Faculdade de Ciências e Letras de Assis

EVOLUÇÃO E DIVERSIDADE DE CERIANTHARIA ()

Submissão Auxílio à Pesquisa FAPESP

SOLICITANTE: SÉRGIO NASCIMENTO STAMPAR

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" CAMPUS DE ASSIS

2015 Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 1

EVOLUÇÃO E DIVERSIDADE DE CERIANTHARIA(CNIDARIA)

PESQUISADOR RESPONSÁVEL: SERGIO N. STAMPAR [email protected]

Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de Assis

RESUMO (20 LINHAS)

A divisão dicotômica entre os grandes grupos (subfilos) em Cnidaria (Anthozoaria x Medusozoa) está muito relacionada com os distintos padrões de ciclo de vida reconhecidos. Vários subgrupos dentro de cada subfilo de Cnidaria têm sido estudados utilizando diferentes abordagens, entretanto, Ceriantharia (um subgrupo de Anthozoaria) permanece ainda uma incógnita em muitos aspectos. A esse subgrupo já foram atribuídas uma série de posições sistemáticas e ainda não existe um consenso. Os Ceriantharia possuem muitas peculiaridades em relação aos demais grupos, incluindo estruturas no seu genoma que são diferentes das conhecidas para Anthozoaria e até a possibilidade de ciclos de vida holoplanctônicos, desconhecido para espécies de Anthozoaria. Análises moleculares realizadas até o momento mostram que a posição de Ceriantharia ainda é controversa, mas apresenta tendência de contrapor as propostas mais utilizadas (Ceriantharia + Hexacorallia). Esse cenário incerto apresenta desdobramentos em várias escalas, principalmente relacionados a origem e tempos de divergência entre os grupos. Baseado no exposto acima, o presente projeto propõe uma avaliação compreensiva sobre Ceriantharia e suas relações com os demais clados em Cnidaria. A proposta incorporará dados morfológicos, biológicos (ciclo de vida e comportamento) e moleculares de espécies de Ceriantharia para avaliar a relação filogenética dentro do grupo e entre os demais clados de Cnidaria. Uma grande quantidade de informações inéditas será gerada e que serão revertidas na produção de publicações mostrando um cenário mais amplo deste grupo. Este projeto permitirá a formação de um novo grupo de pesquisadores, podendo se nivelar aos laboratórios internacionais.

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EVOLUTION AND DIVERSITY OF CERIANTHARIA (CNIDARIA)

RESEARCHER: SERGIO N. STAMPAR [email protected] Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Campus de Assis

ABSTRACT

The dichotomy between Anthozoaria x Medusozoa, major groups (subphyla) in Cnidaria, is closely related to distinct recognized life cycle patterns. Many subgroups within each of the Cnidaria subphylum have been studied using different approaches. However, Ceriantharia (a subgroup of Anthozoaria) remains a mystery in many aspects. A number of systematic positions have been inferred for this group and there is still no consensus. Ceriantharia have many peculiarities compared to other groups, including different genome structures from those known to Anthozoaria and even the possibility of holoplanktonic life cycles, unknown in Anthozoarian species. Molecular studies performed to date demonstrate that the position of Ceriantharia remains controversial, but exhibits a tendency to oppose the most frequent proposals (Ceriantharia + Hexacorallia). This scenario has many outcomes at various scales, especially related to the origin and time of divergence among groups. Based on the above explanation, this project proposes a comprehensive evaluation of Ceriantharia and its connection with other clades of Cnidaria. The proposal will incorporate morphological, biological data (life cycle and behavior) and molecular data of Ceriantharian species to assess the phylogenetic relationship within Ceriantharia and among other clades of Cnidaria. A large amount of new information will be generated that will be reverted to publications in the area showing an improved scenario of this group. This project will allow the formation of a new research group, enabling it to level with other international laboratories.

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ENUNCIADO DO PROBLEMA O número de espécies de cnidários no mundo é estimado em mais de 11.000 (Daly et al. 2007). A evolução do grupo resultou em uma enorme variedade de formas corporais e uma grande diversidade de estratégias de ciclos de vida (Collins, 2009), reconhecidas também na fauna contemporânea. Os cnidários são reconhecidos por apresentarem três tipos corporais básicos: larva, pólipo e medusa. Com base nestes tipos, existem dois padrões generalizados de ciclos de vida, o metagenético que inclui alternância de gerações entre pólipo (jovem) e medusa (adulto) e o ametagenético com apenas a fase de pólipo no ciclo de vida (Ax, 1996). Estes dois estágios do ciclo de vida e os padrões relacionados a eles são, atualmente, a base da classificação dos cnidários (Anthozoaria x Medusozoa) (Petersen 1979; Marques & Collins 2004), sendo esse padrão dicotômico poucas vezes contestado (van Beneden, 1898; McMurrich, 1910; Park et al., 2012). Anthozoaria () é foco de trabalho de vários grupos de pesquisa ao redor do mundo, entretanto, o interesse dos pesquisadores não é uniforme dentre os grandes grupos e muito menos nas temáticas de pesquisa (ver mais em Daly et al., 2007). Uma série de trabalhos com viés evolutivo já foi realizada em determinados grupos, principalmente nas ordens Actiniaria e Scleractinia (ver mais em Kitahara et al., 2014). Apesar de intensamente estudada diversos tópicos na biologia características destes grupos, a sistemática dentro de Anthozoa ainda é bastante problemática e a posição filogenética dos grupos pouco estudados, como Ceriantharia tem sido bastante controversa (ver exemplos na Fig.1). As anêmonas de tubo (Anthozoa, Ceriantharia, ~50 espécies descritas) compõem um grupo muito particular de Cnidaria pelo tipo de cnidas, forma de crescimento e simetria exclusivos. Desde o trabalho de Andres (1884) se inicia a tendência em agrupar os Ceriantharia dentre os Hexacorallia, mais especificamente dentre ou próximo das ordens Actiniaria e Antipatharia. van Beneden (1898) apontou que Andres (1884) não estava correto em suas afirmações e criou um novo clado agrupando Ceriantharia e Antipatharia, em uma subclasse distinta denominada Cerianthipatharia. Durante este tempo alguns estudos propuseram diferentes classificações para Ceriantharia, mas nenhuma foi completamente aceita. Por exemplo, McMurrich (1910) apresentou uma classificação alternativa onde Ceriantharia seria um ramo independente dentre os Anthozoa. Entretanto publicações de grande difusão como Hyman (1940) e Manuel (1981) continuaram a utilizar o clado Ceriantipatharia e as propostas de McMurrich não foram reconhecidas. O grande apelo para a manutenção do clado Ceriantipatharia foi a relação ontogenética dos dois grupos inclusos, pois algumas larvas de alguns antipatários são semelhantes às larvas de algumas espécies de ceriantários. Foi exatamente esta similaridade, discutida por van Beneden (1898), que acarretou na delimitação desta subclasse Ceriantipatharia. Porém, com as propostas sistemáticas baseadas em dados moleculares, essa subclasse foi desfeita e os dois grupos foram colocados como ordens dentro da subclasse Hexacorallia (Chen et al., 1995; Berntson et al., 1999).

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Figura 1 – Exemplos de propostas filogenéticas que abordaram Ceriantharia em relação aos demais antozoários (sendo: MF – Morfologia; MF/ML – Morfologia/Molecular e ML – Molecular).

Os Ceriantharia: relações filogenéticas a partir da genética Análises moleculares que incluíram sequências de Ceriantharia foram iniciadas em 1995 por Chen e colaboradores. Neste estudo os autores descrevem um resultado “incomum” em relação às análises de sequências do marcador ribossomal nuclear 28S de Cerianthus sp. (posteriormente identificado com Pachycerianthus magnus). Nesta análise, o ramo que representa Ceriantharia ficou alocado entre o grupo externo (Cubozoa Chironex fleckeri) e os demais Anthozoa. Os autores discutiram que a posição de Ceriantharia era muito confusa e não entraram em detalhes. Ainda sim, foi possível verificar que a antiga proposição do grupo Ceriantipatharia não era válida segundos seus resultados. Subsequentemente, Song & Won (1997) apresentaram uma análise baseada no marcador ribossomal nuclear 18S (Cerianthus filiformis), concluindo que Ceriantharia seria grupo irmão do clado Octocorallia+Hexacorallia. Berntson et al. (1999) conduziram uma análise também de 18S utilizando duas espécies de Ceriantharia, sendo esse o primeiro estudo a empregar mais do que uma espécie em uma mesma análise ( americana e Cerianthus (Pachycerianthus) borealis) Entretanto, as sequências utilizadas neste estudo não são coerentes com as demais obtidas para Ceriantharia em diversos outros estudos (provavelmente contaminação - ver mais em Stampar et al., 2014a). Mesmo assim, os autores discutiram que a posição de Ceriantharia não foi consistente (valores de suporte muito baixos) nas análises. Dois trabalhos subsequentes, Won et al. (2001) e Daly et al. (2003), abordaram a classe Anthozoa integrando dados morfológicos e diferentes marcadores moleculares. Ainda sim, os resultados são inconsistentes em relação a posição de Ceriantharia dependendo do tipo de análise. Por outro lado, os estudos mais recentes apresentaram dois padrões muito distintos: > Ceriantharia como uma linhagem dentre os membros de Hexacorallia (Kayal et al., 2013; Rodriguez et al., 2014). Neste padrão os estudos demonstraram, com base em marcadores mitocondriais, que alguns setores conservados são muito relacionados entre Ceriantharia e Hexacorallia. Entretanto, essa correlação só é observada com a manipulação das sequências (ex. exclusão/pesagem de setores, definição a priori de raiz); > Ceriantharia externo à Hexacorallia, como grupo irmão de Hexacorallia + Octocorallia ou, até mesmo, grupo irmão de todos os demais Cnidaria (ver discussão em Stampar et al., 2014a). Estes últimos

Solicitação auxílio FAPESP Sérgio N. Stampar Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 5 resultados são coerentes com aqueles apresentados inicialmente por Chen et al. (1995) e Won & Song (1997). Outra análise (Park et al., 2012) baseada em genes codificantes de proteínas mitocondriais apontou Anthozoa como sendo parafilético, com Octocorallia sendo grupo irmão de Medusozoa. Kayal e colaboradores (2013) também apresentaram resultados similares em uma das análises, mas os autores não discutiram muito este padrão. Entretanto, nesta análise nenhum membro de Ceriantharia foi considerado. Ainda sim, esse último estudo exemplifica bem o problema da definição da relação interna neste filo e da base dos Cnidaria em geral. Recentemente, o grupo de Cnidaria do “NSF - Tree of Life” (Zapata et al., 2015) publicou uma extensiva filogenia baseada em transcriptomas e genes nucleares. Os autores justificam a inclusão de Ceriantharia dentre os Hexacorallia pela similaridade de tipos de cnidas, entretanto as reconstruções filogenéticas não recuperaram essa relação com valores de suporte considerados aceitáveis. Resumindo, todos os estudos acima apresentam um ponto em comum, a indefinição da posição de Ceriantharia em Cnidaria e como esta afeta o padrão geral dos Cnidaria contemporâneos (ou seja, não permite definir uma hipótese basal geral de forma clara). Desta maneira, os autores apontam que essa discussão não é trivial, principalmente pelos vários resultados apontando Ceriantharia como uma linhagem de derivação basal em relação aos demais Cnidaria. Dentre as “ordens” que tradicionalmente compõem Hexacorallia, apenas Ceriantharia não tem representantes com ao menos um genoma mitocondrial descrito até o momento. Os estudos filogenéticos de Ceriantharia baseado em marcadores mitocondriais e nucleares apresentam resultados divergentes daqueles baseados na morfologia (ver discussão em Stampar et al., 2014a). Desta forma Ceriantharia pode ser considerado como na atualidade um grupo “incertae sedis” dentre Anthozoaria (Stampar et al., 2012). Em geral, a reconstrução de filogenias de elevados níveis taxonômicos (ex. classe, ordem) demanda marcadores moleculares com “baixa” taxa (acumulo) de mutações (ex. menos do que 1% de divergência/milhão de anos) (Vandamme, 2009). Desta maneira, os genes nucleares ribossomais 28S e 18S têm sido aceitos como adequados (Cruickshank, 2002). Estes marcadores são conservados o bastante para produzir alinhamentos sem ambiguidades e para produzir sinal filogenético apropriado para relações basais (Higgins & Lemey, 2009). Os marcadores mitocondriais também podem ser utilizados neste tipo de avaliações, mas em alguns casos estes podem apresentar alguns problemas (ex. saturação) (Blouin et al., 1998; Liu et al., 2014). Para todas essas abordagens, Ceriantharia é um dos grupos em Cnidaria com menor quantidade e confiabilidade de dados. Neste tópico ainda devemos ressaltar que Ceriantharia não conta com nenhuma proposta filogenética até o momento e a consistência de alguns gêneros é contestada (ver resultados esperados).

Discussões sobre relações morfológicas e biológicas Ao contrário da profusão de reconstruções filogenéticas baseadas em dados moleculares bastante refinados (mesmo que com resultados pouco confiáveis), as poucas avaliações morfológicas carecem de explorações mais abrangentes e com abordagens diferenciadas. Atualmente, ainda existem muitas inconsistências, principalmente na interpretação de homologia entre os caracteres. Como já comentado, desde Andres 1884 que existe a tentativa de correlacionar Ceriantharia com Hexacorallia. Isso ocorre pela

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óbvia interpretação da similaridade externa de Actiniaria com Ceriantharia (van Beneden, 1924; Tiffon, 1987), como forma do corpo (principalmente da coluna) e tentáculos. Entretanto, observações mais detalhadas na morfologia (anatomia) e dados sobre a ontogenia de Ceriantharia permitem discernimento entre Ceriantharia e os demais grupos de Anthozoa (van Beneden, 1924; Stampar et al., 2014a). Contudo, ainda não existe uma discussão consistente sobre os caracteres e como estes podem ser discernidos dos diferentes clados de Anthozoa. Neste sentido, o outro grande grupo de Cnidaria (Medusozoa) está muito melhor definido, pois tem sido amplamente estudado (ver mais em Marques & Collins, 2004; Collins et al., 2006). A posição sistemática de Ceriantharia é muito importante por vários aspectos, mas o principal é relacionado com a origem e cognação dos grandes grupos atuais de Cnidaria (Anthozoaria x Medusozoa). O clado Anthozoa é atualmente aceito como um grupo natural (monofilético) formado por dois outros clados monofiléticos, Hexacorallia e Octocorallia (Daly, et al., 2007). Os fósseis de Anthozoa, principalmente dentre os Hexacorallia, permitem estimar o surgimento do grupo para, no mínimo, o período entre o Cambriano inferior no Paleozóico (~540 milhões de anos atrás) (Han et al., 2010) e o Ediacarano no Pré- Cambriano (~600 milhões de anos atrás) (Scrutton, 1999). Entretanto, nenhum destes trabalhos utilizou dados de Ceriantharia e a ausência desse grupo pode estar criando um artefato nestas análises. A ausência de registros fósseis de Ceriantharia é um grande problema para a sua inclusão, restringindo as estimativas para a apenas dados atuais. Outro aspecto muito relevante é sobre a possível existência de formas com ciclo de vida holoplantônicos (ver discussão em Molodtsova, 2004). Essa possibilidade também pode modificar muito o cenário filogenético de Cnidaria, principalmente da proposta dicotômica de Anthozoaria x Medusozoa. Este é outro aspecto pouco discutido nas propostas evolutivas do grupo. Com o cenário acima, fica evidente a necessidade de uma abordagem abrangente na posição relativa de Ceriantharia dentre os demais clados de Cnidaria. Desta forma, o presente projeto propõe uma avaliação compreensiva sobre Ceriantharia para avaliar de forma mais detalhada a posição deste grupo em relação aos outros cnidários. Essa avaliação será diferenciada da tendência atual no grupo, pois não abordará apenas dados moleculares. A proposta é abarcar dados morfológicos, ciclo de vida, comportamentais e moleculares atingindo também objetivos próprios da biologia e classificação do grupo.

OBJETIVO GERAL O objetivo central do presente projeto é discutir/avaliar a consistência sistemática dos gêneros/espécies de Ceriantharia e também a sua relação com os demais antozoários. O presente estudo abordará dois testes de hipóteses: 1) – Testar a posição de Ceriantharia em relação aos demais Cnidaria com base em caracteres morfológicos (principalmente), biológicos e moleculares - hipótese nula (H0) que Ceriantharia é grupo irmão de Hexacorallia, perfazendo um grupo monofilético com as demais ordens deste clado. A hipótese alternativa (H1) será de que Ceriantharia não é monofilético com as ordens de Hexacorallia; 2) – Testar a consistência dos gêneros previamente descritos para Ceriantharia - hipótese nula

(H0) que os gêneros são coerentes e que os caracteres definitórios estão corretos. A hipótese alternativa (H1) será que os gêneros atuais não são monofiléticos e os caracteres definitórios não são adequados.

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A abordagem utilizada será baseada em dados morfológicos, ciclo de vida, comportamento e molecular. Para atingir este objetivo central estão elencados abaixo os objetivos específicos que compõem a proposta.

Objetivos específicos:

- Análise morfológica de espécimes de todos os gêneros descritos (exceto larvas) de Ceriantharia; - Compilação e obtenção de dados de ciclo de vida de espécies de Ceriantharia; - Redefinição dos gêneros de Ceriantharia com base em caracteres morfológicos e marcadores moleculares; - Análise de variação intraespecífica morfologia/molecular para algumas espécies de Ceriantharia; - Análise da posição de Ceriantharia dentre os demais Cnidaria em base dos caracteres morfológicos, biológicos e moleculares;

RESULTADOS ESPERADOS Cada um dos objetivos específicos produzirá resultados independentes e serão publicados, inicialmente, desta maneira, mantendo a ideia inicial (e também final do projeto): uma abordagem integral do grupo. Posteriormente, os resultados serão combinados para reconstruir os cenários evolutivos necessários para as discussões propostas. A primeira abordagem será a compilação de dados morfológicos que podem ser comparáveis entre Ceriantharia x Hexacorallia + Octocorallia. A proposta é basear essa revisão na recente proposta de caracteres (10 tipos gerais com vários subtipos) de Daly et al. 2015. Esses tipos de caracteres serão avaliados em Ceriantharia para contrapor aos dados morfológicos dos demais grupos de Anthozoa. Os dados obtidos a partir destes caracteres serão utilizados para reconstruções filogenéticas e discussões de homologia. Essas abordagens resultarão em extenso e colaborativo (ver grupo de colaboração) estudo de revisão que servirá para um grande número de pesquisas posteriores. Concomitantemente, os dados morfológicos também serão utilizados para comparação dentro de Ceriantharia, sendo que o primeiro produto deste tópico será um balizador para os gêneros reconhecidos com os caracteres morfológicos que os definem. Os dados primários indicam que existe uma grande inconsistência da definição dos gêneros em Ceriantharia (Fig. 2). Nessa etapa também serão estudadas espécies ainda não descritas, principalmente na América do Sul e outras áreas pouco estudadas (Oceano Índico e Pacífico). Isso resultará na descrição de novas espécies (estimativa em 20 novas espécies). Ao mesmo tempo, algumas coleções serão visitadas para observação de materiais de espécies conhecidas para verificar padrões de variação intraespecífica.

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Figura 2 – Proposta preliminar de agrupamentos na família (Ceriantharia) sendo respectivamente: Máxima verossimilhança (bootstrap/SH-like/aLRT) e Bayesiana (Dados não publicados).

Ainda, nesta abordagem será produzida uma filogenia para Ceriantharia. O grupo não conta com nenhuma filogenia publicada até o momento. Assim sendo, todos os resultados oriundos da presente etapa serão novidades ou complementares a informações prévias. Ainda, a partir destes serão aplicadas técnicas de reconstrução biogeográfica em busca das áreas de origem dos clados de Ceriantharia. Este tópico abordará todos os oceanos apresentando amplo interesse e grande potencial colaborativo. A terceira abordagem será relacionada com dados de ciclo de vida e comportamento de algumas espécies. Essa investida tem como mote a utilização de dados não convencionais em reconstruções filogenéticas. Os ciclos de vida serão descritos para as espécies da costa do Brasil e comparados com dados pretéritos (vide Stampar et al., 2015). Ainda, serão elencados caracteres comportamentais (sequência de comportamento) em uma tentativa de abordagem inovadora no grupo. Esse tipo de caractere já foi utilizado para outros grupos de invertebrados (Japyassú & Vieira, 2002; Noll, 2002), mas nunca para algum grupo de Cnidaria. A quarta e conclusiva abordagem do projeto se dará com a proposição de cenários evolutivos para Cnidaria. As afinidades serão observadas com a elaboração de propostas filogenéticas robustas com base nos dados morfológicos, comportamentais e moleculares. Da mesma maneira que apresentamos em Stampar et al., 2014a, as propostas filogenéticas serão apresentadas de forma ampla e discussões dos possíveis desdobramentos de cada abordagem. Ainda, estas abordagens permitirão a utilização de ferramentas de relógio molecular para propostas temporais de origem dos grandes grupos (ver mais em Park et al., 2012; Duchêne & Ho, 2014; Van Iten et a., 2014). Obviamente, essa abordagem terá relevância para toda a comunidade científica.

DESAFIOS CIENTÍFICOS E OS MÉTODOS PARA SUPERÁ-LOS Metodologia específica Obtenção de materiais O presente trabalho abordará, ao menos, 23 espécies de 8 gêneros dentro 3 famílias de Ceriantharia (~ 30% da diversidade conhecida) (Tabela 1). Sendo que alguns materiais das espécies centrais

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(representando grande parte dos gêneros) já estão disponíveis (preservados) para as análises morfológicas e/ou moleculares. As demais espécies serão coletadas na natureza ou obtidas a partir de amostras em aquários ou museus. As novas coletas serão realizadas em parceria com pesquisadores locais (ver Tabela 2 e seção parcerias). Tabela 1 – Espécies elencadas para o presente trabalho. Sendo: Mol – Molecular e Mor – Morfologia.

ORDEM FAMÍLIA GÊNERO (N° DE ESPÉCIES ESPÉCIES OCORRÊNCIA DISPONIBILIDA DESCRITAS) DE Uruguai, Brasil, Mar do Imediata Cerianthidae Ceriantheomorphe (2) Ceriantheomorphe brasiliensis Caribe e Golfo do México (Mol/Mor) Jamaica e Corpus Christ Imediata Ceriantheopsis (3) Ceriantheopsis americana (EUA) (Mol/Mor) Cidade do Cabo (África Imediata Ceriantheopsis africanus do Sul) (Mol/Mor) Imediata Ceriantheopsis sp.1 Espírito Santo (Brasil) (Mol/Mor) Ceriantheopsis linetata Brasil – Argentina Imediata (Mor) Cerianthus membranaceus Piran (Eslovênia), Imediata Cerianthus (26) Barcelona (Espanha) (Mol/Mor) Cerianthus sp.1 Punta del Este (Uruguai) Imediata (Mor) Cerianthus lloydii Egmond Aan Zee Imediata

(Holanda) (Mol/Mor) Coleta Cerianthus filiformis Japão necessária Coleta Cerianthus orientalis Japão necessária Pachycerianthus magnus Gongliao (Taiwan) Imediata Pachycerianthus (17) (Mol/Mor) Pachycerianthus schlenzae Espírito Santo (Brasil) Imediata

(Mol/Mor) Pachycerianthus sp.1 Golfo de Aqaba (Arábia Imediata

Saudita) (Mol/Mor) Botrucnidiferidae Botruanthus (1) Botruanthus benedeni EUA Imediata (Mor) Imediata Botruanthus sp.1 Vera Cruz (Mexico) (Mol/Mor) Botrucnidifer (2) Botrucnidifer norvegicus Noruega, Suécia Imediata (Mor) Coleta Penicilaria Arachnactidae Arachnanthus (4) Arachnanthus oligopodus Itália/Eslovênia necessária/Receb imento Imediata Arachnanthus sarsi Irlanda (Mol/Mor) Golfo de Aqaba (Arábia Imediata Arachnanthus sp.1 Saudita) (Mol/Mor) Imediata Arachnanthus sp. 2 São Sebastião, SP (Brasil) (Mol/Mor) Imediata Isarachnanthus (4) Isarachnanthus bandanensis Várias regiões da Oceania (Mol/Mor) Caribe, Ilha da Madeira, Imediata Isarachnanthus maderensis Costa Atlântica da África (Mol/Mor) Argentina, Uruguai, Brasil Imediata Isarachnanthus nocturnus e Mar do Caribe (Mol/Mor)

Quando necessárias, as coletas serão realizadas com a utilização de mergulho autônomo com equipamento especial para sucção. Na tabela 2 estão expostos os possíveis pontos de coleta fora do Brasil. As coletas no Brasil ocorrerão na região sudeste (Espírito Santo e São Paulo) e sul (Paraná e Santa Catarina), principalmente para obtenção de espécimes vivos.

Tabela 2. Áreas estimadas para obtenção de materiais marinhos do presente projeto e as colaborações estabelecidas em cada área no exterior.

PAÍSES LOCAL COLABORAÇÃO EUA Charleston, Key Largo, Los Angeles, Allen Collins (Smithsonian, National Museum of Natural History); Estefania Elizabeth City e Corpus Christi Rodriguez (American Museum of Natural History) Fábio Moretzsohn (Texas A&M University-Corpus Christi (TAMU-CC) Itália Gênova Giorgio Bavestrello & Anny Forero (University of Genoa) Japão Okinawa, Seto James D. Reimer (MISE – University of the Ryukyus)

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Shin Kubota (MLSETO – Kyoto University) Peru Lima, Ilo Yuri Hooker (Universidad Nacional de Trujillo) Uruguai La Paloma Fabrizio Scarabino (UDELar)

Ao mesmo tempo, serão abordadas também séries de materiais coletados e depositados em alguns museus e coleções particulares. Por exemplo, os materiais depositados no Florida Museum of Natural History (série de materiais do Oceano Índico) e materiais do National Museum of Natural History (Smithsonian) (série de materiais do Golfo do México e Oceano Pacífico) já estão no Laboratório de Evolução e Diversidade Aquática (LEDA/UNESP/Assis). Esses materiais, em grande parte, apresentam espécies ainda não conhecidas e uma abordagem taxonômica tradicional será empregada para estas.

Dados de ciclos de vida No presente projeto praticamente nenhuma das espécies que serão abordadas têm o ciclo de vida conhecido/descrito. Desta forma, as coletas de algumas espécies serão focadas na obtenção de animais vivos para que sejam empregados os métodos para a elucidação do ciclo de vida (ver mais em Stampar, 2012). Neste caso, as espécies de áreas mais próximas da instituição sede serão objetivadas. Assim, as coletas realizadas no Brasil terão essa finalidade. Neste tópico alguns dados já estão sendo obtidos, como é o caso do ciclo de vida de Isarachnanthus nocturnus (Fig. 3) e de uma espécie ainda não descrita do Pará, Brasil. Neste último caso a discussão será sobre a existência de uma espécie holoplanctônica (material já disponível). O objetivo neste tópico é obter dados de ao menos uma espécie da família Arachnactidae (Isarachnanthus nocturnus) e duas da família Cerianthidae (Ceriantheomorphe brasiliensis e Pachycerianthus schlenzae). Os ciclos de vida obtidos poderão ser publicados separadamente, o que poderá gerar quantidade significativa de artigos. Esta parte do projeto será realizada em conjunto com o Laboratório de Cultivo e Estudos de Cnidaria – IB/USP (Resp. Dr. André C. Morandini) e Centro de Biologia Marinha – USP ( Resp. Dr. Alvaro E. Migotto).

Figura 3 - Ciclo de vida de Isarachnanthus nocturnus. Sendo A – Indivíduo adulto no Canal de São Sebastião, B – larva recém coletada, poucas horas de vida, C – larva após 18 dias com os aconcióides aparentes no M-mesentérios, D - F – larva entre 20 e 30 dias com evidente alongamento da coluna e tentáculos labiais, G – larva após 40 dias, H – larva após 50 dias de cultivo já com mais coloração e tentáculos curvados, I – larva após 60 dias de cultivo com poro aboral muito evidente, J – indivíduo já

Solicitação auxílio FAPESP Sérgio N. Stampar Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 11 assentado após 70 dias de cultivo e K – indivíduo já com as características de adulto, após 100 dias de cultivo (Stampar et al., 2015). Outros dados relativos aos ciclos de vida serão abordados com base na literatura e discussão com outros pesquisadores para os demais grupos de Cnidaria (ex. Nyholm, 1943, Rodriguez et al., 2011). Desta forma, serão adicionados caracteres para as reconstruções filogenéticas que possam auxiliar na interpretação da relação dos grupos. Porém, ressalta-se que a obtenção de informações sobre o ciclo de vida não é totalmente garantida, dependendo de diversas condições. Os dados até agora conseguidos são indicativos de sucesso (ex. desenvolvimento de larvas, desova em condições de laboratório – Stampar, 2012; Stampar et al., 2014b, Stampar et al., 2015b). Sistemática As linhagens abordadas serão reconhecidas primariamente utilizando-se as acepções de espécies pré- definidas na literatura (provavelmente conceito morfológico/tipológico de espécies) e posteriormente com o conceito de espécies filogenético (de Pinna, 1999), com a definição de espécie sendo um clado monofilético. Sendo assim, uma espécie seria o menor agrupamento diagnosticável de organismos individuais, dentro dos quais há um padrão de ancestralidade e descendência (Mallet, 1995).

Caracteres morfológicos Obtenção de dados Os pólipos serão identificados com base nas características morfológicas definidas em literatura específica para cada gênero (ex. Carlgren, 1912; Stampar et al., 2014b). As análises serão efetuadas com a utilização de técnicas histológicas e dissecções (vide Molodtsova, 2001; Stampar et al., 2014b; Stampar et al., 2015a). As observações serão sempre com intuito comparativo (caractere a caractere). Por exemplo, os mesentérios e respectivos filamentos mesentéricos apresentam diferenças entre as famílias (Fig. 4). Essa comparação será efetuada dentre as espécies de cada gênero, entre os gêneros e entre as famílias. Posteriormente esses padrões serão comparados com os padrões encontrados em cada um dos grupos de Anthozoaria atualmente reconhecidos. Essas comparações serão efetuadas com colaborações em cada um dos grupos (vide tópico colaborações). Muitos dados pretéritos já foram elencados durante a tese de doutorado do proponente (Stampar, 2012). Desta forma, uma base para comparação já está disponível. Como apontado acima, o início da análise será baseado nos 10 tipos gerais (com vários subtipos) sugeridos por Daly et al. 2015 em análises de pólipos (Actiniaria). Após essa primeira abordagem, os caracteres que forem passíveis de utilização serão incluídos na análise evolutiva e discutidos individualmente.

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Figura 4 – Mesentério e filamento mesentérico em cortes histológicos de diferentes membros de Ceriantharia, sendo: A – Isarachnanthus nocturnus (Arachnactidae), B – Ceriantheomorphe brasiliensis (Cerianthidae) e C – Botrucnidifer novergicus (Botrucnidiferidae). Escala – 100 µm (Dados não publicados).

Análises evolutivas Outro foco do projeto é a elaboração de filogenias para os grupos estudados com base em dados morfológicos. Estas serão baseadas nos diferentes princípios cladísticos assim como de distâncias e modelos evolutivos. Os terminais serão gêneros e espécies dos grupos em questão. Os caracteres morfológicos e seus estados propostos serão codificados em uma matriz de dados, para comparação e análises cladísticas (utilizando o programa Mesquite 3.0 e o formato neXML; Maddison & Maddison 2014; Vos et al., 2012). Esta matriz será estudada para inferência filogenética via análise de parcimônia com uso do programa PAUP e/ou TNT, considerando diferentes relações de transformação (pesagem fixa e implícita) assim como diferentes métodos de suporte nodal calculados nos mesmos programas (ex. índice de retenção e consistência de topologia e nodal; Goloboff et al., 2008).

Dados comportamentais Reconstruções filogenéticas utilizando dados comportamentais ainda são inexistentes em Cnidaria. Desta forma, o projeto abordará uma estratégia já aplicada para outros grupos de invertebrados (ex. Noll, 2002). Essa abordagem será a avaliação da sequência do comportamento alimentar dos pólipos. Para isso serão acompanhadas em laboratório as espécies listadas na Tabela 3.

Tabela 3. Espécies que serão utilizadas para análise da sequência do comportamento alimentar.

CLASSE SUBCLASSE ESPÉCIE Anthozoa Ceriantharia Ceriantheomorphe brasiliensis, Pachycerianthus fimbriatus, Isarachnanthus nocturnus Hexacorallia Bunudosoma caissarum, Tubastraea coccinea, Protopalythoa variabilis Octocorallia Renilla muelleri, Carijoa riisei, Ellisella elongata Scyphozoa Discomedusae Cephea cephea, Chrysaora lactea Cubozoa -- Carybdea marsupialis Hydrozoa Hydroidolina Obelia dichotoma

Os pólipos serão isolados e mantidos em aquário por 24 horas sem alimentação e com temperatura controlada (22°C). Após esse período, náuplios de Artemia sp. serão colocados no recipiente de cultivo e a reação dos pólipos será filmada para posterior análise. Para observação dos pólipos pequenos será utilizado

Solicitação auxílio FAPESP Sérgio N. Stampar Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 13 um estereomicroscópio com câmera acoplada para a filmagem. Subsequentemente, as imagens serão analisadas para identificação dos comportamentos alimentares e inclusão no sistema EthoLog (Ottoni, 2000) para transformação em matriz de dados. Posteriormente, a matriz analisada em sistema EthoSeq (Japyassú et al., 2006). Ainda, os dados serão analisados via otimização direta seguindo protocolo de Robillard et al., 2006.

Sistemática molecular Obtenção das sequências Serão avaliados marcadores moleculares mitocondriais e ribossomais. Os dados mitocondriais serão obtidos a partir do sequenciamento de setores dos genes COI, CO3, 16S e 12S. Os dados ribossomais serão obtidos a partir do sequenciamento das subunidades longas (LSU) e curtas (SSU). Para ambas as abordagens serão utilizadas as técnicas definidas em Stampar et al., 2014. Nas extrações dos materiais serão utilizados sempre pedaços dos tentáculos, partes internas ou o inteiro (ver mais detalhes em Stampar et al., 2012; Stampar et al., 2014a). As sequências dos outros grupos serão obtidas em parcerias com os demais grupos de pesquisa associados ao projeto. Entretanto, se for necessário as sequências também serão obtidas como nos protocolos acima.

Delimitação de espécies As sequências obtidas serão analisadas pelo método de distâncias de Kimura 2-parâmetros (Kimura, 1980; Tamura et al., 2011) e p-distance (Felsenstein, 1984). Os marcadores obtidos serão analisados separadamente e depois em conjunto para verificar congruências e incongruências. Serão utilizados como base os dados de distância aplicados para a técnica de DNA Barcoding (Citocromo oxidase I) (ex. Ortman et al., 2010). Os marcadores moleculares pouco explorados serão sempre comparados com as taxas de substituição para o Citocromo oxidase I, tratando-os assim como mais ou menos variáveis em sua comparação. Serão aplicadas técnicas que permitam estabelecer estados de caracteres “diagnósticos” (CAOS, Sarkar et al., 2008), assim como técnicas que permitam considerar a delimitação de espécies como uma hipótese a ser avaliada, e corroborada, pela maior quantidade de dados genéticos disponíveis. Esta delimitação será empregada para dois propósitos; A) evitar a inclusão de indivíduos de uma mesma espécie nas análises evolutivas e B) auxiliarem no reconhecimento de novas espécies de áreas ainda pouco exploradas.

Análises filogenéticas de espécies As sequências de setores (marcadores) obtidas serão analisadas de três formas distintas. A primeira análise será direta com alinhamentos via MUSCLE (Edgar, 2004) e MAFFT (Katoh & Standley, 2013) para posterior comparação em pacote Mesquite 3.0. Após a obtenção do alinhamento este será submetido ao sistema jModeltest 2 (Darriba et al., 2012) para verificação do melhor modelo evolutivo a ser empregado nas análises filogenéticas posteriores (analises marcadores individuais). Para delimitar as partições e modelos evolutivos nas análises combinadas será utilizado o sistema PartitionFinder (Lanfear et al., 2014) e em

Solicitação auxílio FAPESP Sérgio N. Stampar Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 14 seguida os alinhamentos serão analisados com programas de reconstrução filogenética: RAxML (Máxima verossimilhança composta) (Stamatakis et al., 2008), GARLI (Máxima verossimilhança particionada com diferentes modelos evolutivos) (Zwickl, 2006), MrBayes 3.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003) implementado em GENEIOUS 7® (Inferência Bayesiana) e MEGA 6 (Tamura et al., 2011) (Máxima Parcimônia). O pacote MESQUITE 3.0 (Maddison & Maddison, 2014) será utilizado para várias adaptações e montagem de matrizes. Para todas as análises acima os índices de suporte paramétricos (ex. aproximate likelihood ratio test) e não paramétricos (ex. bootstrap) serão estimados via Phyml (Guindon et al., 2010) e SOWHAT (Church et al., 2014).

Análises filogeográficas nos Ceriantharia Após a definição das melhores árvores filogenéticas, estas serão utilizadas para as análises filogeográficas e estimativa de tempo de divergência. As estimativas de tempo serão obtidas, inicialmente, por duas metodologias. A primeira será por aplicação da taxa evolutiva estimada pelo Citocromo Oxidase I com base em Medusozoa (segundo Dawson, 2005), Ceriantharia (Stampar et al., 2012) e Anthozoa (Stampar et al., 2014). Esta metodologia será empregada via MEGA 6 com aplicação de relógio molecular estrito (Tamura et al., 2011). Ao mesmo tempo será empregado o teste da hipótese oriunda da datação por relógio molecular relaxado via BEAUti e BEAST 2 (Drummond & Rambaut, 2007). O protocolo de aplicação deste teste pode ser encontrado em Stampar et al., 2012. As delimitações das áreas de ocorrência das espécies serão baseadas nas ecorregiões marinhas de Spalding et al. (2007). Estas delimitações serão “plotadas” em mapas utilizando o software Google Earth. Ao mesmo tempo a melhor árvore oriunda das análises de Inferência Bayesiana (obtidas no software BEAST 2) com as datações estimadas serão submetidos ao software SPREAD (Bielejec et al., 2011) onde a análise filogeográfica será conduzida. As demais árvores serão analisadas por comparação direta topologia/geografia (vide Stampar et al., 2012).

JUSTIFICATIVA A proposta inicial deste projeto é permitir o estabelecimento de um novo grupo de pesquisa na Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho” – Faculdade de Ciências e Letras de Assis, Departamento de Ciências Biológicas. Desta maneira vários subprojetos serão apresentados durante e como desdobramento do presente projeto. Isso permitirá um panorama interessante sobre a taxonomia e a evolução dos grupos de Cnidaria e a discussão do uso de diferentes tipos de caracteres para as análises. O foco principal do projeto é o entendimento das relações dentro de Ceriantharia e com os demais grupos de Cnidaria. Isso é extremamente relevante para discutir os grandes padrões evolutivos em Metazoa, principalmente sobre a origem e tempo de diversificação. Aparentemente a inclusão de Ceriantharia apresentará mudanças significativas nos panoramas estimados. O momento é exato para estudos que tenham como enfoque a resolução de questões de parentesco entre os grandes clados. A grande dúvida de “quem veio primeiro” ainda persiste e que nos últimos dois anos foi suscitada por alguns artigos que apresentam

Solicitação auxílio FAPESP Sérgio N. Stampar Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 15 propostas conflitantes. Desta forma, um estudo abordando mais clados e, principalmente, com análises francas e diversas poderá apresentar resultados mais confiáveis. Ao mesmo tempo, o conhecimento sistemático de qualquer grupo é imperativo para estudos posteriores. Neste sentido a produção de listas, guias e inventários taxonômicos é importante, pois fornece dados para propostas de manejo e conservação, verificação de espécies invasoras ou introduzidas, monitoramento de taxas de extinção, e “simplesmente” para se conhecer a biodiversidade. Entretanto para isso é necessário que se tenha uma base confiável para a delimitação das espécies que serão tratadas nestas publicações de referência. Uma série de outras linhas de pesquisa são dependentes de uma acurada delimitação de espécies, a qual pode por muitas vezes modificar o resultado de uma série de estudos (ex. fisiologia, ecologia). O estudo de espécimes que ocorrem em distintas regiões permite compreender a diversidade de caracteres do o que chamamos de “espécie” de maneira mais integrada. Para auxiliar a identificação de espécies, as informações sobre a biologia (ciclo de vida) e os dados moleculares são importantes recursos que complementam as informações obtidas pelo estudo morfológico. Assim, quaisquer estudos em muito contribuirão com o conhecimento da biodiversidade deste grupo. Com o panorama delimitado acima fica evidente a necessidade da utilização e definição de ferramentas que permitam o balizamento entre espécies. Finalmente, a instalação de um laboratório de estudos evolutivos na UNESP/Assis permitirá uma grande série de colaborações. Na lista de colaboradores e equipe executora fica evidente o potencial deste laboratório. Os objetivos do presente projeto estão claramente integrados à proposta geral do BIOTA/FAPESP. CRONOGRAMA O cronograma proposto para o projeto encontra-se dividido em duas etapas anuais, subdivididas por semestre. Felizmente, como grande parte dos animais já está disponível o trabalho poderá ser iniciado imediatamente. A proposta é que este projeto seja dividido em subprojetos, os quais serão enquadrados no programa de pós-graduação em Biociências da UNESP/Assis e Biodiversidade Aquática da UNESP/Litoral Paulista. O cronograma abaixo está delimitado de forma geral para que sejam incluídas as distintas propostas. Primeiro semestre: Contatos para obtenção dos demais materiais (viagens de coletas e recebimento de materiais); preparação das amostras para extrações, início da obtenção das sequências dos marcadores moleculares, envio dos materiais para sequenciamento e possível adequação da metodologia molecular. Segundo semestre: Gerenciamento do projeto, prosseguimento da obtenção das sequências dos marcadores moleculares, viagens de coletas e recebimento de materiais, análise morfológica e dos ciclos de vida dos indivíduos, apresentação das metodologias de trabalho para possíveis estagiários, elaboração de disciplina de pós-graduação a ser ministrada na FCL-UNESP/Assis relacionada ao projeto e confecção de relatório. Terceiro semestre: gerenciamento do projeto; prosseguimento da obtenção das sequências moleculares; possíveis coletas em diferentes locais; análise morfológica e dos ciclos de vida dos indivíduos; obtenção de sequências moleculares; oferecimento de disciplina de pós-graduação na UNESP/Litoral Paulista e participação em eventos. Quarto semestre: gerenciamento do projeto; trabalho de bioinformática e

Solicitação auxílio FAPESP Sérgio N. Stampar Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 16 discussão dos resultados; e entrega do relatório final. Quinto semestre (a posteriori): Submissão de artigos para publicação e divulgação de resultados para meios de comunicação ao grande público.

ATIVIDADES 2016/1 2016/2 2017/1 2017/2 Gerenciamento do projeto X X X X Coletas / Obtenção de materiais X X X X Análise morfológica X X X X Obtenção de sequências X X X X Análise dos resultados X X X Confecção de relatório X X Participação em eventos X X X Submissão de manuscritos X

DISSEMINAÇÃO E AVALIAÇÃO Entende-se que a disseminação dos resultados obtidos no projeto se dará principalmente com a produção de artigos científicos. No entanto, também será dada atenção para a confecção de contribuições de cunho didático (artigos de divulgação, elaboração de site) que são de fundamental importância para a divulgação dos dados em processo de geração e obtidos. A avaliação deverá ser realizada levando-se em consideração o cumprimento dos objetivos e metas propostos, além das atividades complementares que surjam oriundas do projeto. Também deverá ser levada em consideração a produção bibliográfica relacionada ao projeto, e a qualidade da mesma. Os resultados serão de interesse geral, não apenas de especialistas em Cnidaria e grupos correlatos. Os padrões biogeográficos gerados poderão ser testados para vários organismos marinhos e pode ser despertado o interesse de outras áreas do conhecimento (ex. geografia e geologia).

METAS ACADÊMICAS E COLABORAÇÕES Metas acadêmicas na instituição (UNESP – Campus Assis e Campus do Litoral Paulista) Como metas acadêmicas locais propõe-se a participação do solicitante em disciplinas de pós- graduação relacionadas aos invertebrados e colaboração em eventuais disciplinas/projetos de extensão. Pretende-se também que as coletas de animais, bem como eventuais intercâmbios de espécimes, possam ampliar as coleções de cnidários, dos Museus de Zoologia da USP e da UNICAMP e também a Coleção do Depto de Ciências Biológicas - UNESP (campus Assis). Além disso, o solicitante pretende orientar alunos de graduação e pós-graduação, propondo e desenvolvendo projetos correlatos à sua área de estudo nestes níveis. Por fim, é esperado que o estudo propicie intercâmbio científico internacional em áreas correlatas ao mesmo, como trabalhos em colaboração no exterior e visitas de pesquisadores ao Brasil. O presente projeto abre portas para orientações e intercâmbio de vários alunos focados nos estudos de Cnidaria e assim auxiliará na internacionalização dos programas de pós-graduação da UNESP - Biociências (Campus de Assis) e do Biodiversidade Aquática (Campus de São Vicente). Como produtos deste projeto, espera-se que haja a publicação de trabalhos científicos em revistas arbitradas de ampla circulação e comunicações em congressos nacionais e internacionais especializados na área. Paralelamente, será realizada a elaboração de uma página de divulgação na Internet que incluirá

Solicitação auxílio FAPESP Sérgio N. Stampar Sistemática Filogenética de Ceriantharia (Cnidaria) 17 informações sobre o projeto, com desdobramentos e informações gerais de andamento dos projetos (ex. cifonauta (CEBIMar-USP) e o Open Tree of Life (NSF). Paralelamente, este projeto auxiliará uma série de outros projetos em andamento/futuros no programa de pós-graduação em Biociências da UNESP. Pois, a obtenção destes recursos viabilizará a organização de um laboratório de sistemática molecular. Este laboratório será partilhado com todos os demais docentes que tenham interesse nesta linha de pesquisa.

Grupo executor O presente projeto tem como um dos méritos a ampla associação com diversos grupos de pesquisa no Brasil e também no exterior. As parcerias principais serão com (sublinhados os pesquisadores associados oficialmente à proposta): - Drs. André C. Morandini, Maximiliano M. Maronna, Antonio C. Marques, Alvaro E. Migotto (Universidade de São Paulo) e Allen G. Collins (NMNH – Smithsonian Institution) para as discussões em Medusozoa; Carla Zilberberg (Universidade Federal do Rio de Janeiro), Marcelo V. Kitahara (Universidade Federal de São Paulo), Giorgio Basvestrello (University of Genoa), James D. Reimer (University of the Ryukyus) e Fabian Acuña (Universidad de Mar del Plata) para as discussões em Anthozoaria; José Eduardo Martinelli Filho (Universidade Federal do Pará), Fabrizio Scarabino (Dirección Nacional de Recursos Acuáticos de Uruguay) para as discussões sobre a dinâmica oceanográfica e padrões biogeográficos. Outras parcerias e projetos associados estão listados em anexo.

Recursos humanos Inicialmente serão incluídos na presente proposta alunos de graduação e pós-graduação da UNESP/Assis. Atualmente o Laboratório de Evolução e Biodiversidade Aquática (LEDA) conta com sete alunos de IC e quatro alunas de mestrado e uma de doutorado (Programas de Pós-Graduação em Biociências na UNESP/Assis e em Biodiversidade Aquátrica na UNESP/CLP – São Vicente) desenvolvendo projetos relacionados ao mote do atual projeto. Todos esses alunos estarão envolvidos na presente proposta e, novos alunos, também serão agregados.

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