79 31,1 Oleato de etilo,

C20H38O2

7 36,55 97,2 2,2'-Metilenobis (6- tert-butil-4 metilfenol),

C23H32O2

Comp Tamaño de partícula 2,0 mm . Tiempo Proba- Nombre estructura N° retención bilidad , min , % 1 21,23 79,8 Ftalato de dietilo

C12H14O4

2 23,53 11,5 Decano,5,6-bis (2,2dimetilpropilideno

)-,(5E, 6Z)-, C20H38

3 32,78 32,5 Oleato de etilo,

C20H38O2

4 36,56 98,0 2,2'-Metilenobis (6- tert-butil-4 metilfenol),

C23H32O2

En la tabla 4-8 se observan los resultados obtenidos por CG-EM, que muestran la relación de los compuestos separados e identificados. En la muestra de aceite del tamaño de partícula de 0,5 mm, se observa una mayor cantidad de compuestos separados en comparación con la del tamaño de partícula 2 mm. Sin embargo, existe concordancia en el tiempo de retención y en la probabilidad entre 4 compuestos que se obtienen en ambas muestras.

Entre los compuestos identificados se encuentra un terpeno (decano,5,6-bis (2,2dimetilpropilideno)-,(5E, 6Z)-); se sabe que los terpenos han mostrado actividad biológica, sin embargo no se ha evidenciado actividad en este terpeno específico. (Masahisa D, 2002)

Además, es importante resaltar que la manipulación y el almacenamiento de los aceites esenciales juegan un papel importante en su análisis puesto que por la estabilidad térmica de los constituyentes químicos volátiles pueden disminuir su detección. (Navarrete C, 2010)

Tabla 4-9: Compuestos determinados por CG-EM en el aceite esencial extraído por fluidos supercríticos

Comp Aceite esencial obtenido por fluidos supercríticos . Tamaño de partícula 0,5 mm N° Tiempo Proba- Nombre Estructura retención bilidad , min , % 1 21,23 79,8 Ftalato de dietilo

C12H14O4

2 23,48 17,5 Decano,5,6-bis (2,2dimetilpropilideno

)-,(5E, 6Z)-, C20H38

3 29,73 91,4 Palmitato de etilo,

C18H36O2

4 32,65 55,3 Éster etílico del ácido

linoleico, C20H36O2

5 32,85 28,9 Oleato de etilo,

C20H38O2

6 33,32 81,3 Estearato de etilo,

C20H40O2

7 47,80 64,5 Stigmasterol, C29H48O

8 48,59 77,9 gamma-sitosterol,

C23H32O2

9 50,0 78,4 gamma-sitostenona,

C29H48O

Comp Tamaño de partícula 2,0 mm . Tiempo Proba- Nombre estructura N° retención bilidad , min , % 1 21,29 24,6 Methyl12,14- dihomojuvenate,

C18H30O3

2 23,53 14,2 Decano,5,6-bis (2,2dimetilpropilideno

)-,(5E, 6Z)-, C20H38

3 29,76 91,3 Palmitato de etilo,

C18H36O2

4 32,84 29,1 Oleato de etilo,

C20H38O2

5 32,84 28,0 Éster etílico del ácido

elaidico, C20H38O2

6 36,6 71,5 Adipato de bis (2-

etilhexilo), C22H42O4

7 42,86 63,0 Stigmasterol, C29H48O

8 48,63 73,6 gamma-sitosterol,

C23H32O2

9 49,99 71,9 gamma-sitostenona,

C29H48O

Los resultados obtenidos por fluidos supercríticos (tabla 4-9), muestran una mayor cantidad de compuestos en comparación con los obtenidos por hidrodestilación. Sin embargo, hay coincidencia con los compuestos en el tiempo de retención bajo (por debajo de los 40 min). Los compuestos obtenidos a tiempo de retención mayores constituyen esteroles; entre los compuestos identificados se encuentra el stigmasterol, el cual en estudios reportados por Rdnattural, (2013) indica que puede usarse para reducir el colesterol y actúa como antioxidante.

Se conoce que ciertos compuestos de tipo esteroles son fotosensibles (Martínez A, 2002). Esto podría justificar porque no se obtuvieron en los aceites obtenidos por hidrodestilación ya que éste método además de utilizar altas temperaturas el equipo utilizado no fue protegido de la luz, en comparación con el equipo de fluidos supercríticos que es cerrado y hermético.

4.3. Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana del aceite

Concentración Mínima inhibitoria (CMI)

Una vez que se realizó la solubilidad de los aceites en etanol, Propilenglicol y glicerina se determinó que el etanol fue el mejor disolvente.

Los aceites esenciales obtenidos por los diferentes métodos de extracción fueron evaluados en un rango de concentraciones de 100mg/ml – 0,19mg/ml, la evaluación se realizó visualmente, estos resultados se utilizaron para la selección de las concentraciones en el método de difusión por perforación, los resultados se presentan en la tabla 4-10.

Tabla 4-10: Concentración mínima inhibitoria de los aceites esenciales

Aceite esencial CMI Staphylococssus aureus Pseudomonas aeruginosa Hidrodestilación 25 mg/ml --- Fluidos supercríticos 12,5 mg/ml 50mg/ml

Con los resultados establecidos se determinaron las 3 concentraciones que se evaluaron en el método de difusión en agar por perforación las cuales son 1 mg/ml, 20 mg/ml y 50 mg/ml, la menor concentración se estableció mediante el control positivo que se utilizó que fue la ceftriaxona a 1mg/ml.

Como se observa en la tabla 4-10 con la cepa Pseudomonas aeruginosa no se pudo evidenciar visualmente la concentración mínima inhibitoria con lo cual ya se predice la inexistencia de actividad antimicrobiana con el aceite obtenido por hidrodestilación.

4.3.1. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por Hidrodestilación

En la tabla 4-11 se evidencian los halos de inhibición obtenidos por el método de difusión en agar por perforación frente a dos cepas bacterianas entre ellas Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.

Tabla 4-11: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido por Hidrodestilación

FACTOR B

H I J 1mg/ml 20mg/ml 50mg/ml F A 0 0 12 C 0 0 11 T S. aureus (S) 0 0 12 O 0 0 0

R 0 0 0 A P. aeruginosa 0 0 0 (Q)

Los resultados encontrados con el aceite esencial obtenido por hidrodestilación no arrojan actividad antibacteriana frente a la cepa Pseudomonas aeruginosa, mientras que la cepa Staphylococcus aureus presenta halos de inhibición a 50mg/ml de concentración, sin embargo, según el rango del criterio de interpretación de susceptibilidad antimicrobiana de la tabla 2-5 la actividad es intermedia.

Puesto que solo se evidencia actividad antibacteriana intermedia frente a Staphylococcus aureus no es necesario aplicar un análisis estadístico.

4.3.2. Evaluación de la actividad antibacteriana en el aceite obtenido por fluidos supercríticos

En la tabla 4-12 se evidencian los halos de inhibición obtenidos por el método de difusión en agar por perforación frente a las cepas bacterianas entre ellas Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa.

Tabla 4-12: Halos de inhibición del aceite esencial obtenido con Fluidos supercríticos

FACTOR B

H I J 1mg/ml 20mg/ml 50mg/ml F A 0 12 19 C 0 13 23 T S. aureus (S) 0 15 20 O 0 0 13

R 0 0 15 A P. aeruginosa 0 0 14 (Q)

En los resultados se evidencia los correspondientes halos de inhibición frente a cada cepa siendo la de Staphylococcus aureus la que mayor cantidad de halos se obtuvo, mientras que con Pseudomonas aeruginosa solo se observa a alta concentración y según los criterios de interpretación de la tabla 2-5 se obtiene lo siguiente:

 Staphylococcus aureus: a 1 mg/ml es resistente, 20mg/ml con una media de 13 es intermedia y a 50mg/ml con una media de 21 es sensible.  Pseudomonas aeruginosa: a 1 y 20 mg/ml es resistente y a 50mg/ml con una media de 14 es intermedia.

Análisis estadístico de actividad antibacteriana.

El análisis en esta etapa tuvo como finalidad la evaluación de la actividad antibacteriana con sus diferentes factores y niveles.

Tabla 4-13: Esquema de diseño experimental para comparación de factores

FACTOR A FACTOR B (Concentración de aceite)

H I J 1mg/ml 20mg/ml 50mg/ml

0,00 12,00 19,00 0,00 13,00 23,00 S. aureus (S) 0,00 15,00 20,00 Promedio 0,00 13,33 20,67 Desviación 0,00 1,53 2,08 estándar 0,00 0,00 13,00

0,00 0,00 15,00 P. aeruginosa 0,00 0,00 14,00 (Q) Promedio 0,00 0,00 14,00

Desviación 0,00 0,00 1,00 estándar

Para evaluar los efectos de los factores establecidos experimentalmente se usó el Software IBM SPSS Statistics, versión 20. El análisis entre las concentraciones y las cepas de prueba se realizó mediante un diseño A x B análisis de varianzas (ANOVA) de la siguiente forma:

 El factor A con 2 niveles (cepas bacterianas)  El factor B con 3 niveles (concentración del aceite)

Tabla 4-14: Análisis de varianza de dos factores

Origen de las Suma de g.l Promedio de F Sig. variaciones cuadrados los cuadrados Cepa bacteriana 200,000 1 200,000 156,522 0,000 Concentración 917,333 2 458,667 358,957 0,000 de aceite Interacción 133,333 2 66,667 52,174 0,000 Dentro del grupo 15,333 12 1,278

Total 2418,000 18

El análisis de varianza indica que existe un efecto estadísticamente influyente entre el factor A (cepas bacterianas) (F = 156,522; p < 0,05), también existe un efecto significativo entre el factor B (concentración de aceite) (F = 358,957; p < 0,05) y el efecto de la interacción de los factores es significativo (F = 52,174; p < 0,05).

Con el análisis estadístico de los efectos en cada factor es que se acepta la Hi de la hipótesis general que indica que existe una diferencia significativa en los grupos o factores (cepas bacterianas, concentración de aceite e interacciones) de estudio.

El análisis gráfico también permite observar lo siguiente:

En el gráfico de perfil 4.3 se evidencia la notable inhibición del aceite extraído por fluidos supercríticos frente a la cepa de Staphylococcus aureus mientras que para la cepa Pseudomonas aeruginosa no presenta inhibición.

Gráfico 4.3: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y las cepas bacterianas

En el grafico 4.4 se observa que a medida que la concentración de aceite aumenta la inhibición también lo que indica una relación proporcional

Gráfico 4.4: Gráfico de perfil entre las medias marginales de los halos de inhibición y las concentraciones

Finalmente, en el grafico 4.5 se evidencia que hay mayor inhibición con la cepa de Staphylococcus aureus puesto que a las dos concentraciones (20 y 50 mg/ml) presenta un halo, mientras que en la cepa de Pseudomonas aeruginosa solo se observa inhibición en su mayor concentración (50mg/ml) por lo que es evidente la sensibilidad frente a la primera cepa.

Gráfico 4.5: Gráfico de perfil entre el halo de inhibición frente a la cepa y la concentración

Como se observa tanto en el análisis estadístico como en los criterios de interpretación de la CLSI de la tabla 2-5 la cepa con mayor sensibilidad es la de Staphylococcus aureus a las concentraciones de 20 y 50 mg/ml, mientras que Pseudomonas aeruginosa en su alta concentración tiene inhibición intermedia.

De acuerdo a los resultados obtenidos en la identificación de los compuestos en los aceites se observa que el aceite obtenido por fluidos supercríticos es el que exhibe actividad antibacteriana, ésta actividad se podría atribuir a los esteroles identificados.

4.4. Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante del aceite.

Para la evaluación de la actividad antioxidante se procedió a utilizar el método DPPH presente en el trabajo de investigación de Coronel (2017) con algunas modificaciones.

4.4.1. Evaluación del porcentaje de inhibición en el estándar de referencia Trolox.

Condiciones espectrofotométricas

 El estándar para la calibración del método es el TROLOX (6-hydroxy- 2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid).  Solvente que se utilizó metanol.

Barrido espectrofotométrico

Se realizó la curva de calibración utilizando el trolox en una concentración de 0,09 mg/ml a un rango de longitud de onda de barrido de 400-600 nm, obteniendo la longitud de onda máxima de 517 nm (gráfico 4.6), que se encuentra en el rango de luz visible del espectro electromagnético.

Gráfico 4.6: Longitud de onda máxima para el estándar trolox

Con la longitud de onda máxima se procedió a realizar la curva de calibración obteniendo los datos de la tabla 4-15, misma que fue base para la aplicación de las muestras de aceite obtenidas por hidrodestilación y fluidos supercríticos.

Tabla 4-15: Datos de la curva de calibración con Trolox.

Volumen Absorbancias de muestras de Trolox (uL) trolox 1 2 3 Promedio 1 BLANCO 0,291 0,29 0,291 0,291 2 25 0,283 0,282 0,283 0,283 3 75 0,271 0,273 0,271 0,272 4 100 0,265 0,269 0,265 0,266 5 150 0,254 0,252 0,254 0,253

Se realizó el promedio de tres curvas de calibración con un alto coeficiente de correlación obteniendo un R2 de 0,9974 (gráfico 4.7).

0.285

0.280

0.275 y = -0,0002x + 0,289 0.270 R² = 0,9974

0.265 Absorbancia 0.260

0.255

0.250 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Volumen uL

Gráfico 4.7: Curva de calibración del estándar trolox

Relación lineal obtenida:

푨 = −ퟎ, ퟎퟎퟎퟐ 푽 + ퟎ, ퟐퟖퟗ

Donde:

 A: corresponde a la absorbancia medida a 517nm.  V: corresponde al volumen en uL de trolox.

Con los resultados de la tabla 4-15 se realizó el cálculo del porcentaje de inhibición mediante la ecuación 2.1.

Tabla 4-16: Resultados del % de inhibición con el trolox

Volumen trolox Absorbancia % Inhibición (uL) 0 Blanco 0,291 0 1 25 0,283 2,749 2 75 0,272 6,529 3 100 0,266 8,591 4 150 0,253 13,058

En la tabla 4-16 se observan que los porcentajes de inhibición son bajos debido a que la concentración de trolox es baja, con estos datos se realizó el gráfico 4.8

14.000

12.000 y = 0,0825x + 0,5155 R² = 0,9979 10.000

8.000

6.000

% Inhibición% 4.000

2.000

0.000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Volumen trolox uL

Gráfico 4.8: Porcentaje de inhibición vs Volumen del trolox uL

Relación lineal obtenida:

% 푰풏풉풊풃풊풄풊ó풏 = ퟎ, ퟎퟖퟐퟓ 푽 + ퟎ, ퟓퟏퟓퟓ

Mediante la relación lineal se obtiene el volumen necesario para una inhibición del 50% utilizando la concentración de 0,09 mg/ml.

50% − 0,5155 V = 0,0825

퐕 = ퟓퟗퟗ, ퟖퟏ 퐮퐋

4.4.2. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido por Hidrodestilación

Con la muestra de aceite extraída por hidrodestilación se obtuvo los datos de la tabla 4-17.

Tabla 4-17: Resultados de absorbancias del aceite obtenido por hidrodestilación

Volumen Absorbancias de obtenidas por muestra hidrodestilación (uL) 1 2 3 Promedio 1 BLANCO 0,271 0,271 0,284 0,275 2 25 0,263 0,27 0,266 0,266 3 75 0,252 0,265 0,251 0,256 4 100 0,238 0,264 0,248 0,250 5 150 0,234 0,252 0,235 0,240

Se realizó el promedio en las tres repeticiones y se utilizó para el cálculo del porcentaje de inhibición mediante el uso de la ecuación 2.1, así como también el factor de equivalencia a la concentración que se utilizó en el estándar de referencia.

Tabla 4-18: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido por Hidrodestilación

Volumen aceite hidrodestilación Absorbancia Factor % Inhibición (uL) 1 0 0,275 133,33 0 2 25 0,266 133,33 0,025 3 75 0,256 133,33 0,052 4 100 0,250 133,33 0,068 5 150 0,240 133,33 0,095

Con los datos obtenidos en la tabla 4-18 se realizó el gráfico 4.9

0.120

y = 0,0006x + 0,0101 0.100 R² = 0,9991

0.080

0.060

0.040 % Inhibición%

0.020

0.000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Volumen aceite uL

Gráfico 4.9: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL.

Relación lineal obtenida:

% 푰풏풉풊풃풊풄풊ó풏 = ퟎ, ퟎퟎퟎퟔ 푽 + ퟎ, ퟎퟏퟎퟏ

Mediante la relación lineal se obtiene el volumen del aceite esencial obtenido por hidrodestilación necesario para una inhibición del 50% utilizando la concentración de 0,09 mg/ml.

50% − 0,0101 V = 0,0006

퐕 = ퟖퟑퟑퟏퟔ, ퟓ 퐮퐋

Como se evidencia el volumen necesario de aceite esencial obtenido por hidrodestilación para llegar al 50% de inhibición, es alto en comparación con el volumen del estándar utilizado.

4.4.3. Evaluación del porcentaje de inhibición en el Aceite obtenido con Fluidos supercríticos

Con la muestra de aceite extraído por Fluidos supercríticos se obtuvo los datos de la tabla 4-19.

Tabla 4-19: Resultados de absorbancias del aceite obtenido con fluidos supercríticos

Volumen Absorbancias de muestras de muestra muestra por fluidos (uL) 1 2 3 Promedio 1 BLANCO 0,294 0,293 0,287 0,291 2 25 0,282 0,282 0,271 0,278 3 75 0,267 0,27 0,257 0,265 4 100 0,262 0,262 0,251 0,258 5 150 0,246 0,246 0,236 0,243

Se realizó el promedio en las tres repeticiones y se utilizó para el cálculo del porcentaje de inhibición mediante el use de la ecuación 2.1, así como también el factor de equivalencia a la concentración que se utilizó en el estándar de referencia.

Tabla 4-20: Resultados del porcentaje de inhibición del aceite obtenido con fluidos supercríticos

Volumen aceite Absorbancia Factor % Inhibición fluidos (uL) 1 0 0,291 55,6 0 2 25 0,278 55,6 0,080 3 75 0,265 55,6 0,161 4 100 0,258 55,6 0,204 5 150 0,243 55,6 0,297

Con los datos obtenidos en la tabla 4-20 se realizó el gráfico 4,10

0.350

0.300 y = 0,0017x + 0,034 R² = 0,9984 0.250

0.200

0.150

% Inhibición% 0.100

0.050

0.000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Volumen uL

Gráfico 4.10: Porcentaje de inhibición vs volumen de aceite uL

Relación lineal obtenida:

% 푰풏풉풊풃풊풄풊ó풏 = ퟎ, ퟎퟎퟏퟕ 푽 + ퟎ, ퟎퟑퟒ

Mediante la relación lineal se obtiene el volumen de aceite esencial obtenido por fluidos supercríticos necesario para una inhibición del 50% utilizando la concentración de 0,09 mg/ml.

50% − 0,034 V = 0,0017

퐕 = ퟐퟗퟑퟗퟏ, ퟕퟔ 퐮퐋

Como se evidencia el volumen necesario de aceite esencial obtenido por fluidos supercríticos para llegar al 50% de inhibición es alto en comparación con el volumen del estándar utilizado, sin embargo, es menor que el necesario con el aceite obtenido por hidrodestilación.

4.4.4. Comparación del estándar de referencia Trolox y los aceites.

En la tabla 4-21 mediante las relaciones lineales obtenidas de los gráficos 4.8; 4.9 y 4.10 se comparan los volúmenes necesarios para alcanzar el 50% de inhibición a una misma concentración.

Tabla 4-21: Comparación de concentraciones

Concen- %Inhibición Volumen Volumen b a tración antioxidante (uL) ml (mg/ml) Trolox 50 0,5155 0,0825 559,81 0,6 0,09 Aceite por 50 0,0101 0,0006 83316,50 83,3 0,09 hidrodestilación Aceite con fluidos 50 0,034 0,0017 29391,76 29,4 0,09 supercríticos

Existe una diferencia notable entre los volúmenes necesarios para llegar al 50% de inhibición, los cuales se evidencian en la tabla 4-21.

Con los datos tabulados en la tabla 4-22 se realizó el grafico 4.11 donde se observa el comportamiento de los aceites en comparación con el estándar trolox.

Tabla 4-22: Comparación de porcentajes de inhibición de los aceites y el estándar

N° Volumen Estándar Trolox Aceite Aceite (uL) Hidrodestilación Fluidos supercríticos 1 25 2,749 0,025 0,080 2 75 6,529 0,052 0,161 3 100 8,591 0,068 0,204 4 150 13,058 0,095 0,297

14.000

12.000

10.000

8.000

6.000

% Inhibición% 4.000

2.000

0.000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Volumen uL

Series1 Series2 Series3

Gráfico 4.11: Comparación entre el estándar trolox y los aceites obtenidos

En donde la serie 1 representa el estándar de referencia trolox, la serie 2 el aceite obtenido con fluidos supercríticos y la serie 3 el aceite obtenido por hidrodestilación, como se observa hay una diferencia altamente evidente entre el comportamiento antioxidante del trolox y los aceites, así como una mínima diferencia de inhibición entre los dos aceites, lo que indican que no funcionan como antioxidante.

4.4.5. Análisis estadístico de la actividad antioxidante

El análisis de la actividad antioxidante tuvo como finalidad evaluar el comportamiento de los aceites obtenidos por diferente método de extracción y el estándar de referencia trolox.

Tabla 4-23: Datos del porcentaje de inhibición de las fuentes de actividad antioxidante

N° Estándar de Aceite obtenido por Aceite obtenido por referencia trolox Hidrodestilación fluidos supercríticos 1 0,000 0,000 0,000 2 2,749 0,025 0,080 3 6,529 0,052 0,161 4 8,591 0,068 0,204 5 13,058 0,095 0,297 Promedio 6,185 0,048 0,148 Desviación 5,080 0,037 0,114 estándar

Para la comparación de los niveles del factor establecido experimentalmente se usó el Software IBM SPSS Statistics, versión 20. El análisis univariante se presenta de la siguiente forma:

 El factor A con 3 niveles (fuentes de actividad antioxidante)

Tabla 4-24: Análisis univariante

Origen de las Suma de g.l Promedio de F Sig. variaciones cuadrados los cuadrados Fuente de act. 123,545 2 61,773 7,178 0,009 antioxidante Error 103,268 12 8,606 Total 294,696 15

El análisis estadístico realizado con un nivel de confianza del 95%, indica que la variable dependiente (porcentaje de inhibición) presenta una diferencia significativa entre sus niveles (aceites de prueba y estándar trolox) (F = 7,178; p < 0,05), por lo que se acepta la Hi.

Mediante el gráfico de perfil de medias se observa claramente la diferencia evidente entre los aceites y el estándar de referencia trolox. (Gráfico 4.12)

Gráfico 4.12: Gráfico de perfil de medias marginales de los porcentajes de inhibición frente a los aceites y el estándar

Finalmente, en el diagrama de barras se evidencia el intervalo de porcentaje de inhibición de los aceites obtenidos en cada método de extracción y el estándar de referencia utilizado trolox.

Gráfico 4.13: Diagrama de barras de error del porcentaje de inhibición frente a los aceites y el estándar de referencia.

Al igual que en el gráfico de perfil se evidencia la diferencia del porcentaje de inhibición del estándar de referencia con los aceites obtenidos, así mismo se observa la baja diferencia de porcentaje de inhibición entre los aceites de prueba, siendo el aceite obtenido por fluidos supercríticos con mayor porcentaje lo cual podría deberse a que en su composición mediante la cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas se detectó el stigmasterol, compuesto que según Panda S y otros (2008) en investigaciones relacionadas sirve como antioxidante, sin embargo ninguno de los aceites presenta actividad antioxidante representativa relacionándolo con el estándar de referencia trolox.

Capítulo V

5. Conclusiones y Recomendaciones

5.1. Conclusiones

 El aceite esencial extraído por fluidos supercríticos presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus (ATCC 25923) a una concentración de 50mg/ml, por otra parte, los aceites esenciales extraídos por hidrodestilación y fluidos supercríticos no presentaron actividad antioxidante representativa.

 Al realizar el control de calidad de la materia prima (tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus) se encontró que cumple con los parámetros establecidos de la muestra tomada como referencia (corteza de canela) según la farmacopea herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos (tabla 4-1), además presenta 35,24% de humedad.

 Se extrajo el aceite esencial del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus mediante dos métodos de extracción, obteniéndose los resultados por cada 100 gramos de muestra, en hidrodestilación 34,6±7,4 mg con 0,5 mm de tamaño de partícula y 21,8± 3,9 mg con 2,0 mm de tamaño de partícula y por fluidos supercríticos 88,1± 7,8 mg con 0,5 mm de tamaño de partícula y 66,7± 14,7 mg con 2,0 mm de tamaño de partícula.

 Se realizó la caracterización de los aceites esenciales obtenidos por ambos métodos, tanto las características organolépticas (tablas 4-5 y 4-6) como las físico- químicas y mediante cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas donde se evidenció la presencia de esteroles (stigmasterol y sitosterol) solo en el aceite esencial extraído por fluidos supercríticos.

 La concentración mínima inhibitoria del aceite esencial extraído por hidrodestilación fue de 25mg/ml frente a Staphylococcus aureus, mientras que frente a Pseudomonas aeruginosa no presentó concentración mínima inhibitoria,

y para el aceite esencial extraído por fluidos supercríticos fue de 12,5 mg/ml frente a Staphylococcus aureus y 50 mg/ml frente a Pseudomonas aeruginosa.

 En el aceite esencial extraído por hidrodestilación, según los criterios de interpretación de la CLSI (tabla 2-7) se evidencia que frente a Staphylococcus aureus (a 50 mg/ml) presenta actividad intermedia, mientras que frente a Pseudomonas aeruginosa presenta resistencia, por otro lado el aceite esencial extraído por fluidos supercríticos frente a Staphylococcus aureus (a 50 mg/ml) presenta sensibilidad y (a 20mg/ml) actividad intermedia y frente a Pseudomonas aeruginosa (a 50 mg/ml) presenta actividad intermedia.

 Se determinó mediante el método 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) que, a una concentración de 0,09mg/ml del estándar de referencia trolox (antioxidante) se necesita 0,6 ml para inhibir el 50%, mientras que para el aceite extraído por hidrodestilación a la misma concentración necesita 83,3 ml y para el aceite extraído por fluidos supercríticos 29,4 ml.

5.2. Recomendaciones

 Utilizar como método de extracción de aceites esenciales el método de fluidos supercríticos.  Ampliar la aplicación del aceite esencial extraído por fluidos supercríticos como tensoactivo o para la formulación de productos de uso tópico.  Realizar un estudio del aceite esencial extrayendo de otra parte de la especie Handroanthus chrysanthus como las hojas o flores o especie del mismo género.  Ampliar la investigación sobre los esteroles como el stigmasterol para futuros fines en tratamientos del colesterol.  Evaluar otro tipo de propiedad fitoterapéutica como la actividad antiinflamatoria en el aceite esencial obtenido por fluidos supercríticos.

6. Referencias

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100

7. Anexos

Anexo A: Árbol de problemas

101

Anexo B: Diagrama de flujo para la metodología realizada

102

103

Anexo C: Categorización de variables

Farmacognosia

Productos naturales

Aceite esencial de tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus

Definición: aceite Presencia y distribución Rendimiento Propiedades físicas y esencial en la naturaleza química Metabolitos primarios y secundarios

Propiedades Fitoterapéuticas Métodos de extracción

Actividad antibacteriana Actividad antioxidante Parámetros de caracterización de aceites esenciales

Técnicas de evaluación

104

Anexo D: Matriz de Operacionalización de Variables

OBJETIVO GENERAL EVALUAR LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y ANTIOXIDANTE DEL ACEITE ESENCIAL EXTRAÍDO DEL TRONCO Y CORTEZA DE HANDROANTHUS CHRYSANTHUS. ETAPAS DE ANÁLISIS OBJETIVO ESPECÍFICO 1: Realizar un estudio de parámetros de calidad de la materia prima. OBJETIVO ESPECÍFICO 2: Extraer el aceite esencial del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus mediante hidrodestilación y fluidos supercríticos. FACTOR O VARIABLE DIMENSIÓN NIVEL INDICADOR

Sistemas de extracción  Hidrodestilación MÉTODO DE EXTRACCIÓN (solido-líquido)  Fluidos supercríticos

Diferenciación de tamaños Unidades de medida mm Rendimiento de extracción (mg de aceite por TAMAÑO DE PARTÍCULA por superficie activa para  0,5 cada 100 g de muestra) extracción (tamizaje).  2,0

OBJETIVO ESPECÍFICO 4: Evaluar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus presenta actividad antibacteriana.  Staphylococcus

aureus Diferenciación de TIPO DE CEPA  Pseudomonas actividades y aplicación aeruginosa Poder de inhibición bacteriano comparado con Unidades de medida: CONCENTRACIÓN DE Grado de eficacia patrón de actividad estándar (Halo de inhibición  1 mg/ml ACEITE comparativa en mm)  20 mg/ml

105

 50 mg/ml

OBJETIVO ESPECÍFICO 5: Determinar si el aceite esencial extraído del tronco y corteza de Handroanthus chrysanthus presenta actividad antioxidante.  Aceite esencial obtenido por Hidrodestilación FUENTE DE ACTIVIDAD Grado de eficacia  Aceite esencial ANTIOXIDANTE comparativa obtenido por fluidos Porcentaje de inhibición frente al radical DPPH. supercriticos  Estándar de referencia Trolox OBJETIVO ESPECÍFICO 3: Caracterizar calidad y rendimiento de los aceites esenciales extraídos por hidrodestilación y fluidos supercríticos. PARÁMETROS DE ANÁLISIS DE CARACTERIZACIÓN DE ACEITE ESENCIAL CARACTERÍSTICAS Parámetros  Color CARACTERÍSTICAS ORGANOLÉPTICAS  Olor  Textura  Índice de refracción ENSAYOS FÍSICOS-QUÍMICOS  CG-EM

106

Anexo E: Instrumento de recolección de datos

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS GUÍA DE OBSERVACIÓN

PROYECTO: Actividad antibacteriana y antioxidante del aceite esencial extraído del tronco y corteza de la especie Handroanthus chrysanthus (Guayacán).

Objetivo: Obtener datos para la posterior evaluación de efectos y estadísticas relacionadas con las variables propuestas.

FECHA DE

ESTUDIO Nombre de

investigador MUESTRA Parte de la muestra TRATAMIENTO CONDICIONES DE EXTRACCIÓN Tamaño de partícula 0,5 mm 2 mm Hidrodestilación Extracción FSC Hidrodestilación Extracción FSC Peso de la muestra Fracciones de muestra Masa de aceite (mg) Concentración

(mg/ml) Porcentaje de rendimiento (%) CONTROL DE CALIDAD

Color Olor

Textura

Índice de refracción

CG-EM EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES EN ACEITE (Tamaño ___) Prueba de solubilidad (Et, Prop o Glic) y determinar CMI:

Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Actividad antibacteriana (Halo de inhibición en mm) 1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml 1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml Et, Prop o Glic.

107

Actividad antioxidante (% de inhibición frente al radical DPPH) MUESTRA DE ACEITE ESENCIAL FÁRMACO DE REFERENCIA Trolox ( Hidrodestilación) (Absorbancias) (Absorbancias)

V Repeticiones Media V Repeticiones Media (uL) (uL) Curva de V1 V1 calibración V2 V2 V3 V3 V4 V4 V5 V5 EVALUACIÓN DE ACTIVIDADES DE EXTRACTO TAMAÑO (___) Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Actividad antibacteriana (Halo de inhibición en mm) 1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml 1 mg/ml 20 mg/ml 50 mg/ml Et, Prop o Glic.

Actividad antioxidante (% de inhibición frente al radical DPPH) MUESTRA DE ACEITE ESENCIAL FÁRMACO DE REFERENCIA Trolox (Fluidos supercríticos) (Absorbancias) (Absorbancias)

V(uL) Repeticiones Media V(uL) Repeticiones Media Curva de V1 V1 calibración V2 V2 V3 V3 V4 V4 V5 V5 Parámetros de calidad de materia prima Definición Descrip. microscopica Descrip. macroscopica Humedad Cenizas totales

Otras observaciones:______

108

Anexo F: Autorización de propiedad de la muestra

109

Anexo G: Certificación de la muestra

110

Anexo H: Perfiles cromatograficos de las muestras de aceite

Gráfico 7.1: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por hidrodestilación

Gráfico 7.2: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por hidrodestilación

111

Gráfico 7.3: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 0,5 mm por fluidos supercríticos

Gráfico 7.4: Perfil cromatográfico del aceite esencial con tamaño 2,0 mm por fluidos supercríticos

112

Anexo I: Certificados de los reactivos utilizados.

Gráfico 7.5: Certificado del reactivo estándar Trolox.

Gráfico 7.6: Certificado del reactivo DPPH

113

Anexo J: Figuras de la experimentación por etapas

 Etapa I: extracción de los aceites.

Figura 7.1: Aceites extraídos por los dos métodos

 Etapa II: Caracterización de los aceites

Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-EM)

Figura 7.2: Equipo de CG-EM

 Etapa III: Evaluación de la actividad antibacteriana

Figura 7.3: Solubilidad del aceite obtenido por fluído y Microdilución en placa

114

Figura 7.4: Halos de inhibición medidos frente a S. aureus y P. aeruginosa

 Etapa IV: Evaluación de la actividad antioxidante

Figura 7.5: Preparación de diluciones del estándar y aceites

Figura 7.6: Agitación de los tubos y lectura de las absorbancias

115