Universidade Federal De Pernambuco

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

Karla Camila Barbosa Santana

Isolamento de gene de defensina em Euphorbia hyssopifolia L., caracterização in silico, propriedades químicas e função putativa da proteína codificada

Recife 2012

Karla Camila Barbosa Santana

Isolamento de gene de defensina em Euphorbia hyssopifolia L., caracterização in silico, propriedades químicas e função putativa da proteína codificada

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica da Universidade Federal de Pernambuco, para a obtenção do Título de Mestre em Inovação Terapêutica

Orientador(a): Profª. Drª. Suely Lins Galdino Co-orientador(a): Profª. Drª. Ana Maria Benko Iseppon

Recife 2012

Santana, Karla Camila Barbosa Isolamento de gene de defensina em Euphorbia hyssopifolia L., caracterização in silico, propriedades químicas e função putativa da proteína codificada/ Karla Camila Barbosa Santana. – Recife: O Autor, 2012.

137 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Suely Lins Galdino Coorientadora: Ana Maria Benko Iseppon Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas. Inovação Terapêutica, 2012. Inclui bibliografia, apêndice e anexos

1. Genética vegetal 2. Proteínas 3. Euphorbiaceae I. Galdino, Suely Lins II. Iseppon, Ana Maria Benko III. Título.

581.35 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2012-102

, Santana K . C.B.

caracterização caracterização hyssopifolia Euphorbia em de gene defensina Isolamento in

silico , propriedades químicas e função putativa da putativa e função químicas propriedades , proteína codificada proteína

L.,

2,5 cm espaço reservado para etiqueta de localização

Mestrado PPGITUFPE 2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica

REITOR Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

VICE-REITOR Prof. Dr. Sílvio Romero de Barros Marques

PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos

DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Profª Drª Ângela Maria Isidro Farias

VICE- DIRETORA DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Profª Drª Silvia Regina Arruda de Moraes

COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA Profª Drª Suely Lins Galdino

VICE- COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA Profª Drª Ana Cristina de Almeida Fernandes

Ao meu avô, Anísio (in memorian)

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela dádiva da vida e por mais esta graça concedida.

A todos os meus familiares, pelo incentivo, compreensão, paciência e amor. Em especial aos meus Avós, Zuleide e Anísio, pelo carinho e liberdade que proporcionaram uma infância inesquecível (incluindo as plantas e rosas trucidadas para fabricação de “chás” e “perfumes” - a farmacêutica nascendo), à minha mãe Josefa pelo exemplo de emoção, luta, dedicação e persistência e ao meu pai Francisco, pelo exercício da serendipidade e do pensamento questionador tão necessário a um cientista.

Pela alegria, solidariedade, companheirismo e afeto, aos amigos cultivados ao longo da vida: Alan Lucena, Allana Barros, Amanda Martins, Andreza Costa, Áthila Ralph, Camilla Miranda, Cristiane Tenório, Deise Nascimento, Diego Menelau, Diogo Gonçalves, Evanilson Alves, Flávia Grandelle, Ingrid Campos, Jarbas Pina, Jonnatan Nunes, Laércio Brandão, Luciana Arrais, Luciana da Silva, Luciana Monte, Luma Gomes, Márcia Barbosa, Pollyanna Melo, Rafaela Damasceno, Renata Grandelle, Renato Lino, Rodrigo Xavier, Salvana Costa, Suziene Dantas, Synara Mariano, Taysa Mirelle, Yara Gomes e Yasmin Gabriela.

Aos colegas integrantes do Batucarte e do Grave Rapel e Ecoturismo pela regojizante experiência da música e da aventura em meio a natureza, capazes de proporcionar alguns dos sentimentos mais instintivos e íntimos.

Aos professores como: Rui Gilberto, que me ensinou a amar as ciências da vida (da 6ª série do Ensino Fundamental ao 3º Ano do Ensino Médio), e que é até hoje um grande amigo; aos farmacêuticos Fabiano Elias, Fábio Kummrow, Marcelo Zaldini, Rodolfo Farias e Suely Galdino cujo afinco e entusiasmo na geração e transmissão do conhecimento levaram a me apaixonar ainda mais pela minha profissão e todas as oportunidades que ela proporciona; além dos demais responsáveis pela minha formação como pesquisadora, Ana Christina Brasileiro Vidal, Karina Pirelli Randau e Tercílio Calsa Jr., pelo exemplo e constante apoio.

Pelo trabalho, brincadeiras e amizade cultivada, aos alunos do Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal - LGBV: Agatha Maria, Alberto Onofre, Amaro Castro, Ana Félix, Brunno Leite, Diego Sotero, Ebenézer Bernardes, Emanuelly Vasconcelos, Giovani Feitosa, Hayana Arruda, Kyria Bortoletti, Marx Lima, Neto Costa, Pedro Lima, Pollyana Karla, Rodrigo César, Rômulo Santos, Silvany Araújo, e a super técnica Vanessa Souza (LGBV). Em especial a João Pacífico, Lidiane Amorim,

Rafaela Oliveira e Santelmo Vasconcelos, sempre solícitos e dispostos a ajudar e compartilhar conhecimento. Também aos membros do grupo Defensinas: Cecília Bernardo, Luís Belarmino, Rodrigo Gazzaneo, Sheyla Silva, Stephani Soares, e em especial a Valesca Pandolfi, pelo entusiasmo, imenso apoio, e por me acalmar em tantos momentos.

À Profª Ana Maria Benko Iseppon, exemplo de profissional, grande ser humano, por enxergar potencial em mim por sua orientação desde o 1º período da universidade, pela oportunidade de crescimento, estímulo, confiança, respeito e amizade. À Profª Suely Lins Galdino, meu profundo reconhecimento pela fé depositada em meu trabalho, pela alegria e ajuda essencial para o término do trabalho. Ao Prof. Sergio Crovella ter nos apresentado às defensinas e por sua presteza nas discussões acerca de dificuldades encontradas durante andamento do projeto.

Ao Prof Dr. Marccus Alves, do Laboratório de Morfo-Taxonomia Vegetal pelo auxílio na identificação do espécime vegetal.

Aos membros da banca de qualificação e da banca examinadora final, pelas contribuições e críticas tão importantes para o aperfeiçoamento do trabalho, dentre eles, ao Prof Paulo Andrade, em especial.

Ao programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica, na figura das professoras Suely Lins Galdino e Ana Cristina Lima Leite, com auxílio sempre gentil de Paulo Germano, os quais viabilizaram a realização deste mestrado, sempre dispostos a solucionar e organizar o necessário para o bom andamento das atividades.

Ainda agradeço à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE) pela concessão de bolsa, sem a qual não poderia realizar este trabalho e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO) pelo financiamento do projeto de pesquisa.

A todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuíram para minha formação e para a realização deste trabalho que aqui não foram citados.

Grata,

Karla Santana.

"O resto das suas vidas é muito tempo, e quer saibam ou não, está sendo traçado agora. Podem escolher culpar o destino, a má sorte, a escolhas erradas. Ou podem lutar. As coisas nem sempre serão justas na vida real. É assim que as coisas são. Mas, na maioria das vezes, você recebe o que dá. Deixe-me perguntar uma coisa: O que é pior? Não conseguir tudo que você sonhou... Ou conseguir, e descobrir que não é o bastante? O resto das suas vidas está sendo definido agora mesmo. Com os sonhos que perseguem, as escolhas que fazem e com as pessoas que decidem ser. O resto da vida é muito tempo...E o resto da sua vida, começa agora." One Tree Hill, Ep 5x12

“Bom mesmo é ir a luta com determinação, abraçar a vida com paixão, perder com classe e vencer com ousadia, pois o triunfo pertence a quem se atreve. A vida é muito para ser insignificante.” Charles Chaplin

“Vá com poesia no olhar!” Martha Medeiros

RESUMO SANTANA, K.C.B. Isolamento de gene em Euphorbia hyssopifolia L., caracterização in silico, propriedades químicas e função putativa da proteína codificada. 2012. 137f. Dissertação (Mestrado). Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil.

Plantas possuem complexos e eficientes mecanismos de defesa contra diversos agentes patogênicos, dentre eles a ativação transcricional de numerosos genes, como os responsáveis pela produção de peptídeos antimicrobianos, incluindo as defensinas. Tratam- se de proteínas pequenas (ca. 5 kDa), básicas e ricas em cisteína, que fazem parte do sistema de defesa desses organismos. Euphorbia hyssopifolia L. é uma erva daninha amplamente empregada na medicina popular brasileira, indiana e asiática, destacando- se pela sua atividade antimicrobiana, a qual, juntamente com seu potencial invasor e sua natural resistência a patógenos, a tornam uma boa candidata para a pesquisa dessas proteínas. O potencial para uso de defensinas vegetais como novas substâncias terapêuticas reside na similaridade estrutural com defensinas de mamíferos; seu amplo espectro antimicrobiano; sua atividade rápida e em baixas doses; no sinergismo com outras defensinas e esquemas terapêuticos. Além disso, podem inativar endotoxinas; e o desenvolvimento de resistência é improvável. Defensinas exibem baixa toxicidade em células de mamíferos e podem modular resposta imune inata em mamíferos. O presente projeto objetivou isolar um gene codificante de defensinas em E. hyssopifolia via genética molecular, analisar sua sequência de nucleotídeos e a de aminoácidos traduzidos, verificando a similaridade com as defensinas de outros organismos, além de modelar tridimensionalmente e predizer as propriedades químicas e caracterizar estruturalmente a proteína putativa obtida. Os fragmentos amplificados por PCR a partir do DNA genômico foliar de E. hyssopifolia foram purificados e clonados em vetor plasmidial inserido em células de Escherichia coli, para sequenciamento. Para a análise in silico da sequência, foram empregados os programas fGenesh; BLAST; Dissulfind; Philius; APD2 Predictor e ProtParam. A modelagem de homologia 3D foi gerada e editada usando o programa Modeller e a estrutura da defensina foi visualizada no Jmol Viewer. A sequência do gene obtida foi de 361 pb dispostos em um íntron e dois éxons. Um pró-peptídeo com 78 aminoácidos foi gerado a partir da sequência codificante, que apresentou 237 pb. O peptídeo maduro compreendeu 47 aminoácidos e obedeceu ao motivo alfa-beta estabilizado por cisteínas (CSαβ) descrito para defensinas. As sequências de nucleotídeos e aminoácidos de E. hyssopifolia exibiram alta homologia com sequências de defensinas vegetais disponíveis em bancos de dados. As sequências codificantes (CDS) mostraram indícios de seleção negativa. Ainda, os preditores de propriedades químicas exibiram condizentes com defensinas. A estrutura tridimensional também foi caracterizada quanto à presença de pontes dissulfeto, hidrofobicidade, potencial eletrostático e acessibilidade ao solvente. Assim, o projeto contribuiu para conhecimento de uma nova defensina vegetal com potencial para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos.

Palavras-chave: Genética vegetal. Peptídeos antimicrobianos. Proteínas medicinais.

ABSTRACT SANTANA, K.C.B. Isolation of defensin from Euphorbia hyssopifolia L.: in silico characterization, putatives chemical properties and functions of the encoded protein. 2012. 137p. Dissertation (Master Thesis). Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil.

Plants have complex and efficient defense mechanisms against many pathogens, among them, the transcriptional activation of numerous genes, including defensins. Defensins are small proteins (ca. 5 kDa), being basic and cysteine rich, and participating in the plant defense system. Euphorbia hyssopifolia L. is a weed widely used in Brazilian, Indian and Asian popular medicine, standing out by its antimicrobial activity, a quality that, together with its invasive potential and pathogen resistance, turn them to be good candidates to the search of new antimicrobial peptides. The potential to use plant defensins as new therapeutic substances comes from its structural similarity with mammalian defensins; broad antimicrobial spectrum; fast activity in low doses; synergism with other defensins and therapeutic schemes. They can also inactivate endotoxins and the resistance development is improvable. Defensins show low toxicity in mammalian cells and can modulate the innate immune response in mammalians. The present work aimed to isolate a defensin coding gene from E. hyssopifolia thought molecular biology, as well as to analyze its nucleotides, to predict its amino acids sequences, verifying the similarity with defensins from other organisms, besides three-dimensional modeling, prediction of its chemical properties and structural characterization of the putative protein retrieved. The amplified fragments were obtained by PCR from E. hyssopifolia foliar genomic DNA, were purified and cloned in a plasmid vector inserted in Escherichia coli cells, for posterior sequencing. For the in silico analysis of the sequence, the following programs were used: fGenesh; BLAST; Dissulfind; Philius; APD2 Predictor and ProtParam. The 3D homology modeling was generated and edited using the Modeller program and the defensin structure was visualized in Jmol Viewer. The sequence retrieved presented 361 bp disposed in one intron and two exons. A propeptide with 78 amino acids was generated from the coding sequence, which presented 237 bp. The mature peptide had 47 amino acids, and obeyed the alpha-beta cysteine stabilized (CSαβ) motif previously described for defensins. The nucleotide and amino acid sequences from E. hyssopifolia presented high homology with defensin sequences available at databases. The coding sequences (CDS) showed evidences of negative selection. Besides, the chemical properties predictors showed results as expected. The 3D analysis revealed the characteristic disulfide bonds, hydrophobicity, electrostatic potential and solvent accessibility. Therefore, this work contributed to the knowledge of a novel defensin that might helps the development of new pharmaceutical products.

Keywords: Antimicrobial peptides. Medicinal proteins. Plant genetics.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página Figura 1. Principais euforbiáceas de importância econômica. Em: A, Hevea brasiliensis; B, Jatropha curcas; C, Manihot esculenta; D, Ricinus communis. No canto direito, os produtos extraídos: látex, semente, tubérculo, sementes, respectivamente. Fontes: ALIIMG (2011), ATR-Árvores (2011), HEAR (2011), Panoramio (2011), Pinhao Manso (2011), TC (2011). 26

Figura 2. Principais eufórbias de importância econômica: A, Euphorbia heterophylla; B, E. milii; C, E. pulcherrima; e D, E. tirucalli. Fontes: Corradini (2011); Garg (2011); Kress (2011); TPS (2011). 30

Figura 3. Exemplar de E. hyssopifolia. No detalhe, destaque para a inflorescência do tipo ciátio. Fotos da autora. 33

Figura 4. Esquema das duas vertentes do sistema imune animal: imunidade humoral (à esquerda), mediada anticorpos proteícos solúveis, produzidos por linfócitos B, e imunidade celular (direita), mediada por linfócitos T. Anticorpos participar na imunidade tanto por ação direta neutralizando os microoganismos extracelulares ou ativando complemento e certas células efetoras (neutrófilos polimorfonucleares [PMNs] e macrófagos) matando os microorganismos. As células T podem diretamente lisar alvos (células T citotóxicas) ou orquestrar a resposta imune de outras células (células T auxiliares) para eliminar os agentes invasores através da produção de mediadores proteicos solúveis chamados citocinas. Adaptado de Kumar et al. (2007). 35

Figura 5. Estratégia de defesa das plantas. Fase 1: Quando uma molécula derivada de um agente patogênico (fungo, bactéria, etc), que rompeu a parede celular e invadiu a célula é reconhecido por um receptor MAMPs (Microbe-associated molecular patterns) sobre a superfície da membrana celular, substâncias antimicrobianas são secretadas e atacam o agente patogênico. Fase 2: Às vezes patógenos escapam do sistema imune de fase de 1 e injetam moléculas imunossupressoras dentro da célula ou invadem a célula. Em tais casos, as proteínas de resistência, tais como proteínas NLR (NOD-like receptor) reconhecem as moléculas de imunossupressores, e a morte celular é induzida. As células infectadas pelo patógeno morrem, impedindo a infecção de outras células. Informações acerca a invasão do patógeno é transmitida para outras células, que assumem uma posição defensiva. Adaptado de Shirasu (2009). 36

distais. O ácido salicílico (SA) é uma molécula sinalizadora essencial para o início da SAR, e é requerido para a ativação de um grande conjunto de genes que codificam proteínas relacionadas à patogênese (PRs, pathogenesis- related proteins) com propriedades antimicrobianas. A resistência sistêmica induzida (ISR, induced systemic resistance) é normalmente ativada após a colonização das raízes das plantas por microorganismos benéficos. Como no

SAR, um sinal de longa distância viaja através do sistema vascular para ativar a imunidade sistémica nas partes aéreas. ISR é comumente regulada por vias de sinalização ácido jasmônico (JA) - e etileno (ET)-dependentes e tipicamente não está associada com a ativação direta de genes PR. Em vez disso, plantas expressando ISR estão preparadas para uma expressão acelerada de genes JA- e ET-dependentes, o que torna-se evidente apenas após o ataque de patógenos. Ambos SAR e ISR são eficazes contra um largo espectro de agentes patogênos vegetais virulentos. Adaptado de Pieterse et al. (2009). 37

Figura 7. Genes de defensinas e peptídeos. À esquerda, alinhamento de genes de α-, β- e θ-defensina. Sombreado, peptídeos sinal e pro-segmentos; em azul, resíduos presentes na defensina madura. À direita, três diferentes esquemas de pontes dissulfeto. As estruturas tridimensionais são αde - defensina RK-1 de rato (topo), β-defensina 1 (meio) e θ-defensina RTD-1 (final) de humanos. Adaptado de (Selsted & Ouellette, 2005). 42

Figura 8. Mobilização, indução e interações de defensinas. Funções imunes de defensinas podem induzir vários estímulos fisiológicos à mobilização de α - defensinas pré-formadas ou pelo aumento da expressão deβ -defensinas em vários tecidos. Os peptídeos liberados interagem com diversas células alvo e tecidos para promover respostas secundárias que podem ser críticas para a regulação da inflamação aguda, o recrutamento de células imunes adaptativas, angiogênese e cicatrização. NK, natural killer; LTA, ácido lipoteicóico; MDP, muramildipeptídeo; IL-1β, interleucina-1β; TNF, fator de necrose tumoral; IFN-γ, interferon- γ; dsRNA, RNA dupla-fita; PAR, receptor protease-ativável; Mast, mastócito; DC, célula dendrítica; Mono, monócito, T, linfócito T. Adaptado de (Selsted & Ouellette, 2005) 43

Figura 9. Classes de defensinas vegetais. (A) todas as defensinas vegetais são produzidas por uma sequência sinal e um domínio maduro de defensina; (B) em algumas solanáceas, existe um pró-domínio C-terminal adicional. Adaptado de Lay & Anderson (2005). 46

Figura 10. Sequência e estrutura secundária de defensina vegetal de ervilha obtida por Almeida et al. (2002). Números em amarelo indicam pontes dissulfeto. Fonte: PDBsum CATH - 1JKZ 40

Figura 11. Alvos membranares de peptídeos antimicrobianos de organismos multicelulares e as bases da especificidade. Adaptado de Zasloff (2002). 59

Figura 12. Modelos de interação de peptídeos antimicrobianos em membranas biológicas. (A) No modelo “barrel-stave”, os peptídeos ligados a membrana se agregam na bicamada lipídica de forma que as regiões hidrofóbicas dos peptídeos se alinham com a região do núcleo lipídico e as regiões hidrofílicas dos peptídeos formam o interior do poro. (B) No modelo de tapete, os peptídeos interrompem a membrana pela orientação paralela na superfície da bicamada lipídica formando uma camada extensiva ou tapete. (C) No modelo toroidal, os peptídeos ligados à membrana se agregam e induzem as monocamadas lipídicas a se dobrarem continuamente através dos poros, de forma que o núcleo hidrofílico seja alinhado com os peptídeos inseridos e os grupamentos polares das cabeças lipídicas. Regiões hidrofílicas do peptídeo são mostradas na cor vermelha, enquanto regiões hidrofóbicas de peptídeo são mostradas na cor azul. Modificada de Brodgen (2005). 60

Figura 13. Sequência nucleotídica com os genes/éxons preditos e sequências de aminoácidos da proteína putativa Dehys, produzida a partir de dados gerados no fGenesh e Philius. 79

(gi|312982411), G. max (gi|255627362), M. esculenta (pz|cassava4.1_020555m.g), J. curcas (gi|223469636) e R. communis

(pz|29908.t000184). Bancos de dados: gi, gene índex; pz, phytozome. Números na base dos ramos referem-se a valores de bootstrap após 1.000 replicações. 80

Figura 16. Dispersões das substituições sinônimas e não-sinônimas das sequências codificantes do peptídeo imaturo (A), do peptídeo sinal (B) e do domínio defensina madura (C). Distâncias obtidas no programa MEGA 5.05 pelo método Kumar (Nei & Kumar, 2000), com bootstrap de 1.000 replicações. Gráficos desenhados no Excel 2011. Reta representa dN=dS. 83

Figura 17. Análise das sequências de peptídeo maduro de defensina mais similares a Dehys. (A) Dendrograma das sequências pelo método Neighbor- Joining com bootstrap de 1.000 replicações no programa MEGA 5.05. (B) Alinhamento via ClustalX2 (Larkin et al., 2007).Resíduos hidrofóbicos estão

em azul, os catiônicos em verde e os aniônicos em vermelho. Números abaixo do alinhamento indicam as pontes dissulfeto formadas. Acima, estrutura secundária predita pelo ESPript 2.2 (Gouet et al., 1999). Abaixo, pontes dissulfeto indicadas pelo DISULFIND (Ceroni et al., 2006). (C) Características gerais e funções putativas/ padrões de expressão das sequências analisadas. Legendas: Fab, Fabaceae; Sol, Solanaceae; Nel, Nelumbonaceae ; Eup,

Euphorbiaceae; Fag, Fagaceae; Vit, Vitaceae; Ros, Rosaceae; Ast, Asteraceae; Bra, Brassicaceae; Poa, Poaceae. DF, defensina; PI, Inibidor de protease; GT, Gamma-thionina; LMWCR, Low-molecular-weight cysteine-rich; FSGT, Flower-specific gamma-thionin; HYPP, hypotethical protein. D, DNA genômico, R, RNAm/ cDNA. NF, Não fornecido; Sem, sementes; Fol, folhas; Fru, frutos, T, tubérculo; Flo, flores; Cas, casca do caule. 86

Figura 18. Carga total estimada para Dehys sob variação no pH. Valores obtidos via Protein Calculator v3.3. 92

Figura 19. Estrutura tridimensional da defensina Dehys, mostrando a arquitetura as folhas beta pregueadas, a alfa-hélice e a disposição espacial dos resíduos de aminoácidos. Em (A) coloridas de acordo com cada característica ácido-base da molécula, sendo resíduos positivos (ácidos) em vermelho, negativos (básicos) em azul e neutros em roxo. Em (B), de acordo com a polaridade, resíduos em ciano são polares, e em lilás, apolares. Em verde, cisteínas e pontes dissulfeto são representadas. Estrutura obtida via VMD 1.9 e Modeller 9v7, com edição no Jmol Viewer 12.0. 95

Figura 20. Avaliação da qualidade da estrutura tridimensional obtida para Dehys. (A) Em vermelho, o Z-score, desejável para moléculas elucidadas via RMN. (B), Dispersões dos resíduos de aminoácidos no gráfico de Ramachandran. (C) posicionamento no gráfico por resíduo. (D) Acessibilidade por resíduo. (A) obtido via QMEAN6 global score; (B), (C) e (D), via PROCHECK v.3.5.4. 96

Figura 21. Superfície molecular da estrutura tridimensional da defensina putativa Dehys. Em (A) colorida de acordo com a acessibilidade da molécula (espectro de cores: quentes, regiões mais acessiveis, frias, menos); Em (B) molécula colorida de acordo com seu potencial eletrostático (azul e vermelho, positivo e negativo potencial eletrostático, respectivamente). Molécula obtida via Modeller 9v7 e caracterizada no DeepView v4.04. Potencial eletrostático obtido pelo método de Poisson-Boltzmannn. 97

LISTA DE TABELAS

Página Tabela 1. Exemplos de patentes de extratos de espécies medicinais do 32 gênero Euphorbia. Reproduzido de Mwine et al. (2010).

Tabela 2. Pequenos peptídeos antimicrobianos, ricos em cisteína do reino vegetal, incluindo sua classificação e aspectos estruturais. Reproduzido de Benko-Iseppon et al. (2010). 40

Tabela 3. Defensinas vegetais com atividade inibitória contra fungos patogênicos. Dados gerados a partir das proteínas disponíveis no PhytAMP 69 Database (Hammami, et al., 2009).

Tabela 4. Defensinas vegetais com atividade inibitória contra bactérias patogênicos. Dados gerados a partir das proteínas disponíveis no PhytAMP 70 Database (Hammami, et al., 2009).

Tabela 5. Predição das propriedades químicas do pró-peptídeo e do peptídeo maduro codificado a partir do gene codificante de Dehys. Itens marcados com “*” foram preditos pelo programa APD2 predictor, os demais, pelo ProtParam. 91

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS aa Aminoácidos ABA Ácido abiscísico AMPs Antimicrobial peptides BVDV Bovine viral diarrhoea vírus CDS Coding sequence CSαβ Cysteine-stabilized α-helix β-sheet CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid dsRNA Double-stranded RNA EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid EST Expressed sequence tag ET Etileno gi Gene index h Hora(s) HIV-1 Human immunodeficiency virus - type 1 HSV-1 Herpes simplex virus - type 1 HSV-2 Herpes simplex virus - type 2

IC50 Inhibitory concentration 50% IFN-γ Interferon-γ IL-1β Interleucina ISR Induced systemic resistance

LC50 Lethal concentration 50% LTA Lipoteichoic acid MAMPs Microbe-associated molecular patterns MDP Muramil-dipeptídeo MIC Minimum inhibitory concentration min Minuto(s) MJ Metil jasmonato NK natural killer NLR NOD-like receptor PAR Protease-activated receptor pb Pares de base PI Ponto isoelétrico

PIV-3 Parainfluenza virus type 3 PMNs Polymorphonuclear neutrophils PRs Pathogenesis-related proteins QSAR Quantitative structure-activity relationship RMN Ressonância magnética nuclear RNA Ribonucleic acid s Segundo(s) SA Salicilato SAR Systemic acquired resistance TA Temperatura ambiente TE Tris- EDTA TNF Tumor necrosis factor

LISTA DE SÍMBOLOS

% Percentual, Por Cento °C Graus Celsius µg Microgramas µM Micro-Molar Da Dalton g Grama kDa Quilodalton M Molar mg Miligrama mL Mililitro mM Milimolar Rpm Rotações por Minuto ηg Nanograma μL Microlitro

Sumário

Página

1 INTRODUÇÃO 22

2 OBJETIVOS 23 2.1. Geral 23 2.2. Específicos 23

3 REVISÃO DE LITERATURA 24 3.1. A família Euphorbiaceae 24 3.1.1 O Gênero Euphorbia 28 3.1.1.1 Euphorbia hyssopifolia 32 3.2. Peptídeos Antimicrobianos Vegetais 35 3.3. Defensinas Vegetais 41 3.3.1. Origem, Características Gerais e Distribuição 41 3.3.2. Organização Gênica 45 3.3.3. Padrões de Expressão 46 3.3.4. Estrutura das Defensinas Vegetais 49 3.3.5. Relações entre Estrutura e Atividade Biológica 51 3.3.6. Atividade Biológica e Modo de Ação das Defensinas Vegetais 53 3.3.6.1 Atividade Antifúngica 54 3.3.6.2 Atividade Antibacteriana 57 3.3.6.3 Outros papéis Biológicos para Defensinas Vegetais in planta 61 3.4. Potencial para Aplicações Biotecnológicas 64 3.4.1. Superexpressão e Transgenia 65 3.4.2. Possíveis Aplicações Terapêuticas 67 3.4.3. Mecanismos de Resistência 73

4 METODOLOGIA 75 4.1. Obtenção do Material Vegetal e Extração de DNA 75 4.2. Obtenção dos Fragmentos, Clonagem e Sequenciamento 76 4.3. Análise Bioinformática das Sequências 76

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 78

5.1. Análises das Sequências de Nucleotídeos 78 5.2. Análise da Estrutura do Gene e da Sequência do Peptídeo Sinal 81 5.3. Análise das Sequências de Aminoácidos - Similaridade e Função 84 5.4. Análise das Sequências de Aminoácidos - Organização Estrutural 87

5.5. Predição de Propriedades Químicas da Proteína e Importância do Peptídeo Sinal 90 5.6. Predição da Estrutura Terciária de Dehys e Propriedades Químicas Relacionadas 93

6 CONCLUSÕES 98

7 PERSPECTIVAS 99

8 REFERÊNCIAS 100

9 APÊNDICE 128

Tabela A. Aminoácidos, abreviaturas e trincas correspondentes 128 Tabela B. Lista e abreviaturas das espécies mencionadas no texto 128

ANEXOS 131

Anexo I - Regras de submissão à revista Peptides 131

1 INTRODUÇÃO

Plantas superiores possuem complexos e eficientes mecanismos de defesa contra diversos patógenos que levam à ativação transcricional de uma cascata de genes de diferentes vias metabólicas, incluindo aquelas responsáveis pela produção de defensinas (Chen et al., 2008). Tratam-se de proteínas pequenas (ca. 5 kDa), básicas e ricas em cisteína, que fazem parte do arsenal de defesa desses organismos. Algumas defensinas são expressas constitutivamente, enquanto outras são reguladas pelo desenvolvimento ou induzidas por diferentes fatores – incluindo agentes abióticos como frio, seca, metais pesados, carência de potássio, entre outros – bem como a presença patógenos microbianos (Sels et al., 2008).

A diversidade e ocorrência disseminada de defensinas no reino vegetal indicam que as mesmas são uma rica fonte de proteínas com atividades biológicas que apresentam potencial para aplicações agrobiotecnológicas e farmacológicas. Segundo Carvalho & Gomes (2009), dentre essas características estão atividades antimicrobianas, inseticidas e antiparasitárias, que fazem desses peptídeos bons candidatos para engenharia proteômica e produção de plantas transgênicas que possam combater patógenos e pestes, uma vez que as proteínas que codificam não são tóxicas a mamíferos ou plantas. Além disso, tais proteínas são ativas contra vários patógenos e podem trabalhar sinergicamente com outros compostos antimicrobianos, oferecendo maior resistência à infecção.

Exemplares de Euphorbia hyssopifolia L. são encontrados em praticamente todo o território brasileiro (Sátiro & Roque, 2008), sendo considerada uma erva daninha, com reconhecido potencial medicinal (Amaral et al., 1999; Matsuse, et al.,1999; Yang et al., 2005) e certa toxicidade (Adedapo et al., 2004). A citada planta é empregada na medicina popular indiana (Kane et al., 2009), asiática (Yang et al., 2005) e latino-americana (Matsuse, et al.,1999), destacando-se pela sua atividade antimicrobiana. No Brasil, é usada como diurético, para o tratamento de infecções genito-urinárias, bem como para remover verrugas (Corrêa, 1984; Amaral et al., 1999).

A exemplo do observado por Jha et al. (2009), até o momento os trabalhos de isolamento e caracterização de defensinas desenvolvidos se referem na maioria das vezes a espécies cultivadas. E. hyssopifolia vem a ser uma das primeiras espécies selvagens a ser submetida a esse tipo de estudo. Além do potencial terapêutico altamente documentado, a mesma ainda se mostra resistente a um amplo espectro de intempéries ambientais e de estresses bióticos, revelando potencial para isolamento de genes interessantes para emprego no desenvolvimento de novas variedades de

plantas transgênicas, possibilitando ainda a concepção de novas alternativas terapêuticas para diversas doenças humanas. No entanto, a toxicidade de seus compostos, demonstra a necessidade de uso cauteloso (Adedapo et al., 2004), sendo a produção de purificados de defensinas com ação antimicrobiana uma forma segura de aplicação de suas propriedades terapêuticas.

Dessa forma, o presente trabalho objetivou isolar um gene codificante de β- defensina em E. hyssopifolia via genética molecular, analisando sua sequência de nucleotídeos, bem como a de aminoácidos da provável proteína correspondente, verificando a similaridade com as defensinas de outros organismos, além de modelar a proteína tridimensionalmente, de modo a caracterizá-la estruturalmente e predizer suas propriedades químicas.

2 OBJETIVOS

2.1. Geral

• Isolar e caracterizar um gene de β-defensina em Euphorbia hyssopifolia e sua proteína codificada para análise comparativa das sequências de nucleotídeos, aminoácidos e estruturas trisimensionais com as disponíveis em bancos de dados.

2.2. Específicos

• Amplificar e sequenciar genes de β-defensinas em E. hyssopifolia, comparando às sequências de nucleotídeos e às estruturas disponíveis em bancos de dados;

• Analisar a estrutura e evolução do gene isolado de β-defensina e de sua proteína codificada, comparando com dados de outras defensinas vegetais;

• Modelar, estudar e caracterizar a estrutura tridimensional da provável defensina obtida, procurando diferenças e similaridades com moléculas obtidas de outras espécies;

• Inferir, a partir de preditores, propriedades químicas e posições de aminoácidos importantes para a função putativa da proteína.

3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1 A Família Euphorbiaceae

Euphorbiaceae Juss. é uma das mais vastas famílias dentre as dicotiledôneas (Hans, 1973). Está entre as famílias de maior importância econômica dentre as Angiospermas, com distribuição pantropical, principalmente nas regiões tropicais e subtropicais de todo o planeta, com destaque para continentes americano e africano (Radcliffe-Smith, 1987; Webster, 1987, 1994a; Heywood, 1993).

A ampla diversidade de habitats, a diversidade morfológica e genética colocam as Euphorbiaceae entre os grupos taxonômicos mais complexos das eudicotiledôneas (Soltis et al., 2005; Simpson, 2006). Assim, em Euphorbiaceae, sempre houve constante pressão e propostas para redefinição dos limites da família, exclusão de gêneros aparentemente mal classificados e inclusão de outros, como também uma reorganização interna de subfamílias, tribos e subtribos (Mwine & Van Damme, 2011). Euphorbiaceae lato sensu, de acordo com Wurdack et al. (2005) e Kathriarachchi et al. (2006) está organizada nas famílias Euphorbiaceae, Phyllanthaceae, Picrodendraceae e Peraceae. Apresenta cinco subfamílias (Phyllanthoideae, Oldfieldioideae, Acalyphoideae, Crotonoideae e Euphorbioideae), 49 tribos, entre 317 e 339 gêneros (Webster, 1994a; Radcliffe-Smith, 2001) e cerca de 8.100 espécies (Webster, 1994b, Mabberly, 1998). Recentemente, Stevens (2010) descreveu Euphorbiaceae stricto sensu constituída por 218 gêneros e 5.735 espécies, as quais foram subdivididas em quatro clados: Chelosiodeae K. Wurdack e P. Hoffmann, Acalyphoideae Beilscmeid ss., Crotonoideae Beilschmeid ss., e Euphorbiodeae Beilscmeid ss. Os principais gêneros da família em número de espécies são: Euphorbia L. (1.500), Croton L. (700), Phyllanthus L. (400), Acalypha L. (400), Macaranga Thouars (400), Antidesma Burman (150), Drypetes Vahl (150), Jatropha L. (150), Manihot Miller (150) e Tragia Plumier (150) (Webster, 1994a). Sua controversa circunscrição e posição sistemática (Webster, 1975; 1994a; Wurdack et al., 2005; Tokuoka & Tobe, 2006; Tokuoka, 2007; Chase & Reveal, 2009) ilustra bem o dilema da classificação e a necessidade de critérios taxonômicos e filogenéticos adicionais para melhorar o entendimento da sistemática dessa família (Jensen et al., 1994).

A família Euphorbiaceae é pouco estudada considerando sua complexidade e número de representantes. Os principais trabalhos envolvendo toda a taxonomia da família foram elaborados por Jussieu (1824 apud Webster, 1994a, b), Bentham & Hooker (1880), Pax (1890 apud Webster, 1994a, b), Hutchinson (1969) e mais recentemente por Webster (1975, 1994a, b). No Brasil, o estudo mais completo foi o

realizado por Müller (1874), intitulado “Flora Brasiliensis”. Atualmente, os levantamentos florísticos para o Brasil revelam que a sua distribuição é ampla, sendo uma das mais ricas em número de espécies, estimando-se a ocorrência de 1.100 espécies e 72 gêneros, difundidas em todos os tipos de vegetação do país e apresentando diversos hábitos (Carneiro et al. 2002; Souza & Lorenzi, 2005; Sátiro & Roque, 2008). Dessas, cerca de 500 espécies são encontradas na Região Nordeste (Barbosa et al.,1996), a qual pode ser considerada um centro de diversidade da família, com 211 espécies e 45 gêneros listados por Cordeiro & Carneiro-Torres (2006), além de apresentar grande número de espécies endêmicas da caatinga (Sátiro & Roque, 2008).

Apesar do elevado número de espécies, os representantes dessa família podem ser reconhecidos por um conjunto de caracteres como porte arbóreo, arbustivo, subarbustivo ou herbáceo com folhas alternas, simples ou compostas, estipuladas, flores unissexuadas, em geral monoperiantadas, em plantas monóicas ou dióicas, com ou sem vestígio do sexo atrofiado e dispostas em inflorescências racemosas ou cimosas, com flores masculinas apresentando número de estames variável e flores femininas tipicamente tricarpelares, triloculares. Apresentam frutos secos deiscentes ou indeiscentes, comumente do tipo cápsula esquizocárpica (tricoca), ou ainda cápsulas septífragas, loculicidas e circundante, drupóides (filotrimídios, drupas e nuculânios) e bacóides (Barroso et al., 1999). Caracteriza-se também pela presença de látex branco e leitoso, flores com sépalas imbricadas ou vestigiais, brácteas em geral biglandulares e grãos de pólen com sexina perforado-reticulada (Webster, 1994a; Wurdack et al., 2005).

Euphorbiaceae tem se destacado como uma família de importância econômica, especialmente na alimentação humana, produção de látex e óleos, além da medicina popular. Certas espécies são utilizadas na alimentação humana, principalmente na Região Nordeste do Brasil, como Manihot esculenta Crantz (Figura 1C), da qual se extrai a farinha de mandioca (Allem & Irgang, 1975; Aloys & Ming, 2006), consumida em larga escala em todo o país e uma importante fonte de amido (Sanchez et al, 2009) para boa parte da população do nordeste brasileiro. As túberas de uma variedade dessa espécie conhecida como “macaxeira”, são amplamente consumidas e delas pode ser produzida uma bebida alcoólica tradicional da Amazônia, a “tiquira” (Braga, 1976).

Outros representantes da família já movimentaram grandes riquezas no Brasil, especialmente pela extração de látex para a produção de borracha natural, como as espécies do gênero Hevea Aublet (seringueira) (Figura 1A), nativa da floresta

amazônica, onde gerou o ciclo da borracha, até ser cultivada com maior produtividade e custos menores no Sri Lanka e nas florestas do arquipélago malaio (Batista, 1976). Os frutos da mamoneira (Ricinus communis L.) (Figura 1D), nativa da África, destacam-se economicamente pela produção de óleos, em especial o óleo de rícino, fibras vegetais e compostos químicos usados na medicina e na indústria (Braga, 1976). Também os óleos extraídos de espécies como E. tirucalli L.(Van Damme, 2001), Jatropha curcas L. (Figura 1B) (Achten et al, 2008); M. esculenta (Adeniyi et al, 2007); R. communis (Benavides et al, 2007), entre outros, podem ser empregados na produção de biodiesel.

Figura 1. Principais euforbiáceas de importância econômica. Em: A, Hevea brasiliensis; B, Jatropha curcas; C, Manihot esculenta; D, Ricinus communis. No canto direito, os produtos extraídos: látex, semente, tubérculo, sementes, respectivamente. Fontes: ALIIMG (2011), ATR- Árvores (2011), HEAR (2011), Panoramio (2011), Pinhao Manso (2011), TC (2011).

A família também apresenta outras espécies que movimentam grandes somas de dinheiro no mercado de plantas ornamentais, como a Poinsétia (Euphorbia pulcherrima Willd). Outros usos menores incluem a produção de madeira, uso no artesanato, utilização em programas de reflorestamento, entre outros (Mwine & Van Damme, 2011). Além dos usos mencionados, a família Euphorbiaceae é uma importante fonte de ervas medicinais de importância humana, veterinária e agrícola (Mwine & Van Damme, 2011).

A etnomedicina das Euphorbiaceae é muito diversificada. Em um levantamento realizado por Lai et al. (2004), 33 espécies pertencentes a 17 gêneros de Euphorbiaceae eram utilizadas na medicina herbal chinesa. De acordo com Benko- Iseppon & Crovella (2010), das 433 espécies identificadas na bioprospecção etnobotânica de espécies brasileiras com propriedades antimicrobianas Euphorbiaceae apresentou-se como a segunda família mais frequente em número de espécies (29) provenientes de oito gêneros. Sua empregabilidade se estende no uso popular na forma de chás, como o das raízes de Cnidoscolus Pohl. ou de espécies do gênero Euphorbia L., que têm efeito terapêutico cicatrizante, tônico e diurético, sendo utilizadas como antidiarréicas (Braga, 1976). Assim, as Euphorbiaceae incluem uma grande variedade de metabólitos secundários incluindo alcalóides, fenóis, flavonóides, saponinas, taninos e óleos essenciais com diversas características e usos terapêuticos (Ahmad et al., 2006; Okgibo et al., 2009). Segundo Seigler (1994), essa diversidade deve-se à presença de uma grande variedade de metabólitos secundários incomuns que fazem com que a maioria dos membros demonstrem elevada toxicidade.

Espécies da família Euphorbiaceae também são bem conhecidas por serem geralmente tóxicas, por mostrarem efeitos irritantes para a pele (Schmidt, 1980; Gundidza et al., 1993), bem como por apresentar compostos antitumorais (Betancur- Galvis et al., 2002) e promotores de tumor (Evans et al., 1983; Vogg et al., 1999). A família abriga uma das substâncias mais tóxicas de origem vegetal, a ricina, uma proteína encontrada em R. communis que apresenta propriedades purgativas, sendo letal caso ocorra a ingestão de mais de oito sementes (Palatnick & Tenenbein, 2000). Outras espécies como J. curcas produtora de curcina, uma proteína com propriedades semelhantes à ricina (Mampane et al., 1987). Não obstante, M. esculenta e M. glaziovii Müll. são produtoras de linamarina, que pode causar envenenamento por determinados compostos associados, quando em certas condições, transformam-se quimicamente em cianeto (HCN), determinando morte imediata na ingestão. A exemplo do estudo de Machado (1981) acerca de óleos essenciais em espécies de várias famílias, o gênero Croton L. destacou-se, com 23 espécies. Vários grupos de

metabólitos secundários, como alcalóides, diterpenos, glucosinolatos, taninos e triterpenos foram relatados neste gênero (Seigler, 1994). Segundo Mwine & Van Damme (2011), parece que as diversas propriedades medicinais da família estão associadas à sua ampla distribuição, apoiada por adaptações a sua sobrevivência, uma vez que a exposição a uma ampla gama de habitats predispõe a uma carga de mutações inevitavelmente alta e uma grande variedade de estímulos ambientais, sendo necessário desenvolver uma ampla gama metabólitos secundários de defesa.

3.1.1 O Gênero Euphorbia

O gênero Euphorbia (Webster, 1967) pertence à família Euphorbiaceae; subfamília Euphorbioideae; tribo Euphorbieae; subtribo Euphorbiinae, sendo um dos mais diversos gêneros do reino vegetal. Inclui estimadas 2.160 espécies (Steinmann & Porter, 2002; Bruyns et al., 2006), sendo o maior gênero em número de espécies na família (Webster, 1994a). Apresenta uma grande diversidade morfológica, de hábito, de tamanho e de números cromossômicos (Hans, 1973). A variedade e adaptação a diferentes condições ambientais são tamanhas, que no gênero existem três tipos de metabolismos fotossintéticos possíveis: C2, C3 e C4 (Sage et al., 2011), com algumas espécies como E. tirucalli, exibindo C3 ou C4, de acordo com a parte da planta (Van Damme 2001). Em contraste com os caracteres vegetativos muito variáveis de Euphorbia, o ciátio é interpretado como a principal inovação do gênero, altamente conservado. Este é um tipo de inflorescência altamente especializada, restrita à tribo Euphorbieae, sendo caracterizada por uma flor central feminina e 4-5 grupos de flores masculinas laterais, com o conjunto envolto por um invólucro (Park & Backlund, 2002).

De acordo com Bruyns et al. (2006), o desenvolvimento de uma classificação natural para Euphorbia tem sido dificultada devido ao grande número de espécies envolvidas, à distribuição muito ampla do gênero, à extrema complexidade das classificações que têm sido apresentadas no passado e ao elevado grau de convergência em vários caracteres vegetativos levando à consequente incerteza quanto às características observáveis para definir os grupos naturais. Visando auxiliar no conhecimento das espécies, um inventário global do gênero Euphorbia, “The EuphORBia Project” (Esser et al., 2009) vem sendo desenvolvido pelo programa de Inventários de Biodiversidade Planetária (Planetary Biodiversity Inventories – PBI) da Fundação de Ciência Nacional Americana (U.S. National Science Foundation). No entanto, apesar da subfamília Euphorbioideae ser marcada por divergências acerca da classificação de Euphorbia devido a sua grande complexidade (Webster, 1987;

Webster, 1994b; Park et al., 2000), são escassos e controversos os estudos de filogenéticos nestes táxons (Steinmann & Porter, 2002; Bruyns et al., 2006; Tokuoka, 2007; Park & Jansen, 2007). Alguns estudos como os de Aqueveque et al., 1999 e Domsalla et al. (2010a) propuseram uma abordagem quimiotaxonômica a partir de perfis flavonólicos e de proteinases do látex, respectivamente. No entanto, mais recentemente, Zimmermann et al. (2010) numa abordagem genética dividiram o gênero Euphorbia em quatro clados, cada um compreendendo um subgênero: Chamaesyce, Euphorbia, Esula e Rhizanthium.

As espécies do gênero apresentam elevado potencial invasivo, com consequentes danos à agricultura e às terras de pastoreio, a exemplo de E. hirta L. e E. heterophylla L. (Figura 2A) (Willard & Griffin, 1993; Aarestrup et al., 2008). No Brasil e em mais de 56 países, E. heterophylla é considerada uma das mais importantes plantas invasoras de plantações (de Vasconcelos et al., 2000). Por outro lado, Bellini et al. (2008) em estudos sobre competição entre a seringueira e plantas espontâneas destacou a importância de eufórbias invasoras no controle dos ácaros-praga em plantios de seringueira pela diversificação dos recursos disponíveis em agroecossistemas, dificultando a disseminação dos patógenos.

Acerca de uma propriedade importante do gênero, amplamente laticífero, Domsalla et al. (2010a) numa análise com 64 espécies sugeriram que os padrões dos constituintes obtidos no látex poderiam ser usados como possíveis marcadores quimiotaxonômicos. No mesmo ano, os autores analisaram o padrão inibitório de enzimas proteolíticas presentes nesse fluído em diversas espécies do gênero (Domsala et al., 2010b). Pintus et al. (2010) fizeram uma revisão onde tentaram relacionar a bioquímica e a composição proteica do látex das espécies do gênero às interações complexas em ambientes adversos. Apesar desses e outros estudos, e ainda que vários projetos de sequenciamento de genomas e transcriptomas tenham sido desenvolvidos (Grabowski et al. 2007), nesse ponto de vista, o gênero fica à sombra de outros tradicionalmente agricultados (e.g. Ahmad et al., 2003 e Uchida et al., 2009).

As espécies do gênero Euphorbia se destacam principalmente pelo seu uso como plantas medicinais e/ou ornamentais (Rizzini & Mors, 1995; Mothana et al., 2009). Embora Euphorbiaceae possua várias plantas cultivadas importantes, não há culturas no gênero Euphorbia e apenas uma é comercialmente importante, a ornamental “bico-de-papagaio” ou poinsétia (E. pulcherrima) (Figura 2C). A comercialização desta planta tem conquistado espaço de destaque dentro do mercado de ornamentais em diferentes partes do mundo, incluindo o Brasil (Lee, 2000). Ainda

são usadas como ornamentais Euphorbia milii Des Moul (Figura 2B), E. tirucalli L. (Van Damme, 2001) e E. obesa Hook (Mwine & Van Damme, 2011). Outros usos de Euphorbia incluem a produção de biodiesel a partir de E. tirucalli (Figura 2D) (Van Damme, 2001) e E. lathyris L. (Duke, 1983). No entanto, o principal fator de destaque do gênero é o seu potencial medicinal, como demonstrado a seguir.

O gênero Euphorbia e a própria família Euphorbiaceae foram nomeados em homenagem a um médico cirurgião grego chamado Euphorbus que atendia o rei Juba II da Mauritânia e a quem se credita ter usado o látex de E. resinifera Berg para curar doenças do rei, como “barriga inchada” (Van Damme, 2001; Jassbi, 2006). As espécies desse gênero, também têm sido utilizadas como plantas medicinais para o

tratamento de doenças de pele, gonorréia, enxaqueca, parasitas intestinais, verrugas e por mediar a percepção da dor (Singla & Pathak, 1990; Appendino et al., 1997; Shi et al., 2008). Muitos pesquisadores têm demonstrado que espécies de Euphorbia também possuem atividade antiproliferativa (Xu et al., 1998), citotóxica (Fatope et al., 1996), antimicrobiana (Khandoker et al.,1999; Sudhakar et al., 2006; Murugan et al., 2007; Akinrinmade & Oyeleye, 2010), analgésica e antipirética (Ma et al., 1997).

Também, tem-se verificado a inibição da infecção viral pelo HIV-1 (Hezareh, 2005) e HBV (Tian et al., 2010), atividade inibitória sobre a cadeia respiratória mitocondrial em mamíferos (Betancur-Galvis et al., 2003), efeito anti-anafilático (Youssouf et al., 2007) e antioxidante (Barla et al., 2007). Ainda diminui a motilidade intestinal (Hore, 2006) e auxilia no tratamento de diabetes mellitus (Widharna, 2010), além de ser larvicida para diversas espécies de mosquitos transmissores de doenças para o homem (Sharma et al., 2009; Mwine et al., 2010; Ramos et al., 2009 ). Diversas espécies de Euphorbia também têm mostrado atividade antitumoral (Ahmad et al., 1988; Duarte et al., 2006; de Melo et al., 2011). Alguns extratos além de inibir a proliferação dessas células, têm efeitos imunomoduladores benéficos sobre os linfócitos (Amirghofran et al., 2011), enquanto outros, modulam a resistência a terapias com múltiplas drogas e induzem células cancerígenas à apoptose (Corea et al., 2009; Duarte et al., 2009; Vasas et al., 2011; Zhang et al., 2011). Tantas propriedades propiciaram o desenvolvimento de diversos medicamentos comerciais patenteados compostos por diversas espécies medicinais de Euphorbia como listados por Mwine et al. (2010) na tabela 1.

A maioria das eufórbias é utilizada na medicina popular, na qual as doses e eficácia não são claras, portanto, existe a necessidade de ensaios em animais e humanos para estabelecimento de sua segurança (Mwine & Van Damme, 2011). Há diversos relatos de toxicidade em espécies de Euphorbia, sendo necessária cautela no uso devido ao elevado potencial venenoso de diversas espécies (ver Al-Qura'n, 2009; Adedapo et al., 2004). Diversas substâncias tóxicas são provenientes da seiva leitosa, que serve de barreira a insetos e herbívoros (Singh & Agarwal, 1988). O contato do látex com os olhos, nariz, boca e até mesmo da pele pode ocasionar dor severa e inflamação (Kedei et al., 2004). Outros compostos de espécies do gênero também podem exibir atividades pró-inflamatórias e promotoras de tumores (Vogg et al., 1999; Baloch et al., 2005). Certos componentes tóxicos das espécies Euphorbia foram classificados como diterpenos específicos, globalmente chamados de “phorboides” (Zayed et al., 2001; Cateni et al., 2003). Em uma tentativa de revelar a diversidade de venenos da família, Abdel-Fattah (1987) listou diversas espécies de Euphorbia

venenosas: para peixes (e.g. E. scheffleri Pax e E. tirucalli L.); para humanos (e.g. E. ledienii A. Berger, E. heterophylla L.); a animais domésticos (e.g. E. silenifolia Sweet, E. ingens E. Mey. Ex Boiss); irritantes (e.g. E. poissonii Pax, E. unispina N.E.Br.); entre outras. O látex, apesar de possuir os principais compostos responsáveis pela toxicidade do gênero (Loannidis et al., 2009; Shlamovitz et al., 2009), vem sendo empregado com resultados promissores no revestimento de nanopartículas para terapia do câncer (Valodkar et al., 2011).

Tabela 1. Exemplos de patentes de extratos de espécies medicinais do gênero Euphorbia. Reproduzido de Mwine et al. (2010). Espécies Data da Número da patente Inventor Indicação/Doença envolvidas patente

Advanced plant Composição US 5707631 E. lathyris Jan/ 1998 Pharm. Inc. Terapêutica-herbal

E. peplus US 6844013 Peplin Biotech Pyt. Imuno-estimulador E. hirta Mar/ 2001

E. drummondii A1 LaRiviere US 2003/0165579 Grubman and Inibição de tumor E. antiquorum Fev/ 2002 Payne LLP. E. peplus US 6432452 Composto Anti- Peplin Biotech Pty. E. hirta Ago/ 2002 câncer E. drummondii E. aaron-rossii A1 Peter Gordon Câncer de próstata E. tirucalli US 2003/0171334 Set/ 2003 Parsons E. tomentella E. tomentosa Componente Anti- US 6923993 Nicholas Dodato E. obesa Ago/ 2005 câncer PhytoMyco Research Propriedades Anti- US 2007/0248694 A1 E. hirta Out/ 2007 Corp. inflamatórias Rajesh Jain and Doenças ano-retal US 2006/0198905 A1 E. prostrata Maio/ 2008 others e colonal Fonte: United States Patent and trademark office (http://patft.uspto.gov)

3.1.1.1 Euphorbia hyssopifolia L.

A espécie representada na Figura 3 atende pelos seguintes sinônimos botânicos, de acordo com Lorenzi (2000): Euphorbia thymifolia L.; Chamaesyce thymifolia (L.) Millsp.; C. hyssopifolia (L.) Small; Euphorbia brasiliensis var. hyssopifolia (L.) Boiss E. brasiliensis senso Boiss. No Brasil também é conhecida como erva- andorinha, erva-de-andorinha, erva-de-Santa Luzia, erva-de-leite, burra-leiteira, leiteira, pé-de-pombo. Em inglês, a espécie é chamada de chicken weed, dwarf spurge, red caustic creeper. Na Ayurveda (medicina tradicional indiana) é denominada chhoti dudhi ou dugdhika, entre outros.

Figura 3. Exemplar de E. hyssopifolia. No detalhe, destaque para a inflorescência do tipo ciátio. Fotos da autora.

Euphorbia thymifolia L., Sp. pl. 1: 454. 1953. Ervas prostradas, pubescentes. Folhas opostas, membranáceas, concolores ou discolores; lâmina foliar oblongo- elíptica, 4,0-7,0×3,0-4,0 mm, ápice arredondado, margem serreada, base oblíqua, glabrescente; pecíolo ca. 1,0 mm compr.; estípulas lanceoladas, ca. 1,0 mm compr., inteiras, unidas na base. Ciátios solitários, axilares, turbinados, externamente pilosos, internamente glabros; lobos triangulares, acuminados, pubescentes; glândulas nectaríferas 4, sésseis, transversalmente elípticas; apêndices petalóides 4, obtriangulares, sinuados, desiguais entre si, glabros, alvos; brácteas internas do ciátio irregulares, ca. 1,0 mm compr., 3 lobadas, lobos agudos com margem pubescente. Flores estaminadas 4-5, ca. 1,0 mm compr. Flor pistilada ca. 1,4 mm compr., ovário globóide, tomentoso; estiletes livres, bífidos, glabros; estigmas capitados. Fruto globóide, ca. 2,0×2,0 mm, glabro; sementes oblongas. São plantas quase sempre associadas a solos arenosos e habitats perturbados (Sátiro & Roque, 2008).

Exemplares de E. hyssopifolia são encontradas em praticamente todo o território brasileiro (Sátiro & Roque, 2008). Seguindo a tendência do gênero, são ervas

daninhas, com reconhecido potencial medicinal (Amaral et al., 1999; Yang et al., 2005) e certa toxicidade (Adedapo et al., 2004). Silva & Freire (2005), estudando plantas empregadas na etnobotânica nordestina, verificou o uso popular de E. thymifolia em Pernambuco. Neste estado, são encontradas do litoral ao sertão, em ambientes tão diversos quanto a restinga (Almeida Jr et al., 2009) e a caatinga (Santos et al., 2009). A planta é usada popularmente no Brasil como um diurético, para o tratamento de infecções genito-urinárias e para remover verrugas (Corrêa, 1984).

De acordo com Bhaavaprakaasha, um dos livros históricos da Ayurveda, também pode ser utilizada como expectorante, na cura da tosse, doença de pele, infecção parasitária, além de possuir propriedades afrodisíacas e rejuvenescedoras (Khare,1991). Na medicina popular indiana, de acordo com Kane et al. (2009), o sumo é usado para curar micose e a raiz como um remédio para amenorréia. É desentumescente, anti-diarréico, anti-malárico, anti-exantêmico, anti-desentérico, anti- hemorroidal e auxilia na desintoxicação na infecção por carbúnculo. A planta triturada com vinho é administrada internamente como um remédio para mordida de cobra, sendo também aplicado externamente à área mordida (Kirtikar & Basu, 1975). Extrato de E. thymifolia possui atividade antimicrobiana, capaz de inibir o crescimento fúngico (Lal & Gupta, 1970; Rao & Gupta, 1970) e de bactérias Gram-positivas e Gram- negativas (Jabbar & Khan, 1965). A espécie também mostrou efeitos benéficos quando usada no tratamento da diarréia (Kirtikar & Basu, 1975), além de possuir propriedades laxativas (Watt & Breyer-Brandwijk, 1962; Kane et al., 2009).

O látex de E. hyssopifolia é aplicado em verrugas e calos (Hartwell, 1969) e pode ser empregado como larvicida para certas espécies de mosquitos (Rahuman et al., 2008). Mencionada como E. thymifolia, verificou-se seus efeitos como potente inibidor da transcriptase reversa do HIV-1 (Matsuse et al., 1999), e a infectabilidade de HSV-2 (Yang et al., 2005), HSV-1 e BVDV (Amaral et al., 1999). Seu extrato etanólico exibe significante atividade antioxidante (Prabhu & Singh, 2005). Em testes de toxicidade em ratos, seu extrato aquoso pode causar hepatotoxicidade, demência, anorexia, anemia normocrômica macrocítica, leucopenia, aumento significativo de albumina e redução significativa de globulinas (Adedapo et al., 2004).

Além do potencial terapêutico altamente documentado de E. hyssopifolia, a sua característica invasiva e pioneira revela resistência a um amplo espectro de intempéries ambientais, exibindo indícios de que possui compostos antimicrobianos interessantes para a pesquisa científica e evidenciando sua relevância tanto farmacológica quanto agronômica que, aliada ao conhecimento a ser obtido acerca de defensinas, tem potencial para ser empregado no desenvolvimento de novas

variedades de plantas transgênicas e na concepção de novas alternativas terapêuticas para diversas doenças humanas. No entanto, a toxicidade de seus compostos em demonstra a necessidade de uso cauteloso, sendo a produção de purificados de defensinas com ação antimicrobiana uma forma mais segura de aplicação de suas propriedades terapêuticas.

3.2 Peptídeos Antimicrobianos Vegetais

Diferente de outros organismos, as plantas não processam moléculas de imunoglobulinas ou células imunes circulantes, não realizam processos fagocíticos e nem mostram imunidade adaptativa (Figura 4) (Spoel & Dong, 2012).

Para compensar a ausência desses, a natureza proporcionou às plantas uma variedade de mecanismos de defesa inata, desencadeando respostas adequadas, geralmente através da secreção de uma mistura de compostos químicos (Figura 5) (Prithiviraj et al., 2006; Benko-Iseppon et al., 2010). O primeiro obstáculo à penetração do patógeno são as barreiras externas naturais das plantas, que incluem a produção de camadas foliares epicuticularizadas e tecidos epidérmicos suberizados, cutinizados e lignificados (Vance et al., 1980; Cano-Delgado et al., 2003).

Em um segundo momento, sua defesa se baseia na indução de estresse oxidativo como parte da reação de hipersensibilidade (Jabs et al., 1997; Lamb & Dixon, 1997; Kawano, 2003), bem como na ativação de proteínas relacionadas a patógenos (como fitoalexinas, inibidores de enzimas e enzimas hidrolíticas), conhecidas como proteínas PR (Pathogene Related) que constituem as defesas químicas (Bowles, 1990). Os tecidos de armazenamento das plantas possuem uma variedade de mecanismos de defesa que podem ser acionados em ferimento ou no contato com

microorganismos, que estão associados com o aumento de várias proteínas constitutivas acima do seu nível basal (Almeida et al., 2000). Além disso, um sistema de reconhecimento de patógeno está presente, ativando as vias de transdução de sinal específico, levando a SAR (Systemic Acquired Resistance - Resistência Sistêmica Adquirida) (Figura 6), que inclui a produção compostos antimicrobianos (Thomma et al., 2002; Durrant & Dong, 2004; Castro & Fontes, 2005) usados na defesa contra uma ampla variedade de patógenos, incluindo bactérias, fungos, vírus e protozoários.

Figura 6. Representação esquemática das respostas imunes sistemicamente induzidas. A Resistência Sistêmica Adquirida (SAR, Systemic Acquired Resistance) é tipicamente ativada de maneira sistêmica em tecidos sadios de plantas localmente infectadas. Após a infecção pelo patógeno, um sinal móvel viaja através do sistema vascular para ativar respostas de defesa em tecidos distais. O ácido salicílico (SA) é uma molécula sinalizadora essencial para o início da SAR, e é requerido para a ativação de um grande conjunto de genes que codificam proteínas relacionadas à patogênese (PRs, pathogenesis-related proteins) com propriedades antimicrobianas. A resistência sistêmica induzida (ISR, induced systemic resistance) é normalmente ativada após a colonização das raízes das plantas por microorganismos benéficos. Como no SAR, um sinal de longa distância viaja através do sistema vascular para ativar a imunidade sistémica nas partes aéreas. ISR é comumente regulada por vias de sinalização ácido jasmônico (JA) - e etileno (ET) -dependentes e tipicamente não está associada com a ativação direta de genes PR. Em vez disso, plantas expressando ISR estão preparadas para uma expressão acelerada de genes JA- e ET-dependentes, o que torna-se evidente apenas após o ataque de patógenos. Ambos SAR e ISR são eficazes contra um largo espectro de agentes patogênos vegetais virulentos. Adaptado de Pieterse et al. (2009).

Os Peptídeos Antimicrobianos (AMPs, Antimicrobial Peptides) são um importante componente do sistema de defesa inato da maioria dos organismos vivos contra patógenos invasores (Pelegrini et al., 2011), amplamente distribuídos também no reino vegetal (Broekaert et al., 1995; Thomma et al., 2002; Castro & Fontes, 2005). Estas proteínas fornecem uma resposta relativamente rápida, com um custo de energia comparativamente mais baixo ao hospedeiro, quando comparado à produção de metabólitos secundários resultantes de vias metabólicas complexas ou com o sistema imune adaptativo dos vertebrados superiores (Broeckaert et al., 1997; Matsunaga & Rahman, 1998). Tal resposta reflete a estrutura genética e proteica dessas moléculas: codificadas por genes únicos, como proteínas de tamanho pequeno, carga geral positiva (são catiônicos em pH fisiológico), comumente ricas em um tipo de aminoácido e distribuídas em várias subclasses que compartilham algumas características responsáveis pela ação antimicrobiana, tolerância a solventes ácidos e orgânicos, estabilidade térmica e estereogeometria anfipática, além de ampla atividade biológica (Yeaman & Yount, 2003; Brogden et al., 2005).

Estes peptídeos frequentemente contêm um número par de resíduos de cisteína que estabilizam a estrutura da proteína através da formação de pontes dissulfeto (Silverstein et al., 2007) e podem representar até 3% do repertório genético de uma planta, considerando-se que existam milhares destas moléculas no reino vegetal (Silverstein et al., 2007). A maioria destes peptídeos é menor do que 10 kDa, com menos de 200 aminoácidos de comprimento (muitas vezes menores que 50 kDa) (Ganz, 2004). Nas plantas, os principais grupos de AMPs são representados por ciclotídeos, defensinas, proteínas de transferência de lipídios, esnaquinas, tioninas, proteínas do tipo heveína e proteínas do tipo knotina, além de peptídeos antimicrobianos de Macadamia integrifolia Maiden & Betche e Impatiens balsamina L. (da Rocha Pitta et al., 2010). Exemplos dessas classes de AMPs e suas características encontram-se dispostas na Tabela 2.

AMPs são secretados na maioria das (se não em todas) espécies de plantas, onde o conjunto de proteínas relacionadas com a defesa pode ser expresso constitutivamente ou induzido como resultado de ferimentos por herbívoros e/ ou por ataque de patógeno (Ryan & Jagendorf, 1995; Garcia-Olmedo et al., 1998; Ryan & Moura, 2002; Jenssen et al., 2006). Em geral são mais bem representados nos tecidos em constante contato com o ambiente externo e, assim, continuamente expostos à biota microbiana (Garcia-Olmedo et al., 1998). Conforme revisado por Benko-Iseppon et al. (2010), estes peptídeos apresentam uma variabilidade considerável entre as sequências de aminoácidos, entretanto, um peptídeo pode ser designado como

membro de uma determinada família de acordo com um regime específico e conservado de conectividade dos resíduos de cisteína. Membros da mesma família apresentam um padrão dobrável que é globalmente comparável entre as famílias, adotando uma estrutura tridimensional que envolve a formação de elementos estruturais secundários, tais como folhas-beta pregueadas e alfa-hélices que são estabilizadas por pontes dissulfeto intramoleculares que impõem uma estrutura mais rígida e permitem uma maior estabilidade do peptídeo na planta (Giudici et al., 2006; Benko-Iseppon et al., 2010). Apesar disso, a falta de homologia de sequências torna difícil prever as atividades dos peptídeos in vivo, tornando desafiador o projeto de desenvolver peptídeos antimicrobianos sintéticos potentes que tenham as atividades in vivo desejadas (Hancock & Chapple, 2009).

Curiosamente, AMPs vegetais demonstram atividade antimicrobiana não só contra patógenos de plantas, mas também contra insetos, fungos, vírus, bactérias Gram-positivas e Gram-negativas patogênicas de humanos (Hancock & Lehrer, 1998; Zasloff, 2002; Brogden et al., 2003). Consequentemente, tais peptídeos têm atraído grande atenção como possíveis fontes de novos agentes terapêuticos. Existem vários tipos de estratégias potenciais para aplicação antimicrobiana de AMPs como (Gordon et al., 2005; Stotz et al., 2009b): agente anti-infeccioso único; em combinação com antibióticos convencionais ou antivirais para promover qualquer aditivo ou efeitos sinérgicos; agentes imunoestimulantes que melhoram a imunidade inata, e agentes neutralizantes de endotoxina para prevenir as complicações potencialmente fatais associadas com fatores de virulência bacteriana que causam choque séptico. Alguns AMPs são eficazes inibidores de enzimas digestivas, tais como proteinases de serina (Melo et al., 2002) e α-amilases (Liu et al., 2006). Alguns AMPs inibem a tradução proteica (Mendez et al., 1996; Chen et al., 2004) ou se ligam a canais iônicos nas plantas (Spelbrink et al., 2004). AMPs vegetais também demonstraram eficácia como inibidores de vírus e células neoplásicas (Daly et al., 1999; Svangard et al., 2004; Chen et al., 2005b; Ngai & Ng, 2005; Ireland et al., 2006; Wang et al., 2009) e exibem baixa toxicidade para células de mamíferos ou de plantas (Brogden, 2005; Carvalho & Gomes, 2009). Assim, peptídeos antimicrobianos são candidatos promissores para o tratamento de doenças infecciosas (Ausubel, 2005; Jenssen et al., 2006; Loeza- Angeles et al., 2008; Berrocal-Lobo et al., 2009 da Rocha Pitta et al., 2011).

Tabela 2. Pequenos peptídeos antimicrobianos, ricos em cisteína do reino vegetal, incluindo sua classificação e aspectos estruturais. Reproduzido de Benko-Iseppon et al. (2010). Estrutura da Entrada Família Nome PD Arranjo Cys* Referência proteína no PDB 3-C-10-C-5-C-3- Defensinas 1AYJ Terras et al., Rs-AFP2 4 C-9-C-8-C-1-C- 1992 vegetais 3-C

1BHP α e β-Tionina Alpha-1- 4 2-CC-7-C-3-C-8- Ohtani et al., (8-cisteína) purothionin C-3-C-1-C-8-C-6 1977

Tionina (6- 2-CC-11-C-9-C- Schrader-Fisher Crambin 1AB1 3 5-C-7-C-6 & Apel, 1994 cisteína) Proteínas 3-C-9-C-12-CC- Transportadoras Cammue et al., Ace-AMP1 1T12 4 18-C-1-C-23- C- 1995 de Lipídeos (não- 15-C-4 específico)

Proteína do tipo 3-C-4-C-4-CC-5- Broekaert et al., Ace-AMP2 1HEV 4 Heveína C-6-C-2 1992

Proteína do tipo 1-C-6-C-8-CC-3- Cammue et al., Mj-AMP1 1DKC 3 Knotina C-10-C-3 1992

Marcus et al., 10-C-9-C-1-C- Macadâmia MiAMP1 1C01 3 1997; McManus 25-C-14-C-11-C et al., 1999

Tailor et al., Impatiens ib-AMP1 - - - 5-CC-8-C-3-C 1997; Patel et al.,1998 6-C-3-C-13-C-3- Duvick et AMP de Milho MBP-1 - - - C-4 al.,1992 10-C-8-C-7-C-9- Blochet et al., Puroindolina WR[W]2K[W]2K- Puroindolinas - - - 1993; Gautier et C-6-C-9-CRC- A al.,1994 35-C-5-C-7 [X]n-C-3-C-2- Segura et RC-8-C-3-C-2- al.,1999; CC-2-C-1-CVP- Esnaquina SN1 - - - Berrocal-Lobo et 1-G-2-GN-3-C- al., 2002 1-CY-10-KCP

Jennings et al., 1-C-3-C-4-C-4- Ciclotídeo Kalata B1 1BH4 3 2001; Broekaert C-1-C-4-C-6 et al., 1989

PDB: Banco de dados “Protein Database”; PD: número de pontes dissulfeto; * Arranjo Cys em peptídeos antimicrobianos, interpolado com o número de aminoácidos frequentemente observado entre resíduos Cys conservados. Adaptado de Benko-Iseppon et al. (2010).

Face à crescente resistência a antibióticos no combate a microorganismos patogênicos, AMPs têm chamado a atenção científica como uma nova classe de candidatos úteis na terapêutica antimicrobiana, assim como para aplicação como medicamentos antibacterianos e moduladores da imunidade inata (Koczulla & Bals,

2003; Finlay & Hancock, 2004; Hamilton-Miller, 2004; Levy & Marshall, 2004). No entanto, a demonstração de um papel de defesa possível para um determinado tipo de peptídeo envolve observações de natureza diversa, sendo que nenhuma das quais pode ser conclusiva por si só. Neste contexto, de acordo com Garcia-Olmedo et al. (1998), alguns critérios relevantes incluem: atividade antimicrobiana in vitro; a expressão do gene, a distribuição de peptídeos, e as concentrações de peptídeo na planta (antes ou após a infecção) que são congruentes com um papel de defesa; a correlação da variação dos níveis de expressão (natural ou geneticamente modificados) com a gravidade dos sintomas; e a correlação da variação da resistência do patógeno aos peptídeos de plantas (naturais ou geneticamente modificados) com a virulência do mesmo.

3.3 β-Defensinas Vegetais

3.3.1 Origem, Características Gerais e Distribuição

As defensinas são peptídeos de defesa, estrutural e funcionalmente relacionados, tendo sido caracterizadas em um espectro bastante amplo de organismos vivos, incluindo: cnidários (Sunagawa et al., 2009), nematóides (Zhang et al., 2000), moluscos (Charlet et al., 1996), crustáceos (Saito et al., 1995), aracnídeos (Ceraul et al., 2007), insetos (Bulet, 1999), peixes (Zou et al., 2007), aves (van Dijk et al., 2008), mamíferos (Yang et al., 2007), fungos (Mygind et al., 2005) e plantas (Lay & Anderson, 2005). Na defesa inata, apenas esta classe de peptídeos antimicrobianos parece ser conservada entre plantas, invertebrados e vertebrados. Análises filogenéticas sugerem que esses peptídeos possuam um ancestral em comum (Charlet et al., 1996; Sugiarto & Yu, 2004) e, segundo Carvalho & Gomes (2009), essa suposição é corroborada pela conservação das estruturas primária, secundária e terciária dessas moléculas dentre diferentes organismos, tornando improvável uma possível origem polifilética.

Embora faltem informações a respeito da atividade antimicrobiana e do espectro desses peptídeos, é concebível que os mesmos representem uma estratégia ancestral de defesa nas formas de vida procarióticas que foi transferido para a linhagem eucariótica em algum ponto durante sua evolução, dando origem às defensinas eucarióticas (Gao et al., 2009). Coerente com esse ponto de vista, seis novas famílias de AMPs foram identificadas em fungos, contendo defensinas similares às de invertebrados, insetos e plantas, indicando sua ancestralidade comum (Zhu, 2008).

De acordo com Selsted & Ouellette (2005), em mamíferos, defensinas evoluíram de maneira a exercer um papel central na defesa do hospedeiro nas propriedadeas granulocíticas dos leucócitos, superfície de mucosas, pele e outros epitélios. Três subfamílias de defensinas (α-, β- e θ-defensinas) são expressas em vertebrados (Figura 7). A expressão deα -defensinas na medula óssea e enterócitos parece ser constitutiva. Deste modo, o aumento da atividade de α-defensinas depende principalmente pela mobilização dos peptídeos do interior das células (fagócitos) ou pela indução da sua secreção. Em contraste com a expressão de α - e γ-, β-defensinas são exibem padrões de transcrição induzíveis em diversos tecidos, geralmente envolvendo respostaspara produção de citocinas pro-inflamatórias (Figura 8).

Figura 7. Genes de defensinas e peptídeos. À esquerda, alinhamento de genes deα -, β- e θ-defensina. Sombreado, peptídeos sinal e pro-segmentos; em azul, resíduos presentes na defensina madura. À direita, três diferentes esquemas de pontes dissulfeto. As estruturas tridimensionais são de α -defensina RK-1 de rato (topo), β-defensina 1 (meio) e θ-defensina RTD-1 (final) de humanos. Adaptado de (Selsted & Ouellette, 2005).

Figura 8. Mobilização, indução e interações de defensinas. Funções imunes de defensinas podem induzir vários estímulos fisiológicos à mobilização deα -defensinas pré-formadas ou pelo aumento da expressão deβ -defensinas em vários tecidos. Os peptídeos liberados interagem com diversas células alvo e tecidos para promover respostas secundárias que podem ser críticas para a regulação da inflamação aguda, o recrutamento de células imunes adaptativas, angiogênese e cicatrização. Nk, natural killer; LTA, ácido lipoteicóico; MDP, muramildipeptídeo; IL-1β, interleucina-1β; TNF, fator de necrose tumoral; IFN-γ, interferon- γ; dsRNA, RNA dupla-fita; PAR, receptor protease-ativável; Mast, mastócito; DC, célula dendrítica; Mono, monócito, T, linfócito T. Adaptado de Selsted & Ouellette, 2005.

β-Defensinas vegetais compreendem peptídeos pequenos (~5 kDa) compostos de 45-54 aminoácidos, catiônicos, ricos em cisteína, e caracterizados pela presença de pontes dissulfeto intramoleculares estabilizantes conservadas, geralmente localizadas no interior de suas estruturas tridimensionais (Almeida et al., 2000; Thomma et al., 2002; Lay & Anderson, 2005; Stotz et al., 2009b; Benko-Iseppon et al., 2010). Compreendem componentes fundamentais do mecanismo de defesa contra patógenos vegetais (Thevissen et al., 2007), preferencialmente localizados em camadas de células periféricas, no xilema, em células estomáticas e em células que

revestem a cavidade subestomática, todos locais onde o primeiro contato e a entrada de patógenos acontecem (Moreno et al., 1994; Broekaert et al., 1997).

Os primeiros membros desta família foram isolados do endosperma da cevada (Mendez et al., 1990) e do trigo (Colilla et al., 1990), propondo-se primeiramente que se tratasse de uma nova subclasse da família tionina (γ-Tioninas), distinta das subclasses α- e β- (Bohlmann, 1994). Tal proposição foi baseada em semelhanças no tamanho, carga e conteúdo de cisteínas; no entanto, o espaçamento das cisteínas foi significativamente diferente (Colilla et al., 1990; Mendez et al., 1990; Bohlmann, 1994). O nome "defensina de plantas" foi proposto por Terras et al. (1995) que isolaram duas proteínas antifúngicas de sementes de rabanete (Rs-AFP1 e Rs-AFP2) e notaram que estas proteínas eram mais relacionadas às defensinas de insetos e mamíferos que às tioninas vegetais no nível de estrutura primária e terciária. Desde então o número de defensinas de plantas descritas tem aumentado rapidamente (Antcheva et al., 2006).

Membros da família defensina representam o maior número de peptídeos antibacterianos descrito até agora (Pelegrini et al., 2011), com uma distribuição generalizada por todo o reino vegetal (Broekaert et al., 1995; Osborn et al., 1995; Broekaert et al., 1997; Shewry et al., 1997; Osborn & Broekaert, 1999; Thomma et al., 2002). A maioria das defensinas de plantas foi isolada a partir de sementes, onde são abundantes (Carvalho & Gomes, 2009), muitas delas já caracterizadas em nível molecular, bioquímico e estrutural (Broekaert et al., 1995; Broekaert et al., 1997; Thomma et al., 2003). Defensinas foram também identificadas em outros tecidos incluindo folhas (Kragh et al., 1995; Terras et al., 1995; Komori et al., 1997; Segura, 1998; Lay et al., 2003b), vagens (Chiang & Hadwiger, 1991), tubérculos (Moreno et al., 1994), frutas (Meyer et al., 1996; Aluru et al., 1999; Wisniewski et al., 2003), raízes (Sharma & Lönneborg, 1996), casca (Moreno et al., 1994; Wisniewski et al., 2003) e tecidos florais (Gu et al., 1992; Karunanandaa et al., 1994; Moreno et al., 1994; Milligan & Gasser, 1995; Li & Gray, 1999; Park et al., 2002; Lay et al., 2003b).

A precisa função in vivo de defensinas de plantas ainda não está completamente clara, atribuindo-se diferentes papéis a estas moléculas, especialmente de defesa da planta. Sua atividade melhor caracterizada é a capacidade de inibir o crescimento de microorganismos in vitro (Thevissen et al., 1999; Carvalho et al., 2001; Wonga et al., 2006). Outras atividades biológicas in vitro têm sido propostas, incluindo a ação como um inibidor da síntese proteica (Méndez et al., 1996; Chen et al., 2004), um bloqueador dos canais iônicos (Kushmerick et al., 1998; Spelbrink et al., 2004), mediador de tolerância de zinco (Mirouze et al., 2006) e como inibidores de α-amilase (Bloch & Richardson, 1991; Pelegrini & Franco, 2005; Liu et al.,

2006). Adicionalmente, algumas defensinas de plantas não são apenas tóxicas para os microorganismos, mas também interferem na regulação do crescimento e desenvolvimento das plantas (Allan et al., 2008; Stotz et al., 2009a).

3.3.2 Organização Gênica

Uma das grandes vantagens do uso de defensinas como moléculas de defesa é que eles são simplesmente produzidos por transcrição e tradução de um único gene, podendo ser entregues de forma relativamente rápida após a infecção, com um gasto reduzido de energia e biomassa, podendo repelir eficientemente patógenos invasores (Hancock, 2001; Thomma et al., 2002). A estrutura do gene de defensina é composta por dois éxons e um íntron. O primeiro éxon codifica quase inteiramente o peptídeo sinal. A sequência é interrompida por um íntron de tamanho variável, seguido de um segundo éxon que codifica o domínio central da defensina (Meyer et al., 1996; Doughty et al., 1998; Manners et al., 1998; Chen et al., 2004; Beer & Vivier, 2008; Pelegrini et al., 2008a).

A partir da análise da estrutura de cDNAs, o transcrito de defensina pode ser dividido em duas classes (Lay & Anderson, 2005). Na primeira e maior classe, a proteína precursora é composta por uma sequência sinal de retículo endoplasmático (ER) que direciona as proteínas para o espaço extracelular (Figura 9A). Este fragmento muitas vezes é ácido e pode também desempenhar um papel na atividade supressora até a maturação, seguido de um domínio de defensina madura (Lay & Anderson, 2005). A segunda classe inclui defensinas produzidas como precursores maiores, com pró-domínio C-terminal (Figura 9B), mais comuns em solanáceas (Gu et al., 1992; Milligan & Gasser, 1995; Brandstadter et al., 1996; Lay et al., 2003a) e em tecidos de frutas (Aluru et al., 1999). Esse pró-domínio pode contribuir para o amadurecimento da defensina, agindo como um chaperona estérica intramolecular e/ou impedindo as interações deletérias entre as defensina e outras proteínas celulares ou membranas lipídicas, neutralizando a atividade tóxica durante a translocação através da via secretora (Michaelson et al., 1992; Bohlmann, 1994; Florack & Stiekema, 1994; Florack et al., 1994; Liu & Ganz, 1995; Lay & Anderson, 2005; Carvalho & Gomes, 2009).

Defensinas de plantas, como muitas outras proteínas relacionadas com a defesa de plantas, são codificadas por pequenas famílias multigênicas (Gu et al., 1992; Terras et al., 1995; Epple et al., 1997; Thomma et al., 2002). Algumas são expressas constitutivamente, enquanto outras são reguladas positivamente após a

infecção do patógeno (Epple et al., 1997; Thomma & Broekaert, 1998; Thomma et al., 1998). Como resultado, a maioria dos tecidos vegetais expressa constitutivamente dois ou mais genes de defensina, sugerindo que defensinas individuais parecem ser expressas em circunstâncias específicas ou em locais específicos.

3.3.3 Padrões de Expressão

A expressão de genes de defensinas em plantas é muito complexa, uma vez que diferentes padrões de expressão podem refletir diferentes funções. Com base no padrão de expressão de defensinas em tecidos de diferentes espécies verificou-se que sua expressão ocorre tanto em sementes como em tecidos periféricos, tais como frutos, tubérculos, raízes, folhas e órgãos florais. Além disso, existe uma diferença de expressão das defensinas conforme o tecido e/ou tipo de estímulo. Por exemplo, muitas defensinas são expressas em abundância em sementes (Terras et al., 1995), enquanto outras são reguladas pelo desenvolvimento (Vanoosthuyse et al., 2001) ou induzidas por diferentes fatores de estresses abióticos (Koike et al., 2002), micróbios patogênicos (e.g. Zimmerli et al., 2004) e moléculas sinalizadoras (Hanks et al., 2005).

A maioria das defensinas está concentrada principalmente em células periféricas e células estomáticas em plantas, o que é consistente com seu papel na

proteção contra patógenos (Terras et al., 1995; Lay & Anderson, 2005; Carvalho & Gomes, 2009). No entanto, a maior parte das defensinas vegetais isoladas na primeira metade da década de 1990 foi derivada de sementes (Thomma et al., 2002). Para sementes de rabanete foi mostrado que, apesar das defensinas representarem apenas 0,5% das proteínas totais das sementes, elas representaram cerca de 30% das proteínas liberadas mediante injúria mecânica (Terras et al. 1995), aumentando a viabilidade da germinação e da plântula (Terras et al., 1995; Carvalho & Gomes, 2009). Carvalho et al. (2006) analisaram a expressão de VUDEF durante o desenvolvimento da semente de V. unguiculata e observaram um padrão similar de acumulação de transcritos de defensinas. Outro exemplo veio de Balandıín et al. (2005) que relataram a expressão do gene de defensina ZmESR-6 durante o desenvolvimento precoce de sementes de milho, provavelmente com a função de proteger o embrião. Defensinas foram encontradas em camadas de células periféricas dos órgãos da flor do tabaco (Gu et al., 1992) e na camada de células epidérmicas e primórdios foliares de tubérculos de batata (Moreno et al. 1994); em células estomáticas e nas paredes das células que revestem as cavidades subestomática de folhas de beterraba (Kragh et al., 1995).

Genes de defensina induzidos após infecção por patógeno têm sido identificados em diversas espécies. Em rabanete, duas isoformas de defensinas (Rs- AFP1 e Rs-AFP2) são fortemente induzidos após infecção pelo fungo Alternaria brassicola (Terras et al., 1992, 1995). Também em vagens imaturas de ervilha, dois transcritos de defensina (pI39 e pI230) são induzidos sob infecção fúngica (Chiang & Hadwiger, 1991). No tecido íntegro de ervilha, níveis relativamente altos de transcritos de DRR230-a e DRR230-c estão presentes em folhas maduras e caules, com níveis intermediários nas folhas jovens, gavinhas e flores, bem como baixos níveis nas raízes e vagens. A indutibilidade de defensinas por patógenos também foi observada em sépalas de tabaco (Gu et al., 1992), bem como em Arabidopsis Heynh. (Penninckx et al., 1996), dentre outros. A infiltração de bactérias ou fungos em folhas de ervilha resultou em níveis elevados de expressão de defensina (Lai et al., 2002). Curiosamente, a injúria de folhas com inoculação apenas do tampão também resultou em acúmulo de RNA da defensina, sugerindo que estes genes também são induzidos por ferimento (Lai et al., 2002).

Algumas substâncias como metil jasmonato (MJ), ácido salicílico (SA), etileno

(ET), ácido abscísico (ABA), benzotiadiazol e peróxido de hidrogênio (H2O2) também são capazes de induzir a expressão de defensinas. Dependendo da planta-modelo, a sua resposta a estes estímulos pode ser regulada de maneiras bastante diversas

(Penninckx et al., 1996; Terras et al., 1998; Do et al., 2004). Além disso, a ativação sistêmica de genes de defensina também tem sido observada em folhas distais, não infectadas, de Arabidopsis e de rabanete (Terras et al., 1995; Penninckx et al., 1996). Vários trabalhos têm apresentado as vias de sinalização envolvidas na ativação sistêmica de defensinas (defensina PDF1.2 de Arabidopsis) induzida por patógeno e por hormônios vegetais (Penninckx et al., 1996; Thomma & Broekaert, 1998; Penninckx et al., 1998; Manners et al., 1998; Mitter et al., 1998; Thomma et al., 1999; Tierens et al., 2002). Esses hormônios têm sido implicados em diversas vias de transdução de sinal que levam à resistência sistêmica adquirida em plantas (Hammerschmidt, 1999; Heil & Bostock, 2002; Tierens et al., 2002). Em Capsicum annuum L., o gene que codifica a defensina CADEF1 foi fortemente induzido por SA,

MJ, H2O2 e ABA, porém não foi induzido por ET (Do et al., 2004). Após infecção de Arabidopsis com Alternaria brassicicola, os níveis da proteína PDF1.2 e do mRNA correspondente subiram não só nas folhas inoculadas, mas também nas demais folhas, sendo que esse aumento coincidiu com um aumento dos níveis de ácido jasmônico em ambos os tipos de folhas (Penninckx et al., 1996,1998). A exigência de um componente funcional de transdução de sinal de etileno (EIN2) na indução sistêmica de PDF1.2 também foi demonstrada por Thomma et al. (1999). Park et al. (2002) identificaram um gene de defensina BSD1 que é especificamente expresso em estame, cuja expressão está ausente em qualquer outro tecido vegetal, não sendo induzida por MJ, SA, ET, ou pelo patógeno testado (X. campestris).

Conforme já mencionado, defensinas também podem ser induzidas por estresse ambientais. A expressão de defensinas de plantas pode ser induzida por frio (Koike et al., 2002; Brogden et al., 2005), seca (Do et al., 2004), salinidade (Koike et al., 2002), metais pesados (Mirouze et al., 2006) e deficiência de potássio (Armengaud, 2004). Gaudet et al. (2003) relataram o aumento da regulação das transcrições de defensina em trigo em resposta à baixa temperatura e climatização. Koike et al. (2002) demonstraram a expressão do cDNA codificando a defensina Tad1 por análise de Northern blotting durante a aclimatação ao frio em Triticum aestivum L.. Este clone foi detectado em baixos níveis em tecidos não-aclimatados, ocorrendo um aumento após 24 h de aclimatação ao frio, mantendo-se elevado nos 14 dias seguintes sem indução por ABA, SA ou MJ. Maitra & Cushman (1998) identificaram um gene defensina de soja (Dhn8) que foi induzido por seca. O nível de Dhn8 foi 10 vezes maior nas folhas e raízes de uma cultivar resistente do que em uma cultivar sensível à seca (Maitra & Cushman, 1998). Genes de defensina de folhas de Nicotiana excelsior J. Black (NeThio1 e NeThio2; Yamada et al., 1997) e N. paniculata L.

(NpThio1; Komori et al., 1997) também foram induzidos em resposta ao estresse salino (250 mM NaCl). A indutibilidade de defensinas por patógenos, estresse hídrico, salinidade e frio fornece exemplos de resposta cruzada (denominada cross-talk) entre as vias de transdução de sinais e programas de expressão de genes que são regulados por diversos estímulos pós-estresse nas plantas (Lay & Anderson, 2005). Esse padrão de expressão gênica, juntamente com sua localização celular suporta um papel para defensinas como importantes moléculas de defesa em plantas.

3.3.4 Estrutura das Defensinas Vegetais

As defensinas vegetais compreendem uma família de peptídeos antimicrobianos com um tamanho molecular entre 5 e 7 kDa, consistindo de 45-55 resíduos de aminoácidos, incluindo oito resíduos de cisteína estritamente conservados (Thomma et al., 2002, Carvalho & Gomes, 2009). Todas as defensinas de plantas têm uma estrutura 3D semelhante, apresentando dobradura global como tipificado por Rs- AFP1 (Fant et al., 1998), a qual apresenta um padrão de três folhas beta pregueadas antiparalelas sobrepostas por uma únicaα -hélice estabilizada por quatro pontes dissulfeto, que formam uma estrutura característica conhecida como a motivo αβ estabilizado por cisteína (assinatura CSαβ, cysteine-stabilized α-helix β-sheet) (Fant et al., 1998; Almeida et al., 2002; Thomma et al., 2003; Janssen et al., 2003; Bloch et al., 2008; Liu et al., 2006; Pelegrini et al., 2008a). Estas características se assemelham à estrutura de defensinas observadas em animais (Broekaert et al., 1995; Antcheva, et al. 2006; Liu et al., 2006) e também são compartilhadas por várias toxinas de insetos, escorpiões, abelhas e aranhas (Pease & Wemmer, 1988; Kobayashi et al., 1991; Bontems et al., 1991, 1992 Cornet et al., 1995). O motivo CSαβ (Figura 10) expande em um motivo menor conhecido como α- hélice estabilizada por cisteína (CSH), primeiramente proposto por Kobayashi et al. (1991), no qual um par de cisteínas, localizado em umaα -hélice e separadas por três aminoácidos (CXXXC) estão ligados a um segundo par de cisteínas localizado em uma folha β-pregueada e separados por um aminoácido (CXC) (Thomma et al., 2002). O motivo CSαβ inclui duas cisteínas adicionais que formam uma terceira ponte dissulfeto. Este motivo pode assim ser representado como segue:

C1..C2XXXC3..C1’..C2’XC3’ onde C1=Cys1, C2=Cys2, C3=Cys3, C1’=Cys4, C2’=Cys5 e

C3’=Cys6. Nas defensinas de plantas uma quarta ligação dissulfeto é formada por duas cisteínas que fazem fronteira com cisteínas do motivo CSαβ, reuni ndo as regiões N- e C- terminais da proteína para criar uma proteína pseudo-cíclica (Lay & Anderson,

2005). Essa estrutura pode ser observada em todos os membros desse grupo, mesmo entre aqueles com funcionalidades diferentes (Peregrini et al., 2011).

Figura 10. Sequência e estrutura secundária de defensina vegetal de ervilha obtida por Almeida et al. (2002). Números em amarelo indicam pontes dissulfeto. Fonte: PDBsum CATH - 1JKZ

β-Defensinas vegetais e de mamíferos diferem na organização das folhas beta-pregueadas: dobramento βαββ para os primeiros e αβββ no segundo. Entretanto, o tamanho e a orientação especial da folha beta-pregueada tripla em defensinas de mamíferos são comparáveis aos encontrados em defensinas vegetais (Broekaert et al., 1995). Além disso, a α -hélice parece ser aproximadamente na mesma posição em relação às folhas β (Hwang & Vogel, 1998). O CSαβ é capaz de suportar uma grande variedade de aminoácidos na sequência primária, embora comparações entre uma série de sequências de defensinas de plantas de diversas espécies revelem que esta família apresenta clara, ainda que limitada, conservação da sequência (Almeida et al., 2000; De Paula et al., 2008; Carvalho & Gomes, 2009; Padovan et al., 2010a). Segundo Lay & Anderson (2005), os oito resíduos de cisteína e uma glicina na posição 34 (numeração em relação a Rs-AFP2) são estritamente conservados. Na maioria dos casos, uma segunda glicina se localiza na posição 13, uma serina na posição oito, um resíduo aromático na posição 11 e um ácido glutâmico na posição 29. Estes resíduos são, provavelmente, conservados, porque eles têm um papel essencial no dobramento ou estabilização da proteína (Lay et al., 2003a), especialmente as cisteínas envolvidas na formação da ligação dissulfeto. Os outros resíduos conservados podem ter surgido como uma consequência das limitações impostas pelo impedimento estérico do dobramento de proteínas (Bontems et al., 1991; Kobayashi et al., 1991; Fant et al., 1998; Lay et al., 2003a). Eles também mostram um alto teor de aminoácidos carregados positivamente (Pelegrini et al., 2011). Considera-se que esta carga positiva se deve à presença de um grande número aminoácidos de arginina e lisina (que são carregados positivamente), em relação ao aspartato e ao glutamato, que são carregados negativamente (aniônicos). Essa característica facilita a sua interação e inserção na parede celular e na interação com a matriz fosfolipídica aniônica da membrana plasmática de microrganismos, causando lise celular (Shai, 2002; Oren, 1998). As variações na sequência primária podem ser responsáveis por diferentes

atividades biológicas relatadas para defensinas de plantas (Lay & Anderson, 2005; De Paula et al., 2008; Carvalho & Gomes, 2009; Padovan et al., 2010a).

A super-família das proteínas contendo tal motivo CSαβ também inclu i algumas neurotoxinas de escorpião (Bontems et al., 1991; Kobayashi et al., 1991; Polikarpov et al., 1999; Jablonsky et al., 2001) e a proteína vegetal Brazzein, conhecida pela seu sabor doce intrínseco (Caldwell et al., 1998). No entanto, estruturas de algumas defensina de plantas possuem características únicas, como exemplificado por PhD1, que possui uma quinta ponte dissulfeto entre a α-hélice e uma folha-β formada pelas Cys7 e Cys23, resultando em uma estrutura muito compacta, que reforça a estabilidade da molécula (Janssen et al., 2003), sem afetar a orientação da proteína, sendo proposta sua inclusão em uma nova subclasse da família defensina de vegetais (Janssen et al., 2003; Lay et al., 2003a). Ciclotídeos compreendem um tipo único de peptídeo no qual os términos N- e C- interagem para formar uma estrutura cíclica (Pelegrini et al., 2007). No entanto, apesar de apresentar uma conformação cíclica, a estrutura terciária dos ciclotídeos é muito semelhante aos de peptídeos da família das defensinas. Estudos anteriores sugeriram que ciclotídeos são variações de genes mutantes de defensina, levando a alterações estruturais dos peptídeos ao longo dos anos (Conlan et al., 2010).

Com relação à estrutura quaternária, existem alguns exemplos de possíveis associações in vivo. Terras et al. (1992) relatou que no estado não reduzido, Rs-AFP1 e Rs-AFP2 migram como uma única banda por SDS-PAGE. Este fato sugere uma possível oligomerização dessas defensinas. Duas defensinas de Raphanus sativus L. em suas formas reduzidas e não reduzidas também apresentam a mesma mobilidade eletroforética, com estudos cristalográficos confirmando a dimerização (Song et al., 2004). Anteriormente, fusões defensina-defensina, já haviam sido observadas (Thomma et al., 2002).

3.3.5 Relações entre Estrutura e Atividade Biológica

As diferentes atividades biológicas das defensinas vegetais podem estar relacionadas a variações na estrutura primária (Carvalho & Gomes, 2009). A exemplo disso, apesar de muito semelhantes, a defensina Ah-AMP1 é específica para bactérias Gram-positivas, enquanto VrD1 só inibe as bactérias Gram-negativas (Osborn et al., 1995; Jennings et al., 2005). Há uma diferença de uma folha-β em suas estruturas, mas isso não prova que a falta ou a presença dela leva a alguma função específica. No entanto, os outros seis peptídeos exibem atividade inibitória contra bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas, confirmando a atual incapacidade de utilizar apenas a conformação terciária para prever funcionalidade peptídeo (Jennings et al., 2005). Dessa madeira, mais estudos são necessários para permitir a identificação da função de um peptídeo por meio de sua estrutura tridimensional (Pelegrini et al., 2011).

Para defensinas antifúngicas de plantas como a Psd1 de ervilha, o loop anterior parece ser necessário para o encaixe de esfingolipídeos específicos presentes em rafts de membrana de células fúngicas e, em seguida, à molécula viral para inserir o último loop na membrana, provocando sua desestabilização (de Medeiros et al., 2009). Para defensinas de plantas inibidoras de α-amilase, este ciclo é mais longo do que nos antifúngicos, estando aparentemente inserido no sítio ativo da enzima (Liu et al., 2006; Carvalho & Gomes, 2009). Os resíduos positivamente carregados e os hidrofóbicos em ambos os loops são importantes tanto para a atividade antifúngica e como inibidora de enzima (Padovan et al., 2010a).

Utilizando mutagênese sítio-dirigida, De Samblanx et al. (1997) almejaram a substituição de resíduos de aminoácidos que estavam presentes nas defensinas antifúngicas, mas estavam ausentes na defensinas desprovida dessa atividade, fazendo uso das defensinas Rs-AFP1 e Rs-AFP2 de rabanete. Essas são constitutivamente expressas em sementes e só diferem em dois aminoácidos. No entanto a potência antifúngica de Rs-AFP2 é, dependendo do fungo teste, 20-30 vezes maior do que a de Rs-AFP1 (Terras et al. 1992). Glu5 em Rs-AFP1 é um Gln em Rs-

AFP2 e Asn27 em Rs-AFP1 é uma Arg no Rs-AFP2. Portanto, Rs-AFP2 tem um menor número de cargas negativas devido à substituição da Glu por Gln e um custo adicional positivo fornecido pela Arg. Por essas razões Rs-AFP2 tem duas cargas positivas a mais do que Rs-AFP1.

A diferença na atividade antifúngica destas variantes da proteína Rs-AFP2, em comparação com a atividade antifúngica de Rs-AFP2 nativas, se mostrou dependente do fungo teste, o que sugere um mecanismo de reconhecimento muito específico entre a defensina vegetal e seu sítio alvo em fungos. Com base em uma análise mutacional foi mostrado que Rs-AFP2 possui dois locais adjacentes importantes para a atividade antifúngica contra Fusarium culmorum. Os primeiros sítios foram identificados na curva que conecta o folhas-β2 e -β3, entre os aminoácidos Tyr38, Phe40, Pro41, Ala42, Lys44 e

Ile46. Com exceção da Pro e Lys, todos os outros aminoácidos são altamente hidrofóbicos. A inserção de um aminoácido de carga positiva (Arg) na posição da Val39 resultou em maior atividade antimicrobiana, em comparação com a defensina de ocorrência natural. Da mesma forma, a substituição de Lys44 por Gln elimina uma carga positiva e diminui a atividade (De Samblanx et al., 1996, 1997; Schaaper et al.,

2001). O segundo sítio está no trecho que liga folhas-β1 e a α-hélice, bem como resíduos contíguos na α-hélice e na folha-β3 (Thr10, Ser12, Leu28 e Phe49). Mais uma vez, as variantes produzidas pela inserção de uma carga positiva, por exemplo, trocar a Val9 por Arg, resultou em um aumento na atividade antimicrobiana (De Samblanx et al., 1997). É interessante notar que nem todas as inserções de um resíduo carregado positivamente produziu uma melhora na atividade antimicrobiana. Quando Gln29 foi substituído por Arg, a atividade antimicrobiana foi reduzida,. Isso ocorreu provavelmente porque a Gln pode formar pontes salinas e sua ausência pode prejudicar a estabilização da estrutura, resultando na perda da atividade antifúngica (De Samblanx et al., 1997, Landon et al., 2000). Do ponto de vista funcional, os autores propuseram que estas regiões podem constituir dois sítios que contatem um único receptor putativo. Alternativamente, a presença de dois sítios pode indicar duas características distintas que são necessárias para a atividade antifúngica, de tal forma que um sítio pode estar envolvido na ligação do Rs-AFP2 ao seu receptor, enquanto permeabilização posterior da membrana pode envolver o segundo sítio (De Samblanx et al., 1997). Estudos de Schaaper et al. (2001), posteriormente mostraram que os peptídeos sintéticos derivados de modificações na folha-β2 possuíam uma atividade antifúngica que foi semelhante à da molécula original.

Outros estudos têm mostrado que o laço de ligação entre folhas-β2 e -β3 é responsável pela atividade antimicrobiana (Schaaper et al., 2001; Spelbrink et al., 2004), pela atividade bloqueadora de canais (Kushmerick et al., 1998) ou ainda pela atividade inibitória de α-amilase. Neste sítio há uma exigência de aminoácidos carregados positivamente para que o peptídeo seja biologicamente ativo. Análises incluindo mutagênese sítio dirigida em MsDEF1, ensaios de atividade e expressão subsequente da defensina mutada em Pichia pastoris revelaram que a Arg38 situada na alça entre as folhas-β2 e -β3 é crítica para a atividade antimicrobiana. Os autores substituíram este resíduo carregado com uma Gln e, como resultado, o peptídeo diminuiu ou mesmo anulou sua atividade antimicrobiana. Este resultado indica a importância de um resíduo carregado nessa posição (Spelbrink et al., 2004). Outros trabalhos também sublinham a necessidade de um resíduo positivo dentro dessa região (Kushmerick et al., 1998; Sugiarto & Yu, 2004).

3.3.6 Atividade Biológica e Modo de Ação das Defensinas Vegetais

A primeira atividade biológica descrita para uma defensina vegetal foi relacionada à capacidade de inibir a síntese proteica (Mirouze et al., 2006). Até agora,

várias defensinas puderam ser purificadas a partir de várias espécies de plantas e tecidos vegetais, como sementes, caules, raízes, folhas e órgãos florais e mostram uma grande variedade de atividades biológicas (Thomma et al., 2002; Lay & Anderson, 2005; Pelegrini & Franco, 2005; Sels et al., 2008), incluindo os efeitos inibitórios de crescimento em uma ampla gama de fungos (Terras et al., 1993; Osborn et al., 1995; Broekaert et al., 1997; Lay et al., 2003a) e de bactérias Gram-positivas e Gram- negativas (Moreno et al., 1994; Zhang & Lewis, 1997; Segura et al., 1998). Algumas defensinas são eficazes inibidores de enzimas digestivas, taisα -amilases (Bloch & Richardson, 1991; Zhang et al., 1997) e proteinases de serina (Wijaya et al., 2000; Melo et al., 2002), duas funções consistentes com o papel na proteção contra a herbivoria de insetos. Defensinas também podem inibir a tradução proteica (Colilla et al., 1990; Mendez et al., 1990; Mendez et al., 1996) ou se ligam a canais iônicos (Kushmerick et al., 1998). Curiosamente, defensinas individuais apresentam uma ou duas destas propriedades, mas raramente poderiam apresentar todas essas propriedades.

3.3.6.1 Atividade Antifúngica

A maioria das defensinas de plantas isoladas até o momento apresenta elevada atividade contra uma ampla gama de fungos (Thevissen et al., 2000; Thomma et al., 2002; Lay & Anderson, 2005; Wong et al., 2007), refletindo a importância patogênica relativa de fungos em oposição a bactérias no mundo das plantas (Hancock & Chapple, 2009). Observações nesse aspecto propiciaram a classificação das defensinas vegetais em quatro grupos com base em seus efeitos sobre o crescimento e morfologia do fungo Fusarium culmorum (Osborn et al., 1995; Segura et al., 1998): defensinas do grupo I causam alterações morfológicas das hifas fúngicas em fungos sensíveis e são conhecidas como defensinas morfogênicas (causam redução alongamento das hifas com um aumento concomitante de hifas ramificadas); proteínas do grupo II inibem o crescimento de fungos, mas não causam alterações morfológicas (grupo não-morfogênico no qual as defensinas reduzem a taxa de alongamento das hifas, mas não induzem distorções morfológicas marcadas); as do grupo III são inativas contra fungos teste, mas inibemα -amilases in vitro; enquanto as do grupo IV são únicas em termos de estrutura e especificidade antifúngica. Portanto, a atividade antifúngica de defensinas é a melhor caracterizada, com capacidade de inibir, com potências variáveis, uma ampla gama de fungos fitopatogênicos (para exemplos, veja Osborn et al., 1995; Broekaert et al., 1997; Lay et al., 2003a) e de inibir

patógenos fúngicos humanos (tais como Candida albicans) em baixas concentrações (1-100 mg/ mL) (Broekaert et al., 1997; Thevissen et al., 2004).

O crescimento de várias espécies de fungos foi inibido quando incubadas com esta classe de antimicrobianos incluindo Aspergillus niger, Neurospora crassa e Saccharomyces cerevisiae, várias patógenos de plantas, como Alternaria brassicola, A. solani, Botrytis cinerea, Cladosporium colocasiae, C. sphaerospermum, Colletotrichum lindemuthianum, Diploidia maydis, Fusarium culmorum, F. decemcellulare, F. graminearum, F. oxysporum, F. verticillioides, Mycosphaerella arachidicola, M. fijinesis, Nectria haematococca, Penicillium digitatum, P. expansum, Pyricularia oryzae, Phaeoisariopsis personata, Physalospora piricola, Rhizoctonia solani, Septoria tritici, Trichoderma viride, Verticilium albo-atrum, Verticilium dahliae, o patógeno humano Candida albicans e os oomicetos Phytophthora infestans e P. parasitica (Terras et al., 1992, 1993; Osborn et al., 1995; Park et al., 2002; Ye & Ng, 2002; Wisniewski et al., 2003; Chen et al., 2005; Wong, 2005a, 2005b; Anaya-López et al., 2006; Olli & Kirti, 2006; Wang & Ng, 2006; Ramamoorthy et al., 2007; Finkina et al., 2008). A atividade inibitória e a concentração necessária para uma inibição parecem ser dependentes da espécie e estirpe do fungo e também da sequência da defensina analisada. Por exemplo, o fitopatógeno F. culmorum foi inibido por Ah-AMP1 com menos 12 mg/mL (IC50) e por Rs-AFP2 em 1,5 mg/mL (IC50). Por outro lado, R. solani foi inibida pelo menos por 100mg/mL de TvD1 e não foi inibida por BSD1, mesmo em concentrações acima de 500 mg/mL (IC50) (Park et al., 2002). Rs-AFP2, por exemplo, inibiu o crescimento de Phoma betae a 1 µg/mL, mas foi ineficaz contra Sclerotinia sclerotiorum em 100 µg/mL (Terras et al., 1992).

• Mecanismo de ação

A atividade antifúngica das defensinas aparentemente requer a interação dessas proteínas com alvos específicos, presentes na membrana celular (Thomma et al., 2002; Spelbrink et al., 2004). As defensinas de plantas, assim como as humanas e as de insetos, possuem domínios anfipáticos constituídos por folhas-β, o que possibilita sua inserção nas membranas lipídicas (Kagan et al., 1990). No entanto, ao contrário de defensinas de mamíferos e insetos, defensinas de plantas não interagem diretamente com os fosfolipídios da membrana plasmática (Thomma et al., 2002; Brogden et al., 2005; Lay & Anderson, 2005; Wong et al., 2007; Kant et al., 2009).

Embora a ação antifúngica de defensinas vegetais não seja totalmente compreendida, é geralmente aceito que a mesma requer uma ligação com alvos de membrana específicos, como esfingolipídeos (Thevissen et al., 2004; Lay & Anderson,

2005). A defensina Dm-AFP1 de dália foi relatada como ligante da manosil-di-inositol- fosforil-ceramida, enquanto que para a defensina Rs-AFP2 de rabanete ocorre ligação à glicosil-ceramida. A presença de ergosterol também é relatada como moduladora da atividade dos peptídeos, por isso é provável que estes esfingolipídeos estejam em rafts de membrana, sugerindo-se que os peptídeos possam interagir diretamente com essas regiões ou de forma mediada por proteínas ancoradas aos esfingolipídeos (Thevissen et al., 2000b; Thevissen et al., 2004; Lay & Anderson, 2005).

Uma observação comum para a maioria das defensinas antifúngicas de plantas, bem como para outros tipos de defensina, é a redução da atividade antifúngica quando a força catiônica do meio é aumentada (Lehrer et al., 1988; Terras et al., 1992, 1993; Cociancich et al., 1993a; Osborn et al., 1995). Isso decorre da presença de cátions, com os bivalentes sendo pelo menos uma ordem de grandeza mais potentes do que cátions monovalentes (Terras et al., 1992, 1993; Osborn et al., 1995; Broekaert et al., 1997). Este efeito antagônico de cátions é fortemente dependente do fungo testado, indicando que as interações eletrostáticas, provavelmente, alteram a conformação do sítio-alvo na membrana de fungos, ao invés da conformação da defensina (Broekaert et al., 1995).

A sinalização de cálcio, que é de vital importância para o crescimento de fungos, pode ser alterada por defensinas. Por exemplo, a defensina MsDef1 de alfafa pode bloquear o canal de cálcio do tipo L, inibir o crescimento de hifas e induzir hiperramificação de hifas fúngicas (Spelbrink et al., 2004). Thevissen et al. (1996; 1999) demonstraram que defensinas de rabanete (Rs-AFP2) e dália (Dm-AMP1) induzem rápido influxo de Ca2+ e efluxo de K+ quando adicionadas a hifas do fungo Neurospora crassa em concentrações que são inibitórios para seu crescimento. Dado que os fungos crescem a partir da ponta e requerem a manutenção de gradiente intracelular de concentração Ca2+ para impulsionar o crescimento polarizado (Robson et al., 1991; Garrill et al., 1993), tem sido sugerido que a inibição do crescimento pode ser devida à dissipação desse gradiente (Thevissen et al., 1996). Em apoio de uma ligação entre íons e atividade antifúngica, De Samblanx et al. (1997) demonstraram que uma variante (substituição Val39 por Arg) do Rs-AFP2 que apresentou maior atividade antifúngica induz captação de Ca2+ ainda maior (até 2,5 vezes), enquanto que uma variante (Tyr38 Gly substituída) que exibia quase nenhuma atividade antifúngica não causou captação de Ca2+, o que demonstra uma ligação direta entre os fluxos de íons e atividade antifúngica (De Samblanx et al., 1997).

Dessa forma, atualmente existem dois modelos para o funcionamento da atividade antifúngica. Um deles decorre na formação de poros multiméricos na

membrana do fungo após a interação das defensinas com esfingolipídeos negativamente carregados. Após a interação eletrostática inicial, esses peptídeos (que são positivamente carregados) se inserem na membrana e em conjunto organizam a formação de canais iônicos, aumentando assim a permeabilidade da membrana e alterando o seu potencial, em decorrência do influxo de Ca2+ e do efluxo de K+ (Sugiarto e Yu, 2004). O segundo modelo postula que os peptídeos inicialmente se ligam como monômeros aos lipídeos aniônicos presentes na membrana, cobrindo parte de sua extensão como um “tapete”. A consequente neutralização desses lipídeos provoca a perda da integridade da membrana, originando grandes poros transientes e permitindo o trânsito de várias moléculas, desde íons até proteínas (Hoover et al., 2000; Padovan et al., 2009, 2010a).

Outro mecanismos também têm sido verificados, mas pouco estudados, como exemplificado no experimento de Aerts et al. (2007) no qual se verificou que a RsAFP2 está envolvida na indução de espécies reativas de oxigênio (ROS) em Candida albicans, resultando em permeabilização da membrana e levando à prisão de fungos de crescimento celular. A defensina de ervilha Psd1 é internalizada na célula fúngica, onde então afeta a progressão normal do ciclo celular (Lobo et al., 2007). Ao invés de ser absorvida pelas células, é possível que outras defensinas fiquem fora da célula e induzam a morte da célula fúngica através de modulação cascatas de sinalização intracelular, após a sua interação com o seu alvo no envoltório fúngico (Aerts et al., 2008).

3.3.6.2 Atividade Antibacteriana

Ao contrário das defensinas de insetos e mamíferos, que são principalmente ativas contra as bactérias (Thomma et al., 2002; Ganz & Lehrer, 1994; Ganz et al., 2004; Lay & Anderson, 2005; Wong & Ng, 2005c, Wong et al., 2007; van Djik et al., 2008). Poucas defensinas de planta exibem atividade antibacteriana (Bloch et al., 1991; Moreno et al., 1994; Osborn et al., 1995; Segura et al., 1998; Carvalho & Gomes, 2009). Possivelmente, isso reflete a importância relativa da pressão de infecção de fungos em relação a patógenos bacterianos em plantas (Thomma et al., 2002). Dentre as bactérias, as Gram-positivas são especialmente inibidas por essas defensinas, embora de uma forma menos pronunciada em comparação aos fungos. A parede celular dessas bactérias é composta de 50% de peptídeoglicanos, 40% a 45% de polímeros ácidos (o que resulta na superfície da célula polarizada e de carga

negativa) e 5% a 10% de proteínas e polissacarídeos. Tais características favorecem a adesão de moléculas catiônicas como as defensinas.

As bactérias Gram-negativas testadas em ensaios de inibição foram Agrobacterium tumefaciens, A. radiobacter, A. rhizogens, Alcaligenes eutrophus, Azospirillum brasilense, E. coli, Erwinia carotovora, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, P. synrigae, P. lachrymans, P. fluorescens, P. cichorii, P. (Ralstonia) solanacearum e Salmonella typhimurium. Entre as bactérias Gram-positivas testadas figuraram Bacillus cereus, B. megaterium, B. subtilis, Clavibacter michiganensis, Curtobacterium flaccumfaciens, Mycobacterium phlei, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus e S . epidermidis (Terras et al., 1992, 1993; Osborn et al., 1995; Segura et al., 1998; Koike et al., 2002; Fujimura et al., 2004; Chen et al., 2005a; Wong & Ng, 2005a, 2005b; Wong et al., 2006; Franco et al., 2006; Huang et al., 2008; van der Weerden, 2008). Br-AFP2 (molécula isolada como peptídeo antifúngico) apresentou atividade inibitória contra B. megaterium na concentração de 52 mg/mL (Terras et al., 1993). Por sua vez, a defensina isolada de folhas de Spinacia oleracea L. apresentou atividade inibitória contra as bactérias C. michiganensis e P. solanacearum em concentrações abaixo de 20 mM (IC50) (Segura et al., 1998).

• Mecanismo de ação

Para a morte microbiana, muitas hipóteses têm sido apresentadas, as quais incluem: a despolarização fatal da membrana bacteriana normalmente energizada (Westerhoff et al., 1989), a criação de buracos físicos que causam vazamento de conteúdo celular para o exterior (Yang et al., 2000b), a ativação de processos mortais como a indução de hidrolases que degradam a parede celular (Bierbaum & Sahl, 1985), o embaralhamento da distribuição habitual de lipídios entre as faces da bicamada, resultando em distúrbio das funções da membrana (Matsuzaki, 1999); e a danificação de alvos críticos intracelulares após a internalização do peptídeo, como sugere o exemplo do peptídeo pyrrhocoricin (Kragol et al., 2001). A principal hipótese para o seu mecanismo de ação envolve a capacidade de AMPs causarem o colapso da membrana, interagindo com as moléculas de lipídios na superfície da célula bacteriana (Epand & Vogel, 1999; Shai, 2002; Yeaman & Yount , 2003).

As membranas bacterianas são organizadas de tal forma que o lado exterior da bicamada é densamente povoado por lipídios carregados negativamente. Em contraste, a camada exterior das membranas de plantas e de animais é composta principalmente de lipídeos sem carga líquida, com a maioria dos lipídios apresentando sítios carregados negativamente segregados na face interior, de frente para o

citoplasma (Figura 11). As estruturas da composição da membrana bacteriana podem servir como um ponto de ancoragem para moléculas de carga positiva, como defensinas vegetais. Além disso, o potencial transmembrana de bactérias é geralmente elevado (De Samblanx et al., 1997; Brogden, 2005; Monk & Harding, 2005; Papo & Shai, 2005; Buscaglia et al., 2006). A presença de colesterol na membrana- alvo em geral reduz a atividade dos peptídeos antimicrobianos, devido ou à estabilização da bicamada lipídica ou a interações entre o colesterol e os peptídeos (Matsuzaki, 1999; Zasloff, 2002). De acordo com essa hipótese, os peptídeos catiônicos são atraídos eletrostaticamente por moléculas carregadas negativamente, tais como fosfolipídios aniônicos, lipopolissacarídeos (Gram-negativas) e ácidos teicóicos (Gram-positivas), os quais estão localizados assimetricamente na arquitetura da membrana (Pelegrini et al., 2011). Em suas membranas há também fosfolipídios carregados negativamente (lipídeos II, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol e cardiolipina) espalhados em ambos os folhetos da membrana (Carvalho & Gomes, 2009).

Peptídeo antimicrobiano

Interação hidrofóbica Interação eletrostática e hidrofóbica

fraca forte

Face externa

Face interna

Membrana plasmática multicelular animal Membrana citoplasmática bacteriana

Colesterol Fosfolipídeos neutros

Ácidos fosfolipídeos

Figura 11. Alvos membranares de peptídeos antimicrobianos de organismos multicelulares e as bases da especificidade. Adaptado de Zasloff (2002).

Quando atingem um limiar de concentração, peptídeos catiônicos acumulam na superfície da membrana. Parâmetros intrínsecos (capacidade dos peptídeos de se auto-montarem e oligomerizarem) e extrínsecos (composição de fosfolipídios de membrana, a fluidez da membrana e o tamanho do grupo terminal) influenciam na concentração de peptídeos, pois interferem no potencial de membrana, o qual é crítico

para determinar o limiar de concentração do peptídeo (Yeamn & Yount, 2003). Os seguintes três processos de formação de poros foram relatados para peptídeos antibacterianos de planta: o mecanismo “barrel-stave”, o poro toróide e o mecanismo de tapete (Epand & Vogel, 1999; Sitaram & Nagaraj, 1999; Shai, 2002; Yeamn & Yount, 2003), os quais podem ser verificados na Figura 12.

Embora a formação de canais iônicos, poros transmembrana e ruptura extensa de membranas leve eventualmente à lise das células microbianas, outras evidências sugerem que os peptídeos transitam dentro do citosol e atuam em alvos intracelulares (Hancock & Rozek, 2002; Patrzykat et al., 2002; Brogden, 2005). Essa teoria tem ganhado suporte (Wu et al., 1999; Xiong et al., 1999; Aerts et al., 2008) com evidências de que a ruptura da membrana por si só não é a causa primária da atividade antimicrobiana de muitos peptídeos catiônicos, mas sim a inibição da síntese de DNA, de RNA ou da proteína (Friedrich et al., 2000). Assim, a capacidade de peptídeos catiônicos em geral de permeabilizar as membranas citoplasmática pode ser um meio para atingir um alvo intracelular. Os resíduos carregados positivamente também podem interagir com os lipídios da membrana através de receptores específicos na superfície da célula (Sitaram & Nagaraj, 1999; Yeamn & Yount, 2003). Consequentemente, a ligação do peptídeo à membrana pode ativar vários caminhos que irão causar a morte celular. Alvos além da membrana externa, como autolisinas e

fosfolipases podem ser ativados por peptídeos antimicrobianos. Em Staphylococcus simulans, uma autolisina, N-acetylmuramoyl-L-alanina-amidase, que é inibida na parede celular dos extratos pela presença de ácidos lipoteicóico e teicurônico, é reativada na presença do peptídeo catiônico Pep5, o que pode explicar a lise das células tratadas (Bierbaum & Sahl, 1987).

Existem poucos exemplos que distinguem se a atividade da defensina vegetal é microbicida ou microbiostática. Wong et al. (2005c) demonstraram que a atividade de da defensina sesquin de P. vulgaris é bactericida nas concentrações de 70 e 140 mM. Curiosamente, desde que os primeiro testes antimicrobianos com defensinas vegetais foram realizados, uma diminuição da força da atividade antifúngica tem sido observada, cujo efeito parece depender se o meio de incubação é complementado com íons metálicos/cátions e especialmente cátions bivalentes, tais como Ca2+ e Mg2+ (Terras et al., 1992, 1993; Osborn et al., 1995; Segura et al., 1998; Ye & Ng, 2002; van der Weerden et al., 2008). Este fenômeno também foi observado com defensinas de insetos e mamíferos (Lehrer et al., 1983; Cociancich et al., 1993b) e parece ser um tema comum entre AMP, com poucas exceções (Tam et al., 2002). No entanto, outro mecanismo foi proposto pelo qual cátions interferem com a atividade antimicrobiana de um determinado AMP. Oard & Karki (2006) demonstraram que a inibição de uma β- purotionina por íons metálicos, tais como K+ e Mg2+, estava relacionada às mudanças estruturais impostas pelos íons. Em geral, na presença desses íons, a estrutura dos peptídeos torna-se mais rígida e, consequentemente, prejudica a interação com os lipídios de membrana.

3.3.6.3 Outros Papéis Biológicos para Defensinas Vegetais In Planta

Certos elementos apóiam um papel de defesa de defensinas vegetais, como sua expressão nas camadas de células periféricas de tecidos, sua indução por estresses bióticos e abióticos e a capacidade de conferir maior proteção contra patógenos em tecidos vegetativos de plantas transgênicas (Lay & Anderson, 2005). No entanto, as defensinas vegetais podem ter funções adicionais no crescimento e desenvolvimento das plantas, além do seu suposto papel de defesa contra patógenos. Dados de Stotz et al. (2009a) indicam que a repressão e a superexpressão da defensina Def2 de tomate reduz a viabilidade do pólen e a produção de sementes, mostrando também que o crescimento foi inicialmente retardado, com plantas menores e crescimento mais vertical.

A precisa função in vivo de defensinas de plantas ainda não está clara, atribuindo-se diferentes papéis a essas moléculas, especialmente na defesa vegetal (dos Santos et al., 2010). Sua atividade é caracterizada pela capacidade de inibir o crescimento de microorganismos in vitro (Thevissen et al., 1999; Carvalho et al., 2001; Wonga et al., 2006). No entanto, outras atividades biológicas in vitro têm sido propostas, incluindo a ação como um inibidor da síntese proteica (Méndez et al., 1996; Chen et al., 2004), como bloqueador de canais iônicos (Kushmerick et al., 1998; Spelbrink et al., 2004), como mediador de tolerância de zinco (Mirouze et al., 2006) e como inibidor de α-amilases (Bloch & Richardson, 1991; Pelegrini & Franco, 2005; Liu et al., 2006), regenerador dehidroascorbato (DHA) e monodehidroascorbato ao ácido ascórbico (AsA) (Huang et al., 2008), entre outras. As mais estudadas são descritas a seguir.

• Inibidores de α-amilase

Algumas defensinas vegetais têm inibido a α-amilase de insetos e de vertebrados (Bloch & Richardson, 1991; Osborn et al., 1995). Com base na capacidade de algumas defensinas de plantas na inibição de amilases intestinais de inseto, tem-se sugerido que defensinas interferem na digestão desses animais (Bloch & Richardson, 1991; Tom et al., 1994; Osborn et al., 1995; Carvalho & Gomes, 2009). No entanto, notavelmente, defensinas vegetais que inibem a α-amilase não parecem mostrar atividade antifúngica e vice-versa (Osborn et al., 1995). Dessa forma, as defensinas constituem uma das seis classes estruturais protéicas de inibidores de α- amilase (Richardson, 1990). Os primeiros exemplos foram três isoformas isoladas de Sorghum bicolor (L.) Moench (SIα1, SIα2 e SIα3) (Bloch & Richardson, 1991). Essas proteínas exerceram fortemente sua função no aparelho digestivo do intestino de gafanhotos e baratas. Posteriormente, foi visto que duas outras defensinas isoladas de cevada (BIα1 e BIα2) inibiram a atividade da α-amilase de Tenebrio molitor (Zhang et al., 1997a).

A base estrutural para essa inibição foi proposta a partir da comparação das estruturas de defensinas diferentes. A defensina VrD1, de Vigna radiata L. apresenta um longo loop entre as folhas-β2 e -β3, em comparação com defensinas que não possuem uma atividade enzimática de inibição, como VrD2 (Lin et al., 2007). As diferenças estruturais entre VrD1 e VrD2 residem nas regiões de loop, particularmente no circuito que liga folhas-β1 a α-hélice, e na alça que liga o folhas-β2 e -β3. Este resultado sugere fortemente que a carga e comprimento do loop são importantes para a atividade inibitória α -amilase (Lin et al., 2007). Como mencionado anteriormente, a constatação de que algumas defensinas podem inibir essa proteína e outras não,

implica que há especificidade envolvida na inibição. Na verdade, as diferenças nas estruturas tridimensionais de entrada do sítio catalítico em amilases de diferentes fontes revelam restrições estéricas que parecem ditar a atividade inibitória (Melo et al., 2002).

• Inibidores de canais iônicos

Kushmerick et al. (1998) foram os primeiros a descrever a inibição de canais de sódio voltagem-dependentes, em células GH3 de mamíferos por duas defensinas denominadas γ1- e γ2-zeathionin isoladas de grãos de milho. Estes peptídeos inibiram reversivelmente as correntes de sódio em um IC50 de 62 e 33 mM, respectivamente. Os autores então sugeriram que essas defensinas podem atuar na condutância do canal, reduzindo o número de canais abertos ou diminuindo o número de canais que se abrem durante a etapa de tensão. Eles também demonstraram que a corrente de potássio não foi alterada na presença do defensinas (Kushmerick et al. 1998). Isto é particularmente interessante, uma vez que existem semelhanças estruturais entre defensinas de plantas e toxinas de escorpião, sendo ambas perturbadoras de canais iônicos (Lay & Anderson, 2005). Também usando ‘whole-cell voltage clamps’ para gravar as correntes de cálcio em células tsA-201 que expressam os canais de cálcio tipo L, Spelbrink et al. (2004) demonstraram que MsDEF1 bloqueou quase 90% da corrente de cálcio através deste canal. Outras defensinas, como a MtDEF2 e a Rs- AFP2 não apresentam atividade bloqueadora de cálcio. Os autores propõem que a atividade de bloqueio pode ser devida à semelhança estrutural entre MsDEF1 e a proteína KP4 que é uma bloqueadora dos canais de cálcio voltagem-dependentes (Spelbrink et al., 2004).

• Inibidores de protease

Dois peptídeos que apresentaram homologia com defensinas de plantas foram isolados das sementes de Cassia fistula L., conhecida por suas propriedades inseticidas. Um deles, denominado 5459, foi mostrado como inibidor de tripsina com base em um ensaio espectrofotométrico utilizando N-benzoyl-D,L-arginine-p- nitroanilide. O outro peptídeo, designado 5144, não inibiu a tripsina. O peptídeo 5459 difere do 5144 por alguns resíduos de aminoácidos, onde a mudança de Thr25 para

Lys25 em 5459 foi determinante para a atividade inibitória de proteinase (Wijaya et al., 2000). Tem-se sido sugerido que esta atividade possa contribuir para a defesa das plantas contra os insetos por um mecanismo relacionado à digestão dos insetos (Molosov & Valeuva, 2008). Moléculas descritas, como Vulgarin (Wong & Ng, 2005a) e WCBAFP (Wong et al., 2006) têm resultado em resistência à digestão de tripsina,

embora a atividade inibitória contra tripsina não tenha sido testada e, portanto, essa resistência à protease possa ser uma indicação de atividade inibitória de protease. O mecanismo de inibição da protease ainda não está determinado, embora a Lys25 de 5459 possa estar envolvida na inibição da enzima. Um mecanismo semelhante de ação foi proposto para o peptídeo Cp tionina-I que se liga à tripsina de pâncreas bovino onde sua Lys11 interage com o bolso S1 da enzima, causando a sua inibição (Melo et al., 2002).

• Resposta a estresses abióticos

O papel de defensinas em resposta a estresses abióticos – como o sal, frio, seca, e metais pesados – não é bem compreendido (Bahramnejad et al., 2009). Dados limitados sobre o envolvimento de defensinas de plantas em resposta a essa categoria de estresses são encontrados na literatura. Exemplos se referem à PDF1.2 como altamente e constitutivamente expressa na halófita salina Thellungiella halophila (Taji et al., 2004). Uma proteína defensin-like de trigo também sofreu indução durante a aclimatação ao frio (Koike et al., 2002). A indução da expressão gênica de defensinas em plantas por estresses de seca também tem sido relatada (Yamada et al, 1997; Maitra & Cushman, 1998). A defensina flora Thi2.1 de Arabidopsis pode ser induzida por estresses abióticos causados pela ação do salicilato de dentro da via de SAR (Epple, 1997). Por último, Mirouze et al. (2006) demonstrou claramente que defensinas AhPDF1.1 de A. halleri são capazes de conferir tolerância a zinco em leveduras e plantas, acumulando o metal nas partes aéreas e oferecendo potencial para uso na fitorremediação.

3.4 Potencial para Aplicações Biotecnológicas

O papel das defensinas na defesa já é bem estabelecido e seu uso na agricultura e no desenvolvimento de fármacos tem sido proposto desde o seu descobrimento. Segundo Carvalho & Gomes (2009) dentre essas características estão atividades antimicrobianas, inseticidas e anti-parasitárias, que fazem desses peptídeos bons candidatos para engenharia proteômica e produção de plantas transgênicas agronomicamente importantes que possam combater patógenos e pestes, uma vez que as proteínas que codificam não são tóxicas a mamíferos ou a outras plantas. Além disso, tais proteínas são ativas contra vários fitopatógenos e podem trabalhar sinergeticamente com outros compostos antimicrobianos, conferindo maior resistência (Oh et al., 1999; Chen et al., 2006), ainda defensinas podem promover adaptações a

estresses abióticos (Koike et al., 2002; Do et al., 2004; Carvalho et al., 2006; Mirouze et al., 2006).

O uso de defensinas também oferece novas oportunidades terapêuticas. Segundo Carvalho & Gomes (2009) isso provém de algumas atividades como: amplo espectro antimicrobiano incluindo vírus, bactérias, fungos, protozoários e até células tumorais; atividade em baixas doses e rápida morte microbiana; sinergismo com outras defensinas e esquemas terapêuticos; habilidade de inativar endotoxinas e prevenir choque séptico; o improvável desenvolvimento de resistência (seu alvo primário é a membrana plasmática); geralmente exibem baixa toxicidade em células de mamíferos; algumas defensinas apresentam modulam a resposta imune inata em mamíferos, oferecendo novas oportunidades terapêuticas.

3.4.1 Superexpressão e Transgenia

Plantas transgênicas expressando compostos antimicrobianos têm o potencial de oferecer ampla resistência contra diversos patógenos, o que pode reduzir a dependência de pesticidas químicos. Vários genes de defensinas foram transformados com sucesso em tomate, tabaco, couve, arroz e mamão (Thomma et al., 2002; Lay & Anderson, 2005; Zhu et al., 2007; Carvalho & Gomes, 2009; Stotz et al., 2009a). A exemplo disso, a expressão constitutiva de uma defensina de rabanete claramente aumentou a resistência de plantas de tabaco contra o fungo Alternaria longipes patógeno de folha (Terras et al., 1995). Da mesma forma, defensinas de tomate levaram à resistência contra Alternaria solani (Parashina et al., 2000), enquanto a superexpressão de defensina WT1 de wasabi em arroz, batata e orquídea resultou em aumento da resistência contra Magnaporthe grisea, Erwinia carotovora e Botrytis cinerea (Lay & Anderson, 2005).

Canola (Brassica napus), constitutivamente expressando uma defensina de ervilha aumentou discretamente a resistência contra a canela-preta, doença causada por Leptosphaeria maculans (Wang et al., 1999), com níveis de fungos nas plantas transformadas reduzidos em cerca de seis vezes em comparação com as plantas não transformadas. A geração de tomate transgênico no qual o gene Cdef1 da defensina de pimenta era expresso de maneira constitutiva resultou em maior resistência contra Phytophthora infestans e Fusarium sp. (Zainal et al., 2009). Expressão da defensina Dm-AMP1 de dália em arroz inibiu diretamente os patógenos Magnaporthe oryzae e Rhizoctonia solani (Jha et al., 2009), enquanto em berinjela protegeu as plantas contra Botrytis cinerea e Verticillium albo-atrum (Turrini et al., 2004). A expressão desta ainda

em mamoeiro aumentou a resistência contra P. palmivora, aumento este associado com uma redução no crescimento de hifas deste patógeno nos sítios de infecção (Zhu et al., 2007). Outro estudo descreveu maior resistência da batata transgênica contra Verticillium dahliae por superexpressão de um gene de defensina em alfafa em casa de vegetação e em condições de campo (Gao et al., 2000). Mirouze et al. (2006), expressando um gene de defensina de Arabidopsis halleri ssp. Halleri (resistente a altas doses de zinco) em A. thaliana e S. cereviseae, verificou que o padrão de hiperacumulação de zinco se mantinha.

Não obstante, genes de defensina de animais foram expressas em várias plantas. Cecropinas A e B, expressas em arroz conferem proteção contra Magnaporthe grisea (Coca et al., 2004) e Xanthomonas oryzae (Sharma et al., 2000). Magainin expressa em tabaco conferiu proteção contra vários fungos e bactérias (De Gray et al. 2001), e Tachyplesin (uma defensina de caranguejo) expressa em batata foi eficaz contra infecção por E. carotovora (Allefs et al., 1996). As defensinas de inseto Heliomicin e Drosomycin, expressas em tabaco, conferiram proteção contra B. cinerea (Banzet et al., 2002), enquanto a Sarcotoxina da mosca da fruta, expressa em tabaco protegeu contra Pseudomonas syringae pv. tabaci e E. carotovora ssp. carotovora (Ohshima et al., 1999).

No entanto, apesar dos relatos publicados de expressão bem-sucedida de certas defensinas vegetais funcionais em plantas transgênicas, mas recentemente foi descoberto que algumas defensinas têm efeitos tóxicos quando expressas continuamente. Os efeitos podem incluir, por exemplo, redução do crescimento de células, diminuição da eficiência de regeneração, redução da fertilidade e morfologia anormal de plantas transgênicas regeneradas (Allan et al., 2008; Anderson et al., 2009; Stotz et al., 2009a). Os efeitos tóxicos podem variar dependendo do nível de expressão da defensina, especificidade tecidual de expressão e estágio de desenvolvimento da planta hospedeira. Anderson et al. (2009) modificaram uma "defensina quimérica" para reduzir ou eliminar um efeito tóxico de expressão da defensina em uma planta hospedeira transgênica, a partir da combinação da defensina NaD1 com um pró-domínio peptídico C-terminal (CTPP). Essas plantas não apresentaram o fenótipo anormal, sugerindo que a CTPP protegeu a planta da porção tóxica da molécula (Anderson et al., 2009).

Apesar de inúmeras plantas transgênicas expressarem AMPs que conferem diferentes graus de proteção contra as doenças, a maioria delas têm sido estudadas apenas in vitro, havendo poucos compostos testados em patossistemas de plantas, dos quais apenas alguns estão no mercado. De acordo com Montesinos (2007),

abordagens sintéticas para obter AMPs guiadas por métodos químicos combinatórios fornecem ferramentas poderosas para otimizar as moléculas derivadas de compostos naturais com atividade melhorada contra patógenos-alvo selecionados, incluindo a citotoxicidade diminuída e estabilidade a proteases aumentada. Contudo, Montesinos (2007) relata que a exploração do grande número de AMPs como ingredientes ativos de pesticidas ainda não foi atingida. Desse modo, as futuras áreas de interesse consistem no desenvolvimento de compostos menos tóxicos e mais estáveis, bem como na diminuição dos custos de produção, melhorando os processos biotecnológicos e de síntese, utilizando sistemas microbianos ou cultivos transgênicos como biofábricas de plantas (Montesinos, 2007).

3.4.2 Possíveis Aplicações Terapêuticas

Em face da crescente resistência aos antibióticos em microorganismos patogênicos, AMPs têm chamado significativa atenção científica como uma nova classe de candidatos para uso em terapêutica antimicrobiana, assim como os medicamentos antibacterianos e moduladores da imunidade inata (Koczulla & Bals, 2003; Finlay & Hancock, 2004; Hamilton-Miller, 2004; Levy & Marshall, 2004). Embora peptídeos antimicrobianos exibam potência relativamente baixa contra alvos bacterianos suscetíveis em relação aos compostos antibióticos convencionais de baixo peso molecular, eles possuem diversas vantagens compensatórias incluindo rápida morte do alvo, ampla variedade de atividades, baixa toxicidade e desenvolvimento mínimo de resistência em organismos-alvo (Hancock, 2001; Yeaman & Yount, 2003).

Em humanos, peptídeos antimicrobianos, liberados das células circulantes ou induzidos no epitélio podem alertar o sistema imune. As β-defensinas epiteliais, são agentes quimiotáticos, com baixa afinidade relativa (10-6 a 10-5 M) se comparadas com concentrações ótimas de fatores quimiotáticos clássicos (10-8 a 10-7 M) (Zasloff, 2002). No entanto, com base na estrutura tridimensional, em geral existe uma relação mais estreita entre β-defensinas de plantas, insetos e mamíferos do que entre α- e β- defensinas de mamíferos (Thomma et al., 2002). Além de homologias estruturais entre defensinas de diferentes reinos eucarióticos, também parece existir homologia funcional entre eles. Por exemplo, a superexpressão de defensinas de inseto (Banzet et al., 2002; Langen et al., 2006) ou mamíferos (Zhang et al., 2000; Aerts et al., 2007b) em plantas pode contribuir para o aumento da resistência destas a doenças fúngicas, de modo comparável ao obtido por superexpressão de defensinas vegetais (Terras et al., 1995; Wang et al., 1999; Gao et al., 2000; Kanzaki et al., 2002; Park et al., 2002; Li

et al., 2003; Zhu et al., 2007). De modo contrário, algumas dessas moléculas de origem vegetal apresentam atividade contra fungos patogênicos a seres humanos, como Candida albicans (Thevissen et al., 1999; 2000), porém, nenhuma se mostrou tóxica em culturas de células humanas ou vegetais (Thevissen et al., 2004).

Todos os resultados indicam a possibilidade de aplicações médicas envolvendo defensinas de plantas para tratar doenças humanas (Stotz et al., 2009b). Segundo Carvalho & Gomes (2009), a atividade biológica de defensinas em células de mamíferos foi inicialmente testada pela determinação da viabilidade das células endoteliais da veia umbilical, de fibroblastos de músculos e de pele humana. Estes peptídeos também foram testados por sua capacidade de promover a lise de eritrócitos. Nenhum dos tipos celulares testados demonstrou viabilidade reduzida quando incubados com as defensinas Rs-AFP1 e Rs-AFP2 em concentrações de 500 µg/mL. Além disso, hemólise de eritrócitos não foi observada na mesma concentração (Terras et al., 1992). Outras defensinas também possuem atividade mitogênica, incluindo RBAFP e PBAFP (Ye & Ng, 2001) e RBAFP (Ye & Ng, 2002).

• Aplicação Antifúngica

Desvendar o modo de ação de peptídeos antimicrobianos antifúngica, como defensinas, é de grande interesse na busca de novos antifúngicos terapêuticos, uma vez que o controle de patógenos fúngicos constitui um problema desafiador para a medicina (Aerts et al., 2008). Nos últimos 20 anos, a incidência de infecções fúngicas em seres humanos aumentou consideravelmente e as causas mais comuns destas infecções são Candida spp. e fungos filamentosos como Aspergillus spp. (Brakhage, 2005; Mavor et al., 2005). Até o momento, o principal recurso clínico para lutar contra infecções fúngicas restringe-se ao uso de antimicóticos (Francois et al., 2005). No entanto, atualmente, alguns oferecem apenas um espectro de atividade limitada (o que favorece o desenvolvimento de resistência), apresenta interações medicamentosas nocivas, ou estão associadas a efeitos colaterais graves, como a alta citotoxicidade (Francois et al., 2005). Assim, a busca de novas terapias antifúngicas é fortemente estimulada, sendo a utilização de peptídeos antifúngicos uma alternativa promissora.

Diversos estudos que abordam o desempenho in vitro de defensinas em modelos contra infecções fúngicas têm se mostrado promissores (ver Tabela 3).

Tabela 3. Defensinas vegetais com atividade inibitória contra fungos patogênicos. Dados gerados a partir das proteínas disponíveis no PhytAMP Database (Hammami, et al., 2009).

Nome da Organismo Organismos alvos e IC (µg/mL) Referências defensina vegetal 50

MA;MA+ (MA+ = Meio A com 1 mM CaCl2 e 50 mM KCl) Botrytis cinerea (25; >100 µg/mL), Cladosporium sphaerospermum (0,5; 12 µg/mL), Fusarium culmorum Aesculus (12; >100 µg/mL), Leptosphaeria maculans (0,5; 6 Osborn et Ah-AMP1 hippocastanum µg/mL), Penicillium digitatum (6; 25 al.,1995 µg/mL), Trichoderma viride (>100; >100 µg/mL), Septoria tritiei (0,5; 1,5 µg/mL), Verticilium albo-atrum (6; >100 µg/mL).

Alternaria brassicola (10 µg/mL), Botrytis cinerea (3,90 Arabidopsis µg/mL), Fusarium culmorum (3 µg/mL), Fusarium Terras et al., At-AFP1 thaliana oxysporum (3µg/mL), Pyricularia oryzae (0,25 1993 µg/mL), Verticiliium dahliae (1,50 µg/mL).

Kragh et al., AX1 e AX2 Beta vulgaris Cercospora beticola 1995

Capsicum Meyer et al., J1-1 e J1-2 Fusarium oxysporum e Botrytis cinerea. annuum 1996

Nicotiana Lay et al., NaD1 Fusarium oxysporum e Botrytis cinerea. tabacum 2003a

PhD1 e Lay et al., Petunia hybrida Fusarium oxysporum e Botrytis cinerea. PhD2 2003a

BD/ BD+ (BD+: meio batata-dextrose com 1 mM CaCl2) Aspergillus niger (12,1; 7,4 µg/mL), Aspergillus Almeida et versicolor (<5,0; 6,0 µg/mL), Fusarium al., 2000; moniliforme (21,7; 33,2 µg/mL), Fusarium Psd1 Pisum sativum 2001 oxysporum (>100; 100 µg/mL), Fusarium solani (12,1;

79,2 µg/mL), Neurospora crassa (0,04; 0,05 µg/mL), Saccharomyces cerevisae (>100 µg/mL; ND), Trichophyton mentagrophytes (>100 µg/mL; ND).

BD/ BD+ (BD+: meio batata-dextrose com 1 mM CaCl2) Aspergillus niger (10,2; 7,8 µg/mL), Aspergillus versicolor (0,34; 5,9 µg/mL), Fusarium moniliforme (10,0; 25,0 µg/mL), Fusarium Almeida et Psd2 Pisum sativum oxysporum (>100; >100 µg/mL), Fusarium solani (8,5; al., 2000 5,0 µg/mL), Neurospora crassa (<0,5; <0,5 µg/mL),Saccharomyces cerevisae (>100 µg/mL; ND), Trichophyton mentagrophytes (<100 µg/mL; ND).

Alternaria brassicola (15 µg/mL), Botrytis cinerea (8 µg/mL), Fusarium culmorum (5 µg/mL), Fusarium Terras et al, Rs-AFP1 Raphanus sativus oxysporum (30 µg/mL), Pyricularia oryzae (0,3 µg/mL), 1992 Verticiliium dahliae (5 µg/mL).

Alternaria brassicola (2 µg/mL), Botrytis cinerea (2 µg/mL), Fusarium culmorum (2 µg/mL), Fusarium Terras et al., Rs-AFP2 Raphanus sativus oxysporum (2 µg/mL), Pyricularia oryzae (0,4 1992 µg/mL), Verticiliium dahliae (1,5 µg/mL).

Alternaria brassicola (4,5 µg/mL), Botrytis cinerea (3,5 µg/mL), Fusarium culmorum (2,3 µg/mL), Fusarium Terras et al., Sa-AFP2 Sinapis alba oxysporum (2.3 µg/mL), Pyricularia oryzae (0,3 1992 µg/mL),Verticiliium dahliae (1,2 µg/mL).

Chen et al., VrD1 Vigna radiata Rhizoctonia solani. 2004

Ainda, a defensina Phaseococcin, presente nas sementes de Phaseolus coccineus L., suprimiu o crescimento micelial de numerosos fungos, incluindo B. cinerea, Coprinus comatus, F. oxysporum, Mycosphaerella arachidicola, Physalospora 16piricola e Rhizoctonia solani (Ngai & Ng, 2005). A defensina de Capsicum chinense, inibiu a viabilidade (70-80% de inibição) de C. albicans (Anaya-López et al., 2006). Outras defensinas, Sesquin, isolada a partir de Vigna sesquipedalis e Lunatusin, de Phaseolus lunatus, exerceram ação antifúngica sobre B. cinerea, F. oxysporum e M. arachidicola (Wong & Ng, 2005b;c). Assim, de acordo com Francois et al. (2005), desvendar o modo de ação será crucial para o desenho racional de novas variantes de peptídeos com atividades antifúngicas melhoradas ou especificidades alteradas de acordo com o patógeno-alvo, em comparação aos antimicóticos atuais.

• Aplicação Antimicrobiana

Peptídeos antimicrobianos são reconhecidos como uma possível fonte de produtos farmacêuticos para o tratamento de infecções bacterianas resistentes aos antibióticos ou choque séptico (Hancock & Patrzykat, 2002; Finlay & Hancock, 2004), uma vez que infecções por bactérias resistentes a multidrogas estão associadas ao aumento da mortalidade e morbidade em pacientes (Fischbach & Walsh, 2009), sendo emergencial a descoberta de novas drogas antibacterianas. Estudos para avaliar os mecanismos de atividade de peptídeos naturais e peptídeos congêneres em sistemas de membranas modelo, combinados com estudos com microorganismos, têm ajudado a identificar os parâmetros que são necessários para a atividade ideal dos peptídeos Estes, de acordo com Brodgen (2005) se referem a: tamanho; sequência; carga; conformação e estrutura; hidrofobicidade e anfipaticidade, e podem variar de defensina para defensina. Algums exemplos estão dispostos na Tabela 4.

Tabela 4. Defensinas vegetais com atividade inibitória contra bactérias patogênicas. Dados gerados a partir das proteínas disponíveis no PhytAMP Database (Hammami, et al., 2009).

Nome da Organismo Organismos alvos Referências defensina vegetal Aesculus Osborn et al., Ah-AMP1 Gram+: Bacillus subtilis (IC = 100µg/mL). hippocastanum 50 1995 Gram+: Staphylococcus aureus (MIC=128 µg/mL)/ Vigna Franco et al., Cp-thionin-2 Gram-: Escherichia coli (MIC=64 µg/mL) unguiculata 2006 e Pseudomonas syringae (MIC=42 µg/mL). Gram+: Bacillus subtilis, Enterococcus hirae/ Gram-: Zhang & Lewis, Fabatin-1 Vicia faba Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa. 1997 Gram+: Bacillus subtilis, Enterococcus hirae/ Gram-: Zhang & Lewis, Fabatin-2 Vicia faba Escherichia coli,Pseudomonas aeruginosa. 1997 Chen et al., VrD1 Vigna radiata Gram-: Escherichia coli. 2004 Phaseolus Gram+: Bacillus megaterium, Bacillus subtilis/ Gram-: Wong & Ng, Lunatusin lunatus Proteus vulgaris e Mycobacterium phlei 2005b

• Aplicação Antiviral

Dentre a enorme variedade de vírus que podem ser patogênicos ao homem, o mais estudado com relação à atividade de peptídeos antimicrobianos é o vírus da imunodeficiência humana (HIV). A propagação da AIDS no mundo estimulou um grande número de pesquisas em busca de produtos anti-HIV altamente eficazes (Hallock et al., 2000). Em humanos, a secreção de defensinas pelas células T CD8+ de indivíduos HIV-não-progressores (infectados pelo HIV, mas que não apresentam os sinais, sintomas e os marcadores laboratoriais da AIDS) vêm se mostrando importante na defesa antiviral desses pacientes. (Zhang et al., 2002).

O mecanismo de ação dessas moléculas é descrito a seguir de acordo com Klotman & Chang (2006). Em resposta a uma infecção viral, as células infectadas induzem a produção defensinas, quimiocinas e citocinas para controlar diretamente a infecção viral e recrutar neutrófilos para o local da infecção. Nestes sítios, as defensinas exercem dupla função na atividade antiviral: a primeira envolve a interação direta com os envelopes virais, possivelmente de um modo semelhante à atividade antibacteriana de defensinas, enquanto a outra se dá indiretamente através de interações com as células-alvo potenciais. Estas interacções de células-defensina são complexas e, possivelmente, mediadas por interações com glicoproteínas da superfície celular e/ou interferindo com células sinalizadoras necessárias para a replicação viral. Tal inibição vem sendo verificada para diversos tipos de vírus animais, como HIV-1 (Quinones-Mateu, et al., 2003; Sun et al., 2005), adenovirus (Bastian & Schafer, 1991), influenza (Leikina, et al, 2005) e PIV-3 (Grubor et al., 2004).

Nesse sentido, as defensinas vegetais RBAFP, PBAFP (Ye & Ng, 2001), RBAFP (Ye & Ng, 2002), Vulgarinin (Wong & Ng, 2005a) e Sesquin (Wong & Ng, 2005c) apresentaram efeito inibitório sobre a transcriptase reversa de HIV-1 in vitro. Da mesma forma, que Phaseococcin (Ngai & Ng, 2005) e Lunatusin (Wong & Ng, 2005b). No entanto, resta demonstrar se tais defensinas são capazes de inibir a replicação viral in vivo.

• Atividade Antiparasitária

Infecções causadas por protozoários e helmintos causam morte, sofrimento e perdas econômicas consideráveis especialmente nas nações em desenvolvimento. Estima-se que um sexto da população mundial sofra de uma ou mais doenças tropicais negligenciadas (Word Health Organization, 2009). Numa tentativa de desenvolver novas terapias para essas necessidades, estudos com AMPs vêm sendo

desenvolvidos. Uma mistura de concentração equimolar de tioninas de trigo tipo α -1, α -2 e β (Triticum aestivum L.) com a defensina PTH1 da batata (Solanum tuberosum) foram testados contra Leishmania donovani, causador da leishmaniose visceral em humanos, com bons resultados, observando-se que a defensina exerceu sua atividade em concentrações superiores a tioninas com IC50 = 33,4 µM e LC50 = 5.9 µM (Berrocal-Lobo et al., 2009).

• Aplicação Antitumoral

A quimioterapia é um dos tratamentos de escolha para pacientes em estado avançado de câncer, doença que continua sendo um importante fator de mortalidade e morbidade em todo o mundo (Espinosa et al., 2003). No entanto, este tratamento está associado a efeitos colaterais deletérios causados pelos danos às células e tecidos saudáveis induzidos pela droga (Buzaid & Atkins, 2001). As células cancerosas em proliferação lenta são refratárias ao efeito citotóxico de drogas que interferem na síntese de DNA (Naumov et al., 2003). Ainda, aumento da expressão de enzimas de desintoxicação e/ou transportadores de drogas, interações alteradas entre a droga e seu alvo, aumento da capacidade de reparo de danos no DNA e defeitos na via de apoptose afetam a sensibilidade às drogas quimioterápicas (Gatti & Zunino, 2005). O desenvolvimento de uma nova classe de drogas anticâncer que não exerçam toxicidade para as células saudáveis e que não sejam afetadas por mecanismos comuns de resistência seria um grande avanço na quimioterapia do câncer. Neste sentido peptídeos bioativos, incluindo peptídeos antimicrobianos (AMPs) apresentam- se como candidatos promissores para o tratamento antitumoral.

Estudos mostram que a defensina vegetal PSD1 pode interagir com a ciclina F, inibindo o ciclo celular do câncer humano (Lobo et al., 2007). Essa descoberta abre novas possibilidades para abordagens terapêuticas para o tratamento de alguns tipos de câncer humanos que mais expressam alguns tipos de ciclinas (Kong et al., 2000; Yasuda et al., 2002; Lobo et al., 2007). O efeito inibitório de defensinas de plantas em direção a certos tipos de células humanas de câncer tem sido descrito. Estudos com Vulgarinin demonstraram capacidade de inibir a proliferação de leucemia L1210 e da linhagem de células M1 em cerca de 35% e 80%, respectivamente, ou ainda em cerca de 80% na linhagem celular MCF-7 de câncer de mama (Wong & Ng, 2005c). A defensina de C. chinense inibiu a viabilidade da linhagem celular de tumor humano HeLa em cerca de 80% (Anaya-López et al., 2006), enquanto Limyin inibiu a proliferação das linhagens de células tumorais Bel-7402 (hepatoma de fígado humano) e SHSY5Y (neuroblastoma humano) com IC50 de 43 e 28 mM, respectivamente (Wang et al., 2009). Ainda foi mostrado que Phaseococcin, inibiu a proliferação de linhagens

de células de leucemia HL60 e L1210 (Ngai & Ng, 2005), enquanto Lunatusin, inibiu a proliferação da linhagem celular de câncer de mama MCF-7 (Wong & Ng, 2005b).

Seu mecanismo de ação provavelmente reside no fato de as células cancerígenas apresentarem alta expressão de moléculas aniônicas, tais como ácido siálico, fosfatidilserina e mucinas O-glicosiladas na membrana externa, características que as assemelham a microorganismos, pelo caráter negativo maior do que nas células normais (Yoon et al., 1996; Dobrzynska et al., 2005; Papo & Shai, 2005). Estas cargas podem fornecer um encaixe para moléculas com carga oposta, como defensinas, atraindo-as para a membrana onde podem exercer seus efeitos tóxicos. Aparentemente, o potencial celular é crítico para a formação de canais peptídicos nas membranas das células tumorais, podendo determinar a morte seletiva destas por AMPs (Cruciani et al., 1991).

3.4.3 Mecanismos de Resistência

Ao contrário dos antibióticos convencionais, tais como a penicilina, a aquisição de resistência por uma cepa microbiana sensíveis contra peptídeos antimicrobianos é bastante difícil (Zasloff, 2002). No entanto, microorganismos possuem de estratégias de resistência para contornar a morte pelo peptídeo antimicrobiano (Brogden, 2005). De acordo com este último autor, estas estratégias bacterianas incluem mecanismos de ancoragem do peptídeo antimicrobiano, a inserção de peptídeos e permeabilidade da membrana através de alteração das cargas total das superfícies, alterações nas proteínas da membrana, alterações no papel dos transportadores e produção de enzimas proteolíticas.

A exemplo disso, Peschel et al. (1999) verificou que Staphylococcus aureus transporta D-alanina do citoplasma para a superfície juntamente com ácido teicóicos, reduzindo reduzir a carga líquida negativa através da introdução de grupos básicos amino. Por outro lado, S. aureus também modifica suas membranas com L-lisina, aumentando a carga positiva líquida (Peschel et al., 2001; Kristian et al., 2003). Em espécies de Salmonella, o grupo fosfato ligado à glucosamina I do lipídeo A é substituído por um resíduo fósforo-etanol-amino com um grupo amino livre, onde uma aminoarabinose é adicionada ao fosfato negativamente carregado em ligação éster ao carbono-4 de glucosamina II do Lipid A (Groisman et al., 1992). Já a cápsula polissacarídica de Klebsiella pneumonie, limita a interação de peptídeos antimicrobianos com os alvos de membrana, sendo que mutantes acapsulados apresentam-se mais susceptíveis à morte mediada por AMPs (Campos et al., 2004).

Em algumas bactérias Gram-negativas, por exemplo, Yersinia enterocolitica, peptídeos antimicrobianos alteram a produção de proteínas de membrana externa (Visser et al., 1996). Outros mecanismos envolvem alteração dos padrões de expressão da superfamília de transportadores ATP-binding cassette, que importam peptídeos antimicrobianos (Parra-Lopez et al., 1993; Groisman, 1994) enquanto a superfamíla resistance-nodulation-cell division exporta peptídeos (Nikaido, 1996; Shafer et al., 1998). As bactérias ainda produzem enzimas proteolíticas que podem degradar peptídeos antimicrobianos levando à sua resistência (Resnick et al., 1991; Groisman, 1994; Roland et al., 1994; Belas et al., 2004). Por exemplo, LL-37 é clivada e inativada por uma metaloproteinase de S. aureus chamada Aureolysin (Sieprawska- Lupa et al., 2004).

Estudos publicados sobre resistência adquirida contra peptídeos antimicrobianos, em geral referem-se a genes identificados que, quando interrompidos, tornam organismos sensíveis mais suscetíveis a um peptídeo antimicrobiano especial, sugerindo-se que esses genes geralmente tenham um papel na virulência (Zasloff, 2002). Em Saccharomyces cerevisiae, o gene Ipt1p codifica uma innositol-fosfotransferase, uma enzima envolvida na etapa final na síntese de esfingolipídeos, como manosil-diinositol-fosforil-ceramida (Dickson et al., 1997;. Thevissen et al., 2000b). Cepas carregando um alelo IPT1 não-funcional se ligam com intensidade significativamente menor a DmAMP1 em comparação com linhagens selvagens, sendo altamente resistentes à permeabilização da membrana, com inibição de crescimento mediada pela DmAMP1 (Thevissen et al 2000b). Além disso, a defensina DmAMP1 interage preferencialmente com o manosil-diinositol-fosforil- ceramida que é necessário para a permeabilização da membrana plasmática fúngica. A eliminação de IPT1 não só leva à resistência por Dm-AMP1, mas também a um aumento da resistência ao antibiótico Cicloheximida e Syringomycin E, um antifúngico da bactéria Pseudomonas syringae (Leppert et al., 1990; Stock et al., 2000).

Micróbios não têm sido evolutivamente mais bem sucedidos na resistência a atividade de peptídeos antimicrobianos porque o alvo primário de destes peptídeos é a membrana bacteriana. Para burlá-la um micróbio teria de redesenhar sua membrana, alterando a composição ou organização de seus lipídios, provavelmente uma solução muito cara para a maioria das espécies microbianas (Brogden, 2005). Por outro lado, a destruição do peptídeo antimicrobiano possui vários problemas, uma vez que a maioria dos peptídeos é criada a partir de sequências de aminoácidos que não apresentam epítopos únicos que poderiam servir como o sítio de reconhecimento de uma protease, necessários para destruição seletiva do antibiótico na presença de

constituintes protéicos celulares (Zasloff, 2002). Além disso, organismos multicelulares atacam micróbios com múltiplos peptídeos de diferentes classes estruturais, portanto, a destruição de um peptídeo pode não bastar para repelir o ataque letal. Talvez os genes de virulência que as bactérias expressam e que afetam a susceptibilidade para peptídeos antimicrobianos representem as melhores defesas às quais a maioria dos micróbios pode recorrer sem sofrer uma perda de viabilidade (Zasloff, 2002).

Dessa forma, o crescente problema da resistência aos antibióticos convencionais e a necessidade de novos antibióticos tem estimulado o interesse no desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos para terapêutica humana. A maioria dos esforços farmacêuticos tem se dedicado ao desenvolvimento de agentes de aplicação tópica, tais como o análogo de Magainin, ou de Pexiganan, em grande parte por causa da relativa segurança da terapia tópica e a incerteza que cerca a toxicologia de longo prazo de qualquer nova classe de medicamentos administrados por via sistêmica (Zasloff, 2001). Exemplos adicionais de drogas em desenvolvimento, são apresentados por Hancock & Chapple (1999), Zasloff (2002) e Gordon et al. (2005). Os principais obstáculos que impedem o desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos como terapia sistêmica incluem o pouco conhecimento acerca de muitos dos peptídeos naturais, que embora ativos in vitro, são eficazes em modelos animais de infecção apenas em doses muito elevadas, muitas vezes perto as doses tóxicas do peptídeo, como no caso de Magainin (Darveau et al., 1991), refletindo uma margem de segurança inaceitável. Dessa forma, existem algumas questões que precisarão de estudos amplos, bem como de melhoria das tecnologias disponíveis para o uso de proteínas como drogas terapêuticas, muitas delas ainda em desenvolvimento (Frokjaer & Otzen, 2005).

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Obtenção do Material Vegetal e Extração de DNA Exemplares E. hyssopifolia foram obtidos em espaços abertos no campus da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), no município de Recife, Pernambuco. Um espécime exemplar da população foi identificado taxonomista Prof. Dr. Marccus Vinícius Alves, do Laboratório de Morfo-Taxonomia Vegetal, da mesma instituição. Uma exsicata foi depositada no herbário da UFPE sob o número de registro 59.135.

Folhas jovens de E. hyssopifolia foram coletadas e armazenadas em ultra- freezer (-80°C). A extração do DNA genômico foi realizada conforme o protocolo descrito por Weising et al. (2004), com modificações no que se refere à quantidade de

material vegetal (aproximadamente 1 g de folhas). Em seguida, esse pellet foi tratado com uma solução de precipitação de polissacarídeos e contaminantes, (10 mM Tris- HCl, pH 8,0; 25 mM NaCl), conforme descrito por Michaels et al. (1994). Procedeu-se, então, o tratamento com RNAse A (10 μg/mL), seguida de quantificação do DNA em gel de agarose 1,2% (contendo brometo de etídio) por comparação com DNA lambda (λ- DNA), tendo diferentes concentrações (20, 50 e 100 ηg/μL) como referencial.

4.2 Obtenção dos Fragmentos, Clonagem e Sequenciamento Para amplificação dos amplicon relacionados a defensinas em E. hyssopifolia foram usados os primers Forward: 5’-TCCATGGCTCGCTCTGTGTCTT-3, e Reverse 5’- TGAAGTTTTAACAGTGTTTGGTGCACAAG-3', desenhados por Padovan et al. (2010a). As reações de amplificação seguiram o descrito pelo autor, mas reduzindo a temperatura de anelamento para diminuir a especificidade. A clonagem dos fragmentos foi realizada em pGEM-T Easy vector System I (Promega, Cat. A1360) como recomendado pelo fabricante, usando as células competentes MAX Efficiency® DH10B™ Competent Cells (Invitrogen). Os insertos clonados foram isolados, reamplificados e submetidos à reação de sequenciamento usando a técnica BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequence Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA-USA) no sequenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA-USA).

4.3 Análise de Bioinformática das Sequências

O alinhamento múltiplo de sequências de nucleotídeos de cada clone foi realizado no programa ClustalW (Larkin et al., 2007). Estes alinhamentos foram triados de modo a gerar sequências consensos, a fim de obter o máximo de comprimento em pares de bases com qualidade. A sequência de nucleotídeos trimada teve a estrutura do gene analisada e traduzida para aminoácidos pelo programa fGenesh (HMM-based gene structure prediction) (http://linux1.softberry.com/berry.phtml). Após essa etapa, as sequências de nucleotídeos foram confrontadas com sequências disponíveis em bancos de dados usando os diversos algoritmos da plataforma BlastN e tBlastX do NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e contra o genoma das espécies do core Fabid disponíveis no Phytozome v7.0 (http://www.phytozome.net/).

A partir destas ferramentas, as sequências genômicas e de EST com maior similaridade foram comparadas às sequências de DNA e de E. hyssopifolia. Também foram gerados dendrogramas de ESTs, pró-peptídeos e peptídeos maduros usando o

programa MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011), empregando a metodologia de Neighboog-Joining, com parâmetro p-distance, e bootstrap de 1000 replicações. Neste programa foi calculada também a distância evolutiva entre as sequências para verificar a presença de uma pressão evolutiva divergente (seleção positiva) ou conservante (seleção negativa) ou nula (neutralizante) nas sequências estudadas. A diferença entre as substituições sinônimas (dS) e não sinônimas (dN) nas sequências codificadoras do pró-peptídeo e dos peptídeos maduros foi analisada por meio do Z- test que testa a hipótese de neutralidade (dS=dN), seleção positiva (dN>dS) ou negativa (dN

A sequência de aminoácidos obtida também foi submetida ao programa de predição do sítio de clivagem de peptídeo sinal Philius Transmembrane Prediction Server (http://www.yeastrc.org/philius/pages/philius/runPhilius.jsp) (Reynolds et al., 2008). A formação das pontes dissulfídicas foi identificada através do programa DISULFIND (Ceroni et al., 2006) e o alinhamento múltiplo de proteínas foi feito no programa ClustalX2 (Larkin et al., 2007) e ESPript 2.2 (Gouet et al., 1999), sendo o primeiro para distinção dos aminoácidos carregados e hidrofóbicos, enquanto o segundo visou à predição da estrutura secundária das proteínas alinhadas. Análises comparativas das propriedades das proteínas, com e sem o peptídeo sinal, foram feitas a partir dos programas APD2: Antimicrobial Peptide Predictor (Wang & Wang, 2004) e ProtParam (Gasteiger et al., 2005). Já a carga estimada da molécula sob uma variação de pH foi predita pela ferramenta Protein Calculator v3.3 (Putnam, 2008). Informações acerca do potencial eletrostático e da acessibilidade da molécula foram obtidas através do programa DeepView v4.04 (Guex & Peitsch, 1997), empregando o método de Poisson-Boltzmannn para cálculo do potencial eletrostático submetendo 4 como constante dielétrica da proteína e 80 para o solvente (água). No Jmol Viewer 12.0 (http://jmol.sourceforge.net/) a molécula foi editada para visualização diferencial da estrutura da molécula e coloração dos resíduos de aminoácidos.

No banco de dados do PDB (RCSB Protein Databank) (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), um BlastP da sequência do peptídeo maduro foi efetuado de modo a se escolher as estruturas de sequências de defensinas mais similares para servirem de modelo para modelagem tridimensional da proteína. A estrutura tridimensional dos peptídeos candidatos selecionados foi solucionada através de modelagem comparativa, usando o programa Modeller 9v7 (Eswar et al., 2008), enquanto a alinhamento multiplo entre as estruturas modelos ocorreu por meio do programa VMD 1.9 (Humphrey et al., 1996). A avaliação da qualidade foi feita a

partir da ferramenta Protein Structure & Model Assessment da plataforma SWISS- MODEL Workspace (http://swissmodel.expasy.org/) (Arnold et al., 2006) a partir de dados de QMEAN6 global score (Benkert et al., 2009) e Z-score (Benkert et al., 2011). Enquanto fazendo uso do PROCHECK v.3.5.4 (Laskowski et al., 1993), foram obtidos o gráfico de Ramachandran da estrutura e seu G-factor (Engh & Huber, 1991).

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análises das Sequências de Nucleotídeos

Através do uso da PCR heteróloga, usando primers desenhados para a EST TC147 de P. vulgaris, foi possível amplificar uma região genômica compatível com uma defensina em E. hyssopifolia (daqui em diante chamada Dehys), exibindo 124 nucleotídeos a mais que a de P. Vulgaris. Usando o programa fGenesh, foi possível descrever a organização da região genômica amplificada (Figura 13). Como esperado, a sequência apresentou dois éxons e um íntron. Este último foi responsável pelos 124 pb adicionais, uma vez que ESTs representam apenas a região codificante de uma proteína. A localização do íntron, no interior da sequência do peptídeo-sinal é consistente com o descrito para outras defensinas obtidas de sequências genômicas, como S. officinarum (Padovan et al., 2009), V. unguiculata (Pelegrini et al., 2008b), Nicotiana megalosiphon (Portieles et al., 2010) e Stellaria media (Slavokhotova et al., 2011).

A região codificante do gene Dehys foi alinhada contra o GenBank (NCBI), o que revelou similaridades com algumas sequências de EST de V. unguiculata e P. vulgaris de 98 e 93%, respectivamente, correspondentes à sequência DEF_VIGUN obtida por Padovan et al. (2010a), e à sequência empregada no desenho do primers (ver alinhamento na Figura 14). Dados similares foram encontrados para Stellaria media, que obteve 94% de identidade com outras sequências de defensinas vegetais (Slavokhotova et al., 2011). O domínio conservado (CDS) de Dehys ainda apresentou elevada similaridade com regiões codificantes de outros membros da família Fabaceae, como 93% para um inibidor de protease de Glycine max (gi|255627362), ainda maior do que o encontrado por Padovan et al. (2010a) para V. unguiculata. Dado interessante, uma vez que a espécie em estudo, embora pertencente ao clado Fabid, é bem mais distante. Para membros da família Euphorbiaceae, a sequência também mostrou similaridade, no entanto, todas abaixo de 80%, a exemplo da sequência codificante das proteínas: cassava4.1_020555m.g de Manihot esculenta (sem id no GI) com 80%, e as “proteínas de baixo peso molecular ricas em cisteína” de Jatropha

curcas (gi|223469636) e de Ricinus communis (gi|255545389) com 79% e 75% de similaridade, respectivamente. Esta similaridade pode ser considerada moderada se comparada às obtidas para alguns membros de Fabaceae. O dendrograma apresentado na Figura 14 expressa bem essa relação, exibindo altos valores de bootstrap (acima de 80%) nos ramos que se referem a E. hyssopifolia e as fabáceas V. unguiculata, P. vulgaris e G. max. Entre as demais euforbiáceas, J. curcas e R. communis, verifica-se valores bem mais baixos, com bootstrap de pouco mais de 50%.

Figura 13. Sequência nucleotídica com os genes/éxons preditos e sequências de aminoácidos da proteína putativa Dehys, produzida a partir de dados gerados no fGenesh e Philius. Sequências omitidas por questões legais de propriedade intelectual.

Tal padrão de similaridade provavelmente deveu-se ao menor número de defensinas identificadas nessa família e pela quantidade e diversidade que tais moléculas apresentam dentro das diversas espécies vegetais. Embora projetos de sequenciamento de genoma e transcriptoma na família tenham sido desenvolvidos, levando a uma rápida expansão do conhecimento acerca das proteínas (Grabowski et al. 2007), nesse ponto de vista, a família Euphorbiaceae ainda está aquém de outras tradicionalmente agricultadas (e.g. Ahmad et al., 2003 e Uchida et al., 2009). Até o momento, apenas duas espécies da família, Jatropha curcas L. (Sato et al., 2011) e Ricinus communis L. (Chan et al., 2010), tiveram seu genoma completo publicado,

sendo estas de subfamílias distintas da qual pertence E. hyssopifolia. Dessa forma, outras sequências de Euphorbiaceae podem surgir apresentando maior similaridade com a defensina Dehys. Por outro lado, a espécie E. hyssopifolia compreende uma erva daninha e pioneira (Bellini et al., 2008; Guglieri-Caporal et al., 2011) capaz de sobreviver mesmo em ambientes ameaçados por patógenos, o que poderia decorrer em uma evolução convergente dessas sequências, uma vez que nesses ambientes, sofreriam as pressões dos mesmos fatores.

Figura 14. Alinhamento, dendrograma e similaridade entre a sequência de nucleotídeos de Dehys comparada com ESTs vegetais obtidas em bancos de dados. O Alinhamento inclui V. unguiculata (gi|225548305), P. vulgaris (gi|312982411), G. max (gi|255627362), M. esculenta (pz|cassava4.1_020555m.g), J. curcas (gi|223469636) e R. communis (pz|29908.t000184). Bancos de dados: gi, gene índex; pz, phytozome. Números na base dos ramos referem-se a valores de bootstrap após 1.000 replicações. Sequências omitidas por questões legais de propriedade intelectual.

A EST de Dehys ainda mostra similaridade elevada com sequências nucleotídicas pertencentes a diferentes famílias vegetais, as quais sustentam que a região amplificada corresponde a uma defensina e/ou atue como inibidor de protease. As sequências nucleotídicas que apresentaram alta similaridade com a de E. hyssopifolia encontradas nos banco de dados foram descritas como: codificantes de γ- tionina em Castanea sativa (gi|16225422) com 83%; Lycopersicon esculentum (gi|350538810) com 78%; Solanum chacoense (gi|170773915) com 77%; Petunia inflata (gi|499654) com 76%; e de defensinas em Nicotiana attenuata (gi|42374732)

com 77%; Elaeis guineensis (gi|24306003) com 77%; Capsicum annuum (gi|1200227), 76% e Arabidopsis thaliana (gi|145359833) 76%.

5.2 Análise Evolutiva da Estrutura do Gene e do Peptídeo Sinal

A disponibilidade de sequências genômicas completas de eucariotos nos permite o endereçamento de questões fundamentais acerca da evolução da estrutura dos íntrons e éxons na estrutura de um determinado gene. Assim, comparou-se a organização estrutural do gene Dehys, com os seis ortólogos de maior similaridade, ainda que a maioria deles não tenham sido descritos como defensinas.

O transcrito de defensina pode ser dividido em duas classes (Lay & Anderson, 2005). Na primeira e mais frequente, a proteína precursora é composta por uma sequência sinal de endereçamento ao retículo endoplasmático, seguida de um domínio de defensina madura. Costumeiramente para defensinas, o primeiro éxon codifica quase inteiramente o peptídeo sinal. A sequência é interrompida por um íntron de tamanho variável, seguido pelo segundo éxon que codifica o domínio central de defensina (Doughty et al., 1998; Manners et al., 1998; Meyer et al., 1996; Chen et al., 2004; Beer & Vivier, 2008; Pelegrini et al., 2008a). Os resultados obtidos não foram diferentes para o gene Dehys, tendo sido o mesmo padrão encontrado para defensinas vegetais de outras espécies, como V. unguiculata (Padovan et al., 2010a) e S. media (Slavokhotova et al., 2011).

Outro aspecto da análise da estrutura do gene se referiu ao tamanho do primeiro éxon, que com 64 pb parece ser conservado, independentemente da família (Figura 15A). Não houve conservação com respeito ao tamanho do íntron; no entanto, o tamanho do segundo éxon foi mantido para Manihot esculenta e R. communis (170 pb), que embora sejam de subfamílias distintas de Euphorbiaceae (entre si e com relação a E. hyssopifolia), esta última apresentou uma trinca de nucleotídeos a mais, com 173 pb. Esta diferença se reflete na inserção de um aminoácido no final da região do peptídeo-sinal dessas sequências (Figura 15C), sendo os indels localizados nessa última região do alinhamento.

Figura 15. Análise da estrutura do gene e da similaridade dos pró-peptídeos. Em (A) Comparação heteróloga de genes de defensinas vegetais. Em (B) Dendrograma (Neighbor- Joining, bootstrap de 1.000 replicações) dos pró-peptídeos e em (C) alinhamento dessas sequências. Espécies organizadas em ordem decrescente de similaridade em relação a Euphorbia hyssopifolia: V. unguiculata (gi|225548305); G. max (pz|Glyma16g18480); M. truncatula (pz|AC229689_3); P. persica (pz|ppa014246m.g); M. esculenta (pz|cassava4.1_020555m.g); S. pimpinellifolium (gi|133711823); P. inflata (gi|499654); R. communis (pz|29908.t000184). Cisteínas conservadas são evidenciadas: Cys3-Cys47; Cys14- Cys43; Cys20-Cys41; Cys24-Cys34. Sequências omitidas por questões legais de propriedade intelectual.

A respeito dos sítios de splicing (A/C)AG|GT(A/G) são consideradas sequências consenso de íntrons para doação do sitio de splicing, enquanto CAG|G, são aceptoras. Esse padrão se manteve para todas as euforbiáceas analisadas e quase todas as demais, com exceção de Petunia inflata (gi|499654). Em geral, essas sequências são conservadas, mas quando o tamanho do íntron varia, a região de ligações dos íntrons aos éxons são como hotspots para indels. Curiosamente, isso frequentemente ocorre na maioria das regiões de peptídeo-sinal, na porção mais terminal, contribuindo para a diversidade no sítio de clivagem e assim contribuindo para a formação de novas defensinas com aminoácidos terminais diversificados. No alinhamento apresentado na Figura 15C, verifica-se que as regiões que mais sofrem esse tipo de ajuste se localizam após o aminoácido 21. Desta forma, o fragmento compreendendo os aminoácidos de 1 a 21 corresponderia às trincas codificadas pelo primeiro éxon.

Substituições não-sinônimas de nucleotídeos, as quais mudam sequência primária da proteína codificada e que podem influenciar a aptidão de um organismo do que uma substituição aleatória sinônima, sendo a comparação do número dessas substituições (dN e dS, respectivamente) um poderoso teste da hipótese de que a seleção darwiniana positiva agiu para favorecer mudanças no nível de aminoácidos (Li et al., 1985; Nei & Gojobori, 1986). A Figura 16 mostra três gráficos onde estão plotadas comparações entre dN contra dS para: as sequências codificante do pró- peptídeo, do primeiro éxon (o qual codifica o peptídeo sinal) e do segundo éxon (que codifica a defensina madura). Ao analisarmos a média de substituições por sítios considerando todas as sequências, a correspondente ao pró-peptídeo exibiu valores de 0,180±0,026 e 1,032±0,086, para dN e dS, respectivamente, sendo que na sequência correspondente ao primeiro éxon, dN= 0,245±0,053 e dS= 0,782±0,100, enquanto para o segundo éxon, dN = 0,128±0,030 e dS= 1,010±0,099.

A razão da taxa de substituições não-sinônimas/ sinônimas, ω = dN / dS, tem sido amplamente adotado como uma medida de pressão seletiva (Nielsen & Yang, 1998; Yang et al., 2000a). Genes altamente conservados podem estar sob seleção purificadora e, portanto, dN dS ω> 1 (Semple et al., 2006). Ao testarmos estatisticamente para seleção purificadora as CDS pró-peptídeo, os domínios do peptídeo sinal e os do peptídeo maduro mostram resultados significativos para seleção negativa (z-test, P <0,05), com valores de 1,10572E-16, 2,39908E-06 e 8,41343E-15, respectivamente.

Após comparação com a mesma abordagem quando aplicada em α-e β- defensinas de mamíferos, estudos revelaram seleção positiva atuando sobre o domínio da defensina madura, mas não em outras regiões do gene (Hughes, 1999; Maxwell et al., 2003). Na vasta maioria das comparações entre as sequências codificantes do pró-peptídeo, do primeiro éxon e do segundo éxon, dS excedeu dN de maneira estatisticamente significante em quase todos os casos no z-teste bicaudal. Em humanos e babuínos tal padrão foi encontrado apenas no primeiro éxon (Semple et al., 2006), o qual evoluiu de maneira neutra ou sob fraca seleção purificadora. Já o padrão visto no segundo éxon para esses espécimes foi bastante diferente: dN facilmente excede dS, com algumas substituições estatisticamente significantes, com algumas exceções como DEFB1, que não variou significativamente em primatas (Semple et al., 2003). Tais alterações podem provocar mudanças na atividade antimicrobiana (Antcheva et al., 2004).

5.3 Análise das Sequências de Aminoácidos - Similaridade e Função

A sequência de aminoácidos deduzida para Dehys consiste de 78 resíduos, com os 31 aminoácidos da região N-terminal correspondendo ao provável peptídeo sinal (Figuras 13 e 15). Dessa forma, o programa Philius determinou a posição do sítio de clivagem entre os aminoácidos 31 e 32. A sequência do peptídeo maduro foi identificada através do mesmo programa, que também indicou que este sítio indica a secreção da proteína. Esta sequência se mostrou composta por 47 aminoácidos, de acordo com o indicado para defensinas vegetais, de 45 a 54 aminoácidos (Almeida et al., 2002).

Surpreendentemente, a sequência do pró-peptídeo Dehys exibiu 97% de similaridade com DEF_VIGUN isolada por Padovan et al., (2010a). Pelo alinhamento e similaridade das sequências do pró-peptídeo (Figura 15B e 15C) percebe que outras

espécies mais próximas de E. hyssopifolia, G. max e Medicago sativa, diferiram dela em dois e quatro aminoácidos, com 89 e 86%, respectivamente. No entanto, essa similaridade pode ser explicada pela ampla convergência da sequência de aminoácidos encontrada nas diversas classes de peptídeos antimicrobianos.

Verifica-se que o nível de similaridade entre os peptídeos maduros são mais altos se comparados aos valores obtidos na análise de ESTs, assim como observado por Slavokhotova et al. (2011). Como resultado disso, o Blast do peptídeo maduro de Dehys contra o banco de proteínas mostrou similaridade com os seguintes peptídeos classificados de diversas maneiras (Figura 17). Defensinas de V. unguiculata (gi|225548306), P. vulgaris (gi|312982412), Solanum pimpinellifolium (gi|133711827), S. lycopersicum (gi|300827243), Prunus persica (gi|28624546), Helianthus annuus (gi|11387188), com 100, 97, 85, 83, 83 e 80% de similaridade, respectivamente. O mesmo se aplica às γ-tioninas (sinônimo de defensina) de Castanea sativa (gi|16225423), Solanum chacoense (gi|170773916) e Nicotiana tabacum (gi|7939581), com 83, 80 e 78% de similaridade, respectivamente, bem como aos inibidores de protease de G. max (gi|533692) S. tuberosum (gi|212525378), com 91 e 78% de similaridade. Por último, duas as sequências de euforbiáceas, R. communis (gi|255545390) e J. curcas (gi|223469637) se apresentaram como proteínas de baixo peso molecular ricas em cisteínas, com 76 e 74% de similaridade. Todas as sequências acima mencionadas e diversas outras que constaram no resultado do alinhamento Blast apresentaram o número e padrão de espaçamento de cisteínas característico de defensinas. Assim como Dehys e DEF_VIGUN (Padovan et al., 2010a), a proteína BcAF de Brassica rapa mostrou 100% com defensina de Brassica napus, com valores decrescentes para espécies de outros gêneros (Chen et al., 2008). No entanto, no presente trabalho, as espécies relacionadas não são tão próximas. Por outro lado uma alta homologia também se mostra necessária, uma vez que a maior parte desses peptídeos dependem de interações com membranas lipídicas, o que limita a variabilidade do motivo CSαβ.

Acerca da função putativa de Dehys, não foi possível inferi-la por homologia, uma vez que as sequências de aminoácidos mais similares (dispostas na Figura 17) são oriundas de sequências nucleotídicas, nas quais a função é deduzida a partir da análise de padrões de indução de expressão dessas proteínas e a resistência a determinado fator biótico ou abiótico resultante das mesmas. Ainda, os transcritos descritos, se mostram importantes em diversas atividades: contra fungos, bactérias, vírus; após processos físicos como injúria, seca, queda de temperatura; importante na maturação e desenvolvimento floral e de frutos, entre outros (Figura 17C). No entanto,

Joining - Neighbor thionina; LMWCR, LMWCR, thionina; s pelo método s método pelo sequência s D, DNA genômico, R, RNAm/ cDNA. NF, Não ., 2007).Resíduos hidrofóbicos estão em azul, os azul, em estão hidrofóbicos 2007).Resíduos ., et al et ., 2006). (C) Características gerais e funções putativas/ putativas/ funções e gerais Características (C) 2006). .,

questões legais de propriedade propriedade de legais questões por omitidas Sequências

et al et

casca caule. casca do

. . protein HYPP, hypotethical ; thionin - specific gamma - adas. Legendas: Fab, Fabaceae; Sol, Solanaceae; Nel, Nelumbonaceae ; Eup, Euphorbiaceae; Fag, Fagaceae; Fagaceae; Fag, Euphorbiaceae; Eup, ; Nelumbonaceae Nel, Solanaceae; Sol, Fabaceae; Fab, Legendas: adas. s no programa MEGA 5.05. (B) Alinhamento via ClustalX2 (Larkin ClustalX2 via Alinhamento (B) 5.05. MEGA programa no

; FSGT, Flower FSGT, ; s de peptídeo maduro de defensina mais similares a Dehys. (A) Dendrograma da Dendrograma (A) Dehys. a similares mais defensina de maduro speptídeo de rich - ., 1999). Abaixo, pontes dissulfeto indicadas pelo DISULFIND (Ceroni DISULFIND pelo indicadas dissulfeto pontes Abaixo, 1999). ., sanali sequência et al et sequência weight cysteine weight de 1.000 replicações de 1.000 -

. . Análise das das Análise . s de expressão das das sexpressão de bootstrap molecular - Figura 17 Figura com o alinhamento indicam as pontes dissulfeto formadas. Acima, estrutura secundária predita predita secundária estrutura Acima, formadas. dissulfeto pontes as indicam alinhamento d o abaixo Números vermelho. em ose aniônicos verde em catiônicos (Gouet 2.2 ESPript pelo padrõe - Gamma GT, ase; de prote Inibidor PI, defensina; DF, Poaceae. Poa, Brassicaceae; Bra, Asteraceae; Ast, Rosaceae; Ros, Vitaceae; Vit, Low fornecido; Sem, sementes; Fol, folhas; Fru, frutos, T, tubérculo; Flo, flores; Cas, flores; Flo, tubérculo; T, frutos, Fru, folhas; Fol, sementes; Sem, fornecido; intelectual

também é difícil delimitar suas funções, uma vez que estas podem exercer diversos papéis em planta, com muitas sendo responsivas a diversos fitormônios. Assim, algumas dessas funções podem ser resultantes da ação de um mesmo mensageiro a partir de estímulos distintos.

A similaridade de peptídeos que pertencem a classes alternativamente chamadas de defensinas ou inibidores de protease sugere que esses peptídeos vegetais são caracterizados pela atividade multifuncional e podem atuar seja em defesa a microorganismos ou insetos, assim como podem estar envolvidos na ativação de outros mecanismos responsivos a estresse. Tais aplicações são condizentes com as características e funções já descritas na literatura para E. hyssopifolia, a qual é empregada como antifúngica (Lal & Gupta, 1970; Kane et al., 2009), antiprotozoário (Kane et al., 2009), antibacteriana (Gram positivas e negativas) (Jabbar & Khan, 1965), antiviral (Matsuse et al., 1999; Yang et al., 2005), larvicida para insetos (Rahuman et al., 2008), e possui em seu látex grande quantidade de enzimas proteolíticas de atividade inibitória (Domsalla et al., 2010b). Pintus et al. (2010) tentaram relacionar a bioquímica e a composição proteica do látex das espécies do gênero à interações complexas em ambientes complexos. Além de ser resistente a intempéries ambientais, habitam em ambientes tão diversos quanto a restinga (Almeida Jr et al., 2009) e a caatinga (Santos et al., 2009). Tamanha adaptabilidade, favorece a seu elevado potencial invasivo e consequente dano a agricultura (Guglieri- Caporal et al., 2011), mas também minimiza o efeito danoso de pragas por competição com as agriculturas pelos patógenos (Bellini et al., 2008), o que predispõe essa espécie à possuir diversas defensinas.

5.4 Análise das Sequências de Aminoácidos - Organização Estrutural

O motivo CSαβé capaz de suportar uma grande variabilidade quanto à sequência primária de aminoácidos, embora comparações entre uma série de sequências de defensinas de plantas de diversas espécies tenha revelado que esta família apresenta clara, ainda que limitada, conservação da sequência (Almeida et al., 2000; De Paula et al., 2008; Carvalho & Gomes, 2009; Padovan et al., 2010b). Acerca da composição da proteína, Dehys pode ser caracterizada pelo já descrito para PDEF_VIGUN: levando em conta a numeração de aminoácidos do peptídeo maduro, sendo que Dehys apresenta aminoácidos característicos de defensinas vegetais (Lay & Anderson, 2005) (Figura 17B), como a serina na posição 7, o resíduo aromático na posição 10, duas glicinas na 12 e 32, e um ácido glutâmico na 27 (Padovan et al.,

2010a), assim como as oito cisteínas que fornecem o típico padrão de pontes dissulfeto descrito no Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk//family/PF00304). Estes resíduos são, provavelmente, conservados, porque eles têm um papel essencial no dobramento ou na estabilização da proteína (Lay et al., 2003a).

Para Dehys, verifica-se a confirmação de algumas observações feitas por

Padovan et al. (2010a) quanto à conservação dos resíduos Ser7 e Glu27, os quais são explicados pelo fato de que, embora polar, eles são ambos internalizados na estrutura e formam uma rede de ligações de hidrogênio essenciais ao estabelecimento do esqueleto da defensina, enquanto os resíduos conservados das posições 10 e 29 e a

Val23 contribuem para o núcleo da molécula. A Gly12 aparece numa posição chave no loop, conectando a primeira folha-β e a α-hélice (ver Figura 17), com sua amida e carboxila da cadeia central formando uma rede de ligações de hidrogênio, juntamente com os outros resíduos conservados, Phe10 e Arg40. A Gly32 está posicionada posteriormente, sobrepondo diretamente a α-hélice. Além disso, outros resíduos conservados em Dehys podem ter papéis estruturais importantes. Asn19, por exemplo, está envolvido numa rede de ligações de hidrogênio que pode indicar sua ação como um protetor que estabiliza a α-hélice, ainda envolvendo a Ser16. A Leu42, que substitui a Phe42 presente em todas as outras espécies próximas não é posicionada no núcleo da molécula, mas projetada da plataforma da folha-β.

A estrutura secundária foi composta pelas folhas β1 (do resíduo Thr 2 ao Gln6),

β2 (do Gly31 ao Cys34) e β3 (do Cys41 ao His46), além da α -hélice (Asp17 ao Thr26). Quanto às quatro pontes dissulfeto, estas foram formadas entre os aminoácidos 3 e 47, 14 e 34, 20 e 41, e por último, 24 e 43. O dendrograma revela a elevada similaridade entre as sequências de aminoácidos, se comparadas ao dendrograma das sequências de nucleotídeos (Figura 17). Essa arquitetura caracterizada por três folhas β-pregueadas antiparalelas e uma curta α-hélice, dispondo de quatro pontes dissulfeto localizadas no centro entre hélice e folha, formam o motivo “alfa-beta estabilizado por cisteínas” (CSαβ) (Bruyx et al., 1993; Almeida et al., 2002), o domínio conservado da família dasγ -tioninas (http://pfam.sanger.ac.uk//family/PF00304). A partir dos peptídeos alinhados na Figura 17 também se verifica a maior proporção de grupamentos hidrofóbicos e grupamentos polares catiônicos em relação aos aniônicos, a exemplo de Dehys. Verifica-se também que a similaridade não está diretamente ligada à organização taxonômica das espécies. Tal fato provavelmente se deve ao número variável de peptídeos antimicrobianos presentes nas espécies. Assim, mais de uma defensina deve ser responsável pela defesa de cada espécie e poucas

disponíveis nos bancos de dados, como já discutido anteriormente acerca das euforbiáceas.

A partir do alinhamento de 18 sequências disponíveis no banco de dados do NCBI mais similares a Dehys (Figura 17), verifica-se que outros resíduos foram conservados, como Arg nas posições 1, 38, 38 e 40, Ser na 5, Asn na 19, Ala em 21 e Phe em 29. Domínios conservados além dos essenciais para o dobramento das defensinas podem ter surgido como uma consequência das limitações impostas pelo impedimento estérico do dobramento de proteínas (Bontems et al., 1991; Kobayashi et al., 1991; Fant et al., 1998; Lay et al., 2003a). Outros estudos têm mostrado que o laço de ligação entre folhas-β2 e -β3 é responsável pela atividade antimicrobiana (Schaaper et al., 2001; Spelbrink et al., 2004), atividade bloqueadora de canais (Kushmerick et al., 1998) e atividade inibitória αde -amilase. Neste sítio há uma exigência de aminoácidos carregados positivamente para que o peptídeo seja biologicamente ativo. Este padrão foi detectado em Dehys. Por mutagênese sítio dirigida em MsDEF1, com ensaios de atividade e expressão subsequente da defensina mutada em P. pastoris revelaram que a Arg38 (numeração em relação à MsDEF1, equivalente à Arg40 para Dehys) situada na alça entre as folhas-β2 e -β3 seria crítica para a atividade antimicrobiana (Spelbrink et al., 2004). Outros trabalhos também sublinharam a necessidade de um resíduo positivo nessa região (Kushmerick et al., 1998; Sugiarto & Yu, 2004). De Samblanx et al. (1997) demonstraram que uma variante (substituição Val39 por Arg) do Rs-AFP2 (correspondente a posição da Arg37 de Dehys) apresentaria maior atividade antifúngica induzindo captação de Ca2+ 2,5 vezes maior. Em Dehys, a Arg40, foi precedida por mais dois resíduos, Arg38 e Arg39, encontrados nessa região de alça. Tais resíduos corroboram para sugestão de que a defensina Dehys possui atividade antifúngica. A defensina So-D2 isolada de folhas de Spinacia oleracea também apresentou o fragmento RRR na mesma posição e exibiu atividade antifúngica, além de atuar contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Segura et al., 1998).

Curiosamente, todas as defensinas e/ou inibidores de protease acima mencionados apresentam a Phe42, enquanto Dehys e PDEF_VIGUN têm Leu em substituição nesta mesma posição. É importante notar também que há um padrão de preferência dos resíduos positivos pelas regiões de loop. Nessas áreas, excluindo-se as posições com resíduos conservados, raras posições não conservaram suas propriedades químicas: foram as posições 13, 28 e 30. Esses resíduos podem ser os principais responsáveis pelo tipo de função ou especificidade de atividade a determinada classe de microorganismos, influenciados pelo impedimento estérico e

interações eletrostáticas dos resíduos que se alteram mantendo suas propriedades. Tal observação se correlaciona com a alta variabilidade em sítios não conservados e taxas de substituição de aminoácidos elevadas que AMPs geralmente exibem (Hughes, 1999). Assim, é notável a ampla variação na sequência primária das proteínas alinhadas (Figuras 15C e 17B). Apesar da alta variabilidade, todas elas compartilham uma estrutura tridimensional bastante próxima à descrita na Figura 17, sendo a convergência da estrutura terciária a principal relação de identificação entre defensinas (Thomma et al., 2002). Apesar disso, a falta de homologia das sequências torna difícil prever as atividades dos peptídeos in vivo e torna desafiador o projeto de peptídeos antimicrobianos sintéticos potentes que tenham as atividades in vivo desejadas (Hancock & Chapple, 1999).

5.5 Predição de Propriedades Químicas da Proteína e Importância do Peptídeo Sinal

A partir dos dados fornecidos pelos preditores das propriedades da defensina putativa Dehys, uma análise comparativa entre o pró-peptídeo e o peptídeo maduro revelou a importância do peptídeo sinal (Tabela 5). Além da própria redução do número de aminoácidos e assim, do seu peso molecular, após o processamento do peptídeo, o valor obtido (5,3 kDa) correspondeu ao comumente encontrado para defensinas vegetais (aproximadamente 5 kDa; Stotz et al., 2009b). Outras características importantes para a funcionalidade da molécula: o peptídeo maduro apresenta um maior ponto isoelétrico teórico, indicando o aumento da sua acidofilia, o que fornece um maior potencial para sua atividade. Portanto, o peptídeo sinal exerce uma função além de endereçamento da proteína. Ainda, o PI básico obtido, corresponde ao geralmente encontrado para o peptídeo maduro de defensinas, com PI em torno de 9 (Carvalho & Gomes, 2009).

Acerca da carga da molécula, são perdidos dois resíduos carregados negativamente e um carregado positivamente, o que aumenta a carga positiva do peptídeos maduro. Esta carga positiva se deve à presença de um grande número aminoácidos de arginina e lisina (que são carregados positivamente), em relação ao aspartato e ao glutamato, que são carregados negativamente (aniônicos). Dessa forma, a carga total da molécula, de +9 passa a +10. Essa característica facilita a sua interação e inserção na parede celular e na interação com a matriz fosfolipídica aniônica da membrana plasmática de microrganismos (Shai, 2002; De Paula et al., 2008). De fato, os valores obtidos pela predição da razão de hidrofobicidade indicam

que o processamento do peptídeo sinal promove uma diminuição do caráter hidrofóbico e da molécula, aumentando a afinidade da proteína pelas membranas celulares. Simultaneamente, o pró-peptídeo que era levemente hidrofóbico (índice de GRAVY positivo), passa a ser levemente hidrofílico (índice de GRAVY negativo), o que favorece alguma facilidade de transporte nos fluídos; ainda, o aumento da energia livre de Gibbs (índice de Boman) propicia uma estabilização de Dehys e a potencializa para interações com outras moléculas. No entanto, a propriedade em que as diferenças foram mais gritantes foi a meia vida estimada, que em mamíferos passou de 30 h como pró-peptídeo à 1 h na sua forma ativa como peptídeo maduro. Por outro lado, o índice alifático diminui, tornando a molécula menos termoestável, o que aumenta sua labilidade e evita acumulação, que poderia causar toxicidade ao hospedeiro.

Peso molecular (Da) 8659,1 5365,1

Resíduos carregados negativamente (Asp + Glu) 5 3

Resíduos carregados positivamente (Arg + Lys) 11 10

Carga total* +9 +10

Ponto isoelétrico teórico 9,16 9,37

Razão de hidrofobicidade* 44 % 31 %

Grand average of hydropathicity index (GRAVY) 0,078 -0,819

Potencial de ligação à proteína (Índice de Boman)* 1,83 kcal/mol 3,58 kcal/mol

Índice alifático 68,72 22,77 Meia vida estimada (reticulócitos de mamíferos in vitro; levedura, in 30 h; > 20 h; > 10 h 1 h; 2 min; 2 min vivo; Escherichia coli, in vivo)

O fragmento do peptídeo sinal muitas vezes é ácido e pode também desempenhar um papel na atividade supressora até a maturação, seguido de um domínio de defensina madura. Estas proteínas entram na via secretora e não têm sinais óbvios de modificação pós-traducional, ou dirigidos a endereços subcelulares específicos (Lay & Anderson, 2005). Esse pró-domínio pode contribuir para o amadurecimento da defensina, agindo como um chaperona estérica intramolecular e/ou impedindo as interações deletérias entre as defensina e outras proteínas

celulares ou membranas lipídicas, neutralizando a atividade tóxica durante a translocação através da via secretora (Michaelson et al., 1992; Florack et al., 1994; Liu & Ganz, 1995; Lay & Anderson, 2005; Carvalho & Gomes, 2009).

O gráfico de variação da carga da molécula em razão da variação do pH (Figura 18) mostra que quando mais ácido o meio (redução do pH provocada por uma reação de hipersensibilidade, por exemplo), mais elevada a carga da proteína, aumentando o potencial de ligação à estruturas negativamente carregadas, como membranas aniônicas de microorganismos. Tal observação concorda com o mecanismo de ação admitido para peptídeos antimicrobianos. As cargas totais dessas moléculas geralmente variam consideravelmente entre −4.8 e +10.4, com variação do pH (Zhu, 2008). Em pH fisiológico (5,5), Dehys apresenta +6 de carga. Outras proteínas, a exemplo de PsDef1 e RsAFP2, apresentaram +6,7 e +5,8, respectivamente (Terras et al., 1992; Kovaleva et al., 2009). O contrário se observa comumente para a maioria das defensinas antifúngicas de plantas, bem como para outros tipos de defensina, que é a redução da atividade antifúngica quando a força catiônica do meio é aumentada (Lehrer et al., 1988;. Terras et al., 1992, 1993;. Cociancich et al., 1993a; Osborn et al., 1995). Nesses processos, isso decorre da presença de cátions, com os bivalentes sendo pelo menos uma ordem de grandeza mais potente do que cátions monovalentes (Terras et al., 1992, 1993; Osborn et al., 1995; Broekaert et al., 1997).

Figura 18. Carga total estimada para Dehys sob variação no pH. Valores obtidos via Protein Calculator v3.3.

5.6 Predição da Estrutura Terciária de Dehys e Propriedades Químicas Relacionadas

A compreensão do mecanismo de função de uma proteína geralmente requer o conhecimento de sua estrutura tridimensional (Blundell et al., 1978; Weber, 1990), que em ultima instância é determinada por sua sequência de aminoácidos (Anfinsen, 1973). O método de modelagem por homologia é aquele a partir do qual se obtém a estrutura tridimensional de uma dada sequência protéica baseada principalmente em sua similaridade com uma ou mais proteínas de estruturas conhecidas (Rost et al., 1996; Kolinski et al., 1999). Ao buscar a sequência de Dehys contra o banco de estruturas do PDB, verifica-se que as quatro moléculas de sequência mais similares foram as seguintes: 1GPT (Hordeum vulgare) com 53% de similaridade; 1GPS (Triticum turgidum), com 49%; 1MR4 (Nicotiana tabacum), com 45%; e 1N4N (Petunia hibrida) com 40%. Todas obtidas pelo método de Ressonância Magnética Nuclear. De acordo com Sanchez & Sali (1997), quando a identidade de sequência é superior a 40%, o alinhamento ocorre de maneira satisfatória. Estas foram então empregadas no desenho do modelo múltiplo de sequências pelo programa VDM para modelagem no Modeller gerando as estruturas tridimensionais apresentadas na Figura 19, diferentemente de Padovan et al., 2010a, que usou apenas 1GTP para o desenho da estrutura terciária de PDEF_VIGUN. A topologia do peptídeo, assim como suas diversas propriedades estão dispostas nas Figuras 19 e 21. A predição da estrutura de defensinas vegetais através de modelagem comparativa foi utilizada para caracterizar a estrutura 3D de outras defensinas, tais como Cp-thioninI e Cp-thioninII de Vigna unguiculata (Melo et al., 2002; Franco et al., 2006), Gbd de Ginkgo biloba (Shen et al., 2005), VrD1 de V. radiata (Shiau et al., 2006), Vv-AMP1 de Vitis vinifera (Beer & Vivier, 2008) e PhaDEF de Phaseolus vulgaris (Games et al., 2008).

Para análise da qualidade da estrutura terciária predita para Dehys, esta foi submetida a uma série de análises. A primeira delas, QMEAN6, compreendeu um método de pontuação composta de seis descritores lineares usando potenciais estatísticos (Benkert et al., 2009). Nesta etapa, a estrutura tridimensional de Dehys obteve valores de 0,43, revelando uma boa a confiabilidade do modelo, para qual o valor estimado deve estar entre 0 e 1. Numa análise para uma medida geométrica de qualidade, o z-score de uma estrutura baseada em RMN, deve ser maior que -5, e preferencialmente maior que -2 (nesse caso, usou-se este parâmetro porque as estruturas empregadas para modelagem comparativa derivaram desse método) (Benkert et al., 2011), o valor obtido (-1.16), mostra a conformidade da proteína modelada com os padrões de qualidade desejados (Figura 20A). Já a distribuição dos

resíduos de aminoácidos no gráfico de Ramachandran, que avalia a qualidade estereoquímica da estrutura, mostrou bons resultados, revelando que 90% dos resíduos se encontravam nas regiões mais favorecidas para um bom modelo de qualidade (Figura 20B). Em moléculas identificadas via RMN no mínimo 85% dos resíduos devem estar plotadas na nessas regiões (Laskowski et al., 1993). Finalmente, G-factor avalia o quanto incomum as propriedades estereoquímicas dos resíduos estão. O valor obtido para o modelo de Dehys foi -0,07. Em geral as propriedades estão boas se maior que -0,5 (Engh & Huber, 1991). Dessa forma, a partir de quatro parâmetros distintos, verificamos a confiabilidade do modelo desenhado para a defensina putativa de Euphorbia hyssopifolia.

O PROCHECK ainda nos forneceu dados acerca da relação entre a sequência de aminoácidos e os resíduos posicionados nas regiões menos favorecidas do gráfico de Ramachandran (Figura 20C). Tais resíduos referem-se às Arg38 e Arg39, possivelmente implicadas numa atividade antifúngica. Se verificarmos as estruturas disponíveis no PDB empregadas na análise (1GPT, 1GPS, 1MR4 e 1N4N), as quatro apresentam as Arg39 e Arg40. O não favorecimento observado por esses resíduos pode ser devido a um possível impedimento estérico causado pela repulsão entre cargas iônicas positivas das cadeias laterais do fragmento RRR. Na relação entre sequências, estrutura secundária e acessibilidade estimada (Figura 20D), os dados coincidiram com o obtido pelo ESPript 2.2 acerca da estrutura secundária, enquanto a acessibilidade revelou que os resíduos das extremidades N- e C- terminal e as áreas de alça são mais acessíveis se comparadas aos localizados na estrutura compacta do core CSαβ. Na região de alça entre as folhasβ 2 e β3, verificamos que as Arg38 e

Arg39, demonstram alguma acessibilidade. Nesta área provavelmente há o favorecimento de interações moleculares fomentadas pela elevada concentração de resíduos com cadeias laterais longas e catiônicas (dos seis aminoácidos que compõem a alça, quatro são argininas) aos quais é permitida uma limitada flexibilidade, e mostrando importante papel em alterações na conformação do sítio ativo.

Por outro lado, modelos obtidos via RMN são estruturas solution-like, ou seja, encontram-se na mesma conformação que apresentam em solução, pois o modelo leva em conta os efeitos do meio, diferente de estruturas obtidas via cristalografia de raios X, onde a proteína está disposta na forma de sais. Diante do exposto, a estrutura de Dehys se apresenta numa conformação natural, em que o peptídeo é ativo, com algumas leves variações possíveis (limitadas pela rigidez do motivo CSαβ) advindas de interações eletrostáticas com componentes do meio ou outras macromoléculas.

Assim, esta seria a provável conformação presente no medicamento baseado em formas farmacêuticas líquidas ou semi-sólidas.

Figura 19. Estrutura tridimensional da defensina Dehys, mostrando a arquitetura as folhas beta pregue-adas, a alfa- hélice e a disposição espacial dos resíduos de amino- ácidos. Em (A) coloridas de acordo com cada carac- terística ácido-base da molécula, sendo resí-duos positivos (ácidos) em vermelho, nega-tivos (básicos) em azul e neutros em roxo. Em (B), de acordo com a polaridade, resíduos em ciano são polares, e em lilás, apolares. Em verde, cisteínas e pontes dissulfeto são representadas. Estrutura obtida via VMD 1.9 e Modeller 9v7, com edição no Jmol Viewer 12.0. Deta- lhes omitidos por questões legais de propriedade intelectual

X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X

A partir da Figura 19A-D, verificamos espacialmente algumas características evidenciadas pelos preditores. A disposição dos resíduos de aminoácidos de acordo com a polaridade e carga, mostrou que Dehys, é bastante catiônica, com um arranjo de resíduos básicos que estão agrupados na base e no topo da estrutura, com predominância nas regiões de loop, conectando as folhas β-pregueadas e a α-hélice. Como já discutido, a proteína apresenta um caráter levemente hidrofílico, que justifica sua polaridade, apesar da presença de numerosos resíduos hidrofóbicos. Verifica-se também que as pontes dissulfeto localizam-se no interior da estrutura, exercendo seu efeito de estabilização da arquitetura αβ.CS Por outro lado, a caracterização da superfície molecular da proteína através do software DeepView v4.04 permitiu inferir sobre a acessibilidade e a exposição de regiões e cadeias laterais da molécula (Figura 21A), assim como acerca do seu potencial eletrostático (Figura 21B), importante na interação com as membranas. Tal análise revelou o alto potencial eletrostático predominante nas regiões mais acessíveis da molécula, acoplado à propriedade

catiônica da maioria desses fragmentos, assim como o já observado para defensinas de P. vulgaris (Games et al., 2008) e V. unguiculata (dos Santos et al., 2010).

Figura 21. Superfície molecular da estrutura tridimensional da defensina putativa Dehys. Em (A) colorida de acordo com a acessibilidade da molécula (espectro de cores: quentes, regiões mais aces- síveis, frias, menos); Em (B) molécula colorida de acordo com seu potencial eletrostático (azul e vermelho, positivo e negativo potencial eletrostático, respectivamente). Molécula obtida via Modeller 9v7 e caracterizada no programa DeepView v4.04. Potencial eletrostático obtido pelo método de Poisson-Boltzmannn. Detalhes omitidos por questões legais de propriedade intelectual.

Quando atingem um limiar de concentração, peptídeos catiônicos acumulam-se na superfície da membrana. Após a interação eletrostática inicial com componentes negativamente carregados da membrana, esses peptídeos (que são positivamente carregados) se inserem na membrana e em conjunto organizam a formação de canais iônicos (Sugiarto & Yu, 2004), ou ainda interrompem a continuidade da membrana pela consequente neutralização desses lipídeos, permitindo o trânsito de várias moléculas, desde íons até proteínas (Hoover et al., 2000; Padovan et al., 2009, 2010a). Assim, a capacidade de peptídeos catiônicos em geral para permeabilizar as membranas citoplasmática pode ser um meio para atingir um alvo intracelular (Wu et al., 1999; Xiong et al., 1999; Aerts et al., 2008). Os resíduos carregados positivamente também podem interagir com os lipídios da membrana através de receptores específicos na superfície da célula (Sitaram & Nagaraj, 1999; Yeamn & Yount, 2003), consequentemente, a ligação do peptídeo à membrana pode ativar vários caminhos que podem causar morte celular.

6 CONCLUSÕES

O Brasil é o país com a maior diversidade vegetal do planeta. No entanto, desconhecem-se quaisquer AMPs isolados de plantas nativas. Nesse país, exemplares da família Euphorbiaceae encontram-se significativamente representados nos mais distintos ambientes. A espécie objeto do presente estudo, Euphorbia hyssopifolia não é diferente, sendo encontrada em diversos ecossistemas, incluindo áreas de Mata Atlântica, Caatinga, Campos Rupestres Cerrados e áreas de transição. Essa espécie chama atenção por suas propriedades medicinais amplamente relatadas, fato acoplado à elevada adaptabilidade a ambientes inóspitos com provável resistência a agentes patogênicos reinantes nestes locais, fornecendo indícios de presença de interessantes candidatos a peptídeos antimicrobianos. A diversidade e a ocorrência generalizada de defensinas no reino vegetal, tornam essas moléculas de especial interesse por compreenderem uma rica fonte de proteínas com atividade antimicrobiana. Ainda, outros fatores como suas atividades biológicas, padrão de expressão gênica em relação aos estímulos, ao tempo de resposta, aos tecidos envolvidos, aos elicitores envolvidos na sinalização de seus genes e tecidos; e à localização celular dos peptídeos expressos, predispõem potencial para aplicações agrobiotecnológicas e farmacêuticas. A maioria das defensinas tem atividade antimicrobiana inicial no nível da membrana plasmática, seguida por alguma atividade secundária dentro da célula, mas pouco se sabe ainda sobre esses mecanismos. Estudos mais detalhados das interações receptor-ligante são necessários para compreender a diversidade funcional dessa classe de peptídeos antimicrobianos. Para estes, o conhecimento de certas características químicas e estruturais específicas necessárias para o mecanismo de ação nas diversas funções são de suma importância. Nesse aspecto, o presente estudo permitiu a identificação e caracterização de um novo gene codificante de defensina a partir de uma espécie selvagem como E. hyssopifolia, analisando aspectos como evolução e organização gênica dessa classe de peptídeos e verificando sua conservação em meio a sequências de outras defensinas vegetais já descritas. É interessante notar que tanto as sequências de nucleotídeos quanto as de aminoácidos se posicionaram nesta nova sequência mais proximamente a outras defensinas descritas para Fabaceae, provavelmente pela carência de estudos de genômicas e proteômica na família Euphorbiaceae, além da complexidade das relações que levam a evolução nessas moléculas, não se mostrando correlacionadas a organização filogenética das espécies envolvidas. Ainda,

a tendência a seleção negativa verificada demonstra a elevada importância da conservação da sequência analisada para a defesa do vegetal. A defensina candidata Dehys obedece ao motivo alfa-beta estabilizado por cisteínas (CSαβ) e apresenta os resíduos conservados característicos, com as variações nas demais posições sendo responsáveis funções na interação com a membrana. Dessa forma, a modelagem comparativa da estrutura tridimensional e a predição de suas propriedades químicas, como dobramento da molécula e visualização do posicionamento dos resíduos; peso molecular; ponto isoelétrico teórico, carga líquida total, carga sob variação do ph; anfipaticidade; potencial de ligação necessária para ligação à molécula; além to tempo de meia vida estimada, são juntos parâmetros de destacada importância para o conhecimento desse tipo de molécula, fornecendo o primeiro passo para o desenvolvimento estudos que auxiliem no desenvolvimento de novos produtos para fins agro-biotecnológicos ou terapêuticos.

7 PERSPECTIVAS

AMPs de origem vegetal são promissores para aplicações na terapêutica por diversas razões (Bulet et al., 2004): têm um tamanho muito pequeno; a maioria deles é expresso sistemicamente em níveis basais; apresentam largo espectro de atividade com uma elevada afinidade para o membranas das células microbianas. Estudos de relação quantitativa estrutura-atividade (QSAR) (e.g. Frecer et al., 2004), mostram peptídeos resistentes à proteólise, que promovem morte rápida de microorganismos, têm uma imunogenicidade limitada sendo improvável o desenvolvimento de resistência por parte dos agentes patogênicos. Também miméticos de epítopos de peptídeos antimicrobianos atuam eficientemente, os quais têm demonstrando elevado potencial terapêutico, como revisado por Scott et al. (2008). No entanto, a questão "AMP vegetais plantas e sua utilização para fins farmacêuticos" ainda é recente e o aumento do conhecimento constitui um estímulo adicional para considerar estas moléculas como uma nova classe de agentes terapêuticos com o objetivo de revolucionar o tratamento de muitas doenças infecciosas (da Rocha Pitta et al., 2010). Estima-se a existência de milhares de genes de defensinas vegetais a serem descobertos e o presente trabalho contribuiu com os parâmetros primários para conhecimento do primeiro peptídeo antimicrobiano descrito para E. hyssopifolia e para a subfamília Euphorbioideae. Uma vez que, a predição da estrutura tridimensional e as propriedades químicas conferidas pela composição de aminoácidos é básica para o entendimento dos mecanismos envolvidos para a atividade da molécula, tal

conhecimento representa o primeiro passo para o desenvolvimento de outros, referentes ao aumento de estabilidade, redução de toxicidade; relação estrutura- atividade, desenvolvimento de miméticos de AMPS, além de técnicas farmacêuticas para desenvolvimento de novos produtos adequados às propriedades desses peptídeos, permitindo de maneira segura a sua a aplicabilidade na terapêutica. Para este gene de defensina isolado de E. hyssopifolia, um estudo detalhado de sua expressão em resposta a estímulos antimicrobianos está em vias de condução, de modo a auxiliar no esclarecimento do papel desse gene na imunidade da planta. Ainda, o grupo de trabalho pretende investigar a localização dos produtos expressos de peptídeos isolados por métodos de biologia celular aplicando ensaios enzimológicos usando GFP (Green Fluorescent Protein) e suas variantes, além de projetos de síntese química e produção do peptídeo a partir de sistema de expressão heteróloga usando a levedura Pichia pastoris, para posterior teste de suas possíveis funções. O objetivo final do grupo é o desenvolvimento de um spray vaginal com ação antimicrobiana voltada ao tratamente de infecções recorentes por Candida albicans. Paralelamente, estudos de simulação docking macromolecular e de dinâmica molecular estão sendo planejados. O primeiro verificará a ancoragem de moléculas potencialmente implicadas na função terapêutica, como amilase, tripsina, caspase, entre outros. Já o segundo pretende verificar os possíveis fragmentos nos quais outras moléculas passíveis de interação (como íons que se apresentam em sistemas biológicos) podem causar na molécula mudanças de conformação e em que amplitude, dados que podem ser relacionados com a ativação e/ou inibição de sítios associados à atividade do peptídeo. Espera-se que no conjunto os resultados desses ensaios auxiliem no entendimento dos mecanismos associados às defensinas vegetais, servindo também de parâmetro para o estudo de suas possíveis atividades terapêuticas e o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos.

8 REFERÊNCIAS Aarestrup, J.R.; Karam, D.;Fernandes, G.W. Chromosome number and cytogenetics of Euphorbia heterophylla L. Genetics and Molecular Research 7 (1): 217-222p, 2008. Abdel-Fattah, M.R. The chemical constituents and economic plants of the Euphorbiaceae. Botanical Journal of the Linnean Society 94: 293-326p, 1987. Achten, W.M.J.; Verchot, L.; Franken, Y.J.; Mathijs, E.; Singh, V.P.; Aerts, R.; Muys, B. Jatropha bio-diesel production and use. Biomass & Bioenergy 32: 1063-1084p, 2008. Adedapo, A.A.; Abatan, M.O.; Olorunsogo, O.O. Toxic effects of some plants in the genus Euphorbia on haematological and biochemical parameters of rats. Veterinarski Arhiv 74: 53-62p, 2004. Adeniyi, O.D.; Kovo, A.S.; Abdulkareem, A.S.; Chukwudozie, C. Ethanol fuel production from cassava as a substitute for gasoline. Journal of Dispersion Science and Technology, 28: 501-504p, 2007.

100

Aerts, A.M.; Carmona-Gutierrez, D.; Lefevre, S.; Govaert, G.; François, I.E.; Madeo, F.; Santos, R.; Cammue, B.P.; Thevissen, K. The antifungal plant defensin RsAFP2 from radish induces apoptosis in a metacaspase independent way in Candida albicans. FEBS Letters 583 (15): 2513-2516p, 2009. Aerts, A.M.; François, I.E.; Cammue, B.P.; Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cellular and Molecular Life Sciences 65 (13): 2069-2079p, 2008. Aerts, A.M.; François, I.E.; Meert, E.M.K.; Li, Q.T.; Cammue, B.P.A.; Thevissen, K. The Antifungal Activity of RsAFP2, a plant defensin from Raphanus sativus, involves the induction of reactive oxygen species in Candida albicans. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 13: 243-247p, 2007a. Aerts, A.M.; Thevissen, K.; Bresseleers, S.M.; Sels, J.; Wouters, P.; Cammue, B.P.; Francois, I.E. Arabidopsis thaliana plants expressing human beta-defensin-2 are more resistant to fungal attack: functional homology between plant and human defensins. Plant Cell Reports 26: 1391-1398p, 2007b. Ahmad, V.U.; Hussain, J.; Hussain, H.; Jassbi, A.R.; Ullah, F.; Lodhi, M.A.; Yasin, A.; Choudhary, M.I. First natural urease inhibitor from Euphorbia decipiens. Chemical & Pharmaceutical Bulletin 51(6) 719-723p, 2003. Ahmad, W.; Nazir, M.; Khan, S.A. The chemical composition of various Euphorbia species for industrial applications. Part II. Neutral lipids of Euphorbia cauducifolia. Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research 31, 85-89p, 1988. Akinrinmade, J.F.; Oyeleye, O.A. Antimicrobial efficacy and tissue reaction of Euphorbia hirta ethanolic extract oncanine wounds. African Journal of Biotechnology 9 (31): 5028-5031p, 2010. ALIIMG. ‘Genius Herbs’ web site. Available from World Wide Web: http://i01.i.aliimg.com/photo/v0/109208103/Jatropha_Curcas_Seeds_for_Plantation_Purp ose.jpg, accession date 18th Dec 2011, cited 10th Feb 2012. Allan, A.; Snyder, A.K.; Preuss, M.; Nielsen, E.E.; Shah, D.M.; Smith, T.J. Plant defensins and virally encoded fungal toxin KP4 inhibit plant root growth. Planta 227: 331-339p, 2008. Allefs, S.J.H.M.; De Jong, E.R.; Florak, D.E.A.; Hoogendoorn, C. Erwinia soft rot resistance of potato cultivars expressing antimicrobial peptide tachyplesin I. Molecular Breeding 2: 97- 105p, 1996. Allem, A.C.; Irgang, B.E. Euphorbiaceae, tribo Euphorbia. In: SCHULTZ, A.R. Flora ilustrada do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, Inst. Central de Biociências. 97p, 1975. Almeida Jr., E.B.; Olivo, M.A.; Araújo, E.L.; Zickel, C.S. Caracterização da vegetação de restinga da RPPN de Maracaípe, PE, Brasil, com base na fisionomia, flora, nutrientes do solo e lençol freático. Acta Botanica Brasilica 23 (1): 36-48p, 2009. Almeida M.S., Cabral K.S., de Medeiros L.N., Valente A.P.,Almeida F.C., Kurtenbach E. cDNA cloning and heterologous expression of functional cysteine-richantifungal protein Psd1 in the yeast Pichia pastoris. Archives of Biochemistry and Biophysics 395:199-207, 2001. Almeida, M.S.; Cabral, K.M.; Kurtenbach, E.; Almeida, F.C.; Valente, A.P. Solution structure of Pisum sativum defensin 1 by high resolution NMR: plant defensins, identical backbone with different mechanisms of action. Journal of Molecular Biology 315: 749-757p, 2002. Almeida, M.S.; Cabral, K.M.; Zingali, R.B.; Kurtenbach, E. Characterization of two novel defense peptides from pea (Pisum sativum) seeds. Archives of Biochemistry and Biophysics 378 (2): 278-286p, 2000. Aloys. N.; Ming, Z.H. Traditional cassava foods in Burundi – A review. Food Reviews International 22: 1-27p, 2006. Al-Qura'n, S. Ethnopharmacological survey of wild medicinal plants in Showbak, Jordan. Journal of Ethnopharmacology 123 (1): 45-50p, 2009. Aluru, M.; Curry, J.; O’Connell, M.A. Nucleotide sequence of a defensin or g-thionin-like gene (accession no. Af128239) from habanero chile. Plant Physiology 120, 633p, 1999.

101

Amaral, A.C.F.; Kuster, R.M.; Gonçalves, J.L.S.; Wigg, M.D. Antiviral investigation on the flavonoids of Chamaesyce thymifolia. Fitoterapia 70: 293-295p, 1999. Amirghofran, Z.; Malek-hosseini, S; Gholmoghaddam, H.; Kalalinia, F. Inhibition of tumor cells growth and stimulation of lymphocytes by Euphorbia species. Immunopharmacology and Immunotoxicology 33 (1): 34-42, 2011. Anaya-López, J.L.; López-Meza, J.E.; Baizabal-Aguirre, V.M.; Cano-Camacho, H.; Ochoa- Zarzosa, A. Fungicidal and cytotoxic activity of a Capsicum chinense defensin expressed by endothelial cells. Biotechnology Letters 28: 1101-1108p, 2006. Anderson, M.A.; Heath, R.L.; Lay, F.T.; Poon, S. Modified plant defensin. US patent application 2009; application 20090083880, 2009. Anfinsen, C.B. Principles that govern the folding of protein chains. Science 181: 223-230p, 1973. Antcheva, N.; Boniotto, M.; Zelezetsky, I.; Pacor, S.; Verga Falzacappa, M.V.; Crovella, S.; Tossi, A. Effects of positively selected sequence variations in humans and Macaca fascicularis b-defensins 2 on antimicrobial activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 48: 685-688p, 2004. Antcheva, N.; Zelezetsky, I.; Tossi, A. Cationic Antimicrobial Peptides - The Defensins. In The Handbook of Biologically Active Peptides; A.J. Kastin, Ed.; Elsevier Science B. V: Amsterdam, 55-66p, 2006. Appendino, G.; Szallasi, A. Euphorbium: Modern research on its active principle, resiniferatoxin, revives an ancient medicine. Life Sciences. 60, 681-696p, 1997. Aqueveque, P.; Bittner, M.; Ruiz, E.; Silva, M. Chemotaxonomy of Chilean species of the genus Euphorbia L. based on their flavonoids profile. Boletin de la Sociedad Chilena de Quimica, 44: 61-65p, 1999. Armengaud, P.; Breitling, R.; Amtmann, A. The potassium-dependent transcriptome of Arabidopsis reveals a prominent role of jasmonic acid in nutrient signaling. Plant Physiology 136: 2556-2576p, 2004. Arnold, K.; Bordoli, L.; Kopp, J.; Schwede, T. The SWISS-MODEL Workspace: A web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics 22:195-201p, 2006. ATR-Árvores. ‘Ache Tudo e Região: Árvores’. Available from World Wide Web: http://www.achetudoeregiao.com.br/arvores/seringueira.htm, accession date 22nd Dec 2011, cited 10th Feb 2012. Ausubel, F.M. Are innate immune signaling pathways in plants and animals conserved? Nature Immunology 10: 973-979p, 2005. Bahramnejad, B.; Erickson, L.R.; Atnaseo, C.; Goodwin, P.H. Differential expression of eight defensin genes of N. benthamiana following biotic stress, wounding, ethylene, and benzothiadiazole treatments. Plant Cell Reports 28 (4): 703-717p, 2009. Baillon, H.E. Histoire des plantes. Paris: L. Hachette et Cie. 262-266p, 1880. Balandín, M.; Royo, J.; Gómez, E.; Muniz, L.M.; Molina, A.; Hueros, G. A protective role for the embryo surrounding region of the maize endosperm, as evidenced by the characterisation of ZmESR-6, a defensin gene specifically expressed in this region. Plant Molecular Biology 58: 269-282p, 2005. Baloch, I.B.; Baloch, M.K.; Saqib, Q.N. Tumor-Promoting Diterpene Esters from Latex of Euphorbia cauducifolia L. Helvetica Chimica Acta 88, 3145-3150p, 2005. Banzet, N.; Latorse, M.P.; Bulet, P.; François, E.; Derpierre, C.; Dubald, M. Expression of insect cystein-rich antifungal peptides in transgenic tobacco enhances resistance to a fungal disease. Plant Science 162: 995-1006p, 2002. Barbosa, M.R.V.; Mayo, S.J.; Castro, A.A.J.F.; Freitas, G.L.; Pereira, M.S.; Gadelha-Neto, P.C.; Moreira, H.M. Checklist preliminar das Angiospermas. In: Sampaio, EVSB, Mayo, SJ e Barbosa, MRV (eds.) Pesquisa botânica nordestina: progresso e perspectivas. SBB, Recife. 253-414, 1996. Barla, A.; Oztürk, M.; Kültür, S.; Oksüz, S. Screening of antioxidant activity of three Euphorbia species from Turkey. Fitoterapia 78 (6): 423-425p, 2007.

102

Barroso, G.M.; Morim, M.P.; Peixoto, A.L.; Ichaso, C.L.F. Frutos e sementes: morfologia aplicada à sistemática de dicotiledôneas. Viçosa: UFV, 443p, 1999. Bastian, A.; Schafer, H. Human α-defensin 1 (HNP-1) inhibits adenoviral infection in vitro. Regulatory Peptides 101, 157-161p, 2001. Batista, D. O complexo da Amazônia. Rio de Janeiro: Conquista. 292p, 1976. Beer, A.; Vivier, M.A. Vv-AMP1, a ripening induced peptide from Vitis vinifera shows strong antifungal activity. BMC Plant Biology 8: 75p, 2008. Belas, R.; Manos, J.; Suvanasuthi, R. Proteus mirabilis ZapA metalloprotease degrades a broad spectrum of substrates, including antimicrobial peptides. Infection and Immunity 72: 5159-5167p, 2004. Bellini, M.R.; Feres, R.J.F.; Buosi, R. Ácaros (Acari) de seringueira (Hevea brasiliensis,Euphorbiaceae) e de euforbiáceas espontâneas no interior dos cultivos. Neotropical Entomology 37 (4): 463-471p, 2008. Benavides, A.; Benjumea, P.; Pashova, V. Castor oil biodiesel as an alternative fuel for diesel engines. Dyna-Colombia, 74: 141-150p, 2007. Benkert, P.; Biasini, M.; Schwede T. Toward the estimation of the absolute quality of individual protein structure models. Bioinformatics 27 (3): 343-350p, 2011. Benkert, P.; Schwede, T.; Tosatto, S.C.E. QMEANclust: Estimation of protein model quality by # combining a composite scoring function with structural density information. BMC Structural Biology 20: 9-35p, 2009. Benko-Iseppon, A.M.; Galdino, S.L.; Calsa, T. Jr; Kido, E.A.; Tossi, A.; Belarmino, L.C.; Crovella, S. Overview on plant antimicrobial peptides. Current Protein & Peptide Science 11 (3): 181-188p, 2010. Benko-Iseppon. A.M.; Crovella, S. Ethnobotanical bioprospection of candidates for potential antimicrobial drugs from Brazilian plants: state of art and perspectives. Current Protein & Peptide Science (3): 189-194p, 2010. Bentham, G.; Hooker, J.D. Genera Plantarum. Lovell Reeve & Co., London. 146-164p, 1880. Berrocal-Lobo, M.; Molina, A.; Rodriguez-Palenzuela, P.; Garcia-Olmedo, F.; Rivas, L. Leishmania donovani: thionins, plant antimicrobial peptides with leishmanicidal activity. Experimental Parasitology 122, 247-249p, 2009. Berrocal-Lobo, M.; Segura, A.; Moreno, M.; López, G.; García-Olmedo, F.; Molina, A. Snakin-2, an antimicrobial peptide from potato whose gene is locally induced by wounding and responds to pathogen infection. Plant Physiology 128: 951-961p, 2002. Betancur-Galvis, L.; Palomares, E.; Marco, J.A.; Estornell, E. Tigliane diterpenes from the latex of Euphorbia obtusifolia with inhibitory activity on the mammalian mitochondrial respiratory chain. Journal of Ethnopharmacology 85: 279-282p, 2003. Betancur-Galvis, L.A.; Morales, G.E.; Forero, J.E.; Roldan, J. Cytotoxic and Antiviral Activities of Colombian Medicinal Plant Extracts of the Euphorbia genus. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 97: 541-546, 2002. Bierbaum, G.; Sahl, H.G. Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. The Journal of Bacteriology 169: 5452-5458p, 1987. Bierbaum, G.; Sahl, H.G. Induction of autolysis of Staphylocci by the basic peptide antibiotics pep5 and nisin and their influence on the activity of autolytic enzymes. Archives of Microbiology 141: 249-254p,1985. Bloch, C. Jr.; Patel, S.U.; Baud, F.; Zvelebil, M.J.; Carr, M.D.; Sadler, P.J.; Thornton, J.M. 1H NMR structure of an antifungal gamma-thionin protein SIalpha1: similarity to scorpion toxins. Proteins 32, 334-349p, 1998. Bloch, C.; Richardson, M. A new family of small (5 kDa) protein inhibitors of insect alpha- amylases from seeds or sorghum (Sorghum bicolor (L) Moench) have sequence homologies with wheat γ-purothionins. FEBS Letters 279 (1): 101-104p, 1991. Blochet, J.E.; Chevalier, C.; Forest, E.; Pebay-Peyroula, E.; Gautier, M.F.; Joudrier, P.; Pézolet, M.; Marion, D. Complete amino acid sequence of puroindoline, a new basic and cystine-

103

rich protein with a unique tryptophan-rich domain, isolated from wheat endosperm by Triton X-114 phase partitioning. FEBS Letters 329: 336-340p, 1993. Blundell, T.L.; Bedarkar, S.; Rinderknech, E.; Humble, R.E. Insulin-like growth factor: a model for tertiary structure accounting for immunoreactivity and receptor binding. Proceedings of the National Academy of Sciences 75: 180-184p, 1978. Bohlmann, H. The role of thionins in plant protection. Critical Reviews in Plant Sciences 13, 1- 16p, 1994. Bontems, F.; Gilquin, B.; Roumestand, C.; Ménez, A.; Toma, F. Analysis of side-chain organization on a refined model of charybdotoxin: structural and functional implications. Biochemistry, 31, 7756-7764p, 1992. Bontems, F.; Roumestand, C.; Gilquin, B.; Menez, A.; Toma, F. Refined structure of charybdotoxin: common motifs in scorpion toxins and insect defensins. Science 254, 1521-1523p, 1991. Bowles, D.J. Defense-related proteins in higher plants. Annual Review of Biochemistry 59: 873- 907p, 1990. Braga, R. Plantas do nordeste especialmente do Ceará. Mossoró. Escola Superior de Agricultura. l70p, 1976. Brakhage, A.A. Systemic fungal infections cuased by Aspergillus species: epidemiology, infection process and virulence determinants. Current drug targets 6: 875-886p, 2005. Brandstadter, J., Rossbach, C. and Theres, K. Expression of genes for a defensin and a proteinase inhibitor in specific areas of the shoot apex and the developing flower in tomato. Molecular & General Genetics 252: 146-154p, 1996. Broekaert, W.; Van Parijs, J.; Leyns, F.; Joos, H.; Peumans, W. A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties. Science 245: 1100-1102p, 1989. Broekaert, W.F.; Cammue, B.P.A.; De Bolle, M.F.C.; Thevissen, K.; De Samblanx, G.W.; Osborn, R.W. Antimicrobial peptides from plants. Critical Reviews in Plant Sciences 16, 297-323p, 1997. Broekaert, W.F.; Mariën, W.; Terras, F.R.; De Bolle, M.F.; Proost, P.; Van Damme, J.; Dillen, L.; Claeys, M.; Rees, S.B.; Vanderleyden, J.; Cammue, B.P.A. Antimicrobial peptides from Amaranthus caudatus seeds with sequence homology to the cysteine/glycine-rich domain of chitin-binding proteins. Biochemistry 31: 4308-4314p, 1992. Broekaert, W.F.; Terras, F.R.; Cammue, B.P.; Osborn, R.W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. Plant Physiology 108 (4): 1353- 1358p, 1995. Brogden, K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nature Reviews Microbiology 3: 238-250p, 2005. Brogden, K.A.; Ackermann, M.; McCray, P.B.; Tack, B.F. Antimicrobial peptides in animals and their role in host defences. International Journal of Antimicrobial Agents 22: 465-478p, 2003. Bruix, M.; Jimenez, M.A.; Santoro, J.; Gonzalez, C.; Colilla, F.J.; Mendez, E.; Rico, M. Solution structure of gamma 1-H and gamma 1-P thionins from barley and wheat endosperm determined by 1H-NMR: a structural motif common to toxic arthropod proteins. Biochemistry 32 (2): 715-724p, 1993. Bruyns, P.V.; Mapaya, R.J.; Hedderson, T. A new subgeneric classification for Euphorbia (Euphorbiaceae) in southern Africa based on its and PSBA-TRNH sequence data. Taxon 55 (2): 397-420p, 2006. Bulet, P.; Hetru, C.; Dimarcq, J-L.; Hofmann, D. Antimicrobial peptides in insects; structure and function. Developmental & Comparative Immunology 23: 329-344p, 1999. Bulet, P.; Stocklin, R.; Menin, L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunological Reviews 198: 169-184p, 2004. Buscaglia, C.A.; Campo, V.A.; Frasch, A.C.C.; Noia, J.M.D. Trypanosoma cruzi surface mucins: host-dependent coat diversity. Nature Reviews Microbiology 4: 229-236p, 2006.

104

Buzaid, A.C.; Atkins, M. Practical guidelines for the management of biochemotherapy - related toxicity in melanoma. Clinical Cancer Research 7: 2611-2619p, 2001. Caldwell, J.E.; Abildgaard, F.; Dzakula, Z.; Ming, D.; Hellekant, G.; Markley, J.L. Solution structure of the thermostable sweet-tasting protein brazzein. Nature Structural Biology 5: 427-431p, 1998. Cammue, B.P.; De Bolle, M.F.; Terras, F.R.; Proost, P.; Van Damme, J.; Rees, S.B.; Vanderleyden, J.; Broekaert, W.F. Isolation and characterization of a novel class of plant antimicrobial peptides form Mirabilis jalapa L. seeds. Journal of Biological Chemistry 267: 2228-2233p, 1992. Cammue, B.P.; Thevissen, K.; Hendriks, M.; Eggermont, K.; Goderis, I.J.; Proost, P.; Van Damme, J.; Osborn, R.W.; Guerbette, F.; Kader, J.C.; Broekaert, W.F. A potent antimicrobial protein from onion seeds showing sequence homology to plant lipid transfer proteins. Plant Physiology 109: 445-455p, 1995. Campos, M.A.; Vargas, M.A.; Regueiro, V.; Llompart, C.M.; Albertí, S.; Bengoechea, J.A. Capsule polysaccharide mediates bacterial resistance to antimicrobial peptides. Infection and Immunity 72: 7107-7114p, 2004. Cano-Delgado, A.; Penfield, S.; Smith, C.; Catley, M.; Bevan, M. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 34: 351-362p, 2003. Carneiro, D.C.; Cordeiro, I.; França, F. A família Euphorbiaceae na Flora de Inselbergs da região de Milagres, Bahia, Brasil. Boletim de Botânica 20: 31-47p, 2002. Carvalho, A.O.; Filho, G.A.S.; Ferreira, B.S.; Branco, A.T.; Okorokova-Façanha, A.L.; Gomes, V.M.. Cloning and characterization of a cDNA encoding a cowpea seed defensin and analysis of its expression. Protein & Peptide Letters 13: 1029-1036p, 2006. Carvalho, A.O.; Gomes, V.M. Plant defensins - Prospects for the biological functions and biotechnological properties. Peptides 30: 1007-1020p, 2009. Carvalho, A.O.; Machado, O.L.T.; Da Cunha, M.; Santos, I.S.; Gomes, V.M. Antimicrobial peptides and immunolocalization of a LTP in Vigna unguiculata seeds. Plant Physiology and Biochemistry 39: 137-146p, 2001. Castro, M.S.; Fontes W. Plant defense and antimicrobial peptides. Protein & Peptide Letters 12 (1): 13-18p, 2005. Cateni, F.; Falsone, G.; Zilic, J. Terpenoids and glycolipids from Euphorbiaceae. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 3: 425-437p, 2003. Ceraul, S.M.; Dreher-Lesnick, S.M.; Gillespie, J.J.; Rahaman, M.S.; Azad, A.F. New Tick Defensin Isoform and Antimicrobial Gene Expression in Response to Rickettsia montanensis Challenge. Infection and Immunity 75 (4): 1973-1983p, 2007. Ceroni, A.; Passerini, A.; Vullo, A.; Frasconi, P. DISULFIND: a Disulfide Bonding State and Cysteine Connectivity Prediction Server, Nucleic Acids Research 34:W177-W181p, 2006. Chan, A.P.; Crabtree, J.; Zhao, Q.; Lorenzi, H.; Orvis, J.; Puiu, D.; Melake-Berhan, A.; Jones, K.M.; Redman, J.; Chen, G.; Cahoon, E.B.; Gedil, M.; Stanke, M.; Haas, B.J.; Wortman, J.R.; Fraser-Liggett, C.M.; Ravel, J.; Rabinowicz, P.D. Draft genome sequence of the oilseed species Ricinus communis. Nature Biotechnology 28 (9): 951-956p, 2010. Charlet, M.; Chernysh, S.; Philippe, H.; Hetru, C.; Hoffmann, J.A.; Bulet, P. Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusk, Mytilus edulis. The Journal of Biological Chemistry 271 (36): 21808-21813p, 1996. Chase, M.W.; Reveal, J.L. A phylogenetic classification of the land plants to accompany APG III. Botanical Journal of the Linnean Society 161 (2): 122-127p, 2009. Chen, B.; Colgrave, M.L.; Daly, N.L.; Rosengren, K.J.; Gustafson, K.R.; Craik, D.J. Isolation and characterization of novel cyclotides from Viola hederaceae: solution structure and anti- HIV activity of vhl-1, a leaf-specific expressed cyclotide. Journal of Biological Chemistry 280: 22395-22405p, 2005b.

105

Chen, G-H.; Hsu, M-P.; Tan, C-H.; Sung, H-Y.; Kuo, C.G.; Fan, M-J. Cloning and characterization of a plant defensin VaD1 from azuki bean. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53: 982-988p, 2005a. Chen, J.-J.; Chen, G.-H.; Hsu, H.-C.; Li, S.-S.; Chen, C.-S. Cloning and functional expression of a mungbean defensin VrD1 in Pichia pastoris. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52: 2256-2261p, 2004. Chen, S-C.; Liu, A-R.; Zou, Z-R. Overexpression of glucanase gene and defensin gene in transgenic tomato enhances resistance to Ralstonia solanacearum. Russian Journal of Plant Physiology 53 (5): 671-677p, 2006. Chen, X.; Hou, X.; Zhang, J.; Zheng, J. Molecular characterization of two important antifungal proteins isolated by downy mildew infection in non-heading Chinese cabbage. Molecular Biololy Reports 35: 621-629p, 2008. Chen, Z.; Gallie, D.R. Dehydroascorbate reductase affects leaf growth, development and function. Plant Physiology 142: 775-787p, 2006. Chiang, C.C.; Hadwiger, L.A. The Fusarium solani-induced expression of a pea gene family encoding high cysteine content proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions 4: 324- 331p, 1991. Clark, A.G.; Wang, L. Molecular population genetics of Drosophila immune system genes. Genetics 147, 713-724p, 1997. Coca, M.; Bortolotti, C.; Rufat, M.; Peñas, G.; Eritja, R.; Tharreau, D.; del Pozo, A.M.; Messeguer, J.; San Segundo, B. Transgenic rice plants expressing the antifungal AFP protein from Aspergillus giganteus show enhanced resistance to the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Plant Molecular Biology 54: 245-259p, 2004. Cociancich, S.; Ghazi, A.; Hetru, C.; Hoffmann, J.A.; Letellier, L. Insect defensin, an inducible antibacterial peptide, forms voltage- dependent channels in Micrococcus luteus. The Journal of Biological Chemistry 268: 19239-19245p, 1993a. Cociancich, S.; Goyffon, M.; Bontems, F.; Bulet, P.; Bouet, F.; Menez, A.; Hoffmann, J. Purification and characterization of a scorpion defensin, a 4 kDa antibacterial peptide presenting structural similarities with insect defensis and scorpion. Biochemical and Biophysical Research Communications 194 (1): 17-22p, 1993b. Colilla, F.J.; Rocher, R.; Mendez, E. Gamma-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. FEBS Letters 270, 191- 194p, 1990. Conlan, B.F.; Gillon, A.D.; Craik, D.J.; Anderson, M.A. Circular proteins and mechanisms of cyclization. Biopolymers 94 (5): 573-583p, 2010. Cordeiro, I.; Carneiro-Torres, D. Euphorbiaceae. In: Checklist das plantas do nordeste brasileiro: Angiospermas e Gymnospermas. Brasília: Ministério de Ciência e Tecnologia. 71-74p, 2006. Corea, G.; Fattorusso, E.; Lanzotti, V.; Taglialatela-Scafati, O.; Appendino, G.; Ballero, M.; Simon, P.N.; Dumontet, C.; Di Pietro, A. Modified jatrophane diterpenes as modulators of multidrug resistance from Euphorbia dendroides L. Bioorganic & Medicinal Chemistry 11 (23): 5221-5227p, 2003. Cornet, B.; Bonmatin, J.M.; Hetru, C.; Hoffmann, J.A.; Ptak, M.; Vovelle, F. Refined three- dimensional solution structure of insect defensin A. Structure 3: 435-448p, 1995. Corradini, M. ‘Jardim de Plantas Suculentas’ web site. Available from World Wide Web: http://www.jardimdesuculentas.net76.net/fichas/eup/imeup07b.jpg, accession date 20th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Corrêa, M.P. Dicionário das plantas úteis do Brasil. IV, Ministério da Agricultura, Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, 111-112p, 1984. Cruciani, R.A.; Barker, J.L.; Zasloff, M.; Chen, H.C.; Colamonici, O. Antibiotic magainins exert cytolytic activity against transformed cell lines through channel formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A, 88, 3792-3796p, 1991.

106

Da Rocha Pitta, M.G.; da Rocha Pitta, M.G.; Galdino, S.L. Development of novel therapeutic drugs in humans from plant antimicrobial peptides. Current Protein & Peptide Science 11(3): 236-247, 2010. Daly, N.L.; Koltay, A.; Gustafson, K.R.; Boyd, M.R.; Casas-Finet, J.R.; Craik, D.J. Solution structure by NMR of circulin A: a macrocyclic knotted peptide having anti-HIV activity. Journal of Molecular Biology 285: 333-345p, 1999. Darveau, R.P.; Cunningham, M.D.; Seachord, C.L.; Cassiano-Clough, L.; Cosand, W.L.; Blake, J.; Watkins, C.S. β-lactam antibiotics potentiate Magainin 2 antimicrobial activity in vitro and in vivo. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 35: 1153-1159p, 1991. De Gray, G.; Rajasekaran, K.; Smith, F.; Sanford, J.; Daniell, H. Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiology 127: 852-862p, 2001. De Medeiros, L.N.; Angeli, R.; Sarzedas, C.G.; Barreto-Bergter, E.; Valente, A.P.; Kurtenbach, E.; Almeida, F.C. Backbone dynamics of the antifungal Psd1 pea defensin and its correlation with membrane interaction by NMR spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta 1798 (2): 105-113P, 2009. De Melo, J.G.; Santos, A.G.; de Amorim, E.L.; do Nascimento, S.C.; de Albuquerque, U.P. Medicinal plants used as antitumor agents in Brazil: an ethnobotanical approach. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine: 365-359p, 2011. De Paula, V.S.; Razzera, G.; Medeiros, L.; Miyamoto, C.A.; Almeida, M.S.; Kurtenbach, E.; Almeida, C.L.; Valente, A.P. Evolutionary relationship between defensins in the Poaceae family strengthened by the characterization of new sugarcane defensins. Plant Molecular Biology 68: 321-335p, 2008. De Samblanx, G.W., Goderis, I.J., Thevissen, K., Raemaekers, R., Fant, F., Borremans, F., Acland, D.P., Osborn, R.W., Patel, S. and Broekaert, W.F. Mutational analysis of a plant defensin from radish (Raphanus sativus L.) reveals two adjacent sites important for antifungal activity. The Journal of Biological Chemistry 272, 1171-1179p, 1997. De Samblanx, G.W.; Fernandez del Carmen, A.; Sijtsma, L.; Plasman, H.H.; Schaaper, W.M.; Posthuma, G.A.; Fant, F.; Meloen, R.H.; Broekaert, W.F.; van Amerongen, A. Antifungal activity of synthetic 15-mer peptides based on the Rs-AFP2 (Raphanus sativus antifungal protein 2) sequence. Journal of Peptide Research 9: 262-268p, 1996. De Vasconcelos, M.J.V.; Abdelnoor, R.V.; Karan, D.; Almeida, A.M.R.; de Oliveira, M.F. Barros, E.G.; Moreira, M.A. Variabilidade genética em biotipos de leiteiro de Londrina/PR. Planta Daninha 18 (2): 285-292p, 2000. Dickson, R.C.; Nagiec, E.E.; Wells, G.B.; Nagiec, M.M.; Lester, R.L. Synthesis of mannose- (inositol-P)2-ceramide, the major sphingolipid in Saccharomyces cerevisiae, requires the IPT1 (YDR072c) gene. Journal of Biological Chemistry 272: 29620-29625p, 1997. Do, H.M.; Lee, S.C.; Jung, H.W.; Sohn, K.H.; Hwang, B.K. Differential expression and in situ localization of a pepper defensin (CADEF1) gene in response to pathogen infection, abiotic elicitors and environmental stresses in Capsicum annuum. Plant Science 166: 1297-1305p, 2004. Dobrzynska, I.; Szachowicz-Petelska, B.; Sulkowski, S.; Figaszewski, Z. Changes in electric charge and phospholipids composition in human colorectal cancer cells. Molecular and Cellular Biochemistry 276: 113-119p, 2005. Domsalla, A.; Garshasebi, A.; Melzig, M. Inhibitory profile of latex-proteases in the genus Euphorbia Planta Medica 76 (12): 1269-1269p, 2010b. Domsalla, A.; Gorick, C.; Melzig, M.F. Proteolytic activity in latex of the genus Euphorbia - a chemotaxonomic marker? Pharmazie 65 (3): 227-230p, 2010a. Dos Santos, I.S.; Carvalho, A.O.; de Souza-Filho, G.A.; do Nascimento, V.V.; Machado, O.L.; Gomes, V.M.Purification of a defensin isolated from Vigna unguiculata seeds, its functional expression in Escherichia coli, and assessment of its insect alpha-amylase inhibitory activity. Protein Expression and Purification 71 (1): 8-15p, 2010.

107

Doughty, J.; Dixon, S.; Hiscock, S.J.; Willis, A.C.; Parkin, I.A.P.; Dickinson, H.G. PCP-A1, a defensin-like brassica pollen coat protein that binds the S locus glycoprotein, is the product of gametophytic gene expression. The Plant Cell 10:1333-1347p, 1998. Duarte, N.; Gyémánt, N.; Abreu, P.M.; Molnár, J.; Ferreira, M.J.U. New macrocyclic lathyrane diterpenes, from Euphorbia lagascae, as inhibitors of multidrug resistance of tumour cells. Planta Medica 72: 162-168p, 2006. Duarte, N.; Ramalhete, C.; Varga, A.; Molnar, J.; Ferreira, M.J.U. Multidrug Resistance Modulation and Apoptosis Induction of Cancer Cells by Terpenic Compounds Isolated from Euphorbia Species. Anticancer Research 29 (11): 4467-4472p, 2009. Duke, J.A. Handbook of Energy Crops. Purdue University centre for new crops and plant products. www.hort.purdue.educ. Acessado em 10 de setembro de 2011. (1983). Durrant, W.E.; Dong, X. Systemic Acquired Resistance. Annual Review of Phytopathology 42, 185-209p, 2004. Duvick, J.P.; Rood, T.; Rao, A.G.; Marshak, D.R. Purification and characterization of a novel antimicrobial peptide from maize (Zea mays L.) kernels. Journal of Biological Chemistry 267: 18814-18820p, 1992. Engh, R.A.; Huber, R. Accurate bond and angle parameters for X-ray protein structure refinement. Acta Crystallographica A47: 392-400p, 1991. Epand, R. M.; Vogel, H.J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochimica et Biophysica Acta 1462 (1-2): 11-28p, 1999. Epple, P.; Apel, K.; Bohlmann, H. An Arabidopsis thaliana thionin gene is inducible via a signal transduction pathway different from that for pathogenesis-related proteins. Plant Physiology 109: 813-820p, 1995. Epple, P.; Apel, K.; Bohlmann, H. Overexpression of an endogenous thionin enhances resistance of Arabidopsis against Fusarium oxysporum. The Plant Cell 9:509-520p, 1997. Espinosa, E.; Zamora, P.; Feliu, J.; Gonzalez Baron, M. Classification of anticancer drugs - a new system based on therapeutic targets. Cancer Treatment Reviews 29: 515-523p, 2003. Esser, H.J.; Berry, P.E.; Riina, R. EuphORBia: a global inventory of the spurges Blumea 54 (1- 3): 11-12p, 2009. Eswar, N.; Eramian, D.; Webb, B.; Shen, M.Y.; Sali, A. Protein Structure Modeling with Modeller. Methods in Molecular Biology 426: 145-159p, 2008. Evans, F.J.; Taylor, S.E. Pro-inflammatory, tumour-promoting and anti-tumour diterpenses of the plant families Euphorbiaceae and Thymelaeaceae. Progress in the chemistry of organic natural 44: 1-99p, 1983. Fant, F.; Vranken, W.; Broekaert, W.; Borremans, F. Determination of the threedimensional solution structure of Raphanus sativus antifungal protein 1 by 1H NMR. Journal of Molecular Biology 279: 257-270p, 1998. Fatope, M.O.; Zeng, L.; Ohayaga, J.E.; Shi, G.; McLaughlin, J.L. Selectively cytotoxic diterpenes from Euphorbia poisonii. Journal of Medicinal Chemistry 39, 1005-1008p, 1996. Finkina, E.I.; Shramova, E.I.; Tagaev, A.A.; Ovchinnikova, T.V. A novel defensin from the lentil Lens culinaris seeds. Biochemical and Biophysical Research Communications 371: 860- 865p, 2008. Finlay, B.B.; Hancock, R.E. Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections? Nature Reviews Microbiology 2, 497-504p, 2004. Fischbach, M.A.; Walsh, C.T. Antibiotics for emerging pathogens. Science 325: 1089-1093p, 2009. Florack, D.E.; Dirkse, W.G.; Visser, B.; Heidekamp, F.; Stiekema, W.J. Expression of biologically active hordothionins in tobacco. Effects of pre- and pro-sequences at the amino and carboxyl termini of the hordothionin precursor on mature protein expression and sorting. Plant Molecular Biology 24, 83-96p, 1994.

108

Florack, D.E.A.; Stiekema, W.J. Thionins: properties, possible biological roles and mechanisms of action. Plant Molecular Biology 26, 25-37p, 1994. Franco, O.L.; Murad, A.M.; Leite, J.R.; Mendes, P.A.M.; Prates, M.V.; Bloch, C. Identification of a cowpea g-thionin with bactericidal activity. FEBS Journal 273: 3489-3497p, 2006. Francois, I.E.; Aerts, A.M.; Cammue, B.P.; Thevissen, K. Currently used antimycotics: spectrum, mode of action and resistance occurrence. Current drug targets 6, 895-907p, 2005. Frecer, V.; Ho, B.; Ding, J.L. De Novo Design of Potent Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 48: 3349-3357p, 2004. Friedrich, C.L.; Moyles, D.; Beveridge, T.J.; Hancock, R.E. Antibacterial action of structurally diverse cationic peptides on gram-positive bacteria. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44: 2086-2092p, 2000. Frokjaer, S.; Otzen, D.E. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery 4: 289-306p, 2005. Fujimura, M.; Ideguchi, M.; Minami, Y.; Watanabe, K.; Tadera, K. Purification, characterization and sequencing of novel antimicrobial peptides Tu-AMP1 and Tu-AMP2 from bulbs of tulip (Tulipa gesneriana L.). Bioscience Biotechnology & Biochemistry 68 (3): 571-577p, 2004. Games, P.D.; Dos Santos, I.S.; Mello, E.O.; Diz, M.S.; Carvalho, A.O.; de, Souza-Filho, G.A.; Da, Cunha, M.; Vasconcelos, I.M.; Ferreira, B.S.; Gomes, V.M., Isolation, characterization and cloning of a cDNA encoding a new antifungal defensin from Phaseolus vulgaris L. seeds. Peptides 29: 2090-2100p, 2008. Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of vertebrates. Comptes Rendus Biologies 327, 539- 549p, 2004. Ganz, T.; Lehrer, R.I. Defensins. Current Opinion in Immunology 6: 584-589p, 1994. Gao, A.G.; Hakimi, S.M.; Mittanck, C.A.; Wu, Y.; Woerner, B.M.; Stark, D.M. Shah, D.M.; Liang, J.; Rommens, C.M. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide. Nature Biotechnology 18: 1307-1310p, 2000. Gao, B.; Rodriguez, M.M.; Lanz-Mendoza, H.; Zhu, S. AdDLP, a bacterial defensin-like peptide, exhibits anti-Plasmodium activity. Biochemical and Biophysical Research Communications 387: 393-398p, 2009. García-Olmedo, F.; Molina, A.; Alamillo, J.M.; Rodríguez-Palenzuéla, P. Plant defense peptides. Biopolymers 47 (6): 479-491p, 1998. Garg, J.M. ‘Wikimedia’ web site. Available from World Wide Web: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1c/Euphorbia_heterophylla_%28Painte d_Euphorbia%29_in_Hyderabad%2C_AP_W_IMG_9720.jpg, accession date 20th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Garrill, A.; Jackson, S.L.; Lew, R.R.; Heath, B.I. Ion channel activity and tip growth: tip-localized stretch-activated channels generate an essential Ca2+ gradient in the oomycete Saprolegnia ferax. European Journal of Cell Biology 60: 358-365p, 1993. Gasteiger, E.; Hoogland, C.; Gattiker, A.; Duvaud, S.; Wilkins, M.R.; Appel, R.D.; Bairoch, A. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server; In: John M. Walker - The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press. 571-607p, 2005. Gatti, L.; Zunino, F. Overview of tumor cell chemoresistance mechanisms. Methods in Molecular Medicine 111: 127-148p, 2005. Gaudet, D.A.; Laroche, A.; Frick, M.; Huel, R.; Puchalski, B. Cold induced expression of plant defensin and lipid transfer protein transcripts in winter wheat. Physiologia Plantarum 117: 195-205p, 2003. Gautier, M.F.; Aleman, M.E.; Guirao, A.; Marion, D.; Joudrier, P. Triticum aestivum puroindolines, two basic cystine-rich seed proteins: cDNA sequence analysis and developmental gene expression. Plant Molecular Biology 25: 43-57p, 1994.

109

Giudici, M.; Poveda, J.A.; Molina, M.L.; de la Canal, L.; Gonzalez-Ros, J.M.; Pfuller, K.; Pfuller, U.; Villalain, J. Antifungal effects and mechanism of action of viscotoxin A3. FEBS Journal 273: 72-83p, 2006. Gordon, Y.J.; Romanowski, E.G.; McDermott, A.M. A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as antiinfective drugs. Current Eye Research 30: 505-515p, 2005. Gouet, P.; Courcelle, E.; Stuart, D.I.; Metoz, F. ESPript: multiple sequence alignments in PostScript. Bioinformatics: 15 305-308p, 1999. Grabowski, M.; Joachimiak, A.; Otwinowski, Z.; Minor, W. Structural genomics: keeping up with expanding knowledge of the protein universe. Current Opinion in Structural Biology 17: 347-353p, 2007. Groisman, E.A. How bacteria resist killing by host-defense peptides. Trends in Microbiology 2: 444-448p, 1994. Groisman, E.A.; Parra-Lopez, C.; Salcedo, M.; Lipps, C. J.; Heffron, F. Resistance to host antimicrobial peptides is necessary for Salmonella virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 89: 11939-11943p, 1992. Grubor, B.; Gallup, J.M.; Meyerholz, D.K.; Crouch, E.C.; Evans, R.B.; Brogden, K.A.; Lehmkuhl, H.D.; Ackermann, M.R. Enhanced surfactant protein and defensin mRNA levels and reduced viral replication during parainfluenza virus type 3 pneumonia in neonatal lambs. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 11, 599-607p, 2004. Gu, Q.; Kawata, E.E.; Morse, M.J.; Wu, H.M.; Cheung, A.Y. Molecular & General Genetics 234, 89-96p, 1992. Guex, N.; Peitsch, M.C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis 18: 2714-2723p, 1997. Guglieri-Caporal, A.; Caporal, F.J.M.; Kufner, D.C.L.; Alves, F.M. Flora invasora de cultivos de aveia-preta, milho e sorgo em região de cerrado do Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil. Bragantia 70 (2): 247-254p, 2011. Gundidza M, Sorg B, Hecker A skin irritant principle from Euphorbia matabelensis Pax. Journal of Ethnopharmacology 39 (3): 209-212p, 1993. Hallock, Y.F.; Sowder, R.C.; Pannell, L.K.; Hughes, C.B.; Johnson, D.G.; Gulakowski, R.; Cardellina, J.H.; Boyd, M.R. Cycloviolins A-D, anti-HIV macrocyclic peptides from Leonia cymosa. Journal of Organic Chemistry 65: 124-128p, 2000. Hamilton-Miller, J.M.T. Antibiotic resistance from two perspectives: man and microbe. International Journal of Antimicrobial Agents 23: 209-212p, 2004. Hammami, R.; Ben Hamida, J.; Vergoten, G.; Fliss, I. PhytAMP: a database dedicated to antimicrobial plant peptides. Nucleic Acids Research 37: D963-968p, 2009 Hammerschmidt, R. Induced disease resistance: how do induced plants stop pathogens? Physiology and Molecular Plant Pathology 55(2): 77-84p, 1999. Hancock, R.E.; Chapple, D.S. Peptide antibiotics. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43 (6): 1317-1323p, 1999. Hancock, R.E.; Lehrer, R. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends in Biotechnology 16, 82-88p, 1998. Hancock, R.E.; Patrzykat, A. Clinical development of cationic antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics. Current Drug Targets - Infectious Disorders 2: 79-83p, 2002. Hancock, R.E.W. Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel antimicrobials. The Lancet Infectious Diseases 1: 156-164p, 2001. Hancock, R.E.W.; Rozek, A. Role of membranes in the activities of antimicrobial cationic peptides. FEMS Microbiol. Lett., 206, 143-149p, 2002. Hanks, J.N.; Snyder, A.K.; Graham, M.A.; Shah, R.K.; Blaylock, L.A.; Harrison, M.J.; Shah, D.M. Defensin gene family in Medicago truncatula: structure, expression and induction by signal molecules. Plant Molecular Biology 58: 385-399p, 2005. Hans, A.S. Chromosomal Conspectus of the Euphorbiaceae. Taxon 22 (5/6): 591-636p, 1973. Hartwell, J. Plants used against cancer. A survey. Journal of Natural Products 32: 153-205p, 1969.

110

HEAR. ‘Hawaiian Ecosystems at Risk project’. Available from World Wide Web: http://www.hear.org/starr/images/images/plants/full/starr-090618-1234.jpg, accession date 15th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Heil, M.; Bostock, R.M. Induced systemic resistance. (ISR) against pathogens in the context of induced plant defences. Annals of botany 89: 503-512p, 2002. Heywood, V.H. Flowering plants of the World. Oxford University Press. New York. 336p. 1993. Hezareh, M. Prostratin as a new therapeutic agent targeting HIV viral reservoirs. Drug News & Perspective 18: 496-500p, 2005. Hoover, D.M.; Rajashankar, K.R.; Blumenthal, R.; Puri, A.; Oppenheim, J.J.; Chertov, O.; Lubkowski, J. The structure of human b-defensin-2 shows evidence of higher order oligomerization. The Journal of Biological Chemistry 275: 32911-32918p, 2000. Hore, S.K.; Ahuja, V.; Mehta, G.; Kumar, P.; Pandey, S.K.; Ahmad, A.H. Effect of aqueous Euphorbia hirta leaf extract on gastrointestinal motility. Fitoterapia 77 (1): 35-38p, 2006. Huang, G-J.; Lai, H-C.; Chang, Y-S.; Sheu, M-J.; Lu, T-L.; Huang, S-S.; Lin, Y-H. Antimicrobial, dehydroascorbate reductase, and monodehydroascorbate reductase activities of defensin from sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam. ‘tainong 57’] storage roots. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56: 2989-2995p, 2008. Hughes, A.L. Evolutionary diversification of the mammalian defensin. Cellular and Molecular Life Sciences 56: 94-103p, 1999. Humphrey, W.; Dalke, A.; Schulten, K. "VMD - Visual Molecular Dynamics", Journal of Molecular Graphics 14: 33-38p, 1996. Hutchinson, J., Tribalism in the family Euphorbiaceae. American Journal of Botany 56: 738- 758p, 1969. Hwang, P.M.; Vogel, H.J. Structure-function relationships of antimicrobial peptides. Biochemistry and Cell Biology 76: 235-246p, 1998. Ioannidis, A.S.; Papageorgiou, K.I.; Andreou, P.S. Exposure to Euphorbia lathyris latex resulting in alkaline chemical injury: a case report. Journal of Medical Case Reports 3:115p, 2009. Ireland, D.C.; Colgrave, M.L.; Craik, D.J. A novel suite of cyclotides from Viola odorata: sequence variation and the implications for structure, function and stability. Biochemical Journal 400: 1-12p, 2006. Jabbar, A.; Khan, G.A.M.S. Antimicrobial alkaloids from Euphorbia thymifolia. Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research 8: 293p, 1965. Jablonsky, M.J.; Jackson, P.L.; Krishna, N.R. Solution structure of an insect-specific neurotoxin from the New World scorpion Centruroides sculpturatus Ewing. Biochemistry 40: 8273- 8282p, 2001. Jabs, T., Tschope, M., Colling, C., Hahlbrock, K. and Scheel, D. Elicitor-stimulated ion fluxes and O2- from the oxidative burst are essential components in triggering defense gene activation and phytoalexin synthesis in parsley. Proceedings of the National Academy of Sciences 94: 4800-4805p, 1997. Janssen, B.J.; Schirra, H.J.; Lay, F.T.; Anderson, M.A.; Craik, D.J. Structure of Petunia hybrida defensin 1, a novel plant defensin with five disulfide bonds. Biochemistry 42: 8214-8222p, 2003. Jassbi, AR. Chemistry and biological activity of secondary metabolites in Euphorbia from Iran. Phytochemistry 67 (18): 1977-1984p, 2006. Jennings, C.; West, J.; Waine, C.; Craik, D.; Anderson, M. Biosynthesis and insecticidal properties of plant cyclotides: the cyclic knotted proteins from Oldenlandia affinis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98: 10614-10619p, 2001. Jennings, C.V.; Rosengren, K.J.; Daly, N.L.; Plan, M.; Stevens, J.; Scanlon, M.J.; Waine, C.; Norman, D.G.; Anderson, M.A.; Craik, D.J. Isolation,solution structure, and insecticidal activity of kalata B2, a circular protein with a twist: do Möbius strips exist in nature? Biochemistry 44 (3): 851-860p, 2005. Jensen, U.; Vogel-Bauer I.; Nitsche, M. Leguminlike proteins and the systematics of the Euphorbiaceae. Annals of Missouri Botanical Garden 81(2): 160-179p, 1994.

111

Jenssen, H.; Hamill, P.; Hancock, R.E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews 19, 491-511p, 2006. Jha, S.; Tank, H.G.; Prasad, B.D.; Chattoo, B.B. Expression of Dm-AMP1 in rice confers resistance to Magnaporthe oryzae and Rhizoctonia solani. Transgenic Research 18: 59- 69p, 2009. Kagan, B.L.; Selsted, M.E.; Ganz, T.; Lehrer, R.I. Antimicrobial defensin peptides form voltage- dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87: 210-214p, 1990. Kane, S.R.; Mohite, S.K.R.; Adnaik, S.; Magdum, C.S. Laxative activity of aqueous extract of Euphorbia thymifolia Linn. Journal of Herbal Medicine and Toxicology 3 (1): 139-140p, 2009. Kant, P.; Liu, W.Z.; Pauls, K.P. PDC1, a corn defensin peptide expressed in Escherichia coli and Pichia pastoris inhibits growth of Fusarium graminearum. Peptides 30 (9): 1593- 1599p, 2009. Kanzaki, H.; Nirasawa, S.; Saitoh, H.; Ito, M.; Nishihara, M.; Terauchi, R.; Nakamura, I. Overexpression of the wasabi defensin gene confers enhanced resistance to blast fungus (Magnaporthe grisea) in transgenic rice. Theoretical and Applied Genetics 105: 809- 814p, 2002. Karunanandaa, B.; Singh, A.; Kao, T.-h. Characterization of a predominantly pistil-expressed gene encoding a-thionin-like protein of Petunia inflata. Plant Molecular Biology 26, 459- 464, 1994. Kathriarachchi, H.; Samuel, R.; Hoffmann, P.; Mlinarec, J.; Wurdack, K.J.; Ralimanana, H.N.; Stuesy, T.F.; Chase, M.W. Phylogenetics of tribe Phyllantheae (Phyllanthaceae, Euphorbiaceae sensu lato) based on nrITS and plastid matK DNA sequence data. American Journal of Botany 93: 637-655p, 2006. Kawano, T. Roles of the reactive oxygen species-generating peroxidase reactions in plant defense and growth induction. Plant Cell Reports 21, 829-837p, 2003. Kedei, N.; Lundberg, D.J.; Toth, A.; Welburn, P.; Garfield, S.H.; Blumberg, P.M. Characterization of the Interaction of Ingenol 3-Angelate with Protein Kinase C. Cancer Research 64: 3243-3255p, 2004. Khandoker, A.K.M.Z.H.; Habib, M.R.; Nikkon, F.; Rahman, M.; Karim, R. Antibacterial and Antineoplastic Effect of Root of Euphorbia hirta L. Drug Invention Today 1 (1): 10-12, 2009. Khare, I.P. Rational western Therapy, Ayurveda and other Traditional usage: Indian herbal remedies, Botany. New York (NY): Springer. 210-211p, 1991. Kirtikar, K.R.; Basu, B.D. Indian medicinal plants. Periodicals Experts Book Agency: Delhi. 536p. 1975. Klotman, M.E.; Chang, T.L. Defensins in innate antiviral immunity. Nature Reviews Immunology 6(6): 447-56p, 2006. Kobayashi, Y.; Takashima, H.; Tamaoki, H.; Kyogoku, Y.; Lambert, P.; Kuroda, H.; Chino, N.; Watanabe, T.X.; Kimura, T.; Sakakibara, S. The cysteine-stabilized alpha-helix: a common structural motif of ion-channel blocking neurotoxic peptides. Biopolymers 31: 1213-1220p, 1991. Koczulla, A.R.; Bals, R. Antimicrobial peptides: current status and therapeutic potential. Drugs 63: 389-407p, 2003. Koike, M.; Okamoto, T.; Tsuda, S.; Imai, R. A novel plant defensin-like gene of winter wheat is specifically induced during cold acclimation. Biochemical and Biophysical Research Communications 298: 46-53p, 2002. Kolinski, A.; Rotkiewicz, P.; Ilkowski, B.; Skolnick, J. A method for the improvement of threading-based protein models. Proteins 37 (4): 592-610p, 1999. Komori, T.; Yamada, S; Imaseki, H. A cDNA clone for γ-thionin from Nicotiana paniculata. Plant Physiology 115: 314p, 1997.

112

Kong, M.; Barnes, E.A.; Ollendorff, V.; Donoghue, D.J. Cyclin F regulates the nuclear localization of cyclin B1 through a cyclin-cyclin interaction. EMBO Journal 19: 1378- 1388p, 2000. Kovaleva, V.; Kiyamova, R.; Cramer, R.; Krynytskyy, H.; Gout, I.; Filonenko, V.; Gout, R. Purification and molecular cloning of antimicrobial peptides from Scots pine seedlings. Peptides 30 (12): 2136-2143p, 2009. Kragh, K.M.; Nielsen, J.E.; Nielsen, K.K.; Dreboldt, S.; Mikkelsen, J.D. Characterization and localization of new antifungal cysteine- rich proteins from Beta vulgaris. Molecular Plant- Microbe Interactions 8: 424-434p,1995. Kragol, G.; Lovas, S.; Varadi, G.; Condie, B.A.; Hoffmann, R.; Otvos, L. Jr. The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone- assisted protein folding. Biochemistry 40 (10): 3016-3026p, 2001. Kress, H. ‘Henriette’s Herbal Homepage’ web site. Available from World Wide Web: http://www.henriettesherbal.com/files/images/photos/e/eu/d08_1975_euphorbia-milii-var- splendens.jpg, accession date 20th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Kristian, S. A.; Durr, M.; Van Strijp, J.A.; Neumeister, B.; Peschel, A. MprF-mediated lysinylation of phospholipids in Staphylococcus aureus leads to protection against oxygenindependent neutrophil killing. Infection and Immunity 71: 546-549p, 2003. Kumar, V.; Abbas, A.K.; Fausto, N.; Mitchel, R.N. Robbins Basic Pathology. 8 th ed. New York: Saunders Elsevier, 2007. Kushmerick, C.; de Souza Castro, M.; Santos Cruz, J.; Bloch, C.Jr.; Beirao, P.S. Functional and structural features of gammazeathionins, a new class of sodium channel blockers. FEBS Letters 440, 302-306p, 1998. Lai, F.M.; De Long, C.; Mei, K.; Wignes, T.; Fobert, P.R. Analysis of the DRR230 family of pea defensins: gene expression pattern and evidence of broad host-range antifungal activity. Plant Science 163, 855-864p, 2002. Lai, X.Z.; Yang, Y.B.; Shan, X.L. The Investigation of Euphorbiaceous Medicinal Plants in Southern China. Economic Botany, 58: S307-S320p, 2004. Lal, S.; Gupta, I. Control of sarcoptic mange with Chotidudhi (Euphorbia prostrato Ait. & Euphorbia thymifolia Linn.). A preliminary report. Indian Journal of Pharmacology 2: 28p, 1970. Lamb, C.; Dixon, R.A. The Oxidative Burst in plant disease resistance. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 48: 251-275p, 1997. Landon, C.; Pajon, A.; Vovelle, F.; Sodano, P. The active site of drosomycin, a small insect antifungal protein, delineated by comparison with the modeled structure of Rs-AFP2, a plant antifungal protein. Journal of Peptide Research 56: 231-238p, 2000. Langen, G.; Imani, J.; Altincicek, B.; Kieseritzky, G.; Kogel, K.H.; Vilcinskas, A. Transgenic expression of gallerimycin, a novel antifungal insect defensin from the greater wax moth Galleria mellonella, confers resistance to pathogenic fungi in tobacco. Biological Chemistry 387: 549-557p, 2006. Larkin, M.A.; Blackshields, G.; Brown, N.P.; Chenna, R.; McGettigan, P.A.; McWilliam, H.; Valentin, F.; Wallace, I.M.; Wilm, A.; Lopez, R.; Thompson, J.D.; Gibson, T.J.; Higgins, D.G. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23: 2947-2948p, 2007. Laskowski, R.A.; MacArthur, M.W.; Moss, D.S.; Thornton, J.M. PROCHECK: A program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal of Applied Crystallography 26: 283-291p, 1993. Lay, F.T.; Anderson, M.A. Defensins-components of the innate immune system in plants. Current Protein & Peptide Science 6 (1): 85-101p, 2005. Lay, F.T.; Brugliera, F.; Anderson, M.A. Isolation and properties of floral defensins from ornamental tobacco and petunia. Plant Physiology 131, 1283-1293p, 2003a. Lay, F.T.; Schirra, H.J.; Scanlon, M.J.; Anderson, M.A.; Craik, D.J. The three-dimensional solution structure of NaD1, a new floral defensin from Nicotiana alata and its application

113

to a homology model of the crop defense protein alfAFP. Journal of Molecular Biology 325: 175-188p, 2003b. Lee, I.M. Phytoplasma casts a magic spell that turns the fair poinsettia into a Christmas showpiece. Plant Health Progress APSnet Online Resources, p.1-7, 2000. Lehrer, R.I. Multispecific myeloid defensins. Current Opinion in Hematology 14: 16-21p, 2007. Lehrer, R.I.; Ganz, T.; Szklarek, D.; Selsted, M.E. Modulation of the in vitro candidacidal activity of human neutrophil defensins by target cell metabolism and divalent cations. The Journal of Clinical Investigation 81: 1829-1835p, 1988. Lehrer, R.I.; Selsted, M.E.; Szklarek, D.; Fleischmann, J. Antibacterial activity of microbicidal cationic proteins 1 and 2, natural peptide antibiotics of rabbit lung macrophages. Infection and Immunity 42 (1): 10-14p, 1983. Leikina, E.; Delanoe-Ayari, H.; Melikov, K.; Cho, M.S.; Chen, A.; Waring, A.J.; Wang, W.; Xie, Y.; Loo, J.A.; Lehrer, R.I.; Chernomordik, L.V. Carbohydrate-binding molecules inhibit viral fusion and entry by crosslinking membrane glycoproteins. Nature Immunology 6, 995-1001p, 2005. Leppert, G.; McDevitt, R.; Falco, SC.; Van, Dyk, TK.; Ficke, MB.; Golin, J. Cloning by gene amplification of two loci conferring multiple drug resistance in Saccharomyces. Genetics 125: 13-20p, 1990. Levy, S.B.: Marshall,B. Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses. Nature Medicine 10, S122-S129p, 2004. Li, H.-Y.; Gray, J.E. Molecular characterization of a cDNA,. NTS13, encoding a defensin-like protein in tobacco styles. Plant Physiology 120, 633p, 1999. Li, W.H.; Wu, C.I.; Luo, C.C. A new method for estimating synonymous and nonsynonymous rates of nucleotide substitutions considering the relative likelihood of nucleotide and codon changes. Molecular Biology and Evolution 2:150-174p, 1985. Li, X.; Gasic, K.; Cammue, B.; Broekaert,W.; Korban, S.S. Transgenic rose lines harboring an antimicrobial protein gene, Ace-AMP1, demonstrate enhanced resistance to powdery mildew (Sphaerotheca pannosa). Planta 218: 226-232p, 2003. Lin, K-F.; Lee, T-R.; Tsai, P-H.; Hsu, M-P.; Chen, C-S.; Lyu, P-C. Structure-based protein engineering for a-amylase inhibitory activity of plant defensin. Proteins 68: 530-540, 2007. Liu, L.; Ganz, T. The pro region of human neutrophil defensin contains a motif that is essential for normal subcellular sorting. Blood 85: 1095-1103p, 1995. Liu, Y.J.; Cheng, C.S.; Lai, S.M.; Hsu, M.P.; Chen, C.S.; Lyu, P.C. Solution structure of the plant defensin VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids. Proteins 63: 777-786p, 2006. Lobo, D.S.; Pereira, I.B.; Fragel-Madeira, L.; Medeiros, L.N.; Cabral, L.M.; Faria, J.; Bellio, M.; Campos, R.C.; Linden, R.; Kurtenbach, E. Antifungal Pisum sativum defensin 1 interacts with Neurospora crassa cyclin F related to the cell cycle. Biochemistry 46: 987-996p, 2007. Loeza-Angeles, H.; Sagrero-Cisneros, E.; Lara-Zárate, L.; Villagómez-Gómez, E.; López-Meza, J.E.; Ochoa-Zarzosa, A. Thionin Thi2.1 from Arabidopsis thaliana expressed in endothelial cells shows antibacterial, antifungal and cytotoxic activity. Biotechnology Letters 30 (10): 1713-1719, 2008. Lorenzi, H. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas, tóxicas e medicinais. Nova Odessa: Plantarum. 440p, 2000. Ma, Q.G.; Liu, W.Z.; Wu, X.Y.; Zhou, T.X.; Qin, G.W. Chemical studies of Lang-Du, atraditional Chinese medicine. Diterpenoids from Euphorbia fischeriana. Phytochemistry 44, 663- 666p, 1997. Mabberly, D.J. The Plant-Book: A portable dictionary of the higher plants. Cambridge University Press United Kingdom. 874p, 1998. Machado, M.I.L. Volatile constituents of Brasilian Euphorbiaceae. Genus Croton. Journal of Natural Products 44 (5): 602-608p, 1981.

114

Maitra, N.; Cushman, J.C. Characterization of a drought-induced soybean cDNA encoding a plant defensin. Plant Physiology 118: 1536p, 1998. Mampane, K.J.; Joubert, P.H.; Hay, I.T. Jatropha curcas: Use as a traditional Tswana medicine and its role as a cause of acute poisoning. Phytotherapy Research 1: 50-51p, 1987. Manners, J.M.; Penninckx, I.A.M.A.; Vermaere, K.; Kazan, K.; Brown, R.L.; Morgan, A.; Maclean, D.J.; Curtis, M.D.; Cammue, B.P.; Broekaert, W.F. The promoter of the plant defensin gene PDF1.2 from Arabidopsis is systemically activated by fungal pathogens and responds to methyl jasmonate but not to salicylic acid. Plant Molecular Biology 38: 1071-1080p, 1998. Marcus, J.P.; Goulter, K.C.; Green, J.L.; Harrison, S.J.; Manners, J.M. Purification, characterization and cDNA cloning of an antimicrobial peptide from Macadamia integrifolia. European Journal of Biochemistry 244: 743-749p, 1997. Matsunaga, T.; Rahman, A. What brought the adaptive immune system to vertebrates? The jaw hypothesis and the seahorse. Immunological reviews 166: 177-186p, 1998. Matsuse, I.T.; Lim, Y.A.; Hattori, M.; Correa, M.; Gupta, M.P. A search for anti-viral properties in Panamanian medicinal plants. The effects on HIV and its essential enzymes. Journal of Ethnopharmacology 64 (1): 15-22p, 1999. Matsuzaki, K. Why and how are peptide±lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochimica et Biophysica Acta 1462: 1-10p, 1999. Mavor, A.L.; Thewes, S.; Hube, B. Systemic fungal infections caused by Candida species: epidemiology, infection process and virulence attributes. Current drug targets 6, 863- 874p, 2005. Maxwell, A.I.; Morrison, G.M.; Dorin, J.R. Rapid sequence divergence in mammalian b- defensins by adaptive evolution. Molecular Immunology 40: 413-421p, 2003. Mayur Valodkara, Padamanabhi S. Nagarb, Ravirajsinh N. Jadejac, Menaka C. Thounaojamc, Ranjitsinh V. Devkarc, Sonal Thakore. Euphorbiaceae latex induced green synthesis of non-cytotoxic metallic nanoparticle solutions: A rational approach to antimicrobial applications. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 384 (1- 3): 337-344p, 2011. McManus, A.M.; Nielsen, K.J.; Marcus, J.P.; Harrison, S.J.; Green, J.L.; Manners, J.M.; Craik, D.J. MiAMP1, a novel protein from Macadamia integrifolia adopts a Greek key beta-barrel fold unique amongst plant antimicrobial proteins. Journal of Molecular Biology 293: 629- 638p, 1999. Melo, F.R.; Rigden, D.J.; Franco, O.L.; Mello, L.V.; Ary, M.B.; Grossi de Sa, M.F.; Bloch, C.Jr. Inhibition of trypsin by cowpea thionin: characterization, molecular modeling, and docking. Proteins 48: 311-319p, 2002. Mendez, E.; Moreno, A.; Colilla, F.; Pelaea, F.; Limas, G.G.; Mendez, R.; Soriano, F.; Salinas, M.; Haro, C.D. European Journal of Biochemistry 194, 533-539p, 1990. Méndez, E.; Rocher, A.; Calero, M.; Girbes, T.; Citores, L.; Soriano, F. Primary structure of x- hordothionin, a member of a novel family of thionins from barley endosperm, and its inhibition of protein synthesis in eukaryotic and prokaryotic cell-free systems. European Journal of Biochemistry 239: 67-73p, 1996. Meyer, B.; Houlné, C.; Pozueta-Romeró, J.; Schantz, M-L.; Schantz, R. Fruit-specific expression of a defensin-type gene family in bell pepper. Plant Physiology 11(2): 615-622, 1996. Michaels, S. D.; John, M. C.; Amasino, R. M. Removal of polysaccharides from plant DNA by ethanol precipitation. Biotechniques 17: 274-276p, 1994. Michaelson, D.; Rayner, J.; Couto, M.; Ganz, T. Cationic defensins arise from charge- neutralized propeptides; a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity? Journal of Leukocyte Biology 51, 634-639p, 1992. Miller, J.H. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Los Angeles. 456p, 1992.

115

Milligan, S.B.; Gasser, C.S. Nature and regulation of pistil-expressed genes in tomato. Plant Molecular Biology 28: 691-711p, 1995. Mirouze, M.; Sels, J.; Richard, O.; Czernic, P.; Loubet, S.; Jacquier, A.; François, I.E.J.A.; Cammue, B.P.A.; Lebrun, M.; Berthomieu, P.; Marques, L. A putative novel role for plant defensins: a defensin from the zinc hyper-accumulating plant, Arabidopsis halleri, confers zinc tolerance. The Plant Journal 47: 329-342p, 2006. Mitter, N.; Kazan, K.; Way, H.M.; Broekaert, W.F.; Manners, J.M. Systemic induction of an Arabidopsis plant defensin gene promoter by tobacco mosaic virus and jasmonic acid in transgenic tobacco. Plant Science 136: 169-180p, 1998. Molosov, V.V.; Valeuva, T.A. Proteinase inhibitors in plant biotechnology: a review. Applied Biochemistry and Microbiology 44 (3): 233-240p, 2008. Monk, B.C.; Harding, D.R.K. Peptide motifs for cell-surface intervention. Biodrugs 19 (4): 261- 278p, 2005. Montesinos E. Antimicrobial peptides and plant disease control. FEMS Microbiology Letters 270 (1): 1-11p, 2007. Moreno, M.; Segura, A.; García-Olmedo, F. European Journal of Biochemistry 223, 135-139p, 1994. Mothana, R.A.; Gruenert, R.; Bednarski, P.J.; Lindequist, U. Evaluation of the in vitro anticancer, antimicrobial and antioxidant activities of some Yemeni plants used in folk medicine. Pharmazie 64 (4): 260-268p, 2009. Müller, A.1874. Euphorbiaceae. In: Flora Brasiliensis. Martius, C. F. V.; Eichler, A. G. Lehre. 1873-1874p, 1967. Murugan, S.; Anand, R.; Uma-Devi, P.; Vidhya, N.; Rajesh, K.A. Efficacy of Euphorbia milii and Euphorbia pulcherrima on aflatoxin producing fungi (Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus). African Journal of Biotechnology 6: 718-719, 2007. Mwine, J.; Van Damme, P.; Jumba, F. Evaluation of larvicidal properties of the latex of Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) against larvae of Anopheles mosquitoes Journal of Medicinal Plants Research 4 (19): 1954-1959p, 2010. Mwine, J.T.; Van Damme, P. Why do Euphorbiaceae tick as medicinal plants? A review of Euphorbiaceae family and its medicinal features. Journal of Medicinal Plants Research 5 (5): 652-662p, 2011. Mygind, P.H.; Fischer, R.L.; Schnorr, K.M.; Hansen, M.T.; Sönksen, C.P.; Ludvigsen, S.; Raventós, D.; Buskov, S.; Christensen, B.; De Maria, L.; Taboureau, O.; Yaver, D.; Elvig- Jørgensen, S.G.; Sörensen, M.V.; Christensen, B.E.; Kjaerulff, S.; Frimodt-Moller, N.; Lehrer, R.I.; Zasloff, M.; Kristensen, H.H. Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus. Nature 437, 975-980p, 2005. Naumov, G.N.; Townson, J.L.; MacDonald, I.C.; Wilson, S.M.; Bramwell, V.H.; Groom, A.C.; Chambers, A.F. Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases. Breast Cancer Research and Treatment 82: 199-206p, 2003. Nei, M.; Gojobori, T. Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions. Molecular Biology and Evolution 3: 418-426p, 1986. Nei, M.; Kumar, S. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, New York. 333p, 2000. Ngai, P.H.; Ng, T.B. Phaseococcin, an antifungal protein with antiproliferative and anti-HIV-1 reverse transcriptase activities from small scarlet runner beans. Biochemistry and Cell Biology 83: 212-220p, 2005. Nielsen, R.; Yang, Z. Likelihood models for detecting positively selected amino acid sites and applications to the HIV-1 envelope gene. Genetics 148: 929-936p, 1998. Nikaido, H. Multidrug efflux pumps of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology 178: 5853-5859p, 1996.

116

Oard, S.; Karki, B. Mechanism of b-purothionin antimicrobial peptide inhibition by metal ions: molecular dynamics simulation study. Biophysical Chemistry 121: 30-43p, 2006. Oh, B.J.; Ko, M.K.; Kostenyuk, I.; Shin, B.; Kim, K.S. Coexpression of a defensin gene anda thionin-like gene via different signal transduction pathways in pepper and Colletotrichum gloeosporioides interactions. Plant Molecular Biology 41: 313-319p, 1999. Ohshima, M.; Mitsuhara, I.; Okamoto, M.; Sawano, S.; Nishiyama, K.; Kaku, H.; Natori, S.; Ohashi, Y. Enhanced resistance to bacterial disease of transgenic tobacco plants overexpressing sarco-toxin IA, a bactericidal peptide of insect. Journal of Biochemistry 125: 431-435p, 1999. Ohtani, S.; Okada, T.; Yoshizumi, H.; Kagamiyama H. Complete primary structures of two subunits of purothionin A, a lethal protein for brewer's yeast from wheat flour. Journal of Biochemistry 82: 753-767p, 1977. Okigbo, R.N.; Anuagasi, C.L.; Amadi, J.E. Advances in selected medicinal and aromatic plants indigenous to Africa. Journal of Medicinal Plants Research 3: 86-89p., 2009. Olli, S.; Kirti, P.B. Cloning, characterization and antifungal activity of defensin Tfgd1 from Trigonella foenum-graecum L. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 39 (3): 278- 283p, 2006. Oren, Z.; Shai, Y. Mode of action of linear amphipathic alphahelical antimicrobial peptides. Biopolymers 47: 451-463p, 1998. Osborn, R.W.; Broekaert, W.F. Seed proteins. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. 727- 751p, 1999. Osborn, R.W.; De Samblanx, G.W.; Thevissen, K.; Goderis, I.; Torrekens, S.; Van Leuven, F.; Attenborough, S.; Rees, S.B.; Broekaert, W.F. Isolation and characterization of plant defensins from seeds Asteraceae, Fabaceae, Hippocastanaceae and Saxifragaceae. FEBS Letters 368, 257-262p, 1995. Padovan, L.; Segat, L.; Tossi, A.; Antcheva, N.; Benko-Iseppon, A.M.; Ederson, A.K.; Brandao, L.; Calsa Jr., T.; Crovella, S. A Plant-Defensin from Sugarcane (Saccharum spp.). Protein & Peptide Letters 16: 430-436p, 2009. Padovan, L.; Segat, L.; Tossi, A.; Calsa Jr., T.; Kido, E. A.; Brandao, L.; Guimaraes, R.L.; Pandolfi, V.; Pestana-Calsa, M.C.; Belarmino, L.C.; Benko-Iseppon, A.M.; Crovella, S. Characterization of a new defensin from cowpea (Vigna unguiculata (L.) Walp.). Protein & Peptide Letters 17 (3): 297-304p, 2010a. Palatnick, W.; Tenenbein, M. Hepatotoxicity from Castor Bean Ingestion in a Child. Clinical Toxicology 38: 67-69p, 2000. Panoramio. ‘Panoramio’ web site. Available from World Wide Web: http://www.panoramio.com/photo/46157050, accession date 19th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Papo, N.; Shai, Y. Host defense peptides as new weapons in cancer treatment. Cellular and Molecular Life Sciences 62:784-790p, 2005. Parashina, E.V.; Serdobinskii, L.A.; Kalle, E.G.; Lavorova, N.V.; Avetisov, V.A.; Lunin, V.G.; Naroditskii, B.S. Genetic engineering of oilseed rape and tomato plants expressing a radish defensin gene. Russian Journal of Plant Physiology 47: 417-423p, 2000. Park, H. C.; Kang, Y. H.; Chun, H. J.; Koo, J. C.; Cheong, Y. H.; Kim, C. Y.; Kim, M. C.; Chung, W. S.; Kim, J.C.; Yoo, J.H.; Koo, Y.D.; Koo, S.C.; Lim, C.O.; Lee, S. Y.; Cho, M.J. Characterization of a stamen-specific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage. Plant Molecular Biology 50, 59-69p, 2002. Park, K.R.; Backlund, A. Origin of the cyathium-bearing Euphorbieae (Euphorbiaceae): phylogenetic study based on morphological characters. Botanical Bulletin of Academia Sinica 43: 57-62p, 2002. Park, K.R.; Elisens, W.J. A Phylogenetic Study of Tribe Euphorbieae (Euphorbiaceae). International Journal of Plant Sciences 161 (3): 425-434p, 2000. Park, K.R.; Jansen, R.K. A Phylogeny of Euphorbieae subtribe Euphorbiinae (Euphorbiaceae) based on molecular data. Journal of Plant Biology 50: 644-649p, 2007.

117

Parra-Lopez, C.; Baer, M.T.; Groisman, E. A Molecular genetic analysis of a locus required for resistance to antimicrobial peptides in Salmonella typhimurium. EMBO Journal 12: 4053- 4062p, 1993. Patel, S.U.; Osborn, R.; Rees, S.; Thornton, J.M. Structural studies of Impatiens balsamina antimicrobial protein (Ib-AMP1). Biochemistry 37: 983-990p, 1998. Patrzykat, A.; Friedrich, C.L.; Zhang, L.; Mendoza, V.; Hancock, R.E. Sublethal concentrations of pleurocidin-derived antimicrobial peptides inhibit macromolecular synthesis in Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46 (3): 605-614p, 2002. Pease, J.H.B.; Wemmer, D.E. Solution structure of apamin determined by nuclear magnetic resonance and distance geometry. Biochemistry 27, 8491- 8498p, 1988. Pelegrini, P.B.; del Sarto, R.P.; Silva, O.M.; Franco, O.L. Grossi-de-Sa, M.F. Antibacterial Peptides from Plants: What They Are and How They Probably Work. Biochemistry Research International 2011: 9p, 2011. Pelegrini, P.B.; Franco, O.L. Plant g-thionins: novel insights on the mechanism of action of a multi-functional class of defense proteins. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 37: 2239-2253p, 2005. Pelegrini, P.B.; Lay, F.T.; Murad, A.M.; Anderson, M.A.; Franco, O.L. Novel insights on the mechanism of action of a-amylase inhibitors from the plant defensin family. Proteins 73:719-729p, 2008b. Pelegrini, P.B.; Murad, A.M.; Silva, L.P.; dos Santos, R.C.P.; Costa, F.T.; Tagliari, P.D.; Bloch. C. Jr; Noronha, E.F.; Miller, R.N.; Franco, O.L. Identification of a novel storage glycine- rich peptide from guava (Psidium guajava) seeds with activity against Gram-negative bacteria. Peptides 29: 1271-1279p, 2008a. Pelegrini, P.B.; Quirino, B.F.; Franco, O. L. Plant cyclotides: an unusual class of defense compounds. Peptides 28 (7): 1475-1481p, 2007. Penninckx, I.A.; Eggermont, K.; Terras, F.R.; Thomma, B.P.; De Samblanx, G.W.; Buchala, A.; Métraux, J.P.; Manners, J.M.; Broekaert, W.F. Pathogen-induced systemic activation of a plant defensin gene in Arabidopsis follows a salicylic acid-independent pathway. The Plant Cell 8: 2309-2323p, 1996. Penninckx, I.A.M.A., Thomma, B.P.H.J., Buchala, A., Metraux, J.P. and Broekaert, W.F. Concomitant activation of jasmonate and ethylene response pathways is required for induction of a plant defensin gene in Arabidopsis. The Plant Cell 10: 2103-2113p, 1998. Peschel, A.; Jack, R.W.; Otto, M.; Collins, L.V.; Staubitz, P.; Nicholson, G.; Kalbacher, H.; Nieuwenhuizen, W.F.; Jung, G.; Tarkowski, A.; van Kessel, K.P.; van Strijp, J.A. Staphylococcus aureus resistance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor MprF is based on modification of membrane lipids with L- lysine. Journal of Experimental Medicine 193: 1067-1076p, 2001. Peschel, A.; Otto, M.; Jack, R.W.; Kalbacher, H.; Jung, G.; Götz, F. Inactivation of the dlt operon in Staphylococcus aureus confers sensitivity to defensins, protegrins, and other antimicrobial peptides. Journal of Biological Chemistry 274: 8405-8410p, 1999. Pieterse, C.M.; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, S.C. Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nature Chemical Biology 5 (5): 308-316p, 2009. Pinhao Manso. ‘Pinhão Manso’ web site. Available from World Wide Web: http://www.pinhaomanso.com.br/fotos-jatropha.html, accession date 15th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Pintus, F.; Medda, R.; Rinaldi, A.C.; Spano, D.; Floris, G. Euphorbia latex biochemistry: Complex interactions in a complex environment. Plant Biosystems 144 (2): 381-391p, 2010. Polikarpov, I.; Junior, M.S.; Marangoni, S.; Toyama, M.H.; Teplyakov, A. Crystal structure of neurotoxin Ts1 from Tityus serrulatus provides insights into the specificity and toxicity of scorpion toxins. Journal of Molecular Biology 290: 175-184p, 1999. Portieles, R.; Ayra, C.; Gonzalez, E.; Gallo, A.; Rodriguez, R.; Chacón, O.; López, Y.; Rodriguez, M.; Castillo, J.; Pujol, M.; Enriquez, G.; Borroto, C.; Trujillo, L.; Thomma, BP.;

118

Borrás-Hidalgo, O. NmDef02, a novel antimicrobial gene isolated from Nicotiana megalosiphon confers high-level pathogen resistance under greenhouse and field conditions. Plant Biotechnology Journal 8 (6): 678-690p, 2010. Prabhu, T.; Singh, S.K. Antioxidant activity of ethanolic extract of Euphorbia thymifolia Linn. Indian Journal of pharmaceultical sciences 67 (6): 736-738p, 2005. Prithiviraj, B.; Paschke, M.W.; Vivano, J.M. Root Communication: The Role of Root Exudates. Encyclopedia of Plant and Crop Science 1, 1-4p, 2006. Putnam, C. Em: http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html; The Scripps Research Institute, USA. 2008. Quinones-Mateu, M.E.; Lederman, M.M.; Feng, Z.; Chakraborty, B.; Weber, J.; Rangel, H.R.; Marotta, M.L.; Mirza, M.; Jiang, B.; Kiser, P.; Medvik, K.; Sieg, S.F.; Weinberg, A. Human epithelial β-defensins 2 and 3 inhibit HIV-1 replication. AIDS 17, F39-F48p, 2003. Radcliffe-Smith, A. Genera Euphorbiacearum. Kew: Royal Botanic Gardens, 455p, 2001. Radcliffe-Smith, A. Segregate families from the Euphorbiaceae. Botanical Journal of the Linnean Society 94 (1/2), 47-66p, 1987. Rahuman, A.; Gopalakrishnan, G.; Venkatesan, P.; Geetha, K. Isolation and identification of mosquito larvicidal compound from Abutilon indicum (Linn.) Sweet. Parasitology Research 102 (5): 981-988p, 2008. Ramamoorthy, V.; Cahoon, E.B.; Li, J.; Thokala, M.; Minto, R.E.; Shah, D.M. Glucosylceramide synthase is essential for alfalfa defensin-mediated growth inhibition but not for pathogenicity of Fusarium graminearum. Molecular Microbiology 66 (3): 771-786p, 2007. Ramos, M.V.; Pereira, D.A.; Souza, D.P.; Araújo, E.S.; Freitas, C.D.; Cavalheiro, M.G.; Matos, M.P.; Carvalho, A.F. Potential of laticifer fluids for inhibiting Aedes aegypti larval development: evidence for the involvement of proteolytic activity. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 104 (6): 805-812, 2009. Rao, V.R.; Gupta, I. In vitro studies on the antifungal activity of some indigenous drugs against Trichophyton mentagrophytes. Indian Journal of Pharmacology 2: 27p, 1970. Resnick, N.M.; Maloy, W.L.; Guy, H.R.; Zasloff, M. A novel endopeptidase from Xenopus that recognizes α-helical secondary structure. Cell 66: 541-554p, 1991. Reynolds, S.M.; Käll, L.; Riffle, M.E.; Bilmes, J.A.; Noble, W.S. Transmembrane Topology and Signal Peptide Prediction Using Dynamic Bayesian Networks. PLoS Computational Biology 4, e1000213p, 2008. Richardson, M. Methods in Plant Biochemistry (Rogers, L., Ed.). Academic Press, London. Vol. 5, 261-307p, 1990. Rizzini, C.T.; Mors, W. Botânica econômica brasileira. Âmbito Cultural, Rio de Janeiro. 248p, 1995. Robson, G.D.; Wiebe, M.G.; Trinci, A.P.J. nvolvement of Ca2+ in the regulation of hyphal extension and branching inFusarium graminearumA 3/5. Experimental Mycology 15: 263- 272p, 1991. Roland, K.L.; Esther, C.R.; Spitznagel, J.K. Isolation and characterization of a gene, pmrD, from Salmonella typhimurium that confers resistance to polymyxin when expressed in multiple copies. Journal of Bacteriology 176: 3589-3597p, 1994. Rost, B.; Fariselli, P.; Casadio, R. Topology prediction for helical transmembrane proteins at 86% accuracy. Protein Science 5 (8): 1704-1718p, 1996. Ryan, C.A.; Jagendorf, A. Self defense by plants. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 4075p, 1995. Ryan, C.A.; Moura, D.S.. Systemic wound signaling in plants: A new perception. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99: 6519-6520p, 2002. Sage, T.L.; Sage, R.F.; Vogan, P.J.; Rahman, B.; Johnson, D.C.; Oakley, J.C.; Heckel, M.A. The occurrence of C(2) photosynthesis in Euphorbia subgenus Chamaesyce (Euphorbiaceae). Journal of Experimental Botany 62 (9): 3183-3195p, 2011.

119

Saito, T.; Kawabata, S.; Shigenaga, T.; Takayenoki, Y.; Cho, J.; Nakajima, H. A novel big defensin identified in horseshoe crab hemocytes: isolation, amino acid sequence, and antibacterial activity. Journal of Biochemistry 117: 1131-1117p, 1995. Sanchez, R; Sali, A. Comparative protein structure modeling as an optimization problem. Journal of Molecular Structure 398: 489-496p, 1997. Sanchez, T.; Salcedo, E.; Ceballos, H.; Dufour, D.; Mafla, G.; Morante, N.; Calle, F.; Perez, J.C.; Debouck, D.; Jaramillo, G.; Moreno, I.X. Screening of Starch Quality Traits in Cassava (Manihot esculenta Crantz). Starch-Starke 61: 12-19p, 2009. Santos, M. F. A. V.; Guerra, T. N. F.; Sotero, M. C.; Santos, J. I. N. Diversidade e densidade de espécies vegetais da caatinga com diferentes graus de degradação no município de floresta, pernambuco, BRASIL. Rodriguésia 60 (2): 389-402p, 2009. Sátiro, L.N.; Roque, R. A família Euphorbiaceae nas caatingas arenosas do médio Rio São Francisco, BA, Brasil. Acta Botanica Brasilica 22 (1): 99-118p, 2008. Sato, S.; Hirakawa, H.; Isobe, S.; Fukai, E.; Watanabe, A.; Kato, M.; Kawashima, K.; Minami, C.; Muraki, A.; Nakazaki. N.; Takahashi, C.; Nakayama, S.; Kishida, Y.; Kohara, M.; Yamada, M.; Tsuruoka, H.; Sasamoto, S.; Tabata, S.; Aizu, T.; Toyoda, A.; Shin-I, T.; Minakuchi, Y.; Kohara, Y.; Fujiyama, A.; Tsuchimoto, S.; Kajiyama, S.; Makigano, E.; Ohmido, N.; Shibagaki, N.; Cartagena, J.A.; Wada, N.; Kohinata, T.; Atefeh, A.; Yuasa, S.; Matsunaga, S.; Fukui, K. Sequence Analysis of the Genome of an Oil-Bearing Tree, Jatropha curcas L. DNA Research 18: 65-76p, 2011. Schaaper, W.M.M.; Posthuma, G.A.; Plasman, H.H.; Sijtsma, L.; Fant, F.; Borremans, F.A.M.; Thevissen, K.; Broekaert, W.F.; Meloen, R.H.; van Amerogen, A. Journal of Peptide Research 57: 409-418p, 2001. Schmidt, R.J.; Evans FJ. Skin irritants of the sun spurge (Euphorbia helioscopia L.). Contact Dermatitis 6: 204-210p, 1980. Schrader-Fischer, G.; Apel, K. Organ-specific expression of highly divergent thionin variants that are distinct from the seed-specific crambin in the crucifer Crambe abyssinica. Molecular and General Genetics 245: 380-389p, 1994. Scott, R.W.; De Grado, W.F.; Tew, G.N. De novo designed synthetic mimics of antimicrobial peptides. Current Opinion in Biotechnology 19: 620-627p, 2008. Segura, A.; Moreno, M.; Madueño, F.; Molina, A.; García-Olmedo, F. Snakin-1, a peptide from potato that is active against plant pathogens. Molecular Plant-Microbe Interactions 12: 16-23p, 1999. Segura, A.; Moreno, M.; Molina, A.; Garcia-Olmedo, F. Novel defensin subfamily from spinach (Spinacia oleracea). FEBS Letters 435: 159-162p, 1998. Seigler, D. S. Phytochemistry and systematic of the Euphorbiaceae. Annals of Missouri Botanical Garden 81, 380-401p, 1994. Sels, J.; Mathys, J.; De Coninck, B.M.A.; Cammue, B.P.A.; De Bolle, M.F.C. Plant pathogenesis-related (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology and Biochemistry 46: 941-950p, 2008. Selsted, M.E.; Ouellette, A.J. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response. Nature Immunology 6(6): 551-557p, 2005. Semple, C.A.; Gautier, P.; Taylor, K.; Dorin, JR. The changing of the guard: Molecular diversity and rapid evolution of beta-defensins. Molecular Diversity 10 (4): 575-584p, 2006. Semple, C.A.; Maxwell, A.; Gautier, P.; Kilanowski, F.M.; Eastwood, H.; Barran, P.E.; Dorin, J.R. The complexity of selection at the major primate beta-defensin locus. BMC Evolutionary Biology 5: 32p, 2005. Semple, C.A.; Rolfe, M.; Dorin, J.R. Duplication and selection in the evolution of primate beta- defensin genes. Genome Biology 4:R31p, 2003. Shafer, W.M.; Qu, X.; Waring, A.J.; Lehrer, R.I. Modulation of Neisseria gonorrhoeae susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the resistance/nodulation/division efflux pump family. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 95: 1829-1833p, 1998.

120

Shai, Y. Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers 66 (4): 236- 248p, 2002. Sharma, A.; Sharma, R.; Imamura, M.; Yamakawa, M.; Machii, H. Transgenic expression of cecropin B, an antibacterial peptide from Bombyx mori, confers enhanced resistance to bacterial leaf blight in rice. FEBS Letters 484: 7-11p, 2000. Sharma, P.; Lönneborg, A. Isolation and characterization of a plant defensin-like protein from roots of Norway spruce. Plant Molecular Biology 31: 707-712p, 1996. Sharma, P.; Mohan, L.; Srivastava, C.N. Amaranthus oleracea and Euphorbia hirta: natural potential larvicidal agents against the urban Indian malaria vector, Anopheles stephensi Liston (Diptera: Culicidae). Parasitology Research 106 (1): 171-176p, 2009. Shen, G.; Pang, Y.; Wu, W.; Miao, Z.; Qian, H.; Zhao, L. Molecular cloning, characterization and expression of a novel jasmonate-dependent defensina gene from Ginkgo biloba. Journal of Plant Physiology 162: 1160-1168p, 2005. Shewry, P.R.; Lucas, J.A. Plant proteins that confer resistance to pests and pathogens. Advances in Botanical Research 26, 135-192p, 1997. Shi, Q.W.; Su, X.H.; Kiyota, H. Chemical and pharmacological research of the plants in genus Euphorbia. Chemical Reviews 108: 4295-4327p, 2008. Shiau, Y-S.; Horng, S-B.; Chen, C-S.; Huang, P-T.; Lin, C.; Hsueh, Y-C.; Lou, K-L. Structural analysis of the unique insecticidal activityof novel mungbean defensin VrD1 reveals possibility of homoplasy evolution between plant defensins and scorpion neurotoxins. Journal of Molecular Recognition 19: 441-450p, 2006. Shirasu (2009) ‘The defense strategy of plants’. Available from World Wide Web: http://www.rikenresearch.riken.jp/eng/frontline/6025, accession date 29th Mar 2012, cited 1st Abr 2012. Shlamovitz, G.Z.; Gupta, M.; Diaz, J.A. A case of acute keratoconjunctivitis from exposure to latex of Euphorbia tirucalli (pencil cactus). The Journal of Emergency Medicine 36: 239- 241p, 2009. Sieprawska-Lupa, M.; Mydel, P.; Krawczyk, K.; Wójcik, K.; Puklo, M.; Lupa, B.; Suder, P.; Silberring, J.; Reed, M.; Pohl, J.; Shafer, W.; McAleese, F.; Foster, T.; Travis, J.; Potempa, J. Degradation of human antimicrobial peptide LL-37 by Staphylococcus aureus-derived proteinases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 48: 4673-4679p, 2004. Silva, T.S.; Freire, E.M.X. Abordagem etnobotânica sobre plantas medicinais citadas por populações do entorno de uma unidade de conservação da caatinga do Rio Grande do Norte, Brasil. Acta Botanica Brasilica 19 (1): 45-60p, 2005. Silverstein, K.A.; Graham, M.A.; Paape, T.D.; VandenBosch, K.A. Genome organization of more than 300 defensin-like genes in Arabidopsis. Plant Physiology 138: 600-610p, 2005. Silverstein, K.A.; Moskal, W.A.; Wu, H.C.; Underwood, B.A.; Graham, M.A.; Town, C.D.: Van den Bosch, K.A. Small cysteine-rich peptides resembling antimicrobial peptides have been under-predicted in plants. The Plant Journal 51 (2): 262-280p, 2007. Simpson, M. Plant Systematics. Elsevier Academic Press, New York. 608p. 2006. Singh, A.; Agarwal, R.A. Possibility of using latex of euphorbiales for snail control. Science of the Total Environment 77: 231-236p, 1988. Singla, A.K.; Pathak, K. Phytoconstituents of Euphorbia species. Fitoterapia 1990, 61, 483-516. Sitaram, N.; Nagaraj, R. Interaction of antimicrobial peptides with biological and model membranes: structural and charge requirements for activity. Biochimica et Biophysica Acta 1462 (1-2): 29-54p, 1999. Slavokhotova, A.A.; Odintsova, T.I.; Rogozhin, E.A.; Musolyamov, A.K.; Andreev, Y.A.; Grishin, E.V.; Egorov, T.A. Isolation, molecular cloning and antimicrobial activity of novel defensins from common chickweed (Stellaria media L.) seeds. Biochimie 93 (3): 450- 456p, 2011. Soltis, D.E.; Soltis, P.S.; Endress, P.K.; Chase, M.W. Phylogeny and evolution of angiosperms. Sinauer Associates, Sunderland. 370p. 2005.

121

Song, X.; Zhou, Z.; Wang, J.; Wu, F.; Gong, W. Purification, characterization and preliminary crystallographic studies of a novel plant defensin from Pachyrrhizus erosus seeds. Acta Crystallographica D60: 1121-1124p, 2004. Souza, V.; Lorenzi, H. Botânica Sistemática. Guia Ilustrado das famílias de Angiospermas da flora brasileira, baseado em APG II. Instituto Plantarum. São Paulo. 640p, 2005. Spelbrink, R.G.; Dilmac, N.; Allen, A.; Smith, T.J.; Shah, D.M.; Hockerman, G.H. Differential antifungal and calcium channel-blocking activity among structurally related plant defensins. Plant Physiology 135: 2055-2067p, 2004. Spoel, S.H.; Dong, X. How do plants achieve immunity? Defence without specialized immune cells. Nature Reviews Immunology 12(2): 89-100p, 2012. Steinmann, V.W.; Porter, J.M. Phylogenetic relationships in Euphorbieae (Euphorbiaceae) based on its and NDHF sequence data. Annals of The Missouri Botanical Garden, 89 (4): 453-490p, 2002. Stevens P.F. Genera and species of angiosperms. Angiosperm Phylogeny Website. 2010. Em: http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb. Acessado em 15 de setembro de 2011. Stock, S.D.; Hama, H.; Radding, J.A.; Young, D.A.; Takemoto, J.Y. Syringomycin E inhibition of Saccharomyces cerevisiae: requirement for biosynthesis of sphingolipids with very- longchain fatty acids and mannose- and phosphoinositol-containing head groups. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44: 1174-1180p, 2000. Stotz, H.U.; Spence, B.; Wang, Y. A defensin from tomato with dual function in defense and development. Plant Molecular Biology 71: 131-143p, 2009a. Stotz, H.U.; Thomson, J.G.; Wang, Y. Plant defensins: defense, development and application. Plant Signaling & Behavior (11): 1010-1012p, 2009b. Sudhakar, M.; Rao, C.V.; Rao, P.M.; Raju, D.B.; Venkateswarlu, Y. Antimicrobial activity of Caesalpinia pulcherrima, Euphorbia hirta and Asystasia gangeticum. Fitoterapia 77: 378- 380p, 2006. Sugiarto, H.; Yu, P-L. Avian antimicrobial peptides: the defense role of defensins. Biochemical and Biophysical Research Communications 323: 721-727p, 2004. Sun, L.; Finnegan, C.M.; Kish-Catalone, T.; Blumenthal, R.; Garzino-Demo, P.; La Terra, Maggiore, G.M.; Berrone, S.; Kleinman, C.; Wu, Z.; Abdelwahab, S.; Lu, W.; Garzino- Demo, A. Human β-defensins suppress human immunodeficiency virus infection: potential role in mucosal protection. Journal of Virology 79, 14318-14329p, 2005. Sunagawa, S.; Desalvo, M.K.; Voolstra, C.R.; Reyes-Bermudez, A.; Medina M. Identification and gene expression analysis of a taxonomically restricted cysteine-rich protein family in reef-building corals. PLoS One 4 (3): e4865, 2009. Svangard, E.; Goransson, U.; Hocaoglu, Z.; Gullbo, J.; Larsson, R.; Claeson, P.; Bohlin, L. Cytotoxic cyclotides from Viola tricolor. Journal of Natural Products 67, 144-147p, 2004. Tailor, R.H.; Acland, D.P.; Attenborough, S.; Cammue, B.P.; Evans, I.J.; Osborn, R.W.; Ray, J.A.; Rees, S.B.; Broekaert, W.F. A novel family of small cysteine-rich antimicrobial peptides from seed of Impatiens balsamina is derived from a single precursor protein. Journal of Biological Chemistry 272: 24480-24487p, 1997. Taji, T.; Seki, M.; Satou, M.; Sakurai, T.; Kobayashi, M.; Ishiyama, K.; Narusaka, Y.; Narusaka, M.; Zhu, J.K.; Shinozaki, K. Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiology 135 (3): 1697-1709p, 2004. Tam, J.P.; Lu, Y-A.; Yang, J-L. Correlations of cationic charges with salt sensitivity and microbial specificity of cystine-stabilized b-strand antimicrobial peptides. Journal of Biological Chemistry 277 (52): 50450-50456p, 2002. Tamura, K.; Peterson, D.; Peterson, N.; Stecher, G.; Nei, M.; Kumar, S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739p, 2011.

122

TC. ‘Temos Comida’ web site. Available from World Wide Web: http://temoscomida.files.wordpress.com/2011/04/mandioca.jpg, accession date 15th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Tennessen, J.A. Molecular evolution of animal antimicrobial peptides: widespread moderate positive selection. Journal of Evolutionary Biology 18 (6): 1387-1394p, 2005. Terras, F.R.; Eggermont, K.; Kovaleva, V.; Raikhel, N.V.; Osborn, R.W.; Kester, A.; Rees, S.B.; Torrekens, S.; Van Leuven, F.; Vanderleyden, J.; Cammue, B.P.A.; Broekaert, W.F. Small cysteine-rich antifungal proteins from radish: their role in host defense. The Plant Cell 7: 573-588p, 1995. Terras, F.R.; Penninckx, I.A.M.A.; Goderis, I.J.; Broekaert, W.F. Evidence that the role of plant defensins in radish defense responses is independent of salicylic acid. Planta 206: 117- 124p, 1998. Terras, F.R.; Schoofs, H.M.; De Bolle, M.F.; Van Leuven, F.; Rees, S.B.; Vanderleyden, J.; Cammue, B.P.; Broekaert, W.F. Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish (Raphanus sativus L.) seeds. The Journal of Biological Chemistry 267 (22): 15301-15309p, 1992. Terras, F.R.; Torrekens, S.; Van Leuven, F.; Osborn, R.W.; Vanderleyden, J.; Cammue, B.P.; Broekaert, W.F. A new family of basic cysteine-rich plant antifungal proteins from Brassicaceae species. FEBS Letters 316: 233-240p, 1993. Thevissen, K.; Cammue, B.P.A.; Lemaire, K.; Winderickx, J.; Dickson, R.C.; Lester, R.L.; Ferket, K.K.; Van Even, F.; Parret, A.H.; Broekaert, W.F. A gene encoding a sphingolipid biosynthesis enzyme determines the sensitivity of Saccharomyces cerevisiae to an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 9531-9536p, 2000b. Thevissen, K.; Ghazi, A.; De Samblanx, G.W.; Brownlee, C.; Osborn, R.W.; Broekaert, W.F. J. Fungal membrane responses induced by plant defensins and thionins. The Journal of Biological Chemistry 271: 15018-15025p, 1996. Thevissen, K.; Kristensen, H.H.; Thomma, B.P.; Cammue, B.P.; François, I.E. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discovery Today 12 (21-22), 966- 971p, 2007. Thevissen, K.; Osborn, R.W.; Acland, D.P.; Broekaert, W.F. Specific binding sites for an antifungal plant defensin from dahlia (Dahlia merckii) on fungal cells are required for antifungal activity. Molecular Plant-Microbe Interactions 31: 54-61p, 2000. Thevissen, K.; Terras, F.R.G.; Broekaert, W.F. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth. Applied and Environmental Microbiology 65: 5451- 5458p, 1999. Thevissen, K.; Warnecke, D.C.; Francois, I.E.; Leipelt, M.; Heinz, E.; Ott, C.; Zahringer, U.; Thomma, B.P.; Ferket, K.K.; Cammue, B.P. Defensins from insects and plants interact with fungal glucosylceramides. Journal of Biological Chemistry 279: 3900-3905p, 2004. Thomma, B.P.; Cammue, B.P.; Thevissen, K. Plant defensins. Planta 216 (2): 193-202p, 2002. Thomma, B.P.H.J., Eggermont, K.; Penninckx, I.A.M.A.; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, B.P.A.; Broekaert, W.F. Separate jasmonate-dependent and salicylate- dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 95, 15107-15111p, 1998. Thomma, B.P.H.J.; Broekaert, W.F. Tissue-specific expression of plant defensin genes PDF2.1 and PDF2.2 in Arabidopsis thaliana. Plant Physiology and Biochemistry 36: 533-537p, 1998. Thomma, B.P.H.J.; Cammue, B.P.A.; Thevissen, K. Mode of action of plant defensins suggests therapeutic potential. Current Drug Targets - Infectious Disorders 3: 1-8p, 2003. Thomma, B.P.H.J.; Eggermont, K.; Tierens, K.F.M.J.; Broekaert, W.F. Requirement of functional ethylene-insensitive 2 gene for efficient resistance of Arabidopsis to infection by Botrytis cinerea. Plant Physiology 121: 1093-1101p, 1999.

123

Tian, Y.; Sun, L.M.; Liu, X.Q.; Li, B.; Wang, Q.; Dong, J.X. Anti-HBV active flavone glucosides from Euphorbia humifusa Willd. Fitoterapia 81(7): 799-802p, 2010. Tierens, K.F.M.J.; Thomma, B.P.H.J.; Bari, R.P.; Garmier, M.; Eggermont, K.; Brouwer, M.; Penninckx, I.A.M.A.; Broekaert, W.F.; Cammue, B.P.A. The Plant Journal 29: 131-140p, 2002. Tiffin, P.; Moeller, D.A. Molecular evolution of plant immune system genes. Trends in Genetics 22 (12): 662-670p, 2006. Tokuoka, T. Molecular phylogenetic analysis of Euphorbiaceae sensu strict based on plastid and nuclear DNA sequences and ovule and seed character evolution. Journal of Plant Research 120: 511-522p, 2007. Tokuoka, T.; Tobe, H. Phylogenetic analyses of Malpighiales using plastid and nuclear DNA sequences, with particular reference to the embryology of Euphorbiaceae sens. str. Journal of Plant Research 119: 599-616p, 2006. TPS. ‘The Pure Sacrifice’ web site. Available from World Wide Web: http://4.bp.blogspot.com/- nzHS8EeqdE4/Tu0zQ9cj0mI/AAAAAAAAARA/cXtwm-mTRR4/s1600/poinsettia.jpg, accession date 20th Dec 2011, cited 10th February, 2012. Turrini, A.; Sbrana, C.; Pitto, L.; Ruffini C.M.; Giorgetti, L.; Briganti, R.; Bracci, T.; Evangelista, M.; Nuti, M.P.; Giovannetti, M. The antifungal Dm-AMP1 protein from Dahlia merckii expressed in Solanum melongena is released in root exudates and differentially affects pathogenic fungi and mycorrhizal symbiosis. New Phytologist 163: 393-403p, 2004. Uchida, H.; Yamashita, H.; Kajikawa, M.; Ohyama, K.; Nakayachi, O.; Sugiyama, R.; Yamato, K.T.; Muranaka, T.; Fukuzawa, H.; Takemura, M.; Ohyama, K. Cloning and characterization of a squalene synthase gene from a petroleum plant, Euphorbia tirucalli L. Planta 229: 1243-1252p, 2009. Valodkara, M.; Jadejab, R.N.; Thounaojamb, M.C.; Devkarb, R.V.; Thakorea, S. Biocompatible synthesis of peptide capped copper nanoparticles and their biological effect on tumor cells. Materials Chemistry and Physics 128: 83-89p, 2011. Van Damme, P.L.J. Euphorbia tirucalli for high biomass production, in: Schlissel A.; Pasternak, D. Combating desertification with plants, Kluwer Academic Pub. 169-187p, 2001. Van der Weerden, N.L.; Lay, F.T.; Anderson, M.A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. Journal of Biological Chemistry 283 (21): 14445-14452p, 2008. Van Djik, A.; Veldhuizen, E.J.A.; Haagsman, H.P. Avian defensis. Veterinary Immunology and Immunopathology 124: 1-18p, 2008. Vance, C.P.; Kirk, T.K.; Sherwood, R.T. Lignification as a mechanism of disease resistance. Annual Review of Phytopathology 18: 259-288p, 1980. Vanoosthuyse, V.; Miege, C.; Dumas, C.; Cock, J.M. Two large Arabidopsis thaliana gene families are homologous to the Brassica gene superfamily that encodes pollen coat proteins and the male component of the self incompatibility response, Plant Molecular Biology 46: 17-34p, 2001. Vasas, A.; Sulyok, E.; Rédei, D.; Forgo, P.; Szabó, P.; Zupkó, I.; Berényi, Á.; Molnár, J.; Hohmann, J. Jatrophane diterpenes from Euphorbia esula as antiproliferative agents and potent chemosensitizers to overcome multidrug resistance. Journal of Natural Products 74 (6): 1453-1461p, 2011. Visser, L.G.; Hiemstra, P.S.; Van Den Barselaar, M.T.; Ballieux, P.A.; Van Furth, R. Role of yadA in resistance to killing of Yersinia enterocolitica by antimicrobial polypeptides of human granulocytes. Infection and Immunity 64: 1653-1658p, 1996. Vogg, G.; Mattes, E.; Rothenburger, J.; Hertkorn, N.; Achatz, S.; Sandermann, H. Tumor promoting diterpenes from Euphorbia leuconeura L. Phytochemistry 51 (2): 289-295p, 1999. Wang, H.X.; Ng, T.B. An antifungal peptide from baby lima bean. Applied Microbiology and Biotechnology 73: 576-581p, 2006.

124

Wang, S.; Rao, P.; Ye, X. Isolation and biochemical characterization of a novel leguminous defense peptide with antifungal and antiproliferative potency. Applied Microbiology and Biotechnology 82 (1): 79-86p, 2009. Wang, Y.P.; Nowak, G.; Culley, D.; Hadwiger, L.A.; Fristensky, B. Constitutive expression of pea defense gene DRR206 confers resistance to blackleg (Leptosphaeria maculans) disease in transgenic canola (Brassica napus). Molecular Plant-Microbe Interactions 12: 410-418p, 1999. Wang, Z.; Wang, G. APD: the Antimicrobial Peptide Database. Nucleic Acids Research 32, D590-D592p, 2004. Watt, J. M.; Breyer-Brandwijk, M. G. The medicinal and poisonous plants of southern and eastern Africa; being an account of their medicinal and other uses, chemical composition, pharmacological effects and toxicology in man and animal. Edinburgh, E. & S. Livingstone. 1457p, 1962. Weber, I.T. Evaluation of homology modeling of HIV Protease. Proteins 7 (2): 172-184p, 1990. Webster G.L. The saga of the spurges: a review of classification and relationships in the Euphorbiales. Botanical Journal of the Linnean Society 94: 3-46p, 1987. Webster, G.L. Classification of the Euphorbiaceae, Annals of Missouri Botanical Garden 81: 3- 32p, 1994b. Webster, G.L. Conspectus of a new classification of the Euphorbiaceae. Taxon 24: 593-601p, 1975. Webster, G.L. Synopsis of the genera and suprageneric taxa of Euphorbiaceae. Annals of Missouri Botanical Garden 81: 33-144p, 1994a. Webster, G.L.; Burch, D. Euphorbiaceae: In: R.E. Woodson & R.W. Schery (eds.). Flora of Panama. Annals of Missouri Botanical Garden 54: 210-350p, 1967. Weising, K.; Nybom, H.; Wolff, K.; Kahl, G. DNA fingerprinting in plants. CRC Press, Boca Raton, 322p, 2004. Westerhoff, H.V.; Juretic, D.; Hendler, R.W.; Zasloff, M. Magainins and the disruption of membrane-linked free-energy transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 6597-6601p, 1989. Widharna, R.M.; Soemardji, A.A.; Wirasutisna, K.R.; Kardono, L.B.S. Anti Diabetes Mellitus Activity in vivo of Ethanolic Extract and Ethyl Acetate Fraction of Euphorbia hirta L. Herb International Journal of Pharmacology 6 (3): 231-240p, 2010. Wijaya, R.; Neumann, G.M.; Condron, R.; Hughes, A.B.; Poly, G.M. Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin. Plant Science 159: 243-255, 2000. Willard, T.S.; Griffin, J.L. Soybean (Glycine max) yield and quality responses associated with poinsettia (Euphorbia heterophylla) control programs. Weed Technology 7: 118-122p, 1993. Wisniewski, M.E.; Bassett, C.L.; Artlip, T.S.; Webb, R.P.; Janisiewicz, W.J.; Norelli, J.L.; Goldway, M.; Droby, S. Characterization of a defensin in bark and fruit tissues of peach and antimicrobial activity of a recombinant defensin in the yeast, Pichia pastoris. Physiologia Plantarum 119: 563-572p, 2003. Wong, J.H.; Ng, T.B. Lunatusin, a trypsin-stable antimicrobial peptide from lima beans (Phaseolus lunatus L.). Peptides 26: 2086-2092p, 2005b. Wong, J.H.; Ng, T.B. Sesquin, a potent defensin-like antimicrobial peptide from ground beans with inhibitory activities toward tumor cells and HIV-1 reverse transcriptase. Peptides 26: 1120-1126p, 2005c. Wong, J.H.; Ng, T.B. Vulgarinin, a broad-spectrum antifungal peptide from haricot beans (Phaseolus vulgaris). International Journal of Biochemistry & Cell Biology 37: 1626- 1632p, 2005a. Wong, J.H.; Xia, L.; Ng, T.B. A review of defensins of diverse origins. Current Protein & Peptide Science 8: 446-459, 2007.

125

Wonga, J.H.; Zhang, X.Q.; Wang, H.X.; Ng, T.B. A mitogenic defensin from white cloud beans (Phaseolus vulgaris). Peptides 27: 2075-2081p, 2006. Word Health Organization. http://www.who.int/ neglected_diseases/en/. Accessed September 17, 2009. Wu, M.; Maier, E.; Benz, R.; Hancock, R.E. Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. Biochemistry 38: 7235-7242p, 1999. Wurdack, K.J.; Hoffmann, P.; Chase, M.W. Molecular phylogenetic analysis of uniovulate Euphorbiaceae (Euphorbiaceae sensu stricto) using plastid RBCL and TRNL-F DNA sequences. American Journal of Botany 92 (8): 1397-1420p, 2005. Xiong, Y.Q.; Yeaman, M.R.; Bayer, A.S. In vitro antibacterial activities of platelet microbicidal protein and neutrophil defensin against Staphylococcus aureus are influenced by antibiotics differing in mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43: 1111-1117p, 1999. Xu, Z.H.; Sun, J.; Xu, R.S.; Qin, G.W. Casbane diterpenoids from Euphorbia ebracteolata. Phytochemistry 49, 149-151p, 1998. Yamada, S.; Komori, T.; Myers, P.N.; Kuwata, S.; Kubo, T.; Imaseki H. Expression of plasma membrane water channel genes under water stress in Nicotiana excelsior. Plant and Cell Physiology 38 (11): 1226-1231p, 1997. Yang, C.M.; Cheng, H.Y.; Lin, T.C.; Chiang, L.C.; Lin, C.C. Euphorbia thymifolia suppresses herpes simplex virus-2 infection by directly inactivating virus infectivity. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 32: 346-349p, 2005. Yang, D.; Liu, Z-H.; Tewary, P.; Chen, Q.; De La Rosa, G.; Oppenheim, J.J. Defensin Participation in Innate and Adaptive Immunity. Current Pharmaceutical Design 13: 3131- 3139p, 2007. Yang, L.; Weiss, T.M.; Lehrer, R.I.; Huang, H.W. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin. Biophysical Journal 79: 2002-2009p, 2000. Yang, Z.; Nielsen, R.; Goldman, N.; Pedersen, A.M.K. Codon-substitution models for heterogeneous selection pressure at amino acid sites. Genetics 155: 431-449p, 2000. Yasuda, M.; Takesue, F.; Inutsuka, S.; Honda, M.N.T.; Korenaga, D. Overexpression of cyclin B1 in gastric cancer and its clinicopathological significance: an immunohistological study. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 128: 412-416p, 2002. Ye, X.Y.; Ng, T.B. A new antifungal peptide from rice beans. Journal of Peptide Science 60: 81- 87p, 2002. Ye, X.Y.; Ng, T.B. Peptides from pinto bean and red bean with sequence homology to cowpea 10-kda protein precursor exhibit antifungal, mitogenic, and HIV-1 reverse transcriptase- inhibitory activities. Biochemical and Biophysical Research Communications 285: 424- 429p, 2001. Yeaman, M.R.; Yount, N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacological Reviews 55: 27-55p, 2003. Yoon, W.H.; Park, H.D.; Lim, K.; Hwang, B.D. Effect of Oglycosylated mucin on invasion and metastasis of HM7 human colon cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 222: 694-699p, 1996. Youssouf, M.S.; Kaiser, P.; Tahir, M.; Singh, G.D.; Singh, S.; Sharma, V.K.; Satti, N.K.; Haque, S.E.; Johri, R.K. Anti-anaphylactic effect of Euphorbia hirta. Fitoterapia 78 (7-8): 535- 539p, 2007. Zainal, Z.; Marouf, E.; Ismail, I.; Fei, C.K. Expression of the Capsicuum annuum (Chili) defensin gene in transgenic tomatoes confers enhanced resistance to fungal pathogens. American Journal of Plant Physiology 4: 70-79p, 2009. Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415 (6870): 389-395p, 2002. Zasloff, M. In: From Development of Novel Antimicrobial Agents: Emerging Strategies. Lohner, K. Horizon Scientific, Wymondham, UK, 261-270p, 2001.

126

Zayed, S.; Farghaly, M.; Soliman, S.M.; Gotta, H.; Sorg, B.; Hecker, E. Dietary cancer risk from conditional cancerogens (tumor promoters) in produce of livestock fed on species of spurge (Euphorbiaceae) V. Skin irritant and tumor-promoting diterpene ester toxins of the tigliane and ingenane type in the herbs Euphorbia nubica and Euphorbia helioscopia contaminating fodder of livestock. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 127: 40-47p, 2001. Zhang ,X.H.; Guo, D.J.; Zhang, L.M.; Li,W.B.; Sun, Y.R. The research on the expression of rabbit defensin (NP- 1) gene in transgenic tomato. Yi Chuan Xue Bao 27: 953-958p, 2000. Zhang, J.Y.; Mi, Y.J.; Chen, S.P.; Wang, F.; Liang, Y.J.; Zheng, L.S.; Shi, C.J.; Tao, L.Y.; Chen, L.M.; Chen, H.B.; Fu, L.W. Euphorbia factor L1 reverses ABCB1-mediated multidrug resistance involving interaction with ABCB1 independent of ABCB1 downregualtion. Journal of Cellular Biochemistry 112 (4): 1076-1083p, 2011. Zhang, L.; Yu, W.; He, T.; Yu, J.; Caffrey, R.E.; Dalmasso, E.A.; Fu, S.; Pham, T.; Mei, J.; Ho, J.J.; Zhang, W.; Lopez, P.; Ho, D.D. Contribution of human alpha-defensin 1, 2, and 3 to the anti-HIV-1 activity of CD8 antiviral factor. Science 298 (5595): 995-1000p, 2002. Zhang, N.Y.; Jones, B.L.; Tao, P. Purification and characterisation of a new class of insect α- amylase inhibitors from barley. Cereal Chemistry 74: 119-122p, 1997a. Zhang, Y.; Lewis, K. Fabatins: new antimicrobial plant peptides. FEMS Microbiology Letters 149: 59-64p, 1997. Zhu, S. Discovery of six families of fungal defensin-like peptides provides insights into origin and evolution of the CSab defensins. Molecular Immunology 45: 828-838p, 2008. Zhu, Y.J.; Agbayani, R.; Moore, P.H. Ectopic expression of Dahlia merckii defensin Dm-AMP1 improves papaya resistance to Phytophthora palmivora by reducing pathogen vigor. Planta 226: 87-97p, 2007. Zimmerli, L.; Stein, M.; Lipka, V.; Schulze-Lefert, P.; Somerville, S. Host and nonhost pathogens elicit different jasmonate/ethylene responses in Arabidopsis. The Plant Journal 40: 633- 646p, 2004. Zimmermann, N.F.A.; Christiane, M.R. and Hellwig, F.H. Further support for the phylogenetic relationships within Euphorbia L. (Euphorbiaceae) from nrITS and trnL–trnF IGS sequence data. Plant Systematics and Evolution 286 (1-2), 39-58p, 2010. Zou, J.; Mercier, C.; Koussounadis, A.; Secombes, C. Discovery of multiple beta-defensin like homologues in teleost fish. Molecular Immunology 44: 638-647p, 2007.

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APÊNDICE

Tabela A. Aminoácidos, abreviaturas e trincas correspondentes Abreviações Aminoácido Trincas de nucleotídeos A Ala Alanina GCA GCC GCG GCT C Cys Cisteína TGC TGT D Asp Ácido aspártico GAC GAT E Glu Ácido glutâmico GAA GAG F Phe Fenilalanina TTC TTT G Gly Glicina GGA GGC GGG GGT H His Histidina CAC CAT I Ile Isoleucina ATA ATC ATT K Lys Lisina AAA AAG L Leu Leucina CTA CTC CTG CTT TTA TTG M Met Metionina ATG N Asn Asparagina AAC AAT P Pro Prolina CCA CCC CCG CCT Q Gln Glutamina CAA CAG R Arg Arginina AGA AGG CGA CGC CGG CGT S Ser Serina AGC AGT TCA TCC TCG TCT T Thr Treonina ACA ACC ACG ACT V Val Valina GTA GTC GTG GTT W Trp Triptofano TGG X Ter Terminação TAA TAG TGA Y Tyr Tirosina TAC TAT

Tabela B. Lista das abreviações de espécies mencionadas no texto Espécie Nomenclatura completa A. brasilense Azospirillum brasilense A. brassicola Alternaria brassicola A. eutrophus Alcaligenes eutrophus A. halleri Arabidopsis halleri A. longipes Alternaria longipes A. niger Aspergillus niger A. radiobacter Agrobacterium radiobacter A. rhizogens Agrobacterium rhizogens A. solani Alternaria solani A. thaliana Arabidopsis thaliana A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens A. versicolor Aspergillus versicolor B. cereus Bacillus cereus B. cinerea Botrytis cinerea B. megaterium Bacillus megaterium B. napus Brassica napus B. subtili Bacillus subtilis B. vulgaris Beta vulgaris C. albicans Candida albicans C. annuum Capsicum annuum C. beticola Cercospora beticola C. chinense Capsicum chinense C. colocasiae Cladosporium colocasiae C. comatus Coprinus comatus

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C. flaccumfaciens Curtobacterium flaccumfaciens C. hyssopifolia Chamaesyce hyssopifolia C. lindemuthianum Colletotrichum lindemuthianum, C. michiganensis Clavibacter michiganensis C. sphaerospermum Cladosporium sphaerospermum C. thymifolia Chamaesyce thymifolia D. maydis Diploidia maydis E. aaron-rossii Euphorbia aaron-rossii E. antiquorum Euphorbia antiquorum E. brasiliensis Euphorbia brasiliensis E. carotovora Erwinia carotovora E. drummondii Euphorbia drummondii E. heterophylla Euphorbia heterophylla E. hirta Euphorbia hirta E. hyssopifolia Euphorbia hyssopifolia E. ingens Euphorbia ingens E. lathyris Euphorbia lathyris E. ledienii Euphorbia ledienii E. milii Euphorbia milii E. obesa Euphorbia obesa E. peplus Euphorbia peplus E. poissonii Euphorbia poissonii E. prostrata Euphorbia prostrata E. pulcherrima Euphorbia pulcherrima E. resinifera Euphorbia resinifera E. scheffleri Euphorbia scheffleri E. silenifolia Euphorbia silenifolia E. thymifolia Euphorbia thymifolia E. tirucalli Euphorbia tirucalli E. tomentella Euphorbia tomentella E. tomentosa Euphorbia tomentosa E. unispina Euphorbia unispina E. hirae Enterococcus hirae E. coli Escherichia coli F. decemcellulare Fusarium decemcellulare F. graminearum Fusarium graminearum F. oxysporum Fusarium oxysporum F. solani Fusarium solani F. verticillioides Fusarium verticillioides F. culmorum Fusarium culmorum F. moniliforme Fusarium moniliforme H. brasiliensis Hevea brasiliensis J. curcas Jatropha curcas K. pneumonia Klebsiella pneumonia L. donovani Leishmania donovani L. maculans Leptosphaeria maculans M. arachidicola Mycosphaerella arachidicola M. esculenta Manihot esculenta M. fijinesis Mycosphaerella fijinesis M. glaziovii Manihot glaziovii M. grisea Magnaporthe grisea M. oryzae Magnaporthe oryzae

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M. phlei Mycobacterium phlei N. crassa Neurospora crassa N. excelsior Nicotiana excelsior N. haematococca Nectria haematococca N. paniculata Nicotiana paniculata P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa P. betae Phoma betae P. cichorii Pseudomonas cichorii P. coccineus Phaseolus coccineus P. expansum Penicillium expansum P. fluorescens Pseudomonas fluorescens P. infestans Phytophthora infestans P. lachrymans Pseudomonas lachrymans P. lunatus Phaseolus lunatus P. palmivora Phytophthora palmivora P. parasítica Phytophthora parasítica P. personata Phaeoisariopsis personata P. piricola Physalospora piricola P. sativum Pisum sativum P. solanacearum Pseudomonas solanacearum P. synrigae Pseudomonas synrigae P. vulgaris Phaseolus vulgaris P. vulgaris Proteus vulgaris P.digitatum Penicillium digitatum P.oryzae Pyricularia oryzae R. communis Ricinus communis R. sativus Raphanus sativus R. solani Rhizoctonia solani S . epidermidis Staphylococcus epidermidis S. aureus Staphylococcus aureus S. bicolor Sorghum bicolor S. cerevisae Saccharomyces cerevisae S. lutea Sarcina lútea S. oleracea Spinacia oleracea S. sclerotiorum Sclerotinia sclerotiorum S. simulans Staphylococcus simulans S. tritici Septoria tritici S. tuberosum Solanum tuberosum S. typhimurium Salmonella typhimurium T. aestivum Triticum aestivum T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes T. molitor Tenebrio molitor T. viride Trichoderma viride V. albo-atrum Verticillium albo-atrum V. dahliae Verticillium dahliae V. radiata Vigna radiata V. sesquipedalis Vigna sesquipedalis V. unguiculata Vigna unguiculata X. campestris Xanthomonas campestris X. oryzae Xanthomonas oryzae Y. enterocolitica Yersinia enterocolitica

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9 ANEXO I

O manuscrito de artigo entitulado "Putative defensin of Euphorbia hyssopifolia: in silico characterization and inferences about its therapeutic potencial" resultante deste trabalho, será submetido à revista: Peptides ELSEVIER Impact Factor 2,654 ISSN: 0196-9781 (Print)

Regras de submissão à revista : http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/525495/authorinstructions Por questoes de propriedade intelectual o manuscrito nao foi anexado a este exemplar.

GUIDE. FOR AUTHORS

INTRODUCTION Peptides will publish original reports on the chemistry, biochemistry, neurochemistry, endocrinology, gastroenterology, physiology, and pharmacology of peptides, as well as their neurological,psychological and behavioral effects. Peptides emphasizes all aspects of peptide research, including investigations in plants, insects, lower vertebrates, animals and clinical studies in humans. A limited number of bjectives, relevant reviews and brief or rapid communications will also be published. Articles will be published in English, American style.

Types of paper Research articles Short communications: these should be restricted to six pages, including references, and should not present more than two figures, two tables, or one of each. Review articles

BEFORE YOU BEGIN Ethics in publishing For information on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal publication see http://www.elsevier.com/publishingethics and http://www.elsevier.com/ethicalguidelines.

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Submission declaration Submission of an article implies that the work described has not been published previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or academic thesis), that it is not under consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhere including electronically in the same form, in English or in any other language, without the written consent of the copyright-holder.

Contributors Each author is required to declare his or her individual contribution to the article: all authors must have materially participated in the research and/or article preparation, so roles for all authors should be described. The statement that all authors have approved the final article should be true and included in the disclosure. Addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship of accepted manuscripts Before the accepted manuscript is published in an online issue Requests to add or remove an author, or to rearrange the author names, must be sent to the Journal Manager from the corresponding author of the accepted manuscript and must include: The reason the name should be added or removed or the author names rearranged. Written confirmation (email, fax, letter) from all authors that they agree with the addition, removal or rearrangement. In the

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case of addition or removal of authors, this includes confirmation from the author being added or removed. Requests that are not sent by the corresponding author will be forwarded by the Journal Manager to the corresponding author, who must follow the procedure as described above. Note that: Journal Managers will inform the Journal Editors of any such requests. Publication of the accepted manuscript in an online issue is suspended until authorship has been agreed. After the accepted manuscript is published in an online issue Any requests to add, delete, or rearrange author names in an article published in an online issue will follow the same policies as noted above and result in a corrigendum.

Changes to authorship This policy concerns the addition, deletion, or rearrangement of author names in the authorship of accepted manuscripts: Before the accepted manuscript is published in an online issue: Requests to add or remove an author, or to rearrange the author names, must be sent to the Journal Manager from the corresponding author of the accepted manuscript and must include: (a) the reason the name should be added or removed, or the author names rearranged and (b) written confirmation (e-mail, fax, letter) from all authors that they agree with the addition, removal or rearrangement. In the case of addition or removal of authors, this includes confirmation from the author being added or removed. Requests that are not sent by the corresponding author will be forwarded by the Journal Manager to the corresponding author, who must follow the procedure as described above. Note that: (1) Journal Managers will inform the Journal Editors of any such requests and (2) publication of the accepted manuscript in an online issue is suspended until authorship has been agreed. After the accepted manuscript is published in an online issue: Any requests to add, delete, or rearrange author names in an article published in an online issue will follow the same policies as noted above and result in a corrigendum.

Copyright Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing Agreement' (for more information on this and copyright see http://www.elsevier.com/copyright). Acceptance of the agreement will ensure the widest possible dissemination of information. An e-mail will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement' form or a link to the online version of this agreement. Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles including abstracts for internal circulation within their institutions. Permission of the Publisher is required for resale or distribution outside the institution and for all other derivative works, including compilations and translations (please consult http://www.elsevier.com/permissions). If excerpts from other copyrighted works are included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases: please consult http://www.elsevier.com/permissions.

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color, not colour; while, not whilst. Authors who require information about language editing and copyediting services pre- and postsubmission please visit http://www.elsevier.com/languageediting or our customer support site at http://epsupport.elsevier.com for more information.

Submission Submission to this journal proceeds totally online and you will be guided stepwise through the creation and uploading of your files. The system automatically converts source files to a single PDF file of the article, which is used in the peer-review process. Please note that even though manuscript source files are converted to PDF files at submission for the review process, these source files are needed for further processing after acceptance. All correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, takes place by e-mail removing the need for a paper trail. Submit your article Please submit your article via http://ees.elsevier.com/peptides Correspondence should be sent to Abba J. Kastin, Editor-in-Chief, Pennington Biomedical Research Center, 6400 Perkins Road, Baton Rouge, LA 70808-4124, USA, or [email protected]. US National Institutes of Health (NIH) voluntary posting (" Public Access" ) policy Elsevier facilitates author response to the NIH voluntary posting request (referred to as the NIH "Public Access Policy"; see http://www.nih.gov/about/publicaccess/index.htm) by posting the peerreviewed author's manuscript directly to PubMed Central on request from the author, 12 months after formal publication. Upon notification from Elsevier of acceptance, we will ask you to confirm via email (by e-mailing us at [email protected]) that your work has received NIH funding and that you intend to respond to the NIH policy request, along with your NIH award number to facilitate processing. Upon such confirmation, Elsevier will submit to PubMed Central on your behalf a version of your manuscript that will include peer-review comments, for posting 12 months after formal publication. This will ensure that you will have responded fully to the NIH request policy. There will be no need for you to post your manuscript directly with PubMed Central, and any such posting is prohibited.

PREPARATION Use of wordprocessing software It is important that the file be saved in the native format of the wordprocessor used. The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the article. In particular, do not use the wordprocessor's options to justify text or to hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. When preparing tables, if you are using a table grid, use only one grid for each individual table and not a grid for each row. If no grid is used, use tabs, not spaces, to align columns. The electronic text should be prepared in a way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier: http://www.elsevier.com/guidepublication). Note that source files of figures, tables and text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text. See also the section on Electronic artwork. To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and 'grammar-check' functions of your wordprocessor.

Article structure Subdivision - numbered sections Divide your article into clearly defined and numbered sections. Subsections should be numbered 1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ...), 1.2, etc. (the abstract is not included in section numbering). Use this numbering also for internal cross-referencing: do not just refer to 'the text'. Any subsection may be given a brief heading. Each heading should appear on its own separate line. Introduction State the objectives of the work and provide an adequate background, avoiding a detailed literature survey or a summary of the results. Material and methods Provide sufficient detail to allow the work to be reproduced. Methods already published should be indicated by a reference: only relevant modifications should be described. AUTHOR INFORMATION PACK 10 Apr 2012 www.elsevier.com/locate/peptides 7 Results Results should be clear and concise. Results and Discussion sections should be separate, even for papers submitted as Brief Communications. Discussion This should explore the significance of the results of the work, not repeat them. Avoid extensive citations and discussion of published literature. Conclusion The main conclusions of the study may be presented in a short Conclusions section, which may stand alone or form a subsection of a Discussion section. Glossary Please supply, as a separate list, the definitions of field-specific terms used in your article. Italics are not to be used for expressions of Latin origin, for example, in vivo, et al., per se. Appendices. If there is more than one appendix, they should be identified as A, B, etc. Formulae and equations in appendices should be given separate numbering: (Eq. A.1), (Eq. A.2), etc.; in a subsequent appendix, (Eq. B.1) and so forth.

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Essential title page information • Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval systems. Avoid abbreviations and formulae where possible. • Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation addresses (where the actual work was done) below the names. Indicate all affiliations with a lower-case superscript letter immediately after the author's name and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of each affiliation, including the country name and, if available, the e-mail address of each author. • Corresponding author. Clearly indicate who will handle correspondence at all stages of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that telephone and fax numbers (with country and area code) are provided in addition to the e-mail address and the complete postal address. Contact details must be kept up to date by the corresponding author. • Present/permanent address. If an author has moved since the work described in the article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent address') may be indicated as a footnote to that author's name. The address at which the author actually did the work must be retained as the main, affiliation address. Superscript Arabic numerals are used for such footnotes. Abstract A concise and factual single paragraph abstract without headings is required. The abstract should state briefly the purpose of the research, the principal results and major conclusions. An abstract is often presented separately from the article, so it must be able to stand alone. For this reason, References should be avoided. Also, non-standard or uncommon abbreviations should be avoided, but if essential they must be defined at their first mention in the abstract itself.

Graphical abstract A Graphical abstract is optional and should summarize the contents of the article in a concise, pictorial form designed to capture the attention of a wide readership online. Authors must provide images that clearly represent the work described in the article. Graphical abstracts should be submitted as a separate file in the online submission system. Image size: Please provide an image with a minimum of 531 × 1328 pixels (h × w) or proportionally more. The image should be readable at a size of 5 × 13 cm using a regular screen resolution of 96 dpi. Preferred file types: TIFF, EPS, PDF or MS Office files. See http://www.elsevier.com/graphicalabstracts for examples. Authors can make use of Elsevier's Illustration and Enhancement service to ensure the best presentation of their images also in accordance with all technical requirements: Illustration Service.

Highlights Highlights are mandatory for this journal. They consist of a short collection of bullet points that convey the core findings of the article and should be submitted in a separate file in the online submission system. Please use 'Highlights' in the file name and include 3 to 5 bullet points (maximum 85 characters, including spaces, per bullet point). See http://www.elsevier.com/highlights for examples. AUTHOR INFORMATION PACK 10 Apr 2012 www.elsevier.com/locate/peptides 8

Keywords Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords, using American spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts (avoid, for example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations firmly established in the field may be eligible. These keywords will be used for indexing purposes.

Abbreviations Define abbreviations that are not standard in this field in a footnote to be placed on the first page of the article. Such abbreviations that are unavoidable in the abstract must be defined at their first mention there, as well as in the footnote. Ensure consistency of abbreviations throughout the article. Acknowledgements Acknowledgements. Place acknowledgements, including information on grants received, before the references, in a separate section, and not as a footnote on the title page. Units Follow internationally accepted rules and conventions: use the international system of units (SI). If other units are mentioned, please give their equivalent in SI. For numbers, use decimal points (not commas); use a space for thousands (10 000 and above). Drugs Proprietary (trademarked) names should be capitalized. The chemical name should precede the trade, popular name, or abbreviation of a drug the first time it occurs. Amino Acids The first letter of the 3-letter abbreviations for amino acids should be capitalized. Anesthesia In describing surgical procedures on animals, the type and dosage of the anesthetic agent should be specified. Curarizing agents are not anesthetics; if these were used, evidence must be provided that anesthesia of suitable grade and duration was employed

Database linking Elsevier aims at connecting online articles with external databases which are useful in their respective

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research communities. If your article contains relevant unique identifiers or accession numbers (bioinformatics) linking to information on entities (genes, proteins, diseases, etc.) or structures deposited in public databases, then please indicate those entities according to the standard explained below. Authors should explicitly mention the database abbreviation (as mentioned below) together with the actual database number, bearing in mind that an error in a letter or number can result in a dead link in the online version of the article. Please use the following format: Database ID: xxxx Links can be provided in your online article to the following databases (examples of citations are given in parentheses): • ASTM: ASTM Standards Database (ASTM ID: G63) • CCDC: Cambridge Crystallographic Data Centre (CCDC ID: AI631510) • GenBank: Genetic sequence database at the National Center for Biotechnical Information (NCBI) (GenBank ID: BA123456) • GEO: Gene Expression Omnibus (GEO ID: GSE27196; GEO ID: GPL5366; GEO ID: GSM9853) • MI: EMBL-EBI OLS Molecular Interaction Ontology (MI ID: 0218) • MINT: Molecular INTeractions database (MINT ID: 6166710) • NCBI Taxonomy: NCBI Taxonomy Browser (NCBI Taxonomy ID: 48184) • NCT: ClinicalTrials.gov (NCT ID: NCT00222573) • OMIM: Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM ID: 601240) • PDB: Worldwide Protein Data Bank (PDB ID: 1TUP) • TAIR: The Arabidopsis Information Resource database (TAIR ID: AT1G01020) • UniProt: Universal Protein Resource Knowledgebase (UniProt ID: Q9H0H5) AUTHOR INFORMATION PACK 10 Apr 2012 www.elsevier.com/locate/peptides 9

Footnotes Footnotes should be used sparingly. Number them consecutively throughout the article, using superscript Arabic numbers. Many wordprocessors build footnotes into the text, and this feature may be used. Should this not be the case, indicate the position of footnotes in the text and present the footnotes themselves separately at the end of the article. Do not include footnotes in the Reference list. Table footnotes Indicate each footnote in a table with a superscript lowercase letter.

Artwork Electronic artwork General points • Make sure you use uniform lettering and sizing of your original artwork. • Save text in illustrations as 'graphics' or enclose the font. • Only use the following fonts in your illustrations: Arial, Courier, Times, Symbol. • Number the illustrations according to their sequence in the text. • Use a logical naming convention for your artwork files. • Provide captions to illustrations separately. • Produce images near to the desired size of the printed version. • Submit each figure as a separate file. A detailed guide on electronic artwork is available on our website: http://www.elsevier.com/artworkinstructions You are urged to visit this site; some excerpts from the detailed information are given here. Formats Regardless of the application used, when your electronic artwork is finalised, please 'save as' or convert the images to one of the following formats (note the resolution requirements for line drawings, halftones, and line/halftone combinations given below): EPS: Vector drawings. Embed the font or save the text as 'graphics'. TIFF: Color or grayscale photographs (halftones): always use a minimum of 300 dpi. TIFF: Bitmapped line drawings: use a minimum of 1000 dpi. TIFF: Combinations bitmapped line/half-tone (color or grayscale): a minimum of 500 dpi is required. If your electronic artwork is created in a Microsoft Office application (Word, PowerPoint, Excel) then please supply 'as is'. Please do not: • Supply files that are optimised for screen use (e.g., GIF, BMP, PICT, WPG); the resolution is too low; • Supply files that are too low in resolution; • Submit graphics that are disproportionately large for the content. Color artwork Please make sure that artwork files are in an acceptable format (TIFF, EPS or MS Office files) and with the correct resolution. If, together with your accepted article, you submit usable color figures then Elsevier will ensure, at no additional charge, that these figures will appear in color on the Web (e.g., ScienceDirect and other sites) regardless of whether or not these illustrations are reproduced in color in the printed version. For color reproduction in print, you will receive information regarding the costs from Elsevier after receipt of your accepted article. Please indicate your preference for color in print or on the Web only. For further information on the preparation of electronic artwork, please see http://www.elsevier.com/artworkinstructions. Please note: Because of technical complications which can arise by converting color figures to "gray

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scale" (for the printed version should you not opt for color in print) please submit in addition usable black and white versions of all the color illustrations. Authors should note that a request to revert from full colour to colour only in the electronic publication at the stage of typesetting and proof correction, will require separate editorial agreement, with possible re-review if necessary, and may significantly delay publication of your manuscript. Figure captions: Ensure that each illustration has a caption. Supply captions separately, not attached to the figure. A caption should comprise a brief title (not on the figure itself) and a description of the illustration. Keep text in the illustrations themselves to a minimum but explain all symbols and abbreviations used.

Tables Number tables consecutively in accordance with their appearance in the text. Place footnotes to tables below the table body and indicate them with superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables and ensure that the data presented in tables do not duplicate results described elsewhere in the article.

References Citation in text Please ensure that every reference cited in the text is also present in the reference list (and vice versa). Any references cited in the abstract must be given in full. Unpublished results and personal communications are not recommended in the reference list, but may be mentioned in the text. If these references are included in the reference list they should follow the standard reference style of the journal and should include a substitution of the publication date with either 'Unpublished results' or 'Personal communication'. Citation of a reference as 'in press' implies that the item has been accepted for publication. Web references As a minimum, the full URL should be given and the date when the reference was last accessed. Any further information, if known (DOI, author names, dates, reference to a source publication, etc.), should also be given. Web references can be listed separately (e.g., after the reference list) under a different heading if desired, or can be included in the reference list. Reference management software This journal has standard templates available in key reference management packages EndNote (http://www.endnote.com/support/enstyles.asp) and Reference Manager (http://refman.com/support/rmstyles.asp). Using plug-ins to wordprocessing packages, authors only need to select the appropriate journal template when preparing their article and the list of references and citations to these will be formatted according to the journal style which is described below. Reference style Text: Indicate references by number(s) in square brackets in line with the text. The actual authors can be referred to, but the reference number(s) must always be given. List: The list of references is arranged alphabetically and then numbered (numbers in square brackets). Examples: Reference to a journal publication: [1] Van der Geer J, Hanraads JAJ, Lupton RA. The art of writing a scientific article. J Sci Commun 2000;163:51–9. Reference to a book: [2] Strunk Jr W, White EB. The elements of style. 3rd ed. New York: Macmillan; 1979. Reference to a chapter in an edited book: [3] Mettam GR, Adams LB. How to prepare an electronic version of your article. In: Jones BS, Smith RZ, editors. Introduction to the electronic age, New York: E-Publishing Inc; 1999, p. 281–304. Note shortened form for last page number. e.g., 51–9, and that for more than 6 authors the first 6 should be listed followed by "et al." For further details you are referred to "Uniform Requirements for Manuscripts submitted to Biomedical Journals" (J Am Med Assoc 1997;277:927–934) (see also http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html). Journal abbreviations source Journal names should be abbreviated according to Index Medicus journal abbreviations: http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lji.html; List of title word abbreviations: http://www.issn.org/2- 22661-LTWA-online.php; CAS (Chemical Abstracts Service): http://www.cas.org/sent.html.

Supplementary data Elsevier accepts electronic supplementary material to support and enhance your scientific research. Supplementary files offer the author additional possibilities to publish supporting applications, highresolution images, background datasets, sound clips and more. Supplementary files supplied will be published online alongside the electronic version of your article in Elsevier Web products, including ScienceDirect: http://www.sciencedirect.com. In order to ensure that your submitted material is directly usable, please provide the data in one of our recommended file formats. Authors should submit the material in electronic format together with the article and supply a concise and descriptive caption for each file. For more detailed instructions please visit our artwork instruction pages at http://www.elsevier.com/artworkinstructions.

Submission checklist The following list will be useful during the final checking of an article prior to sending it to the journal for review. Please consult this Guide for Authors for further details of any item.

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Ensure that the following items are present: One author has been designated as the corresponding author with contact details: • E-mail address • Full postal address • Telephone and fax numbers All necessary files have been uploaded, and contain: • Keywords • All figure captions • All tables (including title, description, footnotes) Further considerations • Manuscript has been 'spell-checked' and 'grammar-checked' • References are in the correct format for this journal • All references mentioned in the Reference list are cited in the text, and vice versa • Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including the Web) • Color figures are clearly marked as being intended for color reproduction on the Web (free of charge) and in print, or to be reproduced in color on the Web (free of charge) and in black-and-white in print • If only color on the Web is required, black-and-white versions of the figures are also supplied for printing purposes. For any further information please visit our customer support site at http://support.elsevier.com.

AFTER ACCEPTANCE Use of the Digital Object Identifier The Digital Object Identifier (DOI) may be used to cite and link to electronic documents. The DOI consists of a unique alpha-numeric character string which is assigned to a document by the publisher upon the initial electronic publication. The assigned DOI never changes. Therefore, it is an ideal medium for citing a document, particularly 'Articles in press' because they have not yet received their full bibliographic information. The correct format for citing a DOI is shown as follows (example taken from a document in the journal Physics Letters B): doi:10.1016/j.physletb.2010.09.059 When you use the DOI to create URL hyperlinks to documents on the web, the DOIs are guaranteed never to change.

Proofs One set of page proofs (as PDF files) will be sent by e-mail to the corresponding author (if we do not have an e-mail address then paper proofs will be sent by post) or, a link will be provided in the e-mail so that authors can download the files themselves. Elsevier now provides authors with PDF proofs which can be annotated; for this you will need to download Adobe Reader version 7 (or higher) available free from http://get.adobe.com/reader. Instructions on how to annotate PDF files will accompany the proofs (also given online). The exact system requirements are given at the Adobe site: http://www.adobe.com/products/reader/tech-specs.html. If you do not wish to use the PDF annotations function, you may list the corrections (including replies to the Query Form) and return them to Elsevier in an e-mail. Please list your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not possible, then mark the corrections and any other comments (including replies to the Query Form) on a printout of your proof and return by fax, or scan the pages and e-mail, or by post. Please use this proof only for checking the typesetting, editing, completeness and correctness of the text, tables and figures. Significant changes to the article as accepted for publication will only be considered at this stage with permission from the Editor. We will do everything possible to get your article published quickly and accurately – please let us have all your corrections within 48 hours. It is important to ensure that all corrections are sent back to us in one communication: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is received.

Offprints The corresponding author, at no cost, will be provided with a PDF file of the article via e-mail. For an extra charge, paper offprints can be ordered via the offprint order form which is sent once the article is accepted for publication. The PDF file is a watermarked version of the published article and includes a cover sheet with the journal cover image and a disclaimer outlining the terms and conditions of use.

AUTHOR INQUIRIES For inquiries relating to the submission of articles (including electronic submission) please visit this journal's homepage. Contact details for questions arising after acceptance of an article, especially those relating to proofs, will be provided by the publisher. You can track accepted articles at http://www.elsevier.com/trackarticle. You can also check our Author FAQs (http://www.elsevier.com/authorFAQ) and/or contact Customer Support via http://support.elsevier.com.

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