ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «IATPIKH XHMEIA: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων»

Διερεύνηση της επίδρασης του εκχυλίσματος κρόκου στην αύξηση των εντομοπαθογόνων μυκήτων με την μέθοδο των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων και στην αποτελεσματικότητα τους επί των προνυμφών του εντόμου Sesamia nonangrioides.

Σπυρίδων Δ. Μαντζούκας Γεωπόνος (Τ.Ε) Μ.Sc Αγροχημεία και Βιολογικές Καλλιέργειες

ΠΑΤΡΑ 2012

University of Patras Medicinal Chemistry: Design and Development of Medicinal Products

The effect of saffron extract at the growth of entomopathogenic fungi in semi selective substrates and at the efficacy of entomopathogenic fungi on larvae of the

insect S. nonangrioides.

Spiridon D. Mantzoukas Master thesis

Patra, 2012

Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής

Ειρήνη Καραναστάση Κωνσταντίνος Πουλάς

Επίκουρη Καθηγήτρια Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα ΘΕ.Κ.Α. Τμήμα Φαρμακευτικής

Επιβλέπων Καθηγήτρια

Φωτεινή Λάμαρη

Επίκουρος Καθηγήτρια Τμήμα Φαρμακευτικής

Accepted on the recommendation of As. Prof. F. Lamari examiner As. Prof E. Karanastasi co-examiner As. Prof. K. Poulas co-examiner

The only real valuable thing is intuition. Albert Einstein (1879 – 1955)

Περιεχόμενα

Πρόλογος (Ευχαριστίες) i Περίληψη ii Abstract iv 1.Εισαγωγή 1 1.1.Crocus Sativus 3 1.1. Ιδιότητες του Κρόκου

1.2.Η Ολοκληρωμένη Αντιμετώπιση 4 1.3. Η Βιολογική Αντιμετώπιση των Εντόμων 5 1.3.1. Φυσικοί εχθροί των επιβλαβών εντόμων 6 1.3.2. Εντομοπαθογόνοι ιοί 9 1.3.3. Εντομοπαθογόνα βακτήρια 12 1.3.4. Εντομοπαθογόνοι νηματώδεις 18 1.3.5. Εντομοπαθογόνα πρωτόζωα 20 1.3.6. Εντομοπαθογόνοι μύκητες 22 1.3.6.1. Γενικά 22 1.3.6.2. Σπόρια 25 1.3.6.3. Προσκόλληση – Βλάστηση - Διείσδυση 26 1.3.6.4. Αναγνώριση Ξενιστή – Πορεία της μόλυνσης 29 1.3.6.5. Εμπορικά μικροβιακά σκευάσματα με βάση μύκητες 31 1.3.6.6. Παράγωγα μυκύτων –μυκοτοξίνες 33 1.3.6.7. Ο Μύκητας Beauveria bassiana 35 1.3.6.8. Ο Μύκητας Metarhizium robertsii 40 1.3.6.9. Ο Μύκητας Isaria fumosorosea 45 1.4. Το έντομο Sesamia nonagrioides 48 1.4.1.Ταξινομική θέση του εντόμου 48 1.4.2 Περιγραφή του εντόμου 49 1.4.3 Βιολογία 52 1.4.4. Η Γεωγραφική Εξάπλωση του εντόμου 55 1.4.5. Ζημία 56 1.4.6 Αντιμετώπιση του Εντόμου. 57 2.Σκοπός της Παρούσας Εργασίας 60 3.Υλικά και Μέθοδοι 3.1. Έντομα 3.1.1 Εισαγωγή 61 3.1.2 Εργαστηριακή αποικία 61 3.1.3. Συνθήκες εκτροφής του εντόμου 61 3.1.4 Κλωβοί ακμαίων και υπόστρωμα ωοτοκίας 62 3.1.5. Υπόστρωμα Εκτροφής 64 3.1.6. Διατήρηση νυμφών 65 3.2. Εντομοπαθογόνοι Μύκητες 3.2.1. Μέθοδος “Galleria bait method” 65 3.2.2. Απομόνωση Εντομοπαθογόνων Μυκήτων 67 3.2.3. To Sabouraud Dextrose Agar (SDA) 70 3.2.4. Παρασκευή Εναιωρήματος Εντομοπαθογονών Μυκήτων 72 3.3. Εκχύλιση στύλων του γένους Crocus 74 3.4.Στατιστική επεξεργασία 74 3.5. Μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος κρόκου Κοζάνης στους εντομοπαθογόνους μικροοργανισμούς εντομοπαθογόνων μυκήτων Beauveria bassiana, Metarhizium anisoplae και Isaria fumosorosea επί των προνυμφών του εντόμου 75 4.Αποτελέσματα 4.1.Επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου Κοζάνης στην αύξηση των εντομοπαθογόνων μυκήτων. 78 4.2. Επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου Κοζάνης στην αποτελεσματικότητα εναντίων 80 των προνυμφών του εντόμου 5.Συζήτηση 87 6. Αντί - Συμπεράσματος 89 7.Βιβλιογραφία 91

Πρόλογος (Ευχαριστίες)

Η εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών του

τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών και στο Εργαστήριο

Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του τμήματος της

Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών.

Με την περάτωση της παρούσας μεταπτυχιακής διατριβής θα ήθελα να

ευχαριστήσω θερμά την επιβλέπουσα Δρα Φωτεινή Λάμαρη, Επίκουρη Καθηγήτρια

του τμήματος Φαρμακευτικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου

Πατρών, για την σωστή καθοδήγηση και επίβλεψη της εργασίας.

Θα πρέπει παράλληλα να ευχαριστήσω τα μέλη της εξεταστικής επιτροπής για

την παρουσία τους καθώς και τον κ. Ιωάννη Ματσούκα, Καθηγητή του τμήματος

Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών για την στήριξη που μου παρείχε στην διάρκεια

όλης αυτής της προσπάθειας.

Τέλος, θα ήθελα να αφιερώσω την διατριβή αυτή στην σύντροφο της ζωής

μου Θεανώ για την υπομονή της και στους γονείς μου για την υποστήριξη τους.

i Περίληψη

Λέξεις κλειδιά: Κρόκος Κοζάνης, Εντομοπαθογόνοι Μύκητες, Sesamia

nonagrioides

Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο του Διατμηματικού

Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και

Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων». Σκοπός αυτής της έρευνας ήταν η

διερεύνηση της επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου τόσο στην αύξηση όσο και στην

αποτελεσματικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων επί των προνυμφών του

λεπιδοπτέρου Sesamia nonangrioides.

Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν οι εντομοπαθογόνοι μύκητες

Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales: Cordycipitaceae),

Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) και

Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae) από την

συλλογή του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου των οποίων η διατήρηση

έγινε στο εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών του τμήματος Βιολογίας με την μέθοδο

των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων (Strasser et al. 1996). Στύλοι του

καλλιεργούμενου Crocus sativus εκχυλίστηκαν με διάλυμα 50% v/v μεθανόλης σε

νερό (3 mL/50 mg ξηρής δρόγης) για 4 h απουσία φωτός.

Οι παραπάνω εντομοπαθογόνοι μύκητες καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία petri με

θρεπτικό υλικό Sabouraud Dextrose Agar (S.D.A.) για διάστημα 5 ημερών παρουσία

(3,0% v/v) και απουσία (100% S.D.A. αλλά και 98,5% S.D.A. - 1,5% μεθανόλης)

εκχυλίσματος. Μετά το πέρας, διαπιστώθηκε ότι η παρουσία της μεθανόλης σε αυτήν

τη συγκέντρωση δεν επηρέασε την ανάπτυξη κανενός μύκητα. Περαιτέρω, οι

εντομοπαθογόνοι μύκητες B. bassiana και I. fumosorosea δεν επηρεάστηκαν από την

ii παρουσία του εκχυλίσματος κρόκου στο υπόστρωμα ανάπτυξης, ενώ ο

εντομοπαθογόνος μύκητας M. robertsii επηρεάστηκε θετικά (P<0,05, τεστ Bonferoni)

από την παρουσία του εκχυλίσματος.

Επιπροσθέτως μελετήθηκε η επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου στην

αποτελεσματικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων επί των προνυμφών του

εντόμου S. nonangrioides.. Για κάθε εντομοπαθογόνο μύκητα παρασκευάστηκαν

τρεις συγκεντρώσεις (106, 107, 108 κονίδια/mL) ενώ η θνησιμότητα των προνυμφών

καταγραφόταν καθημερινά για 7 ημέρες. Oι εντομοπαθογόνοι μύκητες προκάλεσαν

υψηλά ποσοστά θνησιμότητας στις προνύμφες του εντόμου• ιδιαίτερα ο I. fumosorosea (υπόστρωμα μόνο S.D.A) προκάλεσε θνησιμότητα του S. nonangrioides

που κυμάνθηκε από 80 έως 93%. Η παρουσία του εκχυλίσματος κρόκου στο

υπόστρωμα αύξησε σημαντικά (P<0,05, test Bonferoni) τη θνησιμότητα του εντόμου

(80-96%) ένεκα του εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii. Η σημαντική θετική

επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου στην αύξηση και την αποτελεσματικότητα του

εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii επί των προνυμφών του S. nonangrioides

χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης ως προς τους μηχανισμούς με τους οποίους

επετεύχθη αλλά και ανοίγουν νέους δρόμους ως προς την ανάπτυξη νέων μεθόδων

βιολογικής καλλιέργεια.

iii Abstract

Key words: Crocus sativus, Entomopathogenic fungi, Sesamia nonagrioides

This thesis was produced as part of the Interdepartmental Graduate Program entitled

“Medicinal Chemistry: Design and Development of Medicinal Products”. The

intention of this thesis was to study the effect of saffron extract at the growth of

entomopathogenic fungi in semi selective substrates and at the efficacy of

entomopathogenic fungi on larvae of the insect S. nonangrioides.

This study used Beauveria bassiana Balsamo (Vuillemin) (Hypocreales:

Cordycipitaceae), Metarhizium robertsii (Metchnikoff) Sorokin (Hypocreales:

Clavicipitaceae) and Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith (Hypocreales:

Clavicipitaceae) from the collection of the Benaki Phytopathological Institute and

maintain with the selective medium method in laboratory of Plant Physiology at the

Department of Biology (Strasser et al. 1996). Saffron (stigmas of Crocus sativus) was

extracted with methanol:water 1:1, v/v (3 mL/50 mg dry plant material) for 4 h in the

absence of light.

Entomopathogenic fungi were cultured in petri dishes with Sabouraud

Dextrose Agar (S.D.A.) for 5 days in the presence (3.0%, v/v) and absence (100%

S.D.A. and 98,5% S.D.A. -1,5% methanol) of saffron extract. Methanol in the culture medium did not affect fungal growth at the particular concentration. After the five days, entomopathogenic fungi B. bassiana and I. fumosorosea were not affected by the presence of saffron extract in the growing medium, whereas M. robertsii growth was influenced positively (P<0.05, Bonferoni test) by the presence of saffron extract.

iv In addition, the effect of saffron extract on the efficacy of entomopathogenic

fungi on larvae of S. nonangrioides was studied. For each entomopathogenic fungus

three concentrations (106, 107, 108 conidia/mL) were used, while the mortality of

larvae was recorded daily for 7 days. Entomopathogenic fungi caused high mortality

in larvae of the insect; particularly I. fumosorosea (substrate SDA) induced mortality

ranging from 80 to 93%. Saffron in the culture medium of M. robertsii significantly

(P<0.05, Bonferoni test) increased insect mortality (80 to 96%). The significant positive effect of saffron in the semi-selective substrate on the growth and effectiveness of M. robertsii on S. nonangrioides larvae demand further investigation of the mechanisms of action and pose new dimension in the use of biological agents.

v 1.1.Crocus sativus

Ο Kρόκος ο ήμερος (Crocus sativus Linnaeus), ανήκει στην οικογένεια των

ιριδοειδών (Liliales: Iridaceae) και απαντάται από πολύ παλιά στην Ελλάδα. Εδώ και

περίπου 300 χρόνια το φυτό Crocus sativus L., καλλιεργείται αποκλειστικά στο Νομό

Κοζάνης για τις αρτυματικές και χρωστικές ικανότητες των στύλων του. Το χωριό

Κρόκος της Κοζάνης κατατάσσεται στην πρώτη θέση παραγωγού κρόκου βιολογικής

καλλιέργειας στον κόσμο ανάμεσα σε πολλά κράτη όπως Ινδία, Ιράν, Κίνα και

Ισπανία. Ο κρόκος Κοζάνης αποτελεί προϊόν Προστατευόμενης Ονομασίας και

Προέλευσης. Στο γένος Crocusανήκουν περίπου 80 είδη (Guner et al. 2000). Ο

Crocus sativus L. είναι ένα βολβώδες πολυετές φυτό με ύψος που κυμαίνεται από 8

μέχρι 30 cm, με έναν υπόγειο σφαιρικό κορμό διαμέτρου 3-5 cm, ο οποίος παράγει 6-

9 φύλλα, ενώ στο κάτω μέρος έχει τέσσερις ή πέντε μεμβράνες. Η ανθοφορία του

γίνεται το φθινόπωρο, ενώ τα φύλλα προβάλλουν μαζί ή λίγο αργότερα. Τα φύλλα

μαραίνονται στην αρχή της ξηρής περιόδου και κατά τη διάρκεια της όψιμης άνοιξης

και του μεγαλύτερου μέρους της καλοκαιρινής περιόδου, το φυτό δεν εμφανίζει

καθόλου υπέργεια όργανα ή ρίζες. Ωστόσο, στην κατάσταση αυτή γίνεται κυτταρική

διαίρεση στον κορυφώδη μέσο μίσχο των μπουμπουκιών, σηματοδοτώντας και την

έναρξη της δημιουργίας των ανθών. Κάθε κόρμος παράγει 1με 3 μωβ άνθη, τα οποία

έχουν 3 βιολετί τέπαλα και 3 πέταλα παρόμοια μεταξύ τους, και ανοίγουν με το

πρώτο φως του ήλιου. Ο ύπερος είναι κεντρικός με μία σωληνοειδή ωοθήκη μέσα

από την οποία εξέρχεται ένας λεπτός στύλος. Ο λαιμός του στύλου, χρώματος απαλού

κίτρινου, είναι αρκετά μακρύς ενώ στο πάνω μέρος χωρίζεται σε τρία στίγματα

χρώματος βαθύ κόκκινου. Στο εμπόριο οι στύλοι κυκλοφορούν σε αποξηραμένη

μορφή με τις ονομασίες saffron, σαφράν ή ζαφορά (Χρυσάνθη 2010).

Ο υπόγειος, σαρκώδης κορμός του γένους Crocus αποτελείται από ένα σχεδόν

1 ομοιόμορφο πλήθος από ιστούς πολύ πλούσιους σε άμυλο. Είναι στην ουσία ένα

αποθηκευτικό όργανο που αποτελείται από ένα συμπαγή υπόγειο βλαστό. Έχει ετήσια

διάρκεια και αντικαθίσταται από έναν καινούργιο κορμό μεταξύ των σταδίων της

ανθοφορίας και της καρποφορίας. Τα περισσότερα είδη Crocus μπορούν να

αναπαραχθούν είτε μέσω ετήσιων κορμών αντικατάστασης είτε μέσω σπορίων. Λόγω

της στειρότητας, μερικά είδη όπως ο C. sativus, αναπαράγονται μόνο με

αντικατάσταση των κορμών. Οι κορμοί του γένους Crocus καθώς φαίνεται έχουν ένα

«ιδανικό βάθος λειτουργίας» στο οποίο λειτουργούν ως ώριμα φυτά. Ανώριμοι

κορμοί ή κορμοί που έχουν διαταραχθεί για κάποιο λόγο μπορεί να μη βρίσκονται σε

αυτό το βέλτιστο βάθος. Σε αυτήν την περίπτωση σχηματίζεται μια συσταλτή ρίζα

σαν κόνδυλος, η οποία παράγεται από τον καινούργιο κορμό, ο οποίος βρίσκεται

πάνω από τον μητρικό και ο οποίος στη συνέχεια έλκεται ισχυρά προς τα κάτω καθώς

ο παλιός κορμός μαραίνεται και η σαρκώδης ρίζα συστέλλεται. Οι ρίζες παράγονται

στο σημείο γύρω από την επιφάνεια της ουλής της βάσης του κορμού και είναι και

αυτές περιορισμένης διάρκειας. Το φυτό έχει μία υπόγεια ωοθήκη της οποίας η

προέκταση, μήκους 9-10 cm, αποτελεί τον στύλο. Το πάνω μέρος του στύλου

χωρίζεται σε τρία νημάτια (2.5 cm) τα οποία περιέχουν τα στίγματα. Κάθε φυτό έχει

ένα και μοναδικό στύλο διαχωρισμένο σε τρία νημάτια χρώματος κίτρινου,

πορτοκαλί ή κόκκινου. Τα είδη Crocus έχουν βαθιά πράσινα φύλλα με μεσαία

ράβδωση η οποία ασπρίζει. Τα φύλλα τους εμφανίζονται μαζί με το άνθος ή λίγο

αργότερα (Κουλακιώτης 2009, Χρυσάνθη 2010).

2

Εικόνα 1.1.1. Χαρακτηριστικό γνώρισμα του φυτού Crocus sativus.

Ως καρύκευμα, το σαφράν έχει αρκετά μεγάλο κόστος γεγονός που αποδίδεται

στις απαιτητικές διεργασίες συλλογής και ξήρανσης των στύλων. Αξίζει να σημειωθεί

ότι για παραγωγή ενός γραμμαρίου ζαφορά χρειάζονται περίπου 150-200 στύλοι. Ο

κόκκινος ελληνικός κρόκος κατατάσσεται στην καλύτερη ποιότητα κρόκου στον

κόσμο και πολλοί τον αποκαλούν «κόκκινο χρυσό». Η ποιότητα του κρόκου

εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μέρος όπου καλλιεργείται, αλλά κυρίως από τον

τρόπο επεξεργασίας.

Ο γνήσιος κρόκος πωλείται μέσα σε τενεκεδένια δοχεία και φιάλες και

συνήθως αποθηκεύεται σε σκοτεινά σημεία. Η Ελλάδα εξάγει κρόκο διαθέτοντας

σχεδόν το 100% της παραγωγής σε χώρες της Ευρώπης, της Αμερικής και της Ασίας.

Σήμερα, κυκλοφορούν στο εμπόριο πολλά υποκατάστατα κρόκου και πολύ συχνά

3 γίνονται νοθείες. Ο πραγματικός κρόκος έχει υπόπικρη γεύση και ελαφρά ιωδιώδες

άρωμα. Πολύτιμο μπαχαρικό, ο κρόκος δίνει μια ιδιαίτερη γεύση και χρώμα στο

φαγητό, στα ροφήματα, στην ποτοποιία, στην τυροκομία κ.ά.

Χρησιμοποιείται για την πικάντική του γεύση κυρίως στα ζυμαρικά, στο ρύζι,

στο κοτόπουλο, στα τυροκομικά προϊόντα, στο κρέας καθώς και σε διάφορα

θαλασσινά. Αποτελεί σημαντικό υλικό της βιομηχανίας τροφίμων, της

ζαχαροπλαστικής και της καπνοποιίας. Η χρωστική ικανότητα των στύλων του

αποδίδεται στα καροτενοειδή (Κουλακιώτης 2009, Χρυσάνθη 2010).

1.1.Ιδιότητες του κρόκου

Ο Διοσκουρίδης αναφέρει ότι ο κρόκος διαθέτει χωνευτικές, διουρητικές,

μαλακτικές και αφροδισιακές ιδιότητες, τα ροφήματά του έχουν ευεργετική δράση

στα εσωτερικά όργανα, ενώ ανακατεμένος με γλυκό κρασί προστατεύει από τη μέθη.

Σήμερα, πολλές από τις παραδοσιακά αποδεκτές ιδιότητες του κρόκου, όπως η

αντισηπτική της στοματικής κοιλότητας, η αντισπασμωδική και η χωνευτική

επικυρώθηκαν πειραματικά, προέκυψαν όμως και νέοι τομείς θεραπευτικής

εφαρμογής του. Έχει επιβεβαιωθεί ότι τα στίγματα του κρόκου

1. Διαθέτουν ισχυρές αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιθρομβωτικές και

αγγειοδιασταλτικές δράσεις (Zheng et al. 2007).

2. Αναστέλλουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων (Serafini et al. 2002,

Devasagayam et al. 2004, Chryssanthi et al. 2011).

3. Βελτιώνουν τις εγκεφαλικές λειτουργίες και ιδιαίτερα τη μνήμη (Papandreou et al.

2011).

4. Προστατεύουν τα εγκεφαλικά κύτταρα από εκφυλιστικές νόσους (Papandreou et al.

2006, Akhondzadeh et al. 2011).

5. Βοηθούν στην αντιμετώπιση της κατάθλιψης (Akhondzadeh Basti et al. 2007).

4 6. Έχουν αντιχοληστερινική δράση (Velioglu et al. 1998).

7. Ευεργετικές ιδιότητες για το στομάχι (Robards et al. 1999).

1.2.Η Ολοκληρωμένη Αντιμετώπιση

Η ολοκληρωμένη αντιμετώπιση των εχθρών των καλλιεργειών (Intergrated

Pest Management – IPM), σύμφωνα με τους Smith and Reynolds (1966), είναι ένα

σύστημα αντιμετώπισης εχθρών, στα πλαίσια κάποιων συγκεκριμένων

περιβαλλοντολογικών συνθηκών και της δυναμικής πληθυσμών του εχθρού το οποίο

χρησιμοποιεί όλες τις κατάλληλες μεθόδους και τεχνικές κατά τον πλέον

εναρμονιζόμενο τρόπο και επιτυγχάνει τη διατήρηση του πληθυσμού του εχθρού

κάτω από αυτόν που δύναται να προξενήσει οικονομική ζημία στην καλλιέργεια

(Λυκουρέσης, 1995).

Είναι δηλαδή, μια οικολογικά βασισμένη στρατηγική αντιμετώπισης εχθρών

των καλλιεργειών που στηρίζεται κυρίως σε φυσικούς παράγοντες θνησιμότητας

όπως είναι οι φυσικοί εχθροί και οι περιβαλλοντικοί παράγοντες και αναζητεί να

εφαρμόζει τακτικές οι οποίες να μην διαταράσσουν ή να διαταράσσουν όσο γίνεται

λιγότερο αυτούς τους παράγοντες.

5

Διάγραμμα 1.2.1: Ολοκληρωμένη Αντιμετώπιση Εχθρών

1.3. Η Βιολογική Αντιμετώπιση των Εντόμων

Γενικά

Η Βιολογική Αντιμετώπιση ορίζεται ως η δράση των φυσικών εχθρών των

επιβλαβών εντόμων (παρασιτοειδή, αρπακτικά, παθογόνα)(Steinhaus 1949, 1956,

1964,DeBach 1971, 1974VandenBoschetal.1982, VanDriescheκαι Bellows 1996,

Katsoyannos 1996)Διακρίνεται σε Φυσική Βιολογική Αντιμετώπιση (δράση των

φυσικών εχθρών χωρίς παρέμβαση του ανθρώπου) και σε Εφαρμοσμένη Βιολογική

Αντιμετώπιση (δράση των φυσικών εχθρών μετά την ενεργό παρέμβαση του

ανθρώπου). Η Εφαρμοσμένη Βιολογική Αντιμετώπιση διακρίνεται σε Διαχείριση

Πληθυσμών (εκτροφή, πολλαπλασιασμός και εξαπόλυση ιθαγενών φυσικών εχθρών)

(DeBach 1971, 1974, Van den Bosch et al.1982, Van Driesche και Bellows 1996,

Katsoyannos 1996) και σε Κλασική Βιολογική Αντιμετώπιση (εισαγωγή και

6 διαχείριση πληθυσμών εξωτικών φυσικών εχθρών και χρήση μικροβιακών

σκευασμάτων) (Εικόνα 2.0.1.) (Katsoyannos 1996).

Βιολογική Καταπολέμηση (η δράση των φυσικών εχθρών των επιβλαβών εντόμων)

ΦΥΣΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ (Φυσική Βιολογική ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ Καταπολέμηση): Βιολογική Καταπολέμηση: (δράση των φυσικών (δράση των φυσικών εχθρών μετά εχθρών χωρίς παρέμβαση την ενεργό παρέμβαση του ανθρώπου) του ανθρώπου)

ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΚΛΑΣΙΚΗ Βιολογική

ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ: Καταπολέμηση:

εκτροφή, πολλαπλασιασμός και εισαγωγή και διαχείριση

εξαπόλυση ιθαγενών φυσικών πληθυσμών (εκτροφή,

εχθρών πολλαπλασιασμός, εξαπόλυση) εξωτικών φυσικών εχθρών και χρήση μικροβιακών σκευασμάτων

Εικόνα 1.3.0.1.: Βιολογική Αντιμετώπιση (Katsoyannos, 1996).

Οι βιολογικές μέθοδοι προστασίας των καλλιεργειών, στις οποίες

συμμετέχουν οι φυσικοί, εχθροί (παρασιτοειδή, αρπακτικά, παθογόνα)παρουσιάζουν

μεγάλη εξειδίκευση, δεν έχουν καμμία υπολειμματική δράση και δρουν με πολλούς

τρόπους. Εξάλλου, πολλά από τα βιολογικά μέσα μετά την πρώτη εφαρμογή τους

υπεισέρχονται αυτόματα στο φυτικό περιβάλλον. Οι μέθοδοι αυτές είναι πολλές και

άλλες αναφέρονται στη χρησιμοποίηση ωφέλιμων ή ακάρεων που έχουν την

ικανότητα να παρασιτούν ή να καταβροχθίζουν τα επιβλαβή έντομα ή ακάρεα, ενώ

άλλες αναφέρονται στη χρησιμοποίηση παθογόνων μικροοργανισμών και ιών που

προκαλούν ασθένειες στα έντομα.

1.3.1. Φυσικοί εχθροί των επιβλαβών εντόμων

Όπως αναφέρθηκε οι φυσικοί εχθροί των επιβλαβών εντόμων είναι τα

παρασιτοειδή, τα αρπακτικά και τα παθογόνα.

7

1. Ο θηρευτής ή άρπαγας ή αρπακτικός οργανισμός (predator) σκοτώνει

και τρώει άλλους οργανισμούς, που αποτελούν γι’ αυτόν το θήραμα, ή,

όπως αλλιώς αποκαλείται, τη λεία του (prey)(DeBach 1971, 1974). Εάν

θελήσουμε να εξετάσουμε την πληθυσμιακή σχέση που έχει ένα είδος

θηρευτή με το είδος που αποτελεί τη λεία του, βλέπουμε ότι υπάρχουν

τρεις ακραίες περιπτώσεις. Εκτός από αυτές μεσολαβεί και ένα φάσμα

από ενδιάμεσες περιπτώσεις, οι οποίες καλύπτουν την κάθε πιθανή

μεταξύ τους πληθυσμιακή αλληλεπίδραση:

• Ο θηρευτής περιορίζει σε πολύ χαμηλά επίπεδα τον πληθυσμό του

θηράματός του, μετά μειώνεται ο δικός του πληθυσμός, από

έλλειψη τροφής, τότε ο πληθυσμός του θηράματος αυξάνεται από

έλλειψη θήρευσης κοκ. Σε αυτή την περίπτωση οι πληθυσμοί

εμφανίζουν εντονότατες διακυμάνσεις. (Ισχυρά περιοριστικός

θηρευτής).

• Ο θηρευτής διατηρεί τον πληθυσμό του θηράματος σε ένα

περίπου σταθερό επίπεδο και έτσι έχει και ο ίδιος ένα περίπου

σταθερό πληθυσμιακό μέγεθος. (Ρυθμιστικός θηρευτής).

• . Ο θηρευτής δεν έχει ούτε ισχυρή περιοριστική, ούτε ρυθμιστική

δράση.

2. Παρασιτοειδή έντομαδεν σκοτώνουν τον οργανισμό με τον οποίο

τρέφονται, ο οποίος αποκαλείται ξενιστής (host). Πιθανόν σε έντονη

μορφή παρασιτισμού, ο ξενιστής οργανισμός να πεθάνει από την

εξάντληση ή την υψηλή συγκέντρωση τοξινών από το σίελο των

παρασίτων του, αλλά αυτός ο θάνατος δεν αποτελεί προϋπόθεση για τη

διατροφή των παρασιτικών οργανισμών, είναι κάτι μάλλον ανεπιθύμητο

και γι’ αυτούς. (De Bach 1971, 1974)

8 Για τη σωστή άλλα και έγκαιρη χρήση των φυσικών εχθρών χρειάζεται καλή

γνώση α) της βιολογίας των φυτών, β) του βιολογικού κύκλου των εχθρών και γ) των

ανταγωνιστών των εχθρών (βιολογία, που και πως διαχειμάζουν, κ.α.).

Οι κατηγορίες των φυσικών εχθρών διαφέρουν σημαντικά στην βιολογία και

συμπεριφορά τους και ως εκ τούτου στην ικανότητα να ελέγξουν τον πληθυσμό των

εχθρών. Εξαρτώμενα από την φυσική τους οικολογία, παρασιτοειδή και αρπακτικά

είναι άλλοτε γενικά ή ειδικά. Τα γενικά παρασιτούν ή «αρπάζουν» μια ποικιλία

κατηγοριών οι οποίες δεν είναι συγγενείς βιοσυστηματικά. Τα αρπακτικά, επειδή

σκοτώνουν την λεία τους αμέσως, τα περισσότερα από αυτά είναι γενικά. Τα γενικά

παρασιτοειδή προτιμούν ένα συγκεκριμένο στάδιο αναπτύξεως των ειδών που θα

παρασιτήσουν. Σπουδαία γενικά παρασιτοειδή τα οποία έχουν μελετηθεί ευρέως στον

αγρό αλλά χρησιμοποιούνται και στην προστασία των αποθηκευμένων προϊόντων

είναι τα παρασιτοειδή ωών του γένους Trichogramma( Hymenoptera)

(Trichogrammatidae), όπως και το παρασιτοειδές Υμενόπτερο Habrobracon (=

Bracon) hebetor (οικ Braconidae). Το τελευταίο παρασιτεί τα ατελή στάδια σχεδόν

όλων των Λεπιδοπτέρων.

Οι φυσικοί εχθροί επίσης δεν είναι πάντα εύκολα διαθέσιμοι στην αγορά ενώ

ταυτόχρονα θεωρείται πολυδάπανη τόσο η εκτροφή τους όσο και η εξαπόλυσή τους.

Οι αυξημένες απαιτήσεις σε χρόνο αλλά και σε κόστος (όπου υπάρχουν), σε

συνδυασμό με την όχι πάντα μεγάλη αξιοπιστία των εφαρμογών αυτών θα πρέπει να

λαμβάνονται σοβαρά υπόψη κατά την κατάστρωση ενός σχεδίου αντιμετωπίσεως των

εχθρών των καλλιεργειών. (DeBach 1971, 1974, Jacques 1981,Van den Bosch et al.

1982, Jahn et al. 2007).

3. Παθογόνο είναι πληθυσμοί μικροοργανισμών(μύκητες, βακτήρια, ιοί)

που μπορούν να διεισδύσουν στο σώμα-ξενιστή να προκαλέσει

9 νόσοκαι θάνατο στο ξενιστή. (Στα παθογόνα των αρθροπόδων

κατατάσσονται και ορισμένα είδη νηματωδών.)

Η παθογένεια η οποία προκαλείται από τους μικροοργανισμούς δεν είναι ίδια

σε όλα τα έντομα και διαφέρει ακόμα και σε κάθε στάδιο του εντόμου. Συνήθως είναι

μεγαλύτερη στα νεαρά στάδια του εντόμου, ιδιαίτερα στο στάδιο της

προνύμφης(Steinhaus 1949, 1956, 1964).

Το σημείο εισόδου ή ανάπτυξης ενός παθογόνου διαφέρει, ανάλογα με το

έντομο και το εκάστοτε παθογόνο. Συνήθως η είσοδος των παθογόνων γίνεται από

την στοματική οδό, ενώ οι μύκητες έχουν τη δυνατότητα να εισβάλλουν στον ξενιστή

τους από το επιδερμάτιο του εντόμου (Ferron 1978, 1981, Jackson et al. 2000).

Εικόνα 1.3.1.1.: Σημεία εισόδου των παθογόνων μικροοργανισμών στο έντομο

1.3.2.Εντομοπαθογόνοι ιοί

Οι ιοί είναι μικρότατα σωματίδια, υποχρεωτικά ενδοκυτταρικού τύπου που το

μέγεθος τους συνήθως κυμαίνεται από 0.01 μm μέχρι και 15 μm (Lacey και Brooks,

1997). Αποτελούνται από τμήμα που περιέχει μία ή και περισσότερες έλικες μόνο

10 D.N.A ή μόνο R.N.A και από ένα περίβλημα πρωτεϊνικής φύσεως. Δεν είναι

μικροοργανισμοί κυτταρικού τύπου, αλλά χαρακτηρίζονται ως έμβια όντα, αφού

μπορούν να αναπαράγονται και να φέρουν μια γενετική πληροφορία, το μηχανισμό

αναπαραγωγής του νουκλεϊνικού οξέος.

Πολλές αναφορές παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την ιολογία

των εντόμων, το ενδεχόμενο ανάπτυξης των ιών ως μέσα μικροβιακού ελέγχου και

τους περιορισμούς ή τις προφυλάξεις πάνω στη χρήση των οργανισμών αυτών

(Cameron 1973, Cantwell 1974a, Summers et al. 1975, Kurstak1982, Granados και

Federici 1986a, Fuxa και Tanada 1987).

Ένα έντομο, μετά την προσβολή του από έναν ιό παρουσιάζει μειωμένη

δραστηριότητα για κάποιο χρονικό διάστημα, μέχρι να επέλθει ο θάνατος. Αν και δεν

προκαλούν οξεία και άμεση θνησιμότητα, πολλές φορές οι ιοί προκαλούν δραματικές

μειώσεις στον πληθυσμό των ξενιστών τους (Steinhaus 1949, 1956, 1964).

Μεταχρωματισμοί, λύσεις ιστών, δημιουργία κηλίδων, ακόμα και αποσύνθεση

ολόκληρου σώματος του εντόμου είναι τα συνήθη σημεία που εμφανίζονται, ανάλογα

φυσικά με το είδος του ιού και του εντόμου (Lacey και Brooks 1997).

Οι ιοί εξαρτώνται από τα κύτταρα του ξενιστή για να αναπαραχθούν.

Διακρίνονται σε δυο κατηγορίες ή αθροίσματα:

• Σε αυτούς που σχηματίζουν μέσα στα κύτταρα του ξενιστή τους σωμάτια

εγκλεισμού πρωτεϊνικής σύστασης που περικλείουν τους ιούς (Maramorosch 1968a,

Cantwell 1974a).

• Στους ιούς χωρίς προστατευτικά εγκλειστικά σωμάτια δηλαδή τους

«ελεύθερους ιούς» (Cantwell 1974a).

• Ανάλογα με τη μορφή των προστατευτικών σωματίων (πολυεδρώσεις)

διακρίνονται σε ιούς πρωτοπλασματικής ή πυρηνικής πολυέδρωσης

11 (Maramorosch1968a, Cantwell, 1974a).

Στις πρωτοπλασματικές πολυεδρώσεις οι ιοί είναι σφαιρικοί και προσβάλουν

κυρίως κύτταρα του εντέρου των προνυμφών των Λεπιδοπτέρων. Στις πυρηνικές

πολυεδρώσεις οι ιοί που περικλείονται στα κρυσταλλικά σωμάτια έχουν σχήμα

επιμήκους βακτηρίου και προσβάλλουν τα κύτταρα της αιμολέμφου, του λιπώδους

ιστού και της υποδερμίδας. Ακόμη μπορούν να προσβάλλουν τον πυρήνα των

κυττάρων του πεπτικού σωλήνα(Cameron, 1973, Cantwell, 1974a, Summers et al.,

1975, Kurstak 1982, Granados και Federici, 1986a, Fuxa και Tanada, 1987).

Εκτός από τα Λεπιδόπτερα μπορούν να προσβληθούν από ιούς πυρηνικών

πολυεδρώσεων και είδη των Υμενοπτέρων όπου η προσβολή εμφανίζεται στο

επιθήλιο του μεσεντέρου. Τέλος, στην Οικογένεια Baculoviridae έχουμε τις ιώσεις με

τα προστατευτικά εγκλειστικά σωμάτια που έχουν σχήμα κοκκίου και περικλείουν

ένα ή σπανιότερα δύο ιούς σε σχήμα επιμήκους βακτηρίου. Οι ιώσεις αυτές

ονομάζονται κοκκιώσεις (Granulosis) και η παθογένεση παρατηρείται στο τμήμα των

κυττάρων της αιμολέμφου ή του λιπώδη ιστού των Λεπιδοπτέρων και των

Κολεοπτέρων μεταξύ πρωτοπλάσματος και πυρήνα(Cameron 1973, Cantwell 1974a,

Summers et al. 1975, Kurstak, 1982, Granados και Federici 1986a, Fuxa και Tanada,

1987).

Τα κρυσταλλικά σωμάτια των πολυεδρώσεων διακρίνονται εύκολα στο

μικροσκόπιο διότι έχουν διάμετρο που κυμαίνεται μεταξύ 0,5μm και 15μm, ενώ

εκείνα των κοκκιώσεων μόλις που διακρίνονται, αφού έχουν μέγεθος 0,2-0,5μm. Οι

ιοί των πυρηνικών πολυεδρώσεων (NPV) και των κοκκιώσεων (GV) έχουν πυρηνικό

οξύ DNA, ενώ αυτοί των κυτταροπλασματικών πολυεδρώσεων RNA

(Maramorosch1968a, Fuxa και Tanada, 1987).

Οι ιοί έχουν την ιδιότητα να μεταδίδονται μέσω ενήλικων μορφών των

12 εντόμων στους απογόνους τους, αν και μερικοί έχουν αναφερθεί ότι μεταδίδονται και

μέσω των ωών. Για να εμφανισθούν τα συμπτώματα της ίωσης απαιτείται ένα

χρονικό διάστημα μεγαλύτερο από 4 ήμερες, ενώ εκτός από τις προνύμφες είναι

δυνατόν να εμφανιστούν συμπτώματα και σε ενήλικα έντομα (Maramorosch 1968a,

Fuxa και Tanada, 1987).

Στην Ελλάδα κυκλοφορούν σήμερα μόνο δύο σκευάσματα, το Carpovirusine

2000 SC και το Madex SC, που περιέχουν τον ιό CpGV και συνιστώνται για την

καταπολέμηση της καρπόκαψας Cydia (Laspeyresia) pomonella. Στο εξωτερικό

κυκλοφορούν περισσότερα εμπορικά σκευάσματα ιών (π.χ. Adoxophyes orana GV,

Spodoptera exigua MNPV, Lymantria dispar MNPV, Mamestra brassicae MNPV

κ.α.).

1.3.3. Εντομοπαθογόνα βακτήρια

Τα βακτήρια αποτελούν τον πιο πολυπληθή τύπο μικροοργανισμών που έχουν

δράση παθογόνο στα έντομα και επομένως δεν εκπλήσσει λοιπόν το γεγονός ότι

μεγάλος αριθμός από τους μικροοργανισμούς αυτούς μπορεί να τους προκαλέσει

μολύνσεις σε μεγάλο εύρος σε συνδυασμό με τις υπάρχουσες συνθήκες (Cantel

1974a, Pierce et al. 2001). Οι πρώτες μελέτες πάνω στις μικροβιακές ασθένειες των

εντόμων έγιναν από το Metchnikoff το 1879 στο Κολεόπτερο Anisoplia austriaca το

προσβλήθηκε από το Bacillus salutarius.Την ίδια περίοδο,οι μελέτες στο

μεταξοσκώληκα έκαναν προφανή τη σημασία των βακτηριακών ασθενειών και ήδη

επιχειρήθηκε η χρήση των μικροοργανισμών για την καταπολέμηση των εντόμων-

εχθρών.Το 1911,ο d’Herelle απομόνωσε ένα βακτήριο από το Schistocerca pallens

Thumb,που το ονόμασε Coccobacillus acridiorum και χρησιμοποίησε καλλιέργειες

αυτού του βακτηρίου για την καταπολέμηση στην Αργεντινή και στην Τυνήσια

(Steinhaus 1949, Cantel 1974a).

13 Τα βακτήρια είναι μονοκύτταροι μικροοργανισμοί οι οποίοι

πολλαπλασιάζονται με διαίρεση. Τα εντομοπαθογόνα βακτήρια είναι σε γενικές

γραμμές, όμοια με τα υπόλοιπα βακτήρια, όσον αφορά τα γενικά χαρακτηριστικά

τους. Από τους υπόλοιπους μικροοργανισμούς ξεχωρίζουν κυρίως λόγω του πολύ

μικρότερου μεγέθους τους, της τάξης των 0.5 – 50 μm (Steinhaus 1949, Pierce et al.

2001). Το σχήμα τους ποικίλει ανάλογα με το είδος, συναντώνται μεμονωμένα ή σε

αλυσίδες και μπορεί να είναι είτε θετικά είτε αρνητικά κατά Gram και αερόβια ή

αναερόβια (Lacey και brooks,1997).

Τα βακτήρια διακρίνονται σε δυο κατηγορίες:

• Στα παθογόνα για ορισμένα έντομα και κάτω υπό ορισμένες συνθήκες

• Στα υποχρεωτικά παθογόνα

Στα πρώτα υπάγονται ορισμένα είδη του γένους Pseudomonas, που όταν

εισέλθουν δια της στοματικής οδού στον εντερικό σωλήνα του εντόμου, διαπερνούν

στην συνέχεια τα εντερικά τοιχώματα, εισέρχονται στην αιμολέμφο και προκαλούν

σηψαιμία. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν επίσης και τα βακτήρια του γένους

Aerobacter και Enterococcus, τα οποία απαντώνται στο περιεχόμενο του εντερικού

σωλήνα των εντόμων και είναι δυνατόν αν προκαλέσουν τοπικές λύσεις του

επιθηλίου του εντέρου (Burgesκαι Hurst 1977).

Στην δεύτερη κατηγορία υπάγονται τα βακτήρια εκείνα που σχηματίζουν κατά

το στάδιο της σπορογονίας κρυστάλλους τοξίνης, οι οποίοι διασπώμενοι ενζυματικά

στον εντερικό σωλήνα του εντόμου δρουν τοξικά γι’ αυτό. Οι κρύσταλλοι αυτοί δεν

είναι βλαβεροί για άλλες μορφές ζωής, γεγονός που καθιστά τα κρυσταλλογόνα αυτά

βακτήρια πολύ ενδιαφέροντα και σημαντικά. Τουλάχιστον 120 είδη εντόμων είναι

ευαίσθητα στα κρυσταλλογόνα βακτήρια, αν και παρατηρούνται διαφορές όσον

αφορά τις αντιδράσεις στην τοξίνη ανάλογα με το είδος του εντόμου. Ο

14 προσδιορισμός της δράσης του βακτηρίου για κάθε είδος απαιτεί εκτεταμένες

έρευνες.

Γενικά, τα έντομα που είναι προσβεβλημένα από βακτήρια παρουσιάζουν

δυσκολίες στην κίνηση, μειωμένη όρεξη, στοματικές και εντερικές εκκρίσεις. Μετά

το θάνατο το σώμα (ειδικά των προνυμφών) σκουραίνει γρήγορα παίρνοντας καφέ ή

μαύρο χρώμα. Γίνεται εντελώς υδαρές και αλλοιώνεται σε μεγάλο βαθμό το σχήμα

του. Τελικά το σώμα του εντόμου ξηραίνεται εντελώς. Σε ένα νεκρό ή ετοιμοθάνατο

έντομο εξαιτίας κάποιας βακτηριολογικής ασθένειας, αν εξετάσουμε τους ιστούς του

θα διαπιστώσουμε την έντονη παρουσία των ευθυνόμενων για το θάνατο βακτηρίων

(Steinhaus 1949, 1956, 1964, Pierce et al. 2001).

Πολλά από τα εντομοπαθογόνα βακτήρια δεν είναι αρχικά θανατηφόρα για τα

έντομα-ξενιστές και μπορούμε να εντοπίσουμε σημεία και συμπτώματα σε ζώντα

έντομα (Puszaietal. 1991). Τέτοια παραδείγματα είναι η προσβολή εντόμων της

οικογένειας Scarabaeidae (Coleoptera) από Bacillus popilliae (milky disease) και από

Seratia entomophila (Honey disease) (Lacey και brooks 1997). Η διάκριση πολλές

φορές μιας βακτηριολογικής προσβολής σε έντομα γίνεται από το χρώμα το οποίο

αποκτά το νεκρωμένο σώμα τους (Burgesκαι Hurst 1977)

Ο Bacillus thuringiensis αποτελεί το σημαντικότερο ίσως εκπρόσωπο των

εντομοπαθογόνων βακτηρίων απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον γερμανό

ερευνητή Berliner το 1911, από προνύμφες του εντόμου Anagasta kuiehniella.Το

ονόμασε τον Bacillus thuringiensis, μετά τη γερμανική Θουριγγία πόλη όπου ο

σκώρος βρέθηκε.

Αερόβιο, σποριογόνο-κρυσταλλοφόρο, θετικό κατά Gram βακτήριο. Στο

στάδιο της σπορογονίας το βακτηριακό κύτταρο μετατρέπεται σε σποριάγγειο όπου

μέσα εκτός από το σπόριο σχηματίζεται και ένας πρωτεϊνικός κρύσταλλος. Η

15 πρωτεϊνική σύσταση του κρυστάλου είναι διαφορετική για κάθε ορότυπο. Οι

κρύσταλλοι αποτελούν το σημαντικότερο ταξινομικό κριτήριο για την αναγνώριση

ενός βακτηρίου σαν Bacillus thuringiensis.

Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις κρυσταλλικές πρωτεΐνες βρίσκονται σε

μεγάλα πλασμίδια (15–120 Md) (Lereclus et al. 1982).αν και έχουν σημειωθεί θέσεις

πάνω στο χρωμόσωμα. Η κάθε θέση που έχει προσδιοριστεί αντιστοιχεί σε μια

υπεύθυνη τοξίνη. Οι υπεύθυνες τοξίνες χωρίζονται σε τέσσερις κατηγορίες (Burges

1982):

1. Στην πρώτη κατηγορία η υπεύθυνη τοξίνη είναι η πρωτεΐνη (P1) με

μοριακό βάρος 130kb, παράλληλα στη πρώτη κατηγορία ανήκει μια

δεύτερη πρωτεΐνη (P2) με μοριακό βάρος 66kb που είναι τοξική

Λεπιδόπτερα (CryIAa, CryIAb, CryIAc)(Bacillus thuringiensis subsp

kurstaki).(Rukmini et al. 2000, Huang et al. 2002)

2. Στην δεύτερη ομάδα αντιστοιχούν οι πρωτεΐνες που είναι τοξικές σε

Δίπτερα με μοριακό βάρος από 25 – 140 kb (Bacillus thuringiensis

subsp israelensis).

3. Στην τρίτη ομάδα αντιστοιχεί τοξίνη που δρα εναντίον των

κολεπτέρων με μοριακό βάρος 66kb(CryIIIA and CryIIIBb) (Bacillus

thuringiensis subsp tenebrionis) (Krieg 1983).

4. Στην τετάρτη ομάδα η υπεύθυνη τοξίνη με μοριακό βάρος 130kb δρα

εναντίον Διπτέρων και Λεπιδοπτέρων.

Όταν οι κρυσταλλικές πρωτεΐνες καταποθούν από ευαίσθητες προνύμφες

διαλυτοποιούνται στο μεσέντερο λόγω του αλκαλικού περιβάλλοντος (pH 8-12). Η

τοξίνη μετατρέπεται σε μια ενεργοποιημένη μορφή μέσω δράσης των πρωτεασών του

μεσεντέρου, οι οποίες διασπούν την τοξίνη σε μικρότερα, ανθεκτικά στις πρωτεάσες

16 τμήματα. Η τοξίνη κατευθύνεται στις επιφανειακές πρωτεΐνες της μεμβράνης των

επιθηλιακών κυττάρων του μεσεντέρου οπού και προσδένεται σε επιφανειακό

κυτταρικό υποδοχέα. Η τοξικότητα του βακίλου εξαρτάται από την αναγνώριση

υποδοχείς, βλάβη στο έντερο από την τοξίνη που εμφανίζεται μετά τη σύνδεση σε

έναν υποδοχέα. Κάθε είδος εντόμου διαθέτει διαφορετικούς τύπους υποδοχέων που

θα ταιριάζει μόνο ορισμένες πρωτεΐνες τοξίνη, όπως μια κλειδαριά με ένα κλειδί

(Luthy και Ebersold, 1981, Knowles και Ellar 1987).

Η επίδραση της τοξίνης είναι γρήγορη. Μέσα σε λίγα λεπτά επέρχεται

παράλυση του στομάχου και των μασητικών οργάνων του εντόμου σαν αποτέλεσμα

έχει την αναστολή της πρόσληψης τροφής. Το επιθήλιο του μεσεντέρου υφίσταται

φούσκωμα απολέπιση και κατάρρευση. Ιστολογικές δομικές αλλαγές λαμβάνουν

χώρα. Η περατότητα του μεσεντέρου αλλάζει, αυξάνεται η συγκέντρωση των ιόντων

K+ και Na+ στην αιμολέμφο, αυξάνεται το pΗ στην αιμολέμφο και μειώνεται στο

μεσέντερο, αυξάνεται η απορρόφηση της γλυκόζης και μειώνεται η απορρόφηση του

ATP, αυξάνεται η κατανάλωση του O2 και περιορίζεται η κανονική μεταφορά του

ιόντος K+. Έτσι τα κύτταρα αρχίζουν να διογκώνονται και να υφίστανται

κόκκιοποίηση. Ο πυρήνας διογκώνεται , το ενδοπλασματικό δίκτυο αποκτά δομή και

μορφή ομοιάζουσα με κενοτόπιο και τα κύτταρα υφίστανται λύση, καταλήγοντας σε

εκτεταμένες ζημίες στο μεσοεντερό και τελικά οδηγεί στο θάνατο της προνύμφης

(Mohd – Seller και Lewis 1981).

Τα πρώτα πειράματα στο αγρό έγινα από τον Husz το 1929 για το έλεγχο του

λεπιδόπτερου Ostrinia nubilalis στο αραβόσιτο(Tanada και Kaya 1993).

Επίσης μια κατηγορία βακτηρίων είναι οι ρικέτσιες, οι οποίες συναντώνται σε

ευρύ φάσμα εντόμων, μπορούν σε ορισμένες περιπτώσεις να προκαλέσουν

αξιοπρόσεχτες μολύνσεις σε ορισμένους πληθυσμούς. Έχουν πολύ μικρό μέγεθος

17 (0.2-0.6μm) και σχήμα ραβδοειδές, είναι αρνητικές κατά Gram, μοιάζουν με

βακτήρια και συμπεριφέρονται ως ιοί. Είδη του γένους Rickettiella και Wolbachia

είναι εντομοπαθογόνα και η παρουσία τους έχει αναφερθεί σε Κολεόπτερα, Δίπτερα,

Λεπιδόπτερα, Ορθόπτερα και άλλες τάξεις εντόμων (Steinhaus 1949, 1956,

1964,Pierce et al. 2001).

Εικόνα1.3.3.1.ΕπίδρασητουεντομοπαθογόνουβακτηρίουBacillus thuringiensis subsp kurstaki

σεπρονύμφηλεπιδοπτέρου.

18

1.3.4.Εντομοπαθογόνοινηματώδεις

Οι νηματώδεις τυπικά δεν είναι μικροβιακά στοιχεία, αλλά κυλινδρικοί

πολυκύτταροι σκώληκες. Όντας σχεδόν μικροσκοπικοί σε μέγεθος χρησιμοποιούνται

όπως τα υπόλοιπα μικροβιακά εντομοκτόνα. Η συμβίωση εντόμων και νηματωδών

δεν είναι πάντα θανατηφόρος για το έντομο, καθότι σε αρκετές περιπτώσεις οι

νηματώδεις τρέφονται δίχως να παρεμποδίζουν τις ζωτικές λειτουργίες του εντόμου

(Welch 1963).

Οι εντομοπαρασιτικοί ή οι εντομοπαθογόνοι νηματώδεις προσβάλλουν έντομα

από όλες τις τάξεις, αρκεί σε κάποιο στάδιο του βιολογικού τους κύκλου (κατά

προτίμηση ως προνύμφες) να βρίσκονται επί ή εντός του εδάφους (Steinhaus 1949).

Οι νηματώδεις μπορούν να δράσουν ως παράσιτα σε οποιοδήποτε ή και σε όλα τα

στάδια του βιολογικού τους κύκλου, ενώ κάποιοι νηματώδεις εμφανίζονται ως

παράσιτα για μια γενιά και στις επόμενες γενιές ζουν ελεύθεροι.

Οι εντομοπαθογόνοι ή οι εντομοπαθογόνοι νηματώδεις προσβάλλοντας το

εσωτερικό του εντόμου, προκαλούν μουμιοποίηση. Τα έντομα που παρασιτούνται από

είδη των Steinernematidae και Heterorhabditidae αποκτούν κόκκινο, πορτοκαλί ή

γαλακτόχρωμο μεταχρωματισμό ο οποίος οφείλεται στην παρουσία και την δράση

των συμβιούντων βακτηρίων (Enterobacteriaceae) (Lacey και Brooks 1997).Τα είδη

των πιο πάνω οικογενειών καταφέρνουν, εξαιτίας της συμβίωσης αυτής, να

θανατώνουν πιο γρήγορα τους ξενιστές τους (Kleespies et al. 1989).

Έντομα εδάφους και νερού τα οποία θανατώνονται από νηματώδεις

αποσυντίθονται γρήγορα ενώ συχνά οι νηματώδεις απομακρύνονται από το νεκρό

έντομο καθιστώντας δύσκολη την παρατήρηση για προσβολές νηματωδών. (Nickle

και Welch 1984, Kleespies et al. 1989).

19

Εικόνα1.3.4.1.: Εντομοπαθογόνος νηματώδης του είδους Steinernema spp (Burgas 1981, 1998, Menti

et al. 2000)

Ιδιότητες εντομοπαθογόνων νηματωδών:

• Μπορούν να σκοτώσουν τα έντομα μέσα σε 24-48 ώρες (πιο γρήγορα από ότι

οι εντομοπαρασιτικοί νηματώδεις) (Kleespies et al. 1989, Burgas 1981, 1998).

• Έχουν ευρεία κλίμακα ξενιστών που περιλαμβάνει την πλειοψηφία των

τάξεων και οικογενειών των εντόμων (Menti et al.1997, 2000, 2003)

• Μπορούν να καλλιεργηθούν σε μεγάλη κλίμακα πάνω ή μέσα σε τεχνητό

στερεό ή υγρό υπόστρωμα (Menti et al.1997, 2000, 2003)

• Σχηματίζουν ένα ανθεκτικό μολυσματικό στάδιο το οποίο μπορεί να

αποθηκευτεί για μεγάλες χρονικές περιόδους, να εφαρμοστεί με τους συμβατικούς

τρόπους και να παραμείνει στο φυσικό περιβάλλον(Burgas 1981, 1998, Menti et al.

1997, 2000, 2003).

• Το μολυσματικό στάδιο είναι ανθεκτικό στα περισσότερα αγροχημικά,

20 γεγονός που επιτρέπει την χρήση τους σε πρόγραμμα ολοκληρωμένης διαχείρισης

(Hajek et al. 2007).

• Τα έντομα δεν φαίνεται να αναπτύσσουν ανθεκτικότητα (Hajek et al. 2007).

• Τα φυτά και τα θηλαστικά δεν επηρεάζονται(Hajek et al. 2007).

1.3.5. Εντομοπαθογόνα πρωτόζωα

Όσα είδη παρουσιάζουν πρακτικό ενδιαφέρον για καταπολέμηση εντόμων

έχουν κατά την ζωή τους ένα ανθεκτικό στάδιο, εκείνο της σπορίωσης. Στις πλείστες

περιπτώσεις το στάδιο αυτό είναι και το μολυσματικό. Το έντομο μολύνεται κατά

κανόνα καταπίνοντας τα πρωτόζωα, ορισμένα όμως είδη πρωτόζωων μπορεί να

μεταδοθούν από την μητέρα έντομο στα τέκνα δια του ωαρίου (Cantel 1974a).

Λιγότερο συχνή, αλλά όχι σπάνια, είναι η είσοδος του πρωτόζωου από οπές ωοτοκίας

παρασιτικών υμενοπτέρων. Οι κυρίως προσβαλλόμενοι ιστοί και όργανα είναι το

λιπόσωμα, οι σωλήνες Malpighi και το εντερικό επιθήλιο. Η προσβολή καταλήγει σε

κυττόλυση (Brooks 1971).

Μειονεκτήματα που περιορίζουν την πρακτική χρησιμότητα των πρωτόζωων

είναι η ευπάθεια τους στο υπεριώδες φως, αλλά προπαντός η μικρή τους

εντομοπαθογόνος δύναμη και η μάλλον αργή δράση τους. Επίσης η αναπαραγωγή

τους για εμπορική χρήση είναι εξαιρετικά δύσκολη, μιας και δεν αναπαράγονται σε

τεχνητά υποστρώματα (Steinhaus 1949).

Οι μικροοργανισμοί αυτοί έχουν ένα πολύπλοκο βιολογικό κύκλο.

Δημιουργούν ασθένειες, όπως η Νοζεμίαση και έχουν μεγάλη διάρκεια εξέλιξης μέσα

στο έντομο. Συνήθως τα εντομοπαθογόνα πρωτόζωα αναπαράγονται στα κύτταρα του

εντόμου. Πάντως ως αποκλειστικά παράσιτα, τα πρωτόζωα απαιτούν ζωντανούς

ξενιστές (έντομα ή κύτταρα) για να αναπαραχθούν (Bell και Harmalle, 1980).

21 Μεταδίδονται δια στόματος, αλλά τις περισσότερες φορές μεταφέρονται από

γενιά σε γενιά μέσω των ωών ή ανάμεσα στα θηλυκά και αρσενικά ενήλικα σε

φυσικές συνθήκες. Συγκεκριμένα, το πρωτόζωο Nosema plodiae μπορεί να μεταδοθεί,

εκτός από την φυσική πορεία μόλυνσης και μέσω των ωών και μέσω θηλυκού-

αρσενικού εντόμου (Kellen και Lindegren 1971).

Τα συμπτώματα και τα παθολογικά αποτελέσματα που εμφανίζουν οι

μολύνσεις των πρωτόζωων σε έντομα, ποικίλλουν σημαντικά. Οι Kellen και

Lindegren (1973a) για παράδειγμα, απέδειξαν μία φλεγμονή που παρουσίαζαν

προνύμφες λεπιδοπτέρων ύστερα από την επίδραση του Nosema invaders. Η σοβαρή

αυτή φλεγμονή περιλάμβανε έναν εγκλεισμό σε κάψα, των αιμοκυττάρων των

μολυσμένων περιοχών με αποτέλεσμα τη διόγκωση του σώματος των προνυμφών.

Σε περαιτέρω έρευνες τους οι Burkholder και Dicke (1964), παρατήρησαν ένα

κιτρινοπράσινο φθορίζον υλικό του εντόμου Trogoderma glabrum (Herbst) το οποίο

είχε μολυνθεί από το πρωτόζωο Mattesia trogodermae. Το παθογόνο αυτό φάνηκε

κάτω από το υπεριώδες φως. Τέλος, πολλές εργαστηριακές καλλιέργειες πρωτόζωων

αποδεικνύουν μεγάλη επιβίωση και αναπαραγωγή τους σε πολλά είδη εντόμων.

Εκτός από το γεγονός ότι προκαλούν θνησιμότητα σε διάφορα στάδια των

μολυσμένων εντόμων, η μόλυνση από το πρωτόζωα μπορεί να επιμηκύνει το χρόνο

ανάπτυξης των εντόμων, να μειώνει την επιβίωση τους στο στάδιο του ενηλίκου, να

αυξάνει τις παραμορφώσεις των ακμαίων και να καταστρέφει την αναπαραγωγή

(Brooks 1971).

Στην Ευρωπαϊκή αγορά κυκλοφορούν σκευάσματα από δύο είδη πρωτόζωων

της κατηγορίας Microsporidium. Το ένα περιέχει το Nosema locustae και

χρησιμοποιείται με επιτυχία κατά της ακρίδας Locusta migratoria σε σχετικά μεγάλες

λιβαδικές εκτάσεις στη Δ. Αφρική, Ινδία, Β. και Ν. Αμερική, ψεκαζόμενο από αέρος,

22 αλλά και σε δημόσια και ιδιωτικά πάρκα όπου η χρήση συνθετικών εντομοκτόνων

είναι ιδιαίτερα ανεπιθύμητη (Τζανακάκης 1995). Το δεύτερο περιέχει το Vairimorpha

necatrix και χρησιμοποιείται για την καταπολέμηση των λεπιδοπτέρων (Copping,

2001).

Αρκετές έρευνες έχουν διεξαχθεί σχετικά με την διάρκεια ζωής των

εντομοπαθογόνων πρωτόζωων μέσα στις αποθήκες. Ο Ashford (1970) απέδειξε ότι τα

σπόρια των πρωτόζωων ήταν σταθερά για τρείς μήνες σε θερμοκρασία 15οC ή ακόμα

και 30οC ενώ από τον τρίτο μήνα μέχρι τον ένατο παρατηρήθηκε μια μείωση στην

μολυσματικότητα τους, ιδιαίτερα στην υψηλή θερμοκρασία (Τζανακάκης 1995).

Δύο χρόνια αργότερα, ο Μilner (1972, 1973) ανέφερε ότι τα σπόρια του

Nosema whitei δεν παρουσίασαν καμία αξιοπρόσεκτη απώλεια στην ζωτικότητα τους

ακόμα και ύστερα από δεκαπέντε μήνες στην αποθήκη σε θερμοκρασία 4οC. Η

θερμοκρασία κατά την αποθήκευση μελετήθηκε, τέλος και από τους Nara et al.

(1981), όπου διαπιστώθηκε επιβίωση ακόμα και στους -19οC.

1.3.6. Εντομοπαθογόνοι μύκητες

1.3.6.1. Γενικά

Οι μύκητες, αυτές οι μικρές μικροβιακές μονάδες φυτικού χαρακτήρα που δεν

περιέχουν χλωροφύλλη, υπόσχονται ευρεία χρησιμοποίηση στις βιολογικές

αντιμετωπίσεις. Περισσότερα από 400 είδη παθογόνων μυκήτων έχουν απομονωθεί

από έντομα, αλλά μέχρι σήμερα ένας μικρός αριθμός τους έχει αξιοποιηθεί ως

βιοεντομοκτόνα, εξαιτίας της εξάρτησής από υψηλή σχετική υγρασία στο περιβάλλον

και της έλλειψης γνώσεων σχετικά με τους παράγοντες που επηρεάζουν την

τοξικότητά τους (Cameron 1973, Cantel 1974a, Gillespieκαι Claydon 1989, Roberts

και Hajek 1992, ZZ Li et al. 2002, Hajek et al. 2007, Zimmermann 2007).

Στη μειωμένη αξιοποίησή τους, συμβάλλουν και οι τοξίνες που παράγουν

23 αυτά τα παθογόνα και που μπορεί να είναι επιβλαβείς για τον άνθρωπο και τα ζώα.

Επιπλέον, μερικοί μύκητες είναι πολύ απαιτητικοί ως προς την καλλιέργειά τους και

παρουσιάζουν δυσκολίες για τη μαζική παραγωγή τους, ενώ όσοι είναι εύκολο να

καλλιεργηθούν, εμφανίζουν εξασθένηση ύστερα από μακροχρόνια παραγωγή με

τεχνητά μέσα (Gillespie και Claydon 1989, Roberts και Hajek 1992)..

Από τα διάφορα είδη εντόμων, τα πιο ευπαθή σε μυκητολογικές μολύνσεις,

είναι τα Λεπιδόπτερα (προνύμφες), από τα Ημίπτερα (και ειδικότερα από τα

Homoptera) οι αφίδες, είδη που ανήκουν στις Οικογένειες Cicadidae και Coccidae,

από τα Υμενόπτερα τα Vespoidea, από τα Κολεόπτερα είδη της οικογένειας

Scarabeidae και από τα Δίπτερα είδη του γένους Hylemyia και τα κουνούπια (Warui

και Kuria 1983, Stleger et al. 1992, Pingel και Lewis 1996, Vandenberg et al. 1998,

Tefera και Pringle 2003, 2004, Ownley 2004, Hajek et al. 2007) .

Αντίθετα με τους ιούς, τα βακτήρια και τα μικροσπορίδια τα οποία πρέπει να

καταποθούν και να μολύνουν μέσω του εντέρου το έντομο, οι μύκητες σχεδόν πάντα

μολύνουν τον έντομο-στόχο με απευθείας διάτρηση του εξωσκελετού (Roberts 1981,

Hajek και St. Leger 1994, ZZ Li et al. 2002, Zimmermann 2007). Συχνά οι μύκητες

εξαρτώνται πολύ από το περιβάλλον, κυρίως όσον αφορά τα αρχικά στάδια μόλυνσης.

Έτσι, οι πιο σημαντικοί παράγοντες που παίζουν ρόλο στην εκδήλωση ασθένειας από

τα παθογόνα αυτά, είναι η θερμοκρασία και η υγρασία. Η σχετική υγρασία

περιβάλλοντος στις περισσότερες περιπτώσεις θα πρέπει να είναι πολύ αυξημένη,

δηλαδή, μεγαλύτερη από 85-90%, ώστε να επιτυγχάνεται αποτελεσματική δράση των

εντομοπαθογόνων μυκήτων(Cameron 1973, Cantel 1974a, Roberts 1981, Gillespie

και Claydon 1989, Roberts και Hajek 1992, Zimmermann 2007).

Όταν ένα έντομο προσβληθεί από ένα μύκητα παθογόνο, ο μύκητας αυτός

διαπερνά την επιδερμίδα και αναπτύσσει σιγά-σιγά στο εσωτερικό του εντόμου το

24 μυκήλιο του, κατακλύζοντας έτσι όλους τους ιστούς και με τις τοξίνες που παράγει,

έχει σαν αποτέλεσμα τη θανάτωση του ξενιστή. Στη συνέχεια ο μύκητας εμφανίζεται

εξωτερικά με μυκήλιο και επανθίσεις και παρατηρούνται στην επιδερμίδα του

εντόμου κονιδιοφόροι από τους οποίους γίνεται η διασπορά του παθογόνου (Gillespie

και Claydon 1989, Roberts και Hajek 1992, Hajek και St. Leger 1994). Σε ορισμένες

περιπτώσεις, οι μύκητες εντοπίζονται σε συγκεκριμένα όργανα του ξενιστή τους,

όπως για παράδειγμα οι μύκητες Massospora cicadinaκαι Strongwellsea castrans

που απαντώνται μόνο στην κοιλιακή χώρα των ενήλικων εντόμων (Poinar 1977).

Πίνακας 1.3.6.1.1.: Τάξεις και μερικά είδη εντομοπαθογόνων μυκήτων

ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΑΞΕΙΣ ΚΑΙ ΕΙΔΗ ΕΝΤΟΜΟΠΑΘΟΓΟΝΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ

Α. ΦΥΚΟΜΥΚΗΤΕΣ Entomophthorales

-Entomophthoraspp., Zoophthoraspp., Erynia spp.

-Massospora (M.cicadina), Conidiobolus spp.

Blastocladiales

-Coelomomyces spp. (C. stegomyiae, C. tamaniensis, παθογόνακουνουπιών)

Lagenidiiales

-Lagenidium giganteum( παθογόνοκουνουπιών)

Β. ΑΣΚΟΜΥΚΗΤΕΣ Ascosphaerales

-Bettsiasp.

-Ascophaera (παθογόναμελισσών) (A. apis)

Myriangiales

-Myriangium spp.(παθογόνα Coccoidae)

Sphaeriales

-Cordycepsspp.

-Torrubiellaspp.

-Hypocrellaspp.

25 Γ.ΑΤΕΛΕΙΣ ΜΥΚΗΤΕΣ Moniliales

-Beauveriaspp.(B.bassiana, παθογόνο πολλών είδών εντόμων),(B. tenella=B. bronchgiarti)

(παθογόνο του Melolonthamelolontha).

-Metarhizium (M.robertsii) [παθογόνοτουAnisopliaeaustiaca (Scarabaeidae)]

-Nomuraea (= Spicaria) (N. rileyi) (παθογόνοτουTrichoplusiani κ.α Noctuidae)

-Paecilomyces

-Hirsutella (H. thompsonii) (παθογόνοτουακάρεωςPhyllocoptuta oleivora)

-Culicomyces clavosporus

-Verticillium lecanii

-Tolypocladium cylindrosporum

Sphaeropsidales

-Aschersonia (A. aleurodis) (παθογόνοτων Aleurodidae)

1.3.6.2.Σπόρια

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες μολύνουν τον ξενιστή τους με κονίδια. Νερό,

ευνοϊκές συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας απαιτούνται για την επιτυχή

βλάστηση του σπορίου και την ανάπτυξη του. Η βλάστηση του κονιδίου και η

συμπεριφορά του βλαστικού σωλήνα φαίνεται να παρουσιάζουν ομοιότητες μεταξύ

των Entomophtorales.

Η βλάστηση του κονιδίου οδηγεί είτε στην δημιουργία δευτερογενών κονιδίων

είτε στην δημιουργία ενός η περισσοτέρων βλαστικών σωλήνων. Ο βλαστικός

σωλήνας (germtube) που δημιουργείται διατρυπά απευθείας το δερμάτιο της

επιδερμίδας του εντόμου.

Το δερμάτιο είναι μία πολύ σύνθετη δομή συντιθέμενη από πρωτεΐνες, χιτίνη

και λιπαρά οξέα (Hackman, 1974). Αποτελείται από δυο στρώματα το επί-επιδερμίδιο

(epicuticle)και το επιδερμίδιο (procuticle). Τα κονίδια του εντομοπαθογονού μύκητα

που προσκολλούνται στο δερμάτιο του ξενιστή απαιτούν συνήθως 12 – 24 ώρες πριν

βλαστήσουν.

26 Μέσα στο σώμα του ξενιστή – εντόμου το παθογόνο πολλαπλασιάζεται με

τμήματα υφών, βλαστοσπόρια. Σύμφωνά με τους Prasertphon και Tanada(1968), τα

τμήματα των υφών ποικίλουν σε μέγεθος και σχήμα.

1.3.6.3. Προσκόλληση - Βλάστηση - Διείσδυση

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες είναι μοναδικοί συγκρινόμενοι με άλλους

μικροοργανισμούς που προκαλούν ασθένειες σε έντομα – στόχους επειδή οι

περισσότεροι εισέρχονται από το επιδερμίδιο και όχι μέσω του πεπτικού σωλήνα

(Hajek et al. 2007). Η μόλυνση ενός εντόμου από εντομοπαθογόνο μύκητα αρχίζει με

την προσκόλληση των αναπαραγωγικών του δομών στο επιδερμίδιο (Boucias et al.

1988). Το επιδερμίδιο του εντόμου είναι το πρώτο εμπόδιο που έρχεται σε επαφή είτε

με τα βιολογικά είτε με τα χημικά εντομοκτόνα. Σχηματίζεται από αρκετές στοιβάδες

οι οποίες χωρίζονται από έξω προς τα μέσα σε επί-επιδερμίδιο, προ-επιδερμίδιο και η

επιδερμίδα

Το επί-επιδερμίδιο είναι λεπτό (0.1 – 3μm), πολύστοιβο και η κάθε στοιβάδα

έχει διαφορετική χημική σύσταση και ιδιότητες (Juarezκαι Calderon2006,Pedrini et al. 2006). Η εξωτερική στοιβάδα αποτελείται από λιπίδια, είναι υδατοαποθωτική και

ανθεκτική στην ενζυμική αποικοδόμηση αποτελώντας το κυριότερο εμπόδιο για την

είσοδο των αποικοδομητικών ενζύμων του μύκητα στο επιδερμίδιο.

Η δημιουργία βλαστικού σωλήνα που σχηματίζεται το κονίδιο του μύκητα

φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στην εδραίωση του παθογόνου στο έντομο

(Wraight et al. 1990, Lu et al. 2008)

Διασυνδέσεις δημιουργούνται μεταξύ της εξωτερικής στοιβάδας του επί –

επιδερμιδίου του ξενιστή και του κυτταρικού τοιχώματος ή και του εξωκυτταρικού

πλέγματος του μύκητα. Συνακόλουθα, ο παθογόνος μικροοργανισμός αντιδρά στα

27 φυσικό – χημικά «ερεθίσματα» του ξενιστή οδηγούμενος σε ένα ή συνδυασμό των

παρακάτω σεναρίων

1. φτωχή/καλή προσκόλληση

2. καλή/φτωχή εκβλάστηση

3. αργή/γρήγορη εκβλάστηση

4. δημιουργία βλαστικού σωλήνα

5. διαφοροποίηση σε απρεσσόριο (appressorium) (Butt, 2002)

Τα υδρόφοβα κονίδια προσκολλούνται με μη ειδικό τρόπο, στο επί –

επιδερμίδιο, ασχέτως αν το έντομο είναι ανθεκτικό ή ευαίσθητο στο παθογόνο

μύκητα (Boucias et al. 1988). Εντούτοις, η παραγωγή διεισδυτικού βλαστικού

σωλήνα (penetration germ tube) δε συμβαίνει σε ανθεκτικούς ξενιστές.

Η διαδικασία της εκβλάστησης απαιτεί την παρουσία τόσο θρεπτικών

συστατικών για την δημιουργία βλαστικού σωλήνα όσο και την κατάλληλη υγρασία.

Εκτός από τις κατάλληλες χημικές συνθήκες, η τοπολογία της επιφάνειας του

επιδερμιδίου φαίνεται να παίζει ρόλο στην προσκόλληση, την εκβλάστηση και την

δημιουργία απρεσσορίου (St Leger et al. 1989b, 1991a, b, Butt et al. 1995)

Για την βλάστηση των σπορίων του εντομοπαθογόνου μύκητα B.bassiana

απαιτείται η παρουσία πηγής άνθρακα ενώ μια πηγή αζώτου είναι απαραίτητη για την

περαιτέρω ανάπτυξη του μύκητα (Smith και Grula, 1982).

Στην περίπτωση του M. robertsii, η παρουσία νερού ενεργοποιεί την πρώτη

φάση βλάστησης των κονιδίων αλλά η περαιτέρω ανάπτυξη και ο σχηματισμός

βλαστικού σωλήνα εξαρτάται από εξωγενείς πηγές άνθρακα (Charnley 1990)

Σε πολλές περιπτώσεις το επιδερμίδιο του εντόμου περιέχει ενώσεις που

28 λειτουργούν μυκοτοστατικά, εμποδίζοντας την ανάπτυξη των υφών. Επί – επιδερμικά

λιπίδια, λιπαρά οξέα και φαινολικές ενώσεις του επιδερμιδίου είναι ορισμένες από τις

ουσίες που έχουν προταθεί ότι δρουν μυκητοστατικά (Smith και Grula 1982, Lecuona

et al. 1997,Vega et al. 1997).

Είναι πιθανό η επιτυχής εκβλάστηση των υφών να εξαρτάται από την

ικανότητα του παθογόνου μύκητα να παράγει ένζυμα που καταστρέφουν –

αδρανοποιούν τις μυκοστατικές ή τοξικές ενώσεις του επιδερμιδίου. Δεν υπάρχει

αμφιβολία ότι το επιδερμίδιο του εντόμου επηρεάζει την προσκόλληση των σπορίων,

την εκβλάστηση και διαφοροποίηση των μυκητιακών δομών (Butt et al. 1995,

Lecuona et al. 1997)

Τα περισσότερα κονίδια βλαστάνουν 6 – 18 ώρες μετά, ενώ αυτά που θα

βλαστήσουν με την πάροδο 24 ωρών θεωρούνται ότι ήταν δευτερογενή η τριτογενή

κονίδια.

Όταν τα κονίδια του μύκητα προσκολληθούν σε υδρόφοβες, σκληρές και

φτωχές σε θρεπτικά υλικά επιφάνειες, τότε αυτά διαφοροποιούνται σε απρεσσόρια.

Το μέγεθος και το σχήμα του απρεσσορίου εξαρτάται από το είδος και το στέλεχος

του μύκητα καθώς και τα χαρακτηριστικά του επιδερμιδίου (Butt etal. 1995).Όλα τα

στελέχη του είδους M. robertsii παράγουν απρεσσόρια ενώ η ιδιότητα αυτή δεν είναι

καθολική στα στελέχη του είδους Beauveria. Τα απρεσσόρια των περισσότερων

μυκήτων παράγουν άφθονη βλέννα που βοηθούν στην προσκόλληση του μύκητα

κατά τη διάρκεια της διείσδυσης.

Φαίνεται να είναι κοινό μεταξύ των μυκήτων οι διεισδυτικές υφές να

αναπτύσσονται πλευρικά, παράλληλα προς τα ελικοειδή στρώματα διασπώντας την

ακεραιότητα του δερμάτιου και χωρίζοντας το επί-επιδερμίδιο από το επιδερμίδιο.

(Mohamed et al. 1978, Brey et al. 1986, Brobyn et al. 1987, Hajek et al. 2007).

29 Οι βλαστικοί σωλήνες εμφανίζουν δυο τύπους συμπεριφοράς είτε απευθείας

διείσδυση εντός του δερματίου με μια ακτίνα 30 μμ από το κονίδιο είτε με

περιφερειακή ανάπτυξη επί της επιφάνειας του δερματίου. Η διείσδυση τις

περισσότερες φορές λαμβάνει μέρος στην κοιλιά και σε μικρότερη έκταση από τον

θώρακα και σε καμία περίπτωση από κεφάλι ή από άλλα σωματικά άρθρα.

Οι διεισδυτικές βλαστικές υφές δεν εμφανίζουν απρεσσόρια ούτε σημάδια από

τομές γύρω από το σημείο διείσδυσης, όμως εκκρίνουν de novo ένα βλεννώδες

στρώμα που απλώνεται ελαφρά πάνω από δερμάτιο και γύρω από διεισδυτική

βλαστική υφή σαν θήκη. Η προσκολλητική φύση αυτού του στρώματος παρέχει την

απαραίτητη μηχανική υποστήριξη κατά την αρχική διείσδυση. Καθώς οι διεισδυτικές

υφές περνούν διαμέσου του επιδερμιδίου οδηγούν σε αποδιοργάνωση τις εξωτερικές

και εσωτερικές στοιβάδες του δερματίου.

Κατά την φάση της διείσδυσης μια ημιδιαφανής ζώνη ανάμεσα στον βλαστικό

σωλήνα και στην επιδερμίδιο γίνεται εμφανής γεγονός που υποδηλώνει ενζυματική

ιστόλυση.

1.3.6.4. Αναγνώριση Ξενιστή – Πορεία της μόλυνσης.

Ο ακριβής τρόπος με τον οποίο ένας παθογόνος μύκητας αναγνωρίζει τον

ξενιστή δεν είναι ξεκάθαρος. Στην περίπτωση των φυτοπαθογόνων μυκήτων έχει

μήπως παρατηρηθεί ότι ο μύκητας παράγει ένα ειδικό μόριο (elicitor) το οποίο

ανιχνεύεται από μεμβρανο συνδεόμενους υποδοχείς του κυττάρου ξενιστή. Αυτή η

σύνδεση ενεργοποιεί το σχηματισμό ειδικών προϊόντων τα οποία με τη σειρά τους

επάγουν την παραγωγή ενζύμων από το παθογόνο που επιτίθεται στο κυτταρικό

τοίχωμα (Butt, 2002). Αντίστοιχο τρόπο δράσης φαίνεται να υιοθετούν και οι

εντομοπαθογόνοι μύκητες.

Επίσης έχουν στην διάθεση τους μια πολύπλοκη σειρά μηχανισμών που τους

30 επιτρέπει να ξεπεράσουν τους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή. Οι μηχανισμοί αυτοί

στηρίζονται κυρίως στα ενζυμικά συστήματα που βοηθούν το παθογόνο να

διαφοροποιήσει την δομική ακεραιότητα του ξενιστή και τοξίνες που αναστέλλουν

επιλεκτικές διαδικασίες ή ενζυμα ή ρυθμιστικά συστήματα του ξενιστή. Οι αιτίες που

οδηγούν συνήθως στον θάνατο του ξενιστή του ξενιστή

1. Η καταστροφή ιστών

2. Οι τοξίνες

3. Η προκαλούμενη εξ αιτίας του μύκητα ασιτία

Στην αναγνώριση των ξενιστών συμμετέχουν γονίδια και προϊόντα

εξειδικευμένων γονιδίων παθογένειας του μύκητα καθώς και γονίδια ανθεκτικότητας

του ξενιστή. Όταν αναγνωριστεί σήμα από τον παθογόνο μύκητα, επάγεται η

ανάπτυξη και η διαφοροποίηση του ενώ ταυτόχρονα οι τοξικές ουσίες που

παράγονται οδηγούν στο θάνατο του εντόμου – ξενιστή (Hajek et al. 2007).

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες περιέχουν ένα πολύπλοκο σύστημα

σηματοδότησης ( περιλαμβάνει G πρωτεΐνες, υποδοχείς, κινάσες και δευτερογενείς

μηνύτορες) που ρόλο έχει την αναγνώριση του ξενιστή και την επαγωγή σύνθεσης

των καταλλήλων αποικοδομητικών ενζύμων (Butt2002). Τα υδρολυτικά ένζυμα

πιθανά να απελευθερώνουν σηματοδοτικά μόρια και να καταστρέφουν

μυκητοστατικές ενώσεις. Η είσοδος του παθογόνου στο εσωτερικού του εντόμου –

ξενιστή καταλήγει στην αποδιοργάνωση των φυσιολογικών λειτουργιών του (Hajek et al. 2007).

Το τελικό αποτέλεσμα τέτοιων πολύπλοκων διεργασιών καθορίζει τη

συμβατότητα μύκητα – ξενιστή καθώς και την ταχύτητα με τη οποία οι

εντομοπαθογόνοι μύκητες εισέρχονται στην αιμολέμφο και προκαλούν το θάνατο στο

έντομο.

31 Όταν ο μύκητας φθάσει στην αιμόκοιλο, αναπτύσσει λεπτότοιχες μόνο- ή

πολυκύτταρικες υφές. Ορισμένες φορές τα σφαιρικά – ωοειδή εκβλαστήματα

αναφέρονται σα βλαστοσπόρια. Κατά τη διάρκεια της φάσης εποικισμού ο μύκητας

πρέπει να αντιμετωπίσει την ανοσολογική απόκριση του εντόμου – ξενιστή γι αυτό

παράγει δευτερογενείς μεταβολίτες (κυκλοδεψιπεπτιδια, κυκλοσπορίνες,

δεστρουξίνες) που φαίνεται να καταστέλλουν την κυτταρική και χημική άμυνα του

έντομου (Vilkinsckas et al. 1997a,Gillespie et al. 2000,Vey et al. 2001) και ο μύκητας

θα ολοκληρώσει τον κύκλο του σχηματίζοντας εξωτερικά κονιδιοφόρους οι οποίοι

συνήθως εμφανίζονται από αδύνατα ή εξασθενισμένα σημεία του εντόμου (Humber.

1991).

1.3.6.5. Εμπορικά μικροβιακά σκευάσματα με βάση μύκητες

Ο πιο μελετημένος μύκητας είναι ο B. bassiana, ένα παθογόνο πολλών

γεωργικών εντόμων. Όμως, ένας μικρός αριθμός ερευνών έχει διεξαχθεί μέχρι

σήμερα, σχετικά με τους εντομοπαθογόνους μύκητες που καταπολεμούν διάφορα

έντομα.

Συγκεκριμένα, οι Ferron και Robert 1975, απέδειξαν την ευαισθησία του

εντόμου Acanthoscelides obtectus (Say) σε αρκετούς μύκητες, συμπεριλαμβανομένου

και τους B .bassiana, B. tenella, M. robertsii και I. fumosorosea. Εντούτοις, η

δυνατότητα αυτών των οργανισμών ως μέσα μικροβιακού ελέγχου δεν

προσδιορίστηκε. Οι Davis και Smith (1977), αντίθετα ασχολήθηκαν με τις συνθήκες

κάτω από τις οποίες μπορούν να καλλιεργηθούν ορισμένοι μύκητες, ώστε η

παραγωγή των διαφορετικών τοξικών μεταβολιτών τους να συμβάλλει στην ανάπτυξη

και το θάνατο των εντόμων στόχων.

Ύστερα από αυτές τις μελέτες, ένα πλήθος ακόμη, μυκήτων έχει απομονωθεί

και δοκιμάζονται στα εργαστήρια. Εκτός από το Beauveria bassiana, τα παθογόνα

32 εκείνα που έχουν κριθεί ως κατάλληλα για βιολογική καταπολέμηση μέχρι τώρα είναι

τα Lecanicillium (Verticillium) lecanii και Metarhizium robertsii (Bischoff et al.

2009).

Κατά τον Γιαμβριά (1991), κυκλοφορούν λίγα παρασκευάσματα που έχουν ως

βάση εντομοπαθογόνους μύκητες. Ένα από αυτά έχει το μύκητα B. bassiana ως

δραστικό παράγοντα. Ο πολλαπλασιασμός του γίνεται με τη μορφή των

βλαστοσπορίων..

Το 1976 η Abbott Laboratories ανέπτυξε μέθοδο για την παραγωγή βρέξιμης

σκόνης με βάση το μύκητα Hirsutella thompsoni με μεγάλη περιεκτικότητα σε

κονίδια. Τελευταία έχει κυκλοφορήσει στο εμπόριο από την Ολλανδική εταιρία

Koppert ένα μυκητολογικό παρασκεύασμα το MYCOTAL σε μορφή βρέξιμης σκόνης

που έχει ως βάση κονιδιοσπόρια του μύκητα Lecanicillium (Verticillium) lecanii και

έχει δραστική ικανότητα μεγάλη, εναντίον του εντόμου Trialeurodes vaporariorum,

του γνωστού αλευρώδη των θερμοκηπίων.

Πολλά από αυτά τα παρασκευάσματα που περιέχουν μύκητες, έχουν

χρησιμοποιηθεί στην πράξη με πολύ καλά αποτελέσματα σε διάφορες καλλιέργειες,

ακόμη και για την καταπολέμηση εντόμων υγειονομικής σημασίας. Έτσι, εκτός από

το MYCOTAL, αποτελεσματικό εναντίων πολλών αφίδων είναι το VERTALEC με

βάση το V. Lecanii, ενώ για την καταπολέμηση του βοτρύτη στον φυτοπαθολογικό

τομέα υπάρχει το βιολογικό σκεύασμα TRICHODEX που περιέχει σπόρια του

μύκητα Trichoderma harzianum (φυλή Τ39). Τα τρία αυτά βιολογικά προϊόντα,

κυκλοφορούν σήμερα με ικανοποιητικά αποτελέσματα.

Αν και η βιομηχανική παραγωγή σκευασμάτων με εντομοπαθογόνους μύκητες

είναι φτωχή, η παραγωγή από κρατικούς φορείς και Ερευνητικά Ιδρύματα, διαφόρων

μυκητολογικών σκευασμάτων για χρήση σε περιορισμένη έκταση, είναι αρκετά πιο

33 σημαντική, καθώς οι μύκητες είναι ικανότατα παθογόνα για τη μείωση των

πληθυσμών των επιβλαβών εντόμων καλλιεργειών και η χρησιμοποίησή τους στην

πράξη έχει προχωρήσει σε ικανοποιητικό στάδιο.

Στην Ελλάδα κυκλοφορεί μόνο το εμπορικό σκεύασμα του B. bassiana

(Naturalis SC) για την αντιμετώπιση αφίδων, αλευρωδών και θριπών, το οποίο έχει

δείξει υψηλή αποτελεσματικότητα και επί άλλων εντομολογικών εχθρών. Επίσης

κατά το παρελθόν έχουν δοκιμαστεί εμπορικά σκευάσματα του Verticillium lecanii

(Mycotal, Vertalec) εναντίον αλευρωδών, θριπών, αφίδων και κοκκοειδών με

ικανοποιητικά αποτελέσματα.

Στο εξωτερικό κυκλοφορούν εμπορικά σκευάσματα και άλλων μυκήτων όπως

του Beauveria brongniartii (=B. tenella) για την αντιμετώπιση κολεοπτέρων

Scarabeidae, του Lagendium giganteum για την αντιμετώπιση διπτέρων, του M. robertsii (Bischoff et al. 2009)για την αντιμετώπιση κολεοπτέρων, λεπιδοπτέρων και

ισοπτέρων, του M. anisopliae acridium για την αντιμετώπιση ορθοπτέρων, του M. robertsii για την αντιμετώπιση του κολεοπτέρου Dermolepida albohirtum

(Scarabeidae), του M. robertsii strain ICIPE 30 για την αντιμετώπιση ισοπτέρων και

θυσανοπτέρων, του M. flavoviridae flavoviridae για την αντιμετώπιση του

κολεοπτέρου Adoryphorus coulonii (Scarabeidae) και του I. fumosorosea για την

αντιμετώπιση αφίδων, αλευρωδών, θριπών και αραχνοειδών.

1.3.6.6. Παράγωγα μυκύτων –μυκοτοξίνες

Οι μυκοτοξίνες είναι φυσικά απαντώμενες φυσικές ουσίες, χημικής σύνθεσης,

που παράγονται από μύκητες που προσβάλλουν φυτικούς ή ζωικούς οργανισμούς.

Απαντώνται αρκετά συχνά στα ζώα αλλά και στον άνθρωπο και μπορούν να

προκαλέσουν τοξικά σύνδρομα. Σε εργαστηριακό επίπεδο έχουν περιγραφεί πάνω

34 από 300 μυκοτόξίνες (Smithetal. 1994).

Σχεδόν όλες οι συνθέσεις που θεωρούνται μυκοτοξίνες και δοκιμάζονται στα

έντομα, έχει αποδειχθεί ότι έχουν παρόμοιες επιδράσεις στα περισσότερα, όπως π.χ.

τη μείωση του βαθμού ανάπτυξης καθώς και μορφολογικές, ιστολογικές και

αναπαραγωγικές αλλαγές.

Η σχετική τοξικότητα μιας συγκεκριμένης μυκοτοξίνης ποικίλει σημαντικά

από έντομο σε έντομο. Ακόμη, η συνύπαρξη διαφορετικών μυκοτοξινών σε φυτικά

υλικά μπορεί να καταλήξει σε αθροιστικές επιδράσεις σε έντομα που τρέφονται από

αυτά (Smith et al. 1994).

Αν και τα έντομα είναι πιθανόν η μόνη ομάδα μικροοργανισμών η οποία φέρει

μια εκτεταμένη αντίσταση στις μυκοτοξίνες, αρκετά πειράματα έχουν δώσει αρκετά

καλά αποτελέσματα.

Μίξη από trichothecens και non-trichothecensses guiterpenes από το Fusarium

gramineavum, σε χαμηλές μάλιστα συγκεντρώσεις, έχει δείξει ότι μπορεί να

ενεργήσει εναντίων των Spodoptera fudgiperda (Lepidoptera) και των Heliothis zea

(Lepidoptera)(Smith et al., 1994).

Στα ίδια Λεπιδόπτερα, ο συνδυασμός των deoxynivalend (DON) σε 25 mg/g

με dihydroxycalonetrin (DHCAL) σε 10 mg/g έδειξε σε διάστημα 7 ημερών

θνησιμότητα 29.3 % στη Spondoptera fudgiperda και 61.5 % στο σκουλήκι του

καλαμποκιού (Smith et al. 1994).

35

1.3.6.7. Ο Μύκητας Beauveria bassiana

Εικόνα1.3.6.7.1: Ο μύκητας B. bassiana (Balsamo) Vuillenim Capinera – Encyclopedia of Entomology

2008.

O μύκητας Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Hypocreales:

Cordycipitaceae) συνίσταται για την καταπολέμηση της πυραλίδας του καλαμποκιού

(Ostrinia nubilalis) των αφίδων, των θριπών, των αλευρωδών, των κολεοπτέρων και

ορισμένων ημιπτέρων (Warui και Kuria 1983, Stleger et al. 1992, Pingel και Lewis

1996, Vandenberg et al. 1998, Keller et al. 1997, 1999, Tefera και Pringle 2003, 2004,

Ownley 2004, Liu et al. 2006). Είναι μύκητες κοσμοπολίτικοι, ατελείς, απλοειδείς και

παραγωγοί βιολογικά ενεργών μεταβολιτών (Ferron et al. 1991). Το όνομα της, το

πήρε από τον ιταλό εντομολόγο Agostino Bassi, οποίος και την ανακάλυψε το 1835

ως αίτιο για την άσπρη επίστρωση (μούχλα) που βρέθηκε πάνω στο Bombyx mori

(Ferron 1981, Stleger et al. 1992, Robertson et al. 2007, Zimmermann 2007). Ο

πρώτος ταξινομικός χαρακτηρισμός του μύκητα που προκαλούσε την ασθένεια – white muscardina - δόθηκε από τον Balsamo – Crivelli όταν ονόμασε το παθογόνο

Botrytis bassiana. Μόλις το 1912 χαρακτηρίστηκε τυπικό είδος από τον Vuillemin

(Εικ 1.3.6.7.3).

36 Οι μύκητες του γένους Beauveria χαρακτηρίζονται μορφολογικά από

ελικοειδή συσσωματώματα σφαιρικών έως και φιαλοειδών, κονιδιοφορέων. Το σχήμα

των κονιδίων μπορεί να είναι σφαιρικό, ελλειψοειδές, νεφροειδές μέχρι και

κυλινδρικό και το μέγεθος κυμαίνεται από 1,7μm έως 5.5 μm. Ο εντομοφάγος αυτός

μύκητας εισβάλλει στο σώμα του εντόμου. Τα κονίδια του έρχονται σε επαφή με την

επιδερμίδα του εντόμου και αφού βλαστήσουν, διαπερνούν την επιδερμίδα και

πολλαπλασιάζονται μέσα στο σώμα του εντόμου (Hall και Higgens 1982, St leger et al. 1992, St leger 1993, Inglis et al 1996; Roditakis et al. 2000, Robertson et al. 2007,

Lu et al. 2008). Τα κονίδια του μύκητα είναι μονοκύτταρα, απλοειδή και υδρόφοβα

(Hall και Higgens 1982, Charnley 1984, StLeger et al. 1992, Jeffs και Khachatourians

1997, Leckie et al. 2002, Quesada-Moraga και Vey 2004, Rehner και Buckley 2005,

Robertson et al. 2007). Η υψηλή υγρασία είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό

των κονιδίων και η μόλυνση ολοκληρώνεται μέσα σε 24-48 ώρες αναλόγως της

θερμοκρασίας (Hall και Higgens 1982, Charnley 1984, Miranpuri και Khachatourians

1991, St Leger et al. 1992, Jeffs και Khachatourians 1997, Leckie et al. 2002,

Quesada-Moragaκαι Vey 2004). Το έντομο μπορεί να επιζήσει μέχρι και 3-5 μέρες

αφού μολυνθεί (Champlinκαι Grula 1979, Charnley 1984).

Η διείσδυση του εντομοπαθογόνου μύκητα B. bassiana από την επιδερμίδας

του εντόμου (π.χ., Helicoverpa Zea) πραγματοποιείται με δημιουργία βλαστικού

σωλήνα αντιθέτως δεν δημιουργεί απρεσσόρια. Μόλις οι βλαστικοί σωλήνες

διεισδύσουν στα επιδερμικά κύτταρα, τότε ο μύκητας αναπτύσσεται προς την

κατεύθυνση της αιμολέμφου όπου τα βλαστοσπόρια γίνονται εμφανής σε περίπου 48

ώρες μετά τη μόλυνση. Το λεπιδόπτερο Heliocoverpa Zea, εμφανίζει πολύ μικρή

ζημία ιστούς και μετά 60-70 ώρες εμφανίζεται λοίμωξη, όταν το σωματικό λίπος

εμφανίζει σημάδια φθοράς. Το έντερο και Μαλπιγγειαννοί σωλήνες επηρεάζονται σε

37 6-7 ημέρες, όταν ο θάνατος και η μουμιοποίηση συμβούν. Ωστόσο, το έντερο, οι

μυείς, αδένες μεταξιού και το τραχειακό σύστημα της προνύμφης μπορεί να

παραμείνουν ανέπαφα καθόλη την διάρκεια της λοίμωξη. Ο θάνατος είναι πιθανό να

οφείλεται στη εξάντληση θρεπτικών συστατικών, αφυδάτωση, και / ή από την

παραγωγή τοξίνης από το μύκητα.

Ο B. bassiana κατά την ανάπτυξη του εντός του εντόμου παράγει τις τοξίνες

Μποβερισίνη, Μποβερολίντες (Beauverolides), Μπασσιoνολίντες (Bassionolide)

καθώς και αντιβακτηριδιακές ουσίες που παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των

σαπροφυτικών βακτηρίων ευνοώντας την ανάπτυξη του μύκητα (Hamil 1969,

Bernardini et al. 1975, Charnley 1984, 1990, Prior 1991, Hajek και Leger 1994,

Jegorov et al. 1994, Leckie et al. 2002, Quesada-Moraga καιV ey 2004, Isaka et al.

2005, Rehner και Buckley 2005). Η Μποβερισίνη (Beauvericin) είναι ένα βιοενεργό

εξαδεπσιπεπτίδιο αποτελούμενο από τρία μόρια N – μέθυλο – D – φενιλαλανινή και

τρία μόρια 2 – υδροξυισοβαρελλικόοξύ και έχει εντομοκτόνο και αντιμικροβιακή

δράση και σαν λιπόφιλη έχει τη δυνατότητα της βιοσυσσώρευσης (Hamil 1969,

Broome et al. 1976, Charnley, 1990, Jegorov et al. 1994, Quesada-Moraga και Vey

2004, Rehner και Buckley 2005). Οι Μποβερολίντες (Beauverolides) είναι

κυκλοτετραδεπσιπεπτιδία που περιέχουν γραμμικά και διακλαδισμένα 9 άτομα

άνθρακα (C9) ή C11 – b – υδρόξυοξύ (Charnley 1990, Jegorov et al. 1994, Quesada-

Moraga και Vey 2004, Rehner και Buckley 2005). Η Μπασσιoνολιντή (Bassionolide)

είναι ένα εντομοκτόνο κυκλοδεπσιπεπτίδιο του οποίου η δομή συντίθεται από 4

μονάδεςD – aυδρόξυ-ισοβαλεριλίνηL – N – μεθυλόλευκίνη (Hamil 1969, Broome et al. 1976, Jegorov et al. 1994, Leckie et al. 2002, Quesada-Moraga και Vey 2004,

Rehner και Buckley 2005).

Ο μύκητας αναπτύσσεται ικανοποιητικά στους 20οC – 30oC με άριστους τους

38 25oC - 30oC. Σπόρια παράγονται σε 15 - 35oC ενώ κάτω 10oC και άνω των 35oC δεν

παράγονται. Διατηρούν δε την βλαστικότητα τους στους 8oC για 12 μήνες

(Champlinκαι Grula 1979, Jeffs και Khachatourians 1997, Robertson et al. 2007).

Πρόσφατα απομονώθηκε η τέλεια μορφή του μύκητα που προέρχεται από του

μύκητες του γένους Cordycepes, καταδεικνύοντας ότι ορισμένα είδη Beauveria έχουν

εγγενές στάδιο (Li et al. 2001, Rehner και Buckley 2005) .

Στην Ευρώπη κυκλοφορούν εμπορικά σκευάσματα όπως τα Naturalis-L, Bio-

power, Botanigard κ.α. Ο μύκητας αυτός δεν παρουσιάζει φυτοτοξικότητα ούτε

δημιουργεί τοξικότητες σε πτηνά, ζώα και ψάρια (Copping 2001)Τa προϊόντα αυτά

που περιέχουν τα κονίδια του μύκητα μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνα τους ή σε

συνδυασμό με άλλα εντομοκτόνα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με

μυκητοκτόνα και σε περίπτωση που πρέπει να γίνει εφαρμογή μυκητοκτόνων πρέπει

να έχουν περάσει 48 ώρες από την εφαρμογή του προϊόντος.

39

Εικόνα1.3.6.7.2.: Ο Βιολογικός κύκλος του εντομοπαθογόνου μύκητα Beauveria bassiana (Vega et al.

2008.

Εικόνα 1.3.6.7.3. Προσβεβλημένες προνύμφες του εντόμου S.nonagrioides από τον εντομοπαθογόνο

μύκητα Beauveria bassiana.

40 1.3.6.8. Ο Μύκητας Metarhizium robertsii

Εικόνα1.3.6.8 1.: O μύκητας Metarhizium robertsii από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Capinera –

Encyclopedia of Entomology 2008)

Ο Metarhizium robertsii (Bischoff et al. 2009) (Metchnikoff) Sorokin

(Hypocreales: Clavicipitaceae) γνωστός παλαιότερα ως Metarhizium anisopliae var

anisopliae, είναι ιένα μύκητας που συναντάμε σε ολόκληρο τον κόσμο, αναπτύσσεται

φυσικά στο έδαφος και προσβάλει διάφορα έντομα λειτουργώντας σαν παράσιτο.

Απέκτησε το όνομα του όταν το 1879 ο I.I. Mechnikov, τον απομόνωσε από σκαθάρι

Anisoplia austriaca. Στην συνέχεια τον χρησιμοποίησε για τον έλεγχο του

κολεοπτέρου Cleonus punctiventris και ο οποίος τελικά το συνέστησε για τη

Βιολογική αντιμετώπιση των εντόμων (Ferron 1981, Tefera και Pringle 2004,

Robertson et al. 2007). Το κοινό όνομα με το οποίο αποδίδεται η ασθένεια που

41 προκαλούν οι μύκητες του γένους Metarhizium είναι –green muscardine- εξαιτίας των

πρασίνων κονιδίων που καλύπτουν τα νεκρά έντομα (Εικ 1.3.6.8.4).

Έχει αναφερθεί ότι προσβάλει περίπου 200 είδη εντόμων (Robertsκαι Humber

1981, McCoy et al. 1988, St. Leger 1992, Driver et al. 2000, Roberts και St. Leger

2004, Tefera και Pringle 2004, Liu et al. 2006, Kabaluk et al. 2007, Robertson et al.

2007) και άλλων αρθροπόδων. Οι μύκητες του είδους M. robertsii ήταν οι πρώτοι

παγκοσμίως που χρησιμοποιήθηκαν μαζικά για τον έλεγχο των εντόμων (Robertsκαι

Humber 1981, McCoy et al. 1988, St. Leger 1992, 1993, Driver et al. 2000). Αν και

παρουσιάζει μεγάλα ποσοστά θνησιμότητας στα έντομα δεν αποτελεί κίνδυνο για τα

θηλαστικά παρά μόνο μπορεί να προκαλέσει αλλεργικές αντιδράσεις σε ευαίσθητα

άτομα. Παράλληλα μπορεί να εφαρμοστεί για τον έλεγχο της Μαλάριας (Roberts και

Humber 1981, McNeil 2005, Robertson et al. 2007, Thomas και Read 2007 a,b, Fung et al. 2011), τοποθετώντας δίχτυα κουνουπιών ή φύλλα βαμβακιού βαπτισμένα σε

διάλυμα νερού που περιέχει κονίδια του μύκητα, στον τοίχο σαν παγίδες .

Εικόνα 1.3.6.8.2.: Βιολογικός κύκλος του μύκητα M.robertsii (http://www.bath.ac.uk/bio-

sci/research/profiles/charnley.html

42

Εικόνα 1.3.6.8.3.: Τρόπος διείσδυσης του μύκητα M.robertsii (Charnley 1984)

O M.robertsii μπορεί να παραχθεί εύκολα σε ζυμωτήρες όμως το μυκήλιο δεν

έχει εντομοκτόνο δράση. Αντίθετα τα βλαστοσπόρια και κονίδια είναι βιολογικός

δραστικά και έχουν την ικανότητα να μολύνουν και να θανατώνουν τον ξενιστή.

Σύμφωνα με τον Tulloch 1976, ο μύκητας έχει δυο τύπους ανάλογα με το μέγεθος

των κονιδίων. Ο πρώτος M. robertsii με κονίδια 3,5 – 9,0 μm και ο δεύτερος M. robertsii var major με κονίδια 9,0 – 18,0 μm (Milner 1992, Driver et al. 2000).

Ο μύκητας εισέρχεται από τους πόρους του τραχειακού συστήματος (Suzuki et al., 1966, 1970, 1971, Solomon et al. 2002, Chanrley 2003, Wang και Leger 2006 ).

Μετά το πέρας 18 ωρών εισέρχεται στο εσωτερικό του εντόμου με την μορφή

απρεσσορίων και παράγει κονίδια που σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο φαίνονται σαν

μακρές, διακλαδιζόμενες υφές και σχηματίζουν νηματοειδή κελιά (εικ. 1.3.6.8.1.)

(Milner 1992, Wangκαι Leger 2006). Στους μύκητες του γένους Metarhizium, το

μυκήλιο αποτελεί τον κύριο τρόπο ανάπτυξης του. Η ραγδαία ανάπτυξη του έχει ως

αποτέλεσμα το έντομο να γεμίσει μυκήλια (Suzuki et al. 1966, 1970, και 1971,

Wangκαι Leger 2006, Robertson et al. 2007) τα οποία θα καταστρέφουν τα εσωτερικά

43 όργανά του. Ο M. robertsii τρέφεται από τα λιπίδια που αποτελείται η επιδερμίδα του

εντόμου. Επίσης είναι ικανός να απελευθερώνει σπόρια υπό χαμηλές συνθήκες

υγρασίας (μικρότερη από 50%). Επιπλέον μπορεί να παράγει δευτερογενής

μεταβολίτες δεστρουξίνες (Destruxins), που είναι ουσίες τοξικές για τα έντομα αλλά

και πρωτεϊνολυτικά ένζυμα που παίζουν σημαντικό παράγοντα στην παθογένεση

(Suzuki et al. 1966, 1970, και 1971, Screen et al. 2002, Robertson et al. 2007).

Μάλιστα η δεστρουξίνη Ε θεωρείται μια από τις τοξικότερες ενώσεις σε ένα μεγάλο

εύρος εντόμων (Butt 2002). Το έντομο μπορεί να επιζήσει μέχρι και 5-15 μέρες

αφότου μολυνθεί (Chanrley 2003).

Οι δεστρουξίνες (Destruxins) προκαλούν παράλυση και θάνατο στα έντομα

όμως λίγα είναι γνωστά γύρω από τον τρόπο δράσης του (Kucera 1980,Gupta et al.

1989, Krasnoff et al. 1996, Wang και Leger 2006 ). Οι δεστρουξίνες έχουν ένα

μοναδικό τρόπο δράσης μεταξύ των πεπτιδίων και δεν δρουν κυρίως σαν ιοντοφορείς,

επάγοντας το σχηματισμό πόρων στις κυτταρικές μεμβράνες ή σαν αναστολείς των

μιτοχονδριακών ATPασες (Kucera 1980, Krasnoff et al. 1996, Screen et al. 2002,

Chanrley 2003,Wang και Leger 2006, Robertson et al. 2007, Silva et al. 2009, Fang et al. 2010a). Έχουν μια συγκεκριμένη επίδραση στην επιφάνεια του κυττάρου και στα

μιτοχόνδρια, η οποία εξαρτάται από την παρουσία διαθέσιμου ασβεστίου στο

εξωτερικό μέσο και μπλοκάρεται από χλωριούχο ασβέστιο, έναν μη ειδικό αναστολέα

των μεταφορικών ασβεστίων (Kucera 1980, St leger 1992, Dumas et al. 1996,

Freimoser et al. 2003, 2005, Robertson et al. 2007, Fang et al. 2009). Προκαλούν

παράλυση στους μυς των λεπιδοπτέρων και οφείλεται σε ασβέστιο – εξαρτώμενη

αποπόλωση των κυτταρικών μεμβρανών των μυών (Kucera 1980, St leger 1992,

Sammuels et al. 1998). Πολλοί συγγραφείς υποστηρίζουν ότι η επίδραση των

δεστρουξίνων σε κύτταρα στόχους οφείλονται στην πρόσδεση των τοξινών σε μόρια

44 υποδοχείς της μεμβράνης (Kucera 1980, Freimoser et al. 2003, 2005).

Εάν η υγρασία είναι αρκετά υψηλή, εμφανίζεται μια λευκή μούχλα στο

κουφάρι του εντόμου που σιγά – σιγά αυξάνεται και σε σύντομο χρονικό διάστημα

μεταχρωματίζεται σε πράσινη (Tanada και Kaya, 1993, Robertson et al. 2007).

Μερικά έντομα έχουν αναπτύξει μηχανισμούς για να περιοριστούν οι

λοιμώξεις που προκαλούνται από τον M. robertsii. Για παράδειγμα το Schistocerca gregaria (η ακρίδα της ερήμου) (Prior και Greathead 1989, Moore e tal. 1992,

Seyoum 1994, Bateman et al. 1997, Thomas et al. 1997) παράγει αντί-μυκητιακές

τοξίνες οι οποίες αναστέλλουν την βλάστηση των σπορίων. Επιπλέον ορισμένα είδη

εντόμων μπορούν να ξεφύγουν από την προσβολή αναπτύσσοντας ταχύτατα ένα νέο

κέλυφος, πριν τα κονίδια του μύκητα διαπεράσουν την επιδερμίδα (Kucera 1980,

Ferron 1981, Prior και Greathead 1989, Moore et al. 1992, Seyoum 1994, Bateman et al. 1997).

Εικόνα 1.3.6.8.4.: Προσβολή του M. robertsiiσε προνύμφη του εντόμου S.nonagrioides

Στην υφή ξηρη περιοχή του Καρού στην Νότιο Αφρική, ψεκασμοί του μύκητα

45 πραγματοποιήθηκαν σε συνθήκες χαμηλής σχετικής υγρασίας και υψηλής

θερμοκρασίας, πέτυχαν σε διάρκεια 2 -3 εβδομάδων να ελέγξουν την καφέ ακρίδα σε

ποσοστό πάνω από 90% (Price, 1995)

Το Bioblast είναι μία εμπορική διαθέσιμη μορφή του εντομοπαθογόνου

μύκητα M. anisopliae που χρησιμοποιείται για το έλεγχο των τερμιτών του γένους

Reticulitermes spp. Ο μύκητας εφαρμόζεται πάνω στο ξύλο όπου είναι γνωστό ότι οι

τερμίτες διατηρούν τις στοές τους. Οι τερμίτες που βρίσκονται μέσα στις στοές είναι

εκτεθειμένοι σε άμεση επαφή με τα κονίδια του μύκητα. Παράλληλα με αυτήν την

μέθοδο προκαλούμε εξάπλωση του παθογόνου μύκητα σε υγιή, μη μολυσμένα άτομα

της αποικίας. Μελέτες έχουν δείξει ότι ο θάνατος επέρχεται σε 4 έως 10 ήμερες

ανάλογα με την θερμοκρασία.

1.3.6.9. Ο Μύκητας Isaria fumosorosea

Το Isaria fumosorosea(Wize) Brown & Smith (Hypocreales: Clavicipitaceae),

θεωρείται πολύ ελπιδοφόρος βιολογικός παράγοντας για τον έλεγχο βλαβερών

εντόμων. Το κοινό όνομα με το οποίο αποδίδεται η ασθένεια που προκαλούν οι

μύκητες του γένους Isaria είναι –pink muscardine- εξαιτίας των ροζ χρώματος

κονιδίων που καλύπτουν τα νεκρά έντομα

Ο μύκητας Isaria fumosorosea παράγει ένα βιοενεργό εξαδεπσιπεπτίδιο

αποτελούμενο από τρία μόρια N – μέθυλο – D – φενιλαλανινή και τρία μόρια 2 –

υδροξυισοβαρελλικόοξύ (Briggsetal. 1966, Jegorovetal. 1994). Η Μποβερισίνη

(Beauvericin)(Shield e tal. 1981, Jegorov et al. 1994) έχει εντομοκτόνο και

αντιμικροβιακή δράση και σαν λιπόφιλη έχει τη δυνατότητα της βιοσυσσώρευσης. Οι

απομονώσεις των ειδών Isaria spp. και Fusarium spp. παράγουν υψηλά επίπεδα

Μποβερισίνης σε σχέση με του μύκητες του είδους Beauveria spp (Shield et al. 1981,

Stleger 1993, Jegorov et al. 1994, Moretti et al. 1995). Οι Ziska και Wisler (1993),

46 διερεύνησαν τις επιδράσεις της Μποβερισίνης σε προνύμφες του εντόμου Culex

pipiens. Το επιθήλιο του μεσεντέρου, ο λιπώδης ιστός και οι μυς ήταν περισσότερο

επηρεασμένα. Η τοξική επίδραση εστιάστηκε στα μιτοχόνδρια (Briggs et al. 1966).

Επίσης από I. fumosorosea έχουν απομονωθεί Λευκινοστίνες και Εφαπερτίνες.

Αυτοί οι δευτερογενείς μεταβολίτες είναι γραμμικά πεπτίδια και εμφανίζουν

ανασταλτική δράση στα μιτοχονδρική ATPασες καθώς επίσης και αντιμυκητιακές και

εντομοκτόνες δράσεις (Samson 1974, Shield et al. 1981, Jegorov et al. 1994). Τα

κονίδια του έρχονται σε επαφή με την επιδερμίδα του εντόμου και αφού βλαστήσουν,

διαπερνούν την επιδερμίδα και πολλαπλασιάζονται μέσα στο σώμα του εντόμου και

εισέρχονται στην αιμολέμφο (Altre 2001) .

Το I. fumosorosea, ακριβώς όπως το B. bassiana, παράγει κονίδια σε στερεό

υπόστρωμα και βλαστοσπόρια σε υγρό υπόστρωμα (Jegorov et al. 1994).Στην

Ευρώπη κυκλοφορεί το εμπορικό σκεύασμα PreFeRal με ένδειξη εναντίον του

Trialeurodes vaporariorum σε τομάτα και αγγούρι. Σε πειράματα που

πραγματοποιήθηκαν στην ερευνητική μονάδα USDA-ARS (Illinois) διαπιστώθηκε

ότι τα βλαστοσπόρια βλαστάνουν ταχύτερα και σε μεγαλύτερο ποσοστό στην

επιδερμίδα του αλευρώδη σε σχέση με τα κονίδια. Η διαπίστωση αυτή δείχνει ότι η

χρήση των βλαστοσπορίων για την ανάπτυξη των εμπορικών σκευασμάτων θα ήταν

συμφέρουσα συγκριτικά με τη χρήση των κονιδίων. Διάφορα γεωργικά προϊόντα

έχουν εξεταστεί ως συστατικά σκευασμάτων και μερικά υπόσχονται τη διατήρηση

της βιωσιμότητας των βλαστοσπορίων στο πέρασμα του χρόνου.

47

Εικόνα 1.3.6.9.1.: Προσβολή της προνύμφης του λεπιδόπτερου S.nonagrioides από I.fumosorosea

Εικόνα1.3.6.9.2.: Καλλιέργεια I.fumosorosea σε θρεπτικό μέσο

48 1.4. Το έντομο Sesamia nonagrioides

1.4.1. Ταξινομική θέση του εντόμου

Το είδος Sesamia nonagrioides (Lefebvre) (Lepidoptera – Noctuidae)

περιέγραψε για πρώτη φόρα ο Lefebvre το 1827, δίδοντας του το όνομα Cossus

nonagrioides. Το 1852, ο Guenne κατατάσσει το έντομο στο γένος Sesamia. Το 1934,

οι Rocci και Turati αναφερόμενοι στο είδος αυτό το κατατάσσουν στο Sesamia

vuteria Stoll, δίδοντας σε παρένθεση ως συνώνυμο το nonagrioides, συνωνυμία την

οποία διευκρινίζει αργότερα ο Μπατζακής (1970). Για το είδος αυτό υπήρχε σύγχυση,

όσον αφόρα την ταυτότητά του, λόγω των διαφόρων συνωνύμων, μερικά από τα

οποία αφορούν άλλα είδη του γένους Sesamia. Μετά από συνεχείς αλλαγές το έντομο

τοποθετήθηκε εκ νέου στο γένος Sesamia από τους Tam και Bowden (1953).

Στην Ελλάδα, η πρώτη αναφορά του εντόμου γίνεται από τον Σ. Καλογερέα,

το 1930 σε κατάλογο εντόμων, τα οποία συνέλεξε κατά το διάστημα 1924 – 27 στη

Λάρισα. Ενδεχομένως το είδος να προ υπήρχε, αφού ο Rebel (1916) αναφέρει ότι το

είδος S. cretica βρέθηκε στην Κρήτη από τον συλλέκτη Frivaldskys, που από τον

Freyer ότι επρόκειτο για το είδος S. hesperica Rbr., συνώνυμο του είδους Sesamia nonagrioides. Οι Rocci και Turati (1934) αναφέρουν την ύπαρξη του είδους και στην

Ελλάδα, χωρίς ωστόσο να καταγράφουν συγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές που

απαντά. Το 1939a, ο Ισαακίδης σε κατάλογο εντόμων αναφέρει την ύπαρξη άλλου

είδους του ιδίου γένους και συγκεκριμένα του S. cretica στις περιοχές Άρτας,

Κωπαΐδας και Μεσολογγίου. Αναφορά του S. cretica, γίνεται επίσης από τον

Πελεκάση το 1962, σε αντίστοιχο κατάλογο εντόμων της περιόδου 1932 – 1962,

χωρίς να αναφέρεται η ύπαρξη του S. nonagrioides.

Ο Σταυρακής, το 1967 ανέφερε ότι ο κυριότερος εχθρός του αραβοσίτου είναι

το είδος S. nonagrioides, καταγράφοντας ωστόσο και την ύπαρξη του S. cretica.

49 Η Αλεξανδρή (1986), αναφέρει ότι κανένα άτομο της S. cretica δεν βρέθηκε

στις περιοχές Αλεξανδρούπολης, Λάρισας, Λαμίας Κωπαΐδας, Αιτωλοακαρνανίας,

Ηλείας και Ιστιαίας κατά το 1984.

Τα τελευταία χρόνια στην Ελλάδα δεν έχει αναφερθεί το είδος S. cretica. Όλες

οι ερευνητικές εργασίες αναφέρονται στο S. nonagrioides. Το έντομο εντοπίζεται στις

περιοχές της Πελοποννήσου, της Αττικής, Βοιωτίας, Λάρισας, Μακεδονίας και

Θράκης και η ταξινομική κατάταξη είναι:

ΚΛΑΣΗ: Insecta

ΤΑΞΗ: Lepidoptera

ΥΠΟΤΑΞΗ: Heteroneura

ΔΙΑΙΡΕΣΗ: Ditrysia

ΥΠΟΔΙΑΙΡΕΣΗ: Heterocera

ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ: Noctuidea

ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ: Noctuidae

ΥΠΟΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ: Amphipyrinae

ΓΕΝΟΣ Sesamia

ΕΙΔΟΣ nonagrioides

(Lefebvre)

1.4.2. Περιγραφή του εντόμου

Το τέλειο έντομο S.nonagrioides έχει σώμα βραχύ, θώρακα καλυμμένο με

πυκνές τρίχες και χρωματισμό καστανόχρυσο.Ο θώρακας στα νώτα είναι αρκετά

χνουδωτός, με τα θηλυκά να παρουσιάζουν εντονότερα αυτή την κατάσταση από ότι

τα αρσενικά. Τα θηλυκά άτομα είναι κατά κανόνα μεγαλύτερα από τα αρσενικά. Το

άνοιγμα των πτερύγων είναι 30 – 35 mm στα αρσενικά και 35 – 40 mm στα θηλυκά.

50 Οι εμπρόσθιες πτέρυγες έχουν χρώμα ανοιχτό καστανό, κατά μήκος δε και στο μέσον

αυτών υπάρχει μία γραμμή με σκούρα καστανή απόχρωση ενώ φέρουν ακαθόριστα

στίγματα στην επιφάνεια τους (Σταμόπουλος 1999). Στην εξωτερική πλευρά

ξεχωρίζουν πέντε μαύρα στίγματα, σε ίσες αποστάσεις μεταξύ τους. Οι οπίσθιες

πτέρυγες έχουν χρώμα λευκό, αργυρόχροο. Οι κεραίες των αρσενικών είναι

αμφικτενοειδείς σε όλο τους το μήκος, διακριτικό γνώρισμα του S. nonagrioides σε

σχέση με το S. cretica, ενώ των θηλυκών, νηματοειδείς.

Εικόνα 1.4.2.1. Αρσενικό ενήλικο του εντόμου Sesamia nonagrioides

Η διάρκεια ζωής των τέλειων εντόμων είναι λίγες ημέρες (5 – 12) (Lopezetal.

2003) και εξαρτάται από μια σειρά βιολογικών και οικολογικών παραγόντων. Τα

θηλυκά ζουν κατά κανόνα περισσότερο από τα αρσενικά. Όπως συμβαίνει σε όλα τα

Λεπιδόπτερα της οικογένειας Noctuidae, η έξοδος των τέλειων, η πτήση, η σύζευξη

και η αναπαραγωγή τους, πραγματοποιούνται την νύχτα.

Η ωοτοκία αρχίζει μια ημέρα μετά την σύζευξη. Το θηλυκό γεννά τα αυγά

του κατά ωομάζες, σε παράλληλες γραμμές. Γεννά 5 – 500 αυγά ανά ημέρα : το 45%

του συνόλου την πρώτη νύχτα, 25% την δεύτερη και στην συνέχεια το ποσοστό (%)

51 μειώνεται (Αλεξανδρή 1986). Η συνολική παραγωγή των αυγών παρουσιάζει μεγάλη

διακύμανση, αρχίζοντας από λίγα και φτάνοντας στα 980. Ο Hilal (1978) αναφέρει

μέσο αριθμό αυγών ανά θηλυκό 440, ενώ η Αλεξανδρή 1986, 709. Η εκκόλαψη των

αυγών πραγματοποιείται σε 10 ημέρες στους 20 οC και σε 3 – 6 ημέρες σε 30 οC

(Θανόπουλος και Τσιτσιπής, 1986)

Τα αυγά είναι σφαιρικά, διάμετρο 1mm περίπου, πεπλατυσμένα στους πόλους

και με ραβδώσεις κατά μήκος. Το χρώμα είναι ανοιχτό κίτρινο, εν συνεχεία ροδόχρου

και τέλος σκούρο καστανό. Τα στάδιο των αυγών διαρκεί 6,5 μέρες, στους 25 οC

(Hilal 1978).Φέρει πολλές ραβδώσεις κατά μήκος και είναι ισχυρά πεπλατυσμένο

στους πόλους. Το μήκος του είναι μεγαλύτερο από το πλάτος του.

Η Προνύμφη είναι λευκή – λευκορόδινη αλλά και λευκοκίτρινη, φαιά ή

ρόδινη, ανάλογα με τον ξενιστή ενώ η κεφαλική κάψα και η προθωρακική πλάκα

έχουν λαμπερό σκούρο καστανό χρώμα. Το μήκος φθάνει τα 30 – 35 mm και στο

κορμό της διακρίνονται δυο σειρές μαύρων αναπνευστικών στιγμάτων, εκατέρωθεν

πλευρικά. Η στάση που παίρνει συνήθως η νύμφη είναι κεκαμμένη (Καγκελάρης

2003)

Η νύμφη περιβάλλεται από νήματα, μαζί με τα απορρίμματα της προνύμφης.

Έχει μήκος περίπου 20 mm και σχήμα ημικυλινδρικό, χρωματισμό ανοιχτό καστανό

τις πρώτες 2 – 3 ημέρες, στους 25 C (Hilal 1978). Επίσης φέρει δυο κοιλιακά και δυο

νώταια άγκιστρα στην επιφάνεια της κοιλίας της. Η νύμφη από την οποία θα

προκύψει το θηλυκό άτομο είναι συνήθως μεγαλύτερη σε μέγεθος από εκείνη που θα

προκύψει το αρσενικό άτομο.

Το τέλειο έντομο εξέρχεται από τη στοά σπάζοντας τους ιστούς, οι οποίοι

καλύπτουν το άνοιγμα της εξόδου.

52 1.4.3. Βιολογία

Το S.nonagrioidesείναι ένα πολυφάγο είδος. Προκαλεί σοβαρές ζημίες κυρίως

σε είδη της οικογένειας Graminaceae, όπως το καλαμπόκι (Zea mays), ρύζι (Oryza

sativa), σόργο (Sorghum bicolor), βρώμη (Avenasativa), κεχρί (Panicum spp.),

ζαχαροκάλαμο (Saccarum officinalis) και λιγότερο συχνά στο σπαράγγι (Asparagus officinalis), το βαμβάκι (Gossypium spp.) και σε είδη της οικογένειας Solanaceae

(Stavrakis 1967,Anonymous 1979,Ζαρταλούδης και συν. 1997, Ntanos και

Koutroubas 2000, Dimas et al. 2007, Ανδρεάδης και συν. 2007). Έχει επίσης

αναφερθεί ότι προσβάλλει τη μπανάνα (Musasp.) (Uygun και Kayapinar 1993) και το

καλλωπιστικό φυτό Streliziareginae(AllsoppκαιSallam 2001).

Το S.nonagrioides διαχειμάζει ως αναπτυγμένη προνύμφη σε κατάσταση

διαπαυσής στα υπολείμματα της καλλιέργειας (στέλεχος, σπάδικες και ριζικό

σύστημα κοντά στην επιφάνεια του εδάφους), καθώς επίσης και σε αυτοφυή φυτά της

οικογένειας Graminaceae (Gillyboeuf 1994, Fantinou et al. 1998b, Allsopp και Sallam

2001). Πειραματικές μελέτες που έχουν διεξαχθεί σε συνθήκες εργαστηρίου,

οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι στην χώρα μας το έντομο εισέρχεται σε διάπαυση από

τα μέσα Σεπτεμβρίου (Fantinou et al. 1998b). Η περάτωση της διάπαυσης λαμβάνει

χώρα νωρίς τον χειμώνα. Στη συνέχεια ακολουθεί μια μεταδιαπαυτική περίοδο, όπου

το έντομο διατηρείται σε κατάσταση αδράνειας τόσο για την αποφυγή των χαμηλών

θερμοκρασιών μέχρι το πέρας του χειμώνα (Gillyboeuf 1994) όσο και για την

επίτευξη συγχρονισμού μεταξύ της εξόδου των ενηλίκων και της εμφάνισης των

ξενιστών τους. Έτσι, η πρώτη νύμφη εμφανίζεται στα μέσα Μαρτίου (Fantinou et al.

1998b) και τα πρώτα ενήλικα στις αρχές Απρίλίου (Stavrakis 1967).

Ο πληθυσμός τους την εποχή αυτή βρίσκεται σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα,

ωστόσο αυξάνεται προοδευτικά, λαμβάνοντας τις υψηλότερες τιμές στα μέσα

53 Σεπτεμβρίου (Τσιτσιπής και συν. 1987). Τα θηλυκά άτομα ωοτοκούν στα νεαρά

φύλλα, κατά προτίμηση στη εσωτερική επιφάνεια του κολεού (Σταμόπουλος 1999,

Desantis et al. 2007). Το κάθε θηλυκό άτομο αποθέτει κατά την διάρκεια της ζωής του

περισσότερα από 100 αβγά κατά μέσο όρο (Tsitsipis, 1990) ενώ στην εκτροφή του Τμ

Βιολογίας του Πανεπιστήμιου Πατρών σε ορισμένες περιπτώσεις έως και τα 400

(παρατήρηση συγγραφέα Απρίλιος 2010).

Μετά την εκκόλαψη των αβγών οι νεοκκολαφθείσες προνύμφες τρέφονται

αρχικά σε βάρος του κολεού, αλλά γρήγορα εισέρχονται στο στέλεχος και

δημιουργούν στοά.

Η προνύμφη του εντόμου νυμφώνεται στο εσωτερικό του στελέχους, αφού

προηγούμενος ανοίξει μια οπή εξόδου για το νεαρό ενήλικο. Συνήθως ανοίγουν στοά

στο ύψος των κόμβων του στελέχους, σημείο το οποίο φαίνεται ότι με την σύσταση

τού ευνοεί την είσοδο των προνυμφών. Την νύχτα, οι προνύμφες μετακινούνται και

προσβάλλουν το στέλεχος σε άλλα μεσογονάτια. Οι προνύμφες της επόμενης γενεάς

ή γενεών εντοπίζονται όχι μόνο στο στέλεχος του καλαμποκιού και του σόργου αλλά

και στους σπάδικες του καλαμποκιού.

54

Εικόνα 1.4.3.1.Σημείο εισόδου της προνύμφη του S. nonagrioidesσε στέλεχος σόργου

Εικόνα 1.4.3.2. Καταστροφή στελέχους σόργου από την προνύμφη του S. nonagrioides

55 1.4.4. Η Γεωγραφική Εξάπλωση του εντόμου

Το S. nonagrioides εντοπίζεται στις περισσότερες Μεσογειακές χώρες (Prota,

1965, Lodos 1981). Εκτείνεται βόρεια μέχρι πλάτους 45ο, ενώ Νότια έχει αναφερθεί

και σε περιοχές της Β. Αφρικής: Μαρόκο, Αλγερία, Σενεγάλη, Σουδάν, Ουγκάντα,

Μαδέρα, Αζόρες, Καναρίους νήσους. (Rocci και Turati, 1934, Tam και Bowden,

1953).

Ειδικότερα στις χώρες της Μεσογείου αναφέρονται οι παρακάτω

παρατηρήσεις ανά χώρα για το έντομο Sesamia nonagrioides

1. Στο Μαρόκο, όπως αναφέρει ο Hilal (1978) το έντομο συμπληρώνει 4 γενεές

το χρόνο σε διαφορετικούς ξενιστές [σε είδη της οικογένειας Graminaceae]

(Anonymous 1979).

2. Στην Ισπανία, συμφωνά με τον Delgado de Torres (1930),Moreno (1972)και

Allsop και Sallam (2001) ο χρόνος εμφάνισης του εντόμου προσδιορίζεται

από τα μέσα Μαΐου έως τον Σεπτέμβριο, εμφανίζοντας δυο γενεές.

3. Στην νότια Γαλλία, ο Nepveu (1953) και ο Αnglade (1972) καταγράφει

εμφάνιση 2 γενεών το χρόνο για το έντομο S. nonagrioides.

4. Στην Σικελία, ο Nicifora (1964) παρατηρεί την εμφάνιση των πρώτων

τέλειων κατά το τέλος Μαρτίου, τη δε τελευταίες ωοτοκίες τον Οκτώβριο έως

τον Δεκέμβριο.

5. Ανάλογες παρατηρήσεις έγιναν στην Μεσσήνα από τον Marianni (1934),

στην Σαρδηνία από τον Prota (1965), στο Ισραήλ από τον Rinvay (1963),

στην Τουρκία από τον Lobos (1981), στο Ιράν από τον Baniabbassi (1981),

στην Πορτογαλία, στην πρώην Γιουγκοσλαβία και τέλος στην Ιταλία.

Το S.nonagrioidesείναι ένα πολυκυκλικό είδος. Ο αριθμός των γενεών που

αναπτύσσεται ετησίως εξαρτάται κατά κύριο λόγο από την περιοχή. Στην Ελλάδα,

56 στις νοτιότερες περιοχές, η πτήση των ενηλίκων αρχίζει στα μέσα Μάρτιου και

διαρκεί και τις αρχές Νοεμβρίου, συμπληρώνοντας τέσσερις γενεές (Fantinou et al.

2008). Στις βορειότερες περιοχές της χώρας, τα ενήλικα της πρώτης γενεάς

εμφανίζονται στα τέλη Απρίλιου και αφού συμπληρωθούν τρεις και μερικές φορές

τέσσερις γενεές, η πτήση τους ολοκληρώνεται στις αρχές Οκτωβρίου (Τσιτσιπής και

συν. 1987).

1.4.5. Ζημία

Η ζημία που κάνει το έντομο S nonagrioides, ιδιαίτερα στις όψιμες

(επίσπορες) καλλιέργειες καλαμποκιού είναι πολύ σοβαρή και μπορεί να φτάσει το

50% της παραγωγής (Προσβολή στο σπάδικα 0 – 50%) (Τσιτσιπής και συν. 1991). Οι

προνύμφες της πρώτης γενεάς προσβάλουν τα νεαρά φυτά στην βάση του ακραίου

φύλλου, οπότε παραιτείται μάρανσή του ενώ ζημιώνεται και η κορυφή του φυτού, με

άμεση συνέπεια την ανάπτυξή πλευρικών στελεχών (Καλαμπόκι και Σόργο) με

συνέπεια την καθυστέρηση στην ανάπτυξη του φυτού.

Οι προνύμφες των επόμενων γενεών προσβάλουν ανεπτυγμένα φυτά

προκαλώντας αυλακώσεις στο στέλεχος, ενώ παράλληλα τρέφονται από την ράχη του

σπάδικα, τα άνθη και τους σπόρους, το οποίο σαν αποτέλεσμα έχει την μείωση της

ποσότητας, του βάρους και της ποιότητας του παραγόμενου σπόρου.

Εκτός από την άμεση ζημία που προκαλεί η προνύμφη του εντόμου

παρατηρούνται και έμμεσες ζημίες όπως εύκολη θραύση των στελεχών από τον άνεμο

και προσβολή σε συνθήκες υψηλής υγρασίας, των προσβεβλημένων μέρων του φυτού

από τον μύκητα Fusarium moniliforme (Τσιτσιπής και συν. 1991, Sobek και

Munkvold, 1999).

57

Εικόνα 1.4.4.1. Στοά που δημιούργησε πρόνυμφη του εντόμου S nonagrioides σε φυτό σόργο

όπου και νυμφώθηκε.

1.4.6. Αντιμετώπιση του Εντόμου.

Ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο για την αποτελεσματική αντιμετώπιση του εντόμου

παίζει ρόλο η επιλογή της ποικιλίας του καλαμποκιού. Η καλλιέργεια ποικιλιών που

εμφανίζουν αφ’ ενός καλή προσαρμογή στις εκάστοτε εδαφοκλιματικές συνθήκες και

αφ’ ετέρου ανθεκτικότητα του συγκεκριμένου εντόμου, θεωρείται βέβαιο ότι θα

συμβάλλει στον περιορισμό των υψηλών πληθυσμών του εντόμου. Επιπλέον, η

εφαρμογή καταλλήλων καλλιεργητικών μέτρων, όπως η πρώιμη σπορά προκειμένου

τα φυτά να έχουν αναπτυχθεί αρκετά την περίοδο που το έντομο αρχίζει να

δραστηριοποιείται, αλλά και η καταστροφή των υπολειμμάτων της καλλιέργειας

αμέσως μετά την συγκομιδή, είναι δυο ακόμη προληπτικά μέτρα που μπορούν να

οδηγήσουν σε αποτελεσματική αντιμετώπιση του S.nonagrioides (Τζανακάκης 1980)

Όσον αφορά στην βιολογική αντιμετώπιση του εντόμου, συστήνεται η

εξαπόλυση φυσικών εχθρών του και η χρήση μικροβιακών σκευασμάτων του

B.thuringiensis subsp kurstaki(ΥΠΑΑΤ 2009). Στην Ελλάδα, το έντομο

58 S.nonagrioides έχει βρεθεί να παρασιτείται από το ωοπαράσιτο Telenomus busseolae

Gaham (Hymenoptera: Scelionidae) (Alexandri και Tsitsipis 1990, Fantinou et al.

1998a, Contiκαι Bin 2000, Desantis et al. 2007) καθώς επίσης και τα παρασιτοειδή

που προσβάλουν τις προνύμφες του εντόμου είναι το Lydella thompsoni (Herting)

(Diptera: Tachinidae), το Habrobracon hebetor Say (Hymenoptera: Braconidae) και

τέλος το Campoplex spp. (Hymenoptera: Ichneumonidae) (Alexandri και Tsitsipis

1990).

Στην Τουρκία έχουν αναφερθεί ως παρασιτοείδη του εντόμου επιπλέον το

Trichogramma evascens (Hymenoptera: Trichogrammatidae) που παρασιτεί το αβγό,

το Cotesia ruficrus (Hymenoptera: Braconidae) που παρασιτεί την προνύμφη του

εντόμου και τα Ichneumon sarcitorius(Hymenoptera: Icheumonidae), Pimpla spuria

(Hymenoptera: Trichogrammatidae) και Barichneumon spp. (Hymenoptera:

Trichogrammatidae) που παρασιτούν την νύμφη του εντόμου. (Colazza et al. 1997,

Sertkay aκαι Kornosor 1999, Sertkaya και Kornosor 2003).

Επίσης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν βιοτεχνολογικές μέθοδοι που

εκμεταλλεύονται ορισμένα βιολογικά χαρακτηριστικά και ιδιαίτερα στοιχειά

συμπεριφοράς του εντόμου. Η προσέλκυση και μαζική παγίδευση του εντόμου με την

χρήση φερομονικών παγίδων (Μπαμπίλης 1992) ή φωτoπαγίδων (φθορισμού λευκού

φωτός) (Τσιτσιπής και συν. 1991) μπορεί να δώσει ικανοποιητικά αποτελέσματα όσον

αφορά στον έλεγχο του πληθυσμού του εντόμου. Ταυτόχρονα, η παρεμπόδιση της

σύζευξης των ενηλίκων ατόμων επιτυγχάνεται είτε με την χρήση εξατμιστήρων

φερομόνης είτε με την χρήση ψεκάσιμου μίγματος φερομόνης [Ζ-11 εξαδισελινικό

οξικό άλας, (Ζ11-16Αc) και Ζ-11 εξαδισενιλόλη, (Ζ11-16:ΟΗ) σε αναλογία 9:1]

οδηγεί σε δραστική μείωση του πληθυσμού (Mazomenos 1989, Μπαμπίλης 1992,

Babilis και Mazomenos 1992, Albajes et al. 2002).

59 Η χημική καταπολέμηση επιβάλλεται να εφαρμόζεται μόνο όταν και όπου

κρίνεται πραγματικά αναγκαία κι εφόσον δεν υπάρχει εναλλακτικός τρόπος

αντιμετώπισης. Στην περίπτωση του εντόμου S.nonagrioides, η έγκαιρη εφαρμογή

εντομοκτόνων είναι ιδιαίτερα σημαντική αφού αν εφαρμοστεί κατά την διάρκεια της

πρώτης προνυμφικής ηλικίας δηλαδή πριν το έντομο προλάβει να εισέλθει στο

εσωτερικού του στελέχους του φυτού ή στο στάδιο του αβγού, οδηγεί σε δραστική

μείωση των πληθυσμών και σε μείωση του αριθμού των επαναληπτικών εφαρμογών

στις επόμενες γενεές. Τα επιτρεπόμενα χημικά σκευάσματα ανήκουν στην ομάδα των

οργανοφωσφορικών (Phosmet), οξαδιαζινών (Indoxacarb) και των πυρεθροειδών

(Cypermethrin, Flucythrinate) (ΥΠΑΑΤ 2009)

Εν κατακλείδι, με την εφαρμογή την γενετικής μηχανικής, έχουν δημιουργηθεί

γενετικά τροποποιημένες ποικιλίες καλαμποκιού με τοξίνη του εντομοπαθογόνου

βακτηρίου B.thuringiensis subsp kurstaki εναντίον των προνυμφών του εντόμου.

Εικόνα 1.4.6.1. Φερομονική παγίδα χοάνης που περιέχει καψίδιο φερομόνης προσέλκυσης των

αρσενικών ακμαίων του εντόμου S.nonagrioides.

60 2. Σκοπός

Οι μύκητες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως εντομοκτόνα στο πλαίσιο της

βιολογικής καλλιέργειας.. Για μια τέτοια στρατηγική, είναι απαραίτητη η φθηνή

παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων μολύσματος καθώς και κάποιος τρόπος τυποποίησης που

να διευκολύνει εύκολη εφαρμογή των μυκήτων με συμβατικό εξοπλισμό. Παράλληλα,

είναι σημαντικό να μεγιστοποιηθεί η αναλογία μόλυνσης και θνησιμότητας μετά την

εφαρμογή του επιλεγμένου μολύσματος.

Η μέθοδος των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων είναι ιδανική για αυτό το

σκοπό. Βασίζεται στη χρήση υποστρωμάτων επί των οποίων αναπτύσσονται μόνο

εντομοπαθογόνοι μύκητες (Strasser et al. 1996). Σημαντικός παράγοντας για την

επιτυχή ανάπτυξη των εντομοπαθογόνων μυκήτων αποτελεί η σύσταση του

υποστρώματος.

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί η προσθήκη του

εκχυλίσματος κρόκου στα ημιεκλεκτικά υποστρώματα ανάπτυξης των

εντομοπαθογόνων μυκήτων. Αυτή η μελέτη στοχεύει στο να διερευνηθεί τυχόν

επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου στην αύξηση των εντομοπαθογόνων μυκήτων και

δεύτερον στο να μελετηθεί η επίδραση στη δράση των εντομοπαθογόνων μυκήτων

επί των προνυμφών του εντόμου Sesamia nonagrioides.

60 4.Αποτελέσματα

4.1.Επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου Κοζάνης στην αύξηση των

εντομοπαθογόνων μυκήτων

Από τα αποτελέσματα μας διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές τόσο στην

ανάπτυξη των εντομοπαθογόνων μυκήτων μεταξύ των τριών χειρισμών που

αξιολογήθηκαν (F=6.586, df=2, P=0.002) όσο και ανά εντομοπαθογόνο μύκητα που

χρησιμοποιήθηκε(F= 9.393, df=2, P=0.000). Αντίθετα δεν παρατηρήθηκαν

σημαντικές διαφορές μεταξύ των επαναλήψεων των χειρισμών που

πραγματοποιήθηκαν (F=1.897, df=2, P=0.156).

Από τον πίνακα 4.1.1. διαπιστώνουμε ότι οι μύκητες που καλλιεργήθηκαν σε

υπόστρωμα που περιείχε εκχύλισμα κρόκου, παρουσιάζουν ένα σημαντικό

προβάδισμα στην αύξηση τους και ιδιαίτερα μετά την τρίτη μέρα, σε σχέση με τους

μύκητες που αναπτύχθηκαν σε υπόστρωμα SDA και σε υπόστρωμα που περιείχε άγαρ

με μεθανόλη. Ιδιαίτερα στον εντομοπαθογόνο μύκητα M. robertsii διαπιστώνουμε ότι

η παρουσία του εκχυλίσματος επιδρά θετικά στην αύξηση του σε σχέση με τα

υπόλοιπα υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν. Τα παραπάνω συμπεράσματα

εμφανίζονται παραστατικά στο διάγραμμα 4.1.1. όπου η παρουσία του εκχυλίσματος

στο υπόστρωμα ανάπτυξης φαίνεται να επιδρά ευνοϊκά στην αύξηση του

εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii σε σχέση με τους μύκητες B.bassiana και

I.fumosorosea που δεν διαπιστώνεται επίδραση του εκχυλίσματος μετά το πέρας των

πέντε ημερών.

78 Πίνακας 4.1.1. Μέσος ρυθμός αύξησης των εντομοπαθογόνων μυκήτων (cm ± SD) ανά

ημέρα(n=3).*Μέσοι όροι εντός της στήλης διαφέρουν σημαντικά (τεστ Bonferroni, P<0,05), #

Στατιστικά σημαντική διαφορά από τους άλλους χειρισμούς (τεστ Bonferroni, P<0,05).

ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΗΜΕΡΕΣ

Παθογόνος α/α Παράγοντας 1 2 3* 4* 5*

1 B.bassiana 0,583±0,052 0,766±0,038 1,316±0,052 1,700±0,130 2,241±0,276 S.D.A

2 M.robertsii# 0,533±0,014 0,575±0,05 1,191±0,200 1,633±0,398 1,958±0,536

3 I.fumosorosea 0,600±0 0,775±0,025 1,25±0,066 1,908±0,434 2,35±0,499

ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΗΜΕΡΕΣ Παθογόνος α/α Παράγοντας 1 2 3* 4* 5*

1 B.bassiana 0,558±0,030 0,825±0,025 1,291±0,125 1,816±0,33/ 2,35±0,420 S.D.A + MeOH

2 M.robertsii# 0,516±0,030 0,516±0,030 0,975±0,241 1,608±0,321 1,791±0,305

3 I.fumosorosea 0,583±0,014 0,866±0,152 1,308±0,101 1,708±0,125 1,958±0,112

ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΗΜΕΡΕΣ Παθογόνος α/α Παράγοντας 1 2 3* 4* 5*

1 B.bassiana S.D.A + 0,558±0,040 0,783±0,030 1,45±0,060 2,133±0,256 2,316±0,09 Εκχύλισμα

2 M.robertsii# Κρόκου 0,500±0 0,575±0,025 1,158±0,08 1,866±0,118 2,55±0,114

3 I.fumosorosea 0,575±0,043 0,858±0,08 1,425±0,043 1,916±0,310 2,183±0,384

79

3 S.D.A

2,5

(cm) 2

1,5 B. bassiana 1 M. robertsii

ΜέσηΑύξηση I. fumosorosea 0,5

0 1 2 3 4 5 Μέρες

3 S.D.A + MeOH

2,5

(cm) 2

1,5 B. bassiana 1 M. robertsii

ΜέσηΑύξηση I. fumosorosea 0,5

0 1 2 3 4 5 Μέρες

3 S.D.A + Εχκ. Κρόκου 2,5

(cm) 2

1,5 B. bassiana

1 M. robertsii

ΜέσηΑύξηση I. fumosorosea 0,5

0 1 2 3 4 5 Μέρες

Διάγραμμα 4.1.1.Μέση αύξηση ανά ημέρα(cm) των εντομοπαθογόνων μυκήτων ανάλογα με την

σύνθεση του υποστρώματος ανάπτυξης, (n=3).

80 4.2.Επίδραση του εκχυλίσματος κρόκου Κοζάνης στην αποτελεσματικότητα εναντίων

των προνυμφών του εντόμου.

Από τα αποτελέσματα διαπιστώθηκαν διαφορετικά ποσοστά θνησιμότητας

των εντομοπαθογόνων μυκήτων ανάλογα με το υπόστρωμα ανάπτυξης τους. Στο

πίνακα 4.2.1. παρατηρείται το μέσο ποσοστό της θνησιμότητας των προνυμφών του

εντόμου S. nonagrioides λόγω δράσης των εντομοπαθογόνων μυκήτων μετά το πέρας

7 ημερών.

Πίνακας 4.2.1. Μέση θνησιμότητα των προνυμφών λόγω δράσης των εντομοπαθογόνων μυκήτων (%

±SD) μετά το πέρας 7 ημερών(n=30).*Μέσοι όροι εντός των στηλών διαφέρουν σημαντικά (τεστ

Bonferroni, P<0.05).

α/α Παθογόνος Παράγοντας Δόση Χειρισμός

S.D.A S.D.A + Εκχύλισμα

κρόκου

Θνησιμότητα (%±SD)

1 B.bassiana 53±11,55 70±10

2 M.robertsii 106 46±5,77* 93±5,77

3 I.fumosorosea 90±10 66±11,55

1 B.bassiana 60±10 66±15,28

2 M.robertsii 107 56±15,28* 96±5,77

3 I.fumosorosea 93±5,77 80±10

1 B.bassiana 86±5,77 73±15,28

2 M.robertsii 108 80±17,32* 80±10

3 I.fumosorosea 80±10 66±20,82

Control H2O+Tergitol Np9 20±0*

Όπως φαίνεται και στον πίνακα Συμφωνά με τα 4.2.1. η θνησιμότητα των προνυμφών

του εντόμου λόγω δράσης τους μετά το ολοκλήρωση επτά ημερών ήταν:

81 α) για τον εντομοπαθογόνο μύκητα B.bassiana:

σε υποστρ. S.D.A106: 53%, 107: 60% και 108: 87%

σε υποστρ. S.D.A + Εκχ. Κρόκου 106: 70%, 107: 66% και 108: 73%

παρατηρούμε ότι δεν παρουσιάζονται στατιστικές διαφορές μεταξύ των δόσεων που

εφαρμοστήκαν επί των προνυμφών (F=1.606, df=2, P=0.206) και των χειρισμών

(F=0.094 , df=1, P=0.759) (Διάγραμμα 4.2.1).

β) για τον εντομοπαθογόνο μύκητα M. robertsii:

σε υποστρ. S.D.A 106: 46%, 107: 56% και 108: 80%

σε υποστρ. S.D.A + Εκχ. Κρόκου 106: 93%, 107: 96% και 108: 80%

διαπιστώνουμε ότι δεν παρουσιάζονται στατιστικές διαφορές μεταξύ των δόσεων που

χρησιμοποιήθηκαν επί των προνυμφών (F=0.181, df=2, P=0.835) ενώ

παρουσιάστηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των χειρισμών (F=7.363, df=1,

P=0.008) (Διάγραμμα 4.2.2).

γ) για τον εντομοπαθογόνο μύκητα I.fumosorosea:

σε υποστρ. S.D.A106: 90%, 107: 93% και 108: 80%

σε υποστρ. S.D.A + Εκχ. Κρόκου 106: 66%, 107: 80% και 108: 66%

φαίνεται ότι δεν παρουσιάζονται στατιστικές διαφορές μεταξύ των δόσεων (F=2.150, df=2, P=0.145) και των χειρισμών (F=0.542, df=1, P=0.583) που

πραγματοποιήθηκαν(Διάγραμμα 4.2.3).

Από τα αποτελέσματα της θνησιμότητας των προνυμφών λόγω δράσης των

εντομοπαθογόνων μυκήτων, διαπιστώνεται σημαντική στατιστική διαφορά μεταξύ

των χειρισμών που χρησιμοποιήθηκαν (F=5.264, df=6, P=0.000)ενώ μεταξύ των

δόσεων (F=2.344, df=2, P=0.097) (Διαγρ 4.2.4.) και ανάμεσα στους

εντομοπαθογόνους μύκητες (F=1.083, df=2, P=0.340) δεν παρατηρούνται σημαντικές

στατιστικές διαφορές.

82 100%

Beauveria 80% bassiana S.D.A 60% Beuaveria 40% bassiana

Θνηιμότητα (%) S.D.A + Εκχ. 20% Κρόκου

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 6 10 κονίδια/ml

100%

Beuaveria 80% bassiana S.D.A 60% Beauveria 40% bassiana

Θνησιμότητα (%) S.D.A + Εκχ. 20% Κρόκου

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 7 10 κονίδια / ml

100%

80% Beauveria bassiana S.D.A 60%

40% Beauveria

Θνησιμότητα (%) bassiana S.D.A + 20% Εκχ. Κρόκου

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 108 κονίδια / ml

Διάγραμμα 4.2.1.Θνησιμότητα (%±SD) τωνπρονυμφώντουεντόμουS.nonagrioidesλόγωτηςδράσηςτου

εντομοπαθογόνουμύκηταB.bassiana, (n=30).

83 100% Metarhizium

80% robertsii S.D.A 60% Metarhizium 40% robertsii S.D.A + Εκχ. Θνησιμόυητα (%) Κρόκου 20%

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 6 10 κονίδια / ml

100% Metarhizium

80% robertsii S.D.A 60% Metarhizium 40% robertsii

Θνησιμότητα (%) S.D.A + 20% Εκχ.Κρόκου

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 7 10 κονίδια / ml

100% Metarhizium

80% robertsii S.D.A 60% Metarhizium 40% robertsii

Θνησιμότητα (%) S.D.A + Εκχ. 20% Κρόκου

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 8 10 κονίδια / ml

Διάγραμμα 4.2.2.Θνησιμότητα (%±SD) τωνπρονυμφώντουεντόμουS.nonagrioidesλόγωτηςδράσηςτου

εντομοπαθογόνουμύκηταM.robertsii, (n=30).

84 100% Isaria

80% fumosorosea S.D.A 60% Isaria 40% fumosorosea

Θνησιμότητα (%) S.D.A + Εκχ. 20% Κρόκου

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 106 κονίδια / ml

100% Isaria

80% fumosorosea S.D.A 60% Isaria 40% fumosorosea S.D.A + Εκχ. Θνησιμότητα (%) Κρόκου 20%

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 107 κονίδια / ml

100% Isaria

80% fumosorosea S.D.A 60% Isaria 40% fumosorosea S.D.A + Θνησιμότητα (%) Εκχ. Κρόκου 20%

0% 1 2 3 4 5 6 7 Μέρες 108 κονίδια / ml

Διάγραμμα 4.2.3.Θνησιμότητα (%±SD) τωνπρονυμφώντουεντόμουS.nonagrioidesλόγωτηςδράσηςτου

εντομοπαθογόνουμύκηταI.fumosorosea, (n=30).

85

Μέση θνησιμότητα των χειρισμών επί των προνυμφών του εντόμου

Μέση θνησιμότητα

Χειρισμοί

Διάγραμμα 4.2.4. Μέση Θνησιμότητα (%±SD) των χειρισμών λόγω της δράσης των

εντομοπαθογόνων μυκήτων, (n=30). 1: I.fumosorosea (υποσ. S.D.A), 2:B.bassiana

(υποσ. S.D.A), 3: M. robertsii (υποσS.D.A), 4: Control, 5: I.fumosorosea (υποσ.

S.D.A+Εκχ. Κρόκου), 6: B.bassiana (υποσ. S.D.A+Εκχ. Κρόκου), 7: M. robertsii

(υποσ. S.D.A+Εκχ. Κρόκου) (τεστ Bonferroni, P< 0.05).

86 3.Υλικά και Μέθοδοι 3.1. Έντομα

3.1.1 Εισαγωγή

Στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν άτομα του εντόμου Sesamia

nonagrioides, τα οποία είχαν εκτραφεί σε τεχνητό υπόστρωμα, σε εργαστηριακές

συνθήκες στο εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών του Τμήματος Βιολογίας του

Πανεπιστήμιου Πατρών τα έτη 2009, 2010 και 2011. Προτιμήθηκαν τα έντομα

τεχνητής εκτροφής, διότι μπορούν να εκτραφούν σε σχετικά μεγάλους αριθμούς, η

ανάπτυξη τους είναι γρήγορη και είναι διαθέσιμα καθ όλη τη διάρκεια του έτους.

3.1.2 Εργαστηριακή αποικία

Η εργαστηριακή αποικία του εντόμου από την οποία προμηθευτήκαμε το

πειραματικό μας υλικό, προήλθε από συλλογή φυσικού πληθυσμού, στην περιοχή του

Αγρινίου. Συγκεκριμένα το Θέρος του 2009 έγινε συλλογή και μεταφορά στο

εργαστήριο Φυσιολογίας Φυτών του τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστήμιου

Πατρών, προσβεβλημένων φυτών αραβόσιτου με στόχο την ανίχνευση εντόμων. Τα

έντομα που προήλθαν από αυτά τα φυτά, αποτέλεσαν το υλικό για τη δημιουργία της

αποικίας στο εργαστήριο. Ανανέωση του γενετικού υλικού της εκτροφής μας, έγινε τη

Άνοιξη του 2010 με την συλλογή προσβεβλημένων φυτών σόργου από το

πειραματικό αργό του Πανεπιστήμιου Πατρών και αντιστοίχως συλλογές το

Καλοκαίρι του 2010 και το Καλοκαίρι του 2011 από προσβεβλημένα φυτά

αραβοσίτου στην περιοχή Ισώματος Αχαΐας. Τα έντομα αυτά αναμείχθηκαν με τα

έντομα της εργαστηριακής αποικίας.

3.1.3. Συνθήκες εκτροφής του εντόμου

Όλα τα στάδια της ανάπτυξης του εντόμου βρίσκονταν σε δωμάτιο με

σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας 25±1οC, υγρασίας 60 – 70% και φωτοπεριόδου

61 16:8 ώρες φως : σκοτάδι.(Μπαμπίλης 1992, Φαντινού 1992)

3.1.4 Κλωβοί ακμαίων και υπόστρωμα ωοτοκίας

Τα ακμαία, διατηρούνταν σε κλωβούς 25x45x30 cm. Ο σκελετός των κλωβών

ήταν ξύλινος, οι δύο πλάγιες πλευρές ήταν καλυμμένες με πλαστικό πλέγμα και η

οπίσθια πλευρά ήταν ξύλινη (MDF). Η εμπρόσθια μεριά του κλωβού ήταν καλυμμένη

με πλαστικό πλέγμα μικρής διατομής, η οποία λειτουργούσε και σαν πόρτα για το

εσωτερικό του. Τα δάπεδο του κλωβού ήταν ξύλινο (MDF). Συνήθως σε κάθε κλωβό

διατηρούνταν 15 έως 20 ζεύγη ενήλικων εντόμων.

Εικόνα 3.1.1.1. Κλωβός διατήρησης των ακμαίων του εντόμου.

Για την τροφή των ενηλίκων ατόμων, χρησιμοποιούνταν οδοντιατρικά

τεμάχια βάμβακος, που τοποθετούνταν σε μικρό τρυβλίο Petri στο δάπεδο του

κλωβού, του οποίου το υπόστρωμα είχε νερό. (Φαντινού 1992)

Για υπόστρωμα ωοτοκίας χρησιμοποιήθηκαν νεαρά φυτά αραβόσιτου 20 – 25 cm (Μπαμπίλης 1992, Φαντινού 1992), τα οποία αναπτύσσονταν σε θάλαμο

ανάπτυξης με σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας 25±1 oC, υγρασίας 60 – 70% και με

62 φωτοπερίοδο 16:8. Τα θηλυκά εναπόθεταν τα αυγά τους κατά μάζες, στους κολεούς

των φύλλων των νεαρών φυτών. Η συλλογή γίνονταν καθημερινά. Η απολύμανση

των αυγών γίνονταν με την εμβάπτιση τους σε διάλυμα 2% εμπορικού σκευάσματος

χλωρίνης για 5 min (Φαντινού 1992). Κατόπιν γίνονταν έκπλυση τους με την

τοποθέτηση τους επί 5 min σε αποσταγμένο νερό (Φαντινού 1992). Στη συνέχεια

μεταφέρονταν σε τριβλία Petri 9 cm Ø, πάνω σε αποστειρωμένο διηθητικό χαρτί, το

οποίο ήταν εμποτισμένο με 0,03% διάλυμα προπιονικού οξέος (Φαντινού 1992).

Εικόνα 3.1.1.2 Απολύμανση των αυγών με την χρήση διαλύματος χλωρίνης και μάζες αυγών του

εντόμου σε τρυβλία petri.

63 Σε αυτές τις συνθήκες, η διάρκεια ζωής των τέλειων εντόμων ήταν περίπου 7

– 8 ημέρες, η δε επώαση των αυγών πραγματοποιούνταν σε 4-6 ημέρες.

3.1.5. Υπόστρωμα Εκτροφής

Μετά την εκκόλαψη, οι νεαρές προνύμφες τοποθετούντο σε πλαστικά κουτιά

τα οποία περιέχουν 50g τροφής (Μπαμπίλης 1992). Ανάλογα με την προνυμφική τους

ηλικία, τα έντομα τοποθετούντο σε μεγαλύτερα πλαστικά κουτιά ώστε να αποφευχθεί

ο συνωστισμός που θα επηρέαζε την ανάπτυξη και την πρόσληψη τροφής του

εντόμου (Fantinou et al. 2005).

Το υπόστρωμα της τεχνητής εκτροφής των προνυμφών είχε την παρακάτω

σύνθεση (Tsitsipis et al. 1983, Tsitsipis 1984, 1989) :

Νερό Βρύσης 700mL

Βιολογικό Αλεύρι Σόγιας 25g

Βιολογική Μαγιά Μπύρας (σκόνη) 50g

Βιολογικό Φύτρο Σταριού 25g

Κυτταρίνη (Sigma Aldrich. USA) 400g

Μείγμα Βιταμινών Vanderzant (Sigma Aldrich, USA) 4g

Ασκορβικό οξύ (Sigma Aldrich, USA) 3g

Νιπαγκίνη (Sigma Aldrich, USA) 2g

Σορβικό Κάλι (Sigma Aldrich, USA) 1g

Υδροχλωρικό οξύ (2Ν) 40mL

Τρόπος παρασκευής τεχνητής τροφής: Μέρος του νερού (400mL)

θερμαίνονταν μέχρι βρασμού και η Νιπαγκίνη διαλυόταν σε αυτό. Αφού κρυώσει το

νερό με την νιπαγκίνη τοποθετείται σε ποτήρι (blender) ενός αναμείκτη (mixer) και

τα υπόλοιπα συστατικά , εκτός από την κυτταρίνη, προστίθεντο διαδοχικά με συνεχύ

ανάδευση με τελευταίες τις βιταμίνες, με συνεχή ανάδευση. Μετά προστίθεντο το

64 HCl και ο αναμείκτης αφήνονταν σε λειτουργία για 5min. Στην συνέχεια το

περιεχόμενο μεταφέρονταν στο κάδο του αναμείκτη, με τα υπόλοιπα 300 mL νερού

που ξεπλέναμε το ποτήρι (blender) και προσθέτουμε σταδιακά τη κυτταρίνη. Αφού

αναμιγνύονταν καλά τα συστατικά, η τροφή αφήνονταν να κρυώσει πριν προσφερθεί

στις προνύμφες ενώ εναπομένουσα τροφή αποθηκεύονταν σε πλαστικό κουτί (taper)

1L στους 40C, μέχρι να ξαναχρησιμοποιηθεί.

3.1.6. Διατήρηση νυμφών

Μετά το πέρας 7 ημερών, οι προνύμφες μεταφέρονταν σε καθαρά κουτιά με

νέο τεχνητό υπόστρωμα. Οι προνύμφες λίγο πριν τη νύμφωση (prepupae)

απομακρύνονταν από τα κουτιά προς αποφυγή του κανιβαλισμού (Φαντινού 1992),

που εκδηλώνεται προς αυτές από τις νεωτέρες προνύμφες.

Οι προνύμφες μεταμορφώνονταν σε νύμφες, συνήθως στην επιφάνεια του

τεχνητού υποστρώματος. Οι νύμφες συλλέγονταν καθημερινά και τοποθετούνταν σε

ζεύγη, μέσα σε τριβλία Petri 15 cm Ø στο κλωβό. Η διάρκεια του νυμφικού σταδίου

ήταν 9 – 10 ημέρες. Τα έντομα διαχωρίζονταν σε φύλα στο στάδιο της νύμφης, 5 – 6

ημέρες μετά την νυμφώση.

Με την έναρξη της παρούσας εργασίας η αποικία στο εργαστήριο

Φυσιολογίας Φυτών είχε ήδη συμπληρώσει 3 γενεές από την σύσταση της.

3.2 Εντομοπαθογόνοι Μύκητες

3.2.1. Μέθοδος “Galleria bait method”

Εντομοπαθογόνοι μύκητες υπάρχουν στην φύση και εντοπίζονται συνήθως σε

έντομα με σημεία ή συμπτώματα από κάποια ασθένεια ή σε επιλεγμένα έντομα που

παρατηρήθηκαν στο εργαστήριο με ειδικές ενδείξεις μυκοσινών. Η διαδικασία αυτή

όμως είναι επίπονη, χρονοβόρα και κοπιαστική καθ΄ ότι η εμφάνιση των εντόμων του

εδάφους εξαρτάται από τον πληθυσμό τους σε καλλιεργητικές περιόδους (Cezary και

65 Renella 2003).

Ανάλογα με το μέγεθος της προνύμφης αλλά και της ποσότητας του εδαφικού

δείγματος τοποθετούνται 5, 10 ή 15 προνύμφες σε κάθε ένα από τα δείγματα. Τα

κουτιά αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου και η εποπτεία πραγματοποιείται

μετά από μία εβδομάδα με επανάληψη μετά από δύο εβδομάδες. Προσβεβλημένες ή

μουμιοποιημένες προνύμφες αφαιρούνται από το δείγμα και εμβαπτίζονται σε 1%

sodium-hypochlorite για 3 λεπτά. Στη συνέχεια ξεπλένονται με απιονισμένο νερό για

μερικά λεπτά ακόμη (Cezary et al. 2000).

Στο τέλος όλα τα δείγματα με εμφανή σημεία και συμπτώματα ασθένειας

τοποθετούνται μέσα σε τρυβλία με αρκετή υγρασία για ανάπτυξη του μυκηλίου. Με

αυτό τον τρόπο διαφορετικά είδη εντομοπαθογόνων μυκήτων ανιχνεύονται από

διάφορα εδαφικά δείγματα, όπως το B. bassiana, M. robertsii, I. farinosus,και I. fumosorosea.

Οι Bedding και Akhurst (1975) (Zimmerman 1986, Cezary και Renella 2003)

έχουν υποδείξει πως οι προνύμφες της G. mellonella είναι περισσότερο ευπαθείς στον

παρασιτισμό νηματωδών που ζουν στο έδαφος. Προφανώς το ίδιο συμβαίνει και με

τους εντομοπαθογόνους μύκητες. Για το λόγο αυτό οι προνύμφες του μεγάλου

κηρόσκορου χρησιμοποιούνται συχνά για βιοδοκιμές εξ’ αιτίας της μεγάλης

ευπάθειας που παρουσιάζουν σε πολλούς παθογόνους μύκητες. Γενικά φαίνεται πως

έντομα που δεν ζουν στο έδαφος αλλά σε άλλα υποστρώματα όπως για παράδειγμα

κηρήθρες, αλεύρι, ξύλο, ή φλοιό δέντρου, είναι ιδανικά για δολώματα

εντομοπαθογόνων μυκήτων. Συνθήκες στρες και έλλειψη τροφής στο έδαφος

πιθανότατα αυξάνει την ευπάθεια τους στα παθογόνα.

Συνοψίζοντας η μέθοδος “ Galleria bait ” είναι ένα εργαλείο πρακτικό και

66 απλό για την εξερεύνηση της φυσικής εμφάνισης εντομοπαθογόνων μυκήτων όπως

και για μεμονωμένα είδη σε οποιοδήποτε εδαφικό τύπο ανεξαρτήτως εποχής. Αυτή η

μέθοδος προσφέρεται για τον εντοπισμό ( ή ανίχνευση )νέων εντομοπαθογόνων

μηκήτων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην βιολογική καταπολέμηση

επιβλαβών εντόμων.

3.2.2. Απομόνωση Εντομοπαθογόνων Μυκήτων

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες απομονώθηκαν με την μέθοδο της χρήσης ως

δολώματος του εντόμου G. mellonella (Galleria Bait Method) (Zimmermann 1986)

και με τη μέθοδο των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων.

Η δολωματική μέθοδος είναι μια απλή τεχνική, η οποία αρχικά

χρησιμοποιούνταν επιτυχημένα σε οικολογικές μελέτες για τον προσδιορισμό των

παρασιτικών νηματωδών των εντόμων (Mracek 1980,1982, Akhurst και Brooks

1984). Συλλέγαμε ποσότητα χώματος, την οποία τοποθετήσαμε σε πλαστικά τρυβλία

petri. Θεωρείται σημαντικό οι προνύμφες να κινούνται μέσα στο δείγμα μας. Οι

προνύμφες εμβαπτίστηκαν σε ζεστό νερό θερμοκρασίας 45οC για μερικά

δευτερόλεπτα ώστε να διεγερθούν, τοποθετηθήκαν στην συνέχεια ανάλογα με το

μέγεθος τους (προνυμφική ηλικία) και των τεμαχιδίων του εδάφους που 5, 10 ή 15 σε

πλαστικά τρυβλία Petri (Zimmermann 1986).

Τα τρυβλία Petri 9 cm Ø αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (25±1 oC)

για 18 – 20 ήμερες και για τις πρώτες 4 ήμερες αναποδογυρίζονταν κάθε μέρα ώστε

οι προνύμφες να μπορούν κινούνται μέσα στα δείγματα μας (Keller et al 2000). Ο

έλεγχος της θνησιμότητας παρακολουθήθηκε για 7, 12, και 14 ημέρες αντίστοιχα

(Mietiewski et al. 1996). Οι νεκρές ή μουμιοποιημένες προνύμφες απομακρύνονταν

και εν συνεχεία αποστειρώνονταν σε 1% χλωριούχο νάτριο για μερικά δευτερόλεπτα.

67

Εικόνα 3.2.2.1. H μέθοδο της χρήσης ως δολώματος του εντόμου G. mellonella

Οι προνύμφες του εντόμου που εμφάνισαν τα συμπτώματα του

εντομοπαθογόνου μύκητα τοποθετήθηκαν σε πλαστικά τρυβλία Petri που είχαν

υψηλή υγρασία (moist chamber) για να επιταχυνθεί η σπορογένεση. Αυτό

επιτεύχθηκε με εναπόθεση ορισμένων σταγόνων νερού πάνω σε χαρτί, κυκλικού

σχήματος μέσα στα τρυβλία (Cezary και Renella 2003, Tkaczuk et al. 2009).

68

Εικόνα 3.2.2.2. Προσβεβλημένες προνύμφες G. mellonella.

Στο τέλος, μετά από την πάροδο 48 ωρών σε θερμοκρασία δωματίου,

λαμβάνονταν δείγματα από τις προσβλημένες προνύμφες. Ακολούθως γινοντάν

καλλιέργεια των κονίδων των μυκήτων που απομακρύνονταν από τις προνύμφες, σε

υπόστρωμα S.D.A ή P.D.A με τη χρήση εστίας νηματικής ροής.

Εικόνα 3.2.2.3. Εστία νηματικής ροής στο Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο.

Η μέθοδο των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων βασίζεται στη χρήση

υποστρωμάτων επί των οποίων αναπτύσσονται μόνο εντομοπαθογόνοι μύκητες

(Strasser et al. 1996). Από κάθε δείγμα 1g χώματος καταμετρήθηκαν τα CFU

(Colony-forming unit) που αναπτύχθηκαν πάνω σε τρυβλία με ημιεκλεκτικό

υπόστρωμα.

Στο τέλος όλοι οι πιθανά εντομοπαθογόνοι μύκητες εξεταστήκαν

μικροσκοπικά, προκειμένου να επιβεβαιωθεί το είδος με βάση το σχήμα και το

69 μέγεθος των σπορίων (Poinar 1978, Tkaczuk et al. 2009).

3.2.3. To Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

Η σύσταση και ο τρόπος παρασκευής του SDA περιγράφεται ως ακολούθως:

To Βacto - Sabouraud Dextrose Agar, είναι μια τροποποίηση του Άγαρ

Dextrose που περιγράφηκε από τον Sabouraud. Συγκριτικά τεστ, έχουν δείξει ότι το

Neoptone Difco, είναι η πιο πετυχημένη πηγή του αζώτου για την ανάπτυξη μυκήτων.

Το Bacto- Sabouraud Dextrose Agar, προσαρμόστηκε εν μέρει για τη καλλιέργεια και

τη ταυτοποίηση μυκήτων Για την αρχική απομόνωση του μύκητα, από λέπια και

επιστρώματα, προτείνεται η προσθήκη 0,015/μονάδα tellurite καλίου ή 0,05/μονάδα

επιφανειακού χαλκού σ’ αυτό το μέσο για να ενισχυθεί την ανάπτυξη των βακτηρίων.

Οι Emmons και Ashburn (1942) χρησιμοποίησαν ένα Sabouraud Dextrose

Agar, προετοιμασμένο με Neopeptone για την ανάπτυξη του Trichophyton gypseum.

Οι Robinson και Kotcher (1951) χρησιμοποίησαν Sabouraud Dextrose Agar, το οποίο

περιείχε 20 μονάδες πενικιλίνη και 40 μονάδες υδροχλωρική

διυδροστρεπτομυκίνη/mL του μέσου για την απομόνωση του Histoplasma από

σκυλιά. Οι Serowy και Jung (1951) χρησιμοποίησαν το Bacto-Sabouraud-Dextrose-

Agar για καλλιέργεια του Microspora κι άλλων παθογόνων μυκήτων. Η προσθήκη

αντιβιοτικών για την απομόνωση των παθογόνων μυκήτων, έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα

αποτελεσματική. Επομένως, 20 μονάδες πενικιλίνη και 40 μικρογραμμάρια

στρεπτομυκίνη ή διυδροστρεπτομυκίνη/ mL του μέσου, προστίθενται στο

αποστειρωμένο και λιωμένο μέσο στους 45 – 50 βαθμούς Κελσίου, υπό ασηπτικές

συνθήκες.

Αυτές οι επιθυμητές συγκεντρώσεις της πενικιλίνης μπορούν εύκολα να

παρασκευασθούν διαλύοντας τα περιεχόμενο ενός φιαλιδίου πενικιλίνης που περιέχει

100.000 μονάδες πενικιλίνης σε 10 ml αποστειρωμένου νερού. Στην συνέχεια 2 ml

70 αυτού του διαλύματος, προστίθενται σε 1 L αποστειρωμένου μέσου, στους 45 – 50

βαθμούς Κελσίου, υπό ασηπτικές συνθήκες 0,2 ml / 100 ml του μέσου.

Για να παρασκευασθούν οι επιθυμητές συγκεντρώσεις στρεπτομυκίνης

στο ίδιο μέσο, διαλύονται 1.000.000 μικρογραμμάρια στρεπτομυκίνης σε 10 ml

αποστειρωμένου νερού. Ένα ml αυτού του διαλύματος προστίθεται σε 9 ml

αποσταγμένου νερού, για να δώσει ένα διάλυμα, τ’ οποίο να περιέχει 10.000

micrograms στρεπτομυκίνης / ml. Στο κάθε λίτρο του μέσου, προστίθενται 4 ml

αυτού του διαλύματος για να παρατηρηθούν 40 micrograms / ml. (0,4 ml για 100 ml

μέσου). Για να ενυδατωθεί ξανά το μέσο, προστίθενται 65g απ’ το Bacto – Sabouraud

Dextrose Agar σε 1000 ml κρύου αποστειρωμένου νερού και θερμαίνονται με

βράσιμο για να διαλυθεί το μέσο εντελώς. Έπειτα διανέμεται στα σωληνάκια ή στα

μπουκαλάκια κι αποστειρώνεται στο κλίβανο για 15 λεπτά σε 15% πίεση (121

βαθμούς Κελσίου). Η τελική αντίδραση του μέσου είναι: pH 5,6.

Εικόνα 3.2.3.1: Ανάπτυξη του Verticillium lecanii επί Sabouraud Dextrose Agar (SDA)

71

Εικόνα 3.2.3.2: Καλλιέργεια B bassiana, I. fumosorosea και M.robertsii σε θρεπτικό μέσο SDA (Sabouraud Dextrose Agar).

3.2.4. Παρασκευή Εναιωρήματος Εντομοπαθογονών Μυκήτων

Προκειμένου να παρασκευαστούν τα εναιωρήματα για τις ανάγκες των

πειραμάτων, οι απομονώσεις καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία Petri 9cm Ø με Sabouraud

Dextrose Agar, τα οποία αφέθηκαν να αναπτυχτούν στο σκοτάδι για 15 μέρες στους

25oC±1. Τα τρυβλία Petri είχαν ασφαλιστεί με Parafilm® για να προστατευτούν από

επιμολύνσεις. «Φρέσκα» κονίδια συλλεχτήκαν από τις καλλιέργειες 15 ημερών για να

χρησιμοποιηθούν στα πειράματα μας. Τα εναιωρήματα κονιδίων μας,

παρασκευάστηκαν με «ξύσιμο», με την χρήση αποστειρωμένου μεταλλικού

«γάντζου», της επιφανείας των τριβλίων Petri και ρίχνοντας κονίδια σε φιάλες των

500mL που περιείχαν 50mL αποστειρωμένου νερού με 0,05% Tergitol® NP9. Το

72 διάλυμα κονιδίων φιλτραρίστηκε διαμέσου αρκετών στρωμάτων αποστειρωμένου

πανιού - «τούλι» μικρής διατομής και στη συνέχεια το διάλυμα ομογενοποιήθηκε για

5 λεπτά με την βοήθεια μαγνητικού αναδευτήρα (Goettel και Inglis 1997, Quesada –

Moraga et al 2007). Στην συνέχεια, σε οπτικό μικροσκόπιο (400x) χρησιμοποιήθηκε

αιματοκυτταρόμετρο Neubuaer για το καθορισμό των επιθυμητών δόσεων. Η

βλάστηση των κονιδίων ήταν 95%. Αυτό εκτιμήθηκε με την εξέταση 100 κονιδίων

των μυκήτων με χρήση οπτικού μικροσκοπίου (40x) υστέρα από την επώαση τους

στο σκοτάδι και μετά το πέρας 24h.

Εικόνα 3.2.4.1. Αιματοκυτταρόμετρο Neubuaer που χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των

δόσεων.

3.3 Εκχύλιση στύλων του γένους Crocus

Η εκχύλιση είναι μια από τις παλαιότερες χημικές δραστηριότητες του

ανθρώπου. Η παρασκευή ενός αφεψήματος (τσάι), αλλά και η παραλαβή μιας

δραστικής φαρμακευτικής ουσίας από μια φυτική πρώτη ύλη, στηρίζονται στις

διαδικασίες εκχύλισης, όπου το επιθυμητό συστατικό με τη χρήση συνήθως θερμού

νερού ή οργανικού διαλύτη μεταφέρεται από την φυτική πρώτη ύλη στην υγρή φάση.

Το εκχυλιστικό μέσο βέβαια δεν θα πρέπει να αντιδρά με την εκχυλιζόμενη ουσία.

73 Με κατάλληλη ρύθμιση των συνθηκών μπορεί να μεγιστοποιηθεί η διαλυτότητα της

εκχυλιζόμενης ουσίας στο εκχυλιστικό μέσο αλλά όχι αυτή των συνυπαρχουσών

(ίσως ανεπιθύμητων) ουσιών, και έτσι να επιτευχθεί ένας αρχικός διαχωρισμός.

O καταλληλότερος διαλύτης εκχύλισης των στύλων βάση της διεθνούς

βιβλιογραφίας αποδείχθηκε το υδατικό διάλυμα μεθανόλης 50% v/v. Οι

αποξηραμένοι στύλοι υποβλήθηκαν σε εκχύλιση με αναλογία στύλων/διαλύτη 50 mg/

3 mL. Η διαδικασία έλαβε χώρα σε θερμοκρασία δωματίου για 4 h υπό ανάδευση και

απουσία φωτός με σκοπό την αποφυγή οξείδωσης των περιεχομένων ενώσεων. Μετά

το τέλος, το στερεό απομακρύνθηκε με φυγοκέντρηση στις 1000 rpm για 5 min

3.4.Στατιστική επεξεργασία

Η ανάλυση της διακύμανσης των μέσων όρων των τιμών της Θνησιμότητας

και της Αύξησης των εντομοπαθογόνων μυκήτων, πραγματοποιήθηκε

χρησιμοποιώντας την τεχνική της ανάλυσης της διακύμανσης ως προς δύο

παράγοντες (Univariate). Το στατιστικό πακέτο PASW (SPSS Inc., IL, USA,version

18.0) χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της διακύμανσης των δεδομένων. Τα

δεδομένα όπου κρίνονταν αναγκαίο, μετατρέπονταν κατάλληλα (arcsin) προκειμένου

να τηρηθούν οι προϋποθέσεις της παραμετρικής ανάλυσης για ίσες

παραλλακτικότητες μεταξύ των μεταχειρίσεων. Η σύγκριση των μέσων τιμών για τη

διαπίστωση στατιστικά σημαντικών ή μη διαφορών μεταξύ των υπό μελέτη

παραμέτρων έγινε με το τεστ Bonferroni για επίπεδο σημαντικότητας P=0.05. Η

αποτελεσματικότητα κάθε μύκητα υπολογίστηκε με τον τύπο του Abbott (Abbott,

1925, Kurstak, 1982).

74 3.5.Μελέτη της επίδρασης του εκχυλίσματος Kρόκου Κοζάνης των εντομοπαθογόνων

μυκήτων Beauveria bassiana, Metarhizium robertsii και Isaria fumosorosea επί των

προνυμφών του εντόμου.

Χρησιμοποιήθηκαν απομονώσεις εντομοπαθογόνων μυκήτων από τη

συλλογή του Μπενακείου Φυτοπαθολογικού Ινστιτούτου (Isaria fumosorosea Άγιος

Στέφανος1, Metarhizium robertsii Elateridae1, Beauveria bassiana ΙΓΕ3).

3.5.1. Επίδραση στην αύξηση σε υπόστρωμα ανάπτυξης των

εντομοπαθογόνων μυκήτων.

Για την παρασκευή των υποστρωμάτων ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν 6,5g

μέσου, τα οποία διαλύθηκαν σε 100mL αποστειρωμένου H2O και θερμανθήκαν με

βράσιμο για να διαλυθεί το μέσο εντελώς. Στην συνέχεια αποστειρώθηκαν σε

αυτόκαυστο για 20 λεπτά (121oC). Τα καινούργια τρυβλία που δημιουργήθηκαν,

περιείχαν τα εξής υποστρώματα 1) S.D.A 2) S.D.A + MeOH (1,5 mL) 3) S.D.A +

Εκχύλισμα κρόκου (3mL). Οι εντομοπαθογόνοι μυκητές καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία

petri για διάστημα 5 ήμερων σε σκοτάδι με θερμοκρασία 25oC ± 1. Αφαιρέθηκαν με

την βοήθεια αποστειρωμένου φελλοτρυπητήρα κομμάτια διαμέτρου 0.5cm, τα οποία

τοποθετήθηκαν σε καινούργια τρυβλία petri. Η αύξηση των εντομοπαθογόνων

μικροοργανισμών καταγραφόταν καθημερινά για 5 ημέρες. Για κάθε χειρισμό έγιναν

τρεις επαναλήψεις.

75

Εικόνα 3.5.1.1. Απομονώσεις των εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea που αναπτυχθήκαν με την μέθοδο των ημιεκλεκτικών υποστρωμάτων.

3.5.2.Επίδραση στην αποτελεσματικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων επί

των προνυμφών του εντόμου.

Οι προνύμφες του εντόμου εμβαπτίστηκαν σε εναιώρημα κονιδίων 10ml των

εντομοπαθογόνων μυκήτων B. bassiana, M. robertsii και I. fumosorosea που

αναπτύχθηκαν σε υπόστρωμα S.D.A και σε υπόστρωμα S.D.A + εκχύλισμα κρόκου

για 5 δευτερόλεπτα, σε δόσεις 106, 107, 108 κονίδια/ml. Για κάθε δόση έγιναν τρεις

επαναλήψεις των 10 ατόμων έκαστη. Οι προνύμφες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν

ηλικίας 20 ημερών.

Στην συνέχεια αφέθηκαν να στεγνώσουν για 10 λεπτά και τοποθετήθηκαν σε

πλαστικά δοχεία 1000ml που περιείχαν φρέσκια τροφή. Η θνησιμότητα των

προνυμφών καταγραφόταν καθημερινά για 7 ημέρες. Οι νεκρές ή μουμιοποιημένες

προνύμφες απομακρύνθηκαν και εν συνεχεία αποστειρώθηκαν σε 2% χλωριούχο

νάτριο για μερικά δευτερόλεπτα Οι προνύμφες τοποθετήθηκαν σε πλαστικά τρυβλία

τύπου Petri 9cm Ø που είχαν υψηλή υγρασία (moist chamber) για να επιταχυνθεί η

σπορογένεση. Αυτό επιτεύχθηκε με εναπόθεση ορισμένων σταγόνων νερού πάνω σε

χαρτί, κυκλικού σχήματος, μέσα στα τρυβλία.

Η αποτελεσματικότητα κάθε μύκητα υπολογίστηκε με τον τύπο του Abbott (Abbott 1925, Kurstak 1982).

76 τελικός πληθυσμός στην επέμβαση αρχικός πληθυσμός στο μάρτυρα αποτελεσµατικό τητα =1− ××100 αρχικός πληθυσμός στην επέμβαση τελικός πληθυσμός στο μάρτυρα

77 5. Συζήτηση

Η παθογένεια στο εντόμου είναι σύνθετο φαινόμενο, το οποίο ξεκινάει με την

βλάστηση και γενικά με την διαδερμική διείσδυση του βλαστικού σωλήνα, που έχει

ως αποτέλεσμα οι εντομοπαθογόνοι μύκητες να εισέρχονται στην αιμολέμφο και να

προκαλούν το θάνατο του ξενιστή. Εκτός από την βλάστηση και την διείσδυση, η in vivo αύξηση του μυκηλίου οφείλεται και στην παραγωγή μεταβολιτών και τοξινών

που είναι απαραίτητες στην παθογένεια. Η ως εκ τούτου βλάστηση των κονιδίων

μπορεί να επηρεάζεται: α) από περιβαλλοντικές κλιματικές συνθήκες ιδιαίτερα της

θερμοκρασίας και υγρασίας της επιδερμίδας του εντόμου (Keller και Zimmermann

1989, Fuxa 1997), β) από την παρουσία αμινοξέων και πηγών άνθρακα στην

επιδερμίδα (Smith και Grula 1982), και γ) από την ηλικία του ξενιστή και την

παρουσία ανασταλτικών ουσιών στην επιδερμίδα του εντόμου (Hajek και St.Leger

1994). Η «επιτυχημένη» διείσδυση των βλαστικών σωλήνων είναι προ-απαιτούμενη

για την εμφάνιση παθογένειας που μεταφράζεται πολλές φορές σε υψηλή

θνησιμότητα (Hajek και St.Leger 1994).

Σύμφωνα με Hallsworth και Magan (1999), τόσο ο Β. bassiana και Μ. robertsii, όσο και οι άλλοι εντομοπαθογόνοι μύκητες, μπορούν να μολύνουν τα

έντομα κάτω από συνθήκες χαμηλής θερμοκρασίας περιβάλλοντος και υγρασίας,

εφόσον υπάρχει επαρκής διαθέσιμη υγρασία στην επιδερμίδα του ξενιστή. Αν η

σχετική υγρασία δεν βρίσκεται σε επίπεδα που να επιταχύνει την σποροπαραγωγή,

τότε ο μύκητας παραμένει στο εσωτερικό του ξενιστή, επιβιώνοντας για αρκετούς

μήνες και τελικά παράγοντας σπόρια κυρίως όταν οι συνθήκες επανέλθουν στο

βέλτιστο επίπεδο.

87 Η πορεία διείσδυσης ωστόσο στην επιδερμίδα του εντόμου, η παθογένεια, η

θνησιμότητα και η κονιδιογένεση ίσως και να οφείλονται στα φυσιολογικά

χαρακτηριστικά της απομόνωσης. Τα φυσιολογικά χαρακτηριστικά αυτά, απαντώνται

στην δυνατότητα του εντομοπαθογόνου μύκητα να παράγει βιοχημικά προϊόντα μέσα

στο σώμα του εντόμου (Gupta et al. 1994). Η υψηλή παθογένεια και η αυξημένη

σποροπαραγωγή των εντομοπαθογόνων μυκήτων, αποτελεί βασικό παράγοντα για τη

διάδοση και εξάπλωση της ασθένειας μέσα σε ένα πληθυσμό επιβλαβών εντόμων.

Το εκχύλισμα του κρόκου βάση των Yen et al. (1993) και Karimi et al (2010),

εμφανίζει αντιμυκητιακές ιδιότητες λόγω της παρουσίας φαινολικών συστατικών. Τα

φαινολικά συστατικά αποτελούν κύριο όπλο στην χημική άμυνα των φυτικών

οργανισμών ενάντια στους παθογόνους μικροοργανισμούς (Μύκητες, Ιούς,

Βακτήρια) (Vaya et al. 1997). Επομένως με βάση τα παραπάνω, η παρουσία του

εκχυλίσματος κρόκου θα επιδρούσε αρνητικά στην αύξηση των μυκήτων, αν και το

φαινολικό περιεχόμενο του εκχυλίσματος είναι χαμηλό. Εντούτοις από τα

αποτελέσματα των πειραμάτων μας, δεν επιβεβαιώνεται το συμπέρασμα των Vaya et al. (1997) και των Karimi et al. (2010), αντίθετα φαίνεται ότι το εκχύλισμα κρόκου

επιδρά θετικά κυρίως μετά την τρίτη μέρα και κυρίως στην περίπτωση του

εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii. Η χαμηλή συγκέντρωση των φαινολικών και

η υψηλή των κροκινών, των υδατοδιαλυτών καροτενοειδών θέτουν ερωτήματα για

τον μηχανισμό δράσης των κροκινών στον συγκεκριμένο μύκητα.

Επιπρόσθετα η προσθήκη του εκχυλίσματος κρόκου στο υπόστρωμα

ανάπτυξης, βάση των πειραματικών μας δεδομένων, έδειξε ότι επηρεάζει την

δραστικότητα των εντομοπαθογόνων μυκήτων. Ιδιαίτερα, ο εντομοπαθογόνος

μύκητας M. robertsii εμφάνισε υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητα όταν αναπτύχθηκε

σε υπόστρωμα με εκχύλισμα κρόκου. Αντίθετα, ο εντομοπαθογόνος μύκητας

88 I.fumosorosea παρουσίασε υψηλότερα επίπεδα ελέγχου του λεπιδοπτέρου όταν

αναπτύχθηκε σε υπόστρωμα χωρίς το εκχύλισμα. Τέλος, η αποτελεσματικότητα του

εντομοπαθογόνου μύκητα B. bassiana φάνηκε να μην επηρεάστηκε στο σύνολο της

από το υπόστρωμα στο οποίο αναπτύχθηκε.

6.Αντί – Συμπεράσματος

Η ευρεία αξιοποίηση των εντομοπαθογόνων μυκήτων αποτελεί ένα καινούργιο πεδίο

έρευνας που θα οδηγήσει σε μια φιλική ως προς το περιβάλλον γεωργία έχοντας σαν

γνώμονα την προστασία του αγοραστή αυτών των προϊόντων. Υπάρχουν πολλά είδη

μυκήτων που χρησιμοποιούμε στο Βιολογικό έλεγχο των ζωικών εχθρών των

καλλιεργειών. Από τους πιο μελετημένους και γνωστούς μύκητες είναι ο B. bassiana

και οι εντομοπαθογόνοι μύκητες M. robertsii, και I. fumosorosea.

Ένας από τους σημαντικότερους ζωικούς εχθρούς στην χώρα μας είναι το

λεπιδόπτερο Sesamia nonagrioides. Το έντομο S. nonagrioides (Lefébvre)

(Lepidoptera: Noctuidae) ανήκει στην κατηγορία εκείνη των εντόμων που προσβάλει

μεγάλο αριθμό αυτοφυών και καλλιεργούμενων φυτών, έχοντας σαφή προτίμηση στο

καλαμπόκι και το γλυκό σόργο (Anonymous 1979, Dimas et al. 2005). Η

αντιμετώπιση του εντόμου σήμερα γίνεται αποκλειστικά με χημικά εντομοκτόνα, η

αποτελεσματικότητα της εφαρμογής των οποίων δεν χαρακτηρίζεται ικανοποιητική,

καθώς το έντομο δραστηριοποιείται στο εσωτερικό του στελέχους του φυτού πολύ

νωρίτερα όταν αυτό βρίσκεται στο στάδιο της προνύμφης και τρέφεται μέσα στο αυτό

(Van Renburg et al. 1992). Παράλληλα είναι πλέον αποδεδειγμένο πως η εκτεταμένη

χρήση εντομοκτόνων είναι εκείνη που ευθύνεται για την πρόκληση δυσμενών

αποτελεσμάτων στο οικοσύστημα (π.χ. μείωση ωφέλιμων εντόμων). Η παρούσα

μεταπτυχιακή διατριβή αποτελεί την πρώτη προσπάθεια για να κατανοηθεί η επιρροή

της προσθήκης του εκχυλίσματος κρόκου στο υπόστρωμα ανάπτυξης ενώ μελετήθηκε

89 η τυχόν επίδραση του τόσο στην αύξηση όσο και στην αποτελεσματικότητα των

εντομοπαθογόνων μυκήτων επί των προνυμφών του λεπιδοπτέρου S. nonagrioides,

εξάγοντας σημαντικά συμπεράσματα.

Σήμερα, που οι τάσεις της επιστήμης στοχεύουν σε μια ολοκληρωμένη

παραγωγή προϊόντων με την χρήση ολοκληρωμένων μέσων και μεθόδων παραγωγής

και διαχείρισης, θεωρείται σκόπιμη η εκπόνηση περαιτέρω σχετικών μελετών που θα

δώσουν την δυνατότητα εφαρμογής σε ευρεία κλίμακα των εντομοπαθογόνων

μυκήτων ως μέσων αντιμετώπισης, συνεισφέροντας ουσιαστικά στο σημαντικό και

ευαίσθητο τομέα της φυτοπροστασίας. Η διερεύνηση της παρουσίας του

εκχυλίσματος του κρόκου στο ημισυλλεκτικό υπόστρωμα κρίνεται σκόπιμη κυρίως

στην περίπτωση του εντομοπαθογόνου μύκητα M. robertsii. Συμπερασματικά θα

λέγαμε ότι οι εντομοπαθογόνοι μύκητες μπορούν να αποτελέσουν παράγοντες

βιολογικού ελέγχου που σαν στόχο θα έχουν, τόσο τη διασφάλιση της ποιότητας των

γεωργικών προϊόντων που παράγονται στην χώρα μας, όσο και την προστασία του

περιβάλλοντος.

90 7.Βιβλιογραφία

Abbott, W.S., 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. In:

Journal of Economic Entomology. 18: 265-267.

Alexandri, M.P. και Tsitsipis , J.A., 1990. Influence of the egg parasitoid Platy

Telenomus busseolae (Hym. Scelionidae) on the population of Sesamia

nonagrioides (Lep. Noctuidae) in Central Greece . Entomophaga. 35: 61–70.

Altre, J. A., και Vandenberg, J. D., 2001. Factors Influencing the Infectivity of

Isolates of Paecilomyces fumosoroseus against Diamondback Moth, Plutella

xylostella. Journal of Invertebrate Pathology. 78: 31–36.

Anagnou-Veroniki, M., 1994. Impact of entomopathogenic agents on the olive fruit

fly. In: IOBC/WPRS Bulletin. 17(3): 279-282.

Anagnou-Veroniki, M. and Kontodimas, D.C., 2003. Laboratory tests of the effect of

Bacillus thuringiensis on grape berry moth Lobesia botrana (Lepidoptera:

Tortricidae) and on the pseudococcids’ predator Nephus includens (Coleoptera:

Coccinellidae). IOBC/WPRS Bulletin. 26(8): 117-119.

Anonymous, 1979 Distribution Maps of Pests. Commonwealth Agricultural Bureau,

London, UK.

Ανδρεαδής, Σ. Σ., Μυλωνάς Π.Γ. και Σαββοπούλου – Σουλτάνη Μ., 2007. Προσβολή

του γλυκού σόργου, σε πειραματική καλλιέργεια στην Βόρειο Ελλάδα, από

έντομο Sesamia nonagrioides. Γεωργία – Κτηνοτροφία. 1: 36-37.

Bajan C., K. Kmitowa, E. Mierzejewska, E. Popowska-Nowak, R. Mietkiewski, R.

Gorski, Z. Mietkiewska 1996. Entopathogenic fungi inhabiting forest litter and

soil in pine forests with different levels of environmental pollution. Bylletin–

OILB/SROP Vol. 19(9), pp. 208- 211.

91 Baniabbassi, N., 1981. News Entomology Newsletter, International Society of sugar –

cane. Technologists. 10(2).

Βalazy, S., 1993. Fungi. Vol XXIV P 79, 102, 136, 176, 195

Barnett, H.L., Hunter, B.B., 1998. Illustrated Genera of Imperfect Fungi, fourth ed.

APS Press, MN.

Bateman, R.P., Carey, M., Batt, D., Prior, C., Abraham, Y., Moore, D., Jenkins, N.

and Fenlon, J. 1996. Screening for virulent isolates of entomopathogenic fungi

against the desert locust, Schistocerca gregaria (Forskål). Biocontrol Science and

Technology. 6: 549-560.

Bell, J.V., Hamalle, R.J., 1980. Heliothis zea larval mortality time from topical and

per os dosages of Nomuraea rileyi conidia. Journal of Invertebrate Pathology. 35:

182–185.

Bernardini, M., Carilli, A., Pacioni, G., Santurbano, B., 1975. Isolation of beauvericin

from Paecilomyces fumosoroseus. Phytochemistry. 14: 1865.

Bischoff, J.F., Rehner, S.A., Humber, R.A., 2009. A multilocus phylogeny of the

Metarhizium anisopliae lineage. Mycologia. 101: 512-530.

Bidochka, M.J., Kamp, A.M., Lavender, T.M., Dekoning, J., De Croos, J.N., 2001.

Habitat association in two genetic groups of the insect-pathogenic fungus

Metarhizium anisopliae: uncovering cryptic species? Appl. Environ. Microbiol.

67: 1335 - 1342.

Brey P.T., Latge J.P. και Prevost M.C., 1986. Intergumental penetration of the pea

aphid, Acyrthosipthon pisum, by Conidiobolus obsurus. J. Inv. Pathol. 48:34-41.

Brooks, W. M., 1971. Protozoan infections of insects with emphasis on inflammation.

Proceedings Ivth Intl. Colloq. Insect Pathol. and Soc. Invertebr. Pathol., College

Pard, Maryland: 11-27.

92 Briggs, L.H., Fergus, B.J., Shannon, J.S., 1966. Chemistry of fungi—IV.

Cyclodepsipeptides from a new species of Isaria. Tetrahedron Part 1 (Suppl. 8):

269–278.

Boucias D. G., Peridland J. C., Latge J. P., 1988. Non specific factors involved in

attachment of entomopathogenic Deuteromycetes to host insect cuticle. Appl.

Envir. Microb. 54(7): 1795-1805.

Burkholder, W.E. και Dicke, R.J., 1964. Detection by ultraviolet light of stored-

product insects infected with Mattesia dispora. Journal of Economic

Entomology. 57: 818-819.

Burges, H. D. and Hurst, J. A., 1977. Ecology of Bacillus thuringiensis in storage

moths. J.Invertebr.Pathol. 30: 131-139

Burges H.D., 1981. Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970-1980.

Academic Press, London. pp 949.

Burges, Η. D., 1982 Control of insects by bacteria; Parasitology. 84: 79–117. Burges, H.D., 1998. Formulation of Microbial Biopesticides, beneficial

microorganisms, nematodes and seed treatments Publ. Kluwer Academic,

Dordrecht, pp412.

Butt T.M., Βrahim L., Clark S.J. Beckett A., 1995. The germination behavior of

Metarhizium anisopliae on the surface of aphid nd flea beetle cuticle. Mycol Res

99: 945-950.

Butt T.M., 2002. Use of entomogenous fungi for the controlinsect pests. The Mycota

XI Agricultural applications. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. pp 111-134

Capinera, J.L., 2008. Encyclopedia of Entomology, Volume 2. 2nd Edition, Springer,

Dordrecht, The Netherlands.

Cameron, J. W. M. 1973. Insect pathology. In History of Entomology. Ann. Rev.

Entomol. pp 285-300.

93 Cantell, G. E., 1974a. Insects Diseases, Vol. I. Marcel Dekker, New York. Cezary, T., Mietkiewski, R., Stanislaw, B., 2000. Temperature as a selective factor for

isolation of entomopathogenic fungi from soil by means of the insect bait

method. Insect Pathogens and Insect Parasitic Nematodes IOBC wprs Bulletin.

23(2): 197-202.

Cezary, T., Giancarlo, R., 2003. Occurrence of entomopathogenic fungi in soils from

Central Italy under different managements. Insect Pathogens and Insect Parasitic

Nematodes IOBC wprs Bulletin. 26(1): 85- 89

Conti, E. και Bin, F., 2000. Parasitoids of concealed noctuidae eggs and their potential

in biological control of gramineae stemborers Redia 83: 8 –104.

Copping, L.G., 2001. The BioPesticide manual, Second edition. British crop

protection council, U.K., p: XlIV-XlVII, 3-154, 161-3, 494-6. Cornell Extension

Service. Retrieved on 2006-12-14.

Colazza, S., Rosi M.C., και Clemente, A., 1997. Response of egg parasitoid

Telonomus busseolae to sex pheromone of Sesamia nonagrioides. J. Chem. Ecol.

23: 2437-2444.

Charnley, A. K., 1984. Physiological aspects of destructive pathogenesis in the insects

by fungi: a speculative review. In. Aderson, J.M., Rayner A.D.M. Walton,

D.W.H. (Eds.) Ivr. Microb. Interactions. Brit. Mycol. Soc. Symp., Vol 6.

Cambridge Un. Press London, pp 229-270

Charnley, A.K., 1990. Secondary metabolites, toxins and entomopathogenic fungi: an

evolutionary perspective. Vth Inter. Coll. Inv. Path. and Micr. Contr. Adelaide.

Charnley, A. K., 2003.Fungal pathogens of insects: cuticle degrading enzymes and

toxins, Adv. Bot. Res. 40: 241–321

94 Champlin, F.R., Grula, E.A., 1979. Non involvement of beauvericin in the

entomopathogenicity of Beauveria bassiana. Applied and Environmental

Microbiology, 37: 1122–1125.

Cherry, A.J., Lomer, C.J., Djegui, D., Shulthess, F., 1999. Pathogen incidence and

their potential as microbial control agents in IPM of maize stem borers in West

Africa. BioControl. 44: 301–327.

Γιαμβριάς, Χ., 1991. Σημειώσεις Γεωργικής εντομολογίας, Β’ τεύχος. Εκδ: Γεωργικό

Πανεπιστήμιο Αθηνών, σελ: 1-19.

Dayakar, S., Kanaujia, K.R., Rathore, R.R.S., 2000. Compatibility of entomogenous

fungi with commonly used insecticides for the management of Spodoptera litura

(Fab.). In: Ignacimuthu, S., Sen, A. (Eds.), Synergistic effect of entomogenous

fungi on some insecticides against S. obliqua Microbials in Insect Pest

Management. Oxford and IBH Publishing Co. Pvt. Ltd, M. Delhi, Kolkata, pp

47–52. ARTICLE IN PRESS

DeBach, P., 1971. Ηe use of imparted natural enemies in insect pest management

ecology. Proc. Tall Timbers Conference on Ecol. and Animal Control by

Habitat Management. 3: 211-33.

DeBach, P., 1974. Chaps. 4 and 5 in Biological control by natural enemies.

Cambridge Univ. Press. pp 71-154.

Devasagayam, P.A., Tilak, J.C., Boloor, K.K., Sane, K.S., Ghaskadbi, S.S., Lele,

R.D., 2004. Free radicals and antioxidants in human health: current status and

future prospects. J. Assoc. Phys. Ind. 52: 794-804.

Delgado de Torres, 1930. Las Orugas del Mais, Bol. Pat. Veg. Ent. Agr. Mardid. 4: 1–

20.

95 De santis, F., Conti, E., Romani, R., Salerno, G., Parillo, F. και Bin, F., 2008.

Colleterial glands of Sesamia nonagrioides as a source of the host-recognition

kairomone for the egg parasitoid Telenomus busseolae. Physiological

Entomology. 33: 7–16

Dimas, I., Pitta, E. και Angelopoulos, K., 2007. Corn Stalk Borer (Sesamia

nonagrioides) Infestation on Sorghum in Central Greece. Phytoparasitica.

35(2): 191-193.

Driver, F., Milner, R.J., Trueman, W.H.A., 2000. A Taxonomic revision of

Metarhizium based on sequence analysis of ribosomal DNA. Mycological

Research. 104: 135-151.

Emmons, C.W., Ashburn L.L., 1942. The isolation of Haplosporagium parvum sp.

and Coccidioides immitis from wild rodents. Their relationship to

coccidioidomycosis. Public Health Reports. 57: 1718-27.

Ζαρταλούδης, Ζ.Δ., Πιτταρά Ε.Σ., Παπαδοπούλου Σ., Ναβροζίδης Ε.Ι., Σαλπιγγίδης

Γ.Κ. και Ντάνος Δ., 1997. Βιολογία του Sesamia nonagrioides (Lepidoptera:

Noctuidae) και αντιμετώπιση 84 ποικιλιών ρυζιού στην προσβολή τους από το

έντομο αυτό. 70 Πανελλήνιο Εντομολογικό Συνέδριο, 21-24 Οκτωβρίου,

Καβάλα.

Fantinou, A.A., Alexandri M.P. και Tsitsipis J.A., 1998a. Adult emergence rhythm of

the egg-parasitoid Telenomus busseolae. BiocControl. 43: 141-151.

Fantinou, A.A., Tsitsipis, J.A. και Karandinos M.G., 1998b. Diapause termination in

Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae) under laboratory and field

conditions. Environ. Entomolo. 27: 53-58.

96 Fantinou A A,. Perdikis D.C και N.Stamogiannis., 2005. Effect of larval crowding on

the life history traits of Sesamia nonagrioides (Lepidoptera: Noctuidae). Eur. J.

Entomol. 105: 625–630.

Fang, W., Pava-ripoll, M., Wang, S., St Leger, R.J., 2009. Protein kinase A regulates

production of virulence determinants by the entomopathogenic fungus,

Metarhizium anisopliae. Fungal Genet. Biol. 46: 277-285.

Fang, W., St. Leger, R.J., 2010a. Mat, a gene unique to fungi encodes an

oligosaccharide transporter and facilitates rhizosphere competency in

Metarhizium robertsii. Plant Physiol. 154: 1549-1557.

Fang, W., Vega-Rodrıguez, J., Ghosh, A.K., Jacobs-Lorena, M., Kang, A., St Leger,

R.J., 2011. Development of transgenic fungi that kill human malaria parasites in

mosquitoes. Science. 331: 1074-1077.

Ferron, P. 1978 Biological control of insect pests by entomogenous fungi. Annual

Review of Entomology. 23: 409–442.

Ferron, P., 1981. Pest control by the fungi Beauveria and Metarhizium. In: H.D.

Burges (ed), Microbial Control of Pests and Plant Diseases 1970–1980.

Academic Press, London. pp 465–482.

Ferron P., Fargues J. και Riba G. 1991. Fungi as microbial instecticides against pests.

In Arora DK., Ajello L., Mukerji KG., eds. Handbook of applied mycology.

Vol.2 Humans, animals and insects. New York: Marcel Dekker. pp 665-706.

Frei, E. and K. Peyer, 1984. Böden, Blatt 7a. In: Inst. Kartographie ETHZ (ed), Atlas

der Schweiz. Bundesamt für Landestopographie, 2. Ausgabe, Bern.

Freimoser, F. M., Screen, S., Bagga, S., Hu, G and St. Leger, R.J. 2003. EST analysis

of two subspecies of Metarhizium anisopliae reveals a plethora of secreted

proteins with potential activity in insect hosts. Microbiology. 149: 239-247.

97 Freimoser, F.M., Hu, G., St Leger, R.J., 2005. Variation in gene expression patterns

as the insect pathogen Metarhizium anisopliae adapts to different host cuticles or

nutrient deprivation in vitro. Microbiology. 151: 361-371.

Fuxa, J.R., 1997. Microbial control of insects: status and prospects for IPM. IPM

System in Agriculture. Biocontrol in Emerging Biotechnology (eds. R.K.

Upadhyay, K.G. Mukerji & R.L. Rajak), pp. 57–104. Aditya Books, New Delhi,

India.

Gillespie, A.T., Claydon, N., 1989. The use of entomogenous fungi for pest control

and the role of toxins in pathogenesis. Pesticide Science. 27: 203–215.

Gillespie, A.T., Bailey A.M., Cobb B., Vilcinskas A. 2000. Fungi as elicitors of insect

immune responses. Arch Insect Biochem Physiol 44: 49-68.

Granados, R.A. και Ferecidi B.A. 1986b. “The Biology of Bacilovirus.” Vol II

Biological Properties and Molecular Biology. Crc Press,Boca Raton, FL.

Goettel, M.S. και Inglis, G.D., 1997. Fungi: Hyphomycetes. Manual of Techniques in

Insect Pathology (ed. L.A. Lacey), pp. 213–249. Academic Press, San Diego, CA.

Guenne, M.A. 1852. Noctuelites. Hist. Nat. Ins Lepidopteres. pp 96.

Guner, A., Ozhatay, N., Ekim, T., Baser, K.H.C., 2000. Flora of Turkey and East

Aegean Islands. Vol 11 (Supll 2), Edinburg Univ. Press.

Gupta, S.C., Leathers, T.D., El-Sayed, G.N., Ignoffo, C.M., 1994. Relationships

among enzyme activities and virulence parameters in Beauveria bassiana

infections of Galleria mellonella and Trichoplusia ni. J. Inv. Pathol. 64: 13-17.

Hajek, A.E., St. Leger, R.J., 1994. Interactions between fungal pathogens and insect

hosts. Annual Review of Entomology. 39:293–322.

98 Hajek, A.E., McManus, M.L., Delalibera Jr., I., 2007. A review of introductions of

pathogens and nematodes for classical biological control of insects and mites.

Biol. Control. 41: 1-13.

Hall, R.A. και Papierok, B., 1982. Fungi as biological control agents of arthropods of

agricultural and medical importance. Parasitology. 84: 205–240.

Hallsworth JE, Magan N., 1999. Water and temperature relations of growth of the

entomogenous fungi Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and

Paecilomyces farinosus. Journal of Invertebrate Pathology. 74: 261-266.

Hamill, R.L., Higgens, C.E., Boaz, H.E., Gorman, M., 1969. The structure of

beauvericin, a new depsipeptide antibiotic to Artemia salina. Tetrahedron Letters

.49: 4255–4258.

Hilal, A. 1978. Etude experimantale de development et de la reproduction de Sesamia

nonagrioides Lef. (Lepidoptera – Noctuidae). Application e l etude des

populations dans les cultures de cane a surce e Maroc. These de docteure

Ingenieur Universite de Bordeux.

Howarth, F.G., 1991. Environmental impacts of classical biological control. Annual

Review of Entomology. 36: 485–509.

Huber, J., 1990. Viral insecticides: Profits, Problems, and Prospects. In: Pesticides

and alternatives, innovative chemical and biological approaches to pest control,

Ed: Cassida, J., Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Oxford, N.Y., pp 117-

121.

Humber, R.A., 1991. Fungal pathogens of aphids. In “Aphid – Plant” interactions:

Population to molecules. Peters DC, Webster JA, Chlouder Cs (eds).

Proceedings.

99 Humber, R.A., 1997. Fungi: Identification. In: Lacey, L.A. (Ed.), Manual of

Techniques in Insect Pathology. Academic Press, London, pp 153–185.

Θανόπουλος Ρ. και Τσιτσιπής Ι.Α. 1986. Επίδραση της θερμοκρασίας στο έντομο

Sesamia nonagrioides (Lef.) (Lepidoptera: Noctuidae). 8ο Συνέδριο Ε.Ε.Β.Ε.

Ιωάννινα 24 -26 Οκτωβρίου 1986.

Inglis, G.D., Johnson, D.L., Goettel, M.S., 1996. Effect of bait substrateand

formulation on infection of grasshopper nymphs by Beauveria bassiana.

Biocontrol Science and Technology. 6: 35–50.

Inglis, G.D., Goettel, M.S., Butt, T.M., and Strasser, H. 2001, Use of Hyphomycetous

Fungi for Managing Insects Pests’, in Fungi as Biocontrol Agents, eds. T.M. Butt,

C. Jackson and N. Magan, Oxon: CABI Publishing, pp 23-69.

Isaka, M., Kittakoop, P., Kirtikara, K., Hywel-Jones, N.L., Thebtaranonth, Y., 2005.

Bioactive substances from insect pathogenic fungi. Acc. Chem. Res. 38, 813-823.

Ισαακίδης, Κ., 1939. Ο σκώληξ του αραβόσιτου εν Ελλάδα. Χρον. Μπενακείου

Φυτοπ. Ινσ. 3(2): 67 -68.

Jacques R.P., Morris O.N., 1981. Compatibility of pathogens with other methods of

pest control and with different crops, In: Burges H.D., Hussey N.W., (Eds.),

Microbial Control of Insect and Mites, Academic Press, New York.

Jahn, G.C., Litsinger, J.A., Chen, Y. και Barrion, A., 2007. Integrated Pest

Management of Rice: Ecological Concepts. In Ecologically Based Integrated Pest

Management (eds. O. Koul and G.W. Cuperus). CAB International pp 315-366.

Jackson, T.A., Alves, S.B. και Pereira, R.M. 2000. Success in biological control of

soil-dwelling insects by pathogens and nematodes. Biological Control: Measures

of Success (eds. G. Gurr & S. Wratten), pp 271–296. Kluwer Academic Public

Publishers, Boston.

100 Jeffrey, C L., 2001. ”Desiccant dusts synergize the effect of Beauveria bassiana

(Hyphomycetes: Moniliales) on Stored – grain beetles.” J. Econ. Entomol.

94(20): 367 – 372.

Jeffs, L.B., Khachatourians, G.G., 1997. Toxic properties of Beauveria pigments on

erythrocyte membranes. Toxicon. 35: 1351–1356.

Jegorov, A., Sedmera, P., Matha, V., Sˆ imek, P., Zahradnicˇkova, Landa, Z., Eyal, J.,

1994. Beauverolides L and La from Beauveria tenella and Paecilomyces

fumosoroseus. Phytochemistry. 37: 1301–1303.

Kabaluk, J.T., Ericsson, J.D., 2007. Environmental and behavioral constraints on the

infection of wireworms by Metarhizium anisopliae. Environ. Entomol. 36: 1415-

1420.

Karimi, E., Oskoueian, E., Hendra, R., Jaafar, Z.E. Hawa., 2010. Evaluation of

Crocus sativus L. Stigma Phenolic and Flavonoid Compounds and Its

Antioxidant Activity. Molecules. 15: 6244-6256.

Katsoyannos, P., 1996. Itegrated Insect Pest Management for Citrus in Nothern

Mediterranean Countries. Benaki Phytopathological Institute. pp 110.

Kellen, W.R. και Lindergren, J.E., 1971. Modes of transmission of Nosema plodiae.

Kellen and Lendergren a pathogen of Plodia interpuctella (Humber). J. Stored

Prod. Pes. 7: 31-34.

Kellen, W.R. και Lindergren, J.E., 1973a. Nosemia invadens sp. (Microsporidia:

Nosemetidae) a pathogen causing inflammatory response in Lepidoptera. J.

Inverted. Patho. 21: 293-300.

Keller, S., Schweizer, C., Keller, E. και. Brenner, H., 1997. Control of white grubs

(Melolontha melolontha L.) by treating adults with the fungus Beauveria

brongniartii. Biocontrol Science and Technology. 7: 105–116.

101 Keller S., Schweizer, C. και Shah, P., 1999. Differential susceptibility of two

Melolontha populations to infections by the fungus Beauveria brongniartii.

Biocontrol Science and Technology. 9: 441–446.

Keller S. και Zimmermann G., 1989. Mycopathogens of soil insects. In: N. Wilding,

N.M. Collins, P.M. Hammond and J.F. Webber (eds), Insect-Fungus.

Knowles, B.H. και Ellar, D.J. 1987 Biochim. Biophys. Acta. 924: 509-518 Kleespies, R., Bathon, H και Zimmermann, G., 1989. Untersuchungen zum

natürlichen Vorkommen von entomopathogenen Pilzen und Nematoden in

verschiedenen Böden in der Umgebung von Darmstadt. Gesunde Pflanzen

41(10): 350–355.

Krasnoff, S.B., Gibson, D.M., Belofsky, G.N., Gloer, K.B., Gloer, J.B., 1996. New

destruxins from the entomopathogenic fungus Aschersonia sp.. Journal of Natural

Products. 59: 485–489.

Krieg, A., Huger, A.M., Langenbruch, G.A., Schnetter, W., 1983. Bacillus

thuringiensis var. tenebrionis: Ein neuer, gegenόber larven von coleopteren

wirksamer pathotyp. Z. Angew. Entomol. 96: 500–508.

Kodaira, Y., 1962. Studies on the new toxic substances to insects, destruxin A and B,

produced by Oospora destructor. Part I. Isolation and purification of destruxin A

and B. Agricultural and Biological Chemistry. 26: 36–42.

Kogan, M., 1998. INTEGRATED PEST MANAGEMENT:Historical Perspectives

and Contemporary Developments, Annual Review of Entomology Vol. 43: 243-

270 (Volume publication date January 1998)

(doi:10.1146/annurev.ento.43.1.243)

Kucera, M., 1980. Proteases from the fungus Metarhizium anisopliae toxic for

Galleria melonella larvae. J. Invertebr. Pathol. 35: 304-310.

Kurstak, E., 1982. Microbial and Viral Pesticides. Markel Dekker, Ink., New York.

102 Καγκελάρης, Ν.Κ., 2003. Ανάπτυξη, επιβίωση και αναπαραγωγή του εντόμου

Sesamia nonagrioides (Lef.) (Lepidoptera: Noctuidae) σε σταθερές

Θερμοκρασίες. Τμήμα Γεωπονίας, Σχολή Γεωτεχνικών Επιστημών, Α.Π.Θ.,

Μεταπτυχιακή Διατριβή.

Καλογερέας, Σ., 1930. Προσδιορισμός εντόμων από την Fauna της Λαρίσης.

Γεωργικό δελτίον (Απριλ – Ιουν.) 333- 339.

Κατσόγιαννος, Π., 1992. Η Βιολογική Καταπολέμηση. Σημειώσεις Εκπαιδεύσεως

Γεωπόνων, Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο, Κηφισιά, σελ 5.

Κουλακίωτη, Ν.Σ., 2009. Ανάπτυξή αναλυτικής μεθοδολογίας για τον

χρωματογράφικο προσδιορισμό βιοδραστικών συστατικών του Crocus sativus L.

και άλλων ενδημικών TAXA. Μεταπτυχιακή Διατριβή, Πανεπιστήμιο Πατρών,

Τμ. Φαρμακευτικής.

Lacey, L.A. και Brooks, W.A. 1997. Biological techniques series – Manual of

techniques in insect pathology. Academic press, London.

Lecuana, R., Clement, J.L., Riba G. Joulie, C., Juanez, P., 1997. Spore germination

and hyphal growth of Beauveria sp. On insect lipids. J. Econ. Entomol. 90: 119-

123.

Lefebvre, A., 1827. Description de divers insects inedits. Ann. Soc. Linn. Paris 6, 98.

Lereclus, D., Lecadet, Μ.Μ., Ribier, J. και Dedonder, R., 1982. Molecular

relationship among plasmids of Bacillus thuringiensis: Conserved sequences

through 11 crystalliferous strains: Mol Gen. Genet. 186 391–398

Li, Z., Li, C., Huang, B., Fan, M., 2001. Discovery and demonstration of telemorph of

Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., an important entomogenous fungus. Chinese

Sci Bull. 46: 751-753.

103 Liu, H. και Bauer L., 2006. Susceptibility of Agrilus planipennis (Coleoptera:

Buprestidae) to Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae. Journal of

Economic Entomology. 99: 1096-1103.

Lobos, N., 1981. Maize pests and their importance in Turkey. EPPO Bull. 11 (2): 87 -

89.

Lomer, C.J., Cherry, A., Denis, D., 1997. Systemic Beauveria isolates for control of

maize stem borers in Africa. In: Proceedings of the 30th Annual Meeting of the

Society for Invertebrate Pathology, Banff, Canada p.44

Lomer, C.J., Bateman, R.P., Johnson, D.L., Langwald, J. και Thomas, M., 2001.

Biological Control of Locusts and Grasshoppers. Annual Review of Entomology

46: 667-702.

Lu, D., Pava-Ripoll, M., Li, Z.Z., Wang, C., 2008. Insecticidal evaluation of

Beauveria bassiana engineered to express a scorpion neurotoxin and a cuticle

degrading protease. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81: 515-522.

Luthy, P. και Ebersold, H. R. (1981) Pathogens of Invertebrate Microbial Diseases

(Davidson, E. W., ed.), pp. 235-267, Allenhead, Osmun and Co., Totowa, NJ

Λυκουρέσης, 1995. Ολοκληρωμένη αντιμετώπιση εντόμων –εχθρών καλλιεργειών.

Πανεπιστημιακές παραδόσεις. Γεωπονικό πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα, σελ.

121.

Mazomenos, B.E., 1989. Sex pheromone components of corn stalk borer Sesamia

nonagrioides (Lef.) isolation, identification and field tests. J. Chem. Ecol. 15:

1241-1247.

Maramorosch, K., 1968b.”Insect viruses”. Eur. Tip Microbiol Immunol. 42:192. Marannino, P., Santiago-Alvarez, C., De Lillo, E. και Quesada-Moraga, E. 2006. A

New Bioassay Method Reveals Pathogenicity of Metarhizium anisopliae and

104 Beauveria bassiana against Early Stages of Capnodis tenebrionis (Coleoptera;

Buprestidae), Journal of Invertebrate Pathology. 93: 210-213.

Marianni, M., 1934. Una grave infestazione di Sesamia veteria Stoll (nonαgrioides

Lef.) in provincial di Messina. Boll. Soc. Ent. Ital. 66(6): 128-130.

McNeil, Donald G. Jr., Fungus Fatal to Mosquito May Aid Global War on Malaria,

The New York Times, 10 June 2005

Menti, H., Wright, D.J και Perry, R.N., 1997. Desiccation survival of populations of

the entomopathogenic nematodes Steinernema feltiae and Heterorhabditis

megidis from Greece and the UK. Journal of Helminthology. 71(1): 41-46.

Menti, H.; Wright, D.J και Perry, R.N., 2000. Infectivity of populations of the

entomopathogenic nematodes Steinernema feltiae and Heterorhabditis megidis in

relation to temperature, age and lipid content. Nematology. 2(5): 515-521.

Menti, H., Patel, M.N., Wright, D.J. και Perry, R.N., 2003. Lipid utilisation during

storage of the entomopathogenic nematodes Steinernema feltiae and

Heterorhabditis megidis from Greece and the UK. Nematology. 5(1): 31-37

Meyer, J.M., Hoy, M.A., και Boucias, D.G., 2008. Isolation and Characterization of

an Isaria fumosorosea Isolate Infecting the Asian Citrus Psyllid in Florida,

Journal of Invertebrate Pathology. 99: 96-102.

Mietkiewski, R., Gorski, R., 1995. Growth of selected entomopathogenic fungi

species and isolates on media containing insecticides. Acta Mycol. 30: 27–33.

Mietkiewski, R.T., Pell, J.K. και Clark, S.J., 1997. Influence of pesticide use on the

natural occurrence of entomopathogenic fungi in arable soils in the UK: Field and

laboratory comparisons. Biocontrol Science and Technology. 7: 565–575.

105 Milner, R.J., 1972. Nosema whitei, a microsporidian pathogen of some species of

Tribolium. I. Morphology, life cycle, and generation time. J. Inv. Pathol. 19: 231–

238.

Milner, R.J., 1973. Nosema whitei, a microsporidian pathogen of some species of

Tribolium. IV. The effect of temperature, humidity and larval age on

pathogenicity for T.castaneum. Entomophaga. 18: 305–315.

Milner, R.J., 1992. Selection and characterization of strains of Metarhizium

anisopliae for control of soil insects in Australia. In: Biological Control of

Locusts and Grasshoppers. CAB International, UK, pp 200-207.

Mohamed, A.K.A., Sikorowski, P.P., Bell J.V., 1978. Histopathology of Nomurea

rileyi in larvae of Heliothis zea and in vitro enzymatic activity. J Inv Pathol. 39:

345-352.

Moore, D., Reed, M., Le Patourel, G., Abraham, Y.J. and Prior, C., 1992. Reduction

of feeding by the desert locust, Schistocerca gregaria, after infection with

Metarhizium flavoviride. Journal of Invertebrate Pathology. 60: 304–307.

Moorhouse, E.R., Gillespie, A.T. και Charnley, A.K., 1993. Laboratory selection of

Metarhizium spp. isolates for control of vine weevil larvae (Otiorhynchus

sulcatus). Journal of Invertebrate Pathology. 62: 15–21.

Muthukrishnan, J. και Pandian, T.J., 1987. Insecta. Animal Energetics (eds. F.J.

Vernberg & T.J. Pandian), pp. 373–511. Academic Press, New York. Ou, H.Y.,

Μπαμπίλης, Ν., 1992. Μελέτη της βιολογίας και της συμπεριφοράς του εντόμου

Sesamia nonagrioides (Lef.) (Lepidoptera: Noctuidae). Διδακτορική Διατριβή.

Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας.

106 Μπατζάκης, Β.Δ., 1970 Διευκρίνιση μιας συνωνυμίας του είδους Sesamia

nonagrioides (Lef.) (Lepidoptera: Noctuidae). Χρον. Μπενακείου Φυτ. Ινς. Ν. Σ.

9: 320-323.

Nara, J.M., Lindsay, R.C. και Burkholder, W. E., 1981. Analysis of volatile

compounds in wheat germ oil responsible for an aggregation response in

Trogoderma glabrum larvae. Agric. Food Chem. 29: 68-72.

Nepveu, P., 1953. Observation s sur la morphologie et la biologie des Sesamies du

mais et du sorgho an France (Sesamia nonagrioides Lef. Et Sesamia cretica

Led.). Ann. Epiph. 4: 445–457.

Nicifora, A. 1966. Appunti sulla biologia di Sesamia nonagrioides (Lef.) in Sicilia.

Tel. Agr. 18: 395-419.

Nickle, W.R and Welch H.E, 1984. Insect Nematodes. In: Plant and Insect

Nematodes. Ed: W.R. Nickle, Marcel Dekker, Inc., New York and Basel, pp 627-

650.

Ownley, B.H., Pereira, R.M., Klingeman, W.E., Quigley, N.B., Leckie, B.M., 2004.

Beauveria bassiana, a dual purpose biocontrol organism, with activity against

insect pests and plant pathogens. In: Lartey, R.T., Cesar, A.J. (Eds.), Emerging

Concepts in Plant Health Management. Research Signpost, India, pp. 255–269.

Pedrini N., Crespo R. και Juanez M.P. 2006. Biochemistry of insect epicuticle

degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and

physiology, Part C.

Petrini, O., 1981. Endophytische Pilze in Epiphytischen Araceae, Bromeliaceae und

Orchidiaceae. Sydowia. 34: 135–148.

Pevling, R., Weyrich, J., 1992. Effects of neem oil, B. bassiana and Dieldrin on non

target tenebrionid beetle in desert zone of the Republic of Niger. Biological

107 control of Locusts and Gras hoppers: Proceedings of the Workshop held at

International Institute of Tropical Agriculture: Cotonou, Republic of Nenin,

April–May 1991, Wallingford, UK, CABI, pp 321–336.

Phillips, D.H. και Burdekin, D.A., 1992. Diseases of Forest and Ornamental Trees.

Macmillan. ISBN 0-333-49493-8.

Pierce, C.M.F., Solter, L.F., Weinzierl, R.A., 2001. Interactions between Nosema

pyrausta (Microsporidia: Nosematidae) and Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki

in the European corn borer (Lepidoptera: Pyralidae), J. Econ. Entomol. 94: 1361-

1368.

Pingel, R.L., Lewis, L.C., 1996. The fungus Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin

in a corn ecosystem: its effect on the insect predator Coleomegilla maculata De

Geer. Biological Control, 6: 137–141.

Poinar, G.O. Jr. και Thomas, G.M., 1978. Diagnostic manual for the identification of

insect pathogens. E.d.: Plenum Press, N.Y. and London, pp: 1-151

Poprawski, T.J., Robert, P.-H., Maniania, N.K., 1985. Susceptibility of the onion

maggot, Delia antiqua (Diptera: Anthomyiidae) to the mycotoxin destruxin E.

Canadian Journal of Entomology. 117: 801–802.

Prasertphon, S., Tanada, Y., 1968. The formation and circulation in Galleria, of

hympal bodies of entomopathoraceous fungi. J. Inv. Pathol. 11: 260-280

Prior, C., Greathead, D.J., 1989 Biological control of locusts: the potential for the

exploitation of pathogens. FAO Plant Protection Bulletin. 37: 37-48.

Prota, R., 1965. Osserrvazioni sul etologia di Sesamia nonagrioides Lef. In Sardegna.

Studi Sass. An. Fac. Agr. Sassari. 13: 336 – 360.

108 Pusztai, M., Fast, P., Gringoten, L., Kaplan, H., Lessard, T. και Carey, P. R., 1981.

The mechanism of sunlight-mediated inactivation of Bacillus thuringiensis

crystals. Biochem. J. 273: 43-47.

Πελεκάσης, Κ.Ε.Δ. 1962. Καταλογός των σπουδαιότερων εντόμων και άλλων ζώων

σημειωθέντων ως επιβλαβή εις την Ελληνική Γεωργία κατά την τελευταία

τριακονταετία. Χρον Μπενακείου Φυτοπ. Ινσ. 5: 5-104.

Rebel, H., 1916. Die lepidopterenfauna Kreta. Ann. K. naturalist. Hofnius, wien. 66-

172.

Rehner, S.A., Buckley, E.P., 2005. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS

and EF1-a sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps

teleomorphs. Mycologia. 97: 84–98.

Rivnay, E. 1963. Situation actuelle des lepidopteres en nenris du mais et les autres

graminees actives en Israel. Bull. Phyt. FAO. 11: 1-3.

Robards, K., Prenzler, P.D., Tucker, G., Swatsitang, P., Glower, W., 1999. Phenolic

compounds and their role in oxidante processes in fruits. Food chem. 66: 401-

436.

Roberts, D.W., 1981. Toxins of entomopathogenic fungi. In: Burges, H.D. (Ed.),

Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970–1980. Academic Press,

London, pp 441–463.

Roberts, D.W. and Hajek, A.E., 1992. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides.

Frontiers in Industrial Mycology (ed. G.F. Leathan), pp 144–159. Chapman &

Hall, New York.

Roberts, D.W., Humber, R.A., 1981. Entomogenous fungi. In: Cole, G.T., Kendrick,

W.B. (Eds), vol. 2. Academic Press, New York, pp 201-236.

109 Roberts, D.W., St. Leger, R.J., 2004. Metarhizium spp., cosmopolitan insect-

pathogenic fungi: mycological aspects. Adv. Appl. Microbiol. 54: 1-70.

Robinson, J.W., Kutcher, E., 1951. Histoplasmosis survey of dogs in Louisiana

Kentucky. Public Health Rep. 66: 1533.

Roditakis, E., Couzin, I.D., Balrow, K., Franks, N.R. & Charnley A.K., 2000.

Improving secondary pick up of insect fungal pathogen conidia by manipulating

host behaviour. Annals of Applied Biology. 137(3): 329-335.

Rossi, U., Turati, E., 1934. Le Leucanidi del gruppo zeae. Dup. ela cosidetta “Nottua

del granoturco” Mem. Soc Ent. Ital. XIII: 273 -293.

Rukmini, V., Reddy, C.Y., Venkateswerlu, G., 2000. Bacillus thuringiensis crystal

endotoxin: roles of proteases in the conversion of protoxin to toxin. Biochimie.

82: 109–116.

Quesada-Moraga, E., Vey, A., 2004. Bassiacridin, a protein toxic for locusts secreted

by the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Mycology Research. 108:

441–452

Quesada-Moraga, Enrique,. Navas – Cortez, Juan A, Maranhao, Elizabeth A. A., Ortiz

- urquiza, Almudena, Candido Santiago Alvarez., 2007. Factors affecting the

occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated

soils. Mycological Research III: 947 – 966.

Samson, R.A., 1974. Paecilomyces and some allied Hyphomycetes. Studies in

Mycology 6: 1–119.

Stavrakis, G.N., 1967. Contributions a L etude des especes nuisibles au mais en grece

du genre Sesamia (Lepidopteres – Noctuidae). Ann. Inst. Phytopathol Benaki. 8:

19-22.

SAS Institute 2011 SAS User’s Guide: Statistics. SAS Institute, Cary, NC, USA.

110 Serafini, M., Bellocco, R., Wolk, A., Ekstrom, A.M., 2002. Total antioxidant potential

fruit and vegetables and risk of gastric cancer. Gastroente. 123: 985-991.

Setrkaya, E. και Kornosor, S., 1999. Lepidtopterous pests and their natural enemies

on the maize in Cukurova region. XXth IWGO Meeting, 5-10 September, Adana,

Turkey.

Setrkaya, E., και Kornosor, S., 2003. Some biological aspects of the egg parasitoid

Telenomus busseolae (Gahan) (Hym., Scelionidae) on the Sesamia nonagrioides

Lef. (Lep., Noctuidae) eggs. (Abstract) Turk. Entomol. Derg. 27: 231-239.

Seyoum, E., Moore, D. και Charnley, A.K., 1994. Reduction in flight activity and

food consumption by the desert locust, Schistocerca gregaria Forskal

(Orthoptera: Cyrtacanthacrinae) after infection with Metarhizium flavoviride.

Journal of Applied Entomology. 118: 310–315.

Screen, S.E., Hu, G. και St. Leger, R.J., 2002. Transformants of Metarhizium

anisopliae sf. anisopliae over expressing chitinase from Metarhizium anisopliae

sf. acridum show early induction of native chitinase but are not altered in

pathogenicity to Manduca sexta . Journal of Invertebrate Pathology. 78: 260-266.

Serowy, G., Juan H.D. 1951. Microsporia as dermatologist problem. Derma.

Wochensc. 124: 665-678.

Silva, W.O.B., Santi, L., Berger, M., Pinto, A.F.M., Guimaraes, J.A., Schranka, A.,

Vainstein, M.H., 2009. Characterization of a spore surface lipase from the

biocontrol agent Metarhizium anisopliae. Process Biochem. 44: 829-834.

Shields, M.S., Lingg, A.J., Heimsch, R.C., 1981. Identification of a Penicillium

urticae metabolite which inhibits Beauveria bassiana. Journal of Invertebrate

Pathology. 38: 374–377.

111 Smith R.J. και Grula E.A. 1982. Toxic components on the larval surface of corn

earworn (Heliothis zea) and their effects on germination and growth of Beauveria

bassiana. J. Inver Pathol. 39: 15-22.

Smith, J.E., Lewis, CW., Anderson, J.G. και Solomons, G.L., 1994. Mycotoxins in

human nutrition and health. Ed: EUR 16048 En Directorate – General, VIII: 138-

139.

Solomon, Eldra, Linda Berg, Diana Martin. 2002. Biology. Brooks/Cole.

Steinhaus, E. A. 1949. Principles of Insect Pathology. McGraw-Hill Book Company,

Inc., N.Y., U.S.A., p: 166-177, 228-9, 318-9, 417-421, 633-7.

Steinhaus, E.A., 1956. Microbial control - the emergence of an idea. Hilgardia.

26(2):107-60.

Steinhaus, E.A., 1964. Microbial diseases of insects, In: Biological Control of Insects

Pests and Weeds, Ed: DeBach, P., London, pp 521-2.

St. Leger, R.J., Butt, T.M., Goettel, M.S., Staples, R., Roberts, D.W., 1989b.

Production in vitro appressoria by entomopathogenic fungus Metarhizium

anisopliae. Exp Mycol. 13: 274-288.

St. Leger, R.J., Goettel M.S., Roberts D.W, Staples R., 1991a. Prepenetration events

during infection of host cuticle by Metarizium anisopliae. J. Invert Pathol. 58:

168-170.

St. Leger, R.J., Roberts D.W, Staples R., 1991b. A model to explain differentiations

of appessoria by germlings of Metarhizium anisopliae. . J. Invert Pathol. 57: 299-

310.

St. Leger, R.J., Staples, R.C. και Roberts, D.W., 1991. Changes in translatable mRNA

species associated with nutrient deprivation and protease synthesis in

Metarhizium anisopliae. Journal of General Microbiology. 137: 807–815.

112 St. Leger, R.J., Allee, L.L., May, B., Staples, R.C. και Roberts, D.W. 1992. World-

wide distribution of genetic variation among isolates of Beauveria spp.

Mycological Research. 96: 1007–1015.

Strasser, H., Forer, A. και Schinner, F., 1996. Development of media for the selective

isolation and maintenance of virulence of Beauveria brongniartii. In: T.A.

Jackson and T.R. Glare(eds), Proceedings of the 3rd International Workshop on

Microbial Control of Soil Dwelling Pests, February 21–23, 1996. AgResearch

Lincoln, New Zealand. pp 125–130.

Strasser, H., Vey, A., Butt, T.M., 2000. Are there any risks in using

entomopathogenic fungi for pest control, with particular reference to the

bioactive metabolites of Metarhizium, Tolypocladium and Beauveria species?

Biocontrol Science and Technology. 10: 717–735.

Summers, M., Engler, R., Falcon, L. A. και Vail, P. V., 1975. Baciloviruses for insect

pest control : Safety considerations. American Society for Microbiology ,

Washington, D. C.

Suzuki, A., Kuyama, S., Kodair, Y. και Tamura, S., 1966. Structural elucidation of

destruxin A. Agric. Biol. Chem. (Tokyo). 30: 517-518.

Suzuki, A., Taguchi, H. και Tamura, S., 1970. Isolation and structure elucidation of

three new insecticidal cyclodepsipeptides, destruxins C and D and desmethyl

destruxin B, produced by Metarrhizium anisopliae. Agric. Biol. Chem. (Tokyo).

34: 813-816.

Suzuki, A., Kawakami, K.και Tamura, S., 1971. Detection of destruxins in silkworm

larvae infected with Metarrhizium anisopliae. Agric. Biol. Chem. (Tokyo). 35:

1641-1643.

113 Suzuki, A., Kanaoka, M., Isogai, A., Murakoshi, S., Ichinoe, M., Tamura, S., 1977.

Bassianolide, a new insecticidal cyclodepsipeptide from Beauveria bassiana and

Verticillium lecanii. Tetrahedron Letters. 25: 2167–2170.

Σταματόπουλος, Κ.Δ., 1999. Έντομα αποθηκών μεγάλων καλλιεργειών και

λαχανικών. Εκδόσεις ΖΗΤΗ, 2η έκδοση, Θεσσαλονίκη.

Tanada, Y., 1993. Epizootiology of infectious diseases, In: Insect Pathology, Ed:

Steinhaus E, Academic press, Inc, USA., pp: 461-468.

Tams, W.H.T. και Bowden J., 1953. A revision of the African species of Sesamia

Guenne and related genera (Agrotidae – Lepidoptera) Bull. Entom. Res. 43: 645

– 678.

Thomas, M.B., Blanford, S. και Lomer, C.J., 1997. Reduction of feeding by the

variegated grasshopper, Zonocerus variegatus, following infection by the fungal

pathogen, Metarhizium flavoviride. Biocontrol Science and Technology.7: 327–

334.

Thomas, M.B., Read, A.F., 2007a. Can fungal biopesticides control malaria? Nat.

Rev. Microbiol. 5: 377-383.

Thomas, M.B., Read, A.F., 2007b. Fungal bioinsecticide with a sting. Nat.

Biotechnol. 25: 1367-1368.

Tkaczuk, C., Kontodimas, D.C, Martinou, A., Mantzoukas S., και Giannouri D., 2009.

Ιsolation of entomopathogenic fungi from different habitats in Greece using the

galleria bait method, semiselective media and samling cadavers. 13 National

Entomological Conference, Alexandroupoli 3-6 November 2009: 251-255

Tsitsipis, J.A. και Alexandri, M., 1989. The corn stalk borer Sesamia nonagrioides

(Lepidoptera: Noctuidae): Population fluctuation and plant infestation

relationships. Acta Phytop. Entom. Hung. 24: 213-218.

114 Tsitsipis, J.A., Mazomenos, B.E., Christoulas, C., Mouloudis, S., Stefanakis, M.,

Papageorgiou, G., Gliatis, A., και Sinis, D., 1983. Report on the lepidopterous

insects attacking corn in the Greece with emphasis on the corn stalk borer,

Sesamia nonagrioides. 9th Interbalc. Plan Prot. Conf. Athens, Nov 7-11.

Tsitsipis, J.A., 1984. Rearing the corn borer, Sesamia nonagrioides on the artifiacial

media in the lab. XVII Inter. Congress of Entomology, Hamburg, Abstact

Volume pp.316.

Tsitsipis, J.A.,1990: Contribution toward the development of an integrated control

method for the corn stalk borer Sesamia nonagrioides (Lef.). In Casida J.E. (ed.):

Pesticides and Alternatives. Elsevier, Amsterdam, pp 217–228.

Τσιτσιπής, Ι.Α., Αλεξανδρή, Μ., Γλιάτης, Α., Σταθόπουλος, Φ., Στεφανάκης, Μ.,

Μαλούδης, Σ., Στυμπίρης, Ι., Κατράνης, Ν., Σιδέρης, Α., Κυπαρισσούδας, Δ.,

Σκλαβάκης, Π., Λεμονία, Α., Αναγνώστου, Β., και Αθανασιάδης, Ν., 1987. Το

σύμπλοκο των επιζήμιων Λεπιδοπτέρων στο αργοοικοσύστημα του αραβόσιτου.

Β’ Πανελλήνιο Εντομολογικό Συνέδριο, Αθήνα 11-13 Νοεμβρίου 1987.

Τσιτσιπής, Ι.Α, Γλιάτης, Α., Σαλτζή,ς Β., Σταθόπουλος, Φ., Μουλούδης, Σ.,

Στεφανάκης, Μ., Παπαστεφάνου Σ., Χριστούλας, Κ., Παπαγεωργίου, Γ.,

Κατράνης, Ν. και Οικονόμου, Δ., 1991. Εποχιακή εμφάνιση του Sesamia

nonagrioides και Ostrinia nubilalis σε διαφορές περιοχές της Ελλάδας και

εκτίμηση της προκαλούμενης απ αυτά ζημίας στην παραγωγή του αραβόσιτου.

Α΄ Πανελλήνιο Εντομολογικό Συνέδριο, Αθήνα 1991.

Τζανακάκης, Μ.Ε., 1995. Εντομολογία. University studio press, Θεσσαλονίκη, σελ

385.

115 Uyqun, N. και Kayapinar, A., 1993. A new pest on banana: Corn stalk borer, Sesamia

nonagrioides Lefebvre (Lep., Noctuidae) in South Anatolia. Turk Entomol. Derg.

17: 33-40.

Van den Bosch, R., Messenger, P.S. και Gutierrez, A.P., 1982. Chapter 3 in

Biological Control. Plenum Press, NY and Lond. pp 21-36.

Vandenberg, J.D., Ramos, M. και Altre, J.A., 1998. Dose response and age and

temperature related susceptibility of the diamondback moth (Lepidoptera:

Plutellidae) to two isolates of Beauveria bassiana (Hyphomycetes: Moniliaceae).

Environmental Entomology. 27: 1017–1021.

Van Driesche, R.G. και Bellows, T.S., 1996. Chapter 1 in Biological Control.

Chapman and Hall, NY. pp 539.

Van Rensburg, J.B.J., Van Den Berg, J., 1992. Infestation patterns of stalk borers

Busseola fusca Fuller (Lep.: Noctuidae) and Chilo partellus Swinhoe (Lep.:

Pyralidae) in sorghum. J Entomol Soc South Afr. 55: 197–212.

Vaya, J., Belinky, P.A. και Aviram, M., 1997. Antioxidant constituents from licorise

roots: Isolation, structure elucidation and antioxidative capacity toward LDL

oxidation. Free Radical Biol. Med. 23(2): 302-313.

Velioglu, Y.S., Mazza, G., Gao, L., Oomah, B.D., 1998. Antioxidant activity and total

phenolics in selected fruits and grain products. J. Agric. Food Chem. 90: 685-

689.

Vega, F.E., Dowd P.F., Mc Guire, M.R. Jackson, M.A., Nelsen, T.C., 1997. In vitro

effects of secondary plant compounds on the germination of blastospores of

entomopathogenic fungus Paecilomyces Fumosoroseus. J. Invert Pathol. 70: 209-

213.

116 Vega, F.E., Posada, F., Aime, M.C., Pava-Ripoll, M., Infante, F., Rehner, S.A., 2008.

Entomopathogenic fungal endophytes. Biol. Control. 46: 72-82.

Vey, F.E.,Hoagland, R. και Butt, T.M., 2001. Toxic metabolites of fungal biological

control agents. Cab International, Wallingford, Oxon, Uk, pp 311-345.

Vilkinskas, S.A., Matha, V. και Gotz, P., 1997a. Inhibition of phagocytic activity of

plasmotocytes isolated from Galleria mellonella by entomopathogenic fungi and

their secondary metabolites. J Insect. Pathol. 43: 475-483.

Vilkinskas, S.A., Matha, V. και Gotz, P., 1997b. Effects of the entomopathogenic

fungus Metarhizium anisopliae and its secondary metabolites on the morphology

and cytoskeleton of plasmotocytes isolates from the greater wax moth Galleria

mellonella. J Insect. Pathol. 43: 1149-1159.

Wang, C., Butt, T.M., St Leger, R.J., 2005a. Colony sectorization of Metarhizium

anisopliae is a sign of ageing. Microbiology. 151: 3223-3236.

Wang, C., Hu, G., St Leger, R.J., 2005b. Differential gene expression by Metarhizium

anisopliae growing in root exudate and host (Manduca sexta) cuticle or

hemolymph reveals mechanisms of physiological adaptation. Fungal Genet. Biol.

42: 704-718.

Wang, C., St. Leger, R.J., 2005c. Developmental and transcriptional responses to host

and non host cuticles by the specific locust pathogen Metarhizium anisopliae sf.

acridum. Eukaryot. Cell 4, 937-947.

Wang, C., St. Leger, R.J., 2006. A collagenous protective coat enables Metarhizium

anisopliae to evade insect immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103,

6647-6652.

Welch, H.E. 1963. Nematode Infections. In: Insect Pathology, An Advanced Treatise,

Volume 2, Ed: Steinhaus, E, Academic Press, London, pp 364-365.

117 Wraight, S.P., Butt, T.M., Galaini-Wraight, S., Allee, L.L., Soper, R.S., Roberts,

D.W., 1990. Germination and infection processes of entomophothoralean fungus

Erynia radicans on the potato leafhopper Emproasca fabae. J. Ivert. Pathol. 56:

157-174.

Φαντινού, Α., 1992. Επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων στη διάπαυση των

ατελών σταδίων του Sesamia nonagrioides (Lef) (Lepidoptera: Noctuidae).

Διδακτορική Διατριβή, Γ.Π.Α.

Yen, G.C., Duh, P.D., Tsai, C.L., 1993. Relationship between antioxidant activity and

maturity of peanut hulls. J. Agric. Food Chem. 41: 67-70.

[ΥΠΑΑΤ] Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων., 2009. Δ/νση

Προστασίας Φυτικής Παραγωγής, Κατάλογοι Φυτοπροστατευτικών Προϊόντων

και Βιοκτόνων, κατά καλλιέργεια και έντομο (εχθρό)

(http://www.minagric.gr/syspest/SYSPEST_ENEMY_dron.apsx)

Zimmermann, G., 1986. The Galleria bait method for detection of entomopathogenic

fungi in soil. J. Appl. Ent. 102: 213–215.

Zimmermann, G., 2007. Review on safety of entomopathogenic fungi Beauveria

bassiana, B.brougniartii. Published in: Biocontrol Science and Technology Vol.

17(6): 553-596.

Zimmermann, G., 2008. The Entomopathogenic Fungi Isaria farinosa (formerly

Paecilomyces farinosus) and the Isaria fumosorosea Species Complex (formerly

Paecilomyces fumosoroseus): Biology, Ecology and Use in Biological Control’,

Biocontrol Science and Technology. 18: 865-901.

Zheng, W., Wang, S.Y., 2001. Antioxidant activity and phenolic compounds in

selected herbs. J. Agric. Food Chem. 49: 5165-5170.

118 Χρυσάνθη, Δ., 2010. Συμβολή στον χαρακτηρισμό και στην διερεύνηση βιολογικών

ιδιοτήτων των στύλων ειδών γένους Crocus. Διδακτορική Διατριβή

Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμ. Φαρμακευτικής.

119